ES2899381T3 - Producción de alta pureza de proteínas de múltiples subunidades, tales como anticuerpos en microbios transformados, tal como Pichia pastoris - Google Patents

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Abstract

Un método para producir un complejo de múltiples subunidades, que comprende: (a) proporcionar un cultivo que comprende células de Pichia pastoris que comprenden genes que proporcionan la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades; (b) añadir un bolo de etanol a dicho cultivo, lo que da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre el 0,5 % y el 1,5 % (en p/v); y (c) agregar una alimentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable a dicho cultivo, y cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades, en el que dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo completo o de longitud completa que comprende polipéptidos de cadena pesada y ligera, en el que dicho complejo de múltiples subunidades no es un anticuerpo anti-NGF que contiene las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO:401 y SEQ ID NO:402.

Description

DESCRIPCIÓN
Producción de alta pureza de proteínas de múltiples subunidades, tales como anticuerpos en microbios transformados, tal como Pichia pastoris
Campo
La presente descripción se refiere en general a métodos para producir proteínas heterólogas en células transformadas. En particular, la presente descripción proporciona métodos mejorados para producir proteínas de múltiples subunidades, que incluyen anticuerpos y otras proteínas de múltiples subunidades, que pueden o no secretarse, con una menor producción de productos secundarios no deseados y/o un mayor rendimiento. En realizaciones ejemplares, las células transformadas son una levadura, tal como Pichia pastoris o Saccharomyces cerevisiae.
Antecedentes
Los anticuerpos convencionales son proteínas tetraméricas compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos humanos puros de un tipo específico pueden ser difíciles o imposibles de purificar a partir de fuentes naturales en cantidades suficientes para muchos propósitos. Como consecuencia, las empresas farmacéuticas y de biotecnología han recurrido a métodos basados en ADN recombinante para preparar anticuerpos a gran escala. La producción de anticuerpos funcionales generalmente implica no solo la síntesis de los dos polipéptidos, sino también una serie de acontecimientos postraduccionales, incluido el procesamiento proteolítico de la secuencia señal de secreción N-terminal; el plegado y el ensamblaje adecuados de los polipéptidos para formar tetrámeros; la formación de enlaces disulfuro; y típicamente incluye una glicosilación N-enlazada específica. Todos estos acontecimientos tienen lugar en la vía secretora de las células eucariotas, un complejo de orgánulos exclusivo de las células eucariotas.
La síntesis recombinante de tales proteínas complejas se ha basado típicamente en cultivos de células eucariotas superiores para producir material biológicamente activo, usándose muy comúnmente células de mamífero cultivadas. Sin embargo, los sistemas de producción basados en cultivos de tejidos de mamíferos incurren en importantes gastos y complicaciones añadidas en relación con los métodos de fermentación microbiana. Además, los productos derivados del cultivo de células de mamíferos pueden requerir pruebas de seguridad adicionales para garantizar la ausencia de patógenos de mamíferos (incluidos los virus) que podrían estar presentes en las células cultivadas o los productos derivados de animales utilizados en el cultivo, como el suero.
El trabajo previo ha ayudado a establecer la levadura Pichia pastoris como una plataforma rentable para producir anticuerpos funcionales que son potencialmente adecuados para un uso en la investigación, en el diagnóstico y un uso terapéutico. Ver las patentes de EE. UU. de propiedad de los solicitantes 7.935.340 y 7.927.863, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. También se conocen en la literatura métodos para el diseño y la optimización de fermentaciones de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes, incluida la optimización de la densidad celular, el volumen del caldo, la tasa de alimentación del sustrato y la duración de cada fase de la reacción. Ver Zhang etal., "Rational design and optimization of fed-batch and continuous fermentations" en Cregg, J. M., ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, pp. 43-63.
Aunque se pueden producir proteínas de múltiples subunidades recombinantes a partir de células cultivadas, también se pueden producir productos secundarios no deseados. Por ejemplo, las células cultivadas pueden producir la proteína de múltiples subunidades deseada junto con monómeros libres, complejos que tienen una estequiometría incorrecta o proteínas que tienen una glicosilación no deseada o aberrante. La purificación de la proteína de múltiples subunidades deseada puede aumentar el coste de producción y las etapas implicadas en la purificación pueden disminuir el rendimiento total de los complejos activos. Además, incluso después de la purificación, pueden estar presentes productos secundarios no deseados en cantidades que causan preocupación. Por ejemplo, los productos secundarios glicosilados pueden estar presentes en cantidades que aumentan el riesgo de una reacción inmunitaria después de la administración, mientras que los complejos o agregados aberrantes pueden disminuir la actividad específica y también pueden ser potencialmente inmunogénicos.
El documento WO 00/56903 A2 describe métodos mejorados para producir proteínas en Pichia transformada. El documento WO 02/48382 A2 describe un método para la producción de una proteína heteróloga por un hongo. Tapani et al. (ACTA Radiologica (Estocolmo, Suecia, 1987), noviembre de 1996, 37: 6, 923-926) describen la toxicidad del etanol en concentraciones bajas y la evaluación experimental en un cultivo celular. El documento WO 2008/063302 A2 describe nuevos promotores de P. pastoris pastoris, y el uso de los mismos para dirigir la expresión de proteínas en levaduras, preferiblemente usando una estrategia de apareamiento haploide. Muhlbauer et al. (Alcohol, vol. 24, n.° 3, 1 de julio de 2001, pp. 179-187) describen la producción alterada de inmunoglobulina M mediante la incubación de células de hibridoma con etanol. Baumann et al. (Biotechnology and Bioengineering, 100:1, 177-183, 1 de mayo de 2008) indican que el cultivo con alimentación discontinua hipóxica de Pichia pastoris aumenta la productividad específica y volumétrica de proteínas recombinantes. David et al. (The Journal of Biological Chemistry, 25 de junio de 1983, pp. 7702-7706) describen estudios sobre el efecto del etanol en la síntesis de proteínas eucariotas in vitro. Van de Laar et al. (Biotechnology and Bioengineering, 96:3, 483-494, 15 de febrero de 2007) describen una mayor producción de proteínas heterólogas por Saccharomyces cerevisiae que crece en etanol como única fuente de carbono.
Además, el documento WO 2012/075340 A2, que se puede citar en virtud del artículo 54(3) del CPE, divulga composiciones anti-NGF y su uso.
Sumario
La mayoría de las moléculas de anticuerpos IgG1 se estabilizan mediante un total de 16 puentes disulfuro intracatenarios e intercatenarios. Los puentes disulfuro intracatenarios estabilizan el plegamiento de los dominios de IgG en cadenas pesadas y ligeras, mientras que los puentes disulfuro intercatenarios estabilizan la asociación entre cadenas ligeras y pesadas. Como resultado de estos enlaces, los anticuerpos forman un complejo estable que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (H2L2). Sin embargo, debido a la formación inadecuada de enlaces disulfuro, a veces se encuentran variantes asociadas al producto en preparaciones de anticuerpos recombinantes, incluido un complejo que tiene una cadena ligera y una pesada (H1L1) y un complejo que tiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera (H2L1). Además, también se pueden formar complejos de orden superior en los que se forman enlaces disulfuro intercatenarios adicionales, lo que da como resultado un mayor número de subunidades unidas covalentemente.
Como se describe más a fondo a continuación, los solicitantes han identificado ahora métodos para disminuir la producción de estos complejos que contienen enlaces disulfuro aberrantes durante la producción recombinante de anticuerpos a partir de cultivos de levadura. Específicamente, el método implica la adición de un bolo de etanol al cultivo y esto da como resultado una disminución de la producción de las variantes asociadas con los productos H1L1, H2L1 y H4L4, y una mayor pureza del producto H2L2 deseado. Los complejos H1L1 y H2L1 se detectaron mediante SDS-PAGE desnaturalizante no reducida, y los complejos H4L4 se detectaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Usando los métodos de la presente, se facilitó la formación adecuada de enlaces disulfuro, lo que resultó en un aumento de la pureza del anticuerpo. Esto se demostró para tres anticuerpos diferentes, todos los cuales exhibieron una pureza mejorada cuando se produjeron con la adición del bolo de etanol (figuras 1-6). Estos tres anticuerpos no solo son diferentes en secuencia, sino que también reconocen tres antígenos diferentes. Además, cuando se produjeron en ausencia de un bolo de etanol, dos de los anticuerpos contenían cantidades mayores del producto H1L1 (figuras 1-4), en comparación con el tercer anticuerpo (figura 5). Los dos anticuerpos que contienen mayores cantidades del producto H1L1 tienen un puente disulfuro adicional o no canónico, mientras que el tercero no. El anticuerpo ejemplificado en las figuras 1, 2 y 3 tiene un puente disulfuro intracatenario adicional en el dominio de cadena ligera variable, mientras que el anticuerpo ejemplificado en la figura 4, tiene un puente disulfuro intracatenario adicional en su cadena pesada. Se ha informado en la literatura que la presencia de puentes disulfuro en proteínas sobreexpresadas aumenta el estrés intracelular en el huésped (ver Gasser et al., Biotechnology and Bioengineering, vol. 94, n.° 2, pp. 353-361, 5 de junio de 2006; Inan et al., Biotechnology and Bioengineering, vol. 93, n.° 4, pp. 771­ 778, 5 de marzo de 2006; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2010, 19 de noviembre, 402(3):519-524). Este aumento de estrés también puede conducir a una menor viabilidad, como se demuestra en las figuras 11, 12 y 13, en las que ambos anticuerpos con el puente disulfuro intracatenario adicional tienen menor viabilidad en las condiciones de "no bolo". La adición del bolo de etanol, por lo tanto, conduce a una mayor viabilidad y una mayor pureza. Esto puede ser útil en particular cuando se expresan proteínas difíciles de expresar con múltiples puentes disulfuro.
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un complejo de múltiples subunidades, que comprende (a) proporcionar un cultivo que comprende células de Pichia pastoris que comprenden genes que proporcionan la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades; (b) añadir un bolo de etanol a dicho cultivo, lo que da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre el 0,5 % y el 1,5 % (en p/v); y (c) agregar una alimentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable a dicho cultivo, y cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades, en el que dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo completo o de longitud completa que comprende polipéptidos de cadena pesada y ligera, en el que dicho complejo de múltiples subunidades no es un anticuerpo anti-NGF que contiene las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO:401 y SEQ iD NO:402.
El bolo de etanol puede potenciar la formación de enlaces disulfuro estables con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de una o más variantes asociadas al producto con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de variantes asociadas al producto que tienen un peso molecular aparente mayor o menor que dicho complejo de múltiples subunidades deseado, según se detecta mediante cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de complejos que tienen una estequiometría aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de complejos que tienen enlaces disulfuro aberrantes con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de complejos que tienen cisteínas reducidas con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de complejos que tienen una glicosilación aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede modular la formación o la estabilidad de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas.
El método puede modular la formación o la estabilidad de enlaces disulfuro que unen las cadenas ligera y pesada de dicho anticuerpo.
El método puede disminuir la abundancia relativa de una o más variantes asociadas al producto con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
Dichas variantes asociadas al producto pueden comprender una o más de las variantes asociadas al producto H1L1, H2L1 y H4L4.
El método aumenta la pureza de dicho anticuerpo con respecto a dicho método efectuado en ausencia de dicho bolo de etanol.
La etapa (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre el 0,7 % y el 1,5 %, o entre el 0,8 % y el 1,25 %.
La etapa (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que puede ser del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 % o 0,9 % (en p/v).
La etapa (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que puede ser del 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 % o 0,5 % (en p/v).
La etapa (b) puede comprender añadir etanol a dicho cultivo, añadir un vehículo que comprende etanol a dicho cultivo, añadir dichas células a un medio o vehículo que comprende etanol, o reemplazar parte del medio de cultivo.
Dicho bolo de etanol se puede añadir al medio de cultivo durante un período de tiempo entre 1 y 20 minutos.
La etapa (c) puede comprender suministrar oxígeno a dichas células.
Dicho suministro de oxígeno puede comprender agitar dicho cultivo.
Dicho suministro de oxígeno puede comprender poner en contacto dicho cultivo con una mezcla de gases que comprende oxígeno.
La etapa (c) puede comprender añadir una alimentación que comprende una fuente de carbono a dicho cultivo. Dicha alimentación puede comprender al menos una fuente de carbono fermentable.
Dicha alimentación puede comprender uno o más de glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, meli 0,5%, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, manosa, manitol y rafinosa.
El método puede comprender además mantener la concentración de etanol entre un punto fijado superior y un punto fijado inferior durante la etapa (c).
Dicho punto de ajuste inferior puede ser del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 % o 0,9 % (en p/v).
Dicho punto de ajuste superior puede ser del 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 % o 0,6 % (en p/v).
Dicho punto de ajuste superior puede ser como máximo 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 % o 1,1 % (en p/v).
El método puede comprender además mantener la concentración de etanol en un punto fijado durante la etapa (c). Dicho punto de ajuste puede ser del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 01,0 %, 01,1 %, 01,2 %, 01,3 %, 01,4 % o 01,5 % (en p/v).
La etapa (c) puede comprender mantener la concentración de etanol en dicho cultivo entre el 0,7 % y el 1,5 %, o entre el 0,8 % y el 1,25 %.
La concentración de etanol en dicho cultivo se puede mantener controlando la producción de etanol por dichas células o mediante la adición de etanol a dicho cultivo.
La etapa de controlar la producción de etanol puede comprender controlar uno o más de la concentración de glucosa, la disponibilidad de oxígeno, la intensidad de la agitación, la presión del gas, el caudal del aire suministrado u otra mezcla de gases, la viscosidad del cultivo, la densidad del cultivo, la concentración de oxígeno en el aire suministrado u otra mezcla de gases, y la temperatura.
El tiempo entre la etapa (a) y la etapa (b) puede ser menos de aproximadamente 72 horas, menos de aproximadamente 48 horas, menos de aproximadamente 24 horas, menos de aproximadamente 12 horas, menos de aproximadamente 9 horas, menos de aproximadamente 6 horas, menos de aproximadamente 5 horas, menos de aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente 3 horas, menos de aproximadamente 90 minutos, menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos o menos de aproximadamente 1 minuto.
El tiempo entre la etapa (b) y la etapa (c) puede ser menos de aproximadamente 10 horas, menos de aproximadamente 9 horas, menos de aproximadamente 8 horas, menos de aproximadamente 7 horas, menos de aproximadamente 6 horas, menos de aproximadamente 5 horas, menos de aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente 3 horas, menos de aproximadamente 2 horas, menos de aproximadamente 90 minutos, menos de aproximadamente 80 minutos, menos de aproximadamente 70 minutos, menos de aproximadamente 60 minutos, menos de aproximadamente 50 minutos, menos de aproximadamente 40 minutos, menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 10 minutos, menos de aproximadamente 5 minutos o menos de aproximadamente 1 minuto.
El cultivo de la etapa (a) puede producirse añadiendo una fuente de carbono a dicho cultivo y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono.
Dicha fuente de carbono puede comprender uno o más de: glicerol, glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, manosa, manitol y rafinosa.
El agotamiento de la fuente de carbono se puede determinar detectando una disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris.
Dicha disminución de la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris se puede identificar detectando una disminución en el consumo de oxígeno por dichas células de Pichia pastoris, detectando un aumento de pH en el cultivo, detectando la estabilización de la masa celular húmeda o detectando un aumento en la concentración de amoníaco en el cultivo.
Dicha disminución en el consumo de oxígeno por dichas células de Pichia pastoris puede identificarse detectando un aumento en la concentración de oxígeno disuelto en dicho cultivo.
Los genes que proporcionan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades pueden integrarse en uno o más loci genómicos.
Al menos uno de dichos loci genómicos puede seleccionarse del grupo que consiste en el locus pGAP, locus 3' AOX TT; PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG; y el locus HIS4 TT.
Al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades puede expresarse bajo el control de un promotor inducible o constitutivo.
Dicho promotor inducible puede seleccionarse del grupo que consiste en los promotores AOX1, CUP1, inducible por tetraciclina, inducible por tiamina y FLD1.
Al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades puede expresarse bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en: promotores CUP1, AOX1, ICL1, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), FLD1, ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5 y Pyk, promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por tiamina, promotores quiméricos derivados de ellos, promotores de levaduras, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores de plantas, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores aviarios.
Dicha célula de Pichia pastoris puede ser diploide, tetraploide o poliploide.
El método puede comprender además purificar dicho complejo de múltiples subunidades a partir de dichas células de Pichia pastoris o del medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede purificarse a partir de un componente intracelular, citoplasma, nucleoplasma o una membrana de dichas células de Pichia pastoris.
Dichas células de Pichia pastoris secretan dicho complejo de múltiples subunidades hacia el medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades se puede purificar a partir de dicho medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo monoespecífico o biespecífico.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Dicho anticuerpo humanizado puede ser de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca.
Dicho anticuerpo humanizado puede ser de origen de conejo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente. Dicho anticuerpo puede purificarse a partir de dicho cultivo por afinidad de proteína A y/o proteína G.
Al menos uno de los genes que proporcionan la expresión de una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades en al menos una de dichas células de Pichia pastoris de dicho panel puede optimizarse para la expresión en dicha célula eucariota.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo, y la pureza de dicho anticuerpo puede evaluarse midiendo la fracción del anticuerpo producido por dicha célula eucariota que puede estar contenida en complejos de anticuerpos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, puede estar contenida en complejos de anticuerpos que tienen el peso molecular esperado y/o se une específicamente a una diana de dicho anticuerpo. Dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo, y el rendimiento de dicho anticuerpo puede evaluarse determinando la cantidad de anticuerpo producido por dichas células de Pichia pastoris descontando cualquier variante asociada al producto que pueda estar anómalamente glicosilada, contenida en complejos de anticuerpos distintos de los complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, contenida en complejos de anticuerpos que tienen el peso molecular esperado y/o que no se une específicamente a la diana de dicha anticuerpo.
El peso molecular de dichos complejos de anticuerpos puede determinarse mediante SDS-PAGE no reductora. Dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo, y dicho método puede comprender además purificar dicho anticuerpo.
Dicha célula de cultivo puede producir un título de anticuerpos en el sobrenadante de al menos 100 mg/L, al menos 150 mg/L, al menos 200 mg/L, al menos 250 mg/L, al menos 300 mg/L, entre 100 y 300 mg./L, entre 100 y 500 mg/L, entre 100 y 1000 mg/L, al menos 1000 mg/L, al menos 1250 mg/litro, al menos 1500 mg/litro, al menos aproximadamente 1750 mg/litro, al menos aproximadamente 2000 mg/litro, al menos aproximadamente 10000 mg/litro o más.
Una o más subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades pueden expresarse a partir de más de una copia del gen.
Dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo que puede expresarse entre 1 y 10 copias de un gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo, y entre 1 y 10 copias de un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo.
Los genes que proporcionan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades pueden integrarse en el genoma de dichas células.
Los genes que proporcionan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades pueden estar contenidos en un elemento extracromosómico, plásmido o cromosoma artificial.
Dichas células pueden comprender más copias del gen que proporciona la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que proporciona la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo.
El número respectivo de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y el número de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células puede ser: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5, 4 y 3, 4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6, o 5 y 7.
El número respectivo de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y el número de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células puede ser: 2 y 1,3 y 1,4 y 1,5 y 1 , 6 y 1,7 y 1,8 y 1,9 y 1, 10 y 1, 1 y 2,2 y 2, 3 y 2, 4 y 2, 5 y 2, 6 y 2, 7 y 2, 8 y 2, 9 y 2, 10 y 2, 1 y 3, 2 y 3, 3 y 3, 4 y 3, 5 y 3,6 y 3, 7 y 3, 8 y 3,9 y 3, 10 y 3 , 1 y 4, 2 y 4, 3 y 4, 4 y 4, 5 y 4,6 y 4, 7 y 4, 8 y 4,9 y 4, 10 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 4 y 5, 5 y 5, 6 y 5, 7 y 5, 8 y 5, 9 y 5, 10 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6, 4 y 6, 5 y 6 ,6 y 6, 7 y 6, 8 y 6, 9 y 6, 10 y 6, 1 y 7, 2 y 7,3 y 7,4 y 7, 5 y 7, 6 y 7, 7 y 7, 8 y 7, 9 y 7, 10 y 7, 1 y 8, 2 y 8, 3 y 8, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 8 y 8, 9 y 8, 10 y 8 , 1 y 9, 2 y 9, 3 y 9, 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 9 y 9, 10 y 9, 1 y 10, 2 y 10, 3 y 10, 4 y 10, 5 y 10, 6 y 10, 7 y 10, 8 y 10, 9 y 10, 10 y 10.
El cultivo de la etapa (c) se puede cultivar en un medio de producción.
Dicho medio de producción puede ser un medio mínimo.
Dicho medio mínimo carece de agentes selectivos.
Dicho medio mínimo carece de aminoácidos preformados u otras biomoléculas complejas.
El medio de producción puede ser un medio complejo.
El medio complejo puede comprender uno o más de extracto de levadura, peptonas de soja y otras peptonas vegetales. El cultivo de la etapa (c) se puede hacer crecer hasta una alta densidad celular.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 50 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 100 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 300 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 400 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 500 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser de al menos 750 g/L.
Las células de Pichia pastoris pueden cultivarse durante al menos 20 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades después de dichas al menos 20 duplicaciones.
Las células de la etapa (c) pueden cultivarse durante al menos 50 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades después de dichas al menos 50 duplicaciones.
Las células de la etapa (c) pueden cultivarse durante al menos 100 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades después de dichas al menos 100 duplicaciones.
Al menos una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender una señal de secreción. Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo.
La señal de secreción puede comprender uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO:414 a 437 y cualquier combinación de las mismas.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede no ser ninguno de los anticuerpos descritos en el documento WO2012/075340 (documento PCT/US11/62963, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0148490 (n.° de serie de EE. UU. 13/309.295, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0141485 (n.° de serie de EE. UU. 13/309.153, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0164067 (n.° de serie de EE. UU. 13/308.665, presentado el 1 de diciembre de 2011), y documento US 2012/0141484 (n.° de serie de EE. UU.
13/308.831, presentado el 1 de diciembre de 2011).
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede ser Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF, o un fragmento Fab2 o Fab1 de los mismos . Dicho complejo de múltiples subunidades no puede contener al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, o al menos las seis regiones determinantes de la complementariedad (“complementarity determining regions”, CDR) contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF , Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF o Ab21-NGF y, opcionalmente, tener especificidad de unión a NGF.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender o consistir en las secuencias polipeptídicas de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO:51 y 401, respectivamente, SEQ ID NO:53 y 402, respectivamente, SEQ ID NO:405 y 406, respectivamente, y SEQ ID NO:407 y 408, respectivamente.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender un anticuerpo que contenga al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis CDR de las SEQ ID NO:55, 56, 57, 58, 59 y 60 y, opcionalmente, tener especificidad de unión a NGF.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender ninguno de los anticuerpos o secuencias codificadoras de anticuerpos descritos en este documento en las secciones tituladas “Anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión de los mismos que tienen actividad de unión a NGF” y “Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos anti-NGF”. La presente descripción proporciona además métodos para producir un complejo de múltiples subunidades, que puede comprender: cultivar una célula huésped que proporciona un cultivo que comprende células eucariotas que expresan dicho complejo de múltiples subunidades, agregar un bolo de etanol a dicho cultivo, y cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades. El complejo de múltiples subunidades puede comprender uno o más enlaces disulfuro y puede ser un anticuerpo.
Según la descripción, la concentración del bolo de etanol (expresada como % en p/v) puede estar entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 5 %, tal como al menos aproximadamente 0,1 %, al menos aproximadamente 0,2 %, al menos aproximadamente el 0,3 %, al menos aproximadamente 0,4 %, al menos aproximadamente 0,5 %, al menos aproximadamente 0,6 %, al menos aproximadamente 0,7 %, al menos aproximadamente 0,8 %, al menos aproximadamente 0,9 %, al menos aproximadamente 1 %, hasta aproximadamente 1 %, hasta aproximadamente 1,1 %, hasta aproximadamente 1,2 %, hasta aproximadamente 1,3 %, hasta aproximadamente 1,4 %, hasta aproximadamente 1,5 %, hasta aproximadamente 1,6 %, hasta aproximadamente 1,7 %, hasta aproximadamente 1,8 %, hasta aproximadamente 1,9 %, hasta aproximadamente el 2 %, hasta aproximadamente el 3 %, hasta aproximadamente el 4 % o hasta aproximadamente el 5 %, tal como entre aproximadamente el 0,1 % y aproximadamente el 1,9 %, entre aproximadamente el 0,2 % y aproximadamente el 1,8 %, entre aproximadamente el 0,3 % y aproximadamente 1,7 %, entre aproximadamente 0,4 % y aproximadamente 1,6 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 1,5 %, entre aproximadamente 0,6 % y aproximadamente 1,4 %, entre aproximadamente 0,7 % y aproximadamente 1,3 %, entre aproximadamente 0,8 % y aproximadamente 1,2 %, o entre aproximadamente 0,9 % y aproximadamente 1,1 %, como aproximadamente 0,1 %, aproximadamente 0,2 %, aproximadamente 0,3 %, aproximadamente 0,4 %, aproximadamente 0,5 %, aproximadamente 0,6 %, aproximadamente 0,7 % , aproximadamente 0,8 %, aproximadamente 0,9 %, aproximadamente 1 %, aproximadamente 1,1 %, aproximadamente 1,2 %, aproximadamente 1,3 %, aproximadamente 1,4 %, aproximadamente 1,5 %, aproximadamente 1,6 %, aproximadamente 1,7 %, aproximadamente 1,8 %, aproximadamente 1,9 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 2,5 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 % o aproximadamente 5 %.
El método puede comprender además la purificación de dicho complejo de múltiples subunidades deseado.
En algunos ejemplos, la concentración de etanol puede controlarse después de la adición del bolo de etanol, que puede usarse para mantener la concentración de etanol en un punto fijado deseado o dentro de un intervalo de punto de ajuste deseado. El punto de ajuste (expresado como % en p/v) puede estar entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 4 %, al menos aproximadamente 0,01 %, al menos aproximadamente 0,02 %, al menos aproximadamente 0,04 %, al menos aproximadamente 0,06 %, al menos aproximadamente 0,08 %, al menos aproximadamente 0,1 %, al menos aproximadamente 0,15 %, al menos aproximadamente 0,2 %, al menos aproximadamente 0,25 %, al menos aproximadamente 0,3 %, al menos aproximadamente 0,35 %, al menos aproximadamente 0,4 %, al menos aproximadamente 0,45 %, al menos aproximadamente 0,5 %, al menos aproximadamente 0,6 %, al menos aproximadamente 0,7 %, al menos aproximadamente 0,8 %, al menos aproximadamente 0,9 %, al menos aproximadamente 1 %, al menos aproximadamente 1,2 %, al menos aproximadamente 1,4 %, al menos aproximadamente 1,6 %, al menos aproximadamente 1,8 %, al menos aproximadamente 2 %, hasta aproximadamente 4 %, hasta aproximadamente 3,75 %, hasta aproximadamente 3,5 %, hasta aproximadamente 3,25 %, hasta aproximadamente 3 %, hasta aproximadamente 2,75 %, hasta aproximadamente el 2,5 %, hasta aproximadamente el 2,25 %, hasta aproximadamente el 2 %, hasta aproximadamente el 1,75 %, hasta aproximadamente el 1,5 %, hasta aproximadamente el 1,25 %, hasta aproximadamente el 1 %, entre aproximadamente el 0,01 % y aproximadamente 4 %, entre aproximadamente 0,02 % y aproximadamente 3,75 %, entre aproximadamente 0,04 % y aproximadamente 3,5 %, entre aproximadamente 0,08 % y aproximadamente 3,25 %, entre aproximadamente 0,1 % y aproximadamente 3 %, entre aproximadamente 0,2 % y aproximadamente 2,75 %, entre aproximadamente 0,3 % y aproximadamente 2,5 %, entre aproximadamente 0,4 % y aproximadamente 2,25 %, entre aproximadamente 0,5 % y aproximadamente 2 %, entre aproximadamente 0,6 % y aproximadamente 1,75 %, entre aproximadamente 0,7 % y aproximadamente 1,5 %, o entre aproximadamente 0,8 % y aproximadamente 1,25 %. Por ejemplo, el punto de ajuste puede ser el mismo que la concentración del bolo o dentro de más o menos el 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de la concentración del bolo.
