ES2306527T3 - Metodo de extraccion de lipidos de tejidos de animales marinos y acuaticos. - Google Patents
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Abstract
Un método para extraer fracciones de lípidos totales de un material de animales marinos y acuáticos, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) poner el material de los animales marinos y acuáticos en un disolvente cetónico, preferiblemente acetona, para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho material de los animales marinos y acuáticos; (b) separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a); (c) recuperar una primera fracción rica en lípidos totales procedente de los contenidos líquidos de (b) por evaporación del disolvente presente en los contenidos líquidos; (d) poner dichos contenidos sólidos en un disolvente orgánico seleccionado del grupo de disolventes que consiste en alcohol, preferiblemente etanol, isopropanol o t-butanol, y ésteres de ácido acético, preferiblemente acetato de etilo, para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles restante procedente de dicho material de animales marinos y acuáticos; (e) separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (d); y (f) recuperar una segunda fracción rica en lípidos totales por evaporación del disolvente de los contenidos líquidos de (e).
Description
Método de extracción de lípidos de tejidos de
animales marinos y acuáticos.
Esta invención se refiere a la extracción de
fracciones de lípidos de animales marinos y acuáticos tales como
krill (plancton), Calanus, peces y mamíferos marinos. Más
específicamente, esta invención se refiere a un método mejorado
para extraer las fracciones de lípidos por deshidratación con
disolventes y recuperar un residuo sólido rico en enzimas
activas.
Las fracciones de lípidos obtenidas de animales
marinos y acuáticos tales como krill, Calanus, peces y
mamíferos marinos tienen diferentes aplicaciones:
Los aceites de animales marinos y acuáticos y
las fracciones de los mismos contienen diferentes agentes
terapéuticos. Por ejemplo, se ha publicado que diferentes aceites
de animales marinos y acuáticos tienen propiedades
anti-inflamatorias. Se ha publicado también que los
aceites de animales marinos y acuáticos son útiles para reducir la
incidencia de las cardiopatías. También, se ha publicado que
algunos aceites de animales marinos y acuáticos reprimen el
desarrollo de ciertas formas de lupus y enfermedades renales. Como
un ejemplo adicional, se puede usar el krill como fuente de enzimas
para desbridamiento de úlceras y heridas o para facilitar la
digestión de los alimentos. También los aceites marinos y acuáticos
contienen diferentes antioxidantes, que pueden tener propiedades
terapéuticas
potenciales.
potenciales.
Considerando los efectos beneficiosos de los
ácidos grasos omega-3, los aceites procedentes de
krill, Calanus y peces podrían ser usados como suplementos
dietéticos para la dieta humana. Estos ácidos grasos son esenciales
para el desarrollo apropiado del cerebro y del ojo. Los aceites de
animales marinos y acuáticos son también ricos en vitaminas
liposolubles A, D y E y carotenoides.
Diferentes aceites de animales marinos y
acuáticos se utilizan para la producción de cremas hidratantes.
Entre los lípidos encontrados en el krill,
Calanus y en los peces, están presentes altas concentraciones
de ácidos grasos 20:5 (ácido eicosapentaenoico) y 22:6 (ácido
docosahexaenoico). Estos ácidos grasos son nutrientes esenciales y
son beneficiosos como pienso para peces. Además, estos nutrientes
esenciales se transfieren a la dieta humana al comer los peces que
han crecido con tales dietas.
Las dietas de piensos animales ricas en ácidos
grasos omega-3 pueden aumentar el nivel de los
ácidos grasos insaturados y reducir los niveles de colesterol de la
carne. Esta propiedad se aprovecha ya en la industria avícola para
mejorar la calidad de los huevos.
Se conocen diferentes métodos para extraer los
aceites de animales marinos y acuáticos. Por ejemplo, es conocido
cómo extraer el aceite de los peces utilizando disolventes orgánicos
tales como hexano y etanol. También es conocido cómo medir el
contenido en grasa del tejido muscular de los peces utilizando
disolventes tales como acetona.
El documento USP 4.331.695 describe un método
que utiliza disolventes presurizados que son gaseosos a temperatura
ambiente, tales como propano, butano o hexano. La extracción se
realiza a temperaturas preferidas de 15 a 80ºC sobre vegetales
molidos o productos animales finamente divididos. Después se hace
que los aceites extraídos precipiten a alta presión y temperaturas
elevadas de 50 a 200ºC. Sin embargo, el hexano es un disolvente de
extracción insatisfactorio para los animales marinos tales como el
krill. Además, las altas temperaturas usadas en la etapa de
precipitación alteran negativamente a los lípidos.
La solicitud de patente canadiense 2.115.571
describe un método para extraer aceites de diferentes especies de
algas pardas y rojas. El método proporciona por ejemplo la
extracción Soxhlet utilizando etanol casi puro durante 40
horas.
