NO321481B1

NO321481B1 - Fremgangsmate ekstraksjon av lipider fra marint og akvatisk dyrevev

Info

Publication number: NO321481B1
Application number: NO20011915A
Authority: NO
Inventors: Adrien Beaudoin; Genevieve Martin
Original assignee: Univ Sherbrooke
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 2001-04-18
Publication date: 2006-05-15
Also published as: PL201771B1; PT1123368E; AU6455299A; WO2000023546A1; HK1038765A1; RU2236441C2; AU765464B2; PL347396A1; JP4181305B2; JP5172281B2; JP2002527604A; CA2251265A1; NO20011915D0; BR9914699B1; EP1123368A1; CN1269940C; ZA200103235B; DK1123368T3; UA75029C2; KR100454899B1

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår ekstraksjonen av lipidfraksjoner fra marine og akvatiske dyr såsom krill, rødåte, fisk og sjøpattedyr. Mer spesifikt angår oppfinnelsen en forbedret fremgangsmåte for ekstraksjon av lipidfraksjoner ved dehydrering med løsemidler og gjenvinning av en fast rest som er rik på aktive enzymer. Oppfinnelsen angår i tillegg et krillekstrakt som er fritt for toksiske løsemidler og anvendelse av ekstraktet til fremstilling av et legemiddel.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Lipidfraksjoner fra marine og akvatiske dyr såsom krill, rødåte, fisk og sjøpattedyr har forskjellige anvendelser:

Medisinske anvendelser

Marine og akvatiske animalske oljer og fraksjoner av disse inneholder forskjellige terapeutiske midler. F.eks. er det angitt at forskjellige marine og akvatiske dyreoljer har anti-inflammatoriske egenskaper. Det er også angitt at marine og akvatiske dyreoljer kan redusere forekomsten av kardiovaskulære sykdommer. Det er videre angitt at enkelte marine og akvatiske dyreoljer undertrykker utviklingen av visse former av lupus og nyresykdommer. Som et videre eksempel kan det nevnes at krill kan brukes som en enzymkilde for debridering av forskjellige sår eller for å lette matfordøyelsen. Marine og akvatiske oljer inneholder dessuten forskjellige antioksidanter, og disse kan ha mulige terapeutiske egenskaper.

Næringsmidler

På bakgrunn av de fordelaktige effekter av omega-3 fettsyrer, kan oljer fra krill, rødåte og fisk brukes som et diettsupplement i den humane diett. Disse fettsyrene er vesentlige for skikkelig utvikling av hjernen og øyet. Marine og akvatiske dyreoljer er også rike på de lipoløselige vitaminene A, D og E og karotenoider.

Kosmetika

Forskjellige marine og akvatiske dyreoljer er brukt for fremstilling av fuktighetskremer.

Akvakultur

Blant de lipider som finnes i krill, rødåte og fisk, er det også høye konsentrasjoner av fettsyrer 20:5 (eicosapentaensyre) og 22:6 (docosaheksaensyre). Disse fettsyrene er essensielle næringsstoffer og er fordelaktige som fiskefor. Videre er det slik at disse vesentlige næringsstoffene føres over i den humane diett ved å spise fisk som er foret med slike dietter.

Dyrefor

Dyrefordietter som er rike på omega-3 fettsyrer kan øke nivået av umettede fettsyrer og nedsette kolesterolnivået i kjøtt. Denne egenskapen er allerede utnyttet innen fjærkreindustrien for å bedre eggkvaliteten.

Det er kjent forskjellige fremgangsmåter for ekstraksjon av marine og akvatiske dyreoljer. Det er f.eks. kjent hvordan en kan ekstrahere fiskeoljer ved å bruke organiske løsemidler såsom heksan og etanol. Det er også kjent hvordan en kan måle fettinnholdet i fiskemuskelvev ved å bruke løsemidler såsom aceton.

US patent 4 331 695 beskriver en fremgangsmåte ved å bruke løsemidler under trykk og som er gassformet ved romtemperatur, såsom propan, butan eller heksan. Ekstraksjonen utføres fortrinnsvis ved temperaturer mellom 15 og 80°C på opprevet vegetabilske eller finfordelte dyreprodukter. De ekstraherte oljer blir deretter utfelt under høyt trykk og forhøyede temperaturer mellom 50 og 200°C. Det er imidlertid slik at heksan er et dårlig ekstraksj<p>nsløsemiddel for marine dyr såsom krill. Videre blir lipidene negativt endret under de høye temperaturer som brukes under utfelningstrinnet.

Canadisk patentsøknd 2 115 571 beskriver en fremgangsmåte for ekstrahering av oljer fra forskjellige brun- og rødalgearter. Denne fremgangsmåten anvender f.eks. en såkalt Soxhlet-ekstraksjon ved å bruke nesten ren etanol i 40 timer.

