MX2013013532A - Produccion de alta pureza de proteinas multi-subunitarias tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris. - Google Patents

Produccion de alta pureza de proteinas multi-subunitarias tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris.

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Abstract

Se describen métodos para producir proteínas multi-subunitarias heterólogas en células transformadas. En particular, la presente descripción proporciona métodos mejorados para producir proteínas multi-subunitarias, que incluyen anticuerpos y otras proteínas multi-subunitarias, que pueden o no pueden ser secretadas, con un rendimiento más alto y producción disminuida de productos secundarios indeseados. En modalidades ejemplares, las células transformadas son una levadura, por ejemplo levadura metilotrófica tal como Pichia pastoris.

Description

ñ PRODUCCIÓN EN ALTA PUREZA DE PROTEÍNAS MULTI-SUBUNITARIAS TALES COMO ANTICUERPOS EN MICROBIOS TRANSFORMADOS TAL· COMO PICHIA PASTORIS 5 DESCRIPCION DE SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/525,307 (expediente del agente N° 67858.730200), presentada el 19 de agosto de 10 2011 (con el titulo "MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS", solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/488,660 (expediente del agente N° 67858.730300), presentada el 20 de 15 mayo de 2011, con el título "ANTI-CGRP COMPOSITIONS AND USE THEREOF, " solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/496,860 (expediente del agente N° 67858.760000), presentada el 14 de junio de 2011, con el título "USE OF ANTI-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO PREVENT OR 20 INHIBIT PHOTOPHOBIA IN SUBJECTS IN NEED THEREOF, ESPECIALLY MIGRAINE SUFFERERS," y solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/496,873 (expediente del agente N° 67858.770000), presentada el 14 de junio de 2011, con el título "USE OF ANTI-CGRP ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS TO TREAT DIARRHEA IN SUBJECTS WITH DISEASES OR TREATMENTS THAT RESULT IN ELEVATED CGRP LEVELS", cada una de las cuales se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
Esta solicitud incluye un listado de secuencias que se presenta en formato ASCII mediante EFS-Web, en un archivo denominado "67858o711002.txt", creado el 8 de mayo de 2012 y que tiene un tamaño de 315.392 bytes, que se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia.
CAMPO La presente descripción se refiere generalmente a métodos para producir proteínas heterólogas en células transformadas. En particular, la presente descripción proporciona métodos mejorados para producir proteínas con múltiples subunidades, incluyendo anticuerpos y otras proteínas con múltiples subunidades, que pueden o no secretarse, con producción disminuida de subproductos indeseados y/o un rendimiento aumentado. En ejemplos de modalidades, las células transformadas son una levadura, tal como Pichia pastoris o Saccharomyces cerevísiae.
ANTECEDENTES Los anticuerpos convencionales son proteínas tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos humanos puros de un tipo específicos pueden ser difíciles o imposibles de purificar de fuentes naturales en cantidades suficientes para muchos propósitos. Como consecuencia, las empresas de bioteenología y farmacéutica han cambiado por los métodos basados en ADN para preparar anticuerpos a gran escala. La producción de anticuerpos funcionales generalmente implica no solo la síntesis de los dos polipéptidos sino también una cantidad de eventos postraduccionales, incluyendo procesamiento proteolítico de la secuencia de señal de secreción de extremo N; un plegamiento y montaje adecuados de polipéptidos en tetrámeros; formación de enlaces disulfuro y típicamente incluyen una glicosilación unida a N específica. Todos estos eventos tienen lugar en la vía secretora de células eucariotas, un complejo de organelos único para las células eucariotas .
La síntesis recombinante de tales proteínas complejas ha dependido típicamente de cultivos de células eucariotas mayores para producir material biológicamente activo, donde las células de mamíferos cultivadas se usan muy comúnmente. Sin embargo, los sistemas de producción basados en cultivo de tejido de mamíferos provocan más gastos y complicaciones significativas con respecto a los métodos de fermentación microbiana. Además, los productos derivados de cultivo de células de mamíferos pueden requerir pruebas de seguridad adicionales para asegurar que estén libres de patógenos de mamíferos (incluyendo virus) que podrían estar presentes en las células cultivadas o productos derivados de animales usados en cultivo, tal como suero.
El trabajo anterior ha ayudado a establecer la levadura Pichia pastor is como una plataforma rentable para producir anticuerpos funcionales que son potencialmente adecuados para investigación, diagnóstico y uso terapéutico. Véase patentes estadounidenses de propiedad conjunta 7,935,340 y 7,927,863, cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. También se conocen métodos en la bibliografía para diseñar y optimizar las fermentaciones de P. pastoris para la expresión de proteínas recombinantes, incluyendo la optimización de la densidad celular, volumen del caldo, velocidad de alimentación del sustrato y la longitud de cada fase de la reacción. Véase Zhang et ál., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" en Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology, Vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., páginas.43-63.
Pese a que las proteínas de múltiples subunidades recombinantes se pueden producir a partir de células cultivadas, también se pueden producir subproductos indeseados. Por ejemplo, las células cultivadas pueden producir la proteína de múltiples subunidades deseada junto con monómeros libres, complejos que tienen estequiometría incorrecta o proteínas que tienen glicosilación indeseada o aberrante. La purificación de la proteína de múltiples subunidades deseada puede aumentar el costo de producción y los pasos implicados en la purificación pueden reducir el rendimiento total de los complejos activos. Además, incluso después de la purificación, los subproductos indeseados pueden estar presentes en cantidades que provocan preocupación. Por ejemplo, los subproductos glicosilados pueden estar presentes en cantidades que aumentan el riesgo de una reacción inmunológica después de la administración, mientras que los agregados o complejos aberrantes pueden disminuir la actividad específica y también pueden ser potencialmente inmunogénicos.
COMPENDIO La mayoría de las moléculas de anticuerpo IgGl se estabilizan por un total de 16 puentes disulfuro intra-cadena e inter-cadena. Los puentes disulfuro intra-cadena estabilizan el plegamiento de los dominios de IgG tanto en cadenas pesadas como livianas, mientras que los puentes disulfuro inter-cadena estabilizan la asociación entre las cadenas pesada y ligera. Como resultado de estos enlaces, los anticuerpos forman un complejo estable que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras (H2L2). Sin embargo, debido a la formación inadecuada de enlaces disulfuro, las variantes asociadas con productos se encuentran a veces en preparaciones de anticuerpos recombinantes, incluyendo un complejo que tiene una cadena ligera y una pesada (H1L1) y un complejo que tiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera (H2L1). Además, también se pueden formar complejos de orden mayor donde se forman enlaces disulfuro inter-cadena, lo que da como resultado una mayor cantidad de subunidades unidas covalentemente.
Tal como se describe en más detalle a continuación, los solicitantes han identificado actualmente métodos para disminuir la producción de estos complejos que contienen enlaces disulfuro aberrantes durante la producción recombinante de anticuerpos de cultivo de levadura. Específicamente, el método implica la adición de un bolo de etanol al cultivo, y dio como resultado una menor producción de las variantes asociadas con productos H1L1, H2L1 y H4L4 y una mayor pureza del producto H2L2 deseado. Los complejos H1L1 y H2L1 fueron detectados por SDS-PAGE desnaturalizante, no reducida y los complejos H4L4 fueron detectados por cromatografía de exclusión por tamaño. Usando los métodos de la presente, se facilitó la formación adecuada de enlaces disulfuro, lo que dio como resultado una mayor pureza de anticuerpo. Esto fue demostrado para tres anticuerpos diferentes, los tres demostraron una pureza mejorada cuando se produjeron con la adición del bolo de etanol (FIG.1-6). Estos tres anticuerpos no solo tienen una secuencia diferente sino que también reconocen tres antágenos diferentes. Además, cuando se produjeron en la ausencia de un bolo de etanol, dos de los anticuerpos contenían mayores cantidades del producto H1L1 (FIG. 1-4), en comparación con el tercer anticuerpo (FIG. 5). Los dos anticuerpos que contienen mayores cantidades del producto H1L1 tienen un puente disulfuro no canónico o adicional, mientras que el tercero no. El anticuerpo ejemplificado en las FIG. 1, 2 y 3 tiene un puente disulfuro intra-cadena adicional en el dominio variable de cadena ligera, mientras que el anticuerpo ejemplificado en la FIG. 4 tiene un puente disulfuro intra-cadena adicional en su cadena pesada. Se ha informado en la bibliografía que la presencia de puentes disulfuro en proteínas sobreexpresadas aumenta la tensión intracelular en el hospedador (véase Gasser et ál., Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, N° 2, pág. 353- 61, 5 de junio de 2006; Inan et ál., Biotechnology And Bioengineering, Vol. 93, N° 4, pág.771-78, 5 de marzo de 2006; Li et ál., Biochem Biophys Res Commun.19 de noviembre de 2010; 402(3): 519-524). Esta tensión aumentada también puede llevar a una menor viabilidad, tal como se demuestra en las FIG. 11, 12 y 13 donde ambos anticuerpos con el puente disulfuro intra-cadena extra tienen una menor viabilidad en las condiciones "sin bolo". La adición del bolo de etanol, por lo tanto, lleva a una mayor viabilidad y una mayor pureza. Esto puede ser útil en particular cuando se expresan proteínas difíciles de expresar con múltiples puentes disulfuro.
En un aspecto, la presente descripción proporciona un método para producir un complejo de múltiples subunidades, que comprende: (a) proporcionar un cultivo que comprende una célula eucariota que comprende genes que facilita la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades; (b) agregar un bolo de etanol a dicho cultivo y (c) cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades.
El bolo de etanol puede potenciar la formación de enlaces disulfuro estables con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede contener uno o más polipéptidos que comprenden al menos un enlace disulfuro.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo.
El método puede disminuir la abundancia relativa de una o más variantes asociadas con productos con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede disminuir la abundancia relativa de variantes asociadas con productos que tienen un mayor o menor peso molecular aparente que dicho complejo de múltiples subunidades deseado según se detecta por cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede reducir la abundancia relativa de complejos que tienen estequiometría aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede reducir la abundancia relativa de complejos que tienen estequiometria aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede reducir la abundancia relativa de complejos que tienen cisteinas reducidas con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede reducir la abundancia relativa de complejos que tienen glicosilación aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
El método puede modular la formación o estabilidad de enlaces disulfuro ínter-cadena pesada.
El método puede modular la formación o estabilidad de enlaces disulfuro que enlazan las cadenas ligera y pesada.
El método puede disminuir la abundancia relativa de una o más variantes asociadas con productos con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
Dichas variantes asociadas con productos pueden comprender una o más de las variantes asociadas con productos H1L1, H2L1 y H4L4.
El método puede aumentar la pureza de dicho anticuerpo con respecto a dicho método efectuado en ausencia de dicho bolo de etanol.
El paso (b) se puede efectuar antes del paso (c).
El paso (b) se puede efectuar posterior al paso (c).
El paso (b) se puede efectuar a la misma vez que el paso (c).
El paso (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4% (p/v).
El paso (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4%, entre alrededor de 0,02% y alrededor de 3,75%, entre alrededor de 0,04% y alrededor de 3,5%, entre alrededor de 0,08% y alrededor de 3,25%, entre alrededor de 0,1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 2,75%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de 2,5%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 2,25%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 1,5%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 2%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,75%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,5%, o entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,25%.
El paso (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que puede ser al menos alrededor de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,6%, 0,7%, 0,8% o 0,9% (p/v).
El paso (b) puede dar como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que puede ser como máximo alrededor de 4%, f co O. f 92O- 9^J9O-^ L9*5 O- f 1,8%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,35%, 0,3%, 0,25%, 0,2% o 0,15% (p/v).
El paso (b) puede comprender agregar etanol a dicho cultivo, agregar un portador que comprende etanol a dicho cultivo, agregar dichas células a un medio o portador que comprende etanol o reemplazar parte del medio de cultivo.
Dicho bolo de etanol se puede agregar al medio de cultivo en un periodo de tiempo entre 1 y 20 minutos.
El paso (c) puede comprender suministrar oxigeno a dichas células.
Dicho suministro de oxigeno puede comprender agitar dicho cultivo.
Dicho suministro de oxigeno puede comprender poner en contacto dicho cultivo con una mezcla de gas que comprende oxigeno.
El paso (c) puede comprender agregar una alimentación que comprende una fuente de carbono a dicho cultivo.
Dicha alimentación puede comprender al menos una fuente de carbono fermentable.
Dicha alimentación puede comprender uno o más de glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, mañosa, manitol y rafinosa.
El método también puede comprender mantener la concentración de etanol entre un punto de referencia superior y un punto de referencia inferior durante el paso (c).
Dicho punto de referencia inferior puede ser alrededor de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,6%, 0,7%, 0,8% o 0,9% (p/v).
Dicho punto de referencia superior puede ser alrededor de 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,8%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,35%, 0,3%, 0,25%, 0,2% o 0,15% (p/v).
Dicho punto de referencia superior puede ser como máximo alrededor de 1,5%, 1,4%, 1,3, 1,2% o 1,1% (p/v).
El método también puede comprender mantener la concentración de etanol en un punto de referencia durante el paso (c).
Dicho punto de referencia puede ser alrededor de 0,1% 0,2 0,3%, 0,4% 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 01,%, 01,1%, 01,2%, 01,3%, 01,4%, o 01,5% (p/v).
El paso (c) puede comprender mantener la concentración de etanol en dicho cultivo entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4%, entre alrededor de 0,02% y alrededor de 3,75%, entre alrededor de 0,04% y alrededor de 3,5%, entre alrededor de 0,08% y alrededor de 3,25%, entre alrededor de 0 , 1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 2,75%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de 2,5%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 2,25%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 2%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,75%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,5% o entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,25%.
La concentración de etanol en dicho cultivo se puede mantener controlando la producción de etanol por dichas células o agregando etanol a dicho cultivo.
El paso de controlar la producción de etanol puede comprender controlar una o más de la concentración de glucosa, disponibilidad de oxigeno, intensidad de agitación, presión de gas, velocidad de flujo de aire suministrado u otra mezcla de gas, viscosidad del cultivo, densidad del cultivo, concentración del oxigeno en el aire suministrado u otro mezcla de gas y temperatura.
El tiempo entre el paso (a) y el paso (b) puede ser menor que alrededor de 72 horas, menor que alrededor de 48 horas, menor que alrededor de 24 horas, menor que alrededor de 12 horas, menor que alrededor de 9 horas, menor que alrededor de 6 horas, menor que alrededor de 5 horas, menor que alrededor de 4 horas, menor que alrededor de 3 horas, menor que alrededor de 90 minutos, menor que alrededor de 30 minutos, menor que alrededor de 5 minutos o menor que alrededor de 1 minuto.
El tiempo entre el paso (b) y el paso (c) puede ser menor que alrededor de 10 horas, menor que alrededor de 9 horas, menor que alrededor de 8 horas, menor que alrededor de 7 horas, menor que alrededor de 6 horas, menor que alrededor de 5 horas, menor que alrededor de 4 horas, menor que alrededor de 3 horas, menor que alrededor de 2 horas, menor que alrededor de 90 minutos, menor que alrededor de 80 minutos, menor que alrededor de 70 minutos, menor que alrededor de 60 minutos, menor que alrededor de 50 minutos, menor que alrededor de 40 minutos, menor que alrededor de 30 minutos, menor que alrededor de 20 minutos, menor que alrededor de 10 minutos, menor que alrededor de 5 minutos o menor que alrededor de 1 minuto.
El cultivo del paso (a) se puede producir agregando una fuente de carbono a dicho cultivo y cultivando dicho cultivo hasta que la fuente de carbono se pueda agotar.
Dicha fuente de carbono puede comprender uno o más de glicerol, glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ra nosa, ribosa, mañosa, manitol y rafinosa.
El agotamiento de la fuente de carbono se puede determinar mediante la detección de una disminución en la actividad metabólica de dichas células eucariotas.
Dicha disminución en la actividad metabólica de dichas células eucariotas se puede identificar detectando una disminución en el consumo de oxígeno por dichas células eucariotas, detectando un aumento en el pH en el cultivo, detectando estabilización de la masa de célula húmeda o detectando un aumento en la concentración de amoníaco en el cultivo.
Dicha disminución en el consumo de oxígeno por dichas células eucariotas se puede identificar detectando un aumento en la concentración de oxígeno disuelto en dicho cultivo.
Dichas células eucariotas pueden comprender células de levadura.
Dichas células de levadura pueden comprender levadura metilotrófica.
Dicha levadura metilotrófica puede ser del género Pichia.
Dicha levadura metilotrófica del género Pichia puede ser Pichia pastoris.
Dicha levadura metilotrófica del género Pichia se puede seleccionar del grupo que consiste en: Pichia angusta, Pichia guillermordii, Pichia methanolica y Pichia inositovera.
Los genes que facilitan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades se pueden integrar en uno o más locus genómicos.
Al menos uno de dichos locus genómicos se puede seleccionar del grupo que consiste en el locus pGAP, locus 3' AOX TT; PpURA5; 0CH1; A0X1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG y el locus HIS4 TT.
Al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades se puede expresar bajo el control de un promotor inducible o constitutivo.
Dicho promotor inducible se puede seleccionar del grupo que consiste en los promotores A0X1, CUP1, inducibles por tetracielina, inducibles por tiamina y FLD1.
Al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades se puede expresar bajo el control de un promotor que se selecciona del grupo que consiste en: los promotores CUP1, A0X1, ICL1, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), FLDl, ADH1 , alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PH03, PH05 y Pyk, promotores inducibles por tetraciclina, promotores inducibles por tiamina, promotores quiméricos derivados de estos, promotores de levadura, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores vegetales, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores de aves.
Dicha célula eucariota puede ser una célula dipolide, tetraploide o poliploide.
El método también puede comprender purificar dicho complejo de múltiples subunidades de dichas células eucariotas o del medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades se puede purificar de un componente intracelular, citoplasma, nucleoplasma o una membrana de dichas células eucariotas.
Dichas células eucariotas secretan dicho complejo de múltiples subunidades en el medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades se puede purificar de dicho medio de cultivo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo monoespecifico o biespecifico.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o un fragmento de este.
Dicho anticuerpo humanizado puede ser de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca.
Dicho anticuerpo humanizado puede ser de origen de conejo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.
Dicho anticuerpo se puede purificar de dicho cultivo por afinidad por proteina A y/o proteina G.
Al menos uno de los genes que facilitan la expresión de una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades en al menos una de dichas células eucariotas en dicho panel se puede optimizar para expresión en dicha célula eucariota.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo y la pureza de dicho anticuerpo se puede evaluar midiendo la fracción del anticuerpo producida por dicha célula eucariota que puede estar contenida en complejos de anticuerpos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, puede estar contenida en complejos de anticuerpo que tienen el peso molecular esperado y/o que se une específicamente a una diana de dicho anticuerpo.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo y el rendimiento de dicho anticuerpo se puede evaluar determinando la cantidad de anticuerpo producida por dicha célula eucariota descontando cualesquiera variantes asociadas con productos que pueden estar glicosiladas anormalmente, contenida en complejos de anticuerpos que no sean complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, contenida en complejos de anticuerpo que tienen el peso molecular esperado y/o que no logran unirse específicamente a la diana de dicho anticuerpo.
El peso molecular de dichos complejos de anticuerpos se pueden determinar mediante SDS-PAGE no reductora.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo, dicho método también puede comprender purificar dicho anticuerpo.
Dicha célula de cultivo puede producir una titulación de anticuerpo de sobrenadante de al menos 100 mg / L, al menos 150 mg / L, al menos 200 mg / L, al menos 250 mg / L, al menos 300 mg / L, entre 100 y 300 mg / L, entre 100 y 500 mg / L, entre 100 y 1000 mg / L, al menos 1000 mg / L, al menos 1250 mg/litro, al menos 1500 mg/litro, al menos alrededor de 1750 mg/litro, al menos alrededor de 2000 mg/litro, al menos alrededor de 10000 mg/litro o más.
Una o más subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades se puede expresar a partir de más de una copia de genes.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo que se puede expresar entre 1-10 copias de un gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo y de 1-10 copias de un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo.
Los genes que facilitan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades se pueden integran en el genoma de dichas células.
Los genes que facilitan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades pueden estar contenidos en un elemento extracromosómico, plásmido o cromosoma artificial.
Dichas células pueden comprender más copias del gen que facilita la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que facilita la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo.
La cantidad respectiva de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y la cantidad de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células puede ser: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5, 4 y 3, 4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6o 5 y 7.
La cantidad respectiva de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y la cantidad de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células puede ser: 2 y 1, 3 y 1, 4 y 1, 5 y 1, 6 y 1, 7 y 1, 8 y 1, 9 y 1, 10 y 1, 1 y 2, 2 y 2, 3 y 2, 4 y 2, 5 y 2, 6 y 2, 7 y 2, 8 y 2, 9 y 2, 10 y 2, 1 y 3, 2 y 3, 3 y 3, 4 y 3, 5 y 3, 6 y 3, 7 y 3, 8 y 3, 9 y 3, 10 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 3 y 4, 4 y 4, 5 y 4, 6 y 4, 7 y 4, 8 y 4, 9 y 4, 10 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 4 y 5, 5 y 5, 6 y 5, 7 y 5, 8 y 5, 9 y 5, 10 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6, 4 y 6, 5 y 6, 6 y 6, 7 y 6, 8 y 6, 9 y 6, 10 y 6, 1 y 7, 2 y 7, 3 y 7, 4 y 7, 5 y 7, 6 y 7, 7 y 7, 8 y 7, 9 y 7, 10 y 7, 1 y 8, 2 y 8, 3 y 8, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 8 y 8, 9 y 8, 10 y 8, 1 y 9, 2 y 9, 3 y 9, 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 9 y 9, 10 y 9, 1 y 10, 2 y 10, 3 y 10, 4 y 10, 5 y 10, 6 y 10, 7 y 10, 8 y 10, 9 y 10, 10 y 10.
El cultivo del paso (c) puede cultivarse en un medio de producción.
Dicho medio de producción puede ser un medio mínimo.
Dicho medio mínimo no tiene agentes selectivos.
Dicho medio mínimo no tiene aminoácidos preformados u otras biomoléculas complejas.
El medio de producción puede ser un medio complejo.
El medio complejo puede comprender uno o más de extracto de levadura, peptonas de soja y otras peptonas vegetales.
El cultivo del paso (c) puede cultivarse a una alta densidad celular.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 50 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 100 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 300 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 400 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 500 g/L.
Dicha alta densidad celular puede ser al menos 750 g/L.
Las células de levadura se pueden cultivar por al menos 20 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 20 duplicaciones.
Las células del paso (c) se pueden cultivar por al menos 50 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 50 duplicaciones.
Las células del paso (c) se pueden cultivar por al menos 100 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 100 duplicaciones.
Al menos una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender una señal de secreción.
Dicho complejo de múltiples subunidades puede comprender un anticuerpo.
La señal de secreción puede comprender uno o más polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 414 a 437 y cualquier combinación de estas.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede ser ninguno de los anticuerpos descritos en la solicitud provisional estadounidense N° 61/418,832, presentada el 1 de diciembre de 2010, PCT/US11/62963, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,295, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,153, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,665, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,831, presentada el 1 de diciembre de 2011.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede ser Abl - NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF o un fragmento Fab2 o Fabl de estos.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede contener al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4- NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2- NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7- NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF o Ab21-NGF y que opcionalmente tiene especificidad de unión por NGF.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender o consistir en las secuencias de polipéptidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO: 51 y 401, respectivamente, SEQ ID NO: 53 y 402, respectivamente, SEQ ID NO: 405 y 406, respectivamente y SEQ ID NO: 407 y 408, respectivamente.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender un anticuerpo que contiene al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis CDR de SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59 y 60 y que opcionalmente tiene especificidad de unión por NGF.
Dicho complejo de múltiples subunidades no puede comprender ninguno de los anticuerpos o secuencias codificantes de anticuerpo descritas en la presente en las secciones con el titulo "anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión de estos que tienen actividad de unión por NGF" y "polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo anti-NGF". En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para producir un complejo de múltiples subunidades, que puede comprender: cultivar una célula hospedadora que proporciona un cultivo que comprende células eucariotas que expresa dicho complejo de múltiples subunidades, agregar un bolo de etanol a dicho cultivo y cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades. El complejo de múltiples subunidades puede comprender uno o más enlaces disulfuro y puede ser un anticuerpo.
La concentración del bolo de etanol (expresada como % p/v) puede ser entre alrededor de 0,1% y alrededor de 5%, tal como al menos alrededor de 0,1%, al menos alrededor de 0,2%, al menos alrededor de 0,3%, al menos alrededor de 0,4%, al menos alrededor de 0,5%, al menos alrededor de 0,6%, al menos alrededor de 0,7%, al menos alrededor de 0,8%, al menos alrededor de 0,9%, al menos alrededor de 1%, hasta alrededor de 1%, hasta alrededor de 1,1%, hasta alrededor de 1,2%, hasta alrededor de 1,3%, hasta alrededor de 1,4%, hasta alrededor de 1,5%, hasta alrededor de 1,6%, hasta alrededor de 1,7%, hasta alrededor de 1,8%, hasta alrededor de 1,9%, hasta alrededor de 2%, hasta alrededor de 3%, hasta alrededor de 4% o hasta alrededor de 5%, tal como entre alrededor de 0,1% y alrededor de 1,9%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 1,8%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de 1,7%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 1,6%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 1,5%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,4%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,3% entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,2% o entre alrededor de 0,9% y alrededor de 1,1%, tal como alrededor de 0,1%, alrededor de 0,2%, alrededor de 0,3%, alrededor de 0,4%, alrededor de 0,5%, alrededor de 0,6%, alrededor de 0,7%, alrededor de 0,8%, alrededor de 0,9%, alrededor de 1%, alrededor de 1,1%, alrededor de 1,2%, alrededor de 1,3%, alrededor de 1,4%, alrededor de 1,5%, alrededor de 1,6%, alrededor de 1,7%, alrededor de 1,8%, alrededor de 1,9%, alrededor de 2%, alrededor de 2,5%, alrededor de 3%, alrededor de 4% o alrededor de 5%.
El método también puede comprender la purificación de dicho complejo de múltiples subunidades deseado.
En ejemplos de modalidades, la concentración de etanol se puede controlar posterior a la adición del bolo de etanol, que se puede usar para mantener la concentración de etanol en un punto de referencia deseado o dentro de un intervalo de puntos de referencia deseados. El punto de referencia (expresado como % p/v) puede ser entre alrededor de 0,1% y alrededor de 4%, al menos alrededor de 0,01%, al menos alrededor de 0,02%, al menos alrededor de 0,04%, al menos alrededor de 0,06%, al menos alrededor de 0,08%, al menos alrededor de 0,1%, al menos alrededor de 0,15%, al menos alrededor de 0,2%, al menos alrededor de 0,25%, al menos alrededor de 0,3%, al menos alrededor de 0,35%, al menos alrededor de 0,4%, al menos alrededor de 0,45%, al menos alrededor de 0,5%, al menos alrededor de 0,6%, al menos alrededor de 0,7%, al menos alrededor de 0,8%, al menos alrededor de 0,9%, al menos alrededor de 1%, al menos alrededor de 1,2%, al menos alrededor de 1,4%, al menos alrededor de 1,6%, al menos alrededor de 1,8%, al menos alrededor de 2%, hasta alrededor de 4%, hasta alrededor de 3,75%, hasta alrededor de 3,5%, hasta alrededor de 3,25%, hasta alrededor de 3%, hasta alrededor de 2,75%, hasta alrededor de 2,5%, hasta alrededor de 2,25%, hasta alrededor de 2%, hasta alrededor de 1,75%, hasta alrededor de 1,5%, hasta alrededor de 1,25%, hasta alrededor de 1%, entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4%, entre alrededor de 0,02% y alrededor de 3,75%, entre alrededor de 0,04% y alrededor de 3,5%, entre alrededor de 0,08% y alrededor de 3,25%, entre alrededor de 0,1% y alrededor de 3%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 2,75%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de 2,5%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 2,25%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 2%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,75%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,5%, o entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,25%. Por ejemplo, el punto de referencia puede ser el mismo que la concentración del bolo o dentro de más o menos 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%,45%, 50%, 60%,70%, 80%, 90% o 100% de la concentración del bolo.
