KR101981662B1 - 형질전환된 미생물 예컨대 피치아 패스토리스에서 다중-서브유닛 단백질 예컨대 항체의 고순도 생산 - Google Patents

Abstract

형질전환된 세포에서 이종기원 다중-서브유닛 단백질을 생산하는 방법이 개시된다. 특히, 본 개시내용은 원하지 않는 부산물의 고수율 및 감소된 생산과 함께 분비되거나 분비되지 않는, 항체 및 다른 다중-서브유닛 단백질을 포함하는 다중-서브유닛 단백질의 개선된 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 상기 형질전환된 세포는 효모, 예를 들면, 메탄올자화 효모 예컨대 피치아 패스토리스이다.

Description

형질전환된 미생물 예컨대 피치아 패스토리스에서 다중-서브유닛 단백질 예컨대 항체의 고순도 생산 {HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS}

관련 출원 개시내용

본원은 미국 가출원 시리즈 번호 61/525,307 (변리사 문서 번호 67858.730200, 2011년 8월 19일 출원, 명칭 "MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS", 미국 가출원 시리즈 번호 61/488,660 (변리사 문서 번호 67858.730300, 2011년 5월 20일 출원, 명칭 "ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF", 미국 가출원 시리즈 번호 61/496,860 (변리사 문서 번호 67858.760000, 2011년 6월 14일 출원, 명칭 "USE OF ANTI-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO PREVENT OR INHIBIT PHOTOPHOBIA IN SUBJECTS IN NEED THEREOF, ESPECIALLY MIGRAINE SUFFERERS", 및 미국 가출원 시리즈 번호 61/496,873 (변리사 문서 번호 67858.770000, 2011년 6월 14일 출원, 명칭 "USE OF ANTI-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO TREAT DIARRHEA IN SUBJECTS WITH DISEASES OR TREATMENTS THAT RESULT IN ELEVATED CGRP LEVELS"의 이점을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.

본원은 2012년 5월 8일에 만들어진 파일명 "67858o711002.txt"에서 EFS-Web를 통해 ASCII 포맷으로 제출되고 315,392 바이트의 크기를 갖는 서열목록을 포함하고, 이는 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.

분야

본 개시내용은 일반적으로 형질전환된 세포에서 이종기원 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은, 원하지 않는 부산물의 생산을 감소시키고/시키거나 수율을 증가시키면서, 분비될 수 있거나 분비될 수 없는, 항체 및 다른 다중-서브유닛 단백질을 포함하는 다중-서브유닛 단백질을 생산하는 개선된 방법을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 형질전환된 세포는 효모, 예컨대 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 또는 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae)이다.

종래의 항체는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 사량체 단백질이다. 특정 유형의 순수한 인간 항체는 다수의 목적을 위해 천연 공급원으로부터 충분한 양으로 정제하는 것이 어렵거나 불가능할 수 있다. 그 결과, 생명공학 및 제약 회사는 큰 규모로 항체를 제조하기 위해 재조합 DNa-기반 방법에 의지하였다. 기능적 항체의 생산은 일반적으로, 2개의 폴리펩타이드의 합성뿐만 아니라 N-말단 분비 신호 서열의 단백분해 처리; 적절한 접힘 및 폴리펩타이드의 사량체로의 어셈블리; 디설파이드 결합의 형성을 포함하는, 수많은 후번역 사건도 포함하며; 전형적으로 특이적 N-연결된 글리코실화를 포함한다. 이들 사건은 모두 진핵세포 분비 경로, 진핵세포에 독특한 소기관 복합체에서 일어난다.

그와 같은 복합 단백질의 재조합 합성은 전형적으로 고등 진핵세포의 배양물에 의거하여 생물학적으로 활성 물질을 생산하며, 배양된 포유동물 세포는 매우 통상적으로 사용된다. 그러나, 포유동물 조직 배양-기반 생산 시스템은 유의미한 추가 비용이 발생하고 미생물 발효 방법에 비해 복잡해진다. 추가로, 포유동물 세포 배양물로부터 유래된 생성물은 배양 세포 또는 배양에 사용된 동물-유래 생성물, 예컨대 혈청에 존재할 수 있는 포유동물 병원체 (바이러스 포함)가 없음을 보장하기 위해 부가적 안전성 시험을 필요로 할 수 있다.

선행 작업은, 연구, 진단 및 치료 용도에 잠재적으로 적당한 기능적 항체를 생산하기 위해, 비용-효과적인 플랫폼으로서 효모 피치아 패스토리스를 확립하는데 도움이 되었다. 공유의 미국 특허 7,935,340 및 7,927,863을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다. 세포 밀도, 액체배지 용적, 기질 공급 속도, 및 각 반응 단계의 길이의 최적화를 포함하는, 재조합 단백질의 발현을 위한 피. 패스토리스 발효의 디자인 및 최적화를 위한 방법이 상기 문헌에 또한 공지되어 있다. Zhang 등, "Rational Design and Optimization of Fed-batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63 참고.

재조합 다중-서브유닛 단백질이 배양 세포로부터 생산될 수 있더라도, 원하지 않는 부산물이 또한 생산될 수 있다. 예를 들면, 배양 세포는 유리 모노머, 부정확한 화학양론을 갖는 복합체, 또는 원하지 않는 또는 이상 글리코실화를 갖는 단백질과 함께 원하는 다중-서브유닛 단백질을 생산할 수 있다. 원하는 다중-서브유닛 단백질의 정제는 생산 비용을 증가시킬 수 있으며, 정제에 관여된 단계는 활성 복합체의 총 수율을 감소시킬 수 있다. 게다가, 심지어 정제 후에도, 원하지 않는 부산물이 걱정스러운 양으로 존재할 수 있다. 예를 들면, 글리코실화된 부산물은 투여 후 면역 반응의 위험을 증가시키는 양으로 존재할 수 있으며, 한편 이상 복합체 또는 응집물은 비활성을 감소시킬 수 있고 또한 잠재적으로 면역원성일 수 있다.

요약

대부분의 IgG1 항체 분자는 총 16 개의 사슬내 및 사슬간 디설파이드 브릿지에 의해 안정된다. 사슬내 디설파이드 브릿지는 중쇄 및 경쇄 모두에서 IgG 도메인의 접힘을 안정시키고, 한편 사슬간 디설파이드 브릿지는 중쇄와 경쇄 사이의 회합을 안정시킨다. 이들 결합의 결과로서, 항체는 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄 (H2L2)를 함유하는 안정한 복합체를 형성한다. 그러나, 부적절한 디설파이드 결합 형성으로 인해, 생성물-연관된 변이체는 재조합 항체 제제에서 때때로 발견되고, 이 제제는, 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄 (H1L1)를 갖는 복합체 및 2 개의 중쇄 및 하나의 경쇄 (H2L1)를 갖는 복합체를 포함한다. 게다가, 고차 복합체가 또한 형성될 수 있고 여기서 부가적 사슬간 디설파이드 결합이 형성되고, 이로써 더 큰 수의 공유 결합된 서브유닛이 생긴다.

이하에 추가로 기재된 바와 같이, 출원인은 이제, 효모 배양물로부터 항체의 재조합 생상 동안에 일탈적인 디설파이드 결합을 함유하는 이들 복합체의 생산을 감소시키는 확인된 방법을 갖는다. 구체적으로, 본 방법은 에탄올 볼러스의 배양물에의 부가를 수반하고, 이로써 H1L1, H2L1, 및 H4L4 생성물-연관된 변이체의 생산이 감소되고, 원하는 H2L2 생성물의 순도가 증가한다. H1L1 및 H2L1 복합체는 비-환원된, 변성 SDS-PAGE에 의해 검출되었고, H4L4 복합체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출되었다. 본 방법을 사용하여, 적절한 디설파이드 결합 형성은 용이하게 되고, 이로써 항체 순도는 증가된다. 이것은 3개 상이한 항체에 대해 실증되었고, 이들 3개 모두는 에탄올 볼러스의 부가와 함께 생사될 때 개선된 순도를 나타내었다 (도 1-6). 이들 3 개의 항체는 서열이 상이할뿐만 아니라 3개의 상이한 항원을 인식한다. 게다가, 에탄올 볼러스의 부재에서 생산될 때, 2 개의 항체는 제 3 개의 항체 (도 5)와 비교하여 다량의 H1L1 생성물 (도 1-4)을 함유했다. 다량의 H1L1 생성물을 함유하는 2 개의 항체는 비-표준적 또는 부가적 디설파이드 브릿지를 갖는다, 반면에 제 3은 그렇지 않다. 도 1, 2 및 3에서 예시된 항체는 가변 경쇄 도메인에서 부가적 사슬내 디설파이드 브릿지를 가지며, 한편 도 4에서 예시된 항체는 그의 중쇄에서 부가적 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 과발현된 단백질 중 디설파이드-브릿지의 존재는 숙주에서 세포내 스트레스를 증가시킨다는 것은 하기 문헌에서 보고되었다: (참고 Gasser 등, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, 번호 2, pg. 353-61, 2006년 6월 5일; Inan 등, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 번호 4, pg. 771-78, March 5, 2006; Li 등, Biochem Biophys Res Commun. 2010 November 19; 402(3): 519-524). 이러한 증가된 스트레스는 도 11, 12, 및 13에서 실증된 바와 같이 생족력을 또한 낮게 만들 수 있고, 상기 도면들에서 여분의 사슬내 디설파이드 브릿지를 갖는 항체 모두는 "볼러스 없는" 조건 하에서 더 낮은 생존력을 갖는다. 따라서에 탄올 볼러스의 부가로 생존력 및 순도가 증가된다. 이것은, 트기 다중 디설파이드 브릿지를 갖는 단백질의 발현이 어려울 때 사용될 수 있다.

일 측면에서, 본 개시내용은 하기를 포함하는, 다중-서브유닛 복합체의 생산 방법을 제공한다: (a) 상기 다중-서브유닛 복합체의 서브유닛의 발현을 제공하는 유전자를 포함하는 진핵세포를 포함하는 배양물을 제공하는 단계; (b) 에탄올의 볼러스를 상기 배양물에 부가하는 단계; 및 (c) 상기 배양물을 배양하여 상기 다중-서브유닛 복합체를 생산하는 단계.

에탄올 볼러스는 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 안정한 디설파이드 결합의 형성을 향상시킬 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함하는 1 이상의 폴리펩타이드를 함유할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 1 이상의 생성물-연관된 변이체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의해 검출된 바와 같은 상기 원하는 다중-서브유닛 복합체보다 더 높거나 낮은 겉보기 분자량 을 갖는 생성물-연관된 변이체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 일탈적인 화학양론을 갖는 복합체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 일탈적인 디설파이드 결합을 갖는 복합체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 감소된 시스테인을 갖는 복합체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 일탈적인 글리코실화 를 갖는 복합체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

본 방법은 인터-중쇄 디설파이드 결합의 형성 또는 안정성을 조절할 수 있다.

본 방법은 경쇄 및 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 형성 또는 안정성을 조절할 수 있다.

본 방법은 에탄올 볼러스의 부재에서 영향받은 동일한 방법에 대해 1 이상의 생성물-연관된 변이체의 상대 존재비를 감소시킬 수 있다.

상기 생성물-연관된 변이체는 H1L1, H2L1, 및 H4L4 생성물-연관된 변이체 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 방법은 에탄올의 상기 볼러스의 부재에서 영향받은 상기 방법에 대해 상기 항체의 순도를 증가시킨다.

단계 (b)는 단계 (c) 전에 영향받을 수 있다.

단계 (b)는 단계 (c) 후에 영향받을 수 있다.

단계 (b) 단계 (c)와 동시에 영향받을 수 있다.

단계 (b)로 약 0.01% 내지 약 4% (w/v)의 상기 배양물 중 에탄올의 농도가 될 수 있다.

단계 (b)로 하기의 상기 배양물 중 에탄올의 농도로 될 수 있다: 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%.

단계 (b)로 하기일 수 있는 상기 배양물 중 에탄올의 농도가 될 수 있다: 적어도 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.10%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.6%, 0.6%, 0.7%, 0.8% 또는 0.9% (w/v).

단계 (b)로 하기일 수 있는 상기 배양물 중 에탄올의 농도가 될 수 있다: 많아야 약 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.8%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.35%, 0.3%, 0.25%, 0.2%, 또는 0.15% (w/v).

단계 (b)는 하기를 포함할 수 있다: 에탄올을 상기 배양물에 부가하는 단계, 에탄올을 포함하는 담체를 상기 배양물에 부가하는 단계, 상기 세포를 에탄올을 포함하는 배지 또는 담체에 부가하는 단계, 또는 배양 배지의 일부를 대체하는 단계.

상기 에탄올의 볼러스는 1 내지 20 분의 일정 기간에 걸쳐 배양 배지에 부가될 수 있다.

단계 (c)는 산소를 상기 세포에 제공하는 것을 포함할 수 있다.

상기 산소의 제공은 상기 배양물을 진탕시키는 것을 포함할 수 있는.

상기 산소의 제공은 상기 배양물을 산소를 포함하는 가스 혼합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

단계 (c)는 탄소 공급원을 포함하는 공급물을 상기 배양물에 부가하는 것을 포함할 수 있다.

상기 공급물은 적어도 하나의 발효성 탄소 공급원을 포함할 수 있다.

상기 공급물은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 글루코오스, 에탄올, 시트레이트, 소르비톨, 자일로스, 트레할로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 푸룩토오스, 멜리비오스, 락토오스, 말토오스, 람노스, 리보오스, 만노스, 만니톨, 및 라피노오스.

본 방법은 에탄올의 농도를 단계 (c) 동안에 상부 설정값 내지 하부 설정값에서 유지하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 하부 설정값은 하기일 수 있다: 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.10%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.6%, 0.6%, 0.7%, 0.8% 또는 0.9% (w/v).

상기 상부 설정값은 하기일 수 있다: 약 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.8%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.35%, 0.3%, 0.25%, 0.2%, 또는 0.15% (w/v).

상기 상부 설정값은 많아야 약 1.5%, 1.4%, 1.3, 1.2%, 또는 1.1% (w/v)일 수 있다.

본 방법은 에탄올의 농도를 단계 (c) 동안에 설정값에서 유지하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 설정값은 하기일 수 있다: 약 0.1%, 0.2%, 0. 3%, 0. 4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 01.%, 01.1%, 01.2%, 01.3%, 01.4%, 또는 01.5% (w/v).

단계 (c)는 하기의 상기 배양물 중 에탄올의 농도를 유지하는 것을 포함할 수 있다: 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%.

상기 배양물 중 에탄올의 농도는 상기 세포에 의해 또는 에탄올의 상기 배양물에의 부가에 의해 에탄올의 생산을 조절하여 유지될 수 있다.

에탄올의 생산을 조절하는 단계는 하기 중 하나 이상을 조절하는 것을 포함할 수 있다: 글루코오스의 농도, 산소의 이용가능성, 진탕의 세기, 가스 압력, 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물의 유속, 배양물의 점도, 배양물의 밀도, 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물 중 산소의 농도, 및 온도.

단계 (a)와 단계 (b) 사이의 시간은 하기일 수 있다: 약 72 시간 미만, 약 48 시간 미만, 약 24 시간 미만, 약 12 시간 미만, 약 9 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4 시간 미만, 약 3 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 30 분 미만, 약 5 분 미만, 또는 약 1 분 미만.

단계 (b)와 단계 (c) 사이의 시간은 하기일 수 있다: 약 10 시간 미만, 약 9 시간 미만, 약 8 시간 미만, 약 7 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4 시간 미만, 약 3 시간 미만, 약 2 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 80 분 미만, 약 70 분 미만, 약 60 분 미만, 약 50 분 미만, 약 40 분 미만, 약 30 분 미만, 약 20 분 미만, 약 10 분 미만, 약 5 분 미만, 또는 약 1 분 미만.

단계 (a)의 배양물은 탄소 공급원을 상기 배양물에 부가하고 탄소 공릅원이 결실될 때까지 상기 배양물을 배양하여 생산될 수 있다.

상기 탄소 공급원은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 글리세롤, 글루코오스, 에탄올, 시트레이트, 소르비톨, 자일로스, 트레할로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 푸룩토오스, 멜리비오스, 락토오스, 말토오스, 람노스, 리보오스, 만노스, 만니톨, 및 라피노오스.

탄소 공급원의 결실은 진핵세포의 대사 활성의 상기 감소를 검출하여 측정될 수 있다.

진핵세포의 대사 활성의 상기 감소는 상기 진핵세포에 의한 산소의 소비의 감소를 검출하고, 배양물 중 pH의 증가를 검출하고, 습성 세포 덩어리의 안정화를 검출하거나, 배양물 중 암모니아 농도의 증가를 검출하여 확인될 수 있고.

상기 진핵세포에 의한 산소의 소비의 감소는 상기 배양물 중 용해된 산소의 농도의 증가를 검촐하여 확인될 수 있다.

상기 진핵세포는 효모 세포를 포함할 수 있다.

상기 효모 세포는 메탄올자화 효모를 포함할 수 있다.

상기 메탄올자화 효모는 피치아속일 수 있다.

상기 피치아속의 메탄올자화 효모는 피치아 패스토리스일 수 있다.

상기 피치아속의 메탄올자화 효모는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 피치아 앙구스타, 피치아 길레르모르디이, 피치아 메타놀리카, 및 피치아 이노시토베라.

상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 제공하는 유전자는 1 이상의 게놈 유전자자리에 통합될 수 있다.

상기 게놈 유전자자리의 적어도 하나는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: pGAP 유전자자리, 3' AOX TT 유전자자리; PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG; 및 HIS4 TT 유전자자리.

다중-서브유닛 복합체의 상기 서브유닛을 인코딩하는 유전자의 적어도 하나는 유도성 또는 항시적 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다.

상기 유도성 프로모터는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: AOX1, CUP1, 테트라사이클린 유도성, 티아민 유도성, 및 FLD1 프로모터.

다중-서브유닛 복합체의 상기 서브유닛을 인코딩하는 유전자의 적어도 하나는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다: CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데하이드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 그것으로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유동물 프로모터, 곤충 프로모터, 식물성 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 및 조류 프로모터.

상기 진핵세포는 2배체, 4배체 세포, 또는 다배체일 수 있다.

본 방법은 상기 진핵세포로부터 또는 배양 배지로부터 상기 다중-서브유닛 복합체를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 상기 진핵세포의 세포내 성분, 세포질, 핵형질, 또는 막으로부터 정제될 수 있다.

상기 진핵세포는 상기 다중-서브유닛 복합체를 배양 배지로 분비한다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 상기 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 인간 항체 또는 인간화 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

상기 인간화 항체는 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 또는 소 기원일 수 있다.

상기 인간화 항체는 토끼 기원일 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 1가, 이가, 또는 다가 항체를 포함할 수 있다.

상기 항체는 단백질 A 및/또는 단백질 G 친화도에 의해 상기 배양물로부터 정제될 수 있다.

상기 패널 중 상기 진핵세포의 적어도 하나에서 상기 다중-서브유닛 복합체의 서브유닛의 발현을 제공하는 유전자의 적어도 하나는 상기 진핵세포에서 발현을 위해 최적화될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있고 상기 항체의 순도는 기대된 겉보기 유체역학적 반경을 갖는 항체 복합체에 함유될 수 있고, 기대된 분자량을 갖는 항체 복합체에 함유되고/거나 상기 항체의 표적에 특이적으로 결합하는 상기 진핵세포에 의해 생산된 항체의 분획을 측정하여 평가될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있고 상기 항체의 수율은 비정상적으로 글리코실화되고, 기대된 겉보기 유체역학적 반경을 갖는 복합체 이외의 항체 복합체에 함유되고, 기대된 분자량을 갖는 항체 복합체에 함유되고/거나 상기 항체의 표적에 특이적으로 결합하지 못할 수 있는 임의의 생성물-연관된 변이체를 무시하여 상기 진핵세포에 의해 생산된 항체의 양을 측정하여 평가될 수 있다.

상기 항체 복합체의 분자량은 비-환원 SDS-PAGE에 의해 측정될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있고, 상기 방법은 상기 항체를 정제하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

상기 배양물 세포는 하기의 상청액 항체 역가를 생성할 수 있다: 적어도 100 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 250 mg/L, 적어도 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L, 적어도 1000 mg/L, 적어도 1250 mg/리터, 적어도 1500 mg/리터, 적어도 약 1750 mg/리터, 적어도 약 2000 mg/리터, 적어도 약 10000 mg/리터, 또는 그 초과.

상기 다중-서브유닛 복합체의 하나 이상의 서브유닛은 하나 초과의 유전자 복제물로부터 발현될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 복제물 및 상기 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 복제물로부터 발현될 수 있는 항체를 포함할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 제공하는 유전자는 상기 세포의 게놈에 통합될 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 제공하는 유전자는 염색체외 요소, 플라스미드, 또는 인공 염색체 상에 함유될 수 있다.

상기 세포는 상기 항체의 중쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복제물보다 더 많은, 상기 항체의 경쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복제물을 포함할 수 있다.

상기 세포 중 상기 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자의 복제물의 수 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자의 복제물의 수 각각은 하기일 수 있다: 2 및 2, 2 및 3, 3 및 3, 3 및 4, 3 및 5, 4 및 3, 4 및 4, 4 및 5, 4 및 6, 5 및 4, 5 및 5, 5 및 6, 또는 5 및 7.

상기 세포 중 상기 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자의 복제물의 수 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자의 복제물의 수 각각은 하기일 수 있다: 2 및 1, 3 및 1, 4 및 1, 5 및 1, 6 및 1, 7 및 1, 8 및 1, 9 및 1, 10 및 1, 1 및 2, 2 및 2, 3 및 2, 4 및 2, 5 및 2, 6 및 2, 7 및 2, 8 및 2, 9 및 2, 10 및 2, 1 및 3, 2 및 3, 3 및 3, 4 및 3, 5 및 3, 6 및 3, 7 및 3, 8 및 3, 9 및 3, 10 및 3, 1 및 4, 2 및 4, 3 및 4, 4 및 4, 5 및 4, 6 및 4, 7 및 4, 8 및 4, 9 및 4, 10 및 4, 1 및 5, 2 및 5, 3 및 5, 4 및 5, 5 및 5, 6 및 5, 7 및 5, 8 및 5, 9 및 5, 10 및 5, 1 및 6, 2 및 6, 3 및 6, 4 및 6, 5 및 6, 6 및 6, 7 및 6, 8 및 6, 9 및 6, 10 및 6, 1 및 7, 2 및 7, 3 및 7, 4 및 7, 5 및 7, 6 및 7, 7 및 7, 8 및 7, 9 및 7, 10 및 7, 1 및 8, 2 및 8, 3 및 8, 4 및 8, 5 및 8, 6 및 8, 7 및 8, 8 및 8, 9 및 8, 10 및 8, 1 및 9, 2 및 9, 3 및 9, 4 및 9, 5 및 9, 6 및 9, 7 및 9, 8 및 9, 9 및 9, 10 및 9, 1 및 10, 2 및 10, 3 및 10, 4 및 10, 5 및 10, 6 및 10, 7 및 10, 8 및 10, 9 및 10, 10 및 10.

상기 단계 (c)의 배양물은 생산 배지에서 성장될 수 있다.

상기 생산 배지는 최소 배지일 수 있다.

상기 최소 배지가 선택적 제제가 부족하다.

상기 최소 배지는 전-형성된 아미노산 또는 다른 복합 생체분자가 부족하다.

상기 생산 배지는 복합 배지일 수 있다.

상기 복합 배지는 효모 추출물, 콩 펩톤, 및 다른 식물성 펩톤 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 단계 (c)의 배양물은 may be 성장되어 높은 세포 밀도로 될 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 50 g/L일 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 100 g/L일 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 300 g/L일 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 400 g/L일 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 500 g/L일 수 있다.

상기 높은 세포 밀도는 적어도 750 g/L일 수 있다.

효모 세포는 적어도 20 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 20 배증 후 높은 수준의 상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 유지할 수 있다.

단계 (c)의 세포는 적어도 50 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 50 배증 후 높은 수준의 상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 유지할 수 있다.

단계 (c)의 세포는 적어도 100 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 100 배증 후 높은 수준의 상기 다중-서브유닛 복합체의 발현을 유지할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체의 적어도 하나의 서브유닛은 분비 신호를 포함할 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 항체를 포함할 수 있다.

분비 신호는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다: 서열번호: 414 내지 437 및 이들의 임의 조합.

상기 다중-서브유닛 복합체는 하기에 개시된 임의의 항체는 아닐 수 있다: 미국 가출원 번호 61/418,832 (2010년 12월 1일 출원), PCT/US11/62963 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/309,295 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/309,153 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/308,665 (2011년 12월 1일 출원), 및 미국 시리즈 번호 13/308,831 (2011년 12월 1일 출원).

상기 다중-서브유닛 복합체는 하기아 아닐 수 있다: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 및 Ab21-NGF, 또는 Fab2 또는 Fab1 그의 단편.

상기 다중-서브유닛 복합체는 하기 항체: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 또는 Ab21-NGF의 임의 것에 함유되고 임의로 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 모두 6 개를 함유하지 않을 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 서열번호: 51 및 401, 각각, 서열번호: 53 및 402, 각각, 서열번호: 405 및 406, 각각, 및 서열번호: 407 및 408, 각각의 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드 서열을 포함하지 않거나 그것으로 이루어지지 않을 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 서열번호: 55, 56, 57, 58, 59, 및 60의 CDR의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 모두 6 개를 함유하고, 임의로 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하지 않을 수 있다.

상기 다중-서브유닛 복합체는 본원의 하기에서 개시된 임의의 항체 또는 항체 코딩 서열을 포함하지 않을 수 있다: 섹션 명칭 "NGF에 대한 결합 활성을 갖는 항-NGF 항체 및 그의 결합 단편" 및 "항-NGF 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드". 일 측면에서, 본 개시내용은 다중-서브유닛 복합체의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 하기를 포함할 수 있다: 상기 다중-서브유닛 복합체를 발현시키는 진핵세포를 포함하는 배양물을 제공하는 숙주세포를 배양하는 단계, 에탄올의 볼러스 7을 상기 배양물에 부가하는 단계, 및 상기 배양물을 배양하여 상기 다중-서브유닛 복합체를 생산하는 단계. 다중-서브유닛 복합체는 1 이상의 디설파이드 결합을 포함할 수 있고 항체일 수 있다.

에탄올 볼러스 농도 (% w/v로서 표현됨)는 하기일 수 있다: 약 0.1% 내지 약 5%, 예컨대 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 최대 약 1%, 최대 약 1.1%, 최대 약 1.2%, 최대 약 1.3%, 최대 약 1.4%, 최대 약 1.5%, 최대 약 1.6%, 최대 약 1.7%, 최대 약 1.8%, 최대 약 1.9%, 최대 약 2%, 최대 약 3%, 최대 약 4%, 또는 최대 약 5%, 예컨대 약 0.1% 내지 약 1.9%, 약 0.2% 내지 약 1.8%, 약 0.3% 내지 약 1.7%, 약 0.4% 내지 약 1.6%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.6% 내지 약 1.4%, 약 0.7% 내지 약 1.3%, 약 0.8% 내지 약 1.2%, 또는 약 0.9% 내지 약 1.1%, 예컨대 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 1.6%, 약 1.7%, 약 1.8%, 약 1.9%, 약 2%, 약 2.5%, 약 3%, 약 4%, 또는 약 5%.

본 방법은 상기 원하는 다중-서브유닛 복합체의 정제를 추가로 포함할 수 있다.

예시적인 구현예에서 에탄올 농도는 에탄올 볼러스의 부가 후에 조절될 수 있고, 상기 볼러스는 원하는 설정값에서 또는 원하는 설정값 범위 내에 에탄올 농도를 유지하기 위해 사용될 수 있다. 설정값 (% w/v로서 표현됨)는 하기일 수 있다: 약 0.1% 내지 약 4%, 적어도 약 0.01%, 적어도 약 0.02%, 적어도 약 0.04%, 적어도 약 0.06%, 적어도 약 0.08%, 적어도 약 0.1%, 적어도 약 0.15%, 적어도 약 0.2%, 적어도 약 0.25%, 적어도 약 0.3%, 적어도 약 0.35%, 적어도 약 0.4%, 적어도 약 0.45%, 적어도 약 0.5%, 적어도 약 0.6%, 적어도 약 0.7%, 적어도 약 0.8%, 적어도 약 0.9%, 적어도 약 1%, 적어도 약 1.2%, 적어도 약 1.4%, 적어도 약 1.6%, 적어도 약 1.8%, 적어도 약 2%, 최대 약 4%, 최대 약 3.75%, 최대 약 3.5%, 최대 약 3.25%, 최대 약 3%, 최대 약 2.75%, 최대 약 2.5%, 최대 약 2.25%, 최대 약 2%, 최대 약 1.75%, 최대 약 1.5%, 최대 약 1.25%, 최대 약 1%, 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%. 예를 들면, 설정값은 볼러스 농도와 동일할 수 있거나 볼러스 농도의 플러스 또는 마이너스 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 내에 있을 수 있다.

