PT1123368E

PT1123368E - Processo para extrair lípidos a partir dos tecidos de animais marinhos e aquáticos

Info

Publication number: PT1123368E
Application number: PT99952180T
Authority: PT
Inventors: Adrien Beaudoin; Genevieve Martin
Original assignee: Univ Sherbrooke
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2008-07-18
Also published as: CA2251265A1; CN1269940C; DE69938504D1; ATE391763T1; BR9914699B1; JP4181305B2; NO20011915D0; DK1123368T3; NO321481B1; JP2008150586A; ES2306527T3; DE69938504T2; EP1123368A1; JP2002527604A; JP5172281B2; NO20011915L; US6800299B1; PL347396A1; WO2000023546A1; BR9914699A

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA EXTRAIR LIPIDOS A PARTIR DOS TECIDOS DE ANIMAIS

MARINHOS E AQUÁTICOS

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à extracção de fracções de lípido dos animais marinhos e aquáticos tais como o krill, o Calanus, os peixes e os mamíferos do mar. Mais especificamente, esta invenção relaciona-se a um método melhorado de extrair fracções do lípido pela desidratação com solventes e de recuperar um resíduo sólido rico em enzimas activas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As fracções de lípido obtidas dos animais marinhos e aquáticos tais como o krill, o Calanus, dos peixes e dos mamíferos do mar têm várias aplicações:

Aplicações médicas

Os óleos animais marinhos e aquáticos e as fracções dos mesmos contêm vários agentes terapêuticos. Por exemplo, relata-se que os vários óleos animais marinhos e aquáticos têm propriedades anti-inflamatórias. Os óleos animais marinhos e aquáticos são referidos igualmente como sendo úteis para reduzir a incidência das doenças cardiovasculares. De um modo adicional, alguns óleos animais marinhos e aquáticos são referidos quanto ao seu papel na supressão do desenvolvimento de determinados formas de lúpus e de doenças renais. Como um outro exemplo adicional, o krill pode ser usado como uma fonte de enzimas para o desbridamento das 1 úlceras e das feridas ou para facilitar a digestão dos alimentos. Os óleos marinhos e aquáticos também contêm os vários antioxidantes, que podem ter potenciais propriedades terapêuticas.

Nutraceuticos

Considerando os efeitos benéficos dos ácidos gordos omega-3, os óleos de krill, de Calanus e os peixes podiam ser usados como suplementos dietéticos para a dieta humana. Estes ácidos gordos são essenciais para o desenvolvimento apropriado do cérebro e dos olhos. Os óleos animais marinhos e aquáticos são igualmente ricos em vitaminas liposolúveis A, D e E e carotenóides

Cosméticos

Os vários óleos animais marinhos e aquáticos são usados para a produção de loções hidratantes.

Piscicultura

Entre os lipidos encontrados no krill, no Calanus e nos peixes, estão presentes concentrações elevadas de 20:5 dos ácidos gordos (ácido eicosapentanoico) e o 22:6 (ácido docosahexanoico). Estes ácidos gordos são nutrientes essenciais e são benéficos porque os peixes alimentam dos mesmos. Além disso, estes nutrientes essenciais são transferidos para a dieta humana quando se comem os peixes desenvolvidos com tais dietas.

Alimentação animal 2

As dietas de alimentação animal ricas em ácidos gordos omega-3 podem aumentar o nivel de ácidos gordos não saturados e diminuir os níveis de colesterol de carne. Esta propriedade é explorada já na indústria das aves domésticas para melhorar a qualidade dos ovos. São conhecidos vários métodos para extrair óleos animais marinhos e aquáticos. Por exemplo, conhece-se a extracção do óleo de peixes usando solventes orgânicos tais como o hexano e o álcool etílico. Igualmente é conhecida a medição do índice gordo no tecido do músculo de peixes usando solventes tais como a acetona. A Patente US n° 4 331 695 descreve um método que usa os solventes pressurizados que são gasosos à temperatura ambiente, tais como o propano, o butano ou o hexano. A extracção é executada às temperaturas preferidas de entre 15 e 80° C em vegetais em farrapos ou em produtos de origem animal finamente divididos. Os óleos extraídos são então feitos precipitar sob alta pressão e a temperaturas elevadas de entre 50 e 200° C. Entretanto, o hexano é um solvente de extracção pobre para animais marinhos tais como o krill. Além disso, as altas temperaturas usadas na etapa da precipitação alteram negativamente os lípidos. O Pedido de Patente canadiana n° 2 115 571 descreve um método para extrair óleos das várias espécies de algas castanhas e vermelhas. O método proporciona por exemplo a extracção de Soxhlet usando álcool etílico quase puro durante 40 horas. A Patente US n° 5 006 281 descreve um método para extrair o óleo dos animais marinhos e aquáticos como sejam os peixes. O animal aquático ou marinho é em primeiro lugar tratado com um 3 composto antioxidante, dividido finamente e centrifugado para separar a fase do óleo da fase aquosa e da fase continua. A fase do óleo é então mais tratada com o antioxidante para remover o odor ou o gosto indesejável. A Patente canadiana n° 1 098 900 descreve um método para extrair óleos do krill. O método envolve emulsionar o krill fresco ou descongelado em um meio aquoso. A fracção do óleo é recuperada pela centrifugação.

Folch no artigo publicado no ano de 1957 em j. biol. Chem. 226: 497-509 "A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues" propõe um método de extracção usando o clorofórmio e o metanol. Este método não é comercialmente praticável por causa da toxicidade dos solventes envolvidos.

Chem. Abs. 177859 descreve um procedimento para a extracção do corante de astaxantina, que é usado como uma forma de corar na piscicultura dos salmões, desde os desjectos de camarão ou krill, compreendendo desde a mistura do material em bruto com óleo de triglierido e a prensagem do material em bruto de modo a extrair o óleo rico em astaxantina.

No entanto, os processos de acordo com as técnicas anteriores são geralmente comercialmente impraticáveis ou fornecem baixos rendimentos quantitativos. A presente invenção proporciona um processo para extrair as fracções de lípidos totais do material animal marinho e aquático, em que o referido processo compreende as etapas de (a) colocação do material animal marinho e aquático num solvente de cetona, de preferência acetona, de modo a que se 4 consiga a extracção da fracção de lípidos solúvel do referido material animal marinho e aquático; (b) separação do teor liquido e sólido resultante da etapa (a); (c) recuperação de uma primeira fracção total rica em lipidos a partir do conteúdo liquido de b) através da evaporação do solvente presente no teor liquido; (d) colocação do referido teor sólido num solvente orgânico seleccionado de entre o grupo de solventes que consiste por álcool, de preferência etanol, isoporpanol ou t-butanol e éster de ácido acético, de preferência acetato de etilo, de modo a que se consiga a extracção da fracção de lipidos restante do referido material de animal aquático e marinho; € separação do conteúdo liquido e sólido resultante da etapa (d); e (f) recuperação de uma segunda fracção total rica em lipidos através de evaporação do solvente a partir do conteúdo liquido de e).