El punto de referencia de la concentración de etanol se puede mantener controlando la producción de etanol por células de levadura durante la fermentación. Por ejemplo, la concentración de etanol se puede aumentar aumentando la concentración de glucosa (por ejemplo, aumentando la velocidad de alimentación de glucosa), disminuyendo la disponibilidad de oxigeno, disminuyendo la intensidad de agitación (por ejemplo, disminuyendo la potencia de entrada del termentador), reduciendo la presión de gas en el termentador, reduciendo la velocidad de flujo del aire suministrado u otra mezcla de gas, aumentando la viscosidad del cultivo o reduciendo la concentración de oxigeno en el aire suministrado u otra mezcla de gas (por ejemplo, si se usa suplementación de oxigeno). La producción de etanol también se puede aumentar aumentando la temperatura de fermentación. Asimismo, la concentración de etanol se puede reducir reduciendo la concentración de glucosa (por ejemplo, reduciendo la velocidad de alimentación de glucosa), reducir aumentando la disponibilidad de oxigeno, aumentando la intensidad de agitación (por ejemplo, aumentando la potencia de entrada del termentador), aumentando la presión de gas en el termentador, aumentando la velocidad de flujo del aire suministrado u otra mezcla de gas, reduciendo la viscosidad del cultivo o aumentando la concentración de oxigeno en el aire suministrado u otra mezcla de gas (por ejemplo, si se usa suplementación de oxigeno). La producción de etanol también se puede reducir reduciendo la temperatura de fermentación.
Usando los métodos de la presente descripción, la abundancia relativa de subproductos indeseados se puede reducir en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99%, o hasta niveles indetectables en comparación con los niveles de abundancia inicial, con respecto a los métodos convencionales. Los ejemplos de subproductos indeseados cuya abundancia relativa puede disminuir de esta forma pueden incluir una o más especies que tienen un peso molecular aparente diferente que el complejo de múltiples subunidades deseado. Por ejemplo, el peso molecular aparente se puede ver afectado por diferencias en la estequiometria, plegamiento, montaje del complejo y/o glicosilación. Por ejemplo, tales subproductos indeseados se pueden detectar usando cromatografía de exclusión por tamaño y/o electroforesis en gel y pueden tener un peso molecular aparente mayor o menor que el complejo de múltiples subunidades deseado. En ejemplos de modalidades, los subproductos indeseados se pueden detectar en condiciones de reducción. En otros ejemplos de modalidades, los subproductos indeseados se pueden detectar en condiciones de no reducción.
En ejemplos de modalidades, la presente descripción también proporciona métodos y composiciones de materia mejoradas que facilitan la producción recombinante de anticuerpos y otros complejo de múltiples subunidades, con un mayor rendimiento. En ejemplos de modalidades, el rendimiento puede aumentar en al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 100% o más (con respecto a los métodos convencionales) usando los métodos descritos en la presente.
En ejemplos de modalidades, la célula hospedadora donde se pueden producir proteínas de múltiples subunidades puede ser una levadura, por ejemplo en una especie Pichia tal como P. pastoris u otra levadura metilotrófica o en una especie Saccharomyces tal como S. cerevisiae, u otra levadura tal como una Schizosaccharomyces (por ej., S. pombe) . Otros ejemplos de levadura metilotrófica que se pueden utilizar en la presente invención incluyen Pichia angusta (también conocida en la téenica como Hansenula polymorpha) , Pichia guillermordii , Pichia methanolica , Pichia inositovera , Ogataea nitratoaversa r y Candida boidnii .
La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, tal como una célula de levadura, tal como una levadura metilotrófica, tal como una levadura del género Pichia . Los ejemplos de levaduras metilotróficas del género Pichia incluyen Pichia pastoras , Pichia angusta , Pichia guillermordii , Pichia methanolica y Pichia inositovera . La célula hospedadora se puede producir por acoplamiento, por ejemplo, acoplando dos células de levadura haploides que contienen, cada una, una o más copias de al menos un gen que codifica una subunidad del complejo de múltiples subunidades.
En una modalidad preferida, las levaduras metilotróficas del género Pichia es Pichia pastoris . La célula hospedadora puede ser una célula dipolide o tetraploide.
Al menos uno de dichos genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades deseado, tal como dicha cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo deseada, se puede expresar bajo el control de un promotor inducible o constitutivo, tal como CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio; véase Koller et ál., Yeast 2000; 16: 651-656.), promotores inducibles por tetracielina (véase, por ej., Staib et ál., Antimicrobial Agents And Chemotherapy, enero de 2008, p. 146-156), promotores inducibles por tiamina, AOX1, ICL1, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), FLD1, ADH1, deshidrogenasa de alcohol II, promotores GAL4, PH03, PH05, y Pyk, promotores quiméricos derivados de estos, promotores de levadura, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores vegetales, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores de aves.
La célula hospedadora puede secretar dicho complejo de múltiples subunidades en el medio de cultivo. De manera alternativa o adicional, dicho complejo de múltiples subunidades deseado puede ser retenido en dicha célula hospedadora y se puede aislar de esta.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoespecífico o biespecífico. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que se une’ específicamente a cualquier antígeno.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede ser un anticuerpo que no sea ninguno de los anticuerpos (por ejemplo, un anticuerpo que no sea ninguno de los anticuerpos anti-NGF) descritos en la solicitud provisional estadounidense N° 61/418,832, presentada el 1 de diciembre de 2010, PCT/US11/62963, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,295, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,153, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,665, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,831, presentada el 1 de diciembre de 2011. En un ejemplo de modalidad, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser ninguno de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4- NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF. En otro ejemplo de modalidad, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser un fragmento Fab2 de cualquiera de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4- NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF. En otro ejemplo de modalidad, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede ser un fragmento Fabl de cualquiera de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4- NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF. En otro ejemplo de modalidad, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede comprender un anticuerpo que contenga al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4- NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2- NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF o Ab21-NGF y que opcionalmente tenga especificidad de unión por NGF. Por ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede comprender o no puede consistir en las secuencias de polipéptidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO: 51 y 401, respectivamente y/o SEQ ID NO: 53 y 402, respectivamente y/o SEQ ID NO: 405 y 406, respectivamente y/o SEQ ID NO: 407 y 408, respectivamente. A modo de otro ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado no puede comprender un anticuerpo que contenga al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis CDR de SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59 y 60 y que opcionalmente tenga especificidad de unión por NGF.
El complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un anticuerpo de cualquier tipo. Los ejemplos de tipos de anticuerpo incluyen anticuerpos de cualquier especie mamifera, por ejemplo, humano, ratón, rata, conejo, cabra, oveja, vaca, etc. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado que puede ser de origen de conejo. El anticuerpo deseado puede ser un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.
Al menos uno de dichos genes que facilitan la expresión de una subunidad del complejo de múltiples subunidades deseado, tal como la cadena ligera y/o la cadena pesada del anticuerpo deseado, en al menos una de dichas células hospedadoras en dicho panel se puede optimizar para la expresión en dicha célula hospedadora (por ejemplo, seleccionando codones preferidos y/o alterando el porcentaje de AT a través de la selección del codón).
La pureza de dicho complejo de múltiples subunidades deseado, tal como el anticuerpo deseado, se puede evaluar midiendo la fracción de complejo de múltiples subunidades deseado producido por dicha célula hospedadora que no está glicosilada, está contenida en complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente y/o el peso molecular aparente esperados ('por ej., medido por cromatografía de exclusión por tamaño), tiene la movilidad electroforética esperada (por ej., detectada por electroforesis en gel, tal como SDS-PAGE y opcionalmente transferencia de Western) y/o midiendo la actividad específica del complejo de múltiples subunidades (por ejemplo, unión específica a una diana de un anticuerpo deseado).
El complejo de múltiples subunidades puede ser un anticuerpo y el rendimiento de dicho anticuerpo se puede evaluar determinando la cantidad de anticuerpo deseado producida por dicha célula hospedadora descontando cualesquiera variantes asociadas con productos que están glicosiladas, contenidas en complejos de anticuerpos que no sean complejos que tienen el peso molecular o el radio hidrodinámico aparentes esperados, y/o que no logran unirse específicamente a la diana de dicho anticuerpo deseado.
Los métodos de la presente pueden producir una titulación de anticuerpo sobrenadante de al menos 100 mg / L, al menos 150 mg / L, al menos 200 mg / L, al menos 250 mg / L, al menos 300 mg / L, entre 100 y 300 mg / L, entre 100 y 500 mg / L, entre 100 y 1000 mg / L o en exceso de 1000 mg/L por ej., tan alto como 1200 mg/L, tan alto como 10.000 mg / L o más alto.
En otro aspecto, la célula hospedadora que produce un complejo de múltiples subunidades deseado puede ser una célula diploide o tetraploide del género Pichia, tal como una célula Pichia pastoris. Los genes que facilitan la expresión de la subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades deseado, tal como la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo deseado, se puede integrar en el genoma de dicha célula hospedadora y/o puede estar contenido en un elemento extracromosómico, plásmido o cromosoma artificial.
En otro aspecto, la célula hospedadora que produce un complejo de múltiples subunidades deseado se puede modificar genéticamente para aumentar el rendimiento y/o la pureza, por ejemplo como se describe en más detalle en la solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/525,307 (expediente del agente N° 67858.730200), presentada el 31 de agosto de 2011, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Tal como se describe allí, el rendimiento y la pureza de un anticuerpo u otro complejo de múltiples subunidades puede mejorarse en gran medida alterando la cantidad de copias por célula de los genes que codifican cada subunidad. Por ejemplo, en los casos en que el complejo de múltiples subunidades deseado es un anticuerpo, la célula hospedadora puede comprender más copias del gen que facilitan la expresión de la cadena ligera que copias del gen que facilitan la expresión de la cadena pesada. En ejemplos de modalidades, la célula hospedadora puede comprender de 1-10 copias de un gen que codifica la cadena ligera y de 1-10 copias de un gen que codifica la cadena pesada. La cantidad respectiva de copias del gen que codifica la cadena pesada y la cantidad de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicha célula hospedadora puede ser: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5, 4 y 3, 4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6 o 5 y 7, respectivamente. Los ejemplos de combinaciones adicionales de números de copia de gen de cadena pesada y ligera incluyen cualquier combinación de hasta diez copias del gen de cadena pesada y/o ligera, tal como H2xLl, H3xLl, H4xLl, H5xLl, H6xLl, H7xLl H8xLl, H9xLl, HlOxLl, HlxL2, H2xL2, H3xL2, H4xL2, H5xL2, H6xL2, H7xL2, H8xL2, H9xL2, H10xL2, HlxL3, H2xL3, H3xL3, H4xL3, H5xL3, H6xL3, H7xL3, H8xL3, H9xL3, H10xL3, llxL4, H2xL4, H3xL4, H4xL4, H5xL4, H6xL4, H7xL4, H8xL4, H9xL4, H10xL4, HlxL5, H2xL5, H3xL5, H4xL5, H5xL5, H6xL5, H7xL5, H8xL5, H9xL5, H10xL5, HlxL6, H2xL6, H3xL6, H4xL6, H5xL6, H6xL6, H7xL6, H8xL6, H9xL6, H10xL6, HlxL7, H2xL7, H3xL7, H4xL7, H5xL7, H6xL7, H7xL7, H8xL7, H9xL7, H10xL7, HlxL8, H2xL8, H3xL8, H4xL8, H5xL8, H6xL8, H7xL8, H8xL8, H9xL8, H10xL8, HlxL9, H2xL9, H3xL9, H4xL9, H5xL9, H6xL9, H7xL9, H8xL9, H9xL9, H10xL9, HlxLlO, H2xL10, H3xL10, H4xL10, H5xL10, H6xLlO, H7xL10, H8xLlO, H9xL10, HlOxLlO, donde el número que le sigue a la "H" identifica la cantidad de copias del gen de cadena pesada y el número que le sigue a la "L" identifica la cantidad de copias del gen de cadena ligera. Por ejemplo, la cantidad especificada de copias de gen de cadena pesada y ligera se puede integrar en tándem en un único locus o en múltiples locus (cualquiera o todos los cuales pueden contener más de una copia). Opcionalmente, cada locus genómico puede contener no más de tres o cuatro copias de gen integradas en tándem, promoviendo asi la estabilidad de la cantidad de copias durante la propagación y/o producción de anticuerpo.
El cultivo más típicamente implica proporcionarle a las células una fuente de energía, oxígeno y nutrientes. También se conocen métodos en la bibliografía para diseñar y optimizar las fermentaciones de P. pastor is para la expresión de proteínas recombinantes, incluyendo la optimización de la densidad celular, volumen del caldo, velocidad de alimentación del sustrato y la longitud de cada fase de la reacción. Véase Zhang et ál., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" en Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., páginas.43-63. El cultivo puede estar provisto con una mezcla de gas que comprende oxigeno, tal como aire con o sin suplementación de oxigeno. El cultivo de levadura puede estar cultivado en un medio de cultivo que puede ser un medio mínimo, puede no tener agentes selectivos y/o puede no tener aminoácidos formados previamente u otras biomoléculas de complejo. El medio de cultivo también puede ser un medio complejo (por ej., que contiene un extracto de levadura y/o una o más peptonas de plantas). El medio puede incluir una fuente de nitrógeno (por ej., cloruro de metilamina, NH4S04, extracto de levadura, peptona de soja, otras peptonas vegetales, etc.). Los ejemplos de medios mínimos incluyen medio de dextrosa mínimo (MD) (1,34% de base de nitrógeno de levadura (YNB) (sin aminoácidos), 4 x 10_5% de biotina y 2% de glucosa), medio de complejo de glicerol mínimo amortiguado (BMGY) (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 1% de glicerol, 1,34% de YNB (sin aminoácidos), 4 x 10—5% de biotina y 100 mM de fosfato de potasio (pH 6,0)). El medio puede incluir una o más sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), amortiguadores (tales como fosfato de potasio, Tris o HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibiótiocs (por ej., agregados para inhibir el crecimiento de contaminantes y/o para mantener un marcador seleccionable), elementos traza y glucosa u otra fuente de energía. También se puede incluir cualquier suplemento y sustitución a concentraciones apropiadas que los expertos en la téenica conocerían.
El cultivo se puede cultivar a una alta densidad celular, tal como al menos 50 g/L, al menos 100 g/L, al menos 300 g/L, al menos 400 g/L, al menos 500 g/L o al menos 700 g/L. Estas densidades de cultivo son ilustrativas más que taxativas y los expertos en la técnica pueden determinar densidades de cultivo adecuadas fácilmente.
Las células de levadura se pueden cultivar por al menos 20 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo luego de dichas al menos 20 duplicaciones.
Las células de levadura se pueden cultivar por al menos 50 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo luego de dichas al menos 50 duplicaciones.
Las células de levadura se pueden cultivar por al menos 100 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho anticuerpo luego de dichas al menos 100 duplicaciones.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un medio de cultivo que contiene un cultivo de levadura Pichia diploide estable producido de acuerdo con cualquiera de los métodos que anteceden, donde el medio de cultivo puede comprender niveles de expresión de dicho anticuerpo deseado que pueden ser al menos alrededor de 50 mg/litro, 100 mg/litro, 500 mg/litro, 750 mg/litro, 1000 mg/litro, 1250 mg/litro, 1500 mg/litro, 1750 mg/litro, 2000 mg/litro o más. Estos valores de rendimiento son ilustrativos y no taxativos. Opcionalmente, el rendimiento se puede optimizar, por ejemplo usando los métodos y enfoque general descritos en Zhang et ál. (2007), anteriormente. Por ejemplo, el rendimiento se puede optimizar variando la temperatura, pH, composición del medio (por ej., fuente de carbono, concentración de la fuente de carbono, mezcla de dos o más fuentes de carbono, fuente y concentración de nitrógeno, concentración de sales y nutrientes incluyendo KH2P04, K2HP04, MgSO4, sulfato de potasio, citrato de sodio, sulfato de potasio, citrato de sodio, metales traza tales como cloruro de cobalto, sulfato cúprico, yoduro de sodio, sulfato de manganeso, molibdato de sodio, ácido bórico, cloruro de zinc, sulfato ferroso, vitaminas tales como biotina, inositol, tiamina, peptona, extracto de levadura, casaminoácidos, urea, fosfato de amonio u otros iones de amonio, L-arginina-clorhidrato), tiempo, densidad de cultivo, oxigenación y otros factores que influyen en el rendimiento. Por ejemplo, el rendimiento, la expresión y/o pureza del complejo de múltiples subunidades deseado puede, en algunos casos, mejorarse manteniendo la temperatura en un punto de referencia deseado, por ej., un punto de referencia entre alrededor de 15 °C y alrededor de 30 °C, tal como entre alrededor de 17 °C y alrededor de 25 °C. Sin pretender limitarse por ninguna teoría, se plantea la hipótesis de que controlar la temperatura puede ayudar al tráfico intracelular a través de las vías de procesamiento postraduccionales y plegamiento y/o puede disminuir la actividad de las proteasas celulares. Asimismo, el rendimiento, la expresión y/o pureza del complejo de múltiples subunidades deseado puede, en algunos casos, mejorarse manteniendo el pH del medio de cultivo a un punto de referencia deseado, por ej., un punto de referencia entre pH 3 y pH 8, tal como entre pH 4 y pH 7.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un medio de cultivo que contiene un cultivo de levadura Pichia pastoris estable diploide producida de acuerdo con cualquiera de los métodos que anteceden que expresan dicho anticuerpo deseado en un medio de cultivo donde la densidad celular de dichas células diploides en dicho cultivo pueden ser al menos alrededor de 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 700 g/L o más. Estas densidades de cultivo son ilustrativas más que taxativas y los expertos en la téenica pueden determinar densidades de cultivo adecuadas fácilmente.
Al menos una subunidad de dicho anticuerpo u otra proteina de múltiples subunidades puede comprender una señal de secreción, tal como el péptido de señal S. lisozima de gallina (CLY); CLY-L8; péptido de señal S. cerevisiae invertase (SUC2); MF-alfa (Prepro); MF-alfa (Pre)-apv; MF-alfa (Pre)-apv- SLEKR; MF-alfa (Prepro)-(EA)3; péptido de señal aF; péptido de señal KILM1; péptido de señal de fosfatasa de ácido represible (PHOl); péptido de señal A. niger GOX; péptido de señal del gen de glucoamilasa Schwanniomyces occidentalis (GAM1); péptido de señal de albúmina sérica humana (HSA) sin prosecuencia; péptido de señal de albúmina sérica humana (HSA) con prosecuencia; péptido de señal ISN; péptido de señal IFN; péptido de señal HGH; fitohemaglutinina (PHA); lisozima de gusano de seda; lisozima humana (LYZ1); receptor de activina tipo 1; receptor de activina tipo II; proteina de unión de inmunoglobulina P. pastoris (PpBiP); líder de cadena ligera de anticuerpo humano 3D6 y cualquier combinación de estos La célula hospedadora se puede producir apareando dos células de levadura haploides que contienen, cada una, una o más copias de un gen que codifica una o más subunidades de dicho anticuerpo u otra proteina de múltiples subunidades.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1A-B. La pureza de un Ab-A producido de forma recombinante se mejoró mediante la adición de un bolo de etanol antes de comenzar la alimentación de glucosa en cultivos de levadura a partir de los cuales se produjeron los anticuerpos. Los anticuerpos se cultivaron luego de 97 horas de cultivo y se purificaron por afinidad por proteina A, luego se evaluó la pureza por SDS-PAGE usando un gel no reducido (FIG.1 A) para resolver el anticuerpo total deseado (flecha, "Ab total (H2L2)") de variantes asociadas con productos indeseados. Los complejos con estequiometria aberrante se identificaron en función de su peso molecular, afinidad por la proteina A y estudios adicionales que se describen en más detalle a continuación, como una especie " anticuerpo medio" que contiene una cadena pesada y una ligera (flecha, "H1L1") y un complejo que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera ("H2L1"). La abundancia relativa de los complejos H2L1 y H1L1 disminuyó en gran medida por la adición del bolo de etanol durante la producción de anticuerpo. Comparar FIG. 1A, vías 2-3 (sin bolo) con la vía 5 (con bolo). FIG. IB muestra las mismas muestras procesadas en condiciones de reducción, que separaron cada uno de los complejos H1L1 y H2L1 del anticuerpo total en cadenas pesadas y ligeras individuales, lo que confirma que los complejos H1L1 y H2L1 están compuestos de cadenas pesadas y cadenas ligeras de longitud completa. Orden de las vías en las FIG. 1A-B: Via 1: marcador de peso molecular; vías 2 y 3: muestras de control preparadas a partir de cultivos de fermentación sin adición de bolo de etanol: via 4: sin muestra; via 5: muestra preparada a partir de cultivos de fermentación con adición de bolo de etanol.
Las FIG. 1C-E muestran la densidad de banda de gel graficada a lo largo de la longitud del gel no reducido (FIG.1A, vías 2, 3 y 5, respectivamente); las flechas identifican los picos que corresponden a las especies H1L1. La FIG. 1F tabula el área contenida en los picos H1L1 que se muestran en las FIG. 1C-E, que demuestran una reducción de aproximadamente 90% en la abundancia relativa de los complejos H1L1. La abundancia del complejo H2L1 no se cuantificó debido a la resolución incompleta de los picos de anticuerpo total Las FIG.2?-B y 3 A-B demuestran la capacidad de reproducción de la mejora de la pureza de Ab-A por una adición de bolo de etanol a los cultivos de levadura. Los anticuerpos se cultivaron luego de 87 u 86 horas de cultivo (FIG.2 y 3, respectivamente) y se purificaron por afinidad por proteina A, luego se evaluó la pureza por SDS-PAGE usando un gel no reducido. La abundancia de los complejos H1L1 y H2L1 (flechas) disminuyó nuevamente por la adición del bolo de etanol. Comparar FIG.2A, via 3 (sin bolo) con la vía 2 (con bolo) y la FIG.3A, vías 4-6 (sin bolo) con las vías 2 y 4 (con bolo). La FIG.2B muestra las mismas muestras que en la FIG. 2A procesada en condiciones de reducción, lo que nuevamente confirma que las variantes asociadas con productos observadas están compuestas de cadenas pesada y ligera de longitud completa. Orden de las vías en las FIG. 2A-B: Vía 1: marcador de peso molecular; vía 2: muestra preparada a partir de un cultivo de fermentación con adición de bolo de etanol: vía 3: muestra de control preparada a partir de un cultivo de fermentación sin adición de bolo de etanol. Orden de las vías en la FIG. 3 A: Via 1: marcador de peso molecular; vías 2 y 4: muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación con adición de bolo de etanol: vía 3: sin muestra; vías 5-7: muestras de control preparadas a partir de cultivos de fermentación sin adición de bolo de etanol.
Las FIG. 2C y 2D muestran la densidad de banda de gel graficada a lo largo de la longitud del gel no reducido (FIG. 2A, vías 2 y 3, respectivamente); las flechas identifican los picos que corresponden a las especies HlLl. Las FIG.2E y 3B tabulan el área contenida en los picos HlLl que se muestran en las FIG.2C y FIG. 3A, lo que demuestra una reducción de aproximadamente 85% en la abundancia relativa de los complejos HlLl en la FIG. 2A y una reducción promedio de aproximadamente 87% en la abundancia relativa de los complejos HlLl en la FIG.3A.
FIG. 4A-D. La pureza de un segundo anticuerpo recombinante ("Ab-B") también se mejoró por una adición de bolo de etanol antes de la fase de producción de un proceso de fermentación. Las muestras del caldo de cultivo de fermentación se cultivaron luego de 67 horas ("T67) u 87 horas ("T87") del cultivo (FIG.4A-B y 4C-D, respectivamente) y los anticuerpos se purificaron por afinidad por proteina A. Luego se evaluó la pureza por SDS-PAGE usando geles no reducidos (FIG.4A y 4C).
En ambos puntos de tiempo evaluados, la abundancia de la especie de anticuerpo medio (H1L1) y el complejo H2L1 disminuyó en gran medida en los cultivos de fermentación preparados que recibieron una adición de bolo de etanol, con respecto a los cultivos de control que no recibieron una adición de bolo de etanol. Comparar FIG. 4A, vías 2-3 (sin bolo) con las vías 6-7 (con bolo) y la FIG.4C, vías 2-3 (sin bolo) con las vías 6-7 (con bolo). Las FIG.4B y 4D muestran las mismas muestras procesadas en condiciones de reducción. Orden de las vías en las FIG. 4A-D: Vía 1: marcador de peso molecular; vías 2-3: muestras de control preparadas a partir de cultivos de fermentación sin adición de bolo de etanol: vías 4-5: sin muestra; vías 6-7: muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación con adición de bolo de etanol.
Las FIG.4E y 4F tabulan el área contenida en los picos H1L1 que se muestran en las FIG. 4A (T67) y 4C (T87), respectivamente, lo que demuestra que la adición del bolo de etanol produjo una reducción de alrededor de 73% en la abundancia relativa de los complejos H1L1 en el punto de tiempo más temprano que se muestra en la FIG. 4A y una reducción promedio de alrededor de 34% en la abundancia relativa de los complejos H1L1 en el punto de tiempo más tarde que se muestra en la FIG.4C.
FIG. 5A-B. La pureza de un tercer anticuerpo recombinante (Ab-C) también se mejoró por una adición de bolo de etanol antes de la fase de producción de fermentación. Los anticuerpos se cultivaron luego de 86 horas de cultivo y se purificaron por afinidad por proteina A, luego se evaluó la pureza por SDS-PAGE usando un gel no reducido (FIG.5A). Los complejos H1L1 y H2L1 fueron menos abundantes en el producto Ab-C incluso sin la adición de un bolo de etanol, dejando menos lugar para la mejora. Sin embargo, la abundancia de la especie de anticuerpo medio (H1L1) y el complejo H2L1 disminuyó de manera notoria en los cultivos de fermentación que recibieron una adición de bolo de etanol, con respecto a los cultivos de control que no recibieron una adición de bolo de etanol. Comparar FIG.5A, vias 5-6 (sin bolo) con la via 3 (con bolo). La FIG. 5B muestra las mismas muestras procesadas en condiciones de reducción. Orden de las vias en las FIG. 5A-B: Via 1: marcador de peso molecular; via 2: sin muestra; via 3: muestra preparada a partir de cultivos de fermentación que recibieron una adición de bolo de etanol: via 4: sin muestra; vias 5-6: muestra de control preparada a partir de cultivos de fermentación que no recibieron una adición de bolo de etanol.
La FIG.5C tabula el área contenida en los picos HlLl que se muestran en las FIG. 5A, lo que demuestra una reducción promedio de alrededor de 61% en la abundancia relativa de los complejos H1L1 por la adición de un bolo de etanol.
La FIG. 6A-F muestran la evaluación de la pureza relativa de las preparaciones Ab-A que se muestran en las FIG.1-3 por cromatografía de exclusión por tamaño. En cada panel, el pico principal contiene el anticuerpo total que contiene dos cadenas pesadas y dos ligeras (H2L2). La especie H1L1 no se resolvió a partir del pico principal por este método (lo que se cree que se debe a que se forman dimeros H1L1 por la asociación no covalente que se retiene en las condiciones usadas). Sin embargo, se detectaron otras variantes asociadas con productos no deseadas, incluyendo especies de mayor peso molecular (izquierda del pico principal) y especies de menor peso molecular (derecha del pico principal). Se detectó (flecha) un pico prominente que se cree que corresponde a que los dimeros de anticuerpo que contienen dos anticuerpos totales (H4L4) y la abundancia relativa de estos disminuyó en las muestras preparadas a partir de cultivos de fermentación que recibieron una adición de bolo de etanol. Comparar las FIG. 6A, 6C y 6E (sin bolo) con las FIG.6B, 6D y 6F (sin bolo).
La FIG. 7 resume la cuantif icación de la cantidad de variantes asociadas con productos detectadas por SEC para las seis muestras de Ab-? que se muestran en la FIG.6 y cinco muestras adicionales. Para cada muestra identificada (col. 1), se muestra el número establecido de ejecución (col. 2 identifica las ejecuciones de fermentación que se realizaron en paralelo), bolo agregado (ya sea 10 g/L o ninguno, col.3) y tiempo de cultivo que pasó antes de que se tomaran y procesaran las muestras de cultivo (col. 4), junto con la fracción de proteína detectada en el pico principal ("% de pico principal de SEC", col.5). La adición de bolo de etanol al final de la fase de crecimiento aumentó el porcentaje promedio contenido en el pico principal, de 80,3% hasta 90,6%).