US patent 5 006 281 beskriver en fremgangsmåte for ekstrahering av olje fra marine og akvatiske dyr såsom fisk. Det marine eller akvatiske dyret blir først behandlet med en antioksiderende forbindelse, blir deretter finfordelt og så sentrifugert for å skille oljefasen fra den vandige fasen og den faste fasen. Oljefasen blir så videre behandlet med et antioksiderende middel for å fjerne uønsket smak eller lukt.

Canadisk patent 1 098 900 beskriver en fremgangsmåte for ekstrahering av oljer fra krill. Denne fremgangsmåten innbefatter en emulgering av fersk eller frossen krill i et vandig medium. Oljefunksjonen blir så innvunnet ved sentrifugering.

Folch, i artikkelen publisert i 1957 i J. biol. Chem. 226: 497-509 «A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues», foreslår en ekstraksjonsmetode hvor en anvender kloroform og metanol. Denne fremgangsmåten er ikke kommersielt gjennomførbar på grunn av at de løsemidler som brukes er toksiske.

De tidligere kjente fremgangsmåter som angitt ovenfor er imidlertid generelt kommersielt lite gjennomførbare og gir lave kvantitative utbytter. Det er således en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en forbedret fremgangsmåte for ekstraksjon av marine og akvatiske oljer som muliggjør en gjenvinning av en verdifull lipidfraksjon og en separat gjenvinning av en verdifull fast rest av proteiner som innbefatter aktive enzymer. Denne hensikt er oppnådd med foreliggende oppfinnelse, kjennetegnet ved det som fremgår av de vedlagte krav.

Andre hensikter og anvendbarheten av den foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den etterfølgende detaljerte beskrivelse. Det er imidlertid underforstått at denne detaljerte beskrivelsen, skjønt den indikerer foretrukne utførelser av oppfinnelsen, kun er gitt for å illustrere oppfinnelsen som sådan, ettersom forskjellige forandringer og modifikasjoner lett kan utføres innenfor oppfinnelsens intensjon slik den fremgår av det etterfølgende.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra tørr krill (kloroform-metanol).

Fig. 2. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra tørr krill (aceton).

Fig. 3. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra frossen krill (aceton).

Fig. 4. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra frossen krill (etanol).

Fig. 5. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra frossen krill (t-butanol).

Fig. 6. Gass-væske-kromatografi av fettsyrer fra frossen krill (etylacetat).

Fig. 7. Tynnsjiktkromatografi av nøytrale lipider av Calanus sp. og M. norvegica.

Fig. 8. Tynnsjiktkromatografi av nøytrale lipider av E. pacifica.

Fig. 9. Tynnsjiktkromatografi av nøytrale lipider av M. schmitti.

Fig. 10. Tynnsjiktkromatografi av nøytrale lipider av G. galeus.

Fig. 11. Tynnsjiktkromatografi av nøytrale lipider av englehai.

Fig. 12. Tynnsjiktkromatografi av fosfolipider av Calanus sp. og M. norvegica.

Fig. 13. Tynnsjiktkromatografi av fosfolipider av E. pacifica.

Fig. 14. Tynnsjiktkromatografi av fosfolipider av M. schmitti.

Fig. 15. Tynnsjiktkromatografi av fosfolipider av G. galeus.

Fig. 16. Tynnsjiktkromatografi av fosfolipider av engelhai.

Fig. 17. Virkningen av acetonvolumet på lipidekstraksjonen (E. pacifica).

Fig. 18. Virkningen av inkubasjonstiden i.aceton på lipidekstraksjonen (E. pacifica).

Fig. 19. Virkningen av etanolvolumet på lipidekstraksjonen (E. pacifica).

Fig. 20. Virkningen av inkubasjonstiden i etanol på lipidekstraksjonen (T. raschii).

Detaljert beskrivelse av den foretrukne utførelsen

Før den foreliggende oppfinnelsen blir detaljert beskrevet er det underforstått at oppfinnelsen ikke er begrenset til dens anvendelse i den prosess som detaljert er

beskrevet i det etterfølgende. Oppfinnelsen kan gjennomføres på forskjellige måter i praksis ved hjelp av andre utførelser. Det er også underforstått at den terminologi som her brukes er for å beskrive oppfinnelsen som sådan og ikke er en begrensning av denne.