에탄올 농도 설정값은 발효 동안에 효모 세포로 에탄올 생산을 조절하여 유지될 수 있다. 예를 들면, 에탄올 농도는 하기에 의해 증가될 수 있다: 글루코오스의 농도의 증가 (예를 들면, 글루코오스 공급물의 속도 증가), 산소의 이용가능성의 감소, 진탕의 세기의 감소 (예를 들면, 발효조 입력 전력의 저하), 발효조에서의 가스 압력 감소, 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물의 유속의 감소, 배양물의 점도의 증가, 또는 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물 중 산소의 농도의 감소 (예를 들면, 산소가 보충되면). 에탄올 생산은 또한 발효 농도의 증가에 의해 증가될 수 있다. 마찬가지로, 에탄올 농도는 하기에 의해 감소될 수 있다: 글루코오스 농도의 감소 (예를 들면, 글루코오스 공급물의 속도 감소), 산소의 이용가능성의 증가, 진탕의 세기의 증가 (예를 들면, 발효조 입력 전력의 증가), 발효조에서의 가스 압력 증가, 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물의 유속의 증가, 배양물의 점도의 감소, 또는 공급된 공기 또는 다른 가스 혼합물 중 산소의 농도의 증가 (예를 들면, 산소가 보충되면. 에탄올 생산은 발효 온도의 감소에 의해 또한 감소될 수 있다.

본 개시내용의 방법을 사용하여, 원하지 않는 부산물(들)의 상대 존재비는, 종래의 방법에 관하여, 초기 존재비 수준과 비교하여 하기까지 감소될 수 있다: 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 검출불가능 수준 아래. 상대 존재비가 그렇게 감소될 수 있는 예시적인 원하지 않는 부산물은 원하는 다중-서브유닛 복합체보다 상이한 겉보기 분자량을 갖는 1 이상의 종을 포함할 수 있다. 예를 들면, 겉보기 분자량은 화학양론, 접힘, 복합체 어셈블리, 및/또는 글리코실화의 차이에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 원하지 않는 부산물은 크기 배제 크로마토그래피 및/또는 겔 전기영동을 사용하여 검출될 수 있고, 원하는 다중-서브유닛 복합체보다 더 높거나 낮은 겉보기 분자량을 가질 수 있다. 예시적인 구현예에서, 원하지 않는 부산물은 감소 조건 하에서 검출될 수 있다. 다른 예시적인 구현예에서, 원하지 않는 부산물은 비-환원 조건 하에서 검출될 수 있다.

예시적인 구현예에서, 본 개시내용은 또한, 항체 및 다른 다중-서브유닛 복합체의 재조합 생산을 고수율로 제공하는 개선된 방법 및 물질의 조성물을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 수율은 본원에 개시된 방법을 사용하여 (종래의 방법)에 해대 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 100%, 또는 그 초과까지 증가될 수 있다.

예시적인 구현예에서, 다중-서브유닛 단백질이 생산될 수 있는 숙주세포는 예를 들면 피치아 종 예컨대 피. 패스토리스 에서 효모일 수 있거나, 또는 사카로마이세스 종 예컨대 에스. 세레비스시아에, 또는 또 하나의 효모 예컨대 쉬조사카로마이세스 (예를 들면, 에스 . 폼베)에서 또 하나의 메탄올자화 효모일 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 메탄올자화 효모의 다른 예는 하기를 포함한다: 피치아 앙구스타 (한세눌라 폴리모르파로도 당해분야에서 공지됨), 피치아 길레르모르디이, 피치아 메타놀리카, 피치아 이노시토베라 , 오가타에아 니트라토아베르사 , 및 칸디다 보이디니이.

숙주세포는 진핵세포, 예컨대 효모 세포, 예컨대 메탄올자화 효모, 예컨대 피치아속의 효모일 수 있다. 피치아속 의 예시적인 메탄올자화 효모는 피치아 패스토리스, 피치아 앙구스타, 피치아 길레르모르디이, 피치아 메타놀리카, 및 피치아 이노시토베라를 포함한다. 숙주세포는 교배하여, 예를 들면, 다중-서브유닛 복합체의 서브유닛을 인코딩하는 적어도 하나의 유전자의 1 이상의 복제물을 함유하는 2 개의 반수체 효모 세포 각각을 교배하여 생산될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 피치아속의 메탄올자화 효모는 피치아 패스토리스이다. 숙주세포는 2배체 또는 4배체 세포일 수 있다.

상기 원하는 항체 경쇄 및/또는 중쇄와 같은 원하는 다중-서브유닛 복합체의 상기 서브유닛을 인코딩하는 상기 유전자의 적어도 하나는 하기와 같은 유도성 또는 항시적 프로모터의 조절 하에서 발현될 수 있다: CUP1 (배지에서 구리의 수준에 의해 유도됨; 참고 Koller 등, Yeast 2000; 16: 651-656.), 테트라사이클린 유도성 프로모터 (참고, 예를 들면, Staib 등, Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Jan. 2008, p. 146-156), 티아민 유도성 프로모터, AOX1, ICL1, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데하이드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 그것으로부터 유래된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유동물 프로모터, 곤충 프로모터, 식물성 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 및 조류 프로모터.

숙주세포는 상기 원하는 다중-서브유닛 복합체를 배양 배지에 분비할 수 있다. 대안적으로 또는 또한, 상기 원하는 다중-서브유닛 복합체는 상기 숙주세포에서 유지될 수 있고 그것으로부터 단리될 수 있다.

원하는 다중-서브유닛 복합체는 항체, 예컨대 단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 항체는 임의의 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

원하는 다중-서브유닛 복합체는 하기에서 개시된 임의의 항체 이외의 다른 항체 (예를 들면, 임의의 항-NGF 항체 이외의 항체)일 수 있다: 미국 가출원 번호 61/418,832 (2010년 12월 1일 출원), PCT/US11/62963 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/309,295 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/309,153 (2011년 12월 1일 출원), 미국 시리즈 번호 13/308,665 (2011년 12월 1일 출원), 및 미국 시리즈 번호 13/308,831 (2011년 12월 1일 출원). 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 하기 항체 중 임의의 것이 아닐 수 있다: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 및 Ab21-NGF. 추가의 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 임의의 하기 항체의 Fab2 단편이 아닐 수 있다: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 및 Ab21-NGF. 추가의 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 임의의 하기 항체의 Fab1 단편이 아닐 수 있다: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 및 Ab21-NGF. 추가의 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 임의의 하기 항체: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF, 또는 Ab21-NGF에서 함유되고 임의로 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 상보성 결정 영역 (CDR)의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 모두 6 개를 함유하는 항체를 포함하지 않을 수 있다. 예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 하기를 포함하지 않거나 그것으로 이루어지지 않을 수 있다: 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드 서열 서열번호: 51 및 401, 각각, 및/또는 서열번호: 53 및 402, 각각, 및/또는 서열번호: 405 및 406, 각각, 및/또는 서열번호: 407 및 408, 각각. 추가 예로서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 서열번호: 55, 56, 57, 58, 59, 및 60의 CDR의 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 또는 적어도 모두 6 개를 함유하고, 임의로 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 포함하지 않을 수 있다.

원하는 다중-서브유닛 복합체는 임의의 유형의 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 항체 유형은 임의의 포유동물 종, 예를 들면, 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 양, 소, 등의 항체를 포함한다. 바람직하게, 항체는 토끼 기원일 수 있는 인간 항체 또는 인간화 항체이다. 원하는 항체는 1가, 이가, 또는 다가 항체일 수 있다.

상기 패널 중 상기 숙주세포의 적어도 하나에서 원하는 다중-서브유닛 복합체, 예컨대 원하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 서브유닛의 발현을 제공하는 상기 유전자의 적어도 하나는 (예를 들면, 바람직한 코돈을 선택하고/거나 코돈 선택을 통해 백분율 AT를 변경하여) 상기 숙주세포에서 발현을 위해 최적화될 수 있다.

상기 원하는 다중-서브유닛 복합체, 예컨대 원하는 항체의 순도는 비-글리코실화되고, 기대된 겉보기 유체역학적 반경 및/또는 겉보기 분자량 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정됨)를 갖는 복합체에 함유되고, 기대된 전기영동 이동도 (예를 들면, 겔 전기영동, 예컨대 SDS-PAGE, 및 임의로 웨스턴 블랏팅에 의해 검출됨)를 갖는 상기 숙주세포에 의해 생산된 원하는 다중-서브유닛 복합체의 분획을 측정하고/거나 다중-서브유닛 복합체의 비활성 (예를 들면, 원하는 항체의 표적에 대한 특이적 결합)을 측정하여 평가될 수 있다.

원하는 다중-서브유닛 복합체는 항체일 수 있고, 상기 항체의 수율은 글리코실화되고, 기대된 겉보기 분자량 또는 유체역학적 반경을 갖는 복합체 이외의 항체 복합체에 함유되고/거나 상기 원하는 항체의 표적에 특이적으로 결합하지 못하는 임의의 생성물-연관된 변이체를 무시하는 상기 숙주세포에 의해 생산된 원하는 항체의 양을 측정하여 평가될 수 있다.

본 방법은 하기의 상청액 항체 역가를 생성할 수 있다: 적어도 100 mg/L, 적어도 150 mg/L, 적어도 200 mg/L, 적어도 250 mg/L, 적어도 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L 또는 과잉의 1000 mg/L 예를 들면, 1200 mg/L 만큼, 10,000 mg/L, 또는 그 초과 만큼.

또 하나의 측면에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체를 생산하는 숙주세포는 피치아속의 2배체 또는 4배체 세포, 예컨대 피치아 패스토리스 세포일 수 있다. 상기 원하는 다중-서브유닛 복합체, 예컨대 원하는 항체의 경쇄 및 중쇄의 서스유닛의 발현을 제공하는 유전자는 상기 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고/거나 염색체외 요소, 플라스미드, 또는 인공 염색체 상에 함유될 수 있다.

또 하나의 측면에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체를 생산하는 숙주세포는 예를 들면 하기에 추가로 기재된 바와 같이 수율 및/또는 순도를 증가시키기 위해 조작될 수 있다: 미국 가출원 시리즈 번호 61/525,307 (변리사 문서 번호 67858.730200, 2011년 8월 31일 출원), 이것은 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 항체 또는 다른 다중-서브유닛 복합체의 수율 및 순도는 각 서브유닛을 인코딩하는 유전자에 세포에 대한 복제물의 수를 변경하여 크게 개선될 수 있다. 예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체가 항체인 경우, 숙주세포는 중쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복제물보다 더 많은, 경쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복제물을 포함할 수 있다. 예시적인 구현예에서, 숙주세포는 경쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 개의 복제물 및 중쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 개의 복제물을 포함할 수 있다. 상기 숙주세포 중 중쇄를 인코딩하는 유전자 복제물의 수 및 경쇄를 인코딩하는 유전자의 복제물의 수 각각은 하기일 수 있다: 2 및 2, 2 및 3, 3 및 3, 3 및 4, 3 및 5, 4 및 3, 4 및 4, 4 및 5, 4 및 6, 5 및 4, 5 및 5, 5 및 6, 또는 5 및 7, 각각. 중쇄 및 경쇄 유전자 복제수의 부가적 예시적인 조합은 하기와 같은 중쇄 및/또는 경쇄 유전자의 최대 10 개의 복제물의 임의의 조합을 포함한다: H2xL1, H3xL1, H4xL1, H5xL1, H6xL1, H7xL1, H8xL1, H9xL1, H10xL1, H1xL2, H2xL2, H3xL2, H4xL2, H5xL2, H6xL2, H7xL2, H8xL2, H9xL2, H10xL2, H1xL3, H2xL3, H3xL3, H4xL3, H5xL3, H6xL3, H7xL3, H8xL3, H9xL3, H10xL3, H1xL4, H2xL4, H3xL4, H4xL4, H5xL4, H6xL4, H7xL4, H8xL4, H9xL4, H10xL4, H1xL5, H2xL5, H3xL5, H4xL5, H5xL5, H6xL5, H7xL5, H8xL5, H9xL5, H10xL5, H1xL6, H2xL6, H3xL6, H4xL6, H5xL6, H6xL6, H7xL6, H8xL6, H9xL6, H10xL6, H1xL7, H2xL7, H3xL7, H4xL7, H5xL7, H6xL7, H7xL7, H8xL7, H9xL7, H10xL7, H1xL8, H2xL8, H3xL8, H4xL8, H5xL8, H6xL8, H7xL8, H8xL8, H9xL8, H10xL8, H1xL9, H2xL9, H3xL9, H4xL9, H5xL9, H6xL9, H7xL9, H8xL9, H9xL9, H10xL9, H1xL10, H2xL10, H3xL10, H4xL10, H5xL10, H6xL10, H7xL10, H8xL10, H9xL10, H10xL10, 여기서 "H" 다음의 숫자는 중쇄 유전자의 복제물의 수를 나타내고, "L" 다음의 숫자는 경쇄 유전자의 복제물의 수를 나타낸다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄 유전자 복제물의 명시된 수는 단일 유전자자리, 또는 다중 유전자자리에 동시에 통합될 수 있다 (이것의 어떤 것 또는 모두는 하나 초과의 복제물을 함유할 수 있다). 임의로, 각각의 유전자자리는 3 또는 4 개 이하의 동시 통합된 유전자 복제물을 함유할 수 있고, 그렇게 함으로써 증식 및/또는 항체 생산 동안에 복제수 안정성을 촉진한다.

배양은 대부분 전형적으로 세포에게 에너지 공급원, 산소, 및 영양소를 공급하는 것을 수반한다. 본 방법은, 반응의 각 상의 세포 밀도, 액체배지 용적, 기질 공급 속도, 및 길이의 최적화를 포함하는 재조합 단백질의 발현을 위한 피. 패스토리스 의 디자인 및 최적화에 대해 문헌에 또한 공지되어 있다. 참고 Zhang 등, "Rational Design and Optimization of Fed-batch and Continuous Fermintations" (Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (제 2 판), Methods in Molucular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63). 배양물은 산소 보충이 있거나 없는 공기와 같은 산소를 포함하는 가스 혼합물이 제공될 수 있다. 효모 배양물은 최소 배지일 수 있고, 선택적 제제가 부족하고/거나 전-형성된 아미노산 또는 다른 복합 생체분자가 부족한 배양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 또한, (예를 들면, 효모 추출물 및/또는 식물성 펩톤(들)을 함유하는) 복합 배지일 수 있다. 배지는 질소 공급원 (예를 들면, 메틸아민 클로라이드, NH4SO4, 효모 추출물, 콩 펩톤, 다른 식물성 펩톤, 등)을 포함할 수 있다. 예시적인 최소 배지는 하기를 포함한다: 최소 덱스트로오스 배지 (MD) (1.34% 효모 질소 염기 (YNB) (w/o 아미노산), 4 × 10^-5% 바이오틴, 및 2% 글루코오스.), 완충액 최소 글리세롤 복합 배지 (BMGY) (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 글리세롤, 1.34% YNB (w/o 아미노산), 4 ×10-5% 바이오틴 및 100 mM 칼륨 포스페이트 (pH 6.0)). 배지는 하기를 포함할 수 있다: 1 이상의 염 (예컨대 나트륨 클로라이드, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액 (예컨대 칼륨 포스페이트, Tris, 또는 HEPES), 뉴클레오사이드 (예컨대 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들면, 오염물질의 성장을 억제하고/거나 선택가능한 마커의 유지를 위해 부가됨), 미량 원소, 및 글루코오스 또는 또 하나의 에너지 공급원. 임의의 보충물 및 치환은 당해분야의 숙련가에게 공지된 적절한 농도에서 포함될 수 있다.

배양물은 성장되어 하기와 같은 높은 세포 밀도로 될 수 있다: 적어도 50 g/L, 적어도 100 g/L, 적어도 300 g/L, 적어도 400 g/L, 적어도 500 g/L, 또는 적어도 700 g/L. 이들 배양물의 밀도는 제한이라기 보다는 설명적이고 적당한 배양물의 밀도는 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

효모 세포는 적어도 20 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 20 배증 후 상기 항체의 높은 수준의 발현을 유지할 수 있다.

효모 세포는 적어도 50 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 50 배증 후 상기 항체의 높은 수준의 발현을 유지할 수 있다.

효모 세포는 적어도 100 배증 동안 배양될 수 있고 상기 적어도 100 배증 후 상기 항체의 높은 수준의 발현을 유지할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 본 개시내용은 임의의 상기 방법에 따라 생산된 안정한 2배체 피치아 효모 배양물을 함유하는 배양 배지를 제공하고, 여기서 상기 배양 배지는 하기일 수 있는 발현 수준의 상기 원하는 항체를 포함할 수 있다: 적어도 약 50 mg/리터, 100 mg/리터, 500 mg/리터, 750 mg/리터, 1000 mg/리터, 1250 mg/리터, 1500 mg/리터, 1750 mg/리터, 2000 mg/리터, 또는 그 초과. 이들 수율 값은 제한이라기 보다는 설명적이다. 임의로, 수율은, 예를 들면 상기의 Zhang 등 (2007)에서 기재된 방법 및 일반적인 접근법을 사용하여 최적화될 수 있다. 예를 들면, 수율은 하기를 변화시켜서 최적화될 수 있다: 온도, pH, 배지 조성물 (예를 들면, 탄소 공급원, 탄소 공급원 농도, 이상의 탄소 공급원의 혼합물, 질소 공급원 및 농도, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO_{4 ,} 칼륨 설페이트, 나트륨 시트레이트, 칼륨 설페이트, 나트륨 시트레이트, 미량의 금속 예컨대 코발트 클로라이드, 황산 제2구리, 나트륨 아이오다이드, 망간 설페이트, 나트륨 몰리브데이트, 붕산, 아연 클로라이드, 황산 제1철, 비타민 예컨대 바이오틴, 이노시톨, 티아민, 펩톤, 효모 추출물, 카사미노산, 우레아, 암모늄 포스페이트 또는 다른 암모늄 이온, L-아르기닌-하이드로클로라이드을 포함하는 염 및 영양소의 농도), 시간, 배양물의 밀도, 산소첨가, 및 수율에 영향을 주는 다른 인자. 예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체의 수율, 발현, 및/또는 순도는 일부 예에서 원하는 설정값, 예를 들면, 약 15 ℃ 내지 약 30 ℃, 예컨대 약 17 ℃ 내지 약 25 ℃의 설정값)에서 온도를 유지하여 개선될 수 있다. 이론에 의해 제한되기를 의도하지 않으면서, 온도 조절은 접힘 및 후번역 가공 경로를 통해 세포내 이동조절에 도움이 될 수 있고/거나, 세포 프로테아제의 활성을 감소시킬 수 있는 것으로 가정된다. 마찬가지로, 원하는 다중-서브유닛 복합체의 수율, 발현, 및/또는 순도는 원하는 설정값, 예를 들면, 설정값 pH 3 내지 pH 8, 예컨대 pH 4 내지 pH 7에서 배양 배지의 pH를 유지하여 개선될 수 있다.

또 하나의 측면에서, 본 개시내용은 상기 원하는 항체를 배양 배지로 발현시키는 임의의 상기 방법에 따라 생산된 안정한 2배체 피치아 패스토리스 효모 배양물을 함유하는 배양 배지를 제공하고, 여기서 상기 배양물 중 상기 2 배체 세포의 세포 밀도는 적어도 약 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 700 g/L 또는 그 초과일 수 있다. 이들 배양물의 밀도는 제한이라기 보다는 설명적이고 적당한 배양물의 밀도는 당해분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

상기 항체 또는 다른 다중-서브유닛 단백질의 적어도 하나의 서브유닛은 하기를 포함할 수 있다: 분비 신호, 예컨대 S. 닭 리소자임 (CLY) 신호 펩타이드; CLY-L8; 에스. 세레비스시아에 인버타제 (SUC2) 신호 펩타이드; MF-알파 (Prepro); MF-알파 (Pre)-apv; MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR; MF-알파 (Prepro)-(EA)3; αF 신호 펩타이드; KILM1 신호 펩타이드; 억제가능한 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩타이드; 에이. 니제르 GOX 신호 펩타이드; 쉬완니오마이세스 옥시덴탈리스 글루코아밀라아제 유전자 (GAM1) 신호 펩타이드; 프로-서열이 없는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩타이드; 프로-서열이 있는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩타이드; ISN 신호 펩타이드; IFN 신호 펩타이드; HGH 신호 펩타이드; 파이토헤마글루티닌 (PHA); 누에 리소자임; 인간 리소자임 (LYZ1); 액티빈 수용체 유형-1; 액티빈 유형 II 수용체; 피. 패스토리스 면역글로불린 결합 단백질 (PpBiP); 인간 항체 3D6 경쇄 리더; 및 이들의 임의 조합.

숙주세포는 상기 항체 또는 다른 다중-서브유닛 단백질의 하나 이상의 서브유닛을 인코딩하는 1 이상의 유전자의 복제물을 함유하는 2 개의 반수체 효모 세포를 교배하여 생산될 수 있다.