La FIG. 8 resume la cuantif icación de la cantidad de variantes asociadas con productos detectadas por SEC para las muestras de anticuerpo Ab-B que se muestran en la FIG. 4. Para cada ejecución de fermentación (col.1), se muestra el bolo agregado al final de la fase de crecimiento (ya sea 10 g/L o ninguno, col.2) y tiempo de cultivo que pasó antes de que se tomaran y procesaran las muestras de cultivo (col.3), junto con la fracción de proteína detectada en el pico principal ("("% de pico principal de SEC", col.4). Aumentó la pureza global y el pico principal aumentó de 76% a 79% en T67 y de 60% a 73% en T87.
La FIG. 9 resume la cuantificación de la cantidad de variantes asociadas con productos detectadas por SEC para las muestras de anticuerpo Ab-C que se muestran en la FIG. 5. Para cada ejecución de fermentación identificada (col.1), se muestra el bolo agregado (ya sea 10 g/L o ninguno, col. 2) y tiempo de cultivo que pasó antes de que se tomaran y procesaran las muestras de cultivo (col. 3), junto con la fracción de proteina detectada en el pico principal ("% de pico principal de SEC", col.4). Hubo una pequeña diferencia en la pureza global según se detecta por este método, con alrededor de 89% del producto contenido en el pico principal con o sin bolo de etanol. Aparentemente esto se debió a la alta pureza inicial del anticuerpo Ab-C incluso sin la adición del bolo. Adicionalmente, SEC no resolvió la especie H1L1 del anticuerpo total y por consiguiente la producción disminuida de esta especie debido al bolo de etanol no se vio reflejada en los resultados de SEC.
La FIG. 10 resume los resultados de la medición de espectrometría de masas de la cantidad de cadena pesada libre (sin enlace disulfuro a una segunda cadena pesada) en muestras de anticuerpo Ab-A que contienen altas o bajas cantidades de la banda H1L1. Tal como se esperaba, la cantidad de cadena pesada libre correlacionada con la cantidad de la banda H1L1, confirma su identidad como que contiene una cadena pesada y una ligera y que no tiene un enlace disulfuro a una segunda cadena pesada.
Las FIG.11-13 muestran la correlación entre la adición de un bolo de etanol y la viabilidad celular. La adición de un bolo de etanol generalmente mejoró la viabilidad celular y la pureza del anticuerpo del anticuerpo Ab-A (FIG. 11) y del anticuerpo Ab-B (FIG.12). Estos resultados sugieren que la mejora en la viabilidad celular puede explicar al menos parte de la mejora de la pureza del anticuerpo a partir de la adición del bolo de etanol. De acuerdo con estos resultados, el cultivo del anticuerpo Ab-C presentó una mayor pureza de anticuerpo y viabilidad celular que los cultivos de Ab-A y Ab-B (FIG. 13). Aparentemente debido a que la viabilidad de los cultivos que producen el anticuerpo Ab-C ya era alta en estos experimentos, hubo poco lugar para la mejora y los cultivos presentaron una pequeña mejora en la viabilidad a partir de la adición del bolo de etanol. En las FIG.11-13, las barras rellenas indican que no hay bolo, mientras que las barras abiertas indican una adición de bolo de etanol. La viabilidad se determinó a partir de cultivos de fermentación muestreados con 1,5 horas del momento en el cual las muestras se recogieron para los análisis de pureza (tal como lo identifican los portaobjetos precedentes).
La FIG.14 muestra que un amplio intervalo de concentraciones de bolo de etanol pueden producir la misma mejora en la pureza del anticuerpo. Se produjo Ab-A con una adición de bolo de etanol entre 5 g/L (0,5% p/v) y 15 g/L (1,5% p/v) y se purificó por afinidad por proteina A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida. Cada cultivo presentó niveles similarmente bajos de los complejos H2L1 y H1L1 a 63 horas (FIG. 14A) y 86 horas (FIG.14B). Orden de las vías en las FIG.14A-B: via 1: marcadores de peso molecular; vías 2 y 7: 5 g/L de bolo; vías 3 y 5: 10 g/L de bolo; vías 4 y 6: 15 g/L de bolo.
La FIG. 15 muestra que el tiempo que pasó entre el pico de oxigeno disuelto y la adición del bolo de etanol puede variar considerablemente mientras que proporciona una mejora similar en la pureza del anticuerpo. Se produjo Ab-A con una adición de bolo de etanol de 10 g/L (1% p/v) y se purificó por afinidad por proteina A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida (FIG. 15A). El "periodo de privación", el tiempo entre el pico de oxigeno disuelto (que indica el agotamiento de la fuente de carbono en el cultivo) y la adición de bolo de etanol, varió entre 0 y 3 horas. Cada cultivo presentó niveles similarmente bajos de los complejos H2L1 y H1L1 independientemente de la duración del periodo de privación, lo que indica que la pureza del anticuerpo es relativamente insensible a la ausencia de un periodo de privación o un periodo de privación de al menos hasta tres horas. Las mismas muestras se analizaron en un gel reducido (FIG. 15B). Orden de las vías en las FIG. 15A-B: vía 1: marcadores de peso molecular; vías 2-4: sin muestra; vía 5: 0 horas de periodo de privación; vía 6: 3 horas de periodo de privación.
La FIG. 16 muestra el efecto del periodo de equilibrio (el tiempo entre la adición del bolo de etanol y el comienzo de la alimentación) sobre la pureza del anticuerpo. El anticuerpo Ab-B se produjo con una adición de bolo de etanol de 10 g/L (1% p/v) y se purificó por afinidad por proteina A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida (FIG. 16A). La duración del periodo de equilibrio fue 0, 30 o 60 minutos. El periodo de equilibrio de 60 minutos dio como resultado una menor pureza de anticuerpo (mayor abundancia de los complejos H2L1 y H1L1). La viabilidad del cultivo también fue marcadamente menor con un período de equilibrio de 60 minutos, particularmente temprano en el cultivo (a las 23 horas, FIG. 16B); la viabilidad había mejorado un poco al final del cultivo (a 85 horas, FIG.16C). Orden de las vías en la FIG.16A: vía 1: marcadores de peso molecular; vías 2 y 4: sin muestra; vía 3: 30 minutos de equilibrio; vías 5 y 6: 60 minutos de tiempo de equilibrio; vías 7 y 8: 0 minutos de tiempo de equilibrio. En las FIG.16B-C, las barras rellenas indican un período de equilibrio de cero minutos, las barras sombreadas indican un periodo de equilibrio de 30 minutos y las barras abiertas indican un período de equilibrio de 60 minutos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Los solicitantes descubrieron inesperadamente que la pureza de los complejos de múltiples subunidades expresados a partir de levadura se pueden mejorar en gran medida mediante la adición de un bolo de etanol al medio de cultivo. Se demostró que la adición de un solo bolo de etanol mejoró la pureza durante un periodo sostenido de producción, por hasta al menos 97 horas.
La presente descripción proporciona métodos y composiciones mejoradas de materia que facilitan la producción recombinante de anticuerpos y otros complejos de múltiples subunidades con mayor pureza y menor producción de uno o más subproductos indeseados. En ejemplos de modalidades, con respecto al complejo de múltiples subunidades deseado, el/los subproducto/s indeseado/s pueden presentar uno o más de: estequiometria alterada, glicosilación aberrante, diferencias en el peso molecular aparente, diferencias en enlaces disulfuro, diferencias en el radio hidrodinámico, fragmentos y/o formas truncadas de una o más subunidades. Los subproductos indeseados también pueden presentar una o más diferencias adicionales. Los subproductos indeseados también se pueden detectar por sus efectos sobre una preparación, por ej., alteración en el nivel de actividad especifica, inmunogenicidad u otros efectos sobre la constitución física y/o función del complejo de múltiples subunidades deseado.
Por ejemplo, cuando el complejo de múltiples subunidades deseado es un anticuerpo, los subproductos indeseado puede incluir una especie H1L1 o de "anticuerpo medio" (es decir, que contiene una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada no está unida por un enlace disulfuro a otra cadena pesada) y/o una especie H2L1 (es decir, que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera, pero que no tiene una segunda cadena ligera).
Pese a que no pretende estar limitado por la teoría, se plantea la hipótesis de que un rápido aumento en la concentración de etanol (que puede ser provocado por una adición de bolo de etanol) puede provocar cambios sostenidos en la expresión génica que otorga una mejora duradera en la producción de complejos de múltiples subunidades adecuadamente plegados y montados y/o aumenta el procesamiento de complejos de múltiples subunidades mal plegados o mal montados, lo que lleva a una pureza mejorada en el complejo de múltiples subunidades. Además, se demostró que la pureza del anticuerpo mejorada se correlacionó con la viabilidad mejorada de la levadura en el cultivo y en función de esto los Solicitantes plantearon la hipótesis de que la viabilidad mejorada puede explicar (al menos en parte) la pureza mejorada, pese a que no se pretende que esta teoría sea taxativa.
En una modalidad preferida, el complejo de múltiples subunidades heterólogo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, tal como un anticuerpo humanizado, que comprende dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera. Las células hospedadoras preferidas incluyen levaduras, y particularmente las levaduras preferidas incluyen cepas de levadura metilotrófica, por ej., Pichia pastoris, Hansenula polymorpha (Pichia angusta) , Pichia guillermordii, Pichia methanolica , Pichia inositovera , y otras ('véase por ej., patentes estadounidenses 4,812,405, 4,818,700, 4,929,555, 5,736,383, 5,955,349, 5,888,768 y 6,258,559 cada una de las cuales se incorpora mediante esta referencia en su totalidad). La célula hospedadora se puede producir por métodos conocidos en la téenica, tales como transformación, apareamiento, esporulación, etc.
En una modalidad preferida, la célula hospedadora puede comprender más de una copia de uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteínas heterólogas. Por ejemplo, múltiples copias de un gen de subunidad se pueden integrar en tándem en uno o más locus cromosómicos. Las copias de genes integradas en tándem se retienen preferentemente en una cantidad estable de copias durante el cultivo para la producción del complejo de múltiples subunidades. Por ejemplo, en los ejemplos descritos a continuación, las cantidades de copias de genes fueron generalmente estables para las cepas de P. pastoris que contenían tres a cuatro copias integradas en tándem de genes de anticuerpo de cadena ligera y pesada.
Uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteína heteróloga están preferentemente integrados en uno o más locus cromosómico de una célula hospedadora. Cualquier locus cromosómico adecuado se puede utilizar para la integración, incluyendo secuencias intergénicas, secuencias promotoras, secuencias codificantes, secuencias de terminación, secuencias reguladoras, etc. Los ejemplos de locus cromosómicos que se pueden usar en P. pastoris incluyen PpURA5; 0CH1 ; A0X1 ; HIS4; y GAP. Los genes codificantes también se pueden integrar en uno o más locus cromosómicos aleatorios en vez de estar direccionados. En modalidades preferidas, los locus cromosómicos se seleccionan del grupo que consiste en el locus pGAP, 3' AOX TT, y el locus HIS4 TT. En otros ejemplos de modalidades, los genes que codifican las subunidades de proteína heteróloga pueden estar contenidos en uno o más elementos extracromosómicos, por ejemplo uno o más plásmidos o cromosomas artificiales.
En ejemplos de modalidades, la proteína de múltiples subunidades puede comprender dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subunidades no idénticas. Además, cada subunidad puede estar presente una o más veces en cada proteína de múltiples subunidades. Por ejemplo, la proteina de múltiples subunidades puede ser un anticuerpo multiespecifico tal como un anticuerpo biespecifico que comprende dos cadenas ligeras no idénticas y dos cadenas pesadas no idénticas.
Las subunidades se pueden expresar a partir de genes onocistrónicos, genes policistrónicos o cualquier combinación de estos. Cada gen policistrónico puede comprender múltiples copias de la misma subunidad o puede comprender una o más copias de cada subunidad diferente.
Los ejemplos de métodos que se pueden usar para la manipulación de Pichia pastoría (incluyendo métodos para cultivar, transformar y aparear) se describen en las solicitudes publicadas incluyendo U.S. 20080003643, U.S. 20070298500 y U.S. 20060270045 y en Higgins, D. R., y Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J. y Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2a edición), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., cada uno de los cuales se incorpora en su totalidad mediante esta referencia.
Un ejemplo de casete de expresión que se puede utilizar está compuesto por el promotor del gen de deshidrogenasa de gliceraldehido (gen GAP), fusionado con secuencias que codifican una señal de secreción, seguido de la secuencia del gen a ser expresado, seguido de secuencias que codifican una señal de terminación de transcripción de P. pastoris del gen de la alcohol oxidasa I (A0X1) de P. pastoris . El gen marcador de resistencia a la Zeocina puede proporcionar un medio para enriquecer las cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa seleccionando los transformantes que son resistentes a mayores niveles de Zeocina. De manera similar, los genes marcador de resistencia a G418 o Kanamicina pueden proporcionar un medio para enriquecer las cepas que contienen múltiples copias integradas de un vector de expresión en una cepa seleccionando los transformantes que son resistentes a mayores niveles de Geneticina o Kanamicina.
Las cepas de hospedadores que se pueden utilizar incluyen P. pastoris auxotrófica u otras cepas Pichia, por ejemplo, cepas que tienen mutaciones en metí, lys3, ura3 y adel u otros genes asociados con la auxotrofia. Las mutaciones preferidas no son capaces de dar origen a revertientes en cualquier frecuencia apreciable y son preferentemente mutantes de eliminación parcial o incluso más preferentemente total.
Preferentemente, las cepas diploides o tetraploides prototróficas se producen apareando un conjunto complementario de cepas auxotróficas.
La transformación de cepas haploides de P. pastoris y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris se pueden desarrollar como se describe en Pichia Protocols (1998, 2007), anteriormente.
Antes de la transformación, cada vector de expresión puede linealizarse mediante escisión de enzima de restricción dentro de una región homologa al locus genómico diana (por ej., la secuencia promotora GAP) para dirigir la integración de los vectores en el locus diana de la célula hospedadora. Luego, las muestras de cada vector pueden transformarse individualmente en cultivos de las cepas deseadas por electroporación u otros métodos y se pueden seleccionar transformantes exitosos mediante un marcador seleccionable, por ej., resistencia antibiótica o complementación de una auxotrofia. Los aislados se pueden elegir, estriarse para colonias simples en condiciones selectivas y luego examinarse para confirmar la cantidad de copias del gen que codifica la subunidad del complejo de múltiples subunidades (por ej., un anticuerpo deseado) por transferencia Southern o ensayo de PCR en ADN genómico extraído de cada cepa. Opcionalmente, la expresión del producto génico de subunidad esperada podría confirmarse, por ej., por FACS, transferencia Western, transferencia de colonia e inmunotransferencia y otros medios conocidos en la téenica. Opcionalmente, los aislados haploides se transforman más veces para introducir genes heterólogos adicionales, por ej., copias adicionales de la misma subunidad integrada en un locus diferente y/o copias de una subunidad diferente. Las cepas haploides se aparean luego para generar cepas diploides (o cepas de mayor ploidía) capaces de sintetizar el complejo de múltiples proteínas. La presencia de cada gen de subunidad esperado puede confirmarse por transferencia Southern, PCR y otros medios de detección conocidos en la técnica. En los casos en que el complejo de múltiples proteínas deseado es un anticuerpo, su expresión también se puede confirmar por un método de transferencia de colonias/inmunotransferencia (Wung et ál. Biotechniques 21 808-812 (1996) y/o por FACS.
Este protocolo de transformación se repite opcionalmente para dirigirse a un gen heterólogo en un segundo locus, que puede ser el mismo gen o un gen diferente que se dirigió al primer locus. Cuando la construcción a ser integrada en el segundo locus codifica una proteina que es la misma o altamente similar a la secuencia codificada por el primer locus, su secuencia puede variar para disminuir la probabilidad de integración indeseada en el primer locus. Por ejemplo, la secuencia a ser integrada en el segundo locus puede tener diferencias en la secuencia promotora, secuencia de terminación, uso del codón y/u otras diferencias tolerables en la secuencia con respecto a la secuencia integrada en el primer locus.
Para aparear cepas haploides P. pastoris, cada cepa a ser cruzada se puede parchear en placas de apareamiento. Por ejemplo, se pueden realizar múltiples apareamientos de forma conveniente al mismo tiempo estriando cada cepa a ser apareada en una placa adecuada para su crecimiento y los compañeros de apareamiento se pueden estriar en una segunda placa (preferentemente las placas son medio rico tal como YPD). Típicamente, luego de uno o dos días de incubación a 30 °C, las células de las dos placas se pueden colocar en placas en réplica en una forma entrelazada en una placa de apareamiento, que da como resultado un patrón sombreado con rayas donde cada par de cepas está colocado en placas conjuntamente y tiene la oportunidad de aparearse en la intersección de un par de las líneas de estrías originales.
La placa de apareamiento se puede incubar luego (por ej., a 30 °C) para estimular el inicio del apareamiento entre las cepas. Luego de alrededor de dos dias, las células en las placas de apareamiento se pueden estriar, parchear, o colocar en placas en réplica en un medio selectivo para las cepas diploides deseadas (por ej., cuando las cepas apareadas tienen autotrofías complementarias, se pueden usar placas de descarte o de medio mínimo). Estas placas se pueden incubar (por ej., a 30 °C) por una duración adecuada (por ej., alrededor de tres días) para permitir el crecimiento selectivo de las cepas diploides deseadas. Las colonias que surgen se pueden elegir y estriar para colonias simples para aislar y purificar cada cepa diploide.
Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención pueden incluir adicionalmente secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador de fármaco o auxotrófico seleccionable para identificar las cepas de lavadura transformadas. También se puede usar un marcador de fármaco para amplificar la cantidad de copia del vector en una célula hospedadora de levadura, por ej., cultivando una población de células en una concentración elevada del fármaco, seleccionando así transformantes que expresan niveles elevados del gen resistencia.
En un ejemplo de modalidad, uno o más de los genes que codifican las subunidades de proteina heteróloga se acoplan a un promotor inducible. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor del gen de la alcohol oxidasa 1, genes de deshidrogenasa de formaldehido (FLD; véase publicación estadounidense N° 2007/0298500) y otros promotores inducibles conocidos en la téenica. El promotor del gen de la alcohol oxidasa 1 está fuertemente reprimido durante el crecimiento de la levadura en las fuentes de carbono más comunes, tales como glucosa, glicerol o etanol pero está altamente inducido durante el crecimiento en metanol (Tschopp et ál., 1987; patente estadounidense N° 4,855,231 concedida a Stroman, D. W., et ál). Para la producción de proteínas extrañas, las cepas se pueden cultivar inicialmente en una fuente de carbono represora para generar biomasa y luego se cambian a metanol como la única (o principal) fuente de carbono y energía para inducir la expresión del gen extraño. Una ventaja de este sistema de regulación es que las cepas de P. pastoris transformadas con genes extraños cuyos productos de expresión son tóxicos a las células se pueden mantener cultivándolos en condiciones de represión.
En otro ejemplo de modalidad, uno o más de los genes heterólogos se pueden acoplar a un promotor regulador, cuyo nivel de expresión se puede regular en aumento en condiciones apropiadas. Los ejemplos de promotores regulados incluyen el promotor CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio), promotores inducibles por tetracielina, promotores inducibles por tiamina, el promotor A0X1 y el promotor FLDl.
Pese a que la mayoría de la presente descripción describe la producción de anticuerpos, los métodos descritos en la presente también se adaptan fácilmente a otros complejos de múltiples subunidades. Sin pretender limitarse por la teoría, se cree que el rendimiento y la pureza de los complejos de múltiples subunidades se puede ver influenciado en gran medida por la concentración y estequiometría de las subunidades, que a su vez se ven influenciadas por el nivel de expresión de los genes responsables de la producción de cada subunidad. Los métodos descritos en la presente se pueden utilizar fácilmente para mejorar el rendimiento y/o la pureza de cualquier complejo de múltiples subunidades recombinantes que comprende dos o más subunidades diferentes. Además, los métodos de la presente no se limitan a la producción de complejos de múltiples proteínas sino que también se pueden adaptar fácilmente para usarse con complejos de ribonucleoproteína (RNP) incluyendo telomerasa, hnRNP, Ribosomas, snRNP, partículas de reconocimiento de señal, complejos de RNasa P procariotas y eucariotas y cualquier otro complejo que contenga múltiples proteínas distintas y/o subunidades de ARN. La célula hospedadora que expresa el complejo de múltiples subunidades se puede producir por métodos conocidos en la téenica. Por ejemplo, se puede generar un panel de células de levadura diploides o tetraploides que contiene diferentes combinaciones de cantidades de copia de gen, apareando células que contienen cantidades distintas de copias de los genes de subunidad individuales (cuyos números de copias se conocen preferentemente antes del apareamiento).
Definiciones Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la metodología, protocolos, líneas celulares, especies o géneros animales, y reactivos particulares que se describen, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el único fin de describir modalidades particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que se verá limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Tal como se usan en la presente, las formas singulares "un/a", "y" y "el/la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto lo determine claramente de otro modo.
Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una variedad de dichas células y la referencia a "la proteina" incluye la referencia a una o más proteínas y los equivalentes de estos que sean conocidos por los expertos en la téenica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado entendido comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención, a menos que se indique claramente de otro modo.
Adición de bolo: En la presente descripción, "adición de bolo" en general se refiere al cambio rápido en la concentración de una sustancia (tal como etanol) en contacto con las células cultivadas (por ejemplo, en un medio de cultivo). Por ejemplo, la sustancia se puede agregar a las células cultivadas en una única adición, una sucesión de más de una adición y/o se puede administrar como infusión durante un período de tiempo (por ejemplo, durante alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, o 120 minutos). La sustancia también se puede agregar reemplazando el medio de cultivo parcial o totalmente, por ejemplo, concentrando las células (usando centrifugación, filtración, sedimentación u otros métodos), retirando todo o parte del medio, y agregando la sustancia, o agregando las células a un medio que contiene la sustancia. La sustancia se puede mezclar con un portador (por ejemplo, medio de cultivo, agua, solución salina, etc.). Por ejemplo, una adición de bolo de etanol puede comprender la adición de etanol puro o concentrado (por ejemplo, 100%, 95%, 70%, 50%, 60%, 40%, 30%, 20%, etc.) al medio de cultivo en una cantidad suficiente para producir la concentración deseada. Como otro ejemplo, las células se pueden agregar a un medio que contiene etanol, por ejemplo, agregando un inoculo que contiene las células a un medio que contiene etanol.
Concentración de bolo: En la presente descripción, "concentración de bolo" en general se refiere a la concentración que resulta de la adición de un bolo de una sustancia (por ejemplo, etanol).
Especies de levadura que pueden aparearse: En la presente invención esto pretende abarcar de forma amplia cualquier levadura diploide o tetraploide que se puede cultivar en cultivo. Dichas especies de levadura pueden existir en una forma haploide, diploide u otra forma poliploide. Las células de una ploidia dada pueden, en condiciones apropiadas, proliferar durante una cantidad indefinida de generaciones en dicha forma. Las células diploides también pueden esporular para formar células haploides. El apareamiento secuencial puede dar como resultado cepas tetraploides mediante el apareamiento o fusión adicional de cepas diploides. La presente invención contempla el uso de levadura haploide, asi como células de levadura diploides u otras poliploides producidas, por ejemplo, mediante apareamiento o fusión (por ejemplo, fusión de esferoplastos).
En una modalidad de la invención, la levadura que puede aparearse es un miembro de la familia Saccharomycetaceae, que incluye los géneros Arxiozyma ; Ascobotryozyma ; Citeromyces ; Debaryomyces ; Dekkera ; Eremothecium ; Issatchenkia ; Kazachstania ; Kluyveromyces ; Kodamaea; Lodderomyces ; Pachysolen; Pichia ; Saccharomyces ; Saturnispora ; Tetrapisispora ; Torulaspora ; Williopsis ; y Zygo saccharomyces . Otros tipos de levadura que pueden ser útiles en la invención incluyen Yarrowia ; Rhodosporidium ; Candida ' , Hansenula; Filobasium; Sporidiobolus ' , Bullera ; Leucosporidium y Filobasidella.
En una modalidad preferida de la invención, la levadura que puede aparearse es un miembro del género Pichia o es otro methylotroph . En una modalidad preferida adicional de la invención, la levadura que puede aparearse del género Pichía es una de las siguientes especies: Pichia pastoras , Pichia methanolica , y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . En una modalidad particularmente preferida de la invención, la levadura que puede aparearse del género Pichia es la especie Pichía pastoris .
Célula de levadura haploide: Una célula con una única copia de cada gen de su complemento genómico normal (cromosómico).
Célula de levadura poliploide: Una célula con más de una copia de su complemento genómico normal (cromosómico).
Célula de levadura diploide: Una célula con dos copias (alelos) básicamente de cada gen de su complemento genómico normal, generalmente formado mediante el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides.
Célula de levadura tetraploide: Una célula con cuatro copias (alelos) básicamente de cada gen de su complemento genómico normal, generalmente formado mediante el proceso de fusión (apareamiento) de dos células diploides. Los tetraploides pueden presentar dos, tres, cuatro o más casetes de expresión distintos. Dichos tetraploides se pueden obtener en 5. cerevisiae mediante acoplamiento selectivo de diploides homocigotas heterotálicos a/a y alfa/alfa y en Pichia mediante el apareamiento secuencial de haploides para obtener diploides auxotróficos. Por ejemplo, un haploide [met his] se puede aparear con un haploide [ade his] para obtener el diploide [his]; y un haploide [met arg] se puede aparear con un haploide [ade arg] para obtener el diploide [arg]; luego el diploide [his] se puede aparear con el diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide. Los expertos en la téenica entenderán que la referencia a los beneficios y usos de células diploides también se pueden aplicar a las células tetraploides.
Apareamiento de la levadura: El proceso mediante el cual dos células de levadura se fusionan para formar una única célula de levadura. Las células fusionadas pueden ser células haploides o células de ploidía más alta (por ejemplo, apareamiento de dos células diploides para producir una célula tetraploide).
Meiosis: El proceso mediante el cual una célula de levadura diploide experimenta división reductiva para formar cuatro productos de espora haploides. Cada espora posteriormente puede germinar y formar una línea celular haploide que crece de forma vegetativa.
Marcador seleccionable . Un marcador seleccionadle es un gen o fragmento de gen que otorga un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) en una célula que recibe dicho gen, por ejemplo, a través de un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo en condiciones en las cuales las células que no reciben dicho gen marcador seleccionable no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionadles en general están comprendidos en varios tipos, incluyendo los genes marcadores seleccionables positivos, tal como un gen que otorga a una célula resistencia a un antibiótico u otro fármaco, temperatura cuando se cruzan dos mutantes sensibles a la temperatura ("ts") o se transforma un mutante ts; genes marcadores seleccionables negativos, tal como un gen biosintético que otorga a una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico requerido por todas las células que no poseen dicho gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que otorga a una célula la incapacidad de crecer por parte de las células que no poseen el gen de tipo salvaje; y similares. Los marcadores adecuados incluyen, de modo no taxativo: ZEO; NEO (G418); LYS3; METI; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; y similares.
Integrado: Un elemento genético (generalmente un elemento genético heterólogo) que se une covalentemente a un cromosoma de un organismo.
Integrado en tándem : Dos o más copias de un elemento genético que se integran en ubicaciones contiguas en un cromosoma. Las dos o más copias no necesariamente tienen la orientación, por ejemplo, para los genes trascritos, algunas copias se pueden transcribir a partir de la cadena Watson y otras a partir de la cadena Crick.
Célula hospedadora : En el contexto de la presente descripción, el término célula hospedadora se refiere a una célula (por ejemplo, una célula eucariota, tal como una célula Píchia ) que contiene un gen heterólogo. Por ejemplo, el gen heterólogo puede facilitar la expresión de una subunidad de un complejo de múltiples subunidades deseado, un gen implicado en el plegamiento (por ejemplo, una chaperona), expresión o secreción de la proteina, y/u otro gen deseado. El gen heterólogo se puede integrar al genoma de la célula eucariota o puede estar contenido en el elemento extracromosómico, tal como un cromosoma artificial o plásmido.
