KR20000036176A - 다-배열, 다-특이성 전기화학발광 시험법 - Google Patents

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Abstract

진단에 사용하기 위한 패턴화된 다-배열, 다-특이성 표면의 생산을 위한 물질 및 방법이 제공됨. 본 발명은 해당 분석물 검출 또는 측정을 위한 전기화학발광 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 ECL 분석을 위한 신규 전극을 제공한다. 전도성 영역의 화학 및/또는 물리적 조절을 위한 물질 및 방법과 다-특이성 시험 절차에 사용하기 위한 시약 침착을 제공한다.

Description

다-배열, 다-특이성 전기화학발광 시험법{MULTI-ARRAY, MULTI-SPECIFIC ELECTROCHEMILUMINESCENCE TESTING}
2.1. 진단 분석
빠르게 감지하는 진단 기술에 대한 강한 경제적 필요가 존재한다. 진단 기술은 건강 치료, 연구, 농업, 수의학, 및 산업시장을 포함하는 광범위한 경제 시장에서 중요하다. 민감도, 요구 시간, 사용의 용이, 견고함, 또는 가격면에서의 향상은, 이전에 시장 수요를 채울 수 있는 기술이 없었던 진단 시장을 새롭게 전적으로 개방할 수 있다. 어떤 진단 기술들은 고감수성을 지닐 수 있으나, 시장 수요를 채우기에는 너무 비싸다. 다른 기술들은 가격면에서는 효과적일 수 있으나, 다양한 시장을 위해서는 충분히 견고하지 않다. 이러한 양질과 결합할 수 있는 신규한 진단 기술은 진단 사업에 있어서 중대한 발전이며 기회이다.
진단 적용에 사용되는 상이한 분석 기술들이 많이 있다. 이러한 기술들은 방사선 표지법, 효소 연결 면역분석법, 화학 유색도 분석법, 형광 표지법, 화학발광 표지법, 및 전기화학발광 표지법을 포함한다. 이러한 기술들 각각은 서로 다른 진단 시장에서의 이들의 사용을 제한하고 한정하는, 민감도 레벨, 사용의 용이, 견고함, 속도 및 가격의 독특한 조합을 가진다. 이러한 차이들은 각 기술들 고유의 물리적 압박에 부분적으로 기인한다. 예를 들면, 방사선 표지법은 표지 자체가 붕괴되기 때문에 비-견고하고, 결과 생기는 방사선 폐기물의 처리가 많은 적용을 위해 값비싼 경제적, 안전적 및 환경적 비용을 초래한다.
오늘날 사용되는 많은 민감한 진단 기술들은 일차적으로 시험을 수행하는 숙련공들을 위한 수요때문에 시장-제한적이다. 오늘날 사용되는 전기화학발광 과정은, 예를 들면, 숙련공들 뿐만 아니라 반복 세척 및 준비 단계도 필요로 한다. 이는 폐기물 처리를 위해 비용 및 수요 모두를 증가시킨다. 시험 당 비용을 절감시킬뿐만 아니라 시험 과정을 단순화하는 신규한 진단법은 기존 시장에서의 수행을 향상시킬 뿐만 아니라, 새로운 시장을 개척함에 있어서 매우 중요하며 활용적이다.
2.2. 전기화학발광 분석법
전기화학발광("ECL")은 전기적으로 여기된 종(species)이 광자를 방출하는 현상이다[참고문헌; Leland and Powell, 1990 J. Electrochem. Soc. 137(10):3127-3131]. ECL이 유도될 수 있는 종을 ECL 표지로 명명하며, 본원에서는 또한 TAG로도 언급하기로 한다. 주로 사용되는 ECL 표지는 다음을 포함한다: 금속이 예를 들면, 8족의 귀금속으로부터 유래되는, Ru-함유 및 Os-함유 유기 금속 화합물을 포함하는 유기금속 화합물, 예컨대, Ru(2,2'-비피리딘)3 2+일부 (또한 "Rubpy" 또는 TAG1으로도 언급됨)가 개시되어 있다[참고문헌; Bard et al. 미국 특허 No. 5,238,808]. "TAG1" 및 "Rubpy" 또한 Ru(2,2'-비피리딘)3 2+의 유도체를 의미한다. ECL-기본 검출 시스템에의 토대는 광자를 방출하기 위해 ECL 표지를 여기시키는 전기 전위를 위하여 필요하다. 전기 전위 파형은 전극 표면, 전형적으로 금속 표면, 및 카운터 전극을 횡단하는 ECL 분석법에 적용된다[참고문헌; 미국 특허 Nos. 5,068,088, 5,093,268, 5,061,445, 5,238,808, 5,147,806, 5,247,243, 5,296,191, 5,310,687, 5,221,605]. ECL은 작동전극으로부터 수신된 전기 에너지에 의해 촉발되는 일련의 화학반응 결과로서 여기상태로 촉진된다. 옥살레이트 또는, 더욱 바람직하게는 트리프로필아민과 같은 TAG의 ECL을 촉진하는 분자가 유리하게 제공된다(미국 특허 5,310,687 참조).
ECL 반응에서 TAG의 여기는 전형적으로 전극 표면으로 TAG 분자의 확산을 동반한다. 전극에 의한 TAG 분자의 여기를 위한 기타 메커니즘은 용액내 전기화학 중개자[참조문헌:Haapakka, 1982, Anal Chim. Acta, 141:263]의 사용 및 전극에 TAG 분자를 제공하는 비드의 포획을 포함한다(PCT 출원 공개 번호 WO 90/05301 및 WO 92/14139).
이와 달리, ECL은 예를 들면, 비특이적 흡착[참조문헌:Xu et al., 1994, Ladgmuir, 10:2409-2424], L-B 필름으로의 혼입[참조문헌: Zhang et al., 1988, J. Phys. Chem., 92:5566], 자가 조립 단일층으로의 혼입[참조문헌: Obeng et al., 1991, Langmuir, 7:195], 및 두꺼운(마이크로미터) 필름 중으로의 혼입[참조문헌: Rubenstein et al., 1981, J. Am. Chem. Soc., 102:6641]에 의해, 작동전극 표면에 직접 흡착된 TAG로부터 관찰된다(미국 특허 5,324,457). 이와 유사하게, Xu 등(PCT 출원 공개 WO 96/06946)은 DNA 스트랜드가 알칸티올레이트의 자가 조립 단일층에 고정된 알루미늄 센터와의 상호작용에 의해 금 전극에 흡착될 때 DNA 스트랜드 중으로 개재된 TAG 분자로부터의 ECL을 관찰하였다.
당업계에 알려진 다양한 장치들이 ECL 반응을 수행하고 검출하는데 이용될 수 있다. 예를 들면, ECL을 수행하기 위한 전기화학 전지용 예시적 전극이 개시되어있다[참고문헌; Zhang et al. 미국 특허 No. 5,324,457]. ECL 반응을 수행함에 있어서 사용되는 전기화학 전지가 개시되어있다[참고문헌; Levantis et al. 미국 특허 No. 5,093,268]. 전압 조절 장치를 포함하여, ECL 반응을 수행하고 검출하기 위한 장치가 개시되어있다[참고문헌; Kamin et al. 미국 특허 No. 5,147,806]. ECL 반응 유도용 전기 전위 파형 다이어그램, 디지탈 대 아날로그 전환기, 조절 장치, 전극 조절 장치로 피드백 정보를 제공하기 위하여 작동전극에서 ECL 반응에 의해 생성된 전류 검출용 검출 장치 및 방법을 포함하여, ECL 반응을 수행하고 검출하기 위한 장치가 개시되어 있다[참고문헌; Zoski et al. 미국 특허 No. 5,061,445].
2.3. 상업적인 ECL 분석법
ECL 표지에 의해 생성된 광은 진단절차에서 리포터 시그널로서 사용될 수 있다[참조문헌: Bard et al., 미국 특허 5,221,605]. 예를 들면, ECL 표지는 항체 또는 핵산 탐침과 같은 결합시약에 공유결합될 수 있다. ECL 표지/결합시약 복합체는 각종 물질의 분석에 사용될 수 있다[참조문헌: Bard et al., 미국 특허 5,238,808]. 분석에 ECL의 사용은 예를 들면, 문헌[참조: Knight et al., 1994, Analyst,119:879-890]에 상세하게 고찰되어 있다. 간단히 말해서, ECL 기술은 비교적 적은 농도로 샘플에 존재하는 해당 분석물을 소정량의 샘플에서 검출하는 방법으로서 사용될 수 있다.
지금까지, 모든 상업적인 ECL 반응은 센티미터 규모 전극 표면 상에서 수행되었다. 센티미터 규모의 전극은 보다 큰 전극으로부터 기인하는 ECL 시그널의 증가된 크기와 각 분석을 위해 필요한 총 샘플 부피를 감소하고자 하는 바램 사이의 균형을 깨뜨린다. 그러나, 센티미터 규모 전극조차도 많은 분석법을 위해 필요되는 민감도를 달성하는데는 실패한다. 상기 문제점을 극복하고자 하는 시도에서, 모든 상업적인 ECL 시스템은 ECL 분석물 또는 시약을 포획하기 위해 코팅된 마그네틱 비드를 사용함으로써 추가로 민감도를 향상시킨다. 그리고나서, 상기 비드는 향상된 민감도를 위해 작동전극에 근접하여 이동된다.
그러나, 현행 기술은 일회용 카트리지를 사용하는 저가 분석에서의 사용 및 다중 분석을 동시에 수행하는 고 처리량 시스템에서의 사용을 제한하는 다수의 제한점을 가진다.
한 번의 분석에 각 분석물을 위한 상이한 ECL 표지를 사용하고, 서로 상이한 분석물을 위해 상이한 파장에서 각각 방출되는 광자를 사용함으로써, 상이한 분석물 하나 이상을 동시적으로 분석하는 방법이 제안되었다[참고문헌; Leventis et al., 미국 특허 No. 5,093,268]. 하지만, 이런한 기술은, 예를 들면, 서로 다른 파장에서 방사하는 충분한 수의 효과적인 ECL 표지의 비유용성 및 각 ECL 표지를 위한 화학 조건을 극대화할 필요성에 의해 제한된다. 이러한 실질적 제한에 의해, 상기 다-파장, 다-분석물 ECL 검출 시스템의 상업화는 방해되었다.
ECL 분석법을 수행하기 위한 상용 방법은 또한, 전극을 포함하는 분석 전지가 희석 산, 희석 염기, 세제 용액 등의 이용을 포함하는 많은 방법[참고문헌; 미국 특허 No. 5,147,806] 중의 임의의 방법에 의해 깨끗하게 되어야 함을 필요로 한다.
2.4 발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 ECL 분석 수행을 위한 신규하고 비용 효과적인 일회용 전극을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 다수의 ECL 반응을 순차적으로 또는 동시적으로 수행하기 위한 신규하고 가격 효과적인 분석법을 제공하며, 개선된 정확도를 위해 강화된 조절 표준이 바람직한 양태에서 제공된다.
추가로, 본 발명의 목적은, 또한 폐기 가능한 많은 ECL 반응을 순차적으로 또는 동시적으로 수행하기에 적절한 하나 이상의 지지체를 포함하는 카세트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 생물학적 샘플내 해당 분석물을 위한 개별적인 분석을 수행함에 있어서 시간 및 비용을 절감하는 것에도 추가로 관련된다.
하나의 생물학적 샘플내 다수의 해당 분석물을 위한 다수의 동시적인 분석법을 수행함에 있어서의 방법 및 장치를 제공하는 것이 본 발명의 추가 관련 목적이다.
발명의 개요
본 발명은 지지체에 고정된 하나 이상의 결합영역으로 이루어진 ECL 반응 및 분석을 수행하기 위한 카세트에 관한 것이다. 지지체는 전기화학발광 생성을 위한 전극으로서 작용할 수 있다. 이와 달리, 하나 이상의 전극은 추가의 지지체 상에 존재할 수 있고, 전극은 ECL을 생성하도록 제 1 지지체에 근접하여 위치한다. 카세트는 하나 이상의 전극 또는 하나 이상의 전극/카운터전극 쌍을 구비할 수 있다. 또한, 카세트는 제 1 지지체에 근접하여 위치할 수 있는 제 2 지지체를 포함할 수도 있는데, 이는 지지체들 사이에 수단을 포함하는 샘플을 제공하거나 및/또는 전극으로서 역할하기 위함이다. 결합영역은 해당 분석물 또는 시약에 결합하기 위하여 지지 표면 상에서 패턴화되고, 제조된다.
본 발명은 또한 일회용 포맷으로 사용하기 알맞은 신규한 일회용 전극에 관한 것이다. 이러한 전극은 유리질 탄소, 카본 블랙 또는 탄소(흑연)나노튜브와 같은 다양한 형태의 탄소로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 복합전극, 즉, 하나 이상의 물질로 이루어진 전극에 관한 것이다. 이러한 전극은 일회용 포맷용에 알맞도록 하기 위해 성능, 가격 및 제조성을 조절하도록 주문될 수 있다.
본 발명은 또한, 입자가 결합시약용 고체상 지지체로서 사용되는 분석에 관한 것이다. 이러한 입자는 여과에 의해 다공성 전극상에 포획되고 분석물을 검출한다. 입자와 예비 제조된 수행필터에 기초한 키트가 설명된다.
본 발명은 추가로 둘 이상의 ECL 시그널을 분석하는 데 사용될 수 있는 전극에 관한 것이다. 전극 개질방법 또한 기술된다.
추가로, 본 발명은 지지체 또는 카세트 조작 수단, 전기화학발광을 개시하기에 효과적으로 조절된 전압 파형에 적용하도록 조정된 전압 조절 수단, 샘플로부터 전기화학발광을 검출하기 위한 광자 검출 수단 및 샘플 조작 수단을 제공하는 샘플의 전기화학발광을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 ECL 분석 조건하에서 다수의 카세트의 결합영역을 다수의 해당 분석물을 함유하는 샘플과 접촉시킨 다음, 전기화학발광을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 적용시켜 개시된 전기화학발광을 검출 또는 측정함으로써, 샘플내 전기화학발광을 측정하기 위한 카세트를 사용하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다수의 전기화학발광 반응을 동시적으로 측정하기에 적절한 카세트, 표면 상에 고정된 다수의 부위가 존재하는 지지표면 및 ECL 분석을 수행하기 위한 화학 반응을 행하는 매질을 포함하는 구성요소로 이루어진 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 고속 일회용 전기화학발광 분석에 관한 것이다. 상용 ECL 분석은 작동전극 및 카운터 전극이 달린 유동 셀을 사용하여 수행된다. 본원에서 기술되는 일회용 전극은 영구 유동 셀 전극에서와 달리 세척 및/또는 소제를 요하지 않는다.
본 발명은 또한 다공성 전극의 사용을 통하여 증가된 동역학을 제공한다. 포맷되고/되거나 다공성인 일회용 전극을 사용하여 분석 결과를 신속히 산출해 낼 수 있다. 일회용 전극을 사용한 분석 결과는 1 시간 안에 달성될 수 있다. 바람직한 양태로서, 일회용 전극으로부터의 ECL 분석결과는 30 분 안에 및 일부 경우에는 15 분 안에 달성될 수 있다. 가장 바람직한 양태로서, 분석 결과는 5 분 안에 또는 가장 유리한 경우에는 1 분 안에 성취될 수 있다. 본 발명의 다중 분석 포맷에 있어서, 하나 이상의 ECL 분석 결과는 이러한 시간 안에 달성될 수 있다. 고속 일회용 ECL 시스템용 키트가 기술된다.
추가로, 본 발명은 휴대용 ECL 진단장비를 제공한다. 휴대용 ECL 진단용 카트리지 또는 키트는 신규한 일회용 전극 및 시약 팩을 사용할 수 있다. ECL 분석용 PMAMS 및 전극은 휴대용 ECL 장비 판독기에 사용하기 위한 키트로서 포장될 수 있다. 이러한 키트 및 ECL 장비 판독기를 사용하여 단기간에 분석결과를 달성할 수 있다. 분석결과는 전술한 매우 짧은 기간 안에 달성될 수 있다.
본 발명은 전기화학발광 기본 시험을 위한 패턴화된 다-배열, 다-특이적 표면(PMAMS)을 제공하며, PMAMS를 제조하고 사용하는 방법도 또한 제공한다.
도 1은 다수의 결합영역이 전극에 존재하는 본 발명에 따른 카세트를 설명한다.
도 1a는 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타내는 것으로서, 상기에서 다수의 결합영역(14)이 지지체(10) 상에 존재하고 다수의 상응하는 전극(16)이 지지체(12) 상에 존재함으로써, 지지체들의 접근에 의해 전극쌍은 각 결합영역에 인접하여 배치된다.
도 2는 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타내는 것으로서, 상기에서 지지체(26) 상의 다수의 결합영역(30)이 단일 전극(32) 각각에 근접함으로써, 지지체(26) 및 (28)의 접근에 의해 카운터 전극(38) 각각은 각 결합영역(30)에 인접하여 배치된다.
도 3은 다수의 결합영역(48)이 지지체(44) 상에서 결합영역에 인접한 전극 및 카운터 전극 쌍(50)을 가지는, 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타낸다. 지지체(46)는 결합영역(48) 및 전극(50)에 근접한 수단을 함유하는 샘플을 제공하기 위해 임의로 지지체(44)에 근접하게 위치할 수 있다.
도 4는 지지체(60) 상의 다수의 결합영역(64)이 분석물을 함유하는 샘플과 접촉하는, 본 발명에 따라 카세트를 형성하는 두 개의 지지체를 나타낸다. 지지체(62)는, 지지체(60) 및 지지체(62)의 접근에 의해 결합영역(64) 및 영역(66)이 서로 접촉하도록 하기 위해서, 해당 분석물을 검출 또는 측정하거나 원하는 반응을 수행하기 위한 반응 매질을 함유하는 영역(66)을 가진다.
도 5a는 다-배열, 다-특이적 결합 표면을 위한 패턴화된 결합영역의 윗면도을 나타낸다. 기하학적 모양, 삼각형, 사각형 및 원은 상이한 분석물을 위한 특이적 결합영역을 나타낸다. 결합영역은 소수성 또는 친수성일 수 있다. 주변 표면은 결합시약 또는 분석물을 결합영역으로부터 분산되는 것을 최소화하기위해 결합영역에 반대되는 성질(친수성 또는 소수성)을 가질 수 있다.
도 5b는 결합시약 및/또는 분석물을 분리된 결합영역으로 전달하기 위한 미세유체 가이드의 윗면도를 나타낸다. 각각의 도트는 미세유체 가이드의 횡단면(예; 모세관)을 나타낸다.
도 5c는 결합시약 및/또는 분석물을 패턴화된 다 배열의 결합영역으로 전달하기 위하여 일직선상에 맞춰져 정렬된 미세유체공학 가이드의 접근을 보여주는 미세유체 가이드의 측면도를 나타낸다. 각각의 미세유체 가이드는 상이한 결합시약을 분리된 결합영역으로 전달할 수 있다.
도 6a는 패턴화된 다-배열, 다-특이적 결합영역을 가지는 표면을 지닌 레지스터내에서의 다-배열 전극들의 접근을 나타낸다. 제거될 수 있는 전극 보호 장벽은 전극 배열과 결합 표면 배열 사이에 보여진다. 전체적인 어셈블리는 다수의 ECL 반응을 수행하기 위한 카세트를 포함한다.
도 6b는 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 카운터 전극의 배열의 접근을 나타낸다. 전극은 결합영역과 상보적인 모양이거나 기타의 모양(예; 깍지낀 모양)일 수 있다.
도 7은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 카운터 전극과 상보적 결합 표면의 접근된 배열을 나타내는 측면도인데, 상기에서, 전도성 중합체는 전극 배열 및 결합영역 사이의 갭을 통해 전극 표면으로부터 연장됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 둘레로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 8은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 카운터 전극과 전위장을 확장하는 양 구성요소들 사이에 끼어든 전도성 입자를 지닌 상보적 결합 표면과의 접근된 배열의 접근의 측면도를 나타낸다. 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시킴에 의해, ECL 반응의 효율은 향상된다. 전도성 입자는 신속한 조작을 허용하는 마그네틱일 수 있다.
도 9는 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 카운터 전극과 상보적 결합 표면과의 접근된 배열의 측면도를 나타내는 것으로서, 상기에서 전극은 전극 표면 및 결합영역 사이의 갭으로 확장하는 미세 돌기를 가짐으로써 전위장을 샘플의 ECL 표지 둘레로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 10은 일직선상에 정렬된 애드레스할 수 있는 작동 및 카운터 전극과 상보적 결합 표면과의 접근된 배열의 측면도를 나타내는 것으로서, 상기에서 표면은 평행하지는 않으나, 대신에 상보적 방식으로 서로 들어맞는다.
도 11은 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. 다-어셈블리 단일층("SMAs")의 배열은 금속층 위에 패턴화된다.
도 12는 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. SAM의 배열은 금속층 위에서 패턴화되고 전도성 마이크로입자는 패턴화된 SAM 사이에 분산됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 13은 단일 전극을 제공하는 금속층을 가진 지지체와 카세트의 형태내 결합 표면 어셈블리의 측면도를 나타낸다. 자동 어셈블리 단일층 또는 SAM의 배열은 금속층 위에서 패턴화되고 전도성 중합체 및/또는 섬유는 ECL 표지로부터 연장됨으로써, 전위장을 샘플의 ECL 표지 주변으로 확장시켜 ECL 반응의 효율을 증가시킨다.
도 14는 컴퓨터에 의해 조절되는 전극쌍 배열을 가지는 지지체의 다이어그램이다.
도 15는 전극쌍의 배열을 가지는 지지체의 다이어그램이다.
도 16은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 전압인가를 조절하기 위한 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 17은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 전압인가를 조절하기 위한 다수의 전압원과 멀티플렉서를 지닌 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 18은 전극쌍의 배열을 가지는 지지체 및 각 전극쌍의 전압인가를 조절하기 위한 다수의 스위치 전압원을 지닌 컴퓨터 시스템의 다이어그램이다.
도 19 (a)-(e)는 여러개의 대안적인 전극-카운터 전극 쌍 조합의 평면도이다.
도 20은 완성된 샌드위치 분석을 지닌 지지체를 나타낸다.
도 21은 지지체 상에서 마주보는 두 개의 PMAMS 표면을 나타낸다.
도 22a는 미세유체 가이드(2201) 및 피브릴 매트(2200)의 배열을 나타낸다.
도 22b는 피브릴 매트(2200) 상의 결합영역(2202)을 나타낸다.
도 23a는 진공 여과에 의해 피브릴 막을 형성하는 장치를 나타낸다.
도 23b는 여과막(2303)상의 피브릴 매트(2304)를 나타낸다.
도 24는 피브릴 매트를 생산하는 롤러의 사용을 나타낸다.
도 25는 다중층 피브릴 매트의 도식도로서, 상층은 분석에 사용되는 결합영역을 가진다.
도 26은 비-특이적 결합을 향상시키는 부분을 지니도록 유도된 피브릴의 도식도로서, 생물학적 비생물학적 여러 종들이 표면에 결합되어 있다.
도 27은 비-특이 결합을 향상시키는 부분을 지니도록 유도된 피브릴의 도식도이고, 여러 종이 유도된 피브릴에 결합되고 일부 종은 추가로 리간드에 결합된다.
도 28은 피브릴에 공유적으로 부착된 여러 종 및 일부 종들이 첨가분에 추가로 결합됨을 나타낸다.
도 29는 다층 피브릴 매트를 광학 여과로서 사용하는 것을 나타내는데, 매트 위 또는 내에 광원의 위치에 의존하여 빛을 통과 및/또는 흡착 및/또는 분산케할 수 있다.
도 30a는 탄소 피브릴 매트 전극상에서의 전기화학 측정으로부터 얻은 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 30b는 금 호일 전극상에서 전기화학 측정으로부터 얻은 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 31은 매트 두께와 스캔 속도와의 함수로서 피브릴 매트의 전기화학적 성질을 비교한 것이다.
도 32는 단백질 용액내 피브릴의 농도가 증가할때 피브릴상에서의 비-특이 결합이 일반적으로 증가함을 나타내는 도표이다.
도 33은 계면활성제의 사용에 의해 ECL-TAG 표지 단백질과 탄소 피브릴 사이에서 비-특이 결합을 감소시킬수 있음을 보여준다.
도 34는 피브릴 매트 전극상에서 전기화학 성질 및 ECL을 측정하는데 사용되는 실험 전지의 윗면 도식도이다.
도 35는 용액내에서 전극으로서 피브릴 매트와 1000 pM TAG1을 사용하여 얻어지는 ECL 시그널(연속선)과 분석 완충제(TAG1이 없음)로부터의 시그널(점선)을 나타낸다.
도 36은 두 개의 표면 PMAMS 장치의 도식도로서, 상기에서 지지된 전극의 두 배열은 패턴화된 이중전기층에 의해 분리된다.
도 37은 하나의 지지체 상에 다수의 결합영역(3702)을 지니고 또다른 지지체 상에 전극 및 카운터 전극을 지니는 장치를 나타낸다.
도 38은 결합영역이 카운터 전극상에 지지된 뚜렷한 목표물 표면 상에 존재하는 카세트를 나타낸다.
도 39는 겔이 작동 및 카운터 전극과 접촉함을 나타낸다.
도 40은 ECL 강도의 그래프와 작동 및 카운터 전극과 접촉하는 ECL 표지된 겔로부터의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 41은 ECL 강도의 그래프와 작동 및 카운터 전극으로 접촉하는 비-ECL 표지된 겔로부터 얻어지는 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 42는 ECL에 사용되는 2-표면 카세트에 대한 도식도이다.
도 43은 피브릴 매트가 매트에 흡착된 항체-TAG1의 ECL을 위한 전극으로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
도 44a는 전극 상에 고정된 TAG1 표지된 단백질의 ECL 강도를 나타낸다.
도 44b는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 45a는 고정된 ECL TAG1 표지된 단백질로부터 ECL 시그널의 준(quasi)-가역적 반복 발생을 나타낸다.
도 45b는 코팅의 부분적 보존을 가리키는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 46a는 고정된 ECL TAG1 표지된 단백질로부터 ECL 시그널의 비가역적 발생을 나타낸다.
도 46b는 코팅의 실질적 손실을 가리키는 코팅된 전극의 사이클릭 볼타모그램을 나타낸다.
도 47은 ECL 시그널을 발생 및 분석하기 위한 조절 수단을 포함하는 다-배열 ECL 장치 및 마이크로프로세서를 나타낸다.
도 48은 스트렙트아비딘-코팅된 다이널 비드상의 샌드위치 복합체 형성, 피브릴 매트 전극상의 비드 포획, 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 면역분석에 대한 용량반응을 나타낸다.
도 49는 스트렙트아비딘-코팅딘 실리카 입자상 샌드위치 복합체의 형성, 피브릴 매트 전극상 입자의 포획, 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 면역분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 50은 표면상에 결합시약을 고정하기 위한 SAM의 사용을 설명하는 개략도이다.
도 51은 금 전극상 알칸디올레이트의 스트렙트아비딘-코팅된 SAM상 샌드위치 복합체의 형성, 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 면역분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 52는 "양면" 분석시 작동전극에 대한 TAG 부분의 제공을 설명한다.
도 53은 스트렙트아비딘-코팅되고 산화된 EVA-피브릴 복합물상 샌드위치 복합체의 형성 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 면역분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 54는 스트렙트아비딘-코팅되고 산화된 EVA-피브릴 복합물상 샌드위치 복합체의 형성 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 핵산 하이브리드화 분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 55는 바이오틴-표지된 올리고뉴클레티드와 TAG1 표지된 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화, 스트렙트아비딘-코팅된 피브릴 매트 전극상 복합체의 포획 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 DNA 분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 56은 나일론 막 상의 스트렙트아비딘-코팅된 UTFM상 샌드위치 복합체의 형성 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 57은 금-코팅된 나일론 막 상의 스트렙트아비딘-코팅된 UTFM상 샌드위치 복합체의 형성 및 ECL에 의한 결합된 복합체의 검출을 포함하는 AFP 분석에 대한 용량 반응을 나타낸다.
도 58은 하나 이상의 성분에 대한 전기화학 전위가 쉬프팅되는 ECL 시그널을 설명한다.
도 59는 샘플의 하나 이상의 성분에 대한 ECL 시그널의 강도가 샘플의 다른 성분에 대한 ECL 시그널에 비해 감소되는 ECL 시그널을 설명한다.
도 60은 ECL 분석 완충제인 샘플의 ECL 흔적을 나타낸다.
도 61은 AFP를 함유하는 샘플의 ECL 흔적을 나타낸다.
도 62는 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널( S-B, 즉 ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 결합시약에 대한 지지체 및 작동전극으로서 플라즈마 처리된 피브릴-중합체 복합체를 사용하여 수행된다.
도 63은 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널(S-B, ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 결합시약에 대한 지지체 및 작동전극으로서 플라즈마 처리된 피브릴-중합체 복합체를 사용하여 수행된다.
도 64는 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널(S-B, ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 결합시약에 대한 지지체 및 작동전극으로서 플라즈마 처리된 피브릴-중합체 복합체(15 중량% 피브릴)를 사용하여 수행된다.
도 65는 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널(S-B, ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 결합시약에 대한 지지체 및 작동전극으로서 플라즈마 처리된 피브릴-중합체 복합체를 사용하여 수행된다.
도 66은 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널(S-B, ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 결합시약에 대한 지지체 및 작동전극으로서 플라즈마 처리된 피브릴-중합체 복합체를 사용하여 수행된다.
도 67은 AFP 분석에 대한 AFP의 농도(IU/ml) 함수로서 ECL 시그널(S-B, ECL 시그널(S)과 백그라운드 시그널(B) 간의 차이))의 플롯을 나타낸다. ECL 매개된 AFP 분석은 건조제를 사용하여 세척단계 없이 수행된다.
도 68은 본 발명의 양태에 따른 분석 셀의 개략도를 나타낸다.
도 69는 본 발명의 다른 양태에 따른 분석 시스템의 개략도를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 다수의 전기화학발광 분석을 수행하기 위한 넓은 일면 카세트를 포함한다. 카세트는 하나 이상의 해당 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 다수의 결합영역을 그 위에 가지는 지지체로 형성된다. 결합영역은 지지체 상에 패턴화된 다-배열 다-특이적 표면("PMAMS")으로 제조된다. PMAMS는 예컨대, 수행될 수 있는 분석 밀도를 크게 증가시키고, 빠르게 또는 동시에 수행될 수 있는 다수의 상이한 분석을 허용함으로써, 공지된 ECL 분석 방법으로부터 상당한 개선을 제공한다.
카세트는 결합영역에 결합된 ECL 표지된 시약으로부터 선택적으로 광의 ECL 방출을 개시할 수 있는 다수의 전극을 포함할 수 있다. 도 47 은 하우징(4717), 카세트내 전극에 대한 전기적 접속부(4718), 파형 발생기 또는 일정전위기(4719), PMAMS로부터 방출된 ECL 조영용 CCD 카메라(4720), 및 파형 발생기를 조절하고 카메라(4721)에 의해 수신된 영상을 분석하기 위한 마이크로컴퓨터를 포함하는 카세트(4700)를 사용하는 다중-배열 ECL 장치를 나타낸다.
도 1에 보여지는 본 발명의 양태에서, 카세트(180)는 지지물질(182)상에 전도물질(181)을 포함하는 작동전극을 포함한다. 다수의 결합영역, 즉 PMAMS(183)는 전극(181)에 존재한다. 카세트는 또한 물질 및 시약 도입수단(유체 채널 184) 및 카운터 전극(185)을 포함한다. 기준전극(186)이 또한 포함될 수 있다.
다른 양태로서, 다수의 작동전극을 사용하여 다수의 결합영역에서 ECL 시그널을 동시에 생성시킬 수 있다. 이러한 양태에서, 각 결합영역으로부터의 ECL 시그널은 광 조영장치의 사용없이 동정된다.
본 발명의 어떤 양태에서는, 표면 상에 특정 또는 예비결정된 양의 하나 이상의 시약을 재생산적으로 고정하는 것이 바람직하다. 고정은 시약을 표면 상에 고착시키는 임의의 방법에 의해 가능한데, 이는 공유 화학 결합; 비-특이성 흡착; 표면 상에서의 시약의 건조; 정전기적 상호작용; 소수성 및/또는 친수성 상호작용; 액체 또는 겔 내 봉쇄(confinement) 또는 승차(entrainment), 생특이적 결합(예; 리간드/수용체 상호작용 또는 올리고뉴클레오티드의 하이브리드); 금속/리간드 결합; 킬레이션 및/또는 중합체내 얽힘을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다.
표면 상에 고정되는 시약의 양은 여러 방식으로서 예비결정될 수 있다. 예를 들면, 표면 상의 시약의 양은 시약이 존재하는 하나 이상의 부피 및/또는 지역 요소에 의해 특정될 수 있다. 또한, 이는 표면 상에 고정되는 시약 개별 분자의 수에 의해서도 특정될 수 있다. 시약의 양은 주어진 영역에서의 특정 시약의 밀도에 의해서도 특정될 수 있다. 시약의 양은 표면 총 지역 또는 표면 상에 존재하는 다른 시약의 상대적인 양에 관해, 특정 시약을 품고 있는 표면 %로서 특정될 수 있다. 시약의 양은 분석이 바람직한 특이성을 달성하도록 하기 위해 충분한 ECL 강도를 제공하고자 특정 표면에 존재해야 하는 시약의 양으로서도 규정될 수 있다. 특정 예에서, 금 표면의 1㎠ 지역이 알칸티올의 단일층으로 코팅될 수 있다.
시약은 또한, 코팅된 표면 상에 재생산적으로 고정될 수도 있다. 코팅은 일부 시약을 위해 고정화를 향상시키거나 및/또는 다른 시약을 위해 고정화를 방해할 수 있다. 표면은 완전히 코팅되거나 표면이 부분적으로 코팅될 수도 있다(즉, 패턴화된 코팅). 코팅은 조성물에 있어서 일정할 수 있거나 또는 상이한 조성물 요소를 함유할 수도 있다. 특정예에서, 코팅은 몇 지역에서는 공유 화학 결합을 통해 면역글로불린 G를 고정하며 기타 지역에서는 고정화를 방해하는, 패턴화된 단일층 필름일 수 있다.
또한, 코팅은 후속 단계 또는 공정에서 표면 상에 존재하는 고정된 하나 이상의 시약의 양을 예비결정하는 역할을 수행할 수도 있다. 대안적으로, 특정 시약의 양은 침착된 시약의 양을 제한함에 의해 조절될 수도 있다.
양적으로 재생산하는 방식으로 고정된 시약(또는 코팅)을 가지는 표면을 가짐으로써, 샘플로부터 ECL 시그널을 재생산적으로 및 양적으로 측정하는 능력을 제공하며, 따라서 검정을 허용한다.
광범위하게, 본 발명에 따라 카세트를 사용하여 수행된 분석법은 다수의 분리된 결합영역의 사용으로부터 이로운 분석법이다. 예를 들면, 상기 카세트의 사용은 광범위한 해당 분석물을 빠르게 또는 동시적으로 검출 또는 측정하는 것을 허용한다. 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 분석법은 또한 ECL 표지된 시약, 분석물 또는 결합 표면의 사용으로부터 이로운 것이기도 하다. 본 발명에 따른 ECL 분석법은 다수의 결합영역을 해당 분석물을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 결합된 ECL 표지로부터 ECL 방출을 개시하는 것으로 이루어지는데, 상기에서 ECL 표지는 분석물상에 또는 분석물의 경쟁자상에, 분석물과 결합하는 시약상에, 또는 다수의 결합영역상에 있다.
본 발명은 (a)ECL 표지로 레벨링된 분자를 포함하는 샘플과 접촉이 이루어지는 전극상에 고정된 하나 이상의 결합영역을 접촉시키고, (b)결합영역에서 ECL을 촉발하기에 효과적인 전압파형을 적용한 다음, (c)ECL을 측정하거나 검출하는 단계를 포함하는, 해당 분석의 검출 또는 측정용 ECL 분석 방법을 제공한다.
샘플이란 용어는 광범위한 의미로 사용된다. 이는 본 발명의 방법에 사용될 일정량의 여타 물질을 포함한다. 비-제한예로서, 이러한 것들에는 해당 분석물을 함유하는 분석될 물질의 일부, 이의 예비처리 또는 제조된 부분 또는 본 발명의 방법에 사용될 일정량의 시약이 포함된다.
또한, 본 발명은 해당 분석물을 검출 또는 측정하기 위한 ECL 분석 방법을 제공하는데, 이는 (a) 하나 이상의 지지체 표면 상에 고정된 다수의 분리된 결합영역을 전기화학발광 표지에 연결된 분자로 이루어진 샘플과 접촉하는 단계; (상기 샘플은 접촉 단계 동안 임의의 전극 또는 카운터 전극과 접촉하지 않는다.) (b) 전극을 상기 하나 이상의 다수 결합영역으로 근접시키는 단계; (c) ECL을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 상기 하나 이상의 다수 결합영역에 적용시키는 단계; (d) ECL를 검출 또는 측정하는 단계로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) (i) 하나 이상의 지지체 상에 고정되고 (ii) 다수 전극 및 카운터 전극 쌍에 근접하여 공간적으로 배열된, 하나 이상의 다수 분리된 결합영역을 전기화학발광 표지로 연결된 분자를 이루어진 샘플과 접촉시키는 단계; (b) 전극 및 카운터 전극을 상기 하나 이상의 다수 결합영역으로 근접시키는 단계; (c) 전기화학발광을 개시하기에 효과적인 전압 파형을 상기 하나 이상의 다수 결합영역에 적용시키는 단계; (d) 전기화학발광을 검출 또는 측정하는 단계로 이루어진 ECL 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 다성분요소, 액체 샘플의 부피내에서 샘플내 다양한 농도로 존재할 수 있는 해당 다수의 분석물을 검출하는 방법을 제공한다.
다수의 분석물은 10-3몰농도 이하에서 다성분요소 샘플로부터 검출될 수 있다. 바람직하게는, 다수 분석물은 다성분요소 샘플로부터 10-12몰농도에서 검출될 수 있다.
본 발명은 이질 분석법(heterogeneous assays), 즉, 다수의 비결합 표지된 시약이, 전기화학 에너지에 결합 표지된 시약의 노출 이전에, 다수 결합 표지된 시약으로부터 분리되는 분석법 및 균질분석법(homogeneous assays), 즉, 다수 비결합 표지된 시약과 결합 표지된 시약이 전기화학 에너지에 함께 노출되는 분석법으로서 수행될 수 있는 다성분요소 샘플로부터 검출용으로 제공한다.
본 발명의 분석법에서, 특정 분석물을 검출하는데 사용되는 전자기 방사는 하나 이상의 유형 특징으로서 위치 및/또는 자리를 확인함에 의하여, 다른 분석물에 상응하는 전자기 방사로부터 구별되는데, 상기 유형은 PMAMS 내에서 결합영역의 유형에 상응한다.
본 발명의 균질 분석법에서, 비결합시약과 비교시 결합 표지된 시약에 의해 방사된 전자기 방사의 양에 있어서의 증가 또는 감소로서, 또는 공간내 상응하는 공급원으로부터 PMAMS 내 결합영역 유형에 상응하는 하나 이상의 유형 특징으로 방출된 전자기 방사의 검출에 의해, 전자기 방사가 결합 표지된 시약에 의해 방출된다.
도 20에 도시된 본 발명의 방법의 특정예에서, 샌드위치 분석법은 특정 분석물(An)을 결합하는데 특이적인 표면 상에 다수 결합영역(BD)를 지닌 지지체(5)상에서 수행된다. 분석물을 포함하는 샘플이 결합영역에 적용될때, 분석물은 결합영역에 결합된다. 선택적으로 분석물(An)를 결합하는데 적절하며 ECL 부분 (TAG)로 표지되어 Ab-TAG를 형성하는 항체(Ab)는 이후, 결합영역상의 분석물에 적용된다. 과량의 비결합 Ab-TAG를 결합영역으로부터 떨어지도록 세척한 후에, 전기화학발광을 개시하는데 적절한 전위 파형은 결합영역상의 임의의 TAG로부터 ECL 방출을 개시하는 전극(비도시)에 의해 TAG에 적용된다. ECL 시그널은 광 검출 수단에 의해 검출되고 디지탈 컴퓨터 수단에 의해 기록된다.
추가 양태에서, 본 발명의 특징 및 다양성이 하기에 기술된 바와 같이 제공된다.
5.1. 결합 표면의 제조
본 발명에 대한 이해를 돕기 위해, 지지체 상에 결합영역을 제조하는 방법을 보다 상세하게 기술한다. 표면 상에 존재하는 다수의 분석물에 특이적인 결합영역의 패턴화된 배열을, 본원에서는 패턴화된 다-배열 다 특이적 표면 또는 PMAMS로 언급하기로 한다. PMAMS는 예를 들면, 자가 조립되는 단일층("SAM")을 패턴화함으로써, 제조된다[참고문헌; Ferguson et al, 1993, Macromolecules 26(22):5870-5875; Prime et al., 1991, Science 252:1164-1167; Laibinis et al., 1989, Science 245:845-847; Kumar et al., 1984, Langmuir 10(5):1498-1511; Bain et al., 1989, Angew. Chem.101:522-528]. 또한, 표면 패턴화 방법은 물리적 에칭(예; 미세장치)[참고문헌; Abbott et al., 1992, Science 257:1380-1382; Abbott, 1994, Chem. Mater. 6(5):596-602], 미세석판술[참고문헌; Laibinis et al., 1989, Science 245:845-847], 광활성 화학물질의 사용을 통한 화학 그룹의 표면 부착[참고문헌; Sundberg et al., 1995, J. Am. Chem. Soc. 117(49):12050-12057], 및 마이크로-스탬핑 기술[참고문헌; Kumar et al., 1994, Langmuir 10(5):1498-1511; Kumar et al., 1993, Appl. Phys. Lett. 63(14):2002-2004]의 사용을 포함한다. 기타 표면 패턴화 방법은 유체 또는 입자의 분배를 공간적으로 조절하는 방법(예; 마이크로펜 침착(X-Y 병진운동을 사용하여 표면 상으로 전달하는 미세유체 가이드를 사용하여)), 미세모세관 필링[참고문헌; Kim et al., 1995, Nature 376:581], 잉크-젯 기술, 또는 주사기 용기를 포함한다. 이러한 기술들의 조합은 복합체 표면 유형을 제공하는데 사용될 수 있다. 도 5a에서, 지지체(600)는, 기하학 모양(602)이 상이한 결합 특이성이 하나의 지지체 상에 존재할 수 있다는 것을 가리키기 위한 기하학 모양(602)으로서, 표현된 결합영역과 독립적인 모양과 함께 단지 예시 목적으로 도시되어 있다. 결합영역 사이의 표면(604)은 결합영역을 형성하는 결합시약의 침착을 봉쇄하는 선택적으로 소수성 또는 친수성일 수 있다. 결합영역 및/또는 결합영역 사이의 표면은 대안적으로 비특이성 결합 경향이 있고 저항적일 수 있으며, 또는 그들은 공유 또는 비공유 상호작용을 통해 결합시약의 부착에 저항적 경향이 있을 수 있다. 소수성 상호작용을 통한 비-특이적 결합이 표면에 결합 화학성질을 부착하기 위한 바람직한 방법이 아닌 경우에 있어서, 세제는 우발적인 비-특이성 결합이 일어나는 것을 방해하기 위해서 첨가될 수 있다.
결합영역은 0.1 ㎍ 내지 1 ㎜의 폭 또는 직경이며, 결합영역의 기하학에 의존하여 폭 차원을 가진다. 표면은 예컨대, ECL 분석 용액에 노출된 특이적 결합 구성요소를 가지도록 선택적으로 유도된다. 부가적으로, 결합영역에서의 비-특이적 상호작용은, 분리된 결합영역의 노출 표면 상의 폴리에틸렌글리콜과 같은 부분을 통합함에 의하여 특이적 결합 부분을 유지시키는 동안에 감소된다[참고문헌; Prime et al., 1993, J. Chem. Soc. 11510714-10721; Prime et al., 1991 Science 252:1164-1167; Pale-Grosdemange et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:12-20].
PMAMS은 넓게 2 내지 1018개의 결합영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합영역의 수는 50 내지 500이다. 다른 양태에서, 결합영역의 수는 25 내지 100이다. 또 다른 양태로서, 결합영역의 수는 2 내지 20 개이다.
지지체는 다양한 물질들일 수 있는데, 이는 유리, 플라스틱, 세라믹, 중합체 물질, 탄성체, 금속, 합금, 호일 구성분, 반도체, 절연체, 실리콘 및/또는 층 물질 등을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 유도된 탄성 지지체는 문헌[참조; Ferguson et al., 1993, Macromolecules 26:5870-5875; Ferguson et al., 1991, Science 253:776-778; Chaudhury et al., 1992, Science 255:1230-1232]에 따라 제조될 수 있다.
PMAMS가 그 위에서 제조되는 지지체의 표면은 예컨대, 메쉬, 펠트, 섬유성 물질, 겔, 고체(예컨대, 금속으로 이루어짐) 탄성체 등과 같은 다양한 물질을 함유할 수 있다. 지지체 표면은 다양한 구조적, 화학적 및/또는 광학적 성질을 가질 수 있다. 예를 들면, 표면은 견고하거나 가요적(flexible)이며, 평평하거나 일그러진 형태이며, 투명하거나, 반투명이며, 일부 또는 전부 반사적이거나 흐릿할 수 있으며, 복합체 성질, 즉, 상이한 성질을 지닌 영역들을 가질수도 있으며, 하나 이상의 물질의 복합체일수도 있다. 표면은 패턴화된 표면 결합영역 및/또는 촉매가 하나 이상의 표면 상에서 본 발명에 따라 일어날 수 있는 패턴화된 영역, 및/또는 하나 이상의 표면 상에서 애드레스할 수 있는 전극 배열을 가질수도 있다. 지지체의 표면은 평면, 구형, 큐빅, 기둥형의 임의의 적절한 모양으로 구성될 수 있다. 특정 양태에서, PMAMS를 품고 있는 지지체는 계량봉(dipstick)이다.
PMAMS를 함유하는 지지체는 흑연, 예를 들면, 입상 탄소, 흑연, 유리질 탄소, 카본 블랙을 함유할 수 있거나 하나 이상의 탄소 섬유를 함유할 수 있다. 이러한 섬유는 무정형 또는 흑연질 탄소일 수 있다.
PMAMS를 함유하는 지지체는 "탄소 피브릴", "탄소 나노튜브", "흑연 나노튜브", "흑연 피브릴", "탄소 튜불"', "피브릴" 및 "버키튜브"를 포함할 수 있고, 이러한 용어 모두는 광범위한 부류의 탄소 물질(예를 들면, Dresselhaus, M.S.; Dresselhaus, G.; Eklund, P.C.; "Science of Fullerenes and Carbon Nanotubes", Academic Press, San Diego, 약, 1996, 및 거기에서 인용하고 있는 문헌들)을 설명하는 데 사용된다. 본 출원인은 본 명세서 전반에 걸쳐서 "피브릴" 및 "탄소 피브릴"을 탄소계 물질의 광범위한 부류를 포함시키기 위해 사용한다.
미국 특허 No. 4,663,230, 5,165,909, 및 5,171,560에 기술된 바와 같은 개개 탄소 피브릴이 특히 유리하다. 이들은 3.5 nm 내지 70 nm 범위의 직경, 직경의 102배 이상의 길이, 규칙적인 탄소 원자로 이루어진 다 연속층의 외부 영역 및 뚜렷한 내부 코어 영역을 가질 수 있다. 예시의 목적으로 간단하게, 탄소 피브릴의 전형적인 직경은 대략 7 내지 25 nm 이고, 길이는 1 ㎛ 내지 10 ㎛ 범위일 수 있다. 탄소 피브릴은 또한 탄소원자의 단일층을 가질 수 있다.
탄소 물질은 집합체를 형성하도록 만들어질 수 있다. 본원에서 참조되는 미국 특허 No. 5,110,693에 개시된 바와 같이, 두 개 이상의 개별 탄소 피브릴은 얽혀진 피브릴의 미세성 집합체를 만들 수 있다. 이들 집합체는 5 nm 내지 수 cm의 범위의 차원을 가진다. 단지 예시할 목적으로, 미세성 집합체의 한 유형("면 사탕 또는 CC")은 5 nm 내지 20 ㎛의 직경 및 0.1 ㎛ 내지 1000 ㎛의 길이를 지닌 얽혀진 섬유의 축 또는 막대기를 닮았다. 역시 예시의 목적으로, 피브릴의 미세성 집합체의 또 다른 유형("새 둥지, BN")은 0.1 ㎛ 내지 1000 ㎛ 범위의 직경을 지닌 구형일 수 있다. 각 유형(CC 및/또는 BN)의 보다 큰 집합체 또는 이들의 혼합물도 형성될 수 있다(vide infra).
지지체에서 사용될 수 있는 피브릴은 개별 피브릴, 하나 이상의 피브릴 집합체, 하나 이상의 피브릴 현탁액, 피브릴 분산제, 피브릴과 다른 물질(예컨대, 오일, 파라핀, 왁스, 중합체, 겔, 플라스틱, 접착제, 에폭시, 테플론, 금속, 유기 액체, 유기 고체, 무기 고체, 산, 염기, 세라믹, 유리, 고무, 탄성체, 생물학적 분자 및 매질 등)의 혼합물 및 이들의 조합을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다.
피브릴은 일부 경우에서 자기성이며 기타 경우에서는 비-자기성일 수 있다. 자기성 또는 비-자기성으로 만들어질 수 있는 피브릴의 양은, 미국 특허 No. 4,663,230, 5,165,909, 및 5,171,560에 개시된 공정과 같이 피브릴 생산 공정 결과로서 피브릴내 존재하는 촉매의 양에 의해서 조절된다. PMAMS는 상기 기술된 지지체 위에, 안에 또는 근접하여 위치한다.
PMAMS는 상이한 유형의 표면 결합 그룹으로부터 발생될 수 있다. 결합하는 표면 상에 단일층을 만들기 위해 사용될 수 있는 자가 조립되는 단일층은 알칸 티올(금 및 기타 금속에 결합), 알킬트리클로로실란(예; 실리콘/실리콘 디옥사이드에 결합), 알칸 카르복실산(예; 알루미늄 옥사이드에 결합) 및 이들의 조합을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 단일층은 먼저 형성될 수 있으며, 이후 연결 화학물질이 결합시약을 부착하는데 사용된다. 자가 조립 후에 유도는 지지 표면 상에 더 적은 핀 홀 또는 흠을 가지는 더 완전한 이-차원 결정질 패킹을 만든다. 단일층은 자가 조립 되기 이전 또는 이후에 결합시약과 함께 유도될 수 있다. 단일층내 정형화된 흠이 바람직할 수 있으며, 단일층 또는 지지 표면의 자가 조립 이전에 유도에 의해서 수득될 수 있다. 결합시약상에 유도된 그룹(예; 노출된 결합 그룹)이 입체적으로 넓다면, 이는 금속 표면에 규칙적인 갭을 가지기는 하나, 노출된 말단에서 밀집된 표면을 창출할 수 있다. 이는 이들 정형화된 갭을 통해 전하를 샘플 용액과 접촉하는 부분에 결합된 ECL 표지된 부분으로 보내도록 하는데 유용하다.
불완전한 단일층의 제조는 당업계에서 공지되어있다. 불완전한 단일층을 제조하는 기타 방법은 결합시약의 희석 용액으로부터 단일층의 형성, 완성 이전에 반응을 형성하는 단일층의 종결, 방사선(예컨대; 이온 입자), 광 또는 화학 시약에 의한 보다 많은 완전 단일층의 손상을 포함하나, 여기에 제한되지는 않는다. 한 양태에서, 스탬프의 재-연결없이 반복되는 스탬핑은 넓은 범위의 결함있는 단일층을 제공할 수 있다[참고문헌; Wilbur et al., 1995, Langmuir, 11:825].
PMAMS는 매트릭스의 표면 상에서 발생될 수 있다. 매트릭스는 고도로 전도성, 예컨대, 금속 전극 또는 전도성 중합체 필름일 수 있으며; 또는 매트릭스는 절연체일 수 있으며; 또는 매트릭스는 반-도체 및/또는 중간 전도체일 수 있다. 매트릭스 물질은 이온성 도체 또는 다공성 금속일 수 있다. 상기 다공성 물질은 지지 물질 및/또는 전도 물질 및/또는 여과 물질 및/또는 채널 물질(예; 유체, 이온족 등을 통과시키는 물질)로서 활용될 수 있다.
다공성 물질은 부가적 물질과 결합될 수 있다. 예를 들면, 복합체 구조는 부가적 다공성 물질, 전도성 물질, 반도체성 물질, 채널 구조 및/또는 용액(예컨대; 이온 유체)과 함께 다공성 물질로 제조될 수 있다. 상기 복합체는 라멜라 구조, 샌드위치 구조 및/또는 섞여 있는 복합체일 수 있다. 고체 매트릭스는 다공성 물질이 금속 전극상에 지지하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 다공성 물질은 전도 물질, 반도체 물질 또는 반도체 및 도체 물질의 조합체 사이의 샌드위치이다. 하나 이상의 결합영역은 다공성 물질의 한 연속 슬랩상에 함유될 수 있거나, 하나 이상의 결합영역을 지닌 각 지지체 상에 다수 분리성 목표물상에 위치할 수 있다. 다공성 물질(예컨대; 겔) 표면은 평평, 반구형 또는 정형 또는 비정형 모양일 수 있으며, 다양한 물리적 성질(예컨대; 탄성, 견고, 저 밀도, 고 밀도, 밀도 구배, 건조, 습윤 등) 및/또는 광학 성질(예컨대; 투명, 반투명, 흐릿, 반사, 굴절 등) 및/또는 전기적 성질(예; 도체성, 반도체성, 절연성, 다양한 전도체성, 예를 들면 습윤 대 건조 등)을 가질 수 있다. 다공성 물질은 하나 이상의 물질로 이루어진 복합체일 수 있다.
채널의 유형은 매트릭스내에서 형성될 수 있다. 다공성 물질 층은 5 마이크론 내지 2000 마이크론 두께일 수 있다. 다공성 물질 층은 또한 2 mm 이상의 두께일수도 있다.
구멍은 물질을 통해 부분적으로 및/또는 완전히 연장될 수 있거나 구멍의 네트워크의 일부일 수 있다. 이들 구멍은 50 Å 내지 10000 ㎛ 의 넓은 범위의 차원을 가질 수 있다. 바람직한 양태에서, 물질은 200 Å 내지 500 Å 범위의 차원을 지닌 일부 구멍 및 0.5 ㎛ 내지 100 ㎛ 범위의 차원을 지닌 일부 구멍을 가진다.
물질의 다공성은 물질내에서 일정할 수 있거나 물질내 위치 함수로서 증가 또는 감소할 수 있다. 물질은 비조직화되거나 랜덤한 방식으로 분포되는 상이한 크기의 다양한 구멍을 가질 수 있다.
예를 들면, 물질은, 생물학적 세포 만큼 큰 물질을 통과시킬 수 있도록 충분히 넓은 구멍, 단백질 또는 항체만큼 넓은 생물학적 매질을 통과시킬수 있는 구멍, 작은 유기 분자(<1000 분자량) 및/또는 이들의 조합만을 통과시킬 수 있는 구멍을 가질 수 있다.
물질의 다공성은 하나 이상의 분자, 액체, 고체, 에멀젼, 현탁액, 가스, 겔 및/또는 분산제가 물질 안으로 및/또는 통하여 통과할 수 있는 그러한 것이다. 물질의 상기 다공성은 생물학적 매질이 확산할 수 있거나(능동 또는 수동) 또는 물질 안으로 및/또는 통하는 일부 수단에 의해 강요될 수 있도록 하는 그런 것이다. 생물학적 매질의 예는 전혈액, 분획된 혈액, 원형질, 혈청, 뇨, 또는 단백질, 항체 또는 이들의 단편의 용액, 세포, 하위세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지질단백질, 지질당, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 호르몬 또는 약물제를 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 다공성 물질은 생물학적 매질이 하나 또는 그 이상의 층을 통과할 수 있으나 기타 층을 통과하지 않도록 하는 하나 이상의 상이한 다공성 층을 가질 수 있다.