도 1a-b. 재조합으로 생산된 Ab-A의 순도는 항체가 생산되는 효모 배양물에 글루코오스 공급의 개시 전에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 개선되었다. 항체를 배양 97 시간 후에 수확하고 단백질-A 친화도에 의해 정제한 다음, 원하지 않는 생성물-관련된 변이체로부터 원하는 완전 항체 (화살표, "완전 Ab (H2L2)")를 분리하기 위해 순도를 비-환원된 겔 (non-reduced gel)을 사용한 SDS-PAGE (도 1a)에 의해 평가했다. 이상 화학양론을 갖는 복합체는, 이들의 분자량, 단백질 A에 대한 친화도, 및 하기 추가로 기재된 부가적 연구를 기반으로 하여, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하는 "하프 항체" 종 (화살표, "H1L1") 및 2개의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하는 복합체 ("H2L1")로서 확인되었다. H2L1 및 H1L1 복합체의 상대 존재비는 항체 생산 동안 에탄올의 볼러스 부가에 의해 크게 감소되었다. 도 1a, 레인 2-3 (볼러스 없음)을 레인 5 (볼러스 부가)와 비교한다. 도 1b는, 각각의 완전 항체, H1L1, 및 H2L1 복합체를 개별적인 중쇄 및 경쇄로 분리시키는, 환원 조건 하에서 처리된 동일한 샘플을 보여주며, 이것은 H1L1 및 H2L1 복합체가 전체길이 중쇄 및 경쇄로 구성되었음을 확증한다. 도 1a-b에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2 및 3: 에탄올의 볼러스 부가 없이 발효 배양물로부터 제조된 대조군 샘플; 레인 4: 샘플 없음; 레인 5: 에탄올의 볼러스 부가와 함께 발효 배양물로부터 제조된 샘플.
도 1c-e는 비-환원된 겔의 길이에 따라 플롯팅된 겔 밴드 밀도를 보여주며 (각각, 도 1a, 레인 2, 3, 및 5); 화살표는 H1L1 종에 상응하는 피크를 식별한다. 도 1f는 도 1c-e에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 H1L1 복합체의 상대 존재비의 대략 90% 감소를 실증한다. H2L1 복합체 존재비는 완전 항체 피크로부터의 불완전한 분할로 인해 정량화되지 않았다.
도 2a-b 및 3a-b는 효모 배양물에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 Ab-A의 순도 개선의 재현성을 실증한다. 항체를 배양 87 또는 86 시간 후에 수확하고 (각각 도 2 및 3), 단백질-A 친화도에 의해 정제하고, 그 다음 순도를 비-환원된 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 평가했다. H1L1 및 H2L1 복합체의 존재비 (화살표)는 에탄올의 볼러스 부가에 의해 다시 감소되었다. 도 2a, 레인 3 (볼러스 없음)을 레인 2 (볼러스 부가)와 비교하고, 도 3a, 레인 4-6 (볼러스 없음)을 레인 2 및 4 (볼러스 부가)와 비교한다. 도 2b는 환원 조건 하에서 처리된 도 2A에서와 동일한 샘플을 보여주며, 이것은 다시 한 번, 관찰된 생성물-관련된 변이체가 전체길이 중쇄 및 경쇄로 구성됨을 확증한다. 도 2a-b에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 에탄올의 볼러스 부가와 함께 발효 배양물로부터 제조된 샘플; 레인 3: 에탄올의 볼러스 부가 없이 발효 배양물로부터 제조된 대조군 샘플. 도 3a에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2 및 4: 에탄올의 볼러스 부가와 함께 발효 배양물로부터 제조된 샘플; 레인 3: 샘플 없음; 레인 5-7: 에탄올의 볼러스 부가 없이 발효 배양물로부터 제조된 대조군 샘플.
도 2c 및 2d는 비-환원된 겔의 길이에 따라 플롯팅된 겔 밴드 밀도를 보여주며 (각각, 도 2a, 레인 2, 및 3); 화살표는 H1L1 종에 상응하는 피크를 식별한다. 도 2e 및 3b는 도 2c 및 도 3a에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 도 2a에서의 H1L1 복합체의 상대 존재비의 대략 85% 감소 및 도 3a에서의 H1L1 복합체의 상대 존재비의 대략 87% 평균 감소를 실증한다.
도 4a-d. 제2 재조합 항체 ("Ab-B")의 순도는 또한 발효 공정의 생산 단계 전에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 개선되었다. 발효 배양 액체배지의 샘플을 배양 67 시간 ("T67) 또는 87 시간 ("T87") 후에 수확하고 (각각, 도 4a-b 및 4C-d) 항체를 단백질-A 친화도로 정제했다. 그 다음, 순도를 비-환원된 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 평가했다 (도 4a 및 4c). 2번의 평가된 시점에서, 하프-항체 종 (H1L1) 및 H2L1 복합체의 존재비는, 에탄올의 볼러스 부가를 경험하지 않은 대조군 배양물에 비해, 에탄올의 볼러스 부가를 경험하여 제조된 발효 배양물에서 크게 감소하였다. 도 4a, 레인 2-3 (볼러스 없음)을 레인 6-7 (볼러스 부가)과 비교하고, 도 4C, 레인 2-3 (볼러스 없음)을 레인 6-7 (볼러스 부가)과 비교한다. 도 4b 및 4d는 환원 조건 하에서 처리된 동일한 샘플을 보여준다. 도 4a-d에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2-3: 에탄올의 볼러스 부가 없이 발효 배양물로부터 제조된 대조군 샘플; 레인 4-5: 샘플 없음; 레인 6-7: 에탄올의 볼러스 부가와 함께 발효 배양물로부터 제조된 샘플.
도 4e 및 4f는 각각 도 4a (T67) 및 4C (T87)에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 에탄올의 볼러스 부가가 도 4a에서 보여주는 바와 같이 조기 시점에서 H1L1 복합체의 상대 존재비를 약 73% 감소시키고, 도 4c에서 보여주는 바와 같이 후기 시점에서 H1L1 복합체의 상대 존재비를 약 34% 평균 감소시킴을 실증한다.
도 5a-b. 제3 재조합 항체 (Ab-C)의 순도도 또한 발효의 생산 단계 전에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 개선되었다. 항체를 배양 86 시간 후에 수확하고 단백질-A 친화도로 정제하고, 그 다음 순도를 비-환원된 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 평가했다 (도 5a). H1L1 및 H2L1 복합체는 심지어 에탄올의 볼러스의 부가 없이도 Ab-C 생성물에서 덜 풍부하며, 이것은 개선의 여지가 보다 덜 남아있다. 그럼에도 불구하고, 하프-항체 종 (H1L1) 및 H2L1 복합체의 존재비는, 에탄올의 볼러스 부가를 경험하지 않은 대조군 배양물에 비해, 에탄올의 볼러스 부가를 경험한 발효 배양물에서 두드러지게 감소했다. 도 5a, 레인 5-6 (볼러스 없음)을 레인 3 (볼러스 부가)과 비교한다. 도 5b는 환원 조건 하에서 처리된 동일한 샘플을 보여준다. 도 5a-b에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 샘플 없음; 레인 3: 에탄올의 볼러스 부가를 경험한 발효 배양물로부터 제조된 샘플; 레인 4: 샘플 없음; 레인 5-6: 에탄올의 볼러스 부가를 경험하지 않은 발효 배양물로부터 제조된 대조군 샘플.
도 5c는 도 5a에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 에탄올의 볼러스 부가에 의한 H1L1 복합체의 상대 존재비의 약 61% 평균 감소를 실증한다.
도 6a-f는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 도 1-3에서 보여주는 Ab-A 제제의 상대 순도의 평가를 보여준다. 각 패널에서, 주 피크는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 완전 항체 (H2L2)를 함유한다. H1L1 종은 이 방법에 의해 주 피크로부터 분할되지 않았다 (사용된 조건 하에서 유지되는 비-공유 결합에 의해 형성된 H1L1 이량체 때문일 것이라 사료됨). 그러나, 더 큰 분자량 종 (주 피크의 왼쪽) 및 더 작은 분자량 종 (주 피크의 오른쪽)을 포함하는, 다른 원하지 않는 생성물-관련된 변이체가 검출되었다. 그래도, 2개의 완전 항체를 함유하는 항체 이량체 (H4L4)에 상응하는 두드러진 피크가 검출되었고 (화살표) 및 이들의 상대 존재비는 에탄올의 볼러스 부가를 경험한 발효 배양물로부터 제조된 샘플에서 감소했다. 도 6a, 6c, 및 6e (볼러스 없음)를 도 6b, 6d, 및 6f (볼러스 부가)와 비교한다.
도 7은 도 6에서 보여주는 6개의 Ab-A 샘플 및 5개의 부가적 샘플에 대해 SEC에 의해 검출된 생성물-관련된 변이체 양의 정량화를 요약한다. 각각의 확인된 샘플 (세로 열 1)에 대해, 수행 세트 번호 (세로 열 2, 동시에 수행된 발효 수행을 식별함), 부가된 볼러스 (10g/L 또는 부가 없음, 세로 열 3), 및 배양물 샘플을 채취하고 처리하기 전의 배양 소요 시간 (세로 열 4)을 주 피크에서 검출된 단백질의 분획 ("SEC 주 피크 %", 세로 열 5)과 함께 보여준다. 성장 단계의 말기에 에탄올의 볼러스 부가는 주 피크에 포함된 평균 백분율을 80.3%에서 최대 90.6%로 증가시켰다.
도 8은 도 4에서 보여주는 Ab-B 항체 샘플에 대해 SEC에 의해 검출된 생성물-관련된 변이체 양의 정량화를 요약한다. 각 발효 수행 (세로 열 1)에 대해, 성장 단계의 말기에 부가된 볼러스 (10g/L 또는 부가 없음, 세로 열 2), 및 배양물 샘플을 채취하고 처리하기 전의 배양 소요 시간 (세로 열 3)을 주 피크에서 검출된 단백질의 분획 ("SEC 주 피크 %", 세로 열 4)과 함께 보여준다. 전체 순도는 증가되었고, 주 피크는 T67에서는 76%에서 79%로, T87에서는 60%에서 73%로 증가했다.
도 9는 도 5에서 보여주는 Ab-C 항체 샘플에 대해 SEC에 의해 검출된 생성물-관련된 변이체 양의 정량화를 요약한다. 각각의 식별된 발효 수행 (세로 열 1)에 대해, 부가된 볼러스 (10g/L 또는 부가 없음, 세로 열 2), 및 샘플을 채취하고 처리하기 전의 배양 소요 시간 (세로 열 3)을 주 피크에서 검출된 단백질의 분획 ("SEC 주 피크 %", 세로 열 4)과 함께 보여준다. 이 방법에 의해 검출된 전체 순도의 차이는 거의 없었으며, 에탄올 볼러스의 부가 또는 부가 없이 주 피크에 함유된 생성물은 약 89%였다. 이것은 심지어 볼러스 부가 없이도 Ab-C 항체의 높은 초기 순도에서 기인하였음이 분명하였다. 추가로, SEC는 완전 항체로부터 H1L1 종을 분할하지 않았으며, 따라서 에탄올 볼러스에 기인한 이 종의 생산 감소는 SEC 결과에 반영되지 않았다.
도 10은 높은 양 또는 낮은 양의 H1L1 밴드를 함유하는 Ab-A 항체 샘플에서 유리 중쇄 (제2 중쇄에 디설파이드 결합의 결핍) 양의 질량 분광분석법 측정의 결과를 요약한다. 예상대로, 유리 중쇄의 양은 H1L1 밴드 양과 관련되었고, 이것은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하고 제2 중쇄에 대한 디설파이드 결합이 결핍됨으로써 이의 동일성을 확증한다.
도 11-13은 에탄올 볼러스의 부가와 세포 생존력 사이의 상관관계를 보여준다. 에탄올 볼러스의 부가는 일반적으로 세포 생존력, 및 Ab-A 항체 (도 11) 및 Ab-B 항체 (도 12)에 대한 항체 순도를 개선시켰다. 이들 결과는 세포 생존력의 개선이 에탄올 볼러스 부가로부터 항체 순도 개선의 적어도 일부의 원인이 될 수 있음을 시사한다. 이들 결과와 일치하게, Ab-C 항체 배양물은 Ab-A 및 Ab-B 배양물보다 더 큰 항체 순도 및 세포 생존력을 나타냈다 (도 13). 분명하게, Ab-C 항체-생산 배양물의 생존력이 이들 실험에서 이미 높았기 때문에, 개선의 여지가 거의 없었으며, 배양물은 에탄올의 볼러스 부가로부터 생존력의 개선이 거의 나타나지 않았다. 도 11-13에서, 채워진 바는 볼러스 부가가 없음을 나타내며, 한편 오픈 바는 에탄올의 볼러스 부가를 나타낸다. 생존력은, (이전의 슬라이드에서 확인된 바와 같이) 순도 분석을 위해 샘플이 수집되는 시간의 1.5 시간에 샘플링된 발효 배양물로부터 결정되었다.
도 14는 광범위한 에탄올 볼러스 농도가 항체 순도의 동일한 개선을 산출할 수 있음을 보여준다. Ab-A는 5 g/L (0.5% w/v) 내지 15 g/L (1.5% w/v)의 에탄올의 볼러스 부가로 생산되며, 단백질 A 친화도에 의해 정제되고, 그 다음 순도를 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다. 각 배양물은 63 시간 (도 14a) 및 86 시간 (도 14b)에서 낮은 수준의 H2L1 및 H1L1 복합체를 유사하게 나타냈다. 도 14a-b에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2 및 7: 5 g/L 볼러스; 레인 3 및 5: 10 g/L 볼러스; 레인 4 및 6: 15 g/L 볼러스.
도 15는 용해된 산소 스파이크 및 에탄올 볼러스 부가 사이의 소요 시간이 상당히 다를 수 있지만, 반면 항체 순도의 유사한 개선을 제공함을 보여준다. Ab-A는 10 g/L (1% w/v) 에탄올의 볼러스 부가로 생산되고 단백질 A 친화도에 의해 정제되며, 그 다음 순도를 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다 (도 15a). 용해된 산소 스파이크 (배양물에서 탄소 공급원의 고갈을 나타냄)와 에탄올의 볼러스 부가 사이의 시간인 "기아 기간 (starvation period)"은 0 내지 3 시간으로 다양했다. 각 배양물은 기아 기간의 지속시간과 무관하게 낮은 수준의 H2L1 및 H1L1 복합체를 유사하게 나타냈으며, 이것은 항체 순도가 기아 기간의 부재 또는 적어도 최대 3 시간의 기아 기간에 대해 비교적 민감하지 않음을 나타낸다. 동일한 샘플을 환원된 겔 상에서 분석했다 (도 15b). 도 15a-b에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2-4: 샘플 없음; 레인 5: 0 시간 기아 기간; 레인 6: 3 시간 기아 기간.
도 16은 항체 순도에 대한 평형 기간의 효과 (에탄올 볼러스 부가와 공급물 개시 사이의 시간)를 보여준다. Ab-B 항체는 10 g/L (1% w/v) 에탄올의 볼러스 부가로 생산되고 단백질 A 친화도에 의해 정제되고, 그 다음 순도를 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다 (도 16a). 평형 기간의 지속시간은 0, 30, 또는 60분이었다. 60분 평형 기간은 더 낮은 항체 순도 (H2L1 및 H1L1 복합체의 더 높은 존재비)를 초래했다. 배양물 생존력은 또한 60분 평형 기간, 특히 배양시 조기 (23 시간, 도 16b)에 현저하게 더 낮았으며; 생존력은 배양 말기 무렵에 어느 정도 개선되었다 (85 시간, 도 16c). 도 16A에서의 레인 순서: 레인 1: 분자량 마커; 레인 2 및 4: 샘플 없음; 레인 3: 30 분 평형; 레인 5 및 6: 60 분 평형 시간; 레인 7 및 8: 0 분 평형 시간. 도 16b-c에서, 채워진 바는 0분의 평형 기간을 나타내며, 해치 바는 30분의 평형 기간을 나타내고, 오픈 바는 60분의 평형 기간을 나타낸다.
상세한 설명
출원인은, 효모로부터 발현된 다중-서브유닛 복합체의 순도가 배양 배지에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 크게 개선될 수 있음을 뜻밖에 발견하였다. 에탄올의 단일 볼러스 부가가 최대 적어도 97 시간 동안 지속된 생산 기간에 걸쳐 순도를 증가시키는 것으로 실증되었다.
본 개시내용은, 순도 증가 및 1 이상의 원하지 않는 부산물의 생산 감소와 함께, 항체 및 다른 다중-서브유닛 복합체의 재조합 생산을 가능하게 하는, 개선된 방법 및 물질의 조성물을 제공한다. 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체에 비해, 원하지 않는 부산물(들)은 하기 중의 1 이상을 나타낼 수 있다: 변화된 화학양론, 이상 글리코실화, 겉보기 분자량의 차이, 디설파이드 결합의 차이, 유체역학적 반경의 차이, 하나 이상의 서브유닛의 단편 및/또는 끝이 잘린 형태. 원하지 않는 부산물은 1 이상의 부가적 차이를 또한 나타낼 수 있다. 원하지 않는 부산물은 또한 제제에 대한 이들의 효과, 예를 들면, 비활성 수준의 변경, 면역원성, 또는 원하는 다중-서브유닛 복합체의 물리적 구성 및/또는 기능에 대한 다른 효과에 의해 검출될 수 있다.
예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체가 항체인 경우, 원하지 않는 부산물은 H1L1 또는 "하프 항체" 종 (즉, 중쇄 및 경쇄를 함유함, 여기서 중쇄는 또 하나의 중쇄에 대해 디설파이드 결합에 의해 연결되지 않음), 및/또는 H2L1 종 (즉, 2개의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하지만, 제2 경쇄가 결핍됨)을 포함할 수 있다.
이론에 제한되는 것으로 의도되지 않더라도, (에탄올의 볼러스 부가에 의해 가져올 수 있는) 에탄올 농도의 신속한 증가가 적절하게 폴딩되고 조립된 다중-서브유닛 복합체의 생산의 지속적 개선을 제공하고/하거나 다중-서브유닛 복합체의 개선된 순도를 야기하는 부적절하게 폴딩되거나 잘못 조립된 다중-서브유닛 복합체의 처리를 증가시키는 유전자 발현에서의 지속된 변화를 유발할 수 있음을 가정하였다. 추가로, 항체 순도 개선이 배양시 효모의 생존력 개선과 관련되었음이 실증되었고, 이를 기반으로 출원인은, 이 이론이 제한되는 것으로 의도되지 않더라도, 생존력 개선이 순도 개선의 (적어도 부분적으로) 원인이 될 수 있음을 가정한다.
바람직한 구현예에서, 이종기원 다중-서브유닛 복합체는 2개의 중쇄 서브유닛 및 2개의 경쇄 서브유닛으로 구성된 항체 또는 항체 단편, 예컨대 인간화 항체이다. 바람직한 숙주세포는 효모를 포함하고, 특히 바람직한 효모는 메탄올자화 효모 균주, 예를 들면, 피치아 패스토리스, 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) (피치아 앙구스타 (Pichia angusta)), 피치아 길레르모르디이 (Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카 (Pichia methanolica), 피치아 이노시토베라 (Pichia inositovera), 및 다른 것들 (예를 들면, 미국 특허 4,812,405, 4,818,700, 4,929,555, 5,736,383, 5,955,349, 5,888,768, 및 6,258,559 참고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 포함되어 있음)을 포함한다. 숙주세포는 당해분야에서 공지된 방법, 예컨대 형질전환, 메이팅(mating), 포자형성, 등에 의해 생산될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 숙주세포는 이종기원 단백질 서브유닛을 인코딩하는 1 이상의 유전자의 하나 초과의 복제물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 서브유닛 유전자의 다중 복제물은 1 이상의 염색체 유전자자리 내로 직열로 통합될 수 있다. 직열 통합된 유전자 복제물은 바람직하게 다중-서브유닛 복합체의 생산을 위해 배양 동안 안정된 수의 복제물로 유지된다. 예를 들면, 아래에 기재된 실시예에서, 유전자 복제수는 일반적으로 경쇄 및 중쇄 항체 유전자의 3개 내지 4개의 직열 통합된 복제물을 함유하는 피. 패스토리스 균주에 대해 안정했다.
이종기원 단백질 서브유닛을 인코딩하는 1 이상의 유전자는 바람직하게 숙주세포의 1 이상의 염색체 유전자자리 내로 통합된다. 유전자간 서열, 프로모터 서열, 코딩 서열, 종결 서열, 조절 서열 등을 포함하는 임의의 적당한 염색체 유전자자리는 통합에 이용될 수 있다. 피. 패스토리스에서 사용될 수 있는 예시적인 염색체 유전자자리는 PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; 및 GAP를 포함한다. 인코딩 유전자는 또한 표적화되기 보다는 1 이상의 무작위의 염색체 유전자자리 내로 통합될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 염색체 유전자자리는 pGAP 유전자자리, 3' AOX TT, 및 HIS4 TT 유전자자리로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 부가적 예시적인 구현예에서, 이종기원 단백질 서브유닛을 인코딩하는 유전자는 1 이상의 염색체외 요소, 예를 들면 1 이상의 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 다중-서브유닛 단백질은 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 비-동일한 서브유닛을 포함할 수 있다. 추가로, 각각의 서브유닛은 각각의 다중-서브유닛 단백질에 1회 이상 존재할 수 있다. 예를 들면, 다중-서브유닛 단백질은 다중-특이적 항체 예컨대 2개의 비-동일 경쇄 및 2개의 비-동일 중쇄를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있다.
서브유닛은 단일시트론성 유전자, 다시트론성 유전자, 또는 이들의 임의 조합으로부터 발현될 수 있다. 각각의 다시트론성 유전자는 동일한 서브유닛의 다중 복제물을 포함할 수 있거나, 또는 각각의 상이한 서브유닛의 1 이상의 복제물을 포함할 수 있다.
피치아 패스토리스의 조작에 사용될 수 있는 예시적인 방법 (배양, 형질전환, 및 메이팅 방법 포함)은 미국 20080003643, 미국 20070298500, 및 미국 20060270045를 포함하는 공개 출원, 및 Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., 및 Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로 포함되어 있다.
이용될 수 있는 예시적인 발현 카세트는 분비 신호를 인코딩하는 서열에 융합된 글리세르알데하이드 데하이드로게나제 유전자 (GAP 유전자) 프로모터, 그 다음 발현되는 유전자의 서열, 그 다음 피. 패스토리스 알코올 옥시다제 I 유전자 (AOX1)로부터 피. 패스토리스 전사 종료 신호를 인코딩하는 서열로 구성된다. 제오신 내성 마커 유전자는 더 높은 수준의 제오신에 내성인 형질전환체를 선택함으로써 균주에서 발현 벡터의 다수의 통합된 복제물을 함유하는 균주에 대한 풍부함의 수단을 제공할 수 있다. 마찬가지로, G418 또는 카나마이신 내성 마커 유전자는 더 높은 수준의 제네티신 또는 카나마이신에 내성인 형질전환체를 선택함으로써 균주에서 발현 벡터의 다수의 통합된 복제물을 함유하는 균주에 대한 풍부함의 수단을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
이용될 수 있는 숙주 균주는 영양요구성 피. 패스토리스 또는 다른 피치아 균주, 예를 들면, met1, lys3, ura3 및 ade1 또는 다른 영양요구-관련된 유전자에서 돌연변이를 갖는 균주를 포함한다. 바람직한 돌연변이는 임의의 상당한 빈도로 복귀돌연변이체가 발생하지 않으며, 바람직하게는 부분 결실 돌연변이체 또는 더욱 더 바람직하게는 전체 결실 돌연변이체이다. 바람직하게는, 자가영양 2배체 또는 4배체 균주는 영양요구성 균주의 보완 세트를 메이팅함으로써 생산된다.
반수체 피. 패스토리스 균주의 형질전환 및 피. 패스토리스 성주기의 유전 조작은 Pichia 프로토콜 (1998, 2007)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
형질전환 전에, 각각의 발현 벡터는, 숙주세포에서 표적 유전자자리 내로 벡터의 통합을 유도하는 표적 유전자자리에 상동인 영역 (예를 들면, GAP 프로모터 서열) 내에서 제한 효소 절단에 의해 선형화될 수 있다. 그때, 각 벡터의 샘플은 별도로 전기천공 또는 다른 방법에 의해 원하는 균주의 배양물 내로 형질전환될 수 있으며, 성공적인 형질전환체는 선택가능한 마커, 예를 들면, 영양요구체의 항생제 내성 또는 보완에 의해 선택될 수 있다. 선택적 조건 하에서 단일 콜로니에 대해 분리주를 피킹하고 스트리킹할 수 있으며, 그때 각 균주로부터 추출된 게놈 DNA에 대한 서던 블랏 또는 PCR 검정에 의해 다중-서브유닛 복합체의 서브유닛 (예를 들면, 원하는 항체)을 인코딩하는 유전자 복제물의 수를 확증하기 위해 시험되었다. 임의로, 기대된 서브유닛 유전자 생성물의 발현은, 예를 들면, FACS, 웨스턴 블랏, 콜로니 리프트 (colony lift) 및 면역블랏, 및 당해분야에 공지된 다른 수단에 의해 확인될 수 있다. 임의로, 반수체 독립주는 부가적 이종기원 유전자, 예를 들면, 상이한 유전자자리에서 통합된 동일한 서브유닛의 부가적 복제물, 및/또는 상이한 서브유닛의 복제물을 도입하기 위해 부가적 횟수로 형질전환된다. 그때, 반수체 균주는 메이팅되어 다중-단백질 복합체를 합성할 수 있는 2배체 균주 (또는 더 높은 배수성의 균주)를 산출한다. 각각의 기대된 서브유닛 유전자의 존재는 서던 블랏팅, PCR, 및 당해분야에 공지된 다른 검출 수단에 의해 확인될 수 있다. 원하는 다중-단백질 복합체가 항체인 경우에, 그것의 발현은 또한 콜로니 리프트/면역블랏 방법 (Wung 등 Biotechniques 21 808-812 (1996)) 및/또는 FACS에 의해 확인될 수 있다.
이 형질전환 프로토콜은, 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있는 이종기원 유전자를, 제1 유전자자리 내로 표적화하기 보다는 제2 유전자자리 내로 표적화하기 위해 임의로 반복된다. 제2 유전자자리 내로 통합되는 구조체가 제1 유전자자리에 의해 인코딩된 서열과 동일하거나 이와 크게 유사한 단백질을 인코딩하는 경우, 그것의 서열은 제1 유전자자리 내로의 원하지 않는 통합 가능성을 감소시키기 위해 변할 수 있다. 예를 들면, 제2 유전자자리 내로 통합되는 서열은 제1 유전자자리 내로 통합된 서열에 비해 프로모터 서열, 종결 서열, 코돈 용법의 차이, 및/또는 다른 용인가능한 서열 차이를 가질 수 있다.
피. 패스토리스 반수체 균주를 메이팅하기 위해, 교차되는 각 균주는 메이팅 플레이트 위로 함께 패치될 수 있다. 예를 들면, 다중 메이팅은 그것의 성장에 적당한 플레이트 전반에 걸쳐 메이팅되는 각 균주를 스트리킹함으로써 동시에 편리하게 수행될 수 있으며, 메이팅 파트너는 제2 플레이트 (바람직하게 플레이트는 부유 배지 예컨대 YPD이다) 전반에 걸쳐 스트리킹될 수 있다. 전형적으로, 30℃에서 1일 또는 2일 인큐베이션 후, 2개의 플레이트로부터의 세포는 메이팅 플레이트 위로 십자형교차 방식으로 배양평판 복사배양 (replica plated)될 수 있으며, 이것은 각 쌍의 균주가 공-플레이팅되고 한 쌍의 초기 스트리크 라인의 교차점에서 메이팅할 기회를 가지면서 교차-해치된 패턴을 초래한다. 그때, 메이팅 플레이트는 균주들 사이에 메이팅의 개시를 자극하도록 (예를 들면, 30℃에서) 배양될 수 있다. 약 2일 후, 메이팅 플레이트 위의 세포는 원하는 2배체 균주에 대해 선택적인 배지 위로 스트리킹되거나, 패치되거나 배양평판 복사배양될 수 있다 (예를 들면, 메이팅된 균주가 상보적 자가영양을 갖는 경우에, 드롭-아웃 (drop-out) 또는 최소 배지 플레이트가 사용될 수 있다). 이들 플레이트는 적당한 지속 시간 (예를 들면, 약 3일) 동안 (예를 들면, 30℃에서) 배양되어 원하는 2배체 균주의 선택적 성장을 가능하게 할 수 있다. 발생하는 콜로니는 각 2배체 균주를 단리하고 정제하기 위해 단일 콜로니에 대해 피킹하고 스트리킹할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 발현 벡터는 추가로, 형질전환된 효모 균주를 확인하기 위한 선택가능한 영양요구성 또는 약물 마커를 포함하여, 효모 특이적 서열을 포함할 수 있다. 약물 마커는 추가로, 높은 농도의 약물에서 세포 모집단을 배양하고, 그렇게 함으로써 높은 수준의 내성 유전자를 발현시키는 형질전환체를 선택함으로써 효모 숙주세포에서 벡터의 복제수를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
예시적인 구현예에서, 이종기원 단백질 서브유닛을 인코딩하는 1 이상의 유전자는 유도성 프로모터에 커플링된다. 적당한 예시적인 프로모터는 알코올 옥시다제1 유전자 프로모터, 포름알데하이드 데하이드로게나제 유전자 (FLD; 미국 공보 번호 2007/0298500 참조), 및 당해분야에 공지된 다른 유도성 프로모터를 포함한다. 알코올 옥시다제1 유전자 프로모터는 가장 통상의 탄소 공급원, 예컨대 글루코오스, 글리세롤, 또는 에탄올에서의 효모의 성장 동안 엄격하게 억제되지만, 메탄올에서의 성장 동안 크게 유도된다 (Tschopp 등, 1987; Stroman, D. W. 등의 미국 특허 번호 4,855,231). 외래 단백질의 생산을 위해, 균주는 처음에 바이오매스를 산출하기 위해 탄소 공급원을 억제하면서 성장시킨 다음, 유일한 (또는 주요) 탄소 및 에너지 공급원으로서의 메탄올로 이동되어 외부 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이 조절 시스템의 하나의 이점은 발현 생성물이 세포에 독성인 외부 유전자로 형질전환된 피. 패스토리스 균주가 억제 조건 하에서 성장함으로써 유지될 수 있다는 것이다.
또 하나의 예시적인 구현예에서, 1 이상의 이종기원 유전자는 발현 수준이 적절한 조건 하에서 상향조절될 수 있는 조절된 프로모터에 커플링될 수 있다. 예시적인 조절된 프로모터는 CUP1 프로모터 (배지에서 구리 수준에 의해 유도됨), 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터, 및 FLD1 프로모터를 포함한다.
다수의 본 개시내용이 항체의 생산을 기재하더라도, 본원에 기재된 방법은 다른 다중-서브유닛 복합체에서도 마찬가지로 쉽게 적용된다. 이론에 제한되는 것으로 의도되지 않으면서, 다중-서브유닛 복합체의 수율 및 순도가 서브유닛의 농도 및 화학양론에 의해 크게 영향을 받을 수 있으며, 이것은 결국 각 서브유닛의 생산을 초래하는 유전자의 발현 수준에 의해 영향을 받는다고 여겨진다. 본원에 개시된 방법은 2 이상의 상이한 서브유닛을 포함하는 임의의 재조합 다중-서브유닛 복합체의 수율 및/또는 순도를 증진시는데 쉽게 이용될 수 있다. 추가로, 본 발명은 다중-단백질 복합체의 생산에 제한되지는 않지만, 텔로머라제, hnRNP, 리보솜, snRNP, 신호 인식 입자, 원핵 및 진핵 RNase P 복합체를 포함하는 리보핵산단백질 (RNP) 복합체, 및 다수의 구별된 단백질 및/또는 RNA 서브유닛을 함유하는 임의의 다른 복합체와의 사용에 쉽게 적용될 수 있다. 다중-서브유닛 복합체를 발현시키는 숙주세포는 당해분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들면, 상이한 조합의 유전자 복제수를 함유하는 2배체 또는 4배체 효모 세포의 패널은 다양한 수의 개별적인 서브유닛 유전자의 복제물 (복제수는 바람직하게 메이팅에 앞서 공지됨)을 함유하는 세포를 메이팅함으로써 산출될 수 있다.
정의
본 발명은 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 및 기재된 시약에 제한되지 않으며, 그것이 다양할 수 있는 것으로써 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정한 구현예를 기재하려고만 하는 목적이며, 부가된 청구항들에 의해서만 제한될 본 발명의 범위를 제한하려고 의도되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이 단수 형태 "하나" ("a", "an"), 및 "당해" ("the")는 문맥에서 달리 명확히 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 복수의 그와 같은 세포를 포함하며, "단백질"에 대한 언급은 1 이상의 단백질 및 당해분야의 숙련가에게 공지된 그것의 등가물, 등에 대한 언급을 포함한다. 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은, 달리 명확히 표시되지 않는 한 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
볼러스 부가: 본 개시내용에서, "볼러스 부가"는 일반적으로 배양 세포와 접촉시 (예를 들면, 배양 배지에서) 물질 (예컨대 에탄올)의 농도의 신속한 변화를 나타낸다. 예를 들면, 물질은 단일 부가, 일련의 하나 초과의 부가로 배양 세포에 부가되고/되거나 일정 기간에 걸쳐 (예를 들면, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, 또는 120분에 걸쳐) 주입될 수 있다. 물질은 또한, 예를 들면 (원심분리, 여과, 침강, 또는 다른 방법을 사용하여) 세포를 농축시킴으로써 배양 배지를 부분적으로 또는 완전히 교체하고, 배지의 일부 또는 모두를 제거하고 상기 물질을 부가하여, 또는 상기 물질을 함유하는 배지에 세포를 부가하여 부가될 수 있다. 상기 물질은 담체 (예를 들면, 배양 배지, 물, 염수 등)와 혼합될 수 있다. 예를 들면, 에탄올의 볼러스 부가는 원하는 농도를 생성하기에 충분한 양으로 배양 배지에 순수한 또는 농축된 에탄올 (예를 들면, 100%, 95%, 70%, 50%, 60%, 40%, 30%, 20%, 등)의 부가를 포함할 수 있다. 또 하나의 예로서, 세포는, 예를 들면, 세포를 함유하는 접종물을 에탄올을 함유하는 배지에 부가함으로써 에탄올을 함유하는 배지에 부가될 수 있다.
볼러스 농도: 본 개시내용에서, "볼러스 농도"는 일반적으로 물질 (예를 들면, 에탄올)의 볼러스 부가로부터 야기되는 농도를 나타낸다.
메이팅 적격 효모 종: 본 발명에서, 이것은 배양시 성장될 수 있는 임의의 2배체 또는 4배체 효모를 광범위하게 포함하는 것으로 의도된다. 그와 같은 효모 종은 반수체, 2배체, 또는 다른 다배체 형태로 존재할 수 있다. 주어진 배수성의 세포는 적절한 조건 하에서 그 형태로 무한한 수의 세대로 증식할 수 있다. 2배체 세포는 또한 반수체 세포를 형성하기 위해 포자를 형성할 수 있다. 순차적 메이팅은 2배체 균주의 추가의 메이팅 또는 융합을 통해 4배체 균주를 야기할 수 있다. 본 발명은 반수체 효모, 뿐만 아니라, 예를 들면, 메이팅 또는 융합 (예를 들면, 스페로플라스트 융합)에 의해 생산된 2배체 또는 다른 다배체 효모 세포의 사용을 고려한다.
본 발명의 일 구현예에서, 메이팅 적격 효모는, 속 아르크시오자이마 (Arxiozyma); 아스코보트라이오자이마 (Ascobotryozyma); 사이테로마이세스 (Citeromyces); 데바리오마이세스 (Debaryomyces); 덱케라 (Dekkera); 에레모테시움 (Eremothecium); 이사첸키아 (Issatchenkia); 카자키스타니아 (Kazachstania); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces); 코다마에아 (Kodamaea); 로데로마이세스 (Lodderomyces); 파차이솔렌 (Pachysolen); 피치아; 사카로마이세스; 사투르니스포라 (Saturnispora); 테트라피시스포라 (Tetrapisispora); 톨루라스포라 (Torulaspora); 윌리옵시스 (Williopsis); 및 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces)를 포함하는, 사카로마이세타시애 (Saccharomycetaceae) 패밀리의 멤버이다. 본 발명에 잠재적으로 유용한 다른 유형의 효모는 야로위아 (Yarrowia); 로도스포리디움 (Rhodosporidium); 칸디다 (Candida): 한세눌라 (Hansenula); 필로바시움 (Filobasium); 스포리디오볼러스 (Sporidiobolus); 불레라 (Bullera); 류코스포리디움 (Leucosporidium) 및 필로바시델라 (Filobasidella)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 메이팅 적격 효모는 피치아속의 멤버이거나 또 하나의 메틸영양체이다. 본 발명의 추가로 바람직한 구현예에서, 피치아속의 메이팅 적격 효모는 하기 종 중의 하나이다: 피치아 패스토리스, 피치아 메타놀리카, 및 한세눌라 폴리모르파 (피치아 앙구스타). 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 피치아속의 메이팅 적격 효모는 종 피치아 패스토리스이다.
반수체 효모 세포: 그것의 정상적인 게놈 (염색체) 보체의 각 유전자의 단일 복제물을 갖는 세포.
다배체 효모 세포: 그것의 정상적인 게놈 (염색체) 보체의 하나 초과의 복제물을 갖는 세포.
2배체 효모 세포: 전형적으로 2개의 반수체 세포의 융합 (메이팅)의 과정에 의해 형성된, 그것의 정상적인 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 2개의 복제물 (대립유전자)을 갖는 세포.
4배체 효모 세포: 전형적으로 2개의 2배체 세포의 융합 (메이팅)의 과정에 의해 형성된, 그것의 정상적인 게놈 보체의 본질적으로 모든 유전자의 4개의 복제물 (대립유전자)을 갖는 세포. 4배체는 2, 3, 4, 또는 그 초과의 상이한 발현 카세트를 보유할 수 있다. 그와 같은 4배체는 에스 . 세레비시아에에서 동형접합체 헤테로탈릭 a/a 및 알파/알파 2배체의 선택적 메이팅에 의해 그리고 피치아에서 영양요구성 2배체를 얻기 위한 반수체의 순차적 메이팅에 의해 수득될 수 있었다. 예를 들면, [met his] 반수체는 2배체 [his]를 얻기 위해 [ade his] 반수체와 메이팅될 수 있으며; [met arg] 반수체는 2배체 [arg]를 얻기 위해 [ade arg] 반수체와 메이팅될 수 있고; 그 다음, 2배체 [his]는 4배체 원영양체를 얻기 위해 2배체 [arg]와 메이팅될 수 있다. 2배체 세포의 이점 및 용도에 대한 참조가 또한 4배체 세포에 적용될 수 있음이 당해분야의 숙련가에 의해 이해될 것이다.
효모 메이팅: 단일 효모 세포를 형성하기 위해 2개의 효모 세포를 융합하는 과정. 융합되는 세포는 반수체 세포 또는 더 높은 배수성을 갖는 세포일 수 있다 (예를 들면, 2개의 2배체 세포를 메이팅하여 4배체 세포를 생성함).
감수분열: 2배체 효모 세포가 4개의 반수체 포자 생성물을 형성하기 위해 감소하는 분열을 겪는 과정. 그때, 각 포자는 발아하고 반수체 무성생식하는 세포주를 형성할 수 있다.
선택가능한 마커: 선택가능한 마커는, 예를 들면, 형질전환 사건을 통해서와 같이 유전자를 받는 세포에 성장 표현형 (특징적인 물리적 성장)을 제공하는 유전자 또는 유전자 단편이다. 선택가능한 마커는 선택가능한 마커 유전자를 받지 않은 세포가 성장할 수 없는 조건 하에서 선택적 성장 배지에서 세포가 생존하고 성장가능하게 한다. 선택가능한 마커 유전자는 일반적으로 양성 선택가능한 마커 유전자 예컨대 항생제 또는 다른 약물에 대한 내성을 세포에 제공하는 유전자, 2개의 온도 민감성 ("ts") 돌연변이체가 교차되거나 또는 ts 돌연변이체가 형질전환되는 경우에 온도에 대한 내성을 세포에 제공하는 유전자; 음성 선택가능한 마커 유전자 예컨대 생체합성 유전자를 갖지 않는 모든 세포에서 필요한 특정 영양소를 갖는 않는 배지에서 성장하는 능력을 세포에 제공하는 생체합성 유전자, 또는 야생형 유전자를 갖지 않는 세포에 의한 성장 무능을 세포에 제공하는 돌연변이유발된 생체합성 유전자; 등을 포함하는 몇 개의 유형 내에 속한다. 적당한 마커는 비제한적으로 하기를 포함한다: ZEO; NEO (G418); LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; 등.
통합된: 유기체의 염색체 내로 공유 연결된 유전 인자 (전형적으로 이종기원 유전 인자).
직열 통합된: 염색체의 인접한 위치에서 통합된 유전 인자의 2개 이상의 복제물. 2개 이상의 복제물은 필연적으로 배향을 갖지 않으며; 예를 들면, 전사된 유전자의 경우, 일부 복제물은 왓슨 스트랜드로부터 전사될 수 있으며 다른 것들은 크릭 스트랜드로부터 전사될 수 있다.
숙주세포: 본 개시내용의 문맥에서, 용어 숙주세포는 이종기원 유전자를 함유하는 세포 (예를 들면, 진핵세포, 예컨대 피치아 세포)를 의미한다. 예를 들면, 이종기원 유전자는 원하는 다중-서브유닛 복합체의 서브유닛, 단백질 접힘에 관여하는 유전자 (예를 들면, 차페론), 단백질 발현, 또는 분비에 관여하는 유전자, 및/또는 또 하나의 원하는 유전자의 발현을 가능하게 할 수 있다. 이종기원 유전자는 진핵세포의 게놈 내로 통합되거나 염색체외 요소 예컨대 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.
발현 벡터: 이들 DNA 벡터는 표적 숙주세포 내에서 외래 단백질의 발현을 위한 조작을 용이하게 하는 요소를 함유한다. 편리하게, 서열의 조작 및 형질전환을 위한 DNA의 생산은 우선 박테리아 숙주, 예를 들면 이. 콜리에서 수행되며, 보통 벡터는 박테리아 복제 기점 및 적절한 박테리아 선택 마커를 포함하여, 그와 같은 조작을 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 것이다. 선택 마커는 선택적 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 인코딩한다. 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주세포는 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소에 대한 내성을 제공하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 임계 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 효모의 형질전환을 위한 예시적인 벡터 및 방법은, 예를 들면, Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 발현 벡터는 추가로, 형질전환된 효모 균주를 확인하기 위한 선택가능한 영양요구성 또는 약물 마커를 포함하여, 효모 특이적 서열을 포함할 수 있다. 약물 마커는 추가로 효모 숙주세포에서 벡터의 복제수의 증폭을 선택하는데 사용될 수 있다.
흥미로운 폴리펩타이드 코딩 서열은 전형적으로 효모 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 이들 벡터 성분은, 비제한적으로, 하기 중의 1 이상을 포함할 수 있다: 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열. 폴리펩타이드의 분비를 위한 서열, 예를 들면 신호 서열, 등이 또한 포함될 수 있다. 효모 복제 기점은, 발현 벡터가 흔히 효모 게놈 내로 통합되기 때문에 임의적이다.
임의적이더라도, 본 발명의 일 구현예에서, 다중-서브유닛 복합체의 하나 이상의 서브유닛은, 이종기원 다중-서브유닛 복합체의 수확 및 정제를 용이하게 할 수 있는, 배양 배지 내로 발현된 폴리펩타이드의 분비를 가능하게 하는 분비 서열에 작동가능하게 연결되거나 융합된다. 더욱 더 바람직하게, 분비 서열은, 예컨대 바람직한 코돈의 선택 및/또는 코돈 선택을 통한 백분율 AT의 변경을 통해 숙주세포 (예를 들면, 효모 2배체 세포)로부터 폴리펩타이드의 최적화된 분비를 가능하게 한다. 분비 효율 및/또는 안정성이 분비 서열의 선택에 의해 영향을 받을 수 있으며 최적의 분비 서열은 상이한 단백질들 사이에서 변할 수 있음이 당해분야에 공지되어 있다 (예를 들면, Koganesawa 등, Protein Eng. 2001 Sep;14(9):705-10 참고, 이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있음). 다수의 잠재적으로 적당한 분비 신호는 당해분야에 공지되어 있고 특정한 이종기원 다중-서브유닛 복합체의 수율 및/또는 순도에 대한 이들의 효과에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 효모 및 다른 종의 분비된 단백질에 존재하는 분비 서열, 뿐만 아니라 엔지니어링된 분비 서열을 포함하는 임의의 분비 서열이 잠재적으로 사용될 수 있다. 이용될 수 있는 예시적인 분비 서열은 하기를 포함한다: 닭 리소자임 (CLY) 신호 펩타이드 (MRSLLILVLCFLPLAALG (서열번호:414)), CLY-L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (서열번호:415)), 에스 . 세레비시아에 인버타제 (SUC2) 신호 펩타이드 (MLLQAFLFLLAGFAAKISA (서열번호:416)), MF-알파 (Prepro) (MRFPSIFTAVLFAASSALa-APVNTTTE-eGVSLEKR (서열번호:417)), MF-알파 (Pre)-apv (MRFPSIFTAVLFAASSALa-APV (서열번호:418)), MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR (MRFPSIFTAVLFAASSALa-APVSLEKR (서열번호:419)), MF-알파 (Prepro)-(EA)3 (MRFPSIFTAVLFAASSALa-APVNTTTE-eGVSLEKR-eAEAEA (서열번호:420)), αF 신호 펩타이드 (MRFPSIFTAVLFAASSALa-APVNTTTE-dETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-eGVSLEKR (서열번호:421)), KILM1 신호 펩타이드 (MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR (서열번호:422)), 억제가능한 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩타이드 (MFSPILSLEIILALATLQSVFA (서열번호:423)), 에이. 니제르 GOX 신호 펩타이드 (MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR (서열번호:424)), 쉬완니오마이세스 옥시덴탈리스 글루코아밀라아제 유전자 (GAM1) 신호 펩타이드 (MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA (서열번호:425)), 프로-서열을 갖는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩타이드 (MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR (서열번호:426)), 프로-서열을 갖지 않는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩타이드 (MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열번호:427)), ISN 신호 펩타이드 (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (서열번호:428)), IFN 신호 펩타이드 (MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP (서열번호:429)), HGH 신호 펩타이드 (MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (서열번호:430)), 파이토헤마글루티닌 (PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG (서열번호:431)), 누에 리소자임 (MQKLIIFALVVLCVGSEA (서열번호:432)), 인간 리소자임 (LYZ1) (MKALIVLGLVLLSVTVQG (서열번호:433)), 액티빈 수용체 유형-1 (MVDGVMILPVLIMIALPSPS (서열번호:434)), 액티빈 유형 II 수용체 (MGAAAKLAFAVFLISCSSG (서열번호:435)), 피. 패스토리스 면역글로불린 결합 단백질 (PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA (서열번호:436)), 및 인간 항체 3D6 경쇄 리더 (MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (서열번호:437)). Hashimoto 등, Protein Engineering vol. 11 no. 2 pp.75-77, 1998; Oka 등, Biosci Biotechnol Biochem. 1999 Nov; 63(11):1977-83; Gellissen 등, FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma 등, Hepatology. 2005 Dec;42(6):1355-63; Raemaekers 등, Eur J Biochem. 1999 Oct 1;265(1):394-403; Koganesawa 등, Protein Eng. (2001) 14 (9): 705-710; Daly 등, Protein Expr Purif. 2006 Apr;46(2):456-67 ; Damasceno 등, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; and Felgenhauer 등, Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다. 다중-서브유닛 복합체는 또한 분비 신호에 작동가능하게 연결되거나 융합되지 않고 배양 배지에 분비될 수 있다. 예를 들면, 일부 이종기원 폴리펩타이드가 심지어 분비 신호에 연결되거나 융합되지 않고서도 피. 패스토리스에서 발현되는 경우 배양 배지에 분비됨이 실증되었다. 추가로, 다중-서브유닛 복합체는 당해분야에서 공지된 방법을 사용하여 (예를 들면, 복합체가 저조하게 분비되는 경우 바람직할 수 있는) 숙주세포로부터 정제될 수 있다.
원하는 다중-서브유닛 복합체를 포함하는 배지 또는 세포는 배양물로부터 회수될 수 있다. 임의로, 분비된 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체를 포함하는 세포는 기계적, 화학적, 효소, 및/또는 삼투 방법 (예를 들면, 액체 질소로의 동결, 균질기 사용, 스페로플라스팅, 초음파처리, 유리 비드 존재 하의 진탕, 세제 사용, 등)을 사용하여 용해될 수 있다. 원하는 다중-서브유닛 복합체는 당해분야에서 공지된 방법을 사용하여 농축, 여과, 투석 등이 될 수 있다. 원하는 다중-서브유닛 복합체는, 예를 들면, 그것의 분자량 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피), 등전점 (예를 들면, 등전점 전기영동), 전기영동 이동도 (예를 들면, 겔 전기영동), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (예를 들면, HPLC), 전하 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피), 친화도 (예를 들면, 항체의 경우에, 원하는 항체가 결합하는 단백질 A, 단백질 G, 및/또는 에피토프에 대한 결합), 및/또는 글리코실화 상태 (예를 들면, 렉틴 결합 친화도에 의해 검출됨)를 기반으로 정제될 수 있다. 다수의 정제 단계는 원하는 수준의 순도를 얻기 위해 수행될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 원하는 다중-서브유닛 복합체는 면역글로불린 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 단백질 A 또는 단백질 G 친화도, 크기 배제 크로마토그래피, 및 (글리코실화된 형태를 제거하기 위한) 렉틴에 대한 결합 결핍을 사용하여 정제될 수 있다. 임의로 A 프로테아제 억제제, 예컨대 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드 (PMSF)는 정제 동안 단백질 분해를 억제하기 위해 부가될 수 있다.
핵산은 또 하나의 핵산 서열과 기능적 관계에 있는 경우 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들면, 신호 서열을 위한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열이 인접하고, 분비성 리더의 경우에, 해독틀에 인접함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해서는 안된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 또는 대안적으로 당해분야의 숙련가에게 익숙한 PCR/재조합 방법을 통해 달성될 수 있다 (Gateway® 기술; Invitrogen, Carlsbad Calif.). 그와 같은 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커가 종래의 실시에 따라서 사용될 수 있다. 원하는 핵산 (작동가능하게 연결된 서열을 포함하는 핵산 포함)은 또한 화학적 합성에 의해 생산될 수 있다.
프로모터는 이들이 작동가능하게 연결된 특정한 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어하는 구조 유전자 (일반적으로 약 100 내지 1000 bp 이내)의 시작 코돈에 대해 업스트림 (5')에 위치된 미번역된 서열이다. 그와 같은 프로모터는 몇 개의 클래스 내에 속한다: 유도성 프로모터, 항시적 프로모터, 및 (억제인자의 부재에 대응하여 전사의 수준을 증가시키는) 억제성 프로모터. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들면, 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 대응하여 이들 제어 하에서 DNA로부터의 전사 수준 증가를 개시할 수 있다.
효모 프로모터 단편은 또한 상동 재조합에 대한 부위 및 효모 게놈에서 동일한 부위 내에 발현 벡터의 통합을 위한 부위로서 작용할 수 있으며; 대안적으로 선택가능한 마커는 상동 재조합을 위한 부위로서 사용된다. 피치아 형질전환은 Cregg 등 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 (이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있음)에 기재되어 있다.
피치아로부터 적당한 프로모터의 예는 CUP1 (배지의 구리 수준에 의해 유도됨), 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터 (Cregg 등 (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 프로모터 (Menendez 등 (2003) Yeast 20(13):1097-108); 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 프로모터 (GAP) (Waterham 등 (1997) Gene 186(1):37-44); 및 FLD1 프로모터 (Shen 등 (1998) Gene 216(1):93-102)를 포함한다. GAP 프로모터는 강한 항시적 프로모터이고, CUP1, AOX 및 FLD1 프로모터는 유도성 프로모터이다. 각각의 상기 참조는 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
다른 효모 프로모터는 ADH1, 알코올 데하이드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, 및 그것으로부터 유래된 키메라 프로모터를 포함한다. 추가로, 비-효모 프로모터, 예컨대 포유동물, 곤충, 식물, 파충류, 양서류, 바이러스, 및 조류 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 가장 전형적으로, 프로모터는 (발현된 유전자에 잠재적으로 내인성인) 포유동물 프로모터를 포함하거나 효모 시스템에서 효율적인 전사를 가능하게 하는 효모 또는 바이러스 프로모터를 포함할 것이다.
흥미로운 폴리펩타이드는 직접 재조합으로 생산될 뿐만 아니라, 이종기원 폴리펩타이드, 예를 들면, 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩타이드와의 융합 폴리펩타이드로서 재조합으로 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터 내에 삽입된 폴리펩타이드 코딩 서열의 일부일 수 있다. 선택된 이종기원 신호 서열은 바람직하게 숙주세포 내의 이용가능한 표준 경로 중의 하나를 통해 인식되고 처리되는 것이다. 에스 . 세레비시아에 알파 인자 전-프로 (pre-pro) 신호는 피. 패스토리스로부터의 다양한 재조합 단백질의 분비에 효과적인 것으로 입증되었다. 다른 효모 신호 서열은 알파 메이팅 인자 신호 서열, 인버타제 신호 서열, 및 다른 분비되는 효모 폴리펩타이드로부터 유래된 신호 서열을 포함한다. 추가로, 이들 신호 펩타이드 서열은 2배체 효모 발현 시스템에서 분비 증대를 가능하게 하도록 엔지니어링될 수 있다. 흥미로운 다른 분비 신호는 또한 분비될 단백질에 이종기원일 수 있거나 분비될 단백질에 대해 천연 서열일 수 있는 포유동물 신호 서열을 포함한다. 신호 서열은 전-펩타이드 서열을 포함하고, 일부 예에서 프로펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 면역글로불린 사슬, 예를 들면, K28 프레프로독소(preprotoxin) 서열, PHa-e, FACE, 인간 MCP-1, 인간 혈청 알부민 신호 서열, 인간 Ig 중쇄, 인간 Ig 경쇄, 등에서 발견되는 신호 서열을 포함하는 다수의 그와 같은 신호 서열은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, Hashimoto 등 Protein Eng 11(2) 75 (1998); 및 Kobayashi 등 Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998)을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
전사는 전사 활성제 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 이들 활성제는 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는, 보통 약 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이다. 전사 인핸서는 비교적 배향 및 위치 독립적이며, 인트론 내에서, 뿐만 아니라 자체의 코딩 서열 내에서, 전사 단위에 대해 5' 및 3'에서 발견되었다. 인핸서는 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치된다.
진핵 숙주세포에 사용된 발현 벡터는 또한 전사의 종료에 필요한 서열 및 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 수 있다. 그와 같은 서열은 통상적으로 진핵 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 미번역된 영역에서, 3'에서 번역 종료 코돈까지 이용가능하다. 이들 영역은 mRNA의 미번역된 부분에서 폴리아데닐레이트된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 세그먼트를 함유한다.
1 이상의 상기-열거된 성분을 함유하는 적당한 벡터의 제작은 표준 결찰 기술 또는 PCR/재조합 방법을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 재단하고 (tailored), 재조합 방법을 통해 또는 요구되는 플라스미드를 산출하기 위해 원하는 형태로 재결찰시킨다. 제작된 플라스미드의 정확한 서열을 확증하기 위한 분석에 있어서, 결찰 혼합물은 숙주세포를 형질전환시키는데 사용되며, 성공적인 형질전환체는 적절한 경우 항생제 내성 (예를 들면 암피실린 또는 제오신)에 의해 선택되었다. 형질전환체로부터 플라스미드가 제조되며, 제한 엔도뉴클레아제 소화에 의해 분석되고/되거나 서열분석된다.
단편의 제한 및 결찰에 대한 대안으로서, att 부위 및 재조합 효소를 기반으로 한 재조합 방법이 DNA 서열을 벡터 내로 삽입하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은, 예를 들면, Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949에 기재되어 있으며; 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 그와 같은 방법은 람다 및 이. 콜리-인코딩된 재조합 단백질의 혼합물에 의해 매개되는 분자간 DNA 재조합을 이용한다. 재조합은 상호작용 DNA 분자 상의 특이적 부착 (att) 부위 사이에서 일어난다. att 부위의 설명을 위해, Weisberg 및 Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250을 참조한다. 재조합 부위를 플랭킹하는 DNA 세그먼트는 스위치되어, 재조합 후, att 부위는 각각의 모 벡터에 의해 제공된 서열로 구성된 하이브리드 서열이다. 재조합은 임의의 위상기하학을 갖는 DNA들 사이에 일어날 수 있다. 각각의 상기 참조는 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
Att 부위는, 흥미로운 서열의 적절한 벡터 내로의 결찰; 특이적 프라이머의 사용을 통한 att B 부위를 함유하는 PCR 생성물의 산출; att 부위를 함유하는 적절한 벡터 내로 클로닝된 cDNA 라이브러리의 산출 등에 의해 흥미로운 서열 내로 도입될 수 있다.
단일시트론성 및 다시트론성 유전자. 단일시트론성 유전자는 단일 단백질만을 번역하기 위한 유전 정보를 함유하는 RNA를 인코딩한다. 다시트론성 유전자는 하나 초과의 단백질을 번역하기 위한 유전 정보를 함유하는 mRNA를 코딩한다. 다시트론성 유전자에 인코딩된 단백질은 동일하거나 상이한 서열 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 디시스트론성 또는 바이시스트론성은 2개의 단백질을 인코딩하는 다시트론성 유전자를 나타낸다. 다시트론성 유전자는 임의로, mRNA 분자의 5' 말단에 결합된 5'-cap 구조와 무관하게 다운스트림 단백질 코딩 영역의 번역을 유도할 수 있는 위치에 놓여질 수 있는, 번역의 cap-독립적 개시를 용이하게 하기 위한 1 이상의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 요소를 포함한다. 임의의 공지된 IRES 서열 (예를 들면, 기원이 바이러스, 진핵, 또는 인공)이 사용될 수 있다. 예를 들면, 유전자간 영역 (IGR)에서 귀뚜라미 마비 바이러스 IRES 서열이 Thompson 등 (2001) PNAS 98:12972-12977에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 임의로, IRES 기능은 유전 변경, 예를 들면, eIF2 키나아제 GCN2의 항시적 발현을 유발하거나 파괴된 2개의 개시제 tRNA(met) 유전자 (id.)를 파괴함으로써 강화될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 접힘은 폴리펩타이드 및 단백질의 3차원 구조를 나타내며, 여기서 아미노산 잔기들 사이의 상호작용은 구조를 안정화시키기 위해 작용한다. 비-공유 상호작용은 구조를 결정하는데 중요한 한편, 보통 흥미로운 단백질은 2개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자내 및/또는 분자간 공유 디설파이드 결합을 가질 것이다. 자연 발생 단백질 및 폴리펩타이드 또는 유도체 및 그의 변이체의 경우, 적절한 접힘은 전형적으로 최적의 생물학적 활성을 초래하는 배열이며, 활성에 대한 검정, 예를 들면 리간드 결합, 효소 활성, 등에 의해 편리하게 모니터링될 수 있다.
일부 예에서, 예를 들면, 원하는 생성물이 합성 기원인 경우, 생물학적 활성에 기반한 검정이 덜 의미 있을 것이다. 그와 같은 분자의 적절한 접힘은 물리적 특성, 에너지 고려, 모델링 연구, 등을 기반으로 결정될 수 있다.
발현 숙주는 접힘 및 디설파이드 결합 형성을 향상시키는 1 이상의 효소, 즉 폴다제 (foldase), 샤페로닌 (chaperoning), 등을 인코딩하는 서열의 도입에 의해 추가로 변형될 수 있다. 그와 같은 서열은 당해분야에 공지된 바와 같이 벡터, 마커, 등을 사용하여 효모 숙주세포에서 항시적으로 또는 유도가능하게 발현될 수 있다. 바람직하게, 원하는 발현 패턴을 위해 충분한 전사 조절 요소를 포함하는 서열은 표적화된 방법론을 통해 효모 게놈에 안정되게 통합된다.
예를 들면, 원핵 PDI는 단백질 시스테인 산화 및 디설파이드 결합 이성질체화의 효율적인 촉매일 뿐만 아니라, 차페론 활성을 나타낸다. PDI의 공-발현은 다중 디설파이드 결합을 갖는 활성 단백질의 생산을 용이하게 할 수 있다. 또한 BIP (면역글로불린 중쇄 결합 단백질); 사이클로필린; 등의 발현이 흥미롭다. 본 발명의 일 구현예에서, 다중-서브유닛 복합체는 메이팅에 의해 생산된 효모 균주로부터 발현될 수 있으며, 여기서 각각의 반수체 모 균주는 뚜렷한 접힘 효소를 발현시키며, 예를 들면, 한 균주는 BIP를 발현시킬 수 있고, 다른 균주는 PDI 또는 이들의 조합을 발현시킬 수 있다.
용어들 "원하는 단백질" 또는 "표적 단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 일반적으로 이종기원 다중-서브유닛 단백질 예컨대 항체 (예를 들면, 인간화 항체) 또는 본원에 기재된 그것의 결합 부분을 나타낸다.
용어 "항체"는 에피토프에 맞추고 이를 인식하는 특이 형상을 갖는 임의의 폴리펩타이드 사슬-함유 분자 구조물을 포함하며, 여기서 1 이상의 비-공유 결합 상호작용은 분자 구조물 및 에피토프 사이의 복합체를 안정화시킨다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이며, 모든 공급원, 예를 들면 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유동물, 닭, 다른 조류, 등으로부터의 모든 유형의 면역글로불린, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 등이 "항체"인 것으로 고려된다. 본 발명에 따르는 개시 물질로서 유용한 항체를 생산하기 위한 바람직한 공급원은 토끼이다. 수많은 항체 코딩 서열이 기재되었으며; 다른 것들은 당해분야에 잘 공지된 방법에 의해 일어날 수 있다. 그것의 예는 키메라 항체, 인간 항체 및 다른 비-인간 포유동물 항체, 인간화 항체, 단일 사슬 항체 예컨대 scFvs, 카멜바디, 나노바디, IgNAR (샤크(shark)로부터 유래된 단일-사슬 항체), 작은-모듈 면역의약품 (SMIP), 및 항체 단편 예컨대 Fabs, Fab', F(ab')₂ 등을 포함한다. Streltsov V A, 등, Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 November; 14(11):2901-9. Epub 2005 Sep. 30; Greenberg A S, 등, A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar. 9; 374(6518):168-73; Nuttall S D, 등, Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 August; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C, 등, Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun. 3; 363(6428):446-8; Gill D S, 등, Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 December; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct. 19.를 참조한다. 각각의 상기 참조는 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
예를 들면, 항체 또는 항원 결합 단편은 유전공학에 의해 생산될 수 있다. 이 기술에서, 다른 방법과 같이, 항체-생산 세포는 원하는 항원 또는 면역원에 감작된다. 항체 생산 세포로부터 단리된 메신저 RNA는 PCR 증폭을 사용하여 cDNA를 만드는데 주형으로서 사용된다. 초기 항원 특이성을 보유하는 각각 하나의 중쇄 유전자 및 하나의 경쇄 유전자를 함유하는 벡터의 라이브러리는 증폭된 면역글로불린 cDNA의 적절한 섹션을 발현 벡터 내로 삽입하여 생산된다. 조합 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리를 경쇄 유전자 라이브러리와 조합하여 제작된다. 이것은 (항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편과 유사한) 중쇄 및 경쇄를 공-발현시키는 클론의 라이브러리를 초래한다. 이들 유전자를 지닌 벡터는 숙주세포 내로 공-전달감염된다. 항체 유전자 합성이 전달감염된 숙주에서 유도되는 경우, 중쇄 및 경쇄 단백질은 자가-조립되어 항원 또는 면역원으로의 스크리닝에 의해 검출될 수 있는 활성 항체를 생산한다.
흥미로운 항체 코딩 서열은 천연 서열, 뿐만 아니라 유전 부호의 축퇴 때문에, 개시된 핵산, 및 그것의 변이체에 대해 서열이 동일하지 않은 핵산에 의해 인코딩된 것들을 포함한다. 변이체 폴리펩타이드는 아미노산 (aa) 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환 또는 비-필수적인 아미노산을 제거하는 치환, 예컨대 글리코실화 부위를 변경시키는 치환, 또는 기능상 필요하지 않은 1 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결실에 의한 잘못접힘 (misfolding)을 최소화하는 치환일 수 있다. 변이체는 단백질의 특정한 영역 (예를 들면, 기능적 도메인, 촉매 아미노산 잔기, 등)의 생물학적 활성을 보유하거나 증대시키기 위해 디자인될 수 있다. 변이체는 또한 본원에 개시된 폴리펩타이드의 단편, 특히 기능적 도메인에 대응하는 생물학적 활성 단편 및/또는 단편들을 포함한다. 클로닝된 유전자의 시험관내 돌연변이유발을 위한 기술이 공지되어 있다. 단백질 분해에 대한 폴리펩타이드의 내성을 증진시키거나 용해도 특성을 최적화시키거나 폴리펩타이드를 치료제로서 더 적당하게 하기 위해 통상의 분자 생물학적 기술을 사용하여 변형된 폴리펩타이드가 본 대상 발명에 또한 포함된다.
키메라 항체는 한 종의 항체 생산 세포로부터 수득된 가변 경쇄 및 중쇄 영역 (V_L 및 V_H)을 또 한 종의 항체 생산 세포로부터 수득된 불변 경쇄 및 중쇄 영역과 조합하여 재조합 수단에 의해 만들어질 수 있다. 전형적으로 키메라 항체는 주로 인간 도메인을 갖는 항체를 생산하기 위하여 설치류 또는 토끼 가변 영역 및 인간 불변 영역을 이용한다. 그와 같은 키메라 항체의 생산은 당해분야에 잘 공지되어 있으며, 표준 수단 (예를 들면, 미국 특허 번호 5,624,659에 기재됨, 이것은 그 전체가 참조로 본원에 인용되어 있음)에 의해 달성될 수 있다. 추가로, 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 영역이 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 또는 IgG19 불변 영역으로부터 선택될 수 있음이 고려된다.
인간화 항체는 엔지니어링되어 더욱 더 인간-유사 면역글로불린 도메인을 함유하며, 동물-유래 항체의 상보성-결정 영역만을 포함한다. 이것은 모노클로날 항체의 가변 영역의 초가변 루프의 서열을 주의 깊게 시험하고, 이들을 인간 항체 사슬의 구조에 핏팅함으로써 달성된다. 표면적으로 복잡하더라도, 상기 과정은 실행시 간단하다. 예를 들면, 미국 특허 번호 6,187,287을 참조하며, 이것은 전문이 참조로 본원에 포함되어 있다. 항체를 인간화하는 방법은 발행된 미국 특허 번호 7935340에 이전에 기재되었으며, 그 개시내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 일부 예에서, 부가적 토끼 뼈대 잔기가 활성을 유지하는데 요구되는지 여부를 결정하는 것이 필요하다. 일부 예에서, 인간화 항체는 친화도 또는 활성의 손실을 최소화하기 위해 유지되는 일부 결정적인 토끼 뼈대 잔기를 여전히 필요로 한다. 이들 경우에, 원하는 활성을 갖기 위해, 인간 생식계열 서열로부터의 단일 또는 다중 뼈대 아미노산을 다시 원래 토끼 아미노산으로 변화시키는 것이 필요하다. 이들 변화는 토끼 잔기가 친화도 및 활성을 보존하는데 필요한지를 확인하기 위해 실험적으로 결정된다.
전체 면역글로불린 (또는 이들의 재조합 대응물) 이외에, 에피토프 결합 부위 (예를 들면, Fab', F(ab')₂, 또는 다른 단편)를 포함하는 면역글로불린 단편이 합성될 수 있다. "단편," 또는 최소 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기술을 이용하여 디지인될 수 있다. 예를 들면 본 발명에 사용하기 위한 "Fv" 면역글로불린은 융합된 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 합성함으로써 생산될 수 있다. 항체의 조합, 예를 들면, 2개의 뚜렷한 Fv 특이성을 포함하는 디아바디 (diabody)가 또한 흥미롭다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, SMIP (소분자 면역의약품), 카멜바디, 나노바디, 및 IgNAR이 면역글로불린 단편에 포함된다.
면역글로불린 및 그것의 단편은, 예를 들면, 효과기 모이어티 예컨대 화학적 링커, 검출가능 모이어티, 예컨대 형광 염료, 효소, 독소, 기질, 생물발광 물질, 방사선활성 물질, 화학발광 모이어티 등, 또는 특이적 결합 모이어티, 예컨대 스트렙타비딘, 아비딘, 또는 바이오틴을 가하여 번역후에 변형될 수 있으며, 이것은 본 발명의 방법 및 조성물에 이용될 수 있다. 부가적 효과기 분자의 예는 하기에 제공된다.
생성물-관련된 변이체: 원하는 생성물 및 원하는 생성물과 관련된 생성물의 제제에 존재하는 원하는 생성물 (예를 들면, 원하는 다중-서브유닛 복합체) 이외의 생성물. 예시적인 생성물-관련된 변이체는 끝이 잘린 또는 신장된 펩타이드, 원하는 글리코실화와 상이한 글리코실화를 갖는 생성물 (예를 들면, 무글리코실화된 생성물을 원하는 경우, 임의의 글리코실화 생성물은 생성물-관련된 변이체로 여겨질 것이다), 비정상 화학양론, 부적절한 어셈블리, 비정상 디설파이드 결합, 비정상 또는 불완전한 접힘, 응집, 프로테아제 절단, 또는 다른 이상을 갖는 복합체를 포함한다. 예시적인 생성물-관련된 변이체는 1 이상의 분자량의 변경 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 검출됨), 등전점의 변경 (예를 들면, 등전점 전기영동에 의해 검출됨), 전기영동 이동도의 변경 (예를 들면, 겔 전기영동에 의해 검출됨), 인산화 상태의 변경 (예를 들면, 질량 분광분석법에 의해 검출됨), 전하 대 질량비의 변경 (예를 들면, 질량 분광분석법에 의해 검출됨), 단백분해 단편의 질량 또는 동일성의 변경 (예를 들면, 질량 분광분석법 또는 겔 전기영동에 의해 검출됨), 소수성의 변경 (예를 들면, HPLC에 의해 검출됨), 전하의 변경 (예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 검출됨), 친화도의 변경 (예를 들면, 항체의 경우, 원하는 항체가 결합하는 단백질 A, 단백질 G, 및/또는 에피토프에 대한 결합에 의해 검출됨), 및 글리코실화 상태의 변경 (예를 들면, 렉틴 결합 친화도에 의해 검출됨)을 나타낼 수 있다. 원하는 단백질이 항체인 경우, 용어 생성물-관련된 변이체는 글리코-헤비 변이체 및/또는 하프 항체 종 (하기 기재됨)을 포함할 수 있다.
예시적인 생성물-관련된 변이체는 이상 디설파이드 결합을 함유하는 변이체 형태를 포함한다. 예를 들면, 대부분의 IgG1 항체 분자는 총 16개의 사슬내 및 사슬간 디설파이드 브릿지에 의해 안정화되며, 이것은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에서 IgG 도메인의 접힘을 안정화시키고, 한편 사슬간 디설파이드 브릿지는 중쇄 및 경쇄 사이의 결합을 안정화시킨다. 마찬가지로, 다른 항체 유형도 특징적인 안정한 사슬내 및 사슬간 디설파이드 결합을 함유한다. 게다가, 일부 항체 (본원에 개시된 Ab-A 및 Ab-B 포함)는 비-표준적 디설파이드 결합이라 통칭되는 부가적 디설파이드 결합을 함유한다. 따라서, 이상 사슬간 디설파이드 결합은, 부가적 서브유닛에 대한 안정한 공유 결합, 및/또는 디설파이드 결합의 부재로 인해, 비정상 복합체 화학양론을 초래할 수 있다. 추가로, 이상 디설파이드 결합 (사슬간이든 사슬내이든)은 항체의 구조 안정성을 감소시킬 수 있으며, 이것은 감소된 활성, 감소된 안정성, 증가된 응집물 형성 경향, 및/또는 증가된 면역원성을 초래할 수 있다. 이상 디설파이드 결합을 함유하는 생성물-관련된 변이체는 비-환원된 변성 SDS-PAGE, 모세혈관 전기영동, cIEX, 질량 분광분석법 (임의로 유리 시스테인의 질량 이동을 생성하기 위해 화학적 변형을 가짐), 크기 배제 크로마토그래피, HPLC, 광 산란의 변화, 및 당해분야에서 공지된 임의의 다른 적당한 방법을 포함하는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 예를 들면, The Protein Protocols Handbook 2002, Part V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259-169-8:581을 참고한다.
하프 항체, 하프-항체 종, 또는 H1L1은 단일 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하지만, 제2 중쇄 및 항체 경쇄에 대한 공유 결합이 결핍된 단백질 복합체를 나타낸다. 2개의 하프 항체는 (예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 겉보기 분자량과 같이 완전 항체와 유사한 거동을 나타낼 수 있는) 일부 조건 하에서 비-공유적으로 결합되어 있을 수 있다. 마찬가지로, H2L1은 2개의 항체 중쇄 및 단일 항체 경쇄를 포함하지만, 제2 항체 경쇄에 대한 공유 결합이 결핍된 단백질 복합체를 나타내며; 이들 복합체는 또한 또 하나의 항체 경쇄와 비-공유적으로 결합될 수 있다 (마찬가지로, 완전 항체와 유사한 행동을 나타낸다). 완전 항체 같이, 하프 항체 종 및 H2L1 종은 환원 조건 하에서 개별적인 중쇄 및 경쇄로 분리될 수 있다. 하프 항체 종 및 H2L1 종은, 종들이 완전 항체보다 더 낮은 겉보기 분자량에서 이동함으로써 비-환원된 SDS-PAGE 겔 상에서 검출될 수 있으며, 예를 들면, H1L1은 완전 항체의 겉보기 분자량의 대략 절반 (예를 들면, 약 75 kDa)에서 이동한다.
글리코 - 헤비 변이체는 때때로 항체 제제에 존재하고 적어도 일부의 Fc 서열을 함유하는 글리코실화된 생성물-관련된 변이체를 나타낸다. 글리코-헤비 변이체는 SDS-PAGE에 의해 관찰가능한 (정상적 중쇄에 비해) 감소된 전기영동 이동도, 렉틴 결합 친화도, 항-Fc 항체에 대한 결합, 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 글리코-헤비 변이체를 함유하는 항체 복합체의 분명한 더 높은 분자량에 의해 특성화된다. 2011년 8월 31일에 제출된, 미국 가출원 시리즈 번호 61/525,307 (변리사 문서 번호 67858.730200)을 참고하며, 이것은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다.