Vector de expresión : Estos vectores de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de una proteina extraña dentro de la célula hospedadora diana. De forma conveniente, la manipulación de las secuencias y la producción de ADN para la transformación se realiza en primer lugar en un hospedador bacteriano, por ejemplo, E. coli, y en general los vectores incluyen secuencias para facilitar dichas manipulaciones, incluyendo un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriano apropiado. Los marcadores de selección codifican proteínas necesarias para la supervivencia o el crecimiento de las células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a los antibióticos u otras toxinas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) brindan nutrientes fundamentales no disponibles a partir del medio complejo. Los ejemplos de vectores y métodos para la transformación de levadura se describen, por ejemplo, en Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Coid Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Coid Spring Harbor Laboratory Press, que se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención pueden incluir adicionalmente secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador de fármaco o auxotrófico seleccionable para identificar las cepas de lavadura transformadas. Un marcador seleccionable además se puede usar para seleccionar la amplificación de la cantidad de copias del vector en una célula hospedadora de levadura.
La secuencia de interés que codifica el polipéptido en general se une operativamente a las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales que facilitan la expresión del polipéptido en las células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, de modo no taxativo, uno o más de los siguientes: un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. También se pueden incluir secuencias para la secreción del polipéptido, por ejemplo, una secuencia de señales, y similares. Un origen de replicación de levadura es opcional, ya que los vectores de expresión a menudo están integrados al genoma de la levadura.
Si bien es opcional, en una modalidad de la invención, una o más subunidades del complejo de múltiples subunidades se unen operativamente, o fusionan, a una secuencia de secreción que facilita la secreción del polipéptido expresado en el medio de cultivo, lo que puede facilitar la cosecha y purificación del complejo de múltiples subunidades. Aun más preferentemente, las secuencias de secreción facilitan la secreción optimizada del polipéptido a partir de las células hospedadoras (por ejemplo, células diploides de levadura), tal como mediante la selección de los codones preferidos y/o modificación del porcentaje AT mediante la selección de codones. Es sabido en la téenica que la eficacia y/o estabilidad de la secreción se pueden ver afectadas por la elección de la secuencia de secreción y la secuencia de secreción ideal puede variar entre las distintas proteínas (véase, por ejemplo, Koganesawa et ál., Protein Eng. set 2001;14 (9):705-10, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia). En la técnica se conocen muchas señales de secreción que pueden ser adecuadas y se puede probar fácilmente su efecto sobre el rendimiento y/o la pureza de un complejo de múltiples subunidades heterólogo particular. Se puede usar cualquier secuencia de secreción, incluyendo las que se encuentran presentes en las proteínas secretadas de levaduras y otras especies, así como las secuencias de secreción manipuladas genéticamente. Los ejemplos de secuencias de secreción que se pueden utilizar incluyen: péptido de señal de lisozima de gallina (CLY) (MRSLLILVLCFLPLAALG (SEQ ID NO:414)), CLY- L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (SEQ ID NO:415)), péptido de señal invertasa de S. cerevisiae (SUC2) (MLLQAFLFLLAGFAAKISA (SEQ ID NO:416)), MF-alfa (Prepro) (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR (SEQ ID NO:417)), MF-alfa (Pre)- apv (MRFP SIFT AVLF AAS SAL A-AP V (SEQ ID NO:418)), MF-alfa (Pre)-apv-SLEKR (MRFPSIFT AVLF AAS S ALA-AP V SLEKR (SEQ ID NO:419)), MF-alfa (Prepro)-(EA)3 (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA (SEQ ID NO:420)), péptido de señal aF (MRFPSIFTAVLFAAS SAL A-AP VNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR (SEQ ID NO:421)), péptido de señal KILM1 (MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR (SEQ ID NO:422)), péptido de señal de fosfatasa ácida represible (PH01) (MFSPILSLEIILALATLQSVFA (SEQ ID NO:423)), péptido de señal de A. niger GOX (MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR (SEQ ID NO:424)), péptido de señal del gen de glicoamilasa de Schwanniomyces occidentalis (GAM1) (MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA (SEQ ID NO:425)), péptido de señal de albúmina de suero humano (HSA) con pro-secuencia (MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR (SEQ ID NO:426)), péptido de señal de albúmina de suero humano (HSA) sin pro-secuencia (MKWVTFISLLFLFSSAYS (SEQ ID NO:427)), péptido de señal de ISN (M AL WMRLLPLL ALL AL W GPDP AAA (SEQ ID NO:428)), péptido de señal de IFN (MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP (SEQ ID NO:429)), péptido de señal de HGH (MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (SEQ ID NO:430)), fitohemaglutinina (PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG (SEQ ID NO:431)), lisozima de gusano de seda (MQKLIIFALVVLCVGSEA (SEQ ID NO:432)), lisozima de humano (LYZl) (MKALIVLGLVLLSVTVQG (SEQ ID NO:433)), receptor de activina tipo 1 (MVDGVMILPVLIMIALPSPS (SEQ ID NO:434)), receptor de activina tipo II (MGAAAKLAFAVFLISCSSG (SEQ ID NO:435)), proteina de unión a la inmunoglobulina P. pastoris (PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLW VPFAKPVRA (SEQ ID NO:436)) y líder de cadena ligera 3D6 de anticuerpo humano (MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID NO:37)). Véase, Hashimoto et ál., Protein Engineering Vol.11 N° 2 p.75-77, 1998; Oka et ál., Biosci Biotechnol Biochem. nov 1999; 63(11): 1977-83; Gellissen et ál., FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma et ál., Hepatology. dic 2005;42(6): 1355-63; Raemaekers et ál, Eur J Biochem. 1 oct 1999;265(1):394-403; Koganesawa et ál, Protein Eng. (2001) 14 (9): 705-710; Daly et ál., Protein Expr Purif. abr 2006;46(2):456-67 ; Damasceno et ál., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; y Felgenhauer et ál., Nucleic Acids Res.25 ago 1990;18(16):4927, cada uno de los cuales se incorporan a la presente en su totalidad mediante esta referencia). El complejo de múltiples subunidades también se puede secretar en el medio de cultivo sin estar fusionado o unido operativamente a una señal de secreción. Por ejemplo, se ha demostrado gue algunos polipéptidos heterólogos se secretan en el medio de cultivo cuando se expresan en P. pastor is , aunque no estén unidos o fusionados a una secuencia de secreción. De manera adicional, el complejo de múltiples subunidades se puede purificar a partir de células hospedadoras (que, por ejemplo, pueden ser preferibles si el complejo es escasamente secretado) utilizando los métodos conocidos en la téenica.
Los medios o células que comprenden un complejo de múltiples subunidades deseado se pueden recuperar del cultivo. Opcionalmente, las proteínas secretadas se pueden purificar. Por ejemplo, las células que comprenden un complejo de múltiples subunidades deseado se pueden lisar utilizando métodos mecánicos, químicos, enzimáticos y/u osmóticos (por ejemplo, congelamiento con nitrógeno líquido, utilizando un homogeneizador, creando esferoplastos, sonicación, agitación en presencia de perlas de cristal, utilizando detergentes, etc.)· El complejo de múltiples subunidades deseado se puede concentrar, filtrar, dializar, etc. utilizando métodos conocidos en la téenica. El complejo de múltiples subunidades deseado se puede purificar en función de, por ejemplo, su masa molecular (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño), punto isoeléctrico (por ejemplo, foco isoeléctrico), movilidad electroforética (por ejemplo, electroforesis en gel), cromatografía de interacción hidrofóbica (por ejemplo, HPLC), carga (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico), afinidad ("por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, unión a la proteína A, proteína G, y/o un epítopo al que se une el anticuerpo deseado), y/o estado de glicosilación (por ejemplo, detectado por afinidad de unión a lectina). Se pueden llevar a cabo múltiples pasos de purificación para obtener el nivel deseado de pureza. En un ejemplo de modalidad, el complejo de múltiples subunidades deseado puede comprender un dominio constante de inmunoglobulina y se puede purificar usando la afinidad con la proteína A o la proteína G, cromatografía de exclusión por tamaño y falta de unión a lectina (para retirar las formas glicosiladas). Opcionalmente, se puede agregar el inhibidor de proteasa A, tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación.
Los ácidos nucleicos se "unen operativamente" cuando se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una secuencia de señales se une operativamente al ADN de un polipéptido si se expresa como una preproteina que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o potenciador se une operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que están unidas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no necesariamente son contiguos. La unión se puede lograr mediante la ligación en sitios de restricción convenientes o alternativamente mediante un método de PCR/recombinación conocido por los expertos en la téenica (Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad Calif.). En caso de que no existan dichos sitios, se pueden usar los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional. Los ácidos nucleicos deseados (incluyendo los ácidos nucleicos que comprenden secuencias unidas operativamente) también se pueden producir mediante síntesis química.
Los promotores son secuencias no traducidas ubicadas corriente arriba (5') del codón de inicio de un gen estructural (generalmente en el intervalo de alrededor de 100 y 1000 bp) gue controlan la transcripción y traducción de secuencias de ácidos nucleicos particulares a las cuales están unidos operativamente. Dichos promotores están comprendidos en varias clases: promotores inducibles, constitutivos y represibles (que aumentan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor). Los promotores inducibles pueden iniciar el aumento de los niveles de transcripción de ADN bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura.
El fragmento promotor de la levadura también puede servir como el sitio para la integración y recombinación homologa del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de la levadura; de manera alternativa, se usa un marcador seleccionable como el sitio para la recombinación homologa. La transformación de Pichia se describe en Cregg et ál. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Los ejemplos de promotores adecuados de Pichia incluyen el CUP1 (inducido por el nivel de cobre en el medio), promotores inducibles por tetracielina, promotores inducibles por tiamina, promotor de A0X1 (Cregg et ál. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); promotor de ICLl (Menendez et ál. (2003) Yeast 20(13): 1097-108); promotor de gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et ál. (1997) Gene 186(1):37-44); y promotor de FLD1 (Shen et ál. (1998) Gene 216(1):93-102). El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores CUP1, AOX y FLD1 son inducibles. Cada una de las referencias que anteceden se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Otros promotores de levadura incluyen ADH1, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PH03, PH05, Pyk y promotores quiméricos derivados de estos. De manera adicional, se pueden usar promotores que no son de levadura en la invención, tales como promotores de mamífero, insecto, vegetales, de reptil, anfibio, viral y de ave. Más comúnmente, el promotor comprenderá un promotor de mamífero (potencialmente endógeno a los genes expresados) o comprenderá un promotor de levadura o viral que proporcione la transcripción eficiente en sistemas de levadura.
Los polipéptidos de interés se pueden producir de manera recombinante no solo directamente sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo, una secuencia de señales u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión especifico en el extremo N del polipéptido o proteina madura. En general, la secuencia de señales puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia codificante de polipéptidos que se inserta en el vector. La secuencia de señales heterólogas seleccionada preferentemente es una que se reconoce y procesa a través de una de las vías estándar disponibles dentro de la célula hospedadora. La secuencia pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha demostrado ser eficaz en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris. Otras secuencias de señales de levadura incluyen la secuencia de señales del factor de apareamiento alfa, la secuencia de señales invertasa y las secuencias de señales derivadas de otros polipéptidos de levadura secretada. De manera adicional, estas secuencias de péptidos de señal se pueden manipular genéticamente para facilitar la mejora de la secreción en sistemas de expresión de levadura diploide. Otras señales de secreción de interés también incluyen las secuencias de señales de mamífero, que pueden ser heterólogas a la proteína que se está secretando, o puede ser una secuencia nativa para la proteina que se está secretando. Las secuencias de señales incluyen las secuencias de prepéptido y, en algunos casos, pueden incluir secuencias de propéptidos. Muchas de dichas secuencias de señales son conocidas en la téenica, incluyendo las secuencias de señales que se encuentran en las cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, la secuencia de preprotoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humana, secuencias de señales de albúmina en suero humano, cadena pesada Ig humana, cadena ligera Ig humana y similares. Por ejemplo, véase Hashimoto et. ál. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et. ál. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998), cada una de las cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Se puede aumentar la transcripción insertando una secuencia activadora transcripcional en el vector. Estos activadores son elementos de acción cis de ADN, comúnmente de alrededor de 10 a 300 bp, que actúan en un promotor para aumentar su transcripción. Los potenciadores transcripcionales son relativamente independientes en términos de orientación y posición, encontrándose 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, asi como dentro de la secuencia codificante en si misma. El potenciador se puede dividir en el vector de expresión en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante, pero preferentemente se ubica en el sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en las células hospedadoras eucariotas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Dichas secuencias comúnmente están presentes desde 3' con respecto al codón de terminación de traducción, en las regiones no traducidas de ADN o ADNc eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm.
La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea téenicas de ligación o métodos de PCR/recombinación estándar. Los plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, adaptan y vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o mediante métodos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan para transformar las células hospedadoras, y los transformantes exitosos se seleccionan por resistencia a antibióticos (por ejemplo, ampicilina o Zeocina) , cuando corresponda. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión de endonucleasa de restricción y/o se secuencian.
Como alternativa a la restricción y ligación de los fragmentos, los métodos de recombinación basados en los sitios att y las enzimas de recombinación se pueden usar para insertar las secuencias de ADN en un vector. Dichos métodos son descritos, por ejemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913- 949; y son conocidos por los expertos en la téenica. Dichos métodos utilizan recombinación de ADN intermolecular que es mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificada por lamba y E. coli. La recombinación ocurre entre los sitios de unión específicos (att) en las moléculas de ADN que interactúan. Por una descripción de sitios att, véase Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Coid Spring Harbor, N.Y.: Coid Spring Harbor Press), p. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación se cambian, de modo que luego de la recombinación, los sitios de att sean secuencias híbridas compuestas por secuencias donadas por cada vector parental. La recombinación puede ocurrir entre los ADN de cualquier topología. Cada una de las referencias que anteceden se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Los sitios de att se pueden introducir a una secuencia de interés ligando la secuencia de interés en un vector apropiado; generando un producto de PCR que contiene los sitios de att B mediante el uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene los sitios de att; y similares.
Genes monocistrónicos y policistrónicos . Un gen monocistrónico codifica un ARN que contiene la información genética para traducir solamente una proteina única. Un gen policistrónico codifica un ARN que contiene la información genética para traducir más de una proteina. Las proteínas codificadas en un gen policistrónico pueden tener las mismas secuencias o diferentes o una combinación de estas.
Dicistrónico o bicistrónico se refiere a un gen policistrónico que codifica dos proteínas. Los genes policistrónicos opcionalmente incluyen uno o más elementos de sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) para facilitar el inicio de la traducción independiente de cap, que pueden estar situados en una ubicación que puede impulsar la traducción de la región codificante de la proteína corriente abajo independientemente de la estructura 5'-cap unida al extremo 5' de la molécula de ARNm. Se puede usar cualquier secuencia de IRES (por ejemplo, de origen viral, eucariota o artificial). Por ejemplo, se puede usar la secuencia de IRES del virus de la parálisis del grillo en la región intergénica (IGR), como se describe en Thompson et ál . (2001) PNAS 98:12972-12977. Opcionalmente, la función de IRES se puede potenciar mediante modificación genética, por ejemplo, provocando la expresión constitutiva de la cinasa eIF2 GCN2 o modificando dos genes de ARNt(met) iniciadores modificados (id. ) .
Plegamiento , tal como se usa en la presente, se refiere-a la estructura tridimensional de los polipéptidos y las proteínas, donde las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Si bien las interacciones no covalentes son importantes para determinar la estructura, comúnmente las proteínas de interés tendrán enlaces disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para las proteínas y polipéptidos de origen natural, o derivados y variantes de estos, el plegamiento adecuado es generalmente la disposición que da como resultado la actividad biológica ideal, y se puede controlar convenientemente mediante ensayos para determinar la actividad, por ejemplo, unión al ligando, actividad enzimática, etc.
En algunos casos, por ejemplo cuando el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegamiento adecuado de dichas moléculas se puede determinar en función de las propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelado y similares.
El hospedador de expresión se puede modificar adicionalmente mediante la introducción de las secuencias que codifican una o más enzimas que potencian el plegamiento y la formación de enlaces disulfuro, es decir, foldasas, chaperones, etc. Dichas secuencias se pueden expresar constitutiva o induciblemente en la célula hospedadora de levadura, utilizando vectores, marcadores, etc. que sean conocidos en la téenica. Preferentemente, las secuencias, incluyendo los elementos reguladores transcripcionales suficientes para el patrón de expresión deseado, se integran establemente en el genoma de levadura mediante una metodología dirigida.
Por ejemplo, el PDI eucariota no solamente es un catalizador eficiente de la oxidación de la cisteína de la proteína y de la isomerización de los enlaces disulfuro, sino que también presenta actividad chaperona. La expresión conjunta de PDI puede facilitar la producción de las proteínas activas con múltiples enlaces disulfuro. También es de interés la expresión de BIP (proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina), ciclofilina y similares. En una modalidad de la invención, el complejo de múltiples subunidades se puede expresar a partir de una cepa de levadura producida mediante apareamiento, donde cada una de las cepas parentales haploides expresa una enzima de plegamiento distinta, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP y la otra cepa puede expresar PDI o combinaciones de estos.
Los términos "proteína deseada" o "proteína diana" se usan de manera intercambiable y refieren en general a una proteína de múltiples subunidades heteróloga, tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humanizado) o una porción de unión de este, que se describe en la presente.
El término "anticuerpo" incluye cualquier estructura molecular que contiene una cadena de polipéptidos con una forma específica que se adapta y reconoce un epítopo, donde una o más interacciones de unión no covalente estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula de anticuerpo arquetípica es la inmunoglobulina y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, gallinas, otras aves, etc., se consideran "anticuerpos". Una fuente preferida para producir anticuerpos útiles como material de partida de acuerdo con la invención es el conejo. Se han descrito varias secuencias codificante de anticuerpos, y otras se pueden establecer mediante métodos conocidos en la téenica. Los ejemplos de estos incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y otros anticuerpos de mamíferos no humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de cadena simple, tales como scFv, anticuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR (anticuerpos de cadena simple derivados de tiburones), productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, Fab', F(ab')2 y similares. Véase, Streltsov V A, et ál., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. noviembre 2005; 14 (11):2901-9. Publicación electrónica 30 set 2005; Greenberg A S, et ál., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature.9 mar 1995; 374(6518): 168-73; Nuttall S D, et ál., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop librarles, Mol Immunol. agosto 2001; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et ál., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 3 jun 1993; 363(6428):446-8; Gilí D S, et ál., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. diciembre 2006; 17(6):653-8. Publicación electrónica 19 oct 2006. Cada una de las referencias que anteceden se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión al antigeno se pueden producir mediante manipulación genética. En esta téenica, al igual que con otros métodos, las células que producen anticuerpos se exponen al antigeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células que producen anticuerpos se usa como plantilla para generar ADNc usando amplificación por PCR. Una biblioteca de vectores, cada uno conteniendo un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera conservando la especificidad inicial del antigeno, se produce mediante inserción de las secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificada en los vectores de expresión. Se construye una biblioteca de combinación combinando la biblioteca del gen de cadena pesada con la biblioteca del gen de cadena ligera. Esto da como resultado una biblioteca de clones que expresan conjuntamente una cadena pesada y ligera (semejante al fragmento Fab o al fragmento de unión al antigeno de una molécula de anticuerpo). Los vectores que transportan estos genes se transfectan conjuntamente en una célula hospedadora. Cuando se induce la síntesis del gen de anticuerpo en el hospedador transfectado, las proteínas de cadena pesada y ligera se disponen a sí mismas para producir anticuerpos activos que se pueden detectar mediante análisis con el antígeno o inmunógeno.
Las secuencias codificantes de anticuerpos de interés incluyen las codificadas por secuencias nativas, así como ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticas en términos de secuencia a los ácidos nucleicos descritos, y variantes de estos. Las variantes de polipéptidos pueden incluir sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos (aa). Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras o sustituciones para eliminar los aminoácidos no esenciales, como para modificar un sitio de glicosilación, o para minimizar el plegamiento incorrecto mediante la sustitución o eliminación de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Las variantes se pueden diseñar para conservar o tener una mejor actividad biológica de una región particular de la proteina (por ejemplo, un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos, etc). Las variantes también incluyen fragmentos de los polipéptidos descritos en la presente, particularmente fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos que corresponden a los dominios funcionales. Se conocen téenicas para la mutagénesis in vitro de los genes clonados. También se incluyen en la presente invención los polipéptidos que se han modificado usando técnicas de biología molecular habituales de modo de mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o de optimizar las propiedades de solubilidad o de hacerlos más adecuados como agente terapéutico.
Los anticuerpos quiméricos se pueden elaborar por medios recombinantes combinando las regiones de cadena ligera y pesada variables (VL y VH), obtenidas a partir de las células que producen anticuerpos de una especie con las regiones constantes de cadena ligera y pesada de otra. En general, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedor o conejo y regiones constantes de humano para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de dichos anticuerpos quiméricos es conocida en la técnica y se puede lograr por medios estándar (como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense N° 5,624,659, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia). Se contempla asimismo que las reqiones constantes humanas de los anticuerpos quiméricos de la invención se pueden seleccionar de las regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
Los anticuerpo humanizados se manipulan genéticamente para que contengan aun más dominios de inmunoglobulina tipo humana e incorporen solamente las regiones determinantes de la complementariedad del anticuerpo derivado del animal. Esto se logra examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hipervariables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y adaptándolos a la estructura de las cadenas de anticuerpo humano. Si bien parece complejo a primera vista, el proceso es sencillo en la práctica. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 6,187,287, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. Los métodos para humanizar anticuerpos se han descrito anteriormente en la patente estadounidense emitida N° 7935340, cuya descripción se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia. En algunos casos, es necesario determinar si los residuos marco de conejo adicionales son necesarios para mantener la actividad. En algunos casos, los anticuerpos humanizados aun requieren conservar algunos residuos marco de conejo fundamentales para minimizar la pérdida de afinidad o actividad. En estos casos, es necesario cambiar los aminoácidos marco únicos o múltiples de las secuencias de linea germinal humana por los aminoácidos de conejo originales para obtener la actividad deseada. Estos cambios se determinan de forma experimental para identificar qué residuos de conejo son necesarios para conservar la afinidad y actividad.
Además de las inmunoglobulinas totales (o sus homólogos recombinantes), se pueden sintetizar los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de unión al epitopo (por ejemplo, Fab', F(ab')2, u otros fragmentos). Se puede diseñar el "fragmento" o las inmunoglobulinas mínimas utilizando las téenicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, se pueden producir inmunoglobulinas "Fv" para su uso en la presente invención sintetizando una región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada fusionadas. Las combinaciones de anticuerpos también son de interés, por ejemplo, diacuerpos, que comprenden dos especificidades a Fv distintas. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de inmunoglobulina comprenden SMIP (productos inmunofarmacéuticos de molécula pequeña) , anticuerpos de camélidos, nanocuerpos e IgNAR.
Las inmunoglobulinas y los fragmentos de estas se pueden modificar postraduccionalmente, por ejemplo, para agregar restos efectores, tales como enlazadores químicos, restos detectadles, tales como tintes fluorescentes, enzimas, toxinas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos, restos quimioluminiscentes y similares, o se pueden usar restos de unión específicos, tales como estreptavidina, avidina o biotina, y similares, en los métodos y composiciones de la presente invención. Los ejemplos de moléculas efectoras adicionales se proporcionan a continuación.
Variante asociada al producto: un producto distinto del producto deseado (por ejemplo, el complejo de múltiples subunidades deseado) que está presente en una preparación del producto deseado y está relacionado con el producto deseado. Los ejemplos de variantes asociadas con productos incluyen los péptidos truncados o elongados, productos con glicosilación distinta a la glicosilación deseada (por ejemplo, si se desea un producto aglicosilado, cualquier producto glicosilado se consideraría una variante asociada con productos), complejos con estequiometría anormal, montaje inadecuado, enlaces disulfuro anormales, plegamiento anormal o incompleto, agregación, escisión de proteasa u otras anormalidades. Los ejemplos de variantes asociadas con productos pueden presentar modificaciones en uno o más de masa molecular (por ejemplo, detectada mediante cromatografía de exclusión por tamaño), punto isoeléctrico (por ejemplo, detectado mediante enfoque isoeléctrico), movilidad electroforética (por ejemplo, detectada mediante electroforesis en gel), estado de fosforilación (por ejemplo, detectado mediante espectrometría de masas), relación carga a masa (por ejemplo, detectada mediante espectrometría de masas), masa o identidad de fragmentos proteolíticos (por ejemplo, detectada mediante espectrometría de masas o electroforesis en gel), hidrofobicidad (por ejemplo, detectada mediante HPLC), carga (por ejemplo, detectada mediante cromatografía de intercambio iónico), afinidad (por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, detectada mediante la unión a la proteína A, proteína G, y/o a un epítopo al cual se une el anticuerpo deseado), y estado de glicosilación (por ejemplo, detectado mediante afinidad de unión a la lectina). Cuando la proteína deseada es un anticuerpo, el término variante asociada con productos puede incluir una variante glico-pesada y/o especies de anticuerpo medio (descrito a continuación).
Los ejemplos de variantes asociadas con productos incluyen formas variantes que contienen enlaces disulfuro aberrantes. Por ejemplo, la mayoría de las moléculas de anticuerpo IgGl están estabilizadas por un total de 16 puentes disulfuro intra-cadena e inter-cadena, que estabilizan el plegamiento de los dominios IgG en las cadenas pesadas y ligeras, mientras que los puentes disulfuro inter-cadena estabilizan la asociación entre las cadenas pesadas y ligeras. Asimismo, otros tipos de anticuerpo contienen enlaces disulfuro intra-cadena e inter-cadena estabilizantes característicos. Además, algunos anticuerpos (incluyendo Ab-A y Ab-B descritos en la presente) contienen enlaces disulfuro adicionales denominados enlaces disulfuro no canónicos. Por lo tanto, los enlaces disulfuro inter-cadena aberrantes pueden dar como resultado la estequiometría compleja anormal, debido a la ausencia de un enlace covalente estabilizante y/o enlaces disulfuro con las subunidades adicionales. Además, los enlaces disulfuro aberrantes (ya sea inter-cadena o intra-cadena) pueden disminuir la estabilidad estructural del anticuerpo, lo que puede dar como resultado la disminución de la actividad, disminución de la estabilidad, aumento de la propensión a formar agregados y/o aumento de la inmunogenicidad. Las variantes asociadas con productos que contienen enlaces disulfuro aberrantes se pueden detectar de varias maneras, incluyendo SDS-PAGE de desnaturalización no reducida, electroforesis capilar, cIEX, espectrometría de masas (opcionalmente con modificación química para producir un cambio de masa de las cisternas libres), cromatografí de exclusión por tamaño, HPLC, cambios en la dispersión de la luz, y cualquier otro método adecuado conocido en la téenica. Véase, por ejemplo, The Protein Protocols Handbook 2002, Parte V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259- 169-8:581; Anticuerpo medio , especie de anticuerpo medio o H1L1 se refieren a un complejo de proteínas que incluye una única cadena de anticuerpo pesada y una única cadena de anticuerpo ligera, pero que carece de un enlace covalente con una segunda cadena de anticuerpo pesada y ligera. Dos anticuerpos medios pueden permanecer asociados no covalentemente en algunas condiciones (lo que puede presentar un comportamiento similar a un anticuerpo total, por ejemplo, peso molecular evidente determinado mediante cromatografía de exclusión por tamaño). De manera similar, H2L1 se refiere a un complejo de proteínas que incluye dos cadenas de anticuerpo pesadas y una única cadena de anticuerpo ligera, pero carece de un enlace covalente con una segunda cadena de anticuerpo ligera; estos complejos también pueden estar asociados no covalentemente a otra cadena de anticuerpo ligera (y asimismo proporcionan un comportamiento similar a un anticuerpo total). Como los anticuerpos totales, las especies de anticuerpo medio y las especies de H2L1 se pueden disociar en condiciones de reducción en cadenas pesada y ligera individuales. Las especies de anticuerpo medio y las especies de H2L1 se pueden detectar en un gel de SDS-PAGE no reducida como una especie que migra en un menor peso molecular evidente que el anticuerpo total, por ejemplo, H1L1 migra en aproximadamente la mitad del peso molecular evidente del anticuerpo total (por ejemplo, alrededor de 75 kDa).