Deste modo, é um objecto da presente invenção proporcionar um método melhorado de extracção de óleo de animal aquático e marinho que permita a recuperação da valiosa fracção de lipidos e a recuperação separada de um valioso resíduo sólido rico em proteínas que compreende enzimas activos. A presente invenção proporciona ainda um processo para a extracção de uma fracção de lípidos total contendo astaxantina e cantaxantina de um material de animal aquático e marinho seleccionado de entre o zooplâncton e peixe, em que o referido processo compreende as etapas de (a) colocação do referido material animal num solvente de cetona, de preferência acetona de modo a conseguir uma extracção da fracção do material de lípidos solúvel do referido material de animal aquático e marinho; (b) separação dos conteúdos liquido e sólido resultantes da etapa (a); (c) recuperação de uma fracção rica em lípidos do teor líquido através de 5 evaporação do solvente presente no conteúdo líquido, pelo que se obtém uma fracção líquida total de astaxantina e cantaxantina. A presente invenção proporciona ainda um método para extrair uma fracção de lípidos total de um material de animal aquático e marinho seleccionado de entre zooplâncton e peixe, em que o referido método compreende as etapas de (a) colocação do referido material animal numa mistura de solvente compreendendo acetona e etanol de modo a conseguir uma extracção da fracção de lípidos solúvel do referido material de animal aquático e marinho; (b) separação do referido conteúdo líquido e sólido resultante da etapa (a); (c) recuperação de uma fracção rica em lípidos do conteúdo líquido através de evaporação dos solventes presentes no conteúdo líquido; pelo que se obtém a tracção total de lípidos. A presente invenção proporciona ainda um extracto total de lípidos de krill caracterizado por ser isento de solvente tóxico e por o teor carotenoide em astaxatina ser de 75 μg/g ou superior e de preferência de pelo menos cerca de 90 \\.g/g ou superior de extracto de krill, e por o teor de carotenoide em cantaxantina ser de 250 \ig/g ou superior e de preferencial ser de pelo menos cerca de 270 μg/g de krill ou superior. A presente invenção proporciona ainda um extracto de lípidos de krill caracterizado por ser comestível e por o caroetnoide na astaxantina ser de 75 μg/g ou superior e de preferência de pelo menos cerca de 90 μg/g ou superior de extracto de krill, e por o teor de carotenoide em cantaxantina ser de 250 μg/g 6 ou superior e de preferencial ser de pelo menos cerca de 270 pg/g de krill ou superior.

Outros objectos e um âmbito adicional de aplicabilidade da presente invenção tornar-se-ão aparentes a partir da descrição detalhada dada em seguida. Deve-se compreender, no entanto, que esta descrição detalhada, ao indicar formas de realização preferidas da invenção, está dada somente a titulo de ilustração, pois várias mudanças e modificações dentro do espirito e do âmbito da invenção se tornarão aparentes aos peritos na técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. cromatografia gás-liquido de ácidos seco (cloroformiometanol). Figura 2. cromatografia gás-líquido de ácidos seco (acetona) Figura 3. cromatografia gás-líquido de ácidos congelado, (acetona) Figura 4. cromatografia gás-líquido de ácidos congelado (etanol) Figura 5. cromatografia gás-líquido de ácidos congelado (t-butanol) Figura 6 cromatografia gás-líquido de ácidos congelado (etilo acetato) Figura 7. cromatografia de camadas finas de da espécie do Calanus. e no M. norvegica Figura 8. cromatografia de camadas finas de da espécie E. pacifica gordos de krill gordos de krill gordos de krill gordos de krill gordos de krill gordos de krill lípidos neutros lípidos neutros 7

Figura 9. cromatografia de camadas finas de lipidos neutros do schmitti do M. Figura 10. . cromatografia de camadas finas de lipidos neutros da espécie G. galeus

Figura 11. . cromatografia de camadas finas de lipidos neutros do Tubarão Anjo

Figura 12. cromatografia de camada fina dos fosfolipidos da espécie do Calanus. e no M. norvegica

Figura 13. cromatografia de camada fina dos fosfolipidos da espécie E. pacifica

Figura 14. cromatografia de camada fina dos fosfolipidos da espécie M. schmitti

Figura 15. cromatografia de camada fina dos fosfolipidos da espécie G.galeus

Figura 16. cromatografia de camada fina dos fosfolipidos do Tubarão Anjo

Figura 17. Influência do volume de acetona na extracção dos lipidos (E. pacifica)

Figura 18. Influência do tempo de incubação em acetona na extracção dos lipidos (E. pacifica)

Figura 19. Influência do volume de álcool etílico na extracção dos lipidos (E. pacifica)

Figura 20. Influência do tempo da incubação no álcool etílico na extracção dos lipidos (T. raschii).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA FORMA DE REALIZAÇÃO PREFERIDA

Antes de se descrever a presente invenção em detalhe, deve ser compreendido que a invenção não está limitada na sua aplicação aos detalhes do processo descritos na presente. A presente invenção pode ter outras formas de realização e ser posta em pratica de várias maneiras.

Deve igualmente ser entendido que a fraseologia ou a terminologia usadas na presente se destinam a ter a finalidade de descrição e não de limitação. 0 método da presente invenção compreende a suspensão do material marinho e aquático recentemente recolhido na acetona. Os lipidos são extraídos com uma cetona como seja a acetona.

Isto permite uma desidratação rápida do tecido animal e uma migração da fracção de lipidos para o solvente. 0 resíduo seco é um produto valioso rico em enzimas activas.

Em uma forma de realização preferida, a extracção é realizada por tratamentos sucessivos da acetona e de álcool. Os álcoois preferidos são o isopropanol, e o t-butanol. 0 álcool pode igualmente ser substituído com um éster de ácido acético tal como o acetato de etilo. 0 procedimento produz duas fracções tipadas sucessivas e um resíduo seco enriquecido com proteínas, incluindo enzimas activas. A recuperação de lipidos totais é comparável aos procedimentos de Folch e outros (1957) relatados nos antecedentes da invenção. Foi testada com krill, tecidos de Calanus, de peixe e de tubarão.

De um modo surpreendente, descobriu-se que os tratamentos sucessivos de extracção como os propostos pela presente invenção têm um rendimento melhor na extracção dos lipidos do que as extracções únicas do sistema solvente. A extracção que usa dois solventes sucessivos que começa com uma cetona tal como a acetona é especialmente vantajosa pois a acetona, de facto, desidrata o tecido animal. Ter o tecido animal na forma desidratada facilita em muito o processo da extracção 9 com o segundo solvente, com um álcool ou com um éster do ácido acético tal como o acetato de etilo.

No caso do zooplâncton tal como o krill e o Calanus e no caso dos subprodutos da separação de partes dos peixes, tais como as vísceras dos peixes, nota-se que a extracção com a acetona sozinha pode ser suficiente para permitir uma recuperação eficaz sob o ponto de vista financeiro de fracções do lípido e para a recuperação separada de um produto sólido seco rico em proteínas que inclui as enzimas activas. 0 método geral de extracção da presente invenção será descrito agora. 0 material inicial que consiste por material animal marinho e aquático recentemente colhido e preferivelmente finamente dividido é submetido à extracção de acetona, durante aproximadamente duas horas e preferivelmente de um dia para o outro. No entanto o tempo da extracção não é crítico relativamente ao rendimento da extracção dos lípidos. Para facilitar a extracção, é preferível usar partículas de menos de 5 mm de diâmetro. A extracção é conduzida preferivelmente sob uma atmosfera inerte e a uma temperatura da ordem de aproximadamente 5o C ou menos.

