PL201771B1

PL201771B1 - Sposób ekstrahowania frakcji lipidowych z materiału ze zwierząt morskich i wodnych, ekstrakt lipidowy kryla oraz zastosowanie ekstraktu lipidowego

Info

Publication number: PL201771B1
Application number: PL347396A
Authority: PL
Inventors: Adrien Beaudoin; GENEVIőVE MARTIN
Original assignee: Univ Sherbrooke
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2009-05-29
Also published as: JP2002527604A; CN1269940C; NO20011915L; NO20011915D0; DK1123368T3; DE69938504T2; JP2008150586A; US6800299B1; UA75029C2; CA2251265A1; AU765464B2; ATE391763T1; BR9914699B1; WO2000023546A1; CN1324394A; AU6455299A; RU2236441C2; ZA200103235B; JP4181305B2; EP1123368A1

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu ekstrakcji frak- cji lipidowych z materia lu ze zwierz at morskich i wodnych, przez ekstrakcj e rozpuszczalnikiem ketonowym, korzystnie acetonem. Otrzyman a nierozpuszczaln a i rozdrobnion a frakcj e podda- je si e korzystnie dodatkowej ekstrakcji rozpusz- czalnikiem, z u zyciem alkoholu, korzystnie eta- nolu, izopropanolu lub tert-butanolu albo estru kwasu octowego, korzystnie octanu etylu, aby osi agnac ekstrakcje pozosta lej rozpuszczalnej frakcji lipidowej z materia lu ze zwierz ecia mor- skiego i wodnego. Pozosta la nierozpuszczaln a rozdrobnion a zawarto sc sta la odzyskuje si e tak ze, poniewa z jest ona bogata w bia lka i za- wiera u zyteczn a ilo sc aktywnych enzymów. W zakres wynalazku wchodzi tak ze ekstrakt lipidowy kryla oraz zastosowanie ekstraktu lipi- dowego do wytwarzania produktu do stosowa- nia lekarskiego, kosmetycznego, od zywkowe- go, do hodowli ryb i karmienia zwierz at. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobu ekstrahowania frakcji lipidowych z materiału ze zwierząt morskich i wodnych, ekstraktu lipidowego kryla oraz zastosowania ekstraktu lipidowego. Zgodnie z wynalazkiem dokonuje się ekstrakcji frakcji lipidowych ze zwierząt morskich i wodnych, takich jak kryl, Calanus, ryba oraz zwierzęta morskie. Konkretniej, wynalazek ten odnosi się do sposobu ekstrakcji frakcji lipidowych przez odwodnienie z użyciem rozpuszczalników oraz odzyskaniu części stałych bogatych w aktywne enzymy.

Frakcje lipidowe otrzymywane ze zwierząt morskich i wodnych, takich jak kryl, Calanus, ryba oraz zwierzęta morskie, mają różne zastosowania:

Zastosowania medyczne

Oleje ze zwierząt morskich i wodnych, oraz ich frakcje zawierają różne czynniki terapeutyczne. Przykładowo opisuje się, że różne oleje ze zwierząt morskich i wodnych mają właściwości przeciwzapalne. Oleje ze zwierząt morskich i wodnych opisuje się także jako pomocne przy redukowaniu występowania choroby sercowo-naczyniowej. Donosi się także, że niektóre oleje ze zwierząt morskich i wodnych hamują rozwój pewnych form tocznia i chorób nerek. Jako dodatkowy przykład, kryl moż e być stosowany jako źródło enzymów niszczących wrzody i rany lub ułatwiających trawienie pokarmów. Oleje ze zwierząt morskich i wodnych zawierają także różne antyoksydanty, które mogą mieć potencjalne właściwości terapeutyczne.

Środki odżywcze

Biorąc pod uwagę korzystny wpływ kwasów omega-3, oleje z kryla, Calanus i ryby można by stosować jako środki dietetyczne uzupełniające dietę człowieka. Te kwasy tłuszczowe są zasadnicze dla prawidłowego rozwoju mózgu i oka. Oleje ze zwierząt morskich i wodnych są także bogate w rozpuszczalne w tłuszczach witaminy A, D i E oraz karotenoidy.

Kosmetyki

Oleje z różnych zwierząt morskich i wodnych stosuje się do wytwarzania kremów nawilżających.

Hodowla ryb

Wśród lipidów znalezionych u kryla, Calanus i ryby, obecne są w wysokim stężeniu kwasy tłuszczowe 20:5 (kwas eikozapentaenowy) oraz 22:6 (kwas dokozaheksaenowy). Te kwasy tłuszczowe są podstawowymi składnikami odżywczymi i są korzystne jako pokarm dla ryb. Ponadto, te podstawowe składniki odżywcze są przenoszone do diety człowieka przez spożywanie ryb karmionych takim pokarmem.

Pasza dla zwierząt

Diety pokarmowe dla zwierząt bogate w kwasy omega-3 mogą zwiększać poziom nienasyconych kwasów tłuszczowych i zmniejszać poziom cholesterolu w mięsie.

Właściwość ta jest już wykorzystywana w przemyśle drobiowym do poprawy jakości jaj.

Znane są różne metody ekstrakcji olejów ze zwierząt morskich i wodnych. Przykładowo, znana jest ekstrakcja oleju rybnego przy użyciu rozpuszczalników organicznych, takich jak heksan i etanol. Wiadomo także jak zmierzyć zawartość tłuszczu w tkance mięśniowej ryby przy użyciu rozpuszczalników takich jak aceton.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr US 4,331,695 opisuje metodę stosującą rozpuszczalniki pod ciśnieniem, które występują w postaci gazowej w temperaturze pokojowej, takie jak propan, butan lub heksan. Ekstrakcję przeprowadza się w zalecanych temperaturach wynoszących 15 do 80°C na poszatkowanej roślinie lub dokładnie rozdrobnionych produktach zwierzęcych. Ekstrahowane oleje wytrąca się następnie pod wysokim ciśnieniem i podwyższonej temperaturze, wynoszącej 50 do 200°C. Jednak heksan jest słabym rozpuszczalnikiem ekstrakcyjnym dla zwierząt morskich, takich jak kryl. Ponadto, wysokie temperatury stosowane w etapie wytrącania ujemnie zmieniają lipidy.

Kanadyjskie zgłoszenie patentowe nr CA 2,115,571 opisuje metodę ekstrakcji olejów z różnych brązowych i czerwonych gatunków alg. Metoda opisuje np. ekstrakcję Soxhleta przy użyciu prawie czystego etanolu przez 40 godzin.

Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr US 5006281 opisuje metodę ekstrakcji oleju ze zwierząt morskich i wodnych, takich jak ryba. Zwierzę morskie i wodne traktuje się najpierw związkiem będącym antyoksydantem, dokładnie rozdrabnia i odwirowuje, aby oddzielić fazę olejową od fazy wodnej i fazy stałej. Następnie fazę olejową dodatkowo traktuje się antyoksydantem, w celu usunięcia niepożądanego zapachu lub smaku.

PL 201 771 B1

Kanadyjski opis patentowy nr CA 1,098,900 opisuje metodę ekstrakcji olejów z kryla. Metoda obejmuje emulgowanie świeżego lub rozmrożonego kryla w środowisku wodnym. Frakcję olejową odzyskuje się przez wirowanie.

Folch w artykule publikowanym w roku 1957 w J. Biol. Chem. 226: 497-509 „A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues” proponuje metodę ekstrakcji przy użyciu chloroformu i metanolu. Metoda ta nie jest możliwa z punktu widzenia rynku, z powodu toksyczności rozpuszczalników.