El punto de ajuste de la concentración de etanol se puede mantener controlando la producción de etanol por las células de levadura durante la fermentación. Por ejemplo, la concentración de etanol puede aumentarse aumentando la concentración de glucosa (por ejemplo, aumentando la tasa de alimentación de glucosa), disminuyendo la disponibilidad de oxígeno, disminuyendo la intensidad de la agitación (por ejemplo, disminuyendo la potencia de entrada del fermentador), disminuyendo la presión de gas en el fermentador, disminuyendo el caudal del aire suministrado u otra mezcla de gases, aumentando la viscosidad del cultivo o disminuyendo la concentración de oxígeno en el aire suministrado u otra mezcla de gases (por ejemplo, si se utiliza un suplemento de oxígeno). La producción de etanol también se puede incrementar aumentando la temperatura de fermentación. Asimismo, la concentración de etanol se puede disminuir disminuyendo la concentración de glucosa (por ejemplo, disminuyendo la tasa de alimentación de glucosa), aumentando la disponibilidad de oxígeno, aumentando la intensidad de la agitación (por ejemplo, aumentando la potencia de entrada del fermentador), aumentando la presión de gas en el fermentador, aumentando el caudal del aire suministrado u otra mezcla de gases, disminuyendo la viscosidad del cultivo o aumentando la concentración de oxígeno en el aire suministrado u otra mezcla de gases (por ejemplo, si se utiliza un suplemento de oxígeno). La producción de etanol también puede reducirse disminuyendo la temperatura de fermentación.
Usando los métodos de la presente descripción, la abundancia relativa de subproducto o subproductos no deseados puede disminuirse en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o hasta niveles indetectables en comparación con los niveles iniciales de abundancia, con respecto a los métodos convencionales. Los ejemplos de productos secundarios no deseados cuya abundancia relativa puede disminuir de esta manera pueden incluir una o más especies que tienen un peso molecular aparente diferente al del complejo de múltiples subunidades deseado. Por ejemplo, el peso molecular aparente puede verse afectado por diferencias en la estequiometría, el plegamiento, el ensamblaje del complejo y/o la glicosilación. Por ejemplo, tales productos secundarios no deseados pueden detectarse usando cromatografía de exclusión por tamaño y/o electroforesis en gel, y pueden tener un peso molecular aparente mayor o menor que el complejo de múltiples subunidades deseado. En algunos ejemplos, los productos secundarios no deseados pueden detectarse en condiciones reductoras. En otros ejemplos, los productos secundarios no deseados pueden detectarse en condiciones no reductoras.
En algunos ejemplos, la presente descripción también proporciona métodos y composiciones de materia mejorados que proporcionan la producción recombinante de anticuerpos y otros complejos de múltiples subunidades, con un mayor rendimiento. En algunos ejemplos, el rendimiento puede aumentarse en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 100 % o más (con respecto a los métodos convencionales) utilizando los métodos descritos en este documento.
En algunos ejemplos, la célula huésped en la que se pueden producir las proteínas de múltiples subunidades puede ser una levadura, por ejemplo, en una especie de Pichia, tal como P. pastoris, u otra levadura metilotrófica, o en una especie de Saccharomyces, tal como S. cerevisiae, u otra levadura, tal como un Schizosaccharomyces (por ejemplo, S. pombe). Otros ejemplos de levaduras metilotróficas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen Pichia angusta (también conocido en la técnica como Hansenula polymorpha), Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera, Ogataea nitratoaversa y Candida boidnii.
La célula huésped puede ser una célula eucariota, tal como una célula de levadura, tal como una levadura metilotrófica, tal como una levadura del género Pichia. Los ejemplos de levaduras metilotróficas del género Pichia incluyen Pichia pastoris, Pichia angusta, Pichia guillermordii, Pichia methanolica, y Pichia inositovera. La célula huésped puede producirse mediante apareamiento, por ejemplo, mediante apareamiento de dos células de levadura haploides que contienen cada una una o más copias de al menos un gen que codifica una subunidad del complejo de múltiples subunidades.
En un ejemplo preferido, las levaduras metilotróficas del género Pichia son Pichia pastoris. La célula huésped puede ser una célula diploide o tetraploide.
Al menos uno de dichos genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades deseado, tal como dicha cadena ligera y/o cadena pesada del anticuerpo deseado, puede expresarse bajo el control de un promotor inducible o constitutivo, tal como promotores CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio; ver Koller et al., Yeast, 2000, 16:651-656), promotores inducibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Staib et al., Antimicrobial Agents And Chemotherapy, enero de 2008, pp. 146-156), promotores inducibles por tiamina, AOX1, ICL1, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), FLD1, ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5 y promotores Pyk, promotores quiméricos derivados de los mismos, promotores de levaduras, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores de plantas, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores aviares.
La célula huésped puede secretar dicho complejo de múltiples subunidades deseado hacia el medio de cultivo. Como alternativa o, además, dicho complejo de múltiples subunidades deseado puede mantenerse en dicha célula huésped y puede aislarse a partir de esta.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoespecífico o biespecífico. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que se une específicamente a cualquier antígeno.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede ser un anticuerpo distinto de cualquiera de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo distinto de cualquiera de los anticuerpos anti-NGF) descritos en el documento WO 2012/075340 (documento PCT/u S11/62963, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0148490 (n.° de serie de EE. UU. 13/309.295, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0141485 (n.° de serie de EE. UU.
13/309.153, presentado el 1 de diciembre de 2011), documento US 2012/0164067 (n.° de serie de EE. UU. 13/308.665 presentado el 1 de diciembre de 2011), y documento US 2012/0141484 (n.° de serie de EE. UU. 13/308.831, presentado el 1 de diciembre de 2011). En un ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser ninguno de los siguientes anticuerpos: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF , Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF. En otro ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser un fragmento Fab2 de ninguno de los siguientes anticuerpos: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF y Ab21 -NGF. En otro ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser un fragmento Fab1 de ninguno de los siguientes anticuerpos: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF. En otro ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede comprender un anticuerpo que contenga al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: Ab1-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, Ab10-NGF, Ab11-NGF, Ab12-NGF, Ab13-NGF, Ab14-NGF, Ab15-NGF, Ab16-NGF, Ab17-NGF, Ab18-NGF, Ab19-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF y, opcionalmente, tener especificidad de unión a NGF. Por ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede comprender ni consistir en las secuencias polipeptídicas de cadena ligera y pesada SEQ ID NO:51 y 401, respectivamente y/o SEQ ID NO:53 y 402, respectivamente y/o SEQ ID NO:405 y 406, respectivamente y/o SEQ iD NO:407 y 408, respectivamente. Como ejemplo adicional, el complejo de múltiples subunidades deseado puede no comprender un anticuerpo que contenga al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis CDR de las SEQ ID NO:55, 56, 57, 58, 59 y 60 y, opcionalmente, tener especificidad de unión a NGF.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un anticuerpo de cualquier tipo. Los ejemplos de tipos de anticuerpos incluyen anticuerpos de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, ser humano, ratón, rata, conejo, cabra, oveja, vaca, etc. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado que puede ser de origen de conejo. El anticuerpo deseado puede ser un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.
Se puede optimizar al menos uno de dichos genes que proporciona la expresión de una subunidad del complejo de múltiples subunidades deseado, tal como la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo deseado, en al menos una de dichas células huésped en dicho panel. para la expresión en dicha célula huésped (por ejemplo, seleccionando codones preferidos y/o alterando el porcentaje de AT a través de la selección de codones).
La pureza de dicho complejo de múltiples subunidades deseado, tal como un anticuerpo deseado, puede evaluarse midiendo la fracción del complejo de múltiples subunidades deseado producida por dicha célula huésped que no está glicosilada, está contenida en complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente y/o peso molecular aparente esperado (por ejemplo, medido por cromatografía de exclusión por tamaño), tiene la movilidad electroforética esperada (por ejemplo, detectada por electroforesis en gel, tal como SDS-PAGE, y opcionalmente transferencia Western) y/o midiendo la actividad específica del complejo de múltiples subunidades (por ejemplo, la unión específica a una diana de un anticuerpo deseado).
El complejo de múltiples subunidades deseado puede ser un anticuerpo, y el rendimiento de dicho anticuerpo puede evaluarse determinando la cantidad de anticuerpo deseado producido por dicha célula huésped descontando cualquier variante asociada al producto que esté glicosilada, contenida en complejos de anticuerpos distintos de los complejos que tienen el peso molecular o radio hidrodinámico aparente esperado y/o que no se unen específicamente a la diana de dicho anticuerpo deseado.
Los métodos de la presente pueden producir un título de anticuerpos en el sobrenadante de al menos 100 mg/L, al menos 150 mg/L, al menos 200 mg/L, al menos 250 mg/L, al menos 300 mg/L, entre 100 y 300 mg./L, entre 100 y 500 mg/L, entre 100 y 1000 mg/L o más de 1000 mg/L, por ejemplo, tan alto como 1200 mg/L, tan alto como 10.000 mg/L o más.
En otro aspecto, la célula huésped que produce un complejo de múltiples subunidades deseado puede ser una célula diploide o tetraploide del género Pichia, tal como una célula de Pichia pastoris. Los genes que proporcionan la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades deseado, tal como la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo deseado, pueden integrarse en el genoma de dicha célula huésped y/o pueden estar contenidos en un elemento extracromosómico, plásmido o cromosoma artificial.
En otro aspecto, la célula huésped que produce un complejo de múltiples subunidades deseado puede modificarse por ingeniería genética para aumentar el rendimiento y/o la pureza. Tal como se describe allí, el rendimiento y la pureza de un anticuerpo u otro complejo de múltiples subunidades pueden mejorarse en gran medida alterando el número de copias por célula de los genes que codifican cada subunidad. Por ejemplo, cuando el complejo de múltiples subunidades deseado es un anticuerpo, la célula huésped puede comprender más copias del gen que proporciona la expresión de la cadena ligera que copias del gen que proporciona la expresión de la cadena pesada. En realizaciones ejemplares, la célula huésped puede comprender de 1 a 10 copias de un gen que codifica la cadena ligera y de 1 a 10 copias de un gen que codifica la cadena pesada. El número respectivo de copias del gen que codifica la cadena pesada y el número de copias del gen que codifica la cadena ligera en dicha célula huésped puede ser: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5 ,4 y 3, 4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6, o 5 y 7, respectivamente. Otros ejemplos de combinaciones de números de copias de genes de cadena pesada y ligera incluyen cualquier combinación de hasta diez copias del gen de cadena pesada y/o ligera, tal como H2xL1, H3xL1, H4xL1, H5xL1, H6xL1, H7xL1, H8xL1, H9xL1, H10xL1, H1xL2 , H2xL2, H3xL2, H4xL2, H5xL2, H6xL2, H7xL2, H8xL2, H9xL2, H10xL2, H1xL3, H2xL3, H3xL3, H4xL3, H5xL3, H6xL3, H7xL3, H8xL3, H9xL3, H10xL3, H1xL4, H2xL4, H3xL4, H4xL4, H5xL4, H6xL4, H7xL4, H8xL4, H9xL4, H10xL4, H1xL5, H2xL5, H3xL5, H4xL5, H5xL5, H6xL5, H7xL5, H8xL5, H9xL5, H10xL5, H1xL6, H2xL6, H3xL6, H4xL6, H5xL6, H6xL6, H7xL6, H8xL6, H9xL6, H10xL6, H1xL7, H2xL7, H3xL7, H4xL7, H5xL7, H6xL7, H7xL7, H8xL7, H9xL7, H10xL7, H1xL8, H2xL8, H3xL8, H4xL8, H5xL8, H6xL8, H7xL8, H8xL8, H9xL8, H10xL8, H1xL9, H2xL9, H3xL9, H4xL9, H5xL9, H6xL9, H7xL9, H8xL9, H9xL9, H10xL9, H1xL10, H2xL10, H3xL10, H4xL10, H5xL10, H6xL10, H7xL10, H8xL10, H9xL10, H10xL10, en los que el número que sigue a la "H" identifica el número de copias del gen de la cadena pesada, y el número que sigue a la "L" identifica el número de copias del gen de la cadena ligera. Por ejemplo, el número especificado de copias de genes de cadena pesada y ligera puede integrarse en tándem en un solo locus, o en múltiples loci (cualquiera o todos los cuales pueden contener más de una copia). Opcionalmente, cada locus genómico puede contener no más de tres o cuatro copias de genes integrados en tándem, promoviendo así la estabilidad del número de copias durante la propagación y/o producción de anticuerpos.
El cultivo generalmente implica suministrar a las células una fuente de energía, oxígeno y nutrientes. También se conocen métodos en la literatura para el diseño y la optimización de fermentaciones de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes, incluida la optimización de la densidad celular, el volumen del caldo, la tasa de alimentación del sustrato y la duración de cada fase de la reacción. Ver Zhang et al., "Rational design and optimization of fed-batch and continuous fermentations" en Cregg, J. M., ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, pp. 43-63. Al cultivo se le puede suministrar una mezcla de gases que comprenda oxígeno, tal como aire con o sin suplementación de oxígeno. El cultivo de levaduras puede cultivarse en un medio de cultivo que puede ser un medio mínimo, puede carecer de agentes selectivos y/o puede carecer de aminoácidos preformados u otras biomoléculas complejas. El medio de cultivo también puede ser un medio complejo (por ejemplo, que contenga extracto de levadura y/o una o más peptonas vegetales). El medio puede incluir una fuente de nitrógeno (por ejemplo, cloruro de metilamina, NH4SO4, extracto de levadura, peptona de soja, otras peptonas vegetales, etc.). Los ejemplos de medios mínimos incluyen medio de dextrosa mínimo (MD) (base de nitrógeno de levadura (“yeast nitrogen base”, YNB) al 1,34 % (sin aminoácidos), biotina al 4 x 10-5 % y glucosa al 2 %), medio complejo de glicerol mínimo tamponado (“buffered minimal glycerol complex medium”, BMGY) (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, glicerol al 1 %, YNB al 1,34 % (sin aminoácidos), biotina al 4 x 10-5 % y fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0)). Los medios pueden incluir una o más sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como fosfato de potasio, Tris o HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (por ejemplo, añadidos para inhibir crecimiento de contaminantes y/o para el mantenimiento de un marcador seleccionable), oligoelementos y glucosa u otra fuente de energía. También se pueden incluir suplementos y sustituciones a concentraciones apropiadas que serían conocidas por los expertos en la técnica.
El cultivo puede crecer hasta una alta densidad celular, tal como al menos 50 g/L, al menos 100 g/L, al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L, o al menos al menos 700 g/L. Estas densidades de cultivo son ilustrativas más que limitantes, y los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente densidades de cultivo adecuadas.
Las células de levadura pueden cultivarse durante al menos 20 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 20 duplicaciones.
Las células de levadura pueden cultivarse durante al menos 50 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 50 duplicaciones.
Las células de levadura pueden cultivarse durante al menos 100 duplicaciones y mantener unos altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 100 duplicaciones.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un medio de cultivo que contiene un cultivo de levaduras Pichia diploides estable producido según cualquiera de los métodos anteriores, en el que el medio de cultivo puede comprender unos niveles de expresión de dicho anticuerpo deseado que pueden ser al menos aproximadamente 50 mg/litro, 100 mg/litro, 500 mg/litro, 750 mg/litro, 1000 mg/litro, 1250 mg/litro, 1500 mg/litro, 1750 mg/litro, 2000 mg/litro o más. Estos valores de rendimiento son ilustrativos más que limitantes. Opcionalmente, el rendimiento puede optimizarse, por ejemplo, utilizando los métodos y la estrategia general descritos en Zhang et al. (2007), supra. Por ejemplo, el rendimiento puede optimizarse variando la temperatura, el pH, la composición del medio (por ejemplo, fuente de carbono, concentración de la fuente de carbono, mezcla de dos o más fuentes de carbono, fuente y concentración de nitrógeno, concentración de sales y nutrientes, incluidos KH2 PO4 , K2HPO4 , MgSO4, sulfato de potasio, citrato de sodio, sulfato de potasio, citrato de sodio, oligoelementos, tales como cloruro de cobalto, sulfato cúprico, yoduro de sodio, sulfato de manganeso, molibdato de sodio, ácido bórico, cloruro de zinc, sulfato ferroso, vitaminas, tales como biotina, inositol, tiamina, peptona, extracto de levadura, casaminoácidos, urea, fosfato de amonio u otros iones de amonio, L-arginina-clorhidrato), el tiempo, la densidad de cultivo, la oxigenación y otros factores que influyen en el rendimiento. Por ejemplo, el rendimiento, la expresión y/o la pureza del complejo de múltiples subunidades deseado pueden mejorarse, en algunos casos, manteniendo la temperatura en un punto fijado deseado, por ejemplo, un punto fijado entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 30 °C, tal como entre aproximadamente 17 °C y aproximadamente 25 °C). Sin la intención de estar limitado por la teoría, se plantea la hipótesis de que el control de la temperatura puede ayudar al tráfico intracelular a través de las rutas de procesamiento de postraduccional y de plegamiento y/o puede disminuir la actividad de las proteasas celulares. Asimismo, el rendimiento, la expresión y/o la pureza del complejo de múltiples subunidades deseado pueden mejorarse, en algunos casos, manteniendo el pH del medio de cultivo en un punto fijado deseado, por ejemplo, un punto fijado entre pH 3 a pH 8, tal como entre pH 4 y pH 7.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un medio de cultivo que contiene un cultivo de levadura Pichia pastoris diploide estable producido según cualquiera de los métodos anteriores que expresa dicho anticuerpo deseado hacia un medio de cultivo, en el que la densidad celular de dichas células diploides en dicho cultivo puede ser de al menos aproximadamente 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 700 g/L o más. Estas densidades de cultivo son ilustrativas más que limitantes, y los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las densidades de cultivo adecuadas.
Al menos una subunidad de dicho anticuerpo u otra proteína de múltiples subunidades puede comprender una señal de secreción, tal como el péptido señal de la lisozima de pollo (“chicken lysozyme”, CLY); CLY-L8; péptido señal de invertasa de S. cerevisiae (SUC2); MF-alfa (Prepro); MF-alfa (Pre)-apv; MF-alfa (Pre)-apvSLEKR; MF-alfa (Prepro)-(EA)3; péptido señal de aF; péptido señal de KILM1; péptido señal de fosfatasa ácida reprimible (PHO1); péptido señal GOX de A. niger; péptido señal del gen de la glucoamilasa de Schwanniomyces occidentalis (GAM1); péptido señal de la albúmina de suero humano (“human serum albumin”, HSA) sin pro-secuencia; péptido señal de la albúmina de suero humano (HSA) con pro-secuencia; péptido señal de ISN; péptido señal de IFN; péptido señal de HGH; fitohemaglutinina (PHA); lisozima del gusano de seda; lisozima humana (LYZ1); receptor de activina de tipo 1; receptor de activina de tipo II; proteína de unión a inmunoglobulina de P. pastoris (PpBiP); conductor de la cadena ligera del anticuerpo humano 3D6; y cualquier combinación de los mismos.
La célula huésped puede producirse mediante el apareamiento de dos células de levadura haploides que contienen cada una una o más copias de un gen que codifica una o más subunidades de dicho anticuerpo u otra proteína de múltiples subunidades.
Breve descripción de los dibujos
Figuras 1A-B. La pureza de un Ab-A producido de forma recombinante se mejoró mediante la adición de un bolo de etanol antes del inicio de una alimentación de glucosa en cultivos de levadura a partir de los cuales se produjeron los anticuerpos. Los anticuerpos se recolectaron después de 97 horas de cultivo y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se evaluó la pureza mediante SDS-PAGE usando un gel no reducido (figura 1A) para resolver el anticuerpo completo deseado (flecha, "Ab completo (H2L2)") de las variantes asociadas al producto no deseadas. Los complejos que tienen una estequiometría aberrante se identificaron en función de su peso molecular, la afinidad por la proteína A y estudios adicionales que se describen con más detalle a continuación, como una especie de "medio anticuerpo" que contiene una cadena pesada y una ligera (flecha, "H1L1") y un complejo que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera ("H2L1"). La abundancia relativa de los complejos H2L1 y H1L1 disminuyó en gran medida por la adición de un bolo de etanol durante la producción de anticuerpos. Comparar, en la figura 1 A, los carriles 2-3 (sin bolo) con el carril 5 (con bolo). La figura 1B muestra las mismas muestras procesadas en condiciones reductoras, que separaron cada uno del anticuerpo completo, complejos H1L1 y H2L1 en cadenas ligeras y pesadas individuales, lo que confirma que los complejos H1L1 y H2L1 están compuestos de cadenas ligeras y pesadas de longitud completa. Orden de los carriles en las figuras 1A-B: Carril 1: marcador de peso molecular; carriles 2 y 3: muestras de control preparadas a partir de cultivos de fermentación sin adición de un bolo de etanol; carril 4: sin muestra; carril 5: muestra preparada a partir de cultivos de fermentación con la adición de un bolo de etanol.
Las figuras 1C-E muestran la densidad de las bandas de gel representada a lo largo de la longitud del gel no reducido (figura 1A, carriles 2, 3 y 5, respectivamente); las flechas identifican los picos correspondientes a la especie H1L1. La figura 1F tabula el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en las figuras 1C-E, que demuestra una reducción de aproximadamente el 90 % en la abundancia relativa de los complejos H1L1. La abundancia del complejo H2L1 no se cuantificó debido a la resolución incompleta de los picos de anticuerpos completos.
Las figuras 2A-B y 3A-B demuestran la reproducibilidad de la mejora en la pureza de Ab-A mediante la adición de un bolo de etanol a los cultivos de levadura. Los anticuerpos se recolectaron después de 87 u 86 horas de cultivo (figuras 2 y 3, respectivamente) y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se evaluó la pureza mediante SDS-PAGE usando un gel no reducido. La abundancia de los complejos H1L1 y H2L1 (flechas) disminuyó de nuevo mediante la adición de un bolo de etanol . Comparar, en la figura 2A, el carril 3 (sin bolo) con el carril 2 (con bolo) y, en la figura 3A, los carriles 4-6 (sin bolo) con los carriles 2 y 4 (con bolo). La figura 2B muestra las mismas muestras que en la figura 2A procesadas en condiciones reductoras, lo que nuevamente confirma que las variantes asociadas al producto observadas están compuestas por cadenas ligeras y pesadas de longitud completa. Orden de los carriles en las figuras 2A-B: Carril 1: marcador de peso molecular; carril 2: muestra preparada a partir de un cultivo de fermentación con una adición de un bolo de etanol; carril 3: muestra de control preparada a partir de un cultivo de fermentación sin adición de un bolo de etanol. Orden de los carriles en la figura 3A: Carril 1: marcador de peso molecular; carriles 2 y 4: muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación con adición de un bolo de etanol; carril 3: sin muestra; carriles 5-7: muestras de control preparadas a partir de cultivos de fermentación sin adición de un bolo de etanol.
Las figuras 2C y 2D muestran la densidad de las bandas de gel representada a lo largo de la longitud del gel no reducido (figura 2A, carriles 2 y 3, respectivamente); las flechas identifican los picos correspondientes a la especie H1L1. Las figuras 2E y 3B tabulan el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en la figura 2C y la figura 3A, que demuestra una reducción de aproximadamente el 85 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 en la figura 2A y aproximadamente un 87 % de reducción promedio en la abundancia relativa de complejos H1L1 en la figura 3A.
Figuras 4A-D. La pureza de un segundo anticuerpo recombinante ("Ab-B") también se mejoró mediante la adición de un bolo de etanol antes de la fase de producción de un proceso de fermentación. Se recolectaron muestras de caldo de cultivo de fermentación después de 67 horas ("T67) u 87 horas ("T87") de cultivo (figuras 4A-B y 4C-D, respectivamente) y se purificaron los anticuerpos por afinidad de proteína A. Después se evaluó la pureza mediante SDS-PAGE usando geles no reducidos (figuras 4A y 4C). En ambos momentos evaluados, la abundancia de la especie de medio anticuerpo (H1L1) y el complejo H2L1 disminuyó considerablemente en los cultivos de fermentación preparados que recibieron la adición de un bolo de etanol, en relación con los cultivos de control que no recibieron la adición de un bolo de etanol. Comparar, en la figura 4A, los carriles 2-3 (sin bolo) con los carriles 6-7 (con bolo) y, en la figura 4C, los carriles 2-3 (sin bolo) con los carriles 6-7 (con bolo). Las figuras 4B y 4D muestran las mismas muestras procesadas en condiciones reductoras. Orden de los carriles en las figuras 4A-D: Carril 1: marcador de peso molecular; carriles 2-3: muestra de control preparada a partir de cultivos de fermentación sin adición de un bolo de etanol; carriles 4-5: sin muestra; carriles 6-7: muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación con la adición de un bolo de etanol.
Las figuras 4E y 4F tabulan el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en las figuras 4A (T67) y 4C (T87), respectivamente, lo que demuestra que la adición de un bolo de etanol produjo una reducción de aproximadamente un 73 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 en el momento más temprano mostrado en la figura 4A, y una reducción promedio de aproximadamente el 34 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 en el momento más tardío mostrado en la figura 4C.
Figuras 5A-B. La pureza de un tercer anticuerpo recombinante (Ab-C) también se mejoró mediante la adición de un bolo de etanol antes de la fase de producción de fermentación. Los anticuerpos se recolectaron después de 86 horas de cultivo y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se evaluó la pureza mediante SDS-PAGE usando un gel no reducido (figura 5A). Los complejos H1L1 y H2L1 fueron menos abundantes en el producto de Ab-C incluso sin la adición de un bolo de etanol, dejando menos margen de mejora. No obstante, la abundancia de la especie de medio anticuerpo (H1L1) y el complejo H2L1 disminuyó notablemente en los cultivos de fermentación que recibieron la adición de un bolo de etanol, en comparación con los cultivos de control que no recibieron la adición de un bolo de etanol. Comparar, en la figura 5A, los carriles 5-6 (sin bolo) con el carril 3 (con bolo). La figura 5B muestra las mismas muestras procesadas en condiciones reductoras. Orden de los carriles en las figuras 5A-B: Carril 1: marcador de peso molecular, carril 2: sin muestra; carril 3: muestra preparada a partir de cultivos de fermentación que recibieron la adición de un bolo de etanol; carril 4: sin muestra; carriles 5-6: muestra de control preparada a partir de cultivos de fermentación que no recibieron la adición de un bolo de etanol.
La figura 5C tabula el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en las figuras 5A, demostrando una reducción promedio de aproximadamente un 61 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 por la adición del bolo de etanol.
Las figuras 6A-F muestran la evaluación de la pureza relativa de las preparaciones de Ab-A mostradas en las figuras 1-3 por cromatografía de exclusión por tamaño. En cada panel, el pico principal contiene el anticuerpo completo que contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras (H2L2). La especie H1L1 no se resolvió a partir del pico principal mediante este método (se cree que se debe a que los dímeros de H1L1 se forman por asociación no covalente que se mantiene en las condiciones utilizadas). Sin embargo, se detectaron otras variantes asociadas al producto no deseadas, incluidas especies de mayor peso molecular (a la izquierda del pico principal) y especies de menor peso molecular (a la derecha del pico principal). Aunque se detectó un pico prominente que correspondía a dímeros de anticuerpos que contenían dos anticuerpos completos (H4L4) (flecha), la abundancia relativa de estos disminuyó en las muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación que recibieron la adición en un bolo de etanol. Comparar las figuras 6A, 6C y 6E (sin bolo) con las figuras 6B, 6D y 6F (con bolo).
La figura 7 resume la cuantificación de la cantidad de variantes asociadas al producto detectadas por SEC para las seis muestras de Ab-A mostradas en la figura 6 y cinco muestras adicionales. Para cada muestra identificada (columna 1), se muestra el número fijado de experimentos (columna 2, identifica los experimentos de fermentación que se realizaron en paralelo), el bolo agregado (ya sea 10 g/L o ninguno, columna 3) y el tiempo de cultivo transcurrido antes de que se tomen y procesen las muestras del cultivo (columna 4), junto con la fracción de proteína detectada en el pico principal ("% de pico principal por SEC", columna 5). La adición en un bolo de etanol al final de la fase de crecimiento aumentó el porcentaje promedio contenido en el pico principal, desde el 80,3 % hasta el 90,6 %.
La figura 8 resume la cuantificación de la cantidad de variantes asociadas al producto detectadas por SEC para muestras de anticuerpos Ab-B mostradas en la figura 4. Para cada experimento de fermentación (columna 1), se muestra el bolo agregado al final de la fase de crecimiento (ya sea 10 g/L o ninguno, columna 2) y el tiempo de cultivo transcurrido antes de que se tomen y procesen las muestras de cultivo (columna 3), junto con la fracción de proteína detectada en el pico principal ("% de pico principal por SEC," columna 4). Se incrementó la pureza general, aumentando el pico principal del 76 % al 79 % en T67, y del 60 % al 73 % en T87.