El documento USP 5.006.281 describe un método
para extraer aceite de animales marinos y acuáticos tales como los
peces. El animal marino y acuático se trata en primer lugar con un
compuesto antioxidante, se divide finamente y se centrifuga para
separar la fase oleosa de la fase acuosa y de la fase sólida. La
fase oleosa se trata entonces también con antioxidante para separar
cualquier olor o sabor no deseable.
La patente canadiense 1.098.900 describe un
método para extraer los aceites del krill. El método incluye
emulsionar el krill fresco o descongelado en un medio acuoso. La
fracción oleosa se recoge por centrifugación.
Folch en el artículo publicado el año 1957 en J.
Biol. Chem. 226: 497-509 "A simple method for the
isolation and purification of total lipids from animal tissues"
propone un método de extracción que utiliza cloroformo y metanol.
Este método no es comercialmente factible debido a la toxicidad de
los disolventes implicados.
Chem. Abs. 177859 describe un procedimiento para
la extracción del colorante astaxantina, que se utiliza como una
fuente de color en las piscifactorías de salmón, a partir de
desechos de gambas o de krill, que comprende mezclar la materia
prima con aceites de triglicéridos y prensar la materia prima para
extraer el aceite enriquecido en astaxantina.
Sin embargo, los procedimientos de la técnica
anterior generalmente no son comercialmente factibles o proporcionan
rendimientos cuantitativos bajos.
La presente invención proporciona un método para
extraer fracciones de lípidos totales de un material de animales
marinos y acuáticos, comprendiendo dicho método las etapas de: (a)
poner el material de los animales marinos y acuáticos en un
disolvente cetónico, preferiblemente acetona, para conseguir la
extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho material de
los animales marinos y acuáticos; (b) separar los contenidos
líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a); (c) recuperar una
primera fracción rica en lípidos totales procedente de los
contenidos líquidos de (b) por evaporación del disolvente presente
en los contenidos líquidos; (d) poner dichos contenidos sólidos en
un disolvente orgánico seleccionado del grupo de disolventes que
consisten en alcohol preferiblemente etanol, isopropanol o
t-butanol, y ésteres de ácido acético,
preferiblemente acetato de etilo, para conseguir la extracción de
la fracción de lípidos solubles restante procedente de dicho
material de animales marinos y acuáticos; (e) separar los
contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (d); y (f)
recuperar una segunda fracción rica en lípidos totales por
evaporación del disolvente de los contenidos líquidos de (e).
Por lo tanto es un objetivo de la presente
invención proporcionar un método mejor para la extracción de aceite
de animales marinos y acuáticos que permita recuperar una fracción
de lípidos valiosa y separar la recuperación de un residuo sólido
valioso rico en proteínas que comprende enzimas activas.
La presente invención proporciona también un
método para extraer una fracción de lípidos totales que contiene
astaxantina y cantaxantina procedente de un material de animales
marinos y acuáticos seleccionado entre zooplacton y peces,
comprendiendo dicho método las etapas de: (a) poner dicho material
animal en un disolvente cetónico, preferiblemente acetona, para
conseguir una extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho
material de animales marinos y acuáticos; (b) separar los
contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a); (c)
recuperar una fracción rica en lípidos procedente de los contenidos
líquidos por evaporación del disolvente presente en los contenidos
líquidos; con lo que se obtiene una fracción de lípidos totales que
contiene astaxantina y cantaxantina.
La presente invención proporciona también un
método para extraer una fracción de lípidos totales procedente de
un material de animales marinos y acuáticos seleccionado entre
zooplacton y peces, comprendiendo dicho método las etapas de: (a)
poner dicho material animal en una mezcla de disolventes que
comprende acetona y etanol para conseguir una extracción de la
fracción de lípidos solubles procedente de dicho material de
animales marinos y acuáticos; (b) separar los contenidos líquidos y
sólidos que resultan de la etapa (a); (c) recuperar una fracción
rica en lípidos procedente de los contenidos líquidos por
evaporación de los disolventes presentes en los contenidos
líquidos; con lo que se obtiene una fracción de lípidos totales.
La presente invención proporciona también un
extracto de lípidos totales de krill caracterizado porque carece de
disolventes tóxicos y porque el contenido de carotenoides expresado
en astaxantina es de 75 \mug/g o más, y preferiblemente al menos
de aproximadamente 90 \mug/g o más del extracto de krill, y el
contenido de carotenoides expresado en cantaxantina es de 250
\mug/g o más, y preferiblemente al menos de aproximadamente 270
\mug/g o más del extracto de krill.
La presente invención proporciona también un
extracto de lípidos totales de krill caracterizado porque es
comestible, y porque el contenido de carotenoides expresado en
astaxantina es de 75 \mug/g o más, y preferiblemente al menos de
aproximadamente 90 \mug/g o más del extracto de krill, y el
contenido de carotenoides expresado en cantaxantina es de 250
\mug/g o más y preferiblemente al menos de aproximadamente 270
\mug/g o más del extracto de krill.