용어 "원하는 분비된 이종기원 폴리펩타이드를 안정되게 발현시키거나 장기간 동안 발현시키는 다배체 효모"는 상기 폴리펩타이드를 역치 발현 수준, 전형적으로 적어도 50-500 mg/리터 (배양시 약 90시간 후), 바람직하게는 실질적으로 더 큰 수준에서 적어도 며칠 내지 몇 주, 더 바람직하게는 적어도 1개월, 더욱 더 바람직하게는 적어도 1-6 개월, 및 더욱 더 바람직하게는 1년 초과 동안 분비하는 효모 배양물을 나타낸다.
용어 "원하는 양의 재조합 폴리펩타이드를 분비하는 다배체 효모 배양물"은, 안정되게 또는 장기적인 기간 동안 적어도 50-500 mg/리터, 가장 바람직하게는 500-1000 mg/리터 또는 그 초과로 분비하는 배양물을 나타낸다.
폴리뉴클레오타이드 서열은, 유전부호에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열의 번역이 폴리펩타이드 서열 (즉, 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리펩타이드 서열을 "인코딩한다")을 산출하는 경우, 폴리펩타이드 서열에 "대응"하고, 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열은, 2개의 서열이 동일한 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 경우, 또 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열에 "대응"한다.
DNA 구조체의 "이종기원" 영역 또는 도메인은 천연에서 더 큰 분자와 함께 발견되지 않는 더 큰 DNA 분자 내의 DNA의 식별가능한 세그먼트이다. 따라서, 이종기원 영역이 포유동물 유전자를 인코딩하는 경우, 상기 유전자는 보통 공급원 유기체의 게놈에서 포유동물 게놈 DNA를 플랭킹하지 않는 DNA에 의해 플랭킹될 것이다. 이종기원 영역의 또 하나의 예는 코딩 서열 그 자체가 천연에서 발견되지 않는 구조체이다 (예를 들면, 게놈 코딩 서열이 인트론, 또는 원상태 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열을 함유하는 경우에 cDNA). 대립 형질 변화 또는 천연 발생 돌연변이 사건은 본원에 규정된 바와 같이 DNA의 이종기원 영역을 유발하지 않는다.
"코딩 서열"은 (유전부호의 관점에서) 단백질 또는 펩타이드 서열에 대응하거나 이를 인코딩하는 코돈의 인프레임 서열이다. 2개의 코딩 서열은 상기 서열 또는 이들의 상보적 서열이 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 경우에 서로 대응한다. 적절한 조절 서열과 관련된 코딩 서열은 전사되고 폴리펩타이드로 번역될 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열에 대해 3'에 위치될 것이다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제를 결합시키고 다운스트림 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 전형적으로 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 조절 분자 (예를 들면, 전사 인자)의 결합을 위한 부가적 부위를 함유한다. 코딩 서열은 프로모터 서열의 "제어 하에" 있거나, RNA 폴리머라제가 세포에서 프로모터 서열과 결합하고 코딩 서열을 mRNA로 전사하고, 결국 코딩 서열에 의해 인코딩된 단백질로 번역되는 경우, 프로모터에 "작동가능하게 연결된"다.
벡터는 이물질, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질을 유기체 또는 숙주세포 내로 도입하는데 사용된다. 전형적인 벡터는 재조합 바이러스 (폴리뉴클레오타이드의 경우) 및 리포솜 (폴리펩타이드의 경우)을 포함한다. "DNA 벡터"는, 또 하나의 폴리뉴클레오타이드 세그먼트가 부착되어 부착된 세그먼트의 복제를 유발할 수 있는, 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파아지 또는 코스미드이다. "발현 벡터"는 적절한 숙주세포에 의해 폴리펩타이드 합성을 유도할 조절 서열을 함유하는 DNA 벡터이다. 이것은 보통 RNA 폴리머라제와 결합하고 mRNA의 전사를 개시하는 프로모터, 뿐만 아니라 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 번역을 유도하는 리보솜 결합 부위 및 개시 신호를 의미한다. 적절한 부위 및 정확한 해독틀에서의 발현 벡터 내로의 폴리뉴클레오타이드 서열의 도입 후 벡터에 의한 적절한 숙주세포의 형질전환은 상기 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드의 생산을 가능하게 한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 "증폭"은 특정한 핵산 서열의 다중 복제물의 시험관내 생산이다. 증폭된 서열은 보통 DNA의 형태이다. 그와 같은 증폭을 수행하기 위한 다양한 기술이 하기 검토 논문에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; 및 Gill and Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Mar;27(3):224-43. 폴리머라제 사슬 반응 또는 PCR은 핵산 증폭의 프로토타입이며, 본원에서 PCR의 사용은 다른 적당한 증폭 기술의 예시인 것으로 간주되어야 한다.
대부분의 척추동물 (포유동물 포함)에서 항체의 일반적인 구조는 현재 잘 알려져 있다 (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). 종래의 항체는 분자량 대략 23,000 달톤의 2개의 동일한 가벼운 폴리펩타이드 사슬 ("경쇄"), 및 분자량 53,000-70,000의 2개의 동일한 무거운 사슬 ("중쇄")로 이루어진다. 4개의 사슬은 "Y" 배치에서 디설파이드 결합에 의해 연결되며, 여기서 경쇄는 "Y" 배치의 하부에서 개시하는 중쇄를 브래킷 (bracket)한다. "Y" 배치의 "분지" 부분은 F_ab 영역으로 지정되며; "Y" 배치의 줄기 부분은 F_C 영역으로 지정된다. 아미노산 서열 배향은 "Y" 배치의 상단부에서의 N-말단 끝에서 각 사슬의 바닥에서의 C-말단 끝으로 진행된다. N-말단 끝은 항원을 유도하는 항원에 대한 특이성을 갖는 가변 영역을 가지며, 길이가 대략 100 아미노산이며, 항체별로 경쇄 및 중쇄 사이에 약간의 변화가 존재한다.
가변 영역은, 남아 있는 사슬의 길이를 연장하고, 특정한 부류의 항체 내에서는 항체의 특이성 (즉, 항원 유도 항체 특이성)이 변하지 않는, 불변 영역의 각 사슬에 연결된다. 면역글로불린 분자의 부류를 결정하는 5개의 공지된 주요 클래스의 불변 영역이 존재한다 (IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE는 감마, 뮤, 알파, 델타, 및 엡실론 중쇄 불변 영역에 상응한다). 불변 영역 또는 부류는, 보체의 활성화 (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), 및 다른 세포 반응 (Andrews, D. W., 등, Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., 등, Immunology, 48: 187 (1983))을 포함하는 항체의 차후 효과기 기능을 결정하는 반면; 가변 영역은 그것이 반응할 항원을 결정한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 각각의 중쇄 부류는 카파 또는 람다 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 서로 공유 결합되며, 2개의 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로불린이 하이브리도마 또는 B 세포에 의해 산출되는 경우 공유 디설파이드 결합에 의해 서로 결합된다.
표현 "가변 영역" 또는 "VR"은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하는 각 쌍의 항체의 경쇄 및 중쇄 내의 도메인을 나타낸다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_H)에 이어서 수많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_L) 및 그것의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 함께 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 정렬된다.
표현 "상보성 결정 영역," "초가변 영역," 또는 "CDR"은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 발견되는 1 이상의 초가변 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 나타낸다 (Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참고). 이들 표현은 Kabat 등 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., 등, US Dept. of Health and Human Services, 1983)에 의해 규정된 초가변 영역을 포함하거나, 항체의 3차원 구조에서의 초가변 루프를 포함한다 (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). 각 사슬의 CDR은 틀 영역에 의해 인접하게 유지되며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR 내에는, 항체-항원 상호작용에서 CDR에 의해 사용된 결정적인 접촉 잔기를 나타내는 선택성 결정 영역 (SDR)으로서 기재된 선택된 아미노산이 존재한다 (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
표현 "틀 영역" 또는 "FR"은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내의 1 이상의 틀 영역을 나타낸다 (Kabat, E. A. 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참고). 이들 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 내의 CDR들 사이에 끼어든 아미노산 서열 영역을 포함한다.
NGF 에 대한 결합 활성을 갖는 항- NGF 항체 및 그의 결합 단편
항체 Ab1
본 발명은, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하고/거나 통증을 치료 또는 예방하는 효과적인 양으로, 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab1와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체 Ab1 또는 그의 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 사용하여 통증 및 특정 통증 연관된 장애를 치료하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKR (서열번호: 1).
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 2).
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS (서열번호: 3).
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 4).
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함한다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 단편이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1 또는 서열번호: 2의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3 또는 서열번호: 4의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 임의로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 단편을 포함하고, 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 1의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 3의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 1의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 5; 서열번호: 6; 및 서열번호: 7); 및 서열번호: 3의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 8; 서열번호: 9; 및 서열번호: 10).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 키메라 항-NGF 항체는 Ab1이고, 이것은 서열번호: 2 및 서열번호: 4을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 본원에서 사용된 항체 단편은 Ab1와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab1에 대해, Fab 단편은 include 서열번호: 1의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 3의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 1 및/또는 서열번호: 3의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 Ab1의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab1 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab2
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab2와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 항체 Ab2 또는 그의 단편, 또는 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKR (서열번호: 11).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 12).
본 발명은 추가로 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS (서열번호: 13).
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 14).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11 또는 서열번호: 12의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 13 또는 서열번호: 14의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 임의로, 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 하기의 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 11의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 13의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 11의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 15; 서열번호: 16; 및 서열번호: 17); 및 서열번호: 13의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 18; 서열번호: 19; 및 서열번호: 20).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 임의로 Ab2이고, 이것은 서열번호: 12 및 서열번호: 14을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF 또는 Fab에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 Ab2와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 다른 1가 항체 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab2에 대해, Fab 단편은 서열번호: 11의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 13의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 11 및/또는 서열번호: 13의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 Ab2의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab2 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab3
본 발명은 NGF와 p75와의 회합을 눈에 띄게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 Ab3 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab3와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다: AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 21).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 22).
본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSS (서열번호: 23).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 24).
본 발명은 추가로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 30의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21 또는 서열번호: 22의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 23 또는 서열번호: 24의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 30의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 21의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 23의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 21의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 25; 서열번호: 26; 및 서열번호: 27); 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 28; 서열번호: 29; 및 서열번호: 30).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab3이고, 이것은 서열번호: 22 및 서열번호: 24을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 Ab3와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함하거나 그것으로 이루어진다. 항체 Ab3에 대해, Fab 단편은 서열번호: 21의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 23의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 21 및/또는 서열번호: 23의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 Ab3의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab3 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab4
본 발명은 NGF와 p75와의 회합을 눈에 띄게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 및/또는 for 통증을 예방 또는 효과적으로 치료하기 위해, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 또는 인간화 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 항체 Ab4 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab4와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편이다. 일 구현예에서, 본 발명은 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 31).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 32).
본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방하기 위한 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 33).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 34).
본 발명은 추가로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31 또는 서열번호: 32의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33 또는 서열번호: 34의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 임의의 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 31의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 33의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 31의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 35; 서열번호: 36; 및 서열번호: 37); 및 서열번호: 33의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 38; 서열번호: 39; 및 서열번호: 40).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab4이고, 이것은 서열번호: 32 및 서열번호: 34을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 Ab14와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편. 항체 Ab4에 대해, Fab 단편은 서열번호: 31의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 33의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 31 및/또는 서열번호: 33의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab4의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab4 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab5
본 발명은 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 임의로, Ab5 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab5와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다: AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 41).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 42).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASWARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (서열번호: 43).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASWARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 44).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 임의로, 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41 또는 서열번호: 42의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43 또는 서열번호: 44의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 임의로, 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 41의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 43의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 41의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 45; 서열번호: 46; 및 서열번호: 47); 및 서열번호: 43의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 48; 서열번호: 49; 및 서열번호: 50).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 임의로 포함된 키메라 항-NGF 항체는 Ab5이고, 이것은 서열번호: 42 및 서열번호: 44을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 Ab5와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 항체 단편을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab5에 대해, Fab 단편은 서열번호: 41의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 43의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 41 및/또는 서열번호: 43의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab5의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab5 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab6
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab6 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab6와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 51).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 52).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (서열번호: 53).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 54).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51 또는 서열번호: 52의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53 또는 서열번호: 54의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57); 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab6이고, 이것은 서열번호: 52 및 서열번호: 54을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 Ab6와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편. 항체 Ab6에 대해, Fab 단편은 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 임의의 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 51 및/또는 서열번호: 53의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab6의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab6 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab7
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 include Ab7 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같이 Ab7와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKR (서열번호: 61).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 62).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSS (서열번호: 63).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 64).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61 또는 서열번호: 62의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63 또는 서열번호: 64의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 61의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 63의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 61의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 65; 서열번호: 66; 및 서열번호: 67); 및 서열번호: 63의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 68; 서열번호: 69; 및 서열번호: 70).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab7이고, 이것은 서열번호: 62 및 서열번호: 64을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 임의로 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편 또는 Ab7와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편. 항체 Ab7에 대해, Fab 단편은 서열번호: 61의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 63의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 61 및/또는 서열번호: 63의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab 7의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab7 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab8
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab8 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab8와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKR (서열번호: 71).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 72).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSS (서열번호: 73).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 74).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71 또는 서열번호: 72의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73 또는 서열번호: 74의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 71의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 73의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 71의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 75; 서열번호: 76; 및 서열번호: 77); 및 서열번호: 73의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 78; 서열번호: 79; 및 서열번호: 80).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab8이고, 이것은 서열번호: 72 및 서열번호: 74을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab8에 대해, Fab 단편은 서열번호: 71의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 73의 가변 중쇄 서열 또는 Ab8와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 71 및/또는 서열번호: 73의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab8의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab8 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab9
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab9 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab9와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 단편을 포함한다. 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 81).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 82).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 83).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 84).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81 또는 서열번호: 82의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83 또는 서열번호: 84의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 81의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 83의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 81의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 85; 서열번호: 86; 및 서열번호: 87); 및 서열번호: 83의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 88; 서열번호: 89; 및 서열번호: 90).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab9이고, 이것은 서열번호: 82 및 서열번호: 84을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab9에 대해, Fab 단편은 include 서열번호: 81의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 83의 가변 중쇄 서열 또는 Ab9와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 81 및/또는 서열번호: 83의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab9의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab9 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab10
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab10 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab10와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 91).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 92).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSS (서열번호: 93).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 94).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91 또는 서열번호: 92의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93 또는 서열번호: 94의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 임의로, 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 91의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 93의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 91의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 95; 서열번호: 96; 및 서열번호: 97); 및 서열번호: 93의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 98; 서열번호: 99; 및 서열번호: 100).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab10이고, 이것은 서열번호: 92 및 서열번호: 94을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab10에 대해, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 서열번호: 91의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 93의 가변 중쇄 서열 또는 Ab10와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 91 및/또는 서열번호: 93의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab10의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab10 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab11
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab11 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab11와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 항체를 포함한다:
AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKR (서열번호: 101).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSRFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 102).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS (서열번호: 103).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 104).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 임의로, 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101 또는 서열번호: 102의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103 또는 서열번호: 104의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 101의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 103의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 101의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 105; 서열번호: 106; 및 서열번호: 107); 및 서열번호: 103의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 108; 서열번호: 109; 및 서열번호: 110).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab11이고, 이것은 서열번호: 102 및 서열번호: 104을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab11에 대해, Fab 단편은 서열번호: 101의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 103의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab11와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 101 및/또는 서열번호: 103의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위해 Ab11의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab11 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab12
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab12 또는 그의 단편, 또는 Ab12와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편, 또는 아래에서 제시된 예를 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKR (서열번호: 111).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 112).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS (서열번호: 113).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 114).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111 또는 서열번호: 112의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113 또는 서열번호: 114의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 하기의 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 111의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 113의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 111의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 115; 서열번호: 116; 및 서열번호: 117); 및 서열번호: 113의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 118; 서열번호: 119; 및 서열번호: 120).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab12이고, 이것은 서열번호: 112 및 서열번호: 114을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab12에 대해, Fab 단편은 서열번호: 111의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 113의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab12와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 임의의 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 111 및/또는 서열번호: 113 의 부가 결실, 및 변이체를 고려한.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab12의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab12 또는 그의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab13
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 Ab13 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab13와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 121).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 122).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS (서열번호: 123).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 124).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121 또는 서열번호: 122의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123 또는 서열번호: 124의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 121의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 123의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 121의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 125; 서열번호: 126; 및 서열번호: 127); 및 서열번호: 123의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 128; 서열번호: 129; 및 서열번호: 130).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab13이고, 이것은 서열번호: 122 및 서열번호: 124을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab13에 대해, Fab 단편은 include 서열번호: 121의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 123의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab13와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 임의의 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 121 및/또는 서열번호: 123의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab13의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab13 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab14
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 Ab14 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab14와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 단편이다. 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 131).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 132).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS (서열번호: 133).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 134).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131 또는 서열번호: 132의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133 또는 서열번호: 134의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 임의로, 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 131의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 133의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 131의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 135; 서열번호: 136; 및 서열번호: 137); 및 서열번호: 133의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 138; 서열번호: 139; 및 서열번호: 140).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab14이고, 이것은 서열번호: 132 및 서열번호: 134을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab14에 대해, Fab 단편은 서열번호: 131의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 133의 가변 중쇄 서열 또는 Ab14와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 131 및/또는 서열번호: 133 의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab14의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab14 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab15
본 발명은, NGF와 p75와의 회합을 눈에 띄게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab15 또는 그의 단편이거나 Ab15와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKR (서열번호: 141).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 142).
본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSS (서열번호: 143).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATWAKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 144).
본 발명은 추가로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 141의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 142의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 145; 서열번호: 146; 및 서열번호: 147의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 143의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 144의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 148; 서열번호: 149; 및 서열번호: 150의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 141 또는 서열번호: 142의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 143 또는 서열번호: 144의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 141의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 142의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 145; 서열번호: 146; 및 서열번호: 147의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 143의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 144의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 148; 서열번호: 149; 및 서열번호: 150의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 하기의 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 141의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 143의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 141의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 145; 서열번호: 146; 및 서열번호: 147); 및 서열번호: 143의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 148; 서열번호: 149; 및 서열번호: 150).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab15이고, 이것은 서열번호: 142 및 서열번호: 144을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab15에 대해, Fab 단편은 서열번호: 141의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 143의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab15와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab를 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 141 및/또는 서열번호: 143의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab15의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab15 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab16
본 발명은, NGF와 p75와의 회합을 눈에 띄게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab16 또는 그의 단편이거나, Ab16와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 151).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKRFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 152).
본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASWAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSS (서열번호: 153).
본 발명은 또한, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASWAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 154).
본 발명은 추가로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 서열번호: 151의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 152의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 155; 서열번호: 156; 및 서열번호: 157의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 153의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 154의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 158; 서열번호: 159; 및 서열번호: 160의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 151 또는 서열번호: 152의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 153 또는 서열번호: 154의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 151의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 152의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 155; 서열번호: 156; 및 서열번호: 157의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 153의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 154의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 158; 서열번호: 159; 및 서열번호: 160의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 151의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 153의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 151의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 155; 서열번호: 156; 및 서열번호: 157); 및 서열번호: 153의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 158; 서열번호: 159; 및 서열번호: 160).
본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab16이거나, 이것은 서열번호: 152 및 서열번호: 154을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가로 특히 바람직한 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab16에 대해, Fab 단편은 서열번호: 151의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 153의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab16와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 또 하나의 이가 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 151 및/또는 서열번호: 153의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab16의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab16 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab17
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab17 또는 그의 단편이거나, Ab17와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKR (서열번호: 161).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSRFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 162).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSS (서열번호: 163).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 164).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 161의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 162의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 165; 서열번호: 166; 및 서열번호: 167의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 163의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 164의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 168; 서열번호: 169; 및 서열번호: 170의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 161 또는 서열번호: 162의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 163 또는 서열번호: 164의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 161의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 162의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 165; 서열번호: 166; 및 서열번호: 167의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 163의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 164의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 168; 서열번호: 169; 및 서열번호: 170의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 161의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 163의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 161의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 165; 서열번호: 166; 및 서열번호: 167); 및 서열번호: 163의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 168; 서열번호: 169; 및 서열번호: 170).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab17이고, 이것은 서열번호: 162 및 서열번호: 164을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab17에 대해, Fab 단편은 서열번호: 161의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 163의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab15와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 또는 이가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 161 및/또는 서열번호: 163의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab17의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab17 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab18
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab18 또는 그의 단편이거나, Ab18와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKR (서열번호: 171).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 172).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSS (서열번호: 173).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 174).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 171의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 172의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 175; 서열번호: 176; 및 서열번호: 177의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 173의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 174의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 178; 서열번호: 179; 및 서열번호: 180의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 171 또는 서열번호: 172의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 173 또는 서열번호: 174의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 171의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 172의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 175; 서열번호: 176; 및 서열번호: 177의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 173의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 174의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 178; 서열번호: 179; 및 서열번호: 180의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 임의의 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 하기의 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 171의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 173의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 171의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 175; 서열번호: 176; 및 서열번호: 177); 및 서열번호: 173의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 178; 서열번호: 179; 및 서열번호: 180).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab18이고, 이것은 서열번호: 172 및 서열번호: 174을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab18에 대해, Fab 단편은 서열번호: 171의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 173의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab18와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 171 및/또는 서열번호: 173의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab18의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab18 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab19
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab19 또는 그의 단편이거나, Ab19와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKR (서열번호: 181).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 182).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS (서열번호: 183).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항체를 포함한다:
QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 184).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 181의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 182의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 185; 서열번호: 186; 및 서열번호: 187의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 183의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 184의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 188; 서열번호: 189; 및 서열번호: 190의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 181 또는 서열번호: 182의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 183 또는 서열번호: 184의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 181의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 182의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 185; 서열번호: 186; 및 서열번호: 187의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 183의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 184의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 188; 서열번호: 189; 및 서열번호: 190의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함하는 항체 단편을 고려한다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 181의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 183의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 181의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 185; 서열번호: 186; 및 서열번호: 187); 및 서열번호: 183의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 188; 서열번호: 189; 및 서열번호: 190).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항-NGF 항체는 Ab19이고, 이것은 서열번호: 182 및 서열번호: 184을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab19에 대해, Fab 단편은 서열번호: 181의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 183의 가변 중쇄 서열을 포함하거나 Ab19와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 항체 단편을 포함하는. 본 발명의 이러한 임의의 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 181 및/또는 서열번호: 183의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab19의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab19 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab20
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab20 또는 그의 단편이거나, Ab20와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 191).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 192).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS (서열번호: 193).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 194).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 191의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 192의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 195; 서열번호: 196; 및 서열번호: 197의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 193의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 194의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 198; 서열번호: 199; 및 서열번호: 200의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 191 또는 서열번호: 192의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 193 또는 서열번호: 194의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 191의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 192의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 195; 서열번호: 196; 및 서열번호: 197의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 193의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 194의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 198; 서열번호: 199; 및 서열번호: 200의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 191의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 193의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 191의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 195; 서열번호: 196; 및 서열번호: 197); 및 서열번호: 193의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 198; 서열번호: 199; 및 서열번호: 200).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab20이고, 이것은 서열번호: 192 및 서열번호: 194을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab20에 대해, Fab 단편은 서열번호: 191의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 193의 가변 중쇄 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 191 및/또는 서열번호: 193의 부가 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab20의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab20 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab21