La figura 9 resume la cuantificación de la cantidad de variantes asociadas al producto detectadas por SEC para las muestras de anticuerpos Ab-C mostradas en la figura 5. Para cada experimento de fermentación identificado (columna 1), se muestra el bolo agregado (ya sea 10 g/L o ninguno, columna 2) y el tiempo de cultivo transcurrido antes de que se tomara y procesara la muestra (columna 3), junto con la fracción de proteína detectada en el pico principal ("% de pico principal por SEC," columna 4). Hubo poca diferencia en la pureza general detectada por este método, con aproximadamente el 89 % de producto contenido en el pico principal con o sin el bolo de etanol. Aparentemente, esto se debió a la alta pureza inicial del anticuerpo Ab-C incluso sin la adición de bolo. Además, SEC no resolvió la especie H1L1 del anticuerpo completo y, en consecuencia, la disminución de la producción de esta especie debido al bolo de etanol no se reflejó en los resultados de SEC.
La figura 10 resume los resultados de la medición por espectrometría de masas de la cantidad de una cadena pesada libre (que carece de un enlace disulfuro con una segunda cadena pesada) en muestras de anticuerpos Ab-A que contienen cantidades altas o bajas de la banda de H1L1. Como era de esperar, la cantidad de cadena pesada libre se correlacionó con la cantidad de la banda de H1L1, lo que confirma la identidad de la misma como que contiene una cadena pesada y una ligera y que carece de un enlace disulfuro con una segunda cadena pesada.
Las figuras 11-13 muestran la correlación entre la adición de un bolo de etanol y la viabilidad celular. La adición de un bolo de etanol generalmente mejoró la viabilidad celular y la pureza del anticuerpo para el anticuerpo Ab-A (figura 11) y el anticuerpo Ab-B (figura 12). Estos resultados sugieren que la mejora en la viabilidad celular puede explicar al menos parte de la mejora en la pureza del anticuerpo como resultado de la adición del bolo de etanol. En coherencia con estos resultados, el cultivo de anticuerpos Ab-C exhibió mayor pureza de anticuerpos y viabilidad celular que los cultivos de Ab-A y Ab-B (figura 13). Aparentemente, debido a que la viabilidad de los cultivos productores de anticuerpos Ab-C ya era alta en estos experimentos, había poco margen de mejora y los cultivos mostraron poca mejora en la viabilidad como resultado de la adición en bolo de etanol. En las figuras 11-13, las barras rayadas indican que no hay bolo, mientras que las barras blancas indican la adición de un bolo de etanol. La viabilidad se determinó a partir de cultivos de fermentación muestreados dentro de 1,5 horas del momento en el que se recogieron las muestras para los análisis de pureza (como se identifica en las diapositivas anteriores).
La figura 14 muestra que una amplia gama de concentraciones de bolo de etanol puede producir la misma mejora en la pureza de los anticuerpos. Se produjo Ab-A con la adición de un bolo de etanol entre 5 g/L (al 0,5 % en p/v) y 15 g/L (al 1,5 % en p/v) y se purificó por afinidad de proteína A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida. Cada cultivo exhibió niveles similarmente bajos de los complejos H2L1 y H1L1 a las 63 horas (figura 14A) y 86 horas (figura 14B). Orden de los carriles en las figuras 14A-B: carril 1: marcadores de peso molecular; carriles 2 y 7: bolo de 5 g/L; carriles 3 y 5: bolo de 10 g/L; carriles 4 y 6: bolo de 15 g/L.
La figura 15 muestra que el tiempo transcurrido entre el pico de oxígeno disuelto y la adición del bolo de etanol puede variar considerablemente, al tiempo que proporciona una mejora similar en la pureza del anticuerpo. Se produjo Ab-A con la adición de un bolo de etanol de 10 g/L (al 1 % en p/v) y se purificó por afinidad de proteína A, luego se analizó la pureza mediante SDS-PAGE no reducida (figura 15A). El "período de inanición", el tiempo entre el pico de oxígeno disuelto (que indica el agotamiento de la fuente de carbono en el cultivo) y la adición del bolo de etanol, varió entre 0 y 3 horas. Cada cultivo exhibió niveles similarmente bajos de los complejos H2L1 y H1L1 independientemente de la duración del período de inanición, lo que indica que la pureza del anticuerpo es relativamente insensible a la ausencia de un período de inanición o a un período de inanición de al menos hasta tres horas. Las mismas muestras se analizaron en un gel reducido (figura 15B). Orden de los carriles en las figuras 15A-B: carril 1: marcadores de peso molecular; carriles 2-4: sin muestra; carril 5: período de inanición de 0 horas; carril 6: período de inanición de 3 horas.
La figura 16 muestra el efecto del período de equilibrio (el tiempo entre la adición del bolo de etanol y el inicio de la alimentación) sobre la pureza del anticuerpo. El anticuerpo Ab-B se produjo con la adición de un bolo de etanol de 10 g/L (al 1 % en p/v) y se purificó por afinidad de proteína A, luego se analizó la pureza mediante SDS-PAGE no reducida (figura 16A). La duración del período de equilibrio fue de 0, 30 o 60 minutos. El período de equilibrio de 60 minutos dio como resultado una menor pureza del anticuerpo (mayor abundancia de los complejos H2L1 y H1L1). La viabilidad del cultivo también fue marcadamente menor con un período de equilibrio de 60 minutos, particularmente en un momento temprano del cultivo (a las 23 horas, figura 16B); la viabilidad mejoró algo al final del cultivo (a las 85 horas, figura 16C). Orden de los carriles en la figura 16A: carril 1: marcadores de peso molecular; carriles 2 y 4: sin muestra; carril 3: 30 minutos de equilibrio; carriles 5 y 6: tiempo de equilibrado de 60 minutos; carriles 7 y 8: 0 minutos de tiempo de equilibrio. En las figuras 16B-C, las barras rayadas hacia la derecha indican un período de equilibrio de cero minutos, las barras rayadas hacia la izquierda indican un período de equilibrio de 30 minutos y las barras blancas indican un período de equilibrio de 60 minutos.
Descripción detallada
Los solicitantes han descubierto inesperadamente que la pureza de los complejos de múltiples subunidades expresados a partir de levaduras puede mejorarse en gran medida mediante la adición de un bolo de etanol al medio de cultivo. Se demostró que la adición de un solo bolo de etanol mejora la pureza durante un período sostenido de producción, hasta al menos 97 horas.
La presente descripción proporciona métodos y composiciones de materia mejorados que proporcionan la producción recombinante de anticuerpos y otros complejos de múltiples subunidades con una mayor pureza y una menor producción de uno o más productos secundarios no deseados. En algunos ejemplos, en relación con el complejo de múltiples subunidades deseado, el producto o productos secundarios no deseados pueden exhibir uno o más de: una estequiometría alterada, una glicosilación aberrante, diferencias en el peso molecular aparente, diferencias en los enlaces disulfuro, diferencias en el radio hidrodinámico, fragmentos y/o formas truncadas de una o más subunidades. Los productos secundarios no deseados también pueden presentar una o más diferencias adicionales. Los productos secundarios no deseados también pueden detectarse por sus efectos sobre una preparación, por ejemplo, la alteración en el nivel de actividad específica, inmunogenicidad u otros efectos sobre la constitución física y/o función del complejo de múltiples subunidades deseado.
Por ejemplo, cuando el complejo de múltiples subunidades deseado es un anticuerpo, los productos secundarios no deseados pueden incluir una especie H1L1 o "medio anticuerpo" (es decir, que contiene una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada no está unida por un disulfuro a otra cadena pesada) y/o una especie H2L1 (es decir, que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera, pero que carece de una segunda cadena ligera).
Aunque sin pretender limitarse a la teoría, se plantea la hipótesis de que un rápido aumento en la concentración de etanol (que puede ser provocado por la adición de un bolo de etanol) puede causar cambios sostenidos en la expresión génica que confieren una mejora duradera en la producción de complejos de múltiples subunidades y ensamblados y plegados de modo adecuado y/o un aumento en el procesamiento de complejos de múltiples subunidades mal ensamblados o plegados incorrectamente, lo que conduce a una pureza mejorada en el complejo de múltiples subunidades. Además, se demostró que la pureza mejorada del anticuerpo se correlacionaba con la viabilidad mejorada de las levaduras en el cultivo y, basándose en ello, los solicitantes plantean la hipótesis de que la viabilidad mejorada puede explicar (al menos en parte) la pureza mejorada, aunque esta teoría no pretende ser limitante.
En un ejemplo preferido, el complejo de múltiples subunidades heterólogo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado, compuesto por dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera. Las células huésped preferidas incluyen levaduras, y las levaduras particularmente preferidas incluyen cepas de levadura metilotróficas, por ejemplo, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha (Pichia angusta), Pichia guillermordii, Pichia methanolica, Pichia inositovera, y otras (Ver, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 4.812.405, 4.818.700, 4.929.555, 5.736.383, 5.955.349, 5.888.768, y 6.258.559). La célula huésped puede producirse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como transformación, apareamiento, esporulación, etc.
En un ejemplo preferido, la célula huésped puede comprender más de una copia de uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas. Por ejemplo, se pueden integrar múltiples copias de un gen de una subunidad en tándem en uno o más loci cromosómicos. Las copias de genes integradas en tándem se mantienen preferiblemente en un número estable de copias durante el cultivo para la producción del complejo de múltiples subunidades. Por ejemplo, en los ejemplos que se describen a continuación, el número de copias de genes fue generalmente estable para cepas de P. pastoris que contenían de tres a cuatro copias integradas en tándem de genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada.
Uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas se integran preferiblemente en uno o más loci cromosómicos de una célula huésped. Se puede utilizar cualquier locus cromosómico adecuado para la integración, incluidas secuencias intergénicas, secuencias de promotores, secuencias codificadoras, secuencias de terminación, secuencias reguladoras, etc. Los ejemplos de loci cromosómicos que se pueden usar en P. pastoris incluyen PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; y GAP. Los genes codificadores también pueden integrarse en uno o más loci cromosómicos aleatorios en lugar de ser dirigidos. En realizaciones preferidas, los loci cromosómicos se seleccionan del grupo que consiste en el locus pGAP, 3' AOX TT y el locus HIS4 TT. En realizaciones ejemplares adicionales, los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas pueden estar contenidos en uno o más elementos extracromosómicos, por ejemplo, uno o más plásmidos o cromosomas artificiales.
En algunos ejemplos, la proteína de múltiples subunidades puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subunidades no idénticas. Además, cada subunidad puede estar presente una o más veces en cada proteína de múltiples subunidades. Por ejemplo, la proteína de subunidades múltiples puede ser un anticuerpo multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico que comprende dos cadenas ligeras no idénticas y dos cadenas pesadas no idénticas.
Las subunidades pueden expresarse a partir de genes monocistrónicos, genes policistrónicos o cualquier combinación de los mismos. Cada gen policistrónico puede comprender múltiples copias de la misma subunidad, o puede comprender una o más copias de cada subunidad diferente.
Los ejemplos de métodos que pueden usarse para la manipulación de Pichia pastoris (incluidos los métodos de cultivo, transformación y apareamiento) se describen en las solicitudes publicadas que incluyen U.S. 20080003643, U.S.
20070298500, y U.S. 20060270045, y en Higgins, D. R. y Cregg, J. M., eds. 1998. Pichia Protocols, Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey., y Cregg, J. M., ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey.
Un ejemplo de módulo de expresión que se puede utilizar está compuesto por el promotor del gen de gliceraldehído deshidrogenasa (gen GAP), fusionado a secuencias que codifican una señal de secreción, seguido de la secuencia del gen que se va a expresar, seguido de secuencias que codifican una señal de terminación transcripcional de P. pastoris procedente del gen de oxidasa I (AOX1) de P. pastoris. El gen marcador de resistencia a la zeocina puede proporcionar un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa, seleccionando transformantes que son resistentes a niveles más altos de zeocina. De manera similar, se pueden usar genes marcadores de resistencia a G418 o kanamicina para proporcionar un medio de enriquecimiento para cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa, seleccionando transformantes que son resistentes a niveles más altos de geneticina o kanamicina.
Las cepas huésped que pueden utilizarse incluyen P. pastoris auxotrófica u otras cepas de Pichia, por ejemplo, cepas que tienen mutaciones en met1, lys3, ura3 y ade1 u otros genes asociados a auxotrofia. Las mutaciones preferidas son incapaces de dar lugar a revertientes con una frecuencia apreciable y son preferiblemente mutantes de deleción parcial o incluso más preferiblemente completa. Preferiblemente, las cepas prototróficas diploides o tetraploides se producen mediante el apareamiento de conjuntos complementarios de cepas auxotróficas.
La transformación de cepas de P. pastoris haploides y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris se pueden realizar como se describe en Pichia Protocols (1998, 2007), supra.
Antes de la transformación, cada vector de expresión puede linealizarse mediante ruptura con enzimas de restricción dentro de una región homóloga al locus genómico diana (por ejemplo, la secuencia promotora GAP) para dirigir la integración de los vectores en el locus diana en la célula huésped. Las muestras de cada vector pueden transformarse luego individualmente en cultivos de las cepas deseadas mediante electroporación u otros métodos, y los transformantes exitosos pueden seleccionarse por medio de un marcador seleccionable, por ejemplo, resistencia a antibióticos o complementación de una auxotrofia. Los aislados se pueden recoger, sembrar en estrías para colonias individuales en condiciones selectivas y luego estudiarse para confirmar el número de copias del gen que codifica la subunidad del complejo de múltiples subunidades (por ejemplo, un anticuerpo deseado) mediante análisis de la transferencia Southern o ensayo de PCR en ADN genómico extraído de cada cepa. Opcionalmente, la expresión del producto del gen de la subunidad esperado puede confirmarse, por ejemplo, mediante FACS, transferencia Western, elevación de colonias e inmunotransferencia, y otros medios conocidos en la técnica. Opcionalmente, los aislados haploides se transforman más veces para introducir genes heterólogos adicionales, por ejemplo, copias adicionales de la misma subunidad integrada en un locus diferente y/o copias de una subunidad diferente. Las cepas haploides luego se aparean para generar cepas diploides (o cepas de ploidía superior) capaces de sintetizar el complejo de múltiples proteínas. La presencia de cada gen de subunidad esperado puede confirmarse mediante transferencia Southern, PCR y otros medios de detección conocidos en la técnica. Cuando el complejo de múltiples proteínas deseado es un anticuerpo, su expresión también puede confirmarse mediante un método de levantamiento de colonias/inmunotransferencia (Wung et al., Biotechniques, 21, 808-812 (1996)) y/o por FACS.
Este protocolo de transformación se repite opcionalmente para dirigir un gen heterólogo a un segundo locus, que puede ser el mismo gen o un gen diferente al que se dirigió al primer locus. Cuando la construcción que se va a integrar en el segundo locus codifica una proteína que es igual o muy similar a la secuencia codificada por el primer locus, su secuencia puede variarse para disminuir la probabilidad de integración no deseada en el primer locus. Por ejemplo, la secuencia que se integrará en el segundo locus puede tener diferencias en la secuencia de promotor, la secuencia de terminación, el uso de codones y/u otras diferencias de secuencia tolerables con respecto a la secuencia integrada en el primer locus.
Para aparear cepas haploides de P. pastoris, cada cepa que se va a cruzar se puede cultivar en parches sobre placas de apareamiento. Por ejemplo, se pueden realizar convenientemente múltiples apareamientos al mismo tiempo sembrando en estría cada cepa que se va a aparear a lo largo de una placa adecuada para su crecimiento, y las parejas de apareamiento pueden ser sembradas en estría a lo largo de una segunda placa (preferiblemente las placas son medios ricos, como YPD). Por lo general, después de uno o dos días de incubación a 30 °C, las células de las dos placas se pueden replicar en otras placas, sembrándolas de forma entrecruzada en una placa de apareamiento, lo que da como resultado un patrón de trama cruzada, y cada par de cepas están cocultivadas en la placa y tienen la oportunidad de aparearse en la intersección de un par de estrías originales. A continuación, la placa de apareamiento se puede incubar (por ejemplo, a 30 °C) para estimular el inicio del apareamiento entre cepas. Después de aproximadamente dos días, las células de las placas de apareamiento se pueden sembrar en estrías, parches o replicar en placas en medios selectivos para las cepas diploides deseadas (por ejemplo, cuando las cepas apareadas tienen autotrofías complementarias, se pueden usar placas de medio mínimo o de abandono). Estas placas se pueden incubar (por ejemplo, a 30 °C) durante un período adecuado (por ejemplo, aproximadamente tres días) para permitir el crecimiento selectivo de las cepas diploides deseadas. Las colonias que surgen se pueden escoger y sembrar en estrías para obtener colonias individuales para aislar y purificar cada cepa diploide.
Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención pueden incluir además secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador auxotrófico o de fármaco seleccionable para identificar cepas de levadura transformadas. Puede usarse además un marcador de fármaco para amplificar el número de copias del vector en una célula huésped de levadura, por ejemplo, cultivando una población de células en una concentración elevada del fármaco, seleccionando así los transformantes que expresan niveles elevados del gen de resistencia.
En un ejemplo, uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas se acoplan a un promotor inducible. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor del gen de alcohol oxidasa 1, genes de formaldehído deshidrogenasa (FLD; ver documento U.S. n.° de publicación 2007/0298500) y otros promotores inducibles conocidos en la técnica. El promotor del gen de la alcohol oxidasa 1 está fuertemente reprimido durante el crecimiento de la levadura en las fuentes de carbono más habituales, tales como glucosa, glicerol o etanol, pero es altamente inducido durante el crecimiento en metanol (Tschopp et al., 1987; patente de EE. UU. n.° 4.855.231 de Stroman, D. W., et al.). Para la producción de proteínas extrañas, las cepas pueden cultivarse inicialmente en una fuente de carbono represora para generar biomasa y luego cambiarse a metanol como única (o principal) fuente de carbono y energía para inducir la expresión del gen extraño. Una ventaja de este sistema regulatorio es que las cepas de P. pastoris transformadas con genes extraños cuyos productos de expresión son tóxicos para las células pueden mantenerse mediante su cultivo en condiciones represivas.
En otro ejemplo, uno o más de los genes heterólogos pueden acoplarse a un promotor regulado, cuyo nivel de expresión puede regularse positivamente en condiciones apropiadas. Los ejemplos de promotores regulados incluyen el promotor CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio), los promotores inducibles por tetraciclina, los promotores inducibles por tiamina, el promotor AOX1 y el promotor FLD1.
Aunque gran parte de la presente descripción describe la producción de anticuerpos, los métodos descritos en este documento también se adaptan fácilmente a otros complejos de múltiples subunidades. Sin la intención de estar limitado por la teoría, se cree que el rendimiento y la pureza de los complejos de múltiples subunidades pueden estar muy influenciados por la concentración y la estequiometría de las subunidades, que, a su vez, están influenciadas por el nivel de expresión de los genes responsables de la producción de cada subunidad. Los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar fácilmente para mejorar el rendimiento y/o la pureza de cualquier complejo de múltiples subunidades recombinante que comprenda dos o más subunidades diferentes. Además, los presentes métodos no se limitan a la producción de complejos de múltiples proteínas, sino que también se pueden adaptar fácilmente para su uso con complejos de ribonucleoproteína (RNP) que incluyen telomerasa, hnRNP, ribosomas, snRNP, partículas de reconocimiento de señales, complejos de RNasa P procarióticos y eucarióticos, y cualquier otro complejo que contenga múltiples subunidades de proteínas y/o de ARN diferenciadas. La célula huésped que expresa el complejo de múltiples subunidades se puede producir mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede generar un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contienen diferentes combinaciones de números de copias de genes mediante el apareamiento de células que contienen números variables de copias de los genes de subunidades individuales (cuyo número de copias se conoce preferiblemente antes del apareamiento).
Definiciones
Debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales y reactivos particulares descritos, ya que tales pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Como se usan en este documento, las formas singulares "un/una", "y" y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células, y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos los términos y expresiones técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.
Adición de un bolo: En la presente descripción, la "adición de un bolo" generalmente se refiere a un cambio rápido en la concentración de una sustancia (tal como etanol) en contacto con células cultivadas (por ejemplo, en un medio de cultivo). Por ejemplo, la sustancia se puede agregar a las células cultivadas en una sola adición, una sucesión de más de una adición y/o infundirse durante un período de tiempo (por ejemplo, durante aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6 , 7 , 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90 o 120 minutos). La sustancia también se puede agregar reemplazando el medio de cultivo en parte o en su totalidad, por ejemplo, concentrando las células (usando centrifugación, filtración, sedimentación u otros métodos), eliminando parte o todo el medio y agregando la sustancia, o agregando las células a un medio que contenga la sustancia. La sustancia se puede mezclar con un vehículo (por ejemplo, medio de cultivo, agua, disolución salina, etc.). Por ejemplo, la adición de un bolo de etanol puede comprender la adición de etanol puro o concentrado (por ejemplo, al 100 %, 95 %, 70 %, 50 %, 60 %, 40 %, 30 %, 20 %, etc.) al medio de cultivo en una cantidad suficiente para producir la concentración deseada. Como otro ejemplo, las células pueden añadirse a un medio que contiene etanol, por ejemplo, añadiendo un inóculo que contiene las células a un medio que contiene etanol.
Concentración de bolo: En la presente descripción, la "concentración de bolo" generalmente se refiere a la concentración que resulta de la adición de un bolo de una sustancia (por ejemplo, etanol).
Especies de levadura competentes para el apareamiento: En la presente descripción, esto pretende abarcar ampliamente cualquier levadura diploide o tetraploide que pueda crecer en cultivo. Dichas especies de levadura pueden existir en forma haploide, diploide u otra forma poliploide. Las células de una ploidía determinada pueden, en condiciones apropiadas, proliferar durante un número indefinido de generaciones en esa forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede resultar en cepas tetraploides a través de un apareamiento posterior o fusión de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de levaduras haploides, así como de células de levadura diploides u otras células de levadura poliploides producidas, por ejemplo, por apareamiento o fusión (por ejemplo, fusión de esferoplasto).
En un ejemplo, la levadura competente para el apareamiento es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma; Ascobotriozima; Citeromyces; Debaryomyces; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazajstania; Kluyveromyces; Kodamaea; Lodderomyces; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygosaccharomyces. Otros tipos de levadura potencialmente útiles en la invención incluyen Yarrowia; Rhodosporidium; Candida; Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus; Bullera; Leucosporidium y Filobasidella.
En un ejemplo preferido, la levadura competente para el apareamiento es un miembro del género Pichia o es otro metilotrofo. En otro ejemplo preferido, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia es una de las siguientes especies: Pichia pastoris, Pichia methanolica, y Hansenula polymorpha (Pichia angusta). Según la invención, la levadura competente para el apareamiento del género Pichia es la especie Pichia pastoris.
Célula de levadura haploide: Una célula que tiene una sola copia de cada gen de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura poliploide: Una célula que tiene más de una copia de su complemento genómico (cromosómico) normal.
Célula de levadura diploide: Una célula que tiene dos copias (alelos) de prácticamente todos los genes de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide: Una célula que tiene cuatro copias (alelos) de prácticamente todos los genes de su complemento genómico normal, típicamente formada por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células diploides. Los tetraploides pueden portar dos, tres, cuatro o más módulos de expresión diferentes. Tales tetraploides podrían obtenerse en S. cerevisiae por apareamiento selectivo de diploides alfa/alfa y a/a heterotálicos homocigóticos, y en Pichia por apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] puede aparearse con un haploide [ade his] para obtener diploide [his]; y un haploide [met arg] se puede aparear con un haploide [ade arg] para obtener un [arg] diploide; entonces el diploide [his] se puede aparear con el diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la técnica entenderán que la referencia a los beneficios y los usos de las células diploides también puede aplicarse a las células tetraploides.
Apareamiento de levaduras: El proceso por el cual dos células de levadura se fusionan para formar una sola célula de levadura. Las células fusionadas pueden ser células haploides o células de ploidía superior (por ejemplo, apareamiento de dos células diploides para producir una célula tetraploide).
Meiosis: Proceso por el cual una célula de levadura diploide se somete a una división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides. Cada espora puede luego germinar y formar una línea celular haploide de crecimiento vegetativo.
Marcador seleccionable: Un marcador seleccionable es un gen o fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) a una célula que recibe ese gen como, por ejemplo, a través de un acontecimiento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las que las células que no reciben ese gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente se dividen en varios tipos, incluidos los genes marcadores seleccionables positivos, como un gen que confiere a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura, cuando se cruzan dos mutantes sensibles a la temperatura (“temperature sensitive”, "ts") o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos, como un gen biosintético que confiere a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico que necesitan todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere a una célula la incapacidad de crecer frente a las células que no tienen el gen de tipo salvaje; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a: ZEO; NEO (G418); LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
Integrado: Un elemento genético (típicamente un elemento genético heterólogo) que está unido covalentemente en un cromosoma de un organismo.
Integrado en tándem: Dos o más copias de un elemento genético que se integran en ubicaciones adyacentes en un cromosoma. Las dos o más copias no tienen que tener necesariamente la misma orientación; por ejemplo, para genes transcritos, algunas copias pueden transcribirse de la hebra Watson y otras de la hebra Crick.
Célula huésped: En el contexto de la presente descripción, la expresión célula huésped se refiere a una célula (por ejemplo, una célula eucariota, tal como una célula de Pichia) que contiene un gen heterólogo. Por ejemplo, el gen heterólogo puede proporcionar la expresión de una subunidad de un complejo de múltiples subunidades deseado, un gen involucrado en el plegamiento de proteínas (por ejemplo, una chaperona), la expresión o la secreción y/u otro gen deseado. El gen heterólogo puede integrarse en el genoma de la célula eucariota o estar contenido en un elemento extracromosómico, tal como un plásmido o un cromosoma artificial.
Vector de expresión: Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteína extraña dentro de la célula huésped diana. Convenientemente, la manipulación de secuencias y la producción de ADN para la transformación se realiza primero en un huésped bacteriano, por ejemplo, E. coli, y normalmente los vectores incluirán secuencias para facilitar tales manipulaciones, incluido un origen de replicación bacteriano y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran nutrientes cruciales no disponibles en medios complejos. Se describen ejemplos de vectores y métodos para la transformación de levadura, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D. y Stearns, T. (2000), Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, Plainview, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención pueden incluir además secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador auxotrófico o de fármaco seleccionable para identificar cepas de levadura transformadas. Puede usarse además un marcador de fármaco para seleccionar la amplificación del número de copias del vector en una célula huésped de levadura.
La secuencia codificadora del polipéptido de interés está típicamente unida operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción que proporcionan la expresión del polipéptido en células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, entre otros, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También se pueden incluir secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo, una secuencia de señal y similares. Un origen de la replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo se integran en el genoma de una levadura.