다공성 물질은 이온족의 흐름에 기인하여 전류를 지지할 수 있다. 추가 정련에서, 다공성 물질은 다공성 물-팽창 겔, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 또는 한천이다. 기타 다양한 겔 조성물이 이용가능하다[참고문헌; Soane, D. S. Polymer Application for Biotechnology; Soane, D. S., Ed.; Simon & Schuster; Englewood Cliffs, NJ, 1992 or Hydrogels in Medicine and Pharmarcy, Vol. I-III; Peppas, N.A. Ed; CRC Press: Boca Raton, FL, 1987]. 결합영역은 공유 및 비공유 결합에 의해 매트릭스에 부착될 수 있다[많은 리뷰와 책이 이 주제에 관하여 저술되었다; Tampion J. and Tampion M.D. Immobilized Cells: Principles and Applications Cambridge University Press: NY, 1987; Solid Phase Biochemistry: Analytical and Synthetic Aspects Scouten, W.H. Ed., John Wiley and Sons: NY, 1983; Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. B Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1988; Methods in Enzymology, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. C Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1987; Methods in Enzymolgy, Immobilized Enzymes and Cells, Pt. C Mosbach, K. Ed., Elsevier Applied Science: London, 1987; Hydrogels in Medicine and Pharmacy]. 예를 들면, 단백질은 폴리아크릴아미드와 N-아크릴로일숙신이미드의 가교 연결된 공중합체에 단백질 용액의 처리에 의해 부착될 수 있다. 결합영역은 또한, 중합화 또는 겔화하기 이전 단계에서 다공성 매트릭스로 통합될 수도 있다. 한 양태에서, 결합영역은 많은 연결 화학물질에 의해 비가교연결된 중합체에 부착될 수도 있다. 그리고나서, 중합체는 가교연결된다(예를 들면, 아미드 결합, 디설피드, 에폭시드에의 친핵성 공격, 등을 포함하는 화학물질을 사용)[참고문헌; Pollack et. al., 1980. J. Am. Chem. Soc. 102(20):6324-36]. 결합영역은 중합화 동안 중합체 체인으로 통합되는 단량체 족에 부착될 수도 있다[참고문헌; Adalsteinsson, O., 1979, J. Mol. Catal. 6(3): 199-225]. 또다른 양태에서, 결합영역은 중합화/겔화 동안에 구멍내 결합영역을 트랩함에 의해, 또는 다공성 매트릭스 및/또는 필름 안으로 결합영역을 투과시킴에 의해 겔 안으로 통합될 수 있다. 부가적으로, 결합영역은 예를 들면, 소수성 및/또는 이온 상호작용에 의해 야기되는 비특이적 흡착에 의해 다공성 매트릭스(예; 중합체 겔 및 필름)의 표면 상으로 흡착될 수도 있다. 바이오틴은 유리하게도 연결제 또는 결합시약으로서 사용될 수도 있다. 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 기타 바이오틴 결합시약은 결합영역으로 통합될 수도 있다.
PMAMS는 다양한 구멍 크기 및 용매량을 지닌 다공성 물질(예; 겔)상에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 구멍 크기에 있어서 다양한 폴리아크릴아미드 겔은 아크릴아미드의 농도 및 가교 정도를 변화시킴에 의해서 만들어질 수 있다.
분석물보다 작은 크기의 구멍을 가진 PMAMS 상에서, 결합 반응은 겔 표면 상에서 실질적으로 일어날 것이다. 이런 경우에, 겔을 통한 여과 및/또는 전기영동은 겔 표면에서의 분석물을 농축시키고 결합 반응의 동역학(예; 속도 증가)을 조절하는데 사용될 수 있다. 보다 빠른 동역학이 빠른 분석법(예; 결과까지 짧은 시간)에서 유리하며, 더 짧은 시간동안 증가된 민감도를 발생시킬 수 있다.
분석물보다 큰 크기의 구멍을 지닌 PMAMS 상에서, 결합 반응은 겔의 벌크내에서 뿐만 아니라 표면 상에서도 일어날 수 있다. 이런 경우에, 여과가 사용될 수 있으며, 또는 전기 영동이 결합 동역학을 증가시키고 표면으로부터 비결합된 족을 제거하고자 사용될 수 있다.
겔상에서 형성된 PMAMS는 습하게 저장될 수 있으며, 또는 그들은 건조된 상태로 저장될 수도 있으며 분석동안 재구성될 수도 있다. ECL 분석을 위해 필요한 시약은 저장되기 이전에 겔 내에서 통합될 수 있으며(겔 안으로 투과 또는 겔 형성동안 통합에 의해), 또는 그들은 분석 동안 첨가될 수도 있다.
PMAMS의 패턴화된 결합영역은 매트릭스내의 각 결합영역을 액체유형으로 함유하는 드롭(drop) 또는 미세드롭(microdrop)을 기질에 적용시킴으로써 생겨날 수도 있다. 그리고나서, 고체화 및/또는 액체의 겔화는 공지된 다양한 기술(중합화, 가교화, 겔 변환 이하로의 냉각, 열)에 의해 일어날 수 있다. 고체화 또는 겔화를 일으키는 약제가 조제 후 일정 시간에 드롭을 겔을 고체화 및/또는 겔화하기 위해, 드롭내에 함유될 수도 있다. 후속 처리(예컨대; 광에의 노출, 방사 및/또는 레독스 전위차계)가 고체화 및/또는 겔화를 야기하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 양태에서, 상기 드롭 또는 미세드롭은 슬러리, 선-중합 복합체, 고형 그룹, 및/또는 실질적 고체 드롭일 수 있다. 부가적으로, 증기상 침착이 활용될 수도 있다.
또한, 패턴화는 하나 이상의 결합영역을 함유하는 각 매트릭스의 층 구조를 형성함에 의해 달성될 수도 있다. 예를 들면, 항체에 연결된 아가로스(표준 화학물질에 의해)를 컨테이너에 부어 냉각에 의해 겔을 만들 수 있다. 이후, 다른 항체를 포함하는 후속 층을 첫째 층상에 부어 겔이 되도록 한다. 이러한 층 구조의 횡단면은 다수의 뚜렷한 결합영역이 존재하는 연속 표면을 제공한다. 상기 횡단면은 축적될 수 있으며, 또 다른 횡단면은 결합영역의 밀도보다 훨씬 큰 PMAMS 표면을 만들도록 잘릴 수 있다. 대안적으로, 주어진 결합 성분을 함유하는 매트릭스의 라인은 또 다른 매트릭스에 근접하게 축적된다. 상기 구조는 또한 횡단면내에서 잘려질 수도 있으며 PMAMS 표면으로 활용될 수도 있다.
또한, 패턴화는 분리를 얻기 위해 일부 매트릭스의 능력을 유리하게 취함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들면, 핵산 탐침의 혼합물은 다수의 뚜렷한 결합영역이 존재하는 표면을 만드는 폴리아크릴아미드 슬랩내에서 전기영동에 의해 분리될 수 있다.
미세유체 가이드는 또한, 지지체 상에 PMAMS 결합영역을 제조하기 위해 사용될 수도 있다. 미세유체 가이드의 부분적 목록은 공동(空洞)의 모세관, 매트릭스(예; 다공성 또는 용매 팽창 매질)로 만들어지거나 충진된 모세관, 또는 얇은 필름 을 지지할 수 있는 고체 지지체 또는 액체 드롭을 포함한다. 모세관은 고체일 수 있으며, 시약은 모세관의 외부 표면을 따라서 흐르며, 시약 유체 저장고는 PMAMS 표면과 접촉하는 다공성 매트릭스 팁에 노출될 수 있다. 예를 들면, 시약 저장고는 다수 시간동안 주어진 다공성 매트릭스 팁이 재생산적으로 시약(예; 단일층을 형성하는 알칸 티올 및/또는 결합시약 등)을 침착할 수 있도록 연속적으로 또는 주기적으로 재충진될 수 있다. 부가적으로, 팁내 다양한 다공성은 시약이 표면을 흐르는 것을 조절하는데 활용될 수 있다. 상이하거나 동일한 결합시약은 다수의 모세관에 존재할 수도 있으며, 또는 다 뚜렷한 결합시약은 주어진 모세관에 존재할 수 있다. 모세관은 PMAMS(예; 패턴화된 SAM)와 접촉하여 일정 영역이 분리된 결합영역을 만들도록 결합시약에 노출된다. 상이한 미세유체 가이드내에 존재하는 각 상이한 결합시약은 유체 가이드 배열로부터 바람직하게 금속 표면, SAM 등 위로 동시적으로 전달된다. 미세유체 가이드는 또한, 지지 표면에 적용하기 이전에 바람직한 분자를 지닌 미세스탬프를 잉크하는데 사용될 수도 있다. 예를 들면, 개별적인 미세유체 가이드는 지지체의 표면에의 흡착를 촉진하는 부분에 연결된 상이한 결합시약에 적용되어(예; 탄화수소 접속부상의 자유 티올은 금에의 흡착를 촉진), PMAMS를 형성할 수도 있다. 이리하여, 예를 들면, 자유 티올과 함께 접속부로 통합되는 상이한 특이성의 항체를 지닌 미세유체 가이드의 사용을 통해 잉크된 미세스탬프는, 금 표면 상의 바람직한 지역내에 상기 항체를 적용하는데 사용되어 PMAMS의 분리된 결합영역을 형성할 수 있다.
미세유동 가이드는 또한 작은 오리피스를 통한 드롭의 분사에 의해 유체의 미세드롭을 전달하는 마이크로프린팅 장치(예; 잉크-젯 프린터)를 의미한다. 이들 장치내에서 드롭의 분사는 가열, 정전기 전하 및/또는 압전 장치로부터의 압력을 포함하는 상이한 기작에 의해 야기될 수 있다. 하나 이상의 액체 유형은 다수 오리피스 및/또는 하나의 오리피스 및 적절한 밸브의 사용을 통해 수행될 수 있다.
PMAMS의 제조를 위한 한 가지 방법에서, 미세유체 가이드는 표면 상의 분리성 영역 상으로 분리된 결합영역을 형성하는 바람직한 결합시약을 함유하는 드롭을 직접 전달하는데 사용된다. 결합시약은 적용되는 표면 상의 화학 그룹과 결합을 형성하는 작용적 화학 그룹을 함유할 수 있다. 또 다른 변형에서, 드롭내 결합시약은 표면에 비특이적으로 흡착되거나 결합될 수 있다(예; 표면 상으로 건조).
대안적으로 표면 상에 침착된 드롭(들)은 매트릭스를 형성할 수 있는 시약을 함유한다. 이 매트릭스는 고체, 중합체 또는 겔일 수 있다. 매트릭스의 형성은 용매의 증발에 의할 수 있다. 이는 단량체 족의 중합화에 의할 수 있다. 이는 미리 형성된 중합체의 가교에 의할 수 있다. 이는 온도 조절(예; 냉각 및/또는 가열)에 의할 수 있다. 이는 다른 방법에 의할 수 있다. 예를 들면, 중합체 족은 냉각 전환을 통해 또는 겔화를 야기화는 시약의 첨가에 의해 냉각될 수 있다. 고체 매트릭스의 형성은 전극에서의 반응족의 생성에 의해(기질 포함), 광에 의해(또는 다른 방사), 고체화 또는 겔화를 유도하는 시약의 첨가에 의해, 냉각 또는 가열에 의해 유도될 수 있다. 부가적으로, 표면은 매트릭스 형성을 개시(예; 겔화 또는 중합화)할 수 있는 촉매를 포함할 수 있다.
바람직한 기술에 있어서, 적용되는 유체 또는 겔의 발산을 방해하는 패턴화된 친수성/소수성 영역이 사용될 수 있다. 상기 유체 또는 겔은 PMAMS의 결합영역을 형성하는 지지체 상의 표면에 연결되는 결합시약을 함유할 수 있다. 이 경우에, 상기 친수성/소수성 경계의 사용은 만들어진 결합영역을 분리성 지역으로 봉쇄하는데 도움을 준다. 대안적으로, 유체는 표면 상에 매트릭스를 형성할 수 있는 시약을 함유하며 결합시약은 표면 상에 침착될때 제한 영역내에 함유된다. 예를 들면, 친수성/소수성 경계 보조제은 제한 영역으로 드롭을 봉쇄하는데 활용될 수 있다. 부가적으로, 친수성 또는 소수성 지역은 매트릭스로 통합(예; 공유 또는 비-공유 결합)될 수 있는 그룹에 존재할 수 있어서, 매트릭스의 기질로의 보다 안정한 접착을 가능케한다[참고문헌; Itaya and Bard, 1978, Anal. Chem. 50(11):1487-1489]. 또 다른 기술에서, 적용되는 유체 또는 겔은 해당 분석물을 함유한 샘플이며, 샘플은 제조된 PMAMS로 적용된다. 하나의 바람직한 양태에서, 친수성 용액을 함유하는 모세관은 용액을 분리성 지역 상으로 침착하는데 사용되어, 소수성 영역에 의해 둘러싸인 친수성 영역을 만들 수 있다. 대안적으로, 친수성 영역에 의해 둘러싸인 소수성 결합영역이 결합시약 또는 분석물(들)을 함유하는 소수성 유체와 함께 사용될 수 있다. 소수성 및 친수성은 적용되는 샘플에서 서로서로에 대한 상대적 용어로서, 즉, 결합영역에 적용되는 유체 또는 겔 샘플의 방사 또는 습윤이 조절된다. 추가로, 미세유체 배열로부터 조절되는 용액 침착은 표면 특징(예; 표면 상의 웰 또는 채널)을 사용하여 달성될 수 있다. 미세유체 가이드는 카세트내에 함유될 수 있거나, 보다 바람직하게는, 사용 이전에 특이적 시약을 지지체에 적용하는데 사용될 수 있다.
하나 이상의 연결 화학물질이 동일 지지 표면에 적용될 수 있으며, 또는 친수성 및 소수성 결합영역을 지닌 표면이 다 스탬프를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 친수성 결합영역이 1번 위치에서 바람직하고 소수성 결합영역이 2번 위치에서 바람직한 지역은 다음과 같이 제조될 수 있다. 제 1 친수성 스탬프는 1번 위치에서 디스크 및 2번 위치에서 보다 넓은 링을 가지도록 만들어진다. 제 2 소수성 스탬프는 스탬프 1에 의해 남겨진 링 단일층 내측에 들어맞는 2번 위치에서 디스크를 지니도록 만들어진다. 마지막으로, 표면은 단일층 성분의 소수성 용액으로 세척된다.
특히, PMAMS는 마이크로-접촉 프린팅, 즉, 스탬핑에 의해 만들어진다. 이렇게 적용되는 단일층은 표면-결합 그룹, 예, 금 표면으로 이루어지며, 알칸(예; (CH2)n) 스페이서를 지닌 티올이 바람직하다. 스페이서 그룹은 연결 그룹 A에 연결된다(바람직하게는 공유 결합). "A"는 예를 들면, 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 바이오틴 또는 파트너 "B"에 상보적으로 결합가능한 임의의 적절한 결합시약일 수 있다. A:B 연결은 공유 또는 비-공유일 수 있으며, 이용될 수 있는 당업계에서 공지된 일부 연결 화학물질이 문헌에 개시되어있다[참고문헌; Bard et al., 미국 특허 Nos. 5,221,605 및 5,310,687]. "B"는 항체, 항원, 핵산, 시험되는 샘플내에서 해당 하나 이상의 분석물에 결합할 수 있는 결합영역을 형성하기에 적절한 기타 약학적 물질과 같은 결합시약에 추가로 연결된다. B는 또한, ECL TAG 또는 표지에도 연결될 수 있다. 연결 그룹 B는 단일층 "A" 연결 상에 상이한 결합 표면 특이성을 지닌 다수의 "B" 시약을 위치할 수 있는 모세관 또는 미세유체 가이드 배열(도 5a-5C)의 수단에 의해 SAM에 전달될 수 있다. 또한, A 및 B는 단일층에 결합하기 이전에 연결될 수도 있다. 도 5a에서 논의될 바와 같이, 결합영역과 독립적인 모양은, 상이한 결합 특이성이 하나의 지지체(600)상에 존재할 수 있음을 나타내기 위한 기하학 모양(602)으로서, 단지 예시의 목적으로만 제시된다. 도 5b는 미세유체 가이드(예; 모세관) 배열(606)의 윗면도를 나타낸다. 도트(610)는 횡단면에서의 가이드이다. 도 5c는 미세유체 가이드 배열(608)의 측면도를 제공한다. 꼭대기 및 바닥으로부터 출현하는 라인은 개별적인 미세유체 가이드(610)이다. 하측면상의 기하학 모양(610)은 개별적인 모세관으로부터 결합시약의 전달시 형성된 특이적 결합영역을 나타낸다.
예에 의하면, 첫째 스탬핑 후에, 층이 없는 맨 표면(예; 금) 영역은 연결 화학물질 A와 연결되지 않으며 또한 첫째 단일층의 소수성/친수성과 반대되는, 이차 알칸 티올과 반응할 수 있다. 이러한 방식에서, 특이적 연결 부위는 표면 상에 제조된다.
하나의 해당 분석물에 특이적인 결합시약은 각각의 결합영역에 사용될 수 있으며, 또는 결합시약은 다수의 해당 분석물에 특이적으로 결합하는데 사용될 수 있다.
또 다른 변환에서, 지지 표면은 상기 도 5a 에서 도시된 상이한 연결 화학물질 및/또는 결합부를 가지는 물질(예; 결합시약, ECL 표지, SAM) 에 의해 수 회 스탬프될 수 있다.
패턴화된 결합시약은 덜 안정하고 견고한 결합 그룹에 나중 연결되는 안정하거나 견고한 화학 그룹(예; 처해진 조건에서 생존하는)일 수 있다. 다 결합 연결은 PMAMS 표면을 제조하는 과정의 각 단계 조건을 최적화하거나 PMAMS 표면의 제조를 단순화하기 위하여 활용될 수 있다. 예를 들면, 첫째 PMAMS 표면은 일반적인 방식으로 제조되며, 이후 상이한 PMAMS 표면을 만들기 위하여 변형된다. 또 다른 예에서, 일반적인 PMAMS 표면은 PMAMS 표면 상의 특정 영역(예; 결합영역)과 직접 결합하는 결합영역을 스스로 함유하는 결합시약의 혼합 용액과 반응할 수 있다. 예를 들면, 상이한 올리고(핵산) 서열을 제시하는 각 결합영역 유형은 표면에 연결된다. 이후, 이 표면은 이차 결합시약의 혼합물을 함유하는 용액으로 처리되고, 각각은 표면 상의 서열에 상보적인 올리고(핵산) 서열에 연결된다. 이러한 방식에서, 이들 이차 결합 요소의 유형이 달성될 수 있다. 바람직하게는, 올리고(핵산) 서열은 6-30량체의 DNA이다. 6-30량체 세트는 실질적으로 유사한 상보적 서열을 함유함으로써, 하이브리드화를 위한 대략 결합 상수가 주어진 세트내에서 유사하고, 덜 상보적인 서열로부터 구별할 수 있을 정도로 상이하도록 할 수 있다. 또 다른 양태에서, 이차 결합 요소는 단백질(예를 들면, 항체)이다.
섹션 5.13에서 기술된 표면 상에서 적용된 시약 또는 샘플을 습하게 하거나 퍼지도록 하는 것을 방해하는 것으로 기술된 방법은 또한, PMAMS의 제조(및/또는 샘플 적용에서)에서 사용될 수도 있다. 적용된 전위(예; 전극/카운터 전극 쌍으로부터)는 시약 및/또는 샘플의 침착 및/또는 퍼짐을 조절하는데 추가로 사용될 수도 있다[참고문헌; Abbott et al., 1994, Langmuir 10(5):1493-1497].
PMAMS 결합시약은 탄소를 함유하는 물질상에 위치할 수 있다. 또한, 그들은 개별적인 탄소 피브릴에 위치할 수도 있거나, 또는 PMAMS 결합시약은 하나 이상의 피브릴의 집합체상에 위치할 수도 있다. 많은 양태에서, PMAMS 결합시약은 하나 이상의 피브릴의 현탁액, 피브릴의 분산액, 피브릴과 다른 물질의 혼합액 및 이들의 조합물상에 위치할 수도 있다.
PMAMS 결합시약은 지지체 상에 또는 안에 또는 근접하게 위치된 다수의 개별 피브릴 및/또는 피브릴의 집합체상에 위치할 수 있다. 한 예에서, 결합시약은 분산된 개별 피브릴 또는 피브릴 집합체상에 위치한다. 이들 피브릴 또는 피브릴의 집합체는 지지체 상의 뚜렷한 부위로 공간상 위치될 수 있으며, 결합영역을 구성할 수 있다. 다른 예로서, 결합시약은 탄소 입자의 집합체상에 위치될 수 있다.
또 다른 예에서, 개별 상기 결합영역 또는 다수의 상기 결합영역은 지지체의 공간적으로 뚜렷한 영역에 위치한다. 비-제한적 예에 의해, 개별 상기 결합영역 또는 집합적 결합영역은 지지체내의 함몰, 구덩이 및/또는 홀에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 개별 결합영역 또는 다수 부위는 지지체의 표면 상에 위치한 물 드롭, 겔, 탄성체, 플라스틱, 오일 등에 위치할 수 있다. 또 다른 예에서, 개별 결합영역은 상이한 결합시약 및/또는 결합시약/피브릴 앙상블을 위한 상이한 결합 친화도를 가진 코팅(패턴화될 수 있다)에 의해 지지체 상에 위치할 수 있다.
결합영역은 다수의 개별 피브릴 상에 바람직하게 위치되며 또는 피브릴 집합체는 하나 이상의 미세유체 가이드(예; 모세관)에 의해 지지체 상에서 제조될 수 있다. 상이하거나 동일한 결합시약은 다수의 미세유체 가이드 내에 또는 위에 존재할 수 있으며, 또는 다수 뚜렷한 결합시약은 주어진 미세유체 가이드 내에 또는 위에 존재할 수 있다. 모세관은 지지체(스포팅)와 접촉하도록 할 수 있으며, 또는 미세유체 가이드 및/또는 표면이 서로에 상대적으로 스캐닝되거나 번역될때(즉, 글쓰기의 펜과 같은 방법) 시약을 전달할 수 있다. 미세유체 가이드는 피브릴 상에 위치한 결합시약을 지지체로 전달하여, 지지체의 일정 영역이 피브릴-결합시약 복합체에 노출되어 분리된 결합영역(들)를 형성할 수 있도록 할 수 있다. 바람직한 일면에서, 상이한 미세유체 가이드내에 존재하는 각 결합시약은 가이드 배열로부터 지지체로 동시적으로 전달된다. 한 예에서, 결합시약 및/또는 결합시약이 위치하는 피브릴은 지지체의 표면과 결합(예; 공유 또는 비공유 상호작용)을 형성하는 화학 작용기와 함께 유도된다. 일부 양태에서는, 결합시약과 피브릴은 표면에 비-특이적으로 결합되거나 흡착된다. 또 다른 양태에서, 피브릴상에 위치한 결합시약은 지지체의 표면내의 함몰, 구덩이 및/또는 홀로 전달될 수 있다. 또 다른 예에서, 결합시약은 어떤 결합시약 또는 결합시약/피브릴 앙상블에 강 또는 약 결합 친화도를 가진 물질로 코팅되는 표면으로 전달되며, 이리하여 다른 결합시약으로부터 공간적으로 뚜렷하게 위치되는 시약의 부위를 만들어낸다.
결합시약은 자기성인 하나 이상의 개별적인 피브릴 또는 피브릴들의 집합체상에 위치한다. 이런 경우에 있어서, 자기성 지지체는 자기성 피브릴상에 위치한 결합시약을 지지체로 끌어당길 수 있다.
지지체는 자기성인 여러 개의 별개 영역을 함유할 수 있으며, 비자기성 영역에 의해 둘러싸인다. 자기성 피브릴상에 위치한 결합시약은 지지체의 자기성 영역에 위치할 수 있다. 한 예에서, 지지체는 자기성인 하나 이상의 뚜렷한 영역을 함유할 수 있으며, 비자기성 영역에 의해 둘러싸이며, 자기성 영역내에서 자기장의 세기는 변조 또는 전환될 수 있다. 이러한 면에서, 상기 변조되거나 전환되는 자기장의 사용은 지지 표면으로부터 피브릴 상에 위치한 결합시약을 붙이거나 풀어주는데 도움을 주며, 따라서 상기 부위를 휘젓거나 혼합하도록 역할한다.
넓게는 2 내지 108개의 결합영역이 있으며, 바람직하게는 25 내지 500 개의 결합영역이 있다.
결합영역은 작동전극 및/또는 카운터 전극 상에 위치할 수 있다.
상이한 유형의 PMAMS, 지지체 및 전극 및 이의 구조(배열)를 위해 본원에서 기술되는 상이한 양태는, 또한 서로 조합하여 실행될 수도 있다.
PMAMS 지지체는 나중 사용을 위해 보존될 수 있다(예; 보호 표면 코팅, 표면 건조, 진공 또는 불활성 대기하에서의 견고한 패키지, 냉각 및 관련 방법을 통해).
5.2. 결합시약
본 발명의 결합영역은 적어도 하나의 해당 분석물(리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합시약을 함유하도록 제조된다. 분리된 결합영역내 결합시약은 결합영역이 바람직한 결합 특이성을 가지도록 선택된다. 결합시약은 해당 분석물에 특이적으로 결합할 수 있거나 추정적으로 결합할 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 화합물 중에서 선택된다. 해당 분석물은 섹션 5.10 "수행될 수 있는 ECL 분석"에서 기술되는 것들로부터 선택될 수 있다. 이리하여, 결합시약은 수용체, 수용체에 대한 리간드, 항체 또는 이의 결합 부분(예; Fab, (Fab)'2), 단백질 또는 이의 단편, 핵산, 올리고핵산, 당단백질, 다당류, 항원, 에피톱, 세포 및 세포내 기관, 하위세포 입자, 탄수화물 부분, 효소, 효소 기질, 렉틴, 단백질 A, 단백질 G, 유기 화합물, 유기금속 화합물, 바이러스, 프리온, 비로이드, 지질, 지방산, 지질다당류, 펩티드, 세포내 대사물, 호르몬, 약학제, 진정제, 최면제, 알칼로이드, 스테로이드, 비타민, 아미노산, 당, 비생물학적 중합체, 바이오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 중합체 수지와 같은 유기 연결 화합물, 지질단백질, 사이토카인, 림포카인, 호르몬, 합성 중합체, 유기 및 무기 분자 등을 포함하나, 여기에 한정되지는 않는다. 핵산 및 올리고핵산은 DNA, RNA 및/또는 올리고핵산 유사체를 언급할 수 있으며, 이중, 올리고핵산 유사체는 변형된 염기 또는 변형된 당을 함유하는 올리고핵산, 포스포디에스테르 연결이 아닌 다른 골격 화학물질을 함유한 올리고핵산[참고문헌; Nielsen, P. E. (1995) Annu Rev. Biophys. Biomcl. Street. 24 167-183], 및/또는 부속물을 형성하는데(공유 또는 비-공유) 사용될 수 있는 화학 그룹을 제시하도록 합성 또는 변형된 올리고핵산(여기에서, 우리는 핵산 또는 올리고(핵산)을 두 개 이상의 핵산 염기 및/또는 핵산 염기의 유도체를 함유한 것으로 정의한다.)을 포함하나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 PMAMS는 다른 결합영역내 함유된 결합시약과는 서로 동일하고 다른 결합시약을 함유하는 적어도 하나의 결합영역을 포함하는 다수의 분리된 결합영역을 가짐으로써, 상이한 결합영역에 의해 해당 상이한 분석물의 결합을 제공할 수 있다. 실시예에 의하면, 상기 PMAMS는 갑상선 자극 호르몬(TSH)에 대한 항체를 포함하는 결합영역, C형 감염 바이러스(HCV)와 하이브리드할 수 있는 올리고핵산을 함유하는 결합영역, HIV와 하이브리드할 수 있는 올리고핵산을 함유하는 결합영역, HIV 단백질 또는 당단백질에 대한 항체를 포함하는 결합영역, 전립선 특이성 항원(PSA)에 대한 항체를 포함하는 결합영역, 및 B형 감염 바이러스(HBV) 에 대한 항체를 포함하는 결합영역, 또는 전술한 것들의 임의의 하위세트를 포함한다.
PMAMS는 하나의 결합영역이 해당 다수의 분석물에 결합할 수 있도록, 결합 특이성이 다른 결합시약내에 함유되는 적어도 하나의 결합영역을 포함하는 다수의 분리된 결합영역을 가질 수 있다. 실시예에 의하면, 상기 PMAMS는 T 세포 항원 수용체에 대한 항체와 CD4와 같은 T 세포 표면 항원에 대한 항체 모두를 함유하는 결합영역을 포함할 수 있다.
PMAMS는 (i) 다른 결합영역내 함유된 적어도 하나의 결합시약으로부터 특이성면에서 서로 다른 결합시약 및 서로 동일한 결합시약을 함유하는 적어도 하나의 결합영역; (ii) 결합 특이성면에서 서로 다른 결합시약을 함유하는 적어도 하나의 결합영역으로 이루어진 다수의 분리된 결합영역을 가질 수 있다. 실시예에 의하면, PMAMS는 (a) 하나의 동일성의 결합시약(예; T 세포 항원 수용체에 대한 항체, 예, α, β T 세포 항원 수용체 또는 γ, δ T 세포 항원 수용체)을 함유하는 적어도 하나의 결합영역이 상기 T 세포 항원 수용체를 발현하는 모든 세포로 결합하도록 하는 것; (b) 두 개의 상이한 결합시약(예; T 세포 항원 수용체에 대한 항체 및 CD4에 대한 항체)을 함유하는 적어도 하나의 결합영역을 T 세포 항원 수용체(즉, T 림프구의 하위군)를 발현하는 CD4+T 림프구에 결합시키는 것으로 만들어진다.
또 다른 양태에서, 적어도 하나의 결합영역은 상이한 분자이지만 동일 결합 특이성(예; 피하 성장 인자 및 피하 성장 인자 수용체에 대한 항체와 같은 결합시약)을 가진 결합시약을 함유한다.
다수의 결합시약은 비록, 결합시약이 다르고 상이한 결합 특이성을 가짐에도 불구하고 그들이 동일 분석물을 인식하도록 선택될 수 있다(대안적인 양태에서, 상이한 분석물이 인식된다). 예를 들면, 분석물이 수많은 결합부를 가진 분석물(예; 상이한 세포 표면 항원을 가지는 세포)인 경우, 상이한 결합부에 결합하는 상이한 결합시약들은 동일한 분석물을 인식할 것이다. 다른 예로서, 하나의 세포상의 상이한 세포 표면 항원에 대한 항체들은 동일한 세포를 인식할 것이다. 또 다른 예로서, 하나의 항원의 서로 다른 에피톱에 대한 항체들은 그 항원을 인식하는 결합시약으로서 사용될 것이다.
다수의 결합시약은 결합영역이 동일 분석물을 인식하지만 상이한 친화성을 갖는 다수의 결합영역이 형성될 수 있도록 선택될 수 있다. 이러한 PMAMs의 사용은 더 큰 농도에 걸쳐서 분석물의 검출을 허용한다(예를 들면, 고 친화성 결합영역은 저 친화성 결합영역을 포화시키지않는 조건하에서 분석물로 포화될 수 있다).
추가 양태에서, 하나의 해당 분석물에 특이적으로 결합하는 오직 결합시약(들)은 하나 이상의 결합영역내에 존재한다. 대안적으로, 해당 하나 이상의 분석물에 특이적으로 결합하는 결합시약들은 하나 이상의 결합영역(예; 가교-반응 항체)내에 존재한다. 특별한 고안에 있어서, 결합시약은 분석물, 예컨대, 유사한 특징을 가지는 부류에 결합하는데 사용될 수 있다.
또한, 결합영역은 바람직한 표준 분석물을 위해 특이적이고, 내부 표준(예; 결합시약이 결합하는 분석물을 한정된 양으로 함유하는 샘플과 접촉될 수 있는 결합영역)으로 활용되는 결합시약을 함유하는 PMAMS 내로 통합될 수도 있다. 또한, 동일 분석물(들)에 특이적인 결합시약을 함유하는 다수 결합영역은 PMAMS내로 통합됨으로써, 분석 결과의 통계 평균을 가능케 할 수 있다. 결합시약은 동일 분석물에 특이적일 뿐만 아니라, 동일할 수 있으며, 이리하여 분석물 상의 동일 결합부를 인식할 수 있다. 따라서, 다수 결합영역(예; 2 내지 108범위내)는 동일 결합부에 특이적으로 결합하도록 제조될 수 있으며, ECL 판독이 분산을 조절하고 정확도를 개선시키고자 통계적으로 평균화된다. PMAMS상의 다수의 결합영역은 하나의 지지체 상의 분석물, 해당 분석물, 또는 모두를 조절하기 위해 특이적일 수 있다.
또 다른 예로서, 하나 이상의 분리된 결합영역은 ECL 표지의 공지된 초기 농도수로 제조될 수 있다. 짜맞춘 ECL 층은 예컨대, 표지 분해 및 온도 효과를 모니터하는 컨트롤로서 역할한다.
결합시약은 기질에 특이적인 효소로 사용될 수 있으며, 기질에 대한 효소반응의 생성물은 리포터 약제(검출가능한 약제), 예컨대, ECL 반응을 개시하는 생성물, 형광 분자, 적절한 효소와의 접촉에 의존하여 색이 변하는 물질(예; 호스라디쉬 퍼옥시다아제에 대한 색원성 물질) 등이다. 상기 양태의 한 예에서, 결합시약으로 사용되는 효소는 글루코스 디하이드로제나아제(GDH)로서, 샘플내 글루코스를 검출하거나 측정하는데 사용될 수 있다. ECL 표지는 GDH를 함유하는 결합영역 내에 또는 근처에 설정된다. NADH는 글루코스에 대한 효소 작용에 의해 생성되며, NADH는 ECL를 촉진하는 ECL 표지와 함께 반응할 수 있다[참고문헌; Martin et al., 1993, Anal. Chim. Acta 281:475].
백그라운드 결합을 증가시키는(즉, 샘플내에서 해당 분석물 및 기타 분석물에 존재하는 결합부에 결합하는) 결합시약을 함유하는 결합영역이 전기화학발광성을 검출 또는 측정하는 동안 시그널 대 잡음 비율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 실시예에 의하면, 해당 분석물이 특수한 세포 하위군(예; CD4+세포)이고 샘플이 환자로부터 얻은 세포를 함유하는 유체 샘플(예; 혈액)인 경우, 시알산에 대한 항체는 샘플내 실질적인 모든 세포로의 주변 결합을 증가시키는 결합시약으로서 사용될 수 있으며, 세포내 하위군(예; CD4에 대한 항체)에 특이적인 세포 표면 항원에 대한 항체는 결합시약으로서(동일 또는 상이한 결합영역에서 시알산에 대한 항체를 함유하는 것으로서) 사용될 수 있다.
5.3. 전압 파형
ECL 전지의 다수의 전극/카운터 전극에 가해진 전압 파형(시간당 전기 전위의 변화)은 ECL 반응을 개시하기에 충분하여야 한다. 이러한 전압 파형은 대개 일차 전압에서 개시하여, 이차 전압으로 이동하고, 다시 일차 전압을 경유하여 삼차 전압으로 이동하고, 이후 다시 일차 전압으로 되돌아가는 일정한 전압 스위프의 유형이다. 예를 들면, 파형은 일차 전압시 -0.5 내지 0.5 볼트의 범위에서 개시하여 1 내지 2.5 볼트의 범위의 이차전압으로 상승하며, 다시 일차 전압을 경유하여 0.0 내지 -1 볼트 범위의 삼차 전압으로 이동한다. 또 다른 예로서, 좀 더 단순한 파형에서, 전압은 0.0 부터 +3.5 까지 변경될 수 있다. 전압 파형은 선형 램프, 단계 기능, 및/또는 기타 기능을 통합시킬 수 있다. 전압 파형은 전압이 한 전위에서 고정된 채로 있을때 시간 범위를 통합시킬 수 있다. 적용된 전위는 하나 이상의 기준전극에 상대적으로 조절될 수 있거나, 기준전극이 하나도 사용되지 않을 수도 있다. 부가적으로, 음 전위가 사용될 수 있다. 이리하여, 본 발명의 카세트로부터 ECL 방출을 유도하는데 사용되는 전압은 최적 ECL 시그널 강도를 위해, 그리고 ECL 표지 및 분석 매질을 위한 특이성을 위해 쉽게 선택될 것이다.
몇몇 적용에서, 결합영역으로부터 방출된 광이 측정됨에 따라, 전압은 바람직하게 변화된다. 이는 결합영역이 광 방출을 야기하도록 하는데 필요한 전기장의 역치값을 결정하는데 특히 중요하다. 이러한 경우에, 결합영역에 적용된 전기 전위는 광을 방출하는데 필요한 역치 이하로 여겨지는 값에서 개시하며, 일차 측정은 방출된 광으로 만들어진다. 광이 측정되지 않거나 광이 예비결정된 역치 이하이면, 전극쌍을 통해 적용된 전기 전위는 컴퓨터 조절된 전압원과 같은 컴퓨터 조절하에 증가되며, 또 다른 광 측정이 이루어진다. 상기 과정은 예비결정된 적절량의 광을 받을때가지 반복될 수 있다. 상기 방식에서, 적용된 전압은 분석 시그널로서 사용될 수 있다.
전압파형은 AC 성분을 함유할 수 있다. 이러한 파형의 사용은 예를 들면, 전압입력으로부터 주파수에 있어 차이가 나는 시그널을 필터링함으로써 ECL 시그널의 검출시 더 양호한 시그널 : 노이즈를 허용한다.
전압과 전류 세팅[참고문헌; 미국 특허 No. 5,324,457 및 5,068,088]에 익숙한 통상의 기술자는 ECL 방출을 개시하기 위한 최적의 작동 전압 및 전압 스위프를 쉽게 선택할 수 있을 것이다.
ECL를 발생시키는데 필요한 전위는, 작동전극이 반도체이거나 광에 반응하여 전기 전류를 발생시키는 또 다른 부분을 함유하는 경우에, 작동전극 표면의 투광에 의해 발생될 수 있다.
5.4. 애드레스할 수 있는 전극 및 이를 사용하기 위한 방법
다수의 전극/카운터 전극 쌍을 애드레스하기 위해 수많은 방법들이 사용될 수 있다. 이러한 기술에 대한 몇가지 예가 도 14 내지 도 18에 도시되어 있다. 이들 도면에서는, 4가지 전극/카운터 전극 쌍(101, 102, 103, 104) 및 전형적으로 디지탈 컴퓨터이며, 바람직하게는 검출 수단에 의해 검출된 ECL을 처리하기 위해 사용된 동일한 컴퓨터인 파형 발생기가 예로서 도시되어 있다.
도 14에서, 각 전극/카운터 전극 쌍(101-104)은 파형 발생기에 접속된 라인 쌍에 의해 개별적으로 애드레스된다. 실시예에 의하면, 라인(105, 106)이 전극/카운터 전극 쌍(101)에 접근한다. 적절한 파형은 주어진 시간에 파형 발생기에 의해서 다양한 전극/카운터 전극 쌍에 접속된 하나 이상의 라인 쌍에 적용될 수 있다.
전극쌍에 애드레스하기에 필요한 접속 수를 감소시키고자, 도 14의 대안적인 직 접속 도식이 제공된다. 예를 들면, 열-및-행 접근 도식은 일부 또는 전부의 전극을 전기적으로 에너지하기 위해 도 15에 도시되어 있다. 상기 도식에서, 다수의 전극/카운터 전극 쌍의 각 행에서 전극(201,202) 중 하나는 지지체(200)상의 통상의 전기 전도체(205)에 접속되며, 다수의 전극/카운터 전극 쌍의 각 열에서 카운터 전극 중 각각은 지지체(200)상의 전도체(207, 208)에 접속된다. 전도체(205, 206)는 각각 지지체(200)의 가장자리에서 접속 C1, C2에 접속하며, 전도체 (207, 208)는 각각 접속 R1, R2에 접속한다. 이후, 이들 접속 각각은 분리 라인에 의해 파형 발생기로 접속된다. 그 결과, 도 15의 도시에서, 파형 발생기로부터의 필요한 접속 및 시그널 라인의 수가 8에서 4로 감소되었다.
각 전극 쌍의 빠르고 순차적인 전압인가를 가능케하기 위하여, 컴퓨터 조절되는 스위치 장치가 유익하다. 도 16의 배열은 제 1 멀티플렉서(310)에 접속된 다수 전극을 나타낸다. 다수의 카운터 전극은 제 2 멀티플렉서(320)에 접속된다. 제 1 멀티플렉서는 또한, 전형적으로 시간 변화성 전기 전위를 제공하는 전압원(330)의 제 1 극에도 접속된다. 제 2 멀티플렉서도 또한 전압원의 제 2 극에 접속된다. 멀티플렉서 각각에 전기적으로 접속되고 래치(34)에 접속되는 애드레스할 수 있는 라인 A0-A3을 사용하여, 컴퓨터 프로세서(350)는 전압원의 제 1 극으로 일부 또는 전부의 제 1 전극이 선택적으로 접속되고, 전압원의 제 2 극으로 일부 또는 전부의 제 2 전극이 접속되도록 멀티플렉서를 지시할 수 있다.
도 17에 도시된 바와 같이, 다수의 전압원은 각 전극의 멀티플렉서의 분리 세트를 통하여 접속된다. 제 1 전기 전위 또는 전기 전위의 범위가 특정 전극 쌍에서 요구된다면, 그 전위를 제공하는 전압원(430)과 결합된 멀티플렉서(410, 420)는 컴퓨터 프로세서에 의해, 전형적으로 래치(340)를 통해, 애드레스됨으로써, 특정 전압원을 문제의 전극 쌍으로 접속시킨다. 상이한 전기 전위 또는 전기 전위 범위가 또 다른 전극 쌍을 위해 요구된다면, 그 상이한 전압원(460)과 결합된 멀티플렉서(440, 450)는 컴퓨터 프로세서에 의해 애드레스됨으로써, 결합된 멀티플렉서(440, 450)를 통한 전압원을 전극 쌍에 접속시킬 수 있다.
양태에서 전극 배열이 도 14 또는 도 15에 도시된 독립적으로 유도할 수 있는 전극 쌍의 적어도 일부를 가진다면, 하나의 전극 쌍은 하나의 전압원에 의해 유도될 수 있는 반면에, 다른 전극 쌍은 다른 전압원으로 동시에 유도된다. 대안적으로, 도 17의 두 개의 전압원은 평행한 멀티플렉서의 양 세트에 접속된 하나의 전압원으로 대체될 수 있어서, 두 개의 전극 쌍이 동일 전압원으로부터 유도되는 것을 가능케한다.
도 17에 도시된 바와 같이 각 전압을 위해 멀티플렉서의 이중 세트 대신에, 도 18에 도시된 바와 같이 다수의 전압원(520, 530)이 제공될 수 있다. 이들 전압원은 컴퓨터 조절되는 전기 스위치(들)(510)를 통해 멀티플렉서(310,320)의 하나의 세트로 접속될 수 있다. 도 18에 도시된 바와 같이, 컴퓨터는 특정 전압원이 멀티플렉서로 접속하도록 스위치(510)를 지시하며, 또한 선택된 전압원이 바람직한 특정 전극 쌍으로 접속하도록 멀티플렉서를 지시(이들의 애드레스 라인 A0-A3 시그널에 의해)할 것이다.
대안적으로, 임의의 양태에서 전극 쌍 각각에 적용된 전기 전위는 변할 수 있다. 이는 다수의 상이한 결합영역을 가진 카세트가 사용될때 특히 유리하다. 상기 카세트는 상이한 결합영역에서 상이한 범위의 적용된 전기 전위를 필요로 할 수 있다. 각 전극에 적용된 전기 전위의 변화가 가능한 여러 상이한 양태가 고려된다.
유리하게도, 컴퓨터 조절된 전압원이 사용될 수 있다. 컴퓨터 조절된 전압원은 공급된 특정 전기 전위를 선택하도록 컴퓨터에 의해 애드레스될 수 있는 것이다. 대안적으로, 이는 예비결정된 시간에 걸쳐서 전기 전위의 특정 범위를 순차적으로 적용하도록 프로그래밍될 수 있다. 상기 시스템에서, 컴퓨터 및 전압에 전기적으로 접속된 애드레스 라인은 전압인가된 전극 쌍에 적용되는 특정 전기 전위를 생산하도록 컴퓨터가 전압원을 프로그램하는 것을 가능케 할 것이다.
다수의 전극 쌍을 애드레스하기 위한 부가적인 방법이 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 다수의 기준전극을 전극 및 카운터 전극 각각에 근접하게 위치시켜 이로부터 적용되는 전압을 감지토록 할 수 있다. 이런 방식에서, 전압 파형의 부가적 조절이 유지될 것이다.
도 36은 본 발명의 또 다른 양태를 도시한다: 전극 배열(3600, 3601)이 절연체(3604)(예를 들면, 펀치된 구멍(3605)을 지닌 플라스틱 시이트)내 갭 유형에 의해 분리된 두 개의 표면(3602, 3603) 각각에 지지된다. 각각의 전극은 다수의 갭을 통해 지날 수 있다. 전위가 각 표면 상의 하나의 전극 사이로 적용된다면, 전류는 양 전극과 접촉한 갭을 통해서만 흐를 것이며, 따라서 발생할 수 있는 임의의 전기화학 또는 ECL 위치를 제한할 것이다. 도면에 나타난 바람직한 양태에서, 전극(3600, 3601)은 지지체 상에서 라인의 배열이다. 두 개의 표면 상의 두 세트의 전극은 서로 직각으로 위치한다. 절연 시이트 내 갭은 각 표면으로부터 전극의 교차에만 위치한다.
이러한 양태는 전기 리드가 덜 필요한 개별 애드레스된 전극 쌍에 걸쳐서 잇점을 가진다.
대안적인 양태에서, 절연체(3604)는 생략되며, 표면은 근접하게 위치하여, 협소한 갭이 두 개의 표면 사이에 존재하도록 한다. 상기 양태에서, 각 표면 상의 전극 사이에 적용된 전위는 전류가 바람직하게는 전극의 교차(즉, 전극 사이의 거리가 최소인 곳)에서 통과하도록 야기함으로써, 일어날 수 있는 임의의 전기화학 또는 ECL의 위치를 제한할 것이다.
5.5. 광 검출
개시된 ECL 방출에 의해 생성되는 광은 본 발명의 장치에 근접하게 위치하는 적절한 광 검출기(들)에 의해 검출된다. 광 검출기는, 예를 들면, 필름, 광전자증배관, 포토다이오드, 애벌랜치 포토 다이오드, 전하 연결 장치("CCD") 또는 기타 광 검출기 또는 카메라일 수 있다. 광 검출기는 순차적인 방출을 검출하는 단순 검출기일 수 있거나, 한 지점에서 동시적 방출 또는 방출된 광의 다 파장을 검출하고 공간적으로 분해할 수 있는 복수 검출기일 수 있다. 방출되고 검출된 광은 가시광선일 수 있거나 적외선 또는 자외선과 같이 비-가시광선으로 방출될 수도 있다. 검출기(들)는 정적이거나 동적일 수 있다. 방출된 광 또는 기타 방사가 카세트의 결합 표면에 근접하게 위치된 렌즈, 유리 및 섬유광학 광 가이드 또는 광 전선(단순, 복합, 고정 또는 이동성)의 수단에 의해 검출기(들)로 전도될 수 있거나, 검출기가 직접 광을 받을 수도 있다. 게다가, 지지체, PMAMS 및 전극 표면 자신은 광의 전파를 가이드 또는 허용하도록 활용될 수 있다.
PMAMS는 각각의 검출기만이 하나의 결합영역으로부터 광을 받도록 하기 위해 광 검출기의 배열 표면 상에 형성될 수 있다. 광 검출기의 배열은 CCD 칩일 수 있으며, 결합영역은 반도체 장치의 표면으로 부착될 수 있다(표준 연결 화학기를 사용하여).
결합영역 상에, 또는 제 2 표면 근처상에 침착된 드롭은 방출된 광을 지시 및 조절하기 위한 마이크로렌즈로 사용될 수 있다. 대안적으로, 광 검출기는 카세트의 정면에 직접 향할 수 있으며; 비유 반사기 또는 렌즈와 같은 다양한 광 포커스 장치는 광을 임의의 다수 결합영역으로부터 검출기로 향하도록 광 전선 대신에 사용될 수 있다. 적어도 두 개의 분리된 결합영역으로부터 방출된 광은 동시적으로 순차적으로 측정될 수 있다.
광 검출기 내 고유의 열 흐름, 장치의 노화, 또는 전기적 잡음에 기인한 오류가, 측정되는 광 검출 장치 및 결합영역 사이의 "초퍼(chopper)"수단에 의해 조절될 수 있다. 초퍼는 광을 통과하도록 하는 슬롯 도는 컷아웃을 지닌 스핀 디스크와 같이 당업계에서 통상의 기술을 가진 이에게 공지된 통상의 기계적 초퍼일 수 있다. 대안적으로, 광은 LCD 셔터, LCD 셔터의 배열, 고체상 광 밸브(들) 등등에 의해 초핑될 수 있다. 대안적으로, 광학 컴퓨터의 기술내에 공지된 것들과 같은 LCD 셔터의 평면 배열 또는 고체상 밸브가 사용될 수 있다. 이러한 장치는 바람직하게는 카세트의 평면과 광을 결합영역으로부터 광 검출기로 지시하는 광 전선(들) 또는 광 포커스 장치 사이에 위치된다. 한 양태에서, 셔터는 각 결합영역 위에 위치한다. LCD 셔터 또는 광 밸브를 사용할때, 셔터는 상이한 빈도에서 변조되어 결합영역을 방출하는 상이한 광을 위한 상이한 초핑된 속도를 제공할 수 있다. 이러한 기술을 이용하여, 다수의 상이한 광 시그널은 하나의 검출기에 의해 겹쳐지며 동시적으로 측정될 수 있다. 광 검출기로 전기적으로 접속된 필터를 통과하는 전기 밴드는 이후, 전기적 단일 시그널을 다수 개별 광 성분 중 하나에 각각 상응하는 여러 전기 성분으로 분리하는데 사용된다. 상기와 같이, 또는 당업계에 공지된 다른 기작을 이용하여 광을 쵸핑함으로써, AC 광 파형은 DC 잡음 성분이 전기적으로 필터링되어 제거되도록 만들어진다.
또한 ECL 시그널은 시약 소모에 기인한 시그널 변조를 수정하기 위해서 사전에 측정된 결과를 표준 시약과 비교함으로써 검정할 수 있다.
5.6. ECL 시그널의 분석
주어진 결합영역으로부터 발생한 시그널은 수치의 범위를 지닐 수 있고, 이러한 수치는 '아날로그' 시그널을 제공하는 양적인 측정과 상호 관련이 있다. 다른 기술에서 '디지탈' 시그널은 분석물이 존재하거나 존재하지 않는다는 것을 나타내는 각각의 부위로부터 수득된다.
통계적인 분석은 두 기술 모두에 사용되고, 특히 양적인 결과를 제공하기 위해서 다수의 디지탈 시그널을 번역하는 데에 유용하다. 그러나, 일부 분석물은 역치 농도를 나타내는 디지탈 존재/비존재 시그널을 요구한다. '아날로그' 및/또는 '디지탈' 포맷은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 다른 통계학적 방법은 PMAMS를 가지고 사용할 수 있다. 예를 들면, 표면상의 PMAMS의 농도 구배를 생성하는 것이 가능하다 (참고문헌 : Chaudhury et al., 1992, Science 256:1539-1541). 이러한 기술은 농도 구배에 대한 결합의 통계학적 분석을 통하여 농도를 측정하는 데에 사용된다. 농도 구배를 갖는 PMAMS의 다중 선형 배열은 상이한 특이 결합시약의 다중성으로 생성할 수 있다. 농도 구배는 상이한 농도의 결합시약을 제시하는 분리된 결합영역로 이루어질 수 있다.
카세트 결합 표면의 통제 배열 시스템의 존재는 또한 시그널 변이(예를 들면, 분해에 기인한 변이, 파동, 카세트와 기타 성분의 노화, 열적 쉬프트, 전자 회로의 잡음, 및 광검출 장치의 잡음 등)에 대해 통제하기 위한 각각의 분석의 균일성을 보장하기 위해서 중요하다. 예를 들면, 동일한 분석물에 대해 다수의 여분의 결합영역(동일한 결합시약 또는 동일한 분석물에 특이적인 상이한 결합시약을 함유)을 활용할 수 있다. 다른 실시예에서, 기지 농도의 분석물을 사용하거나 PMAMS의 통제 부위를 ECL 표지의 기지의 양에 결합시키거나 용액 중의 ECL 표지의 기지의 양을 사용한다.
본 발명에 따라 수행된 분석은 예를 들면 임상 또는 조사 정보의 수집물로 이루어진 데이터베이스의 형태로 저장될 수 있는 대량의 데이터를 수월하고 효율적으로 수집할 것이다. 수집된 데이터는 또한 신속한 법정 또는 개인적 신원확인에 사용할 수 있다. 예를 들면, 사람 DNA에 노출시 다수의 핵산 탐침의 용도는 임상 또는 조사 샘플을 증명하기 위해 수월하게 사용할 수 있는 DNA 핑거프린트로 사용할 수 있다.
5.7. 다중 전극 배열의 제조
전극은 광범위하게 폭 또는 직경으로 0.001 내지 10 mm일 수 있다. 바람직한 범위에서 전극 쌍은 크기(폭 또는 직경 또는 전극쌍의 입체에 따른 가장 광범위한 크기)로 0.01 내지 1 mm이다.
바람직하게는, 전극은 당분야에 익히 공지된 바와 같이 예를 들면 액정 디스플레이 등의 제조를 위한 투명한 금속 필름 또는 반도체(예를 들면, 각각 금 또는 인듐-틴 옥사이드)와 같은 적합한 도체 물질로부터 제작된다. 카세트의 조립된 형태에서, 예를 들면 얇은 필름 또는 가습된 표면과 같은 분석 샘플을 함유하기 위해서 제 1 지지체와 제 2 지지체 사이에 충분한 공간이 잔존한다.
전극은 탄소, 탄소 섬유, 탄소 나노튜브 및/또는 이들의 집합체를 함유하는 물질로부터 제조할 수 있다.
하나 이상의 개별적인 피브릴 및/또는 하나 이상의 피브릴의 집합체는 더욱 대규모의 집합체를 형성하도록 가공될 수 있다 (미국 특허 제 5,124,075호). 하나의 양태로서, 이러한 이러한 더욱 대규모의 집합체는 매트 또는 직물이다. 이후 "피브릴 매트"라는 용어는 피브릴이 엉켜 서로 짜여질 수 있는 매트 또는 메쉬를 기술하는 데 사용될 것이다. 피브릴 매트는 전형적으로 50 내지 400 M2/g의 표면적을 갖는다.
예를 들어, 피브릴 매트를 분석적 및/또는 제조 전기화학에서 작동전극, 카운터 전극 또는 기준전극으로 사용할 수 있다. 하나의 예에서, 피브릴 매트를 전기화학발광(ECL)을 위한 전극으로서 사용한다.
PMAMS의 결합영역을 전극, 예를 들면, 피브릴 매트 또는 카본 블랙으로부터 형성된 전극에 의해서 지지할 수 있다. 본 발명의 PMAMS는 둘 이상이 서로 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 다수의 분리된 결합영역을 갖는다. 피브릴 매트는 하나 이상의 결합영역을 지지한다.
하나 이상의 미세유체 가이드는 피브릴 매트 상의 다수의 결합영역을 제조하기 위해서 사용할 수 있다. 상이하거나 동일한 결합시약이 다수의 미세유체 가이드에 존재할 수 있고/거나 다수의 분리된 결합시약이 미세유체 가이드에 존재할 수 있다.
도 22a와 22b에서, 바람직하게는 배열의 다수의 미세유체 가이드 2201을 분리된 결합영역 2202를 형성하기 위해서 피브릴 매트 2200의 부위에, 바람직한 결합시약을 함유하는 드롭에 바람직하게는 동시에 전하는 데에 사용한다. 결합시약은 피브릴 매트에 존재하는 잔기와 결합을 형성한다. 결합시약은 표면의 매트 또는 건조부위로 비-특이적으로 흡착할 수 있다.
흡입 여과가 매트에 적용되는 동안 바람직한 결합시약을 피브릴 매트에 운반한다. 이러한 경우에, 흡입 여과는 매트 안으로 또는 매트를 통하여 어떤 결합시약도 끌어 넣지 않거나 일부 또는 모든 결합시약을 끌어 넣고, 그렇게 하여 패턴화 과정 동안 매트 표면에의 결합시약의 측면 분산의 양을 감소시킨다.
피브릴 매트는 현탁액이 통과하는 물질(예를 들면, 필터) 상의 탄소 피브릴의 현탁물을 압축함으로써 제조한다. 피브릴 매트를 형성하기 위해 사용할 수 있는 필터의 예에는 필터지, 중합체(예를 들면, 나일론) 막으로부터 형성된 필터, 금속 미세망, 세라믹 필터, 유리 필터, 탄성중합체성 필터, 섬유유리 필터 및/또는 이러한 필터 물질의 둘 이상의 조합이 포함된다. 여과에 대한 당분야의 전문가는 이러한 물질이 고체의 현탁물의 여과에 적합한 다수의 가능한 물질의 단순한 예임을 인식할 것이다.
도 23a 와 23b는 피브릴 매트가 흡입 여과에 의해서 제조될 수 있는 양태를 도시한다. 탄소 피브릴 2301의 분산액 및/또는 현탁액을 임의로 필터 막 2303 및/또는 필터 지지체 2302로 구비된 필터 2300을 사용하여 여과한다. 현탁액을 진공원 2305에 의해 필터, 예를 들면 필터 플라스크 2306에 의해 적용된 흡입을 사용하여 여과한다. 피브릴 매트 2304는 필터 막 2303 및/또는 필터 지지체 2302에서 수집한다. 필터 막 2303을 갖거나 갖지 않는 피브릴 매트 2304를 필터로부터 제거할 수 있다.
다른 양태에서, 피브릴의 현탁액을 압력을 사용하여 필터를 통과하게 한다. 하나의 실시예에서, 피스톤으로 현탁액 상부의 공기 및/또는 액체의 제한된 층을 압축함으로써 피브릴의 제한된 현탁액 상에 압력을 가한다. 특정 실시예에서, 피브릴의 현탁액은 주사기내에 봉쇄되고, 피스톤은 주사기 플런저이고, 필터는 일회용 주사기 필터이다 (이러한 다수의 필터가 당분야의 전문가들에게 익히 공지되어 있다).