Preferivelmente, o começo da extracção será conduzido sob agitação e durante aproximadamente 10 a 40 minutos, preferivelmente durante 20 minutos. Embora o tempo de extracção não fosse crítico, descobriu-se que uma extracção de 2 horas com uma relação de volume de 6:1 entre a acetona e o material animal marinho e aquático é a melhor.

As fracções solubilizadas dos lípidos são separadas do material contínuo pelas técnicas padrão que incluem, por exemplo, a filtragem, a centrifugação ou a sedimentação. 10

De um modo preferencial é usada a filtragem

Após a separação pela filtragem em um filtro resistente ao solvente orgânico (metal, vidro ou papel) o residuo é lavado opcionalmente com acetona pura, preferivelmente dois volumes (volume original de material) para recuperar ainda mais lípidos. Os filtrados combinados são evaporados sob pressão reduzida. Opcionalmente podem ser usadas, a evaporação instantânea ou a secagem de pulverizador. 0 residuo de água obtido após a evaporação pode separar-se da fase de óleo (fracção 1) a baixa temperatura. 0 residuo continuo recolhido no filtro é suspenso e extraído com álcool, como seja o álcool etílico, o isopropanol, o t-butanol ou alternativamente com acetato de etilo, preferivelmente dois volumes (volume original de material). 0 filtrado é evaporado deixando uma segunda fracção de lípidos (identificados como sendo a fracção 11) . Embora o período de extracção não seja crítico, descobriu-se que um tempo de extracção de aproximadamente 30 minutos é suficiente com temperaturas abaixo de aproximadamente 5o C. A temperatura dos solventes orgânicos, a não ser que seja o t-butanol, e temperatura da amostra não são parâmetros críticos, mas é preferível seja tão baixa quanto possível. No entanto, no caso de t-butanol que é sólido à temperatura ambiente, é importante aquecê-la antes de a usar e executar imediatamente a extracção a 25° C.

Exemplos comparativos

Para comparar a eficácia do processo de extracção, foi aplicada ao krill uma técnica clássica (Folch e outros 1957) 11 que usa o clorofórmio e o metanol. Este método é a referência para a eficácia de medição do processo da extracção. Uma outra comparação foi feita com uma técnica usando o hexano como solvente de extracção. A recuperação dos lipidos foi estimada suspendendo fracções dos lipidos em volumes pequenos de seus solventes originais e medindo por gravimetria pequenas partes de amostra após a evaporação.

Para todos os exemplos fornecidos na presente, o método da presente invenção que envolve a extracção de acetona seguida pela extracção com um segundo solvente (acetato de etilo, por exemplo) deu um óleo translúcido ou que têm a aparência e as propriedades mais atractivas do que qualquer óleo obtido pela técnica clássica de Folch e outros (1957).

Para analisar a composição de lipidos, 780 μg de cada extracto foram carregadas em placas do silica-gel e fraccionadas por cromatografia fina das camadas, tlc (Bowyer e outros 1962) com os seguintes solventes. Lipidos neutros: hexano, éter de etilo, ácido acético (90: 10:1, v/v) e fosfolipidos, clorofórmio, metanol, água (80: 25:2, v/v). A composição em ácido gordo de E. pacifica foi analisada por cromatografia liquida de gás, GLC (Bowyer e outros 1962) incluindo algumas modificações à técnica original: 2h a 65° C em vez de 1 h a 80° C, de três lavagens com hexano em vez de duas e de nenhuma lavagem com água.

Para ficar livre de vestígios de solventes orgânicos, as fracções de lipidos I e II são aquecidos a aproximadamente 125° C durante aproximadamente 15 minutos sob uma atmosfera inerte. 12 A gordura foi analisada de acordo com a American Oil Chemisfs Society (AOCS) . . Os seguintes critérios foram usados para analisar os lipidos extraídos: saponificação e índices do iodo de Wijs e níveis humidade volátil da matéria. 0 índice do colesterol foi determinado igualmente pelo método de Plummer 1987. As mesmas análises e outras foram feitas por um laboratório independente sob a supervisão do Professor Robert Ackman (Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousie University, Halifax, Nova Scotia, Canada). Isto inclui o índice do iodo de Wijs, os valores do peróxido e de anisina, a composição de classe do lípido, a composição de ácido gordo FAME, do colesterol, do tocoferol, do retinol trans, do colecalciferol, da astaxantina e do cantaxantina. A tabela 1 mostra que uns níveis mais elevados de lipidos são extraídos do krill seco pela acetona seguida pelo álcool etílico em comparação com o procedimento clássico de Folch e outros (1957). A tabela 2 mostra os resultados da extracção do lípido de Euphausia pacifica congelado, uma espécie de krill do Oceano Pacífico. Partindo do princípio de um índice de oitenta por cento da água, o índice do lípido é comparável ao do krill seco segundo as indicações da tabela 1. 0 isopropanol, o t-butanol e o acetato de etilo, como solvente para a segunda extracção, dão um rendimento menos importante do que o álcool etílico, mas não é necessariamente menos eficaz na recuperação do lípido desde que o álcool etílico carregue mais impurezas do que o acetato do isopropanol, o t-butanol ou o acetato de etilo. Então, podem ser também usados como o segundo solvente após a acetona. As variações entre resultados das extracções de acetona são principalmente devidas às separações de água-óleo. Estas separações são 13 influenciadas pela quantidade de acetona residual na solução do água-óleo após a evaporação da acetona. Esta quantidade de acetona varia de uma experiência para a outra, porque o sistema da evaporação usado a uma pequena escala é menos reprodutível (na escala industrial, a etapa da evaporação será aperfeiçoada). Os solventes simples foram testados igualmente para extrair a totalidade dos lípidos do krill. Isto mostra que o acetato de etilo (taxa de extracção de 1,37 %), assim como o hexano (taxa de extracção de 0.23%) não são bons solventes, comparáveis à acetona simples (taxa de extracção de 1,86 %, e mesmo taxas de extracção maiores com um sistema eficiente da evaporação da acetona).

Uma das vantagens principais do procedimento é a remoção das bactérias dos extractos (fracção dos lípidos e material rico em proteínas sólido). Certamente, as amostras de E. pacifica incubadas em relações diferentes da acetona a 4o C por 112 dias foram inoculadas num meio de NA contendo um extracto de carne Bacto TM com 0,3 % de Bacto, 0,5 % de peptona e ágar de Bacto a 1,5 % (Difco Laboratories, Detroit, EUA) incubaram então à temperatura ambiente ou a 4o C durante 18 dias. Nenhum crescimento bacteriano significativo foi observado em uma relação de 1 volume de acetona por grama do krill. Com proporções mais elevadas de acetona (2 volumes e 5 volumes), não havia nenhum crescimento bacteriano de todo, o que significa que a acetona preserva amostras de krill. A acetona é conhecida como um agente bactericida e virai eficaz (Goodman e outros 1980). A tabela 3 mostra o rendimento dos lípidos do M. norvegica. A percentagem dos lípidos (3,67 %) é comparável à obtida com o do E. pacifica (3,11%) mostrado na tabela 2. As variações 14 podem ser atribuíveis à dieta e à época (estação) da recolha, que são diferentes para aquelas duas espécies. A tabela 4 mostra a influência da moagem na eficiência da extracção de lípidos do M. norvegica. Estas extracções foram realizadas sob circunstâncias óptimas e mostram a vantagem definitiva do procedimento sobre o método clássico (4,46 % contra 3,30 %) . Igualmente mostra que a moagem pode ser um factor importante quando a espécie é grande (4,46 % contra 3,53 %) . A tabela 5 relata na extracção do lípido de Calanus. As quantidades consideráveis de lípidos foram obtidas. Algumas variações na composição da espécie de Calanus podem explicar as variações entre as experiências 1 e 2 (8,22 % e 10,90 % do peso em fresco).