Den foreliggende fremgangsmåte omfatter at nylig oppsamlet eller oppfisket marint og akvatisk materiale suspenderes i aceton. Lipider blir ekstrahert med et keton såsom aceton. Dette gir en rask dehydrering av dyrevevet og en vandring av lipidfråksjonen over i løsemidlet. Den tørre resten er et verdifullt produkt som er rikt på aktive enzymer. I en foretrukket utførelse blir ekstraheringen utført ved suksessive aceton og alkoholbehandlinger. Foretrukne alkoholer er isopropanol og t-butanol. Alkoholen kan også erstattes med en ester av eddiksyre, f.eks. etylacetat. Denne fremgangsmåten gir to suksessive lipidfraksjoner og en tørr rest som er anriket på protein, og heri inngår aktive enzymer. Gjenvinning av totale lipider lar seg sammenligne med det som ble oppnådd av Folch et al. (1957), hvis fremgangsmåte er beskrevet i det foregående. Foreliggende fremgangsmåte er også testet med krill, rødåte, fisk og haivev.

Overraskende har en funnet at de suksessive ekstraheringsbehandlinger som er foreslått i foreliggende oppfinnelse, gir et bedre utbytte med hensyn til lipidekstrahering enn ved å bruke et enkelt løsemiddelsystem. Ekstraheringen hvor en bruker to suksessive løsemidler starter med keton såsom aceton, og dette er spesielt fordelaktig fordi acetonen i virkeligheten dehydrerer dyrevevet. Så snart dette befinner seg i dehydrert form vil ekstraheringsprosessen i høy grad bli lettet med det andre løsemidlet, enten dette er en alkohol eller en ester av eddiksyre, såsom etylacetat.

I forbindelse med zooplankton såsom krill og rødåte og i forbindelse med biprodukter fra fiskefilletering, såsom fiskeavfall, skal det bemerkes at en ekstrahering med aceton alene kan være tilstrekkelig til å gi en økonomisk effektiv gjenvinning av lipidfraksjoner og en separat gjenvinning av tørt fast produkt som er rikt på proteiner, blant annet aktive enzymer.

Den generelle ekstraheringsmetoden ifølge foreliggende oppfinnelse vil nå bli beskrevet. Utgangsmaterialet består av nylig innhøstet og fortrinnsvis finfordelt marint og akvatisk dyremateriale som underkastes en acetonekstraksjon, i ca. to timer, og fortrinnsvis over natten. Ekstraheringstiden er imidlertid ikke kritisk for utbyttet av lipidekstraheringen. For å lette ekstraheringen er det foretrukket å bruke partikler som er mindre enn 5 mm i diameter. Ekstraheringen blir fortrinnsvis utført under en inert atmosfære og ved temperaturer av størrelsesorden på ca. 5°C eller lavere.

Begynnelsen av ekstraksjonen bør fortrinnsvis utføres under røring i ca. 10-40 min., fortrinnsvis 20 min. Skjønt ekstraheringstiden ikke er kritisk, har man funnet at et tilfredsstillende resultat blir oppnådd med en to timers ekstrahering med et 6:1 volumforhold mellom aceton og det marine og akvatiske dyrematerialet.

De løseliggjorte lipidfraksjonene blir skilt fra det faste materialet ved standard teknikk, f.eks. filtrering, sentrifugering eller sedimentering. Det er foretrukket å bruke filtrering.

Etter separasjon ved filtrering på et filter som er resistent mot organiske løsemidler (metall, glass eller papir) blir resten eventuelt vasket med ren aceton, fortrinnsvis to volumer (i forhold til opprinnelige materialvolumet) for å gjenvinne enda flere lipider. De samlede filtrater blir så fordampet under redusert trykk. Eventuelt kan en bruke såkalt flash-fordampning eller forstøvningstørking. Den vannholdige resten etter fordampingen blir så hensatt for å skylle ut oljefasen (fraksjon I) ved lav temperatur.

Den faste resten som er oppsamlet på filteret, blir så suspendert og ekstrahert med alkohol, såsom etanol, isopropanol, t-butanol eller alternativt med etylacetat, fortrinnsvis to volumer (i forhold til det opprinnelige materialvolumet). Filtratet blir fordampet, dette gir en ny fraksjon av lipider (identifisert som fraksjon II). Skjønt ekstraheringstiden ikke er kritisk, har man funnet at en ekstraheringstid på ca. 30 min. er tilstrekkelig ved temperaturer under ca. 5°C.

Temperaturen på de organiske løsemidlene, bortsett fra t-butanol, og temperaturen på prøven er ikke kritiske parametre, men det er foretrukket at den er så lav som mulig. I forbindelse med t-butanol som imidlertid er fast ved romtemperatur, er det viktig at denne varmes før den anvendes og at ekstraheringen utføres umiddelbart ved ca. 25°C.

Sammenlignende eksempler

For å sammenligne effekten av den foreliggende ekstraheringsprosessen ble en klassisk fremgangsmåte (Folch et al. 1957) hvor en anvender kloroform og metanol, anvendt på krill. Denne fremgangsmåten er referansen for å måle effekten av den foreliggende ekstraheringsprosessen. En annen sammenligning ble utført med en teknikk hvor en anvender heksaner som ekstraheringsløsemidlet. Lipidgjenvinning ble bedømt ved å suspendere lipidfraksjoner i små volumer av de opprinnelige løsemidlene og utføre en gravimetrisk måling av små porsjoner etter fordampning.