피브릴의 현탁액을 모세관 작용에 의해 필터를 통과하게 하거나 현탁액을 필터 안으로 또는 필터를 통하여 위킹함으로써 여과한다.
다른 양태에서, 개별적인 피브릴 또는 피브릴의 집합체는 공유적으로 가교결합하여 매트로 될 수 있다. 빛에 노출시 중합하는 광민감성 잔기로 유도된 피브릴은 빛으로 조사된다.
다른 양태로서, 개개의 피브릴 또는 피브릴 집합체는 기질상에 분무될 수 있다. 전기분무를 사용하는 것이 가능하다.
필터는 피브릴을 구멍 내에 가두어 필터가 지지체로서 작용하는 복합체 매트를 형성하는 데에 사용할 수 있다. 도 24에서, 피브릴 매트 (2400)은 두개의 대규모의 롤러 (2403) 사이에, 원 (2402)에 의해 운반된 피브릴 (2401)의 슬러리를 통과함으로써 제조할 수 있다. 종이 또는 중합체 시트의 제조에서 발견된 방법과 유사할 수 있는 이러한 방법에서, 롤러는 현탁액으로부터 액체를 나오게하고 더 작은 매트로 절단 될 수 있는 피브릴의 대규모의 연속적인 매트가 생성된다.
피브릴 매트는 프리스탠딩(예를 들면, 비지지)하거나 지지할 수 있다.
여과율은 매트의 바람직한 성질을 이루기 위해서 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 변화시킬 수 있는 성질에는 구조의 균일성 또는 비-균일성, 피브릴 또는 피브릴 집합체의 엉김도, 두께, 매트의 다공성, 및/또는 이의 조합이 포함된다.
탄소 피브릴의 현탁액은 제한되고 피브릴이 현탁된 액체가 제거된다. 하나의 실시예에서, 피브릴이 현탁된 액체를 증발시키도록 한다. 다른 실시예에서, 액체를 가열함으로써 제거한다. 다른 실시예에서, 현탁액을 원심분리하도록 하고, 생성된 액체(예를 들면, 상층액)를 제거한다. 다른 실시예에서, 액체를 배출에 의해 제거한다.
현탁액을 상기에 기재된 하나 이상의 필터에 배치하고 현탁액을 증발에 의해 건조한다. 현탁액은 오븐에서 가열 또는 베이킹함으로써 건조할 수 있거나 액체는 액체를 냉동하고 추출함으로써 제거할 수 있다. 다른 실시예에서, 액체를 펌프를 이용한 배출에 의해 제거할 수 있다. 당분야 전문가들에게 익히 공지되어 있는 다수의 다른 방법은 현탁액으로부터 액체를 제거하기 위해 이용할 수 있다.
여과에 의한 피브릴을 형성하는 데에 적합한 피브릴의 현탁액은 하나 이상의 탄소 피브릴을 적합한 액체, 준(quasi) 고체 또는 겔에 분산시킴으로써 형성할 수 있다. 적합한 액체의 예에는 물, 에탄올, 메탄올, 헥산, 메틸렌 클로라이드, 완충된 용액, 계면활성제, 유기 용매, 생물학적 매질(예를 들면, 단백질, 항생제 또는 이의 분획, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 호르몬 또는 약제, 소입자의 용액, 중합체 전구체, 산 또는 염기의 용액, 오일 및/또는 이의 배합)를 함유하는 용액이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
피브릴의 현탁액은 초음파 분해에 의해 탄소 피브릴을 수용액에 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 다른 양태에서, 계면활성제 및/또는 세제를 첨가할 수 있다.
피브릴 매트는 광범위하게 0.01 ㎛ 내지 10,000 ㎛의 두께를 지닐 수 있다.
바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 1 ㎛ 내지 100 ㎛의 두께를 지닐 수 있다. 특히 바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 폭 또는 직경으로 10 mm 내지 200 mm의 범위이다.
피브릴 매트는 현탁액으로부터 잔존하는 잔여 물질을 제거하기 위해서 반복적으로 세척하고 재여과할 수 있다.
여과 또는 증발에 의해 제조된 피브릴 매트는 여과에 의해 제거되지 않은 현탁액으로부터의 잔여 액체를 제거하기 위해서 가열(예를 들면, 오븐에서)한다.
하나 이상의 다른 층에 접촉하거나 아주 근접하는 하나 이상의 분리된 층으로 구성된 피브릴의 매트를 형성하기 위해서 연속적인 여과 단계를 사용할 수 있다. 층들은 다공성, 밀도, 두께, 개별적인 피브릴 및/또는 피브릴의 초소형 집합체의 크기의 분포, 유형, 피브릴 집합체의 수 및/또는 크기, 피브릴의 화학적인 유도 작용(하기 참조), 및/또는 피브릴에 부착한 다른 물질의 존재에 포함되는 여러 성질에서의 차이에 의해서 구별될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
도 25, 다층 피브릴 매트 2500은 연속적인 여과 단계에 의해 제조된다. 평평한 피브릴의 0.5 ㎛ 내지 100 ㎛ 두께의 층 2501이 제 1 층을 형성한다; 단백질과 기타 분자의 흡착를 저지하는 폴리-(에틸렌글리콜)과 같은 잔기를 혼입하는 피브릴 2502의 0.5 내지 10 ㎛ 두께의 층이 제 2 층을 형성한다; 하나 이상의 결합영역(하기 참조)을 혼입하는 0.5 내지 5 ㎛ 두께의 층 2503은 제 3 층을 형성한다. 결합영역은 분석물 2505에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 2504를 함유한다. 이러한 항체/분석물 복합체는 표지된 항체 2506에 결합할 수 있다. 표지는 ECL 표지일 수 있다. 다른 양태에서, 표지는 본 출원 외에서 기재된 하나 이상의 다수의 표지일 수 있다. 이러한 다층 매트는 프리스탠딩하거나 상기에 기재된 다수의 가능한 지지체 중의 하나에서 지지될 수 있다.
일부 또는 모든 층이 상이할 수 있는 층의 조합이 존재하는 다층 매트를 형성할 수 있다.
피브릴 매트, 피브릴, 및/또는 피브릴 매트에 사용되는 필터는 코팅할 수 있다. 특정 양태에서, 코팅은 금속이다. 이러한 코팅을 패턴화하여 특정 부위를 코팅하고 다른 부위를 코팅하지 않을 수 있다. 하나의 실시예에서, 코팅은 전기침착에 의해 적용한다. 다른 예에서, 코팅은 비전기 침착에 의해 적용한다. 금속 침착의 다른 방법, 예를 들면, 열 또는 전자 빔 침착 또는 스퍼터링도 사용될 수 있다.
필터를 금속으로 코팅하고, 피브릴을 금속과의 결합을 형성하는 화학적 작용기로 유도한다. 필터는 금속 스크린 또는 금속 시트이다.
피브릴 매트는 평평하거나 일그러지고, 규칙적이거나 비규칙적이고, 원형, 타원형, 직사각형, 또는 다수의 형태 중의 하나이거나 경성 또는 가요성, 투명, 반투명, 부분적으로 또는 완전히 불투명할 수 있고, 복합체 성질 또는 상이한 개별성 또는 상이한 복합체 성질을 지닐 수 있다.
매트는 디스크이거나 시트로부터 수득된 조각일 수 있다.
다수의 피브릴 매트를 바람직하게는 동시에, 바람직하게는 배열로 제조할 수 있다. 하나의 실시예에서, 미세유체 가이드의 배열은 상기에 기재되어 있는 바와 같이 지지체 상의 다수의 피브릴 매트를 형성한다. 다른 실시예에서, 필터의 배열 또는 패턴화된 필터는 피브릴 매트의 배열을 제조하기 위해서 사용된다.
홀의 배열을 갖는 마스크(예를 들면, 체)는 필터 또는 지지체의 특정 부위를 덮기 위해서 사용되고, 다수의 분리된 피브릴 매트는 여과 및/또는 증발에 의해서 동시에 제조된다.
피브릴 매트는 0.1 내지 3.0 g/㎠의 밀도를 지닐 수 있다. 매트는 다양한 밀도를 지닐 수 있다. 예를 들면, 기계적 힘 또는 압력을 밀도를 증가시키거나 감소시키기 위해서 상이한 횟수로 매트에 적용할 수 있다.
피브릴 매트는 구멍를 지닐 수 있다. 이러한 구멍는 매트를 통하여 부분적으로 및/또는 완전히 확장할 수 있거나 네트워크 또는 구멍들의 일부가 될 수 있다. 이러한 구멍는 광범위하게 50 A 내지 1000 ㎛ 범위의 크기를 지닐 수 있다. 바람직한 양태에서, 피브릴 매트는 광범위하게 200 A 내지 500 ㎛ 범위의 크기를 갖는 구멍를 지닌다. 매트의 다공성은 기타 요인들 중에서 매트의 밀도에 좌우될 수 있다.
매트의 다공성은 전 매트에 걸쳐 일정하거나 매트에서 위치의 작용으로서 증가하거나 감소할 수 있다. 피브릴 매트는 비조직 및/또는 임의의 방법으로 분포된 상이한 크기의 매우 다양한 구멍를 지닐 수 있다.
피브릴 매트는 상이한 다공성의 분리된 부위를 함유할 수 있다. 예를 들면, 피브릴 매트는 하나 이상의 층을 가질 수 있고, 각각은 상이한 다공성을 지닌다. 피브릴 매트는 매트를 통과하는 상이한 다공성의 컬럼을 지닐 수 있다.
매트의 다공성은 집합체가 상이한 크기, 형태, 조성물 또는 조합을 갖는 탄소 피브릴의 상이한 양의 집합체를 포함함으로써 변화시킬 수 있다. 특정한 실시예에서, 매트는 개별적인 피브릴, (상기에 기재된)CC 피브릴 및 (상기에 기재된)BN 피브릴, 또는 상이한 조합으로부터 제조된다. 예를 들면, 피브릴 매트는 생물학적 세포만큼 큰 물체를 통과시키기에 충분히 큰 구멍, 단백질 또는 항체만큼 큰 생물학적 매질을 통과시킬 수 있는 구멍, 단지 작은(1000 분자량 이하) 유기 분자를 통과시킬 수 있는 구멍, 및/또는 이들의 조합을 지닐 수 있다.
매트의 다공성이 그러하므로 하나 이상의 분자, 액체, 고체, 유제, 현탁액, 가스, 겔 및/또는 분산액은 매트 안으로, 매트 이내에 및/또는 매트를 통하여 분산시킬 수 있다. 피브릴 매트의 다공성이 그러하므로 생물학적 매질이 분산(능동적 또는 수동적으로) 시킬 수 있거나 일부 방법에 의해서 매트 안으로, 매트 이내에 및/또는 매트를 통하게 할 수 있다. 생물학적 매질의 예에는 전체 혈액, 분획화된 혈액, 플라즈마, 혈청, 뇨, 단백질 용액, 항체 또는 이의 분획, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 핵산, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 호르몬, 또는 약제가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 피브릴 매트는 하나 이상의 상이한 다공성의 층을 지닐 수 있어 물질이 하나 이상의 층을 통과할 수 있지만 다른 층을 통과할 수 없다.
피브릴 매트는 다른 물질에 의해서 또는 다른 물질 상에서 지지된다. 실시예에 의해서, 지지 물질은 금속, 플라스틱, 중합체, 탄성중합체, 겔, 종이, 세라믹, 유리, 액체, 왁스, 오일, 파라핀, 유기 고체, 탄소 또는 이들 각각의 둘 이상의 혼합물일 수 있다. 물질은 고체이거나 액체일 수 있다. 이것이 고체일 경우, 이것은 하나 또는 다수의 홀 또는 구멍를 함유할 수 있다. 특정 실시예에서, 지지체는 금속 망, 나일론 필터 막 또는 여과지일 수 있다. 지지체는 도체, 반도체 및/또는 절연체일 수 있다. 피브릴 매트는 다른 물질, 예를 들면, 가는 피브릴, 샤드, 또는 금속 볼을 포함하여 매트의 전도성을 증가시킬 수 있다. 다른 예로서, 피브릴 매트는 피브릴 만으로 달성될 수 있는 것과는 상이한 다공성을 생성하기 위하여 다양한 크기, 형상 및 밀도의 다른 탄소, 유리 및/또는 금속 섬유를 혼입할 수 있다. 다른 양태로서, 매트는 마그네틱 비드(예를 들면, DYNAL 비드)를 포함할 수 있다. 후자의 경우, 비드는 매트의 다공성을 변화시키는 역할을 하거나, 그 자체로 결합영역을 고정하기 위한 지지체로서 사용될 수 있다.
미국 특허 제 5,304,326호와 제 5,098,771호에 기재되어 있는 양태에서, 피브릴을 다른 물질에 분산시킬 수 있다. 예를 들면, 피브릴은 오일, 왁스, 파라핀, 플라스틱(예를 들면, ABS, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 아크릴로니트릴 등), 세라믹, 테플론, 중합체, 탄성중합체, 겔, 및/또는 이들의 배합물에 분산시킬 수 있다. 기타 물질에서 피브릴의 분산액은 전도성이다. 기타 물질내 피브릴의 분산액은 원하는 형상 및/또는 형태의 물체를 형성시키기 위하여 성형, 가압, 형성, 주조, 자아내고, 짜고/거나 비튼다.
기타 탄소 물질(예를 들면, 입상 탄소, 탄소 섬유, 흑연 탄소, 버크민스터풀러러렌, 풀러렌, 또는 이들의 배합물)을 다른 물질에 분산시킬 수 있다. 이들은 여기에 다른 물질을 부착시키는 데 사용될 수 있는 화학 작용기로 유도체화될 수 있다. 물질은 이러한 작용기에 공유결합되거나, 또는 비공유 흡착될 수 있다.
탄소 피브릴은 이들의 표면에 공유적으로 부착된 화학적 작용기로 제조할 수 있다. 국제 공개 제 WO 90/14221호에 기재된 바와 같이, 이러한 화학적 작용기에는 COOH, OH, NH2N-하이드록시 숙신이미드 (NHS)-에스테르, 폴리-(에틸렌 글리콜), 티올, 알킬 ((CH2)n) 그룹, 및/또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 기타 화학적 작용기는 기타 물질을 피브릴의 표면에 부착시키는 데에 사용할 수 있다.
특정 화학 작용기(예를 들면, COOH, NH2, SH, NHS-에스테르)는 다른 작은 분자를 피브릴에 커플링시키기 위해 사용할 수 있다. 이러한 화학적 작용기와 작은 분자의 가능한 다수의 조합이 존재한다.
다수의 양태에서, NHS-에스테르 그룹은 친핵성 화학 작용기(예를 들면, 아민)를 생성하는 다른 분자 또는 물질을 부착시키는 데에 사용한다. 바람직한 양태에서, 친핵성 화학 작용기는 생체분자 상에 및/또는 생체분자 내에 자연적으로 및/또는 화학적 유도작용에 의해 존재한다. 적합한 생체분자의 예에는 아미노산, 단백질 및 이의 작용성 분획, 항체, 항체의 결합 분획, 효소, 핵산, 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 다수의 이러한 가능한 기술들 중의 하나이고, 일반적으로 본원에 주어진 실시예와 다수의 다른 유사 물질 및/또는 생체분자에 적용할 수 있다. 바람직한 양태에서, ECL에 사용할 수 있는 시약은 NHS-에스테르 그룹에 의해서 피브릴에 부착할 수 있다.
ECL 분석에 사용할 수 있는 항체는 공유 결합(예를 들면, NHS-에스테르와의 반응)에 의해서, 적합한 링커와의 반응에 의해서(하기 참조), 비-특이 결합에 의해서 및/또는 이들의 조합에 의해서 하나 이상의 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다. 핵산 및/또는 세포는 피브릴에 부착된 NHS-에스테르에의 공유 결합에 의해 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다.
물질의 피브릴 및/또는 피브릴 매트에의 비-특이 결합의 정도를 조절하는 것이 바람직하다. 비-제한 실시예에 의해서 단순히, 단백질, 항체, 항체의 단편, 세포, 아세포 입자, 바이러스, 혈청 및/또는 하나 이상의 성분, ECL 태그(예를 들면, RuII(bpy)3과 RuIII(bpy)3유도체), 옥살레이트, 트리알킬아민, 항원, 분석물, 및/또는 이의 조합의 비-특이 흡착를 감소시키거나 저지하는 것이 바람직할 수 있다. 다른 실시예에서, 생체분자의 결합을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.
비-특이 결합을 감소시키거나 저지하는 하나 이상의 화학적 잔기는 탄소 함유 전극(예를 들면, 카본 블랙) 또는 하나 이상의 피브릴, 하나 이상의 피브릴 집합체, 다른 물질 중의 피브릴 분산액 및/또는 피브릴 매트 내에, 그 안에, 또는 그에 아주 인접하여 존재할 수 있다. 이러한 잔기, 예를 들면, PEG 잔기 및/또는 하전된 잔기(예를 들면, 포스페이트, 암모늄 이온)는 전극에 부착할 수 있다.
지지체, 전극 및/또는 결합영역에 사용되는 물질은 비-특이 결합을 감소시키기 위해서 계면활성제로 처리할 수 있다. 예를 들면, 피브릴 또는 피브릴 매트는 당분야의 통상적인 기술(예를 들면, the Tween series, Triton, Span, Brij) 중의 하나로 익히 공지되어 있는 계면활성제 및/또는 세제로 처리할 수 있다. 피브릴 또는 피브릴 매트를 계면활성제 및/또는 세제의 용액으로 및/또는 이의 조합으로 세정하고, 적시고, 배양한다. PEG에 유사한 방법으로 행동하는 PEG 및/또는 분자(예를 들면, 올리고- 또는 다당류, 기타 친수성 올리고머 또는 중합체)의 용액("Polyethylene glycol chemistry: Biotechnical and biomedical applications, Harris, J.M. Editor, 1992, Plenum Press)을 계면활성제 및/또는 세제 대신에 및/또는 접합하여 사용할 수 있다.
상기에 기재된 물질과 같은 특정 물질의 바람직하지 않은 비-특이 흡착는 결쟁적 비-특이 흡착에 의해 블록킹될 수 있다. 이러한 경쟁적인 결합 종은 보빈 혈청 알부민(BSA) 면역글로불린 G(IgG)일 수 있다.
ECL-TAG의 비-특이 결합은 TAG의 화학적 변형에 의해 감소할 수 있다. 예를 들면, TAG는 이의 친수성을 증가시키기 위해서(예를 들면, 친수성, 극성, 수소결합, 및/또는 하전된 작용기를 Ru(bpy3)의 바이피리딜 리간드에 첨가함으로써) 변형할 수 있고 따라서 TAG의 다른 표면에의 비-특이 결합을 감소시킨다.
생체분자 또는 기타 매질을 탄소 함유 물질, 예를 들면, 카본 블랙, 피브릴 , 피브릴 매트 및/또는 다른 물질에 분산된 탄소에 고정시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 효소, 효소 기질, 억시약, 조인자, 항원, 헵텐, 지단백질, 지당류, 세포, 아세포 성분, 세포 수용체, 바이러스, 핵산, 항원, 지질, 당단백질, 탄수화물, 펩티드, 아미노산, 호르몬, 단백질-결합 리간드, 약제, 및/또는 이들의 조합물을 부착할 수 있다. 예를 들면, 중합체, 엘라스토머, 겔, 코팅, ECL 태그, 산화환원 활성종(예를 들면, 트리프로필아민, 옥살레이트), 무기 물질, 킬레이트화제, 링커 등(이에 한정되지 않음)과 같은 비-생물학적 물질을 부착시키는 것이 바람직할 수도 있다.
하나 이상 또는 다수의 종이 탄소로 이루어진 물질의 표면에 비-특이적으로 결합할 수 있다(예를 들면, 흡착).
생물학적 분자 또는 기타 매질은 비-특이 흡착에 의해 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착할 수 있다. 주어진 피브릴, 피브릴 매트 및/또는 생체분자에 대한 비-특이 흡착의 정도는 각각의 특정한 성질에 의해 측정될 것이다. 피브릴에 존재하는 특정 화학적 작용기 또는 생물학적 잔기는 비-특이적 결합을 감소시키거나 개선할 수 있다. 단백질 표면의 소수성 및/또는 친수성 패치의 존재는 단백질의 피브릴 또는 피브릴 매트에의 비-특이 결합을 개선하거나 감소시킬 수 있다. 친수성 및/또는 소수성 패치는 통제된 부위내에서 비-특이 결합을 조절하는 데에 사용된다.
탄소는 생물학적 분자 또는 매질 또는 기타 물질의 비-특이 결합을 개선하기 위해서 알킬 (CH2) 쇄 및/또는 카복실산 그룹으로 유도할 수 있다.
도 26은 단일 피브릴의 경우에 상기 양태를 도시하여 설명한다. 피브릴 2600은 알킬쇄 2601로 유도한다. 생체분자 2602, 2603, 및 2604는 알킬 쇄에 비-특이적으로 결합한다. 중합체/탄성중합체 2605가 또한 결합된다.
비유도체화된 피브릴, 피브릴 집합체 및/또는 피브릴 매트는 비-특이 결합에 의한 생체분자, 생물학적 매질, 및 기타 물질의 고정을 위해 사용한다.
ECL TAG는 하전된 잔사를 함유한다. ECL TAG를 지지체 및/또는 전극에 선택적으로 부착되도록 한다. 예를 들면, 네트 음전하인 유도된 ECL TAG는 환원성전위에서 전극에 대해 상대적으로 낮은 친화력을 지니고, 이어서 전극 전위가 좀더 산화됨에 따라 전극에 대해 더 높은 친화력을 지닌다. ECL 표지 및/또는 결합시약의 전극에의 친화력을 조정할 수 있다. 이러한 조정을 이용하여 결합 동역학을 향상시키거나 세척 단계의 효율을 향상시킬 수 있다.
도 28에서 (생물학적 및 비-생물학적) 분자가 공유 결합에 의해서 피브릴에 부착될 수 있다. NHS-에스테르 화학적 작용기를 생성하는 피브릴 2800은 생체분자 또는 생물학적 매질 2802,2803에 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 생물학적 매질은 NHS-에스테르 그룹과의 반응에 의해 공유 결합을 형성하기 위해서 아미노기를 사용할 수 있다. 중합체 2808을 고정한다. 당분야의 통상의 기술자가 분자의 커플링제로서 NHS-에스테르 그룹의 일반성을 알아내었고 고정을 이루기 위한 적합한 생체분자와 적합한 반응 조건을 선별할 수 있었다.
하나 이상이 피브릴에 부착되어 있는 한 쌍의 잔기 및/또는 분자 "M1"과 " S1"은 상호 친화력 또는 결합 역량을 나타낸다. M1/S1은 항체/항원, 항체/햅텐, 효소/기질, 효소/조효소, 효소/억시약, 렉틴/탄수화물, 수용체/호르몬, 수용체/작동체, 핵산/핵산, 단백질/핵산, 바이러스/리간드, 세포/세포 수용체 등일 수 있다. "결합쌍" M1/S1의 다수의 조합은 바람직한 결합을 달성하기 위해서 적합한 조합을 선별할 수 있다. M1 또는 S1을 하나 이상의 피브릴에 부착할 수 있다.
도 27과 28은 이러한 양태에 가능한 다수의 가능한 배치 중의 일부를 도시한다. 도 27에서, 알킬쇄 2701로 비-특이적으로 유도된 피브릴 2700은 다른 분자 2703에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는 분자 2702를 결합시킨다. 분자 2703을 또한 다른 분자 2704에 부착한다. 블록킹 분자 2705는 피브릴에 비특이적으로 흡착될 수 있다. 분자 2709에 대해 친화력을 갖는 리간드(2708)를 지닌 블록킹 중합체 2706 및/또는 중합체 2707은 비-특이적으로 흡착된다.
도 28에서, 피브릴 2800은 2801에 의해서 분자 2802와 2803 및 링커 분자 2804에 공유적으로 결합된다. 링커 분자 2804는 다른 생체분자 2805에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는다. 생체분자 2803은 2807에 공유적으로 결합된 다른 링커 분자 2806에 대해 상호 친화력 또는 결합 역량을 갖는다. 결합 파트너 2809에 특이적인 리간드 2812를 갖는 중합체 2808은 피브릴에 공유적으로 결합한다. 블록킹 분자(예를 들면, BSA) 2811과 블록킹 중합체 2810이 공유적으로 부착된다.
피브릴은 바이오틴 및/또는 바이오틴화된 링커로 유도될 수 있고 아비딘 및/또는 스트렙트아비딘은 이러한 링커에 결합할 수 있다. 아비딘 및/또는 스트렙트아비딘은 피브릴에 결합할 수 있고, 바이오틴화된 항체 및/또는 단백질이 결합할 수 있다. 아비딘 및/또는 스트렙트아비딘은 비-특이적 결합, 공유 결합, 다른 또는 동일한 커플링 쌍, 또는 이들의 조합에 의해 피브릴에 고정될 수 있다. "결합 쌍"으로서 (스트렙트)아비딘과 바이오틴의 사용은 생체분자 또는 생물학적 매질을 다른 물질에 부착시키는 광범위하게 적용된 방법이고 당분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다 (참고 문헌 : Spinke et al., 1993, Langmuir 9 : 1821).
결합 쌍은 모노클론 항체와 이 항체에 결합하는 항원일 수 있다.
다중 결합 쌍(예를 들면, M1/S1/M2)을 형성할 수 있다. M1은 모노클론 항체이고, S1은 M1의 항원이고, M2는 S1에 결합하는 항체이다. 이러한 복합체는 항체/항원/항체 "샌드위치" 복합체를 구성할 수 있다 (이러한 항체는 모노클론이거나 아닐 수 있다). M2는 ECL-반응 태그(하기 참조), 형광 표지, 방사선 표지, 효소 태그, 및/또는 이들의 조합을 덧붙인 항체일 수 있다.
M1은 금속, 금속 이온, 또는 유기금속 화합물("킬레이팅제")과 복합할 수 있는 잔기일 수 있고 S1은 M1과 복합체를 형성하는 금속, 금속 이온, 또는 유기금속 화합물("킬레이트")이고, M2는 M1/S1 복합체에 결합하는 생물학적 분자의 잔기이다 (Gerhon and Khilko, 1995, Journal of Immunogical Methods, 7371).
전류를 표면상의 이러한 전극에 분포시키는 금속 전극 유형과 전도성 전지의 제조는 당분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행된다 (Leventis et al., U.S. 특허 제 5,189,549호 참조). 투명한 표면상에 금속 필름의 제조는 액정 디스플레이를 생성하는 데에 사용되고 본 발명에 따른 전극의 제조에 수월하게 적용된다 (Haneko, 1987, Liquid Crystal TV Displays, Principles and Applications of Liquid Crystal Displays, KTK Scienific Publishers, Tokyo, D. Reidel Publishing). 예를 들면, DiMilla et al., 1994, J. Am. Chem. Soc. 116(5):2225-2226의 방법에 따라서 투명한 전극 표면을 또한 제조할 수 있다. 0.5 nm의 티타늄과 5 nm의 금을 투명한 물질(유리 또는 플라스틱)에 침착시킨다. 상기의 DiMilla의 방법에 의해 제조된 얇은 금층은 상기의 Kumar의 방법에 의한 투명한 전기적 구조를 제조하기 위해서 사용할 수 있다. 바람직하게는 투명도를 유지하면서 향상된 전류 운반 역량을 위해 도체 층의 두께를 증가시키기 위한 이러한 절차의 변형이 바람직하고 통상의 기능공에게 수월하게 이해된다. 이러한 기술은 PMAMS의 분리된 결합영역과 인접하도록 정렬된 전극 표면을 제조하는 데에 사용할 수 있다.
추가로, 필름 및/또는 단일층은 Zhang와 Bard에 의해 교지된 바와 같이 절연체 잔기(예를 들면, 알킬쇄)를 사용하기보다는 전극 표면으로부터 ECL 표지까지 전기적 전위의 전달을 촉진하는 잔기로 구성될 수 있다. 예를 들면, 광범위하게 접합된 시스템에서 pi 오비탈 오버랩을 전자 전달에 사용할 수 있다. 이러한 pi 오비탈 전극 전달은 폴리-피롤 또는 기타 접합된 환 또는 이중 결합된 구조에 의해 제공된다.
올리고뉴클레오티드는 전자 전달을 조정하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 이중 가닥 DNA에서의 오버랩핑 pi 결합은 전자 전달율을 증가시키기 위해서 사용할 수 있다. 전극 표면에 결합된 올리고뉴클레오티드는 결합 영역에서 결합시약으로서 사용할 수 있다. 보충 올리고뉴클레오티드 서열을 결합시킬 경우, 조직화된 오버랩핑 pi 결합을 갖는 이중 가닥이 형성된다. 특정 양태에서, 제 1의 또는 1차의 고정된(예를 들면, 지지체에 공유적으로 결합된) 올리고뉴클레오티드를 ECL로 표지한다. 다른 양태에서, 2차 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 1차 올리고뉴클레오티드에 부분적으로 상보적인 서열을 ECL로 표지한다. 2차 올리고뉴클레오티드에 상보적인 3차 올리고뉴클레오티드 또는 부분적으로 상보적인 3차 올리고뉴클레오티드를 표지한다 (예를 들면, 샌드위치 분석). 올리고뉴클레오티드의 측쇄를 또한 사용할 수 있다. 다양한 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모조물을 사용할 수 있다 (예를 들면, 질소 및/또는 황을 함유하는 변형된 염기 및/또는 변형된 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드). 차별적인 연구를 수행할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 복합체의 pi 오버랩의 다양한 안정성은 전자 전달의 조정을 통하여 모니터링할 수 있다. pi 결합 안정화된 ECL 표지 이중 나선 올리고뉴클레오티드 쌍으로 표지된 은으로부터 생성된 시그널(예를 들면, 생성된 ECL 광 및/또는 임피던스 측정)은 더욱 혼란된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로부터 단일 및/또는 예상되는 시그널에 대해 상호 연관될 수 있다. 완전히 상보적인 ECL 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 상보적인 ECL 표지 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 사이의 ECL 시그널의 변이를 상호 연관시킬 수 있다. 부가적으로, 다수의 올리고뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 복합체를 사용할 수 있다. 예를 들면, 삼중 나선을 사용할 수 있다.
전자 전달율의 조정은 전자적 방법 및 ECL 검출를 사용하여 측정할 수 있다. ECL 표지는 올리고뉴클레오티드 가닥에 결합하고/거나 비-공유적으로 연결될 수 있다 (예를 들면, 사이에 끼워 넣음). DNA는 링커를 사용하지 않고(금에서 5' 티올화된 DNA의 흡착) 또는 DNA로부터 전극까지 전자 전달의 낮은 저항성을 보장하는 짧은(10 원자 이하) 링커로 전극에 커플링할 수 있다. 전극으로부터 DNA 가닥(예를 들면, 폴리아세틸렌 쇄)까지 전자를 효율적으로 전달할 수 있는 연결쇄를 사용할 수 있다.
혼합된 단일층 및/또는 필름을 단일층 또는 필름의 적어도 하나의 성분이 경우에 따라서 전위의 전달을 촉진하는 데에 사용할 수 있다. 이와는 달리, 전위의 전달을 촉진하는 분자 또는 입자가 단일층 또는 필름에 흡착된다. 전술한 실시예로서, pi 접합된 단일층 및/또는 흡착하고/거나 전극 표면에 적합한 전도하는 마이크로-입자를 사용할 수 있다. 패턴화된 규칙적인 갭을 단일층 또는 필름에 생성한다. ECL 표지가 연속적으로 부착된 장쇄 알칸 티올로 구성된 (즉, 절연하는) 정연한 실질적으로 수직의 SAM에서 갭의 조절된 유형을 사용함으로써 ECL 표지에 부과된 효과적인 전위를 조절할 수 있다. 예를 들면, 도 11은 금속층 1204를 갖는 단일 지지체 1202로 형성된 카세트 1200, SAM 유형 1206 및 SAM 유형 사이의 갭 1208을 나타낸다.
ECL 표지 단백질은 단일층 표면에 비-공유적으로 결합할 수 있다. ECL 표지 단백질은 금 표면에 유도된 메틸 종결된 알칸 티올의 표면에 흡착될 수 있다. 금 표면은 작동전극 또는 카운터 전극으로서 작용할 수 있다. 다수의 결합영역은 도 11 내지 13에서 도시되는 바와 같이 단일 지지체 상에 혼입될 수 있다. 바람직한 양태에서 결합영역은 표지 및/또는 비표지 단백질 및/또는 핵산 및/또는 세포 및/또는 화학적 종을 함유한다.
이와는 달리, 단일층의 성분의 길이(예를 들면, 알칸 티올 단일층의 알칸 쇄의 길이)는 단일층의 노출된 표면에서 효과적인 전위를 조절하기 위해서 변화할 수 있다.
광범위하게는, 알칸 티올은 1개 내지 100개 탄소 길이의 탄소쇄를 지닐 수 있다. 바람직한 양태에서, 알칸 티올의 탄소 길이는 2 내지 24개의 탄소를 함유한다. 알칸 티올의 탄소쇄 길이는 2 내지 18개의 탄소이다. 탄소쇄 길이는 7 내지 11개의 탄소이다. 이러한 알칸 티올은 메틸 그룹, 하이드록시 그룹, 아민, 카복실산, 올리고(에틸렌 글리콜), 포스페이트 그룹, 포스포릴 그룹, 바이오틴, 니트릴로트리아세트산, 글루타티온, 에폭사이드 디니트로페닐, 및/또는 NHS 에스테르가 포함되는 분석 매질에 노출된 다양한 헤드 그룹을 지닐 수 있다. 기타 헤드 그룹에는 재조합 융합 단백질의 정제와 고정에 보편적으로 사용되는 리간드가 포함된다 (예를 들면, Sassenfeld, 1990, TIBTECH 8:88-93). 결합영역은 결합시약의 다양한 밀도를 이루기 위해서 다양한 정도로 유도될 수 있다. 예를 들면, 활성화할 수 있는 화학물질의 상이한 밀도를 사용할 수 있고/거나 유도를 다양한 정도로 수행할 수 있다. 혼합된 화학물질은 바람직한 결합 밀도를 생성하기 위해서 사용할 수 있다. 혼합된 단일층은 활성화할 수 있는 그룹 및/또는 결합시약의 밀도를 조절하기 위해서 사용할 수 있다. 결합 그룹의 밀도는 ECL 시그널을 잡음율로 최고로 활용하기 위해서 조절한다. ECL 광 시그널이 순차적으로 또는 동시에 및/또는 광 검출 수단에 관해 검출되든지 간에 다른 결합영역으로부터 다른 ECL 광 시그널에 관해 광 시그널의 강도를 최고로 활용하기 위해서 결합영역내의 결합영역의 총수를 조절한다.
전압 파형은 한번 이상의 시간에 PMAMS 내에 결합영역과 연계된 ECL 표지를 활성화시키기 위해서 적용할 수 있다. ECL 광 생성을 활성화 하기에 충분한 전위는 다중 ECL 광 시그널을 생성하기 위해서 결합된 ECL 표지를 갖는 동일한 알칸 티올 유도 표면에 여러 번 적용할 수 있다. 전위는 ECL을 가역적으로 생성하기 위해서 충분히 적용된다. 전위는 ECL을 준-가역적으로 생성하기 위해서 적용한다. 전압 파형의 준-가역적 시리즈에서, ECL 표지가 연계된(예를 들면, 결합된) 결합영역을 화학적으로 및/또는 물리적으로 변경할 수 있다. 적용된 전압 파형 시리즈는 비가역적인 ECL 광 생성을 수득할 수 있다.
또한, 단일층의 성분을 방출하기에 충분한 전위를 적용할 수 있다. 전극 표면 위의 용적이 작은 단일층 성분(예를 들면, 전극 표면 상에서 휴지하는 다른 지지체 또는 플레이트)을 방출하는 것이 바람직하다. 이러한 방법에서, 단일층이 붕괴됨에 따라, 효율적으로 여기되지 않은 일부의 ECL 표지는 전기화학발광 시그널을 생성하기 위해 전극 표면에 의해 여기될 수 있고 ECL 표지는 전극으로부터 확산을 제한하는 작은 용량으로 제한된다. 다양한 단일층 조성물은 주어진 전위에 대한 단일층의 붕괴 정도를 조절하기 위해서 사용할 수 있다. 강한 상호-성분 친화력을 갖는 성분을 지닌 단일층은 단일층 붕괴에 더욱 저항적일 것이다. 더욱 긴 알칸쇄 티올은 짧은 알칸쇄 티올보다 더욱 효율적으로 붕괴에 저항한다. 쇄 길이를 변화시킴으로써 바람직한 안정성을 이루어낼 수 있다.
PMAMS 내의 결합영역의 변형은 ECL 시그널을 조정하기 위해서 사용할 수 있다. 전압 파형 시리즈는 ECL 시그널의 다중성을 생성하기 위해서 적용된다. ECL 시그널의 다중성은 여분 및/또는 더 나은 결과를 수득하기 위해서 사용할 수 있다. ECL 시그널의 변형율의 통계적인 분석은 하나 이상의 결합영역의 전반적인 양과 관련될 수 있다. 추가로, ECL 시그널의 다중성은 예를 들면, 시리즈의 특정 ECL 시그널을 여과함으로써 시그널을 잡음에 증가시키는 데에 사용할 수 있다. 또한, 다중 전자 전위 파형 펄스는 비-특이 결합에 기인한 바람직하지 않은 조정을 감소시키는 데에 사용할 수 있다. 전자적 전위는 특정 하전된 종의 비-특이 결합을 저지하기 위해서 적용할 수 있다. 추가로, 전자적 전위는 특정 분석물 또는 관심이 되는 화학적 종의 결합영역 가까이에서 구역화를 촉진하기 위해서 적용할 수 있다. 적용된 전압 파형은 대규모의 오버-전위(예를 들면, ECL을 생성하기 위해서 요구되는 것보다 더욱 높은 전위)를 공급한다. 오버-전위는 전압 파 시리즈에서 또는 단일 전압 파 펄스에서 ECL 시그널을 조정하는 데에 사용할 수 있다. 또한, 오버-전위는 ECL 반응 동역학을 조정하기 위해서 및/또는 결합 전위를 화학적으로 및/또는 물리적으로 조정하기 위해서 사용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 전압 파형 및/또는 당분야 전문가들에게 공지되어 있는 기타 전자적 실험은 전극의 양 및/또는 전극의 전자적 성질에 대한 정보를 평가하고/거나 연관시키고/거나 추정하는 데에 사용할 수 있다.
바람직하게는, ECL 반응의 효율은 전극과 접촉하여 부가적인 전도 방법을 제공함으로써 작동전극 표면 부위를 확장함으로써 개선할 수 있다. 전도 물질 또는 전도 입자의 전극(예를 들면, 와이어 또는 위스커)으로부터의 주입 또는 확장은 전극 표면 면적을 증가시키기 위해 사용하여 전기장과 ECL 표지를 더욱 밀접하게 접근시킨다. 또한, 전극 구조에서 결각부 또는 웰은 동일한 목적을 제공할 수 있다.
특히, 전도성 입자는 전극 표면의 갭을 채울 수 있고/거나 지지체 또는 단일층을 커버하여 도 12에서 도시된 바와 같이 ECL 표지 주위의 전기장을 절대적인 등급으로 증가시킨다. 이러한 전도성 입자는 전극 표면 부위를 확장하여 이로 인해 ECL 반응의 효율을 증가시킨다. 도 12는 금속 층 1304 상에 패턴화된 SAM (1306)을 생성하는 지지체 (1302)를 갖는 카세트를 도시하고, 갭(예를 들면, 도 11에서 1208)에서 채우고 SAM 유형 사이에 금속 표면 위로 확장하는 미세입자를 전도하는 것을 나타낸다. 자기 전도 입자에 대해서, 자기 또는 자기장은 입자를 표면으로 당기는 데에 사용할 수 있다. 전도성 입자는 또한 전극 표면과 2개의 적합한 지지체를 갖는 PMAMS의 결합영역 사이에 전기적 전위를 확장하기 위해서 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 도 8에서, 카세트 (900)은 전극의 다중 배열을 갖는 제 1 지지체 (902)와 PMAMS를 갖는 제 2 지지체 (904)로 이루어진다. 전도 미세-입자 (906)을 전도하는 것은 결합영역(도시되지 않음)의 ECL 표지를 향하여 전위를 확장하기 위해서 대응하는 면 사이에 위치된다.
이와는 달리, 전도 중합체는 도 13에서 도시되는 바와 같이 샘플의 ECL 표지 주위의 전위를 확장하는 것을 촉진하기 위해서 전극 표면의 노출된 갭으로부터 성장된다. 도 13은 패턴화된 SAM 표면 (1406)의 금속 층 (1404)를 생성하는 지지체 (1402)를 갖는 카세트 (1400)를 도시한다. 전도 중합체 (1408)은 SAM 표면을 연장하여 SAM 표면의 결합영역(도시되지 않음)으로의 전극의 다중 배열(도시되지 않음)에 의해 제공된 전기장을 확장한다. 전도성 중합체는 또한 도 7에서 도시된 바와 같이 두개의 접근된 지지체의 PMAMS의 결합영역과 전극 표면 사이에서 전위를 확장하는 것으로 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 도 7에서, 카세트 (800)은 접근된 지지체 (802) 및 (804)로 이루어진다. 전도성 중합체 (806)은 결합영역(도시되지 않음)의 ECL 표지를 향하여 전위를 확장하기 위해서 대응하는 표면 사이에 연장된다.
도 9는 다중전극 배열을 갖는 제 1 지지체 (1002), PMAMS 결합 표면을 갖는 제 2 지지체 (1004)로 형성되고, 작동전극의 전도성 주입부(1006)(예를 들면, 미세 와이어 또는 기타 돌출부)가 PMAMS 결합영역의 ECL 표지 주위에서 전기장을 확장하는 카세트 (1000)을 도시한다.
전극 쌍은 다양한 배치로 생성할 수 있다. 본 명세서에 수반된 도에서 도시된 가장 단순한 배치는 비-전도 평면에 적용된 금속 및/또는 금속 옥사이드 필름 및/또는 반도체 필름으로 구성되어 있다. 이러한 전극 쌍의 전극은 상대적으로 연속적인 전기장을 제공함으로써 바람직하게는 이들 사이에서 상대적으로 연속적인 폭의 범위를 제한한다.
전극의 기타 배치가 제공된다. 여러 이러한 배치는 도 19(a) 내지 (e)의 평면도에 도시되어 있다. 도 19(a)는 인터-디지테이티드 콤(inter-digitated comb)-유사 전극 쌍을 도시한다. 이러한 구조에서, 각각의 전극은 콤-유사 형태를 형성하는 도체로부터 확장하는 다수의 디지트를 갖는다. 전극 및 카운터 전극 쌍은 결합영역에 인접하여 위치될 수 있거나 결합영역은 전극과 카운터 전극 사이에서 위치될 수 있다. 도 19(b)는 한 쌍의 중심이 같은 전극, 하나의 서큘러, 및 하나의 세미서큘러를 도시한다. 도 19(c)는 서로 직면하는 이들의 직선 가장자리를 갖는 두개의 세미서큘러 전극을 도시한다. 도 19(d)는 한쌍의 직사각형 전극을 도시한다. 도 19(e)는 그 사이에 구불구불한 갭을 형성하기 위해서 상보적인 대응하는 곡선의 표면을 갖는 인터디지테이티드 쌍을 도시한다.
전극/카운터 전극 쌍은 또한 정렬 목적으로 PMAMS 결합 표면의 형태에 상보적인 특이한 형태로 형성할 수 있다. 예가 되는 형태가 도 6b에 도시된다. 전극쌍 (714) 내지 (720)을 생성하는 지지체(712)가 도시된다. 전극쌍은 예를 들면 서큘러(714), 인터디지테이티드 (716) 삼각 인터디지테이팅 (718) 또는 다중 전극 인터디지테이팅 (720)일 수 있다.
상기에 기재된 도 14 내지 19에 도시된 양태에서, 전극 쌍은 단일 지지체에 위치한다. 이와는 달리, 전극쌍은 도 2에 도시된 바와 같은 제 1 및 제 2 대응하는 지지체에 위치한다.
5.8. 카세트
카세트는 본 발명의 하나 이상의 지지체를 함유한다. 카세트에는 다수의 결합영역과 하나 이상의 작동전극이 포함될 수 있다.
도 2에서 지지체 (26)의 각각의 복수의 결합영역 (30)은 복수의 전극 (32) 중의 하나에 인접한다. 카운터 전극 (38)은 제 2 지지체 (28)에 형성된다. ECL 분석은 샘플을 결합영역 (30)에 배치하고 이어서 지지체 (26)과 (28)을 함께 이동시킴에 의해 상기에 기재된 바와 같이 실행됨으로써 카운터 전극 (38) 각각은 각각의 결합영역 (30)에 인접하며 ECL 반응은 리드 (34)를 경유한 파형 발생기 수단에 의해 상기 기술된 바와 같이 개시되어, ECL 시그널은 광 검출 수단 (40), 와이어 (41), 및 디지탈 컴퓨터 수단 (42)에 의해 검출되고 기록될 수 있다.
도 3은 각각의 복수의 결합영역 (48)이 지지체 (44) 상에서 이에 인접한 복수 전극/카운터 전극 쌍(50) 중에서 상이한 것을 갖는 카세트를 도시한다. 지지체 46은 임의로 지지체 (44)에 인접하여 배치되어 지지체 (46)이 복수 결합영역 48과 복수 전극(50)에 인접한 수단을 함유하는 샘플을 형성할 수 있다. 따라서, ECL 반응은 전기 접속(52)을 통해 파형 생성 수단에 의해 개시되며, ECL 시그널은 광 검출 수단(56)에 의해 탐지되며, 디지탈 컴퓨터 수단(58)에 의해 기록, 분석될 수 있다.
도 21에 도시된 바와 같은 한 쌍 이상의 지지체를 함유하는 카세트가 제공되고, 이들 지지체의 각쌍은 배치되어 결합영역을 함유하는 제 1 지지체 (1501)의 표면을 각각의 표면이 전극(1504)와 결합영역 (1506)을 함유하는 제 2 지지체(1502) 상의 결합영역을 함유하는 표면에 직면하고, 각각의 표면은 전극(1504)와 결합영역 (1506)을 함유하며, 제 1 지지체 상의 각각의 결합영역은 제 2 지지체 상의 전극과 직면하여 정렬되며, 제 2 지지체 표면 상의 각각의 결합영역은 제 1 지지체 상의 전극과 정렬된다.
도 4는 ECL 전극이 임의적인 카세트를 도시한다. 지지체 (60)의 결합영역 (64)는 분석물을 함유하는 샘플과 접촉된다. 지지체 (62)의 영역 (66)은 관심의 대상이 되는 분석물을 검출하거나 측정하기 위한 또는 바람직한 반응을 수행하기 위한 반응 매질을 함유한다. 지지체 (60)과 지지체 (62)를 함께 옮겨서 결합영역 (64)와 영역(66)을 접촉시키고 분석물 또는 반응 산물의 존재를, 예를 들면 광검출기(68)에 의해 탐지하고 디지탈 컴퓨터 수단(70)에 의해 분석할 수 있는 비색계 화학발광 또는 형광 시그널인 보고 시스템에 의해 측정한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 카세트 또는 장치는 다수의 분리된 결합영역에 샘플 운반을 위한 수단을 포함한다 (예를 들면, 미국 특허 제 5,147,806 호의 도 1의 전지 1; 미국 특허 제 5,068,088 호의 도 1의 전지 1; 각각은 완전히 참고문헌으로 인용됨). 하나 이상의 주입부, 홀, 구멍, 채널, 파이프, 미세유체 가이드(예를 들면, 모세관), 튜브, 스피고트 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 샘플 운반을 위한 수단은 고정가능하거나 이동가능하고, 당분야에 공지될 수 있다. 유체는 익히 공지된 방법에 다양한 의한 시스템, 예를 들면 펌프, 피펫, 주사기, 중력 유동, 모세관 작용, 위킹, 전기 영동, 압력, 진공 등을 통하여 이동시킬 수 있다. 유체 이동을 위한 방법은 카세트 또는 개별적인 단위에 위치할 수 있다. 샘플은 결합영역 모두에 함께 배치할 수 있다. 대안적으로, 모세관 유체 전달 수단에 의해 특정한 결합영역에 배치할 수 있다. 대안적으로, 샘플을 유체 샘플의 지지체 상의 PMAMS로의 직접적인 운반을 위한 자동 피펫터에 의해 지지체에 배치하거나, 결합 표면으로의 추후의 직접적인 운반을 위한 카세트 또는 카세트 홀더의 저장기로 배치할 수도 있다.
지지체는 유리, 플라스틱, 세라믹, 중합체 물질, 탄성중합체성 물질, 금속, 탄소 또는 물질을 함유하는 탄소, 합금, 복합체 호일, 실리콘 및/또는 층 물질이 포함되지만 이에 제한되지 않는 물질로부터 제조할 수 있다. 지지체는 매우 다양한 구조적, 화학적 및/또는 광학적 성질을 지닐 수 있다. 이들은 경성 또는 가요성이고, 평평하거나 일그러지고, 투명, 반투명, 부분적으로 또는 완전히 반사적이거나 불투명할 수 있고, 복합체 성질, 상이한 성질을 갖는 영역을 가질 수 있고 한 물질 이상의 복합체일 수 있다.
분석을 실행하기 위한 시약을 카세트에 및/또는 개별적인 컨테이너에 저장할 수 있다. 시약을 건조 및/ 또는 습윤 상태에서 저장할 수 있다. 하나의 양태에서, 카세트의 건조 시약은 탐침 샘플의 첨가에 의해 재수화된다. 상이한 양태에서, 시약을 이동가능한 롤러 또는 피스톤으로부터의 압력에 기인하여 열리게 된 "블리스터 팩(blister packs)"의 용액에 저장한다. 카세트는 폐기 부분 또는 분석의 완료 후 액체 폐기물의 저장을 위한 스폰지를 함유할 수 있다. 하나의 양태에서, 카세트는 시험될 생물학적 샘플의 제조를 위한 장치를 포함한다. 혈액으로부터 세포를 제거하기 위해 필터를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 카세트에는 샘플을 측정하기 위한 정확한 모세관과 같은 장치가 포함될 수 있다.
지지체 상의 다수의 결합영역과 다수의 전극/카운터 전극은 전형적으로 기계적인 수단에 의해, 예를 들면, 가이드 포스트, 정렬 핀, 힌지(각각의 지지체 사이의) 또는 가이드 가장자리를 사용함으로써 서로 레지스터링되어 밀접하게 배치된다. 광학적 가이드 수단은 두개의 지지체와 지지체에 제한된 광학적 가이드 마크를 사용하는 전자적 수단을 배치하는 데에 사용할 수 있다. 전기적 또는 자기 정합 수단을 사용하는 기타 시스템이 또한 이용가능하다.
카세트의 지지체는 ECL 반응을 개시하기 위해서 요구될 때까지 샘플과의 접촉으로부터 전극쌍을 보호하기 위해서 배치할 수 있다. 예를 들면, 전극은 샘플과 접촉한 전극이 제거가능한 전극 보호 수단과 같은 다양한 기계적 수단을 사용함으로써 요구될 때까지 결합영역으로부터 분리되어 있도록 유지할 수 있다.
본 발명의 카세트 또는 장치는 기준전극, 예를 들면 Ag/AgCl 또는 포화된 칼로멜 전극(SCE)을 포함할 수 있다.
지지체는 클립, 접착제, 리벳, 핀 또는 다른 적합한 기계적인 부착물에 의해 함께 지속할 수 있다. 이것은 또한 액체 샘플의 표면 장력에 의해서 또는 두개의 지지체의 대응하는 면에 제거가능하게 배치된 압력 수단에 의해 함께 지속할 수 있다.
카세트는 또한 예를 들면, 결합영역의 층과 전극 또는 단일 지지체에 결합 표면과 전극 표면을 포함하는 다중 지지체를 변경하면서 2개 이상의 지지체를 포함할 수 있다. 이것을 ECL 분석 세포의 3차원의 배열을 형성할 것이다. 카세트의 모든 전술한 성분은 임의로 결합영역 사이의 일부 구역을 제외하고는 투명하다. 예를 들면, 다중 투명한 결합 표면, 전극 표면, 및 지지체를 쌓을 수 있다.
제 1 및 제 2 지지체는 이들 사이에 샘플-유지 용적을 제한하기 위해서 평평하게 마주볼 수 있다. 대안적으로, 두 지지체 및 임의의 기타 구성성분이 동일 모양에 따른다는 조건으로 제 1 및 제 2 지지체 층을 타원체형, 입방형, 원통형을 포함하는 기타 적합한 형태로 배치할 수 있다. 예를 들면, 도 10은 두개의 인접한 비-평형 지지체 1102와 1104로부터 형성된 카세트 1100을 도시한다. 각각의 지지체는 배치에서 다른 것에 상보적인 표면을 갖는다. 지지체는 PMAMS 표면 또는 다중 전극 배열 또는 둘 모두를 가질 수 있다. 하나 또는 둘 모두의 지지체는 다른 지지체의 형태를 형성하기 위해서 탄성중합체성일 수 있다. 지지체 또는 카세트는 또한 예비절단 포맷으로 제조되거나 롤 분배기로부터 적합한 길이로 절단될 수 있다. 카세트는 또한 샘플-유지 용적과 샘플 분배 홈, 채널, 결각부 등과 같은 샘플 수령 수단을 포함할 수 있다.
도 37은 매트릭스 (3703) 내 및/또는 매트릭스 상의 결합영역(3702)이 표면 (3701) 상에 제시되는 카세트를 도시한다. 작동전극 (3704)과 카운터 전극(3705)를 지지하는 제 2 표면 (3700)이 배치되어 결합영역이 작동전극에 아주 밀접하게 된다. 결합영역에 결합된 ECL 표지로부터 광생성을 일으키는 조건하에서, 빛은 표면을 통하여 검출할 수 있다. 광 검출기의 배열(3706, 예를 들면, CCD 배열, 강화된 CCD 배열, 또는 쇄도 포토다이오드 배열)은 각각의 결합영역으로부터 다수의 광 시그널을 동시에 측정하기 위해서 사용한다. 광 검출기 배열은 결합영역으로부터 생성된 광의 상을 만든다. 상생성을 개선하기 위해서 렌즈, 반사기 및/또는 광학적 가이드를 사용할 수 있다. 다른 실시예에서, 광 검출기(예를 들면, 광 검출 픽셀)의 존 또는 영역으로부터 검출된 빛은 결합영역에 연관되어 있다. 상 분석은 결합영역과 검출된 광의 연관에 보조를 위해서 사용할 수 있다. 하나의 바람직한 양태에서, 표면은 탄성중합체성이거나 순수하고 따라서 전극 표면과 접촉한 접촉물을 생성할 수 있다. 결합영역은 카운터 전극으로부터 작동전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 중합체에 결합한다. 좀더 바람직한 양태에서, 물체는 카운터 전극으로부터 작동전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 물로 불어난 중합체이다.
도 38은 결합영역(3805, 3806, 3807)이 카운터 전극(3800)에 지지된 분리된 물체(3808, 3809, 3810)의 표면에 제시되는 카세트를 도시한다. 작동전극(3801)은 물체의 표면에 밀접하게 배치된다. 결합영역에 결합된 TAGged 그룹으로부터 ECL을 일으키는 조건하에서, 빛은 둘중 하나 또는 둘 모두의 전극(하나 또는 둘 모두의 전극이 투명하거나 또는 반-투명할 경우)을 통하여 및/또는 측면으로부터 검출될 수 있다. 광 검출기(3802)의 배열은 각각의 결합영역으로부터 다수의 광 시그널을 동시에 측정하기 위해서 사용한다. 대상은 탄성중합체성이고/거나 순수하며 그러므로 작동전극과 접촉한 접촉물을 형성할 수 있다. 대상은 카운터 전극으로부터 작동전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 중합체일 수 있다. 물체는 카운터 전극으로부터 작동전극까지 이온 전류를 이동시킬 수 있는 물로 불어난 중합체일 수 있다.
하나 이상의 결합영역을 함유하는 투명한 지지체를 피브릴 매트 전극과 접촉하게 한다. 시약을 지지체/결합영역과 피브릴 매트 사이에서 또는 매트를 통하여 결합영역로 흐르게 할 수 있다. 빛은 결합영역으로부터 투명한 지지체를 통하여 검출기로 통과할 수 있다.
다른 바람직한 양태에서, 전극은 전극의 유효 표면적을 증가시키기 위해서 광학적으로 탄소(예를 들면, 피브릴)의 반투명 또는 투명 층으로 코팅할 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 PMAMS 지지체 및/또는 카세트를 키트로서 패키지 수 있다. 키트는 분석, 조절 등을 포함하는 ECL 반응을 수행하기 위해서 본 발명에 따라 제조된 하나 이상의 PMAMS 지지체를 포함한다. 시약은 임으로 조절 시약, ECL 분석 및 검정 시약 등을 포함하는 키트에 포함될 수 있다. 다수의 상이한 분석물에 특이한 다수의 결합시약을 함유하는 시약 혼합물이 포함될 수 있다.