Otros objetivos y alcance adicional de la
aplicabilidad de la presente invención quedarán claros a partir de
la descripción detallada dada de aquí en adelante. Se debe entender,
sin embargo, que esta descripción detallada, aunque indicando las
realizaciones preferidas de la invención, se da a modo de
ilustración solamente, puesto que diferentes cambios y
modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención serán
claros para los expertos en la técnica.
Figura 1. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill seco (cloroformo-metanol)
Figura 2. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill seco (acetona)
Figura 3. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill congelado (acetona)
Figura 4. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill congelado (etanol)
Figura 5. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill congelado (t-butanol)
Figura 6. Cromatografía de
gases-líquidos de los ácidos grasos procedentes de
krill congelado (acetato de etilo).
Figura 7. Cromatografía en capa fina de los
lípidos neutrales de Calanus sp. y M. norvegica
Figura 8. Cromatografía en capa fina de los
lípidos neutrales de E. pacifica
Figura 9. Cromatografía en capa fina de los
lípidos neutrales de M. schmitti
Figura 10. Cromatografía en capa fina de los
lípidos neutrales de G. galeus
Figura 11. Cromatografía en capa fina de los
lípidos neutrales de Angel Shark
Figura 12. Cromatografía en capa fina de los
fosfolípidos de Calanus sp. y M. norvegica
Figura 13. Cromatografía en capa fina de los
fosfolípidos de E. pacifica
Figura 14. Cromatografía en capa fina de los
fosfolípidos de M. schmitti
Figura 15. Cromatografía en capa fina de los
fosfolípidos de G. Galeus
Figura 16. Cromatografía en capa fina de los
fosfolípidos de Angel Shark
Figura 17. Influencia del volumen de acetona
sobre la extracción de lípidos (E. pacifica)
Figura 18. Influencia del tiempo de incubación
en acetona sobre la extracción de lípidos (E. pacifica)
Figura 19. Influencia del volumen de etanol
sobre la extracción de lípidos (E. pacifica)
Figura 20. Influencia del tiempo de incubación
en etanol sobre la extracción de lípidos (T. raschii).
Antes de describir la presente invención en
detalle, se debe entender que la invención no está limitada en su
aplicación a los detalles del procedimiento descrito aquí. La
invención es capaz de otras realizaciones y de ser practicada de
diferentes modos. Se debe entender también que la fraseología o
terminología usada aquí cumple fines de descripción y no de
limitación.
El método de la invención comprende suspender el
material marino y acuático, recientemente recogido, en acetona. Se
extraen los lípidos con una cetona tal como acetona. Esto permite
una rápida deshidratación del tejido animal y una migración de la
fracción de lípidos hacia el disolvente. El residuo seco es un
producto valioso rico en enzimas activas.
En una realización preferida, la extracción se
lleva a cabo por tratamientos sucesivos con acetona y alcohol. Los
alcoholes preferidos son isopropanol, y t-butanol.
El alcohol puede ser reemplazado también con un éster de ácido
acético tal como acetato de etilo. El procedimiento produce dos
fracciones de lípidos sucesivas y un residuo seco enriquecido en
proteínas, que incluye enzimas activas. La recuperación de lípidos
totales es comparable al procedimiento de Folch et al.
(1957) mencionado en los antecedentes de la invención. Ha sido
ensayado con tejidos de krill, Calanus, peces y tiburón.
Sorprendentemente, se ha encontrado que los
tratamientos sucesivos de extracción como se proponen en la presente
invención, tienen un mejor rendimiento en la extracción de lípidos
que las extracciones del sistema de disolvente único. La extracción
que usa dos disolventes sucesivos que empieza con una cetona tal
como acetona es especialmente ventajosa puesto que la acetona, en
efecto, deshidrata el tejido animal. El que el tejido animal esté en
forma deshidratada facilita en gran manera el procedimiento de
extracción con el segundo disolvente, alcohol o un éster de ácido
acético tal como acetato de etilo.
En el caso de zooplancton tal como krill y
Calanus y en el caso de los sub-productos que
quedan después de cortar los peces en filetes, tales como las
vísceras de los peces, se observa que la extracción con acetona
sola puede ser suficiente para permitir una recuperación rentable de
las fracciones de lípidos y separar la recuperación de un producto
sólido seco rico en proteínas que incluye enzimas activas.
El método general de extracción de la presente
invención será descrito ahora. El material de partida que consiste
en un material de animales marinos y acuáticos recientemente
recogido y preferiblemente finamente dividido, se somete a
extracción con acetona, durante aproximadamente dos horas y
preferiblemente durante la noche. Sin embargo el tiempo de
extracción no es crítico para el rendimiento de la extracción de los
lípidos. Para facilitar la extracción, es preferible usar
partículas de menos de 5 mm de diámetro. La extracción se realiza
preferiblemente en atmósfera inerte y a una temperatura del orden de
aproximadamente 5ºC o menos.