Aunque es opcional, en una realización de la invención, una o más subunidades del complejo de múltiples subunidades están operativamente unidas, o fusionadas, a una secuencia de secreción que proporciona la secreción del polipéptido expresado hacia el medio de cultivo, lo que puede facilitar la recolección y la purificación del complejo heterólogo de múltiples subunidades. Incluso más preferiblemente, las secuencias de secreción proporcionan una secreción optimizada del polipéptido desde las células huésped (por ejemplo, células diploides de levadura), tal como mediante la selección de codones preferidos y/o alterando el porcentaje de AT mediante la selección de codones. Se sabe en la técnica que la eficacia y/o la estabilidad de la secreción pueden verse afectadas por la elección de la secuencia de secreción, y la secuencia de secreción óptima puede variar entre diferentes proteínas (ver, por ejemplo, Koganesawa et al., Protein Eng., septiembre de 2001, 14(9):705-710). Se conocen en la técnica muchas señales de secreción potencialmente adecuadas y se pueden ensayar fácilmente para determinar su efecto sobre el rendimiento y/o la pureza de un complejo de múltiples subunidades heterólogo particular. Se puede usar potencialmente cualquier secuencia de secreción, incluidas las presentes en proteínas secretadas de levaduras y otras especies, así como secuencias de secreción modificadas por ingeniería genética. Los ejemplos de secuencias de secreción que pueden utilizarse incluyen: péptido señal de lisozima de pollo (CLY) (MRSLLiLv LCFLPLAALG (SEQ ID NO:414)), CLY-L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (SEQ ID NO:415)), péptido señal de la invertasa de S. cerevisiae (SUC2) (MLLQAFLFLLAGFAAKISA (SEQ ID NO:416)), MF-alfa (Prepro) (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR (SEQ ID NO:417)), MF-alfa (Pre)-apv (APVFAPSIFTAVL (SEQ ID NO:418)), MF-alfa (Pre)-apv-SLEKR (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR (SEQ ID NO:419)), MF-alfa (Prepro)-(EA)3 (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA (SEQ ID NO:420)), péptido señal de aF (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR (SEQ ID NO:421)), péptido señal de KILM1 (MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR (SEQ ID NO:422)), péptido señal de la fosfatasa ácida reprimible (PHO1) (MFSPILSLEIILALATLQSVFA (SEQ ID n O:423)), péptido señal de GOX de A. niger (MQTLLVSSLWSLAAALPHYIR (SeQ ID NO:424)), péptido señal del gen de la glucoamilasa de Schwanniomyces occidentalis (GAM1) (MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA (SeQ ID NO:425)), péptido señal de la albúmina de suero humano (HSA) con secuencia pro (MKWVTFISLLFLFSSa Ys RGVFRR (SeQ ID NO:426)), péptido señal de la albúmina de suero humano (HSA) sin secuencia pro (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO:427)), péptido señal de ISN (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (SEQ ID NO:428)), péptido señal de IFN (MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP (SEQ ID Proteína NO:429), péptido señal de HGH (MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (SEQ ID NO:430)), fitohemaglutinina (PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG (SEQ ID NO:431)), lisozima de gusano de seda (MQKLIIFALVVLCVGSEA (SEQ ID NO:432)), lisozima humana (LYZ1) (MKALIVLGLVLLSVTVQG (SEQ ID NO:433)), receptor de activina de tipo 1 (MVDGVMILPVLIMIALPSPS (SEQ iD NO:434)), receptor de activina de tipo II (MGAAAKLAFAVFLISCSSG (SEQ ID NO:435)), proteína de unión a inmunoglobulina de P. pastoris (PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMllVVVPKAKPVRA (SEQ ID NO:436)), y conductor de la cadena ligera del anticuerpo humano 3D6 (MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID NO:437)). Ver Hashimoto et al., Protein Engineering, vol. 11 n.° 2, pp. 75-77, 1998; Oka et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., noviembre de 1999, 63 (11):1977-1983; Gellissen et al., FEm S Yeast Research, 5 (2005), 1079-1096; Ma et al., Hepatology, diciembre de 2005, 42(6):1355-1363; Raemaekers et al., Eur. J. Biochem., 1 de octubre de 1999, 265 (1):394-403; Koganesawa et al., Protein Eng. (2001), 14(9):705-710; Daly et al., Protein Expr. Purif., abril de 2006, 46(2):456-467; Damasceno et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007), 74:381-389; y Felgenhauer et al., Nucleic Acids Res., 25 de agosto de 1990, 18(16):4927. El complejo de múltiples subunidades también puede secretarse hacia el medio de cultivo sin estar fusionado o unido operativamente a una señal de secreción. Por ejemplo, se ha demostrado que algunos polipéptidos heterólogos se secretan hacia los medios de cultivo cuando se expresan en P. pastoris incluso sin estar fusionados o unidos a una señal de secreción. Además, el complejo de múltiples subunidades puede purificarse a partir de células huésped (lo que, por ejemplo, puede ser preferible si el complejo se secreta mal) usando métodos conocidos en la técnica.
Los medios o las células que comprenden un complejo de múltiples subunidades deseado pueden recuperarse del cultivo. Opcionalmente, las proteínas secretadas pueden purificarse. Por ejemplo, las células que comprenden un complejo de múltiples subunidades deseado se pueden lisar usando métodos mecánicos, químicos, enzimáticos y/u osmóticos (por ejemplo, congelación con nitrógeno líquido, usando un homogeneizador, esferoplastia, sonicación, agitación en presencia de esferas de vidrio, utilizando detergentes, etc.). El complejo de múltiples subunidades deseado se puede concentrar, filtrar, dializar, etc., usando métodos conocidos en la técnica. El complejo de múltiples subunidades deseado se puede purificar basándose, por ejemplo, en su masa molecular (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño), punto isoeléctrico (por ejemplo, enfoque isoeléctrico), movilidad electroforética (por ejemplo, electroforesis en gel), cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo, HPLC), carga (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico), afinidad (por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, unión a proteína A, proteína G y/o un epítopo al que se une el anticuerpo deseado) y/o estado de glicosilación (por ejemplo, detectado por afinidad de unión a lectina). Se pueden realizar múltiples etapas de purificación para obtener el nivel de pureza deseado. En una realización ejemplar, el complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina y puede purificarse usando afinidad de proteína A o proteína G, cromatografía de exclusión por tamaño y falta de unión a lectina (para eliminar las formas glicosiladas). Opcionalmente, se puede añadir un inhibidor de la proteasa A, tal como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación.
Los ácidos nucleicos se "unen operativamente" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una secuencia señal está operativamente unido al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia. Generalmente, "operativamente unido" significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un conductor secretor, contiguas y en un marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se puede lograr mediante conexión en sitios de restricción convenientes o, como alternativa, mediante un método de PCR/recombinación familiar para los expertos en la técnica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad CA). Si tales sitios no existen, pueden usarse adaptadores o conectores de oligonucleótidos sintéticos según la práctica convencional. Los ácidos nucleicos deseados (incluidos los ácidos nucleicos que comprenden secuencias unidas operativamente) también pueden producirse mediante síntesis química.
Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas cadena arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción de secuencias de ácido nucleico particulares con las que están operativamente unidos. Dichos promotores se dividen en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y reprimibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar niveles aumentados de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura.
El fragmento del promotor de levadura también puede actuar como sitio para la recombinación homóloga y la integración del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de la levadura; como alternativa, se usa un marcador seleccionable como sitio para la recombinación homóloga. La transformación de Pichia se describe en Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5:3376-3385.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio), promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por tiamina, promotor AOX1 (Cregg et al. (1989), Mol. Cell. Biol., 9:1316-1323); promotor ICL1 (Menéndez et al. (2003), Yeast, 20(13):1097-108); promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et al. (1997), Gene, 186(1):37-44); y el promotor FLD1 (Shen et al. (1998), Gene, 216(1):93-102). El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores CUP1, AOX y FLD1 son inducibles.
Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk y promotores quiméricos derivados de los mismos. Además, en la invención se pueden usar promotores que no sean de levadura, tales como promotores de mamíferos, de insecto, plantas, reptiles, anfibios, virales y aviares. Más típicamente, el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporciona una transcripción eficaz en sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés pueden producirse de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de ruptura específico en el extremo N-terminal de la proteína o polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser parte de la secuencia codificadora del polipéptido que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada preferiblemente es una secuencia que se reconoce y procesa a través de una de las vías convencionales disponibles dentro de la célula huésped. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha demostrado ser eficaz en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris.
Otras secuencias señal de levadura incluyen la secuencia señal del factor de apareamiento alfa, la secuencia señal de invertasa y las secuencias señal derivadas de otros polipéptidos de levadura secretados. Además, estas secuencias de péptidos señal pueden diseñarse para proporcionar una secreción mejorada en sistemas de expresión de levaduras diploides. Otras señales de secreción de interés también incluyen secuencias señal de mamíferos, que pueden ser heterólogas a la proteína que se secreta, o pueden ser una secuencia nativa de la proteína que se secreta. Las secuencias señal incluyen secuencias de pre-péptido y, en algunos casos, pueden incluir secuencias de pro-péptido. Muchas de estas secuencias señal son conocidas en la técnica, incluidas las secuencias señal que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias señal de la albúmina de suero humano, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana y similares. Por ejemplo, ver Hashimoto et al., Protein Eng., 11(2), 75 (1998); y Kobayashi et al., Therapeutic Apheresis, 2(4), 257 (1998).
La transcripción se puede incrementar insertando una secuencia activadora de la transcripción en el vector. Estos activadores son elementos de ADN que actúan en cis, generalmente de aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores de la transcripción son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado a 5' y 3' de la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia codificadora. El potenciador puede empalmarse en el vector de expresión en una posición 5' o 3' de la secuencia codificadora, pero preferiblemente se ubica en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles desde 3' hasta el codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de acoplamiento convencionales o métodos de PCR/recombinación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se adaptan y se vuelven a acoplar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o mediante métodos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de acoplamiento se usan para transformar las células huésped, y los transformantes exitosos son seleccionados por resistencia a antibióticos (por ejemplo, ampicilina o zeocina) cuando sea apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian.
Como alternativa a la restricción y acoplamiento de fragmentos, se pueden usar métodos de recombinación basados en sitios att y enzimas de recombinación para insertar secuencias de ADN en un vector. Tales métodos se describen, por ejemplo, en Landy (1989), Ann. Rev. Biochem., 58: 913-949, y son conocidos por los expertos en la técnica. Dichos métodos utilizan la recombinación de ADN intermolecular que está mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas por E. coli y lambda. La recombinación se produce entre sitios de unión (att) específicos en las moléculas de ADN que interactúan. Para obtener una descripción de los sitios att, consúltese Weisberg y Landy (1983), Site-specific recombination of bacteriophage lambda, en Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, Nueva York, Cold Spring Harbor Press), pp. 211 -250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se intercambian, de modo que, después de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas compuestas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede producirse entre ADN de cualquier topología.
Los sitios att pueden introducirse en una secuencia de interés acoplando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contiene sitios att B mediante el uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonado en un vector apropiado que contiene sitios att; y similares.
Genes monocistrónicos ypolicistrónicos. Un gen monocistrónico codifica un ARN que contiene la información genética para traducir solo una proteína. Un gen policistrónico codifica un ARNm que contiene la información genética para traducir más de una proteína. Las proteínas codificadas en un gen policistrónico pueden tener secuencias iguales o diferentes o una combinación de las mismas. Dicistrónico o bicistrónico se refiere a un gen policistrónico que codifica dos proteínas. Los genes policistrónicos incluyen opcionalmente uno o más elementos de sitio interno de entrada al ribosoma (“internal ribosome entry site”, IRES) para facilitar el inicio de la traducción independiente de casquete, que puede estar situado en una ubicación que puede dirigir la traducción de la región codificadora de la proteína corriente abajo independientemente de la estructura del casquete 5' unida al extremo 5' de la molécula de ARNm. Puede usarse cualquier secuencia de IRES conocida (por ejemplo, de origen viral, eucariota o artificial). Por ejemplo, se puede utilizar la secuencia IRES del virus de la parálisis del grillo en la región intergénica (IGR), como se describe en Thompson et al. (2001), PNAS, 98:12972-12977. Opcionalmente, la función de IRES puede potenciarse mediante alteración genética, por ejemplo, provocando la expresión constitutiva de eIF2 quinasa GCN2 o alterando dos genes iniciadores de ARNt (met) alterados (id.).
Plegamiento, como se usa en este documento, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, en la que las interacciones entre los restos aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, normalmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra- y/o intermoleculares formados por dos restos cisteína. Para proteínas y polipéptidos de origen natural o derivados y variantes de los mismos, el plegamiento adecuado es típicamente la disposición que da como resultado una actividad biológica óptima, y puede controlarse convenientemente mediante ensayos de actividad, por ejemplo, unión de ligandos, actividad enzimática, etc.
En algunos casos, por ejemplo, cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento apropiado de tales moléculas puede determinarse sobre la base de propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelado y similares.
El huésped de expresión se puede modificar adicionalmente mediante la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que mejoran el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir, foldasas, chaperonas, etc. Tales secuencias pueden expresarse de forma constitutiva o inducible en la célula huésped de levadura, usando vectores, marcadores , etc. como se conoce en la técnica. Preferiblemente, las secuencias, incluidos los elementos reguladores de la transcripción suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran de manera estable en el genoma de la levadura mediante una metodología dirigida.
Por ejemplo, la PDI eucariota no solo es un catalizador eficaz de la oxidación de la proteína cisteína y la isomerización del enlace disulfuro, sino que también exhibe actividad de chaperona. La coexpresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y similares. En una realización de la invención, el complejo de múltiples subunidades puede expresarse a partir de una cepa de levadura producida por apareamiento, en la que cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de las mismas.
Las expresiones "proteína deseada" o "proteína diana" se usan indistintamente y se refieren generalmente a una proteína heteróloga de múltiples subunidades, tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) o una porción de unión del mismo descrito en este documento.
El término "anticuerpo" incluye cualquier estructura molecular que contiene una cadena polipeptídica con una forma específica que se ajusta a un epítopo y lo reconoce, en la que una o más interacciones de unión no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, humana, de roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollo, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida según la invención son los conejos. Se han descrito numerosas secuencias codificadoras de anticuerpos; y otras pueden plantearse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios tales como scFv, cuerpos de camello, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos monocatenarios derivados de tiburones), inmunofármacos modulares pequeños (“small-modular immunopharmaceuticals”, SMIP) y fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', F(ab')2 y similares. Ver Streltsov V. A., etal., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci., noviembre de 2005, 14(11):2901-2909, publicación electrónica, 30 de septiembre de 2005; Greenberg A. S., et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature, 9 de marzo de 1995, 374(6518):168-173; Nuttall S. D., et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol. Immunol., agosto de 2001,38(4):313-326; Hamers-Casterman C., et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature, 3 de junio de 1993, 363(6428):446-448; Gill D. S., et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr. Opin. Biotechnol., diciembre de 2006, 17(6):653-658, publicación electrónica, 19 de octubre de 2006.
Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno mediante ingeniería genética. En esta técnica, al igual que con otros métodos, las células productoras de anticuerpos se sensibilizan al antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de células productoras de anticuerpos se usa como molde para producir ADNc usando amplificación por PCR. Se produce una biblioteca de vectores, cada uno de los cuales contiene un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que conserva la especificidad antigénica inicial, mediante la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificado en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca combinatoria combinando la biblioteca de genes de cadena pesada con la biblioteca de genes de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que coexpresan una cadena ligera y pesada (que se asemeja al fragmento Fab o al fragmento de unión al antígeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que portan estos genes se cotransfectan en una célula huésped. Cuando se induce la síntesis de genes de anticuerpos en el huésped transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se autoensamblan para producir anticuerpos activos que pueden detectarse mediante una la selección con el antígeno o inmunógeno.
Las secuencias codificadoras de anticuerpos de interés incluyen aquellas codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticas en secuencia a los ácidos nucleicos descritos, y variantes de las mismas. Los polipéptidos variantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos (aa). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, por ejemplo, para alterar un sitio de glicosilación o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante sustitución o deleción de uno o más restos cisteína que no son necesarios para la función. Las variantes pueden diseñarse para conservar una actividad biológica o tener una actividad biológica mejorada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, restos aminoácidos catalíticos, etc.). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en este documento, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos correspondientes a dominios funcionales. Se conocen técnicas para la mutagénesis in vitro de genes clonados. También se incluyen en la presente invención polipéptidos que se han modificado usando técnicas de biología molecular normales para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como agente terapéutico.
Los anticuerpos quiméricos se pueden preparar por medios recombinantes combinando las regiones variables de cadena ligera y pesada (VL y VH), obtenidas a partir de células productoras de anticuerpos de una especie, con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otra. Normalmente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedor o conejo y regiones constantes humanas, para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de tales anticuerpos quiméricos es bien conocida en la técnica y se puede lograr por medios convencionales (como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 5.624.659). Se contempla además que las regiones constantes humanas de los anticuerpos quiméricos de la invención puedan seleccionarse entre regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
Los anticuerpos humanizados se diseñan para contener dominios de inmunoglobulina aún más parecidos a los de tipo humano e incorporar solo las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado de animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal y ajustándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpos humanos. Aunque facialmente complejo, el proceso es sencillo en la práctica. Ver, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 6.187.287. Los métodos de humanización de anticuerpos se han descrito previamente en la patente de EE. UU. expedida n.° 7935340. En algunos casos, es necesaria una determinación de si se requieren restos de marco de conejo adicionales para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados seguirán requiriendo la retención de algunos restos de marco de conejo críticos para minimizar la pérdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar un solo aminoácido o múltiples aminoácidos de marco de las secuencias de la línea germinal humana de nuevo a los aminoácidos originales de conejo para tener la actividad deseada. Estos cambios se determinan experimentalmente para identificar qué restos de conejo son necesarios para conservar la afinidad y la actividad.
Además de las inmunoglobulinas completas (o sus homólogos recombinantes), se pueden sintetizar fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2 , u otros fragmentos). Se puede diseñar un "fragmento" o inmunoglobulinas mínimas utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención pueden producirse sintetizando una región de cadena ligera variable fusionada y una región de cadena pesada variable. También son de interés las combinaciones de anticuerpos, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades distintas de Fv. En otra realización de la invención, se incluyen los SMIP (“small molecule immunopharmaceuticals”, inmunofármacos de molécula pequeña), los anticuerpos de camello, los nanocuerpos y la IgNAR en los fragmentos de inmunoglobulina.
Las inmunoglobulinas y sus fragmentos se pueden modificar postraduccionalmente, por ejemplo, para añadir restos efectores, tales como conectores químicos, restos detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o restos de unión específica, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares, y se pueden utilizar en los métodos y composiciones de la presente invención. A continuación, se proporcionan ejemplos de moléculas efectoras adicionales.
Variante asociada al producto: Un producto distinto del producto deseado (por ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado) que está presente en una preparación del producto deseado y está relacionado con el producto deseado. Los ejemplos de variantes asociadas al producto incluyen péptidos truncados o alargados, productos que tienen una glicosilación diferente a la glicosilación deseada (por ejemplo, si se desea un producto aglicosilado, entonces cualquier producto glicosilado se consideraría una variante asociada al producto), complejos que tienen una estequiometría anómala, un ensamblaje inadecuado, enlaces disulfuro anómalos, plegamiento anómalo o incompleto, agregación, escisión por proteasa u otras anomalías. Los ejemplos de variantes asociadas al producto pueden presentar alteraciones en una o más de la masa molecular (por ejemplo, detectada por cromatografía de exclusión por tamaño), punto isoeléctrico (por ejemplo, detectado por enfoque isoeléctrico), movilidad electroforética (por ejemplo, detectada por electroforesis en gel), estado de fosforilación (por ejemplo, detectado por espectrometría de masas), proporción de carga a masa (por ejemplo, detectada por espectrometría de masas), masa o identidad de los fragmentos proteolíticos (por ejemplo, detectadas por espectrometría de masas o electroforesis en gel), hidrofobicidad (por ejemplo, detectada por HPLC), carga (por ejemplo, detectada por cromatografía de intercambio iónico), afinidad (por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, detectada por unión a proteína A, proteína G y/o un epítopo al que se une el anticuerpo deseado), y estado de glicosilación (por ejemplo, detectado por afinidad de unión a lectina). Cuando la proteína deseada es un anticuerpo, el término variante asociada al producto puede incluir una variante glicopesada y/o una especie de medio anticuerpo (descrita a continuación).
Las variantes asociadas al producto ejemplares incluyen formas variantes que contienen enlaces disulfuro aberrantes. Por ejemplo, la mayoría de las moléculas de anticuerpo IgG1 están estabilizadas por un total de 16 puentes disulfuro intracatenarios e intercatenarios, que estabilizan el plegamiento de los dominios IgG en cadenas pesadas y ligeras, mientras que los puentes disulfuro intercatenarios estabilizan la asociación entre cadenas pesadas y ligeras. Asimismo, otros tipos de anticuerpos contienen enlaces disulfuro intracatenarios e intercatenarios estabilizadores característicos. Además, algunos anticuerpos (incluidos Ab-A y Ab-B descritos en el presente documento) contienen enlaces disulfuro adicionales denominados enlaces disulfuro no canónicos. Por tanto, los enlaces disulfuro intercatenarios aberrantes pueden dar como resultado una estequiometría compleja anómala, debido a la ausencia de un enlace covalente estabilizador y/o enlaces disulfuro a subunidades adicionales. Además, los enlaces disulfuro aberrantes (ya sean intercatenarios o intracatenarios) pueden disminuir la estabilidad estructural del anticuerpo, lo que puede provocar una disminución de la actividad, una disminución de la estabilidad, una mayor propensión a formar agregados y/o una mayor inmunogenicidad. Las variantes asociadas al producto que contienen enlaces disulfuro aberrantes se pueden detectar de diversas formas, que incluyen SDS-PAGE desnaturalizante no reducida, electroforesis capilar, cIEX, espectrometría de masas (opcionalmente con modificación química para producir un desplazamiento de masa en cisteínas libres), cromatografía de exclusión por tamaño, HPLC, cambios en la dispersión de la luz y cualquier otro método adecuado conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, The Protein Protocols Handbook, 2002, parte V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259-169-8:581.
Especie de medio anticuerpo, medio anticuerpo, o H1L1 se refiere a un complejo proteico que incluye una única cadena de anticuerpo pesada y una única cadena de anticuerpo ligera, pero que carece de un enlace covalente a una segunda cadena de anticuerpo pesada y ligera. Dos medio anticuerpos pueden permanecer asociados de forma no covalente en algunas condiciones (lo que puede producir un comportamiento similar a un anticuerpo completo, por ejemplo, un peso molecular aparente determinado por cromatografía de exclusión por tamaño). De modo similar, H2L1 se refiere a un complejo proteico que incluye dos cadenas pesadas de anticuerpo y una sola cadena ligera de anticuerpo, pero que carece de un enlace covalente a una segunda cadena ligera de anticuerpos; estos complejos también pueden asociarse de forma no covalente con otra cadena ligera de anticuerpo (y, de forma similar, producir un comportamiento similar a un anticuerpo completo). Al igual que los anticuerpos completos, las especies de medio anticuerpo y las especies H2L1 pueden disociarse en condiciones reductoras en cadenas ligeras y pesadas individuales. La especie de medio anticuerpo y la especie H2L1 se pueden detectar en un gel de SDS-PAGE no reducido como una especie que migra a un peso molecular aparente más bajo que el anticuerpo completo, por ejemplo, H1L1 migra a aproximadamente la mitad del peso molecular aparente del anticuerpo completo (por ejemplo, aproximadamente 75 kDa).
Variante glico-pesada se refiere a una variante asociada al producto glicosilada que a veces está presente en preparaciones de anticuerpos y que contiene al menos una secuencia Fc parcial. La variante gluco-pesada se caracteriza por una disminución de la movilidad electroforética observable por SDS-PAGE (en relación con una cadena pesada normal), afinidad de unión a lectina, unión a un anticuerpo anti-Fc, y un peso molecular aparente más alto de complejos de anticuerpos que contienen la variante gluco-pesada determinado por cromatografía de exclusión por tamaño. Ver solicitud provisional de EE. UU. n.° de serie 61/525.307 (n.° de expediente de abogado 67858.730200), presentada el 31 de agosto de 2011.
La expresión "levadura poliploide que expresa o expresa de manera estable un polipéptido heterólogo secretado deseado durante un tiempo prolongado" se refiere a un cultivo de levaduras que secreta dicho polipéptido durante al menos varios días a una semana, más preferiblemente al menos un mes, aún más preferiblemente al menos 1-6 meses, e incluso más preferiblemente durante más de un año a niveles de expresión umbral, típicamente al menos 50-500 mg/litro (después de aproximadamente 90 horas en cultivo) y preferiblemente un nivel sustancialmente mayor.
La expresión "cultivo de levadura poliploidal que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante" se refiere a cultivos que de manera estable o durante períodos prolongados secretan al menos al menos 50-500 mg/litro, y más preferiblemente 500-1000 mg/litro o más.
Una secuencia polinucleotídica "corresponde" a una secuencia polipeptídica si la traducción de la secuencia polinucleotídica según el código genético produce la secuencia polipeptídica (es decir, la secuencia polinucleotídica "codifica" la secuencia polipeptídica), y una secuencia polinucleotídica "corresponde" a otra secuencia polinucleotídica si las dos secuencias codifican la misma secuencia polipeptídica.
Una región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra en asociación con la molécula más grande en la naturaleza. Por tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, el gen normalmente estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el genoma del organismo de origen. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en la que la secuencia de codificación en sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia codificadora genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). Las variaciones alélicas o los acontecimientos mutacionales que ocurren naturalmente no dan lugar a una región heteróloga de ADN como se define en el presente documento.
Una "secuencia codificadora" es una secuencia de codones dentro de marco que (teniendo en cuenta el código genético) se corresponden o codifican una secuencia de proteína o péptido. Dos secuencias codificadoras se corresponden entre sí si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificadora en asociación con secuencias reguladoras apropiadas puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se ubicarán en 3' con respecto a la secuencia codificadora. Una "secuencia de promotor” es una región reguladora de ADN capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora cadena abajo (dirección 3'). Las secuencias de promotor contienen típicamente sitios adicionales para la unión de moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan a la transcripción de la secuencia codificadora. Una secuencia codificadora está "bajo el control" de la secuencia promotora u "operativamente unida" al promotor cuando la ARN polimerasa se une a la secuencia de promotor en una célula y transcribe la secuencia codificadora en ARNm, que luego se traduce a la proteína codificada por la secuencia codificadora.
Los vectores se utilizan para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteína, en un organismo o célula huésped. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas (para polipéptidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento polinucleotídico para provocar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptidos por una célula huésped apropiada. Por lo general, esto significa un promotor para unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción del ARNm, así como sitios de unión al ribosoma y señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm a uno o más polipéptidos. La incorporación de una secuencia polinucleotídica en un vector de expresión en el sitio apropiado y en el marco de lectura correcto, seguida de la transformación de una célula huésped apropiada por el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia polinucleotídica.
La "amplificación" de secuencias polinucleotídicas es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico particular. La secuencia amplificada suele estar en forma de ADN. En los siguientes artículos de revistas se describen diversas técnicas para llevar a cabo dicha amplificación: Van Brunt, 1990, Bio/Technol., 8(4): 291-294; y Gill y Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, marzo de 2008, 27(3):224-243. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácidos nucleicos, y el uso de la PCR en la presente debe considerarse un ejemplo de otras técnicas de amplificación adecuadas.
La estructura general de los anticuerpos en la mayoría de los vertebrados (incluidos los mamíferos) ahora se comprende bien (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci. 190:5 (1971)). Los anticuerpos convencionales consisten en dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons (la "cadena ligera") y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en "Y", en la que las cadenas ligeras rodean las cadenas pesadas comenzando por la boca de la configuración "Y". La parte de "rama" de la configuración "Y" se denomina región Fab; la parte de tallo de la configuración "Y" se denomina región Fc. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N-terminal en la parte superior de la configuración en "Y" hasta el extremo C-terminal en la parte inferior de cada cadena. El extremo N-terminal posee la región variable que tiene especificidad por el antígeno que lo suscitó, y tiene aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, existiendo ligeras variaciones entre la cadena ligera y pesada y de anticuerpo a anticuerpo.
La región variable está unida en cada cadena a una región constante que extiende la longitud restante de la cadena y que, dentro de una clase particular de anticuerpo, no varía con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antígeno que lo suscitó). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de la molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, correspondientes a las regiones constantes de cadena pesada gamma, mu, alfa, delta y épsilon). La clase o región constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluida la activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a ed., pp.
413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)) y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp. 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S. et al., Immunology, 48:187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el que reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Cada clase de cadena pesada se puede emparejar con la cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí mediante enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas o por células B.
La expresión "región variable" o "VR" se refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas ligera y pesada en un anticuerpo que están involucrados directamente en la unión del anticuerpo al antígeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en el otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
Las expresiones "región determinante de la complementariedad", "región hipervariable" o el término "CDR" se refieren a una o más de las regiones determinantes de la complementariedad o hipervariables (CDR) que se encuentran en las regiones variables de las cadenas ligera o pesada de un anticuerpo (ver Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institututes of Health, Bethesda, Maryland, (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables definidas por Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E., et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de Ee . UU., 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)). Las CDR de cada cadena se mantienen muy próximas por regiones marco y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos seleccionados que se han descrito como las regiones determinantes de la selectividad (SDR) que representan los restos de contacto críticos utilizados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
Las expresiones "región de marco" o "FR" se refieren a una o más de las regiones de marco dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo (ver Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institututes of Health, Bethesda, Maryland, (1987)). Estas expresiones incluyen aquellas regiones de secuencia de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo.
Anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión de los mismos que tienen actividad de unión a NGF
Anticuerpo Ab1
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor utilizando el anticuerpo Ab1 o fragmentos del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab1, por ejemplo, como se indica a continuación, solo o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 y/o inhibe o previene el dolor. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGV PSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVWKR (SEQ ID
NO: 1).
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGV PSRFRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVWKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2).
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVI
TSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 3).
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVI
TSIGSTVYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQ
GTLVTV S S ASTKGPS VFPLAPS SKSTSGGT AALGCLVKD YFPEP VTVS WNSG ALTSG VHT
FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQY ASTYR W S VLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ
VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:5; SeQ ID NO:6; y SEQ ID NO:7 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada y ligera variables y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o está asociado con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que el anticuerpo es un fragmento que tiene especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la invención comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la invención comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; y SEQ ID NO:7 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2.