5.9. ECL 반응을 수행하는 장치
하나의 양태에서, 지지체 상의 PMAMS와 동일물을 함유하는 카세트가 하나 이상의 탐침 샘플을 PMAMS 결합영역에 적용시키고 다수의 ECL 반응을 개시하기 위한 수단을 함유하는 장치에 삽입되도록 설계된다. 이러한 장치는 지지체 또는 카세트에 기초한 다수의 ECL 분석을 수행하도록 본 발명에 따라 적합하게 변형된 통상적인 장치로부터 유도될 수 있다. 본 발명은 상기의 장에서 기재된 PMAMS 의 각각의 특이 양태를 사용하는 ECL 분석을 실행하도록 계조된 다양한 장치를 제공한다. ECL 반응을 수행하기 위한 장치가 Zoski 등에 의해 기재되었다 (미국 특허 제 5,061,445호). 요구되는 변형에는 지지체 및/또는 카세트 조작, 다수의 샘플 운반, 전압 파형의 원에 의한 다중 전극 애드레싱 및 다중 ECL 시그널 습득 및 가공의 공급이 포함된다.
본 발명에 따른 도시된 장치의 요소는 도 6a에 도시되어 있다. 이러한 장치 700은 상부 및 하부 지지체 702, 704 및 전극 가드 710을 포함한다. 상부 지지체는 다수의 전극/카운터 전극 쌍(도시되지 않음)을 생성한다. 하부 지지체는 결합영역 706을 생성한다. 장치는 카세트로부터 전극을 제거하고 전극/카운터 전극을 결합영역에 결합된 분석물을 접촉시키도록 배치할 수 있다. 시약 또는 유체 유동 공간 708은 결합영역을 생성하는 지지체에 인접한다. 장치는 또한 동시에 또는 연속적으로 동일하거나 개별적으로 측정된 전압파를 카세트에서 ECL 반응을 개시하는 각각의 다수의 전극/카운터 전극 쌍으로 보낼 수 있고 이어서 방출된 ECL 조사를 광 검출, 예를 들면 광 검출기 수단에 의해 측정할 수 있다. 장치는 또한 지지체 및/또는 카세트의 온도 또는 이의 환경을 유지하고 ECL 반응 조건을 최적화하기 위해 필요한 온도를 조절하기 위한 온도 제어수단을 포함할 수 있다. 온도 제어수단은 바람직하게는 가열 및 냉각 수단, 예를 들면 전기적 저항 가열 전지, 냉각 팬, 냉장 수단, 및 기타 적합한 가열 또는 냉각원이다. 온도 제어수단에는 또한 온도 센서, 예를 들면 서머스탯 또는 열전쌍 장치와 검출된 온도 변화에 대해 가열 또는 냉각 수단을 가동 또는 중단하게 하는 수단이 포함된다.
장치는 또한 ECL 반응을 수행하는 하나 이상의 지지체 또는 카세트를 유지, 이동 및 조정하는 수단을 제공한다. 장치는 또한 상기에서 카세트에 대해 기재된 바와 같이 PMAMS 결합영역에 샘플을 배치하기 위한 고정 또는 이동가능한 샘플 운반 수단을 포함할 수 있다.
장치는 또한 전극의 전압 파형 생성 수단, 예를 들면 포텐쇼스태트로 카세트의 개별적으로 애드레스할 수 있는 전극 접속의 배열을 전기적으로 접속할 수 있는 전극 접촉 수단을 포함한다 (미국 특허 제 5,068,088호의 도 5 참조). 파형 생성 수단은 카세트에서 다수의 ECL 반응을 비단독적으로 개시하기 위해서 시그널을 순차적으로 또는 동시에 운반한다.
ECL 분석 동안, 작동 및 카운터 전극 사이의 이온 전류는 이온적으로 전도된 액체를 통하여, 이러한 액체의 얇은 필름을 통하여, 및/또는 이온적으로 전도하는 고체 매트릭스를 통하여 흐를 수 있다.
따라서, 샘플에서 전기화학발광을 측정하기 위한 장치는 전지가 하나 이상의 전극과 하나 이상의 카운터 전극과 다수의 분리된 결합영역을 포함하는 제 1 지지체으로부터 형성될 수 있는 적어도 하나의 샘플을 유지하기 위한 다수의 전지를 포함할 수 있다. 전극과 카운터 전극은 제 1 지지체의 표면에 제 1 지지체의 결합영역에 아주 밀접한 또는 제 2 지지체의 표면에 제공할 수 있다. 전극과 카운터 전극은 쌍으로 발생할 수 있다. 전지는 또한 작동전극에 인접한 전압을 감지하는 다수의 감지 전극을 포함할 수 있다. 카세트는 또한 기준전극을 함유하는 전지를 포함할 수 있다.
장치는 또한 카세트에서 예를 들면, 하나 또는 다수의 검출 수단에 의해 수행된 ECL 반응을 검출할 수 있는 광 검출 수단을 포함한다. 이러한 검출 수단은 실시예에 의해 단순히 전극 배열을 갖는 레지스터에서 섬유광학 채널의 배열을 포함하고, 이에 인접하게 배치되고, 광검출기 수단의 배열에 연결되거나 방출된 ECL 시그널의 배열을 스캐닝할 수 있는 단일 광 검출기에 접속된다.
장치는 임으로 장치의 다양한 성분의 작용을 조절하기 위해서 디지탈 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 포함한다.
장치는 또한 시그널 프로세싱 수단을 포함한다. 하나의 양태 및 단순히 실시예에 의해서, 단일 프로세싱 장치는 각각의 ECL 분석 결과의 전달, 기록, 분석 및/또는 제시를 위한 디지탈 컴퓨터를 포함한다.
대안적으로, 장치는 예를 들면, 순차적으로 ECL을 개시하는 결합 표면을 가로질러 하나 이상의 전극/카운터 전극 쌍을 스캐닝하는 전극 해독 수단을 포함한다.
크기 배제 필터는 PMAMS의 배열과 병행하여 사용할 수 있다.
5.10. 지속할 수 있는 ECL 분석
본 발명에 따라 사용되는 ECL 표지는 당분야에 공지되어 있는 ECL로부터 선별할 수 있다 (상기의 장 2.2, 및 미국 특허 제 5,310,687호 참조). ECL 표지는 예를 들면 금속이 루테늄, 오스뮴, 레늄, 이리듐, 로듐, 플래티늄, 팔라듐, 몰리브데늄, 테크네튬, 및 텅스텐으로 이루어진 그룹 중에서 선별된 금속-함유 유기 화합물을 포함할 수 있다. ECL TAG 시약을 제조하기 위한 적합한 결합 화학 물질은 익히 공지되어 있고, 예를 들면 Bard 등에 의하여 기재되었다 (미국 특허 제 5,310,687호 및 5,221,605호 참조). ECL 표지의 결합시약으로의 부착 수단은 공유적 및/또는 비공유적일 수 있다. ECL 표지는 결합시약에 비-공유적으로 결합할 수 있다 (예를 들면, 소수성 효과 또는 이온성 상호작용을 통하여). 비공유 부착의 다른 실시예에서, ECL 표지는 결합-시약에 비-공유적으로 순차적으로 결합된 복합체에 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 결합된다. 더욱 특이한 예는 Ru(bpy)3의 링커를 통한 Ni(II)-트리니트릴로트리아세트산 복합체로의 공유적 부착일 것이다. 이러한 분자는 다수의 히스티딘을 함유하는 펩티드 서열을 포함하는 결합시약에 부착할 것이다. 유사한 방법(참고문헌: Sassenfeld, 1990, TIBTECH 8:99-93)으로 사용할 수 있는 기타 수용체 리간드 쌍이 당분야에 공지되어 있다. 추가로, (예를 들면, 탄화수소 링커를 통하여) 분지된 네트워크로서 배치된 다수의 유기 금속 화합물(예를 들면, Ru-함유)을 함유하는 ECL 표지를 사용할 수 있다. ECL이 가능한 다수의 유기금속 잔기를 함유하는 이러한 분지된 네트워크를 한번 부착시키거나 분자의 다수의 위치에 ECL이 표지되도록 부착시킬 수 있다. 다른 양태에서, 다수의 유기금속 화합물을 함유하는 ECL 표지는 중합체 쇄(예를 들면, 선형, 측쇄형 또는 사이클릭 중합체)의 길이에 따라 다수의 위치에 부착된 유기금속 그룹을 갖는 선형 중합체이다.
다수의 결합영역을 당분야에 익히 공지되어 있는 다양한 부가적인 ECL 분석 포맷에서 사용할 수 있다. 양적 분석에서, ECL 표지된 시약의 기지량을 사용하고, 측정된 ECL의 양을 존재하는 분석물의 양을 측정하기 위해서 기지의 표준에 연관시킨다. 전문가들에게 익히 공지되어 있는 방법에 의해 진행, 역, 경쟁적 및 샌드위치 배열을 실행할 수 있다. 경쟁적인 배열에서, 예를 들면 해당 분석물의 양을 다중성분의 양적으로 측정하기 위한 방법에서, 액체 샘플은 하기와 같이 실행된다. 결합 표면을 (a) 결합영역에 존재하는 결합시약으로의 결합에서 해당 분석물의 기지량 및 (b) 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 샘플과 동시에 접촉시키고, 접촉은 적합한 조건하에서 실행하여 해당 분석물과 리간드가 결합시약에 경쟁적으로 결합한다. 샘플의 분석물의 존재는 결합영역에 결합하여 경쟁하는 ECL-표지 리간드의 양을 감소시키고, 따라서 생성되는 ECL의 양을 감소시킬 것이다(어떠한 분석물도 샘플에 존재하지 않을 경우 상대적임). 생성된 결합영역의 ECL을 개시하고, 방출된 빛의 양이 양적으로 측정하며, 이로 인해 샘플에 존재하는 해당 분석물의 양을 양적으로 측정한다. 이와는 달리, 결합 표면을 ECL 표지된 리간드에 결합시키기에 앞서 샘플을 결합 표면과 접촉시킬 수 있고; 이어서 ECL 표지된 리간드를 PMAMS 표면 상의 샘플로부터 미리 결합된 분석물과 경쟁시키고 일부의 미리 결합된 분석물을 제거한다. 이와 다른 양태에서, 샘플을 ECL-표지된 물질/분자를 함유하기 위해서 처리할 수 있고, 경쟁 분석을 실행하기 위해서 결합 표면을 샘플과 접촉시키는 동시에 또는 이에 앞서 해당 비표지된 분석물의 표준량을 결합 표면과 접촉시킬 수 있다.
샌드위치 분석에서, ECL 표지된 리간드는 해당 분석물의 제 2 결합 잔기에 특이적으로 결합하는 결합 파트너이다. 따라서, PMAMS의 결합영역의 결합시약에 특이적으로 결합한 분석물이 샘플에 존재할 경우, 따라서 샘플로부터 분석물에 결합되고 ECL 표지된 결합 파트너에 결합된 결합영역의 결합시약으로 이루어진 "샌드위치"가 형성된다. 다른 경쟁적인 샌드위치 분석에서, 분석물 그 자체의 카피는 샘플에의 노출에 앞서 다중배열 결합 표면의 결합영역에 부착된다. (분석물에 특이적으로 결합할 수 있는) ECL 표지된 결합 파트너는 분석 용액 중의 (샘플로부터의) 유리 분석물의 부재시 분석물을 결합시킬 것이지만, 분석 용액 중의 (샘플로부터의) 유리 분석물의 존재시 경쟁적으로 억제될 것이다.
선택적인 양태에서, 순차적인 표지가 수행된다. 예를 들면, 샌드위치 분석의 특정 양태에서, 결합영역에 결합된 분석물이 연속적으로 분석물의 다수의 ECL 표지된 결합 파트너에 접촉된다. ECL 측정 및 임의적인 세척 단계는 각각의 상이한 결합 파트너와 접촉시키는 사이에 수행된다. 이러한 방법으로 분석물의 다수의 상이한 결합 잔기의 ECL 측정을 실행할 수 있다(예를 들면, CD8+, a, b T세포 항원 수용체 양성 T 세포). 이와는 달리, 구별할 수 있는 파장의 빛을 방출시키는 다중 ECL 표지는 각각 분석물의 상이한 잔기에 특이적인 상이한 결합시약에 결합될 수 있다. 또한, 분석물의 상이한 결합 잔기에 특이적인 상이한 결합시약에 부착된 다수의 구별할 수 있는 보고 수단(예를 들면, ECL 표지, 형광 표지 및 효소 결합 표지)이 각각 예를 들면 CD4+, a, b T 세포 항원 수용체-양성 세포를 CD8+ a, b, T 세포 항원 수용체-양성 세포와 구별하는 데에 사용될 수 있다.
바람직한 양태에서 결합영역은 표지된 단백질 및/또는 핵산 및/또는 세포 및/또는 화학적 종을 함유한다. 이러한 표지된 성분(예를 들면, ECL 표지)을 제조 동안, 분석의 개시에 앞서, 분석 동안 및/또는 분석 말기에 결합영역에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 다중 표지된 성분을 다양한 시간에 첨가할 수 있고, 순차적인 해독을 할 수 있다. 이러한 해독은 누적적인 정보를 제공할 수 있다. 다른 양태에서, PMAMS의 결합영역을 여러번 재사용할 수 있다. 주어진 분석을 실행한 후, 표면을 PMAMS 표면의 하나 이상의 결합영역을 활성을 회복시키는 조건 하에서 세척할 수 있다. 실시예에 의해서, 일부 결합 반응은 반응 용액의 이온 강도를 변화시킴으로써 역전될 수 있다. 대안적으로, 결합 복합체를 해리시키기 위해서 열을 사용할 수 있다. 일부 결합영역은 본래대로 자기-재생할 수 있다. 촉매(예를 들면, 효소) 작용성을 함유하는 결합영역은 한번 이상 사용할 수 있다. 결합영역을 연속적으로 사용하고, 따라서 바이오센서 적용에 사용할 수 있다.
추가로, 분석을 포맷하여 다-배열 다-특이적 패턴화된 표면에 부착된 결합시약을 ECL로 표지한다. 샘플의 해당 특정 분석물에 결합시킬 경우, ECL 시그널이 양적으로 조정될 것이다. 예를 들면, 표면에 부착된 ECL 표지된 결합시약은 세포 표면상의 분석물, 예를 들면 알파 및 베타 T 세포 항원 수용체 항원, 또는 CD4 또는 CD8 항원과 같은 항원에 특이적일 것이다. 세포의 혼합물에 노출시, 표면에 결합된 세포는 다중-배열 다중-특정 표면과 인접한 전극 표면의 능력이 ECL 표지된 결합시약을 여기 시키는 것을 입체적으로 저지할 것이고, 따라서 ECL 시그널이 다운-조절된다.
균질 및 이질 분석을 수행할 수 있다. 이질 분석에서, 결합 또는 비결합 표지된 시약을 전기 전위에 함께 노출시키기에 앞서 비결합 표지된 시약을 결합된 표지된 시약으로부터 분리한다 (예를 들면, 세척 단계에 의해). 균질 분석에서, 비결합된 표지된 시약과 결합된 표지된 시약을 전위에 함께 노출시킨다. 균질 분석에서, 결합된 표지된 시약에 의해 방출된 시그널의 강도 또는 스펙트럼 특성은 비결합된 표지된 시약에 의해 방출된 시그널의 강도 이상 또는 이하이다. 각각의 결합 및 비결합된 성분의 존재 또는 부재를 강도에 있어서의 차이를 측정함으로써 결정할 수 있다.
일단 결합시약을 분석물 또는 이의 경쟁자 및 이의 결합 파트너와 접촉시키는 바람직한 단계가 완료되면, 이어서 ECL 표지는 ECL에 도움이 되는 환경에 처해진다. 적합한 ECL 분석 매질이 당분야에 공지되어 있다. 이러한 분석 매질은 유리하게는 ECL 표지의 ECL을 촉진하는 분자를 포함하고, 옥살레이트, NADH, 및 가장 바람직하게는 트리프로필아민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 "프로모터" 분자는 용액에 유리되어 제공될 수 있거나 앞선 결합에 의해 또는 PMAMS 표면, 표면의 단일층, 결합영역, 전극 표면, 결합시약, 및/또는 ECL 표지 등에의 생성에 의해(예를 들면, 화학 반응의 산물로서) 제공될 수 있다. 접촉 단계로부터 생성된 결합영역에 결합된 ECL 표지를 둘러싼 매질이 ECL에 도움이 될 경우, 매질에의 어떠한 변화도 생겨날 필요가 없다. 대안적으로, 매질은 ECL에 도움이 되는 매질을 제공하기 위해서 조정하거나 대치할 수 있다. 전극 및 카운터 전극을 결합영역에 근접시키거나 또는 결합영역과 접촉하도록 가까이 가져와서, 파형을 적용시켜 ECL을 검출하거나 측정한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 결합시약을 분석물 또는 이의 경쟁자 및 이의 결합 파트너와 접촉시키는 상기에 기재된 단계를 전극 및 카운터 전극의 부재시에 실행하여 샘플을 전극 또는 카운터 전극에 접촉시키지 않는다. 이러한 접촉 단계에 후속적으로, 전극 및 카운터 전극을 ECL 반응을 개시하기 위해서 결합영역에 결합된 ECL 표지에 충분히 근접하게 한다.
PMAMS를 갖는 지지체는 핵산 가닥을 서열화하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 다수의 결합영역을 갖는 PMAMS는 상이한 결합영역의 결합시약으로서 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열의 상이한 올리고뉴클레오티드 탐침으로 제조된다. 즉, 상이한 결합영역은 상이한 공지되어 있는 뉴클레오티드 서열의 결합시약을 함유할 것이다. 이어서 서열화되어 있는 올리고뉴클레오티드 쇄 또는 올리고뉴클레오티드 쇄의 분획 PMAMS 결합영역에 결합(하이브리드화)하게 한다. 서열화된 핵산을 ECL 표지한다. 결합 분석을 PMAMS 상에서 수행하고 PMAMS의 분리된 결합영역으로부터의 ECL 시그널의 분포는 올리고뉴클레오티드 쇄를 서열화하기 위해서 사용한다.
상기-기재된 방법은 이들의 상보적거나 다른 핵산 분자에서 실질적으로 상보적인 서열을 하이브리드화하는 짧은 올리고뉴클레오티드의 능력에 기초한다 (참고 문헌: 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 Strezoska et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1089-1093; Bains, 1992, Bio/Technology 10: 757-58). 서열 상보성의 바람직한 정도는 성공적인 하이브리드화를 위해 필수적이도록 조건을 선별할 수 있다. 미지 서열의 DNA 분자의 비결정된 서열의 탐침으로의 하이브리드화는 DNA 분자의 상보적인 서열의 존재를 검출한다. 방법은 하이브리드화 반응을 용액 중의 결합영역 및 샘플 DNA에 결합된 올리고뉴클레오티드 탐침과 함께 실행되도록 바람직하게 실행된다.
PMAMS는 또한 신규한 분자 또는 바람직한 작용(예를 들면, 결합 또는 촉매)의 복합체를 분리하고, 거르고/거나 선별하는 데에 사용할 수 있다. PMAMS는 화합물 및/또는 처치 용도의 납 화합물을 분리하는 데에 사용할 수 있다. 다양한 조합의 화학물질에 의해 합성된 다수의 펩티드, 핵산, 바이러스 벡터, 또는 중합체를 함유하는 PMAMS를 본 발명의 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 광범위하게 다양한 PMAMS 처리된 지지체는 예를 들면, ECL 표지 세포 수용체에 결합시키기 위해 수월하게 거르는 데에 사용할 수 있다. 하나의 방법으로 매우 다양한 무관한 펩티드 서열을 갖는 제 1 PMAMS는 납 결합 펩티드 서열을 분리하기 위해서 사용한다. 이어서 제 1 PMAMS의 해당 분자(예를 들면, 세포 수용체)에의 결합을 나타내는 것에 관련된 서열의 펩티드를 갖는 PMAMS를 사용한다. 바람직한 결합 특성을 갖는 펩티드를 발견할 때까지 과정을 반복한다.
해당 분석물은 예를 들면, 전체 세포, 아세포 입자, 바이러스, 프리온, 비로이드, 핵산, 단백질, 항원, 지단백질, 지당류, 지질, 당단백질, 탄수화물 잔기, 셀룰로스 유도체, 항체 또는 이의 분획, 펩티드, 호르몬, 약제, 세포 또는 세포 성분, 유기 화합물, 비-생물학적 중합체, 합성 유기 분자, 유기-금속 화합물 또는 샘플에 존재하는 유기 분자일 수 있다.
샘플은 예를 들면 고체, 유액, 현탁액, 액체 또는 가스로부터 유도할 수 있다. 더욱이, 샘플은 예를 들면 생체 유체 또는 조직, 물, 식품, 혈액, 혈청, 플라즈마, 뇨, 페스, 조직, 타액, 오일, 유기 용매 또는 공기로부터 유도할 수 있다. 샘플은 환원제 또는 산화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 의해서 하기 물질을 검출하거나 측정하는 분석은 물질에 특이한 결합시약을 본 발명의 결합 표면의 결합영역로 혼입시킴으로써 수행할 수 있다: 알부민, 알칼라인 포스페이트, 알트/SGPT, 암모니아, 아밀라아제, AST/SGOT, 빌리루빈-토탈, 혈액에 사용된 질소, 칼슘, 이산화탄소, 클로라이드, 콜레스테롤-토탈, 크레아티닌, GGT, 글루코스, HDL 콜레스테롤, 철, LDH, 마그네슘, 인, 칼륨, 단백질-토탈, 나트륨, 트리글리세라이드, 요산, 남용한 약, 호르몬, 심장 혈관의 시스템 조정제, 종양 마커, 감염 질병 항원, 알러지 발병 항원, 면역단백질, 사이토카인 빈혈증/대사 마커, 카바마제핀, 디곡신, 젠타마이신, 리튬, 페노바비탈, 페니토인, 프로카인아미드, 퀴니딘, 테오필린, 토브라마이신, 발프로산, 밴코마이신, 암페타민, 항억시약, 바르비튜레이트, 벤조디아제핀, 카나비노이드, 코카인, LSD, 메타돈, 메타쿠알론, 오피에이트, 페네일린딘, 프로폭시펜, 에탄올, 살리실레이트, 아세타미노펜, 에스타라디올, 프로게스테론, 테스토스테론, hCG/bhCG, 여포 자극 호르몬, 루테인화 호르몬, 프로락틴, 갑상선 자극 호르몬과 같은 티로이드 호르몬, T4, TUP, 토탈-T3, 프리-T4, 프리-T3, 콜티솔, 크레아티닌 키나제-MB, 토탈-크레아티닌 키나제, PT, APTT/PTT, LD ISOs, 크레아티닌 키나제 ISOs, 미오글로빈, 미오 광쇄, 트로포닌 1, 트로포닌 T, 클라미디아, 고노레아, 허프스 바이러스, 라임 질환, 엡스타인 바 바이러스, IgE, 루벨라-G, 루벨라-M, CMV-G, CMV-M, 톡소-G, 톡소-M, HBsAg(헤파티티스 B 바이러스 표면 항원), HIV 1, HIV 2, 안티-HBc, 안티-HBs, HCV, 안티-HAV IgM, 안티-HBc IgM, 안티-HAV, HBeAg, 안티-HBeAg, TB, 전립선 특이 항원, CEA, AFP, PAP, CA125, CA15-3, CA19-9, b2-마이크로글로불린, 헤모글로빈, 적혈구 세포, HBcAb, HTLV, ALT, STS 매독, ABO 혈액형 항원 및 기타 혈액형 항원, 사이토메갈로바이러스, 페리틴, B-12, 폴레이트, 글리켈레이티드 헤모글로빈, 암페타민, 항억시약 및 기타 향정신제.
상이한 결합영역에서의 ECL 측정은 순차적으로 또는 동시에 수행할 수 있다.
세포-표면 단백질인 해당 분석물에 특이한 PMAMS를 먼저 샘플에서 세는 것이 바람직한 세포를 함유하는 샘플에 노출시킨다. 바람직한 양태에서, 기지의 샘플 용적 및/또는 희석된 샘플을 적어도 하나의 세포 표면 항원에 특이적인 다수의 결합영역을 갖는 PMAMS에 노출시킨다. 이어서 결합된 세포를 ECL 태그에 결합된 2차 결합 그룹의 부착에 의해 정량할 수 있다. 이것은 세포 유형의 광범위와 상호작용할 수 있는 그룹, 예를 들면 세포막으로 삽입할 수 있는 소수성 그룹 또는 세포 표면 당에 대하여 향하는 렉틴에 결합된 ECL-태그이다. ECL-택은 세포 표면 항체에 대하여 향하는 제 2 항체에 결합한다. 좀더 특이한 양태에서, 동일한 부위에 결합한 여러 세포 유형은 다중 ECL-택 표지된 제 2 항체를 사용함으로써 구별할 수 있다. 바람직하게는 세포 표면의 해당 분석물에 특이적인 분리된 결합영역의 수가 샘플에 존재하여 결합할 세포의 평균 수를 초가한다는 것을 확증한다. 이어서 통계적인 기술을 샘플 용적 당 세포의 수를 측정하기 위해서 사용할 수 있다. 이러한 기술은 또한 예를 들면, 결합시약이 바이러스 상의 항원을 인식하는 곳에서 바이러스와 같은 기타 입자 수를 세기 위해서 사용할 수 있다. 부위는 세포 크기에 비교하면 작아서 하나의 세포만이 부위에 결합할 수 있고 따라서 통계적인 방법을 사용하여 부위의 총계를 분석할 수 있는 각각의 부위에 대한 디지탈 시그널을 발생시킨다. 부위는 세포의 크기에 비교하면 커서 다수의 세포가 부위에 결합할 수 있다. 이러한 경우에, 각 부위로부터 시그널의 수준은 샘플 용적당 세포의 수를 부여하기 위해 검정할 수 있다. 광 검출기(예를 들면, CCD 카메라 또는 쇄도 포토다이오드 배열)를 사용한 상 분석은 세포를 세고 세포 형태를 측정하기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 ECL 반응, 예를 들면 배열을 1000 ECL 반응율로 5 내지 15분 동안 수행하기 위한 방법도 제공한다.
5.11. 기타 분석적 방법 및/또는 ECL로 사용하기 위한 PMAMS
검출를 기초로 하는 ECL에 대해 상기에 기재된 기술을 기타 배열 기술과 접합하여, 예를 들면 촉매와 기타 화학 반응을 발생시킬 수 있는 부위로서 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 분리된 결합영역은 임상 화학적 화학물질 배열, 예를 들면 전기물 측정, 임상적 효소 측정, 혈액 단백질 측정, 글루코스, 뇨, 및 크레아티닌 측정 등과 같은 기타 배열 기술에서 이용할 수 있다. ECL 배열과 결합할 수 있거나 본 발명의 PMAMS와 단독으로 사용할 수 있는 기타 분석 기술에는 화학발광 기초 표지, 형광 기초 분석, 효소-결합 분석 시스템, 전기화학 분석(참고문헌 : Hickman et al., 1991, Science 252:688-691) 및/또는 공명성 검출(예를 들면, 표면 플라스몬 및 음향 기술) 분석 시스템이 포함된다.
드롭의 배열안에 다수의 상이한 화학물질이 존재하는 경사를 갖는 PMAMS 지지체를 사용할 수 있다. 각각의 드롭은 상이한 결합시약 및/또는 상이한 화학 분석(예를 들면, 동일물에 대한 반응 매질)을 함유할 수 있다. 예를 들면, 드롭은 친수성이고, 소수 표면 부위에 의해 둘러싸인 친수성 표면 결합영역에서 휴지할 수 있다. 드롭은 표면을 덮고 있는 소수성 용액에 의해 보호된다. 분석될 친수성 용액은 소수성 부위에 의해 둘러싸인 친수성 결합영역을 갖는 제 2 PMAMS에 침착된다. 두 표면은 대응하는 면의 친수성 부위를 접촉시키도록 하기 위해서 근접하게 레지스터링되고 스펙트럼 분석은 화학적 분석의 반응 산물을 검출하기 위해서 실행된다.
피브릴 매트는 친수성 및/또는 소수성 부위에 의해 둘러싸인 다수의 분리된 소수성 부위 및/또는 친수성 부위가 존재하도록 패턴화될 수 있다. 결합시약을 함유하는 수용액의 드롭은 친수성 부위에서 휴지할 수 있고 둘러싸고 있는 소수성 부위에 의해 제한된다. 이러한 드롭은 예를 들면, 피브릴, 피브릴의 집합체, 결합시약, ECL 시약, 분석용 시약, 계면활성제, PEGs, 세제, 실시예에 의해서 상기에 언급된 다수의 생물학적 분자 및/또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.
제 1 PMAMS를 덮고 있는 소수성 용액은 상단의 친수성 드롭의 부분을 환경으로 노출하기 위해서 통제가능하게 제거한다 (예를 들면, 증발, 위킹). 이어서 광학적 화학 반응에 대해 분석될 친수성 용액을 PMAMS 표면에 노출시키고 분석될 친수성 마이크로-드롭 및 용액을 혼합하고 분석(예를 들면, 스펙트럼)을 수행한다.
PMAMS 결합영역은 또한 예비-필터 또는 필터로서 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포 특이 PMAMS는 크기 배제 필터와 결합하여 및 특정 세포 유형에 대한 필터로서 단독으로 특정 사례에서 사용할 수 있다. 이어서 생성된 분석물 용액을 아세포 미립자 물질(예를 들면, 바이러스)에 특정한 PMAMS에 노출시킨다. 미립자 아세포 PMAMS 및/또는 크기 배제 필터는 작은 분자(예를 들면, 단백질, 작은 화학적 물체) 분석물 용액을 생성하기 위해서 사용된다. 일련의 PMAMS 분석 시스템을 사용함으로써 분석물 용액을 비-특정 분석물 상호작용을 감소시키기 위해서 순차적으로 정제할 수 있다.
지지체, 전극 및/또는 결합영역에 사용되는 물질의 광학적 불투명도를 바람직한 성질을 달성하기 위해서 변화시킬 수 있다. 이러한 물질은 두께, 조성, 및/또는 물질의 광학적 밀도에 따라 반투명, 투명 또는 실질적으로 불투명할 수 있다.
피브릴 매트의 광학적 불투명도는 매트의 두께가 증가하면서 증가한다. 매우 얇은 매트는 광학적으로 반투명하다. 더욱 두꺼운 매트는 실질적으로 불투명할 것이다. 일부 실시예에서, 두께가 0.01 ㎛ 내지 0.5 ㎛ 범위인 매트는 실질적으로 반투명할 수 있다. 다른 실시예에서, 20 ㎛ 이상의 두께를 갖는 매트는 실질적으로 불투명하다. 0.5 ㎛ 내지 20 ㎛ 사이의 두께를 갖는 매트는 피브릴 매트의 두께가 증가하면서 증가하는 중간적인 불투명성을 지닌다. 매트의 특정 두께의 광학적 불투명성은 조성, 밀도, 유도작용, 층의 수, 유형 및 매트에 분산된 물질의 양, 및/또는 이의 조합에 좌우될 수 있다. 이것은 또한 사용된 빛의 파장에 좌우될 수 있다.
물질이 해당 두께에서 실질적으로 반투명하고 다른 두께에서 실질적으로 불투명할 경우, 다른(더욱) 깊이로부터 방출된 빛이 실질적으로 물질에 의해 흡착되거나 분산될 수 있는 반면, 물질의 특정 깊이로부터 방출된 빛은 물질 밖으로 통과하여 나갈 수 있다. 하나의 실시예에서, 물질의 변하기 쉬운 불투명성은 물질을 광학적 필터로서 사용되도록 한다.
피브릴 매트에서 특정 깊이로부터 방출된 빛은 실질적으로 매트를 통과하고 검출기가 피브릴 매트의 표면 상에 또는 인접하여 배치된 검출기로 관찰할 수 있다. 다른 깊이로부터 방출된 빛을 매트에 의해 실질적으로 흡착되고/거나 산란될 수 있고 매트의 표면 상에 또는 인접하여 배치된 검출기에 의해 관찰되지 않는다. 피브릴 매트(및/또는 광학적으로 유사한 물질)의 이러한 성질은 ECL 분석의 결합 및 비결합시약을 구별하기 위해서 사용할 수 있다.
특정 시약이 이러한 시약으로부터의 방출이 매트에 의해 실질적으로 또는 전적으로 흡착되거나 산란되는 다공성 물질에서 충분한 깊이로 압력에 의해 (수동적으로 또는 능동적으로) 분산되거나, (예를 들면, 흡입 여과 및/또는 모세관 작용에 의해) 당겨지거나, 윅되거나, 밀릴 수 있다. 하나의 실시예에서, 피브릴 매트는 특정 시약이 통과하고, 특정 시약이 동반되고/거나 특정 시약이 매트의 표면 및 이에 인접하여 얇은 층에 결합하는 물리적 및 광학적 필터로서 작용한다. 하나 이상의 결합영역에 결합된 시약 및/또는 하나 이상의 결합영역에 결합된 종에 결합된 종(이러한 부위는 피브릴 매트의 표면에 또는 PMAMS의 매트 표면 가까이의 매우 얇은 층에 위치한다.)은 매트로의 또는 매트를 통한 분산 및 당김 등으로부터 저지된다. 시약 및/또는 기타 용액이 피브릴 매트의 표면 상 및/또는 그 위로 흐르거나 현탁되어 시약은 매트 표면의 매우 얇은 층에만 결합한다. 시약을 매트를 통하여 한번 또는 여러번, 한 방향 또는 그 이상의 방향으로 세척할 수 있다. 시약은 피브릴 매트, 하나 이상의 결합영역, 하나 이상의 결합영역에 결합된 다르거나 동일한 시약 에 결합할 수 있거나, 매트의 내부로 끌어들여지거나 매트를 통과할 수 있거나, 이들의 조합이다.
지지체 및/또는 전극으로 사용되는 다공성 물질은 상층이 결합영역을 갖고 매트내의 다른 층이 결합영역을 갖지 않는 한 층 이상을 지닐 수 있다. 하나의 실시예에서, (도 29에 개략적으로 도시되어 있는) 피브릴 매트, 상층 2900은 이러한 층 아래로 매트로부터 층 2901, 2902에서 생성된 빛의 통과를 저지하기에 충분히 두껍다. 이러한 상층에 결합된 원 2904, 2905로부터 생성된 빛 2903은 매트의 표면에 또는 인접하여 위치한 검출기 2906에 의해 검출될 수 있다. 하부 층 2901, 2902의 원 2907, 2908, 2909로부터 생성된 빛은 일부 또는 모든 층에 의해 흡착되고/거나 산란되고, 검출기 2906, 2910에 의해 검출될 수 있다.
예비-여과 단계는 매트가 제조되기 전에 피브릴 및/또는 피브릴 집합체의 특정한 크기, 유형, 유도체를 선별하기 위해서 사용할 수 있다. 피브릴의 현탁액을 여과하기 위해 사용되는 여과제는 특정 및 다수의 다공성의 피브릴의 매트이다.
다공성 물질(예를 들면, 피브릴 매트)을 결합영역의 지지체, ECL, 기타 전기화학 적용 또는 시약의 운반을 조절하기 위해 사용될 수 있는 필터 및/또는 빛을 다양한 정도로 전달, 흡착 및/또는 산란 시킬 수 있는 광학적 필터로서 사용할 수 있다.
5.12. 전기크롬 ECL 디스플레이 패널
본 발명은 또한 평평한 패널 디스플레이에서 사용되는 분리된 전기화학 픽셀의 생성에 대해 제공한다. 석판술은 전기화학적으로 애드레스할 경우 이웃 픽셀에서 제한된 영향을 지니는(즉, 제한된 크로스-토크) 픽셀을 생성하기 위해서 평평한 패널 디스플레이에 기초한 전기크롬 및 전기화학발광에서 사용되도록 고안되었다 (미국 특허 제 5,189,549호 참조). 이러한 크로스-토크를 감소시키기 위한 석판술의 한계는 전해 물질을 빛의 노출시 틀림없이 이의 전도성을 변화시킬 수 있다는 것이다. 광-유도 전도성 조정을 가능하게 하는 물질을 사용할 필요없이 픽셀 사이에서 크로스-토크를 감소시키고 이로 인해 광범위의 상이한 용액, 겔 또는 필름을 사용하게 하는 것이 본 발명의 특징이다.
픽셀의 능동적인 구역인 두개의 전극 표면이 샌드위치 배치에서 서로 직면하는 두개의 표면 상에 있다. 전극 표면을 예를 들면, 상보적인 전극 크롬 물질로 코팅한다. 크로스-토크를 감소시키기 위해서 전도 전해 필름을 전극 표면과 상이한 전극 쌍 사이에(예를 들면, 픽셀 전지 사이) 비-전도성 영역을 갖는 전극 표면 사이에 배치한다. 코팅된 전극 표면이 친수성일 경우, 전극 주위의 표면적은 (예를 들면, 스탬플링 또는 마스크를 통한 침착에 의해) 소수성으로 되도록 하고, 친수성 전도성 미세드롭을 제 1 표면의 전극에 배치하고, 이어서 제 2 표면이 로봇식으로 정렬되고 제 1 표면과 접촉하게 되어 전극이 레지스터하게 된다. 따라서 전해성 미세드롭을 픽셀 사이의 전도성 물질이 없이 하나의 픽셀 내의 부위로 밀어넣을 수 있다. 픽셀의 전극 쌍은 동일한 표면에 아주 밀접하게 나란한다. 코팅된 전극쌍이 친수성일 경우, 두 전극을 포함하는 면적은 친수성 전극 부위 주위의 소수성 환과 함께 친수성으로 되게 한다 (예를 들면, 스탬플링 또는 마스크를 통한 침착에 의해서). 상기의 두 양태에 기재된 미세드롭은 소수성 용액을 사용하여 안정화된다. 용액의 점성은 미세드롭 배열의 안정성을 증가시키기 위해서 증가할 수 있다. 친수성과 소수성이 역전될 수 있다. 다른 양태에서, 미세드롭은 전극 쌍 사이 또는 상에서 필름의 안정성 및/또는 전도성(예를 들면, 전도 중합체)을 증가시키기 위해서 중합할 수 있는 용액을 함유할 수 있다. 추가로, 구조적 특색을 픽셀 사이의 크로스-토크를 제한하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 표면 상의 전극 픽셀 쌍을 나란히 둘러쌀 수 있는 환 형태 스탬프 돌출 특색을 갖는 탄성중합체성 스탬프(예를 들면, 폴리(디메틸실옥산))는 전해 용액, 겔, 또는 픽셀 사이의 필름을 분리하기 위해서 사용할 수 있다. 이와는 달리, 나란한 전극 픽셀 쌍을 전극 위의 웰에 배치된 표면, 전해 용액, 겔 또는 필름 상의 전기적 절연 유사 구조에 배치할 수 있고, 전면은 각각의 픽셀의 전해 성분을 분리하고 함유하기 위해서 커버하거나 코팅한다.
5.13. 다른 화학 반응에서 사용하기 위한 PMAMS
본 발명의 PMAMS는 또한 ECL과 조합하지 않고 화학반응을 수행하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들면, 상기의 5.11 장에 기재된 모든 기술과 비-ECL 분석을 사용할 수 있다.
카세트는 (a) 적어도 하나의 결합 표면, 다른 결합영역보다 상이한 결합 특이성이 있는 적어도 일부의 분리된 결합영역, 친수성 및 소수성 부위에 의해 둘러싸인 각각의 다수의 분리된 결합영역을 형성하기 위해서 표면에 다수의 분리된 결합영역을 갖는 제 1 지지체 및 (b) 다수의 분리된 결합과 다수의 반응 매질이 접촉하게 하여 각각의 결합영역에 존재하는 분석될 샘플을 해당 분석물을 검출하거나 측정하기 위해 반응 매질과 접촉시키는 분석 표면을 형성하기 위해서 화학적 분석을 수행하기에 적합한 반응 매질을 포함하는 다수의 친수성 부위를 갖는 제 2 지지체를 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하기 위해서 제공한다. 이와는 달리, 결합영역은 소수성이고, 제 2 지지체는 반응 매질을 함유하는 다수의 소수성 부위를 갖는다.
본 발명은 또한 (a) 다수의 분리된 결합영역이 서로 동일하고 다른 결합영역 내에 함유된 결합시약과 특이성에 있어서 상이한 결합시약을 함유하는 적어도 하나의 결합영역을 포함하는 지지체 표면의 다수의 분리된 결합영역에서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플의 드롭을 배치하고, 이때 각각의 분리된 결합영역은 소수성이거나 친수성임을 특징으로하고, 단 각각의 결합영역을 둘러싸는 각각의 지지체 표면의 영역은 샘플의 해당 하나 이상의 분석물을 결합영역에 결합하게 하기 위해서 (i) 결합영역이 친수성일 경우, 소수성이고 (ii) 결합영역이 소수성일 경우, 친수성이며, (b) 제 1 지지체의 드롭을 화학적 분석을 수행하기에 적합한 반응 매질을 포함하는 다수의 분리된 친수성 부위를 갖는 제 2 지지체의 표면과 접촉시키며, (c) 결합영역에 결합한 해당 분석물의 존재를 측정함을 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 다수의 분리된 결합영역이 서로 동일하고 다른 결합영역 내에 함유된 결합시약과 특이성에 있어서 상이한 결합시약을 함유하는 적어도 하나의 결합영역을 포함하는 지지체 표면의 다수의 분리된 결합영역에서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플의 드롭을 배치하고, 이때 각각의 분리된 결합영역은 소수성이거나 친수성임을 특징으로 하고, 단 각각의 결합영역을 둘러싸는 각각의 지지체 표면의 영역은 샘플의 해당 하나 이상의 분석물을 결합영역에 결합하게 하기 위해서 (i) 결합영역이 친수성일 경우, 소수성이고 (ii) 결합영역이 소수성일 경우, 친수성이며, (b) 샘플의 드롭에 반응 배질의 드롭을 배치하며 (c) 결합영역에 결합한 해당 분석물의 존재를 측정함을 포함하는 샘플의 해당 분석물을 검출하거나 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 양태의 특정 실시예에서, 각각이 화학적 반응에서 기질로서 연속적인 중간물을 이용하는 상이한 효소를 혼입하는 결합영역은 PMAMS 표면에 위치하여, 연속적인 효소에 대한 반응물인 해당 효소 반응의 산물이 반응 경로에서 다음 효소로 이동한다. 본 발명은 또한 상기에 기재된 방법을 사용하여 자기-조립 단일층의 벌크 고정에 대해, 예를 들면 산업적인 적용에 대해 제공한다.
예를 들면, 한면 또는 두면에 이렇게 고정된 효소를 갖는 시트는 높은 표면적 대 용액 용적 비를 달성하기 위해서 쌓을 수 있다. 이와는 달리, 이러한 고정된 효소는 다공성 물질에 부착될 수 있다. 추가로, 이러한 고정된 효소는 딥스틱, 교반제 상에, 튜브 또는 모세관의 벽에, 또는 배양실과 같은 컨테이너의 벽에 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 상기에서 기재된 바와 같은 비-ECL 분석은 비-ECL 반응을 수행하기 위한, 반드시 결합시약을 혼입한 것은 아니며 따라서 반드시 결합영역이 존재하는 것은 아닌 분리된 부위를 함유한다는 점에서 상기에 기재된 바와 같은 PMAMS와는 다른 PMAMS 동족체에서 실행할 수 있다. 이러한 PMAMS 동족체는 반응을 수행하기 위한 분리된 부위를 갖고 분리된 부위로 적용된 용액의 확산 및/또는 분산을 억제하기 위해서 제조된다. 하나의 양태에서, 부위는 반응 매질 및/또는 샘플을 분리된 부위로 제한하는 것을 돕기 위해서 지지체 표면상의 둘러싼 부위에 대하여 소수성이거나 친수성이다. 웰의 용도, 펠트 또는 다공성 물질의 반응 매질 또는 샘플의 침착, 겔, 필름 등의 반응 매질 또는 샘플의 침착 또는 건조를 확산 또는 분산을 억제하기 위해서 사용할 수 있다. 이러한 분리된 부위 각각은 직경 또는 폭으로 1 mm 이하이고 바람직하게는 50 nm 내지 1 mm 범위이고, 가장 바람직하게는 1 ㎛ 내지 1 mm 범위이다. 동일하거나 상이한 반응 매질이 샘플 적용에 앞서 각각의 분리된 부위에 침착될 수 있거나 샘플 적용이 반응 매질의 침착을 진행시킬 수 있다.
비-ECL 분석을 수행하는 PMAMS 동족체 용도의 바람직한 양태에서, 반응 매질의 드롭을 다수의 분리된 부위에 배치하고, 바람직하게는 미세유체 가이드의 배열로부터 동시에 운반되고; 이어서 임의로 안정성을 개선하고/거나 드롭을 보호하기 위해서, 점성 용액(예를 들면, 오일)을 반응 매질의 상단, 또는 이와는 달리 분리된 부위 사이에 배치하며; 이어서 검출되거나 측정될 분석물을 함유하는 샘플을 각각의 분리된 부위로의 분리된 적용에 의해, 또는 벌크로, 부위를 함유하는 PMAMS 동족체의 전면을 유체 샘플에 노출시킴으로써 각각의 부위에 적용한다. 결합영역에서 생성된 반응이 진행하게 되고, 결과는 당분야에서 공지되어 있는 것들 중에서 선택된 리포터 및 검출 시스템의 사용에 의해 관찰된다.
5.14. 다공성 전극상 입자의 포획을 이용하는 ECL 분석
본 발명은 복합체가 형성되는 전기화학발광 결합 분석 수행방법을 포함한다. 복합체는 적어도, 입자 및 전기화학발광을 일으킬 수 있는 표지 화합물을 포함한다. 복합체는 또한, 문헌[참조: Yang H.J. et al., BioTechnology, 12, (1994), 193-194]에 기재된 바와 같이 전기화학발광에 사용된 리간드를 포함한다. 방법은 (a)복합체를 형성하고; (b)다공성이고 전도성인 전극상에서 여과에 의해 복합체를 수집하며; (c)전극에 전압을 인가하여 수집된 복합체내 표지 화합물이 발광하도록 유도한 다음; (d)전극으로부터 방출된 발광을 검출하는 단계를 포함한다.
다른 전기화학발광 결합 분석법에서, 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 입자가 먼저 다공성 전도성 전극에 수집된다. 이어서, 해당 분석물을 함유하는 샘플을 다공성의 전도성 전극을 통해 통과시키고 전극상의 이렇게 수집된 입자에 복합체를 형성한다. 이어서, 표지 화합물을 전극에 전압을 인가하여 발광하도록 유도하고 방출된 발광을 검출하여 해당 분석물의 존재를 측정한다. 바람직한 양태로서, 다공성의 전도성 전극은 그 안에 혼입된 입자로 예비제조되고 사용시 해당 분석물을 함유하는 샘플은 전극을 통해 통과하여 복합체를 형성할 것이다.
본 발명은 다수의 해당 분석물에 대한 다수의 전기화학발광 결합분석 수행법에 적용될 수 있다. 이러한 분석에서, 다수의 복합체가 형성되고 복합체 각각은 적어도 입자 및 표지 화합물을 포함하며 이들은 다수의 독립 영역에 수집되며, 이들 영역 각각은 다공성의 전도성 전극을 포함한다. 전술한 바와 같이, 표지 화합물의 입자 및 임의로는 기타 분석 성분은 용해에서 복합체를 형성할 수 있고 이어서 영역상에 수집되거나 영역은 처음에는 입자를 함유하고 샘플을 전극을 통해 통과시킴으로써 표지 화합물 및 임의로는 기타 분석 성분과 복합체를 이룰 수 있다.
본 발명은 고 처리량 분석 프로세싱의 표준 포맷, 예를 들면, 384 웰 플레이트상 96 웰에 사용하기 위해 적용될 수 있다.
특정의 바람직한 양태에서, 입자는 분석시 내부 표준으로서 작용할 수 있는 발광종을 함유할 수 있다. 발광은 분석을 보정하기 위해 측정될 수 있다.
본 발명은 입자가 결합시약에 대한 고체상 지지체로서 사용되는 결합분석을 포함한다. 입자란 용어는 크기, 형상 또는 조성에 대한 제한이 없음을 의미한다. 입자는 여과에 의해 다공성 전극에 포획되고 분석물의 존재는 입자상 결합 복합체에 존재하는 ECL 표지로부터 ECL의 여기에 의해 검출된다.
입자-기본 분석은 ECL 분석(예를 들면, PCT 출원 WO90/05301 및 WO92/14139 참조)에 사용되어 왔는데, 그 이유는 이들이 높은 결합능을 지니기 때문이다. 이들은 또한, 용액중의 결합 사건에 대해 관찰된 것들에 접근하는 운동속도로 일어나도록 허용한다.
고도로 민감하고 정확한 분석은 금속표면상 자기입자의 포획을 위해 자기장을 사용하는 시스템을 이용하여 수행되어 왔다(PCT 출원 WO92/14139; Eeaver, D.R., Nature 377, (1995) 758-760; Yang, H.J. et al., BioTechnology 12, (1994) 193-194 참조). 이러한 포획방법은 표지 입자의 여기가 달성될 수 잇도록 전극에 매우 근접하게 입자를 위치시킨다. 이러한 기술은 다양한 분야에서 매우 성공적이었다. 그러나, 일회용 카트리지를 사용하는 저가 분석에의 사용을 제한하는 일부 한계가 있다(주로 비용 및 복잡성).
다공성 전극을 통해 여과에 의해 입자를 포획하는 시스템은 높은 결합능과 입자-기본 분석의 양호한 동역학을 이용한다. 이는 또한 유체공학을 단순화시키고, 대다수의 저렴하고 비-자성인 시판 입자를 사용할 수 있으며, 저렴하고 다공성 탄소계 전극을 사용할 수 있다. 이는 또한, 입자에 결합된 표지의 ECL 여기 효율을 향상시킨다. 다공성 전극은 비-다공성 전극, 예를 들면, 금속 필름보다 월등히 더 높은 유효 표면적을 지닐 수 있다. 전극이 다공성이고 섬유상 물질로 이루어지는 피브릴 매트이면, 피브릴은 예를 들면, 입자의 상당 분획 주위 또는 가로질러 싸매어 접촉시킬 수 있다.
본 발명은 ECL에 의한 분석물의 검출을 위한 입자를 포획하는 다공성 전극을함유하는 카세트를 포함한다. 카세트는 ECL-비활성 필터상에 지지된 탄소 피브릴로 된 얇은 ECL 활성층을 포함하는 작동전극을 함유할 수 있다(탄소 피브릴의 자세한 설명에 대해서는 섹션 5.1 및 인용문헌 참조. 피브릴 매트의 자세한 설명에 대해서는 섹션 5.7 참조). 카세트 안의 분리된 챔버는 스트렙트아비딘-코팅된 입자 및 건조된 결합시약, 예를 들면, 바이오틴-표지된 포획제 및 ECL-태그 표지된 검출제를 함유한다. 카세트는 또한, 입자를 함유하는 챔버에 액체 샘플을 도입하는 수단, 여과에 의해 작동전극상에 입자를 포획하는 수단, 카운터 전극 및 기준전극을 제공한다. 본 발명은 또한, 카세트, 예를 들면, 하우징, 카세트내 전극과의 전기적 접속부, 파형 발생기 또는 일정전위기, PMAMS로부터 방출된 ECL을 조영하기 위한 전하 커플링 장치(CCD), 및 파형 발생기를 제어하고 카메라에 의해 수신된 영상을 분석하는 마이크로컴퓨터로 ECL 분석을 위한 관련 시스템을 포함한다.
입자가 여과에 의해 포획되는 입자-기본 분석을 위한 작동전극의 몇몇 바람직한 양태가 존재한다. 전극이 형성되는 재료는 적당한 전기화학 전위가 인가될 때 매우 근접하게 위치하여 ECL 표지로부터 ECL을 방출시킬 수 있어야 한다. 전극이 다공성이면, 구멍의 크기는 비결합시약의 여과를 전극 중으로 또는 이를 통하여 허용하기에는 충분해야 하지만 입자를 포획하기에 충분히 작다.
바람직하게는, 작동전극은 전도성 필터로 이루어진다. 전도성 필터는 예를 들면, 다공성 탄소, 입상 탄소 집합체, 흑연 섬유의 매트, 탄소 피브릴 및/또는 ECL을 방출할 수 있는 다공성 금속으로부터 제조될 수 있다. 전극은 비-전도성 다공질 물질, 예를 들면, 금, 백금 및/또는 흑연 섬유와 같은 ECL-활성 물질로 코팅된 시판 중합체-기본 여과막으로 이루어질 수 잇다. 전극은 다수의 층을 지닐 수 있다. 하나의 양태로서, ECL-활성 전극 물질의 박층은 좀더 두꺼운 ECL-비활성(그러나 전기 전도성) 물질에 침착된다. "활성" 및 "비활성"이란 용어는 ECL 표지로부터 ECL을 방출하기 위한 전극의 상대 효능을 의미하며, 이러한 특징은 ECL 표지의 구조 및 특정 적용시 ECL 개시에 사용되는 조건 모두에 좌우된다. 전도성의 ECL-비활성층은 활성층 전표면을 따라 양호한 전기 접촉을 보장하지만, 활성층을 통해 여과되는 비결합 ECL-태그 표지된 시약으로부터의 ECL 여기를 방지한다. 바람직한 양태로서, ECL-활성층은 탄소 피브릴로 된 얇은 매트이고 ECL-비활성 지지체는 스테인레스강 여과지이다.
비-공유 및/또는 공유 결합 반응에 의해 입자에 결합시약을 고정하기 위한 다수의 기술이 당해분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 입자는 스트렙트아비딘으로 코팅될 수 있고 특정 결합시약은 이어서 스트렙트아비딘-바이오틴 상호작용을 이용하여 포획된다.
본 발명에 사용하기 적당한 광범위의 입자가 시판되고 있다. 이러한 것들에는 기타 유형의 입자-기본 분석에 통상적으로 사용되는 비드, 예를 들면, 마그네틱, 폴리프로필렌, 및 라텍스 입자, 고체상 합성에 통상적으로 사용되는 입자, 예를 들면, 폴리스티렌 및 폴리아크릴아미드 입자, 및 크로마토그래피 적용에 통상적으로 사용되는 입자, 예를 들면, 실리카, 알루미나, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌이 포함된다.
표면에 다양한 작용기를 갖는 물질이 이용될 수 있다. 이렇게 하여 광범위의 고정화 화학의 이용이 가능해진다. 일부 분석에 있어서, 분석물 자체는 입자로서 작용할 수 있다. 예를 들면, 특정 세포 표면 항원을 갖는 세포에 대한 분석(또는 세포군내 세포 표면 마커의 양을 정량하기 위한 분석)은 세포를 항원에 대해 ECL-태그 표지 항체로 처리한 다음 세포를 다공성 전극에 여과시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 섹션 5.10에 기술된 것들을 포함하는 다수의 상이한 결합분석을 수행하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 것들에는 경쟁성 및 샌드위치 포맷 모두에서 면역분석 및 핵산 하이브리드화 분석을 포함한다. 다수의 이러한 분석은 전극에 근접해 있는 표지 분석물 또는 결합시약을 검출한다. 필요하다면 온화한 혼합을 이용하여 현탁액내 입자 결합반응을 수행하는 것이 유리한 데, 그 이유는 결합 반응의 동역학이 특히 호적하기 때문이다(이들은 균질 반응의 것에 접근할 수 있다.).
이와 달리, 입자는 전극에 침착될 수 있고 하기 샘플로 수행된 결합반응은 포획 입자를 통과시킨다. 입자 함유 결합영역은 패턴화된 배열로 있는 전극, 즉 PMAMS에, 섹션 5.1에 기재된 다양한 방법에 의해 침착시킬 수 있다.
하나의 양태로서, 입자는 96-웰 플레이트의 패턴에 상응하는 배열의 전극에 침착된다. 이러한 입자/전극 정착물은 고 처리량 ECL 분석에 사용되는 키트의 기초를 형성한다. 96-웰 패턴내 홀이 있는 마스크를 마스크 안의 홀이 침착된 입자의 패턴과 일렬로 정렬되도록 전극에 대해 가압된다. 홀의 벽은 웰의 벽을 규정하고; 전극 및 입자는 웰의 바닥과 결합영역을 규정한다. 바람직한 키트는 공업표준을 만족하는 수의 홀을 함유할 수 있다(예를 들면, 고 처리량 스크리닝을 위해 96 또는 384개의 홀).
결합시약을 함유하는 입자는 전극의 다수 지역에 침착될 수 있다. 동일한 결합시약을 함유하는 입자를 갖는 둘 이상의 지역이 존재할 수 잇다. 상이한 결합시약을 함유하는 입자를 갖는 둘 이상의 지역이 존재할 수 있다.
샘플은 유동공학 퀴드에 의해 하나 이상의 지역에 수송될 수 있거나 단일 단계로 모든 지역을 통해 플러싱될 수 있다.
이와 달리, 입자는 전극의 표면에 균일하게 침착될 수 있고, (즉, 패턴화된 배열로가 아님), 홀이 있는 정착물은 전극의 활성영역을 규정하기 위하여 전극에 대하여 가압될 수 있다.