Aas tabelas 6-8 indicam a quantidade total de lípidos extraídos do tecido dos peixes. O método da presente invenção foi demonstrado na cavala, na truta e nos arenques. O método foi demonstrado em tecidos periféricos (principalmente músculos) e em vísceras. Vantajosamente, o presente método permitiria a recuperação de fracções valiosas do lípido das partes dos peixes que são desperdiçadas geralmente após a retirada dos filetes dos peixes. Aqueles tecidos dos peixes não usados depois da transformação dos peixes para o consumo humano poderiam ser armazenados na acetona, e os lípidos extraíram daí de acordo com a presente invenção mesmo se o método Folch 1957 recupera mais lípidos do que nosso método. As pequenas quantidades de lípidos da cavala (0,52 % das vísceras e 1,45 % dos tecidos) foram extraídas pelo método de Folch após uma primeira extracção com acetona e álcool etílico como descritas na presente invenção. As extracções 15 comparativas com o método descrito na presente invenção realizada paralelamente ao método de Folch na truta e nos arenques mostram a recuperação superior com os últimos. Entretanto, é notável que o método de Folch não possa ser aplicado para a recuperação dos lipidos para usos comerciais (por causa da toxicidade).

Nas tabelas de 9 a 11, são mostrados os resultados da extracção dos lipidos dos tecidos do figado do tubarão. Não há nenhuma diferença marcada nos resultados entre técnicas dentro de uma mesma espécie.

As tabelas 12 mostram algumas características da fracção I (acetona) e a fracção II (acetato do álcool ou de etilo) para o óleo do krill (E. pacifica). Primeiramente, o índice de saponificação da fracção I (130,6) indica que esta fracção contém ácidos gordos com as correntes mais longas, comparadas para a fracção II (185,7). O indice do iodo de Wijs da fracção I mostra que esta fracção contém altos índices de ácidos gordos poli insaturados. Em comparação com o azeite que tem um indice de 81,1. Explica porque a fracção I é

liquida à temperatura ambiente. É conhecido que os ácidos gordos não saturados têm um ponto de fusão inferior ao dos seus homólogos saturados. As mesmas observações são feitas para a fracção 11 que tem um indice do iodo de 127,2. A composição de ácido gordo mostrada na tabela 12 corrobora estes indices de iodo: a fracção I tem uma percentagem elevada (30,24 %) de ácidos gordos poli insaturados (pentenos + hexanos) e assim da fracção II (22, 98 %) . Finalmente, a tabela 12 mostra igualmente essa fracção I está compreendida por 10,0 % de matéria volátil e de humidade após a evaporação do solvente. Para o mesmo teste, a fracção II dá um valor de 6,8 %. Para eliminar os vestígios de solventes, é importante 16 aquecer momentaneamente (a aproximadamente 125° C durante aproximadamente 15 minutos) o óleo sob o nitrogénio.

Os resultados nos óleos de krill obtidos de acordo com o método da presente invenção (fracção I extraída com a acetona e fracção II extraída com acetato de etilo) são fornecidos nas tabelas 12, 13, 14, 15, 16 e 17. É de destacar que na tabela 17, o índice dos carotenóides era significativamente elevado como medido nos termos de dois carotenóides, nomeadamente da astaxantina e da cantaxantina. De facto, os duplicados analisam valores revelados de 92 a 124 μg/g da fracção do lípido para o astaxantina e os 262 a 734 μg/g para a cantaxantina. Assim, a fim de que a presente invenção possa ser referenciada como em que o extracto de krill compreende μg/g do astaxantina pelo menos 75 e preferivelmente pelo menos 90 da fracção do lípido. No caso do cantaxantina, pelo menos 250 e preferivelmente em menos 270 μg/g da fracção do lípido. Os baixos valores para o peróxido e a anisina são vantajosos e são devidos à presença de altos níveis de antioxidantes naturais (astaxantina e cantaxantina) . Estes compostos são indicativos de propriedades farmacêuticas ou cosméticas favoráveis do extracto de krill por meio de que os altos níveis dos carotenóides indicam características transdérmicas excelentes da migração. Assim, o extracto do krill é um bom candidato à administração transdérmica dos medicamentos. A tabela 18 mostra a melhor forma de realização do método de acordo com a presente invenção para a extracção dos lípidos de tecidos animais aquáticos. 17 A tabela 19 mostra que a actividade de enzima da fracção sólida é mantida depois do método de acordo com a presente invenção. De facto, a demonstração foi terminada para o resíduo sólido de krill obtido após a extracção sucessiva do acetato da acetona e de etilo. As actividades proteolitícas eram medida pela libertação dos grupos aminados através do ensaio espectrofotometrico usando o o-ftaldialdeido como reagente. As concentrações da proteína foram medidas pelo método de Bradford. As proteínas solúveis foram extraídas com água e adicionadas a um concentrado de proteína do soro do leite a 10 % obtido pelo ultra filtragem. No fim da incubação a 37°C no tampão de fosfato do potássio de 50 mM, o ácido tricloro-acético foi adicionado e a quantidade de grupo NH3 foi medida como sobrernadante de acordo com o método de Church e outros [1983, J Dairy Sei 66:1219 - 1227].

As figuras de 1 a 6 mostram cromatogramas da composição de ácido gordo de lípidos do E. pacifica. Em cada um delas, elevadas proporções de 20:5 e de 22:6 de ácidos gordos (característicos de óleos marinhos e aquáticos) são visíveis e representadas por dois picos distintos.

As variações em testes padrões dos lípidos de lípidos neutros (da figura 7 à figurell) de uma espécie para a outra são atribuíveis às diferenças nas fontes de alimentação. Dentro de uma espécie (E. pacifica, por exemplo) não há nenhuma variação marcada entre os testes padrões dos lípidos obtidos através das técnicas diferentes de extracção dos lípidos. A respeito dos fosfolípidos (da figura 12 à figura 16), o oposto é observado: as variações são explicadas pelos processos diferentes da extracção de lípidos desde que as mesmas espécies não conduzam ao mesmo teste padrão do lípido. Os lípidos das espécies do tubarão (extraídas pelos métodos 18 mencionados) e do óleo de fígado de bacalhau comercial (amostra disponível das drograrias Uniprix, da província de Québec, Canadá) são compostas principalmente por lípidos neutros ao contrário dos fosfolípidos. A influência do volume de solvente e do tempo da incubação na eficiência da acetona a extrair lípidos do E. pacifica é ilustrada nas figuras 17 e 18, respectivamente. Uma relação do 1:6 (w/v) produziu o rendimento óptimo com extracção completa próxima após 2h. A segunda etapa da extracção foi experimentada com o álcool etílico. 0 volume deste solvente não parece ser crítico pois o mesmo rendimento foi obtido com volumes diferentes de álcool etílico (figura 19), mas o tempo das incubação no álcool etílico deve ser de pelo menos 30 minutos como indicado pelos resultados da figura 20.