I alle de foreliggende eksempler ga den foreliggende fremgangsmåten hvor en anvendte en acetonekstrahering fulgt av en ekstrahering med et nytt løsemiddel (etylacetat, f.eks.), en gjennomskinnelig olje med utseende og egenskaper som var mer tiltrekkende enn noen olje fremstilt ved hjelp av den klassiske teknikken til Folch et al. (1957).

For en analyse av lipidsammensetningen ble 780 |ig av hvert ekstrakt påsatt silikagelplater og fraksjonert ved hjelp av tynnsjiktkromatografi, TLC (Bowyer et al. 1962) med følgende løsemidler. Nøytrale lipider: heksan, etyleter, eddiksyre (90:10:1, v/v) og fosfolipider: kloroform, metanol, vann (80:25:2, v/v). Fettsyresammensetningen i E. pacifica ble analysert ved hjelp av gassvæskekromatografi , GLC (Bowyer et al. 1962) med visse modifikasjoner i forhold til den opprinnelige teknikk: 2 timer ved 65°C istedenfor 1 time ved 80°C, og tre vaskinger med heksan istedenfor to og ingen vasking med vann.

For å fjerne spor av det organiske løsemidlet ble lipidfraksjoner I og II oppvarmet til ca. 125°C i ca. 15 min. under en inert atmosfære.

Fett ble analysert ifølge the American Oil Chemisfs Society (AOCS). De følgende kriteria ble brukt for å analysere de ekstraherte lipidene: forsåpning og måling av Wijs jodindeks og nivå av fuktighet og flyktige stoffer. Kolesterolinnholdet ble også bestemt ved hjelp av fremgangsmåten til Plummer 1987. De samme analyser og andre ble utført av et uavhengig laboratorium under oppsyn av professor Robert Ackman (Canadian Institute of Fisheries Technology, DalTech, Dalhousi University, Halifax, Nova Scotia, Canada). Dette innbefatter Wijs jodindeks, innholdet av peroksid og anisidin, lipidklassesammensetning, fettsyresammensetning, frie fettsyrer FAME, kolesterol, tokoferol, all-trans retinol, kolekalsiferol, astaxantin og kantaxantin-innholdet.

Tabell 1 viser at større mengder av lipider ble ekstrahert fra tørr krill ved hjelp av aceton etterfulgt av etanol i sammenligning med den klassiske fremgangsmåte til Folch et al. (1957).

Tabell 2 viser resultatene av lipidekstrahering fra frosset Euphausia pacifica, en krillart fra Stillehavet. Idet en antar at 80 % av innholdet er vann, er lipidinnholdet sammenlignbart med det en finner i tørr krill slik det er vist i tabell 1. Isopropanol, t-butanol og etylacetat som løsemiddel i den andre ekstraheringen, gir et utbytte som er mindre viktig enn ved å anvende etanol, men er nødvendigvis ikke mindre effektivt med hensyn til lipidgjenvinning ettersom etanol overfører mer urenheter enn isopropanol, t-butanol og etylacetat. De kan således dessuten brukes som et nytt løsemiddel etter acetonen. Variasjoner mellom resultatene etter acetonekstraheringene skyldes i alt vesentlig vann-olje-separasjonene. Disse separasjonene er påvirket av mengden av gjenværende aceton i vann-olje-løsningen etter acetonfordampningen. Denne acetonmengden varierer fra ett eksperiment til et annet, fordi det fordampningssystem som blir brukt i mindre skala, ikke så lett lar seg reprodusere (i industriell skala vil fordampningstrinnet være optimalisert). Enkle løsemidler ble også testet for å ekstrahere den totale mengde av lipider fra krill. Dette viser at etylacetat (1,37 % ekstraheringsmengde) såvel som heksan (0,23 % ekstraheringsmengde) ikke er gode løsemidler, sammenlignet med aceton alene (1,86 % ekstraheringsmengde og enda mer med et mer effektivt acetonfordampningssystem).

En av hovedfordelene ved den fremgangsmåte som her er beskrevet, er at en fjerner bakterier fra ekstraktene (lipidfraksjonen og det faste, proteinrike materialet). Prøver av E. pacifica som var inkubert med varierende mengde av aceton ved 4°C i 112 dager ble inokkulert på NA-medium inneholdende Bacto™ kjøttekstrakt 0,3 %, Bacto™ pepton 0,5 % og Bacto™ agar 1,5 % (Difco Laboratories, Detroit, USA), ble så inkubert ved romtemperatur i 4°C i 18 døgn. En kunne ikke observere noen signifikant bakterievekst i et forhold på ett volum aceton pr. gram krill. Ved høyere mengder aceton (2 volumer og 5 volumer), var det ingen bakterievekst i det hele tatt, noe som betyr at aceton konserverer krillprøver. Aceton er kjent som et effektivt middel mot bakterier og virus (Goodman et al. 1980).