종종, 하나 이상의 내부 표준을 포함시키는 것이 바람직하다. 시그널을 내부 표준에 의해 생성된 것과 비교함으로써 분석 카세트의 제조 또는 분석의 수행시 편차를 보상할 수 있다. 염료는 내부 표준으로서 입자에 혼입시킬 수 있다. 형광성 염료를 혼입하는 입자는 시판되고 있으며; 이들 염료중 일부는 ECL을 방출하도록 유도될 수 있다. 특정 ECL-표지와 상이한 (예를 들면, 스펙트럼 특성, ECL이 방출되는 전기화학 전이 및/또는 ECL 수명) 염료는 특정 ECL 표지 및 내부 표준으로부터의 ECL의 동시 측정을 허용한다. 상이한 스펙트럼 특성을 지닌 ECL 방출은 필터, 그레이팅, 및/또는 규정된 스펙트럼 윈도우내 광을 측정하기 위해 당해분야에 공지되어 있는 기타 기술에 의해 구별될수 있다.
입자는 하나 이상의 분석물에 대한 하나 이상의 분석의 동시 수행을 위한 PMAMS를 제조하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 다수의 입자 현탁액이 제조될 수 있는데, 여기에서 각각의 현탁액은 고정된 포획제를 함유하는 입자를 포함한다. PMAMS는 현탁액의 미세드롭을 예를 들면, 작동전극상의 규정된 영역에 섹션 5.1에 기술된 방법에 의해 적용함으로써 형성된다.
카세트는 하나의 ECL 분석을 수행하기 위한 하나의 결합영역만을 함유할 수 있다. 이러한 경우, ECL의 강도는 단일 광 검출기를 이용하여 정량될 수 있다. 광의 강도를 분석의 기지 농도로부터 수득된 것과 비교함으로써 분석물의 정량이 허용된다. 사용될 수 있는 광 검출 장치에는 포토다이오드, 광전자 증배관 및 애벌랜치 포토다이오드가 포함될 수 있다.
카세트는 다수의 결합영역을 함유할 수 있다. 방출광은 각각의 결합영역에서 생성된 시그널을 분해하기 위하여 조영될 수 있다. 조영화는 CCD 카메라와 같은 광 검출기 배열로 달성될 수 있다(섹션 5.5 참조). 빽빽하게 패킹된 결합영역 간의 크로스 토크는 결합영역 배열 위에 렌즈 배열을 위치시켜 제거할 수 있다. 이와 달리, 검출기 배열에서 측정된 강도의 수학적 분석은 이러한 크로스 토크를 보상할 수 있다.
5.15. 전극상에 PMAMS를 이용하는 ECL 분석
본 발명은 전극표면에 직접 형성된 PMAMS를 함유하는 카세트를 포함한다. 카세트는 지지물질 상에 얇은 금속필름을 포함하는 작동전극을 함유한다. 다수의 결합영역, 즉 PMAMS는 금속필름의 표면에 존재한다. 카세트는 또한, 전극 표면 위에 유체 샘플 및 시약을 도입하기 위한 수단, 및 작동전극에서 ECL의 전기화학적 여기를 허용하기 위한 카운터 전극을 포함한다. 기준전극은 작동전극에서의 전기화학 전위의 양호한 제어를 위해 포함될 수 있다. ECL 분석 수행용 장치는 하우징을 포함할 수 있는 카세트, 카세트내 전극에 대한 전기적 접속부, 파형 발생기 또는 일정전위기, PMAMS로부터 방출된 ECL의 조영화를 위한 CCD 카메라, 및 파형 발생기를 조절하고 카메라에 의해 수신된 영상을 분석하기 위한 마이크로컴퓨터를 구비한다.
작동전극상에 직접 PMAMS의 형성은 기존 ECL 시스템에 비해 몇가지 장점이 있다: 결합분석용 작동전극 및 고체상 지지체를 하나의 단위장치에 겸비함으로써 일회용 포맷으로 ECL 분석의 제조 및 실행을 대폭 간편하게 하여, 일회용 분석이 저렴한 비용으로 생성되도록 한다. 다수의 분석이 다중 ECL 표지의 사용없이 수행될 수 없다. 다수의 분석 각각으로부터 ECL 여기는 전위를 하나의 작동전극/카운터 전극 쌍에 인가함으로써 동시에 수행될 수 있고, 이들 결합영역 전부는 동일 작동전극의 표면에 위치한다. PMAMS에 대한 지지체로서 금속 표면의 사용은 PMAMS의 형성에 잘 개발된 기술- 예를 들면, 금속상 자가 조립 단일층(SAM)의 형성-의 사용을 허용한다.
작동전극은 금속(예를 들면, 금 및 백금), 금속 옥사이드 전도체 및 반도체(예를 들면, ITO), 탄소(예를 들면, 흑연, 카본 블랙, 탄소 피브릴), 및 전도성 유기 중합체(예를 들면, 폴리티오펜)을 포함한 광범위의 물질로 제조될 수 있다. 전극은 상이한 물질의 복합물을 포함할 수 있다.
하나의 양태로서, 작동전극은 기질상의 얇은(5 내지 10,000 nm) 필름이다. 증착, 중합, 스퍼터링, 화학증착, 및 도금을 포함한 기술에 의한 이러한 필름의 제조는 당해분야에 공지되어 있다. 바람직한 양태로서, 작동전극은 기질상에 증착된 금으로 이루어진 박막이다. 박막 전극에 대한 기질의 특성은 분석 시스템의 요구조건에 따라 선택될 수 있다. 기질은 고체일 수 있거나, 또는 전극을 통한 샘플의 여과 또는 전극을 따라 행하는 샘플의 위킹이 요구되는 경우, 기질은 다공성 물질, 예를 들면, 여과막일 수 있다.
결합시약은 전극표면에 직접 비-특이적 흡착에 의해 또는 전극 표면에 화학적 작용기에의 공유결합에 의해 고정시킬 수 있다. 전극의 표면상 화학 작용기의 도입에 대한 하나의 방안은 박막의 전착 또는 전기중합이다. 다른 방안으로는 자가 조립된 단일층(SAM)의 제조이다. 전극 물질상에 제조될 수 있는 SAM의 예는 금 위의 유기 티올 및 ITO상의 유기 실란의 단일층을 포함한다(섹션 5.1 참조). 도 50에 나타난 바와 같이, SAM은 분자 A-L-B 5032를 전극 5033의 표면과 반응시킴으로써 제조될 수 있으며, 여기에서 A는 전극에 대한 분자의 결합에 관여하는 작용기이며, L은 결합쇄이며, B는 시약 5034를 표면에 결합시키는 데 사용될 수 있는 작용기이다. 또한, B는 결합시약일 수 있다.
바람직한 양태에서, SAM은 말단 작용화된 알칸 티올(HS-(CH2)n-B)를 기질에 침착된 금으로 된 박막과 반응시켜 형성된다. 다양한 작용기(B)가 달린 티올이 제조될 수 있어, 다양한 고정화 기술의 사용이 허용된다. 예를 들면, 그룹 B가 카복실레이트기를 포함할 경우, 아미노기를 포함하는 결합시약은 SAM의 활성화 후 이를 (N-하이드록시숙신이미드(NHS) 존재하에 에틸-3-디아미노프로필카보디이미드(EDC)와 반응시켜 고정시킬 수 있다. 이와 달리, 작용기 B는 메틸 그룹일 수 있고, 결합시약은 비-특이성 소수성 작용에 의해 고정될 수 있거나 작용기 B가 바이오틴 잔기를 함유하는 경우, 스트렙트아비딘 또는 바이오틴-스트렙트아비딘 상호작용을 통해 또는 공유적으로 스트렙트아비딘에 결합된 기타 시약은 표면에 고정될 수 있다.
결합시약의 고정을 위한 다수의 다른 화학이 당해분야에 공지되어 있으며, 사용될 수 있다. 일부 경우에, 표면에 고정된 결합시약의 밀도를 조절하고 표면이 일부 바람직한 특성, 예를 들면 비-특이성 결합에 대한 저항성을 유지하기 위해 전극표면상의 작용기 B의 밀도를 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 작용기 B의 표면밀도의 조절은 표면상의 B의 목적하는 농도로 혼합된 SAM을 생성하도록 결정된 비로 단량체 A-L-B 및 A-L-C를 함유하는 혼합물로 전극표면을 처리함으로써 달성될 수 있다. 작용기 C는 결합시약을 B와 커플링하는 데 사용된 고정화 기술에 저항성이 되도록 선택되며 비-특이성 결합이 감소된 표면과 같은 기타 바람직한 특성을 가질 수 있다.
전극표면상 PMAMS의 형성은 (i)광-리소그래픽 고정화; (ii)미세접촉 인쇄; 및 (iii)미세간 배열 또는 잉크 젯 인쇄(섹션 5.1에 논의)의 사용을 통해 표면에 결합시약 드롭을 조절 적용하는 방법을 포함하여 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 패턴화된 SAM는 결합영역으로 개질되는 표면상의 영역을 더욱 잘 규정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 미세접촉 인쇄를 사용하여 카복실산 말단 알칸 티올로부터 형성된 친수성 SAM을 제공하는 금 표면상에 원 영역을 패턴화할 수 있다. 이어서, 잔류 금 표면을 메틸 말단 알칸 티올과 반응시켜 소수성 SAM을 생성할 수 있다. 표면을 NHS의 존재하에 EDC로 활성화 한 후, 각각 상이한 항체를 함유하는 드롭을 친수성 원에 적용한다. 드롭은 원 밖의 표면의 소수성에 기인하여 소수성 영역에 국한될 것이며, 따라서 고정된 결합영역의 신중한 조절이 허용된다.
전극상에 고정된 PMAMS를 사용하여 수행될 수 있는 유형의 분석은 섹션 5.10에 기술된 것들을 포함한다. 다수의 이러한 분석법(예를 들면, 경쟁적 및 샌드위치 포맷의 면역분석 및 핵산 하이브리드화)는 결합시약 또는 ECL-활성그룹(tag)으로 표지된 분석물의 전극 표면에의 결합 검출에 의존한다. SAM 표면상의 태그-표지된 시약으로부터 방출된 시그널의 강도는 ECL 여기에 사용된 전이 파형의 성질에 의해 강력하게 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 금 위의 알칸티올레이트의 SAM은 우수한 전기 절연제이지만 전극표면에서의 고도의 산화 또는 환원 전위는 단일층에 무질서를 도입함으로써 필름의 절연성을 감소시킬 수 있다. SAM 중으로 무질서를 도입하지 않는 전위에서의 ECL의 여기는 터널링에 의한 단일층을 통한 전자전달을 요한다. 훨씬 높은 강도의 시그널은 무질서를 도입하는 전위를 SAM에 인가함으로써 달성되어, 전극으로의 전류의 덜 방해받은 유동을 허용한다. 이러한 전위는 ECL의 여기 전에 또는 여기 동안 적용될 수 있다. 이와 달리, SAM은 무질서 단일층을 생성하기 위해 당해분야에 공지되어 있는 조건을 이용하여 형성시킬 수 있다. 단일층의 전도성은 또한, 전자전달을 촉진하는 단일층내에 성분을 포함시킴으로써(예를 들면, pi-접합 시스템의 연결그룹 L로의 도입에 의해) 증가시킬 수 있다. 전도율이 높은 SAM의 형성이 섹션 5.7에 더욱 상세히 기술되어 있다.
일부 경우, SAM에 무질서를 도입하지 않는 전위의 사용이 유리하다. 이러한 조건하에서, 용액내 비결합 태그-표지된 시약으로부터의 결합된 태그-표지된 시약의 구별은 전자 터널링의 강력한 의존에 기인하여 최대화될 것이며, 따라서 세척단계에 대한 필요성이 제거된다. 표면상의 ECL 표지는 용액내 ECL 표지보다 훨씬 강력한 ECL 시그널을 생성할 것이고 ECL은 결합으로부터 생기는 ECL 표지와 SAM 간의 전도성 변화에 의해 조정될 수 있다. 핵산 하이브리드화 분석 수행에 이러한 접근법의 사용은 섹션 5.7에 기술되어 있다.
본 발명의 카세트는 하나의 ECL 분석을 수행하기 위한 단 하나의 결합영역을 함유할 수 있다. ECL의 강도는 단일광 검출기를 사용하여 정량할 수 있다. 광의 강도를 기지 농도의 분석물에서 수득한 것과 비교함으로써 분석물의 정량이 허용된다. 사용될 수 있는 광 검출 장치에는 포토다이오드, 광전자 증배관 및 애벌랜치 포토다이오드가 포함된다. 카세트는 다수의 결합영역을 또한 함유할 수 있다. 이러한 카세트로부터 방출된 광은 각각의 결합영역에서 생성된 시그널의 분리를 위해 조영화될 수 있다. 조영화는 CCD 카메라와 같은 광 검출기 배열에 의해 달성될 수 있다(섹션 5.5 참조). 빽빽하게 패킹된 결합영역 간의 크로스 토크는 결합영역이 배열 위에 렌즈 배열을 위치시키거나 수 개의 결합영역으로부터의 시그널 강도의 수학적 분석에 의해 제거시킬 수 있다.
5.16. 다공성 기질상의 PMAMS를 사용하는 ECL 분석
도 37은 매트릭스(3703) 안에 및/또는 그 위에 있는 결합영역(3702)가 표면 (3701)에 제공되는 카세트를 나타낸다. 결합영역상에서 결합반응의 종료 후, 작동전극(3704) 및 카운터 전극(3705)를 지탱하는 제 2 표면(3700)은 결합영역이 작동전극에 밀접하게 위치하도록 위치된다. 결합영역에 결합된 ECL 표지로부터의 발광은 표면 한쪽 또는 양쪽에서 검출될 수 있다. ECL에 대한 이러한 형태를 "양면" ECL 분석으로 언급한다.
도 38은 결합영역(3805, 3806, 3807)이 카운터 전극(3800)에 지지된 표면에 제시된 카세트를 나타낸다. 결합영역에서 결합반응 종료 후, 작동전극(3801)을 매트릭스 표면에 근접하게 위치시킨다. 결합영역에 결합된 ECL 표지로부터의 발광은 전극 중 하나 또는 둘다 투명하거나 반투명한 경우 전극 중 하나 또는 둘을 통해 및/또는 측면으로부터 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 PMAMS를 함유하는 카세트를 사용하는 ECL 분석을 수행하기 위한 장치를 포함한다. 도 38에 도시된 카세트를 사용하는 ECL 분석 수행장치는 전극과의 전기적 접속을 형성하기 위한 수단, 전극에서의 전이를 조절하기 위한 수단, 작동전극과 밀접하게 위치하도록 매트릭스를 이동시키는 수단 및 ECL의 여기 동안 방출된 광의 조영수단을 포함한다.
양면법은 기존의 ECL법보다 몇가지 유리한 점이 있다. 다수의 분석이 다수의 ECL 표지의 사용없이 편리하게 수행될 수 있다. 다수의 분석 각각으로부터의 ECL 여기는 전위를 하나의 작동전극/카운터 전극 쌍에 인가함으로써 동시에 수행될 수 있고, 모든 결합영역은 동일 작동전극에 근접하여 배치된다. 작동전극은 ECL의 여기에 앞서 제거되는 물리적 배리어에 의해 샘플로부터 결합반응 동안 보호될 수 있으며, 따라서 자신의 전기화학적 성능에 변화를 초래할 수 있는 전극표면의 오염을 방지하게 된다. 샌드위치 면역분석의 경우에 대해 도 55에 도시된 바와 같이, 매트릭스(5200)상에 고정된 1차 항체(5201)에 결합된 분석물(5202)에 ECL-태그 표지된 시약(5203)의 결합은 태그와 전극 표면 간의 전극표면(5205)에 태그 (5204)를 최적으로 제공한다(즉, 최소량의 유기물질-예를 들면, 단백질, 핵산, 또는 결합그룹). 매트릭스는 예를 들면, 전기영동 및.또는 매트릭스를 통한 여과에 의해 샘플의 성분의 농축 및/또는 분리에 사용될 수 있다. 매트릭스는 건조되거나 부분 수화된 형태의 분석시약 저장용 매질로서 사용될 수 있다. 매트릭스의 표면은 작동전극과 등각 접촉 상태로 배치된다.
PMAMS는 바람직하게는 다음과 같은 특징 중 하나 또는 모두를 갖는 매트릭스에 및/또는 그 위에 형성된다. 매트릭스는 작동전극과 카운터 전극 간의 이온전류를 운반할 수 있고, 따라서 전기화학적 회로를 완성할 수 있다. 매트릭스는 바람직하게는 작동전극과 균질 접촉시킬 수 있고, 예를 들면, 이는 탄성질이고/이거나 유연하다. 이러한 특성을 지닌 물질은 당해분야에 공지되어 있고 여과막 및 수-팽윤 중합체 겔과 같은 다공성 물질을 포함한다. 본 발명의 일부 양태에서, 예를 들면, 작동전극에서 여기된 광이 매트릭스를 통해 검출되면, 매트릭스가 투명한 것이 유리하다.
PMAMS는 구멍 크기 및 용매 함량을 변화시켜 다공성 물질(겔)에 생성시킬 수 있다. 예를 들면, 구멍크기가 변하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드의 농도 및 가교결합도를 변화시켜 제조할 수 있다.
구멍크기가 분석물보다 작은 이러한 매트릭스상에서 결합반응은 겔의 표면에서 실질적으로 발생할 것이다. 이 경우에, 겔을 통한 여과 및/또는 전기영동을 이용하여 겔 표면에 분석물을 농축시키고 결합반응의 동역학을 조정, 예를 들면 속도를 증가시킬 수 있다. 더 빠른 동역학은 고속 분석에 유리하고 단기간에 증가된 민감도를 생성할 수 있다.
분석물보다 큰 구멍 크기의 매트릭스의 경우, 결합반응은 겔의 표면 및 전체에서 일어날 수 있다. 이 경우, 여과 및/또는 전기영동은 결합 동역학을 증가시키고 비결합 종을 표면으로부터 제거하는 데 사용될 수 있다.
겔에 형성된 PMAMS는 건조상태로 저장될 수 있고 분석 중에 재구성될 수 있다. ECL 분석에 필수적인 시약은 저장 전에, 겔 중으로의 투과에 의해 또는 겔의 형성 동안 혼입에 의해 겔에 혼입시킬 수 있고, 및/또는 이들은 분석 중에 첨가될 수 있다.
공유 및 비공유 결합에 의한 결합영역의 매트릭스에의 고정은 당해분야에 공지되어 있다. 결합영역의 각종 매트릭스 물질에의 고정화를 위한 방법 중 일부 예는 섹션 5.1.에 더욱 상세하게 기술되어 있다. 섹션 5.1은 또한 매트릭스상에 결합영역을 패턴화하여 PMAMS를 형성하기 위한 방법을 상세히 기술하고 있다. 이러한 패턴화 방법은 i)포토리소그래픽 고정화; ii)매트릭스 표면에 시약의 미세드롭의 패턴화된 적용; iii)액체 형태의 매트릭스에 결합영역을 함유하는 드롭 또는 미세드롭의 기질에의 적용에 이어 가교결합, 중합, 겔화 전이점 이하에서의 냉각 등을 포함한 공지기술을 이용한 액체의 고형화 및/또는 겔화로 매트릭스 물질로 이루어진 기질상에 뚜렷한 드롭의 생성(각각의 고형화된 드롭은 따라서 상이한 결합영역을 포함한다); iv)예를 들면, 폴리아크릴아미드 슬랩내 전기영동에 의한 분리를 성취하기 위한 매트릭스 이용; 및 각각 하나 이상의 결합영역을 함유하는 매트릭스의 층상 구조 형성을 포함할 수 있다.
작동전극은 바람직하게는 적당한 전기화학 전위가 인가될 때 표면에 밀접하게 근접한 ECL 표지로부터 ECL를 방출할 수 있는 전극 물질로부터 제조된다. 일부 양태에서, 광은 작동전극 및/또는 카운터 전극을 통해 PMAMS의 표면으로부터 검출된다. 이러한 경우에, 투명하거나 반투명한 전극물질을 사용하는 것이 유리하다. 이러한 전극물질은 당해분야에 공지되어 있다. 이러한 예에는 인듐 주석 옥사이드 및 금으로 된 매우 얇은(＜30 nm) 필름을 포함한다. 이와 달리, 샘플로부터 작동전극을 보호하는 것이 유리할 수 있다. 전극상의 물리적 배리어는 샘플을 PMAMS와 배양하는 동안 자신을 보호할 수 있다. 이어서, 물리적 배리어는 PMAMS를 전극에 근접배치 하기 전에 제거된다.
5.17. 복합전극 상 PMAMS를 사용하는 ECL 분석
본 발명의 바람직한 양태에서 전극은 분산된 다수의 탄소 피브릴을 함유하는 중합체의 복합체이다. 바람직하게는 복합체는 다공성이다.
분석 수행을 위한 바람직한 장치는 제 1 요소로서 이에 분산된 탄소 피브릴을 함유하는 매트릭스와 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 하나 이상의 결합 영역을 포함한다.
전기화학발광에 의한 분석의 검출을 위한 장치는 분산된 다수의 전도성 입자를 갖는 매트릭스의 복합체로 이루어진 전극과 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 결합 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는 매트릭스는 중합체이고 전도성 입자는 탄소이다. 전도성 입자는 바람직하게는 탄소 섬유이고 수득된 최상의 결과는 탄소 섬유 또는 탄소 피브릴이다.
다수 분석물의 검출에 사용하기 위한 장치가 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 장치에서 전극은 분산된 다수의 전도성 입자를 함유하는 매트릭스와 각각이 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는, 전극 표면 상에 지지된 다수의 결합 영역으로 이루어진다.
중합체과 분산된 탄소 피브릴을 포함하는 전극의 성질은 복합체를 다양한 화학적 및 물리적 단계, 예를 들면, 산화, 플라즈마로의 노출 및 하나 이상의 작용기의 첨가에 의해 전극을 유도할 수 있는 시약으로의 노출에 투입시킴으로써 변형될 수 있다. 최후 방법에서 중합체가 유도될 수 있거나 이에 함유된 피브릴이 유도될 수 있거나 둘다 유도될 수 있다. 바람직하게 전기화학발광이 복합체에 위치하는 전기화학발광 화합물에서 발생하는 전기적 전위를 변경시키기에 충분한 시간 동안 변형을 수행하기 위해서 복합체를 화학적 또는 물리적 처리에 투입한다. 바람직한 작용기를 노출시키기 위해서 전극을 변형시킴으로써 중합체와 이에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극의 성질을 변형시키는 것이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 전기화학발광이 일어나는 전기적 전위를 변경시키기 위해서 화학적 또는 물리적 처리에 의해서 변형된 전극을 포함한다.
본 발명은 하나 이상의 물질로 이루어진 전극, 예를 들면 복합전극의 표면에 직접 형성된 PMAMS를 함유하는 카세트를 포함한다. 이러한 카세트의 여러 성분이 상기에 기재되어 있다.
복합제 전극은 지지체 매트릭스에 포화된 전도성이고/이거나 전기화학적으로 활성인 입자로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 매트릭스는 오일, 왁스, 파라핀, 플라스틱, 세라믹, 테플론, 중합체, 엘라스토머, 겔 및/또는 이들의 배합으로 이루어질 수 있다. 복합전극의 제조에 사용될 수 있는 시판 중합체의 예에는 EVA, 폴리에틸렌 (PE), 폴리스티렌 (PS) 및 ABS가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
매트릭스는 제시된 적용을 위한 디자인 요구를 충족시키도록 선택될 수 있다. 물질은 특정 유형의 고정 화학물질에 적합할 수 있고, 이것은 바람직한 물리성, 예를 들면, 가요성, 강도 및 화학적 내성을 지니므로 특정 유형의 분석시 높은 특정 시그널 및/또는 낮은 백그라운드를 제공할 수 있다.
복합전극은 매트릭스에 결합시 전기 전도성 복합체를 제공하는 입자를 사용하여 형성될 수 있다. 입자는 탄소, 예를 들면, 입상 탄소, 카본 블랙, 탄소 섬유, 탄소 펠트일 수 있고 바람직하게는 탄소 피브릴이다 (5.1 장 및 5.7 장 참조).
매트릭스를 위해 하나 이상의 유형의 입자 및/또는 하나 이상의 유형의 물질을 함유하는 복합체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 복합전극은 전기 전도성 및 ECL-활성을 부여하기 위한 한 유형의 입자와 결합 영역을 위한 지지체로서의 다른 유형의 입자를 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 복합전극은 탄소 입자의 블렌드와 매트릭스로 이루어진다. 특히 바람직한 양태에서, 복합전극은 탄소 피브릴과 중합체로 이루어진다. 미국 특허 제5,304,326호 및 5,098,771호에는 피브릴로 포화된 중합체 복합체가 기재되어 있다.
피브릴-중합체 복합전극은 플라스틱 물질 및 부품 제조 기술에 공지되어 있는 기술에 의해서 생성될 수 있다. 예를 들면, 평평한 전극은 피브릴 복합체의 압축 시이트 또는 압출 필름으로부터 절단될 수 있다. 반응 챔버를 위한 유체 또는 웰의 이동을 위한 복잡한 형태 또는 표면 특성, 예를 들면, 홈 또는 채널을 갖는 전극이 사출성형에 의해서 형성될 수 있다.
복합전극은 충실성이거나 다공성일 수 있다. 다공성 복합체는 다공성 플라스틱 물질, 예를 들면, 여과막을 생성하기 위한 기술을 사용함으로써 형성될 수 있다. 다공성 복합전극을 통한 여과는 전극 표면에 고정된 결합 영역으로의 결합 반응의 동역학을 개선할 수 있다.
결합시약은 변형되지 않은 복합전극 상에 고정될 수 있다. 예를 들면, 결합시약은 매트릭스 및/또는 전도성 입자 상으로의 비-특이적 흡착에 의해 고정될 수 있다. 매트릭스 및/또는 전도성 입자 상에 존재하는 작용기는 시약의 고정을 위해서 사용될 수 있다. 이들 시약는 결합시약으로서 및/또는 표면의 성질, 예를 들면, 습윤능 또는 비-특이 결합 내성을 변화시키는 시약으로서 제공될 수 있다. 매트릭스로 사용될 수 있는 시약의 물질 상의 공유 및 비-공유 고정이 당해분야에 공지되어 있다 (5.1 장 참조).
일양태에서, 탄소 입자는 복합체의 0.1 중량% 내지 99.9 중량%를 구성한다. 다른 양태에서, 탄소 입자는 복합체의 0.5 중량% 내지 50 중량%를 구성한다. 바람직한 양태에서, 탄소 입자는 복합체의 1 중량% 내지 30 중량%를 구성한다. 특히 바람직한 양태에서, 탄소 입자는 복합체의 2 중량% 내지 20 중량%를 구성한다.
복합체 중의 탄소 피브릴의 사용이 특히 유리하다. 피브릴의 전도성 및 높은 종횡비는 복합체 중의 저-퍼센티지 탄소로 높은 전도성을 갖는 복합체의 제조를 허용할 수 있다 (동일한 중량-퍼센티지로 존재하는, 피브릴이 아닌 탄소 입자를 함유하는 복합체에 비하여). 일부 탄소 입자의 높은 탄소 로딩이 구조적 통합성 및/또는 복합체 처리능을 타협할 수 있으므로, 높은 전도성을 지닌 낮은 탄소 로딩을 갖는 복합체가 유리할 수 있다. 탄소 피브릴을 함유하는 복합체는 또한 큰 외부 표면적으로 인하여 높은 결합 능력을 지닐 수 있다. 피브릴을 노출시키기 위한 복합체의 가공 (예를 들면, 화학적 수단에 의해서 또는 플라즈마로의 노출에 의해서)이 유리하게도 피브릴의 노출을 증가시키기 위해서 결합 능력을 변경시킬 수 있다. 결합 능력이란 물질의 주어진 기하학적 면적 상에 고정될 수 있는 시약의 양, 즉, 물질 cm2당 단백질 나노그램을 의미한다. 기하학적 면적이란 물질의 규모에 의해서 규정된 물질의 면적을 의미한다 (즉, 1 cm x 1 cm의 규모를 갖는 물질의 정사각형 조각이 기하학적 면적 1 cm2을 지닌다.). 다수 물질들 중의 한계 중의 하나가 결합 능력이 물질의 기하학적 면적에 의해서 제한된다는 점이다. 예를 들면, 매끄러울 경우, 평면이 사용되고 (예를 들면, 금속의 표면), 매끄러운 평면의 기하학적 면적에 걸쳐서 분포된 폐쇄-패킹 단층의 시약의 결합 능력을 초과하는 시약 (예를 들면, 단백질, 핵산, 결합시약)의 결합 능력을 수득함이 가능하지 않을 수 있다. 노출된 피브릴을 갖는 복합체의 사용은 이러한 한계를 극복한다. 피브릴의 노출은 복합체 표면에 다수의 돌출 피브릴 (각각 높은 표면적을 지님)을 생성하고: 시약의 결합을 위해 이용가능한 피브릴의 총 표면적은 복합체의 기하학적 면적을 현저하게 초과할 수 있다. 일양태에서, 이러한 복합체 상의 시약에 대한 결합 능력은 복합체의 기하하적 평면에 걸쳐서 분포된 폐쇄 패킹 단층 시약의 결합 능력의 1 배 이상일 수 있다. 다른 양태에서, 이러한 복합체 상의 시약에 대한 결합 능력은 복합체의 기하하적 평면에 걸쳐서 분포된 폐쇄 패킹 단층 시약의 결합 능력의 2 배 이상일 수 있다. 다른 바람직한 양태에서, 이러한 복합체 상의 시약에 대한 결합 능력은 복합체의 기하하적 평면에 걸쳐서 분포된 폐쇄 패킹 단층 시약의 결합 능력의 10 배 이상일 수 있다. 다른 바람직한 양태에서, 이러한 복합체 상의 시약에 대한 결합 능력은 복합체의 기하하적 평면에 걸쳐서 분포된 폐쇄 패킹 단층 시약의 결합 능력의 100 배 이상일 수 있다.
일부 양태에서, 탄소 피브릴을 함유하는 복합체는 특정 용매, 온도, 시약 및 복합체 매트릭스를 손상시킬 수 있는(매트릭스만이 처리될 경우) 방법에 의한 손상에 대해 내성이 있을 수 있다. 이러한 손상 내성은 가공시 유리할 수 있다. 예를 들면, 복합체 유도를 위한 특정 절차 (예를 들면, 매트릭스만을 용해시키지만, 매트릭스 또는 피브릴이 복합체로서 함께 존재할 경우 이들을 용해시키지 않는 절차)를 사용함이 가능할 수 있다.
복합전극은 결합시약의 고정을 개선하기 위해서 화학적 또는 기계적 처리에 의해서 변형될 수 있다. 표면은 시약의 고정을 위한 작용기를 도입하기 위해서 처리될 수 있다. 사용될 수 있는 기술에는 전자기 방사, 이온화 방사, 플라스마 또는 화학적 시약, 예를 들면, 산화제, 친전자체, 친핵체, 환원제, 강산 및 강염기 및/또는 이들의 배합으로의 노출이 포함된다 (5.18 장 참조).
특히 흥미로운 일양태가 이러한 복합전극, 좀더 광범위하게는 매트릭스 (예를 들면, 중합체)와 이에 분산된 하나 이상의 피브릴 및/또는 피브릴 구조물을 포함하는 복합체 물질 (전극에 제한되지 않음)의 플라즈마로의 처리에 의한 변형이다. 처리는 처리 동안 플라스마와 접촉하게 되는 피브릴, 피브릴 구조 및/또는 매트릭스의 표면 특성을 변화시키기 위해서 수행되고; 이러한 방식에 의해서 처리된 피브릴 복합체는 작용화되거나 원하는 대로 변형될 수 있다. 일단 본원의 교시대로 장치되면, 통상의 기술자 중의 한 명이 이러한 복합체 물질의 처리에 익히-공지된 플라즈마 처리 기술 (추가 발명 또는 과도한 실험이 필요없이)을 적응시켜 사용할 것이다. 따라서, 플라즈마를 생성하기 위해서 적합한 압력 및 기타 조건에서 적합한 기간 동안 적합한 반응 용기에서 처리를 수행할 수 있고, 이것을 복합체 물질과 접촉시키고, 원하는 종류 및 정도의 변형을 수행할 수 있다. 산소, 암모니아, 헬륨 또는 기타 화학적으로 활성이거나 불활성 기체를 기초로 하는 것들과 같은 플라즈마가 사용될 수 있다. 이의 성질에 따라서, 변형된 조성물이 전극으로서(상기와 같이) 또는 기타 적용을 위해서 사용될 수 있다.
플라즈마를 생성하기 위해서 사용되는 기타 기체의 예에는 아르곤, 물, 질소, 에틸렌, 탄소 테트라플루오라이드, 설퍼헥사플루오라이드, 퍼플루오로에틸렌, 플루오로포름, 디플루오로-디클로로메탄, 브로모트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄 등이 포함된다. 플라즈마는 단일 기체 또는 둘 이상의 기체의 혼합물로부터 생성될 수 있다. 복합체 물질을 한 유형의 플라즈마에 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 복합체 물질을 플라즈마에 연속적으로 수 회 노출시키는 것이 또한 유리할 수 있고; 플라즈마를 생성하기 위해서 사용된 조건, 이러한 연속적인 처리의 기간 및 이러한 연속적인 처리간의 기간이 물질에 특정한 변경사항을 달성하기 위해서 변화될 수 있다. 연속적인 처리 간의 복합체 물질을 처리 (예를 들면, 물질을 액으로 코팅하고 물질의 표면을 세척하는 등)가 또한 가능하다.
복합체 물질의 플라즈마 처리는 여러 변화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 중합체와 이에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 복합체 물질이 플라즈마에 노출될 수 있다. 플라즈마로의 노출은 중합체를 에칭하고 복합체의 표면에 탄소 피브릴을 노출시킬 수 있고, 이에 따라 노출된 피브릴의 표면적을 증가시킨다 (예를 들면, 노출된 피브릴의 표면적이 복합체의 기하학적 표면적보다 더 크다). 플라즈마로의 노출은 화학적 작용기를 피브릴 또는 중합체 상에 도입할 수 있고; 이러한 작용기가 시약의 고정을 위해서 사용될 수 있다.
플라즈마는 복합체 물질에 시약을 결합시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 복합체 물질은 소정량의 시약이 복합체 물질을 코팅하도록 시약 (예를 들면, 세제, 다방향족 분자, 소수성 분자, 하전 분자 등)를 함유하는 용액에 노출될 수 있다. 이어서 시약-코팅 복합체 물질이 플라즈마에 노출될 수 있고; 플라즈마로의 노출은 시약을 복합체 물질에 결합시킨다. 다른 예에서, 이분자 (예를 들면, 단백질, 핵산 등)로 코팅된 복합체 물질이 플라즈마에 노출되고: 플라즈마로의 노출은 이분자를 복합체 물질에 결합시킨다. 다른 예에서, 복합체 물질은 하나 이상의 원하는 시약 (예를 들면, 친화력 크로마토그래피 수지, 생체특이 리간드를 갖는 중합체)를 특정적으로 결합시키는 시약으로 코팅되고 플라즈마로 노출된다. 플라즈마로의 노출은 시약을 복합체 물질에 결합시킨다.
복합체 물질에 결합된 시약는 복합체 상에 다른 시약을 고정시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 복합체 물질에 결합된 소수성 시약는 복합체로의 단백질의 흡착을 개선시킬 수 있다. 친화력 크로마토그래피 수지, 생체특이 중합체, 단백질 등은 복합체 물질로의 생체분자의 고정을 개선할 수 있다 (예를 들면, 생체특이적으로 및/또는 비-특이적으로).
플라즈마는 또한 복합체 물질 상에 시약의 중합을 유도하기 위해서 사용될 수 있다. 이어서 플라즈마 유도 중합으로부터의 산물이 복합체 물질 상에 시약을 고정시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 단량체 전구체가 복합체 물질 상에 코팅될 수 있고; 플라즈마로의 노출은 일부 또는 모든 단량체 전구체의 그래프팅 및/또는 중합을 유도할 수 있다. 다른 예에서, 중합체가 복합체를 단량체를 포함하는 플라즈마로 처리함으로써 복합체 물질 상에 코팅될 수 있다. 다른 예에서, 복합체 물질은 종을 개시하는 중합이 복합체 상에 생성되도록 복합체를 플라즈마에 노출시킨 다음 복합체를 단량체로 처리함으로써 단량체 또는 중합체로 코팅될 수 있다.
결합시약을 매트릭스 및 입자 상에 고정시키는 것이 유리할 수 있거나 결합시약을 성분, 예를 들면, 매트릭스 또는 입자 중 하나 상에만 고정시키는 것이 유리할 수 있다. 예로서, EVA (공중합체 또는 에티렌과 비닐 아세테이트)의 피브릴로 이루어진 복합전극은 전극 상에 카복실산 그룹을 도입하기 위해서 크롬산과 황산의 혼합물로 처리될 수 있다. 이어서 이들 카복실산 그룹이 아미드 결합의 형성에 의해서 아민을 함유하는 결합시약을 고정시키기 위해서 사용될 수 있다. 또한 EVA의 피브릴의 복합체가 나트륨 하이드록사이드로 처리될 수 있다. 이 경우에, 피브릴은 변형되지 않은 상태로 유지되지만 하이드록실 그룹이 중합체 상에 노출된다. 이어서 이들 하이드록사이드 그룹이 친핵체를 함유하는 결합시약을 고정시키기 위해서 사용될 수 있다.
복합체의 변형이 기타 유리한 성질을 유발시킬 수 있다. 매트릭스 및/또는 입자의 변형이 높은 결합능을 갖는 복합전극을 생성할 수 있다. 친수성 그룹의 복합전극으로의 도입은 매트릭스를 수화하고 얇은 수-팽창성 겔 층의 형성을 유발시킬 수 있다. 시약는 동일한 기하하적 표면적을 갖는 편평한 충실성 표면을 채울 수 있는 것 보다 더 많은 시약의 고정을 허용하는 이러한 겔 층 내에서 고정될 수 있다. 매트릭스의 부분 분해가 전도 입자의 노출 표면적을 증가시키고 특히 입자가 용액으로 확장될 수 있는 섬유인 경우, 결합시약의 전도 입자 상의 직접 고정을 위해 고 표면적 전극을 유발할 수 있다.
복합체 표면의 변형은 ECL을 여기시키기 위해서 요구되는 전기화학 전위를 이동시킬 수 있다. 복합전극의 변형이 ECL 태그로부터 ECL의 여기를 위해서 요구되는 과잉전위을 감소시키거나 증가시킬 수 있고, 이로 인해 특정 시그널, 예를 들면, 분석물 및 백그라운드 시그널로부터의 시그널이 분해되도록 한다.
복합전극 표면 상의 PMAMS 형성이 사진평판 고정, 미세접촉 프린팅 및/또는 미세관 배열 또는 잉크-젯 프린팅의 사용을 통한 결합시약 몇 방울의 표면으로의 통제된 적용을 포함하는 다양한 방법에 의해서 달성될 수 있다. 또한, 복합전극의 표면은 이것을 마스크와 접촉하여 배치시킴으로써 뚜렷한 영역으로 분리될 수 있다.
본 발명은 ECL 분석시의 용도를 위해서 일회용 다수웰 플레이트 (본원에서 "ECL 플레이트"라고 언급됨)를 포함한다. 일양태에서, ECL 플레이트는 전도성 복합체를 다수웰 미세역가 플레이트의 형태로 형성 (예를 들면, 압착, 몰딩 또는 성형)시킴으로써 제조된다. 다른 양태에서, 물질의 시이트를 통한 구멍의 배열을 포함하는 마스크가 형성된다. 이어서 이러한 마스크가 전극에 대해서 밀봉된다 (전극은 바람직하게는 전도성 복합체 또는 피브릴 매트이고; 피브릴 매트의 제조는 5.7 장, 5.18 장 및 본원의 참조에 상세하게 기재된다). 이어서 마스크를 통한 구멍이 마스크를 포함하는 벽과 전극을 포함한 베이스를 갖는 웰을 규정한다. 마스크와 전극은 사용자에게 예비조립 일회용 카세트로서 또는 키트의 개별적 일회용 부품으로서 제공될 수 있다. 또한, 단지 전극은 일회용일 수 있다. 전극은 충실성이고/이거나 다공성일 수 있다. 다공성 전극의 경우에, 결합 반응이 전극을 통하여 시약을 여과시킴으로써 수행될 수 있다 (결합 분석에 사용하기 위한 다중웰 여과 분기물 - "도트 블럿"이 당해분야에 공지되어 있음). 상이한 양태의 ECL 플레이트에서, 마스크내 다수의 구멍(상기 양태에서 기재된 바와 같이)은 개별 웰 및/또는 웰 그룹 내 전극이 개별적으로 시도될 수 있도록 다수의 개별 전극에 대해서 밀봉된다.
ECL 플레이트는 바람직하게 다중웰 미세역가 플레이트용으로 사용되는 표준 형태로 성형된다. 이러한 표준 포맷이 당해분야에 공지되어 있고, 24, 96 및 384 웰 플레이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표준 포맷의 사용은 미세역가 플레이트 상의 결합 반응을 수행하기 위해서 시판되는 장치 (예를 들면, 이동 플레이트, 세척 플레이트 및/또는 분배 샘플)의 통합을 허용한다. 본 발명은 ECL 플레이트의 전극(들)으로부터 ECL을 여기시키고 각 웰로부터 방출된 ECL을 정량하기 위한 장치를 포함한다.
ECL 플레이트는 최종 사용자에게 하나 이상의 분석물을 위한 고정 결합시약을 제공할 수 있다. 또한 사용자에게 ECL 플레이트 및 결합시약을 고정시키기 위해서 필요한 시약을 포함하는 키트를 제공할 수 있다 (결합시약이 사용자에 의해서 제공될 경우).
복합전극은 ECL을 사용하지 않는 분석에 사용될 수 있다. 이들은 형광, 화학발광 또는 ELISA-형 포맷을 기초로 하는 분석을 위해 고체상 결합 지지체로서 사용될 수 있다. 이들은 전류계 또는 전위차계 전기화학 검출을 기초로 하는 분석을 위한 전극 및/또는 고체 상 지지체로서 사용될 수 있다.
5.18. 다공성 전극 상의 PMAMS를 사용한 ECL 분석
본 발명의 전극은 다수의 탄소 피브릴의 매트를 포함할 수 있다. 이러한 매트는 본 발명에 이르러 전기화학발광 분석용 전극으로서 잘 실행되는 것으로 밝혀졌다.
매트는 광범위하게는 다수의 탄소 피브릴과 분석시약을 함유하는 적어도 하나의 영역을 포함한다. 본 발명의 일양태에서 매트는 상이한 전도성 층 둘 이상, 유도 또는 비유도 탄소 피브릴 또는 유도 또는 비유도 피브릴 배합의 층 둘 이상, 상이한 광학적 불투명도의 피브릴 층 둘 이상, 또는 상이한 구멍 크기 피브릴 층 둘 이상으로 구성될 수 있다.
바람직하게는 이들 매트는 전기화학발광 분석을 위한 전극에 사용된다. 전극에는 지지체, 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 피브릴 매트 및 매트와의 전기 접촉을 위한 수단이 포함된다. 전극은 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 포함하는 결합 영역을 함유할 수 있다.
본 발명은 이러한 분석용 전극을 제조하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 지지체, 피브릴 매트 및 매트와의 전기 접촉을 위한 수단을 포함한다. 피브릴 매트는 결합 영역을 포함할 수 있다.
전극은 전도성이거나 다공성일 수 있고 바람직하게는 전도성이고 다공성이며 예를 들면, 금속-코팅 다공성 물질로 구성될 수 있다. 전극은 스테인레스강 섬유 메쉬일 수 있다.
전기화학발광 분석의 전극을 위한 지지체로서 사용하기 위한 피브릴 매트가 여러 상이한 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 방법 중 하나에서 피브릴은 표면에 고정된 결합시약으로 생성된다. 이들 피브릴이 매질에 분산된다. 이어서 이들을 용액으로부터 여과시켜 피브릴 매트를 생성한다.
또한, 피브릴 매트는 피브릴을 매질에 분산시키고 피브릴을 매트를 제조하기 위해서 매질로부터 여과시키고 최종적으로 피브릴 매트를 결합시약의 동원을 위해 제조하기 위해서 유도함으로써 제조될 수 있다.
본 발명은 광범위하게는 해당 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석을 수행하기 위한 방법을 포함한다. 이 방법은 (a) 전도성 중합체로 이루어진 전극과 (b) 결합 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 결합 영역의 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 생물학적 샘플의 해당 다수 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석을 수행하기 위해서 사용될 수 있다. 이 방법은 (a) 해당 분석물을 함유하는 샘플과 전기화학발광을 가능하게 하는 표지 화합물을 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 결합 영역을 함유하는 다수 탄소 피브릴을 포함하는 전극과 접촉시키고; (b) 전극에서 표지 화합물을 전압을 부과함으로써 발광물질로 유도시킨 다음; (c) 방출된 발광물질을 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 이 방법은 (a) 해당 다수 분석물을 함유하는 샘플과 전기화학발광을 가능하게 하는 표지 화합물을 각각이 전기화학발광 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 결합 영역을 함유하는 피브릴 매트를 포함하는 다수 전극 영역과 접촉시키고; (b) 피브릴 매트 상에 수집된 표지 화합물을 전기화학발광으로 유도한 다음; (c) 방출된 발광물질을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 다공성 전극을 함유하는 카세트를 포함한다. 카세트는 다공성 물질에 의해서 지지된 탄소 피브릴의 다공성 매트로 이루어진 작동전극을 함유한다. 하나 이상의 결합 영역이 작동전극 표면에 존재한다.
다공성 전극은 탄소, 예를 들면, 흑연 탄소, 유리질 탄소 또는 탄소 섬유으로 이루어질 수 있고 특히 바람직한 양태는 탄소 피브릴을 포함한다. PMAMS의 결합 영역은 피브릴 매트에 의해서 지지될 수 있다 (5.7 장 참조). 매트는 둘 이상이 서로 동일하거나 모두가 서로 상이할 수 있는 다수의 분리된 결합 영역을 지지할 수 있다. 피브릴은 또한 하나의 결합 영역을 지지할 수 있다.
탄소 피브릴은 공유적으로 또는 화학적 흡착에 의해서 이의 표면에 부착된 화학 작용기를 갖도록 제조될 수 있다. 이들 및 기타 화학적 작용기는 기타 물질을 피브릴 표면에 부착시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, ECL분석에 사용될 수 있는 항체는 하나 이상의 피브릴 또는 피브릴 매트에 부착될 수 있다.
피브릴 매트는 비유도 피브릴, 유도 피브릴 또는 상이한 유형의 피브릴 둘 이상의 혼합물을 함유하는 단일 층으로 존재할 수 있다. 피브릴 매트는 둘 이상의 층을 지닐 수 있다. 연속적인 여과 단계가 하나 이상의 다른 층에 접촉하거나 매우 인접한 하나 이상의 분리된 층으로 구성된 피브릴의 매트를 형성하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들면, 2-층 피브릴 매트는 비유도 피브릴 층과 이분자로 유도된 피브릴 층을 함유할 수 있다. 일부 다중-층 매트에서, 층 사이가 중첩되거나 혼합될 수 있다.
피브릴 매트로부터 발생한 ECL 시그널은 매트의 조성물에 좌우될 수 있다. 예를 들면, 상이한 전기화학 전위가 비유도 피브릴 매트에 비하여 유도 피브릴 매트에서 ECL을 도출하기 위해서 요구될 수 있다. 전기화학 전위에 있어 이러한 차이는 분석의 하나 이상의 성분에 대해 특이적일 수 있거나 이에 제한될 수 있다. 유도 피브릴로 이루어진 매트는 백그라운드 ECL 시그널이 특별한 종으로부터의 ECL이 관찰되는 것보다 상이한 전기화학 전위로 관찰되는 전기화학발광 전위를 이동시킬 수 있고, 즉, 측정하기에 바람직한 분석의 성분으로부터의 시그널이 그렇게 할 경우 특정 시그널과 백그라운드 시그널 간의 분해력을 증가시킨다.
상이한 유형의 피브릴이 특정 능력을 갖는 피브릴 매트를 제조하기 위해서 사용될 수 있다. 비유도 피브릴 층 및 유도 피브릴 층으로 이루어진 매트에서, 비유도 피브릴의 층은 전기 전도체와 유도 피브릴 층간 전기 연결을 제공할 수 있으며 또한 물리적 강도를 제공한다. 유도 피브릴의 층은 분석 수행에 필요한 하나 이상의 반응물을 함유한다. 다른 양태에서, 매트는 기타 시그널의 보정을 위해서 표준으로서 제공되는 분자로 유도된 하나 이상의 피브릴을 함유할 수 있다. 매트는 또한 ECL 활성인 피브릴 층을 위한 물리적 지지체를 제공하는 ECL 불활성인 피브릴 층을 함유할 수 있다.
기타 물질, 예를 들면, 필터 막과 같은 다공성 물질 상에 피브릴 매트를 지지하는 것이 유용할 수 있다. 피브릴 층을 막의 표면 상에 포획하기 위해서 막을 통하여 피브릴의 현탁액을 여과시킴으로써 피브릴 매트가 막 상에 형성될 수 있다. 다중-층 매트가 상이한 유형의 피브릴의 연속적 여과에 의해서 제조될 수 있다.
비-전도 막 상에 지지된 피브릴 매트로의 전기적 연결이 하나 이상의 전기 전도성 요소, 예를 들면, 와이어, 금속 메쉬 또는 금속 환과 피브릴 표면을 접촉시킴으로써 이루어질 수 있거나 전기 전도성 요소, 예를 들면, 금속 핀의 배열이 피브릴 매트로 또는 피브릴 매트를 통하여 삽입될 수 있다.
피브릴 매트를 지지하기 위해서 사용되는 필터 막이 전기 전도성일 수 있다. 전도성 필터의 예에는 금속-코팅 중합체 막, 전도성 중합체 막, 금속 메쉬, 탄소 페이퍼, 탄소 펠트, 다공성 금속 필름, 소결된 금속 필터, 금속-섬유 필터 및/또는 금속-섬유 페이퍼가 포함된다.
금속-코팅 중합체 막은 열적 증발, 전자-빔 증발, 스퍼터링, 화학적 증착 또는 도금에 의해서 하나 이상의 금속을 갖는 것들을 코팅함으로써 제조될 수 있다. 바람직한 양태에서, 중합체 여과막은 열적 증발에 의해서 금으로 코팅된다.
필터 막이 여과에 의해서 효율적으로 피브릴을 포획하지 않는 경우, 여과 효율을 개선하기 위한 방법이 사용될 수 있다. 막의 효과적인 구멍 크기는 필터의 표면 및/또는 내부 영역 상의 금속 침착에 의해서 감소될 수 있다. 필터 막은 부분적으로 플러깅되거나 적합한 크기의 물질로 흡장될 수 있고, 즉, 필터 보조물이 사용될 수 있다. 필터는 피브릴과 필터 간의 결합을 유도하기 위해서 화학적으로 처리될 수 있다. 결합은 공유 결합, 반 데르 발스 힘, 수소 결합, 전하/전하 상호작용, 또는 친수성 소수성 상호작용, 또는 생체특이적 결합 (단백질/리간드, 항체/항원 등)에 의해서 수행될 수 있다. 피브릴은 기타 메커니즘, 즉, 이들이 현탁되는 액체의 증발에 의한 필터 표면 상의 침착에 의해서 포획될 수 있다.
피브릴 매트를 지지할 수 있는 필터가 ECL을 위한 전극으로서 작동할 수 있다. 예에는 금, 백금, 탄소 및/또는 인듐-주석 옥사이드 (ITO)로 이루어지거나 코팅된 필터가 포함된다. 이러한 양태에서, 지지체와 피브릴 매트 모두 관찰된 ECL 시그널에 기여할 수 있다. 일부 양태에서, 피브릴 매트를 지지하는 필터는 ECL을 위한 전극으로서 작용하지 않는다. 이러한 피브릴은 피브릴 매트를 위한 지지체 및 전기적 연결성을 제공하지만, 백그라운드 ECL 시그널을 포함하는 관찰된 ECL 시그널에 기여하지 않는다.
피브릴 매트는 또한 비-다공성 물질 상에서 지지될 수 있다. 피브릴 매트는 금 호일, 백금 호일, 전도성 복합체 또는 ITO와 같은 ECL 전극으로서 작용할 수 있는 물질 상에서 지지될 수 있다. 피브릴 매트는 스테인레스강, 니켈 또는 비-전도성 물질과 같은 ECL 전극으로서 작용할 수 없는 물질 상에서 지지될 수 있다.
PMAMS는 피브릴 매트 상에서 제조될 수 있다. PMAMS 형성에 필요한 시약는 상기와 같이 미세유동성 가이드에 의해서 이전에 형성된 피브릴 매트의 공간적으로 분리된 영역으로 운반된다. 예를 들면, 미세유동성 가이드 (G1, G2,...Gn)의 배열은 스트렙트아비딘-코팅 피브릴로 이루어진 매트의 공간적으로 분리된 영역에 바이오티닐화 항체 (A1, A2...An)를 운반하기 위해서 사용될 수 있다. 유도 피브릴은 이들이 예를 들면, 여과 또는 증발에 의해서 포획되는 미세유체 가이드에 의해서 지지체의 공간적으로 분리된 영역으로 운발될 수 있다. 예를 들면, 미세유체 가이드 (G1, G2,...Gn)의 배열은 금-코팅 한외여과막의 공간적으로 분리된 영역으로 항체 (A1, A2...An)에 공유 결합된 피브릴을 운반하기 위해서 사용될 수 있다. 다른 방법에서, 피브릴의 현탁액은 피브릴이 메쉬의 와이어간 공간에 의해서 노출되는 필터 상에 침착되도록 필터 막과 접촉하여 배치된 물리적 마스크, 예를 들면, 와이어 메쉬를 통하여 여과될 수 있다.
피브릴 매트 상에 고정된 PMAMS를 사용하여 수행될 수 있는 분석의 유형에는 5.10 장에 기재된 것들이 포함된다. 피브릴 매트가 다공성이므로, 시약을 피브릴 매트 및 일부 경우에 밑에 놓인 지지체를 통하여 유동시킴으로써 분석을 수행함이 가능하다. 피브릴 매트 중의 구멍의 크기가 작으므로 (예를 들면, 10 내지 10000 nm), 매트를 통한 시약의 유동은 시약을 효율적으로 혼합시킨다. 이것은 결합영역의 표면으로의 물질 전달율을 개선시킴으로써 면역분석을 수행하기 위해서 요구되는 시간을 감소시킨다. 샘플을 매트로 또는 매트를 통하여 위킹(wicking)시킴으로써 수행된 분석은 증가된 동력으로부터 유사하게 이익을 얻는다. 또한, 피브릴 매트가 샘플에 침지될 수 있다. 피브릴 매트는 또한 생물학적 샘플로부터 원하지 않는 물질을 제거하기 위해서 필터로서 작용할 수 있다.
피브릴 매트 전극은 ECL을 사용하지 않는 분석에 사용될 수 있다. 이들은 형광, 화학발광 또는 ELISA-형 포맷을 기초로 하는 분석을 위한 고체상 결합 지지체로서 사용될 수 있다. 이들은 전류계 또는 전위차계 전기화학 검출을 기초로 하는 전극 및/또는 고체 상 지지체로서 사용될 수 있다.
5.19. 백그라운드로 시그널을 증가시키는 방법
전기화학발광 분석시 전기화학발광종 으로부터 발생되는 둘 이상의 시그널이 전기화학발광이 일어나는 상이한 전기화학 전위를 갖는 적어도 두 영역을 갖는 전극에서 분석을 수행함으로써 분해될 수 있다. 이러한 방법에 의해서 백그라운드 전기화학발광으로부터 시그널을 분해시키고 이로 인해 분석의 성능을 현저하게 개선시킴이 가능하다.
분석시에 전기화학발광종 으로부터 발생된 둘 이상의 시그널을 분해하기 위한 다른 방법은 전기화학발광종 중의 하나의 전기화학발광을 선택적으로 조절하는 시약을 분석시에 함유함을 포함한다. 예를 들면, 종 중의 하나로부터 전기화학발광을 소멸시키는 시약이 포함될 수 있다.
전기화학발광종 으로부터 둘 이상의 시그널을 분해하기 위한 다른 방법은 분석시 하나 이상의 종으로부터 전기화학발광을 생성하기 위해 불활성인 한 영역을 포함하는 전극에서 분석을 수행함을 포함한다.
백그라운드 시그널은 상이한 전기화학 전위에서 각각 표지 및 백그라운드에 대한 전기화학발광을 포함하는 전극에서 분석을 수행함으로써 분석시 목적하는 시그널로부터 식별될 수 있다. 또한, 동일한 전기화학발광 화합물로 표지된 둘 이상의 종으로부터의 시그널은 상이한 전위에서 각각의 표지로부터 전기화학발광을 유도하는 전극에서 서로 식별될 수 있다. 이러한 개선된 방법은 복합전극, 바람직하게는 탄소로 이루어진 것들에서 수행될 수 있고 최상의 결과는 전기화학발광이 일어나는 전기화학 전위를 변화시키기 위해서 화학적 또는 물리적 처리에 의해서 변형된 것들에 의해서 수득된다.
본 발명은 (a) 해당 분석물을 함유하는 샘플과 전기화학발광을 가능하게 하는 표지 화합물을 분석의 성분을 결합시킬 수 있는 시약을 함유하는 결합 영역을 함유하는, 분석시 적어도 한 종의 전기화학발광이 일어나는 전기화학 전위를 변형시키기 위해서 화학적 또는 물리적 처리에 의해서 변형된 탄소 피브릴 다수를 포함하는 전극과 접촉시키고; (b) 전극의 표지 화합물을 전압을 이에 부과시킴으로써 발광물질로 유도한 다음; (c) 방출된 발광물질을 검출하는 단계를 포함하는 해당 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석의 수행을 위한 방법을 포함한다.