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 통증 및 특정 통증 연관된 장애를, 단독으로 또는 또 하나의 활성제, 예를 들면, NSAID 또는 오피오이드 진통제와 공동으로 치료하는 방법을 고려하고, 여기서 상기 항체는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 키메라 항체를 포함하고, 여기서 상기 항체는 Ab21 또는 그의 단편, 또는 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 Ab5와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 경쇄 서열을 보유하는 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (서열번호: 51).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 401).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 가변 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (서열번호: 53).
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 중쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항체를 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 402).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체를 고려한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 401의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 402의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려한다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 그의 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51 또는 서열번호: 401의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53 또는 서열번호: 402의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 401의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 402의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57); 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 키메라 또는 인간화 항-NGF 항체는 Ab21이고, 이것은 서열번호: 401 및 서열번호: 402을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본 발명의 추가의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab21에 대해, Fab 단편은 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 Ab5와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 1가 항체 단편을 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예는 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 유지하면서 상기 Fab에서 서열번호: 51 및/또는 서열번호: 53의 부가, 결실, 및 변이체를 고려한다.
본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 Ab21의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab21 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 단편 Fab1
본 발명은 임의로, NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로, 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 항체 단편 Fab1 또는 그의 단편을 사용하여 통증을 치료하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 본 발명은 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 항체 단편을 포함한다:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 405).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 항체 단편을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (서열번호: 406).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 405의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 406의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51 또는 서열번호: 405의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53 또는 서열번호: 406의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 405의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 406의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과로 이루어지고, 하기 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57); 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 항-NGF 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 Fab1이고, 이것은 서열번호: 405 및 서열번호: 406, 또는 Fab1와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 항체 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체 단편 Fab1 Ab21의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다.
항체 단편 Fab2
본 발명은 임의로, 예를 들면 아래에서 제시된 바와 같은 항체 단편 Fab2 또는 그의 단편을 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제하는 치료적 효과적인 양으로 사용하여 통증을 치료하는 방법을 고려한다. 일 구현예에서, 본 발명은 NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 항체 단편을 포함한다: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 407).
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 가지며 아래에 제시된 서열을 포함하는 경쇄 서열을 보유하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 항체 단편을 포함한다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (서열번호: 408).
본 발명은 추가로 임의로, 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 407의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 및/또는 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 408의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상, 또는 이들 폴리펩타이드 서열의 조합. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 항체 단편은 상기에 제시된 CDR, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열, 및 중쇄 및 경쇄 서열의 하나 이상의 조합을 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어지고, 그것들 모두를 포함한다.
본 발명은 또한 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체의 단편을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51 또는 서열번호: 407의 폴리펩타이드 서열. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53 또는 서열번호: 408의 폴리펩타이드 서열.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 서열 또는 서열번호: 407의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 하기를 포함하거나 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 가변 중쇄 서열 또는 서열번호: 408의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)에 해당하는 서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60의 폴리펩타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 고려하고, 이 단편은 본원에 기재된 항체 단편의 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체의 단편은 하기의 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 하기의 항체 단편 모두를 포함한다: 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역; 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역; 서열번호: 51의 가변 경쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 55; 서열번호: 56; 및 서열번호: 57); 및 서열번호: 53의 가변 중쇄 영역의 상보성-결정 영역 (서열번호: 58; 서열번호: 59; 및 서열번호: 60).
본 발명의 특히 바람직한 임의의 구현예에서, 항-NGF 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편은 Fab2이고, 이것은 서열번호: 407 및 서열번호: 408, 또는 Fab2와 동일한 또는 중복 에피토프에 결합하는 또 하나의 Fab 또는 항체 단편을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어지고, 본원에 제시된 생물학적 활성의 적어도 하나를 갖는다.
본원 (아래)에서 기재된 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체 단편 Fab2은 하기 예에서 제시된 프로토콜을 사용하여 피치아 패스토리스에서의 발현에 의해 생산될 수 있다.
또 하나의 구현예에서, 항체 단편은 하기 비제한 형태 중 하나 이상으로 존재할 수 있다: Fab, Fab', F(ab')₂, Fv 및 단일 사슬 Fv 항체 형태. 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 항-NGF 항체는 일정한 아래에 제시된 서열을 포함하는 카파 경쇄 서열을 추가로 포함한다:
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열번호: 412).
또 하나의 바람직한 임의의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 본원에 기재된 항-NGF 항체는 추가로 아래에서 제시된 서열을 포함하는 감마-1 일정한 중쇄 폴리펩타이드 서열을 포함한다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호: 413).
또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 단리된 항-NGF 항체를 고려하고, 상기 항체는 서열번호: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 402 로부터 선택된 V_H 폴리펩타이드 서열, 또는 그의 변이체를 포함하고; 서열번호: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 401 로부터 선택된 V_L 폴리펩타이드 서열, 또는 그의 변이체를 추가로 포함하고, 여기서 상기 V_H 또는 V_L 폴리펩타이드 중 뼈대 잔기 (FR 잔기)의 1 이상은 NGF에 특이적으로 결합하는 항-NGF 항체를 생기게 하는 또 하나의 아미노산 잔기로 치환되었다. 본 발명은 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 이들 항체의 인간화 키메라 형태를 고려한다. 키메라 항체는 하기로부터 유래된 Fc를 포함할 수 있다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 또는 IgG19 불변 영역.
본 발명의 일 구현예에서, 항체 또는 V_H 또는 V_L 폴리펩타이드는 유래되거나 본원에서 참조된 인간화 과정의 개시 전에 1 이상의 토끼 B 세포 집단로부터 선택된다.
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항-NGF 항체 및 그의 단편은 p75 또는 TrkA에 대한 결합 특이성을 갖지 않는다. 본 발명의 추가 구현예에서, NGF와 p75와의 회합 및/또는 TrkA를 억제하기 위해 항-NGF 항체 및 그의 단편을 사용하는 것을 포함하는 통증 치료 방법이 고려된다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, NGF와 TrkA 및/또는 그의 다량체와의 회합을 억제하고/거나 그의 생물학적 효과에 역작용하기 위해 항-NGF 항체 및 그의 단편을 사용하는 것을 포함하는 통증 치료 방법이 고려된다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, NGF와 p75 및/또는 그의 다량체와의 회합 및 NGF와 TrkA 및/또는 그의 다량체와의 회합을 억제하고, p75 및 TrkA의 생물학적 효과에 역작용하기 위해 항-NGF 항체 및 그의 단편을 사용하는 것을 포함하는 통증 치료 방법이 고려된다.
상기에서 언급된 바와 같이, 항체 및 그의 단편은 후번역으로 변형되어 효과기 모이어티 예컨대 화학적 링커, 검출가능 모이어티 예컨대 예를 들면 형광 염료, 효소, 기질, 생물발광 물질, 방사선활성 물질, 및 화학발광 모이어티, 또는 기능적 모이어티 예컨대 예를 들면 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 세포독소, 세포독성 약물, 및 방사선활성 물질를 부가할 수 있다.
검출가능 모이어티에 관해서, 추가로 예시적인 효소는, 비제한적으로, 홀스래디쉬 페록시다아제, 아세틸콜린에스테라제, 알칼리성 인산분해효소, 베타-갈락토시다아제 및 루시퍼라아제를 포함한다. 추가로 예시적인 형광 물질은, 비제한적으로, 로다민, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 엄벨리페론, 디클로로트리아지닐아민, 파이코에리트린 및 단실 클로라이드를 포함한다. 추가로 예시적인 화학발광 모이어티는, 비제한적으로, 루미놀을 포함한다. 추가로 예시적인 생물발광 물질은, 비제한적으로, 루시페린 및 에쿼린을 포함한다. 추가로 예시적인 방사선활성 물질은, 비제한적으로, 요오드 125 (¹²⁵I), 탄소 14 (¹⁴C), 황 35 (³⁵S), 트리튬 (³H) 및 인 32 (³²P)을 포함한다.
기능적 모이어티에 관해서, 예시적인 세포독성 약물은, 비제한적으로, 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진; 알킬화제 예컨대 메클로레타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴 (CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 사이클로토스파마이드, 메클로레타민, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴 및 카보플라틴 (파라플라틴)을 포함하고; 안트라사이클린은 다우노루비신 (예전에 다우노마이신), 독소루비신 (아드리아마이신), 데토루비신, 카르미노마이신, 아이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비스안트렌을 포함하고; 항생제는 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리키아마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC); 및 항유사분열제 예컨대 빈카 알카로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 다른 세포독성 약물은 하기를 포함한다: 파클리탁셀 (탁솔), 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 사이토칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테노포사이드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 프로카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 마이토탄 (O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이들 세포독성 약물의 혼합물.
추가로 세포독성 약물은, 비제한적으로, 화학요법제 예컨대 카보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 젬시타빈, 칼리키아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 블레오마이신을 포함한다. 식물 및 박테리아 예컨대 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소로부터 유래된 독성 효소는 인간화 또는 키메라 항체, 또는 그의 결합 단편에 콘주게이트되어, 세포-유형-특이적 사멸 시약을 생성할 수 있다 (Youle, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
다른 세포독성 약물은 하기에 의해 기재된 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다: Goldenberg (미국 특허 번호 6,653,104). 본 발명의 구현예는 또한, 방사선면역콘주게이트에 관한 것이고, 여기서 알파 또는 베타 입자를 방출하는 방사선핵종은 복합체-형성제의 사용과 함께 또는 없이 항체, 또는 그의 결합 단편에 안정되게 콘주게이트된다. 그와 같은 방사선핵종은 하기를 포함한다: 베타-에미터 예컨대인-32 (³²P), 스칸듐-47 (⁴⁷Sc), 구리-67 (⁶⁷Cu), 갈륨-67 (⁶⁷Ga), 이트륨-88 (⁸⁸Y), 이트륨-90 (⁹⁰Y), 요오드-125 (¹²⁵I), 요오드-131 (¹³¹I), 사마륨-153 (¹⁵³Sm), 루테튬-177 (¹⁷⁷Lu), 레늄-186 (¹⁸⁶Re) 또는 레늄-188 (¹⁸⁸Re), 및 알파-에미터 예컨대 아스타틴-211 (²¹¹At), 납-212 (²¹²Pb), 비스무트-212 (²¹²Bi) 또는 -213 (²¹³Bi) 또는 악티늄-225 (²²⁵Ac).
추가로 예시적인 방사선활성 물질은 비제한적으로 하기를 포함한다: 요오드 125 (¹²⁵I), 탄소 14 (¹⁴C), 황 35 (³⁵S), 트리튬 (³H) 및 인 32 (³²P).
기능적 모이어티에 관해서, 예시적인 세포독성 약물은, 비제한적으로, 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진; 알킬화제 예컨대 메클로레타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴 (CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 사이클로토스파마이드, 메클로레타민, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴 및 카보플라틴 (파라플라틴)을 포함하고; 안트라사이클린은 include 다우노루비신 (예전에 다우노마이신), 독소루비신 (아드리아마이신), 데토루비신, 카르미노마이신, 아이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비스안트렌; 항생제는 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리키아마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC); 및 항유사분열제 예컨대 빈카 알카로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다. 다른 세포독성 약물은 파클리탁셀 (탁솔), 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 사이토칼라신 B, 그라마이시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 에토포사이드, 테노포사이드, 콜히친, 디하이드록시 안트라신디온, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 퓨로마이신, 프로카르바진, 하이드록시우레아, 아스파라기나제, 코르티코스테로이드, 마이토탄 (O,P'-(DDD)), 인터페론, 및 이들 세포독성 약물의 혼합물을 포함한다.
추가로 세포독성 약물은, 비제한적으로, 화학요법제 예컨대 카보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 젬시타빈, 칼리키아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 블레오마이신을 포함한다. 식물 및 박테리아 예컨대 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소로부터 유래된 독성 효소는 인간화 또는 키메라 항체, 또는 그의 결합 단편에 콘주게이트되어, 세포-유형-특이적-사멸 시약을 생성할 수 있다 (Youle, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
다른 세포독성 약물은 하기에 의해 기재된 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다: Goldenberg (미국 특허 번호 6,653,104). 본 발명의 구현예는 또한, 방사선면역콘주게이트에 관한 것이고, 여기서 알파 또는 베타 입자를 방출하는 방사선핵종은 복합체-형성제의 사용과 함께 또는 없이 항체, 또는 그의 결합 단편에 안정되게 콘주게이트된다. 그와 같은 방사선핵종은 하기를 포함한다: 베타-에미터 예컨대인-32 (³²P), 스칸듐-47 (⁴⁷Sc), 구리-67 (⁶⁷Cu), 갈륨-67 (⁶⁷Ga), 이트륨-88 (⁸⁸Y), 이트륨-90 (⁹⁰Y), 요오드-125 (¹²⁵I), 요오드-131 (¹³¹I), 사마륨-153 (¹⁵³Sm), 루테튬-177 (¹⁷⁷Lu), 레늄-186 (¹⁸⁶Re) 또는 레늄-188 (¹⁸⁸Re), 및 알파-에미터 예컨대 아스타틴-211 (²¹¹At), 납-212 (²¹²Pb), 비스무트-212 (²¹²Bi) 또는 -213 (²¹³Bi) 또는 악티늄-225 (²²⁵Ac)..
항체 또는 그의 결합 단편을 검출가능 모이어티 등에 콘주게이트하기 위한 방법, 예컨대 하기에 의해 기재된 방법에 당해기술에 공지되어 있다: Hunter 등, Nature 144:945 (1962); David 등, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain 등, J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); 및 Nygren, J., Histochem. 및 Cytochem. 30:407 (1982).
본원에 기재된 구현예는 추가로, 본원에서 제시된 항체, 항체 단편, 디아바디, SMIPs, 카멜바디, 나노바디, IgNAR, 폴리펩타이드, 가변 영역 및 CDR와 실질적으로 상동인 변이체 및 동등물을 포함한다. 이들은, 예를 들면, 보존적 치환 돌연변이를 함유할 수 있다 (즉, 유사한 아미노산에 의한 1 이상의 아미노산의 치환). 예를 들면, 보존적 치환은 동일한 일반적인 부류 내의 또 하나에 의한 아미노산, 예를 들면, 또 하나의 산성 아미노산에 의한 하나의 산성 아미노산, 또 하나의 염기성 아미노산에 의하 하나의 염기성 아미노산, 또는 또 하나의 중성 아미노산에 의한 하나의 중성 아미노산의 치환을 의미한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도된 것은 당해분야에 공지되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 임의의 1 이상의 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 90% 또는 그 초과 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 고려한다. 더 바람직하게, 본 발명은 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 임의의 1 이상의 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 95% 또는 그 초과 서열 상동성, 더욱 더 바람직하게 적어도 98% 또는 그 초과 서열 상동성, 및 더욱 더 바람직하게 적어도 99% 또는 그 초과 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 고려한다. 핵산과 아미노산 서열 사이의 상동성을 측정하는 방법은 당해분야의 숙련가에게 공지되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 추가로, 항-NGF 활성을 추가로 갖는 본원에 제시된 항체 단편, 가변 영역 및 CDR의 상기-인용된 폴리펩타이드 동족체를 고려한다. 항-NGF 활성의 비제한 예는 본원에서 제시되어 있다.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 추가로, 임의의 상기 서열에 결합하는 항-유전자형 항체의 생성 및 사용을 고려한다. 예시적인 구현예에서, 그와 같은 항-유전자형 항체는 항-NGF 항체의 효과를 조절, 감소 또는 상쇄시키기 위해 항-NGF 항체를 수용한 대상체에 투여될 수 있다. 그와 같은 항-유전자형 항체는 항-NGF 항체의 존재를 특징으로 하는 자가면역 질환의 치료에 또한 유용할 수 있다. 그와 같은 항-유전자형 항체의 추가로 예시적인 사용은, 예를 들면 대상체의 혈액 또는 다른 체액에서 존재하는 항-NGF 항체의 수준을 모니터링하기 위해 본 발명의 항-NGF 항체의 검출을 위한 것이다.
본 발명은 본원에 기재된 임의의 다른 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 치환된 본원에 기재된 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 항-NGF 항체를 또한 고려한다. 예를 들면, 비제한적으로, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열의 조합을 포함하는 항체를 고려하고 본원에 기재된 임의의 다른 CDR 서열에 대한 본원에 기재된 임의의 CDR 서열의 치환으로부터 얻은 항체를 추가로 고려한다.
항- NGF 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
항체 Ab1
본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 Ab1 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 개인에게 항체 Ab1 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증의 치료 방법에서 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 1의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 201).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 2의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 202).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 3의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 203).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 4의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 204).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 205; 서열번호: 206; 및 서열번호: 207의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 208; 서열번호: 209; 및 서열번호: 210의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어진다: 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 201; 서열번호: 2의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 202; 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 203; 서열번호: 4의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 204; 서열번호: 1의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 2의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 205; 서열번호: 206; 및 서열번호: 207)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 3의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 4의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 208; 서열번호: 209; 및 서열번호: 210)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 항체 Ab1에 대해, 전체 길이 Ab1 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 2의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 202 및 서열번호: 4의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 204.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab1의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab1 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab1 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab2
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab2 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증의 치료 방법에서 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 Ab2 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 11의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGAGTCCCATCAAGGTTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 211).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 12의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGAGTCCCATCAAGGTTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 212).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 13의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 213).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 14의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 214).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 215; 서열번호: 216; 및 서열번호: 217의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 218; 서열번호: 219; 및 서열번호: 220의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어진다: 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 211; 서열번호: 12의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 212; 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 213; 서열번호: 14의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 214; 서열번호: 11의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 12의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 215; 서열번호: 216; 및 서열번호: 217)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 13의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 14의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 218; 서열번호: 219; 및 서열번호: 220)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 항체 Ab2에 대해, 전체 길이 Ab2 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 12의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 212 및 서열번호: 14의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 214.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab2의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab2 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab2 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab3
본 발명은 추가로, 개인에게 항체 Ab3 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증의 치료 방법에서 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab3 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기폴리뉴클레오타이드는 NGF와 p75와의 회합을 눈에 뜨게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 21의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 221).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 22의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 222).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 23의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCGGAGGTGGTGGTAGTATTTATGATATTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 223).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 24의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 224).
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 225; 서열번호: 226; 및 서열번호: 227의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 228; 서열번호: 229; 및 서열번호: 230의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함하여 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어진다: 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 221; 서열번호: 22의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 222; 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 223; 서열번호: 24의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 224; 서열번호: 21의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 22의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 225; 서열번호: 226; 및 서열번호: 227)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 23의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 24의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 228; 서열번호: 229; 및 서열번호: 230)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 항체 Ab3에 대해, 전체 길이 Ab3 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 22의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 222 및 서열번호: 24의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 224.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab3의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab3 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab3 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab4
본 발명은 추가로, 개인에게 항체 Ab4 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab4 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 p75와의 회합을 눈에 띄게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 31의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 231).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 32의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 232).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 33의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCAGTGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTGGAGGTGGTGGTAGTATCTATGATATTTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 233).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 34의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 234).
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 235; 서열번호: 236; 및 서열번호: 237의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 238; 서열번호: 239; 및 서열번호: 240의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 231; 서열번호: 32의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 232; 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 233; 서열번호: 34의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 234; 서열번호: 31의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 32의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 235; 서열번호: 236; 및 서열번호: 237)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 33의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 34의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 238; 서열번호: 239; 및 서열번호: 240)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 항체 Ab4에 대해, 전체 길이 Ab4 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 32의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 232 및 서열번호: 34의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 234.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab4의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항-NGF 항체 예컨대 Ab4 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab4 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab5
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab5 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 Ab5 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 41의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 241).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 42의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 242).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 43의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTGGGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAAGCGAGGACACGGCCACATATTTCTGTGCCAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 243).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 44의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 244).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 단편을 인코딩하는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 245; 서열번호: 246; 및 서열번호: 247 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 248; 서열번호: 249; 및 서열번호: 250의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 241; 서열번호: 42의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 242; 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 243; 서열번호: 44의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 244; 서열번호: 41의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 42의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 245; 서열번호: 246; 및 서열번호: 247)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 43의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 44의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 248; 서열번호: 249; 및 서열번호: 250)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab5에 대해, 전체 길이 Ab5 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 42의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 242 및 서열번호: 44의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 244.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab5의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab5 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab5 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab6
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab6 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab6 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 51의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 251).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 52의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 252).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 53의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 253).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 54의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 254).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 단편을 인코딩하는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 251; 서열번호: 52의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 252; 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 253; 서열번호: 54의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 254; 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 52의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 54의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab6에 대해, 전체 길이 Ab6 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 52의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 252 및 서열번호: 54의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 254.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab6의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab6 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab6 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab7
본 발명은 임의로 추가로, 개인에게 항체 Ab7 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab7 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 61의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACAATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 261).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 62의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACAATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 262).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 63의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCGAGCTGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 263).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 64의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 264).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 265; 서열번호: 266; 및 서열번호: 267의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 268; 서열번호: 269; 및 서열번호: 270의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 261; 서열번호: 62의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 262; 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 263; 서열번호: 64의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 264; 서열번호: 61의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 62의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 265; 서열번호: 266; 및 서열번호: 267)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 63의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 64의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 268; 서열번호: 269; 및 서열번호: 270)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab7에 대해, 전체 길이 Ab7 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 62의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 262 및 서열번호: 64의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 264.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab7의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab7 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab7 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab8
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab8 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab8 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 71의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 271).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 72의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 272).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 73의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCAAGCAGTGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 273).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 74의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 274).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 275; 서열번호: 276; 및 서열번호: 277의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 278; 서열번호: 279; 및 서열번호: 280의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 271; 서열번호: 72의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 272; 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 273; 서열번호: 74의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 274; 서열번호: 71의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 72의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 275; 서열번호: 276; 및 서열번호: 277)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 73의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 74의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 278; 서열번호: 279; 및 서열번호: 280)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab8에 대해, 전체 길이 Ab8 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 72의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 272 및 서열번호: 74의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 274.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab8의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab8 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab8 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab9
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab9 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab9 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 81의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 281).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 82의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 282).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 83의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATATTACGCGAGCTGGGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGAGCTGAAGATCACCAGTCCGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTCCTGTTAATTATTATTTGGACATTTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 283).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 84의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 284).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 285; 서열번호: 286; 및 서열번호: 287의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 288; 서열번호: 289; 및 서열번호: 290의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 281; 서열번호: 82의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 282; 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 283; 서열번호: 84의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 284; 서열번호: 81의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 82의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 285; 서열번호: 286; 및 서열번호: 287)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 83의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 84의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 288; 서열번호: 289; 및 서열번호: 290)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab9에 대해, 전체 길이 Ab9 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 82의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 282 및 서열번호: 84의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 284.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab9의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab9 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab9 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab10
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab10 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab10 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 91의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 291).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 92의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 292).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 93의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATACTACGCTAGCAGCGCTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTCCTGTTAATTACTACTTGGACATTTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 293).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 94의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 294).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 295; 서열번호: 296; 및 서열번호: 297의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 298; 서열번호: 299; 및 서열번호: 300의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 291; 서열번호: 92의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 292; 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 293; 서열번호: 94의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 294; 서열번호: 91의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 92의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 295; 서열번호: 296; 및 서열번호: 297)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 93의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 94의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 298; 서열번호: 299; 및 서열번호: 300)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab10에 대해, 전체 길이 Ab10 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 92의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 292 및 서열번호: 94의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 294.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab10의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab10 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab10 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab11
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab11 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab11 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 101의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGATGGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 301).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 102의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGATGGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 302).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 103의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATACATCGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 303).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 104의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 304).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 305; 서열번호: 306; 및 서열번호: 307의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 단편을 인코딩하는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 308; 서열번호: 309; 및 서열번호: 310의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 301; 서열번호: 102의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 302; 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 303; 서열번호: 104의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 304; 서열번호: 101의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 102의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 305; 서열번호: 306; 및 서열번호: 307)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 103의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 104의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 308; 서열번호: 309; 및 서열번호: 310)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab11에 대해, 전체 길이 Ab11 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 102의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 302 및 서열번호: 104의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 304.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab11의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab11 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab11 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab12
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab12 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab12 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 111의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGATGGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 311).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 112의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGATGGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 312).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 113의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACCTCCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 313).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 114의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 314).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 315; 서열번호: 316; 및 서열번호: 317의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 318; 서열번호: 319; 및 서열번호: 320의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 311; 서열번호: 112의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 312; 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 313; 서열번호: 114의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 314; 서열번호: 111의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 112의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 315; 서열번호: 316; 및 서열번호: 317)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 113의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 114의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 318; 서열번호: 319; 및 서열번호: 320)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab12에 대해, 전체 길이 Ab12 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 112의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 312 및 서열번호: 114의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 314.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab12의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab12 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab12 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab13
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab13 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab13 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 121의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 321).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 122의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTA (서열번호: 322).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 123의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 323).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 124의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 324).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 325; 서열번호: 326; 및 서열번호: 327의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 328; 서열번호: 329; 및 서열번호: 330의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 321; 서열번호: 122의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 322; 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 323; 서열번호: 124의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 324; 서열번호: 121의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 122의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 325; 서열번호: 326; 및 서열번호: 327)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 123의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 124의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 328; 서열번호: 329; 및 서열번호: 330)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab13에 대해, 전체 길이 Ab13 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 122의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 322 및 서열번호: 124의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 324.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab13의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab13 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab13 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab14