Jednakże, procesy według wcześniejszego stanu techniki ogólnie nie są łatwe do wykorzystania rynkowego lub zapewniają niską wydajność ilościową. Tak więc, przedmiotem niniejszego wynalazku jest zapewnienie ulepszonego sposobu ekstrakcji oleju ze zwierząt morskich i wodnych, pozwalającego na odzysk wartościowej frakcji olejowej i oddzielny odzysk wartościowej stałej pozostałości bogatej w białko, która zawiera aktywne enzymy.

Inne przedmioty i dodatkowe zakresy zastosowania niniejszego wynalazku staną się widoczne w szczegółowym opisie podanym w niniejszym potem. Jednakże należy rozumieć, że ten szczegółowy opis, mimo iż ukazuje zalecane postacie realizacji wynalazku, jest podany jedynie w celu zilustrowania, ponieważ dla specjalistów staną się widoczne rozmaite zmiany i modyfikacje w duchu i kształ cie wynalazku.

Krótki opis rysunków

Fig. 1. Chromatografia gazowo-cieczowa kwasów tłuszczowych z suchego kryla (chloroform-metanol)

Fig. 2. Chromatografia gazowo-cieczowa kwasów tłuszczowych z suchego kryla (aceton)

Fig. 3. Chromatografia gazowo-cieczowa kwasów tłuszczowych z mrożonego kryla (aceton)

Fig. 4. Chromatografia gazowo-cieczowa kwasów tłuszczowych z mrożonego kryla (etanol)

Fig. 5. Chromatografia gazowo-cieczowa kwasów tłuszczowych z mrożonego kryla (tert-butanol)

Fig. 6. Chromatografia cienkowarstwowa obojętnych lipidów Calanus sp. i M. norvegica

Fig. 8. Chromatografia cienkowarstwowa obojętnych lipidów E. pacifica

Fig. 9. Chromatografia cienkowarstwowa obojętnych lipidów M. schmitti.

Fig. 10. Chromatografia cienkowarstwowa obojętnych lipidów G. galeus

Fig. 11. Chromatografia cienkowarstwowa obojętnych lipidów rekina anioł morski

Fig. 12. Chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów Calanus sp. i M. norvegica

Fig. 13. Chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów E. pacifica

Fig. 14. Chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów M. schmitti

Fig. 15. Chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów G. galeus

Fig. 16. Chromatografia cienkowarstwowa fosfolipidów rekina anioł morski

Fig. 17. Wpływ objętości acetonu na ekstrakcję lipidów (E. pacifica)

Fig. 18. Wpływ czasu inkubacji w acetonie na ekstrakcję lipidów (E. pacifica)

Fig. 19. Wpływ objętości etanolu na ekstrakcję lipidów (E. pacifica)

Fig. 20. Wpływ czasu inkubacji w etanolu na ekstrakcję lipidów (T. raschii)

Przed szczegółowym opisem niniejszego wynalazku, należy zrozumieć, że wynalazek nie ogranicza się w swym zastosowaniu do szczegółów procesu opisanych w niniejszym. Wynalazek umożliwia inne postacie realizacji, praktykowane różnymi sposobami. Należy także zrozumieć, że frazeologia i terminologia jest stosowana w niniejszym w celu opisu, a nie ograniczenia.

Według wynalazku sposób ekstrahowania frakcji lipidowych z materiału ze zwierząt morskich i wodnych, charakteryzuje się tym, ż e obejmuje etapy:

(a) umieszczanie materiału ze zwierząt morskich i wodnych w rozpuszczalniku ketonowym, korzystnie acetonie z uzyskaniem ekstrakcji rozpuszczalnej frakcji lipidowej z wymienionego materiału ze zwierząt morskich i wodnych, (b) oddzielenie zawartości płynnej i stałej, (c) odzyskanie frakcji bogatej w lipidy z zawartości płynnej, przez odparowanie rozpuszczalników obecnych w zawartości płynnej z uzyskaniem całkowitej frakcji lipidowej.

W korzystnym wykonaniu sposób charakteryzuje się tym, ż e ponadto obejmuje (d) umieszczenie wymienionej zawartości stałej w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy, obejmują cej alkohol, korzystnie etanol, izopropanol lub tert-butanol, oraz estry kwasu octowego, korzystnie octan etylu, do uzyskania ekstrakcji pozostałej rozpuszczalnej frakcji lipidowej z wymienionego materiału ze zwierząt morskich i wodnych, (e) oddzielenie zawartości płynnej i stałej,

PL 201 771 B1 (f) odzyskanie drugiej frakcji bogatej w lipidy przez odparowanie rozpuszczalnika z zawartości płynnej z e), i (g) odbieranie zawartości stałej.

W etapie (a) rozpuszczalnik i materiał zwierzęcy korzystnie homogenizuje się .

W etapie (d), rozpuszczalnik i zawartość stałą również korzystnie homogenizuje się .

W korzystnym wykonaniu wynalazku etapy (b) i/lub (d) prowadzi się w atmosferze obojętnego gazu.

Ponadto etapy (b) i/albo (e) wykonuje się technikami wybranymi korzystnie spośród filtracji, wirowania i sedymentacji.

Natomiast etapy (c) i/albo (f) wykonuje się korzystnie technikami wybranymi spośród odparowywania pod zmniejszonym ciśnieniem, odparowywania rzutowego i suszenia z rozpylaniem.

W innym korzystnym wykonaniu sposobu wedł ug wynalazku po etapie (b), a przed etapem (c) sposób dodatkowo obejmuje pośredni etap mycia zawartości stałej z użyciem rozpuszczalnika, oraz dodanie otrzymanego roztworu myjącego do zawartości płynnej z etapu (b).

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku po etapie (e), a przed etapem (f) sposób dodatkowo obejmuje pośredni etap mycia zawartości stałej z użyciem rozpuszczalnika organicznego wybranego w etapie (d).

Korzystnie przed etapem (a) materiał ze zwierzęcia morskiego i wodnego jest dokładnie rozdrabniany, korzystnie do wielkości średnicy cząstek wynoszącej 5 mm lub mniej.

Etapy sposobu (a) i (b) prowadzi się w temperaturze rozpuszczalnika wynoszącej około 5°C lub niższej.

W sposobie wedł ug wynalazku zwierzę ciem morskim lub wodnym jest korzystnie zooplankton, korzystniej kryl lub Calanus.

W innym korzystnym wykonaniu wynalazku zwierzę ciem morskim lub wodnym jest produkt uboczny odfiletowanej ryby.

Całkowita frakcja lipidowa otrzymana w sposobie według wynalazku zawiera co najmniej astaksantynę i/lub kantaksantynę.

Wynalazek dotyczy ekstraktu lipidowego kryla, charakteryzującego się tym, że zawartość karotenoidów w astaksantynie wynosi co najmniej około 75 i korzystnie co najmniej około 90 μg/g ekstraktu krylowego, i zawartość karotenoidów w kantaksantynie wynosi co najmniej około 250 μg/g i korzystnie co najmniej około 270 μg/g ekstraktu kryla.

W sposobie ekstrakcji lipidów według wynalazku odzyskuje się zawartość stałą etapu b) i/lub e) składającą się z odwodnionej pozostałości zawierającej aktywne enzymy.

Wynalazek obejmuje zastosowanie ekstraktu lipidowego uzyskanego sposobem według wynalazku do stosowania lekarskiego, kosmetycznego, odżywkowego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.

Wynalazek obejmuje także zastosowanie ekstraktu lipidowego uzyskanego sposobem według wynalazku do wytwarzania produktu wybranego z grupy składającej się z produktu medycznego, odżywczego, kosmetycznego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.