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen fragmentos que tienen especificidad de unión a NGF que comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:8; SeQ ID nO:9; y SEQ ID NO:10 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; y SEQ ID NO:7) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:9; y SEQ ID NO:10) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico es Ab1, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:2 y SeQ ID NO:4, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para su uso en la presente comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab1. Con respecto al anticuerpo Ab1, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:1 y/o SEQ ID NO:3 en dicho Fab, al mismo tiempo que se mantiene la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab1. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab1 o sus fragmentos Fab, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tales como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es el anticuerpo Ab2 o fragmentos del mismo, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab2, por ejemplo como se indica a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVnTCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVP
SRPSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:
II) .
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLS AS VGDRVTITCQ ASQNIYSNLAWY QQKPGBCAPKLLIY GASNLDAGVP SRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas al dolor y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTV YASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGT LVTVSS (SEQ ID NO: 13).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTV Y AS S AKGRFTISRDN SKNTL YLQMN SLRAEDTAVYY C ARGYDD YDEMTYFNIWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SEQ ID NO:17 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; y SEQ ID NO:20 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:11 o SEQ ID NO:12. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:13 o SEQ ID NO:14.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden opcionalmente o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SEQ ID NO:17 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; y SEQ ID NO:20 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:15; SEQ ID NO:16; y SEQ ID NO:17) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:18; SEQ ID NO:19; y SEQ ID NO:20) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es opcionalmente Ab2, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:14 y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF o un Fab u otro fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab2. Con respecto al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:11 y/o SEQ ID NO:13 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab2. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab2 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamífero, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab3 o fragmentos. del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab3, por ejemplo, como se indica a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGV PSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVWKR (SEQ ID
NO: 21).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos, o el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGV PSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVWKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 22).
La descripción incluye además anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEY1GITWSAGTYYAS WAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSrYDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID
NO: 23).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYAS WAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS WTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).
La descripción contempla además anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:21 o SEQ ID NO:22. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:23 o SEQ ID NO:24.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de Se Q ID NO:24.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:25; SEQ ID NO:26; y SEQ ID NO:27) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29; y SEQ ID NO:30) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab3, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:22 y SEQ ID NO:24, y que tiene al menos al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab3. Con respecto al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:21 y/o SEQ ID NO:23 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF. En un ejemplo opcional de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3. En otra realización de la invención, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab3 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es el anticuerpo Ab4 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab4, por ejemplo, como se indica a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75 y/o para prevenir o tratar eficazmente el dolor. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLI
YDASNLPSGVPSRFSGSGSGTEFTLTJSSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEI KR (SEQ ID NO: 31).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSG VPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 32).
La descripción incluye además anticuerpos humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a nGf y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYY
ASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 33).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYY
ASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYA
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).
La descripción contempla además anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SEQ ID NO:37 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:31 o SEQ ID NO:32. En otra realización de la invención, los fragmentos de anticuerpos de la invención comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:33 o SEQ ID NO:34.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SEQ ID NO:37 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:34.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:35; SEQ ID NO:36; y SEQ ID NO:37) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39; y SEQ ID NO:40) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33.
En un ejemplo particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab4, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:32 y SEQ ID NO:34, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab14. Con respecto al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:31 y/o SEQ ID NO:33 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab4. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab4 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen opcionalmente Ab5 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab5, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVP SRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVWKR (SEQ ID
NO: 41).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVP SRFKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVWKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 42).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYA SWARGRFTISKTSTTVDLKJTSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 43).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYA SWARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCVWDVSHEDPEYKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
ASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKGKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SEQ ID NO:47 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden opcionalmente o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:41 o SEQ ID NO:42. En otro ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:43 o SEQ ID NO:44.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SEQ ID NO:47 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden opcionalmente o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:45; SEQ ID NO:46; y SEQ ID NO:47) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:48; SEQ ID NO:49; y SEQ ID NO:50) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico opcionalmente incluido para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab5, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:42 y SEQ ID NO:44, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab5. Con respecto al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:41 y/o SEQ ID NO:43 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab5. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab5 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab6 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab6, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPS RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:
51).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRYTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPS RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 52).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNT WYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAYYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 53).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNT WYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:52. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:54.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab6, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:52 y SEQ ID NO:54, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab6. Con respecto al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ Id NO:51 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53. Este ejemplo opcional de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:51 y/o SEQ ID NO:53 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab6. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab6 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab7 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab7, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ADWMTQTPASVSQPVGGTVT1KCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGV
PSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEWVKR (SEQ
ID NO: 61).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ADWMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGV
PSRFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVWKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGY1DTDTSAYYA
SWVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 63).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYA
SWVKGRFT1SRTSTTVDLKJTSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS
GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
ASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SEQ ID NO:67 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:61 o SEQ ID NO:62. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:63 o SEQ ID NO:64.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SEQ ID NO:67 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:63; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:66; y SEQ ID NO:67) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:68; SEQ ID NO:69; y SEQ ID NO:70) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:63.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab7, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:62 y SEQ ID NO:64, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En otro ejemplo particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab7. Con respecto al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:63. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:61 y/o SEQ ID NO:63 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF. En un ejemplo opcional de la descripción, descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab7. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab7 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab8 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab8, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 71).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPS RFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 72).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYY
ASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTL
VTVSS (SEQ ID NO: 73).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYY
ASSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTL
VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA
VLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAP
ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYYDGVEVHNAKTKP
REEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SEQ ID NO:77 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción, o fragmentos de los mismos, comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:71 o SEQ ID NO:72. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:73 o SEQ ID NO:74.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SEQ ID NO:77 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:75; SEQ ID NO:76; y SEQ ID NO:77) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:78; SEQ ID NO:79; y SEQ ID NO:80) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab8, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:74, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab8 . Esta realización de la invención contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:71 y/o SEQ ID NO:73 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab8. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab8 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab9 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab9, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo opcional, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVP SRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEWYKR (SEQ ID
NO: 81).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASEN1GSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVP
SRFKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVWKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGN SQES VTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 82).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYA SWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 83).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYA
SWAKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKG
PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL
SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY
RWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT
KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ
QGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84),
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SEQ ID NO:87 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:81 o SEQ ID NO:82. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la invención comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:83 o SEQ ID NO:84.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SEQ ID NO:87 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:83; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:85; SEQ ID NO:86; y SEQ ID NO:87) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:88; SEQ ID NO:89; y SEQ ID NO:90) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:83.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab9, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:82 y SEQ ID NO:84, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID nO:83 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab9 . Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:81 y/o SEQ ID NO:83 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab9. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab9 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab10 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab10, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de n Gf con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPS RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 91).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEN1GSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPS
RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNPYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL5
STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 92).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAY YASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 93).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAY YASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPYNYYLDIWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SEQ ID NO:97 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; y SEQ ID NO:100 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:91 o SEQ ID NO:92. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:93 o SEQ ID NO:94.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden opcionalmente o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SEQ ID NO:97 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:98; SEQ ID nO:99; y SEQ ID NO:100 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:95; SEQ ID NO:96; y SEQ ID NO:97) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; y SEQ ID NO:100) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab10, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:92 y SEQ ID NO:94, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab10, el fragmento Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente. que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab10. Este ejemplo de la descripción contempla además opcionalmente adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:91 y/o SEQ ID NO:93 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab10 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solo o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab11 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab11, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo opcional, la descripción incluye anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSS RFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVWKR (SEQ ID NO:
101 ).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNrVTNLA WY QQKPGQPPKLLIY GASTLASGVS S
RFKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEWVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 102).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYA TWAKGRJFTISKTSTTVDLBCITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 103).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYA T WAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDT ATYFC ARSLY AGPN AGIGPFNIWGQGTLVTVS S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY ASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:104, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden opcionalmente o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:101 o SEQ ID NO:102. En otro ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:103 o SEQ ID NO:104.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:104.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:103; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; y SEQ ID NO:107) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; y SEQ ID NO:110) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:103.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab11, que comprende o, como alternativa, consiste en SeQ ID NO:102 y SEQ ID NO:104, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab11, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:103 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab11. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:101 y/o SEQ ID NO:103 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab11. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab11 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab12 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab12, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de nGf con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:
111).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AFQMTQSPSSLSASVGDRVTrrCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVP
SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKYDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGL1SYDGNT
YYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQG TLVTVSS (SEQ ID NO: 113).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNT YYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:114, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:111 o SEQ ID NO:112. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:113 o SEQ ID NO:114.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de Se Q ID NO:114.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:115; SEQ ID NO:116; y SEQ ID NO:117) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:118; SEQ ID NO:119; y SEQ ID NO:120) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab12, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:112 y SEQ ID NO:114, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab12, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab12. Este ejemplo opcional de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:111 y/o SEQ ID NO:113 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab12. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab12 o fragmentos Fab del mismo, para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor mediante la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen Ab13 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab13, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de n Gf con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
VPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSS5DNAFGGGTEVVVKR (SEQ
ID NO: 121).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASG VPSRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 122).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNY
ASWAKGRFTISKTSTTVDLNYISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 123).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNY
ASWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSAS
TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL
YSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVW DV SHEDPEVKFN WYVDG VEVHNAKTKPREEQ YA
STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRE
EMTKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:124, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En el ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:121 o SEQ ID NO:122. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:123 o SEQ ID NO:124.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:124.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:123; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:125; SEQ ID NO:126; y SEQ ID NO:127) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:128; SEQ ID NO:129; y SEQ ID NO:130) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:123.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab13, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:122 y SEQ ID NO:124, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab13, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:123 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab13. Este ejemplo opcional de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:121 y/o SEQ ID NO:123 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab13. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab13 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab14 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab14, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo opcional, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 131).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKJHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGD1YFSNEET
NYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLV TYSS (SEQ ID NO: 133).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEET
NYASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGEDMWGPGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139; y SEQ ID NO:140 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:134, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:131 o SEQ ID NO:132. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:133 o SEQ ID NO:134.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas al dolor comprenden opcionalmente, o como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139; y SEQ ID NO:140 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:134.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:135; SEQ ID NO:136; y SEQ ID NO:137) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:138; SEQ ID NO:139; y SEQ ID NO:140) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab14, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:132 y SEQ ID NO:134, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab14, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab14. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:131 y/o SEQ ID NO:133 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab14. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab14 o fragmentos Fab del mismo, para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor mediante la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab15
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab15 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab15, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSYYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSG
VPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEWVKR (SEQ
ID NO: 141).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
VPSRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVWKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST
YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 142).
La descripción incluye además anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATW
AKGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSS (SEQ ID
NO: 143).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATW
AKGRETISKTSTTVDLQrrSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSSASTKGPSV
FPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP
KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN
QVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 144).
La descripción contempla además anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:145; SEQ ID NO:146; y SEQ ID NO:147 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:148; SEQ ID NO:149; y SEQ ID NO:150 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:144, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:141 o SEQ ID NO:142. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:143 o SEQ ID NO:144.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:145; SEQ ID NO:146; y SEQ ID NO:147 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:148; SEQ ID NO:149; y SEQ ID NO:150 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:143 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:144.
La descripción también contempla fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:143; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:145; SEQ ID NO:146; y SEQ ID NO:147) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:148; SEQ ID NO:149; y SEQ ID NO:150) de la región de cadena pesada variable de SeQ ID NO:143.
En un ejemplo particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab15, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:142 y SeQ ID NO:144, y que tiene al menos al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab15, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:143 o comprende otro Fab que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab15. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SeQ ID NO:141 y/o SEQ ID NO:143 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab15. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, tales como Ab15 o sus fragmentos Fab, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab16
La descripción contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab16 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab16, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQN1GNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPK
RFSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEWVKR (SEQ ID
NO: 151).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPK RFSGSRSGTQFTLT1SDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVWKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 152).
La descripción incluye además anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYAS WAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFN1WGPGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 153).
La descripción también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIG1IGS1GTTYYAS
WAKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY ASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNWSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 154).
La descripción contempla además anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:155; SEQ ID NO:156; y SEQ ID NO:157 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:158; SEQ ID NO:159; y SEQ ID NO:160 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:151 o SEQ ID NO:152. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:153 o SEQ ID NO:154.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:155; SEQ ID NO:156; y SEQ ID NO:157 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152.
En un ejemplo adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:158; SEQ ID NO:159; y SEQ ID nO:160 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154.
La descripción también contempla fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:153; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:155; SEQ ID NO:156; y SEQ ID NO:157) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:158; SEQ ID NO:159; y SEQ ID NO:160) de la región de cadena pesada variable de SeQ ID NO:153.
En un ejemplo particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab16, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:152 y SEQ ID NO:154, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab16, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:153 o comprende otro Fab u otro fragmento de anticuerpo bivalente o monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab16. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:151 y/o SEQ ID NO:153 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab16. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, tales como Ab16 o sus fragmentos Fab, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab17
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en el que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab17 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab17, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPS RFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEWVKR (SEQ id
NO: 161).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQT1SNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPS
RFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVWKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 162).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYA SWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSS (SEQ
ID NO: 163).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYA SWAKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAST YRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSD1AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 164).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:165; SEQ ID NO:166; y SEQ ID NO:167 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:168; SEQ ID NO:169; y SEQ ID NO:170 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:163 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:164, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadenas pesadas y ligeras expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:161 o SEQ ID NO:162. En otro ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:163 o SEQ ID NO:164.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:165; SEQ ID NO:166; y SEQ ID NO:167 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:168; SEQ ID NO:169; y SEQ ID NO:170 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:163 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:164.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a nGf comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:163; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:165; SEQ ID NO:166; y SEQ ID NO:167) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:168; SEQ ID NO:169; y SEQ ID NO:170) de la región de cadena pesada variable de SeQ ID NO:163.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab17, que comprende o, como alternativa, consiste en SeQ ID NO:162 y SEQ ID NO:164, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab17, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:163 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente o bivalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab15. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:161 y/o SeQ ID NO:163 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab17. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab17 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab18
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab18 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab18, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de nGf con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPS
RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 171).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 172).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTY YASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 173).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTY YASSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 174).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:175; SEQ ID NO:176; y SEQ ID NO:177 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:178; SEQ ID NO:179; y SEQ ID NO:180 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:173 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:174, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:171 o SEQ ID NO:172. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:173 o SEQ ID NO:174.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:175; SEQ ID NO:176; y SEQ ID NO:177 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:178; SEQ ID NO:179; y SEQ ID NO:180 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:173 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:174.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:173; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:175; SEQ ID NO:176; y SEQ ID NO:177) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:178; SEQ ID NO:179; y SEQ ID NO:180) de la región de cadena pesada variable de SeQ ID NO:173.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab18, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:172 y SEQ ID NO:174, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En otro ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab18, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:173 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab18 . Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SeQ ID NO:171 y/o SEQ ID NO:173 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab18. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab18 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab19
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab19 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab19, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de nGf con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNYYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASG
VPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVWKR (SEQ ID
NO: 181).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASG
VPSRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVWKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 182).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETN
YATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 183).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWYRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETN
YATWAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSA
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG
LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY
ASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNYFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 184).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:185; SEQ ID NO:186; y SEQ ID NO:187 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:188; SEQ ID NO:189; y SEQ ID NO:190 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:184, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:181 o SEQ ID NO:182. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:183 o SEQ ID NO:184.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:185; SEQ ID NO:186; y SEQ ID NO:187 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:188; SEQ ID NO:189; y SEQ ID NO:190 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:184.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:185; SEQ ID NO:186; y SEQ ID NO:187) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:188; SEQ ID NO:189; y SEQ ID NO:190) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab19, que comprende o, como alternativa, consiste en Se Q ID NO:182 y SEQ ID NO:184, y que tiene al menos una de las actividades biológicas expuestas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab19, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab19 . Este ejemplo opcional de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:181 y/o SEQ ejemplo de la descripción se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab19. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF, tales como Ab19 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab20
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab20 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab20, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de n Gf con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID
NO: 191).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASG
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 192).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEET
NYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVELAIDMWGQGTLV
TVSS (SEQ ID NO: 193).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEET
NYATSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLV
TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTYSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNYNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTBTCPPCPAPE
LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTL
PPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK. (SEQ ID NO: 194).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:195; SEQ ID NO:196; y SEQ ID NO:197 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:198; SEQ ID NO:199; y SEQ ID NO:200 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:194, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:191 o SEQ ID NO:192. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:193 o SEQ ID NO:194.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:195; SEQ ID NO:196; y SEQ ID NO:197 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:198; SEQ ID NO:199; y SEQ ID NO:200 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:194.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:195; SEQ ID NO:196; y SEQ ID NO:197) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:198; SEQ ID NO:199; y SEQ ID NO:200) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab20, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:192 y SEQ ID NO:194, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab20, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193. Esta realización de la invención contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:191 y/o SEQ ID NO:193 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción, descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab20. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, tales como Ab20 o fragmentos Fab del mismo, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab21
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados al dolor, solos o en asociación con otro agente activo, por ejemplo, un AINE o analgésico opioide, en los que los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF, en los que el anticuerpo es Ab21 o fragmentos del mismo, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o un epítopo solapante, que Ab5, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVT1TCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLÍYDASTLESGVPS
RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:
51).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPS RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 401).
La descripción incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada variable que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNT WYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGT LVTVSS (SEQ ID NO: 53).
La descripción también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNT WYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWY\?'DGVEVHNAK.TK
PREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 402).
La descripción además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los anticuerpos de la descripción o fragmentos de los mismos comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:401. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:402.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Ab21, que comprende o, como alternativa, consiste en SEQ ID NO:401 y SEQ ID NO:402, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en este documento.
En un ejemplo opcional adicional particularmente preferido de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab21, el fragmento Fab incluye la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 y la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Ab5. Este ejemplo de la descripción contempla además adiciones, deleciones y variantes de SEQ ID NO:51 y/o SEQ ID NO:53 en dicho Fab, al mismo tiempo que se conserva la especificidad de unión a NGF.
En un ejemplo opcional de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab21. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, tales como Ab21 o sus fragmentos Fab, pueden producirse mediante expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Fragmento de anticuerpo Fab1
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor usando el fragmento de anticuerpo Fab1 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye opcionalmente fragmentos de anticuerpos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPS RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 405).
La descripción incluye además opcionalmente fragmentos de anticuerpos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWYGIIGRNGNT WYASS ARGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYY C ARGY GRSV AYYVFNIWGPGT LVTVSS ASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEP VT VS WNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (SEQ ID
NO: 406).
La descripción contempla además opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:405 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:406, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo opcional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena ligera variable y pesada variable, y las secuencias de cadenas pesadas y ligeras expuestas anteriormente, incluidas todas ellas.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:405. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:406.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:5 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:405.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:406.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el fragmento de anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Fab1, que comprende SEQ ID nO:405 y SEQ ID NO:406, u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Fab1, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, el fragmento de anticuerpo Fab1 puede producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab21.
Fragmento de anticuerpo Fab2
La descripción contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor usando el fragmento de anticuerpo Fab2 o fragmentos del mismo, por ejemplo, como se expone a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En un ejemplo, la descripción incluye fragmentos de anticuerpos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena ligera que comprende la secuencia que se indica a continuación:
RFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 407).
La descripción incluye además opcionalmente fragmentos de anticuerpos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF y que poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se indica a continuación:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNT WYASSARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (SEQ ID
NO: 408).
La descripción contempla además opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprenden una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:407 y/o una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SeQ ID NO:408, o combinaciones de estas secuencias polipeptídicas. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable, y las secuencias de cadena pesada y ligera expuestas anteriormente, incluyendo todas de ellos.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la invención para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:51 o SEQ ID NO:407. En otro ejemplo de la descripción, los fragmentos de anticuerpos de la descripción para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO:53 o SEQ ID NO:408.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:407.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60 que corresponden a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:408.
La descripción también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los fragmentos de los anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes fragmentos de anticuerpos: la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53; las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:55; SEQ ID NO:56; y SEQ ID NO:57) de la región de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51; y las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:58; SEQ ID NO:59; y SEQ ID NO:60) de la región de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53.
En un ejemplo opcional particularmente preferido de la descripción, el fragmento de anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor es Fab2, que comprende SEQ ID n O:407 y SEQ ID NO:408, u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo, o a un epítopo solapante, que Fab2, y que tiene al menos una de las actividades biológicas indicadas en el presente documento.
En otro ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante la expresión en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción, el fragmento de anticuerpo Fab2 puede producirse mediante expresión en Pichia pastoris usando los protocolos establecidos en este documento en los ejemplos.
En otro ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden estar presentes en una o más de las siguientes formas no limitantes: Fab, Fab', F(ab')2 , Fv y formas de anticuerpo Fv monocatenario. En un ejemplo preferido, los anticuerpos anti-NGF descritos en el presente documento comprenden además la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia que se indica a continuación:
VAAPSVFÍFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ
ID NO; 412).
En otro ejemplo opcional preferido, los anticuerpos anti-NGF descritos en el presente documento para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor comprenden además la secuencia polipeptídica de cadena pesada constante gamma-1 que comprende la secuencia que se indica a continuación:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK.DYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCP
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYASTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR
EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 413).
En otro ejemplo opcional, la descripción contempla un anticuerpo anti-NGF aislado para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que comprende una secuencia polipeptídica de Vh seleccionada de: SEQ ID NO:3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, o 402, o una variante de la misma; y además comprende una secuencia polipeptídica de Vl seleccionada de: SEQ ID NO:1, 11,21,31,41,51, 61,71,81,91, 101, 111, 121,131,141, 151, 161, 171, 181,191, o 401, o una variante de la misma, en las que uno o más de los restos de marco (restos de FR) en dicho polipéptido de Vh o Vl se ha sustituido por otro resto aminoácido dando como resultado un anticuerpo anti-NGF que se une específicamente a NGF. La descripción contempla formas humanizadas y quiméricas de estos anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fc derivado de las regiones constantes IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En un ejemplo de la descripción, los anticuerpos o los polipéptidos de Vh o Vl se originan o se seleccionan de una o más poblaciones de células B de conejo antes del inicio del proceso de humanización al que se hace referencia en este documento.
En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF y sus fragmentos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor no tienen especificidad de unión a p75 o T rkA. En un ejemplo adicional de la descripción, se contemplan métodos para tratar el dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de los mismos para inhibir la asociación de NGF con p75 y/o TrkA. En otro ejemplo de la descripción, se contemplan métodos para tratar el dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de los mismos para inhibir la asociación de NGF con TrkA y/o multímeros del mismo y/o antagonizar sus efectos biológicos. En otro ejemplo de la descripción, se contemplan métodos para tratar el dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de los mismos para inhibir la asociación de NGF con p75 y/o multímeros del mismo y la asociación de NGF con TrkA y/o multímeros del mismo, y antagonizar los efectos biológicos de p75 y TrkA.
Como se indicó anteriormente, los anticuerpos y los fragmentos de los mismos se pueden modificar postraduccionalmente para añadir restos efectores, tales como conectores químicos, restos detectables, tales como, por ejemplo, tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos y restos quimioluminiscentes, o restos funcionales, tales como, por ejemplo, estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radiactivos.
Con respecto a los restos detectables, otros ejemplos de enzimas incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Otros ejemplos de materiales fluorescentes incluyen, pero no se limitan a rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Otros ejemplos de restos quimioluminiscentes incluyen, pero no se limitan a luminol. Otros ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen, pero no se limitan a luciferina y aequorina. Otros ejemplos de materiales radiactivos incluyen, pero no se limitan a yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fósforo 32 (32P).
Con respecto a los restos funcionales, los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina; agentes alquilantes, tales como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclotosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cisdiclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina (adriamicina), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos, tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricina, exotoxina de Pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Otros agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos, tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Pueden conjugarse enzimas tóxicas de plantas y bacterias, tales como ricina, toxina diftérica y toxina de Pseudomonas, con los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión de los mismos, para generar reactivos de destrucción específicos del tipo celular (Youle etal., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:5483 (1980); Gilliland et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:4539 (1980); Krolick et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas, como describe Goldenberg en la patente de EE. UU. n.° 6.653.104. Los ejemplos de la descripción también se refieren a radioinmunoconjugados en los que un radionúclido que emite partículas alfa o beta está acoplado de forma estable al anticuerpo, o fragmentos de unión del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejo. Dichos radionucleidos incluyen emisores beta, tales como fósforo-32 (32P), escandio-47 (47Sc), cobre-67 (67Cu), balio-67 (67Ga), itrio-88 (88Y), itrio-90 (90Y), yodo-125 (125I), yodo-131 (131I), samario-153 (153Sm), lutecio-177 (177Lu), renio-186 (186Re) o renio-188 (188Re) y emisores alfa, tales como astato-211 (211At), plomo-212 (212Pb), bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o actinio-225 (225Ac).
Otros ejemplos de materiales radiactivos incluyen, pero no se limitan a yodo 125 (125I), carbono 14 (14C), azufre 35 (35S), tritio (3H) y fósforo 32 (32P).
Con respecto a los restos funcionales, los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil descarbazina; agentes alquilantes, tales como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclotosfamida, mecloretamina, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cisdiclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina (adriamicina), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, caliqueamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos, tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricina, exotoxina de Pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1 deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,P'-(DDD)), interferones y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Otros agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos, tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, caliqueamicina, doxorubicina, 5-fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Pueden conjugarse enzimas tóxicas de plantas y bacterias, tales como ricina, toxina diftérica y toxina de Pseudomonas, con los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión de los mismos, para generar reactivos de destrucción específicos del tipo celular (Youle etal., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:5483 (1 9 8 0 ); Gilliland et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:4539 (1980); Krolick et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas, como describe Goldenberg en la patente de EE. UU. n.° 6.653.104. Los ejemplos de la descripción también se refieren a radioinmunoconjugados, en los que un radionúclido que emite partículas alfa o beta está acoplado de forma estable al anticuerpo, o fragmentos de unión del mismo, con o sin el uso de un agente formador de complejo. Dichos radionucleidos incluyen emisores beta, tales como fósforo-32 (32P), escandio-47 (47Sc), cobre-67 (67Cu), galio-67 (67Ga), itrio-88 (88Y), itrio-90 (90Y), yodo-125 (125I), yodo-131 (131I), samario-153 (153Sm), lutecio-177 (177Lu), renio-186 (186Re) o renio-188 (188Re) y emisores alfa, tales como astato-211 (211At), plomo-212 (212Pb), bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o actinio-225 (225Ac).
Se conocen en la técnica métodos para conjugar un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo a un resto detectable y similares, tales como, por ejemplo, los métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144:945 (1962); David et al., Biochemistry, 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982).
Los ejemplos descritos en el presente documento incluyen además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, diacuerpos, SMIP, anticuerpos de camello, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables y CDR establecidos en el presente documento. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservativas (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares). Por ejemplo, la sustitución conservativa se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general, por ejemplo, un aminoácido ácido por otro aminoácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un aminoácido neutro por otro. aminoácido neutro. Lo que se pretende con una sustitución conservativa de aminoácidos es bien conocido en la técnica.
En otro ejemplo, la descripción contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos un 90 % o más de homología de secuencia con una cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Más preferiblemente, la descripción contempla secuencias polipeptídicas que tienen al menos 95 % o más de homología de secuencia, incluso más preferiblemente al menos 98 % o más de homología de secuencia, y aún más preferiblemente al menos 99 % o más de homología de secuencia con uno cualquiera o más de las secuencias polipeptídicas de fragmentos de anticuerpos, regiones variables y CDR expuestas en el presente documento. Los métodos para determinar la homología entre secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
En otro ejemplo, la descripción contempla además los homólogos de polipéptidos mencionados anteriormente de los fragmentos de anticuerpo, las regiones variables y las CDR expuestas en el presente documento que además tienen actividad anti-NGF. En este documento se exponen ejemplos no limitantes de actividad anti-NGF.
En otro ejemplo, la descripción contempla además la generación y el uso de anticuerpos antiidiotípicos que se unen a cualquiera de las secuencias anteriores. En un ejemplo, dicho anticuerpo antiidiotípico podría administrarse a un sujeto que ha recibido un anticuerpo anti-NGF para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-NGF. Dichos anticuerpos antiidiotípicos también podrían ser útiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos anti-NGF. Otro ejemplo de uso de tales anticuerpos antiidiotípicos es para la detección de los anticuerpos anti-NGF de la presente invención, por ejemplo, para controlar los niveles de los anticuerpos anti-NGF presentes en la sangre de un sujeto u otros fluidos corporales.