Tabell 3 viser utbyttet av lipider fra M. norvegica. Prosenten av lipider (3,67 %), lar seg sammenligne med det en oppnådde med E. pacifica (3,11 %), og som er vist i tabell 2. Variasjoner kan skyldes diett og tidspunkt med hensyn til innhøsting, som er forskjellig for de to artene.

Tabell 4 viser påvirkningen av oppmalingen på effekten av ekstrahering av lipider fra M. norvegica. Disse ekstraheringene ble utført under optimale betingelser og viser at den foreliggende fremgangsmåte er meget fordelaktig i forhold til den klassiske metoden (4,46 % versus 3,30 %). Den viser også at oppmaling kan være en viktig faktor når arten er stor (4,46 % versus 3,53 %).

Tabell 5 angir lipidekstrahering fra rødåte. Det ble oppnådd betydelig mengder av lipider. Enkelte variasjoner med hensyn til sammensetningen av de forskjellige Calanusartene kan forklare variasjonene mellom eksperimentene 1 og 2 (8,22 % og 10,90 % av fersk vekt).

Tabellene 6-8 angir den totale mengde lipider som ble ekstrahert fra fiskevev. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ble anvendt på makrell, ørrett og sild. Fremgangsmåten blir demonstrert på perifert vev (i alt vesentlig muskler) og involler. Fordelaktig gjorde foreliggende fremgangsmåte det mulig å gjenvinne verdifulle lipidfraksjoner fra fiskedeler som vanligvis blir kastet etter at filetene er fjernet fra fisken. Det fiskevev som ikke brukes etter at fisken er blitt bearbeidet for menneskelig bruk, bør lagres i aceton, hvoretter lipidene kan ekstraheres i

overenstemmelse med foreliggende oppfinnelse, selv om fremgangsmåten til Folch

(1957) gjenvinner mer lipider enn foreliggende fremgangsmåte. I virkeligheten blir små mengder lipider fra makrell (0,52 % fra involler og 1,45 % fra vev) ekstrahert ved hjelp av fremgangsmåten til Folch etter en første ekstraksjon med aceton og etanol som beskrevet i foreliggende oppfinnelse. Sammenlign ekstraheringen med den foreliggende fremgangsmåten utført i parallell med fremgangsmåten til Folch på ørrett og sild, viste at sistnevnte fremgangsmåte ga bedre gjenvinning. Det skal imidlertid bemerkes at fremgangsmåten til Folch ikke kan anvendes for innbinding av lipider for kommersielt bruk (på grunn av giftighet).

Tabellene 9-11 viser resultatene av lipidekstrahering av hailevervev. Det er ingen markerte forskjeller i resultater mellom de to teknikker innenfor én enkelt art.

Tabell 12 viser enkelte karakteristiske trekk ved fraksjon I (aceton) og fraksjon II (alkohol eller etylacetat) for krillolje (e. pacifica). For det første indikerer forsåpningsindeksen for fraksjon I (130,6) at denne fraksjonen inneholder fettsyrer med lengre kjeder sammenlignet med fraksjon II (185,7). Wijs jodindeks for fraksjon I viser at denne fraksjonen inneholder større mengder av polyumettede fettsyrer. Som en sammenligning kan det nevnes at olivenolje har en indeks på 81.1. Dette forklarer hvorfor fraksjon I er flytende ved romtemperatur. Det er velkjent at umettede fettsyrer har et smeltepunkt som ligger lavere enn én som inneholder de mettede homologene. De samme observasjoner kan gjøres for fraksjon II, som har en jodindeks på 127,2. Fettsyresammensetningen som er vist i tabell 14 bekrefter tallene fra jodindeksene, idet fraksjon I har en høyere prosent (30,24 %) av polyumettede fettsyrer (pentaner + heksaner), enn fraksjon II (22,98 %). Endelig viser tabell 12 at fraksjon I inneholder 10,0 % flyktige forbindelser og fuktighet etter fordampning av løsemidlet. I den samme testen har fraksjon II en prosent på 6,8. For å fjerne spor av løsemidler er det viktig raskt å oppvarme (til ca. 125°C i ca. 15 min.) oljen under nitrogen.