Jak przedstawiono wyżej sposób według wynalazku obejmuje zawieszenie świeżo zebranego materiału morskiego i wodnego w acetonie. Lipidy ekstrahuje się z użyciem ketonu, takiego jak aceton. Pozwala to na szybkie odwodnienie tkanki zwierzęcej i migrację frakcji lipidowej do rozpuszczalnika. Sucha pozostałość jest wartościowym produktem bogatym w aktywne enzymy.

W zalecanej postaci realizacji, ekstrakcję przeprowadza się przez kolejne traktowania acetonem i alkoholem. Zalecanym alkoholem jest izopropanol i tert-butanol. Alkohol może być także zastąpiony estrem kwasu octowego, takim jak octan etylu. W wyniku procedury powstają dwie kolejne frakcje lipidowe oraz sucha pozostałość bogata w białko, zawierające aktywne enzymy. Odzysk lipidów całkowitych jest porównywalny z procedurą Folch i inni (1957) przytoczonej w części tło wynalazku. Testy przeprowadzano z użyciem tkanek kryla, Calanus, ryby i rekina.

Kolejne traktowania ekstrakcyjne proponowane w niniejszym wynalazku, dają lepszą wydajność ekstrakcji lipidowej niż system ekstrakcji z pojedynczym rozpuszczalnikiem. Ekstrakcja przy użyciu dwóch kolejnych rozpuszczalników, która rozpoczyna się ketonem, takim jak aceton, jest szczególnie korzystna ponieważ aceton w efekcie, odwadnia tkankę zwierzęcą. Posiadanie tkanki zwierzęcej w formie odwodnionej bardzo ułatwia proces ekstrakcji drugim rozpuszczalnikiem, alkoholem lub estrem kwasu octowego, takim jak octan etylu.

W przypadku zooplanktonu, takiego jak kryl i Calanus oraz w przypadku produktów ubocznych filetowania ryb, takich jak trzewia rybie, widać, że ekstrakcja samym acetonem może wystarczać do

PL 201 771 B1 efektywnego pod względem kosztów odzysku frakcji lipidowej i oddzielnego odzysku suchego produktu stałego bogatego w białka zawierające aktywne enzymy.

Obecnie zostanie opisany ogólny sposób ekstrakcji według niniejszego wynalazku. Materiał wyjściowy składający się ze świeżo zebranego i korzystnie dokładnie rozdrobnionego materiału ze zwierząt morskich i wodnych, poddaje się ekstrakcji acetonem, przez około dwie godziny, a korzystnie przez noc. Jednak czas ekstrakcji nie jest krytyczny dla wydajności ekstrakcji lipidowej. Aby ułatwić ekstrakcję, zaleca się stosowanie cząstek mniejszych niż 5 mm średnicy. Ekstrakcję prowadzi się korzystnie w obojętnej atmosferze i w temperaturze rzędu około 5°C lub niższej.

Korzystnie, początek ekstrakcji będzie prowadzony przy mieszaniu przez około 10 do 40 minut, korzystnie 20 minut. Chociaż czas ekstrakcji nie jest krytyczny, stwierdzono, że najlepsza jest ekstrakcja 2 godzinna przy stosunku objętościowym wynoszącym 6:1 acetonu do materiału zwierzęcia morskiego lub wodnego.

Rozpuszczone frakcje lipidowe oddziela się od materiału stałego standardowymi technikami, włączając np. filtrację, wirowanie lub sedymentację. Korzystnie stosuje się filtrację.

Po oddzieleniu przez filtrację na filtrze opornym wobec rozpuszczalników organicznych (metal, szkło lub papier), pozostałość ewentualnie przemywa się czystym acetonem, korzystnie dwoma objętościami (początkowa objętość materiału), aby odzyskać jeszcze więcej lipidów. Połączone przesącze odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Ewentualnie, można stosować odparowywanie rzutowe lub suszenie przez rozpylanie. Pozostałość wodną otrzymaną po odparowaniu pozostawia się do oddzielenia od fazy olejowej (frakcji) w niskiej temperaturze.

Stałą pozostałość zebrana na filtrze zawiesza się i ekstrahuje alkoholem, takim jak etanol, izopropanol, tert-butanol lub alternatywnie octanem etylu, korzystnie dwoma objętościami (początkowa objętość materiału). Przesącz odparowuje się pozostawiając drugą frakcję lipidów (określaną jako frakcję II). Chociaż okres ekstrakcji nie jest krytyczny, zauważono, że wystarcza czas ekstrakcji wynoszący około 30 minut, w temperaturach poniżej około 5°C.

Temperatura rozpuszczalników organicznych, z wyjątkiem tert-butanolu, oraz temperatura próbki nie jest parametrem krytycznym, lecz zaleca się, aby były one możliwie zimne. Jednakże w przypadku tert-butanolu, który jest stał y w temperaturze pokojowej, istotne jest ogrzanie go przed użyciem i przeprowadzenie ekstrakcji natychmiast, w temperaturze 25°C.

Przykłady porównawcze

Aby porównać skuteczność procesu ekstrakcji, stosowano klasyczną technikę (Folch i inni, 1957) z użyciem chloroformu i metanolu wobec kryla. Metoda ta jest odniesieniem w stosunku do pomiarów skuteczności procesu ekstrakcji. Wykonywano inne porównanie stosując technikę z użyciem heksanu jako rozpuszczalnika ekstrakcyjnego. Odzysk lipidów szacowano zawieszając frakcje lipidowe w małych objętościach ich oryginalnych rozpuszczalników i mierząc przez grawimetrię małych równych ilości po odparowaniu.

Dla wszystkich opisanych w niniejszym przykładów, sposób według niniejszego wynalazku, obejmujący ekstrakcję acetonową, a następnie ekstrakcję drugim rozpuszczalnikiem (np. octanem etylu) dawał przezroczysty olej, mający wygląd i właściwości atrakcyjniejsze niż jakikolwiek olej otrzymany techniką klasyczną Folch i innych (1957).

Aby przeanalizować skład lipidów, 780 μg każdego ekstraktu załadowano na płytki z żelem krzemionkowym i frakcjonowano przez chromatografię cienkowarstwową, TLC (Bowyer i inni, 1962) stosując następujące rozpuszczalniki. Lipidy obojętne: heksan, eter etylowy, kwas octowy (90:10:1, objętościowo) oraz fosfolipidy: chloroform, metanol, woda (80:25:2, objętościowo). Skład kwasu tłuszczowych E. pacifica analizowano stosując chromatografię gazowo-cieczową, GLC, (Bowyer i inni, 1962 przez bibliografia) włączając pewne modyfikacje w stosunku do techniki oryginalnej: 2 godziny w temperaturze 65°C, zamiast 1 godziny w temperaturze 80°C, trzy przemycia heksanem, zamiast dwóch oraz brak przemywania wodą.

Aby pozbyć się śladów rozpuszczalników organicznych, frakcje lipidowe I i II ogrzewa się do temperatury około 125°C przez około 15 minut w obojętnej atmosferze.

Tłuszcz analizowano zgodnie z American Oil Chemist's Society (AOCS). W analizie ekstrahowanych lipidów stosowano następujące kryteria: zmydlanie i indeksy jodowe Wijs'a oraz poziom wilgotność-substancja lotna. Określono także zawartość cholesterolu metodą Plummer 1987 (patrz bibliografia). Takie same i inne analizy wykonywano w niezależnym laboratorium pod nadzorem profesora Roberta Ackamann'a (Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousie University, Halifaks, Nowa Szkocja, Kanada). Obejmują one indeks jodowy Wijs'a, wartości nadtlenkowe

PL 201 771 B1 i anizydyny, zawartość klas lipidów, zawartość kwasów tł uszczowych, wolne kwasy tł uszczowe FAME, cholesterol, tokoferol, zawartości całego trans-retinolu, cholekalcyferolu, astaksantyny i kantaksantyny.