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab14 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab14 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 131의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 331).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 132의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 332).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 133의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 333).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 134의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 334).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 335; 서열번호: 336; 및 서열번호: 337의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 338; 서열번호: 339; 및 서열번호: 340의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 331; 서열번호: 132의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 332; 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 333; 서열번호: 134의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 334; 서열번호: 131의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 132의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 335; 서열번호: 336; 및 서열번호: 337)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 133의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 134의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 338; 서열번호: 339; 및 서열번호: 340)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab14에 대해, 전체 길이 Ab14 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 132의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 332 및 서열번호: 134의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 334.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab14의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab14 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab14 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab15
본 발명은 추가로, 개인에게 항체 Ab15 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab15 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 p75와의 회합을 눈에 뜨게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 141의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATACTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 341).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 142의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATACTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 342).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 143의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTTGGAGTGGTGGCACCTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGCAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACGCGGCCACCTATTTCTGTGCCGCAGGTGGTGGTAGTATTTATGATGTTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 343).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 144의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 344).
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 141의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 142의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 345; 서열번호: 346; 및 서열번호: 347의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 143의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 144의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 348; 서열번호: 349; 및 서열번호: 350의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 141의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 341; 서열번호: 142의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 342; 서열번호: 143의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 343; 서열번호: 144의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 344; 서열번호: 141의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 142의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 345; 서열번호: 346; 및 서열번호: 347)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 143의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 144의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 348; 서열번호: 349; 및 서열번호: 350)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab15에 대해, 전체 길이 Ab15 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 142의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 342 및 서열번호: 144의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 344.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab15의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab15 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab15 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab16
본 발명은 추가로, 개인에게 항체 Ab16 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 Ab16 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 p75와의 회합을 눈에 뜨게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 151의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTGGCAACTGGGGTCCCAAAGCGGTTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTATAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 351).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 152의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTGGCAACTGGGGTCCCAAAGCGGTTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTATAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 352).
본 발명의 또 하나의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 153의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGAGTTCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGATCATTGGTAGTATTGGTACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCTTCATCTCCAAAACCTCGACCACTGTGGATCTGAAAATCATTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGCTGGCGTTACTGTTGATGGTTATGGCTACTACTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 353).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 154의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 354).
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 151의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 152의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 355; 서열번호: 356; 및 서열번호: 357의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 153의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 154의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 358; 서열번호: 359; 및 서열번호: 360의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 151의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 351; 서열번호: 152의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 352; 서열번호: 153의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 353; 서열번호: 154의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 354; 서열번호: 151의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 152의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 355; 서열번호: 356; 및 서열번호: 357)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 153의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 154의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 358; 서열번호: 359; 및 서열번호: 360)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab16에 대해, 전체 길이 Ab16 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 152의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 352 및 서열번호: 154의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 354.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab16의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab16 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab16 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab17
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab17 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab17 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기폴리뉴클레오타이드는 NGF와 p75와의 회합을 눈에 뜨게 억제하지 않으면서 NGF와 TrkA와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 161의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 361).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 162의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 362).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 163의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGGGATCCCTGACACTCACCTGCGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCACTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGACTCTGACGATCACCGATCTGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTATGGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 363).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 164의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 364).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 161의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 162의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 365; 서열번호: 366; 및 서열번호: 367의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 163의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 164의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 368; 서열번호: 369; 및 서열번호: 370의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 161의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 361; 서열번호: 162의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 362; 서열번호: 163의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 363; 서열번호: 164의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 364; 서열번호: 161의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 162의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 365; 서열번호: 366; 및 서열번호: 367)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 163의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 164의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 368; 서열번호: 369; 및 서열번호: 370)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab17에 대해, 전체 길이 Ab17 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 162의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 362 및 서열번호: 164의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 364.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab17의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab17 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab17 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab18
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab18 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab18 폴리펩타이드를 생산하기위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 171의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 371).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 172의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 372).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 173의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCTAGCTCTGCTAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTATGGCATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 373).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 174의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 374).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 171의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 172의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 375; 서열번호: 376; 및 서열번호: 377의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 173의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 174의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 378; 서열번호: 379; 및 서열번호: 380의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 171의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 371; 서열번호: 172의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 372; 서열번호: 173의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 373; 서열번호: 174의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 374; 서열번호: 171의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 172의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 375; 서열번호: 376; 및 서열번호: 377)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 173의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 174의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 378; 서열번호: 379; 및 서열번호: 380)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 항체 Ab18에 대해, 전체 길이 Ab18 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 172의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 372 및 서열번호: 174의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 374.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab18의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab18 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab18 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab19
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab19 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab19 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 181의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (서열번호: 381).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 182의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 382).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 183의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGTCTGGTCATGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAGGAAACAAACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCAAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 383).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 184의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 384).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 181의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 182의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 385; 서열번호: 386; 및 서열번호: 387의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 183의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 184의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 388; 서열번호: 389; 및 서열번호: 390의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 181의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 381; 서열번호: 182의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 382; 서열번호: 183의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 383; 서열번호: 184의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 384; 서열번호: 181의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 182의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 385; 서열번호: 386; 및 서열번호: 387)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 183의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 184의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 388; 서열번호: 389; 및 서열번호: 390)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab19, 전체 길이 Ab19 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 182의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 382 및 서열번호: 184의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 384.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab19의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab19 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab19 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab20
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab20 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 Ab20 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 191의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (서열번호: 391).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 192의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 392).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 193의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCGACCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 393).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 194의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 394).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 191의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 192의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 395; 서열번호: 396; 및 서열번호: 397의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 193의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 194의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 398; 서열번호: 399; 및 서열번호: 400의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 191의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 391; 서열번호: 192의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 392; 서열번호: 193의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 393; 서열번호: 194의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 394; 서열번호: 191의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 192의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 395; 서열번호: 396; 및 서열번호: 397)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 193의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 194의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 398; 서열번호: 399; 및 서열번호: 400)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab20에 대해, 전체 길이 Ab20 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 192의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 392 및 서열번호: 194의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 394.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab20의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab20 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab20 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 Ab21
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab21 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 항체 Ab21 폴리펩타이드를 생산하기 위한, 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 NGF와 TrkA와의 회합 및 NGF와 p75와의 회합을 억제한다. 본 발명은 추가로 임의로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 51의 가변 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT(서열번호: 251).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 임의로 서열번호: 401의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 403).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 53의 가변 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (서열번호: 253).
본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 402의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다:
AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (서열번호: 404).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 401의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 402의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 251; 서열번호: 401의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 403; 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 253; 서열번호: 402의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 404; 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 401의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 402의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 Ab21에 대해, 전체 길이 Ab21 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다: 서열번호: 401의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 403 및 서열번호: 402의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 404.
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본원(내)에서 기재된 본 발명의 하나의 임의의 구현예에서, Fab 단편은 적당한 숙주에서 전체길이 폴리뉴클레오타이드의 발현 다음에 Ab21의 효소 소화 (예를 들면, 파파인)에 의해 생산될 수 있다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 항-NGF 항체 예컨대 Ab21 또는 그의 Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Ab21 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
항체 단편 Fab2
본 발명은 추가로 임의로, 개인에게 항체 Ab1 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 개인의 통증의 치료 방법에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 NGF와 TrkA 및 p75와의 회합을 억제하는 항체 단편 Fab2 폴리펩타이드를 생산하기 위한 아래에서 제시된 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방용 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 Fab 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 407의 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (서열번호: 409).
본 발명의 또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호: 408의 중쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 하기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하거나, 또는 대안적으로 그것으로 이루어진다:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTACTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACTAG (서열번호: 410).
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함한다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 409의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명의 추가 임의의 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 Fab 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함한다: 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 410의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 해당하는 서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260의 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상.
본 발명은 또한 임의로, 본원에 기재된 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, NGF에 대한 결합 특이성을 갖는, 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한 항체 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 1, 2, 3 또는 그 초과를 포함하거나, 그것으로 이루어지고, 항체 단편을 인코딩하는 모든 하기의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다: 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 251; 서열번호: 407의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 409; 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 253; 서열번호: 408의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 410; 서열번호: 51의 경쇄 가변 서열 또는 서열번호: 407의 경쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 255; 서열번호: 256; 및 서열번호: 257)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 서열번호: 53의 중쇄 가변 서열 또는 서열번호: 408의 중쇄 서열의 상보성-결정 영역 (서열번호: 258; 서열번호: 259; 및 서열번호: 260)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 바람직한 임의의 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 NGF에 대한 결합 특이성을 갖는 Fab (단편 항원 결합) 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하거나, 대안적으로 그것으로 이루어진다. 항체 단편 Fab2에 대해, Fab 단편을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 하기를 포함한다: 서열번호: 407의 경쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 409 및 서열번호: 408의 중쇄 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열번호: 410.
본 발명의 또 하나의 구현예는 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO, HEK-293에서, 또는 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 예컨대 효모 피치아에서 발현을 위한 발현 벡터로 통합된 이들 폴리뉴클레오타이드를 고려한다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다. 본 명세서(내)에 기재된 본 발명의 일 구현예에서, Fab 단편은 포유동물 세포 예컨대 CHO, NSO 또는 HEK 293 세포, 진균, 곤충, 식물 또는 미생물계 예컨대 효모 세포 (예를 들면 2배체 효모 예컨대 2배체 피치아) 및 다른 효모 균주에서 Fab2 폴리뉴클레오타이드의 발현을 통해 생산될 수 있다. 적당한 피치아 종은, 비제한적으로, 피치아 패스토리스를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 임의로, 서열번호: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 402 로부터 선택된 항-NGF V_H 항체 아미노산 서열을 인코딩하거나 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 뼈대 잔기 (FR 잔기)는 토끼 항-NGF 항체 V_H 폴리펩타이드 또는 보존적 아미노산 치환 에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환되었다.
또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 401의 항-NGF VL 항체 아미노산 서열을 인코딩하고, 또는 그의 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 적어도 하나의 뼈대 잔기 (FR 잔기)는 토끼 항-NGF 항체 V_L 폴리펩타이드 또는 보존적 아미노산 치환 에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산으로 치환되었다.
또 하나의 임의의 구현예에서, 본 발명은 하기에 함유된 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열을 포함하는 1 이상의 이종기원 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다:
서열번호:1 및 서열번호:3; 서열번호:11 및 서열번호:13; 서열번호:21 및 서열번호:23; 서열번호:31 및 서열번호:33; 서열번호:411 및 서열번호:43; 서열번호:51 및 서열번호:53, 서열번호:61 및 서열번호:63; 서열번호:71 및 서열번호:73; 서열번호:81 및 서열번호:83; 서열번호:91 및 서열번호:93; 서열번호:101 및 서열번호:103; 서열번호:111 및 서열번호:113; 서열번호:121 및 서열번호:123; 서열번호:131 및 서열번호:133; 서열번호:141 및 서열번호:143; 서열번호:151 및 서열번호:153; 서열번호:161 및 서열번호:163; 서열번호:171 및 서열번호:173; 서열번호:181 및 서열번호:183; 서열번호:191 및 서열번호:193; 또는 서열번호:401 및 서열번호:403.
또 하나의 구현예에서, 본 발명은 임의로, 항-NGF 항체로부터 유래된 CDR 폴리펩타이드의 적어도 하나를 함유하는 폴리펩타이드를 발현시키는 단리된 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 여기서 상기 발현된 폴리펩타이드 단독은 NGF에 특이적으로 결합하거나 통증 및 통증 연관 상태의 치료 또는 예방을 위한, 항-NGF 항체로부터 유래된 CDR 폴리펩타이드의 적어도 하나를 함유하는 폴리펩타이드를 발현시키는 또 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열와 공동으로 발현될 때 NGF에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 CDR의 적어도 하나는 하기의 V_L 또는 V_H 폴리펩타이드에서 함유된 것으로부터 선택된다:
서열번호: 1, 3, 11, 13, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, 133, 141, 143, 151, 153, 161, 163, 171, 173, 181, 183, 191, 193, 401 또는 서열번호:403.
상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주세포 및 벡터가 또한 고려된다.
본 발명은 추가로 임의로, 가변 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 뿐만 아니라 본원에 제시된 개별적인 상보성-결정 영역 (CDR, 또는 고도가변 영역)을 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 상기 벡터 서열을 포함하는 숙주세포를 고려한다. 본 발명의 일 구현예에서, 숙주세포는 효모 세포이다. 본 발명의 또 하나의 구현예에서, 효모 숙주세포는 피치아속에 속한다.
실시예
하기 실시예는 당해분야의 숙련가에게 제공하기 위해 완전한 개시내용 및 본 발명의 제조 및 사용 방법에 대한 설명과 함께 제시되며, 본 발명으로 간주되는 것의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용된 수치 (예를 들면 양, 온도, 농도, 등)에 대한 정확도를 보증하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 감안되어야 한다. 달리 지적되지 않으면, 부는 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 ℃ 단위이며; 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1
이 실시예는 배양된 피. 패스토리스 세포로부터 생산된 재조합 항체의 순도를 개선하는 배양 방법을 기재한다. 에탄올의 볼러스가 배양 동안 부가된 경우, 생성된 항체는 원하지 않는 생성물-관련된 변이체의 농도가 크게 감소하였다.
방법
접종물을 산출하기 위해, 2배체 피. 패스토리스를 하기 영양소로 구성된 배지를 사용하여 성장시켰다 (백분율은 w/v로서 주어짐): 효모 추출물 3%, 무수 덱스트로오스 2%, YNB 1.34%, 바이오틴 0.004% 및 100 mM 칼륨 포스페이트 (pH 6.0). 수행 L355, L357, L358, L359 및 L360을 위한 접종물 배지는 하기 영양소로 구성되었다 (백분율은 w/v로서 주어짐): 효모 추출물 3%, 글리세롤 2%, YNB 1.34%, 바이오틴 0.004%, 200 mM 칼륨 포스페이트 (pH 6.0). 접종물을 진탕 배양기에서 대략 24 시간 내지 29 시간 동안 30℃ 및 300 rpm에서 성장시켰다. 그 다음, 10% 접종물을 1 L 멸균 성장 배지를 함유하는 Labfors 2.5L 작업 용적 용기에 부가했다. 성장 배지는 하기 영양소로 구성되었다: 칼륨 설페이트 18.2 g/L, 암모늄 포스페이트 1염기성 36.4 g/L, 칼륨 포스페이트 이염기성 12.8 g/L, 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트 3.72 g/L, 나트륨 시트레이트 디히드레이트 10 g/L, 글리세롤 40 g/L, 효모 추출물 30 g/L, PTM1 미량 금속 4.35 mL/L, 및 거품억제제204 1.67 mL/L. PTM1 미량 금속 용액은 하기 성분으로 구성되었다: 쿠프릭 설페이트 펜타히드레이트 6 g/L, 나트륨 아이오다이드 0.08 g/L, 망간 설페이트 히드레이트 3 g/L, 나트륨 몰리브데이트 디히드레이트 0.2 g/L, 붕산 0.02 g/L, 코발트 클로라이드 0.5 g/L, 아연 클로라이드 20 g/L, 페러스 설페이트 헵타히드레이트 65 g/L, 바이오틴 0.2 g/L, 및 황산 5 mL/L. 효모 균주는 엔지니어링되어 중쇄 코딩 서열의 4개의 통합된 게놈 복제물 (서열번호: 441) 및 경쇄 코딩 서열 (서열번호: 440)의 3개의 복제물로부터 Ab-A 항체를 발현시켰다. 중쇄 유전자 복제물은 pGAP 유전자자리 (3 복제물) 및 HIS4 TT 유전자자리 (1 복제물) 내로 통합되는 한편, 3개의 경쇄 유전자 복제물은 pGAP 유전자자리 내로 통합되었다. 항체 사슬 유전자 복제물은 각각 GAP 프로모터의 제어하에 있었다. 생물반응기 공정 제어 파라미터는 하기와 같이 설정되었다: 진탕 1000 rpm, 기류 1.35 표준 리터/분, 온도 28℃, 및 pH는 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 (6으로) 조절되었다. 산소 보충은 제공되지 않았다.
접종물의 부가 후, 발효 배양물을 대략 12 내지 16 시간 ("성장 단계") 동안 성장시켰다. 성장 단계는, 용해된 산소 ("DO") 스파이크 (용해된 산소 농도의 갑작스러운 증가)에 의해 검출된 바와 같이, 배지에 초기 글리세롤이 소비된 경우에 종료되었다. 그 다음, 배양물을 수행 L306을 위해 용해된 산소 스파이크 후 대략 3 시간 동안 단식시켰다 ("기아 단계"). 다른 수행을 위해, 에탄올 볼러스를 DO 스파이크 직후 부가했다. 그 다음, 에탄올의 볼러스를 반응기에 부가하여 1% 에탄올 (w/v)의 최종 농도를 제공했다. 대조 배양물을 동일하게 처리하되, 단, 상기 에탄올의 볼러스 부가는 제외했다. 발효 배양물을 15 내지 30분 동안 평형화시켰다 ("평형 단계"). 평형 단계 후, 공급물을 40분 동안 30 g/L/hr의 일정한 속도로 부가했다 ("전이 단계"). 나머지 배양 ("생산 단계") 동안, 에탄올 농도를, 공급 속도를 조절하는데 사용되었던 에탄올 감지 프로브 (Raven Biotech)를 사용하여 검출했으며, 상기 공급 속도는 에탄올 농도가 설정값 미만인 경우에는 15 g/L/hr로 설정되거나 에탄올 농도가 설정값 초과인 경우에는 7.5 g/L/hr로 설정되었다. 15 g/L/hr의 높은 공급 속도가 (L315 발효 수행에서 발생되는) 설정값에서 에탄올을 유지시키기에 충분히 높지 않은 경우에, 높은 공급 속도를 22.5 g/L/hr로 설정하는 한편, 낮은 공급 속도를 15 g/L/hr로 설정했다. 동일한 설정값이 에탄올 볼러스가 배양물에 부가되는지 여부와 상관없이 유지되었다 (효모에 의한 에탄올의 생산은 에탄올의 볼러스 부가 없이 설정값에 도달하게 하였다). 공급물은 하기 성분으로 구성되었다: 효모 추출물 50 g/L, 무수 덱스트로오스 500 g/L, 마그네슘 설페이트 헵타히드레이트 3 g/L, PTM1 미량 금속 12 mL/L, 및 나트륨 시트레이트 디히드레이트 0.5g/L. 총 발효 시간은 전형적으로 이들 실험에서 85 시간 내지 97 시간이더라도, 더 장시간 및 더 단시간이 또한 사용될 수 있다.
생산 단계 후, 발효 배양물에 각각 0.05% w/v 및 3 mM 최종 농도로 PEI (폴리에틸렌이민) 및 EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 부가했다. 그 다음, 배양물을 원심분리기에서 회전시키고 항체를 단백질 A 친화도에 의해 배양물 상청액으로부터 정제했다. 간단히 말해서, 수확된 발효 액체배지로부터 0.2μ 정화된 상청액 대략 20 mL를 동일한 용적의 평형 완충액 (20 mM 히스티딘 pH6)으로 희석했다. 그 다음, 이 희석된 액체배지로부터, 20 mL를 미리-평형화시킨 1 mL HiTrap MabSelect Sure 칼럼 (GE, Piscataway, NJ) 위로 부하했다. 칼럼을 차후에 40 칼럼 용적의 평형 완충액을 사용하여 세척했다. 컬럼 위에 결합된 항체를 100% 용출 완충액 (100 mM 시트르산 pH 3.0)으로의 단계 구배를 사용하여 용출시켰다. 1 mL 분획을 수집하고 100 μL의 2M Tris 완충액 pH 8.0을 사용하여 즉각적으로 중화했다. 분획을 함유하는 단백질을 280nM에서의 흡광도를 측정함으로써 결정하고 단백질-함유 분획은 풀드(pooled)되었다.
단백질 A 정제된 항체는 SDS-PAGE를 사용하여 순도를 분석했다. 비-환원된 샘플의 경우, SDS-PAGE는 제조자의 지침에 따라서 4%-12% 폴리아크릴아마이드 구배를 함유하는 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 겔 (NuPAGE® Bis-Tris 겔)을 사용하여, NuPAGE® MES SDS 러닝 버퍼 및 NuPAGE® LDS 샘플 완충액 (모두 Invitrogen에서 입수, Carlsbad, Ca.)을 사용하여 수행되었다. 그 다음, 단백질을 쿠마씨 블루 염색으로 시각화하였다. 환원된 샘플을 동일한 방식으로 처리하되, 단, 샘플은 제조자의 지침에 따라서 NuPAGE® 샘플 환원제 (Invitrogen, Carlsbad, Ca.)를 사용하여 부하 전에 환원되었다.
결과
배양 동안 항체 순도에 대한 에탄올의 볼러스 부가의 효과를 결정하기 위해, 항체 Ab-A를 성장 단계의 말기 및 생산 단계 이전에 1% (10 g/L)의 최종 농도로 에탄올의 볼러스 부가의 존재 또는 부재 하에서 효모 배양물로부터 생산했다. 생산 단계는 97 시간 (도 1), 87 시간 (도 2), 또는 86 시간 (도 3) 동안 계속되었다. 그 다음, 각 배양물에 의해 생산된 항체를 배양 배지로부터 수확하고, 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제했다.
SDS-PAGE는 완전 항체, "하프 항체" 또는 H1L1 복합체 (하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유함) 및 H2L1 복합체 (2개의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유함)의 상대 존재비를 검출하기 위해 사용되었다. H1L1 및 H2L1 복합체의 존재비는 에탄올의 볼러스 부가와 함께 생산된 배양물에서 크게 감소했다. 이러한 개선은 도 1A (레인 2 및 3 (볼러스 부가)을 레인 5 (볼러스 없음)와 비교한다); 도 2A (레인 2 (볼러스 부가)를 레인 3 (볼러스 없음)과 비교한다); 도 3A (레인 2 및 4 (볼러스 부가)를 레인 5-7 (볼러스 없음)과 비교한다)에서 보여주는 3개의 실험에서 재현되었다. 환원 조건 하에서, H1L1, H2L1, 및 완전 항체 종은 각각 개별적인 중쇄 및 경쇄로 분리되었고, 이것은 디설파이드-결합에 의해 연결된 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄로 이루어짐으로써 75 kDa 밴드의 동일성을 확증한다 (도 1B 및 2B; 레인 순서는 각각 도 1A 및 1B에서와 동일하다).
그때, H1L1 종의 존재비의 감소는 ImageJ를 사용하여 정량화되어 비-환원된 겔의 길이에 따른 겔 밴드 밀도를 플롯팅하였다 (도 1c-e 및 2C-d는 각각 도 1A, 레인 2, 3, 및 5, 및 도 2A, 레인 2 및 3에 상응하며, 도 3B는 도 3A의 레인 2 및 4-6에 상응한다). H1L1 피크 아래의 면적을 정량화했고 그 결과를 도 1F, 2E, 및 3B에 표로 나타냈다. 이들 측정을 기반으로, 항체 생산 전에 에탄올 볼러스의 부가는 75 kDa 밴드의 상대 존재비를 도 1A에서는 약 90%만큼, 도 2A에서는 약 85%만큼, 그리고 도 3A에서는 약 87%만큼 감소시켰다.
요약하면, 이들 결과는, H1L1 종의 농도가 배양물에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 크게 감소되었음을 실증하며, 이것은 H1L1 종의 생산을 약 85% 내지 90% 감소시켰다.
실시예 2
이 실시예는, 2개의 부가적 항체의 생산 동안 사용되는 경우 동일한 방법이 항체 순도의 유사한 개선을 초래함을 실증함으로써 실시예 1에서 수득된 결과를 확장시킨다.
방법
항체 Ab-B 및 Ab-C는 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 재조합으로 생산되었다. 항체 Ab-C는 엔지니어링된 효모 균주로부터 발현되었으며, 중쇄 코딩 서열 (서열번호: 439)의 4개의 복제물 및 경쇄 코딩 서열 (서열번호: 438)의 3개의 복제물을 함유한다. 샘플을 반응기로부터 채취하고 항체를 함유하는 배양물 상청액을 Ab-B 항체의 경우 67 시간 (T67) 또는 87 시간 (T87)의 총 발효 시간 후에, Ab-C 항체의 경우 86 시간 (T86) 동안 수집하고, 단백질 A 친화도로 정제하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE로 분석했다.
결과
항체 Ab-B (도 4) 및 Ab-C (도 5)는 성장 단계 말기 및 생산 단계 전에 1% 최종 농도로 에탄올의 볼러스 부가의 존재 또는 부재하에 생산되었다. 에탄올의 볼러스 부가 없이 생산된 항체의 경우, H1L1 또는 하프 항체 종, 및 H2L1 종은 각각 두드러진 밴드로서 관찰되었다 (도 4A, 레인 6 및 7; 도 4C, 레인 6 및 7; 도 5A, 레인 5 및 6). 이들 밴드의 세기는 에탄올의 볼러스 부가와 함께 생산된 배양물의 경우 크게 감소되었다 (도 4A, 레인 2-3; 도 4C, 레인 2-3; 도 5A, 레인 3). 환원 조건 하에서, H1L1 및 H2L1 밴드는 개별적인 중쇄 및 경쇄로 분리되었고, 이것은 전체 길이 중쇄 및 경쇄로 이루어짐으로써 이들 종의 동일성을 확증한다 (도 4B, 4D, 및 5B; 레인 순서는 각각 도 4A, 4D, 및 5A에서와 동일하다).
그때, H1L1 종의 존재비의 감소는 ImageJ를 사용하여 정량화되어 비-환원된 겔의 길이에 따른 겔 밴드 밀도를 플롯팅했다. 도 4E 및 4F는 각각 도 4A (T67) 및 4C (T87)에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 에탄올의 볼러스 부가가 도 4A에서 보여주는 바와 같이 조기 시점에서 H1L1 복합체의 상대 존재비를 약 73% 감소시키고, 도 4C에서 보여주는 바와 같이 후기 시점에서 H1L1 복합체의 상대 존재비를 약 34% 평균 감소시킴을 실증한다. 마찬가지로, 도 5C는 도 5A에서 보여주는 H1L1 피크에 포함된 영역을 표로 나타내며, 이것은 에탄올의 볼러스 부가에 의해 H1L1 복합체의 상대 존재비를 약 61% 평균 감소시킴을 실증한다.
요약하면, 이들 결과는 H1L1 및 H2L1 종의 농도가 상이한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 부가적 항체를 위한 배양물에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 약 61% 내지 73%만큼 감소되었음을 실증한다.
실시예 3
이 실시예는 추가로 배양 동안 에탄올의 볼러스 부가를 통해 배양된 피. 패스토리스 세포로부터 생산된 재조합 항체의 개선된 순도를 기재한다. H1L1 및 H2L1 종의 존재비의 커다란 감소 이외에, 이 실시예는 추가로 다른 생성물-관련된 변이체의 농도의 감소를 실증한다.
방법
재조합 항체 Ab-A, Ab-B, 및 Ab-C를 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 피. 패스토리스 배양물로부터 제조하고 정제했다. 항체를 성장 단계 말기 및 생산 단계 전에 1% (w/v) 최종 농도로 에탄올의 볼러스 부가의 존재 또는 부재 하에 생산했다. 단백질 A 정제된 항체 제제의 순도를 분석하기 위해, 크기 배제 고-성능 액체 크로마토그래피 (SE-HPLC)를 사용했다. 간단히 말해서, UV 검출 기기를 포함한 Agilent (Santa Clara, CA) 1200 시리즈 HPLC를 사용했다. 샘플 분리를 위해, Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA)로부터 입수된 TSKgel Guard SW_XL 6x40 mm와 연결된 TSKgel 3000SW_XL 7.8x300 mm 칼럼을 사용했다. 등용매 모드에서 0.5 mL/min의 유속으로 100 mM 나트륨 포스페이트, 200 mM 나트륨 클로라이드 pH 6.5의 용액을 이동상으로서 사용했으며, UV 215nm에서의 흡광도를 모니터링했다. 샘플의 주사 전에, 칼럼을 안정한 기준선이 달성될 때까지 평형화시켰다. 샘플을 이동상을 사용하여 1 mg/mL의 농도로 희석하고 30 μL 용적을 주입했다. 칼럼 성능을 모니터링하기 위해, BioRad (Hercules, CA) 겔 여과 표준물을 사용했다.
결과
동일한 방법을 사용하여 생산된 실시예 1에 기재된 Ab-A 항체 제제 및 부가적 제제를 효모에서 발현시키고, 단백질 A 친화도로 정제하고, 그 다음 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여 순도를 분석했다. 사용된 조건 하에서, 하프 항체 (H1L1) 종은 완전 항체와 공-용출되며, 이것은 하프 항체들의 쌍들 사이의 비-공유 결합에 기인한 것으로 사료된다. 그러나, 이 방법은 다른 생성물-관련된 변이체에 대하여 순도를 평가가능하게 하며, 그와 같은 복합체는 이상 화학양론, 단편, 글리코실화된 형태, 및 응집물을 갖는다.
SE-HPLC 데이터는 에탄올의 볼러스 부가의 부재 (도 6A, 6C, 및 6E) 또는 존재 (도 6B, 6D, 및 6F) 하에 생산된 Ab-A 샘플에 대해 보여준다. 2개의 완전 항체의 응집물 (4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 함유함)로 이루어진 생성물-관련된 변이체가 검출되었고 (화살표), 그것의 존재비는 볼러스 부가와 함께 제조된 샘플에서 평균하여 감소했다. 도 7은 주 피크에 포함된 항체 제제 (완전 항체를 함유함)의 백분율을 측정함으로써 Ab-A 순도의 정량화를 보여준다. 에탄올의 볼러스 부가는 80.3%에서 최대 90.6%까지 주 피크에 포함된 평균 백분율을 증가시켰다.
유사한 분석을 실시예 2에 기재된 바와 같이 Ab-B 및 Ab-C 항체 제제에 대해 수행하고, 각각 도 8 및 9에 기재된 바와 같이 정량화했다. Ab-B 항체의 전체 순도가 개선되었고, 주 피크 중의 평균 분획이 T67에서는 76%에서 79%로 증가하고, T87에서는 60%에서 73%로 증가했다. Ab-C 항체의 경우, 이 방법에 의해 평가된 항체 순도에서 검출가능한 차이가 거의 존재하지 않았으며, 이것은 심지어 볼러스 부가 없이도 Ab-C 항체의 높은 초기 순도로 인한 것이 분명하다.
요약하면, 이들 결과는 배양물로의 에탄올의 볼러스 부가가 하프-항체 종 이외에 다른 생성물-관련된 변이체의 농도를 감소시킬 수 있음을 실증한다.
실시예 4
이 실시예는 추가로 하프 항체 종이 단지 하나의 항체 중쇄 및 단지 하나의 항체 경쇄를 함유함으로써 75 kDa 생성물 관련된 변이체의 동일성의 확증을 기재한다. 이 가설은 몇 개의 관찰을 기반으로 하였다. 우선, 75 kDa 밴드가 단백질 A 정제된 샘플 (실시예 1 참고)에 존재했으며, 이것은 상기 밴드가 적어도 항체 중쇄의 단백질 A 결합 부분를 함유함을 지시한다. 둘째로, 75 kDa 밴드는 SDS-PAGE에 의해 분석되는 경우 비-환원된 샘플에 두드러졌으나 (예를 들면, 도 1A, 레인 2-3 참고), 환원 조건 하에서 동일한 샘플은 (기대된 경쇄 및 중쇄 이외에) 어떠한 비교할만한 세기의 밴드도 함유하지 않았고, 이것은 75 kDa 밴드가 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 동일한 전기영동 이동도를 갖는 다른 종) 이외에 어떠한 성분도 포함하지 않음을 지시한다. 세 번째로, 환원된 샘플에서 75 kDa 밴드의 소멸은 또한 그것의 구성요소가 적어도 하나의 디설파이드 결합에 의해 연결됨을 지시한다. 넷째로, SEC 분석은 75 kDa 종의 완전 항체와의 공-용출을 실증했으며, 이것은 75 kDa 종이 비-공유 자가-관련되어 완전 항체 (또는 동일한 겉보기 유체역학적 반경을 갖는 또 하나의 복합체)를 형성할 수 있음을 강력하게 시시한다. 마지막으로, (전기영동 표준물을 참조하여 결정된) 약 75 kDa의 겉보기 분자량은, 이 복합체가 전체길이 항체 사슬로만 이루어졌다는 (변성 겔로부터의) 관찰과 함께, 단지 하나의 중쇄 및 단지 하나의 경쇄를 함유하는 복합체와 일치하지만, 다른 복합체와 불일치하였다.
방법
상이한 샘플에서 질량 분광분석법을 사용하여 중쇄간 디설파이드 결합 (정상적으로 아미노산 220 및 223에서 발견됨)이 결핍된 중쇄의 상대 존재비를 검출하였다. 250 마이크로그램의 각 샘플을 에펜도르프 튜브에 부가했다. 적절한 양 (~450 μL)의 변성 완충액 (6 M 구아니딘-HCl, 1 mM EDTA, 0.25 M Tris, pH 7.5)을 튜브에 부가하여 500 μL의 최종 용적 및 0.5 mg/mL의 샘플 농도를 얻었다. 12.5 마이크로리터의 2 M 아이오도아세트아마이드를 각 샘플에 부가하여 임의의 유리 시스테인을 알킬화시켰다. 샘플을 와동시킨 후 실온에서, 암흑에서 30 ± 5 분 동안 배양하였다. 그 다음, 샘플을 소화 완충액 (0.1 M 트리스-HCl, pH 7.5)으로 미리-평형화시킨 NAP-5 칼럼을 사용하여 탈염시켰다. 각 샘플 용액은 분리를 위해 (미리-평형화시킨) 칼럼에 부가되고 칼럼 베드에 진입하게 했다. 1 밀리리터의 소화 완충액을 각 칼럼에 부가하고 용출물을 에펜도르프 튜브에 수집했다. 샘플을 대략 50 μg의 물질을 함유하는 동일한 분취량으로 분할했다 (5개의 200 μL 분취량). 알킬화되고 탈염된 분취량을 필요할 때까지 -20 ℃에서 보관했다. (알킬화되고 탈염된) 각 샘플의 1개의 분취량을 각각의 소화에 사용했다. 0.5 mg/mL의 트립신 용액을 트립신:단백질의 1:25 w:w 비로 각 샘플 분취량에 부가했다 (4 μL). 모든 트립신 튜브를 4 시간 동안 37 ± 2 ℃에서 배양했다. 인큐베이션 후, 각 튜브에 1 μL의 트리플루오로아세트산을 부가하여 효소 소화를 켄칭시켰다. 그 다음, 감소되고 비-환원된 샘플을 2개의 동일한 분획으로 분할했다. 샘플의 절반은 37 ± 2 ℃에서 1 시간 동안 1 M DTT의 존재 하에서 감소되었다. 감소되고 감소되지 않은 샘플 둘 모두의 내용물을 HPLC 바이알로 옮기고 분석용 자동시료주입기에 놓았다.
MS 및 MS/MS 데이타를 양이온 모드에서 전기분무 이온화 (ESI)를 사용하여 Micromass Q-TOF Ultima 질량 분광분석기 상에서 수집했다. 데이타를 MS 모드에서 m/z 200-1950으로부터 획득했다. 분석 전에, 질량 분광분석기는, m/z 175 내지 1285 범위를 포괄하는 [Glu¹]-피브리노펩타이드의 조각 이온 (fragment ion) 상의 5차 피트 (5th order fit)를 사용하여 보정되었다. 대략 20 pmole 단백질의 온-칼럼 (on-column) 부하량을 달성하기 위해 주사 용적을 조정했다.
결과
상기 논의된 관찰을 기반으로, 출원인은 75 kDa 밴드가 서로 디설파이드 결합을 통해 공유 연결된 하나의 항체 중쇄 및 하나의 항체 경쇄를 함유하는 "하프 항체" 종이었으며, 하프 항체 복합체의 쌍이 완전 항체 (2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)와 동일한 화학양론을 갖는 복합체를 형성하도록 비-공유 결합될 수 있지만, 2개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합이 결핍되었음 ("연결되지 않은 중쇄")을 가정했다. 이를 기반으로, 75 kDa 밴드의 상대 존재비가 연결되지 않은 중쇄의 상대적인 비율과 관련될 것임이 예측되었으며, 이것은 트립신 소화된 항체 샘플의 질량 분광분석법 분석을 사용하여 결정되었다.
이 연구에서 흥미로운 펩타이드 단편은 각각 아미노산 217-242로 구성된 중쇄의 T17 트립신 단편 (T17H)이었다. 아미노산 220 및 223은 항체 중쇄 사이의 디설파이드 결합을 초래한다. 전형적으로, 유리 시스테인 분석은 트립신 소화 후 감소된 샘플에서 알킬화된 시스테인 잔기 대 비-알킬화된 잔기의 비를 결정함으로써 수행될 수 있다. 그러나, 알킬화된 종은 양쪽 로트의 물질에 존재하지 않았다. 흥미로운 펩타이드 단편, T17H의 2개의 시스테인 잔기가 서로 결합하거나 시스테인은 항체의 4차 구조에 의해 보호된다고 가정되었다. 어느 경우에나, 시스테인 잔기는 알킬화에 영향을 받기 쉽지 않을 것이다. 대신에, 분석 접근법은 퍼센트 차이를 계산하기 위해 양쪽 로트에서 비-환원된 종 대 감소된 종의 비를 활용하는 것이었다. 비-환원된 샘플이 2 Da 분자량 감소를 나타냄을 관찰했고, 이것은 디설파이드 결합을 지시한다. 이 거동은 유리 T17H 퍼센트를 계산하기 위해 활용되었다. 비-환원된 T17H 종의 이론적 질량은 2727.41 Da (Cys220 & Cys223 사이의 디설파이드 결합)이고, 감소된 펩타이드의 경우 2729.41 Da이다
감소된 및 비-환원된 샘플의 추출된 이온 크로마토그램을 대표적인 전하 상태에 대해 분석했다. 비-환원된 샘플 대 감소된 샘플 사이의 카운트 비는 유리 T17H 종이 에탄올의 볼러스 부가와 함께 생산된 항체에서 2.3%이며, 에탄올의 볼러스 부가 없이 생산된 샘플에서 26.1%인 것으로 추산된다. 이들 결과는 도 9에 표 형태로 제공된다.
따라서, 중쇄간 디설파이드 결합이 결핍된 중쇄의 존재비는 에탄올의 볼러스 부가 없이 생산된 샘플에서 크게 증가되었으며, 이것은 추가로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 함유하지만 중쇄간 디설파이드 결합이 결핍됨으로써 이 종의 동일성을 확증한다. 게다가, 기대된 질량보다 2 Da 더 가벼운 종의 검출은, H1L1 종의 중쇄가 정상적인 중쇄간 디설파이드 결합의 형성을 방해할 수 있는 그 자체로 가외의 디설파이드 결합을 함유할 수 있음을 지시했다.
실시예 5
이 실시예는 세포 생존력 및 항체 순도 사이의 상관관계를 실증한다. 에탄올 볼러스의 부가는 일반적으로 Ab-A 및 Ab-B 항체에 대한 세포 생존력 및 항체 순도를 개선시켰다. 게다가, 심지어 볼러스 부가 없이도 이미 고순도를 나타냈던 Ab-C 항체도 또한 더 높은 배양 생존력을 나타냈다. 종합하여, 이들 결과는, 에탄올의 볼러스 부가로부터 초래된 항체 순도의 개선이 적어도 부분적으로 증가된 배양 생존력에 기인한 것이라고 시사한다.
방법
Cellometer (Nexcelom)를 사용하여 배양 생존력을 결정했다. 배양 샘플을 PBS로 희석하여 최종 세포수가 1 x 10⁷ 내지 5 x 10⁷ 세포/mL가 되도록 하였다. 그 다음, 샘플의 절반을 프로피디움 아이오다이드 (PI) 염색에 대한 양성 대조군으로서 10분 동안 75℃의 가열 조건으로 처리했다. 그 다음, 미처리된 샘플 및 처리된 샘플을 PI (20 uL의 샘플 + 20 uL의 PI)와 혼합했다. 그 다음, 샘플을 슬라이드 카세트에 놓고, 생존력을 비-형광 세포의 수를 계수한 후 세포의 총계로 나누어 결정했다. 사망한 세포는 프로피디움 아이오다이드를 흡수하고 형광을 발하여 양성 대조군 열 사멸 샘플은 1% 미만의 세포 생존을 보여주어야 한다.
결과
세포 생존력을, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 에탄올의 볼러스 부가의 존재 또는 부재 하에서 성장된 항체-생산 배양물에 대해 결정했다. 상기에서 기재된 바와 같이, Ab-A 및 Ab-B 항체의 순도는 효모 배양물에 에탄올의 볼러스 부가에 의해 크게 개선되었다 (실시예 1-2 및 도 1-4 참고). 에탄올 볼러스의 부가는 이들 배양물에 대해 마찬가지로 세포 생존력을 개선시켰다. Ab-A 항체의 경우, 생존력은 평균하여 91.9%에서 97.2%로 개선되었으며 (도 11), 한편 Ab-B 항체의 경우, 생존력은 평균하여 84.8%에서 95.1%로 개선되었다 (도 12). Ab-C 항체는 심지어 에탄올의 볼러스 부가 없이도 이미 고순도로 생산되었기 때문에, 에탄올의 볼러스 부가로부터 초래된 이 항체의 순도 개선은 더 완만했다(실시예 3 및 도 5 참고). 높은 세포 생존력이 더 높은 항체 순도와 관련된다는 관찰과 일치하게, Ab-C 항체 배양물은 에탄올의 볼러스 부가의 부재 하에 높은 세포 생존력 (평균하여 95.8%%)을 나타냈으며, 이것은 에탄올의 볼러스 부가에 의해 거의 변하지 않았다 (96.8%).
종합하여, 이들 결과는 에탄올의 볼러스 부가로부터 초래된 항체 순도의 개선이 세포 생존력의 개선에 의해 부분적으로 야기될 수 있음 (또는 적어도 이와 관련될 수 있음)을 지시한다.
실시예 6
이 실시예는 항체 순도의 유사한 개선이 에탄올 볼러스 농도를 가변시킴으로써 달성될 수 있음을 실증한다.
방법
Ab-A 항체를 실시예 1에서와 같이 생산하되, 단, 상기 에탄올의 볼러스 부가는 5 g/L (0.5% w/v), 10 g/L (1% w/v), 또는 15 g/L (1.5% w/v)였다. 항체 샘플을 63 및 86 시간에 배양 배지로부터 정제하고, 단백질 A 친화도에 의해 정제하고, 그 다음 순도를 실시예 1에서와 같이 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다.
결과
항체 순도는 부가된 볼러스 농도 (0.5% 내지 1.5% w/v)와 무관하게 시험된 시점, 63 시간 (도 14A) 및 86 시간 (도 14B) 둘 모두에서 유사하게 높았다. H1L1 및 H2L1 종의 검출된 수준은 각 배양물에서 유사하게 낮았다.
이들 결과는 항체 순도의 개선이 에탄올 볼러스 농도를 가변시키면서 달성될 수 있음을 지시한다.
실시예 7
이 실시예는, 항체 순도의 유사한 개선이 용해된 산소 스파이크 및 배양물에 에탄올의 볼러스 부가 사이의 "기아 기간"의 지속시간을 가변시키면서 달성될 수 있음을 실증한다.
방법
Ab-A 항체는 실시예 1에서와 같이 생산되되, 단, 용해된 산소 스파이크 (배양물에서 탄소 공급원의 고갈을 나타냄) 및 에탄올의 볼러스 부가 사이의 시간인, 상기 기아 기간의 지속시간이 0 시간 또는 3 시간이었다. 항체 샘플을 배양 배지로부터 정제하고, 단백질 A 친화도에 의해 정제하고, 그 다음 순도를 실시예 1에서와 같이 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다.
결과
항체 순도는 0 내지 3 시간의 기아 기간의 변화와 무관하게 유사하게 높았다 (도 15A, 레인 5 (0 시간 기아) 및 레인 6 (3 시간 기아)을 비교한다). H1L1 및 H2L1 종의 검출된 수준은 각 배양물에서 유사하게 낮았다.
이들 결과는 항체 순도의 개선이 기아 기간의 지속시간을 가변시키면서 달성될 수 있음을 지시한다.
실시예 8
이 실시예는 에탄올의 볼러스 부가 및 배양물에 공급 부가 개시 사이의 "평형 기간"의 지속시간을 가변시킴으로써 항체 순도에 대한 효과를 시험한다.
방법
Ab-B 항체는 실시예 2에서와 같이 생산되되, 단, 에탄올의 볼러스 부가 및 배양물의 공급 개시 사이의 시간인, 상기 평형 기간의 지속시간은 0, 30, 또는 60 분이었다. 추가로, Ab-B 항체가 생산되는 효모 균주는 4개의 경쇄 유전자 복제물 대신에 3개의 경쇄 유전자 복제물을 함유했다. 항체 샘플을 배양 배지로부터 정제하고, 단백질 A 친화도에 의해 정제하고, 그 다음 순도를 실시예 1에서와 같이 비-환원된 SDS-PAGE로 분석했다. 생존력을 또한 실시예 5에 기재된 방법을 사용하여 평가했다.
결과
항체 순도는 0 또는 30 분의 평형 기간 동안 유사하게 높았다 (도 16A, 레인 7 및 8 (0 분 평형 시간) 및 레인 3 (30 분 평형 시간). 그러나, H1L1 및 H2L1 종의 검출된 수준은 배양물에서 60 분 평형 기간과 함께 증가했다 (도 16A, 레인 5 및 6).
생존력을 또한 각 배양물에 대해 23 시간 및 85 시간 시점에 평가했다. 60 분 평형 기간의 경우, 생존력은 23 시간에 75% 내지 80%였고, 한편 동시에 시점 생존력은 0 및 30 분 평형 기간의 경우 대략 88-90%이었다 (도 16B). 차후에, 85 시간에서, 생존력은 개선되었지만, 0 및 30 분 평형 기간에 비해 60 분 평형 기간 동안 어느 정도 감소되었다 (도 16C).
이들 결과는, 항체 순도의 개선이 적어도 0 및 30 분 사이의 평형 기간을 가변시키면서 달성될 수 있으며, 한편 (순도가 에탄올의 볼러스 부가 없이도 대조 배양물에 비해 여전히 개선될 수 있더라도) 60 분 또는 더 긴 시간의 평형 기간 동안 생존력 및 순도의 일부 손실이 일어날 수 있음을 지시한다.
본 발명의 다양한 예증된 구현예의 상기 설명은 총망라된 것으로 의도되지 않거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 특정 구현예 및 본 발명에 대한 예시가 본원에 설명 목적으로 기재되더라도, 관련 분야의 숙련가가 인지할 수 있다면, 다양한 동등한 변형이 본 발명의 범위 내에서 가능하다. 본원에 제공된 본 발명의 교시는 상기 기재된 예시 이외의 다른 목적에 적용될 수 있다.
본 발명은 특히 이전의 설명 및 예시에 기재된 것들과 다른 방식으로 실시될 수 있다. 본 발명의 수많은 변형 및 변화가 상기 교시에 비추어 가능하며, 따라서, 부가된 청구항들의 범위 내에 있다.
이들 및 다른 변화는 상기 상세한 설명에 비추어 본 발명에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항들에서, 사용된 용어들은 명세서 및 청구항들에 개시된 특정 구현예에 본 발명을 제한하려고 해석되지 않아야 한다. 따라서, 본 발명은 개시내용에 의해 제한되지 않지만, 대신, 본 발명의 범위는 하기 청구항들에 의해 전적으로 결정되어야 한다.
항원-특이적 B 세포의 크론 개체군을 얻기 위한 방법과 관련된 특정 교시는 2006년 5월 19일에 제출된 미국 가특허출원 번호 60/801,412에 개시되었으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.
토끼-유래 모노클로날 항체의 인간화 및 항원 결합 친화도를 유지하기 위한 바람직한 서열 변형과 관련된 특정 교시는 2008년 5월 21일에 제출된 국제 공보 번호 WO/2008/144757, 명칭 "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies"에 상응하는 국제 출원 번호 PCT/US2008/064421에 개시되었으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.
적격 효모의 메이팅 및 상응하는 방법을 사용하여 항체 또는 그의 단편을 생산하는 것과 관련된 특정 교시는 2006년 5월 8일에 제출된 미국 특허 출원 번호 11/429,053 (미국 특허 출원 공보 번호 US2006/0270045)에 개시되었으며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.
배경, 요약, 상세한 설명, 및 실시예에 인용된 각 문서를 포함하는 본원에 인용된 각 문서 (특허, 특허 출원, 학술지 논문, 개요, 매뉴얼, 서적, 또는 다른 개시내용 포함)의 전체 개시내용은 인용에 의해 그 전체가 본원에 참조로 포함되어 있다.