연구자 및 임상학자의 요구는 분석의 검출 한계를 낮추고 이들 분석의 민감성을 증가시키며 분석이 수행되는 속도를 증가시키는 것을 필수적으로 만든다.
이들 요구 충족에 중요한 파라미터는 시그널 대 백그라운드 비의 최적화이다. 여기에서, 시그널 대 백그라운드 비 (S/B)는 측정하기에 바람직한 샘플 (즉, 분석물)의 성분으로부터의 시그널 대 측정하기에 바람직하지 않은 샘플 (즉, 오염물질)의 성분으로부터의 시그널의 비로서 정의된다. S/B 비의 최적화는 일반적으로 측정하기 바람직한 성분으로부터의 시그널의 최대화와 백그라운드 시그널의 최소화를 수반한다.
다양한 방법이 표지된 종으로부터의 시그널을 증가시키기 위해서 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,652,333호에서 형광, 인광 또는 원자 형광 표지로 표지된 입자는 측정 단계가 수행되기 전 한외여과에 의해서 농축될 수 있다.
다양한 방법이 또한 백그라운드 시그널을 감소시키기 위해서 당해분야에 공지되어 있다. 세척 단계가 오염물질, 비결합 분석물, 비결합 표지 종 또는 샘플의 기타 성분을 제거하기 위해서 사용되어 왔다.
하나 이상의 시그널의 검출이 최적화되도록 둘 이상의 시그널을 분해함이 유리하다.
도 58은 하나 이상의 성분에 대한 ECL 시그널의 전기화학 전위가 이동되는 방법을 도시한다. 도 58A에서, 샘플의 두 성분 (A 및 B)에 대한 ECL 시그널은 유사한 전기화학 전위에서 나타난다. 이처럼, 이들은 분해하기 어렵다. 도 58B는 상이한 전기화학 전위에서 나타나는 두 성분 (A 및 B)에 대한 ECL 시그널을 도시한다. 성분 B에 대한 ECL 시그널의 전위가 상이한 전위로 이동했고 성분 A' 및 B'에 대한 ECL 시그널이 쉽게 분해되었다.
도 58에 도시된 전기화학 전위의 선택적 이동은 ECL이 전극에 인접한 하나 이상의 표지로부터 도출되는 전기화학 전위에 따라 작동전극을 위한 물질을 선택함으로써 달성될 수 있다. 또한, 물질은 샘플의 하나 이상의 성분에 대한 ECL 시그널의 전기화학 전위를 변화시키기 위해서 화학적 또는 기계적 처리에 의해서 변형될 수 있다.
전극은 한 영역이 다른 영역보다 상이한 전기화학 전위에서 ECL 표지를 여기시키도록 상이한 전기화학성을 갖는 둘 이상의 영역을 지닐 수 있다. 전극은 층(1)이 샘플로부터의 하나 이상의 분석물과 ECL 표지를 생성하는 분자를 결합시키는 결합시약으로 유도되고, 역으로 층(2)이 유도되지 않는 2-층 피브릴일 수 있다. 이것은 분석물을 결합시키지 않지만 백그라운드 ECL 시그널을 생성하는 샘플의 기타 성분과 상호작용할 수 있다. 유도의 결과로서, 층(1)에 결합된 표지 분자로부터의 ECL 시그널이 층(2)으로부터 생성된 백그라운드 ECL 시그널보다 더 높은 전기화학 전위에서 나타난다.
다른 양태에서, 전기화학성, 예를 들면, ECL이 표지로부터 도출되는 전기화학 전위 및/또는 샘플내 하나 이상의 성분의 ECL 시그널의 강도가 샘플에 첨가될 수 있다.
도 59는 둘 이상의 시그널을 분해하기 위한 다른 방법의 개략도를 도시한다. 샘플의 하나 이상의 성분에 대한 ECL 시그널의 강도는 샘플의 다른 성분에 대한 ECL 시그널의 강도에 대하여 감소된다. 도 59A에서, 두 성분 (A 및 B)은 유사한 전기화학 전위에서 나타나는 ECL 시그널을 지닌다. 도 59B에서, 성분 B에 대한 ECL 시그널 강도 값은 성분 A의 ECL 시그널의 강도에 대하여 점점 더 작아진다.
도 59에서 도시되는 ECL 시그널의 강도에 있어서의 선택적 변화는 샘플의 하나 이상의 성분에 대한 ECL 시그널을 소멸시키는 물질을 첨가함으로써 달성될 수 있다. 또한, 작동전극은 상이한 전기화학성을 갖는 둘 이상의 영역을 지닐 수 있고, 즉, 전극은 ECL을 개시할 수 있는("ECL-활성") 하나 이상의 영역 (R1)과 ECL을 개시할 수 없는("ECL-불활성") 하나 이상의 영역 (R2)을 지닐 수 있다. 영역 R1에 결합된 샘플의 성분 (A1)은 적합한 전기화학 전위의 존재하에 ECL 시그널을 생성하고 반면에 R2에 결합된 성분 (B2)는 ECL 시그널을 생성하지 않는다.
용어 "ECL-불활성"으로 또한 전극 또는 상이한 전극의 다른 영역으로부터의 ECL 시그널보다 실질적으로 더 작은 비-제로 ECL 시그널을 생성하는 전극의 영역을 기재할 수 있다. 제공된 물질은 일부 조건 하에서, 즉, 완충제 또는 특정 ECL 표지의 존재 하에서 ECL-활성일 수 있고 상이한 조건 하에서 ECL-불활성일 수 있다.
전극은 ECL 활성인 피브릴과 ECL 불활성인 지지체로 이루어질 수 있다. 이 양태에서, 피브릴과 전기 접촉하는 샘플의 성분이 적당한 전기화학 전위 적용시 ECL 시그널을 방출한다. 대조적으로, 피브릴이 아니라 ECL-불활성 지지체와 전기화학 접촉하는 샘플의 성분은 전기화학 전위 적용시 ECL 시그널을 방출하지 않는다.
전극의 광학적 불투명도가 샘플의 하나 이상의 성분으로부터 ECL 시그널의 검출을 선택적으로 방지하기 위해서 사용될 수 있다 (5.11 장과 도 29 참조).
전극은 샘플의 하나 이상의 성분에 대해 ECL 활성이고 기타 성분들에 대해 ECL 불활성일 수 있다.
다른 양태에서, 샘플의 하나 이상의 성분 (An)은 ECL 활성 전극과 전기화학 접촉할 수 있고 샘플의 하나 이상의 성분 (Bn)은 ECL 전극과 전기화학 접촉하지 않을 수 있으며, 즉, 이들은 전극에 충분히 인접되어 있지 않다. 적합한 전기화학 전위가 전극에 적용될 때, ECL 시그널이 성분 An으로부터 생성되고 성분 Bn으로부터 생성되지 않는다. 전극은 분석물 An에 대한 하나 이상의 결합 영역을 생성하는 다공성 ECL 활성 층과 ECL 불활성 층으로 이루어질 수 있다. 샘플이 이러한 전극을 통하여 여과될 때, 약간의 분석물 An이 ECL 활성 층에 결합하고 결합되지 않은 성분이 ECL-불활성 층에 포획된다. 전위가 전극에 적용될 때, ECL 불활성 층에 동반되므로 ECL이 결합 성분 A에 대해서 개시된다. 본 발명은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는 하기의 실시예에서 추가로 상세하게 기재된다.
5.20. 초음파처리를 사용하는 ECL 분석
결합 반응이 시약간에 발생하는 다수의 진단 시스템에서, 시약의 개선된 혼합은 반응의 속도를 증가시킬 수 있다. 종종, 저속 혼합은 결국에는 진단 시험이 완료되는 속도를 제한한다. 시약간 결합 반응이 일어나는 진단 분석의 예에는 면역분석, DNA-탐침 분석, 임상 화학 시험, 수용체-리간드 결합 분석 등이 포함된다. 저속의 결합 동력은 용액내 시약간 결합 반응을 포함하고 시약이 고체 상에 제시되는 분석 수행시 특히 제한적인 압박이었다. 초음파처리는 용액내 시약의 혼합 및 용액내 시약의 고체 표면 상 또는 근처에 위치하는 시약으로의 물질 수송을 개선한다. 실험은 분석시약의 초음파처리가 고체상 지지체를 사용하는 결합 분석을 수행하기 위해서 요구되는 시간을 현격히 감소시킴을 입증하였다. 초음파처리는 약 100 Hz 내지 10 MHz의 주파수를 갖는 진동을 포함하는 것으로 정의된다. 초음파처리 (fs)의 주파수가 하기의 범위로 세분될 수 있다: 저-주파수 초음파처리 (100 Hz ≤ fs5 KHz), 초-초음파처리 (5 KHz ≤ fs1 MHz), 및 초-고 초음파처리 (1 MHz ≤ fs< 10 MHz). 진동의 진폭은 하기의 범위로 세분될 수 있다: 저 진폭 초음파처리 (<1 ㎛), 중 진폭 초음파처리 (1 내지 10 ㎛) 및 고 진폭 초음파처리 (>10 ㎛).
초음파처리에 의해서 달성된 개선된 혼합으로 최종점 및 동역학적 분석시 즉석의 유용한 적용을 발견하였다. 최종점 분석시, 해당 분석물의 농도 또는 양은 결합 반응이 완료에 다다를 때 발생되는 결합의 양을 측정함으로써 측정된다. 결합 반응 과정 도중의 초음파처리가 결합 반응을 위해 요구되는 시간을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 동역학적 분석시, 해당 분석물의 농도 및 양은 결합 반응의 속도를 측정함으로써 측정된다. 유사하게, 결합 반응 과정 도중의 초음파처리가 결합 반응의 속도를 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 더욱 신속한 결합 반응은 이전에 가능했던 것보다 훨씬 더 적은 시간에 측정가능한 시그널을 생성한다. 본 발명은 이러한 반응을 이용하는 분석이 수 분만에, 즉, 3 분 이하에 완료될 수 있다.
고체 지지체 상의 물질 수송-제한 결합 반응의 속도는 가용성 시약의 농도와 그 시약의 고체 지지체로의 물질-전달에 대한 물질-수송 계수 모두의 작용일 수 있다. 그러므로, 동역학적 분석 동안 적용된 초음파처리의 양, 속도 및 유형이 조심스럽게 조절되고 정확히 재생성가능해야 함이 특히 중요하다. 질량-전달 계수의 변동은 동일한 시험 중에서 반응 속도의 변동을 유발하는 것 같고, 따라서 부정확하거나 전적으로 무용한 결과가 되게 한다. 구조적으로 분석 셀 및/또는 고체상 지지체에 커플링된 초음파처리 장치의 사용은 신속하고 정량적이며 매우 민감하며 재생가능한 동역학적 결합 분석의 수행을 가능하게 한다.
작동전극 상에 배치된 포획 항체를 사용하는 ECL 샌드위치 면역분석에서, 결합 반응은 고체-지지체 표면에 물질 수송을 증가시키기 위해서 와동이 사용될 경우에도 완료에 도달하는 데에 1/2 시간 이상이 걸린다. 이러한 시간 규모는 기타 매우 민감한 고체상 결합 분석, 예를 들면, ELISA 및 RIA에서 전형적이다. 예상치않게도, 시약의 초음파처리가 이러한 결합 반응의 완료에 요구되는 시간을 수 분으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 장치 및 방법은 면역분석에 제한되지 않고 매우 다양한 결합 반응 (예를 들면, 핵산 하이브리드화, 항원-항체, 수용체-리간드, 효소-기질 등)에 유용할 수 있다.
초음파처리는 또한 유리하게 각각이 고체 상 지지체 상의 상이한 위치에 체류하는 결합 영역 다수를 지니는 시스템에서 사용된다. 이러한 경우에 정확하고 재생가능한 결과의 수득은 샘플의 모든 부분이 모든 결합 영역에 노출되도록 충분히 혼합될 것을 요한다. 초음파처리는 물질 수송을 효율적으로 되게 함으로써 이 방법을 가능하게 한다.
이것은 또한 영역을 찾는 것 일부 또는 모두가 상이한 분석물에 대해 특이적인, 고체상 지지체가 다수의 결합 영역을 갖는 시스템에서 유리하게 사용된다. 정확하고 재생가능한 결과의 수득은 샘플의 모든 부분이 지지체 상의 모든 결합 영역에 도출될 것을 요한다 (예를 들면, 샘플의 특정 부분이 적당하게 혼합되지 않고 따라서 샘플의 부분에 함유된 분석물에 특이적인 결합 영역을 갖는 결합 표면의 영역에 노출되지 않을 경우, 잘못된 "음성" 결과가 수득될 수 있다.).
본 발명에 따른 장치는 실험 셀이 ECL 여기 동안 초음파처리될 때 TAG1과 ECL 공반응물 트리프로필아민 (TPA)을 함유하는 용액에 의해서 생성된 ECL 시그널에 있어 3 배 이상의 증가를 제공한다. 그러므로, 본 발명은 ECL 표지 및 ECL 공반응물의 더욱 민감성 ECL 검출에 적용될 수 있다.
초음파처리는 시약의 물질 수송 대 고체 표면의 비율을 증가시킬 것이고 또한 표면으로부터 떨어져 있는 시약, 산물, 부산물, 오염물질 등의 물질 수송의 비율을 증가시킬 것이다. 초음파처리는 치환 반응, 예를 들면, 결합시약에 결합된 표지 분석물의 샘플에 존재하는 비표지 분석물에 의한 치환의 비율을 증가시키기 위해서 사용될 수 있다. 초음파처리는 또한 고체상 지지체 상의 원하지 않는 오염물질의 탈착의 비율을 증가시키기 위해서 사용되고, 이렇게 하여 특정 분석시에 생성된 간섭 및 비-특정 결합의 양을 감소시킬 수 있다. 또한, 초음파처리는 바람직한 물질, 예를 들면, 보호 코팅 등의 흡착의 비율을 증가시키고 소모되거나 바람직하지 않은 물질, 예를 들면, 보호 코팅 등의 탈착의 비율을 증가시킬 수 있다. 초음파처리는 표면 상에 정착한 입상 오염물질, 예를 들면, 세포막 또는 입상 시약을 재현탁시키기 위해서 사용될 수 있다.
초음파처리는 또한 샘플 제조 단계에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 초음파처리는 생물학적 조직 세포, 미생물, 바이러스 입자 등과 같은 물질을 파괴하기 위해서, 물질의 성분을 반응 매질로 방출시키기 위해서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 샘플 제조는 측정 세포, 예를 들면, ECL 세포 그 자리에서 일어난다.
또한, 초음파처리는 둘 이상의 용액을 균질적으로 혼합시키기 위해서 필요한 시간, 용액에 고체를 용해시키기 위해서 필요한 시간 및 건조된 물질을 재수화하기 위해서 필요한 시간을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 초음파처리는 또한 얇은 모세관을 통한 유체 유동의 속도를 증가시키는 데에 유용하다.
초음파처리는 다양한 기계 및 전기화학 장치에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 장치는 편심 설치된 캠, 전자기 스피커, 결정 발진기, 진자 장치 등을 갖는 전기 모터를 포함한다. 본 발명에 특히 적합한 주파수 및 진폭에서 초음파처리를 생성하기 위한 바람직한 장치는 압전 물질을 포함한다. 압전 물질은 일반적으로 비용이 많이 들지 않고 통상 이용가능하며 경량이며, 광범위한 주파수 및 진폭에 걸쳐서 초음파처리가 유도될 수 있다. 통상적으로, 압전 초음파처리 장치는 보통 크기가 다소 작고, 이들을 데스크톱 및 휴대용 장치에 특히 유용하게 한다. 좀더 유리하게, 압전 장치는 매우 적은 양의 전기력으로 작동될 수 있다. 본 발명에 따른 초음파처리 장치는 10 와트 이하를 소모하는 압전 장치로 효과적으로 초음파처리되고, 특정 장치는 약 0.25 와트를 소모하는 압전 장치로 작용한다. 바람직한 압전 장치는 피스톤-질량 장치이다.
초음파처리 발생기로부터 분석 물질을 함유하는 셀로의 초음파처리 에너지의 구조적 커플링이 매우 효율적인 고안임이 추가로 발견되었다. 가장 효과적인 구조적 커플링은 예를 들면, 초음파처리 발생기의 세포로의 직접 부착 또는 고체 컨티늄이 초음파처리 발생기와 분석 셀 사이에 제공되도록 초음파처리 발생기의 부착에 의해서 고체 접착되는 것으로 입증되었다. 초음파처리 에너지를 분석 셀 또는 분석 셀내 고체상 지지체로 특이적으로 전달시킴으로써, 초음파처리를 위해서 전 장치를 유도함에 비하여 훨씬 더 적은 에너지가 요구된다. 초음파처리 발생기의 조심스러운 배치가 분석 셀 내용물 에너지의 촛점이 맞추어진 방향을 허용하고 분석 시스템 기타 요소에 의한 감폭 효과를 감소시킨다. 구조적 커플링은 가역적일 수 있거나 (예를 들면, 초음파처리 발생기 및 셀은 연결 및 비연결 다수 시간이 존재하도록 고안될 수 있음) 영구적 연결을 나타낼 수 있다.
초음파처리 에너지의 구조적 커플링이 다수의 상이한 유형의 배치로 달성될 수 있음이 이해되어야 한다. 초음파처리 에너지의 구조적인 커플링은 특이적으로 (a) 초음파처리 발생기와 분석 매질 또는 결합 표면간 충실성 고유 영역을 통하여; 또는 (b) 초음파처리 발생기로부터 직접 분석 매질 또는 결합 표면으로의 초음파처리 에너지의 전달을 포함한다.
본 발명에 따른 장치내 초음파처리 에너지의 구조적 커플링이 정확히 조절될 수 있음이 본 발명의 중요한 장점이다. 구조적 커플링 메커니즘의 이러한 조절은 제작 장치 부품 및 이의 조립의 정확한 조절을 통하여 쉽게 이행된다. 구조적 커플링 매커니즘의 각각의 부품, 예를 들면, 초음파처리 발생기, 격판 등이 경질 물질로 이루어질 수 있으므로, 각각의 부품은 정확한 내성으로 제조될 수 있다. 유사하게, 구조적 커플링 메커니즘은 사실상 동일한 초음파처리 전달 특성을 갖는 다수 장치의 작성을 허용하는 정확한 경질 조립품에 적합하다.
본 발명은 일반적으로 면역분석, 핵산 하이브리드화 분석, 수용체-리간드 결합 분석 등과 같은 결합 분석 시스템에 적용될 수 있다. 결합 반응이 전극에 인접하여 일어나는 분석에서, 전극의 초음파처리 자체는 분석 반응 속도를 증가시키는 데에 있어 특히 유리한 효과를 지니는 것으로 입증되었다.
도 68은 본 발명의 양태에 따른 분석 셀 (68013)의 특정 횡단면도를 도시한다. 분석 셀 (68010)은 베이스 (68011), 격판 (68013) 및 초음파처리 발생기 (68016)를 포함한다. 베이스 (68011)는 캐비티 (68017)와 개구 (68014)를 규정하기 위해서 성형되고 바람직하게는 경질 물질이다. 또한, 베이스 (68011)는 가요성 물질을 포함한다 (예를 들면, 베이스 (68011)는 가용성 플라스틱 용기 또는 블리스터 팩을 포함한다.). 광학적 검출 기술 (예를 들면, ECL, 형광, 화학발광)을 사용하는 사용하는 분석 포맷에서, 베이스 (68011)는 바람직하게는 캐비티 (68017) 내에 생성된 빛이 베이스 (68011)에 커플링된 검출기 (도시되지 않음)에 의해서 검출되도록 하는 투명한 물질, 예를 들면, 아크릴류 등이다.
격판 (68013)은 시약 (68015), 예를 들면, 결합시약에 대한 고체상 지지체이고, 바람직하게는 얇은 필름 또는 시이트의 물질로 이루어진다. 특히, 격판 (68013)은 바람직하게는 피브릴-중합체 복합체 물질이다. 도시된 바와 같이, 격판 (68013)은 개구 (68014)에서 베이스 (68011)에 커플링된다. 바람직하게는, 격판 (68013)은 개구 (68014)를 덮는 베이스 (68011)로의 밀봉을 형성한다.
초음파처리 발생기 (68016)는 격판 (68013)을 초음파처리하기 위한 장치이다. 바람직하게는, 초음파처리 발생기 (68016)는 압전 초음파처리 장치를 포함한다. 발생기 (68016)는 바람직하게는 전기 조절 회로 등과 같은 초음파처리 발생기 조절기 (도시되시 않음)에 의해서 조절된다. 초음파처리 발생기 (68016)는 초음파처리 에너지를 격판 (68013) 및 시약 (68012)로 효율적으로 전달하기 위해서 격판 (68013)에 커플링된다.
작동시, 시약 (68012)는 캐비티 (68017)로 도입된다. 초음파처리 발생기 (68016)에 전류가 통해지고 격판 (68013)을 초음파처리한다. 격판 (68013)은 초음파처리 에너지를 캐비티 (68017) 및 이에 따라 이에 함유된 시약 (68012)로 보낸다. 초음파처리는 시약 (68012)가 혼합되도록 하고, 시약 (68012)간 반응 속도를 증가시킨다. 초음파처리는 또한 격판 (68013) 상의 결합시약 (68015)로 및 이로부터의 시약, 산물, 부산물 등의 물질-수송의 속도를 증가시킬 것이고, 이렇게 하여 고체상 지지체에서 결합 반응의 속도를 증가시킨다. 또한, 결합시약 (68015)는 생략될 수 있다.
다른 양태에서, 비-고체 커플링 물질 (도시되지 않음)이 발생기 (68016)와 격판 (68013) 사이에 배치된다. 커플링 물질은 액체 또는 기체일 수 있다. 커플링 물질은 밀봉된 용기, 예를 들면, 가요성 플라스틱 막에 유지될 수 있는 것으로 생각된다. 다른 양태에서, 커플링 물질은 고체 피스톤 구조를 포함할 수 있다. 초음파처리 발생기 (68016)로부터의 초음파처리 에너지가 고체 피스톤 구조에 의해서 격판 (68013)으로 구조적으로 커플링된다. 추가의 다른 양태에서, 시약 (68015)는 격판의 포면으로부터 생략되고 캐비티 (68017)의 표면 상에 배치된다.
계측기 (690101)를 갖는 일회용 카트리지 (69090)에서 ECL 분석을 수행하기 위한 분석 시스템 (690100)이 도 69에 도시되어 있다. 카트리지 (69090)는 베이스 (69091), 격판 (69092), 카운터전극(69093), 반응 엔클로저 (69094), 샘플 포트 (69095), 전기 리드 (69096) 및 기준전극 (69099)을 포함한다. 계측기 (690100)는 카트리지 수용기 (690108), 광 검출기 및/또는 조영 장치 (690102), 전기 접속기 (690103), 전압 또는 전류를 작동 및 카운터 전극 (690104)에 적용시키기 위한 전기 에너지원; 초음파처리 장치 (690105); 초음파처리 장치 (690105)를 구동하기 위한 전기 에너지원 (690106); 및 계측기 조절, 분석 데이터 수집, 및 분석 데이터 분석을 위한 마이크로프로세서 (690107)를 포함한다.
격판 (69092)은 시약, 예를 들면 결합시약을 위한 전기 전도성 고체상 지지체이고 작동전극으로서 작용한다. 바람직한 양태에서, 격판 (69092)은 피브릴-중합체 복합전극이고 시약 (69097A)는 이에 고정된 항체, 핵산, 수용체 등과 같은 결합시약을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 다양한 분석물에 특이적인 결합시약은 격판 (69092) 상의 결합 영역으로 패턴화된다. 베이스 (69091)는 바람직하게는 엔클로저 (69094) 내에서 발생한 ECL 반응에 의해서 생성된 빛이 검출기 (690102)에 의해서 검출되도록 하는 경질의 투명한 물질, 예를 들면, 아크릴류 등이다. 베이스 (69091)는 반응 엔클로저 (69094)와 샘플 포트 (69095)를 규정하도록 성형된다. 격판 (69092)은 바람직하게는 베이스 (69091)로 밀봉된다.
전기 리드 (69096)는 격판 (69092) 및 카운터 전극 (69093)으로의 전기적 커플링을 제공하는 전기 접촉물이다. 바람직하게는, 격판 (69092)은 초음파처리 에너지의 장치 (690105)로부터 베이스 (69091)로의 전달이 최소화되도록 설치된다. 또한, 격판 (69092)은 초음파처리 에너지를 장치 (690105)로부터 베이스 (69091)로 및 반응 엔클로저 (69094) 전면으로 전달하도록 설치될 수 있다.
바람직하게는, 반응 엔클로저 (69094)는 베이스 (69091)의 내면에 의해서 부분적으로 한정된다. 또한, 반응 엔클로저 (69094)는 베이스 (69091)로 커플링되는 투명한 물질로 제조된 분리된 엔클로저를 포함할 수 있다.
카운터 전극 (69093)은 바람직하게는 금속과 같은 전기 전도성 물질이다. 기준전극 (69099)은 바람직하게는 Ag/AgCl 기준전극이다. 전극 (69093) 및 (69099)은 베이스 (69091) 내에 배치되고 리드 (69096)로 커플링되며, 시약 (69098)와 전기 접촉하도록 개조된다. 임의로, 기준전극 (69098)이 생략될 수 있다. 개구 (69095)는 바람직하게는 모세관과 같은 작은 관 (도시되지 않음)에 의해서 샘플 물질의 삽입 (예를 들면, 시약 69098)을 위해 개조된다.
계측기 (690101)의 내면은 카트리지 (69090) 및 수용기 (690108)을 갖는 이의 부품 및 초음파처리 장치 (690105), 전기 연결 (690103) 및 검출기 (690102)를 포함하는 이의 카운터파트 부품을 수령하고 정렬하기 위해서 개조된다. 바람직하게는, 검출기 (690102)는 ECL 반응 도중 작동전극에서 방출되는 빛을 조영할 수 있는 검출기의 배열 (예를 들면, CCD 카메라 또는 포토다이오드 배열)이다. 검출기 (690102)는 단일 검출기, 예를 들면, 광전자증배관, 포토다이오드 등일 수 있다. 계측기 (690101) 중의 카트리지 (69090)의 삽입은 검출기 (690102)가 엔클로저 (69094) 내에 생성된 다량의 빛을 검출하기 위해서 배치되도록 검출기 (690102)를 베이스 (69091)와 함께 정렬시킨다.
초음파처리 장치 (690105)는 반응 엔클로서 (69094)에 함유된 시약 (69098)로 초음파처리 에너지를 전달하는 격판 (69092)을 초음파처리하기 위한 장치이다. 계측기 (690101) 중의 카트리지 (69090)의 삽입은 바람직하게는 장치 (690105)가 격판 (69092)과 접촉하여 이동할 수 있도록 장치 (690105)를 격판 (69092)의 중앙과 정렬시킨다. 계측기 (690101)내 카트리지의 삽입은 초음파처리 장치 (690105)가 전극 (69092)에 구조적으로 커플링되도록 한다. 초음파처리 장치 (690105)가 피스톤을 포함할 수 있는 압전 초음파처리 장치를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 초음파처리 장치 (69015)는 카트리지 (69090)가 계측기 (690101)로 삽입되는 경우 격판 (69092)과의 접촉을 이루기 위해서 이동가능하다.
카트리지 (69090)의 수용기 (690108)로의 삽입시, 전기 리드 (69096)는 전기 연결 (690103)로 커플링된다. 전기 에너지원 (690104)은 마이크로프로세서 (690107)에 의한 조절을 위해 개조된 조절가능한 전압원 또는 전류원일 수 있다. 또한, 카트리지 (69090)가 기준전극을 포함할 경우, 에너지원 (690104)은 바람직하게는 일정전위기이다.
조절된 에너지원 (690106)은 바람직하게는 초음파처리 장치 (690105)의 작동을 조절하기 위한 통상적인 조절가능한 전자 회로 추진 장치이다. 에너지원 (690106)의 작동은 마이크로프로세서 (690107)에 의해서 조절된다. 마이크로프로세서 (690107)는 통상적인 프로세서 장치, 예를 들면, 소프트웨어 프로그래밍 마이크로프로세서, 마이크로컨트롤러 등이다. 마이크로프로세서 (690107)는 검출기 (690102)와 에너지원 (690104) 및 (690106)의 작동을 조절하고 에너지원 (690104)으로부터의 전압 및/또는 전류 데이터와 함께 검출기 (690102)로부터의 강도 데이터를 수령한다. 바람직하게는, 마이크로프로세서 (690107)는 또한 분석 데이터를 처리하고 사용자 및/또는 다른 장치에 상응하는 출력을 제공할 수 있다.
작동시, 시약 (69098)를 포함하는 샘플이 샘플 주입 포트 (69095)에 의해서 반응 엔클로저 (69094)로 도입된다. ECL 분석을 수행하기 위해서 요구되는 시약이 이미 샘플에 첨가되었다. 시약에는 ECL 조-시약 (예를 들면, 트리프로필아민), ECL 잔기 (예를 들면, 바람직하게는 분석물 또는 분석물의 결합 파트너에 연결된 Ru(II)(bpy)3또는 유도체), 저해제 (예를 들면, BSA), 완충제, 부형제, 첨가제 및 방부제가 포함된다. 바람직한 양태에서, 카트리지는 시약 (69097B)로서 예시된, 분석을 수행하기 위해서 요구되는 일부 또는 모든 시약과 함께 예비저장된다. 특히 바람직한 양태에서, 시약 (69097B)는 반응 엔클로저 (69094) 내에 건조 형태로 저장된다.
분석을 수행하기 위해서, 카트리지 (69090)가 계측기 (690101)에 배치되고, 초음파처리 장치 (690105)가 격판 (69092)에 구조적으로 커플링되며, 장치 (690105)는 격판 (69092)을 초음파처리하기 위해서 에너지원 (690106)에 의해서 활성화된다. 이어서 초음파처리 에너지가 격판 (69092)을 통하여 시약 (69098)로 전달된다. 격판 (69092)의 설치에 따라서, 초음파처리 에너지가 또한 이러한 에너지를 반응 엔클로저 (69094) 및 이에 따라 시약 (69098)로 보낼 베이스 (69091)로 전달될 수 있다.
초음파처리는 시약 (69098)와 시약 (69098B)가 혼합되도록 하고, 성분 시약 (69098) 및/또는 (69097B) 간의 반응 속도와 격판 (69092)으로 및 격판 (69092)으로부터의 시약 (69098) 및/또는 (69097B)의 물질 전달 속도를 현저하게 증가시킨다. 장치 (690105)로부터의 초음파처리 에너지는 시약 (69098) 및/또는 (69097B)의 지지체 (69092)로의 물질 전달 속도를 현저하게 증가시키고, 이로 인해 시약 (69097A)와 시약 (69097B) 및 (69098)의 성분간 결합 반응의 속도를 증가시키고 ECL 측정을 위해 요구되는 시간을 감소시킨다. 반응물 (69097A), (69097B) 및/또는 (69098) 중의 전기화학발광 잔기가 발광하도록 하기 위해서 전기 에너지가 격판 (69092) 및 전극 (69093)으로 접속기 (690103) 및 리드 (690106)를 경유하여 에너지원 (690104)에 의해서 적용된다. ECL 반응에 의해서 생성된 빛이 측정(또는 조영)될 수 있고 초음파처리 장치 (690105)가 동시에 또는 이후에 작동한다.
마이크로프로세서 (690107)는 에너지원 (690104) 및 (690196)의 작동을 조절하고 에너지원 (690104)로부터의 전압 및/또는 전류 데이터와 함께 검출기 (690102)로부터의 강도 데이터를 수령한다. 마이크로프로세서 (690107)는 분석하고 수신된 데이터를 저장할 수 있고 바람직하게는 사용자 또는 다른 장치 (도시되지 않음)로의 제공을 위해 상응하는 출력을 생성한다. 바람직하게는, 데이타 수집 완료시, 마이크로프로세서 (690107)는 카트리지 (69090)가 계측기 (690101)로부터 제거될 수 있는지를 사용자에게 알린다. 마이크로프로세서 (690107)로부터의 이러한 통보를 수령하거나 분석 데이터가 완전한지를 결정하자마자 카트리지 (69090)는 장치 (690101)로부터 제거되어 적합하게 배치되거나 재순환된다.
시스템 (690100)의 다른 양태에서, 격판 (69092)에 커플링된 리드 (69096)의 부분이 생략되고 전기 연결이 에너지원 (690104)과 초음파처리 장치 (690105) 사이에 첨가된다. 또한, 접속기 (690103)의 상응하는 연결이 또한 생략될 수 있다. 이 양태에서, 초음파처리 장치 (690105)는 격판 (69092)에 전기 연결로서 작용한다. 카트리지 (69090)가 계측기 (690101)로 삽입될 때, 전기 에너지가 초음파처리 장치 (690105)를 통해서 시약 (69098)로 격판 (69092)을 경유하여 제공된다. 전기 에너지의 이러한 적용은 초음파처리 에너지와 동시에 일어나거나 그렇지 않을 수 있다.
다른 양태에서, 격판 (69092) 및/또는 엔클로저 (69094)는 시약 등으로 예비-코팅된다. 전극 (69092)의 초음파처리는 이러한 시약을 느슨하게 하고, 시약이 엔클로저 (69094) 내에서 시약 (69098)와 혼합되도록 할 수 있다.
다른 양태에서, 건조 시약 (69097B)는 반응 엔클로저 (69094)에 예비저장되고 액체 시약 (69098)가 건조 시약 (69097B)를 직접 접촉시키기 위해서 반응 엔클로저 (69094)로 도입된다. 초음파처리 장치 (690105)의 활성화시, 건조 시약 (69097B)와 액체 시약 (69098)는 초음파처리 에너지 부재시보다 매우 더 빠른 속도로 혼합된다. 혼합된 시약는 예를 들면, 서로 및/또는 고체상 지지체 (69092) 상의 시약과 반응할 수 있거나 이어서 다른 시약이 첨가되고 또한 혼합될 수 있다. 상이한 양태에서, 시약 (69097B)가 생략된다.
반응 엔클로저 (69094)의 내면은 분석을 방해하는 물질로 코팅될 수 있다. 이러한 방해 물질에는 오염물질, 세포 파편, 비-특이 결합시약, 반응 부산물 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, 초음파처리 장치(690105)가 활성화되고 초음파처리 에너지는 느슨하게 하기 위해서 이들 물질을 초음파처리함으로써 또는 표면에서 물질 수송 속도의 증가를 유발함으로써 엔클로저 (69094)의 내면으로부터 방해 물질을 제거한다. 예를 들면, ECL 분석은 ECL의 여기를 위한 전극을 적당히 제조하기 위해서 결합 반응 전 및/또는 후에 장치 (690105)의 활성화를 수반하는 소제 사이클을 사용할 수 있다. 이러한 소제 사이클은 반응 엔클로저 (69094)에 이러한 방해 물질을 느슨하게 하는 것을 돕는 소제 용액을 첨가함을 수반할 수 있다.
다른 양태에서, 초음파처리 장치 (690105) 및 에너지원 (690106)은 계측기 (690101)부터 생략되고 격판 (69092)은 또한 장치 (690105)와 같은 초음파처리 장치를 포함한다. 또한, 에너지원 (690104)은 에너지원 (690106)의 작용성을 포함한다. 격판 (69092)의 초음파처리 장치를 활성화하기 위한 에너지원 (690104)으로부터의 전기력이 접속기 (690103)와 리드 (69096)에 의해서 수행된다.
연속적 또는 간헐적 ECL 측정시, 결합 반응의 속도는 연속적으로 또는 간헐적인 간격으로 측정된다. 이러한 방법의 기재는 미국 특허 제5,527,710호 (Nacamulli 등)에서 발견된다. 본 발명은 이 분석시 결합 반응 속도를 증가시키기 위해서 작용할 것이고, 또한 정확한 재생가능한 측정을 제공하기 위해서 재생가능한 혼합을 제공할 것이다. 초음파처리는 또한 이러한 분석 동안 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 결합 반응 속도를 측정하기 위한 연속 또는 간헐적 측정의 장점은 이것이 단일-점 ECL 측정에 비하여 증가된 민감도 및 정밀도를 제공한다는 점이다.
본 실시예에 사용된 모든 탄소 피브릴은 Hyperion Catalysis Incorporated, Lot No. 166-39-1로부터 입수한다. 이러한 피브릴은 대략 3.5 내지 70 nm 범위의 직경, 직경의 10 배 이상의 길이, 탄소원자 다중층으로 된 외측 영역 및 뚜렷한 내부 코어 영역을 갖는다.
6.1. 마이크로 스탬핑에 의한 MAB PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra and Prime et al., Science 252:1164-7). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체를 함유한다.
6.2. 마이크로-스탬핑에 의한 MAB와 핵산 PMAMS의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지된 절차에 따라 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액(1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra and Prime et al., Science 252:1164-7). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 클론 항체 또는 변형된 핵산을 함유한다.
6.3. 에칭에 의한 PMAMS의 제조
깨끗한 금 표면을 친수성 OH-종결 알칸 티올, 에탄올 용액(1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH에 노출시킨다 (Prime et al., Science 252:1164-1167). 미세한 티핑된 에칭 우텐실의 선형 배열을 정렬된 금 표면과 접촉하여 광학적으로 레지스터되도록 로봇식으로 하고, 선형 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위의 2차원 그리드 배열을 생성하는 표면의 X와 Y 차원 모두에서 에칭하기 위해서 사용한다. 이어서 물질을 소수성 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH(에탄올 중의 1 내지 10mM)의 용액으로 몇초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다. 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이적이고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체 또는 핵산을 함유한다.
6.4. PMAMS 표면 상의 샌드위치 분석
표면에 결합된 1차 항체의 패턴화된 다중-특이 배열을 갖는 실질적으로 투명한 투명한 PMAMS 표면을 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. 지지체, 전극 분석, 단일층 표면을 투명하도록 선별하여 사용한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 보이는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다. 이어서 PMAMS 표면을 표면 상의 결합된 분석물에 특이적인 2차 ECL-표지 항체를 함유하는 용액에 노출시킨다. 이어서 이러한 용액을 분석물이 존재하는 부위에 결합된 ECL 표지 2차 항체를 남긴채로 PMAMS 표면으로부터 세척한다.
전극 분석을 오염 효과를 피하기 위해서 전극 표면과의 샘플의 조급한 접촉을 저지하는 제거할 수 있는 장애물에 의해 보호된다. 이어서 장애물을 제거하고 전극 배열, 즉 분석 완충제로 가습된 것을 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 하다. 전극 배열을 전위 파형 발생기에 연결하고 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. 이어서 CCD가 방출된 빛을 판독하고 시그널은 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.5. 제 1 및 제 2 PMAMS 표면의 분석
표면에 결합된 1차 항체의 패턴화된 다중-특이 배열을 갖는 투명한 PMAMS 표면을 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다.
보호 커버하의 제 2 PMAMS는 ECL 태그로 표지된 다수의 2차 항체의 패턴화된 마이크로-드롭이 존재하는 엇갈리는 소수성/친수성 유형과 함께 제공된다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터의 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 1차 항체 결합영역을 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극 배열을 제 1 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 부여한다. 전극 배열을 전위 파형 발생기에 연결하고, 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. 광전자 증배관은 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.6. PMAMS 표면 상의 핵산 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 단일-가닥 핵산 탐침의 패턴화된 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. 탐침은 해당 핵산 분석물의 5' 부위에 상보적이다. PMAMS 표면을 분석될 해당 하이브리드화 할 수 있는 핵산 분석물을 함유하는 것으로 추측되고 미리 변성되고, 즉 해당 단일 가닥의 분석물이 되도록 처리된 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 샘플을 하이브리드화된 분석물을 표면에 남긴채로 세척한다. PMAMS 표면을 표면에 결합된 핵산 분석물의 3' 말단에 특이적인 2차 ECL 표지된 핵산 탐침을 함유하는 용액으로 노출시킨다. 이러한 용액을 분석물이 존재하는 부위에 결합된 ECL 표지 핵산 탐침을 남긴채로 PMAMS로부터 세척한다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터에서 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 1차 항체 결합영역을 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극을 배열하고 제 1 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다.
전극 배열을 전위 파형을 발생기에 연결하고, 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 연결한다. 이어서 CCD가 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.7. 광전자 증배관 검출기를 갖는 PMAMS 표면의 경쟁적 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 해당 분석물에 특이적인 패턴화된 1차 항체의 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 해당 분석물과 항체에의 결합을 위해 해당 분석물과 경쟁하는 ECL 표지 분자의 기지량을 함유하는 것으로 추측되는 샘플의 혼합물인 분석될 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 샘플을 표면에 분석물에 결합된 항체 및/또는 표지된 경쟁적 결합물 남긴채로 세척한다.
전극 배열을 오염 영향을 피하기 위해서 샘플의 전극 표면과의 접촉을 저지하기 위해서 제거가능한 장애물로 보호한다. 이어서 장애물을 제거하고 배열 완충제로 가습된 전극을 배열하고, PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다. 전극 배열을 전위 파형을 발생기에 연결하고, 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. 이어서 광전자 증배관이 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.8. CCD 검출기를 갖는 PMAMS 표면상의 경쟁적 분석
투명한 PMAMS 표면을 표면에 결합된 1차 항체의 패턴화된 다중-특이 배열로 상기에 기재된 바와 같이 제조한다. PMAMS 표면을 분석된 해당 분석물을 함유하는 것으로 추측되는 용액 샘플에 노출시킨다. 이어서 표면상의 분석물에 결합된 항체를 남긴채로 샘플을 세척한다.
보호 커버하의 제 2 PMAMS는 해당 분석물과 경쟁적인 표지된 ECL의 다수의 기지량의 패턴화된 마이크로-드롭이 존재하는 엇갈리는 소수성/친수성 유형과 함께 제공된다.
제 1 PMAMS를 갖는 레지스터의 제 2 PMAMS를 보호하는 장애물을 제거하고 마이크로-드롭을 제 1 PMAMS 상에 주요한 항체 결합영역을 갖는 레지스터로 되게 한다. 제 2 PMAMS를 들어 올리고 전극 배열을 PMAMS 표면과 접촉하여 정렬되도록 한다. 전극 배열을 전위 파형 발생기에 연결하고, 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. CCD는 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.9. SH(CH2)10CH3알칸 티올을 갖는 마이크로 스탬핑에 의한
MAB PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산); Dow Corning으로부터 시판)과 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의SH(CH2)11OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 SH(CH2)11OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노클론 항체를 함유한다.
6.10. SH(CH2)10CH3알칸 티올을 갖는 마이크로 스탬핑에 의한
MAB 및 핵산 PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11OH를 정렬된 금 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, SH(CH2)10CH3(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 특이한 항체 및/또는 각각의 부위에 혼성화할 수 있는 핵산을 배치하기 위해서 SH(CH2)11OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키는 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체 또는 변형된 핵산을 함유한다.
6.11. 스트렙트아비딘-바이오틴 링커를 사용한 PMAMS 표면의 제조
1 내지 2 mm 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 바이오틴화된 티올의 몰 분획이 0.1인 머캡토언데캐놀과 12-머캡토(8-바이오틴아미드-3,6-디옥사옥틸)도데칸아미드의 혼합물로의 노출에 의해 "잉크트" 된다 (참고 문헌 : Spinke et al., 1993, Langmuir 9: 1821-5 and Spinke et al., 1993, J. Chem. Phys. 99(9): 7012-9). 이어서 물질을 소수성 CH3-종결 알칸 티올, HS(CH2)10CH3알칸 티올(에탄올 중의 1 내지 10 mM)의 용액으로 몇 초간(예를 들면, 2 내지 10초) 세척한다 (참고문헌 : Kumar et al., supra). 이어서 생성된 표면을 질소 스트림하에 부드럽게 건조한다. 이어서 각각의 모세관에 스트렙트아비딘 용액을 함유하는 모세관 배열을 정렬된 표면과 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관을 정렬하고 바이오틴화된 부위와 접촉하게 하고 모세관 배열을 제거하고 표면을 세척한다. 다수의 바이오틴화된 항체와 바이오틴화된 핵산 용액을 함유하는 제 2 모세관 배열을 특이한 항체 및 핵산을 각각의 부위에 배치하기 위해서 접촉하여 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다.
6.12. MAB 단일 표면의 제조
실리콘 표면의 금 상의 인터디지테이팅 작동 및 카운터 전극의 전극 배열은 당분야에 공지되어 있는 방법(예를 들면, Kumar et al supra)을 통하여 제조된다. 이러한 실시예에서, 전극 배열 및 분리된 결합 배열은 지지체의 동일한 표면에 존재한다. 1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 작동전극의 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산(PDMS)); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 전극 배열 표면의 정렬된 작동전극에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체를 배치하기 위해서 전극 배열 표면 상의 SH(CH2)11OH- (OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시킴으로써 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 모노 클론 항체를 함유한다.
6.13. MAB 단일 표면 상에서 수행된 분석
상기 6.12에 기재되어 있는 지지체가 제조된다. PDMS 스탬프는 각각이 단독적으로 작동전극/카운터 전극 쌍을 둘러싸는 환으로 패턴화된 포토레지스트 물질로부터 상기에 기재된 바와 같이 제조된다. 이어서 전극 배열 표면을 분석될 샘플에 노출시키고 ECL 표지된 2차 항체의 혼합물로 세척하고 이어서 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제 용액으로 세척한다. PMS 스탬프를 정렬하고 각각의 전극 쌍 위로 분석 완충제의 각각의 용적 전지를 둘러싸고 제한하기 위해서 PDMS 스탬프의 링을 정렬하면서 접촉하여 레지스트되도록 한다. 오버전위를 작동전극을 ECL 표지 2차 항체에 노출시키는 표면으로부터 단일층을 방출시키기 위해서 전극쌍에 적용한다. 이어서 광전자 증배관이 투명한 PDMS를 통하여 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환하는 마이크로프로세서로 전달한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.14. 작동전극 및 카운터 전극을 갖는 단일 표면의 제조
실리콘 지지체의 금의 인터디지테이팅 전극 사이에 금 결합영역을 갖는 인터디지테이팅 작동 및 카운터 금 전극쌍의 전극 배열이 당분야에 공지된 방법(예를 들면 Kumar et al., supra)을 통해 제조한다. 이러한 실시예에서, 전극 배열과 분리된 결합영역 배열이 동일한 표면에 존재한다. 1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 인터디지테이팅 전극 쌍 사이에서 결합영역의 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184(폴리(디메틸실록산(PDMS)); Dow Corning으로부터 시판)와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 금 전극 배열 표면에 접촉하여 레지스터된 핀에 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 이어서 친수성 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체를 배치하기 위해서 전극 배열 표면 상의 SH(CH2)11- (OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 정렬시키며 접촉한 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체를 함유한다.
6.15. 작동 및 카운터 전극을 갖는 단일 표면에서 수행된 분석
상기 6.14에 기재된 바와 같은 지지체 표면이 기재된 방법에 의해 제조된다. 제조된 표면을 분석될 샘플에 노출시키고, ECL 표지된 2차 항체의 혼합물로 세척하고, 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제 용액으로 세척한다. 전극 배열을 전위 파형 발생기에 연결하고, 전위를 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. 광전자 증배관이 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.16. 카운터 전극을 갖는 표면의 제조
1 내지 2 ㎛ 두께의 노출되고 현상된 포토레지스트 물질을 익히 공지되어 있는 절차에 따라서 사각 배열 유형으로 제조한다. SYLGARD 실리콘 탄성중합체 184와 상응하는 SYLGARD 184 경화제의 10 : 1 혼합물을 물질에 따르고, 경화한다. 중합된 SYLGARD 184를 실리콘 물질로부터 조심스럽게 제거한다. 생성된 탄성중합체성 스탬프는 친수성 OH-종결 알칸 티올로의 노출에 의해 "잉크트" 되고, 에탄올 용액 (1 내지 10 mM) 중의 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH를 정렬된 패턴화된 카운터 전극 및 금 표면의 사각 결합영역에 접촉하는 레지스터된 핀으로 로봇식으로 되게 하고 제거한다. 패턴화된 금 표면은 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH가 스탬프팅한 결합영역을 둘러싸는 애드레스할 수 있는 환 카운터 전극으로 이루어진다. 갭 또는 분리 공간이 각각의 금 카운터 전극 및 각각의 단일층 결합영역에 대한 각각의 사각 금 물질 사이에 존재한다. 결합시약 용액을 함유하는 모세관 배열을 각각의 부위에 특이한 항체 또는 핵산을 배치하기 위해서 SH(CH2)11-(OCH2CH2)6OH 부위를 갖는 모세관을 레지스터링한 정렬된 표면과 접촉하여 레지스터된 핀으로 로봇식으로 부여한다. 모세관 배열 중의 각각의 모세관은 해당 분석물에 특이하고 아미노 결합을 통하여 친수성 부위의 반응성 OH 그룹에 공유적으로 결합할 수 있는 항체 또는 핵산을 함유한다.
6.17. 상이한 표면에서 작동 및 카운터 전극을 갖는
단일 표면에서 수행되는 분석
실시예 6.16에서 상기에 기재된 지지체 표면을 분석될 샘플 용액에 노출시킨다. 이어서 지지체 표면을 세척하고 다수의 ECL 표지된 모노클론 항체 또는 상이한 특이성의 ECL 표지된 핵산을 함유하는 용액에 노출하고 트리프로필 아민을 함유하는 분석 완충제로 세척한다. 투명한 애드레스 할 수 있는 작동전극 배열을 6.16.장에서 상기에 기재된 바와 같은 지지체의 분리된 결합영역/카운터 전극 부위에 상응하는 배열의 각각의 작동전극으로 제조한다. 두개의 지지체를 분석 완충제로 가습하고 레지스터 된 정렬 등각 접촉으로 되게 한다. 전극 배열을 전위 파형 발생기에 연결하고, 전위를 두개의 지지체 사이에 전위장을 생성하는 정렬된 작동전극/카운터 전극 쌍에 적용한다. CCD가 투명한 작동전극을 통하여 방출된 빛을 판독하고 시그널을 바람직한 판독된 정보 형태로 전환한다.
판독된 정보를 분석물의 실재량을 측정하기 위해서 해당 분석물의 기지 량의 형태에서 대조군을 사용하여 획득된 판독된 정보와 비교한다.
6.18. 진공 여과에 의해 CC (분산된) 피브릴 매트의 제조
1 mg 피브릴/ mL 용액을 갖는 CC 피브릴의 수성 슬러리를 0.1% w/w CC 피브릴/탈이온수를 혼합함으로써 제조한다. CC 피브릴을 10분 내지 1시간 동안 슬러리의 400 와트 초음파 처리 혼을 탐침시킴으로써 슬러리에 분산한다(더욱 크고, 마이크론-스케일 집합체를 작은 집합체 또는 개별적인 섬유로 분산한다). 분산의 정도를 광학 현미경에 의해 모니터링한다.
나일론 여과 막(0.47 ㎛ 구멍 크기, 25 mm 직경)을 25 mm 직경 프릿화된 필터에 배치한다. 분산된 피브릴 슬러리를 막/필터 설치를 통하여 흡입 여과(도 23a)에 의해 여과한다. 슬러리의 분취량(5 ㎖)을 20 ㎖의 탈이온수로 세척하고, 막/필터 장치를 통하여 희석한다. 약 0.25 내지 0.3 g/cc의 평균 매트에 대해서, 약 100 ㎛의 매트는 6 분취량을 요구한다.
분산액으로부터의 모든 물을 매트로부터 제거할 때까지(시각적 검사에 의해) 흡입 여과를 지속한다. 매트를 여과막으로부터 직접적으로 (손으로) 필링한다.
매트를 약 10 내지 15분 동안 60℃ 오븐에서 건조한다. 매트를 이용하기 위해 절단하고, 펀칭하거나 섹션한다.
6.19. 증발에 의한 금속 망 지지체의 피브릴 매트의 제조
1 mg 피브릴/ mL 용액을 갖는 CC 피브릴의 수성 슬러리를 0.1% w/w CC 피브릴/탈이온수를 혼합함으로써 제조한다. CC 피브릴을 10분 내지 1시간 동안 슬러리의 400 와트 초음파 처리 혼을 탐침시킴으로써 슬러리에 분산시킨다(더욱 큰 마이크론-스케일 집합체를 작은 집합체 또는 개별적인 섬유로 분산한다). 분산의 정도를 광학 현미경에 의해 모니터링한다.
스텐레스 스틸 망의 1 ㎠ 섹션을 25 mm 직경 종이 필터에 배치한다. 슬러리의 5 ml 분취량을 스크린/필터 인셈블 표면에 피펫팅한다. 슬러리 중의 물을 실온 및 압력으로 또는 가열된 오븐에서 증발시키도록 한다.
일단 피브릴 매트를 건조하면, 부가적인 분취량을 첨가한다. 피브릴과 스크린을 여과지로부터 단일 단위로서 필링한다.
매트를 매트를 이용하기 위해 절단하고, 펀칭하거나 섹션한다.
6.20. NHS-에스테르 작용기를 생성하는 피브릴 상의 아비딘의 고정
(Hyperion Catalysts Inc.에 의해 제공된)COOH로 유도된 피브릴을 연속적으로 교반하면서 무수 디옥산 10 mg/ml에 현탁한다. N-하이드록시숙신이미드의 20-폴드 몰 초과량을 첨가하고 용해시키도록 한다. 이어서, 에틸-디아미노-프로필-카보디이미드(EDAC)의 20-폴드 몰 초과량을 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한다.
교반한 후, 상층액을 빨아 들이고 고체를 무수 디옥산으로 세번 세척하고 무수 메탄올로 한번 세척하고 0.45 ㎛ 폴리설폰 막으로 여과한다. 여과물을 첨가한 메탄올로 세척하고 질량에의 감소가 관찰되지 않을 때까지 진공하에서 유리 바이얼에 방치한다.
10.4 mg의 NHS-에스테르 피브릴을 PBS-1(내지 70 mM 포스페이트, 150 mM NaCl)(ORIGEN 시약 402-130-01, pH 7.8, IGEN, Inc.)로 세척한다. 세척된 피브릴을 아비딘의 2.3 ㎖ 용액(8.5 mg 아비딘/ml PBS-1)으로 현탁한다.
현탁액을 교반을 제공하기 위해서 플라스크를 연속적으로 회전시키면서 실온에서 1.5 시간 동안 가라앉힌다.
1.5 시간 후, 현탁액을 4 ℃에서 16시간 동안 저장하고, 실온이 되게하고 PBS-1으로 세척하고 PBS-1에 현탁액으로서 4℃에서 저장한다.
6.21. 탄소 피브릴의 모노 클론 (항-AFP)의 고정
NHS 에스테르로 작용화된 탄소 피브릴을 실시예 6.20.에 기재된 바와 같이 제조한다.
피브릴-NHS 에스테르 14mg을 500 ㎖의 PBS-1 완충제와 혼합한다. 혼합물을 점성의 슬러리가 될 때까지 20분 동안 초음파 처리한다. 부가적인 500 ㎖의 PBS-1 완충제를 첨가한다.
80 ㎖ PBS-1 중의 총 1.6 mg의 항-AFT(알파-태 단백질) 항체를 슬러리에 첨가한다. 반응물은 실온에서 2.5 시간 동안 가라앉히도록 한다.
6 ㎖의 PBS-1 완충제를 첨가하고 반응 혼합물을 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 피펫에 의해 제거한다. 이러한 절차를 아홉 번 반복한다.
최종 세척 후, 상층액을 제거하고, 피브릴-항AFT 산물을 4 ℃에 저장한다.
6.22. 피브릴 매트의 사이클릭 볼타모그램:
피브릴 매트와 금 호일 전극의 비교
0.5 M K2SO4중의 사이클릭 볼타모그램의 6mM Fe3+/2+(CN)6을 측정한다. 도 30 A에서, (분산된) CC의 평평한 피브릴 매트에 대한 CV를 10, 25 및 50 mV/초에서 0.10 mA/cm으로 측정한다. 매트를 실시예 6.18에 기재된 바와 같이 제조한다. 도 30b에서, CV를 10, 25 및 50 mV/초에서 0.10 mA/cm으로 금 호일 전극에 대해 측정한다. 모든 전위는 볼트 대 Ag/AgCl이다.
6.23. 피브릴 매트 전극의 전기화학적 성질:
매트의 두께와 아노딕 피크 전류와의 비교
0.5 M K2SO4중의 사이클릭 볼타모그램의 6mM Fe3+/2+(CN)6을 동일한 기하 면적(0.20 ㎠)이지만 상이한 두께의 피브릴 매트에 대해 측정한다. 아노딕 피크 전류(도 31)은 두께에 대해 24 내지 425 ㎛의 매트의 두께가 증가함과 함께 증가한다. 각각의 두께에 대해, 아노딕 피크 전류는 또한 (10 내지 150 mV/초 범위의) 스캔율이 증가함과 함께 증가한다. 두께의 작용으로서의 아노딕 피크 전류의 증가율은 또한 두께를 증가시킴과 함께 증가한다. 24 ㎛ 두께의 피브릴 매트는 금 호일 전극에 비하여 행동한다.
6.24. 단백질의 피브릴에의 비-특이 결합
단백질의 탄소 피브릴에의 비-특이 결합을 하기와 같이 측정한다 : i) Ru(bipy)3 2+("TAG1") 표지된 단백질의 용액을 평형에 도달할 때까지 탄소 피브릴의 기지량에 노출시킨다 ; ii) 비표지-단백질/피브릴 용액을 원심분리하고, 상층액을 수집하고, iii) 비표지-단백질의 상층액에서의 잔여량을 전기화학발광(ECL)을 사용하여 분석한다.