Tablica 1 ukazuje, że z suchego kryla ekstrahuje się wyższe poziomy lipidów acetonem, a następnie etanolem, w porównaniu z procedurą klasyczną Folcha i innych (1957).

Tablica 2 ukazuje wyniki ekstrakcji lipidowej zamrożonego Euphausia pacifica, gatunku kryla z Oceanu Spokojnego. Zakładając osiemdziesięcioprocentową zawartość wody, zawartość lipidów jest porównywalna z krylem suchym, jak ukazano w tablicy 1. Izopropanol, tert-butanol i octan etylu jako rozpuszczalniki drugiej ekstrakcji, dają wydajność mniej istotną niż etanol, lecz nie koniecznie są mniej efektywne przy odzysku lipidów, ponieważ etanol niesie więcej zanieczyszczeń niż izopropanol, tert-butanol lub octan etylu. A więc, można je również stosować jako drugi rozpuszczalnik po acetonie. Zmienności między wynikami ekstrakcji acetonowych są spowodowane głównie oddzieleniami wodaolej. Na te rozdzielenia ma wpływ ilość resztkowego acetonu w roztworze woda-olej po odparowaniu acetonu. Ta ilość acetonu zmienia się z doświadczenia na doświadczenie, ponieważ system odparowywania stosowany na małą skalę jest mniej powtarzalny (w skali przemysłowej etap odparowywania będzie optymalizowany). Przetestowano także pojedyncze rozpuszczalniki, pod względem ekstrakcji całości lipidów z kryla. Pokazuje to, że octan etylu (współczynnik ekstrakcji 1,37%), jak i heksan (współczynnik ekstrakcji 0,23%) nie są dobranymi rozpuszczalnikami w porównaniu z samym acetonem (współczynnik ekstrakcji 1,86%, a nawet większe współczynniki ekstrakcji przy skutecznym systemie odparowywania acetonu).

Jedną z głównych korzyści procedury jest usuwanie bakterii z ekstraktów (frakcja lipidowa i materiał stały bogaty w białko). Rzeczywiście, próbki E. pacifica inkubowane w różnych stosunkach acetonu w temperaturze 4°C przez 112 dni, szczepiono na pożywce NA, zawierającej ekstrakt wołowy Bacto™ 0,3%, pepton Bacto™ 0,5% i agar Bacto™ 1,5% (Difco Laboratories, Detroit, USA), następnie inkubowano w temperaturze pokojowej lub 4°C przez 18 dni. Nie obserwowano istotnego wzrostu bakterii przy stosunku 1 objętości acetonu na gram kryla. W wyższych proporcjach acetonu (2 objętości i 5 objętości) nie występował istotny wzrost bakterii, co oznacza, że aceton zabezpiecza próbki kryla. Wiadomo, że aceton jest skutecznym środkiem bakteriobójczym i wirusobójczym (Goodman i inni, 1980).

Tablica 3 pokazuje wydajność lipidów z M. norvegica. Procentowość lipidów (3,67%) jest porównywalna z otrzymaną od E. pacifica (3,11%) pokazaną w tablicy 2. Zmienność można przypisać diecie i czasowi (pora) zbioru, które są różne dla tych dwóch gatunków.

Tablica 4 pokazuje wpływ rozdrabniania na skuteczność ekstrakcji lipidów M. norvegica. Ekstrakcje te przeprowadzano w optymalnych warunkach i pokazują niepodważalną korzyść procedury w stosunku do metody klasycznej (4,46% w stosunku do 3,30%). Pokazuje ona także, że rozdrabnianie może być istotnym czynnikiem, gdy gatunek jest duży (4,46% w stosunku do 3,53%).

Tablica 5 opisuje ekstrakcję lipidów z Calanus. Otrzymywano istotne ilości lipidów. Pewne zmienności w składzie gatunkowym Calanus mogą tłumaczyć zmienność między doświadczeniami 1 i 2 (8,22% i 10,90% wagi świeżej).

Tablice 6-8 opisują całkowitą ilość lipidów ekstrahowanych z tkanki ryb. Sposób według niniejszego wynalazku przedstawiono na makreli, pstrągu i śledziu. Sposób przedstawiono na tkankach obwodowych (głównie mięśniach) i trzewiach. Korzystnie, niniejszy sposób pozwalałby na odzysk wartościowych frakcji lipidowych z części ryb, które zazwyczaj traci się po oddzieleniu filetów rybich. Te rybie tkanki, które nie są używane po transformacji ryby do konsumpcji przez człowieka, można by przechowywać w acetonie, a także lipidy ekstrahowane z nich zgodnie z niniejszym wynalazkiem, nawet jeśli metoda Folcha [1957] odzyskuje więcej lipidów niż nasz sposób. W rzeczywistości małe ilości lipidów z makreli (0,52% z trzewi i 1,45% z tkanek) ekstrahowano metodą Folcha po pierwszej ekstrakcji acetonem i etanolem, jak opisano w niniejszym wynalazku. Porównawcze ekstrakcje sposobem opisanym w niniejszym wynalazku przeprowadzone równolegle z metodą Folcha na pstrągu i śledziu, wykazują większy odzysk przy użyciu tej ostatniej. Jednak należy zauważyć, że metody Folcha nie można stosować do odzysku lipidów do zastosowań rynkowych (z powodu toksyczności).

W tablicach 9 do 11, pokazane są wyniki ekstrakcji lipidów z tkanek wątroby rekina. Nie występuje istotna różnica w wynikach między technikami w obrębie gatunku.

Tablica 12 ukazuje niektóre cechy charakterystyczne frakcji I (acetonowa) i frakcji II (alkoholowa lub octanu etylu) dla oleju z kryla (e. pacifica). Po pierwsze, indeks zmydlania frakcji I (130,6) wskazuje, że frakcja ta zawiera kwasy tłuszczowe o dłuższych łańcuchach w porównaniu z frakcją II (185,7). Indeks jodowy Wijsa frakcji I wskazuje, że frakcja ta zawiera więcej wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, w porównaniu z olejem z oliwek, który ma indeks 81,1. Tłumaczy to, dlaczego frakcja I

PL 201 771 B1 jest płynna w temperaturze pokojowej. Wiadomo dobrze, że nienasycone kwasy tłuszczowe posiadają temperaturę topnienia niższą niż jeden z ich nasyconych homologów. Takie same obserwacje wykonuje się dla frakcji II, która ma indeks jodowy wynoszący 127,2. Skład kwasów tłuszczowych ukazany w tablicy 12 potwierdza te indeksy jodowe: frakcja I odznacza się wysoką zawartością procentową (30,24%) wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (pentaenowych-heksaenowych), i frakcja II także (22,98%). Ostatecznie, tablica 12 ukazuje także, że frakcja I składa się z 10,0% substancji lotnej i wilgoci po odparowaniu rozpuszczalnika. W tym samym teś cie, frakcja II daje warto ść 6,8%. Aby usunąć ślady rozpuszczalników, ważne jest krótkie ogrzewanie (do temperatury około 125°C przez około 15 minut) oleju w atmosferze azotu.