Preferiblemente, el comienzo de la extracción se
realizará con agitación durante aproximadamente 10 a 40 minutos,
preferiblemente 20 minutos. Aunque el tiempo de extracción no es
crítico, se ha encontrado que una extracción de 2 horas con una
relación 6:1 en volumen de acetona al material de los animales
marinos y acuáticos, es la mejor.
Las fracciones de lípidos solubilizados se
separan del material sólido por técnicas estándar que incluyen, por
ejemplo, filtración, centrifugación o sedimentación. Preferiblemente
se usa la filtración.
Después de separación por filtración por un
filtro (metal, vidrio o papel) resistente al disolvente orgánico,
el residuo se lava opcionalmente con acetona pura, preferiblemente
dos volúmenes (volumen original del material) para recuperar aún
más lípidos. Los filtrados reunidos se evaporan a presión reducida.
Opcionalmente, se puede utilizar evaporación rápida o secado por
pulverización. El residuo acuoso obtenido después de evaporación se
deja que se separe de la fase oleosa (fracción I) a baja
temperatura.
El residuo sólido recogido sobre el filtro se
suspende y se extrae con alcohol, tal como etanol, isopropanol,
t-butanol o alternativamente con acetato de etilo,
preferiblemente dos volúmenes (volumen original del material). Se
evapora el filtrado llevando a una segunda fracción de lípidos
(identificada como fracción II). Aunque el periodo de extracción no
es crítico, se ha encontrado que un tiempo de extracción de
aproximadamente 30 minutos es suficiente a temperaturas por debajo
de aproximadamente 5ºC.
La temperatura de los disolventes orgánicos,
excepto t-butanol, y la temperatura de la muestra no
son parámetros críticos, pero es preferible que sean lo más frías
posible. Sin embargo, en el caso de t-butanol que es
sólido a temperatura ambiente, es importante calentarlo antes de
usarlo y realizar la extracción a 25ºC inmediatamente.
Para comparar la eficiencia del procedimiento de
extracción, se aplicó al krill una técnica clásica (Folch et
al. 1957) utilizando cloroformo y metanol. Este método es la
referencia para medir la eficiencia del procedimiento de
extracción. Se ha hecho otra comparación con una técnica que utiliza
hexano como el disolvente de extracción. La recuperación de lípidos
suspendiendo las fracciones de lípidos en pequeños volúmenes de sus
disolventes originales y midiendo por gravimetría de pequeñas
alícuotas después de evaporación.
Para todos los ejemplos que se presentan aquí,
el método de la presente invención que incluye extracción con
acetona seguida por extracción con un segundo disolvente (acetato de
etilo, por ejemplo) dio un aceite traslúcido que tiene un aspecto y
unas propiedades más atractivas que cualquier aceite obtenido por la
técnica clásica de Folch et al. (1957).
Para analizar la composición de los lípidos, se
cargaron 780 \mug de cada extracto sobre placas de gel de sílice
y se fraccionaron por cromatografía en capa fina, TLC (Bowyer et
al. 1962) con los siguientes disolventes. Lípidos neutrales:
hexano, éter etílico, ácido acético (90:10:1, v/v) y fosfolípidos:
cloroformo, metanol, agua (80:25:2, v/v). Se analizó la composición
de ácidos grasos de E. pacifica por cromatografía de
gases-líquidos, GLC (Bowyer et al. 1962)
incluyendo algunas modificaciones a la técnica original: 2 h a 65ºC
en lugar de 1 h a 80ºC, tres lavados con hexano en lugar de dos y
ningún lavado con agua.
Para dejarlas limpias de trazas de disolventes
orgánicos, se calientan las fracciones de lípidos I y II a
aproximadamente 125ºC durante aproximadamente 15 minutos bajo
atmósfera inerte.
Se analizó la grasa según la American Oil
Chemist's Society (AOCS). Se han utilizado los siguientes criterios
para analizar los lípidos extraídos: índice de saponificación e
índice de yodo Wijs y niveles de humedad y sustancias volátiles.
También se ha determinado el contenido de colesterol por el método
de Plummer 1987. Los mismos análisis y otros han sido realizados
por un laboratorio independiente bajo la supervisión del Profesor
Robert Ackman (Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech,
Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada). Esto incluye
el índice de yodo Wijs, los valores de peróxidos y anisidina, la
composición de la clase de lípidos, la composición de los ácidos
grasos, FAME (ésteres metílicos de ácidos grasos) de los ácidos
grasos libres, los contenidos de colesterol. tocoferol, retinol
todo-trans, colecalciferol, astaxantina y
cantaxantina.
La Tabla 1 muestra que los niveles más altos de
lípidos se extraen del krill seco con acetona seguida por etanol en
comparación con el procedimiento clásico de Folch et al.
(1957).