도 32에 도시된 곡선을 생성하기 위해서, 유도된 TAG1 3 ㎍/㎖에 부착된 항-CEA 항체(항체 대 유도된 TAG1 ECL 표지에 부착된 카시노배 항원)을 0.1 M 칼륨 포스페이트 완충제의 CC(평평한) 피브릴의 연속적인 희석액에 첨가한다. 피브릴을 20분 동안 와동한 후 원심분리에 의해 제거한다. 상층액에 잔여하는 (비결합) 단백질 양을 측정하는 ECL 분석을 ORIGEN 분석 완충제로 5번 희석된 반응 혼합물 상층액의 분취량의 ORIGEN 1.5(IGEN, Inc.) 분석기에서 실행한다. (피브릴에 노출되지 않은 반응 혼합물의 대상에 대한 ECL 시그널에 대하여) ECL 시그널의 감소가 탄소 피브릴의 더 높은 농도가 존재할 경우, 유도된 TAG1으로 표지된 단백질의 증가된 결합으로부터 생성된다.
6.25. 세제/계면 활성제를 이용한 비특이적 피브릴 결합 단백질의 감소
실시예 6.2.4에 기술된 방법을 이용하여, 피브릴 결합 단백질에 대한 계면 활성제의 영향을 분석한다. 유도 TAG1/피브릴 혼합물에 부착된 안티-CEA에 트리톤 X-100을 가하고, 상기 용액을 20 분간 배양시키고, 튜브를 여과하여, 분취량의 상청액을 ORIGEN 정량 완충제로 5 회 희석하여 ECL에 의하여 분석한다. 결과를 하기의 표 1 및 도 33에 나타낸다.
튜브 번호 [T-X100]ppm 피크강도 Prot-TAG1μg/ml [GF]ppm
19 1674 1611 2.65 52
18 837 1634 2.65 52
17 418 1697 2.65 52
16 209 1583 2.65 52
15 105 1772 2.65 52
14 52 1463 2.65 52
13 26 627 2.65 52
12 13 23 2.65 52
용액 내의 유도 TAG1로 표지된 단백질의 ECL 강도 대 트리톤 X-100 농도를 도시한 결과 곡선을 도 33에 나타낸다. 높은 ECL 시그널은 상층액 내에 유도-TAG1-표지 단백질이 더 많음을 나타내는 것이며, 이는 피브릴에 결합된 유도-TAG1-표지 단백질이 더 적음을 나타내는 것이다. 10 ppm 내지 100 ppm의 농도의 트리톤 X-100은 결합 정도를 감소시킨다; 농도를 100 내지 2000 ppm으로 증가시키면 더 이상 결합 정도를 감소시키지 않는다.
6.26. 피브릴 매트 전극을 가진 용액 내의 자유 TAG의 ECL
도 34에 나타난 "피브릴 전지" 설비의 작동전극 홀더 3401의 정점 지역 3403 내에, 실시예 6. 18에서 제조한 피브릴 매트를 설치한다. 홀더 3401을 전기화학 전지 구획 3400의 바닥으로 미끄러지게 한다. 3 M Ag/AgCl 기준전극(Cyprus # EE008)을 기준 전지 홀 3402를 통하여 전기화학 전지 내에 설치한다. 전지를 정량 완충제( IGEN # 402-005-01 lot# 5298)로 충진시키고, PMT 홀더 3404에 부착시킨다. EG&G PARC 모델 175 만능 프로그래머 및 EG&G 모델 175 일정전위기/검류전위기를 이용하여, 전위를 100 mV/s로 0 V 내지 +3 V vs. Ag/AgCl로 스위핑한다. Pacific Instrument 모델 126 광도계에 의하여 900 V의 동력이 공급되는 Hamamatsu R5600U-01을 이용하여 ECL을 측정한다. HEM Snap-Master에 의하여 작동되는 CIO-DAS-1601 A/D 보드를 이용하여, 10 Hz에서 아날로그 데이타를 계수화한다. 피브릴 전지를 유출시키고, 1000 pM TAG1 (IGEN # 402-004-C lot# 4297)로 플러싱하고, 1000 pM TAG1으로 충진시킨다. 전위를 정량 완충제를 이용하여 스위핑한다. 정량 완충제 3501 및 1000 pM TAG1 3502에 대한 ECL 선(24.0 ± 0.2 ℃에서 측정)을 도 35에 나타낸다. 흑색으로 수정된 ECL 피크 면적은 정량 완충제에 대하여 22.10 nAs이며, 1000 pM TAG1에 대하여 46.40 nAs이다.
6.27. 피브릴 매트 전극을 이용한 흡착 표지된 항체의 ECL
피브릴 매트를 실시예 6. 18에 기술한 방식으로 평평한 cc-분산 피브릴로부터 0.0035 inch의 두께로 제조한다. 그리고 나서, 건조 매트를 3 mm 디스크로 펀칭하고, 지지체 상에 고정시킨다. 본 실험에 사용되는 지지체는 전도성 금 잉크가 프린팅된 스크린을 따라 만들어진 0.03 inch의 폴리에스테르로부터 제조된 것이다. 이러한 전도성 금 잉크는 카운터 전극, 기준전극을 형성하고, 작동을 위한 납과 기타 전극을 제공한다. 두 개의 피브릴 디스크를 전도성 테이프(Adhesives Reaserch)를 함유한 양면 탄소를 이용하여 각각 패턴화된 지지체 상에 고정시킨다. 고정시킨 후, 탈이온수 내의 유도 TAG1에 부착된 10 ㎍/ml의 항-TSH 항체 디스크 0.5 ㎕ (Ru-TSH mono 1:2 26JUN95, IGEN, Inc.) 또는 탈이온수 내의 10 ㎍/ml의 항-TSH unTAG1'ed 포획 항체 0.5 ㎕ (TSH poly 25JUN95, IGEN, Inc.)를 이용하여 점적하고, 건조시킨다. 건조 후, 매트를 IGEN 정량 완충제로 충진시킨다. 지지체 상에 충진된 매트를 IGEN Origen 1.5 기본 장치 내에 적재하고, 500 mV/s의 스캔 율로 0 내지 4500 mV의 ECL을 판독한다. 도 43은 매트 4301을 함유한 TAG1-항체로부터의 피크 ECL 시그널과 매트 4302를 함유한 unTAG1'ed 포획 항체를 대조한다.
6.28. 샌드위치 분석을 위한 피브릴 매트 전극을 이용한 ECL
상기와 같이 항-AFP 포획 항체를 피브릴 상에 고정시킨다. 항-AFP 피브릴을 탈이온수(dI) 내에서 세척하고, 1 mg/ml의 밀도로 재현탁시킨다. 실시예 6. 18에 기술한 바와 같이 진공 여과를 이용하여 네 개의 층의 피브릴 매트를 제조한다. 2 mg의 항-AFP 피브릴을 3 mg의 평평한 CC 분산 피브릴에 가하고, 혼합물을 dI 내의 전체 부피 20 ml로 희석시킨다. 희석된 혼합물을 0.45 ㎛ 나일론 필터 상으로 여과한다. 그리고 나서, 이러한 초기의 매트 층 다음에 각각 5 mg의 평평한 CC 분산 피브릴로 구성되는 두 개의 코어 층을 위치시킨다. 그리고 나서, 매트 코어의 상부에 초기 층과 동일한 혼합 피브릴 층을 위치시킨다. 이는 상부 및 하부 표면 상에 40%의 항-AFP 피브릴과 코어 내에 100%의 평 피브릴의 결과를 초래한다. 상기 혼합 매트를 진공하에서 공기 건조시키고, 3 mm 디스크로 펀칭한다. 그리고 나서, 실시예 6. 27에 기술한 바와 같이 상기 디스크를 지지체 상에 고정시킨다. 건조, 지지된 항-AFP 매트를 AFP 눈금 측정기 A, C 및 F로 충진시키고, 벤치 상부에서 실온하에 15 분 간 배양시킨다. 배양 후, 지지된 전극을 dI 증기로 10 초 동안 세척한 후, 린트 프리 와이프로 건조되도록 닦아낸다. 그리고 나서, 피브릴 매트를 유도 TAG1 (IGEN, Inc.)로 표지된 항체에 부착된 항-AFP로 충진시키고, 벤치 상부에서 실온하에 15 분 간 배양시킨다. 배양 후, 지지된 전극을 dI로 세척하고, 와이프로 건조시킨다. 그리고 나서, 피브릴 매트를 IGEN 정량 완충제로 충진시키고, 실시예 6. 27에 기술한 바와 같이 판독한다.
6.29. 폴리아크릴아미드 표면 상에서 TAG1 표지 아비딘의 ECL 검출
공지의 조건(암모늄 퍼설페이트 및 TEMED로 개시)을 이용하여, 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드와 N-아크릴로일-N'-바이오티닐-3,6-디옥소옥탄-1,9-디아민 (트리(에틸렌 글리콜) 링커를 통하여 아크릴아미드 부분에 결합된 바이오틴)을 공중합함으로써, 공유 결합 바이오틴을 함유한 가교 폴리아크릴아미드 겔을 제조한다. 본 실험에서, 세 단량체의 농도는 각각 2.6 M, 0.065 M 및 0.023 이다(이러한 아크릴아미드 및 비스-아크릴아미드의 농도는 대부분의 단백질보다 구멍 크기가 작은 겔을 생성하는 것으로 보고되었다). 약 0.7 mm의 거리를 둔 두 유리 판 사이에 단량체를 함유한 용액의 중합은 동일한 두께의 슬랩 겔을 형성시킨다. 중합 반응의 완결 후, 네 개의 PBS 체인지 내에 겔을 침지함으로써 비함침 바이오틴을 세척하여 제거시킨다. 유도 TAG1 표지 아비딘( 본 실험에서는 NeutrAvidin이라 언급되는, NSB 감소를 위하여 변형된 아비딘을 사용한다)을 PBS 내 50 ㎍/mL의 농도로 단백질을 함유하는 용액 내에 20 분 간 침지함으로써 겔 표면에 결합시킨다. 그리고 나서, ECL 정량 완충제(200 mM 인산 나트륨, 100 mM 트리프로필아민, 0.02% (w/v) Tween-20, pH 7.2)의 네 개의 체인지 내에 겔을 침지함으로써, 과량의 TAG1-표지 아비딘을 세척하여 제거시킨다. 도 39에 도시한 바와 같이, 겔을 유리 지지체(1903) 상에 패턴화된 금 작동 (3901) 및 카운터 전극(3902)과 접촉하도록 위치시킨다. 500 mV/s의 비율로 두 전극을 통하여 0.0 에서 3.0 V로, 다시 0.0 V로 전압을 램핑시키면 겔 위에 위치한 PMT(3904)로부터 측정된 ECL 광 시그널이 유도된다. 아크릴아미드 유도체를 함유한 바이오틴을 포함하지 않고 제조된 겔은 ECL 시그널을 보이지 않는다(도 41). 바이오틴 함유 중합체에 대하여 얻어진 시그널은 완전한 단백질 단일층이 겔 표면 상에 존재함을 암시한다.
6.30. 폴리아크릴아미드 표면 상의 ECL 샌드위치 면역분석
실시예 6. 29에 기술한 바와 같이, 공유 결합된 바이오틴을 함유하는 가교 폴리아크릴아미드 겔을 제조한다. 겔 표면에 스트렙트아비딘을 흡착하여, 바이오틴 표지 종을 포획할 수 있는 결합영역을 형성시킨다. 상기 표면을, 트리프로필아민, 미지의 농도의 분석물, 분석물에 대한 바이오틴 표지 항체, 및 분석물에 대한 상이한 ECL TAG1 표지 항체를 함유한 용액으로 처리한다. 분석물의 존재는 분석물 복합체 및 스트렙트아비딘 표면 상에 포획되는 두 항체의 형성을 야기시킨다. 실시예 6. 29에 기술된 바와 같이, 표면 상에 존재하는 2 차 항체에 결합된 ECL 표지를 측정한다.
6.31. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서 다수 ECL 샌드위치 면역분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 소량의 패턴화된 예비 중합체를 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 2 차 항체를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.32. 전극 상에 지지된 폴리아크릴 표면 상에서의 다수 ECL 경쟁 면역학적 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 생성되는 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적(droplet)을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 분석물의 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 아날로그를 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리(예를 들면, 결합영역에의 결합을 위하여 경쟁 ECL-TAG1 표지 및 표지되지 않은 분석물를 설치)함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.33. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상의 전지 결합을 위한 다수의 ECL 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-TAG1 표지 2 차 항체 및/또는 기타 분석물 특이성 결합시약을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.34. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서 분석물의 전지에의 결합을 위한 다수 ECL 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 ECL-Tag 표지 2 차 항체 및/또는 기타 분석물 특이성 결합시약을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.35. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 다수 ECL 경쟁 하이브리드화 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 표면에 결합을 위하여 해당 분석물과 경쟁할 수 있는 ECL-TAG1 표지 서열을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.36. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 다수 ECL 하이브리드화 샌드위치 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 표면 결합 탐침과 보족성이 아닌 서열에서 분석물과 결합할 수 있는 ECL-TAG1 표지 서열을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 a-b에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.37. 전극 상에 지지된 폴리아크릴아미드 표면 상에서의 상이한 유형의 다수 분석
공지된 방법에 따라 1 내지 2 미크론 두께의 노출, 현상된 감광성 내식막 마스터를 제조하여, 배열 내에 원형 침강의 유형을 생성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 대응 SYLGARD 184 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 다음, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD 를 실리콘 마스터로부터 제거한다. 생성되는 탄성 스탬프를 에탄올 내에 히드록실 말단 티올 HS-(CH2)11-(OCH2CH2)3-OH (1 내지 10 mM)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 잉킹하고, 정렬된 금 기질과 접촉시킨후, 제거한다. 상기 기질을 티올 HS-(CH2)10-CH3(에탄올 내에 1 내지 10 mM)을 함유한 용액으로 수 초 동안 세척한다. 그리고 나서, 결과적인 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림 하에서 건조시킨다. 디옥산 내에 아크릴로일 클로라이드 및 트리에틸아민을 함유한 용액으로 표면을 처리하면, 아크릴레이트 그룹을 가진 히드록실 말단 영역이 작용화된다. 아크릴아미드, 비스-아크릴아미드, N-아크릴로일숙신이미드, 아조-비스-시아노발레 산, 및 아미노기를 제시하는 항체의 혼합물을 함유한 모세관 배열을 아크릴레이트 말단 영역으로 모세관을 정렬하는 정렬된 표면과 접촉시켜, 특이적 항체를 각 영역에 함유하는 예비 중합체 용액을 위치시킨다. 모세관 배열 내의 각 모세관은 상이한 해당 분석물 특이성 항체를 함유한다. 패턴화된 예비 중합체 적을 UV 선에 노출시키면, 표면의 결합영역을 제시하는 기질 상에 가교 겔을 형성한다. 트리프로필아민과 결합영역에의 결합을 위하여 분석물과 경쟁할 수 있는 ECL-TAG1 표지 아날로그 및/또는 해당 분석물로의 ECL-TAG1 표지 2 차 결합시약을 함유하는 완충 용액 내에서 겔 표면 상에 제시된 하나 이상의 결합영역에 결합할 수 있는 분석물의 혼합물로 기질을 처리함으로써, 분석을 수행한다. 결합영역 (4200, 4201, 4202) (폴리아크릴아미드 상(4203) 금 전극 상(4232))을 도 42 A-B에 도시하는 바와 같이 ITO 작동전극(4204)과 근접하여 위치시킨다. 각 결합영역으로부터 발산된 광을 CCD 카메라를 이용하여 분석하고, 시료 용액 내에 포함된 내부 표준에 대한 결합영역과 비교한다.
6.38. 고도의 가역적 ECL
다결정성 금 전극(Bio-Analytical Services로부터 구입, 2 mm2)을 0.5 ㎛ 및 0.03 ㎛ 알루미나 슬러리로 연속적으로 핸드 폴리싱한 다음, 1:3 H2O2/H2SO4내에서 화학적으로 부식시키고, 희석된 H2SO4내에서 -0.2 V 내지 1,7 V vs. Ag/AgCl 사이에서 전기화학적으로 사이클링함으로써 세척한다. 세척된 전극을 밤새 에탄올 내에 용해되어 있는 희석된 옥틸티올 (C8SH) 용액 내에 침치시킨다. C8SH-변형 전극을, 인산 완충염(PBS, 0.15 M NaCl/0.1 M NaPi, pH 7.2)내에 용해되어 있는 20 ㎕의 TAG1-표지 송아지 혈청 알부민(BSA)으로 피복하고, 표면을 10 분 간의 배양 후에 동일한 완충제로 세척함으로써 단백질 흡착을 수행한다.
ECL을 Ag/AgCl 기준전극, 백금 전선 카운터 전극 및 EG&G 283 일정 전위기가 구비된 3-전극 전지 내에서 ECL을 수행한다. 전기화확 전지의 하부에 위치한 Pacific Instrument 광도계 및 Hamamatsu 광전자 증배관으로 빛의 강도를 측정한다. 흡착된 단백질을 0.1 M TPA 및 0.2 M 인산염, pH 7.2 의 용액 내에 침지한다. 전극 전위를 0.0 V 에서 1.2 V사이로 사이클링하면, 고도의 가역 ECL 반응(전후방의 스캔 상에 실질적으로 유사한 강도)이 관찰되며, 도 44a에 도시하는 바와 같이 이는 ECL 과정의 가역 특성 및 전극 상의 티올과 단백질 층의 안정성을 가리키는 것이다.
PMT 와 감광계를 사용하지 않고 ECL에서와 동일한 설비 상에서 순환 전압 전류 실험을 수행한다. 실험에서, C8SH 피복 전극(단백질 없음)을 1 mM 포타슘 페리시아나이드 용액 (PBS 내의) 내에 위치시키고, 전극을 +0.5 V에서 1.2 V로 또한 반대로 스캐닝한 다음, +0.5 V 내지 -0.3 V 사이에서 다른 사이클링을 행한다. +0.5 V 에서 -0.3 V 사이의 볼타모그람(voltammogram) 내에 용량성 전류만이 있고 페리시아나이드의 유도 전류가 존재하지 않으므로, 이는 단일층이 여전히 손상되지 않은 것이며 1.2 V에서 탈착하지 않음을 나타내는 것이다(도 44b).
6.39. 준-가역적 ECL
상기한 바와 동일한 방식으로 전극 변형 및 단백질 흡착을 행한다. ECL 실험에서, 전위를 0.0 V 에서 1.5 V사이로 스캐닝하고, 상응하는 광의 강도를 기록한다. 도 45a에 도시하는 바와 같이, 상이한 사이클뿐 아니라 동일한 사이클의 전후방 스캔 간에 약간의 ECL 손실이 있다. 1.5 V에서 산화 후, 페리시아나이드 내의 티올/Au의 순환 볼타모그람은 상당량의 유도 전류를 보이며, 이는 1.5 V에서 티올 단일층의 적어도 부분적 탈착을 가리키는 것이다(도 45b).
6.40. 비가역적 ECL
본 실험에서는, 실시예 6. 38과 동일한 방식으로 전극 변형 및 단백질 흡착을 수행한다. ECL을 측정하기 위하여, 전극 전위를 2.0 V 까지 상승시켰다가 0.0 V로 하강시켜 스캐닝한다. 전방의 스캔 상에서 강렬한 광이 발견되나(실시예 6. 38에서의 가역적 조건하에서 관찰된 것보다 다량), 이는 도 46a에 도시하는 바와 같이 역 스캔 상에서 백그라운드으로 떨어진다. 2.0 V에서의 산화가 대부분의 티올 단일층을 나타낸 후, 페리시아나이드 내의 변형된 전극의 순환 볼타모그람이 탈착된다(도 46b).
6.41. 패턴화된 금 전극 상에 고정된 1 차 항체를 이용한 ECL 샌드위치 면역학적 분석
본 실험에서는, PSA의 면역학적 분석에의 사용을 위하여, 프로스트레이트(prostrate) 특이성 항원(PSA)에 대한 항체를 패턴화된 금 전극 상에 고정시킨다.
1 내지 2 미크론 두꼐의 노출, 현상된 감광성 내식막을 공지된 방법에 따라 제조함으로써 감광성 내식막이 제거되는 1 mm × 1 mm 정방형의 조각을 가지는 실리콘 지지체 상에 감광성 내식막 층을 형성한다. SYLGARD 실리콘 탄성체 184와 이에 상응하는 경화제의 10:1 혼합물을 마스터에 부은 후, 경화시킨다. 중합된 SYLGARD를 실리콘 마스터로부터 조심스럽게 제거한다. 생성되는 탄성 "스탬프"를 에탄올 내의 히드록시-말단 티올 HS-(CH2)11(OCH2CH2)3-OH 및 니트릴로트리아세트산 (NTA) 말단 티올 HS-(CH2)11(OCH2CH2)3OC(O)NH(CH2)4CH(CO2H)N(CH2CO2H)을 함유한 용액에 노출시킴으로써 "잉킹"한다. 잉킹된 스탬프를 금 기질과 접촉시키고, 제거시켜 1mm×1mm SAM을 형성시킨다. 기질을 수 초 동안 에탄올 내에 히드록시 말단 티올만을 함유한 용액으로 세척함으로써, 단백질의 외부 영역에의 비특이적 결합을 방지한다. 그리고 나서, 생성되는 표면을 에탄올로 헹구어 내고, 질소 스트림하에서 건조시킨다. NiCl2용액으로 표면을 처리한 다음, 항-PSA 마우스 단일클론의 결합영역을 제시하는 융합 단백질 및 펩티드 (His)6를 함유하는 용액으로 처리하면, 조절된 방식으로 표면 상에 융합 단백질이 고정된다. 이러한 방법은 표면 상에 재생산할 수 있고 예측 가능한 양의 고정된 단백질을 생산한다. 표면 상에서 단백질의 방향은 융합 단백질의 1 차 구조 내의 (His)6서열의 위치에 의하여 조절된다. 고정된 단백질의 실제적인 양은 스탬프 SAM 내의 NEA 말단-티올 대 히드록시-말단 티올의 비율 및 스탬프 특성의 표면적에 의하여 조절된다. 혈청 내의 공지 농도(1 fM 내지 1 uM의 농도)의 PSA를 함유하는 용액을 제조함으로써, PSA에 대한 검정 곡선을 결정한다. 상기한 바에 따라 제조된 다수의 표면을 PSA 검정 표본으로 처리한 다음, PSA에 대한 최적 농도의 2 차 항체를 함유하는 용액(TAG1의 유도체로 표지)으로 처리한다. 표면을 0.1 M TPA 및 0.2 M 인산염(pH 7.2)을 함유하는 용액 내에 침지시키고, 전기 전위가 금 표면에서 0.5V/초의 스캔율로 0.0 에서 2.0 V 사이를 순환할 때 발산되는 광의 피크 강도를 측정함으로써 검정 곡선을 결정한다. PSA 농도가 검정 곡선을 참조하여 피크 ECL 시그널로부터 계산되는 점을 제외하고는 동일한 방법으로 샘플의 혈청 내 미지 농도의 PSA의 측정을 수행한다.
6.42. 스트렙트아비딘으로 코팅된 에어로실-200 실리카 입자의 제조
에어로실-200(미국 오하이오 아크론의 Degussa Corporation), 12 ㎚의 입자 크기를 지닌 훈증 실리카 및 175-220 ㎡/g의 활성 표면적을 화학적으로 개질시켜 NHS 에스테르 그룹을 도입한다. 개질은 세 단계를 수반한다: i) 아미노기를 3-아미노프로필트리메톡시실란과 반응시켜 입자의 표면에 도입한다. 에어로실-200(155.5 ㎎)을 5 mL의 톨루엔에서 3-아미노프로필트리메톡시실란(513 ㎎)과 합치고 1시간 동안 환류시킨다. 실리카 입자를 4 mL의 톨루엔으로 2회, 4 mL의 메탄올로 3회 및 4 mL의 디클로로메탄으로 3회 세척한다. 각각의 세척은 현탁물의 원심분리에 이어 프레쉬 용매에서 펠렛의 재현탁으로 구성된다; ii) 아미노기를 숙신산 무수물과 반응시켜 표면에 카복실산 그룹을 도입한다. 55.2 ㎎의 세척된 입자를 3 mL의 무수 DMF에서 재현탁시킨다. 숙신산 무수물(102 ㎎)과 트리에틸아민(0.025 mL)를 첨가하고 현탁물을 16시간 동안 교반한다. 추가 숙신산 무수물(50 ㎎)을 첨가하고 반응을 또다시 3시간 동안 진행시킨다. 입자를 DMF로 2회, 메탄올로 1회, 및 디클로로메탄으로 2회 세척시켜 과량의 시약을 제거한다; iii) 표면상의 카복실산 그룹을 NHS와 에틸-3-디아미노프로필카보디이미드(EDC)를 반응시켜 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 에스테르의 형태로 활성화시킨다. 입자(25.1 ㎎)를 3 mL의 메틸렌 클로라이드에서 재현탁시킨다. NHS(64 ㎎) 및 EDC(110 ㎎)를 첨가하고 현탁물을 3시간 동안 교반한다. 입자를 디클로로메탄으로 3회 세척하고 진공하에 건조시킨다.
활성화된 실리카 입자는 활성화된 입자의 표면상에서 단백질과 HNS 에스테르를 반응시켜 스트렙트아비딘으로 코팅한다. 입자(∼ 1.5 ㎎)를 pH 7.85, 포스페이트로 완충된 염수(PBS)에서 0.750 ㎎의 스트렙트아비딘을 함유한 용액에 첨가한다. 반응을 16시간 동안 진행시킨다. 입자를 PBS 및 물로 세척하고 PBS에서 재현탁시켜 입자를 함유한 공급 현탁물을 0.1 ㎎/mL의 농도로 생성한다.
6.43. 입자-기본 ECL 분석에 유용한 스테인레스강 여과지 지지체상에서 피브릴 매트의 형성
탐침 초음파처리기(미국 커네티컷 덴버리에 소재하는 Branson Ultrasonic Corp.)를 이용하여 15분간 CC 피브릴 현탁물(수중 0.2% 트리톤 X-100 중의 0.1 ㎎/mL)의 초음파 처리로 피브릴 잉크를 형성한다. 현탁물은 스테인레스강 여과지의 디스크(GA-4, Baekart Fibre Technologies)상의 1/8" 직경의 원형 구역상으로 부드러운 흡입을 이용하여 여과된다. 이 방법으로 형성된 매트의 두께는 첨가된 피브릴 잉크의 대략 1㎛/mL이다.
6.44. 피브릴 매트상에 포획된 스트렙트아비딘-코팅된 비드를 이용하여 AFP에 대한 입자-기본 ECL 분석
AFP 분석을 하기의 단계를 이용하여 진행한다: i) 현탁물에서 비드의 표면상에 샌드위치 면역 복합체의 형성; ii) 스테인레스강 여과지상에 지지된 피브릴 매트상으로 비드의 여과; 및 iii) 피브릴 전극을 산화 전위로 스캐닝하여 면역 복합체중의 TAG1-표지된 항체로부터 ECL 검출. AFP 분석 키트(Boehringer-Mannheim)를 이용하여 분석을 행한다. 이 분석 키트는 Elecsys System(Boehringer-Mannheim)을 이용한 ECL-기본 분석을 위해 고안된 것으로; 이 시스템은 자기장의 적용에 의해 백금 전극상의 자기 비드를 포획한다. 분석 키트는 하기 공급 용액을 포함한다: 스트렙트아비딘-코팅된 자기 비드(M-280, Dynal Inc.)를 함유한 현탁물, 바이오틴-표지된 포획 항체(R-1), TAG1-표지된 2차 항체(R-2), 및 혈청과 비슷하게 고안된 매트릭스에 용해된 AFP를 함유한 일련의 검정체.
분석용 검정곡선을 결정하기 위해, 스트렙트아비딘-코팅된 비드(∼0.012 ㎎의 비드를 함유한 0.017 mL)의 공급 현탁물을 플라스틱 튜브에서 R-1(0.017 mL), R-2(0.017 mL), 및 AFP 검정체(0.010 mL)를 함유한 공급 용액과 합친다. 튜브를 와동시킨 다음 30분간 실온에서 부드럽게 교반한다. 실시예 6.43에 기술된 것과 같이 형성된 피브릴 매트(매트 두께 = 0.030 ㎜)상으로 부드러운 흡입을 이용하여 현탁물을 여과시킨다. 매트를 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세척한다. 실시예 6.26에 기술된 바와 같이 ECL을 측정한다. 각각의 검정체를 3개로 실행한다. 도 48은 AFP 농도의 함수에 따른 백그라운드 보정된 ECL 시그널을 도시하고 있다.
6.45. 피브릴 매트상에 포획된 스트렙트아비딘-코팅된 실리카 비드를 이용하여 AFP에 대한 입자-기본 ECL 분석
스트렙트아비딘으로-코팅된 실리카 입자(Aerosil-200, 실시예 6.42에 기재된 바에 따라 제조)를 AFP 분석 키트가 제공된 자기 비드 대신 이용되는 것을 제외하고는 AFP 분석은 실시예 6.44에 기술된 바에 따라 진행된다. 분석용 검정곡선을 결정하기 위해, 스트렙트아비딘으로 코팅된 에어로실-200(0.001 ㎎의 입자를 함유한 0.010 mL)의 공급 현탁물을 플라스틱 튜브에서 R-1(0.017 mL), R-2(0.017 mL), 및 AFP 검정체(0.010 mL)를 함유한 공급 용액과 합친다. 튜브를 와동시킨 다음 30분간 실온에서 부드럽게 교반한다. 실시예 6.43에서 기술된 바에따라 형성된 피브릴 매트(매트 두께 = 40 mm)상으로 부드러운 흡입을 이용하여 현탁물을 여과시킨다. 매트를 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세척한다. 실시예 6.26에 기술된 바와 같이 ECL을 측정한다. 각각의 검정체를 3개로 실행한다. 도 49는 AFP 농도의 함수에 따른 백그라운드 보정된 ECL 시그널에 관해 도시하고 있다.
6.46. 피브릴 매트 전극상에 포획된 형광 염료로 표지된 라텍스 비드에서 발산된 ECL
본 실시예는 비드상으로 혼입된 형광 염료가 비드-기본 ECL 분석에서 내적 표준으로 이용될 수 있음을 보여주는 실험에 관해 기술하고 있다. 3가지 형태의 형광 비드를 Polysciences Inc.에서 구입한다. 비드는 혼입된 염료의 여기 및 방출 파장에서 차이가 난다: i) Catalog # 17685 (1ex= 273 ㎚, 1ex=340 ㎚). ii) Catalog # 19392 (1ex= 530 ㎚, 1ex=590 ㎚). iii) Catalog # 17797 (1ex= 641 ㎚, 1ex=740 ㎚). 피브릴 매트를 실시예 6.43에 기술된 바에 따라 제조한다. 형광 비드(0.010 ㎎)를 부드러운 흡입을 이용하여 매트상으로 여과시킨다. 매트를 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세척하고 ECL을 실시예 6.26에 기술한 바에따라 측정한다. 각각의 비드는 3가지로 시험된다. 세가지 비드 모두 이러한 조건하에 ECL을 발산한다. Polyscince catalog # 17685, 19392, 및 17797 비드의 경우에 측정된 평균 총 ECL 시그널은 각각 0.7 nA·s, 6 nA·s, 및 2.3 nA·s이다.
6.47. 금 전극상에 포획 항체를 고정화시키기 위해 바이오틴-스트렙트아비딘 포획을 이용한 AFP에 대한 ECL 샌드위치 면역분석
본 실시예에서는, 알파-페토단백질(AFP)에 대한 항체를 면역분석에 유용한 금 전극상에 고정화시킨다.
유리 슬라이드(1 ㎝ x 1 ㎝ x 0.06 ㎝)를 열 휘발에 의해 얇은 금 필름을 지닌 한쪽 측면에 코팅한다. 3 ㎚의 Ti에 이어 100 ㎚의 Au(99.99%)를 휘발시켜 금 필름을 접착층의 형태로 형성한다. 대략 10시간 동안 머캅토운데카노산을 함유한 에탄올 용액에 1 mM의 농도로 슬라이드를 배양하여 자가-삽입된 단일층(SAM)을 금 필름상에 형성한다. SAM의 표면에 제공된 카복실산 그룹을 10분간 0.05 mL의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 수용액 각각 0.2M 및 50 mM의 농도로 처리하여 활성화시킨다. 표면을 물로 간단히 세척한다. 스트렙트아비딘을 포스페이트로 완충된 염수(PBS)에서 0.3 ㎎/mL의 농도로 스트렙트아비딘 용액을 함유한 0.05 mL의 용액으로 60분간 표면을 처리하여 활성화된 표면상에 고정화시킨다. 표면을 pH 8.5, 1M의 에탄올아민을 함유한 0.08 mL의 수용액을 첨가하여 차단시킨다. 30분간 배양한 후 칩을 HBS/p20(10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, pH 7.4)으로 세척한다.
AFP 분석 키트(Boehringer-Mannheim)는 인간 혈청과 유사하게 고안된 인공 매트릭스 중에 바이오틴으로 표지된 1차 항체의 공급 용액(0.007 ㎎/mL), TAG1-표지된 2차 항체의 공급 용액(0.012 ㎎/mL), 및 5개의 검정 용액으로 구성된다. 이들 시약으로 분석 조건을 최적화하지는 못한다. AFP 분석을 수행하기 위해, 0.020㎖의 1차 항체 공급물, 0.020 ㎖의 2차 항체 공급물 및 0.020㎖의 검정 용액을 합쳐 스트렙트아비딘으로 코팅된 슬라이드에 적용한다. 용액을 20분간 표면에서 배양한다. 표면을 HBS/p20(10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.005% Tween 20, pH 7.4)으로 세척한다.
ECL을 하기의 과정에 의해 슬라이드의 표면상에서 측정한다: 슬라이드를 전기화학 셀에 놓는다. 셀은 전기화학적으로 여기된 금 표면적(0.13 ㎠)으로 정의된 O-링을 함유한다. 셀은 또한 Pt 카운터 전극 및 Ag/AgCl 기준전극 및 금 필름에 전기적 접촉을 위함 장치를 함유한다. 셀을 광전자 증배관(PMT)하의 한정된 위치에 놓아두어 재생가능한 ECL 방출을 검출한다. ECL을 여기시키기 위해, 전극을 분석 완충제(0.1 M 트리프로필아민, 0.2 M 나트륨 포스페이트, 0.02%(중량/용적) Tween-20, pH 7.2)에 함침시키고 금 표면에서의 전위는 0.2 V/s의 속도로 0 V에서 2 V(vs. Ag/AgCl)로 증가한다. PMT에서 발생한 광전류를 스캐닝 동안 통합하여 nA·s의 단위인 ECL 시그널을 발생시킨다.
도 51은 ECL 시그널 대 용액에서 AFP의 농도와의 그래프를 도시하고 있다.
6.48. 금 전극상에 고정화된 탐침에 핵산 하이브리드화 검출
본 실시예에서 사용된 올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 정의한다:
SC1.2: 5' ca gtt gtg tgc cac cta caa 3' C6 디설파이드 개질제
SC2.3: 5' ttg tag gtg gca cac aac tg 3' C3 아미노 개질제
SC4.1: 5' TAG1-gaa-aat-gtg-ctg-acc-gga-cat-gaa-aat-gag 3'
올리고뉴클레오티드를 Oligos Etc. Inc.에서 구입한다. SC2.3는 NHS 에스테르(NHS-TAG, IGEN Inc.)를 제공하는 TAG1 유도체와 반응시켜 TAG1으로 표지된다. pH 7.4의 PBS 0.100 ㎖(130 nmole) 중의 SC2.3는 TAG-NHS-에스테르의 0.5 ㎎ 바이얼 중의 DMSO 0.400 ㎖와 합쳐진다. 용액을 혼합하고 실온의 암실에서 밤새 배양한다. 밤새 배양한 다음 표지링 반응을 1.380 ㎖의 탈이온수로 희석시킨다. 5 M(0.120 mL)의 농도로 나트륨 클로라이드를 함유한 수용액에 이어 0.120 mL의 무수 에탄올을 첨가한다. 이 용액을 70℃에서 적어도 1시간 동안 배양시켜 산물을 침전시킨다. 표지된 올리고뉴클레오티드를 10℃에서 10분간 5000 x g으로 원심분리한다. 생성된 펠렛을 물에 70%(용적/용적)의 에탄올 용액 0.25 mL로 2회 세척한다. 세척된 펠렛을 진공하에 건조시키고 -20℃에서 암실에 보관한다. SC4.1 올리고뉴클레오티드의 제조자는 TAG1의 포스포르아미디트 유도체(IGEN, Inc.)와 반응시켜 올리고뉴클레오티드 합성 동안 TAG1을 지닌 탐침을 표지링한다.
유리 슬라이드(1 ㎝ x 1 ㎝ x 0.06 ㎝)를 열 휘발에 의해 얇은 금 필름으로 한 측면상에 코팅한다. 접착층으로 4 ㎚의 Ti에 이어 200 ㎚의 Au(99.99%)를 휘발시켜 금 필름을 형성한다. 플라스틱의 블록을 통해 드릴된 구멍을 향하게, 0-링 을 지닌, 슬라이드를 밀봉시켜 금 필름위에 웰을 형성한다. O-링은 용액과 접촉하는 금 필름 영역(0.25 ㎠)을 말한다. 각각의 웰에 0.010 ㎎의 올리고뉴클레오티드(10 mM 암모늄 아세테이트, pH 6.0)를 함유한 용액 0.050 mL를 첨가시켜 올리고뉴클레오티드 SC1.2를 금 필름의 표면상에 고정화시킨다. 고정화는 암 건조기에서 밤새 진행되고, 이 시간 동안 올리고뉴클레오티드를 함유한 용액을 건조되도록 휘발시킨다. 탈이온수로 여러번 세척하여 과량의 시약을 제거한다.
금 슬라이드의 표면상에 올리고뉴클레오티드의 예비하이브리드화는 SSC 용액 성분(1배), Denhardts 용액 성분(1배), 이스트 tRNA(0.100 ㎎/mL), 및 초음파 처리된 헤링 스펌 DNA(0.050 ㎎/mL)를 함유한 0.050 mL 용액을 첨가시켜 달성된다. 슬라이드를 실온에서 30분간 격렬하게 교반한다. 예비하이브리드화 단계에 이어, 슬라이드를 SCC로 세척하고 TAG1-표지된 SC2.3(표면에 고정화된 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드), 또는 TAG1-표지된 SC4.1(비-특이 결합을 시험하기 위해 음성 대조구로 사용된 비-상보성 탐침)의 (1 x 1012)분자량을 함유한 검정 용액으로 하이브리드화한다. TAG1-표지된 탐침을 예비하이브리드화를 위해 사용된 0.050 ㎖의 용액에 용액의 형태로 적용한다. 격렬히 교반하면서 하이브리드화를 실온에서 2시간 동안 진행시킨다. 금 슬라이드를 0.1%(중량/용적)의 SDS를 함유한 1배의 SDS로 3회 세척하고, 실온에서 30분간 동일한 완충제로 배양한 다음 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세정한다. ECL을 실시예 6.47에 기재된 바와같이 금 필름의 표면으로부터 여기시킨다. ECL을 또한 TAG1-표지된 탐침에 노출되지 않는 표면에서 여기시켜 백그라운드 시그널의 크기를 측정한다. 상보적인 탐침으로부터 백그라운드 조정된 시그널값은 330 x 103nA·s로, 이는 TAG1-표지된 탐침이 표면에 하이브리드화되고 ECL에 의해 검출될 수 있음을 보여준다. 비-상보성 탐침에서 나온 백그라운드 조정된 시그널값은 -2.2 x 101nA·s이고, 이는 비-상보성 탐침의 결합이 특이적이고 비-특이적인 결합이 낮음을 보여준다.
6.49. 피브릴과 EVA를 함유한 복합전극 시이트의 제조
피브릴을 중합체와 화합시키고 화합된 물질을 시이트로 압축 성형시켜 복합전극을 제조한다. 180℃의 온도 및 100 r.p.m.의 속도로 쌍나사 조절 헤드를 지닌 Brabender Plasticorder을 이용하여 피브릴을 EVA로 화합시킨다. 9.45 g의 피브릴을 25.55 g의 EVA(Quntum Chemical, Microthene, FS-532)와 건조 블렌딩한다. 블렌드된 물질을 1분간 혼합 헤드에 첨가하여 물질을 용융시킨다. 추가 5분간 혼합을 계속 수행한 다음 복합체를 혼합 헤드에서 옮겨와 냉각시킨다. 전극으로 유용한 복합체 시이트의 제조를 위해, 2 g의 화합된 물질 조각을 조립해 두개의 폴리싱된 스테인레스강 플레이트(3중 플레이트된 페로타입 플레이트, Testrite Company) 사이에 샌드위치시키고 조립체를 수압 프레스(Carver)에서 180℃로 가열된 플래튼 세트 사이에 놓는다. 물질이 가열되도록 시간을 부여한 후, 복합체를 1000 파운드의 총압으로 압축시켜 평면 시이트로 만든다. 조립체를 프레스에서 옮겨와 실온으로 냉각한다. 조립체를 분리하고 20 mil의 노말 두께를 지닌 평면 디스크를 제거한다.
6.50. 크롬산에 의한 피브릴-중합체 복합체의 산화
에틸 비닐아세테이트를 지닌 탄소 피브릴(27 중량%)(피브릴-EVA)과 폴리에틸렌을 지닌 탄소 피브릴(피브릴-PE)의 복합체를 사용한다. 대략 1 ㎜ 두께인 3" 디스크의 형태로 복합체를 수득한다. 실온에서 1시간 동안, 크롬산을 함유한 용액(CrO3, H2O 및 H2SO4(29/42/29; 중량/중량/중량))상에 디스크를 띄워 두가지 피브릴-EVA 및 피브릴-PE 복합체를 산화시킨다. 크롬산 용액과의 반응 후, 산화된 복합체를 탈이온수로 4-5회 세척하고, 탈이온수에서 적어도 5분간 함침한 다음 1시간 동안 공기에서 건조시킨다.
6.51. 황산과 질산 혼합물을 이용한 피브릴-중합체 복합체의 유도화
EVA 및 탄소 피브릴(3" 직경 평면 디스크의 형태)의 복합체를 1:1비(12 mL)의 황산과 질산 혼합물로 3시간 동안 처리한다. 처리된 복합체를 물로 세척한다. 물(150 mL)과 암모늄 하이드라이드(30%, 150 mL)의 혼합물에서 처리된 복합체에 나트륨 디티오나이트(10 g)를 첨가한다. 반응 혼합물을 2시간 동안 환류시킨다. 복합체를 물로 광범위하게 세척한다.
6.52. 노출된 하이드록실 그룹을 지닌 피브릴 복합전극의 제조
복합체의 표면 및 이 근처에 아세테이트 그룹을 가수분해시켜 하이드록실 그룹을 피브릴-EVA 복합체상에 노출시킨다. 복합체 물질(EVA 중 27 중량% CC 피브릴)의 디스크(3" 직경, 0.01" 두께)를 실온에서 17-20시간 동안 2 M의 NaOH 용액 100 mL에 함침시킨다. 이러한 처리는 복합체의 두 측면상에 하이드록실 그룹을 노출시킨다. 복합체를 물과 메탄올로 세척한 다음 공기에서 건조한다.
6.53. 산화된 피브릴-중합체 복합체상에 스트렙트아비딘의 고정화
EVA-피브릴 복합체를 실시예 6.50에 기술한 바에 따르거나 산소 플라즈마에 노출시켜 산화시킨다. 산화된 3" 디스크 복합체를 진공 펌프하에 1시간 동안 건조시키고 0.1 M의 EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필(카보디이미드) 및 0.1 M의 N-하이드록시숙신아미드를 함유한 25 ㎖의 디클로로메탄에 밤새(교반과 동시) 함침시킨다. NHS로 활성화된 복합체를 디클로로메탄, 메탄올, 탈이온수 및 메탄올로 세척한 다음, 실온에서 건조시킨다.
스트렙트아비딘의 고정화를 위해, NHS로 활성화된 복합체를 탈이온수로 세정하고 6 mL의 스트렙트아비딘 용액상에 띄워 NHS-에스테르로 활성화된 표면을 아래로 향하게 한다. 스트렙트아비딘 용액을 PBS-1(0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M 나트륨 클로라이드, pH = 7.8)에서 0.7 ㎎/㎖의 농도로 제조한다. 복합체를 스트렙트아비딘 용액에서 3시간 동안 교반하고 0.1% Triton을 함유한 20 ㎖의 PBS-1에서 30분간(1회) 및 20 ㎖의 PBS-1에서 30분간(55회)교반시켜 세척한다. 스트렙트아비딘으로 로딩된 EVA 복합체를 4℃의 PBS-1에 보관한다.
6.54. SMCC 활성에 의한 피브릴-중합체 복합체상에서의 단백질 고정화
질산과 황산의 혼합물로 처리된 EVA-피브릴 복합체의 3" 직경 디스크(실시예 6.51에 따라)를 15 mL의 나트륨 포스페이트 완충제(0.1 M, pH 7.5)에 놓는다. 술포숙신이미디딜-4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트(술포-SMCC, 10 ㎎)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 배양한다. 반응을 멈추고 복합체를 나트륨 포스페이트 완충제로 세척한다. 0.1 M의 나트륨 포스페이트, 20 mM EDTA, pH 7.5(300 mL) 중의 스트렙트아비딘 용액(4.5 ㎎)에 Traut's 시약(19.8 mL, 2.8 ㎎/mL)를 첨가한다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 30분간 배양한다. 술프하이드릴-표지된 스트렙트아비딘을 PD-10(Pharmacia) 일회용 크기 배제 컬럼(3.5 mL 분획중에 수집된)을 이용하여 정제한다. SMCC-처리된 복합체(1인치, EVA CC 복합체의 질산화/환원에 의해 유도)를 술프하이드릴-표지된 스트렙트아비딘을 함유한 용액(3.5 mL)에 놓고 4℃에서 밤새 교반하면서 배양한다. 생성된 스트렙트아비딘-코팅된 복합체를 pH 7.5, 1% Triton X-100을 함유한 0.1 M의 나트륨 포스페이트에서 교반하면서 세척(5 x 20 분)한다.
6.55. 노출된 하이드록실 그룹을 제공하는 복합전극상에 스트렙트아비딘의 고정화
스트렙트아비딘을 표면 및 이 근처에 하이드록실 그룹을 제시하는 피브릴-EVA 복합체상에 고정화시킨다. 카보닐디이미다졸(CDI)로 하이드록실 그룹을 활성화시킨 후 단백질을 고정화한다. 하이드록실 그룹을 노출시키기 위해 (실시예 6.52에 기술된 과정에 의해) NaOH로 처리된 피브릴-EVA 복합전극을 진공하에 건조시킨다. 건조 복합체를 건조 유리병에서 50 mL의 무수 메틸렌 클로라이드에 함침시킨다. 용액에 100 ㎎(0.6 mmol)의 1,1'-카보닐디이미다졸(CDI)을 첨가하고 병을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔든다. 복합체를 메틸렌 클로라이드 및 메탄올로 세척한 다음 공기에서 건조시킨다. CDI로 활성화된 복합체를 3/16" 디스크(총 96개)로 커팅(펀치 사용)한다. 각각의 디스크를 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 바닥에 놓는다. 스트렙트아비딘(0.2 M 나트륨 비카보네이트 중 0.1 ㎎/mL 용액 100 mL, pH 8.5)을 각각의 웰에 첨가한다. 고정화를 4℃에서 18-20시간 동안 진행시킨다. 디스크를 pH 7.5에서, 50 mM의 나트륨 포스페이트 부위 100 ㎖에 함침시키고 사용시까지 pH 7.2에서 50 mM의 나트륨 포스페이트 100 mL에 보관시켜 3회 세척한다.
6.56. EVA 및 피브릴의 복합전극상에서 AFP 분석
EVA-피브릴 복합전극상에 고정화된 스트렙트아비딘을 지닌 EVA-피브릴 복합전극을 이용하여 AFP 분석을 수행한다(실시예 6.53에 기재된 바에 따라 제조). 1% BSA 용액(0.1 M 나트륨 포스페이트 중 1% BSA 및 0.3% Tween 20, pH = 6.8)으로 미리 차단시키고 분석 이전에, pH=6.8, 0.1 M 나트륨 포스페이트에서 0.3% Tween 20으로 1회 세정된 96개의 웰 플레이트에서 분석을 수행한다. 3/16"의 직경을 지닌 48개의 디스크를 3" 직경의 EVA-SA 복합체에서 펀칭하고 처리된 표면을 지닌 96개의 웰 플레이트에 놓는다. 50 ㎕의 바이오티닐화된 AFP 항체를 복합체를 함유한 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 30분간 교반한다. 복합체를 0.1 mL의 PBS-1으로 2회 세정하고 0.05 mL의 검정체 및 0.05 mL의 TAG1으로 표지된 항체의 혼합물과 함께 실온에서 1시간 동안 교반한다. 반응의 마지막 단계에, 복합체를 0.150 mL의 ECL 분석 완충제로 세정하고 ECL을 측정할 때까지 단백질 완충제(3% BSA, 3% Tween 20, 25 mM 나트륨 클로라이드 및 0.1 M 나트륨 포스페이트, pH = 7.3)에 저장한다. 본 출원인은 0.56 내지 7950 IU/㎖ 범위의 8개의 AFP 검정체를 사용한다. 각각의 검정체를 6개로 분석한다. 도 53은 그 결과를 도시하고 있다.
6.57. EVA 및 피브릴의 복합전극을 이용하여 TSH에 대한 ECL 분석
EVA-피브릴 복합체(실시예 6.55에 기재된 바에따라 제조)의 3/16" 직경의 스트렙트아비딘-코팅된 디스크를 이용하여 분석을 수행한다. 분석시약는 TSH 분석 키트(IGEN, Inc.)의 일부이고 각각 완충제에 용해된(TSH 분석 희석제), 바이오틴-표지된 항-TSH 항체 및 TAG1-표지된 항-TSH 항체를 포함한다. 디스크를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 개개 웰에 위치시킨다. 바이오틴-표지된 항체(0.05 ㎎, 0.012 ㎎/mL)를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 30분간 부드럽게 교반한다. 디스크를 TSH 분석 희석제로 세척한 후, TAG1-표지된 항체(0.025 mL, 600 ng/mL)를 함유하고 TSH의 양이 다른 용액을 첨가하고 플레이트를 37℃에서 또다시 60분간 교반한다. 디스크를 TSH 분석 희석제로 세척하고 ECL을 분석할 때까지 여기에 보관한다.
6.58. 피브릴-중합체 복합체상에서 DNA 하이브리드화 분석
본 실시예는 DNA 서열 분석에 관해 기술하고 있다. 분석은 바이오틴-표지된 포획 탐침(SC5), 분석물(SC3.1) 및 TAG1-표지된 탐침(SC4.1)을 포함한 스트렙트아비딘-코팅된 복합전극상에 샌드위치 복합체의 형성을 수반한다. SC3.1 및 SC4.1에 관해서는 실시예 6.48에서 기술하고 있다. SC5는 Oligos, Etc., Inc.에서 구입되고 서열 5'-ca gtt gtg tgc cac cta caa gca tta cgg act agt cat ggt tca cag agg-3'-바이오틴을 가진다. 산화된 피브릴-EVA 복합체를 실시예 6.53에서 기재된 바와 같이 EDC 및 NHS로 활성화시킨다. O-링을 이용하여, 플라스틱 블록을 통해 드릴된 홀을 향해 디스크를 밀봉시켜 3/8"의 복합체 디스크 위에 웰을 한정한다. O-링은 웰에 놓인 용액과 접촉하는 복합체 영역(0.25 ㎠)을 말한다. 각각의 웰에 0.5 ㎎/mL의 스트렙트아비딘 용액(PBS중) 0.05 mL를 첨가시켜 스트렙트아비딘을 디스크상에 고정화시킨다. 장치를 교반하면서 반응을 실온에서 3시간 동안 진행시킨다. 디스크를 PBS로 2회, 0.10%(중량/용적) Triton x-100을 함유한 PBS로 1회 및 PBS로 2회 이상 세척한다.
바이오틴으로 표지된 올리고를 포획하기 위해, 0.05 mL의 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)에 1013개의 SC5 분자를 첨가하고 격렬히 교반하면서 실온에서 2시간 동안 배양한다. PBS, 0.10%(중량/용적) Triton x-100을 함유한 PBS, 및 ECL 분석 완충제로 세척하여 과량의 SC5를 제거한다. ECL 분석 완충제에 SC4.1(0.025 mL 중 1012분자) 및 SC3.1(0.025 mL 중 다양한 양)을 첨가한다. 하이브리드화 반응을 4시간 동안 진행시킨다. PBS, 0.10%(중량/용적) Triton x-100을 함유한 PBS, 및 ECL 분석 완충제로 세척하여 과량의 시약을 제거한다. 디스크를 ECL 장치에 놓고 ECL 시그널을 측정한다. 도 54는 SC3.1 양의 함수에 따른 ECL 시그널을 도시하고 있다.
6.59. 피브릴-복합전극의 표면적 측정
복합전극의 표면에서 돌출된 피브릴 양을 이중층 콘덴서의 측정값에서 평가할 수 있다. 0.25 인치 직경의 복합체 디스크를 펀칭하고 구리 와이어를 전기 페인트에 부착시켜 하나의 표면에 전기 접촉을 행하여 전극을 제조한다. 노출된 구리 와이어를 에폭시에 밀봉한다. 전극을 사용하여 -0.2 V vs, Ag/AgCl 내지 +0.8 V vs. Ag/AgCl의 몇몇 전위 스캔율(예: 5, 10 및 25 mV/초)로 아르곤-퍼징된 0.5 M K2SO4에서 원형 볼타모그램을 기록한다. 이중층 전하 전류, Idl,을 원형 볼타모그램, 전형적으로는 +0.25 V vs. Ag/AgCl의 광범위한, 평면 영역에서 측정한다. Idl대 스캔율의 기울기는 이중층 콘덴서 Cdl의 형태로 취해진다. 10 ㎌/㎠의 피브릴 표면적, 및 200 M2/g의 피브릴 표면적의 평균값을 이용하여, 전해질에 노출된 피브릴의 양을 측정할 수 있다.
6.60. NHS 에스테르-작용화된 피브릴의 제조
N-하이드록시숙신이미드(NHS)(0.35 g) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)(0.60 ㎎)를 25 mL의 디옥산 중에 220 ㎎의 카복실화 피브릴(Hyperion Catalysts Inc.에서 제공)을 함유한 현탁물에 첨가하고 혼합물을 5분간 초음파 처리(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)한 다음 실온에서 밤새 교반한다. 소결 유리 깔때기에서 피브릴로부터 반응물을 진공 여과시켜 반응을 멈춘다. 피브릴을 디옥산(3 x 15 ㎖)으로 세척하고 메탄올을 진공하에 (광범위하게) 건조시켜 220 ㎎의 NHS 에스테르-활성화된 피브릴을 생성한다.
6.61. NHS 에스테르 피브릴로 스트렙트아비딘의 결합
NHS 에스테르-개질된 피브릴(2.1 ㎎, 실시예 6.60에 기재되 바에따라 제조)을 최하의 전압 세팅으로 5분간 400 ㎕의 PBS-1 완충제(0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M 나트륨 클로라이드, pH = 7.8)에서 초음파 처리(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)한다. 스트렙트아비딘 용액(150 ㎕ PBS-1 중 2.4 ㎎)을 분산된 피브릴 현탁물과 혼합하고 혼합물(650 ㎕)을 실온에서 3시간 동안 부드럽게 교반시킨다. 복수회의 반복 원심분리, 및 일련의 하기 완충제를 이용한 재현탁에 의해 피브릴을 세척한다: 1% Triton X-100을 함유한 0.1 M의 나트륨 포스페이트(1회), PBS=-1(2회), 1% Triton X-100을 함유한 0.1 M의 나트륨 포스페이트(1회), 및 PBS-1(4회). 스트렙트아비딘으로 로딩된 피브릴을 4℃의 PBS-1에 보관한다.
6.62. 나일론 막 필터상에 초박 피브릴 매트(UTFM)의 형성
0.1 ㎎/mL의 농도로 CC 피브릴을 함유한 수성 현탁물은 CC 피브릴의 공급 현탁물(수중 1 ㎎/mL)을 Triton X-100(0.2%(중량/용적)) 수용액 중으로 희석시켜 제조된다. CC 피브릴은 30%의 총효율 사이클을 이용한 5분간의 초음파 처리 및 출력 조절을 3 값으로 세팅시켜 CC 피브릴을 탐침 초음파 처리기(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)로 엷게 분산시킨다. 초음파 처리된 현탁물의 0.01 ㎎/mL의 농도로의 추가 희석은 Triton X-100 수용액을 이용하여 4 mL의 현탁물을 40 mL 이하의 용적으로 희석시켜 달성된다.
진공 여과(피브릴 매트의 여과 장치의 예로서 도 24 참조)에 의해 UTFM을 나일론막(0.45 ㎜ 구멍 크기, 47 ㎜ 직경)상에 제조한다. 대략 26 in.Hg의 진공을 이용하여 4 mL의 4개의 각 분취물에서 얇게 분산된 피브릴을 나일론막상에 여과시킨다. 단지 소량의 액체가 막 위에서 여과되지 않은 상태로 남을 때까지(육안으로 확인) 진공 여과를 계속한다. 매트를 여과 장치로부터 제거하고, 투명하고, 건조한 여과지 5장 중 2 장 사이를 압축시킨 다음, 60℃에서 대략 10-15분간 오븐에서 편평하게 건조시킨다.