Wyniki z olejem krylowym otrzymane zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku (frakcja I ekstrahowana acetonem i frakcja II ekstrahowana octanem etylu), zapewniono w tablicach 12, 13, 14 15, 16 i 17. Należy zauważyć, że w tablicy 17, zawartość karotenoidów była istotnie wysoka, jak zmierzono dla dwóch karotenoidów, mianowicie astaksantyny i kantaksantyny. Rzeczywiście, podwójne analizy ujawniły wartości wynoszące 92 do 124 μg/g frakcji lipidowej dla astaksantyny oraz 262 do 734 μg/g dla kantaksantyny. Tak więc, dla celów niniejszego wynalazku, można powiedzieć, że ekstrakt krylowy zawiera astaksantynę w ilości co najmniej 75, a korzystnie co najmniej 90 μg/g frakcji lipidowej. Niskie wartości dla nadtlenku i anizydyny są korzystne i spowodowane obecnością wysokiego poziomu naturalnych antyoksydantów (astaksanyty i kantaksantyny). Związki te są wskaźnikami korzystnych właściwości farmaceutycznych lub kosmetologicznych ekstraktu krylowego, dzięki którym wysoki poziom karotenoidów wskazuje doskonałą charakterystykę migracji przezskórnej. Tak wiec ekstrakt krylowy jest dobrym kandydatem dla przezskórnego dostarczania leków.

Tablica 18 ukazuje najlepszy sposób realizacji sposobu według niniejszego wynalazku pod względem ekstrakcji lipidów z tkanek zwierząt wodnych.

Tablica 19 ukazuje, że w następstwie sposobu według niniejszego wynalazku zachowana jest aktywność enzymów frakcji stałej. W rzeczywistości demonstrację spełniono dla stałej pozostałości krylowej otrzymanej po kolejnych ekstrakcjach acetonem i octanem etylu. Aktywność proteolityczna była miarą uwalniania grup aminowych w teście spektrofotometrycznym z użyciem o-ftalodialdehydu jako odczynnika. Stężenie białek mierzono metodą Bradforda. Rozpuszczalne białka ekstrahowano wodą i dodawano do koncentratu 10% białka laktosurowicy, otrzymanego przez ultrafiltrację. Przy końcu inkubacji w temperaturze 37°C w 50 mM buforze fosforanu potasu, dodawano kwas trichlorooctowy i mierzono ilość grup NH3 w supernatancie, zgodnie z metodą Church i innych [1983, J Dairy Sci 66: 1219-1227].

Fig. 1-6 ukazują chromatogramy składu kwasów tłuszczowych lipidów E. pacifica. W każdej pozycji można zauważyć wysokie proporcje wynoszące 20:5 i 22:6 kwasów tłuszczowych (charakterystycznych dla olejów morskich i wodnych) i reprezentowane przez dwa różne piki.

Zmienność we wzorach lipidowych lipidów obojętnych (z fig. 7 do fig. 11) z jednego gatunku na drugi, można przypisać różnicom w źródle pokarmu. Wewnątrz gatunku (np. E. pacifica) nie obserwuje się istotnych różnic między wzorami lipidów otrzymanych różnymi technikami ekstrakcji lipidowej. Biorąc pod uwagę fosfolipidy (fig. 12 do fig. gatunku (np. E. pacifica) nie obserwuje się istotnych różnic między wzorami lipidów otrzymanych różnymi technikami ekstrakcji lipidowej. Biorąc pod uwagę fosfolipidy (fig. 12 do fig. 16), obserwowano co innego: zmienność tłumaczy się różnymi procesami ekstrakcji lipidów ponieważ ten sam gatunek nie prowadzi do takiego samego wzoru lipidowego. Lipidy od rekinów (ekstrahowane wspomnianymi metodami) oraz rynkowy olej z wątroby dorsza (próbki dostępne z drogerii Uniprix, prowincja Quebec, Kanada) składają się głównie z lipidów obojętnych w przeciwieństwie do fosfolipidów.

Wpływ objętości rozpuszczalnika i czasu inkubacji na skuteczność acetonu do ekstrakcji lipidów z E. pacifica ilustruje się odpowiednio w fig. 17 i 18. Stosunek 1:6 (ciężar/objętość) dawał optymalną wydajność przy prawie pełnej ekstrakcji po 2 godzinach. Drugi etap ekstrakcji przeprowadzano doświadczalnie z użyciem etanolu (fig. 19), lecz czas inkubacji w etanolu powinien wynosić co najmniej 30 minut, co wskazują wyniki z fig. 20.

Jeden z wynalazców, dr. Adrien Beaudoin, spożył różne frakcje lipidów kryla. Nie obserwowano profilu efektów ubocznych.

Chociaż wynalazek opisano powyżej ze względu na jedną specyficzną postać, dla specjalisty będzie oczywiste, że można go modyfikować i doskonalić na różne sposoby. Należy zatem rozumieć, że niniejszy wynalazek nie powinien być ograniczony w kształcie, z wyjątkiem następujących zastrzeżeń.

Demonstracja, że pozostałości krylowe, otrzymane po ekstrakcji acetonem i octanem etylu, zawierają aktywność enzymów proteolitycznych. Aktywność proteolityczną mierzono przez uwolnienie

PL 201 771 B1 grup aminowych w teście spektrofotometrycznym z użyciem o-ftalodialdehydu jako odczynnika. Stężenie białka mierzono metodą Bradforda.

Źródłem enzymu była pozostałość otrzymana po ekstrakcji lipidowej acetonem i octanem etylu. Rozpuszczalne białka ekstrahowano wodą i dodawano do 10% koncentratu białka laktosurowicy otrzymanego przez ultrafiltrację.

Przy końcu inkubacji w temperaturze 37°C w 50 mM buforze fosforanu potasu, dodawano kwas trichorooctowy i mierzono ilość grup NH3 w supernatancie, zgodnie z metodą Church i innych 1983.

Bibliografia

Bowyer, D. E., Leat, W. M. F. Howard. A. N. i Gresham, G. A. 1962. The determination of the fatty acid composition of serum lipids separated by thin-layer chromatography; and a comparison with column chromatography. BBA. 70:423-431.

Chandrasekar, B., Troyer, DA, Venkatraman. J. T. i Fernandes, G. 1996. Tissue specific regulation of transforming growth factor beta by omega-3 lipid-rich krill oil in autoimmune murine lupus. Nutr Res. 16(3): 489-503.

Christensen, M. S., Hoy. C-E. i Redgrave, T. G. 1994. Lymphatic absorption of n-3 polyunsaturated fatty acids from marine oils with different intramolecular fatty acid distributions. BBA. 1215:198-204.

Church, F. C., Swaisgood. H. E. Porter, D. H. i Catignani, G. L. 1983. Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. J Dairy Sci. 66: 1219-1227.

Difco laboratories. 1984. Difco Manual Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology. 10-te wydanie Detroit.

Folch, J., Lees. M. i Sloane-Stanley, G. H. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. biol Chem. 226:497-509.

Goodman Gilman, A., Goodman, L. L i Gilman, A. 1980. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 6-te wydanie Collier Macmillan Canada Ltd, Toronto.

Harwood, H-J. i Geyer, R. P. 1964. Biology Data Book. The Federation of American Societies for Experimental Biology, Washington.

Hellgren, L, Karlstam. B. Mohr. V. i Vincent, J. 1991.

Krill enzymes. A new concept for efficient debridement of necrotic ulcers. Int J Dermatol. 30(2): 102-103

Plummer, D. T. 1987. An introduction to practical biochemistry. 3-cie wydanie. McGraw-Hill Book Company, Londyn

Rawn, J. D. i Holy, P. 1994. Rapport sur l'etat des invertebres en 1994: 7:0 Zooplancton (Euphausiaces et Calanus) de l'Estuaire et du Golfe du Saint-Laurent.

Sargent, J. R. 1997. Fish oils and human diet. Br J. Nutr. 78 Dodatek 1: S5-S13.

T a b l i c a 1

Ekstrakcja lipidów suchego kryla (E. pacifica)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)	Średnia (%) ±s.d
1-	aceton ^a)etanol ^b)	8,00 7,60	15,60
2-		19,70 6,90	26,60
3-		8,15 11,20	19,35
4-		6,80 13,60	20,40	20,49±3,95
5-	chlor: MeOH ^c)		15,50
6-			14,90	15,20±0,30

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a) ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), bez inkubacji.