Variante glico-pesada se refiere a una variante asociada con productos glicosilada que a veces está presente en las preparaciones de anticuerpo y que contiene al menos una secuencia Fe parcial. La variante glico-pesada está caracterizada por una disminución de la movilidad electroforética observable mediante SDS-PAGE (con respecto a una cadena pesada normal), afinidad de unión a la lectina, unión a un anticuerpo anti-Fc y peso molecular más alto evidente de los complejos de anticuerpos que contienen la variante glico-pesada, según se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Véase, solicitud provisional estadounidense N° de serie 61/525,307 (expediente del agente N° 67858.730200), presentada el 31 de agosto de 2011, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.
El término "levadura poliploide que expresa de forma estable o expresa un polipéptido heterólogo secretado deseado durante un período prolongado" se refiere a un cultivo de levadura que secreta dicho polipéptido durante al menos varios días hasta una semana, más preferentemente al menos un mes, aun más preferentemente al menos 1-6 meses, y aun más preferentemente más de un año a niveles de expresión de umbral, generalmente al menos 50-500 mg/litro (luego de alrededor de 90 horas en cultivo) y preferentemente considerablemente más.
El término "cultivo de levadura poliploidal que secreta cantidades deseadas de polipéptido recombinante" se refiere a cultivos que secretan de forma estable o durante períodos prolongados al menos 50-500 mg/litro, y más preferentemente 500-1000 mg/litro o más.
Una secuencia de polinucleótidos "equivale" a una secuencia de polipéptidos si la traducción de la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con el código genético proporciona la secuencia de polipéptidos (es decir, la secuencia de polinucleótidos "codifica" la secuencia de polipéptidos), una secuencia de polinucleótidos "equivale" a otra secuencia de polinucleótidos si las dos secuencias codifican la misma secuencia de polipéptidos.
Una región o dominio "heterólogo" de una construcción de ADN es un segmento identificable de ADN dentro de una molécula de ADN más grande que no se encuentra asociada a la molécula más grande en la naturaleza. Por lo tanto, cuando la región heteróloga codifica un gen de mamífero, generalmente el gen estará flanqueado por ADN que no flanquea el ADN genómico de mamífero en el geno a del organismo de partida. Otro ejemplo de una región heteróloga es una construcción en la que la secuencia codificante en sí misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un ADNc en el que la secuencia codificante genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas con codones distintos al gen nativo) . Las variaciones alélicas o los eventos mutacionales de origen natural no generan una región heteróloga de ADN, tal como se define en la presente.
Una "secuencia codificante" es una secuencia de codones dentro del marco que (en vista del código genético) equivale a o codifica una proteina o secuencia de péptidos. Dos secuencias codificantes tienen equivalencia reciproca si las secuencias o sus secuencias complementarias codifican las mismas secuencias de aminoácidos. Una secuencia codificante asociada a las secuencias reguladoras apropiadas se puede transcribir y traducir a un polipéptido. Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción generalmente estarán ubicadas 3' con respecto a la secuencia codificante. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN que puede unirse a la polimerasa de ARN en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante corriente abajo (dirección 3')· En general, las secuencias promotoras contienen sitios adicionales para la unión de las moléculas reguladoras (por ejemplo, factores de transcripción) que afectan la transcripción de la secuencia codificante. Una secuencia codificante está "bajo el control" de la secuencia promotora o "unida operativamente" al promotor cuando la polimerasa de ARN se une a la secuencia promotora en una célula y transcribe la secuencia codificante en ARNm, que a su vez luego se traduce en la proteina codificada por la secuencia codificante.
Se usan vectores para introducir una sustancia extraña, tal como ADN, ARN o proteina, en un organismo o célula hospedadora. Los vectores típicos incluyen virus recombinantes (para polinucleótidos) y liposomas (para polipéptidos). Un "vector de ADN" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que se puede unir otro segmento de polinucleótido de modo de generar la replicación del segmento unido. Un "vector de expresión" es un vector de ADN que contiene secuencias reguladoras que dirigirán la síntesis de polipéptido mediante una célula hospedadora apropiada. Esto generalmente se refiere a un promotor para unirse a la polimerasa de ARN e iniciar la transcripción de ARNm, así como los sitios de unión al ribosoma y las señales de inicio para dirigir la traducción del ARNm a uno o más polipéptidos. La incorporación de una secuencia de polinucleótidos en un vector de expresión en el sitio adecuado y en el marco de lectura correctos, seguido de la transformación de una célula hospedadora apropiada mediante el vector, permite la producción de un polipéptido codificado por dicha secuencia de polinucleótidos.
"Amplificación" de las secuencias de polinucleótidos es la producción in vitro de múltiples copias de una secuencia de ácidos nucleicos particular. La secuencia amplificada se encuentra generalmente en forma de ADN. En los siguientes artículos de revisión se describe una variedad de téenicas para realizar dicha amplificación, cada uno de los cuales se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; y Gilí and Ghaemi, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. mar 2008;27(3): 24—43. La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es un prototipo de amplificación de ácido nucleico, y el uso de PCR en la presente debe considerarse como ejemplo de otras téenicas de amplificación adecuadas.
La estructura general de los anticuerpos en la mayoría de los vertebrados (incluyendo mamíferos) es comprendida en la actualidad (Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). Los anticuerpos convencionales consisten en dos cadenas de polipéptidos ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 daltons (la "cadena ligera"), y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular 53.000-70.000 (la "cadena pesada"). Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración "Y", donde las cadenas ligeras encierran a las cadenas pesadas que comienzan en la entrada de la configuración "Y". La parte de "rama" de la configuración "Y" se denomina región Fab; la parte de tallo de la configuración "Y" se denomina región Fc. La orientación de la secuencia de aminoácidos va desde el extremo N en la parte superior de la configuración "Y" hasta el extremo C en la parte inferior de cada cadena. El extremo N posee la región variable con especificidad para el antigeno que lo provocó, y tiene aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, existiendo pequeñas variaciones entre la cadena ligera y pesada y entre los anticuerpos.
La región variable se une en cada cadena a una región constante que extiende la longitud restante de la cadena y que dentro de una clase particular de anticuerpo no varia con la especificidad del anticuerpo (es decir, el antigeno que lo provoca). Hay cinco clases principales conocidas de regiones constantes que determinan la clase de molécula de inmunoglobulina (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE que equivalen a las regiones constantes de cadena pesada gamma, mu, alpha, delta y epsilon). La región o clase constante determina la función efectora posterior del anticuerpo, incluyendo la activación del complemento (Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2a ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), y otras respuestas celulares (Andrews, D. W., et ál., Clinical Immunobiology, p 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et ál., Immunology, 48: 187 (1983)); mientras que la región variable determina el antígeno con el cual reaccionará. Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda. Cada clase de cadena pesada se puede aparear con la cadena ligera kappa o lambda. Las cadenas ligeras y pesadas se unen covalentemente entre si, y las partes de "cola" de las dos cadenas pesadas se unen entre si mediante enlaces disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan mediante hibridomas o células B.
La expresión "región variable" o "VR" se refiere a los dominios dentro de cada par de cadenas pesada y ligera en un anticuerpo que están implicados directamente en la unión del anticuerpo al antigeno. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una cantidad de dominios variables. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (VL) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
La expresiones "región determinante de complementariedad", "región hipervariable" o "CDR" se refieren a una o más de las regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDR) encontradas en las regiones variables de cadenas pesada o ligera de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones hipervariables tal como se define en Kabat et ál. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et ál., US Dept, of Health and Human Services, 1983) o los bucles hipervariables en estructuras tridimensionales de anticuerpos (Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)). Las CDR en cada cadena se mantienen próximas entre si por regiones marco y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antigeno. Dentro de las CDR hay aminoácidos que se describieron como las regiones determinantes de selectividad (SDR) que representan los residuos de contacto críticos usados por las CDR en la interacción anticuerpo-antígeno (Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).
La expresiones "región marco" o "FR" se refieren a una o más de las regiones marco dentro de las regiones variables de cadenas pesada o ligera de un anticuerpo (Véase Kabat, E. A. et ál., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Estas expresiones incluyen las regiones de secuencia de aminoácidos interpuestas entre las CDR dentro de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo.
Anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión a estos que tienen actividad de unión a NGF Anticuerpo Abl La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor que usan el anticuerpo Abl o fragmentos de este, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Abl, por ejemplo tal como se establece más adelante, solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA.y la asociación de NGF con p75 y/o inhibe o previene el dolor. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSR FRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 1).
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ALVMTQTPSSVSAAVGGTVTINCQASQNIYSNLAWYQQRPGQRPKLLIYGASNLDAGVPSR FRGSGSGTEYTLTISDLECDDVGTYYCQSAFDSDSTENTFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2).
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprende la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASW AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3).
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad de unión a NGF y poseen una secuencia de cadena pesada que comprende la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGVITSIGSTVYASW AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARGYDDYDE TYFNIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 4).
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde el anticuerpo es un fragmento que tiene especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2.
La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen fragmentos que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; y SEQ ID NO: 7) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; y SEQ ID NO: 10) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico es Abl, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para usar en la presente comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro fragmento Fab o de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl. Con respecto al anticuerpo Abl, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 3 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es el anticuerpo Ab2 o fragmentos de este, o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epitopo de superposición que Ab2, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 11).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQNIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLDAGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQSAFDSDSTENTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor y poseen una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13).
La invención incluye también opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor y poseen una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGVITSIGSTVYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYDDYDEMTYFNIWGQGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR W SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 11 o la SEQ ID NO: 12. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 13 o la SEQ ID NO: 14.
En una modalidad adicional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden opcionalmente, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16; y SEQ ID NO: 17 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO 16; y SEQ ID NO: 17) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; y SEQ ID NO: 20) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es opcionalmente Ab2, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 14, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
¿ En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF o un fragmento Fab u otro anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab2. Con respecto al anticuerpo Ab2, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 13 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab2. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab2 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3 La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Ab3 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab3, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de manera apreciable la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPS RFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 21).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AVLTQTPSPVSAAMGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPRLLIYDASNLPSGVPS RFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDADNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 22).
La invención incluye además anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWA KGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASWA KGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCAGGGGSIYDIWGPGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVL HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 24).
La invención además contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 21 o la SEQ ID NO: 22. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 23 o la SEQ ID NO: 24.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; y SEQ ID NO: 27) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 29; y SEQ ID NO: 30) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab3, que comprende, o de manera alternativa consiste en, la SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro fragmento Fab o anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab3. Con respecto al anticuerpo Ab3, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 21 y/o SEQ ID NO: 23 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab3. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab3 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4 La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF, donde el anticuerpo es un anticuerpo Ab4 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab4, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de forma apreciable la asociación de NGF con p75 y/o para evitar o tratar el dolor de forma eficaz. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 31).
La invención incluye además anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGKAPKLLIYDASNLPSGVP SRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCLGDYDDDADNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 32).
La invención incluye además anticuerpos humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASS AKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 33).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYVMIWVRQAPGKGLEYIGITWSAGTYYASS AKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGGGSIYDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 34).
La invención además contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 34, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 34.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36; y SEQ ID NO: 37) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; y SEQ ID NO: 40) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33.
En una modalidad particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab4, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 34, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl4. Con respecto al anticuerpo Ab4, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 31 y/o SEQ ID NO: 33 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab4. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab4 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab5 La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen opcionalmente Ab5 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab5, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYD TQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSR FKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 41).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSIYSNLAWYQQRPGQPPKLLIYDASTLESGVPSR FKGSGSGTEYTLTISGVECADAASYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 42).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASW ARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 43).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAVGWVRQAPGKGLEWIGIIGRNGNTWYASW ARGRFTISKTSTTVDLKITSPTSEDTATYFCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 44).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden opcionalmente, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 42. En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 44.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos del anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden opcionalmente, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46; y SEQ ID NO: 47) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 48; SEQ ID NO: 49; y SEQ ID NO: 50) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico opcionalmente incluido para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab5, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 44, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab5. Con respecto al anticuerpo Ab5, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 41 y/o SEQ ID NO: 43 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab5. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab5 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Ab6 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab6, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75.
En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 52).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYAS SARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYAS SARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 54.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab6, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 54, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab6. Con respecto al anticuerpo Ab6, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53. Esta modalidad opcional de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 51 y/o SEQ ID NO: 53 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab6. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab6 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Ab7 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab7, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPS RFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 61).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ADVVMTQTPASVSQPVGGTVTIKCQASEDIYNLLAWYQQKPGQPPKLLIYSASTLASGVPS RFKGSGSGTEYTLTISGLECADAATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 62).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYAS WVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDP GPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 63).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QEQLKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYAS WVKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSYAAYGGYPATFDPWGPGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 64).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos del anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 61 o SEQ ID NO: 62. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 63 o SEQ ID NO: 64.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor o afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor o afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 66; y SEQ ID NO: 67) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 68; SEQ ID NO: 69; y SEQ ID NO: 70) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab7, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad particularmente y opcionalmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo o epitopo de superposición que Ab7. Con respecto al anticuerpo Ab7, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 61 y/o SEQ ID NO: 63 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab7. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab7 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Ab8 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab8, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 71).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDIYNLLAWYQQKPGKVPKLLIYSASTLASGVPSR FSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQNNYLVTTYGVAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC ( SEQ ID NO : 72 ) .
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYAS SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 73).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGYIDTDTSAYYAS SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSYAAYGGYPATFDPWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 74).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 71 o SEQ ID NO: 72. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 73 o SEQ ID NO: 74.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 76; y SEQ ID NO: 77) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 78; SEQ ID NO: 79; y SEQ ID NO: 80) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab8, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 74, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab8, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab8. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 71 y/o SEQ ID NO: 73 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab8. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab8 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab9 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Ab9 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab9, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75.
En una modalidad opcional, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSR FKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 81).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYDMTQTPASVSAAVGGTVTIKCQASENIGSYLAWYQQKPGQPPELLIYRASTLASGVPSR FKGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 82).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASW AKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 83).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYASW AKGRFTISKTSTTVELKITSPTIEDTATYFCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 84).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 81 o SEQ ID NO: 82. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 83 o SEQ ID NO: 84.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86; y SEQ ID NO: 87) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; y SEQ ID NO: 90) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab9, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 84, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab9, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo o epitopo de superposición que Ab9. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 81 y/o SEQ ID NO: 83 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab9. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab9 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl O La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen AblO o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que AblO, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 91).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AYDMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIGSYLAWYQQKPGKVPKLLIYRASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYNSENLDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 92).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 93).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSMYSMGWVRQAPGKGLEYIGWISYGGTAYYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARETPVNYYLDIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 94).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, gue incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 91 o SEQ ID NO: 92. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 93 o SEQ ID NO: 94.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; y SEQ ID NO: 97) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 99; y SEQ ID NO: 100) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es AblO, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 92 y SEQ ID NO: 94, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo AblO, el fragmento Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que AblO. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 91 y/o SEQ ID NO: 93 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de AblO. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como AblO o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abll La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Abll o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Abll, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad opcional, la invención incluye anticuerpos quiméricos que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSR FKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 101).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AFELTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQNIVTNLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTLASGVSSR FKGSGSGTQFTLTISDLECADAATYFCQSYDGFNSAGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 102).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATW AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 103).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEYIGLISYDGNTYYATW AKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 104).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 102. En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 103 o SEQ ID NO: 104.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 106; y SEQ ID NO: 107) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 109; y SEQ ID NO: 110) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abll, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 104, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abll, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abll. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 101 y/o SEQ ID NO: 103 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abll. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abll o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl2 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Abl2 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epítopo de superposición que Abl2, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 111).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AFQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIVTNLAWYQQKPGKVPKLLIYGASTLASGVPSR FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQSYDGFNSAGFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 112).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYAT SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVS S (SEQ ID NO: 113).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSLSGYDMSWVRQAPGKGLEWVGLISYDGNTYYAT SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCARSLYAGPNAGIGPFNIWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYAST YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 114).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 113 o SEQ ID NO: 114.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114.
La invención también contempla opcionalmente los fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 116; y SEQ ID NO: 117) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119; y SEQ ID NO: 120) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl2, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 112 y SEQ ID NO: 114, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl2, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl2. Esta modalidad opcional de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 111 y/o SEQ ID NO: 113 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl2. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl2 o fragmentos Fab de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl3 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen Abl3 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Abl3, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVP SRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 121).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVP SRFKGGGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 122).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYAS WAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 123).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEASGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYAS WAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 124).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 121 o la SEQ ID NO: 122. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 123 o la SEQ ID NO: 124.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 126; y SEQ ID NO: 127) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129; y SEQ ID NO: 130) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl3, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 124, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl3, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl3. Esta modalidad opcional de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 121 y/o SEQ ID NO: 123 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl3. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl3 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl 4 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl4 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Abl4, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad opcional, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 131).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 132).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYA SSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 133).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYA SSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVDIGIDMWGPGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCW VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 134).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 131 o la SEQ ID NO: 132. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 133 o la SEQ ID NO: 134.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden opcionalmente, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 136; y SEQ ID NO: 137) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 139; y SEQ ID NO: 140) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl4, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 132 y SEQ ID NO: 134, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl4, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl4. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 131 y/o SEQ ID NO: 133 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl4. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl4 o fragmentos Fab de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl5 La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl5 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Abl5, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de forma apreciable la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVP SRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 141).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGDTVTIKCQSSQSVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYDASNLPSGVP SRFSGSGSGTQFTLTISGVQCDDAATYYCLGDYDDDTDNGFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 142).
La invención incluye además anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATWA KGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 143).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSYAMIWVRQAPGKGLEYIGIIWSGGTYYATWA KGRFTISKTSTTVDLQITSPTTEDAATYFCAAGGGSIYDVWGPGTLVTVSSASTKGPSVFP LAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 144).
La invención además contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 141 o la SEQ ID NO: 142. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 143 o la SEQ ID NO: 144.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 146; y SEQ ID NO: 147) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 148; SEQ ID NO: 149; y SEQ ID NO: 150) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143.
En una modalidad particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl5, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 144, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl5, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143 o comprende otro Fab que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl5. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 141 y/o SEQ ID NO: 143 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl5. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor tales como Abl5 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl 6 La invención contempla métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl6 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl6, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de forma apreciable la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKR FSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 151).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: ALVMTQTPSSTSEPVGGTVTINCQASQNIGNDLSWYQQKPGQPPELLIYSTSKLATGVPKR FSGSRSGTQFTLTISDLECDDAATYYCLGVYSYISDDGNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 152).
La invención incluye además anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASW AKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 153).
La invención también incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNNYAMTWVRQAPGKGLEWIGIIGSIGTTYYASW AKGRFFISKTSTTVDLKIISPTTEDTATYFCARDAGVTVDGYGYYFNIWGPGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 154).
La invención además contempla anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 152, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 151 o la SEQ ID NO: 152. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 153 o la SEQ ID NO: 154.
En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 152.
En otra modalidad de la invención los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154.
La invención también contempla fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 156; y SEQ ID NO: 157) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 159; y SEQ ID NO: 160) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153.
En una modalidad particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl6, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 152 y SEQ ID NO: 154, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl6, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153 o comprende otro Fab u otro fragmento de anticuerpo monovalente o bivalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl6. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 151 y/o SEQ ID NO: 153 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl6. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor tales como Abl6 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl 7 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl7 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl7, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AIEMTQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSR FKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 161).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AIE TQTPFSVSAAVGGTVTIKCQASQTISNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASNLESGVPSR FKGSGSGTQFTLTISDLECDDAATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 162).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tenqan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASW AKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 163).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSLEESGGRLVTPGGSLTLTCAASGFSLTGYNLVWVRQAPGKGLEWIGFISYGDTTYYASW AKGRFTISKTSTTVTLTITDLQPSDTGTYFCARETANTYDYGIWGPGTLVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPK PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 164).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 161 o la SEQ ID NO: 162. En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 163 o la SEQ ID NO: 164.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162. En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 166; y SEQ ID NO: 167) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 169; y SEQ ID NO: 170) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl7, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 162 y SEQ ID NO: 164, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl7, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente o bivalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl5. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 161 y/o SEQ ID NO: 163 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl7. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl7 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl8 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl8 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl8, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 171).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQTISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQGYTISNVDNNVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 172).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 173).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSGYNLVWVRQAPGKGLEWVGFISYGDTTYYAS SAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETANTYDYGIWGQGTLVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVW DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO : 174 ) .
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 171 o la SEQ ID NO: 172. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 173 o la SEQ ID NO: 174.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180 que corresponden a las reqiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 176; y SEQ ID NO: 177) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 179; y SEQ ID NO: 180) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl8, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 172 y SEQ ID NO: 174, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl8, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl8. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 171 y/o SEQ ID NO: 173 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl8. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl8 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl9 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Abl9 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl9, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVP SRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKR (SEQ ID NO: 181).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: AAVLTQTPSPVSAAVGGTVSISCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVP SRFKGSGSGTDFTLTISDVQCDAAATYYCAGGYSSSSDNAFGGGTEVVVKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 182).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYAT WAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 183).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: QSVEASGGRLVMPGGSLTLTCTASGFSLSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGDIYFSNEETNYAT WAKGRFTISKTSTTVDLNVISPTTEDTATYFCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 184).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 181 o la SEQ ID NO: 182. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 183 o la SEQ ID NO: 184.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 186; y SEQ ID NO: 187) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 189; y SEQ ID NO: 190) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Abl9, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 184, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl9, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183 o comprende otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Abl9. Esta modalidad opcional de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 181 y/o SEQ ID NO: 183 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl9. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl9 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab20 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Ab20 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, o comprende otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab20, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 191).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSQNVYKNNYLSWYQQKPGKVPKLLIYKASTLASGVP SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCAGGYTSSSDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 192).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYA TSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 193).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSTYWMSWVRQAPGKGLEWVGDIYFSNEETNYA TSAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSPDVEIAIDMWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 194).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo que tiene especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 191 o la SEQ ID NO: 192. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 193 o la SEQ ID NO: 194.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 196; y SEQ ID NO: 197) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 199; y SEQ ID NO: 200) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab20, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 192 y SEQ ID NO: 194, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab20, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 191 y/o SEQ ID NO: 193 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab20. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor tales como Ab20 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab21 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor y los trastornos específicos asociados con el dolor solo o en asociación con otro agente activo, por ej., un NSAID o analgésico opioide, donde los anticuerpos incluyen anticuerpos quiméricos que tienen especificidad a NGF donde el anticuerpo es Ab21 o fragmentos de este, u otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epítopo o epítopo de superposición que Ab5, por ejemplo tal como se establece más adelante, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye anticuerpos quiméricos o humanizados que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO: 51).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 401).
La invención incluye además opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia variable de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYAS SARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53).
La invención también incluye opcionalmente anticuerpos quiméricos o humanizados para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYAS SARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 402).
La invención además contempla opcionalmente anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos de la invención o fragmentos de estos comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena pesada y variables de cadena ligera y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 401. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 402.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el anticuerpo anti-NGF quimérico o humanizado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Ab21, que comprende, o de manera alternativa consiste en, SEQ ID NO: 401 y SEQ ID NO: 402, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional particularmente preferida de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab21, el fragmento Fab incluye la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 y la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 u otro Fab o fragmento de anticuerpo monovalente que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Ab5. Esta modalidad de la invención contempla además adiciones, eliminaciones y variantes de SEQ ID NO: 51 y/o SEQ ID NO: 53 en dicho Fab mientras que conserva la especificidad de unión a NGF.
En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab21. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor tales como Ab21 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Fragmento de anticuerpo Fabl La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor usando el fragmento de anticuerpo Fabl o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye opcionalmente fragmentos de anticuerpo Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 405).
La invención además incluye opcionalmente fragmentos de anticuerpo Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYAS SARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (SEQ ID NO: 406).
La invención además contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 405, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 406, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena ligera y variables de cadena pesada y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 405. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 406.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 405.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 406.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el fragmento de anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Fabl, que comprende SEQ ID NO: 405 y SEQ ID NO: 406, u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Fabl, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente. En una modalidad de la invención, el fragmento de anticuerpo Fabl se puede producir mediante digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab21.
Fragmento de anticuerpo Fab2 La invención contempla opcionalmente métodos para tratar el dolor usando el fragmento de anticuerpo Fab2 o fragmentos de este, por ejemplo tal como se establece a continuación, en una cantidad terapéuticamente eficaz que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75. En una modalidad, la invención incluye fragmentos de anticuerpo Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena ligera que comprenda la secuencia que se establece a continuación: DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIYSNLAWYQQKPGKAPKLLIYDASTLESGVPSR FSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQGFTVSDIDNAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 407).
La invención además incluye opcionalmente fragmentos de anticuerpo Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones relacionadas con el dolor que tengan especificidad de unión a NGF y posean una secuencia de cadena pesada que comprenda la secuencia que se establece a continuación: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSNYAVGWVRQAPGKGLEWVGIIGRNGNTWYSS ARGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYGRSVAYYVFNIWGPGTLVTVSAST KGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDARVEPKSCDKTH (SEQ ID NO: 408).
La invención además contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprenden una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 407, y/o una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 408, o combinaciones de estas secuencias de polipéptidos. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, combinaciones de una o más de las CDR, las secuencias variables de cadena ligera y variables de cadena pesada y las secuencias de cadena pesada y ligera establecidas anteriormente, que incluyen todos estos.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 51 o la SEQ ID NO: 407. En otra modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo de la invención para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 53 o la SEQ ID NO: 408.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 407.
En otra modalidad opcional de la invención, los fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polipéptidos de SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60 que corresponden a las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 408.
La invención también contempla opcionalmente fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que incluyen uno o más de los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes fragmentos de anticuerpo: la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 56; y SEQ ID NO: 57) de la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; y las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 58; SEQ ID NO: 59; y SEQ ID NO: 60) de la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53.
En una modalidad opcional particularmente preferida de la invención, el fragmento de anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor es Fab2, que comprende SEQ ID NO: 407 y SEQ ID NO: 408, u otro Fab o fragmento de anticuerpo que se une al mismo epitopo o epitopo de superposición que Fab2, y que tiene al menos una de las actividades biológicas establecidas en la presente.
En otra modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse mediante la expresión en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención, el fragmento de anticuerpo Fab2 se puede producir mediante expresión de Pichia pastoris usando protocolos establecidos en la presente en los ejemplos.
En otra modalidad, los fragmentos de anticuerpo pueden estar presentes en una o más de las siguientes formas no taxativas: Fab, Fab', F(ab')2, Fv y formas de anticuerpo Fv de cadena simple. En una modalidad preferida, los anticuerpos anti-NGF descritos en la presente comprenden además la secuencia de cadena ligera constante kappa que comprende la secuencia que se establece a continuación: VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 412).
En otra modalidad opcional preferida, los anticuerpos anti-NGF descritos en la presente para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor comprenden además la secuencia de polipéptidos de cadena pesada constante gamma-1 que comprende la secuencia que se establece a continuación: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 413).
En otra modalidad opcional, la invención contempla un anticuerpo anti-NGF aislado para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que comprende una secuencia de polipéptidos VH que se selecciona de: SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193 o 402, o una variante de esta; y que comprende además una secuencia de polipéptidos VL que se selecciona de: SEQ ID NO: 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191 o 401, o una variante de esta, donde uno o más de los residuos marco (residuos FR) en dicho polipéptido VH o VL se sustituyó con otro residuo de aminoácido que ocasiona un anticuerpo anti-NGF que se une específicamente a NGF. La invención contempla formas quiméricas y humanizadas de estos anticuerpos para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. Los anticuerpos quiméricos pueden incluir un Fe derivado de las regiones constantes IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgGlO, IgGll, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 o IgG19.
En una modalidad de la invención, los anticuerpos o polipéptidos VH o VL se originan o seleccionan de una o más poblaciones de células B de conejo antes del inicio del proceso de humanización mencionado en la presente.
En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF y fragmentos de estos para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor no tienen especificidad de unión a p75 o TrkA. En una modalidad adicional de la invención, se contemplan métodos para el tratamiento del dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de estos para inhibir la asociación de NGF con p75 y/o TrkA. En otra modalidad de la invención, se contemplan métodos para el tratamiento del dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de estos para inhibir la asociación de NGF con TrkA y/o multimeros de este y/o antagonizar los efectos biológicos de este. En otra modalidad de la invención, se contemplan métodos para el tratamiento del dolor que comprenden el uso de anticuerpos anti-NGF y fragmentos de estos para inhibir la asociación de NGF con p75 y/o multimeros de este y la asociación de NGF con TrkA y/o multimeros de este, y antagonizar los efectos biológicos de p75 y TrkA.