La Tabla 2 muestra los resultados de la
extracción de lípidos a partir de Euphausia pacifica
congelada, una especie de krill del Océano Pacífico. Asumiendo un
contenido de agua del ochenta por ciento, el contenido de lípidos
es comparable al krill seco que se muestra en la Tabla 1. El
isopropanol, t-butanol y acetato de etilo, como
disolventes para la segunda extracción, dan un rendimiento menos
importante que el etanol, pero no son necesariamente menos
efectivos en la recuperación de lípidos debido a que el etanol
arrastra más impurezas que el isopropanol,
t-butanol o acetato de etilo. Además, se pueden
utilizar asimismo como segundo disolvente después de la acetona.
Las variaciones entre resultados de las extracciones con acetona son
debidas principalmente a las separaciones
agua-aceite. Estas separaciones están influenciadas
por la cantidad de acetona residual en la solución
agua-aceite después de la evaporación de la acetona.
Esta cantidad de acetona varía de un experimento a otro, debido a
que el sistema de evaporación utilizado a pequeña escala es menos
reproducible (a escala industrial, la etapa de evaporación será
optimizada). También se han ensayado disolventes individuales para
extraer la totalidad de los lípidos del krill. Esto demuestra que
tanto el acetato de etilo (1,37% de tasa de extracción), como el
hexano (0,23% de tasa de extracción) no son buenos disolventes,
comparados con la acetona sola (1,86% de tasa de extracción, e
incluso mayores tasas de extracción con un sistema eficiente de
evaporación de la acetona).
Una de las principales ventajas del
procedimiento es la separación de las bacterias de los extractos
(fracción de lípidos y material sólido rico en proteínas). En
efecto, muestras de E. pacifica incubadas en diferentes
proporciones de acetona a 4ºC durante 112 días han sido inoculadas
en medio NA que contiene extracto de ternera Bacto^{TM} al 0,3%,
peptona Bacto^{TM} al 0,5% y agar Bacto^{TM} al 1,5% (Difco
Laboratories, Detroit, USA) y después incubadas a temperatura
ambiente o a 4ºC durante 18 días. No se observó ningún crecimiento
bacteriano importante en una proporción de 1 volumen de acetona por
gramo de krill. A proporciones más altas de acetona (2 volúmenes y
5 volúmenes), no hubo en absoluto ningún crecimiento bacteriano, lo
que significa que la acetona conserva las muestras de krill. La
acetona es conocida como un eficaz agente bactericida y viricida
(Goodman et al. 1980).
La Tabla 3 muestra el rendimiento de lípidos a
partir de M. norvegica. El porcentaje de lípidos (3,67%) es
comparable al obtenido con E. pacifica (3,11%) mostrado en la
Tabla 2. Las variaciones pueden ser atribuibles a la dieta y al
tiempo (estación) de la recogida, que son diferentes para las dos
especies.
La Tabla 4 muestra la influencia de la molienda
sobre la eficiencia de la extracción de lípidos de M.
norvegica. Estas extracciones se llevaron a cabo en condiciones
óptimas y demuestran la ventaja definitiva del procedimiento sobre
el método clásico (4,46% frente a 3,30%). También demuestra que la
molienda puede ser un factor importante cuando la especie es grande
(4,46% frente a 3,53%).
La Tabla 5 presenta la extracción de lípidos a
partir de Calanus. Se obtuvieron cantidades considerables de
lípidos. Algunas variaciones en la composición de la especie de
Calanus pueden explicar las variaciones entre los
experimentos 1 y 2 (8,22% y 10,90% de peso fresco).
Las tablas 6-8 presentan la
cantidad total de lípidos extraídos del tejido de peces. Se demostró
el método de la presente invención sobre caballa, trucha y arenque.
Se demostró el método sobre tejidos periféricos (principalmente
músculos) y vísceras. De forma ventajosa, el presente método
permitiría la recuperación de fracciones de lípidos valiosas de
partes del pescado que usualmente se desechan después de partir el
pescado en filetes. Estos tejidos de peces que no se usan después
de la transformación de los peces para el consumo humano podrían
ser conservados en acetona y se podrían extraer de ellos los lípidos
de acuerdo con la presente invención aunque el método Folch [1957]
recupera más lípidos que el método de la invención. En efecto,
pequeñas cantidades de lípidos procedentes de caballa (0,52% de las
vísceras y 1,45% de los tejidos) han sido extraídas por el método
de Folch después de una primera extracción con acetona y etanol como
se describe en la presente invención. Extracciones comparativas con
el método descrito en la presente invención llevado a cabo en
paralelo con el método de Folch en la trucha y el arenque
demuestran una superior recuperación con el último. Sin embargo, es
de notar que el método de Folch no puede ser aplicado para la
recuperación de lípidos para usos comerciales (a causa de la
toxicidad).
En las tablas 9 a 11, se muestran los resultados
de la extracción de lípidos de los tejidos del hígado de tiburón.
No hay diferencia marcada en los resultados entre técnicas dentro de
una especie.