^b) ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowane 1 noc w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c) : Folch i inni 1957.

PL 201 771 B1

T a b l i c a 2

Ekstrakcja lipidów zamrożonego kryla (E. pacifica)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)	Średnia (%) ±s.d
1	2	3	4	5
1-	aceton ^a)etanol ^b)	1,17 1,23	2,40
2-		3,05 1,09	4,14
3-		1,53 1,26	2,79	3,11±0,91
4-	aceton ^a)izopropanol ^b)	2,45 0,70	3,15
5-		1,80 0,80	2,60
6-	n	1,60 0,80	2,40	2,72±0,39
7-	aceton ^a)t-butanol ^c)	2,15 0,47	2,62
8-		2,11 0,40	2,51
9-		2,37 0,45	2,82	2,65±0,16
10-	aceton ^a)octan etylu ^b)	2,28 0,21	2,49
11-		1,09 0,16	1,26
12-		2,54 0,09	2,63	2,12±0,76
13-	połączone aceton-etanol ^d)		3,28
14-			3,02
15-			3,25	3,18±0,14
16-	octan etylu ^e)		1,32
17-			1,49
18-			1,31
19-	heksan ^e)		0,31
20-			0,18
21-			0,20

0,23±0,07

PL 201 771 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4
22-	chlor:
	MeOH ^f)		2,37
23-			2,07

2,62

2,35±0,28

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 25°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^d) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton-etanol, wynoszącym 1:5:5 (ciężar/objętość/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^e) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość) inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^f) Folch i inni 1957.

T a b l i c a 3

Ekstrakcja lipidów zamrożonego kryla (M. norvegica)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)	Średnia (%) ±s.d
1-	aceton ^a)etanol ^b)	1,82 1,82	3,64
2-		1,15 2,35	3,5
3-		1,68 2,19	3,87	3,67±0,15

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość). Inkubowanie 1 noc w temperaturze 4°C.

^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowanie 1 godzinę w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

T a b l i c a 4

Wpływ rozdrabniania na ekstrakcję lipidów zamrożonego kryla (M. norvegica)

Doświadczenie nr	Technika	1 rozdrobnienie kryla przed ekstrakcją	Wydajność (%)	Całość (%)
1-	aceton ^a)etanol ^b)	tak	3,10 1,07	4,17
2-		nie	2,14 1,39	3,53
3-		tak	3,32 1,14	4,46
4-	chlor: MeOH^c)	tak		3,30
5-		tak		3,26

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:6, inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^b) ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2, inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c) : Folch i inni 1957.

PL 201 771 B1

T a b l i c a 5

Ekstrakcja lipidów zamrożonego Calanus (Calanus sp.)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)	Średnia (%) ±s.d
1-	aceton ^a)	6,18	8,22
etanol ^b)	2,04
2-		8,64
n	2,26	10,90	9,56±1,34

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 1 noc w temperaturze 4°C.

^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowane 1 godziny w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

T a b l i c a 6

Ekstrakcja lipidów świeżej ryby (makreli)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)
1-trzewia ryby 1	aceton ^a)etanol ^b)	6,11 0,59	6,70
2-tkanki ryby 1		3,78 0,91	4,69
3-trzewia ryby 2		10,46 0,57	11,03
4-tkanki ryby 2		6,65 1,41	8,06
5-trzewia ryby 3		8,39 0,66	9,05
6-tkanki ryby 3		5,27 0,97	6,24
7-trzewia ryby 4		8,47 0,69	8,16
8-trzewia ryby 4		8,40 1,02	9,42
8-trzewia ryby 1	chlor: MeOH ^c)		0,52
10-tkanki ryby 1			1,45

^a) Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), czas inkubacji:

• trzewia ryby 1: 4 godziny, tkanki ryby 1: 23 godziny • trzewia ryby 2: 23 godziny 45, tkanki ryby 2: 45 godziny 30 • trzewia ryby 3: 8 dni 2 godziny 20, tkanki ryby 3: 8 dni 22 godziny 30 • trzewia ryby 4: 17 dni 23 godziny, tkanki ryby 4: 18 dni 2 godziny 25.

^b) Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowane 1 godziny w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem, ^c) : Folch i inni 1957, po ekstrakcjach acetonem, potem etanolem.

T a b l i c a 7

Ekstrakcja lipidów świeżej ryby (pstrąg)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)
1-trzewia	aceton ^a)etanol ^b)	34,70 2,18	36,88
2-tkanki		5,53 1,17	6,70
3-trzewia	chlor MeOH ^c)		39,81
4-tkanki			14,93

PL 201 771 B1

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

a): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 1 noc w temperaturze 4°C.

b): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowane 1 godziny w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

c) Folch i inni 1957.

T a b l i c a 8

Ekstrakcja lipidów świeżej ryby (śledź)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)
1-tkanki i trzewia	aceton ^a)	2,09
	etanol ^b)	0,68	2,77
2-tkanki i trzewia	chlor MeOH ^c)		5,96

Doświadczenia potrójne (odchylenie < 5%).

^a): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 1 noc w temperaturze 4°. ^b): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:4 (ciężar/objętość), inkubowane 1 godziny w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c) Folch i inni 1957.

T a b l i c a 9

Ekstrakcja lipidów świeżej wątroby rekina (M. schmitti)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)
1-	aceton^a)	36,39	40,87
etanol^b)	4,48
2-	octan etylu^c)		36,68
3-	chlor: MeOH^d)		41,86

Doświadczenia potrójne (odchylenia <5%).

^a): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^b): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^d): Folch i inni 1957

T a b l i c a 10

Ekstrakcja lipidów świeżej wątroby rekina (G. galeus)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność (%)	Całość (%)
1-	aceton^a)	21,39	26,66
	octan etylu ^b)	5,27
2-	octan etylu ^c)		25,89
3-	chlor MeOH^d)		29,99
Doświadczenia potrójne (odchylenia <5%). ^a): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), w temperaturze 4°C. ^b): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem. ^c): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość),	inkubowane 2 godziny inkubowane 30 minut inkubowane 2 godziny

w temperaturze 4°C. d) Folch i inni 1957.

T a b l i c a 11

Ekstrakcja lipidów świeżej wątroby rekina (anioł morski)

Doświadczenie nr	Technika	Wydajność(%)	Całość (%)
1-	aceton ^a)	19,23
octan etylu ^b)	8,98	28,21
2-	octan etylu ^c)		39,22
3-	chlor: MeOH ^d)		39,23

PL 201 771 B1

Doświadczenia potrójne (odchylenia <5%).

^b) Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^c) ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-rozpuszczalnik, wynoszącym 1:9 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^d) Folch i inni 1957.

T a b l i c a 12

Charakterystyka oleju krylowego (E. pacifica) niezależ ne laboratorium ^a) podręcznik

Indeks zmydlenia

Frakcja I^c)	130,6	---
Frakcja II^a)	185,7	---
Oliwa z oliwek	192,0 ^a)	---	189,7
Indeks jodowy Wijsa
Frakcja I^c)	185,2	172,5	---
Frakcja II^d)	127,2	139,2	---
Oliwa z oliwek	85,3 ^e)	---	81,1
Zawartość cholesterolu (%)
Frakcja I^c)	2,1	1,9	---
Frakcja II^d)	3,7	3,0	---
Oliwa z oliwek	_0,2 ^e)	---	---
Substancje lotne i poziom wilgotności (%)
Frakcja I^c)	10,0	---	---
Frakcja II^d)	6,8	---	---
Wartość nadtlenkowa
(milirównoważnik nadtlenku/kg oleju)
Frakcja I^c)	---	0,0	---
Frakcja II^d)	---	0,0	---
Wartość p-anizydyny (absorpcja q-¹)
Frakcja I^c)	---	0,1	---
Frakcja II^d)	---	5,5	---

^a) : Laboratorium profesora Roberta Ackmana, Canadian Institute of Fisheries Technology, Halifax, Nowa Szkocja.