La presente descripción también contempla anticuerpos anti-NGF que comprenden cualquiera de las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas descritas en el presente documento sustituidas por cualquiera de las otras secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento. Por ejemplo, sin limitación a los mismos, la presente descripción contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquiera de las secuencias de cadena ligera variable y cadena pesada variable descritas en este documento, y además contempla los anticuerpos resultantes de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en este documento por cualquiera de las otras. Secuencias de CDR descritas en el presente documento.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos anti-NGF
Anticuerpo Ab1
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab1 para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab1. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:1:
GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGG TATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTG GATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTT TGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GT (SEQ ID NO: 201).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:2:
GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGG TATCAACAGAGACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTG GATGCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTT TGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:3:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTG GTAGCACAGTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCA GGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:4:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTG GTAGCACAGTCTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCA GGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT GGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGC CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA (SEQ ID NO: 204).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:205; SEQ ID NO:206; y SEQ ID NO:207 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:208; SEQ ID NO:209; y SEQ ID NO:210 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:201 que codifica el secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1; el polinucleótido SEQ ID NO:202 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2; el polinucleótido SEQ ID NO:203 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3; el polinucleótido SEQ ID NO:204 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:205; SEQ ID NO:206; y SEQ ID NO:207) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:208; SEQ ID NO:209; y SEQ ID NO:210) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab1, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab1 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:202 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:2 y el polinucleótido SEQ ID NO:204 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:4.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab1 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab1 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab1 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se exponen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab2 que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden la administración a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab2. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:11:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCC AGGCC AGTCAGAACATTT AC AGC AACTT AGCCT G
GTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCT
GGATGCTGGAGTCCCATCAAGGTTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT
CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTT
TGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC
GT (SEQ ID NO: 211).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:12:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAACTTAGCCTG
GTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCT
GGATGCTGGAGTCCCATCAAGGTTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT
CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTT TGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC
GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTÁACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:13:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGCAATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTACTAGTA TTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATC TGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 213).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:14:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGCAATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTACTAGTA TTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGCTACGATGACTATGATGAGATGACCTACTTTAACATC TGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGT CTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACC GTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCC TGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGA GCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTG GCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCA T CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGT GTAC ACC CTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGT CAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGG AGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCT ACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCT CCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 214).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:215; SEQ ID NO:216; y SEQ ID NO:217 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:218; SEQ ID NO:219; y SEQ ID NO:220 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:211 que codifica el secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11; el polinucleótido SEQ ID NO:212 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12; el polinucleótido SeQ ID NO:213 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13; el polinucleótido SEQ ID NO:214 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SeQ ID NO:215; SEQ ID NO:216; y SEQ ID NO:217) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:218; SEQ ID NO:219; y SEQ ID NO:220) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab2, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab2 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:212 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:12 y el polinucleótido SEQ ID NO:214 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:14.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab2 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tale como Ab2 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab2 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3
La descripción se dirige además al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab3 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpos Ab3. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:21:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGA
GACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATGATGCATCC AATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTC ACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGC GATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGT (SEQ ID NO: 221).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:22:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGA
GACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGT ATCAGCAGAAACCAGGGC AGCCTCCCAGGCTCCTGATCT ATGATGC ATCC AATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTC ACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGC GATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).
En otro ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:23:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGATCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGG TACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGÁ CCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTC TGTGCCGGAGGTGGTGGTAGTATTTATGATATTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:24:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGATCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGG TACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGA CCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTC TGTGCCGG AGGTGGTGGTAGT ATTT ATGATATTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTC ACC GTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAG AGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGA ACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCC CGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCT CCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAA ACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAG GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGT GGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGAT GACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACA TCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO:
224).
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:225; SEQ ID NO:226; y SEQ ID NO:227 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22.
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:228; SEQ ID NO:229; y SEQ ID NO:230 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24.
La descripción también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:221 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21; el polinucleótido SEQ ID NO:222 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22; el polinucleótido SEQ ID NO:223 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23; el polinucleótido SEQ ID NO:224 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:225; SEQ ID NO:226; y SEQ ID NO:227) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:228; SEQ ID nO:229; y SEQ ID NO:230) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24.
En un ejemplo preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab3, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab3 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:222 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:22 y el polinucleótido SEQ ID NO:224 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:24.
Otro ejemplo de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichiapastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab3 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab3 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab3 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4
La descripción se dirige además al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab4 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo, que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab4. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:31:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA
TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC
ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC
ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGC
GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA
ACGT (SEQ ID NO: 231).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:32:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 232).
En otro ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:33:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGTAATGAT CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAATCACTTGGAGTG CTGGTACATACTACGCGAGCAGTGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAT TCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTG TATTACTGTGCTGGAGGTGGTGGTAGTATCTATGATATTTGGGGCCAAGGGACCCTC GTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 233).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:34:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGTAATGAT CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAATCACTTGGAGTG CTGGTACATACTACGCGAGCAGTGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAAT TCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTG TATTACTGTGCTGGAGGTGGT GGT AGTATCTATGATATTTGGGGCCAAGGGACCCTC GTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ
ID NO: 234).
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:235; SEQ ID NO:236; y SEQ ID NO:237 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32.
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:238; SEQ ID NO:239; y SEQ ID NO:240 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34.
La descripción también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos descritos en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:231 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31; el polinucleótido SEQ ID NO:232 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32; el polinucleótido SEQ ID NO:233 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33; el polinucleótido SEQ ID NO:234 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:235; SEQ ID NO:236; y SEQ ID NO:237) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:238; SEQ ID NO:239; y SEQ ID NO:240) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34.
En un ejemplo preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab4, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab4 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:232 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:32 y el polinucleótido SEQ ID NO:234 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:34.
Otro ejemplo de la descripción, contempla estos polinucleótidos incorporados a un vector de expresión para su expresión en células de mamíferos, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichiapastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab4 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor, tales como Ab4 o sus fragmentos Fab, pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab4 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se exponen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab5 para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab5. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:41:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTG GTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCT GGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTC TCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTT TTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GT (SEQ ID NO: 241).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:42:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTG GTATCAGCAGAGACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCT GGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTC TCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTT TTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG T ACAGT GGAAGGT GG AT AACGCCCT CC AAT CGGGT AACTCCC AGG AGAGTGTCAC A GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 242).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:43:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAGTGGGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCGTAATG OTAACACATGGIACGCGAGCTGGGCAAGAGGCCGATTCACCAICTCCAAAACCTCG ACC ACGGT GGATCTGAAAATC ACC AGTCCGACAAGCGAGGAC ACGGCC AC AT ATTT CTGTGCCAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCC AGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:44:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAGTGGGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCGTAATG GT AACACATGGT ACGCGAGCTGGGC AAGAGGCCGATTCACCATCTCC AAAACCTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAAGCGAGGACACGGCCACATATTT CTGTGCCAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCC AGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCT GGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACG TGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGC CAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGC TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA TGA (SEQ ID NO: 244).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:245; SEQ ID NO:246; y SEQ ID NO:247 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:248; SEQ ID NO:249; y SEQ ID NO:250 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:241 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41; el polinucleótido SEQ ID NO:242 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42; el polinucleótido SEQ ID NO:243 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43; el polinucleótido SEQ ID NO:244 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:245; SEQ ID nO:246; y SEQ ID NO:247) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:248; SEQ ID NO:249; y SEQ ID NO:250) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab5, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab5 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:242 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:42 y el polinucleótido SEQ ID NO:244 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:44.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab5 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo opcional de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab5 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab5 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab6 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab6. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGG
T AT C AGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCT AAGCTCCT G ATCTAT GATGC ATCC ACT CT G
GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT
CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTT
TACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC
GT (SEQ ID NO: 251).
En un e jem p lo op c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n co m p re n d e n o, co m o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d ific a la s e cu e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a lige ra de S E Q ID N O :52 :
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTG GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTT TACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 252).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTA ATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCT GGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:54:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTA ATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCT GGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT
TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTT GTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG T C AGT CTTCCT CTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC AT G ATCTCCCGG ACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA (SEQ ID NO: 254).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:255; SEQ ID NO:256; y SEQ ID NO:257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51; el polinucleótido SEQ ID NO:252 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52; el polinucleótido SEQ ID NO:253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53; el polinucleótido SEQ ID NO:254 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:255; SEQ ID nO:256; y SEQ ID NO:257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab6, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab6 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:252 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:52 y el polinucleótido SEQ ID NO:254 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:54.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab6 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab6 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab6 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7
Opcionalmente, la descripción se dirige además al uso de polinucleótidos expuestos a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab7 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab7. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:61:
GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTG
GGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGC CTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCAC TCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACA CTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACA ATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCA AACGT (SEQ ID NO: 261).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:62:
GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTG
GGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGC CTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCAC TCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACA CTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACA ATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCA AACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGA AATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCA AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTC ACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAG CAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 262).
En o tro e jem p lo o p c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ica q u e co d if ic a la se c u e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a p e sa d a va ria b le de S E Q ID N O :63 :
CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGAC
ACCCCTGACACTCACCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAT CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTG ATACTAGCGCATACTACGCGAGCTGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACC TCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTA TTTCTGTGCCAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGG GGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:64:
CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGAC
ACCCCTGACACTCACCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAT CTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTG ATACTAGCGCATACTACGCGAGCTGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACC TCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTA TTTCTGTGCCAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGG GGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATGA (SEQ ID NO: 264).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:265; SEQ ID NO:266; y SEQ ID NO:267 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:268; SEQ ID NO:269; y SEQ ID NO:270 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:261 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61; el polinucleótido SEQ ID NO:262 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62; el polinucleótido SEQ ID NO:263 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63; el polinucleótido SEQ ID NO:264 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:265; SEQ ID nO:266; y SEQ ID NO:267) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:268; SEQ ID NO:269; y SEQ ID NO:270) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab7, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab7 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:262 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:62 y el polinucleótido SEQ ID NO:264 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:64.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab7 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab7 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab7 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab8 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab8. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:71:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGG
TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTG
GCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTC
ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTAT
CTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT
(SEQ ID NO: 271).
En un e jem p lo op c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n co m p re n d e n o, co m o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d ific a la s e cu e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a lige ra de S E Q ID N O :72 :
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTG GCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTC ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTAT CTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT ACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 272).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:73:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCAATGATC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGA TACTAGCGCATACTACGCAAGCAGTGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCTAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATC CCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 273).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:74:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCAATGATC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGA TACTAGCGCATACTACGCAAGCAGTGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT
GTGTATTACTGTGCTAGATCTTATGCTGCTTATGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATC CCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGG TCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCT GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCC CTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGC AACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGG AGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACT GGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCC ATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG TCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATG CTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 274).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:275; SEQ ID NO:276; y SEQ ID NO:277 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:278; SEQ ID NO:279; y SEQ ID NO:280 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:271 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71; el polinucleótido SEQ ID NO:272 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72; el polinucleótido SEQ ID NO:273 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73; el polinucleótido SEQ ID NO:274 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:275; SEQ ID nO:276; y SEQ ID NO:277) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:278; SEQ ID NO:279; y SEQ ID NO:280) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab8, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab8 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:272 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:72 y el polinucleótido SEQ ID NO:274 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:74.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab8 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab8 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab8 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab9 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab9. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:81:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCT GGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCT CACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTA TAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GT (SEQ ID NO: 281).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:82:
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCT GGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCT CACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTA TAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 282).
En o tro e je m p lo o p c io n a l de la de sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, co m o a lte rna tiva , co n s is te n en la s ig u ie n te se cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a qu e co d ific a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ica de c a d e n a p e sa d a va ria b le de S E Q ID N O :83 :
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGÁCACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTATGTATTCAATGGGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTG GTACTGCATATTACGCGAGCTGGGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGAGCTGAAGATCACCAGTCCGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAGAGACTCCTGTTAATTATTATTTGGACATTTGGGGCCAGGGGACCCT CGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 283).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:84:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTATGTATTCAATGGGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTG GTACTGCATATTACGCGAGCTGGGCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGAGCTGAAGATCACCAGTCCGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAGAGACTCCTGTTAATTATTATTTGGACATTTGGGGCCAGGGGACCCT CGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTC CTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT TCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC AGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACAC ATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ
ID NO: 284).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:285; SEQ ID NO:286; y SEQ ID NO:287 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:288; SEQ ID NO:289; y SEQ ID NO:290 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:281 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81; el polinucleótido SEQ ID NO:282 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82; el polinucleótido SEQ ID NO:283 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83; el polinucleótido SEQ ID NO:284 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:285; SEQ ID nO:286; y SEQ ID NO:287) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:288; SEQ ID NO:289; y SEQ ID NO:290) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab9, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab9 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:282 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:82 y el polinucleótido SEQ ID NO:284 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:84.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab9 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab9 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab9 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab10
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab10 que tienen especificidad de unión a nGf, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab10. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:91:
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG
ACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGT ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGG CATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACA ATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT
(SEQ ID NO: 291).
En un e jem p lo op c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n co m p re n d e n o, co m o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d ific a la s e cu e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a lige ra de S E Q ID N O :92 :
GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAG
ACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGT ATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGG CATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCA CCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACA ATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT ACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTA CAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGA GCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAG CAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGC TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 292).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:93:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTG AG ACT CT CCTGTGC AGCTTCT GGATTC ACCTTCAGTAT GTATTCAAT GGGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGG TGGTACTGCATACTACGCTAGCAGCGCTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTCCTGTTAATTACTACTTGGACATTTGGGGCCAA GGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 293).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:94:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTATGTATTCAATGGGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGG TGGTACTGCATACTACGCTAGCAGCGCTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT
GTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTCCTGTTAATTACTACTTGGACATTTGGGGCCAA GGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCG TGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACA TGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTA CAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGC ATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 294).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:295; SEQ ID NO:296; y SEQ ID NO:297 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:298; SEQ ID NO:299; y SEQ ID NO:300 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:291 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91; el polinucleótido SEQ ID NO:292 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92; el polinucleótido SEQ ID NO:293 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93; el polinucleótido SEQ ID NO:294 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:295; SEQ ID nO:296; y SEQ ID NO:297) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:298; SEQ ID NO:299; y SEQ ID NO:300) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab10, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab10 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:292 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:92 y el polinucleótido SEQ ID NO:294 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:94.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab10 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab10 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab10 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab11
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab11 que tienen especificidad de unión a n Gf , que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuos los polipéptidos de anticuerpos Ab11. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:101:
GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGG TATCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTG GCÁTCTGGGGTCTCÁTCGCGGTTCÁAÁGGCÁGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTC ACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGAT GGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ
ID NO: 301).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:102:
GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGG TATCAACAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTG GCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTC ACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGAT GGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGT AGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGG ACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 302).
En o tro e jem p lo o p c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ica q u e co d if ic a la se c u e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a p e sa d a va ria b le de S E Q ID N O :103:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATACATCGGACTCATTAGTTATGATG GTAACACATACTACGCGACGTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTG GGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 303).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:104:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTGGAATACATCGGACTCATTAGTTATGATG GTAACACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTT CTGTGCCAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTG GGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTT CCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCT
GGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGA CCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCA GCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAAC GTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTG AGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAAC TGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA (SEQ ID NO: 304).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:305; SEQ ID NO:306; y SEQ ID NO:307 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:308; SEQ ID NO:309; y SEQ ID NO:310 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:301 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101; el polinucleótido SEQ ID NO:302 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102; el polinucleótido SEQ ID NO:303 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103; el polinucleótido SEQ ID NO:304 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:305; SEQ ID NO:306; y SEQ ID NO:307) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:101 o la secuencia de cadena ligera de s Eq ID NO:102; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:308; SEQ ID NO:309; y SEQ ID NO:310) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab11, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab11 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:302 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:102 y el polinucleótido SEQ ID NO:304 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:104.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab11 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo opcional de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab11 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab11 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab12
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se exponen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab12 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos de tratamiento del dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab12. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:111:
GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTG GCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTGACTCTC ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGAT GGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ
ID NO: 311).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:112:
GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTG GCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGAT GGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGT AGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAAC TGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGG ACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCC CGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 312).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:113:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGACTCATTAGTTATG ATGGTAACACATACTACGCGACCTCCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGC TGTGTATTACTGTGCTAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTT AACATCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 313).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:114:
CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCTTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGACTCATTAGTTATG ATGGTAACACATACTACGCGACCTCCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAATGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGC TGTGTATTACTGTGCTAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTT AACATCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCC ATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCT GGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAG GCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCT ACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCC AAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAA GTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG AGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGC CCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGT ACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA GCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 314).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:315; SEQ ID NO:316; y SEQ ID NO:317 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:318; SEQ ID NO:319; y SEQ ID NO:320 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:311 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111; el polinucleótido SEQ ID NO:312 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112; el polinucleótido SEQ ID NO:313 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113; el polinucleótido SEQ ID NO:314 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:315; SEQ ID nO:316; y SEQ ID NO:317) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:318; SEQ ID NO:319; y SEQ ID NO:320) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab12, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab12 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:312 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:112 y el polinucleótido SEQ ID NO:314 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:114.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab12 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab12 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab12 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab13
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab13 que tienen especificidad de unión a n Gf , que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab13. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:121:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGC ACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTT AT AAGAACAACTACTT A TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGT (SEQ ID NO: 321).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:122:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTA (SEQ ID NO: 322).
En o tro e jem p lo o p c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ica q u e co d if ic a la se c u e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a p e sa d a va ria b le de S E Q ID N O :123:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTA ATGAAGAAACAAACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACC TCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTA TTTCTGTGCCAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCGGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 323).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:124:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTA ATGAAGAAACAAACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACC TCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTA TTTCTGTGCCAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCGGG CACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGC ACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCAC AAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCT CTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAG CACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTA TCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATG
A (SEQ ID NO: 324).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:325; SEQ ID NO:326; y SEQ ID NO:327 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:328; SEQ ID NO:329; y SEQ ID NO:330 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:321 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121; el polinucleótido SEQ ID NO:322 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122; el polinucleótido SEQ ID NO:323 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123; el polinucleótido SEQ ID NO:324 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:325; SEQ ID nO:326; y SEQ ID NO:327) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:328; SEQ ID NO:329; y SEQ ID NO:330) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab13, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab13 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:322 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:122 y el polinucleótido SEQ ID NO:324 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:124.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab13 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab13 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab13 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab14
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab14 que tienen especificidad de unión a nGf, que inhiben la asociación de NGF con T rkA y la asociación de NGF con p75, en métodos de tratamiento del dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab14. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:131:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGT (SEQ ID NO: 331).
En un e jem p lo op c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n co m p re n d e n o, co m o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e c o d ific a la s e cu e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a lige ra de S E Q ID N O :132:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACC AT C AGC AGCCT GCAGCCTG AAG ATGTTGC AACTTATT ACT GTGC AGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 332).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:133:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTA GTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACAC TGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGG GGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 333).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:134:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTA GTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACAC TGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGATATTGGTATAGATATGTGG GGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACAC AT GCCCACCGTGCCC AGC ACCT GAACTCCTGGGGGGACCGTC A GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATGA (SEQ ID NO: 334).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:335; SEQ ID NO:336; y SEQ ID NO:337 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:338; SEQ ID NO:339; y SEQ ID NO:340 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:331 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131; el polinucleótido SEQ ID NO:332 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132; el polinucleótido SEQ ID NO:333 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133; el polinucleótido SEQ ID NO:334 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:335; SEQ ID nO:336; y SEQ ID NO:337) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:338; SEQ ID NO:339; y SEQ ID NO:340) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab14, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab14 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:332 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:132 y el polinucleótido SEQ ID NO:334 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:134.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab14 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab14 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab14 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab15
La descripción se dirige además al uso de polinucleótidos que se describen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab15 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab15. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:141:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCC AATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTC ACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGC GATTATGATGATGATACTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGT (SEQ ID NO: 341).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:142:
GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GACACAGTCACCATCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCC AATCTGCCATCTGGGGTCCCATCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTC ACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGC GATTATGATGATGATACTGATAATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 342).
En o tro e jem p lo de la de sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la de sc rip c ió n co m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , c o n s is te n en la s ig u ie n te s e c u e n c ia p o lin u c le o tíd ica que co d ific a la s e cu e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a p e sa d a v a ria b le de S E Q ID N O :143:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGATCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTTGGAGTGGTG GCACCTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACC ACGGTGGATCTGCAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACGCGGCCACCTATTTCTGT GCCGCAGGTGGTGGTAGTATTTATGATGTTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTC TCGAGC (SEQ ID NO: 343).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:144:
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGATCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTTGGAGTGGTG GCACCTACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACC ACGGTGGATCTGCAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACGCGGCCACCTATTTCTGT GCCGCAGGTGGTGGTAGTATTTATGATGTTTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTC TCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACC GGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGG CTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCA GCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTC AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAG GGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACC AAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCC GTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGT GCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAG GTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCA CTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 344).
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:345; SEQ ID NO:346; y SEQ ID NO:347 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142.
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:348; SEQ ID NO:349; y SEQ ID NO:350 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:144.
La descripción también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:341 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:141; el polinucleótido SEQ ID NO:342 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142; el polinucleótido SEQ ID NO:343 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:143; el polinucleótido SEQ ID NO:344 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:144; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:345; SEQ ID NO:346; y SEQ ID nO:347) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:348; SEQ ID NO:349; y SEQ ID NO:350) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:144.
En un ejemplo preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab15, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab15 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:342 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:142 y el polinucleótido SeQ ID NO:344 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:144.
Otro ejemplo de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichiapastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab15 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tale como Ab15 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab15 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab16
La descripción se dirige además al uso de polinucleótidos expuestos a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab16 para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab16. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:151:
GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGG
TATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTG
GCAACTGGGGTCCCAAAGCGGTTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCT
CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTA
TAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA
ACGT (SEQ ID NO: 351).
En un e je m p lo de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , c o n s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ic a q u e co d if ic a la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a de c a d e n a lig e ra de S E Q ID N O :152 :
GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTG GCAACTGGGGTCCCAAAGCGGTTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCT CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTA TAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 352).
En otro ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:153:
CAGTCGGTGGAGGAGTTCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGACCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGATCATTGGTAGTATTG GTACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCTTCATCTCCAAAACCTCGA CCACTGTGGATCTGAAAATCATTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCT GTGCCAGAGATGCTGGCGTTACTGTTGATGGTTATGGCTACTACTTTAACATCTGGG GCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 353).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:154:
CAGTCGGTGGAGGAGTTCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACC
CCTGACACTCACCTGCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGACCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGATCATTGGTAGTATTG GTACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCTTCATCTCCAAAACCTCGA CCACTGTGGATCTGAAAATCATTAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCT GTGCCAGAGATGCTGGCGTTACTGTTGATGGTTATGGCTACTACTTTAACATCTGGG GCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC CCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACC AGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGG TACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGT ACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAG AAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCC CCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAG GCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC AAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGT GATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGG TAAATGA (SEQ ID NO: 354).
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:355; SEQ ID NO:356; y SEQ ID NO:357 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152.
En un ejemplo adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:358; SEQ ID NO:359; y SEQ ID NO:360 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154.
La descripción también contempla secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:351 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:151; el polinucleótido SEQ ID NO:352 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152; el polinucleótido SEQ ID NO:353 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:153; el polinucleótido SEQ ID NO:354 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:355; SEQ ID NO:356; y SEQ ID nO:357) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:358; SEQ ID NO:359; y SEQ ID NO:360) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154.
En un ejemplo preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab16, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab16 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:352 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:152 y el polinucleótido SeQ ID NO:354 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:154.
Otro ejemplo de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichiapastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab16 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab16 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab16 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. Anticuerpo Ab17
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab17 que tienen especificidad de unión a n Gf , que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir apreciablemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab17. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:161:
GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCT GGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCT CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTA TACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGT (SEQ ID NO: 361).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:162:
GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTG GTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCT GGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCT CACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTA TACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 362).
En o tro e jem p lo o p c io n a l de la d e sc rip c ió n , los p o lin u c le ó tid o s de la d e sc rip c ió n c o m p re n d e n o, com o a lte rna tiva , con s is te n en la s ig u ie n te s e cu e n c ia p o lin u c le o tíd ica q u e co d if ic a la se c u e n c ia p o lip e p tíd ic a de ca d e n a p e sa d a va ria b le de S E Q ID N O :163:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGGGATC
CCTGACACTCACCTGCGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCACTGGCTACAACTTGGTCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATTCATTAGTTATGGTG ATACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGACTCTGACGATCACCGATCTGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTC TGTGCCAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTATGGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTC GTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 363).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:164:
CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGGGATC
CCTGACACTCACCTGCGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCACTGGCTACAACTTGGTCTG GGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATTCATTAGTTATGGTG ATACCACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCG ACCACGGTGACTCTGACGATCACCGATCTGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTC TGTGCCAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTATGGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTC GTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCC TCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTT CCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACA CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCG TGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCA GCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACA TGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTA CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCC AAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGA GGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGAC CACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGG CTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ
ID NO: 364).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:365; SEQ ID NO:366; y SEQ ID NO:367 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:368; SEQ ID NO:369; y SEQ ID NO:370 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:164.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:361 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:161; el polinucleótido SEQ ID NO:362 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162; el polinucleótido SEQ ID NO:363 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:163; el polinucleótido SEQ ID NO:364 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:164; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:365; SEQ ID nO:366; y SEQ ID NO:367) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:368; SEQ ID NO:369; y SEQ ID NO:370) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:164.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab17, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab17 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:362 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:162 y el polinucleótido SEQ ID NO:364 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:164.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab17 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab17 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab17 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab18
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se exponen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab18 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab18. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:171:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTG GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTC ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTAT ACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA
ACGT (SEQ ID NO: 371).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:172:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTG GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTC ACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTAT ACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 372).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:173:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGGCTACAACTTGGT CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGATTCATTAGTTATG GTGATACCACATACTACGCTAGCTCTGCTAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTG T GTATTACTGT GCTAG AG AGACT GCT AATACTTAT GATTAT GGCAT CT GGGGCC AAG GGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 373).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:174:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGGCTACAACTTGGT CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGATTCATTAGTTATG GTGATACCACATACTACGCTAGCTCTGCTAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACA ATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTG TGTATTACTGTGCTAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTATGGCATCTGGGGCCAAG GGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGG CACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAG GACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGG CGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGT GGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCA CAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAA CTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCC TCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTG GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCA GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACC ATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATC CCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCT ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTAC AAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTC ACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATG
A (SEQ ID NO: 374).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:375; SEQ ID NO:376; y SEQ ID NO:377 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:378; SEQ ID NO:379; y SEQ ID NO:380 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:174.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:371 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:171; el polinucleótido SEQ ID NO:372 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172; el polinucleótido SEQ ID NO:373 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:173; el polinucleótido SEQ ID NO:374 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:174; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:375; SEQ ID nO:376; y SEQ ID NO:377) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:378; SEQ ID NO:379; y SEQ ID NO:380) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:174.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab18, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab18 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:372 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:172 y el polinucleótido SEQ ID NO:374 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:174. Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción, descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab18 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab18 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab18 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab19
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se exponen a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab19 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab19. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:181:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGC GGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGT (SEQ ID NO: 381).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:182:
GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGA
GGCACAGTCAGCATCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGTGTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGC GGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 382).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:183:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGTCTGGTCATGCCTGGAGGATCC
CTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGTCCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAA TGAGGAAACAAACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCT CGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTAT TTCTGTGCAAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAGGGC ACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 383).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:184:
CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGTCTGGTCATGCCTGGAGGATCC
CTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGTCCTGG GTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAA TGAGGAAACAAACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCT CGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTAT TTCTGTGCAAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAGGGC ACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCA CCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGA CTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGT GACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACA AGCCCAGGAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAGT CACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGC GTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGC ACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAG GAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCC GGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTAT CCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATG
A (SEQ ID NO: 384).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:385; SEQ ID NO:386; y SEQ ID NO:387 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:388; SEQ ID NO:389; y SEQ ID NO:390 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:184.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:381 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:181; el polinucleótido SEQ ID NO:382 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182; el polinucleótido SEQ ID NO:383 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:183; el polinucleótido SEQ ID NO:384 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:184; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:385; SEQ ID nO:386; y SEQ ID NO:387) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:388; SEQ ID NO:389; y SEQ ID NO:390) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:184.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab19, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab19 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:382 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:182 y el polinucleótido SEQ ID NO:384 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:184.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En una realización opcional de la invención descrita en este documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab19 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab19 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab19 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab20
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab20 para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a nGf, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab20. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:191:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGT (SEQ ID NO: 391).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:192:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTA TCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCC ACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGC GGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAA ACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAA ATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAA AGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCA CAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCT GAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 392).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:193:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTA GTAATGAAGAAACAAACTACGCGACCAGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACAC TGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGG GGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 393).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:194:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTA GTAATGAAGAAACAAACTACGCGACCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGA GACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACAC TGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGATTGCTATAGATATGTGG GGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTG GTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGAC CAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGT GAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTG ACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAG GTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAG TACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTG AATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAA CAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAG CAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCG TGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG GTAAATGA (SEQ ID NO: 394).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:395; SEQ ID NO:396; y SEQ ID NO:397 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:398; SEQ ID NO:399; y SEQ ID NO:400 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:194.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:391 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:191; el polinucleótido SEQ ID NO:392 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192; el polinucleótido SEQ ID NO:393 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:193; el polinucleótido SEQ ID NO:394 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:194; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:395; SEQ ID nO:396; y SEQ ID NO:397) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:398; SEQ ID NO:399; y SEQ ID NO:400) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:194.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab20, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab20 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:392 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:192 y el polinucleótido SEQ ID NO:394 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:194.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab20 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab20 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab20 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levaduras (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab21
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos de anticuerpos Ab21 que tienen especificidad de unión a nGf, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab21. La descripción también se dirige opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera variable de SEQ ID NO:51:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGG
TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTG
GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT
CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTT
TACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC
GT (SEQ ID NO: 251).