Tal como se estableció anteriormente, los anticuerpos y fragmentos de estos se pueden modificar postraduccionalmente para agregar restos efectores tales co o enlazadores químicos, restos detectables tales como por ejemplo tintes fluorescentes, enzimas, sustratos, materiales bioluminiscentes, materiales radioactivos y restos quimioluminiscentes, o restos funcionales tales como por ejemplo estreptavidina, avidina, biotina, una citotoxina, un agente citotóxico y materiales radioactivos.
Con respecto a los restos detectables, ejemplos adicionales de enzimas incluyen, de modo no taxativo, peroxidasa de rábano picante, acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa y luciferasa. Ejemplos adicionales de materiales fluorescentes incluyen, de modo no taxativo, rodamina, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, umbeliferona, diclorotriazinilamina, ficoeritrina y cloruro de dansilo. Ejemplos adicionales de restos quimioluminiscentes incluyen, de modo no taxativo, luminol. Ejemplos adicionales de materiales bioluminiscentes incluyen, de modo no taxativo, luciferina y aequorina. Ejemplos adicionales de materiales radioactivos incluyen, de modo no taxativo, Yodo 125 (125I), Carbono 14 (14C), Azufre 35 (35S), Tritio (3H) y Fósforo 32 (32P).
Con respecto a los restos funcionales, ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, de modo no taxativo, metotrexato, a inopterina, 6-mercaptopurina, b-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina; agentes alquilantes tales como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina (adriamicina), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, calicheamicina, mitramicina y antramicina (A C); y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricino, exotoxina pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,R'- (DDD)), interferonas y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Agentes citotóxicos adicionales incluyen de modo no taxativo, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorubicina, 5- fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricino, toxina diftérica y toxina Pseudomonas se pueden conjugar a los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión de estos, para generar reactivos destructores específicos de tipo celular (Youle, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas según describió Goldenberg en la patente estadounidense N° 6,653,104. Las modalidades de la invención también refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta está acoplado establemente al anticuerpo, o fragmentos de unión de este, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionúclidos incluyen emisores beta tales como Fósforo-32 (32P), Escandio-47 (47Sc), Cobre-67 (67Cu), Galio-67 (67Ga), Itrio-88 (88Y), Itrio-90 (90Y), Yodo-125 (125I), Yodo-131 (131I), Samario-153 (153Sm), Lutetio-177 (177Lu), Renio-186 (186Re) o Renio-188 (188Re), y emisores alfa tales como Astatina-211 (211At), Plomo-212 (212Pb), Bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o Actinio-225 (225AC).
Ejemplos adicionales de materiales radioactivos incluyen, de modo no taxativo, Yodo 125 (125I), Carbono 14 (14C), Azufre 35 (35S), Tritio (3H) y Fósforo 32 (32P).
Con respecto a los restos funcionales, ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, de modo no taxativo, metotrexato, aminopterina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazina; agentes alquilantes tales como mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), mitomicina C, lomustina (CCNU), 1-metilnitrosourea, ciclofosfamida, mecloretamina, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino y carboplatino (paraplatino); las antraciclinas incluyen daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina (adriamicina), detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, mitoxantrona y bisantreno; los antibióticos incluyen dactinomicina (actinomicina D), bleomicina, calicheamicina, mitramicina y antramicina (AMC); y agentes antimitóticos tales como los alcaloides de la vinca, vincristina y vinblastina. Otros agentes citotóxicos incluyen paclitaxel (taxol), ricino, exotoxina pseudomonas, gemcitabina, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, etopósido, tenopósido, colchicina, dihidroxi antracina diona, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, procarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, corticosteroides, mitotano (O,R'-(DDD)), interferonas y mezclas de estos agentes citotóxicos.
Agentes citotóxicos adicionales incluyen, de modo no taxativo, agentes quimioterapéuticos tales como carboplatino, cisplatino, paclitaxel, gemcitabina, calicheamicina, doxorubicina, 5- fluorouracilo, mitomicina C, actinomicina D, ciclofosfamida, vincristina y bleomicina. Las enzimas tóxicas de plantas y bacterias tales como ricino, toxina diftérica y toxina Pseudomonas se pueden conjugar a los anticuerpos humanizados o quiméricos, o fragmentos de unión de estos, para generar reactivos destructores específicos de tipo celular (Youle, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5483 (1980); Gilliland, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:4539 (1980); Krolick, et ál., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77:5419 (1980)).
Otros agentes citotóxicos incluyen ribonucleasas citotóxicas según describió Goldenberg en la patente estadounidense N° 6,653,104. Las modalidades de la invención también refieren a radioinmunoconjugados donde un radionúclido que emite partículas alfa o beta está acoplado establemente al anticuerpo, o fragmentos de unión de este, con o sin el uso de un agente formador de complejos. Dichos radionúclidos incluyen emisores beta tales como Fósforo-32 (32P), Escandio-47 (47Sc), Cobre-67 (67Cu), Galio-67 (67Ga), Itrio-88 (88Y), Itrio-90 (90Y), Yodo-125 (125I), Yodo-131 (131I), Samario-153 (153Sm), Lutetio-177 (177Lu), Renio-186 (186Re) o Renio-188 (188Re), y emisores alfa tales como Astatina-211 (211At), Plomo-212 (212Pb), Bismuto-212 (212Bi) o -213 (213Bi) o Actinio-225 (225AC).
Se conocen en la téenica los métodos para conjugar un anticuerpo o fragmento de unión de este a un resto detectable y similares, tales como por ejemplo aquellos métodos descritos por Hunter et ál, Nature 144:945 (1962); David et ál, Biochemistry 13:1014 (1974); Pain et ál, J. Immunol. eth. 40:219 (1981); y Nygren, J., Histochem. y Cytochem. 30:407 (1982).
Las modalidades descritas en la presente incluyen además variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, diacuerpos, SMIP, anticuerpos de camélidos, nanocuerpos, IgNAR, polipéptidos, regiones variables y CDR establecidos en la presente. Estos pueden contener, por ej ., mutaciones de sustitución conservativa, (es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por aminoácidos similares) . Por ejemplo, la sustitución conservativa refiere a la sustitución de un aminoácido con otro dentro de la misma clase general, por ej., un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido, un aminoácido básico con otro aminoácido básico, o un aminoácido neutro por otro aminoácido neutro. Lo que se pretende con la sustitución de un aminoácido conservativo se conoce bien en la téenica.
En otra modalidad, la invención contempla secuencias de polipéptidos que tienen al menos 90% o más de homología de secuencia con uno o más de las secuencias de polipéptidos de fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDR establecidos en la presente. Más preferentemente, la invención contempla secuencias de polipéptidos que tienen al menos 95% o más de homología de secuencia, aun más preferentemente al menos 98% o más de homología de secuencia, y aun más preferentemente al menos 99% o más de homología de secuencia con uno o más de las secuencias de polipéptidos de fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDR establecidos en la presente. Los expertos en la téenica conocen bien los métodos para determinar la homología entre secuencias de ácido nucleico y aminoácidos.
En otra modalidad, la invención contempla además los homólogos de polipéptidos mencionados anteriormente de los fragmentos de anticuerpo, regiones variables y CDR establecidos en la presente que además tienen actividad anti-NGF. Se establecen en la presente ejemplos no taxativos de la actividad anti-NGF.
En otra modalidad, la invención contempla además la generación y el uso de anticuerpos anti-idiotípicos que unen cualquiera de las secuencias anteriores. En un ejemplo de modalidad, dicho anticuerpo anti-idiotípico se podría administrar a un sujeto que recibió un anticuerpo anti-NGF para modular, reducir o neutralizar el efecto del anticuerpo anti-NGF. Dichos anticuerpos anti-idiotípicos también podrían ser útiles para el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria caracterizada por la presencia de anticuerpos anti-NGF. Otro ejemplo de uso de dichos anticuerpos anti-idiotípicos es la detección de anticuerpos anti-NGF de la presente invención, por ejemplo para controlar los niveles de los anticuerpos anti-NGF presentes en la sangre u otros fluidos corporales de un sujeto .
La presente invención contempla también anticuerpos anti-NGF que comprenden cualquiera de las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos descritas en la presente sustituidas por cualquiera de las otras secuencias de polinucleótidos descritas en la presente. Por ejemplo, de modo no taxativo, la presente invención contempla anticuerpos que comprenden la combinación de cualquier secuencia variable de cadena ligera y variable de cadena pesada descritas en la presente, y contempla demás anticuerpos que se originan de la sustitución de cualquiera de las secuencias de CDR descritas en la presente por cualquier otra secuencia de CDR descrita en la presente.
Polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuexpo anti-NGF Anticuerpo Abl La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Abl para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1: GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGG GCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 201).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 2: GCCCTTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAGACCAGG GCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGTTGGCACTTACTACTGTCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAATACTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 202).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGAT GACCTACTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 203).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 4: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGCTTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGCTACGATGACTATGATGAGAT GACCTACTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA (SEQ ID NO: 204).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 201 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1; el polinucleótido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2; el polinucleótido SEQ ID NO: 203 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3; el polinucleótido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 206; y SEQ ID NO: 207) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 209; y SEQ ID NO: 210) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 202 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 2; y el polinucleótido SEQ ID NO: 204 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 4.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab2 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab2 que inhiban la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab2. La invención se refiere también a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGAGTCCCATCAAGG TTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 211).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 12: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTTACAGCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGATGCTGGAGTCCCATCAAGG TTCTCTGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAAAGTGCTTTTGATAGTGATAGTACTGAAAACACTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 212).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGC AGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGCTACGATGACTA TGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 213).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 14: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGCAATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGTCATTACTAGTATTGGTAGCACAGTCTACGCGAGC AGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGCTACGATGACTA TGATGAGATGACCTACTTTAACATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 214).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de comple entariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 211 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11; el polinucleótido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12; el polinucleótido SEQ ID NO: 213 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13; el polinucleótido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 216; y SEQ ID NO: 217) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 11 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 219; y SEQ ID NO: 220) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 13 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab2, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab2 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 212 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 12; y el polinucleótido SEQ ID NO: 214 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 14.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab2 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab2 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab2 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab3 La invención también se refiere al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab3 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de manera apreciable la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab3. La invención se refiere también a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21: GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGAGACACAGTCACCA TCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCA TCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 221).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 22: GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTATGGGAGACACAGTCACCA TCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAGGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCA TCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATGCTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 222).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCTGGGCG AAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCGGAGGTGGTGGTAGTATTTATGATAT TTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 223).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 24: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCTGGGCG AAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCGGAGGTGGTGGTAGTATTTATGATAT TTGGGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTC CCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACC GTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCA ACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACC GTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAG GACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGAC AAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAG CCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC CCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAA GGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 224).
En una modalidad adicional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24.
La invención también contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo descritas en la presente para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 221 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21; el polinucleótido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22; el polinucleótido SEQ ID NO: 223 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23; el polinucleótido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 226; y SEQ ID NO: 227) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 229; y SEQ ID NO: 230) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 23 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24.
En una modalidad preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab3, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab3 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 222 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 22; y el polinucleótido SEQ ID NO: 224 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 24.
Otra modalidad de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab3 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tal como fragmentos Fab o Ab3 de estos se pueden producir mediante expresión de polinucleótidos Ab3 en células amíferas tales como CHO, NSO o células HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab4 La invención también se refiere al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab4 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de manera apreciable la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab4. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACG (SEQ ID NO: 231).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 32: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 232).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCAGT GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGA ACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTGGAGGTGGTGGTAGTATCTA TGATATTTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 233).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 34: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAGCTATGTAATGATCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTACATCGGAATCACTTGGAGTGCTGGTACATACTACGCGAGCAGT GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGA ACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTGGAGGTGGTGGTAGTATCTA TGATATTTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 234).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 3 .
La invención contempla además secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo descritas en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 231 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31; el polinucleótido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32; el polinucleótido SEQ ID NO: 233 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33; el polinucleótido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 34; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 236; y SEQ ID NO: 237) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 239; y SEQ ID NO: 240) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 33 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 3.
En una modalidad preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab4, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab4 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 232 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 32; y el polinucleótido SEQ ID NO: 234 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 34.
Otra modalidad de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab4 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor tales como fragmentos Fab o Ab4 de estos se pueden producir mediante expresión de polinucleótidos Ab4 en células mamiferas tales como CHO, NSO o células HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia . pastoris .
La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab5 para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab5. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41: GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 241).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 42: GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAGACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCTCTTACTACTGTCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 242).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTGG GCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAAGCGAGGACACGGCCACATATTTCTGTGCCAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTA TTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 243).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 44: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGCTGG GCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAAGCGAGGACACGGCCACATATTTCTGTGCCAGAGGATATGGCCGTAGTGTTGCTTA TTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATC CCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACC ACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 244).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican para el tratamiento o prevención del dolor y fragmentos de afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250 que corresponden a polinucleótidos que codifican regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 241 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41; el polinucleótido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42; el polinucleótido SEQ ID NO: 243 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43; el polinucleótido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 246; y SEQ ID NO: 247) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 249; y SEQ ID NO: 250) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 43 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Eab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab5, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab5 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 242 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 42; y el polinucleótido SEQ ID NO: 244 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 44.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir mediante digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab5 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab5 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab5 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab6 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab6 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab6. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican para el tratamiento o prevención del dolor y polipéptidos de afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 251).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 52: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 252).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGC TCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAG TGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 54: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGC TCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAG TGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 254).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican para el tratamiento o prevención del dolor y fragmentos de afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; el polinucleótido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52; el polinucleótido SEQ ID NO: 253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; el polinucleótido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab6, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab6 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 252 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 52; y el polinucleótido SEQ ID NO: 254 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 54.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab6 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab6 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab6 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab7 La invención se refiere además opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Ab7 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Ab7.
La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 61: GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTGGGAGGCACAGTCA CCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTG CCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACAATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 261).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 62: GCCGATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTCAACCTGTGGGAGGCACAGTCA CCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTATAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACC AGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCG CGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGGCCTGGAGTGTG CCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAACAATTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 262).
En otra modalidad opcional de la invención los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 63: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCA CCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCGAGC TGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACTA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATCTTATGCTGCTTATGGTGG TTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 263).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 64: CAGGAGCAGCTGAAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCA CCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCGAGC TGGGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAACCTCGACCACGGTGGATCTCAAAATCACTA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGATCTTATGCTGCTTATGGTGG TTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 264).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 261 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61; el polinucleótido SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62; el polinucleótido SEQ ID NO: 263 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63; el polinucleótido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 266; y SEQ ID NO: 267) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 61 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 269; y SEQ ID NO: 270) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 63 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab7, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab7 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, los polinucleótidos de SEQ ID NO: 262 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 62 y el polinucleótido SEQ ID NO: 264 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 64.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab7 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab7 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab7 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab8 La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Ab8 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Ab8. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 71: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 271).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 72: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTGAGGACATTTACAACTTATTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAACAACTATCTTGTTACTACTTATGGTGTTGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 272).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCAAGC AGTGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGATCTTATGCTGCTTA TGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 273).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 74: CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATACATTGATACTGATACTAGCGCATACTACGCAAGC AGTGTGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGATCTTATGCTGCTTA TGGTGGTTATCCTGCTACTTTTGATCCCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 274).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 271 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71; el polinucleótido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72; el polinucleótido SEQ ID NO: 273 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73; el polinucleótido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 276; y SEQ ID NO: 277) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 71 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 279; y SEQ ID NO: 280) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 73 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab8, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab8 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 272 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 72 y el polinucleótido SEQ ID NO: 274 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 74.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab8 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab8 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab8 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris .
Anticuerpo Ab9 La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Ab9 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Ab9. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 81: GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 281).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 82: GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCGAACTCCTGATCTACAGGGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGG CGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 282).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 83: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATATTACGCGAGCTGG GCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGAGCTGAAGATCACCAGTC CGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTCCTGTTAATTATTATTT GGACATTTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 283).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 84: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATATTACGCGAGCTGG GCGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGAGCTGAAGATCACCAGTC CGACAATCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTCCTGTTAATTATTATTT GGACATTTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC 5 TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT 10 GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 284).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para 15 el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 285; SEQ ID NO: 286; y SEQ ID NO: 287 que corresponden a los 20 polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 288; SEQ ID NO: 289; y SEQ ID NO: 290 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 281 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81; el polinucleótido SEQ ID NO: 282 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82; el polinucleótido SEQ ID NO: 283 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83; el polinucleótido SEQ ID NO: 284 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 285; SEQ ID NO: 286; y SEQ ID NO: 287) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 81 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 288; SEQ ID NO: 289; y SEQ ID NO: 290) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 83 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab9, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab9 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 282 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 82 y el polinucleótido SEQ ID NO: 284 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 84.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab9 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab9 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab9 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo AblO La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo AblO que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo AblO. La invención además se refiere opcionalmente a los polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 91: GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 291).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 92: GCCTATGATATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTGAGAACATTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAGGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAACAGGGTTACAATAGTGAGAATCTTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 292).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 93: CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATACTACGCTAGC AGCGCTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTCCTGTTAA TTACTACTTGGACATTTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 293).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 94: CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCACCTTCAGTATGTATTCAATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGATGGATTAGTTATGGTGGTACTGCATACTACGCTAGC AGCGCTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTCCTGTTAA TTACTACTTGGACATTTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA (SEQ ID NO: 294).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 295; SEQ ID NO: 296; y SEQ ID NO: 297 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 298; SEQ ID NO: 299; y SEQ ID NO: 300 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 291 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91; el polinucleótido SEQ ID NO: 292 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92; el polinucleótido SEQ ID NO: 293 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93; el polinucleótido SEQ ID NO: 294 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 295; SEQ ID NO: 296; y SEQ ID NO: 297) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 91 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 298; SEQ ID NO: 299; y SEQ ID NO: 300) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 93 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo AblO, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo AblO de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 292 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 92 y el polinucleótido SEQ ID NO: 294 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 94.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de AblO seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como AblO o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de AblO en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abll La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Abll que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Abll. La invención además se refiere a los polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 101: GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGATGGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGG GACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 301).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 102 GCATTCGAATTGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCG ATGCTGCCACTTATTTCTGTCAGAGCTATGATGGTTTTAATAGTGCTGGGTTCGGCGGAGG GACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 302).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 103: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG AAAGGGGCTGGAATACATCGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGC TGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 303).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 104: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG AAAGGGGCTGGAATACATCGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAAGTCTTTATGCTGGTCCTAATGC TGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAGGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 304).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 305; SEQ ID NO: 306; y SEQ ID NO: 307 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad para NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 308; SEQ ID NO: 309; y SEQ ID NO: 310 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 301 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101; el polinucleótido SEQ ID NO: 302 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102; el polinucleótido SEQ ID NO: 303 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103; el polinucleótido SEQ ID NO: 304 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 305; SEQ ID NO: 306; y SEQ ID NO: 307) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 308; SEQ ID NO: 309; y SEQ ID NO: 310) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 103 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abll, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abll de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 302 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 102 y el polinucleótido SEQ ID NO: 304 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 104.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK- 293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abll seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad opcional de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abll o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abll en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl2 La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Abl2 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Abl2. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 111: GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGATGGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGG AACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 311).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 112: GCATTCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAACATTGTTACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCTCGT TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATGTTGCAACTTATTACTGTCAGAGCTATGATGGTTTCAATAGTGCTGGTTTCGGCGGAGG AACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT GATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCA GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAG TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCT CGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 312).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 113: CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACC TCCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAAGTCTTTATGCTGG TCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCG AGC (SEQ ID NO: 313).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 114: CAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGTGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCTTCTGGATTCTCCCTCAGTGGCTACGACATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGGACTCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGACC TCCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTACCTGCAAA TGTCTAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCTAGAAGTCTTTATGCTGG TCCTAATGCTGGTATCGGACCGTTTAACATCTGGGGCCAAGGTACCCTCGTCACCGTCTCG AGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTG GGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTC GTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAA ATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGT GGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACG TACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAG AACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGT GGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 314).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 315; SEQ ID NO: 316; y SEQ ID NO: 317 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 318; SEQ ID NO: 319; y SEQ ID NO: 320 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 311 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111; el polinucleótido SEQ ID NO: 312 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112; el polinucleótido SEQ ID NO: 313 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113; el polinucleótido SEQ ID NO: 314 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 315; SEQ ID NO: 316; y SEQ ID NO: 317) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 111 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 318; SEQ ID NO: 319; y SEQ ID NO: 320) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 113 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl2, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl2 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 312 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 112 y el polinucleótido SEQ ID NO: 314 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 114.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl2 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl2 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl2 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl3 La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Abl3 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Abl3. La invención además se refiere opcionalmente a los polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 121: GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCA TCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 321).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 122: GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCA TCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAAAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTA (SEQ ID NO: 322).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 123: CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTTCTCCTGATGTTGATAT TGGTATAGATATGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 323).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 124: CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCGAGC TGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTTCTCCTGATGTTGATAT TGGTATAGATATGTGGGGCCCGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 324).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 325; SEQ ID NO: 326; y SEQ ID NO: 327 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complémentariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 328; SEQ ID NO: 329; y SEQ ID NO: 330 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 321 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121; el polinucleótido SEQ ID NO: 322 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122; el polinucleótido SEQ ID NO: 323 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123; el polinucleótido SEQ ID NO: 324 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 325; SEQ ID NO: 326; y SEQ ID NO: 327) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 121 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 328; SEQ ID NO: 329; y SEQ ID NO: 330) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 123 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl3, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl3 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 322 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 122 y el polinucleótido SEQ ID NO: 324 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 124.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl3 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl3 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl3 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl4 La invención además se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Abl4 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Abl4. La invención además se refiere opcionalmente a los polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 131: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 331).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 132: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 332) En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 133: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCG AGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTC AAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGA TGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 333).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 134: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCG AGCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTC AAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGA TGTTGATATTGGTATAGATATGTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 334).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 335; SEQ ID NO: 336; y SEQ ID NO: 337 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 338; SEQ ID NO: 339; y SEQ ID NO: 340 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 331 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131; el polinucleótido SEQ ID NO: 332 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132; el polinucleótido SEQ ID NO: 333 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133; el polinucleótido SEQ ID NO: 334 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 335; SEQ ID NO: 336; y SEQ ID NO: 337) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 131 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 338; SEQ ID NO: 339; y SEQ ID NO: 340) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 133 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl4, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl4 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 332 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 132 y el polinucleótido SEQ ID NO: 334 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 134.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl4 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl4 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl4 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl5 La invención además se refiere al uso de polinucleótidos establecidos a continuación para producir polipéptidos del anticuerpo Abl5 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA sin inhibir sensiblemente la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrarle a dicho individuo polipéptidos del anticuerpo Abl5. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 141: GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACAGTCACCA TCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCA TCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATACTGATAATGGTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 341).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 142: GCAGCCGTGCTGACCCAGACACCATCGCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACAGTCACCA TCAAGTGCCAGTCCAGTCAGAGTGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCAATCTGCCATCTGGGGTCCCA TCACGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGCAGT GTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGCGATTATGATGATGATACTGATAATGGTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 342).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia variable de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 143: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTTGGAGTGGTGGCACCTACTACGCGACCTGGGCG AAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGCAAATCACCAGTCCGA CAACCGAGGACGCGGCCACCTATTTCTGTGCCGCAGGTGGTGGTAGTATTTATGATGTTTG GGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 343).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 144: CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCTATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTTGGAGTGGTGGCACCTACTACGCGACCTGGGCG AAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGCAAATCACCAGTCCGA CAACCGAGGACGCGGCCACCTATTTCTGTGCCGCAGGTGGTGGTAGTATTTATGATGTTTG GGGCCCGGGCACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC CTGGCAcCCTCCTCCaAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGG ACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCA CACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTG CCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACA CCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTG CCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGaTCTCCCgGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAG ACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAA GCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCAC CAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCC CCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCT GCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGC TTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACA AGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 344).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 345; SEQ ID NO: 346; y SEQ ID NO: 347 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o la prevención de dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 348; SEQ ID NO: 349; y SEQ ID NO: 350 que corresponden a los polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144.
La invención también contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 341 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141; el polinucleótido SEQ ID NO: 342 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142; el polinucleótido SEQ ID NO: 343 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143; el polinucleótido SEQ ID NO: 344 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 345; SEQ ID NO: 346; y SEQ ID NO: 347) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 141 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 348; SEQ ID NO: 349; y SEQ ID NO: 350) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 143 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144.
En una modalidad preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl5, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl5 de longitud completa comprende, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 342 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 142 y el polinucleótido SEQ ID NO: 344 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 144.
Otra modalidad de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293 o en sistemas fúngicos, de insectos, vegetales o microbianos tales como células de levadura tales como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab se pueden producir por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl5 seguida de la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl5 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl5 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl 6 La invención se refiere además al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Abl6 para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de manera apreciable la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl6. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151: GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTGGCAACTGGGGTCCCAAAGCGG TTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTATAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 351).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 152: GCCCTGGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCACGTCTGAACCAGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAATTGCCAGGCTAGTCAGAATATTGGTAACGACCTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCGAGCTCCTAATCTATTCTACATCCAAACTGGCAACTGGGGTCCCAAAGCGG TTCAGTGGCAGCAGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCTAGGTGTTTATAGTTATATTAGTGATGATGGTAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 352) .
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153: CAGTCGGTGGAGGAGTTCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGATCATTGGTAGTATTGGTACCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCTTCATCTCCAAAACCTCGACCACTGTGGATCTGAAAATCATTAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGCTGGCGTTACTGTTGATGG TTATGGCTACTACTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 353).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 154: CAGTCGGTGGAGGAGTTCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCT GCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAATAACTATGCAATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGGATCATTGGTAGTATTGGTACCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCTTCATCTCCAAAACCTCGACCACTGTGGATCTGAAAATCATTAGTC CGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGATGCTGGCGTTACTGTTGATGG TTATGGCTACTACTTTAACATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 354).
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 355; SEQ ID NO: 356; y SEQ ID NO: 357 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO 152.
En otra modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 358; SEQ ID NO: 359; y SEQ ID NO: 360 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154.
La invención también contempla secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 351 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151; el polinucleótido SEQ ID NO: 352 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 152; el polinucleótido SEQ ID NO: 353 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153; el polinucleótido SEQ ID NO: 354 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 355; SEQ ID NO: 356; y SEQ ID NO: 357) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 151 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 152; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 358; SEQ ID NO: 359; y SEQ ID NO: 360) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 153 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154.
En una modalidad preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl6, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl6 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 352 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 152; y el polinucleótido SEQ ID NO: 354 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 154.