^b) : Harwood i Geyer 1864.

^c) : Ekstrakcja wykonywana w stosunku próbka-aceton 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^d) : Ekstrakcja wykonywana w stosunku próbka-aceton 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

^e) : Oliwa z oliwek Extra virgin wyciskana na zimno od Bertolli ™.

T a b l i c a 13

Zawartość klas lipidów w oleju krylowym (% obszaru) (E. pacifica)

2

Trójglicerydy

Frakcja I^a) 19,0±0,7

Frakcja II^b) 66,5±2,3

Węglowodory

Frakcja ^Ia) ślad

PL 201 771 B1

cd. tabeli 13
1	2
_Frakcja ^IIb)	1,3±10,1
Wolne kwasy tłuszczowe
_Frakcja ^Ia)	23,7±1,1
_Frakcja ^IIb)	20,3±0,3
Monoalicerydy
Frakcja ^Ia)	1,4±0,3
_Frakcja ^IIb)	0,5±0,1
Fosfolipidy lub inny materiał polarny
_Frakcja ^Ia)	54,1±6,1
Frakcja ^IIb)	8,5±1,6

Dane z laboratorium profesora Roberta Ackmana. Canadian Institute of Fisheries Technology, Halifax, Nowa Szkocja.

^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton, wynoszącym 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-octan etylu, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

T a b l i c a 14

Zawartość kwasów tłuszczowych w oleju krylowym (ciężar/ciężar %) (E. pacifica)

Kwasy tłuszczowe	Frakcja I^a)	Frakcja II
1	2	3
12:0	0,0	0,1
13:0	0,2	0,1
ISO 14:0	0,4	0, 6
14:0	4,2	7,6
ISO 15:0	0,5	0,7
ANT 15:0	0,2	0,2
15:0	0,6	1,0
ISO 16:0	0,2	0,3
ANT 16:0	0,2	0,2
16:0	14,1	21,6
7MH	0,6	0,9
ANT 17:0	0,1	0,3
17:0	2,8	3,7
18:0	1,0	1,6
20,0	0,1	0,3
Nasycone	25,2	39,2
14:1	0,4	0,5
15:1	0,1	0,2
16:1 n-7	6,6	7,8
16:1 n-5	0,6	0,2
17:1	0,6	0,7
18:1 n-9	8,0	9,8

PL 201 771 B1 cd. tabeli 14

1	2	3
18:1 n-7	4,2	5,6
18:1 n-5	0,1	0,1
20:1 n-9	0,3	0,4
20:1 n-7	0,3	0,4
20:1 n-5	0,3	0,4
22:1 n-11+13	0,1	0,2
Monoeny	21,6	26,3
16:2 n-6	0,6	1,2
16:2 n-4	1,3	1,3
18:2 n-7	0,1	0,2
18:2 n-6	2,0	1,8
18:2 n-4	0,1	0,1
20:2 NMID	0,2	0,2
20:2 n-6	0,1	0,1
Dieny	4,4	4,9
16:3 n-4	1,4	1,2
18:3 n-6	0,4	0,3
18:3 n-4	0,2	0,2
18:3n-3	3,2	3,0
18:3n-1	0,1	0,1
20:3 n-3	0,1	0,1
Trieny	5,4	4,9
16:4 n-3	0,9	0,7
16:4n-1	1,0	0,8
18:4 n-3	9,2	7,4
18:4n-1	0,1	0, 0
20:4 n-6	0,7	0,5
20:4 n-3	0,7	0,3
Tetraeny	12,6	9,7
20:5 n-3	17,4	8,6
21:5 n-3	0,7	0,5
22:5 n-6	0,2	0,1
22:5 n-3	0,5	0,3
Pentaeny	18,8	9,5
22:6 n-3	13,2	6,6
Heksaeny
Obliczona wartość jodowa	214,8	145,1

Dane z laboratorium profesora Roberta Ackmana, Canadian Institute of Fisheries Technology, Halifax, Nowa Szkocja.

^a): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton, wynoszącym 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C.

^b): Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-octan etylu, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem.

PL 201 771 B1

T a b l i c a 15

Występowanie kwasów tłuszczowych lipidów kryla (% wagowy) (E. pacifica)

Kwasy tłuszczowe	Frakcja I^a)	Frakcja II
1	2	3
12:0	0,5	0,1
13:0	0,2	0,0
ISO 14: 0	0,2	0,2
14:0	1,3	2,6
ISO 15:0	0,3	0,3
ANT 15:0	0,1	0,1
15:0	0,2	0,5
ISO 16:0	0,1	0,2
ANT 16:0	0,2	0,1
16:0	3,3	10,6
7MH	0,6	0,8
ANT 17:0	0,2	0,2
Fitanowy	0,2	0,0
17:0	0,5	0,8
18:0	0,2	0,8
20:0	0,3	0,2
22:0	0,0	0,1
Nasycone	8,4	17,4
14:1	0,2	0,2
15:1	0,2	0,1
16:1 n-9	0,5	0,0
16:1 n-7	5,2	6,8
16:1 n-5+ 17:0	0,1	0,1
17:1	0,6	0,7
18:1 n-9	7,0	11,4
18:1 n-7	4,9	9,3
18:1 n-5	0,1	0,3
20:1 n-11	0,2	0,3
20:1 n-9	0,1	0,3
22:1 n-11+13	0,1	0,2
24:1 n-9	0,0	0,1
Monoeny	19,2	29,8
16:2n-6	0,4	0,9
16:2n-4	1,2	1,0
18:2n-7	0,1	0,2
18:2 n- 6	2,4	2,6

PL 201 771 B1 cd. tabeli 15

1	2	3
18:2n-4	0,1	0,1
20:2 n-6	0,1	0,1
Dieny	4,3	4,9
16:3 n-4+ \|17:1	1,4	0,9
16:3 n-3+ \|18:0	0,2	0,5
18:3 n-6	0,4	0,3
18:3 n-4	0,1	0,1
18:3 n-3	3,3	3,4
18:3 n-1	0,1	0,1
20:3 n-6	0,1	0,1
20:3 n-3	0,1	0,2
Trieny	5,7	5,6
16:4 n-3	0,6	0,3
16:4 n-1	1,0	0,6
18:4 n-3	9,8	6,2
18:4 n-1	0,1	0,1
20:4n-6	1,7	1,4
20:4 n-3	0,6	0,5
22:4 n-3	0,3	0,3
Tetraeny	14,1	9,4
18:5 n-3	0,2	0,1
20:5 n-3	26,4	17,4
21:5 n-3	0,9	0,6
22:5 n-6	0,0	0,1
22:5 n-3	0,7	0,5
Pentaeny	28,2	18,7
22:6 n-3	20,5	14,4
Heksaeny	20,5	14,4
Obliczona wartość jodowa	291,6	220,3

T a b l i c a 16

Zawartość tokoferolu, całego trans-retinolu i cholekalcyferolu w oleju krylowym (E. pacifica)

2

alfa-tokoferol przez HPLC (IU)
Frakcja I^a)	0,91
Frakcja II^b)	0,83
qamma-tokoferol przez HPLC nq/q
Frakcja I^a)	Tr