En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden opcionalmente, o como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:401:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTG GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTAGTACTGCCAACAGGGTTT TACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 403).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada variable de SEQ ID NO:53:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTA ATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCT GGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En un ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:402:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGG CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTA ATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC AATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT GTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTACTACGTCTTTAACATCT GGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTT GTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCT GAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGC AGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAG AACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAC AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCC GGGTAAATGA (SEQ ID NO: 404).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:255; SEQ ID NO:256; y SEQ ID NO:257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51; el polinucleótido SEQ ID NO:403 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401; el polinucleótido SEQ ID NO:253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53; el polinucleótido SEQ ID NO:404 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:255; SEQ ID nO:256; y SEQ ID NO:257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab21, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab21 de longitud completa comprenden o, como alternativa, consisten en el polinucleótido SEQ ID NO:403 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:401 y el polinucleótido SEQ ID NO:404 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:402.
Otro ejemplo opcional de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo opcional de la descripción descrito en el presente documento (más adelante), los fragmentos Fab pueden producirse mediante digestión enzimática (por ejemplo, papaína) de Ab21 después de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un huésped adecuado. En otro ejemplo de la descripción, se pueden producir anticuerpos anti-NGF, tales como Ab21 o fragmentos Fab del mismo, mediante la expresión de polinucleótidos de Ab21 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura (por ejemplo, levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
Fragmento de anticuerpo Fab2
La descripción también se dirige opcionalmente al uso de polinucleótidos que se indican a continuación para producir polipéptidos Fab2 del fragmento de anticuerpo que inhiben la asociación de NGF con TrkA y p75 para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprenden administrar a dicho individuo los polipéptidos de anticuerpos Ab1. La descripción se dirige además a polinucleótidos que codifican polipéptidos de fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos Fab de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena ligera de SEQ ID NO:407:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGA
GACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGG TATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTG GAATCTGGAGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCT CACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTT TACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAAC GTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACIGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAG TACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACA GAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAA AGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 409).
En otro ejemplo opcional de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en la siguiente secuencia polinucleotídica que codifica la secuencia polipeptídica de cadena pesada de SEQ ID NO:408:
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGG
GTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGG
CTGGGTCCGTCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTA
ATGGTAACACATGGTACGCGAGCTCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGAC
AATTGCAAGAACACCCTGTATCTTGAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCT
GTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTACTACGTCTTTAACATCT
GGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCT
TCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC
TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTG
ACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC
AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAA
CGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTT
GTGACAAAACTCACTAG (SEQ IDNO: 410).
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos Fab que tienen especificidad de unión a NGF comprenden una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO:255; SEQ ID NO:256; y SEQ ID NO:257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:409.
En un ejemplo opcional adicional de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos Fab para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID nO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:410.
La descripción también contempla opcionalmente secuencias polinucleotídicas que incluyen una o más de las secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor descritas en el presente documento. En un ejemplo de la descripción, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos para el tratamiento o la prevención del dolor y las afecciones asociadas al dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden o, como alternativa, consisten en uno, dos, tres o más, incluidos todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpos: el polinucleótido SEQ ID NO:251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51; el polinucleótido SEQ ID NO:409 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:407; el polinucleótido SEQ ID NO:253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53; el polinucleótido SEQ ID NO:410 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:408; los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:255; SEQ ID nO:256; y SEQ ID NO:257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO:51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:407; y los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (SEQ ID NO:258; SEQ ID NO:259; y SEQ ID NO:260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO:53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:408.
En un ejemplo opcional preferido de la descripción, los polinucleótidos de la descripción comprenden o, como alternativa, consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al fragmento de anticuerpo Fab2, los polinucleótidos que codifican el fragmento Fab incluyen el polinucleótido SEQ ID NO:409 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:407 y el polinucleótido SEQ ID NO:410 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO:408.
Otro ejemplo de la descripción contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para su expresión en células de mamífero, tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos, tales como células de levadura, tal como la levadura Pichia. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris. En un ejemplo de la descripción descrito en este documento (más adelante), los fragmentos Fab se pueden producir mediante la expresión de polinucleótidos Fab2 en células de mamíferos, tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos como células de levadura (por ejemplo levaduras diploides, tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies de Pichia adecuadas incluyen, pero no se limitan a Pichia pastoris.
En un ejemplo, la descripción se dirige opcionalmente a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de Vh de un anticuerpo anti-NGF seleccionada de SEQ ID NO:3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, o 402, o que codifica una variante de la misma en la que al menos un resto de marco (resto de FR) ha sido sustituido por un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido de Vh de un anticuerpo anti-NGF de conejo o una sustitución conservativa de aminoácidos.
En otro ejemplo opcional, la descripción está dirigida a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia polinucleotídica que codifica una secuencia de aminoácidos de Vl de un anticuerpo anti-NGF seleccionada de SEQ ID NO:1, 11,21,31,41,51,61, 71,81,91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191 o 401, o que codifica una variante de la misma en la que al menos un resto de marco (resto de FR) ha sido sustituido por un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido de VL de un anticuerpo anti-NGF de conejo o una sustitución conservativa de aminoácidos.
En otro ejemplo opcional más, la descripción se dirige a uno o más polinucleótidos heterólogos que comprenden una secuencia que codifica los polipéptidos contenidos en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:13; SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:411 y SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:81 y SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:91 y SEQ ID NO:93; SEQ ID NO:101 y SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO:113; SEQ ID NO:121 y SEQ ID NO:123; SEQ ID NO:131 y SEQ ID NO:133; SEQ ID NO:141 y SEQ ID NO:143; SEQ ID NO:151 y SEQ ID NO:153; SEQ ID NO:161 y SEQ ID NO:163; SEQ ID NO:171 y SEQ ID NO:173; SEQ ID NO:181 y SEQ ID NO:183; SEQ ID NO:191 y SEQ ID NO:193; o SEQ ID NO:401 y SEQ ID NO:403.
En otro ejemplo, la descripción se dirige opcionalmente a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-NGF, en el que dicho polipéptido expresado solo se une específicamente a NGF o se une específicamente a NGF cuando se expresa en asociación con otra secuencia polinucleotídica que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido de CDR derivado de un anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas al dolor, en el que dicha al menos una CDR se selecciona de las contenidas en los polipéptidos de Vl o Vh de SEQ ID NO:1, 3, 11, 13, 21, 23, 31,33, 41,43, 51,53, 61,63, 71,73, 81,83, 91,93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, 133, 141, 143, 151, 153, 161, 163, 171, 173, 181, 183, 191, 193, 401 o SEQ ID NO:403.
También se contemplan las células huésped y los vectores que comprenden dichos polinucleótidos.
La descripción además contempla opcionalmente vectores que comprenden las secuencias polinucleotídicas que codifican las secuencias polipeptídicas variables de cadena pesada y ligera, así como las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) individuales, como se establece en el presente documento, así como las células huésped que comprenden dichas secuencias de vector. En un ejemplo de la descripción, la célula huésped es una célula de levadura. En otro ejemplo de la descripción, la célula huésped de levadura pertenece al género Pichia.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es la atmosférica o es una presión cercana a esta.
Ejemplo 1
Este ejemplo describe métodos de cultivo que mejoraron la pureza de los anticuerpos recombinantes producidos a partir de cultivos de células de P. pastoris. Cuando se añadió un bolo de etanol durante el cultivo, los anticuerpos resultantes mostraron una gran disminución en la concentración de una variante asociada al producto no deseada.
Métodos
Para generar el inóculo, se cultivó P. pastoris diploide usando un medio compuesto por los siguientes nutrientes (los porcentajes se indican en p/v): extracto de levadura al 3 %, dextrosa anhidra al 2 %, YNB al 1,34 %, biotina al 0,004 % y fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0). El medio de inóculo para los experimentos L355, L357, L358, L359 y L360 estaba compuesto por los siguientes nutrientes (los porcentajes se indican en p/v): extracto de levadura al 3 %, glicerol al 2 %, YNB al 1,34 %, biotina al 0,004 %, fosfato de potasio 200 mM (pH 6,0) El inóculo se hizo crecer durante aproximadamente 24 horas a 29 horas en una incubadora con agitación a 30 °C y 300 rpm. A continuación, se añadió un inóculo al 10 % a recipientes de volumen de trabajo Labfors de 2,5 l que contenían 1 l de medio de cultivo estéril. El medio de cultivo estaba compuesto por los siguientes nutrientes: sulfato de potasio 18,2 g/L, fosfato de amonio monobásico 36,4 g/L, fosfato de potasio dibásico 12,8 g/L, sulfato de magnesio heptahidratado 3,72 g/L, citrato de sodio dihidratado 10 g/L, glicerol 40 g/L, extracto de levadura 30 g/L, metales traza PTM1 4,35 mL/L y antiespumante 204 1,67 mL/L. La disolución de metales traza PTM1 estaba compuesta por los siguientes componentes: sulfato cúprico pentahidratado 6 g/L, yoduro de sodio 0,08 g/L, sulfato de manganeso hidratado 3 g/L, molibdato de sodio dihidratado 0,2 g/L, ácido bórico 0,02 g/L, cloruro de cobalto 0,5 g/L, cloruro de zinc 20 g/L, sulfato ferroso heptahidratado 65 g/L, biotina 0,2 g/L y ácido sulfúrico 5 mL/L. La cepa de levadura se modificó para expresar el anticuerpo Ab-A a partir de cuatro copias genómicas integradas de la secuencia codificadora de la cadena pesada (SEQ ID NO:441) y 3 copias de la secuencia codificadora de la cadena ligera (SEQ ID NO:440). Las copias del gen de la cadena pesada se integraron en el locus pGAP (3 copias) y el locus HIS4 TT (1 copia), mientras que las 3 copias del gen de la cadena ligera se integraron en el locus pGAP. Las copias del gen de la cadena de anticuerpo estaban cada una bajo el control del promotor GAP. Los parámetros de control del proceso del biorreactor se establecieron como sigue: agitación 1000 rpm, flujo de aire 1,35 litros estándar por minuto, temperatura 28 °C, y el pH se controló (a 6) usando hidróxido de amonio. No se proporcionó ningún suplemento de oxígeno.
Después de la adición del inóculo, los cultivos de fermentación se cultivaron durante aproximadamente 12 a 16 horas (la "fase de crecimiento"). La fase de crecimiento terminó cuando se consumió el glicerol inicial en el medio, que se detectó mediante un pico de oxígeno disuelto ("OD") (un aumento repentino en la concentración de oxígeno disuelto). A continuación, los cultivos se privaron de alimento durante aproximadamente tres horas después del pico de oxígeno disuelto ("fase de inanición") para el experimento L306. Para otros experimentos, el bolo de etanol se añadió inmediatamente después del pico de OD. Luego se añadió un bolo de etanol al reactor para obtener una concentración final de etanol al 1 % (en p/v). Los cultivos de control se trataron de forma idéntica, excepto que se omitió la adición del bolo de etanol. Se dejó que los cultivos de fermentación se equilibraran durante 15 a 30 minutos ("fase de equilibrio"). Después de la fase de equilibrado, se añadió una alimentación a una tasa constante de 30 g/L/h durante 40 minutos ("fase de transición"). Para el resto del cultivo ("fase de producción"), la concentración de etanol se detectó usando una sonda detectora de etanol (Raven Biotech) que se usó para controlar la tasa de alimentación, con la tasa de alimentación establecida en 15 g/L/h cuando la concentración de etanol estaba por debajo del punto fijado, o en 7,5 g/L/hr cuando la concentración de etanol estaba por encima del punto fijado. En los casos en los que la alta tasa de alimentación de 15 g/L/h no fue lo suficientemente alta para mantener el etanol en el punto fijado (esto se produjo en el experimento de fermentación L315), la alta tasa de alimentación se estableció en 22,5 g/L/hr mientras que la tasa de alimentación baja se fijó en 15 g/L/h. Se mantuvo el mismo punto fijado tanto si se había añadido un bolo de etanol al cultivo como si no (la producción de etanol por la levadura hizo que se alcanzara el punto fijado sin la adición de bolo de etanol). La alimentación estaba compuesta por los siguientes componentes: extracto de levadura 50 g/L, dextrosa anhidra 500 g/L, sulfato de magnesio heptahidratado 3 g/L, metales traza PTM1 12 mL/L y citrato de sodio dihidratado 0,5 g/L. El tiempo de fermentación total fue típicamente de 85 horas a 97 horas en estos experimentos, aunque también se pueden usar tiempos más largos y más cortos.
Después de la fase de producción, se añadieron PEI (polietilenimina) y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) a los cultivos de fermentación, añadidos a concentraciones finales del 0,05 % en p/v y 3 mM, respectivamente. A continuación, los cultivos se centrifugaron en una centrífuga y los anticuerpos se purificaron del sobrenadante del cultivo por afinidad con proteína A. Brevemente, se diluyeron aproximadamente 20 ml de sobrenadantes aclarados de 0,2 g del caldo de fermentación recolectado con el mismo volumen de tampón de equilibrio (histidina 20 mM, pH 6). A partir de este caldo diluido, se cargaron 20 ml en una columna HiTrap MabSelect Sure de 1 ml preequilibrada (GE, Piscataway, NJ). La columna se lavó posteriormente usando 40 volúmenes de columna de tampón de equilibrio. El anticuerpo unido a la columna se eluyó usando un gradiente escalonado en tampón de elución al 100 % (ácido cítrico 100 mM, pH 3,0). Se recogieron fracciones de 1 ml y se neutralizaron inmediatamente usando 100 gl de tampón Tris 2 M, pH 8,0. Las fracciones que contienen proteínas se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nM y se combinaron las fracciones que contenían proteínas.
Se analizó la pureza de los anticuerpos purificados con proteína A mediante SDS-PAGE. Para las muestras no reducidas, se llevó a cabo una SDS-PAGE utilizando geles de poliacrilamida prefabricados (geles NuPAGE® Bis-Tris) que contenían un gradiente de poliacrilamida al 4 %-12 %, utilizando tampón de ejecución de SDS NuPAGE® MES y tampón de muestras NuPAGE® LDS (todos de Invitrogen, Carlsbad, Ca.) según las instrucciones del fabricante. A continuación, las proteínas se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie. Las muestras reducidas se procesaron de la misma manera excepto que las muestras se redujeron antes de la carga usando el agente reductor de muestras NuPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, Ca.) según las instrucciones del fabricante.
Resultados
Para determinar el efecto de la adición de un bolo de etanol durante el cultivo sobre la pureza del anticuerpo, el anticuerpo Ab-A se produjo a partir de cultivos de levadura con o sin la adición de un bolo de etanol hasta una concentración final del 1 % (10 g/L) al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. La fase de producción continuó durante 97 horas (figura 1), 87 horas (figura 2), o 86 horas (figura 3). A continuación, se recogió el anticuerpo producido por cada cultivo del medio de cultivo, se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A.
Se utilizó una SDS-PAGE para detectar la abundancia relativa del anticuerpo completo, el "medio anticuerpo" o complejo H1L1 (que contiene una cadena pesada y una ligera) y el complejo H2L1 (que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera). La abundancia de los complejos H1L1 y H2L1 disminuyó considerablemente en los cultivos que se produjeron con la adición del bolo de etanol. Esta mejora se reprodujo en tres experimentos mostrados en la figura 1A, comparar los carriles 2 y 3 (con bolo) con el carril 5 (sin bolo); figura 2A, comparar el carril 2 (con bolo) con el carril 3 (sin bolo); figura 3A, comparar los carriles 2 y 4 (con bolo) con los carriles 5-7 (sin bolo). En condiciones reductoras, las especies de anticuerpos H1L1, H2L1 y completo se separaron en cadenas ligeras y pesadas individuales, lo que confirma la identidad de la banda de 75 kDa como una cadena ligera y una pesada unidas por un enlace disulfuro (figuras 1B y 2B; el orden de los carriles es el mismo que en las figuras 1A y 1B, respectivamente).
Después se cuantificó la disminución en la abundancia de la especie H1L1 usando ImageJ para representar gráficamente la densidad de la banda de gel a lo largo de la longitud de los geles no reducidos (figuras 1C-E y 2C-D, que corresponden respectivamente a la figura 1A, carriles 2, 3 y 5, y la figura 2A, carriles 2 y 3, y la figura 3b, que corresponde los carriles 2 y 4-6 de la figura 3A). Se cuantificó el área bajo el pico de H1L1 y los resultados se tabulan en las figuras 1F, 2E y 3B. Con base en estas mediciones, la adición de un bolo de etanol antes de la producción de anticuerpos disminuyó la abundancia relativa de la banda de 75 kDa en aproximadamente un 90 % en la figura 1A, en aproximadamente un 85 % en la figura 2A, y en aproximadamente un 87 % en la figura 3A.
En resumen, estos resultados demuestran que la concentración de la especie H1L1 se redujo en gran medida por la adición en bolo de etanol al cultivo, lo que resultó en una disminución de la producción de la especie H1L1 entre aproximadamente el 85 % y el 90 %.
Ejemplo 2
Este ejemplo amplía los resultados obtenidos en el ejemplo 1 al demostrar que los mismos métodos produjeron una mejora similar en la pureza del anticuerpo cuando se usaron durante la producción de dos anticuerpos adicionales.
Métodos
Los anticuerpos Ab-B y Ab-C se produjeron de forma recombinante usando los métodos descritos en el ejemplo 1. El anticuerpo Ab-C se expresó a partir de una cepa de levadura diseñada para contener cuatro copias de la secuencia codificadora de la cadena pesada (SEQ ID NO:439) y tres copias de la secuencia codificadora de la cadena ligera (SEQ ID NO:438). Se tomaron muestras de los reactores y se recogió el sobrenadante del cultivo que contenía los anticuerpos después de un tiempo total de fermentación de 67 horas (T67) u 87 horas (T87) para el anticuerpo Ab-B, y de 86 horas (T86) para el anticuerpo Ab-C, se purificaron por afinidad de proteína A, y se analizaron mediante SDS-PAGE como se describe en el ejemplo 1.
Resultados
Los anticuerpos Ab-B (figura 4) y Ab-C (figura 5) se produjeron con o sin la adición de un bolo de etanol hasta una concentración final del 1 % al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. Para los anticuerpos producidos sin la adición de un bolo de etanol, la especie H1L1 o medio anticuerpo y la especie H2L1 se observaron cada una como una banda prominente (figura 4A, carriles 6 y 7; figura 4C, carriles 6 y 7; figura 5A, carriles 5 y 6). La intensidad de estas bandas se redujo en gran medida para el cultivo producido con la adición de un bolo de etanol (figura 4A, carriles 2-3; figura 4C, carriles 2-3; figura 5A, carril 3). En condiciones reductoras, las bandas de H1L1 y H2L1 se separaron en cadenas ligeras y pesadas individuales, lo que confirma la identidad de estas especies como cadenas pesadas y ligeras de longitud completa (figura 4B, 4D y 5B; el orden de los carriles es el mismo que en las figuras 4A, 4D y 5A, respectivamente).
A continuación, se cuantificó la disminución en la abundancia de la especie H1L1 usando ImageJ para representar gráficamente la densidad de la banda de gel a lo largo de la longitud de los geles no reducidos. Las figuras 4E y 4F tabulan el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en las figuras 4A (T67) y 4C (T87), respectivamente, lo que demuestra que la adición del bolo de etanol produjo una reducción de aproximadamente un 73 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 en el momento más temprano mostrado en la figura 4A y una reducción promedio de aproximadamente el 34 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 en el momento más tardío mostrado en la figura 4C. Del mismo modo, la figura 5C tabula el área contenida en los picos de H1L1 que se muestran en las figuras 5A, que demuestra una reducción promedio de aproximadamente un 61 % en la abundancia relativa de complejos H1L1 por la adición de bolo de etanol.
En resumen, estos resultados demuestran que la concentración de las especies H1L1 y H2L1 disminuyó entre aproximadamente un 61 % y un 73 % mediante la adición de un bolo de etanol al cultivo para dos anticuerpos adicionales que tienen especificidad de unión a diferentes dianas.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe además la pureza mejorada de los anticuerpos recombinantes producidos a partir de células de P. pastoris cultivadas mediante la adición de un bolo de etanol durante el cultivo. Además de disminuir en gran medida la abundancia de las especies H1L1 y H2L1, este ejemplo demuestra además una disminución en la concentración de otras variantes asociadas al producto.
Métodos
Los anticuerpos recombinantes Ab-A, Ab-B y Ab-C se prepararon y purificaron a partir de cultivos de P. pastoris como se describe en los ejemplos 1 y 2. Los anticuerpos se produjeron con o sin la adición de un bolo de etanol hasta una concentración final del 1 % (en p/v) al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. Para analizar la pureza de las preparaciones de anticuerpos purificados con proteína A, se utilizó cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (SE-HPLC). Brevemente, se utilizó un instrumento de HPLC con detección de UV Agilent (Santa Clara, CA) serie 1200. Para la separación de muestras, se usó una columna TSKgel 3000SWxl de 7,8 x 300 mm conectada con un TSKgel Guard SWxl de 6 x 40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA). Se usó una disolución de fosfato de sodio 100 mM, cloruro de sodio 200 mM, pH 6,5, como fase móvil con un caudal de 0,5 ml/min en modo isocrático y se controló la absorbancia a UV 215 nm. Antes de la inyección de las muestras, la columna se equilibró hasta que se alcanzó una línea de base estable. Las muestras se diluyeron hasta una concentración de 1 mg/mL usando fase móvil y se inyectó un volumen de 30 pL. Para controlar el rendimiento de la columna, se utilizaron patrones de filtración en gel BioRad (Hercules, CA).
Resultados
Las preparaciones de anticuerpo Ab-A descritas en el ejemplo 1 y otras preparaciones producidas usando los mismos métodos se expresaron en levadura, se purificaron por afinidad de proteína A y luego se analizaron para determinar su pureza usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). En las condiciones utilizadas, la especie de medio anticuerpo (H1L1) coeluye con el anticuerpo completo, lo que se cree que se debe a una asociación no covalente entre pares de medios anticuerpos. Sin embargo, este método permite evaluar la pureza con respecto a otras variantes asociadas al producto, y estos complejos tienen una estequiometría aberrante, son fragmentos, formas glicosiladas y agregados.
Los datos de SE-HPLC se muestran para muestras de Ab-A producidas sin la adición de un bolo de etanol (figuras 6A, 6C y 6E) o con la adición de un bolo de etanol (figuras 6B, 6D y 6F). Se detectó una variante asociada al producto que consistía en un agregado de dos anticuerpos completos (que contenían cuatro cadenas pesadas y cuatro ligeras) (flecha), y su abundancia se redujo en promedio en las muestras preparadas con la adición del bolo. La figura 7 muestra la cuantificación de la pureza de Ab-A determinando el porcentaje de preparación de anticuerpo contenido en el pico principal (que contiene el anticuerpo completo). La adición del bolo de etanol aumentó el porcentaje promedio contenido en el pico principal del 80,3 % al 90,6 %.
Se realizó un análisis similar para las preparaciones de anticuerpos Ab-B y Ab-C descritas en el ejemplo 2, cuantificadas en las figuras 8 y 9, respectivamente. Se mejoró la pureza global del anticuerpo Ab-B, aumentando la fracción promedio en el pico principal del 76 % al 79 % en T67 y del 60 % al 73 % en T87. Para el anticuerpo Ab-C, hubo poca diferencia detectable en la pureza del anticuerpo evaluada por este método, aparentemente debido a la alta pureza inicial del anticuerpo Ab-C incluso sin la adición del bolo.
En resumen, estos resultados demuestran que la adición de un bolo de etanol al cultivo puede disminuir la concentración de otras variantes asociadas al producto además de la especie de medio anticuerpo.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe la confirmación adicional de la identidad de la variante asociada al producto de 75 kDa como una especie de medio anticuerpo que contiene solo una cadena pesada de anticuerpo y solo una cadena ligera de anticuerpo. Esta hipótesis se basó en varias observaciones. En primer lugar, la banda de 75 kDa estaba presente en muestras purificadas con proteína A (ver el ejemplo 1), lo que indica que contenía al menos la porción de unión a proteína A de una cadena pesada de anticuerpo. En segundo lugar, la banda de 75 kDa fue prominente en las muestras no reducidas analizadas por SDS-PAGE (ver, por ejemplo, la figura 1A, carriles 2-3), pero, en condiciones reductoras, las mismas muestras no contenían ninguna banda de intensidad comparable (aparte de las cadenas ligeras y pesadas esperadas), lo que indica que la banda de 75 kDa no incluye ningún componente que no sean las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (u otras especies que tengan la misma movilidad electroforética). En tercer lugar, la desaparición de la banda de 75 kDa de las muestras reducidas también indica que sus constituyentes están unidos por al menos un enlace disulfuro. En cuarto lugar, el análisis SEC había demostrado la coelución de las especies de 75 kDa con el anticuerpo completo, lo que sugiere con intensidad que las especies de 75 kDa pueden autoasociarse de forma no covalente para formar un anticuerpo completo (u otro complejo del mismo radio hidrodinámico aparente). Por último, el peso molecular aparente de aproximadamente 75 kDa (determinado por referencia a patrones de electroforesis), tomado junto con la observación (de geles desnaturalizantes) de que este complejo solo estaba compuesto por cadenas de anticuerpos de longitud completa, fue coherente con el complejo que contenía solo una cadena pesada y sólo una cadena ligera, pero era incompatible con otros complejos.
Métodos
Se utilizó espectrometría de masas para detectar la abundancia relativa de cadenas pesadas que carecen de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas (que normalmente se encuentran en los aminoácidos 220 y 223) en diferentes muestras. Se añadieron 250 microgramos de cada muestra a un tubo Eppendorf. Se añadió al tubo una cantidad apropiada (aproximadamente 450 pL) de tampón desnaturalizante (guanidina-HCl 6 M, EDTA 1 mM, Tris 0,25 M, pH 7,5) para obtener un volumen final de 500 pL y una concentración de muestra de 0,5 mg/mL. Se añadieron doce microlitros y medio de yodoacetamida 2 M a cada muestra para alquilar cualquier cisteína libre. Las muestras se agitaron en vórtice y luego se incubaron a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 ± 5 minutos. A continuación, las muestras se desalaron utilizando columnas NAP-5 preequilibradas con tampón de digestión (Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5). Cada disolución de muestra se añadió a columnas separadas (preequilibradas) y se dejó que entrase en el lecho de la columna. Se añadió un mililitro de tampón de digestión a cada columna y el eluyente se recogió en tubos Eppendorf. Las muestras se dividieron en partes alícuotas iguales que contenían aproximadamente 50 gg de material (cinco partes alícuotas de 200 gL). Las partes alícuotas alquiladas y desaladas se conservaron a -20 °C hasta que se necesitaron. Se utilizó una parte alícuota de cada muestra (alquilada y desalada) para cada digestión. Se añadió una disolución de tripsina a 0,5 mg/ml a cada parte alícuota de muestra en una proporción de tripsina: proteína de 1:25 p:p (4 gl). Todos los tubos de tripsina se incubaron a 37 ± 2 °C durante 4 horas. Después de la incubación, se interrumpió la digestión enzimática añadiendo 1 gl de ácido trifluoroacético a cada tubo. A continuación, las muestras se dividieron en dos porciones iguales, reducidas y no reducidas. La mitad de las muestras se redujeron en presencia de DTT 1 M durante 1 hora a 37 ± 2 °C. Los contenidos de las muestras tanto reducidas como no reducidas se transfirieron a viales de HPLC y se colocaron en el muestreador automático para su análisis.