Otra modalidad de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Abl6 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl6 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl6 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ahl7 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Abl7 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA sin inhibir de manera apreciable la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl7. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161: GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 361).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 162: GCCATCGAAATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCA TCAAGTGCCAGGCCAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG GCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGG TTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACG ATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 362).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGGGATCCCTGACACTCACCT GCGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCACTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGACTCTGACGATCACCGATC TGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTA TGGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 363).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 164: CAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGGGATCCCTGACACTCACCT GCGCAGCCTCTGGATTCTCCCTCACTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAGTGGATCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGACTCTGACGATCACCGATC TGCAACCTTCAGACACGGGCACCTATTTCTGTGCCAGAGAGACTGCTAATACTTATGATTA TGGCATCTGGGGCCCAGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG CGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATG CCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCC TCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTG GTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGA ACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCAT GAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 364).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 366; y SEQ ID NO: 367 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 368; SEQ ID NO: 369; y SEQ ID NO: 370 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 361 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161; el polinucleótido SEQ ID NO: 362 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162; el polinucleótido SEQ ID NO: 363 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163; el polinucleótido SEQ ID NO: 364 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 365; SEQ ID NO: 366; y SEQ ID NO: 367) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 161 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 368; SEQ ID NO: 369; y SEQ ID NO: 370) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 163 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl7, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl7 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 362 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 162; y el polinucleótido SEQ ID NO: 364 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 164.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl7 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl7 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl7 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Abl8 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Abl8 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl8. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 371).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 172: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGTCAGGCTAGTCAGACCATTAGCAACTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAATCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGAACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGGTTATACTATCAGTAATGTTGATAACAATGTTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 372).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCTAGC TCTGCTAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTGCTAATAC TTATGATTATGGCATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 373).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 174: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGGCTACAACTTGGTCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGATTCATTAGTTATGGTGATACCACATACTACGCTAGC TCTGCTAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGAGACTGCTAATAC TTATGATTATGGCATCTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCC TGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGC CCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGA ATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC TCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGG TGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGT GCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTG ACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCT CTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCC GTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTA AATGA (SEQ ID NO: 374).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 375; SEQ ID NO: 376; y SEQ ID NO: 377 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 378; SEQ ID NO: 379; y SEQ ID NO: 380 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 371 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171; el polinucleótido SEQ ID NO: 372 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172; el polinucleótido SEQ ID NO: 373 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173; el polinucleótido SEQ ID NO: 374 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de comple entariedad (SEQ ID NO: 375; SEQ ID NO: 376; y SEQ ID NO: 377) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 171 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 378; SEQ ID NO: 379; y SEQ ID NO: 380) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 173 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl8, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl8 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 372 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 172; y el polinucleótido SEQ ID NO: 374 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 174.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl8 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl8 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl8 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo A b!9 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Abl9 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl9. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181: GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCA TCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGT (SEQ ID NO: 381).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 182: GCCGCCGTGCTGACCCAGACTCCATCTCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCAGCA TCAGTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTATTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCTTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACGTGCAGT GTGACGCTGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 382).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183: CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGTCTGGTCATGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAGGAAACAAACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCAAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGAT TGCTATAGATATGTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO : 383 ) .
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 184: CAGTCGGTGGAGGCGTCCGGGGGTCGTCTGGTCATGCCTGGAGGATCCCTGACACTCACCT GCACAGCCTCTGGATTCTCCCTCAGTACCTACTGGATGTCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGGAGACATTTATTTTAGTAATGAGGAAACAAACTACGCGACC TGGGCGAAAGGCCGATTTACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAATGTCATCA GTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCAAGAGGTTCTCCTGATGTTGAGAT TGCTATAGATATGTGGGGCCAGGGCACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGC CCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGG GCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGC AGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATC ACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGG ACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCA TAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGC CGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTA CAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTG ATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 384).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 385; SEQ ID NO: 386; y SEQ ID NO: 387 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 388; SEQ ID NO: 389; y SEQ ID NO: 390 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 381 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181; el polinucleótido SEQ ID NO: 382 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182; el polinucleótido SEQ ID NO: 383 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183; el polinucleótido SEQ ID NO: 384 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 385; SEQ ID NO: 386; y SEQ ID NO: 387) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 181 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 388; SEQ ID NO: 389; y SEQ ID NO: 390) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 183 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antígeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Abl9, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Abl9 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 382 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 182; y el polinucleótido SEQ ID NO: 384 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 184.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Abl9 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Abl9 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Abl9 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo A b20 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab20 para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF, que inhibe la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75, en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab20. La invención se refiere también a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 391).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 192 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGTCCAGTCAGAATGTTTATAAGAACAACTACTTATCCTGGTATCAGCAGAA ACCAGGGAAAGTCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCA TCTCGTTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGC CTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTGCAGGCGGTTATACCAGTAGTAGTGATAATGCTTT CGGCGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTC CCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACT TCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTC CCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTG ACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG GCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 392).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCG ACCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTC AAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGA TGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 393).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 194: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTACCTACTGGATGAGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAGACATTTACTTTAGTAATGAAGAAACAAACTACGCG ACCAGCGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTC AAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGTTCTCCTGA TGTTGAGATTGCTATAGATATGTGGGGCCAAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCCTCC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 394).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 395; SEQ ID NO: 396; y SEQ ID NO: 397 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 398; SEQ ID NO: 399; y SEQ ID NO: 400 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 391 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191; el polinucleótido SEQ ID NO: 392 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192; el polinucleótido SEQ ID NO: 393 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193; el polinucleótido SEQ ID NO: 394 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 395; SEQ ID NO: 396; y SEQ ID NO: 397) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 191 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 398; SEQ ID NO: 399; y SEQ ID NO: 400) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 193 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab20, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab20 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 392 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 192; y el polinucleótido SEQ ID NO: 394 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 194.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaína) de Ab20 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab20 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab20 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
Anticuerpo Ab21 La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de anticuerpo Ab21 que tienen especificidad de unión a NGF, que inhiben la asociación de NGF con TrkA y la asociación de NGF con p75 en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Ab21. La invención también se refiere opcionalmente a polinucleótidos que codifican polipéptidos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGT (SEQ ID NO: 251).
En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden opcionalmente, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 401: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 403).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGC TCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAG TGTTGCTTATTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 253).
En una modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 402: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGC TCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAG TGTTGCTTACTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA (SEQ ID NO: 404).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; el polinucleótido SEQ ID NO: 403 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401; el polinucleótido SEQ ID NO: 253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; el polinucleótido SEQ ID NO: 404 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al anticuerpo Ab21, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo Ab21 de longitud completa comprenden, o de manera alternativa consisten en, el polinucleótido SEQ ID NO: 403 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 401; y el polinucleótido SEQ ID NO: 404 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 402.
Otra modalidad opcional de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK- 293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad opcional de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse por digestión enzimática (por ej., papaina) de Ab21 tras la expresión de los polinucleótidos de longitud completa en un hospedador adecuado. En otra modalidad de la invención, los anticuerpos anti-NGF tales como Ab21 o fragmentos Fab de estos pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Ab21 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
La invención también se refiere opcionalmente al uso de polinucleótidos establecido más adelante para producir polipéptidos de fragmento de anticuerpo Fab2 que inhiban la asociación de NGF con TrkA y p75 para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF en métodos para tratar el dolor en un individuo que comprende administrar a dicho individuo polipéptidos de anticuerpo Abl. La invención también se refiere a polinucleótidos que codifica polipéptidos de fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos de Fab de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 407: GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTTACAGCAATCTTGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGG AAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGATGCATCCACTCTGGAATCTGGAGTCCCATCAAGG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATG ATTTTGCAACTTACTACTGCCAACAGGGTTTTACTGTTAGTGATATTGATAATGCTTTCGG CGGAGGAACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTAGCGGCCCCATCTGTCTTCATCTTCCCG CCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCT ATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCA GGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 409).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, la siguiente secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de polipéptidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 408: GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTAACTATGCAGTGGGCTGGGTCCGTCAGGCTCC AGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGGAATCATTGGTCGTAATGGTAACACATGGTACGCGAGC TCTGCAAGAGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAA TGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCTAGAGGATATGGCCGTAG TGTTGCTTACTACGTCTTTAACATCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCGAGCGCC TCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACGCGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACTAG (SEQ ID NO: 410).
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo Fab que tienen especificidad de unión a NGF comprenden una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 409.
En otra modalidad opcional de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo Fab para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260 que corresponden a polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDR, o regiones hipervariables) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 410.
La invención también contempla opcionalmente secuencias de polinucleótidos que incluyen una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor descritos en la presente. En una modalidad de la invención, los polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor que tienen especificidad de unión a NGF comprenden, o de manera alternativa consisten en, uno, dos, tres o más, incluyendo todos los siguientes polinucleótidos que codifican fragmentos de anticuerpo: el polinucleótido SEQ ID NO: 251 que codifica la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51; el polinucleótido SEQ ID NO: 409 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 407; el polinucleótido SEQ ID NO: 253 que codifica la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53; el polinucleótido SEQ ID NO: 410 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 408; polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 256; y SEQ ID NO: 257) de la secuencia variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 o la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 407; y polinucleótidos que codifican las regiones determinantes de complementariedad (SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 259; y SEQ ID NO: 260) de la secuencia variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 53 o la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 408.
En una modalidad opcional preferida de la invención, los polinucleótidos de la invención comprenden, o de manera alternativa consisten en, polinucleótidos que codifican fragmentos Fab (fragmento de unión al antigeno) que tienen especificidad de unión a NGF. Con respecto al fragmento de anticuerpo Fab2, los polinucleótidos que codifican el fragmento Fab incluyen el polinucleótido SEQ ID NO: 409 que codifica la secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 407; y el polinucleótido SEQ ID NO: 410 que codifica la secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 408.
Otra modalidad de la invención contempla estos polinucleótidos incorporados en un vector de expresión para la expresión en células de mamífero tales como CHO, NSO, HEK-293, o en sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura como la levadura Pichia. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris. En una modalidad de la invención descrita en la presente (a continuación), los fragmentos Fab pueden producirse mediante la expresión de polinucleótidos de Fab2 en células de mamífero tales como células CHO, NSO o HEK 293, sistemas fúngicos, de insecto, vegetales o microbianos tales como células de levadura (por ejemplo levadura diploide tal como Pichia diploide) y otras cepas de levadura. Las especies adecuadas de Pichia incluyen, de modo no taxativo, Pichia pastoris.
En una modalidad, la invención se refiere opcionalmente a un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo VH anti-NGF que se selecciona de SEQ ID NO: 3, 13, 23, 33, 43, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193 o 402, o que codifica una variante de esta donde al menos un residuo marco (residuo FR) se sustituyó con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VH de anticuerpo anti-NGF de conejo o una sustitución de aminoácidos conservativa.
En otra modalidad opcional, la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos del anticuerpo VL anti-NGF de 1, 11, 21, 31, 41, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191 o 401, o que codifica una variante de esta donde al menos un residuo marco (residuo FR) se sustituyó con un aminoácido presente en la posición correspondiente en un polipéptido VL de anticuerpo anti-NGF de conejo o una sustitución de aminoácidos conservativa .
En aun otra modalidad opcional, la invención se refiere a uno o más polinucleótidos heterólogos que comprenden una secuencia que codifica los polipéptidos contenidos en SEQ ID NO :1 y SEQ ID NO:3; SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:23; SEQ ID NO:31 y SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:411 y SEQ ID NO:43; SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:71 y SEQ ID NO:73; SEQ ID NO:81 y SEQ ID NO:83; SEQ ID NO:91 y SEQ ID NO:93; SEQ ID NO:101 y SEQ ID N0:103; SEQ ID NO:lll y SEQ ID NO:113; SEQ ID NO:121 y SEQ ID NO: 123; SEQ ID NO: 131 y SEQ ID NO: 133; SEQ ID NO: 141 y SEQ ID NO: 143; SEQ ID NO:151 y SEQ ID NO:153; SEQ ID NO:161 y SEQ ID NO:163; SEQ ID NO:171 y SEQ ID NO:173; SEQ ID NO:181 y SEQ ID NO:183; SEQ ID NO:191 y SEQ ID NO:193; o SEQ ID NO:401 y SEQ ID N0:403.
En otra modalidad, la invención se refiere opcionalmente a un polinucleótido aislado que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido CDR derivado del anticuerpo anti-NGF donde dicho polipéptido expresado solo se une específicamente a NGF o se une específicamente a NGF cuando se expresa en asociación con otra secuencia de polinucleótidos que expresa un polipéptido que contiene al menos un polipéptido CDR derivado de un anticuerpo anti-NGF para el tratamiento o prevención del dolor y afecciones asociadas con el dolor donde dicha al menos una CDR se selecciona de las contenidas en los polipéptidos VL o VH de SEQ ID NO: 1, 3, 11, 21, 23, 31, 33, 41, 43, 51, 53, 61, 63, 71, 73, 81, 83, 91, 93, 101, 103, 111, 113, 121, 123, 131, 133, 141, 143, 151, 153, 161, 163, 171, 173, 181, 183, 191, 193, 401 o SEQ ID NO:403.
También se contemplan las células hospedadoras y vectores que comprenden dichos polinucleótidos.
La invención también contempla opcionalmente vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos que codifican las secuencias de polipéptidos variables de cadena pesada y ligera, asi como también regiones determinantes de complementariedad individuales (CDR, o regiones hipervariables), tal como se establece en la presente, asi como también células hospedadores que comprenden dichas secuencias de vector. En una modalidad de la invención, la célula hospedadora es una célula de levadura. En otra modalidad de la invención, la célula hospedadora de levadura pertenece al género Pichia.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se extienden para proporcionarle a los expertos en la téenica una descripción completa de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que se considera la invención. Se han hecho esfuerzos por asegurar la precisión con relación a los números usados (por ej., cantidades, temperatura, concentraciones, etc.) pero se tendrán en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión está a temperatura ambiente o casi atmosférica.
EJEMPLO 1 Este ejemplo describe métodos de cultivo que mejoraron la pureza de anticuerpos recombinantes producidos a partir de células P. pastoris cultivadas. Cuando se agregó un bolo de etanol durante el cultivo, los anticuerpos resultantes mostraron una gran reducción en la concentración de una variante asociada con productos no deseada.
Métodos Para generar el inoculo, se cultivó P. pastoris diploide usando un medio compuesto por los siguientes nutrientes (los porcentajes se proporcionan en p/v): extracto de levadura al 3%, dextrosa anhidra al 2%, YNB al 1,34%, Biotina al 0,004% y 100 mM de fosfato de potasio (pH 6,0). El medio de inoculo para las ejecuciones L355, L357, L358, L359 y L360 estaba compuesto por los siguientes nutrientes (los porcentajes se proporcionan en p/v): extracto de levadura al 3%, glicerol al 2%, YNB al 1,34%, Biotina al 0,004%, 200 mM de fosfato de potasio (pH 6,0). El inoculo se cultivó durante aproximadamente 24 horas a 29 horas en un incubador con agitación a 30°C y 300 rpm. Luego se agregó un inoculo al 10% a recipientes de volumen de trabajo de 2,5L de Labfors que contenían 1 L de medio de crecimiento estéril. El medio de crecimiento estaba compuesto por los siguientes nutrientes: 18,2 g/L de sulfato de potasio, 36,4 g/L de fosfato de amonio monobásico, 12,8 g/L de fosfato de potasio dibásico, 3,72 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 10 g/L de citrato de sodio dihidratado, 40 g/L de glicerol, 30 g/L de extracto de levadura, 4,35 mL/L de metales traza PTM1, y 1,67 mL/L de antiespumante 204. La solución de metales traza PTM1 estaba compuesta por los siguientes componentes: 6 g/L de sulfato cúprico pentahidratado, 0,8 g/L de yoduro de sodio, 3 g/L de sulfato de manganeso hidratado, 0,2 g/L de molibdato de sodio dihidratado, 0,02 g/L de ácido bórico, 0,5 g/L de cloruro de cobalto, 20 g/L de cloruro de zinc, 65 g/L de sulfato ferroso heptahidratado, 0,2 g/L de biotina, y 5 mL/L de ácido sulfúrico. La cepa de levadura se diseñó para expresa el anticuerpo Ab-A a partir de cuatro copias genómicas integradas de la cadena codificante de cadena pesada (SEQ ID NO: 441) y 3 copias de la secuencia codificante de cadena ligera (SEQ ID NO: 440). Las copias génicas de cadena pesada se integraron en el locus pGAP (3 copias) y locus HIS4 TT (1 copia) mientras las 3 copias génicas de cadena ligera se integraron en el locus pGAP. Cada una de las copias génicas de cadena de anticuerpo se encontraban bajo el control del promotor GAP. Los parámetros de control del proceso de biorreactor se configuraron de la siguiente manera: Agitación 1000 rpm, 1,35 litros estándar de flujo de aire por minuto, temperatura 28°C y el pH se controló (a 6) usando hidróxido de amonio. No se proporcionaron suplementos de oxigeno.
Luego de la adición de inoculo, se cultivaron cultivos de fermentación durante aproximadamente 12 a 16 horas (la "fase de crecimiento"). La fase de crecimiento terminó cuando se consumió el glicerol inicial en el medio, como si detectado por un pico de oxigeno disuelto ("DO") (un aumento repentino en la concentración de oxigeno disuelto). Luego los cultivos se privaron durante aproximadamente tres horas luego del pico de oxigeno disuelto ("fase de privación") para la ejecución L306. Para otras ejecuciones, el bolo de etanol se agregó inmediatamente luego del pico de DO. Luego se agregó un bolo de etanol al reactor para dar una concentración final de etanol al 1% (p/v). Los cultivos de control se trataron de manera idéntica, salvo que se omitió la adición del bolo de etanol. Los cultivos de fermentación se dejaron equilibrar durante 15 a 30 minutos ("fase de equilibrio"). Luego de la fase de equilibrio, se agregó alimentación a una tasa constante de 30 g/L/hr durante 40 minutos ("fase de transición"). Para el resto del cultivo ("fase de producción") se detectó la concentración de etanol usando una sonda de detección (Raven Biotech) que se usó para controlar la tasa de alimentación, la tasa de alimentación se establece en 15 g/L/hr cuando la concentración de etanol estaba por debajo del punto de referencia, o 7,5 g/L/hr cuando la concentración de etanol estaba por encima del punto de referencia. En los casos en que la alta tasa de alimentación de 15 g/L/hr no fue lo suficientemente alta como para mantener etanol en el punto de referencia (lo que ocurrió en la ejecución de fermentación L315) , l-a alta tasa de alimentación se estableció en 22,5 g/L/hr mientras que la baja tasa de alimentación se estableció en 15 g/L/hr. El mismo punto de referencia se mantuvo ya sea que se hubiera agregado un bolo de etanol o no al cultivo (la producción de etanol por la levadura hizo que se alcanzara el punto de referencia sin la adición del bolo de etanol). La alimentación estaba compuesta por los siguientes componentes: 50 g/L de extracto de lavadura, 500 g/L de dextrosa anhidra, 3 g/L de sulfato de magnesio heptahidratado, 12 mL/L de metales traza PTM1, y 0,5 g/L de citrato de sodio dihidratado. El tiempo de fermentación total fue típicamente 85 horas a 97 horas en estos experimentos, aunque se pueden haber usado otros tiempos más cortos o más largos.
Luego de la fase de producción, se agregó a los cultivos de fermentación PEI (polietilenimina) y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) hasta 0,05% p/v y 3 mM de concentraciones finales respectivamente. Luego los cultivos se rotaron en una centrifugadora y los anticuerpos se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo por afinidad por Proteína A. En resumen, se diluyeron aproximadamente 20 mL de 0,2 m de sobrenadantes aclarados del caldo de fermentación recolectado con el mismo volumen de amortiguador de equilibrio (20 mM de histidina pH 6). A partir de este caldo diluido, luego se cargaron 20 mL en una columna HiTrap MabSelect Sure de 1 mL preequilibrada (GE, Piscataway, NJ). La columna se lavó posteriormente usando 40 volúmenes de columna de amortiguador de equilibrio. El anticuerpo unido a la columna se eluyó usando un gradiente escalonado en 100% de amortiguador de elución (100 mM de ácido cítrico pH 3,0). Se recolectó un mL de fracciones e inmediatamente se neutralizó usando 100 mL de amortiguador Tris 2M pH 8,0. Las fracciones que contenían proteína se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nM y las fracciones que contenían proteína se agruparon.
Los anticuerpos purificados con proteína A se analizaron para determinar la pureza por SDS-PAGE. Para las muestras no reducidas, se realizó SDS-PAGE usando geles de poliacrilamida prefabricados (NuPAGE® Bis-Tris Gels) que contienen 4%-12% de gradiente de poliacrilamida, usando amortiguador de migración NuPAGE® MES SDS y amortiguador de muestras NuPAGE® LDS (de Invitrogen, Carlsbad, Ca.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se visualizaron las proteínas por tinción con azul Coomassie. Las muestras reducidas se procesaron de la misma manera salvo que las muestras se redujeron antes de la carga usando el agente reductor de muestras NuPAGE® (Invitrogen, Carlsbad, Ca.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Resultados Para determinar el efecto de una adición de bolo de etanol durante el cultivo sobre la pureza de un anticuerpo, se produjo el anticuerpo Ab-A a partir de cultivos de levadura con o sin la adición de un bolo de etanol a una concentración final de 1% (10 g/L) al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. La fase de producción se siguió durante 97 horas (FIG.1), 87 horas (FIG.2), u 86 horas (FIG. 3). El anticuerpo producido por cada cultivo luego se recolectó del medio de cultivo, se purificó por cromatografía de afinidad por Proteína A.
Se usó SDS-PAGE para detectar la abundancia relativa del anticuerpo total, "anticuerpo medio" o complejo H1L1 (que contiene una cadena pesada y una ligera) y el complejo H2L1 (que contiene dos cadenas pesadas y una cadena ligera). La abundancia de los complejos H1L1 y H2L1 se redujo mucho en los cultivos que fueron producidos con la adición de bolo de etanol. Esta mejora se reprodujo en tres experimentos que se muestran en la FIG.1 A, comparar vías 2 y 3 (con bolo) con la 5 (sin bolo); FIG.2A, comparar vía 2 (con bolo) con la 3 (sin bolo); FIG.3A, comparar vías 2 y 4 (con bolo) con las 5-7 (sin bolo). En condiciones de reducción, cada una de las especies H1L1, H2L1 y de anticuerpo total se separaron en cadenas pesada y ligera individuales, confirmando la identidad de la banda de 75 kDa que consiste en una cadena ligera y una pesada unidas por un enlace disulfuro (FIG. IB y 2B; el orden de los vías es el mismo que en las FIG. 1A y IB, respectivamente).
La reducción en la abundancia de la especie H1L1 luego se cuantificó usando ImageJ para graficar la densidad de banda de gel a lo largo de la longitud de los geles no reducidos (FIG. 1C-E y 2C-D, respectivamente correspondientes a la FIG. 1A, vías 2, 3, y 5, y FIG. 2A, vías 2 y 3, y FIG. 3B, correspondientes a los vías 2 y 4-6 de la FIG.3A). El área bajo el pico de H1L1 se cuantificó y los resultados se tabularon en las FIG. IF, 2E, y 3B. En función de estas mediciones, la adición del bolo de etanol antes de la producción de anticuerpo redujo la abundancia relativa de la banda de 75 kDa en alrededor de 90% en la FIG. 1 A, en alrededor de 85% en la FIG.2A, y en alrededor de 87% en la FIG. 3A.
En resumen, estos resultados demostraron que la concentración de la especie H1L1 se redujo mucho por la adición del bolo de etanol al cultivo, dando como resultado una producción reducida de la especie H1L1 entre alrededor de 85% y 90%.
EJEMPLO 2 Este ejemplo amplia los resultados obtenidos en el Ejemplo 1 demostrando que los mismo métodos produjeron una mejora similar en la pureza del anticuerpo cuando se usaron durante la producción de dos anticuerpos adicionales.
Metodos Los anticuerpos Ab-B y Ab-C se produjeron de forma recombinante usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. El anticuerpo Ab-C se expresó a partir de una cepa de levadura diseñada que contenia cuatro copias de la secuencia codificante de cadena pesada (SEQ ID NO: 439) y tres copias de la secuencia codificante de cadena ligera (SEQ ID NO: 438). Las muestras se tomaron de los reactores y el sobrenadante de cultivo que contiene anticuerpos se recolectó luego de un tiempo total de fermentación de 67 horas (T67) u 87 horas (T87) para el anticuerpo Ab-B y 86 horas (T86) para el anticuerpo Ab-C, se purificó por afinidad por Proteina A, y analizó por SDS-PAGE tal como se describe en el Ejemplo 1.
Resul tados Los anticuerpos Ab-B (FIG.4) y Ab-C (FIG.5) se produjeron con o sin una adición de bolo de etanol a una concentración final de 1% al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. Para los anticuerpos producidos sin la adición de bolo de etanol, cada una de la especie H1L1 o anticuerpo medio, y la especie H2L1 se observó como una banda prominente (FIG. 4A, lineas 6 y 7; FIG.4C, vías 6 y 7; FIG. 5 A, vías 5 y 6). La intensidad de estas bandas se redujo mucho para el cultivo producido con una adición de bolo de etanol (FIG. 4A, vias 2-3; FIG.4C, vias 2-3; FIG.5A, via 3). En condiciones de reducción, las bandas HlLl y H2L1 se separaron en cadenas pesada y ligera individuales, confirmando la identidad de estas especies que consisten en cadenas pesada y ligera de longitud completa (FI6.4B, 4D, y 5B; el orden de los vias es el mismo que en las FIG. 4A, 4D, y 5A, respectivamente).
La reducción en la abundancia de la especie HlLl luego se cuantificó usando ImageJ para graficar la densidad de banda de gel a lo largo de la longitud de los geles no reducidos Las FIG.4E y 4F tabulan el área comprendida en los picos de HlLl que se muestran en las FIG. 4A (T67) y 4C (T87), respectivamente, lo que demuestra que la adición del bolo de etanol produjo alrededor de 73% de reducción en la abundancia relativa de los complejos HlLl en el punto de tiempo más temprano que se muestra en la FIG. 4A y alrededor de 34% de reducción promedio en la abundancia relativa de complejos HlLl en el último punto de tiempo que se muestra en la FIG. 4C. De manera similar, la FIG.5C tabula el área comprendida en los picos de HlLl que se muestran en las FIG. 5A, demostrando alrededor de 61% de reducción promedio en la abundancia relativa de complejos HlLl por la adición del bolo de etanol.
En resumen, estos resultados demuestran que la concentración de las especies H1L1 y H2L1 se redujeron por entre 61% y 13 % por la adición del bolo de etanol al cultivo para dos anticuerpos adicionales que tienen especificidad de unión a diferentes dianas.
EJEMPLO 3 Este ejemplo describe además la pureza mejorada de anticuerpos recombinantes producidos a partir de células P. pastoris cultivadas a través de la adición de un bolo de etanol durante el cultivo. Además de disminuir en gran medida la abundancia de las especies H1L1 y H2L1, este ejemplo demuestra además una disminución en la concentración de otras variantes asociadas con productos.
Métodos Los anticuerpos recombinantes Ab-A, Ab-B, y Ab-C se prepararon y purificaron a partir de cultivos de P. pastoris tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los anticuerpos se produjeron con o sin una adición de bolo de etanol a una concentración final de 1% (p/v) al final de la fase de crecimiento y antes de la fase de producción. Para analizar la pureza de preparaciones de anticuerpo purificados con proteína A, se usó cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño (SE-HPLC). Brevemente, se usó HPLC 1200 Series Agilent (Santa Clara, CA) con un instrumento de detección UV. Para la separación de muestras, se usó una columna TSKgel 3000SWXL 7,8x300 mm conectada con TSKgel Guard SXL 6x40 mm de Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA). Se usó una solución de 100 mM de fosfato de sodio, 200 mM de cloruro de sodio pH 6,5 como fase móvil con una velocidad de flujo de 0,5 mL/min en modo isocrático y se monitoreó absorbancia a UV 215nm. Antes de la inyección de muestras la columna se equilibró hasta que se logró una línea de base estable. Las muestras se diluyeron hasta una concentración de 1 mg/mL usando fase móvil y se inyectó un volumen de 30 pL. Para monitorear el rendimiento de columna, se usaron normas de filtración de gel BioRad (Hercules, CA).
Resultados Las preparaciones de anticuerpo Ab-A descritas en el Ejemplo 1 y preparaciones adicionales producidas usando los mismos métodos se expresaron en levadura, se purificaron por afinidad por proteína A y se analizaron para detectar la pureza usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). En las condiciones usadas, la especie de anticuerpo medio (H1L1) se coeluye con el anticuerpo total, que se cree se debe a la asociación no covalente entre pares de anticuerpos medios. Sin embargo, este método permite evaluar la pureza con respecto a otras variantes asociadas con productos, tales como complejos que tienen estequiometria aberrante, fragmentos, formas glicosiladas y agregados.
Los datos de SE-HPLC se muestran para muestras Ab-A producidas sin (FIGS.6A, 6C y 6E) o con (FIGS.6B, 6D y 6F) una adición de bolo de etanol. Se detectó una variante asociada con productos que consiste en un agregado de dos anticuerpos totales (que contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro ligeras) (flecha), y la abundancia de esta se redujo en promedio en las muestras preparadas con la adición del bolo. La FIG.7 muestra la cuantificación de la pureza de Ab-A al determinar el porcentaje de la preparación de anticuerpo contenida en el pico principal (que contiene el anticuerpo total). La adición de bolo de etanol aumentó el porcentaje promedio contenido en el pico principal de 80,3% hasta 90,6%. Se realizaron análisis similares para las preparaciones de anticuerpo Ab-B y Ab-C descritas en el Ejemplo 2, cuantificado en las FIGS.8 y 9, respectivamente. La pureza general del anticuerpo Ab-B mejoró, con la fracción promedio en el pico principal que aumentó de 76% a 79% en T67 y de 60% a 73% en T87. Para el anticuerpo Ab-C, hubo una pequeña diferencia detectadle en la pureza del anticuerpo evaluada por este método, aparentemente debido a la alta pureza inicial del anticuerpo Ab-C incluso sin la adición del bolo.