PL 201 771 B1 cd. tabeli 16

1	2
Frakcja II^b)	Tr
delta-tokoferol przez HPLC μg/g Frakcja I^a)	N.D.
Frakcja II^b)	N.D.
cały trans-retinol przez HPLC (IU) Frakcja I^a)	395,57
Frakcja II^b)	440,47
cholekalcyferol przez hPLC (IU) Frakcja I^a)	N.D.
Frakcja II^b)	N.D.
Dane z laboratorium profesora Roberta Ackmana, Canadian Institute of Fisheries Technology, Halifax, Nowa Szkocja. Dane wyrażone na gram oleju krylowego. ^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton, wynoszącym 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C. ^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-octan etylu, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość), inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem. TR = ślad N.D. = nie wykryte Przemiana : witamina alfa-tokoferol mg/g oil x 1,36 = jednostka międzynarodowa cały trans-retinol Lig/g ± 0,3 = jednostka międzynarodowa T a b l i c a 17 Zawartość astaksantyny (E. pacifica) oraz kantaksantyny w oleju krylowym
Astaksantyna ^g/g oleju) Frakcja I^a)	93,1
Frakcja II ^b)	121,7
Kantaksantyna ^g/g oleju) Frakcja I ^a)	270,4
Frakcja II ^b)	733,0
Dane z laboratorium profesora Roberta Ackmana, Canadian Institute of Fisheries Technology, Halifax, Nowa Szkocja. ^a) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton, wynoszącym 1:6 (ciężar/objętość), inkubowane 2 godziny w temperaturze 4°C. ^b) : Ekstrakcja wykonywana przy stosunku próbka-aceton, wynoszącym 1:2 (ciężar/objętość)/ inkubowane 30 minut w temperaturze 4°C, po pierwszej ekstrakcji acetonem. T a b l i c a 18 Optymalne warunki dla ekstrakcji lipidów z tkanek zwierząt wodnych (procedura sugerowana)
Etap	Warunki
1	2
Rozdrabnianie (jeśli temperatura 4°C cząstki > 5 mm)
Ekstrakcja lipidów	stosunek próbka-aceton 1:6 (ciężar/objętość) 2 godziny (włączając wirowanie 20 minut) temperatura 4°C
Filtracja	filtr odporny na rozpuszczalniki organiczne pod zmniejszonym ciśnieniem
Mycie	stosunek próbka-aceton 1:2 (ciężar/objętość) czysty i zimny aceton
Filtracja	filtr odporny na rozpuszczalniki organiczne pod zmniejszonym ciśnieniem

PL 201 771 B1 cd. tabeli 18

	1	2
Odparowywanie		pod zmniejszonym ciśnieniem
Separacja olej-woda		4°C
Ekstrakcja lipidów		stosunek próbka-octan etylu 1:2 (ciężar/objętość)^a)czysty octan etylu 30 minut w temperaturze 4°C ^b)
Filtracja		filtr odporny na rozpuszczalniki organiczne pod zmniejszonym ciśnieniem
Odparowywanie		pod zmniejszonym ciśnieniem
^a) : Etanol można zastąpić izopropanolem, tert-butanolem lub octanem etylu. ^b) : temperatura 25°C przy stosowaniu tert-butanolu.
Atywność proteolityczna pozostałości krylowych pH 7,0, dla stosunku	T a b l i c a 19 przy użyciu laktosurowicy jako substratu, w temperaturze 37°C, enzym: substrat, wynoszącego 1:43
Czas (min)	Uwolnione aminokwasy ^mole)	Prędkość reakcji enzymatycznej ^mole/minutę)	Specyficzna aktywność enzymatyczna ^mole/min/mq*)
15	28,76	1,917	0,164
30	43,74	0,999	0,125
170	98,51	0,322	0,050
256	177,26	0,308	0,060

* cał kowita ilość enzymów w ś rodowisku hydrolizy

Claims

1. Sposób ekstrahowania frakcji lipidowych z materiału ze zwierząt morskich i wodnych, znamienny tym, że obejmuje etapy:

2. Sposób ekstrahowania frakcji lipidowych z materiału ze zwierząt morskich i wodnych, znamienny tym, że obejmuje etapy:

(d) umieszczenie wymienionej zawartości stałej w rozpuszczalniku organicznym wybranym z grupy, obejmują cej alkohol, korzystnie etanol, izopropanol lub tert-butanol, oraz estry kwasu octowego, korzystnie octan etylu, do uzyskania ekstrakcji pozostałej rozpuszczalnej frakcji lipidowej z wymienionego materiału ze zwierząt morskich i wodnych, (e) oddzielenie zawartości płynnej i stałej, (f) odzyskanie drugiej frakcji bogatej w lipidy przez odparowanie rozpuszczalnika z zawartości płynnej z e), i (g) odbieranie zawartości stałej.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że podczas etapu (a) rozpuszczalnik i materiał zwierzęcy homogenizuje się.

PL 201 771 B1

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że podczas etapu (d), rozpuszczalnik i zawartość stałą homogenizuje się.

5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy (b) i/albo (d) prowadzi się w atmosferze obojętnego gazu.

6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy (b) i/albo (e) wykonuje się technikami wybranymi spośród filtracji, wirowania i sedymentacji.

7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy (c) i/albo (f) wykonuje się technikami wybranymi spośród odparowywania pod zmniejszonym ciśnieniem, odparowywania rzutowego i suszenia z rozpylaniem.

8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że po etapie (b), a przed etapem (c) sposób dodatkowo obejmuje pośredni etap mycia zawartości stałej z użyciem rozpuszczalnika, oraz dodanie otrzymanego roztworu myjącego do zawartości płynnej z etapu (b).

9. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że po etapie (e), a przed etapem (f) sposób dodatkowo obejmuje pośredni etap mycia zawartości stałej z użyciem rozpuszczalnika organicznego wybranego w etapie (d).

10. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że przed etapem (a) materiał ze zwierzęcia morskiego i wodnego jest dokładnie rozdrabniany, korzystnie do średniej wielkości średnicy cząstek wynoszącej 5 mm lub mniej.

11. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy (a) i (b) prowadzi się w temperaturze rozpuszczalnika wynoszącej około 5°C lub mniej.

12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wymienionym zwierzęciem morskim lub wodnym jest zooplankton.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że zooplanktonem jest kryl.

14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że zooplanktonem jest Calanus.

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienionym zwierzęciem morskim lub wodnym jest produkt uboczny odfiletowanej ryby.

16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że całkowita frakcja lipidowa zawiera co najmniej astaksantynę i/lub kantaksantynę.

17. Ekstrakt lipidowy kryla, znamienny tym, że zawartość karotenoidów w astaksantynie wynosi co najmniej około 75 i korzystnie co najmniej około 90 μg/g ekstraktu krylowego, i zawartość karotenoidów w kantaksantynie wynosi co najmniej około 250 μg/g i korzystnie co najmniej około 270 μg/g ekstraktu kryla.

18. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że odzyskuje się zawartość stałą etapu b) i/lub e) składającą się z odwodnionej pozostałości zawierającej aktywne enzymy.

19. Zastosowanie ekstraktu lipidowego określonego w zastrzeżeniu 17 do stosowania lekarskiego, kosmetycznego, odżywkowego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.

20. Zastosowanie ekstraktu lipidowego określonego w zastrz. 17 do wytwarzania produktu wybranego z grupy składającej się z produktu medycznego, odżywczego, kosmetycznego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.

21. Zastosowanie ekstraktu lipidowego uzyskanego sposobem określonym w zastrz. 1 albo 2 do stosowania lekarskiego, kosmetycznego, odżywkowego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.

22. Zastosowanie ekstraktu lipidowego uzyskanego sposobem określonym w zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania produktu wybranego z grupy składającej się z produktu medycznego, odżywczego, kosmetycznego, do hodowli ryb i karmienia zwierząt.