La Tabla 12 muestra algunas características
específicas de la fracción I (acetona) y de la fracción II (alcohol
o acetato de etilo) para el aceite de krill (e. pacifica). En
primer lugar, el índice de saponificación de la fracción I (130,6)
indica que esta fracción contiene ácidos grasos con cadenas más
largas, en comparación con la fracción II (185,7). El índice de
yodo Wijs de la fracción I demuestra que esta fracción contiene
altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados. En comparación con
el aceite de oliva que tiene un índice de 81,1. Esto explica por
qué la fracción I es líquida a temperatura ambiente. Es bien
conocido que los ácidos grasos insaturados tienen un punto de
fusión inferior al de sus homólogos saturados. Las mismas
observaciones se hacen para la fracción II que tiene un índice de
yodo de 127,2. La composición de los ácidos grasos que se muestra
en la Tabla 14 corrobora estos índices de yodo: la fracción I tiene
un alto porcentaje (30,24%) de ácidos grasos poliinsaturados
(pentaenos+hexaenos) y también la fracción II (22,98%). Finalmente,
la Tabla 12 muestra también que la fracción I tiene el 10,0% de
sustancias volátiles y humedad después de la evaporación del
disolvente. Para el mismo ensayo, la fracción II da un valor de
6,8%. Para mantener limpio el aceite de trazas de disolventes, es
importante calentarlo durante poco tiempo (a aproximadamente 125ºC,
durante aproximadamente 15 min) bajo nitrógeno.
Los resultados de los aceites de krill obtenidos
de acuerdo con el método de la presente invención (fracción I
extraída con acetona y fracción II extraída con acetato de etilo) se
dan en las tablas 12, 13, 14, 15, 16 y 17. Es notable mencionar que
en la Tabla 17, el contenido de carotenoides fue significativamente
alto medido en términos de dos carotenoides, concretamente
astaxantina y cantaxantina. En efecto, los análisis duplicados
revelaron valores de 92 a 124 \mug/g de la fracción de lípidos
para la astaxantina y 262 a 734 \mug/g para la cantaxantina. Por
lo tanto, para el propósito de la presente invención se puede decir
que el extracto de krill comprende al menos 75 \mug y
preferiblemente al menos 90 \mug de astaxantina por gramo de la
fracción de lípidos. En el caso de la cantaxantina, al menos 250
\mug y preferiblemente al menos 270 \mug por gramo de la
fracción de lípidos. Los valores bajos de peróxidos y anisidina son
ventajosos y son debidos a la presencia de altos niveles de
antioxidantes naturales (astaxantina y cantaxantina). Estos
compuestos son indicativos de propiedades farmacéuticas o
cosméticas favorables del extracto de krill porque los niveles de
carotenoides indican excelentes características de migración
transdérmica. Por lo tanto, el extracto del krill es un buen
candidato para la administración transdérmica de medicamentos.
La Tabla 18 muestra el mejor modo del método de
acuerdo con la presente invención para la extracción de lípidos de
los tejidos de animales acuáticos.
La Tabla 19 muestra que la actividad enzimática
de la fracción sólida se mantiene siguiendo el método de la
presente invención. En efecto, se completó la demostración para el
residuo sólido del krill obtenido después de sucesivas extracciones
con acetona y acetato de etilo. Las actividades proteolíticas se
midieron por la liberación de grupos amino mediante un ensayo
espectrofotométrico usando o-ftaldialdehído como
reactivo. Las concentraciones de proteínas se midieron por el
método Bradford. Se extrajeron las proteínas solubles con agua y se
añadieron a un concentrado de proteínas de lactosuero al 10%
obtenido por ultrafiltración. Al final de la incubación a 37ºC en
tampón de fosfato de potasio 50 mM, se añadió ácido tricloroacético
y se midió la cantidad de grupos NH_{3} en el sobrenadante según
el método de Church et al. [1983, J Dairy Sci 66:
1219-1227].
Las figuras 1 a 6 presentan cromatogramas de la
composición de los ácidos grasos de los lípidos de E.
pacifica. En cada uno de ellos, son notables las altas
proporciones de ácidos grasos 20:5 y 22:6 (características de los
aceites marinos y acuáticos) y se representan por dos picos
definidos.
Las variaciones del modelo lipídico de los
lípidos neutrales (de la Figura 7 a la Figura 11) de una especie a
otra son atribuibles a las diferencias en las fuentes de alimentos.
Dentro de una especie (E. pacifica, por ejemplo) no hay una
variación marcad entre el modelo lipídico obtenido por diferentes
técnicas de extracción de lípidos. Con respecto a los fosfolípidos
(Figura 12 a Figura 16), se observa lo contrario: las variaciones
se explican por los diferentes procedimientos de extracción de
lípidos ya que las mismas especies no llevan al mismo modelo de
lípidos. Los lípidos de las especies de tiburón (extraídos por los
métodos mencionados) y el aceite de hígado de bacalao comercial
(muestra disponible de Uniprix drugstores, Province of Quebec,
Canada) están compuestos principalmente de lípidos neutrales a
diferencia de los fosfolípidos.