Um dos inventores, Dr. Adrien Beaudoin, ingeriu as fracções diferentes dos lípidos do krill. Nenhum perfil de efeitos secundários foi observado.

Muito embora a invenção tenha sido acima descrita em relação a uma forma específica, será evidente a um perito na técnica que pode ser modificada e refinada em várias maneiras. Deseja-se deste modo deixar esclarecido que a presente invenção não deve ser limitada em termos de âmbito, a não ser que pelos termos das reivindicações que se seguem.

Foi feita a demonstração que o resíduo de krill, obtido após a extracção do acetato de acetona e etilo, contém actividades enzimeproteoliticas. As actividades proteoliticas foram medidas pela libertação dos grupos aminados pelo ensaio espectrofotometrico usando o ftaldialdeido como reagente. As 19 concentrações das proteínas foram medidas pelo método de Bradford. A fonte de enzimas era o resíduo obtido após as extracções do acetato da acetona e de etilo dos lípidos. As proteínas solúveis foram extraídas com água e adicionadas a um concentrado de proteína do soro do leite de 10 % obtido pelo ultra filtragem.

No fim da incubação a 37° C no tampão de fosfato do potássio de 50 mM, o ácido tricloroacético foi adicionado e a quantidade dos grupos de NH3 foi medida no sobrenadante, de acordo com Church e outros 1983.

BIBLIOGRAFIA

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Calanus) de 1'Estuaire et du Golfe du Saint-Laurent". Sargent, J.R. 1997. "Fish oils and human diet". Br J Nutr.78 Suppl 1: S5-S13. TABELA 1. EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS DE KRILL SECO (E. pacifica) Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) Média (%) ± d. p. 1 - acetona a) 8,00 etanol b| 7,60 15,60 2 - 19,70 6,90 26,60 3 - 8,15 11,20 19, 35 4 - 6,80 13,60 20, 40 20,49 ± 3,95 5 - Clor: MeOH c| 15,50 6 - " 14, 90 15,20 ± 0,30 Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), sem incubação b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:4 (p/v), incubado durante 1 noite a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) Folch e outros 1957 TABELA 2 . EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS DE pacifica) KRILL CONGELADO (E. Exp. . No Técnica Rendimento (%) Total (% ) Média (%) ± d. p. 1 - acetona a| 1,17 etanol 1,23 2,40 2 - " 3,05 1,09 4,14 3 - - 1,53 1,26 2,79 3,11 ± 0,91 4 - acetona a) 2, 45 isopropanol b| 0,70 3,15 5 - " 1,80 0,80 2,60 6 - - 1,60 0,80 2,40 2,72 ± 0,39 7 _ acetona al 2,15 22 t-butanol 0,47 8 - " 2,11 0,40 9 - " 2,37 0, 45 10 - acetona al 2,28 acetato de etilo b) 0,21 11 - " 1,09 0,16 12 - " 2,54 0,09 13 - acetona e etanol combinados dl 14 - 15 - 16 - acetato de etilo e) 17 - 18 - 19 - hexano e 20 -21 - 22 - Clor: MeOH 23 - 24 - 2,62 2,51 2,82 2.49 1.25 2,63 3,28 3,02 3.25 1,32 1.49 1,31 0,31 0,180,20 2,37 2,07 2,62 2,65 ± 0,16 2,12 ± 0, 76 3,18 ± 0,14 1,37 ± 0,10 0,23 ± 0,07 2,35 ± 0,28

Determinações em triplicado (variação < 5 %) (p/v), incubado (p/v), incubado (p/v), incubado de 1:5:5 (p/v), (p/v), incubado

al : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 durante 2 horas a 4o C bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:2 durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. cl : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:2 durante 30 minutos a 25° C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. dl Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol incubado durante 2 horas a 4° C. el Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 durante 2 horas a 4o C £) Folch e outros 1957 23 TABELA 3. EXTRACÇAO DE LIPIDOS DE KRILL CONGELADOS (M. norvegica) Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (% ) Média (%) ± d.p. 1 -2 -3 - acetona â etanol b| ’ 1,82 1, 82 3,64 1,15 2,35 3,50 1,68 2,19 3,87 3,67 ± 0,15 Determinações em triplicado (variação < 5 %) al : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 1 noite a 4o C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:4 (p/v), incubado durante 1 hora a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. TABELA 4. INFLUÊNCIA DA MOAGEM NA EXTRACÇÃO DE LIPIDOS DE KRILL CONGELADOS (M. norvegica) Exp. No Técnica ? ? ? ? Total (%) 1 - acetona a) sim 3,10 etanol b) 1,07 4,17 2 - " não 2,14 1,39 3,53 3 - " sim 3,32 1,14 4, 46 4 - chlor: MeOHc) sim 3,30 5 - “ sim 3,26

Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) Folch e outros 1957 TABELA 5. EXTRACÇAO DE LIPIDOS DE Calanus CONGELADOS (Calanus sip. )

Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) Média (%) ± d.p. 1 - acetona al 6,18 24 2 etanol bl 2,04 8,22 " 8,64 2,26 10,90

Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 1 noite a 4o C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:4 (p/v), incubado durante 1 hora a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona.

TABELA 6. EXTRACÇAO DE LIPIDOS DE PEIXE FRESCO (Mackerel)

Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) 1 - víscera acetona 1 2 6,11 de peixe 1 etanol 3 4 0,59 6,70 2 - tecidos " 3,78 de peixe 1 0,91 4,69 3 - víscera " 10,46 de peixe 2 0,57 11,03 4 - tecidos " 6,65 de peixe 2 1,41 8,06 5 - víscera 8,39 de peixe 3 0,66 9,05 6 - tecidos " 5,27 de peixe 3 0,97 6,24 7 - víscera " 8,47 de peixe 4 0,69 9,16 8 - tecidos " 8,40 de peixe 4 1,02 9, 42 9 - víscera chlor: MeOH 0,52 de peixe 1 10 -tecidos 1, 45 de peixe 1 25 1

Determinações em triplicado (variação < 5 %) 2 : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), tempo de incubação: vísceras de peixe 1: 4 horas, tecido de peixe 1: 23 horas - vísceras de peixe 2: 23 horas e 45 minutos, tecido de peixe 2: 45 horas e 30 minutos - vísceras de peixe 3: 8 dias 22 horas e 30 minutos, tecido de peixe 3: 17 dias 23 horas - tecido de peixe 4: 18 dias 2 horas e 25 minutos 3 : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:4 (p/v), incubado durante 1 hora a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. 4

Folch e outros 1957, a seguir a uma primeira extracção com acetona, seguida de etanol TABELA 7. EXTRACÇÃO DE LIPIDOS DE PEIXE FRESCO (Truta) Exp. No Técnica Rendimento (%) ) Total (%) 1 - víscera acetona a) 34, 70 etanol b) 2,17 36,88 2 - tecidos " 5,53 1,17 6,70 3 - víscera chlor: MeOHc ) 39,81 4 - tecidos " 14, 93 Determinações em triplicado (variação < 5 %) a : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 1 noite a 4o C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:4 (p/v), incubado durante 1 hora a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) Folch e outros 1957

TABELA 8. EXTRACÇAO DE LIPIDOS DE PEIXE FRESCO

Arenque

Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) 1 - tecidos acetona al 2,09 e víscera etanol b| 0,68 2, 77 2 - tecidos chlor: MeOHc| 5,95 e víscera

Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 1 noite a 4o C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:4 (p/v), incubado durante 1 hora a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) Folch e outros 1957

TABELA 9. EXTRACÇAO DE LIPIDOS DE FÍGADO DE TUBARÃO FRESCO (M. schmitti) Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) 1 - acetona a) 36,39 acetato de etilo b| CO 40,87 2 - acetato de etilo c) 36,68 3 - chlor: MeOHd| 41,86 Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 26 1:9 (ρ/ν), incubado durante 2 horas a 4o C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c| : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. d) Folch e outros 1957 uma primeira extracção com acetona. c| : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. d| Folch e outros 1957 TABELA 10. EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS DE FÍGADO DE TUBARÃO FRESCO (_G. galeus) Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) 1 - acetona a) 21,39 acetato de etilo bl 5.27 26,66 2 - acetato de etilo c) 25,89 3 - chlor: MeOHd) 29,99 Determinações em triplicado (variação < 5 %) a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4° C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de ! L: 2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4° C. d) Folch e outros 1957 TABELA 11. EXTRACÇÃO DE LÍPIDOS DE FÍGADO DE TUBARÃO FRESCO ( Tubarão Anjo) Exp. No Técnica Rendimento (%) Total (%) 1 - acetona a) 19,23 acetato de etilo b) 8,98 28,21 2 - acetato de etilo c) 39,22 3 - chlor: MeOHdl 39,23

Determinações em triplicado (variação < 5 %) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. c) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:9 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. d) Folch e outros 1957 27 TABELA 12. CARACTERISTICAS DO OLEO DE KRILL (M. pacifica) índice de saponificação

Laboratório Manual b independente

Fracção I c) 130,6 — — Fracção II dl 185, 7 — — Azeite 192,0 e) — 189,7 índice de iodo de Wijs Fracção I cl 185,2 172, 5 — Fracção II d) 127, 2 139, 2 — Azeite 85,3 el — 81,1 Conteúdo de colesterol (%) Fracção I c| 2,1 1,9 — Fracção II dl 3,7 3,0 — Azeite 0,2 el — — Materiais voláteis e níveis de humidade (%) Fracção I c) 10,0 — — Fracção II dl 6,8 — — Valor de peróxido (meq peróxido/ quilo de óleo) Fracção I c) — 0,0 — Fracção II dl — 0,0 — Valor de p-Anisidina (g-1 de absorção) Fracção I cl — 0,1 — Fracção II dl — 5,5 — Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano de Tecnologia da Pesca, Halifax, Nova Escócia. a) : Extracção feita com uma re lação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4° C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona < b o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. e) : Azeite extra virgem frio comprimido de Bertolli ™ TABELA 13. COMPOSIÇÃO DA CLASSE DE LÍPIDOS DO ÓLEO D (ÁREA %) (E. pacifica) Trigiceridos Fracção I a) 19,0 ± 0,7 Fracção II b| 66,5 ± 2,3 Hidrocarbonetos Fracção I a) traços Fracção II b) 1,3 ± 0,1 ácidos sem gordura

KRILL 28

Fracção I a) Fracção II b) Monoglicéridos 23,7 ± 1, 1 20,3 ± 0,3 Fracção I a) 1,4 ± 0,3 Fracção II bl 0,5 ± 0,1 Fosfolípidos ou outro material polar Fracção I a) 54, 1 ± 6, 1 Fracção II b) 8,5 ± 1,6

Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano de Tecnologia da Pesca, _Halifax, Nova Escócia. al : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. TABELA 14. COMPOSIÇÃO DE DE KRILL (P/P/%) ÁCIDOS GORDOS (E. pacifica) DE ÓLEO Ácidos Gordos Fracção I a) Fracção II b) 12 : 0 0, 0 0,1 13 : 0 0, 2 0,1 ISO 14 : 0 0,4 0, 6 14 : 0 4,2 7,6 ISO 15 : 0 0, 5 0,7 ANT 15 : 0 0, 2 0,2 15 : 0 0, 6 1,0 ISO 16 : 0 0, 2 0,3 ANT 16 : 0 0,2 0,2 16 : 0 14,1 21, 6 7MH 0, 6 0, 9 ANT 17 : 0 0,1 0,3 17 : 0 2, 8 3,7 18 : 0 1,0 1,6 20 : 0 0,1 0,3 Saturados 25, 2 39, 2 14 : 1 0,4 0,5 15 : 1 0,1 0,2 29 16 : 1 n-7 6, 6 7,8 16 : 1 n-5 0, 6 0,2 17 : 1 0, 6 0,7 18 1 n-9 8, 0 9, 8 18 1 n-7 4,2 5, 6 18 1 n-5 0,1 0,1 20 1 n-9 0, 3 0,4 20 1 n-7 0, 3 0,4 20 1 n-5 0, 3 0,4 1 n- 11 + 13 0,1 0,2 monoenos 21, 6 26,3 16 2 n-6 0, 6 1,2 16 2 n-4 1,3 1,3 18 2 n-7 0,1 0,2 18 2 n-6 2, 0 1,8 18 2 n-4 0,1 0,1 20 2 MID 0, 2 0,2 20 2 n-6 0,1 0,1 dienos 4,4 4, 9 16 3 n-4 1,4 1,2 18 3 n-6 0,4 0,3 18 3 n-4 0, 2 0,2 18 3 n-3 3, 2 3, 0 18 3 n-1 0,1 0,1 20 3 n-3 0,1 0,1 trienos 5,4 4, 9 16 4 n-3 0, 9 0,7 16 4 n-1 - i,o 0, 8 18 4 n-3 9,2 7,4 18 4 n-1 0,1 0, 0 20 4 n-6 0,7 0,5 20 4 n-3 0,7 0,3 30 tetraenos 12, 6 9,7 20 : 5 n-3 17, 4 8, 6 21 : 5 n-3 0,7 0,5 22 : 5 n-6 0, 2 0,1 22 : 5 n-3 0, 5 0,3 pentenos 18, 8 9,5 22 : 6 n-3 hexenos 13, 2 6,6 valor de iodo 214,8 145,1 calculado Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano de Tecnologia da Pesca, _Halifax, Nova Escócia. a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. b) : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. TABELA 15. ESTRUTURA DE ÁCIDOS GORDOS LIVRES DE LÍPIDOS DE KRILL (P/P %) (E. pacifica) Ácidos Gordos Fracção I a) Fracção II b) 12 : 0 0, 5 0,1 13 : 0 0, 2 0, 0 ISO 14 : 0 0, 2 0,2 14 : 0 1,3 2, 6 ISO 15 : 0 0, 3 0,3 ANT 15 : 0 0,1 0,1 15 : 0 0, 2 0,5 ISO 16 : 0 0,1 0,2 ANT 16 : 0 0, 2 0,1 16 : 0 3, 3 10, 6 7MH 0, 6 0, 8 ANT 17 : 0 0, 2 0,2 Fitanico 0, 2 0, 0 17 : 0 0, 5 0, 8 18 : 0 0,2 0,6 31 16 : 22 16 : 18 : 20 : 0 0, 3 0,2 22 : 0 0, 0 0,1 Saturados 8,4 17, 4 14 : 1 0, 2 0,2 15 : 1 0, 2 0,1 16 : 1 n-9 0, 5 0,0 16 : 1 n-7 5, 2 6,8 1 η- 5 + 117 : 0 0,1 0,1 17 : 1 0, 6 0,7 18 : 1 n-9 7,0 11, 4 18 : 1 n-7 4, 9 9,3 18 : 1 n-5 0,1 0,3 20 : 1 n-11 0, 2 0,3 20 : 1 n-9 0,1 0,3 : 1 n- 11 + 13 0,1 0,2 24 : 1 n-9 0, 0 0,1 monoenos 19, 2 29, 8 16 : 2 n-6 0,4 0, 9 16 : 2 n-4 1,2 1,0 18 : 2 n-7 0,1 0,2 18 : 2 n-6 2,4 2, 6 18 : 2 n-4 0,1 0,1 20 : 2 n-6 0,1 0,1 dienos 4,3 4, 9 3 n- 4 + 117 : 1 1,4 0, 9 3 n- -3 + 1 18 : 0 0, 2 0,5 18 : 3 n-6 0,4 0,3 18 : 3 n-4 0,1 0,1 18 : 3 n-3 3,3 3,4 18 : 3 n-1 0,1 0,1 20 : 3 n-6 0,1 0,1 20 : 3 n-3 0,1 0,2 32 trienos 5,7 5, 6 16 : 4 n-3 0, 6 0,3 16 : 4 n-1 -1,0 0, 6 18 : 4 n-3 9, 8 6,2 18 : 4 n-1 0,1 0,1 20 : 4 n-6 1,7 1,4 20 : 4 n-3 0, 6 0,5 22 : 4 n-3 0, 3 0,3 tetraenos 14, 1 9, 4 18 : 5 n-3 0, 2 0,1 20 : 5 n-3 26, 4 17, 4 21 : 5 n-3 0, 9 0, 6 22 : 5 n-6 0, 0 0,1 22 : 5 n-3 0,7 0,5 pentenos 28, 2 18, 7 22 : 6 n-3 20, 5 14, 4 hexenos 20,5 14, 4 valor de iodo 291,6 220,3 calculado Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano _Halifax, Nova Escócia. a| : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente durante 2 horas a 4o C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção de Tecnologia da Pesca, de 1:6 (p/v), incubado o etanol de 1:2 (p/v), com acetona. TABELA 16 CONTEÚDO DE TOCOFEROL, TRANSRETINOL E COLECALOIFEROL EM OLEO DE KRILL (E. Pacifica) alfa-locoferol por fracção Ia J HPLC 0, 01 (IU) Fracção IIb) o, 83