Resultatene på krillolje fremstilt i overensstemmelse med foreliggende fremgangsmåte (fraksjon I ekstrahert med aceton, og fraksjon II ekstrahert med etylacetat), er gitt i tabellene 12, 13, 14, 15, 16 og 17. Det skal bemerkes at i tabell 17 var innholdet av karetenoider signifikant høyt slik det ble målt ved hjelp av to karotenoider, nemlig astaxantin og kantaxantin). To parallelle analyser ga verdier på fra 92-124 \ xg pr. gram av lipidfraksjonen for astaxantin og 262-732 \ ig pr. gram for kantaxantin. Den foreliggende oppfinnelse viser således at krillekstraktet innbefatter astaxantin i en mengde på minst 75, fortrinnsvis minst 90 jig pr. gram av lipidfraksjonen. I forbindelse med kantaxantin inneholder lipidfraksjonen minst 250, fortrinnsvis minst 270 ug pr. gram. Lave verdier for peroksid og anisidin er fordelaktige og skyldes det høye innholdet av naturlige antioksidanter (astaxanin og kantaxantin). Disse forbindelser indikerer at krillekstraktet har gunstige farmasøytiske eller kosmetologiske egenskaper, og hvor det høye innholdet av karotenoider indikerer utmerkede hudabsorberende egenskaper. Krillekstraktet er således en god kandidat for transdermal administrering av medisiner.

Tabell 18 viser den beste utførelsen av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for lipidekstrahering av akvatisk dyrevev.

Tabell 19 viser at enzymaktiviteten for den faste fraksjonen opprettholdes etter behandling ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte. Eksperimentene ble utført på faste krillrester etter suksessive ekstraheringer med aceton og etylacetat. Proteolyttiske aktiviteter ble målt ved frigjøringen av aminogrupper ved hjelp av en spektrofotometrisk prøve hvor en anvendt o-ftaldialdehyd som en reagens. Proteinkonsentrasjonene ble målt ved hjelp av Bradford metoden. Løselige proteiner ble ekstrahert med vann og tilsatt et 10 % laktoserum-proteinkonsentrat fremstilt ved ultrafiltrering. Etter en inkubering ved 37°C i 50 mM kaliumfosfatbuffer, ble det tilsatt trikloreddiksyre, og mengden av NEb-grupper ble målt i supernatanten ved hjelp av den fremgangsmåten, som er beskrevet av Church et al. (1983, J Dairy Sei 66:1219-1227).

Fig. 1-6 viser kromatogrammer av fettsyresammensetningen i E. pacifica lipider. I hvert av kromatogrammene kan en bemerke de store mengdene av 20:5 og 22:6 fettsyrer (karakteristisk for marine og akvatiske oljer), og som er representert ved to distingte topper.

Variasjoner i lipidsammensetningen i nøytrale lipider (fra fig. 7 til fig. 11) fra én art til en annen, skyldes forskjeller i beitepreferanser eller matkilder. Innenfor én art (f.eks. E. pacifica) er det f.eks. ingen markert variasjon mellom de lipidsammensetninger en oppnådde ved hjelp av forskjellige teknikker med hensyn til lipidekstraheringen. Med hensyn til fosfolipider (fig. 12 til fig. 16), er det motsatte tilfeller, idet variasjonene kan forklares ut fra de forskjellige ekstraheringsprosessene, ettersom den samme arten ikke fører til samme lipidmønster. Lipider fra forskjellige haiarter (ekstrahert ved de nevnte fremgangsmåter) og kommersiell tranolje (prøver tilgjengelig fra Uniprix butikker, provinsen Québec, Canada) er i alt vesentlig sammensatt av nøytrale lipider i motsetning til fosfolipider.

Virkningen av løsemiddelvolumet og inkuberingstiden på effekten med hensyn til acetons evne til å ekstrahere lipider fra E. pacifica, er vist i fig. 17 og 18, henholdsvis. Et forhold på 1:6 (vekt/volum) ga et optimalt utbytte etter en fullstendig ekstraksjon i to timer. I det andre ekstraheringstrinnet ble det eksperimentert med etanol. Volumet av dette løsemidlet synes ikke å være kritisk, ettersom en fikk det samme utbyttet med forskjellige etanolvolumer (fig. 19), men inkuberingstiden for etanol bør være minst 30 min., hvis dette er indikert ved resultatene på fig. 20.

En av oppfinnerne, Dr. Adrien Beaudoin, har tatt forskjellige lipidfraksjoner av krill. En kunne ikke observere noen sideeffekter.

Skjønt oppfinnelsen er blitt beskrevet med hensyn til én spesifikk form, så er det innlysende at den lett kan modifiseres og raffineres på forskjellige måter. Slike modifikasjoner og variasjoner inngår derfor i foreliggende oppfinnelse som sådan, og at oppfinnelsen derfor utelukkende er begrenset på bakgrunn av de etterfølgende krav.

Forsøk har vist at krillrester oppnådd etter en ekstrahering med aceton og etylacetat, inneholder enzymer med proteolyttiske aktiviteter. Proteolytiske aktiviteter ble målt ved frigjøringen av aminogrupper ved hjelp av en spektrofotometrisk prøve hvor en brukte o-ftaldialdehyd som en reagens. Proteinkonsentrasjonene ble målt ved Bradford metoden.