Los datos de MS y MS/MS se recogieron en un espectrómetro de masas Micromass Q-TOF Ultima usando ionización por electropulverización (ESI) en modo de iones positivos. Los datos se adquirieron de m/z 200-1950 en modo MS. Antes del análisis, el espectrómetro de masas se calibró utilizando un ajuste de quinto orden en iones de fragmentos de [Glu1]-fibrinopéptido que cubre un intervalo de m/z 175 a 1285. Los volúmenes de las inyecciones se ajustaron para lograr una carga en la columna de aproximadamente 20 pmoles de proteína.
Resultados
Con base en las observaciones analizadas anteriormente, los solicitantes plantearon la hipótesis de que la banda de 75 kDa era una especie de "medio anticuerpo" que contenía una cadena de anticuerpo pesada y una cadena de anticuerpo ligera unidas covalentemente entre sí a través de enlaces disulfuro, y que los pares de complejos de medio anticuerpo podían asociarse no covalentemente para formar un complejo que tiene la misma estequiometría que un anticuerpo completo (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras), pero que carecen de los enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas ("cadenas pesadas no unidas"). En base a esto, se predijo que la abundancia relativa de la banda de 75 kDa se correlacionaría con la proporción relativa de cadenas pesadas no unidas, que se determinó usando un análisis de espectrometría de masas de muestras de anticuerpos digeridas con tripsina.
Los fragmentos de péptidos de interés para este estudio fueron el fragmento de tripsina T17 de la cadena pesada (T17H) que está compuesto por los aminoácidos 217-242, respectivamente. Los aminoácidos 220 y 223 son responsables del enlace disulfuro entre las cadenas pesadas de anticuerpo. Normalmente, el análisis de cisteína libre se puede realizar determinando una relación de restos cisteína alquilados a restos no alquilados en muestras reducidas después de una digestión tríptica. Sin embargo, las especies alquiladas no estaban presentes en ninguno de los lotes de material. Se planteó la hipótesis de que los dos restos cisteína del fragmento de péptido de interés, T17H, se unían entre sí, o que las cisteínas estaban protegidas por la estructura cuaternaria del anticuerpo. En cualquier caso, los restos cisteína no serían accesibles para la alquilación. En cambio, la estrategia analítica consistió en utilizar la proporción de especies no reducidas a especies reducidas en ambos lotes para calcular una diferencia porcentual. Se observó que las muestras no reducidas tenían una disminución de 2 Da en el peso molecular, indicativo de la presencia de enlaces disulfuro. Este comportamiento se aprovechó para calcular el porcentaje de T17H libre. La masa teórica de la especie T17H no reducida es 2727,41 Da (enlace disulfuro entre Cys220 y Cys223) y 2729,41 Da para el péptido reducido.
Los cromatogramas de iones extraídos de muestras reducidas y no reducidas se analizaron para estados de carga representativos. La proporción de recuentos entre las muestras no reducidas y reducidas calcula que la especie de T17H libre es del 2,3 % en el anticuerpo producido con la adición de un bolo de etanol y del 26,1 % en la muestra producida sin la adición de un bolo de etanol. Estos resultados se presentan en forma de tabla en la figura 9.
Por lo tanto, la abundancia de cadenas pesadas que carecen del enlace disulfuro entre cadenas pesadas aumentó considerablemente en la muestra producida sin la adición del bolo de etanol, lo que confirma aún más la identidad de esta especie como que contiene una cadena pesada y una cadena ligera, pero que carece de un enlace disulfuro entre cadenas pesadas. Además, la detección de una especie 2 Da más ligera que la masa esperada indicó que la cadena pesada en la especie H1L1 podría contener un enlace disulfuro adicional con sí misma que puede interferir con la formación del enlace disulfuro normal entre cadenas pesadas.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra una correlación entre la viabilidad celular y la pureza del anticuerpo. La adición de un bolo de etanol generalmente mejoró la viabilidad celular y la pureza para el anticuerpo Ab-A y el anticuerpo Ab-B. Además, el anticuerpo Ab-C, que ya presentaba una alta pureza incluso sin la adición del bolo, también exhibía una mayor viabilidad de cultivo. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la mejora en la pureza del anticuerpo resultante de la adición de un bolo de etanol es al menos parcialmente atribuible a una mayor viabilidad del cultivo.
Métodos
La viabilidad del cultivo se determinó usando un Cellometer (Nexcelom). Las muestras de cultivo se diluyeron con PBS para que el recuento celular final estuviera dentro de 1 x 107 hasta 5 x 107 células/mL. La mitad de la muestra se trató luego a condiciones de calor de 75 °C durante 10 minutos como control positivo para la tinción con yoduro de propidio (PI). La muestra sin tratar y la muestra tratada se mezclaron luego con PI (20 uL de muestra más 20 uL de PI). A continuación, se colocó la muestra en un módulo de portaobjetos y se determinó la viabilidad contando el número de células no fluorescentes y luego dividiendo entre el número total de células. Las células que están muertas han absorbido el yoduro de propidio y son fluorescentes, por lo que la muestra de control positivo muerta por calor debe mostrar menos del 1 % de células vivas.
Resultados
La viabilidad celular se determinó para cultivos productores de anticuerpos desarrollados con o sin la adición de un bolo de etanol como se describe en los ejemplos 1 y 2. Como se describió anteriormente, la pureza de los anticuerpos Ab-A y Ab-B mejoró en gran medida mediante la adición de un bolo de etanol al cultivo de levaduras (véanse los ejemplos 1 -2 y las figuras 1 -4). La adición de un bolo de etanol también mejoró la viabilidad celular de estos cultivos. Para el anticuerpo Ab-A, la viabilidad mejoró del 91,9 % al 97,2 % en promedio (figura 11), mientras que para el anticuerpo Ab-B, la viabilidad mejoró del 84,8 % al 95,1 % en promedio (figura 12). Debido a la ya alta pureza del anticuerpo Ab-C producido incluso sin la adición del bolo de etanol, las mejoras en la pureza de este anticuerpo resultantes de la adición del bolo de etanol fueron más modestas (ver ejemplo 3 y figura 5). En coherencia con la observación de que la alta viabilidad celular se correlaciona con una mayor pureza de anticuerpos, los cultivos de anticuerpos Ab-C exhibieron una alta viabilidad celular (95,8 % en promedio) en ausencia de la adición de un bolo de etanol, que se modificó poco por la adición del bolo de etanol (96,8 %).
Tomados en conjunto, estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo resultante de la adición de un bolo de etanol puede estar causada en parte por una mejora en la viabilidad celular, o al menos se correlaciona con esta.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra que se puede lograr una mejora similar en la pureza del anticuerpo con concentraciones variables de bolo de etanol.
Métodos
El anticuerpo Ab-A se produjo como en el ejemplo 1, excepto que la adición del bolo de etanol fue de 5 g/L (al 0,5 % en p/v), 10 g/L (al 1 % en p/v) o 15 g/L (al 1,5 % en p/v). Las muestras de anticuerpos se purificaron del medio de cultivo a las 63 y 86 horas y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se analizó la pureza mediante SDS-PAGE no reducida como en el ejemplo 1.
Resultados
La pureza del anticuerpo fue similarmente alta independientemente de la concentración de bolo añadida (entre el 0,5 % y el 1,5 % en p/v), en ambos momentos ensayados, 63 horas (figura 14A) y 86 horas (figura 14B). Los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 fueron similarmente bajos en cada cultivo.
Estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo se puede lograr variando la concentración del bolo de etanol.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra que se pueden lograr mejoras similares en la pureza del anticuerpo variando la duración del "período de inanición" entre el pico de oxígeno disuelto y la adición del bolo de etanol a los cultivos.
Métodos
El anticuerpo Ab-A se produjo como en el ejemplo 1, excepto que la duración del período de inanición, el tiempo entre el pico de oxígeno disuelto (que indica el agotamiento de la fuente de carbono en el cultivo) y la adición del bolo de etanol, fue de 0 horas o 3 horas. Las muestras de anticuerpos se purificaron del medio de cultivo y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se analizó la pureza mediante SDS-PAGE no reducida como en el ejemplo 1.
Resultados
La pureza del anticuerpo fue similarmente alta independientemente de la variación del período de inanición entre 0 y 3 horas (figura 15A, comparar los carriles 5 (0 horas de inanición) y 6 (3 horas de inanición)). Los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 fueron similarmente bajos en cada cultivo.
Estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo se puede lograr variando la duración del período de inanición.
Ejemplo 8
Este ejemplo ensaya el efecto sobre la pureza del anticuerpo al variar la duración del "período de equilibrio" entre la adición del bolo de etanol y el comienzo de la adición de la alimentación a los cultivos.
Métodos
El anticuerpo Ab-B se produjo como en el ejemplo 2, excepto que la duración del período de equilibrio, el tiempo entre la adición del bolo de etanol y el comienzo de la alimentación del cultivo, fue de 0, 30 o 60 minutos. Además, la cepa de levadura a partir de la cual se produjo el anticuerpo Ab-B contenía tres copias del gen de la cadena ligera en lugar de cuatro. Las muestras de anticuerpos se purificaron del medio de cultivo y se purificaron por afinidad de proteína A, luego se analizó la pureza mediante SDS-PAGE no reducida como en el ejemplo 1. También se evaluó la viabilidad usando los métodos descritos en el ejemplo 5.
Resultados
La pureza del anticuerpo fue similarmente alta para un período de equilibrio de 0 o 30 minutos (figura 16A, carriles 7 y 8 (tiempo de equilibrio de 0 minutos) y carril 3 (tiempo de equilibrio de 30 minutos). Sin embargo, los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 aumentaron en el cultivo con el período de equilibrio de 60 minutos (figura 16A, carriles 5 y 6).
También se evaluó la viabilidad para cada cultivo en los momentos de 23 horas y 85 horas. Para el período de equilibrio de 60 minutos, la viabilidad estuvo entre el 75 % y el 80 % a las 23 horas, mientras que, en el mismo momento, la viabilidad fue aproximadamente del 88-90 % para los períodos de equilibrio de 0 y 30 minutos (figura 16B). Posteriormente, a las 85 horas, la viabilidad había mejorado, pero permaneció algo reducida durante el período de equilibrio de 60 minutos con respecto a los períodos de equilibrio de 0 y 30 minutos (figura 16C).
Estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo se puede lograr variando el período de equilibrio al menos entre 0 y 30 minutos, mientras que puede producirse cierta pérdida de viabilidad y pureza durante un período de equilibrio de 60 minutos o más (aunque la pureza aún puede mejorar en relación con un cultivo de control sin la adición de un bolo de etanol).
La descripción anterior de varias realizaciones ilustradas de la invención no pretende ser exhaustiva ni limitar la invención a la forma precisa descrita. Las indicaciones proporcionadas en el presente documento de la invención se pueden aplicar a otros fines, distintos de los ejemplos descritos anteriormente.
La invención se puede poner en práctica de formas distintas a las descritas concretamente en la descripción y los ejemplos anteriores.
Estos y otros cambios se pueden realizar en la invención a la luz de la descripción detallada anterior. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no deben interpretarse como que limitan la invención a las realizaciones específicas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones. Por consiguiente, la invención no está limitada por la memoria descriptiva, sino que el alcance de la invención se determinará en su totalidad mediante las siguientes reivindicaciones.
Ciertas indicaciones relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y las modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antígeno se describieron en la solicitud internacional n.° PCT/US2008/064421, correspondiente a la publicación internacional n.° WO/2008/144757, titulada "Nuevos métodos de humanización de anticuerpos de conejo y anticuerpos de conejo humanizado", presentada el 21 de mayo de 2008.
Ciertas indicaciones relacionadas con la producción de anticuerpos, o sus fragmentos, usando levaduras competentes para el apareamiento y los correspondientes métodos se describen en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 11/429.053, presentada el 8 de mayo de 2006 (publicación de solicitud de patente de EE. uU. n.° US2006/0270045).

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un método para producir un complejo de múltiples subunidades, que comprende:
    (a) proporcionar un cultivo que comprende células de Pichia pastoris que comprenden genes que proporcionan la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades;
    (b) añadir un bolo de etanol a dicho cultivo, lo que da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre el 0,5 % y el 1,5 % (en p/v); y
    (c) agregar una alimentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable a dicho cultivo, y cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades,
    en el que dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo completo o de longitud completa que comprende polipéptidos de cadena pesada y ligera,
    en el que dicho complejo de múltiples subunidades no es un anticuerpo anti-NGF que contiene las secuencias polipeptídicas SEQ ID n O:401 y SEQ ID NO:402.
  2. 2. - El método de la reivindicación 1, en el que:
    (i) el bolo de etanol mejora la formación de enlaces disulfuro estables con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (ii) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de una o más variantes asociadas al producto con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (iii) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de variantes asociadas al producto que tienen un peso molecular aparente mayor o menor que dicho anticuerpo deseado, según se detecta mediante cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel, con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (iv) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de anticuerpos que tienen una estequiometría aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (v) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de anticuerpos que tienen enlaces disulfuro aberrantes con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (vi) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de anticuerpos que tienen cisteínas reducidas con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (vii) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de anticuerpos que tienen una glicosilación aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol;
    (viii) el método de cultivo modula la formación o la estabilidad de enlaces disulfuro entre cadenas pesadas; (ix) el método de cultivo modula la formación o la estabilidad de enlaces disulfuro que unen las cadenas ligera y pesada de dicho anticuerpo;
    (x) el método de cultivo disminuye la abundancia relativa de una o más de las variantes asociadas al producto H1L1, H2L1 yH 4L4;o
    (xi) el método de cultivo aumenta la pureza de dicho anticuerpo con respecto a dicho método efectuado en ausencia de dicho bolo de etanol.
  3. 3. - El método de la reivindicación 1 o 2, en el que:
    (i) la etapa (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre el 0,7 % y el 1,5 %, o entre el 0,8 % y el 1,25 % (en p/v);
    (ii) la etapa (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que es del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 % o 0,9 % (en p/v);
    (iii) la etapa (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que es del 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 % o 0,5 % (en p/v);
    (iv) la etapa (b) comprende agregar etanol a dicho cultivo, agregar un vehículo que comprende etanol a dicho cultivo, agregar dichas células a un medio o vehículo que comprende etanol, o reemplazar parte del medio de cultivo;
    (v) el bolo de etanol se agrega al medio de cultivo durante un período de tiempo de entre 1 y 20 minutos; (vi) la etapa (c) comprende suministrar oxígeno a dichas células;
    (vii) la etapa (c) comprende suministrar oxígeno a dichas células agitando el cultivo;
    (viii) la etapa (c) comprende suministrar oxígeno a dichas células poniendo en contacto dicho cultivo con una mezcla de gases que comprende oxígeno;
    (ix) la etapa (c) comprende añadir una alimentación que comprende uno o más de glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, manosa, manitol y rafinosa;
    (x) el método de cultivo comprende además mantener la concentración de etanol entre un punto fijado superior y un punto fijado inferior durante la etapa (c);
    (xi) el método de cultivo comprende además mantener la concentración de etanol entre un punto fijado superior y un punto fijado inferior durante la etapa (c), en el que dicho punto de ajuste inferior es del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 % o 0,9 % (en p/v);
    (xii) el método de cultivo comprende además mantener la concentración de etanol entre un punto fijado superior y un punto fijado inferior durante la etapa (c), en el que dicho punto de ajuste superior es del 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 % o 0,6 % (en p/v); o
    (xiii) el método de cultivo comprende además mantener la concentración de etanol entre un punto fijado superior y un punto fijado inferior durante la etapa (c), en el que dicho punto de ajuste inferior es del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 % o 0,9 % (en p/v) y dicho punto de ajuste superior es del 1,5 %, 1,4 %, 1,3 %, 1,2 %, 1,1 %, 1,0 %, 0,9 %, 0,8 %, 0,7 % o 0,6 % (en p/v).
    todo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que:
    (i) la concentración de etanol se mantiene en un punto fijado durante la etapa (c);
    (ii) la concentración de etanol se mantiene en un punto fijado que es del 0,5 %, 0,6 %, 0,7 %, 0,8 %, 0,9 %, 1 %, 1,1 %, 1,2 %, 1,3 %, 1,
  4. 4 % o 1,5 % (en p/v) durante la etapa (c);
    (iii) la etapa (c) comprende mantener la concentración de etanol en dicho cultivo entre el 0,7 % y el 1,5 %, o entre el 0,8 % y el 1,25 % (en p/v);
    (iv) la concentración de etanol en el cultivo de la etapa (c) se mantiene controlando la producción de etanol por dichas células o mediante la adición de etanol a dicho cultivo;
    (v) la concentración de etanol en el cultivo de la etapa (c) se mantiene controlando la producción de etanol por dichas células o mediante la adición de etanol a dicho cultivo, en el que la etapa de controlar la producción de etanol comprende controlar una o más de la concentración de glucosa, la disponibilidad de oxígeno, la intensidad de agitación, la presión de gas, el caudal del aire suministrado u otra mezcla de gases, la viscosidad del cultivo, la densidad del cultivo, la concentración de oxígeno en el aire suministrado u otra mezcla de gases y la temperatura;
    (vi) el tiempo entre la etapa (a) y la etapa (b) es menos de 72 horas, menos de 48 horas, menos de 24 horas, menos de 12 horas, menos de 9 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas, menos de 3 horas, menos de 90 minutos, menos de 30 minutos, menos de 5 minutos o menos de 1 minuto;
    (vii) el tiempo entre la etapa (b) y la etapa (c) es menos de 10 horas, menos de 9 horas, menos de 8 horas, menos de 7 horas, menos de 6 horas, menos de 5 horas, menos de 4 horas , menos de 3 horas, menos de 2 horas, menos de 90 minutos, menos de 80 minutos, menos de 70 minutos, menos de 60 minutos, menos de 50 minutos, menos de 40 minutos, menos de 30 minutos, menos de 20 minutos, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos o menos de 1 minuto;
    (viii) el cultivo de la etapa (a) se produce añadiendo una fuente de carbono a dicho cultivo y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono;
    (ix) el cultivo de la etapa (a) se produce agregando una fuente de carbono a dicho cultivo y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono, en el que dicha fuente de carbono comprende uno o más de: glicerol, glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, manosa, manitol y rafinosa.
    (x) el cultivo de la etapa (a) se produce agregando una fuente de carbono a dicho cultivo, y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono, en el que el agotamiento de la fuente de carbono se determina detectando una disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris;
    (xi) el cultivo de la etapa (a) se produce agregando una fuente de carbono a dicho cultivo, y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono, en el que el agotamiento de la fuente de carbono se determina detectando una disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris, en el que dicha disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris se identifica detectando una disminución en el consumo de oxígeno por dichas células de Pichia pastoris, detectando un aumento de pH en el cultivo, detectando la estabilización de la masa celular húmeda o detectando un aumento en la concentración de amoniaco en el cultivo; o
    (xii) el cultivo de la etapa (a) se produce agregando una fuente de carbono a dicho cultivo, y cultivando dicho cultivo hasta que se agota la fuente de carbono, en el que el agotamiento de la fuente de carbono se determina detectando una disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris, en el que dicha disminución en la actividad metabólica de dichas células de Pichia pastoris se identifica detectando una disminución en el consumo de oxígeno por dicho Pichia pastoris células, detectando un aumento de pH en el cultivo, detectando la estabilización de la masa celular húmeda, o detectando un aumento en la concentración de amoníaco en el cultivo, en el que dicha disminución en el consumo de oxígeno por dichas células de Pichia pastoris se identifica detectando un aumento en la concentración de oxígeno disuelto en dicho cultivo.
  5. 5. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en el que:
    (i) las células de Pichia pastoris comprenden genes integrados en su genoma que proporcionan la expresión de dicho anticuerpo, en el que dichos genes están integrados en uno o más loci genómicos;
    (ii) las células de Pichia pastoris comprenden genes integrados en su genoma en loci seleccionados del grupo que consiste en el locus pGAP, locus 3' AOX TT; PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG; y el locus HIS4 TT;
    (iii) los genes que codifican las subunidades del anticuerpo se expresan bajo el control de un promotor inducible o constitutivo;
    (iv) los genes que codifican las subunidades del anticuerpo se expresan bajo el control de un promotor inducible seleccionado del grupo que consiste en los promotores AOX1, CUP1, inducible por tetraciclina, inducible por tiamina y FLD1;
    (v) al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del anticuerpo se expresa bajo el control de un promotor seleccionado del grupo formado por: promotores CUP1, AOX1, ICL1, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), FLD1, a Dh 1, alcohol deshidrogenasa II, g Al4, PHO3, PHO5 y Pyk, promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por tiamina, promotores quiméricos derivados de ellos, promotores de levadura, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores de plantas, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores aviares; y/o
    (xi) las células de Pichia pastoris son células diploides, tetraploides o poliploides.
  6. 6. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que además comprende al menos uno de los siguientes:
    (i) purificar dicho anticuerpo a partir de dichas células de Pichia pastoris o a partir del medio de cultivo;
    (ii) purificar dicho anticuerpo a partir de un componente intracelular, citoplasma, nucleoplasma o una membrana de dichas células de Pichia pastoris;
    (iii) las células de Pichia pastoris secretan dicho anticuerpo al medio de cultivo;
    (iv) purificar dicho anticuerpo a partir de dicho medio de cultivo;
    (v) el anticuerpo comprende un anticuerpo monoespecífico o biespecífico;
    (vi) el anticuerpo comprende un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado;
    (vii) el anticuerpo comprende un anticuerpo humanizado, en el que dicho anticuerpo humanizado tiene un origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca;
    (viii) el anticuerpo comprende un anticuerpo humanizado de origen de conejo;
    (ix) el anticuerpo comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente;
    (x) el anticuerpo se purifica a partir de dicho cultivo por afinidad de proteína A y/o proteína G;
    (xi) al menos uno de los genes que proporcionan la expresión de una subunidad de dicho anticuerpo en al menos una de dichas células de Pichia pastoris de dicho panel están optimizados para la expresión en dicha célula de levadura;
    (xii) la pureza de dicho anticuerpo se evalúa midiendo la fracción del anticuerpo producido por dicha célula de levadura que está contenida en complejos de anticuerpos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, está contenida en complejos de anticuerpos que tienen el peso molecular esperado y/o se une específicamente a una diana de dicho anticuerpo;
    (xiii) el rendimiento de dicho anticuerpo se evalúa determinando la cantidad de anticuerpo producido por dicha célula de levadura descontando cualquier variante asociada al producto que esté anómalamente glicosilada, contenida en complejos de anticuerpos distintos de los complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, contenida en complejos de anticuerpos que tienen el peso molecular esperado y/o que no se unen específicamente a la diana de dicho anticuerpo, y el peso molecular de dichos complejos de anticuerpos se determina opcionalmente mediante SDS-PAGE no reductora;
    (xiv) dicho método comprende además purificar dicho anticuerpo;
    (xv) las células del cultivo producen un título de anticuerpo en el sobrenadante de al menos 100 mg/L, al menos 150 mg/L, al menos 200 mg/L, al menos 250 mg/L, al menos 300 mg/L, entre 100 y 300 mg/L, entre 100 y 500 mg/L, entre 100 y 1000 mg/L, al menos 1000 mg/L, al menos 1250 mg/litro, al menos 1500 mg/litro, al menos 1750 mg/litro, al menos al menos 2000 mg/litro, al menos 10000 mg/litro o más;
    (xvi) una o más subunidades de dicho anticuerpo se expresan a partir de más de una copia del gen;
    (xvii) el anticuerpo se expresa entre 1-10 copias de un gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo y entre 1-10 copias de un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo, opcionalmente integrado en el genoma de dichas células;
    (xviii) los genes que proporcionan la expresión de dicho anticuerpo están contenidos en un elemento extracromosómico, plásmido o cromosoma artificial;
    (xix) las células de Pichia pastoris comprenden más copias del gen que proporciona la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que proporciona la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo;
    (xx) las células cultivadas comprenden más copias del gen que proporciona la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que proporciona la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo, en el que el número respectivo de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y el número de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células es: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5, 4 y 3 ,4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6, o 5 y 7; y
    (xxi) las células cultivadas comprenden más copias del gen que proporciona la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que proporciona la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo, y además en el que el número respectivo de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y el número de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células es: 2 y 1,3 y 1,4 y 1,5 y 1,6 y 1,7 y 1,8 y 1,9 y 1, 10 y 1, 1 y 2, 2 y 2, 3 y 2, 4 y 2, 5 y 2, 6 y 2, 7 y 2, 8 y 2, 9 y 2 , 10 y 2, 1 y 3, 2 y 3, 3 y 3, 4 y 3, 5 y 3, 6 y 3, 7 y 3, 8 y 3, 9 y 3, 10 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 3 y 4, 4 y 4, 5 y 4, 6 y 4, 7 y 4, 8 y 4, 9 y 4, 10 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 4 y 5 , 5 y 5, 6 y 5, 7 y 5, 8 y 5, 9 y 5, 10 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6, 4 y 6, 5 y 6, 6 y 6, 7 y 6, 8 y 6, 9 y 6, 10 y 6, 1 y 7, 2 y 7, 3 y 7, 4 y 7, 5 y 7, 6 y 7, 7 y 7, 8 y 7, 9 y 7, 10 y 7, 1 y 8, 2 y 8, 3 y 8, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 8 y 8, 9 y 8, 10 y 8, 1 y 9, 2 y 9, 3 y 9, 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 9 y 9, 10 y 9, 1 y 10, 2 y 10, 3 y 10, 4 y 10, 5 y 10, 6 y 10,
  7. 7 y 10, 8 y 10, 9 y 10, 10 y 10.
    todo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
    (i) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción;
    (ii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción que comprende un medio mínimo;
    (iii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción que comprende un medio mínimo que carece de agentes selectivos;
    (iv) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción que comprende un medio mínimo que carece de aminoácidos preformados u otras biomoléculas complejas;
    (v) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción que comprende un medio complejo;
    (vi) el cultivo de la etapa (c) se cultiva en un medio de producción que comprende un medio complejo que comprende uno o más de extracto de levadura, peptonas de soja y otras peptonas vegetales;
    (vii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular alta;
    (viii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 50 g/L;
    (ix) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 100 g/L;
    (x) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 300 g/L;
    (xi) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 400 g/L;
    (xii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 500 g/L;
    (xiii) el cultivo de la etapa (c) se cultiva hasta una densidad celular que es de al menos 750 g/L;
    (xiv) las células de Pichia pastoris de la etapa (c) se cultivan durante al menos 20 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 20 duplicaciones;
    (xv) las células de Pichia pastoris de la etapa (c) se cultivan durante al menos 50 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 50 duplicaciones; o
    (xvi) las células de Pichia pastoris de la etapa (c) se cultivan durante al menos 100 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo después de dichas al menos 100 duplicaciones.
  8. 8. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que al menos una subunidad del anticuerpo está codificada por un gen que comprende una señal de secreción, en el que opcionalmente la señal de secreción comprende uno o más polipéptidos seleccionados del grupo que consiste en: SEQ ID NO:414 a 437 y cualquier combinación de las mismas.
  9. 9. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el complejo de múltiples subunidades no contiene las seis secuencias de CDR de las SEQ ID NO:5-10, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:15-20, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:25-30, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:35-40, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:45-50, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:55-60, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:65-70, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:75-80, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:85-90, no contiene las seis secuencias de CDR de SeQ ID NO:95-100, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:105-110, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:115-120, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:125-130, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:135-140, no contiene las seis secuencias de CDR de SeQ ID NO:145-150, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:155-160, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:165-170, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:175-180, no contiene las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:185-190 no contienen las seis secuencias de CDR de SEQ ID NO:195-200.
  10. 10. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el complejo de múltiples subunidades no es un anticuerpo anti-NGF.
  11. 11. - El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 10, en el que el complejo de múltiples subunidades no contiene al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco de las CDR contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:5-10, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:15-20, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:25-30, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:35-40, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:45-50, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:55-60, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:65-70, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:75-80, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:85-90, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:95-100, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:105-110, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:115-120, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ iD NO:125-130, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:135-140, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:145-150, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:155-160, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:165-170, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:175-180, un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:185-190, o un anticuerpo que tiene las secuencias de CDR de SEQ ID NO:195-200 y que opcionalmente tiene especificidad de unión a NGF.
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