Gama - tocoferol por HPLC (pg/g)

Fracção Ia) Tr 33

Fracção IIb) Tr

Delta - tocoferol por HPLC (\iq/q)

Fracção Ia) N.D.

Fracção IIb) N.D. transretinol por HPLC (IU)

Fracção Ia) 395, 57

Fracção IIb) 440, 47

Colecalciferol por HPLC (IU)

Fracção Ia) N.D.

Fracção IIb) N.D.

Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano de Tecnologia da Pesca, _Halifax, Nova Escócia. a) : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4o C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. TR = vestígios N.D. = não detectado

Conversão: vitamina de óleo de alfa-tocoferol mg/g * 1,36 = Unidade Internacional transretinol μg/g + 0,3 = Unidade Internacional TABELA 17 CONTEÚDO DE ASTAXANTINA E DE CANTAXANTINA DE OLEO DE KRILL (E. pacifica)

Astaxantina (μq/q óleo)

Fracção Ia) 93,1

Fracção llb) 121,7

Cantaxantina (μq/q óleo)

Fracção Ia) 270,4

Fracção IIb) 733,0

Dados do Laboratório do Professor Robert Ackman, Instituto Canadiano de Tecnologia da Pesca, _Halifax, Nova Escócia. al : Extracção feita com uma relação entre a amostra e o solvente de 1:6 (p/v), incubado durante 2 horas a 4° C. bl : Extracção feita com uma relação entre a amostra, a acetona e o etanol de 1:2 (p/v), incubado durante 30 minutos a 4o C, a seguir a uma primeira extracção com acetona. 34 TABELA 18. CONDIÇÕES ÓPTIMAS PARA A EXTRAÇÃO DE TECIDOS DE ANIMAIS AQUÁTICOS (procedimento sugerido)

Etapa Condiçoes Mogem (se partículas > 5 mm) 4°C Extracção de lípidos relação amostra-acetona de 1 : 6 (p/v) 2h (incluindo agitação durante 20 min) 4o C Filtragem Filtro resistente ao solvente orgânico sob pressão reduzida Lavagem Relação amostra-acetona de 1 : 2 (p/v) de acetona pura e fria Filtragem Filtro resistente ao solvente orgânico sob pressão reduzida Evaporação Sob pressão reduzida Separação de óleo-água o o Extracção de lípidos Relação de amostra : acetato de etilo de 1 : 2 (p/v)a) Filtragem Filtro resistente ao solvente orgânico sob pressão reduzida Evaporação Sob pressão reduzida a) o etanol pode ser substituído por isopropanol, t-butanol ou acetato de etilo b) 25° C quando se usa t-butanol TABELA 19. ACTIVIDADE PROTEOLITICA DOS RESÍDUOS DE KRILL USANDO SORO DO LEITE COMO SUBSTRACTO NA 37° C, PH 7,0 PARA UMA RELAÇÃO ENTRE ENZIMA E SUBSTRACTO DE 1 : 43

Tempo (min) Amino ácidos libertados (jjmoles) Taxa enzimática (fimoles/min) Actividade especifica Enzima 15 28, 76 (|jmoles/min /mg*) 1, 917 0,164 30 43, 74 0, 999 0,125 170 98,51 0,322 0,050 255 177,26 0,308 0,060 * quantidade total de enzimas no meio de hidrólise 35