La influencia del volumen de disolvente y del
tiempo de incubación sobre la eficiencia de la acetona para extraer
lípidos de la E. pacifica se ilustra en las figuras 17 y 18,
respectivamente. Una proporción de 1:6 (p/v) produjo un rendimiento
óptimo con una extracción casi completa después de 2 h. La segunda
etapa de extracción se ha experimentado con etanol. El volumen de
este disolvente no parece que sea crítico ya que se obtuvo el mismo
rendimiento con diferentes volúmenes de etanol (Figura 19), pero el
tiempo de las incubaciones en etanol debe ser al menos de 30
minutos como se indica por los resultados de la Figura 20.
Uno de los inventores, Dr. Adrien Beaudoin, ha
ingerido las diferentes fracciones de lípidos de krill. No se
observó ningún perfil de efectos secundarios.
Aunque la invención ha sido descrita antes con
respecto a una forma específica, quedará claro para una persona
experta en la técnica que puede ser modificada y perfeccionada de
varios modos. Es por tanto deseable entender que la presente
invención no debe estar limitada en su alcance, excepto por los
términos de las siguientes reivindicaciones.
Demostración de que el residuo del krill,
obtenido después de extracción con acetona y acetato de etilo,
contiene actividades enzimáticas proteolíticas. Las actividades
proteolíticas se midieron por la liberación de grupos amino
mediante un ensayo espectrofotométrico usando
o-ftaldialdehído como reactivo. Las concentraciones
de proteínas se midieron por el método Bradford.
La fuente enzimática fue el residuo obtenido
después de las extracciones de lípidos con acetona y acetato de
etilo. Se extrajeron las proteínas solubles con agua y se añadieron
a un concentrado de proteínas de lactosuero al 10% obtenido por
ultrafiltración.
Al final de la incubación a 37ºC en tampón de
fosfato de potasio 50 mM, se añadió ácido tricloroacético y se
midió la cantidad de grupos NH_{3} en el sobrenadante según el
método de Church et al. 1983.
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Claims (35)
1. Un método para extraer fracciones de lípidos
totales de un material de animales marinos y acuáticos,
comprendiendo dicho método las etapas de:
- (a)
- poner el material de los animales marinos y acuáticos en un disolvente cetónico, preferiblemente acetona, para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho material de los animales marinos y acuáticos;
- (b)
- separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a);
- (c)
- recuperar una primera fracción rica en lípidos totales procedente de los contenidos líquidos de (b) por evaporación del disolvente presente en los contenidos líquidos;
- (d)
- poner dichos contenidos sólidos en un disolvente orgánico seleccionado del grupo de disolventes que consiste en alcohol, preferiblemente etanol, isopropanol o t-butanol, y ésteres de ácido acético, preferiblemente acetato de etilo, para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles restante procedente de dicho material de animales marinos y acuáticos;
- (e)
- separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (d); y
- (f)
- recuperar una segunda fracción rica en lípidos totales por evaporación del disolvente de los contenidos líquidos de (e).
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que la extracción de la etapa (a) se realiza con agitación una vez
que el material animal ha sido molido.
3. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2, en el que la extracción de la etapa (d) se
realiza con agitación una vez que el material animal ha sido
molido.
4. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que las etapas (a) y (d) se realizan
en atmósfera inerte.
5. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que las etapas (b) y (e) se llevan a
cabo por técnicas seleccionadas del grupo que consiste en
filtración, centrifugación y sedimentación.
6. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las etapas (c) y (f) se llevan a
cabo por técnicas seleccionadas entre evaporación a presión
reducida, evaporación rápida y secado por pulverización.
7. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que después de la etapa (b) y antes de
la etapa (c), el método comprende adicionalmente la etapa
intermedia de lavado de los contenidos sólidos con el disolvente y
de adición de la solución de lavado resultante a los contenidos
líquidos de la etapa (b).
8. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que después de la etapa (e) y antes de
la etapa (f), el método comprende adicionalmente la etapa
intermedia de lavado de los contenidos sólidos con el disolvente
orgánico seleccionado en la etapa (d).
9. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que antes de la etapa (a) el material
del animal marino y acuático se divide finamente, preferiblemente
hasta un tamaño medio de partícula de 5 mm o menos.
10. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente orgánico se
selecciona del grupo de disolventes que consiste en etanol o
isopropanol y ésteres de ácido acético, preferiblemente acetato de
etilo, y en el que dicho método se lleva a cabo a una temperatura de
5ºC o menos.
11. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho animal marino y acuático es
zooplancton.
12. Un método según la reivindicación 11, en el
que dicho zooplancton es krill.
13. Un método según la reivindicación 11, en el
que dicho zooplancton es Calanus.
14. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dichos animales marinos y
acuáticos son peces.
15. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el disolvente orgánico es
t-butanol, y en el que dicho método se lleva a cabo
a una temperatura de 25ºC.
16. Un método para extraer una fracción de
lípidos totales que contiene astaxantina y cantaxantina a partir de
un material de animales marinos y acuáticos seleccionado entre
zooplancton y peces, comprendiendo dicho método las etapas de:
- (a)
- poner dicho material animal en un disolvente cetónico, preferiblemente acetona, para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho material de animales marinos y acuáticos;
- (b)
- separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a);
- (c)
- recuperar una fracción rica en lípidos de los contenidos líquidos por evaporación del disolvente presente en los contenidos líquidos;
con lo que se obtiene una fracción
de lípidos totales que contiene astaxantina y
cantaxantina.
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17. Un método para extraer una fracción de
lípidos totales a partir de un material de animales marinos y
acuáticos seleccionado entre zooplancton y peces, comprendiendo
dicho método las etapas de:
- (a)
- poner dicho material animal en una mezcla de disolventes que comprende acetona y etanol para conseguir la extracción de la fracción de lípidos solubles de dicho material de animales marinos y acuáticos;
- (b)
- separar los contenidos líquidos y sólidos que resultan de la etapa (a);
- (c)
- recuperar una fracción rica en lípidos de los contenidos líquidos por evaporación de los disolventes presentes en los contenidos líquidos;
con lo que se obtiene una fracción
de lípidos
totales.
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18. Un método según la reivindicación 16 o 17,
en el que el material animal es krill.
19. Un método según la reivindicación 16 o 18,
en el que el material animal es Calanus.
20. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que la extracción de la etapa (a) se
realiza con agitación una vez que el material animal ha sido
molido.
21. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en el que la etapa (a) se lleva a cabo en
atmósfera inerte.
22. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, en el que la etapa (b) se realiza por una
técnica seleccionada entre filtración, centrifugación y
sedimentación.
23. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22, en el que la etapa (c) se realiza por una
técnica seleccionada entre evaporación a vacío, evaporación rápida y
secado por pulverización.
24. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 23, en el que después de la etapa (b) y antes
de la etapa (c), el método comprende adicionalmente una etapa de
lavado de dichos contenidos sólidos con un disolvente y de adición
de la solución de lavado resultante a los contenidos líquidos de la
etapa (b).
25. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 24, en el que antes de la etapa (a) el
material del animal marino y acuático se divide finamente,
preferiblemente hasta un tamaño medio de partícula de 5 mm o
menos.
26. Un método según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 25, en el que dicho método se realiza a una
temperatura de 5ºC o menos.
27. Un método de extracción de lípidos según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, en el que los contenidos
sólidos resultantes se recuperan y consisten en un residuo
deshidratado que contiene enzimas activas.
28. Un extracto de lípidos totales de krill,
caracterizado porque carece de disolventes tóxicos y porque
el contenido de carotenoides expresado en astaxantina es de 75
\mug/g o más y preferiblemente al menos de aproximadamente 90
\mug/g o más del extracto de krill, y el contenido de carotenoides
expresado en cantaxantina es de 250 \mug/g o más y
preferiblemente al menos de aproximadamente 270 \mug/g o más del
extracto de krill.
29. Un extracto de lípidos según la
reivindicación 28, obtenible de un animal acuático o marino por un
método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
30. El uso de un extracto de lípidos de krill
según la reivindicación 28 o 29, en una aplicación seleccionada del
grupo que consiste en aplicaciones para nutraceuticals,
cosméticos, piscifactorías y piensos animales.
31. El uso de un extracto de lípidos de krill
según la reivindicación 28 o 29, para la fabricación de un
medicamento para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que
consiste en una enfermedad inflamatoria, cardiopatía, lupus y
enfermedad renal.
32. Un extracto de lípidos de krill,
caracterizado porque es comestible, y porque el contenido de
carotenoides expresado en astaxantina es de 75 \mug/g o más y
preferiblemente al menos de aproximadamente 90 \mug/g o más del
extracto de krill, y el contenido de carotenoides expresado en
cantaxantina es de 250 \mug/g o más y preferiblemente al menos de
aproximadamente 270 \mug/g o más del extracto de krill.
33. Un extracto de lípidos de krill según la
reivindicación 32, obtenible de un animal acuático o marino por un
método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
34. El uso de un extracto de lípidos de krill
según la reivindicación 32 o 33, en una aplicación seleccionada del
grupo que consiste en aplicaciones para nutraceuticals,
cosméticos, piscifactorías y piensos animales.
35. El uso de un extracto de lípidos de krill
según la reivindicación 32 o 33, para la fabricación de un
medicamento para tratar una enfermedad seleccionada del grupo que
consiste en una enfermedad inflamatoria, cardiopatía, lupus y
enfermedad renal.
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