사용된 용적을 상이한 면적 및/또는 두께의 전극의 경우에 따라 등급을 매긴다.
6.63. 이중층 초박 피브릴 매트 전극상에 핵산 하이브리드화 분석
실시예 6.61에 기술된 바에 따라 스트렙트아비딘을 분산된 CC 탄소 피브릴상에 공유적으로 고정화시킨다. 총 100 ㎍의 이들 피브릴을 1 ㎎/mL(중량/용적)의 농도로 BSA를 함유한 용액에 현탁시켜 피브릴상에 채워지지 않은 부위를 차단시킨다. 차단된 피브릴을 원심분리하고 1 mL의 탈이온수에 재현탁시킨다. 이 현탁물을 5분간 초음파 처리(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)에 의해 재분산시킨다.
실시예 6.62에 기술된 바와 같이 초-박 피브릴 매트(UTFM)를 제조한다. UTFM을 제조한 후, 실시예 6.62에 사용된 것과 동일한 조건하에 제 1 층상에 17 ㎕의 스트렙트아비딘-피브릴 현탁물을 여과시켜 제 2 층을 형성한다.
DNA 하이브리드와 분석을 수행하기 위해, 본 출원인은 상보적인 "TAGged" 올리고뉴클레오티드(28 염기쌍, TAG1-NHS 에스테르로 말단 표지됨)를 하이브리드화하는 "포획" 올리고뉴클레오티드(28 염기쌍, 5' 위치에 바이오티닐화됨)를 사용한다. 분석을 하기의 단계로 진행한다: i) 다양한 농도의 바이오틴-표지된 올리고 및 일정한 과량(1012분자)의 TAG1-표지된 올리고를 함유한 검정 용액을 제조하고; ii) 피브릴 매트에 스트렙트아비딘-코팅된 피브릴상으로 바이오티닐화된 복합체를 포획시키기 위해 50 ㎛/초의 유동률로 검정 용액(50 ㎕)을 초-박 피브릴 매트(하나의 UTFM/용액)를 통해 여과시키며; iii) UTFM을 50 ㎕의 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세척하여 비결합시약을 제거한 다음, iv) UTFM(및 부착된 올리고뉴클레오티드 복합체)을 측정 셀로 전달(도 34)하여 ECL을 측정한다. 도 55는 분석이 고 감도의 TAG1-표지된 올리고뉴클레오티드를 측정하고 광범위한 동태적 범위에 걸쳐 일련의 반응을 생성함을 보여주고 있다.
6.64. 이중층 초박 피브릴 매트 전극상에서 AFP에 대한 샌드위치 면역분석
스트렙트아비딘-코팅된(및 BSA-차단된) 피브릴 현탁물을 실시예 6.61에 기술된 바와 같이 제조한다. 현탁물을 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)에서 희석시켜 7 ㎎/mL의 피브릴 농도를 지닌 공급 현탁물을 생성한다. 용액을 빙욕(스트렙트아비딘의 변성 방지)에 두고 20%의 총효율 사이클을 이용하고 출력 조절을 1.5 값으로 세팅시켜 5분간 초음파 처리(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)하여 피브릴을 재분산시킨다.
진공 여과 장치를 이용하여 나일론 필터 막(0.45 ㎜ 구멍 크기)상에 이중층 UTFM 전극을 제조한다. 여과 장치는 여과가 일어나는 막상의 1/8"직경 영역으로 한정된다. 0.01 ㎎/mL의 농도로 유도되지 않은 피브릴을 함유한 87.5 ㎕의 얇게 분산된 현탁물을 여과시켜(흡입사용) 유도되지 않은 피브릴층을 형성한다(실시예 6.62에 기재된 바에따라 제조). 50 ㎕의 스트렙트아비딘-코팅된 피브릴의 공급 현탁물을 유도되지 않은 피브릴 층상으로 여과시켜 제 2 층을 형성한다.
AFP 분석시약(Elecsys, Boehringer-Mannheim)는 여과 직전에 50 ㎕의 바이오티닐화 AFP 항체의 공급 용액, 50 ㎕의 TAG1-표지된 AFP 항체의 공급 용액, 및 AFP의 공지 농도를 함유한 여러 공급 용액 중 10 ㎕ 하나를 합쳐 미리-혼합된다. 5 in. Hg의 진공 압을 이용하여 조절된 유동 속도로 흡입하여 합쳐진 용액을 여과시킨다. 각 샘플은 30 내지 50분 사이에 필터에 취해진다. 매트를 150 ㎕의 ECL 분석 완충제(IGEN, Inc.)로 세척하고, 제거한 다음 건조시킨다. 매트를 측정 셀로 옮기고(도 34) ECL을 측정한다. 도 56은 검정 용액에서 AFP의 농도의 함수에 따른 ECL 시그널을 보여준다.
6.65. 비-전도성 필터 막상에 전도성 금 필름의 형성
Whatman(0.45 ㎛ 구멍 크기)의 나일론 막 필터를 Balzers MED 010 Minideposition System을 이용하여 스퍼터링 금로 코팅한다. 아르곤 플라즈마(5 x 10-2mbar 압력에서) 및 100 mA의 방전 전류를 이용하여 침착을 수행한다.
6.66. 금-코팅된 나일론 필터막상에 형성된 초박 피브릴 매트 전극상에 AFP에 대한 샌드위치 면역분석
스트렙트아비딘-코팅된(및 BSA-차단된) 피브릴의 현탁물을 실시예 6.61에 기술된 바와같이 제조한다. 현탁물을 ECL 분석 완충제(IGEN,Inc.)로 희석하여 28 ㎎/mL의 피브릴 농도를 지닌 공급 현탁물을 생성한다. 용액을 빙욕(스트렙트아비딘의 변성 방지)에 두고 20%의 총효율 사이클을 이용하고 출력 조절을 1.5값에 세팅시켜 5분간 초음파 처리(Sonifier 250, Branson Ultrasonics)하여 피브릴을 재분산시킨다.
전도성 Au-코팅된 나일론 필터막(200 ㎚ 금 필름, 실시예 6.65에 기재된 바에따라 제조)에서 펀칭된 총 36개의 5/16" 직경 디스크를 커팅하여(홀 펀치 이용) 5/16" 직경 디스크를 형성한다. 디스크를 다수의 샘플 여과 장치의 웰 중에 두어, 동시에 96개의 샘플을 조절된 진공 압하에 여과시킨다. 이 장치는 각 디스크상의 3/16" 직경 원형 구역상으로 샘플을 여과시킨다. 82.5 ㎕의 스트렙트아비딘-코팅된 피브릴의 공급 용액을 디스크상으로 여과(26 in. Hg의 진공 사용)시켜 단일층 UTFM을 형성한다. AFP 분석시약(Elecsys, Boehringer-Mannheim)는 여과 직전에 50 ㎕의 바이오티닐화 AFP 항체의 공급 용액, 50 ㎕의 TAG1-표지된 AFP 항체의 공급 용액, 및 AFP의 공지 농도를 함유한 여러 공급 용액 중 10 ㎕ 하나를 합쳐 미리-혼합되어진다. 5 in. Hg의 진공 압을 이용하여 조절된 유동 속도로 흡입하여 합쳐진 용액을 여과시킨다. 각 샘플은 30분간 필터에 취해진다. 각 매트를 150 ㎕의 분석 완충제로 세척하고, 제거한 다음 3.0%의 BSA, 3.0% Tween-20, 25 mM NaCl, 및 100 mM NaH2PO4를 함유한 단백질 완충제에 보관한다. 매트를 측정 셀로 옮기고(도 34) ECL을 측정한다. 도 57은 검정 용액에서 AFP의 농도의 함수에 따른 ECL 시그널을 보여준다.
6.67. 두가지 상이한 전극상에서 AFP 분석: 시그널 및 백그라운드의 전압 전류 분석
두 복합전극상에서 AFP 분석을 전개한다. 27 중량% CC-피브릴을 함유한 에틸렌 비닐 아세테이트(EVA) 공중합체로부터 두가지 전극을 제조한다. 한 전극("가수분해된 EVA" 전극)을 칼륨 하이드록사이드로 처리하고, CDI로 활성화시킨 다음, 스트렙트아비딘에 노출시킨다(실시예 6.55에 따라). 나머지 전극("크롬산 EVA" 전극)을 크롬산으로 처리하고, NHS 및 EDC로 처리한 다음 스트렙트아비딘에 노출시킨다(실시예 6.53에 따라).
바이오틴-표지된 항-AFP 항체, TAG1-표지된 항-AFP 항체 및 AFP를 함유한 샌드위치 복합체를 실시예 6.56에 기재된 과정에 의해 두 전극의 3/16" 디스크상에 포획한다.
각 전극을 전극의 활성 영역(1/8" 직경)을 규정하는 개스킷(1/8" id., 7/8" od, 및 0.017" 두께)으로 ECL 시험 셀에 장치한다(도 34). 시험 셀은 3가지 전극 전기화학 셀 및 작업 전극과 평행한 광학 윈도우를 함유한 블랙 Delrin 바디로 구성된다. 전극은 3 M Ag/AgCl 기준전극, 백금 메쉬 카운터 전극, 및 작업 전극으로 피브릴-EVA 복합체가 있다. 시험 셀을 약 1 ㎖의 분석 완충제로 충진하고 원형 전기 히터기로 약 33℃로 가열된 경-타이트 박스에 놓는다. 시험 셀 광학 윈도우를 PMT의 앞에 놓고 박스를 닫는다. 약간의 광 전류 범위(즉, 10 nA/V, 30 nA/V, 100 nA/V, 300 nA/V, 및 1000 nA/V)를 이용하여 1초간의 일정한 필터와 유사한 방식으로 작동하는 Pacific Instruments Model 126 Photometer를 이용하여 PMT에 900 V의 전압을 가한다. 전기화학 셀을 EG&G PARC Model 175 Universal Programmer 및 EG&G PAR Model 173 Potentiostat/Galvanostat에 의해 조절한다. 0 V vs. 3 M Ag/AgCl에서 100초간의 지연 후 전위를 100 mV/s에서 0 V(E0)에서 -0.8 V(E1)의 하한선까지, 2.3 V(E2)의 상한선 및 0 V(E3)의 마지막 전위에서 스위핑한다. 전류 범위는 1 mA/V로 세팅된다. 시험 셀 주위의 공기 온도를 Cole Parmer Thermistor Thermometer 및 탐침으로 측정한다. 모든 아날로그 자료(온도, 광, 적용 전위, 및 전류)를 10 Hz에서 Pyramid 100 MHz의 펜티엄 컴퓨터에서 Windows J에 대한 HEM Data Corp. Snap-Master에 의해 조절된 Computer Boards Inc. CIO-DAS1602/16 A/D 보드를 이용하여 디지털화한다. 임의 자료로부터, ECL과 전압측정 전류 대 적용된 전위의 그래프를 그리고 하기를 포함하는 몇몇 자료를 계산한다: 최대 음극 전류, ECL 피크 전위(ECL 피크시 적용된 전위), 평균 ECL 암 전위(출발 전위와 0.5 V 사이의 평균 광), 및 암 수정된 통합 ECL(주어진 전위 범위에 걸친 평균 ECL과 평균 암 간의 차이, 이 모두를 주어진 전위 범위의 초 기간으로 곱한다.).
AFP 분석으로부터 나온 전압 전류는 사용된 전극에 좌우된다. 가수분해된 EVA상에서의 AFP 분석을 위한 볼타모그램은 1.4 V에서 시작하고 약 1.8 V에서 음전극 피크를 가진 비가역 산화성 파장으로 구성된다. -0.8 V 내지 1.4 V에서는 거의 전류가 흐르지 않는다. 크롬산으로 처리된 EVA의 볼타모그램은 0.7 V에서 시작하고 여러 비한정된 음전극 피크(약 1.1, 1.5, 및 2.0 V) 및 2.3 V에서의 최대 음전극 전류를 가진 매우 광범위한 비가역 산화성 파장으로 구성된다. -0.8 V 내지 0.7 V에서는 거의 전류가 흐르지 않는다.
가수 분해된 EVA는 고 전위 측면에 소량의 테일링을 지닌 곳에서 피크를 구성하는 약간의 ECL을 생성한다. 피크 전위는 블랭크 시그널에 대한 1.85 V에서 분석물 시그널에 대한 1.75 V로 약간 이동한다. 크롬산으로 처리된 EVA는 둘 사이 간격이 근접한 피크를 생성하는데, 이 둘모두 분석물 농도를 이용하여 평가된다. 이들 피크는 약 1.6 V 및 약 1.25 V이다. 낮은 분석물 농도에서 1.6 V에서의 피크가 우세한 반면 보다 높은 분석물 농도에서는 1.25 V에서의 피크가 우세하다. 크롬산 처리는 약 100 mV(가수분해된 EVA)에서 약 350 mV까지의 피크간 분해도를 증가시킨다. 이러한 피크 이동은 분석물에 좀더 민감하고 분석에 사용되는 블랭크 시그널 양을 감소시키는 것으로 나타난 제 1 피크의 분석을 가능케하기 충분하다.
유사 실험에서, 본 출원인은 AFP 검정체 1(압도적인 ECL 분석 완충제, 도 60) 및 AFP 검정체 3(도 61)에 대한 소량의 ECL을 비교한다. 도 60에서, 분석 완충제에 상응하는 ECL 시그널은 1.5 V에서 최대 피크를 나타낸다. 도 61에서, 분석 완충제에 대한 ECL 시그널도 또한 1.5 V이고; 1.0 V에서의 추가 피크는 TAG1-표지된 상보적인 항체를 포함하는 샌드위치 복합체에서 분석물로부터 나온 시그널에 상응한다.
6.68. 피브릴-EVA 복합체의 압출된 시이트의 제조
본 출원인은 Henschel 실험 믹서에서 270 g의 탄소 나노튜브(HCl 피브릴, CC 등급) 및 730 g의 에틸 비닐아세테이트(EVA, Quantum Microthene FE530)를 2분간 블렌딩한다. 나노튜브-EVA 블렌드를 밀봉된 호퍼로 진공 전달시키고, 180℃에서 Buss PR 46 니더상에서 화합한 다음, Buss 크로스 헤더 펠렛타이저에 공급한다. 펠렛을 Gala 건조기에서 건조시킨다. 이 공정은 27 중량%의 피브릴을 함유한 복합체를 제공한다.
압출 이전에, 화합된 나노튜브-EVA 복합체의 펠렛을 80℃에서 적어도 12시간 동안 건조시킨다. 건조된 펠렛을 Brabender PL2000 Plasti-Corder(¾", 2:1 압축비 스크루 및 6" 플렉스-립 다이가 장착된 25:1 L/D 단일 스크루 압출기)에 공급한다. 압출기 및 다이의 3개의 가열 지대의 온도는 245℃이다. 압출기의 출력 다이는 무시할 정도로 내려간 주위 온도에서 운반기 벨트상에서 수집된 나노튜브-EVA 복합체의 연속 리본(∼15㎝ 폭, ∼1㎜ 두께)을 생성한다. 운반기 벨트와 접촉하지 않는 복합체의 표면을 모든 추가 실험을 위해 사용한다.
6.69. ECL 면역분석을 위해 피브릴 복합체를 화학적으로 개질하기위한 산소 플라즈마의 사용
탄소 피브릴 및 EVA(27 중량% 피브릴)의 복합체를 산소(O2) 가스에서 형성된 플라즈마에 노출시킨다. 복합체를 2000 W(20 kWmin)에서 10분간 플라즈마에 노출시킨다. N-하이드록시숙신이미드-에스테르 작용기(NHS-에스테르)를 도입하기 위해, 플라즈마-처리된 피브릴-EVA 복합체(126 ㎠)를 실온에서 2시간 동안 무수 메틸렌 클로라이드(50 ㎖)에서 N-하이드록시숙신이미드(700 ㎎, Aldrich 13067-2) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(1.6 g, Aldrich 16146-2)와 반응시킨 다음, 메탄올과 물로 세정하고, 아르곤 가스 스트림으로 건조시킨다. NHS-에스테르 유도된 복합체를 실온에서 4시간 동안 PBS-1 완충제(0.1 M 나트륨 포스페이트, 0.15 M 나트륨 클로라이드, pH = 7.8, 50 mL)에서 스트렙트아비딘(5 ㎎, Pierce 21125)으로 배양한다. 복합체를 30분간 교반하면서 PBS-1 중의 1% Triton X-100 및 30분간 교반하면서 PBS-1로 3회 세척한다.
6.70. 피브릴 복합체를 화학적으로 개질하기 위해 산소 플라즈마(40 KWmin)에 이어 NH3/N2플라즈마(4:1, 120 KWmin)의 사용
탄소 피브릴 및 EVA(27 중량% 피브릴)의 복합체(123 ㎠)를 산소(O2) 가스에서 형성된 플라즈마에 우선 노출시킨다. 복합체를 2000 W(40 kWmin)에서 20분간 플라즈마에 노출시킨다. 복합체를 암모니아(NH3) 가스 및 질소(N2) 가스의 혼합물(각각 가스의 4:1비)에서 형성된 플라즈마에 노출시킨다. 복합체를 2000 W(120 kWmin)에서 60분간 이 플라즈마에 노출시킨다. 말레이미드 작용기를 형성하기 위해, 플라즈마-처리된 피브릴-EVA 복합체를 실온에서 교반하면서 3시간 동안 PBS-1(50 ㎖)에서 술포-SMCC(35 ㎎, Pierce: 22322)로 배양한다. 복합체를 물(60 ㎖ 10분간 교반하면서)로 1회 및 PBS-1(60 ㎖ 10분간 교반하면서)로 3회 세척한다.
활성화된 복합체상에서의 고정화를 위한 IgG를 제조하기 위해, 디티오트레이톨(5 ㎎, Sigma D-9779)을 항-AFP IgG(Boehringer-Mannhem) 용액(500 ㎕ PBS-1 완충제 중 5.5 ㎎)에 첨가한다. 혼합물을 실온에서 30분간 배양한다(혼합하기 위해 회전). 이 과정은 IgG("IgG-(SH)n")상에 티올 그룹을 노출시킨다. "IgG-(SH)n"을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 다음, 20 mM EDTA PBS-1 완충제 중으로 희석한다.
말레이미드-활성화된 복합체(60 ㎠)를 실온에서 2.5 시간 동안 정제된 "IgG-(SH)n" 용액(20 mM EDTA PBS-1 완충제 30 ㎖ 중 5.5 ㎎ "IgG-(SH)n")으로 배양한다. 복합체를 1% Triton X-100(60 ㎖)으로 20분간 1회 및 PBS-1으로 3회 20분간 교반하면서 세척한다. 항-APF-IgG 복합체를 PBS-1에 보관한다.
AFP 분석을 항-AFP-IgG 복합체 상에서 수행한다. 96-웰 플레이트를 BSA로 미리 코팅한다. 복합체의 개개 디스크(3/16" 직경)를 직접 손으로 금속 펀치를 이용하여 펀칭한다. 각 디스크를 실온에서 60분간 TAG1-표지된 IgG(100 ㎕)를 함유한 용액 및 공지 양의 AFP(20 ㎕)을 함유한 샘플과 함께 배양한다. 배양 후, 디스크를 PBS-1(200 ㎕)로 3회 세정하고 BSA 분석 희석제(100 ㎕)에 보관한다. 도 62는 샘플 중의 AFP 농도의 로그의 함수에 따라 AFP를 함유한 샘플과 AFP를 함유하지 않은 샘플(백그라운드 샘플) 간의 차이의 로그값 그래프를 보여준다.
6.71. 물/아르곤 플라즈마에 산화된 복합전극상에 단백질의 흡착
피브릴-EVA 복합전극(실시예 6.68에 기재된 바에따라 제조)을 Advanced Plasma Systems Series C 플라즈마 반응기(1시간, 2000 W, 300 mtorr)에서 물-포화된 아르곤에서 형성된 플라즈마로 처리한다. 복합체(∼80 ㎠)를 pH 7.5, 100 mM 포스페이트에서 0.2 ㎎/㎖의 농도로 항-AFP 모노클로날(Beohringer-Mannheim)을 함유한 20 mL 용액에 두고 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하면서 배양한다. 복합체를 pH 7.5, 100 mM 포스페이트로 세척하고 -4℃에서 동일한 용액에 보관한다. 방사성 동위 원소로 표시하여 사용하면서, 디스크상의 흡착된 항체의 양을 2.9 pmol로 측정한다.
AFP에 대한 샌드위치 면역분석을 이들 디스크상에서 수행한다. AFP를 함유한 샘플(20 ㎕)을 12 ㎍/mL의 농도로 TAG1-표지된 2차 항체(Beohringer-Mannheim)를 함유한 50 ㎕의 용액과 합친다. 표면을 이 혼합물로 처리한 다음 포스페이트 완충제로 세척한다. 트리프로필아민(분석 완충제, IGEN)을 함유한 용액과 복합전극을 접촉시키고 0 V 내지 -0.8 V 내지 2.3V(vs. Ag/AgCl)의 복합전극에서 0.1 V/s의 스캔율로 전위를 스캐닝하여 ECL을 측정한다. 공지 양의 AFP를 지닌 샘플의 경우에 측정된 ECL 시그널은 도 63에 도시되어있다.
6.72. 15 중량%의 피브릴을 함유한 피브릴-EVA 복합전극을 이용한 AFP 분석
27 중량%의 피브릴을 함유한 피브릴-EVA 복합체의 펠렛을 추가 EVA와 화합시켜 15 중량%의 피브릴을 함유한 피브릴-EVA 복합체를 생성한다. 이 복합체를 실시예 6.68에 기재된 것과 유사한 과정에 의해 시이트로 압출시킨다. 복합체를 아르곤/물 플라즈마로 처리하고 실시예 6.71에 기술한 바와같이 항-AFP 항체로 코팅한다. 방사선 표지된 항체를 이용한 연구는 단지 15 중량%의 피브릴을 함유한 이들 복합체가 27 중량%의 피브릴(2.9 pmol, 실시예 6.71참조)을 함유한 기타 복합체보다 좀더 많은 항체(3.13 pmol)를 흡착함을 보여준다. 항체-코팅된 복합체를 실시예 6.71에 기술된 바와 같이 AFP 분석에 이용할 수 있다. 공지 양의 AFP을 함유한 샘플의 경우에 관측된 ECL 시그널은 도 64에 도시되어있다. 단지 15 중량%의 피브릴을 함유한 복합체는 27 중량%의 피브릴(도 63, 실시예 6.71)을 함유한 복합체보다 약간 높은 ECL 시그널(도 64)을 제공한다.
6.73. 플라즈마-산화된 복합체상에 옥타데실아민의 플라즈마-그래프팅 층상의 단백질 흡착
피브릴-EVA 복합체(실시예 6.68에 기재된 바에따라 제조)를 클로로포름에서 1 ㎎/mL의 농도로 옥타데실 아민을 함유한 용액에 2 시간 동안 흡착시킨다. 복합체를 공기에서 건조시킨다(건조 공정동안 복합체 시이트가 평면이 되도록 가장자리에 중량 적용). 복합체를 Advanced Plasma Systems Series C 플라즈마 반응기(30분, 2000 W, 300 mtorr)에서 산소 플라즈마로 처리한다. pH 7.5, 5 mM 포스페이트에서 아비딘을 함유한 용액(1.25 ㎎/㎖)에 물질을 함침시켜 복합체를 아비딘으로 코팅한다. 포스페이트로 완충된 염수로 세척하여 과량의 아비딘을 제거한다.125I-표지된 스트렙토아비딘 및125I 및 바이오틴-표지된 토끼 IgG를 이용한 방사성 동위원소 실험은 본 출원인이 30-43 pmol의 스트렙토아비딘을 고정화하고 스트렙토아비딘이 >2.2 pmol 바이오틴-표지된 항체를 결합시킬 수 있음을 보여준다.
이들 디스크상에서 AFP에 대한 샌드위치 면역분석을 수행한다. 표면을 바이오틴-표지된 항-AFP 항체(7 ㎍/㎖, Beohringer-Mannheim)를 함유한 100 ㎕ 용액으로 30분간 교반하면서 처리한 다음 포스페이트로 완충된 염수로 세척한다. 20 ㎕의 샘플을 12 ㎍/㎖의 농도로 TAG1-표지된 2차 항체(Beohringer-Mannheim)를 함유한 100 ㎕ 용액과 합친다. 교반하면서 표면을 60분간 이 혼합물로 처리한 다음 분석 완충제(IGEN)로 세척한다. 복합전극을 트리프로필아민을 함유한 용액(분석 완충제, IGEN)과 접촉시키고 0 V에서 -0.8 V 내지 2.3 V(vs. Ag/AgCl)까지의 복합전극에서 0.1 V/s의 스캔 속도로 전위를 스캐닝하면서 ECL을 수행한다. 공지된 양의 AFP를 이용하여 샘플의 경우에 관측된 ECL 시그널은 도 65에 도시되고 있다.
6.74. 플라즈마-처리된 복합체상에 그래프팅된 작용기에 단백질의 커플링
피브릴-EVA 복합체(실시예 6.68에 기술된 바에따라 제조)를 Advanced Plasma Systems Series C 플라즈마 반응기(1000 W, 3분, 300 mtorr)에서 아르곤 플라즈마로 처리한다. 복합체를 반응기에서 제거하고 물에 4%(중량/용적)의 아크릴산(증류된) 또는 알릴 아민을 함유한 산소-유리 용액에 즉시 둔다. 복합체를 물로 광범위하게 세척된 30 C 에서 3 시간 동안 이들 용액에 배양시키고 공기 건조한다. 실시예 6.69에 기술된 것과 유사한 방법에 의해 카복실산 그룹을 NHS 에스테르의 형태로 활성화시켜 스트렙트아비딘을 그래프팅되고/되거나 중합된 아크릴산 부위를 통해 고정화시킨다. 실시예 6.70에 기술된 것과 유사한 방법에 의해 복합체상에 말레이미드 그룹을 도입한 후 티올-표지된 스트렙트아비딘을 그래프팅되고/되거나 중합된 알릴 아민을 통해 고정화시킨다. 본 출원인은 이들 복합체가 바이오틴-표지된 시약과 결합할 수 있고 ECL 표지로부터 ECL을 여기시킬 수 있음을 보여주고; 본 출원인은 바이오틴 및 TAG1 그룹으로 표지된 과량의 토끼 IgG로 물질을 처리한 후 복합전극으로부터 ECL을 측정한다. 복합전극을 트리프로필아민을 함유한 용액과 접촉시키고(분석 완충제, IGEN) 0 V에서 -0.8 V 내지 2.3 V(vs. Ag/AgCl)까지의 복합전극에서 0.1 V/s의 스캔율로 전위를 스캐닝하여 결합한 IgG에서 ECL을 생성한다. 각각 생성된 아크릴산 및 알릴 아민으로 처리된 복합체는 203 nAs 및 123 nAs의 PMT 전류를 통합한다.
6.75. ECL 면역분석을 위해 피브릴 복합체에 아비딘을 결합시키기 위한 플라즈마의 사용
플라즈마를 사용하여 아비딘을 복합체 물질의 표면에 융합시킨다. 우선 0.5 ㎎/㎖의 아비딘 용액에 피브릴-EVA 복합체의 블록을 3시간 동안 함침시켜(실시예 6.68) 융합을 수행한다. 세번 간 60 ㎖의 PBS-1으로 세척한 후, 복합체를 공기 건조시키고, 스트립으로 만든 다음 600 와트(3000 Wmin)에서 5분간 Ar 또는 O2플라즈마로 처리한다. 이들 실험을 Series B 플라즈마 반응기(APS Technologies)상에서 수행한다.
복합체의 플라즈마 처리에 이어, 5/16" 디스크를 펀칭하고 바이오티닐화된125I-IgG를 결합하는데 사용된 방사선 동위원소 표시 실험으로 고정화된 활성 아비딘의 양을 측정한다. 이들 표면에 결합된 아비딘을 지닌 복합체는 0.244 pmole(Ar 플라즈마로 처리) 및 1.899 pmole(산소 플라즈마로 처리)의 IgG와 결합한다.
바이오티닐화된-TAG1-IgG(BTI)를 이용한 결합 분석도 수행한다. BTI를 41 nM의 농도로 사용하고 결합 양을 ECL로 정량한다. O2플라즈마로 융합된 아비딘의 경우, BTI를 이용한 배양 이전에 1시간 동안 4 μM의 d-바이오틴을 배양한다. 이는 바이오틴과 아비딘간의 상호 작용으로 인해 결합의 양을 평가하기 위해 행해진다. 측정된 ECL: Ar 플라즈마 및 O2플라즈마에 대한 시그널은 각각 10424 nAsec 및 8179 nAsec이다.
6.76. 피브릴 복합체에 친화성 매트릭스의 결합을 위한 플라즈마의 사용
바이오틴(Sigma#B-3272, 100#57F4034)을 포함한 아크릴산 비드(125 ㎎)를 미세하게 간다. 이 분말을 대략 20 ㎖의 탈이온수에 현탁시키고 0.45 마이크론 필터(Gelman Sciences #4598)를 통해 여과시킨다. 여과된 현탁물을 여러 5/16" 직경의 피브릴-EVA 복합체상에서 건조시킨다(27 중량% 피브릴, 실시예 6.68 참조).
몇몇 디스크는 1000 Wmin 동안 O2플라즈마로 처리된 플라즈마이고; 나머지는 12000 Wmin동안 O2로 처리된 플라즈마이다. 플라즈마 처리 후, 디스크를 PBS-1에서 10분간 3회 세척한 다음 PBS-1로 3회 세정하여 결합하지 않은 단편을 제거한다.
세척 후, 유도된 복합체를 실온에서 0.2 ㎎/㎖의 스트렙트아비딘으로 2시간 동안 배양하고, 세정한 다음 PBS-1 완충제에 보관한다. 스트렙트아비딘-코팅된 복합체의 디스크(3/16" 직경)를 펀칭하고 96-웰 플레이트의 웰에 둔다. 바이오티닐화된 항-AFP 항체를 함유한 용액을 각 웰에 첨가한다. 30분간 교반하면서 디스크를 배양한 다음, PBS-1 완충제로 세척한다. 100 ㎕의 TAG1-표지된 항-AFP 항체 및 공지된 농도의 AFP를 함유한 20 ㎕의 샘플을 웰에 첨가하고 교반과 동시에 실온에서 1시간 동안 배양한다. 이 디스크를 분석 완충제로 3회 세정하고 실시예 6.71에 기술된 바와 같이 ECL을 측정한다. 도 66은 샘플에서 AFP의 농도에 따른 ECL 시그널의 로그 그래프를 도시하고 있다.
6.77. 건조된 시약을 사용하고 세척 단계를 요구하지 않는 ECL-기본 결합 분석
피브릴-EVA 복합체(실시예 6.68에 기술된 바에따라 제조)를 산소 플라즈마에서 산화시키고 스트렙트아비딘으로 코팅한다(실시예 6.69에 기재된 바에따라). 디스크의 한 표면을 용액과 접촉하도록 홀더에 놓인 5/16" 직경 디스크로 복합전극을 절단한다. 교반하면서 1시간 동안 바이오틴-표지된 항-AFP 항체를 함유한 100 ㎕ 용액으로 디스크를 처리한 다음 포스페이트-완충된 염수로 세척한다. 분석을 위해 요구된 기타 시약을 하기 용액을 첨가하고 동결건조시켜 표면상에 건조시킨다: TAG1-표지된 항-AFP 항체(12 ㎍/㎖, Boehringer-Mannheim), 포스페이트(200 mM), 트리프로필아민(200 mM), 소 혈청 알부민(2%), 수크로스(2%), 클로로아세트아미드(0.1%), 및 Triton X-100(0.02%), pH 7.6. 95 ㎕ 샘플을 디스크의 표면상에서 건조된 시약에 첨가하고 교반하는 동안 1시간 동안 배양시켜 AFP 분석을 수행한다. 카운터 및 기준전극을 복합전극 위의 용액상으로 삽입하고 0 V에서 -0.8 V 내지 2.3 V(vs.Ag/AgCl)까지의 카운터 전극에서 4.8 V/s의 스캔율로 전위를 스캐닝하여 ECL을 여기시킨다. 도 67은 공지된 양의 AFP를 함유한 용액에 대해 광전자 증배관 튜브에서 측정된 ECL 시그널을 도시하고 있다.
7. 참고 자료의 통합
본 발명은 본원에 기술되어 있는 특정 구체예에 의하여 그 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본원에 기술되어 있는 것 외에 본 발명에 대한 다양한 변형이 전술한 상세한 설명 및 도면으로부터 당업자에게 분명해질 것이다. 그러한 변형은 청구 범위의 범위 내이어야 한다. 다양한 문헌이 본원에 인용되고 있으며, 그 개시는 그 자체로 본원에 참고 자료로서 통합되어 있다.

Claims (153)

  1. 적어도, 입자 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 포함하는 복합체가 형성되는 전기화학발광 결합 분석의 수행방법에 있어서,
    (a)복합체를 형성시키고;
    (b)여과에 의해 다공성의 전도성 전극상상 복합체를 수집하며;
    (c)전극에 전압을 인가하여 수집된 복합체내의 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
    (d)전극으로부터 방출된 발광을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 다공성의 전도성 전극이 탄소로 이루어지는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 전극이 탄소 피브릴 매트로 이루어지는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 입자가 분석시 내부 표준으로 작용할 수 있는 발광종을 함유하고 이의 발광을 측정하여 분석을 검량하는 방법.
  5. 적어도, 입자 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 포함하는 복합체가 형성되는 해당 분석물의 전기화학발광 결합 분석의 수행방법에 있어서,
    (a)다공성의 전도성 전극에서 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 입자를 수집하고;
    (b)해당 분석물을 함유하는 샘플을 다공성의 전도성 전극을 통해 통과시켜 다공성의 전도성 전극에서 복합체를 형성시키며;
    (c)전극에 전압을 인가함으로써 복합체내 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
    (d)전극으로부터 방출된 발광을 검출하여 해당 분석물의 존재 유무를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  6. 적어도, 입자 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 포함하는 복합체가 형성되는 해당 분석물의 전기화학발광 결합 분석의 수행방법에 있어서,
    (a)해당 분석물을 함유하는 샘플을 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 입자를 함유하는 다공성의 전도성 전극을 통해 통과시켜 댜공성의 전도성 전극에서 복합체를 형성시키고;
    (b)전극에 전압을 인가함으로써 복합체내 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
    (c)전극으로부터 방출된 발광을 검출하여 해당 분석물의 존재 유무를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  7. 각각이 적어도, 입자 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 포함하는 다수의 복합체가 형성되는 다수의 해당 분석물에 대한 다수의 전기화학발광 결합 분석의 수행방법에 있어서,
    (a)각각 다공성의 전도성 전극을 포함하는 다수의 영역에 다수의 복합체를 수집하고;
    (b)영역과 결부된 전극에 전압을 인가함으로써 다수의 영역 중 하나 이상에서의 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
    (c)분석영역으로부터 방출된 발광을 검출하여 해당 분석물의 존재 유무를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 각각이 적어도, 입자 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 포함하는 다수의 복합체가 형성되는 다수의 해당 분석물에 대한 다수의 전기화학발광 결합 분석의 수행방법에 있어서,
    (a)다공성의 전도성 전극상 다수의 영역에 다수의 입자를 수집하고;
    (b)해당 분석물을 함유하는 샘플을 다공성의 전도성 전극상 다수의 영역을 통해 통과시키며;
    (c)영역과 결부된 전극에 전압을 인가함으로써 하나 이상의 영역내에 있는 복합체 중의 표지 화합물을 발광하도록 유도한 다음;
    (d)분석영역으로부터 방출된 발광을 검출하여 해당 분석물의 존재 유무를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 다수의 입자가 혼입된 다공성 전극을 포함하는 전기화학발광 분석 수행용 물질의 조성물.
  10. 적어도 전기화학발광할 수 있는 화합물을 포함하는 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 다수의 입자가 혼입된 다공성 전극을 포함하는 전기화학발광 분석 수행용 물질의 조성물.
  11. 적어도 전기화학발광할 수 있는 화합물을 포함하는 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 다수의 입자가 혼입된 다공성 전극을 포함하는 물질의 조성물.
  12. (a)다수의 영역을 갖는 다공성 전극; 및
    (b)적어도 전기화학발광할 수 있는 화합물을 포함하는 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 영역에 혼입된 다수의 입자를 포함하는 전기화학발광 분석 수행용 물질의 조성물.
  13. (a)다수의 영역 및 적어도 전기화학발광할 수 있는 화합물을 포함하는 전기화학발광 분석의 성분과 복합체를 형성할 수 있는 영역에 혼입된 다수의 입자를 갖는 다공성 전극; 및
    (b)전기화학발광 표지를 포함하는 전기화학발광 분석 수행용 키트.
  14. (a)전도성 중합체로 이루어진 전극; 및
    (b)결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 장치.
  15. (a)금속 옥사이드로 이루어진 전극; 및
    (b)결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 전극이 적어도 부분적으로 투명한 장치.
  17. 제 15 항에 있어서, 금속 옥사이드가 인듐 주석 옥사이드인 장치.
  18. (a)중합체; 및
    (b)여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴의 복합체를 포함하는 전극.
  19. 제 18 항에 있어서, 복합체가 다공성인 전극.
  20. (a)(i)매트릭스; 및
    (ii)여기에 분산된 하나 이상의 탄소 피브릴을 포함하는 요소; 및
    (b)분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 하나 이상의 결합영역을 포함하는 분석 수행용 장치.
  21. 매트릭스와 여기에 분산된 다수의 전도성 입자의 복합체로 이루어지고 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 지닌 전극을 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 장치.
  22. 제 21 항에 있어서, 매트릭스가 중합체인 장치.
  23. 제 21 항에 있어서, 전도성 입자가 탄소인 장치.
  24. 제 21 항에 있어서, 전도성 입자가 탄소 섬유로 이루어지는 장치.
  25. 제 21 항에 있어서, 전도성 입자가 탄소 피브릴로 이루어지는 장치.
  26. (a)매트릭스와 여기에 분산된 다수의 전도성 입자로 이루어진 전극; 및
    (b)전극 표면에 지지되고, 각각 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 다수의 결합영역을 포함하는, 전기화학발광에 의한 다수의 분석물의 검출용 장치.
  27. 중합체와 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극 특성의 개질방법에 있어서, 복합체를 산화에 투입하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 중합체와 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극 특성의 개질방법에 있어서, 전극을 플라즈마에 투입하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 중합체와 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극 특성의 개질방법에 있어서, 하나 이상의 작용기를 첨가함으로써 전극을 유도체화 하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 중합체가 유도체화되는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 복합체에 함유된 피브릴이 유도체화되는 방법.
  32. 제 29 항에 있어서, 함유되어 있는 중합체 및 피브릴 모두가 유도체화되는 방법.
  33. 전기화학발광 화합물내 복합체에서 전기화학발광이 일어나는 전기 전위를 변경하기 위한, 중합체 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 복합체의 처리 방법에 있어서, 복합체를 전기 전위를 변경시키기에 충분한 시간 동안 화학적 또는 물리적 처리에 투입하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 중합체 및 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전기화학발광 분석 수행용 전극에 있어서, 전극이 전기화학발광이 일어나는 전기 전위를 변경시키기에 충분한 시간 동안 화학적 또는 물리적 처리에 투입되는 전극.
  35. 중합체 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극 특성의 개질방법에 있어서, 전극상의 목적하는 작용기를 노출시키기 위해 전극을 개질하는 단계를 포함하는 방법.
  36. 다수의 탄소 피브릴로 이루어진 매트를 포함하는 전극.
  37. 다수의 탄소 피브릴로 이루어지고 분석시약을 함유하는 영역을 추가로 포함하는 매트.
  38. 제 36 항에 있어서, 다수의 상이한 전도층을 갖는 매트.
  39. 제 36 항에 있어서, 하나 이상의 유도체화된 탄소 피브릴 층으로 이루어진 매트.
  40. 제 36 항에 있어서, 하나 이상의 비-유도체된 피브릴 층으로 이루어진 매트.
  41. 제 36 항에 있어서, 적어도 하나의 비-유도체화된 피브릴 층 및 적어도 하나의 유도체화된 피브릴 층을 갖는 매트.
  42. 제 36 항에 있어서, 다수의 상이한 광 불투명 층을 함유하는 매트.
  43. 제 36 항에 있어서, 다수의 상이한 구멍 크기 층을 함유하는 매트.
  44. (a)지지체;
    (b)다수의 탄소 피브릴을 포함하는 피브릴 매트; 및
    (c)매트와 전기적 접촉을 이루기 위한 수단을 포함하는, 전기화학발광 분석용 전극.
  45. 제 44 항에 있어서, 피브릴 매트가 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는 전극.
  46. (a)지지체;
    (b)다수의 탄소 피브릴을 포함하는 피브릴 매트; 및
    (c)매트와 전기적 접촉을 이루기 위한 수단을 포함하는, 결합 전기화학발광 분석용 전극을 위한 키트.
  47. 제 46 항에 있어서, 피브릴 매트가 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는 키트.
  48. 제 44 항에 있어서, 지지체가 전도성인 전극.
  49. 제 44 항에 있어서, 피브릴 매트가 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는 전극.
  50. 제 44 항에 있어서, 지지체가 다공성인 전극.
  51. 제 44 항에 있어서, 지지체가 금속-코팅된 다공성 물질로 이루어지는 전극.
  52. 제 44 항에 있어서, 지지체가 스테인레스강 섬유 메쉬로 이루어지는 전극.
  53. (a)표면에 결합시약이 고정된 피브릴을 생성시키고;
    (b)피브릴을 매질 중에 분산시킨 다음;
    (c)피브릴을 용액으로부터 여과하여 피브릴 매트를 생성시키는 단계를 포함하는, 전기화학발광 분석에 지지체 또는 전극으로 사용하기 위한 피브릴 매트의 제조방법.
  54. (a)피브릴을 매질에 분산시키고;
    (b)피브릴을 매질로부터 여과하여 매트를 제조한 다음;
    (c)피브릴 매트를 유도체화하여 결합시약의 고정화용으로 제조하는 단계를 포함하는, 전기화학발광 결합 분석용 피브릴 매트의 제조방법.
  55. (a)해당 분석물 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 함유하는 샘플을 , 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 함유하는 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극과 접촉시키고;
    (b)전극에 전압을 인가하여 표지 화합물을 전극에서 발광하도록 유도한 다음;
    (c)방출된 발광을 검출하는 단계를 포함하는, 해당 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석 수행방법.
  56. (a)다수의 해당 분석물 및 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 함유하는 샘플을, 각각 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 영역을 함유하는 피브릴 매트를 포함하는 다수의 전극 지역과 접촉시키고;
    (b)피브릴 매트에 수집된 표지 표지 화합물을 전기화학발광하도록 유도한 다음;
    (c)방출된 발광을 측정하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플내 다수의 해당 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석 수행방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 지역이 순서대로 위치하고 생물학적 샘플의 소형 성분을 연속적으로 제거하도록 적용시킨 좀더 작은 구멍 크기를 연속적으로 갖는 방법.
  58. 전기화학발광이 일어나는 상이한 전기화학 전위를 갖는 적어도 두 지역을 지닌 전극에서 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 전기화학발광 분석시 전기화학발광종 기원의 둘 이상의 시그널을 분해하는 방법.
  59. 제 58 항에 있어서, 상기 방법에 의해 분해된 시그널이 백그라운드 전기화학발광인 방법.
  60. 분석에 전기화학발광종 중 하나의 전기화학발광을 선택적으로 조정하는 시약을 포함하는, 전기화학발광 분석시 전기화학발광종 기원의 둘 이상의 시그널을 분해하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 시약이 상기 종으로부터의 전기화학발광을 소멸시키는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서, 상기 종 중 하나의 전기화학발광을 조정하는 분석에 완충제가 첨가되는 방법.
  63. 분석시 하나 이상의 종으로부터 전기화학발광 생성에 비활성인 적어도 하나의 지역을 포함하는 전극에서 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 다수의 분석물의 검출 또는 측정을 위한 전기화학발광 분석시 전기화학발광종 기원의 둘 이상의 시그널의 분해방법.
  64. 표지 및 백그라운드에 대한 전기화학발광을 각각 상이한 전기화학 전위에서 유도하는 전극에서 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 전기화학발광 분석시 백그라운드 시그널과 전기화학발광 표지로부터의 시그널을 구별하는 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 전극이 복합체인 방법.
  66. 제 64 항에 있어서, 전극이 탄소로 이루어지는 방법.
  67. 제 64 항에 있어서, 전극이 화학적 또는 물리적 처리에 의해 개질되는 방법.
  68. 각각의 표지로부터의 전기화학발광을 상이한 전기화학 전위에서 유도하는 전극상에서 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 전기화학발광 분석시 동일한 전기화학발광 화합물로 표지된 둘 이상의 종으로부터의 시그널을 상호 구별하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 전극이 복합체인 방법.
  70. 제 68 항에 있어서, 전극이 탄소로 이루어지는 방법.
  71. 제 68 항에 있어서, 전극이 화학적 또는 물리적 처리에 의해 개질되는 방법.
  72. (a)해당 분석물과 전기화학발광할 수 있는 표지 화합물을 함유하는 샘플을, 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 함유하는 다수의 탄소 피브릴을 포함하는 전극과 접촉시키고(여기에서, 탄소 피브릴은 전기화학발광 분석시 적어도 하나의 종의 전기화학발광이 일어나는 전기화학 전위를 변경시키기 위해 화학적 또는 물리적 처리에 의해 개질된다);
    (b)전극에 전압을 인가하여 표지 화합물이 전극에서 발광하도록 유도한 다음;
    (c)방출된 발광을 검출하는 단계를 포함하는, 해당 분석물에 대한 전기화학발광 결합 분석 수행방법.
  73. (a)매트릭스 및 (b)표면이 플라즈마 처리에 의해 개질된 하나 이상의 피브릴 또는 피브릴 구조를 함께 포함하는 복합 물질.
  74. 제 73 항에 있어서, 복합 물질이 다수의 피브릴 또는 매트릭스에 분산된 피브릴 구조를 함유하는 복합체.
  75. 중합체 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 함유하는 복합체를 포함하는 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 전극에 있어서, 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는 전극.
  76. 제 75 항에 있어서, 탄소 입자가 복합체의 0.5 내지 50 중량%를 구성하는 전극.
  77. 제 75 항에 있어서, 탄소 입자가 복합체의 1 내지 30 중량%를 구성하는 전극.
  78. 제 75 항에 있어서, 탄소 입자가 복합체의 2 내지 20 중량%를 구성하는 전극.
  79. 제 75 항에 있어서, 복합체가 성형되는 전극.
  80. 제 75 항에 있어서, 복합체가 압출되는 전극.
  81. 제 75 항에 있어서, 시약이 전극에 공유결합되는 전극.
  82. 제 75 항에 있어서, 시약이 전극에 비-공유결합되는 전극.
  83. 제 75 항에 있어서, 시약이 전극에 직접 고정되는 전극.
  84. 제 75 항에 있어서, 시약이 결합쌍을 통해 전극에 간접 고정되는 전극.
  85. 제 75 항에 있어서, 전극이 다수의 결합영역을 포함하는 전극.
  86. 제 75 항에 있어서, 결합시약이 항체 또는 이의 단편, 핵산, 수용체 또는 효소인 전극.
  87. 제 75 항에 있어서, 탄소 입자가 피브릴인 전극.
  88. 제 75 항에 있어서, 전기화학발광 분석이 균질 분석인 전극.
  89. (a)매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 함유하는 복합체를 플라즈마 처리한 다음;
    (b)결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 처리 복합체상에 결합영역을 형성시키는 단계를 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물의 검출 또는 정량에 사용하기 위한 전극의 제조방법.
  90. 제 89 항에 있어서, 둘 이상의 순차적인 플라즈마 처리가 수행되는 방법.
  91. 제 89 항에 있어서, 플라즈마가 원자 또는 O2, Ar, H2O, N2, NH3, CF4, SF6, C2F6, CHF3, CF2Cl2, CF3Br, CF3Cl 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화합물을 함유하는 방법.
  92. 제 89 항에 있어서, 플라즈마 처리가 (a)중합체 에칭, 또는 (b)중합체에 분산된 탄소 입자의 노출면을 유도체화하는 목적 중 하나 이상을 위한 방법.
  93. 제 89 항에 있어서, 매트릭스가 중합체인 방법.
  94. 제 89 항에 있어서, 탄소 입자가 피브릴인 방법.
  95. 제 89 항에 있어서, 결합영역이 복합체상에 배치된 마스크내 구멍을 통해 시약을 도입함으로써 형성되는 방법.
  96. (a)매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 함유하는 복합체를 화학시약으로 처리한 다음;
    (b)결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 처리 복합체상에 결합영역을 형성시키는 단계를 포함하는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 전극의 제조방법.
  97. 제 96 항에 있어서, 매트릭스가 중합체인 방법.
  98. 제 96 항에 있어서, 탄소 입자가 피브릴인 방법.
  99. 제 96 항에 있어서, 화학시약이 산화제인 방법.
  100. 제 96 항에 있어서, 결합영역이 복합체상에 배치된 마스크내 구멍을 통해 시약을 도입함으로써 형성되는 방법.
  101. 제 89 항의 방법에 의해 제조된 전기화학발광에 의한 분석물의 검출용 전극.
  102. 제 96 항의 방법에 의해 제조된 전기화학발광에 의한 분석물의 검출용 전극.
  103. 각각 중합체 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 포함하는 하나이상의 전극을 포함하고, 하나 이상의 전극 각각은 다수의 결합영역을 가지며, 각각의 영역은 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는, 분석물 검출 또는 정량을 위한 전기화학발광 분석 수행용 계측기 시스템에 사용하기 위한 카트리지.
  104. 제 103 항에 있어서, 액체 분석시약을 함유하지 않는 카트리지.
  105. 제 103 항에 있어서, 하나 이상의 전극 외에, 건조 분석시약을 함유하는 카트리지.
  106. 제 105 항에 있어서, 건조 분석 시약이 전기화학발광 공반응물인 카트리지.
  107. 제 105 항에 있어서, 분석시약이 완충제인 카트리지.
  108. 제 105 항에 있어서, 분석시약이 전기화학발광성 잔기를 함유하는 카트리지.
  109. 제 105 항에 있어서, 시약이 검량 표준인 카트리지.
  110. 제 105 항에 있어서, 시약이 보존제인 카트리지.
  111. 제 105 항에 있어서, 시약이 탄수화물인 카트리지.
  112. 제 103 항에 있어서, 전극이 액체 샘플을 함유하기 위한 셀의 내벽을 규정하는 카트리지.
  113. 제 103 항에 있어서, 카트리지로부터의 광의 분석으로부터의 광 검출 수단으로의 통과를 위한 윈도우를 포함하는 카트리지.
  114. 제 103 항에 있어서, 유체 계량 수단을 포함하는 카트리지.
  115. 제 103 항에 있어서, 카트리지 온도 조정수단을 포함하는 카트리지.
  116. 제 103 항에 있어서, 카트리지 온도 측정 수단을 포함하는 카트리지.
  117. 제 103 항에 있어서, 유로를 포함하는 카트리지.
  118. 제 103 항에 있어서, 카운터 전극을 포함하는 카트리지.
  119. 제 103 항에 있어서, 기준전극을 포함하는 카트리지.
  120. 제 103 항에 있어서, 전기 에너지원을 포함하는 카트리지.
  121. 제 103 항에 있어서, 카트리지에 도입된 유체 샘플의 포함 수단을 포함하는 카트리지.
  122. 제 103 항에 있어서, 사출성형되는 카트리지.
  123. 제 103 항에 있어서, 일회용인 카트리지.
  124. 제 103 항에 있어서,내용물 혼합수단을 포함하는 카트리지.
  125. 제 124 항에 있어서, 혼합수단이 음파처리 장치인 카트리지.
  126. 제 125 항에 있어서, 음파처리 장치가 카트리지내 전극에 구조적으로 커플링된 압전장치인 카트리지.
  127. 제 103 항에 있어서, 전기화학발광 분석이 균질인 카트리지.
  128. (a)각각 중합체 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 함유하는 복합체를 포함하는 하나 이상의 전극을 포함하는 카트리지(여기에서,하나 이상의 전극 각각은 하나 또는 다수의 결합영역을 갖고, 각각의 영역은 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유한다); 및
    (b)각각의 결합영역으로부터 광을 선택적으로 검출 또는 정량하는 수단을 포함하는, 분석물의 검출 또는 정량용 전기화학발광 분석을 수행하기 위한 계측기 시스템.
  129. 제 128 항에 있어서, 탄소 입자가 피브릴인 계측기 시스템.
  130. 제 128 항에 있어서, 카트리지의 내용물 혼합수단을 포함하는 계측기 시스템.
  131. 제 128 항에 있어서, 카트리지가 건조 분석시약을 포함하는 계측기 시스템.
  132. 제 128 항에 있어서, 광 검출 또는 정량 수단이 CCD인 계측기.
  133. 제 128 항에 있어서, 광 검출 또는 정량 수단이 포토다이오드인 계측기.
  134. 제 128 항에 있어서, 카트리지의 온도 조절을 위한 온도 제어수단을 포함하는 계측기.
  135. (a)각각 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 함유하는 복합체를 포함하는 하나 이상의 전극을 포함하는 카트리지(여기에서, 하나 이상의 전극 각각은 하나 또는 다수의 결합영역을 갖고, 각각의 영역은 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유한다);
    (b)각각의 결합영역으로부터 광을 선택적으로 검출 또는 정량하는 수단; 및
    (c)카트리지 내용물 혼합수단을 포함하는, 분석물의 검출 또는 정량을 위한 전기화학발광 분석 수행용 계측기 시스템.
  136. 제 135 항에 있어서, 혼합 시스템이 음파 처리장치인 계측기 시스템.
  137. (a)각각 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 입자를 함유하는 복합체를 포함하는 하나 이상의 전극을 포함하는 카트리지(여기에서, 하나 이상의 전극 각각은 하나 또는 다수의 결합영역을 갖고, 각각의 영역은 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유한다);
    (b)하나 이상의 전극에서 전위를 인가하는 수단;
    (c)결합영역으로부터 광을 선택적으로 검출 또는 정량하는 수단;
    (d)결합영역으로부터의 광 검출 또는 정량 수단의 작동과 하나 이상의 전극에서의 전위 인가를 조화시키는 전자수단; 및
    (e)광 검출 또는 정량 수단으로부터 수신된 정보의 저장 또는 처리용 전자수단을 포함하는, 분석물의 검출 또는 정량을 위한 전기화학발광 분석 수행용 계측기 시스템.
  138. 제 137 항에 있어서, 카트리지 내용물 혼합수단을 포함하는 계측기 시스템.
  139. 제 137 항에 있어서, 카트리지가 건조 분석시약을 포함하는 계측기 시스템.
  140. 제 137 항에 있어서, 탄소 입자가 피브릴인 계측기 시스템.
  141. (a)각각 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 하나 또는 다수의 결합영역을 각각 갖는 하나 이상의 전극을 포함하는 카트리지;
    (b)하나 이상의 전극에서 전위를 인가하는 수단;
    (c)결합영역으로부터 광을 선택적으로 검출 또는 정량하는 수단;
    (d)결합영역으로부터의 광 검출 또는 정량 수단의 작동과 하나 이상의 전극에서의 전위 인가를 조화시키는 전자수단; 및
    (e)광 검출 또는 정량 수단으로부터 수신된 정보의 저장 또는 처리용 전자수단을 포함하는, 분석물의 검출 또는 정량을 위한 전기화학발광 분석 수행용 계측기 시스템.
  142. 제 141 항에 있어서, 카트리지 내용물 혼합수단을 포함하는 계측기 시스템.
  143. 제 141 항에 있어서, 카트리지의 온도 조절을 위한 온도 제어수단을 포함하는 계측기.
  144. 제 141 항에 있어서, 카트리지가 건조 분석시약을 포함하는 계측기 시스템.
  145. 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴의 복합체로 이루어지고 결합분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는 전극을 포함하는 분석물 검출용 장치.
  146. 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 함유하는 복합체를 포함하고, 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 결합영역을 갖는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 전극.
  147. 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 함유하는 복합체를 포함하는, 생체 분자 고정용 고체상 지지체.
  148. 제 147 항에 있어서, 매트릭스가 중합체인 고체상 지지체.
  149. 제 147 항에 있어서, 지지체가 분석물의 검출 또는 정량에 사용되는 고체상 지지체.
  150. 제 147 항에 있어서, 효소가 지지체상에 고정되는 고체상 지지체.
  151. 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하고, 생체 분자가 고정되어 있는, 전기화학발광에 의한 분석물 검출용 전극.
  152. 각각 매트릭스 및 여기에 분산된 다수의 탄소 피브릴을 포함하고, 각각이 결합 전기화학발광 분석의 성분과 결합할 수 있는 시약을 함유하는 하나 또는 다수의 결합영역을 갖는 하나 이상의 전극을 포함하는, 분석물 검출 또는 정량을 위한 전기화학발광 분석 수행용 계측기 시스템에 사용하기 위한 카트리지.
  153. 제 145 항에 있어서, 하나 이상의 전극 외에, 건조 분석시약을 함유하는 카트리지.
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