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para a extracção de fracções totais de lípidos dos materiais animais marinhos e aquáticos, em que o referido processo compreende as etapas de (a) colocação do material marinho e aquático num solvente de cetona, de preferência acetona de modo a conseguir a extracção da fracção de lipidos solúvel do referido material animal marinho e aquático; (b) separação dos conteúdos liquido e sólido resultantes da etapa (a); (c) recuperação de uma primeira fracção total rica em lipidos do conteúdo liquido de b) através de evaporação do solvente presente no conteúdo liquido; (d) colocação do referido conteúdo sólido num solvente orgânico seleccionado de entre o grupo de solventes que consiste por álcool, de preferência etanol, isopropanol ou t-butanol, e esteres de ácido acético, de preferência acetato de etilo, de modo a conseguir obter a extracção da fracção de lipidos solúvel restante a partir do referido material marinho e aquático; (e) separação dos conteúdos liquido e sólido resultantes da etapa (d); e (f) recuperação de uma segunda fracção total rica em lipidos através de evaporação do solvente a partir do conteúdo liquido de e). 1
2. Um processo de acordo com a Reivindicação 1, em que a extracção da etapa (a) é realizada sob agitação após o material animal ter sido moido.
3. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 e 2, em que a extracção da etapa (d) é levada a cabo sob agitação após o material animal ter sido moido.
4. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 3, em que as etapas (a) e (d) são realizadas sob uma atmosfera inerte.
5. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 4, em que as etapas (b) e (e) são efectuadas através de técnicas seleccionadas entre a filtragem, a centrifugação e a sedimentação.
6. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 5, em que as etapas (c) e (f) são efectuadas através de técnicas seleccionadas de entre a evaporação sob uma pressão reduzida, a evaporação por expansão e a secagem por pulverização.
7. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 6, em que após a etapa (b) e antes da etapa (c) o processo ainda compreendia a etapa de intervenção de lavagem do conteúdo sólido com o solvente e a adição da solução de lavagem resultante ao conteúdo liquido da etapa (b).
8. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, em que após a etapa (e) e antes da etapa (f), o processo compreende ainda a etapa de intervenção de lavagem do conteúdo sólido com o solvente orgânico seleccionado na etapa (d). 2
9. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 8, em que antes da etapa (a) o material animal aquático e marinho se encontra dividido em partes muito finas, de preferência com um tamanho médio de película de 5mm ou menos.
10. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9, em que o solvente orgânico é seleccionado de entre o grupo de solventes que consiste por etanol ou por isopropanol e esteres de ácido acético, de preferência de acetato de etilo e em que o referido processo é realizado a uma temperatura igual ou inferior a 5o C.
11. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10, em que o referido animal marinho e aquático é zooplâncton.
12. Um processo de acordo com a Reivindicação 11, em que o referido zooplâncton é krill.
13. Um processo de acordo com a Reivindicação 11, em que o referido zooplâncton é Calanus.
14. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 10, em que o referido animal marinho e aquático é peixe.
15. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 9, em que o solvente orgânico é t-butanol e em que o referido processo é realizado a uma temperatura de 25° C.
16. Um processo para extrair uma fracção de lípidos total contendo astaxantina e cantaxantina a partir de um material animal marinho e aquático seleccionado a partir de 3 zooplâncton e peixe, em que o referido processo compreende as etapas de: (a) colocação do referido material animal num solvente de cetona, de preferência acetona de modo a conseguir a extracção da fracção de lipidos solúvel do referido material animal marinho e aquático; (b) separação dos conteúdos liquido e sólido resultantes da etapa (a); (c) recuperação de uma primeira fracção total rica em lipidos do conteúdo liquido através de evaporação do solvente presente no conteúdo liquido; em que uma fracção total de lipidos contendo astaxantina e cantaxantina é obtida
17. Um processo para a extracção de uma fracção de lipidos total de um material animal marinho e aquático seleccionado de entre zooplâncton e peixe, em que o referido processo compreende as etapas de: (a) colocação do referido material animal numa mistura de solvente compreendendo acetona e etanol de modo a conseguir obter uma extracção da fracção de lipidos solúvel a partir do referido material animal marinho e aquático; (b) separação dos conteúdos liquido e sólido resultantes da etapa (a); (c) recuperação de uma primeira fracção total rica em lipidos do conteúdo líquido através de evaporação do solvente presente no conteúdo líquido; em que uma fracção total de lipidos é obtida.
18. Um processo de acordo com a Reivindicação 16 ou com a Reivindicação 17, em que o material animal é krill.
19. Um processo de acordo com a Reivindicação 16 ou com a Reivindicação 18, em que o material animal é Calanus.
20. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 19, em que a extracção da etapa (a) é realizada sob agitação após o material animal ter sido moido.
21. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 20, em que a etapa (a) é realizada sob uma atmosfera inerte.
22. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 21, em que a etapa (b) é efectuada através de uma técnica seleccionada entre a filtragem, a centrifugação e a sedimentação.
23. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 22, em que a etapa (c) é efectuada através de uma técnica seleccionada de entre a evaporação sob vácuo, a evaporação por expansão e a secagem por pulverização.
24. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 23, em que após a etapa (b) e antes da etapa (c) o processo ainda compreende a etapa de lavagem do referido conteúdo sólido com um solvente e a adição da solução de lavagem resultante ao conteúdo liquido da etapa (b) .
25. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 24, em que antes da etapa (a) o material o material animal marinho e aquático é dividido de um modo fino, de 5 preferência até uma tamanho médio de partículas igual ou inferior a 5mm.
26. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 16 a 25, em que o referido processo é realizado a uma temperatura igual ou inferior a 5o C.
27. Um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 26, em que os conteúdos sólidos resultantes são recuperados e consistem por um resíduo desidratado contendo enzimas activas.
28. Um extracto de lípidos total de krill caracterizado por estar isento de solvente tóxico e por o conteúdo de carotenoide na astaxantina ser de 75 \iq/q ou de um modo preferencial de pelo menos cerca de 90 μg/g ou mais de extracto de krill, e o conteúdo de carotenoide na cantaxantina ser de 250 μg/g ou mais, e de preferência de pelo menos cerca de 270 μg/g de extracto de krill ou mais.
29. Um extracto de lípido de acordo com a Reivindicação 28, que pode ser obtido a partir de um animal aquático ou marinho através de um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 27.
30. O uso de um extracto de lípidos de krill de acordo com as Reivindicações 28 ou 29, numa aplicação seleccionada de entre o grupo que consiste por aplicações de nutracêuticos, de cosméticos, de piscicultura e de alimentação de animais.
31. O uso de um extracto de lípidos de krill de acordo com as Reivindicações 28 ou 29, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença seleccionada de entre o 6 grupo que consiste por uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, lúpus e uma doença renal.
32. Um extracto de lipidos de krill caracterizado pelo facto de ser comestível e por o conteúdo de carotenoide na astaxantina ser de 75 μq/g ou de um modo preferencial de pelo menos cerca de 90 μg/g ou mais de extracto de krill, e o conteúdo de carotenoide na cantaxantina ser de 250 μg/g ou mais, e de preferência de pelo menos cerca de 270 μg/g de extracto de krill ou mais.
33. Um extracto de lípido de krill de acordo com a Reivindicação 32, que pode ser obtido a partir de um animal aquático ou marinho através de um processo de acordo com qualquer uma das Reivindicações de 1 a 27.
34. O uso de um extracto de lipidos de krill de acordo com as Reivindicações 32 ou 33, numa aplicação seleccionada de entre o grupo que consiste por aplicações de nutracêuticos, de cosméticos, de piscicultura e de alimentação de animais.
35. O uso de um extracto de lipidos de krill de acordo com as Reivindicações 32 ou 33, para o fabrico de um medicamento destinado ao tratamento de uma doença seleccionada de entre o grupo que consiste por uma doença inflamatória, uma doença cardiovascular, lúpus e uma doença renal. 7 'H'mtmMi«|iiiipiiynnn>in«>itn(ya^itvmtnn>ijwnfMiyiii>vimin>inpn^ni ΙΟ 20 30 40 50 00 70 MR ~£ã$rWdi'-l 1,263 1.455 - 12:0 i.m UI2i.ms 2,056 2,173 3,331 ~ *4:0 2.505 2,5« ~ 14:1 2,032 2.002 3,855 3,078 ~ std 15:0 3.303 3.588 3.630 4.178 - 16:0 4.521 * 1.8: i 4.664 4.881 - ifeltr 51215.4265,570 6.03?6.8626.6717,235 7.985 » 18:0 6.439 - 16:1 8.640 “ l&ltr 9,544 9.801 * 1.6:2 18.491 1Ú. 525 11.042 li.837 12.145 - 10:3 15.620 - 30:0 16.482 - 20:1 17,017 18.34482.608 24.103 28.,.247 28.28?31.295 40,655 49,721 58...373 82.225 £0:!{ci$ll) 20-:¾

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