Enzymkilden var den rest en fikk etter en aceton- og etylacetatekstrahering av lipider. Løselige proteiner ble ekstrahert med vann og tilsatt et 10 % laktoserumproteinkonsentrat fremstilt ved ultrafiltrering.

Etter en inkubering ved 37°C i en 50 mM kaliumfosfatbuffer, ble det tilsatt trikloreddiksyre, og mengden av Nt^-grupper ble målt i supernatanten ved hjelp av en fremgangsmåte, som er beskrevet av Church et al. 1983.

BIBLIOGRAFI

Bowyer, D.E., Leat, W.M.F., Howard, A.N. and Gresham, G.A. 1962. The determination of the fatty acid composition of serum lipids separated by thin-layer chromatography; and a comparison with column chromatography. BBA. 70: 423-431.

Chandrasekar, B., Troyer, D.A., Venkatraman, J.T. and Fernandes, G. 1996. Tissue speficic regulation of transforming growth factor beta by omega-3 lipid-rich krill oil in autoimmune murine lupus. Nutr Res. 16(3): 489-503.

Christensen, M.S., Hoy, C-E. and Redgrave, T.G. 1994. Lymphatic absorption of n-3 polyunsaturated fatty acids from marine oils with different intramolecular fatty acid distributions. BBA. 1215: 198-204.

Church, F.C., Swaisgood, H.E., Porter, D H. and Catignani, G.L. 1983. Spectrophotometric assay using o-Phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins. J. Dairy Sei. 66: 1219-1227.

Difco laboratories. 1984. Difco Manual Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology. 10th ed. Detroit.

Folch, J., Lees, M. and Sloane-Stanley, G.H. 1957. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. biol. Chem. 226: 497-509.

Goodman Gilman, A., Goodman, L.L. and Gilman, A. 1980. The Pharmacological Basis of Therapeutics. 6,h ed. Collier Macmillan Canada ltd, Toronto.

Harwood, H.J. and Geyer, R.P. 1964. Biology Data Book. The Federation of American Societies for Experimental Biology, Washington.

Hellgren, L., Karlstam, B., Mohr, V. and Vincent, J. 1991. Krill enzymes. A new concept for efficient debridement of necrotic uleers. Int J Dermatol. 30(2): 102-103.

Plummer, D.T. 1987. An introduction to practical biochemistry. 3th ed. McGraw-Hill Book Company, London.

Rawn, J.D. 1990. Traité de biochimie. De Boeck-Wesmael, Bruxelles.

Runge, J.A. and Joly, P. 1994. Rapport sur Pétat des invertébrés en 1994: 7:0 Zooplancton (Euphausiacés et Calanus) de PEstuaire et du Golfe du Saint-Laurent. Sargent, J.R. 1997. Fish oils and human diet. Br J. Nutr.78 Suppl 1: S5-S13.

Claims

1. Fremgangsmåte for ekstrahering av totale lipidfraksjoner fra marint og akvatisk dyremateriale, karakterisert ved at fremgangsmåten innbefatter følgende trinn: (a) plassering av det marine og akvatiske dyrematerialet i et ketonløsemiddel, fortrinnsvis aceton, for å oppnå en ekstraksjon av den løselige lipidfraksjonen fra nevnte marine og akvatiske dyremateriale; (b) skille væske og faste innhold som resulterer fra trinn (a); (c) gjenvinne en første lipidrik fraksjon fra væskeinnholdet fra trinn b) ved å fordampe det løsemiddel, som er til stede i væskeinnholdet; (d) plassere nevnte faste innhold i et organisk løsemiddel, for å oppnå en ekstrahering av den gjenværende løselige lipidfraksjonen fra nevnte marine og akvatiske dyremateriale; (e) skille væske og faste stoffer som resulterer fra trinn (d); (f) gjenvinne en andre totale lipidrik fraksjon ved å fordampe løsemidlet fra væskeinnholdet i e).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen av trinn (a) blir utført under risting etter at dyrematerialet er malt.

3. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 og 2, karakterisert ved at ekstraksjonen av trinn (d) blir utført under risting etter at dyrematerialet er malt.

4. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at trinnene (a) og (d) utføres under en inert atmosfære.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at trinnene (b) og (e) utføres ved hjelp av teknikk valgt fra filtrering, sentrifugering og sedimentering.

6. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at trinnene (c) og (f) utføres ved hjelp av teknikk valgt fra fordampning under redusert trykk, flashfordampning og forstøvningstørkning.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at etter trinn (b) og før trinn (c) omfatter fremgangsmåten et ytterligere mellomliggende trinn hvor det faste stoff vaskes med løsemidlet, hvoretter den resulterende vaskeløsningen tilsettes væskeinnholdet fra trinn (b).