<110> Patti McNeill Leon F. Garcia-Martinez Nicole Janson Gary Lesnicki Pei Qi John Latham <120> HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS <130> 67858.711002 <150> 61/525,307 <151> 2011-08-19 <150> 61/496,860 <151> 2011-06-14 <150> 61/496,873 <151> 2011-06-14 <150> 61/418,832 <151> 2010-12-01 <160> 441 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 1 Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Asp Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Asp Asp Val Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Phe Asp Ser Asp Ser 85 90 95 Thr Glu Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Arg 100 105 110 <210> 2 <211> 217 <212> PRT <213> Synthetic 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ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 654 <210> 203 <211> 354 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 203 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggcttctc cctcagtagc tatgcaatga gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat cggagtcatt actagtattg gtagcacagt ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaaa acctcgacca cggtggatct gaaaatcacc 240 agtccgacaa ccgaggacac ggccacctat ttctgtgcca gaggctacga tgactatgat 300 gagatgacct actttaacat ctggggccag gggaccctcg tcaccgtctc gagc 354 <210> 204 <211> 1347 <212> DNA <213> Synthetic <400> 204 cagtcgctgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggcttctc cctcagtagc tatgcaatga gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatggat 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gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320 agcctctccc tgtctccggg taaatga 1347 <210> 205 <211> 33 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 205 caggccagtc agaacattta cagcaattta gcc 33 <210> 206 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 206 ggtgcatcca atctggatgc t 21 <210> 207 <211> 36 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 207 caaagtgctt ttgatagtga tagtactgaa aatact 36 <210> 208 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 208 agctatgcaa tgagc 15 <210> 209 <211> 48 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 209 gtcattacta gtattggtag cacagtctac gcgagctggg cgaaaggc 48 <210> 210 <211> 39 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 210 ggctacgatg actatgatga gatgacctac tttaacatc 39 <210> 211 <211> 333 <212> DNA <213> Synthetic <400> 211 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggccagtca gaacatttac agcaacttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatccaatc tggatgctgg agtcccatca 180 aggttctctg gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ctgccaaagt gcttttgata gtgatagtac tgaaaacact 300 ttcggcggag gaaccaaggt ggaaatcaaa cgt 333 <210> 212 <211> 654 <212> DNA <213> Synthetic <400> 212 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggccagtca gaacatttac agcaacttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaagctcct gatctatggt gcatccaatc tggatgctgg agtcccatca 180 aggttctctg gcagtggatc tgggacagag tacactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttacta ctgccaaagt gcttttgata gtgatagtac tgaaaacact 300 ttcggcggag gaaccaaggt ggaaatcaaa cgtacggtag cggccccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat 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cuniculus <400> 395 cagtccagtc agaatgttta taagaacaac tacttatcc 39 <210> 396 <211> 21 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 396 aaggcatcca ctctggcatc t 21 <210> 397 <211> 33 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 397 gcaggcggtt ataccagtag tagtgataat gct 33 <210> 398 <211> 15 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <400> 398 acctactgga tgagc 15 <210> 399 <211> 51 <212> DNA <213> Synthetic <400> 399 gacatttact ttagtaatga agaaacaaac tacgcgacca gcgcgaaagg c 51 <210> 400 <211> 33 <212> DNA <213> Synthetic <400> 400 ggttctcctg atgttgagat tgctatagat atg 33 <210> 401 <211> 217 <212> PRT <213> Synthetic <400> 401 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe 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ctttaacatc tggggcccag ggaccctcgt caccgtctcg 360 agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacgc gagagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcactag 687 <210> 411 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 411 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 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Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 414 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 414 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 415 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 415 Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 <210> 416 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 416 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala <210> 417 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 417 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg 35 <210> 418 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 418 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val 20 <210> 419 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 419 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Ser Leu Glu Lys Arg 20 25 <210> 420 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 420 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Ala 35 40 <210> 421 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 421 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 422 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 422 Met Thr Lys Pro Thr Gln Val Leu Val Arg Ser Val Ser Ile Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ile Thr Leu Leu His Leu Val Val Ala Leu Asn Asp Val Ala Gly 20 25 30 Pro Ala Glu Thr Ala Pro Val Ser Leu Leu Pro Arg 35 40 <210> 423 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 423 Met Phe Ser Pro Ile Leu Ser Leu Glu Ile Ile Leu Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15 Leu Gln Ser Val Phe Ala 20 <210> 424 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 424 Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Pro His Tyr Ile Arg 20 <210> 425 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 425 Met Ile Phe Leu Lys Leu Ile Lys Ser Ile Val Ile Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Val Ser Ala Ile Gln Ala 20 <210> 426 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 426 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 427 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 427 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 428 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 428 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala 20 <210> 429 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 429 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro 20 <210> 430 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 430 Met Ala Ala Asp Ser Gln Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Trp Pro Gln Glu Pro Gly Ala 20 25 <210> 431 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 431 Met Lys Lys Asn Arg Met Met Met Met Ile Trp Ser Val Gly Val Val 1 5 10 15 Trp Met Leu Leu Leu Val Gly Gly Ser Tyr Gly 20 25 <210> 432 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 432 Met Gln Lys Leu Ile Ile Phe Ala Leu Val Val Leu Cys Val Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ala <210> 433 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 433 Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val 1 5 10 15 Gln Gly <210> 434 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 434 Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Met Ile Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ser 20 <210> 435 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 435 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly <210> 436 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 436 Met Leu Ser Leu Lys Pro Ser Trp Leu Thr Leu Ala Ala Leu Met Tyr 1 5 10 15 Ala Met Leu Leu Val Val Val Pro Phe Ala Lys Pro Val Arg Ala 20 25 30 <210> 437 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion peptide <400> 437 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Lys Cys 20 <210> 438 <211> 651 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody <400> 438 gctatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggccagtca gagcattaac aatgagttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag ggttatagtc tgaggaacat tgataatgct 300 ttcggcggag ggaccaaggt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651 <210> 439 <211> 1350 <212> DNA <213> Oryctolagus cuniculus <220> <223> Humanized antibody <400> 439 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt ctccctcagt aactactacg tgacctgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggcatc atctatggta gtgatgaaac cgcctacgct 180 acctccgcta taggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac cctgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt actgtgctag agatgatagt 300 agtgactggg atgcaaagtt caacttgtgg ggccaaggga ccctcgtcac cgtctcgagc 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 440 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody <400> 440 caagtgctga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 60 aattgccagg ccagtcagag tgtttatcat aacacctacc tggcctggta tcagcagaaa 120 ccagggaaag ttcctaagca actgatctat gatgcatcca ctctggcatc tggggtccca 180 tctcgtttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 240 cctgaagatg ttgcaactta ttactgtctg ggcagttatg attgtactaa tggtgattgt 300 tttgttttcg gcggaggaac caaggtggaa atcaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 441 <211> 1326 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody <400> 441 gaggtgcagc ttgtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag tctctggaat cgacctcagt ggctactaca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtcggagtc attggtatta atggtgccac atactacgcg 180 agctgggcga aaggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaccac ggtgtatctt 240 caaatgaaca gcctgagagc tgaggacact gctgtgtatt tctgtgctag aggggacatc 300 tggggccaag ggaccctcgt caccgtctcg agcgcctcca ccaagggccc atcggtcttc 360 cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 420 aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 480 gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 540 accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 600 agcaacacca aggtggacgc gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc 660 ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac gccagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaatga 1326