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at etter trinn (e) og før trinn (f) omfatter fremgangsmåten et mellomliggende trinn hvor de faste stoffer vaskes med det organiske løsemidlet som er valgt under trinn (d).

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det før trinn (a) blir det marine og akvatiske dyrematerialet finfordelt, fortrinnsvis til en midlere partikkelstørrelse på 5 mm eller mindre.

10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at trinnene (a) og (b) utføres ved løsemiddeltemperaturer på 5°C eller lavere.

11. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at nevnte marine og akvatiske dyr er zooplankton.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte zooplankton er krill.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at nevnte zooplankton er rødåte.

14. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-10, karakterisert ved at nevnte marine og akvatiske dyr er fisk.

15. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-14, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet er valgt fra gruppen som består av etanol, isepropanol og estere av eddiksyre.

16. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-14, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet er etylacetat.

17. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at det organiske oppløsningsmiddelet er t-butanol og hvori trinnene (a) og (b) blir utført ved oppløsningsmiddeltemperaturer på 25°C.

18. Fremgangsmåte for for ekstrahering av en astaxantin-og-kantaxantin-holdig fullstendig lipidfraksjon fra et marint og akvatisk dyremateriale valgt fra zooplankton og fisk, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte innbefatter følgende trinn: (a) plassere nevnte dyremateriale i et ketonløsemiddel, fortrinnsvis aceton for å oppnå en ekstraksjon av den løselige lipidfraksjonen fra nevnte marine og akvatiske dyremateriale; (b) skille innholdet av væske og faste stoffer som resulterer fra trinn (a); (c) gjenvinne en lipidrik fraksjon fra væskeinnholdet ved å fordampe løsemidlet i nærvær av væskeinnholdet; hvorved en oppnår en astaxantin-og-kantxantin-holdig total lipidfraksjon.

19. Fremgangsmåte for ekstrahering av en total lipidfraksjon fra et marint og akvatisk dyremateriale valgt fra zooplankton og fisk, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter følgende trinn: (a) plassere nevnte dyremateriale i en oppløsningsblanding som omfatter aceton og etanol for å oppnå en ekstraksjon av den løselige lipidfraksjonen fra nevnte marine og akvatiske dyremateriale; (b) skille innholdet av væske og faste stoffer som resulterer fra trinn (a); (c) gjenvinne en lipidrik fraksjon fra væskeinnholdet ved å fordampe løsemidlet i nærvær av væskeinnholdet; hvorved en oppnår en total lipidfraksjon.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 18 eller 19, karakterisert ved at dyrematerialet er krill.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 18 eller 19, karakterisert ved at dyrematerialet er rødåte.

22. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-21, karakterisert ved at ekstraksjonen av trinn (a) blir utført under risting etter at dyrematerialet er malt.

23. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-22, karakterisert ved at trinn (a) utføres under en inert atmosfære.

24. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-23, karakterisert ved at trinn (b) utføres ved hjelp av en teknikk valgt fra filtrering, sentrifugering og sedimentering.

25. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-24, karakterisert ved at trinn (c) utføres ved hjelp av en teknikk valgt fra vakuumfordampning, flashfordampning og forstøvningstørking.

26. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-25, karakterisert ved at etter trinn (b) og før trinn (c), omfatter fremgangsmåten ytterligere et trinn med vasking av nevnte faste stoffer med et løsemiddel og tilsetter den resulterende vaskeløsningen til væskeinnholdet fra trinn (b).

27. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-26, karakterisert ved at før trinn (a) blir det marine og akvatiske dyrematerialer finfordelt, fortrinnsvis til en midlere partikkelstørrelse på 5 mm eller mindre.

28. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 18-27, karakterisert ved at trinnene (a) og (b) utføres ved en løsemiddeltemperatur på 5°C eller lavere.

29. Fremgangsmåte for lipidekstraksjon ifølge ethvert av kravene 1-28, karakterisert ved at de resulterende faste stoffer gjenvinnes og består av en dehydrert rest inneholdende aktive enzymer.

30. Total krill-lipidekstrakt, karakterisert ved at det er fritt for toksiske løsningsmidler og at karotenoidinnholdet i astaxantin er 75 eller mer, fortrinnsvis minst ca. 90 fig/g eller mer krillekstrakt, og karotenoidinnholdet i kantaxantin er 250 ug/g eller mer og fortrinnsvis minst ca. 270 ug/g krillekstrakt eller mer.

31. Anvendelse av krill-lipidekstrakt fra krav 30 i en applikasjon valgt fra gruppen bestående av medisinske, næringsmessige, kosmetiske, akvakultur og dyreforapplikasjoner.

32. Anvendelse av krill-lipidekstrakter ifølge krav 30 for fremstilling av et legemiddel for behandling av en sykdom valgt fra gruppen som består av inflammatorisk sykdom, kardiovaskulær sykdom, lupus og nyresykdom.