Claims (105)

1. (a) 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현을 제공하는 유전자들을 포함하는 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) 세포를 포함하는 배양물을 제공하는 단계;
   (b) 상기 배양물에 에탄올을 단일 볼러스 부가로 부가하여, 상기 배양물 중의 에탄올의 농도가 0.5% 내지 1.5%가 되는 단계; 및
   (c) 상기 배양물에 하나 이상의 발효성 탄소 공급원을 포함하는 공급물을 부가하고, 상기 배양물을 배양하여 상기 항체를 생산하는 단계
   를 포함하며, 단 상기 항체의 발현을 제공하는 유전자들은 알코올-유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있지 않은 것인, 전체 길이(full-length) 항체의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서,
   (i) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 하나 이상의 생성물-연관된 변이체의 상대 존재비(relative abundance)를 감소시키고;
   (ii) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의해 검출된 상기 항체보다 더 높거나 낮은 겉보기 분자량을 갖는 생성물-연관된 변이체의 상대 존재비를 감소시키고;
   (iii) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 이상(異常) 화학양론을 갖는 항체의 상대 존재비를 감소시키고;
   (iv) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 이상(異常) 디설파이드 결합을 갖는 항체의 상대 존재비를 감소시키고;
   (v) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 감소된 시스테인을 갖는 항체의 상대 존재비를 감소시키고;
   (vi) 상기 방법은 에탄올 볼러스의 부재하에 행해지는 동일한 방법에 비해 이상(異常) 글리코실화를 갖는 항체의 상대 존재비를 감소시키고;
   (vii) 상기 방법은 인터-중쇄 디설파이드 결합의 형성 또는 안정성을 조절하고;
   (viii) 상기 방법에 의해 생성되는 생성물-연관된 변이체는 H1L1(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 갖는 항체), H2L1(2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 갖는 항체), 및 H4L4(4개의 중쇄 및 4개의 경쇄를 갖는 항체) 생성물-연관된 변이체 중 하나 이상을 포함하는 것
   중 하나 이상을 포함하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법은 단계 (c) 동안에 배양물 중의 에탄올의 농도를 상부 설정값 내지 하부 설정값에서 유지하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 하부 설정값은 0.5% (w/v)이고 상부 설정값은 1.5% (w/v)인 방법.
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 피치아 패스토리스 세포가 상기 항체의 발현을 제공하는 그의 게놈에 통합된 유전자를 포함하고, 여기서 상기 유전자는 하나 이상의 게놈 유전자자리에 통합된 것인 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (i) 상기 피치아 패스토리스 세포로부터 또는 상기 세포를 함유하는 배양 배지로부터 상기 항체를 정제하는 것;
   (ii) 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 중 하나 이상은 하나 초과의 유전자 복제물로부터 발현되는 것; 및
   (iii) 상기 항체는 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 복제물 및 상기 항체의 중쇄를 인코딩하는 유전자의 1 내지 10 복제물로부터 발현되고, 이들은 상기 세포의 게놈에 통합될 수 있는 것
   중 적어도 하나를 추가로 포함하는 방법.
7. 삭제
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체는 아래 중 어느 것도 함유하지 않는 것인 방법:
   (i) 서열번호: 5, 6, 및 7의 가변 경쇄(V_L) 상보성 결정 영역1(CDR1), CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 8, 9, 및 10의 가변 중쇄(V_H) CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (ii) 서열번호: 15, 16, 및 17의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 18, 19, 및 20의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (iii) 서열번호: 25, 26, 및 27의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 28, 29, 및 30의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (iv) 서열번호: 35, 36, 및 37의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 38, 39, 및 40의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (v) 서열번호: 45, 46, 및 47의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 48, 49, 및 50의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (vi) 서열번호: 55, 56, 및 57의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 58, 59, 및 60의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (vii) 서열번호: 65, 66, 및 67의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 68, 69, 및 70의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (viii) 서열번호: 75, 76, 및 77의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 78, 79, 및 80의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (ix) 서열번호: 85, 86, 및 87의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 88, 89, 및 90의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (x) 서열번호: 95, 96, 및 97의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 98, 99, 및 100의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xi) 서열번호: 105, 106, 및 107의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 108, 109, 및 110의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xii) 서열번호: 115, 116, 및 117의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 118, 119, 및 120의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xiii) 서열번호: 125, 126, 및 127의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 128, 129, 및 130의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xiv) 서열번호: 135, 136, 및 137의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 138, 139, 및 140의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xv) 서열번호: 145, 146, 및 147의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 148, 149, 및 150의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xvi) 서열번호: 155, 156, 및 157의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 158, 159, 및 160의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xvii) 서열번호: 165, 166, 및 167의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 168, 169, 및 170의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xviii) 서열번호: 175, 176, 및 177의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 178, 179, 및 180의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xix) 서열번호: 185, 186, 및 187의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 188, 189, 및 190의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체;
   (xx) 서열번호: 195, 196, 및 197의 V_L CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드 및 서열번호: 198, 199, 및 200의 V_H CDR1, CDR2, 및 CDR3 폴리펩티드를 포함하는 항-인간 NGF 항체; 및
   (xxi) 상기 항-인간 NGF 항체들의 F(ab')₂ 또는 Fab' 단편.
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