En resumen, estos resultados demuestran que una adición de bolo de etanol al cultivo puede disminuir la concentración de otras variantes asociadas con productos además de la especie de anticuerpo medio.
EJEMPLO 4 Este ejemplo describe la confirmación adicional de la identidad de la variante asociada al producto de 75 kDa como una especie de anticuerpo medio que contiene solo una cadena pesada de anticuerpo y solo una cadena ligera de anticuerpo. Esta hipótesis se basó en varias observaciones. En primer lugar, la banda de 75 kDa estuvo presente en las muestras purificadas con proteina A (véase el Ejemplo 1) que indican que contenia al menos la porción de unión de proteina A de una cadena pesada de anticuerpo. En segundo lugar, la banda de 75 kDa fue prominente en muestras no reducidas analizadas por SDS-PAGE (véase, por ej., la FI6.1 A, vías 2-3), pero en condiciones de reducción las mismas muestras no contuvieron ninguna banda de intensidad comparable (distintas de las cadenas pesada y ligera esperadas), que indica que la banda de 75 kDa no incluye ningún componente distinto de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo (u otras especies que tengan la misma movilidad electroforética). En tercer lugar, la desaparición de la banda de 75 kDa de las muestras reducidas también indica que sus constituyentes están unidos por al menos un enlace disulfuro. En cuarto lugar, el análisis SEC demostró coelución de la especie de 75 kDa con el anticuerpo total, lo que sugiere firmemente que la especie de 75 kDa no puede auto asociarse de forma no covalente para formar un anticuerpo total (u otro complejo del mismo radio hidrodinámico aparente). Finalmente, el peso molecular aparente de alrededor de 75 kDa (determinado por referencia a normas de electroforesis), junto con la observación (de geles desnaturalizados) que este complejo conformado solo por cadenas de anticuerpo de longitud completa, fue consistente con el complejo que contenia solo una cadena pesada y solo una cadena ligera, pero fue inconsistente con otros complejos.
Métodos La espectrometría de masas se usó para detectar la abundancia relativa de cadenas pesadas que carecen de enlaces disulfuro inter-cadenas pesadas (normalmente encontrados en los aminoácidos 220 y 223) en diferentes muestras. Se agregaron doscientos cincuenta icrogramos de cada muestra en un tubo Eppendorf. Se agregó una cantidad adecuada (~450 pL) de amortiguador de desnaturalización (6 M Guanidina-HCl, 1 mM de EDTA, Tris 0,25 M, pH 7,5) al tubo para obtener un volumen final de 500 mL y una concentración de muestra de 0,5 mg/mL. Se agregaron doce microlitros y medio de yodoacetamida 2M en cada muestra para alquilar cualquier cisteina libre. Las muestras se agitaron en vórtex y luego se incubaron a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante 30 ± 5 minutos. Las muestras se desalaron luego usando NAP- 5 columnas preequilibradas con amortiguador de digestión (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5). Cada solución de muestra se agregó en columnas separadas (preequilibradas) y se dejó ingresar al lecho de la columna. Se agregó un mililitro de amortiguador de digestión en cada columna y el eluyente se recogió en tubos Eppendorf. Las muestras se dividieron en alícuotas iguales que contenían aproximadamente 50 (pg de material (cinco alícuotas de 200 pL). Las alícuotas alquiladas y desaladas se almacenaron a -20 °C hasta que fue necesario. Se usó una alícuota de cada muestra (alquilada y desalada) para cada digestión.
Se agregó una solución de Tripsina a 0,5 mg/mL a cada alícuota de la muestra a una relación 1:25 p:p de tripsina:proteína (4 pL). Todos los tubos de tripsina se incubaron a 37 ± 2 °C durante 4 horas. Tras la incubación, la digestión enzimática se inactivó al agregar 1 mL de ácido trifluoroacético en cada tubo. Las muestras se dividieron luego en dos partes iguales, reducidas y no reducidas. La mitad de las muestras se redujeron en presencia de DTT 1 M durante 1 hora a 37 ± 2 °C. Los contenidos de ambas muestras reducidas y no reducidas se transfirieron a recipientes de HPLC y se colocaron en el muestreador automático para analizar.
Los datos MS y MS/MS se recogieron en un espectrómetro de masas Micromass Q-TOF Ultima usando ionización por electrospray (ESI) en modo de iones positivos. Se adquirieron datos de m/z 200-1950 en modo MS. Antes del análisis, el espectrómetro de masas se calibró usando un ajuste de 5o orden en iones fragmentados de [Glu1]-Fibrinopéptido abarcando un intervalo de m/z 175 a 1285. Los volúmenes de las inyecciones se ajustaron para lograr una carga en la columna de aproximadamente 20 pmoles de proteína.
Resultados Según las observaciones discutidas anteriormente, los Solicitantes plantearon la hipótesis de que la banda de 75 kDa era una especie de "anticuerpo medio " que contenía una cadena pesada de anticuerpo y una cadena ligera de anticuerpo unidas covalentemente entre si mediante enlaces disulfuro, y que los pares de complejos de anticuerpos medios podrían asociarse de forma no covalente para formar un complejo que tuviera la misma estequiometría que un anticuerpo total (dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras) pero que careciera de enlaces disulfuro entre las dos cadenas pesadas ("cadenas pesadas no enlazadas"). Según esto, se predijo que la abundancia relativa de la banda de 75 kDa se correlacionaría con la proporción relativa de cadenas pesadas no enlazadas, que se determinó usando análisis por espectrometría de masas de muestras de anticuerpos digeridas con tripsina.
Los fragmentos de péptidos de interés para este estudio fueron el fragmento de tripsina T17 de la cadena pesada (T17H) que está compuesto por los aminoácidos 217-242, respectivamente. Los aminoácidos 220 y 223 son responsables de los enlaces disulfuro entre las cadenas pesadas de anticuerpo. Típicamente, los análisis de cisteina libre pueden realizarse al determinar una relación de residuos de cisteina alquilada a residuos no alquilados en muestras reducidas tras la digestión tríptica. Sin embargo, las especies alquiladas no estuvieron presentes en cualquiera de los lotes de materiales. Se planteó la hipótesis de que los dos residuos de cisterna del fragmento de péptidos de interés, T17H, se enlazaban entre si, o las cisteinas se protegieron con la estructura cuaternaria del anticuerpo. En cualquiera de los casos, los residuos de cisteina no estarían accesibles para alquilación. Por el contrario, el enfoque analítico fue utilizar la relación de especies no reducidas a especies reducidas en ambos lotes para calcular una diferencia de porcentaje. Se observó que las muestras no reducidas tuvieron una reducción de 2 Da en peso molecular, indicadores de enlaces disulfuro. Este comportamiento se aprovechó para calcular el porcentaje de T17H libre. La masa teórica de la especie T17H no reducida es 2727,41 Da (enlaces disulfuro entre Cys220 y Cys223) y 2729,41 Da para péptido reducido.
Los cromatogramas de iones extraídos de muestras reducidas y no reducidas se analizaron para detectar estados de carga representativas, la relación de conteos entre las muestras reducidas a no reducidas calcula que la especie T17H libre sea 2,3% en el anticuerpo producido con una adición de bolo de etanol, y 26,1% en la muestra producida sin una adición de bolo de etanol. Estos resultados se presentan en forma tabular en la Fig.9.
Por ende, la abundancia de cadenas pesadas que carecen de enlace disulfuro inter-cadenas pesadas aumentó en gran medida en la muestra producida sin la adición de bolo de etanol, lo que confirma además que la identidad de esta especie contiene una cadena pesada y una cadena ligera pero carece de un enlace disulfuro inter-cadenas pesadas. Además, la detección de una especie 2 Da más liviana que la masa esperada indicó que la cadena pesada en la especie H1L1 puede contener un enlace disulfuro extra para si mismo que puede interferir con la formación del enlace disulfuro inter-cadenas pesadas normal.
EJEMPLO 5 Este ejemplo demuestra una correlación entre la viabilidad celular y la pureza del anticuerpo. La adición de un bolo de etanol mejoró generalmente la viabilidad celular y la pureza del anticuerpo para el anticuerpo Ab-? y Ab-B. Asimismo, el anticuerpo Ab-C, que ya exhibió una alta pureza incluso sin la adición de bolo, también exhibió mayor viabilidad de cultivo. Juntos, estos resultados sugieren que la mejora en la pureza del anticuerpo que resulta de la adición de bolo de etanol es al menos parcialmente atribuible a la viabilidad de cultivo aumentada.
Metodos La viabilidad del cultivo se determinó usando un Cellometer (Nexcelom). Las muestras de cultivo se diluyeron con PBS de modo que el conteo final de células estuvo entre 1 x 107 y 5 x 107 células/mL. La mitad de la muestra se trató luego a condiciones de calor de 75°C durante 10 minutos como control positivo para tinción de yoduro de propidio (PI). La muestra no tratada y la muestra tratada se mezclaron luego con PI (20 uL de muestra más 20 uL de PI). La muestra se colocó luego en un casete de portaobjetos y la viabilidad se determinó mediante el conteo de la cantidad de células no fluorescentes y luego dividiendo por la cantidad total de células. Las células muertas absorbieron el yoduro de propidio y están fluorescentes de modo que la muestra de células muertas por calor de control positivo deberla mostrar menos de 1% de células vivas.
Resul tados Se determinó la viabilidad celular para cultivos productores de anticuerpos cultivados con o sin adición de bolo de etanol tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Tal como se describe anteriormente, la pureza de los anticuerpos Ab-A y Ab-B mejoró en gran medida por la adición de un bolo de etanol al cultivo de levadura (véase los Ejemplos 1-2 y FIGS. 1-4). La adición de un bolo de etanol mejoró la viabilidad celular también para estos cultivos. Para el anticuerpo Ab-A, la viabilidad mejoró de 91,9% a 97,2% en promedio (FIG.11), mientras que para el anticuerpo Ab-B, la viabilidad mejoró de 84,8% a 95,1% en promedio (FIG.12). Debido a la alta pureza existente del anticuerpo Ab-C producido incluso sin la adición de bolo de etanol, las mejoras en la pureza de este anticuerpo que resultan de la adición de bolo de etanol fueron más moderadas. (Véase Ejemplo 3 y FIG. 5). La observación de que la alta viabilidad celular estaba correlacionada con la mayor pureza de anticuerpo concuerda con el hecho de que los cultivos de anticuerpo Ab-C exhibieron alta viabilidad celular (95,8% en promedio) en ausencia de una adición de bolo de etanol, que varió levemente por la adición de bolo de etanol (96,8%).
Juntos, estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo que resulta de la adición de un bolo de etanol puede deberse en parte a (o al menos se correlaciona con) una mejora en la viabilidad celular.
EJEMPLO 6 Este ejemplo demuestra que puede lograrse una mejora similar en la pureza del anticuerpo con concentraciones de bolo de etanol que varían Metodos El anticuerpo Ab-A se produjo como en el Ejemplo 1, excepto que la adición de bolo de etanol fue de 5 g/L (0,5% p/v), 10 g/L (1% p/v) o 15 g/L (1,5% p/v). Las muestras de anticuerpo se purificaron del medio de cultivo a las 63 y 86 horas y se purificaron por afinidad por proteina A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida como en el Ejemplo 1.
Resultados La pureza de anticuerpo fue similarmente alta independientemente de la concentración de bolo agregada (entre 0,5% y 1,5% p/v), en ambos puntos de tiempo analizados, 63 horas (FIG.14A) y 86 horas (FIG.14B) . Los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 fueron similarmente bajos en cada cultivo.
Estos resultados indican que puede lograrse la mejora en la pureza del anticuerpo mientras varia la concentración de bolo de etanol.
EJEMPLO 7 Este ejemplo demuestra que las mejoras similares en la pureza de anticuerpo pueden lograrse mientras varia la duración del "período de privación" entre el pico de oxígeno disuelto y la adición del bolo de etanol a los cultivos.
Metodos El anticuerpo Ab-A se produjo como en el Ejemplo 1, excepto que la duración del período de privación, el tiempo entre el pico de oxígeno disuelto (que indica el agotamiento de la fuente de carbono en el cultivo) y la adición de bolo de etanol, fue 0 horas o 3 horas. Las muestras de anticuerpo se purificaron del medio de cultivo y se purificaron por afinidad por proteína A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida como en el Ejemplo 1.
Resultados La pureza del anticuerpo fue similarmente alta independientemente de la variación del período de privación entre 0 y 3 horas (FIG. 15 A, comparar vía 5 (0 horas de privación) con la 6 (3 horas de privación)). Los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 fueron similarmente bajos en cada cultivo.
Estos resultados indican que puede lograrse la mejora en la pureza del anticuerpo con una variación en la duración del período de privación.
EJEMPLO 8 Este ejemplo analiza el efecto en la pureza del anticuerpo de variar la duración del "periodo de equilibrio" entre la adición del bolo de etanol y el inicio de la adición de alimentación a los cultivos.
Metodos El anticuerpo Ab-B se producto como en el Ejemplo 2, excepto que la duración del periodo de equilibrio, el tiempo entre la adición del bolo de etanol y el inicio de la alimentación del cultivo, fue 0, 30 o 60 minutos. De manera adicional, la cepa de levadura de la cual se produjo el anticuerpo Ab-B contenía tres copias del gen de cadena ligera en vez de cuatro. Las muestras de anticuerpo se purificaron del medio de cultivo y se purificaron por afinidad por proteína A, luego la pureza se analizó por SDS-PAGE no reducida como en el Ejemplo 1. La viabilidad también se evaluó usando los métodos descritos en el Ejemplo 5.
Resul tados La pureza del anticuerpo fue similarmente alta durante un período de equilibrio de 0 o 30 minutos (FIG.16A, vías 7 y 8 (0 minutos de tiempo de equilibrio) y vía 3 (30 minutos de tiempo de equilibrio). Sin embargo, los niveles detectados de las especies H1L1 y H2L1 aumentaron en el cultivo con el periodo de equilibrio de 60 minutos (FIG.16A, vías 5 y 6). También se evaluó la viabilidad para cada cultivo en los puntos de tiempo de 23 horas y 85 horas. Durante el periodo de equilibrio de 60 minutos, la viabilidad se encontraba entre 75% y 80% a las 23 horas, mientras que en el mismo punto de tiempo la viabilidad era aproximadamente 88-90% para los periodos de equilibrio de 0 y 30 minutos (FIG. 16B). Posteriormente, a las 85 horas, la viabilidad había mejorado pero permanecía de algún modo reducida durante el período de equilibrio de 60 minutos con relación a los períodos de equilibrio de 0 y 30 minutos (FIG.16C).
Estos resultados indican que la mejora en la pureza del anticuerpo puede lograrse mientras varía el periodo de equilibrio al menos entre 0 y 30 minutos, mientras que puede ocurrir alguna pérdida de viabilidad y pureza durante un período de equilibrio de 60 minutos o más (aunque la pureza puede mejorar aun con relación al cultivo de control sin una adición de bolo de etanol).
La descripción anterior de varias modalidades ilustradas de la invención no pretende ser exhaustiva o limitar la invención a la forma precisa descrita. Mientras que las modalidades especificas de la invención y ejemplos de estas se describen en la presente a efectos ilustrativos, son posibles varias modificaciones equivalentes dentro del alcance de la invención, como lo reconocerán los expertos en la téenica relevante. Las enseñanzas que se proveen en la presente respecto de la invención pueden aplicarse a otros efectos, distintos que los ejemplos descritos en la presente. La invención puede realizarse en formas diferentes a las particularmente descritas en la descripción y ejemplos que anteceden. Son posibles numerosas modificaciones y variantes de la invención en vista de las enseñanzas anteriores y, por ende, se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Se pueden realizar estos y otros cambios a la invención en vista de la anterior descripción detallada. En general, en las siguientes reivindicaciones, los términos usados no deberían interpretarse como taxativos de la invención para las modalidades específicas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones. Por consiguiente, la invención no está limitada por la descripción, pero en cambio el alcance de la invención lo determinarán completamente las siguientes reivindicaciones.
Determinadas enseñanzas relacionadas con los métodos para obtener una población clonal de células B especificas del antigeno se describieron en la solicitud de patente provisional estadounidense N° 60/801,412, presentada el 19 mayo de 2006, cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Determinadas enseñanzas relacionadas con la humanización de anticuerpos monoclonales derivados de conejo y modificaciones de secuencia preferidas para mantener la afinidad de unión al antigeno se describieron en la solicitud internacional N° PCT/US2008/064421, correspondiente a la publicación internacional N° W0/2008/144757, denominada "Novel Rabbit Antibody Humanization Methods and Humanized Rabbit Antibodies", presentada el 21 de mayo de 2008, cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
Determinadas enseñanzas relacionadas con producir anticuerpos o fragmentos de estos usando levadura competente de apareamiento y métodos correspondientes se describen en la solicitud de patente estadounidense N° 11/429,053, presentada el 8 de mayo de 2006, (publicación de solicitud de patente estadounidense N° US2006/0270045), cuya descripción se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.
La totalidad de la descripción de cada documento citado en la presente (que incluye patentes, solicitudes de patente, artículos de periódicos, resúmenes, manuales, libros u otras descripciones), que incluye cada documento citado en los Antecedentes, Compendio, Descripción detallada y Ejemplos, se incorpora a la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Claims (105)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un complejo de múltiples subunidades, que comprende: (a) proporcionar un cultivo que comprende una célula eucariota que comprende genes que facilitan la expresión de las subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades; (b) agregar un bolo de etanol a dicho cultivo; y (c) cultivar dicho cultivo para producir dicho complejo de múltiples subunidades.
2. El método de la reivindicación 1, donde el bolo de etanol mejora la formación de enlaces disulfuro estables con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
3. El método de la reivindicación 1, donde dicho complejo de múltiples subunidades contiene uno o más polipéptidos que comprenden al menos un enlace disulfuro.
4. El método de la reivindicación 1, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de una o más variantes asociadas con productos con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de las variantes asociadas con productos que tienen un mayor o menor peso molecular aparente que dicho complejo de múltiples subunidades deseado según se detecta por cromatografía de exclusión por tamaño o electroforesis en gel con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de complejos que tienen una estequiometría aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de complejos que tienen enlaces disulfuro aberrantes con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de complejos que tienen cisteínas reducidas con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que disminuye la abundancia relativa de complejos que tienen una glicosilación aberrante con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
11. El método de la reivindicación 4, que modula la formación o estabilidad de enlaces disulfuro inter-cadena pesada.
12. El método de las reivindicaciones 4 u 11, que modula la formación o estabilidad de enlaces disulfuro que enlazan las cadenas ligera y pesada.
13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 u 11 a 12, que disminuye la abundancia relativa de una o más variantes asociadas con productos con respecto al mismo método efectuado en ausencia del bolo de etanol.
14. El método de la reivindicación 13, donde dichas variantes asociadas con productos comprenden una o más de las variantes asociadas con productos H1L1, H2L1, y H4L4.
15.El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 u 11 a 14, que aumenta la pureza de dicho anticuerpo con respecto al dicho método efectuado en ausencia de dicho bolo de etanol.
16. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) se efectúa antes del paso (c).
17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el paso (b) se efectúa posterior al paso (c).
18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el paso (b) se efectúa simultáneamente con el paso (c).
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4% (p/v).
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo de entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4%, entre alrededor de 0,02% y alrededor de 3,75%, entre alrededor de 0,04% y alrededor de 3,5%, entre alrededor de 0,08% y alrededor de 3,25%, entre alrededor de 0,1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 2,75%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de entre alrededor de 2,5%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 2,25%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 1,5%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 2%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,75%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,5%, o entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,25%.
21. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que es al menos alrededor de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,6%, 0,7%, 0,8% o 0,9% (p/v).
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) da como resultado una concentración de etanol en dicho cultivo que es como máximo alrededor de 4%, 3,5%, 3%, 2,5% 2% 1,8%, 1,6%, 1,5%, 1,4%, 1,3%, 1,2%, 1,1%, 1,0%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,35%, 0,3%, 0,25%, 0,2%, o 0,15% (p/v).
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (b) comprende agregar etanol a dicho cultivo, agregar un portador que comprende etanol a dicho cultivo, agregar dichas células a un medio o portador que comprende etanol o reemplazar parte del medio de cultivo.
24. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho bolo de etanol se agrega al medio de cultivo en un periodo de tiempo de entre 1 y 20 minutos.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (c) comprende suministrarle oxigeno a dichas células.
26. El método de la reivindicación 25, donde dicho suministro de oxigeno comprende agitar dicho cultivo.
27. El método de la reivindicación 25 o 26, donde dicho suministro de oxigeno comprende poner en contacto dicho cultivo con una mezcla de gas que comprende oxigeno.
28. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el paso (c) comprende agregar una alimentación que comprende una fuente de carbono a dicho cultivo.
29. El método de la reivindicación 28, donde dicha alimentación comprende al menos una fuente de carbono fer entable.
30. El método de la reivindicación 28, donde dicha alimentación comprende uno o más de glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, mañosa, manitol y rafinosa.
31. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que además comprende mantener la concentración de etanol entre un punto de referencia superior y un punto de referencia inferior durante el paso (c).
32. El método de la reivindicación 31, donde dicho punto de referencia inferior es de alrededor de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,10%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,6%, 0,6%, 0,7%, 0,8% o 0,9% (p/v).
33. El método de la reivindicación 31 o 32, donde dicho punto de referencia superior es de alrededor de 4% 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,8%, 1,6%, 1,5%, 1,4! 1,3%, 1,2 ° r 1,1%, 1,0J 0,9$ 0,8%, 0,7! 0,6$ 0,5%, 0,4%, 0,35%, 0,3%, 0,25%, 0,2! 0,15% (p/v).
34. El método de la reivindicación 31 o 32, donde dicho punto de referencia superior es como máximo alrededor de 1,5%, 1,4%, 1,3, 1,2% o 1,1% (p/v).
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, que comprende además mantener la concentración de etanol en un punto de referencia durante el paso (c).
36. El método de la reivindicación 35, donde dicho punto de referencia es de alrededor de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 01,%, 01,1%, 01,2%, 01,3%, 01,4%, o 01,5% (p/v).
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, donde el paso (c) comprende mantener la concentración de etanol en dicho cultivo entre alrededor de 0,01% y alrededor de 4%, entre alrededor de 0,02% y alrededor de 3,75%, entre alrededor de 0,04% y alrededor de 3,5%, entre alrededor de 0,08% y alrededor de 3,25%, entre alrededor de 0,1 % y alrededor de 3%, entre alrededor de 0,2% y alrededor de 2,75%, entre alrededor de 0,3% y alrededor de 2,5%, entre alrededor de 0,4% y alrededor de 2,25%, entre alrededor de 0,5% y alrededor de 2%, entre alrededor de 0,6% y alrededor de 1,75%, entre alrededor de 0,7% y alrededor de 1,5%, o entre alrededor de 0,8% y alrededor de 1,25%.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, donde la concentración de etanol en dicho cultivo se mantiene controlando la producción de etanol por dichas células o mediante la adición de etanol a dicho cultivo.
39. El método de la reivindicación 28, donde el paso de controlar la producción de etanol comprende controlar una o más de la concentración de glucosa, disponibilidad de oxigeno, intensidad de agitación, presión de gas, velocidad de flujo de aire suministrado u otra mezcla de gas, viscosidad del cultivo, densidad del cultivo, concentración del oxigeno en el aire suministrado u otro mezcla de gas y temperatura.
40. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el tiempo entre el paso (a) y el paso (b) es menor que alrededor de 72 horas, menor que alrededor de 48 horas, menor que alrededor de 24 horas, menor que alrededor de 12 horas, menor que alrededor de 9 horas, menor que alrededor de 6 horas, menor que alrededor de 5 horas, menor que alrededor de 4 horas, menor que alrededor de 3 horas, menor que alrededor de 90 minutos, menor que alrededor de 30 minutos, menor que alrededor de 5 minutos o menor que alrededor de 1 minuto.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el tiempo entre el paso (b) y el paso (c) es menor que alrededor de 10 horas, menor que alrededor de 9 horas, menor que alrededor de 8 horas, menor que alrededor de 7 horas, menor que alrededor de 6 horas, menor que alrededor de 5 horas, menor que alrededor de 4 horas, menor que alrededor de 3 horas, menor que alrededor de 2 horas, menor que alrededor de 90 minutos, menor que alrededor de 80 minutos, menor que alrededor de 70 minutos, menor que alrededor de 60 minutos, menor que alrededor de 50 minutos, menor que alrededor de 40 minutos, menor que alrededor de 30 minutos, menor que alrededor de 20 minutos, menor que alrededor de 10 minutos, menor que alrededor de 5 minutos o menor que alrededor de 1 minuto.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el cultivo del paso (a) se produce agregando una fuente de carbono a dicho cultivo y cultivar dicho cultivo hasta que la fuente de carbono se agote.
43. El método de la reivindicación 42, donde dicha fuente de carbono comprende uno o más de: glicerol, glucosa, etanol, citrato, sorbitol, xilosa, trehalosa, arabinosa, galactosa, fructosa, melibiosa, lactosa, maltosa, ramnosa, ribosa, mañosa, manitol y rafinosa.
44. El método de la reivindicación 42 o 43, donde el agotamiento de la fuente de carbono se determina detectando una disminución en la actividad metabólica de dichas células eucariotas.
45. El método de la reivindicación 44, donde dicha disminución en la actividad metabólica de dichas células eucariotas se identifica detectando una disminución en el consumo de oxigeno por dichas células eucariotas, detectando un aumento en el pH en el cultivo, detectando estabilización de la masa de célula húmeda o detectando un aumento en la concentración de amoniaco en el cultivo.
46. El método de la reivindicación 45, donde dicha disminución en el consumo de oxigeno por dichas células eucariotas se identifica detectando un aumento en la concentración de oxigeno disuelto en dicho cultivo.
47. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dichas células eucariotas comprenden células de levadura.
48. El método de la reivindicación 47, donde dichas células de levadura comprenden levadura metilotrófica.
49. El método de la reivindicación 48, donde dicha levadura metilotrófica es del género Pichia .
50. El método de la reivindicación 49, donde dicha levadura metilotrófica del género Pichia es Pichia pastoris.
51. El método de la reivindicación 49, donde dicha levadura metilotrófica del género Pichia se selecciona del grupo que consiste en: Pichia angusta , Pichia guillermordii , Pichia methanolica y Pichia inositovera .
52. El método de la reivindicación 49, donde los genes que facilitan la expresión de dicho complejos de múltiples subunidades se integran en uno o más locus genómicos.
53. El método de la reivindicación 49, donde al menos uno de dichos locus genómicos se selecciona del grupo que consiste en el locus pGAP, locus 3' AOX TT; PpURA5; 0CH1; A0X1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG y el locus HIS4 TT.
54. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades se expresa bajo el control de un promotor inducidle o constitutivo.
55. El método de la reivindicación 54, donde dicho promotor inducible se selecciona del grupo que consiste en los promotores A0X1, CUP1, inducibles por tetracielina, inducibles por tiamina y FLD1.
56. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde al menos uno de los genes que codifican dichas subunidades del complejo de múltiples subunidades se expresa bajo el control de un promotor que se selecciona del grupo que consiste en: los promotores CUP1, A0X1, ICLl, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenase (GAP), FLD1, ADHl, alcohol deshidrogenasa II, GAL4, PH03, PH05 y Pyk, promotores inducibles por tetracielina, promotores inducibles por tiamina, promotores quiméricos derivados de estos, promotores de levadura, promotores de mamíferos, promotores de insectos, promotores vegetales, promotores de reptiles, promotores de anfibios, promotores virales y promotores de aves.
57. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicha célula eucariota es una célula diploide, tetraploide o poliploide.
58. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, que comprende además purificar dicho complejo de múltiples subunidades de dichas células eucariotas o del medio de cultivo.
59. El método de la reivindicación 58, donde dicho complejo de múltiples subunidades se purifica de un componente intracelular, citoplasma, nucleoplasma o una membrana de dichas células eucariotas.
60. El método de la reivindicación 58, donde dichas células eucariotas secretan dicho complejo de múltiples subunidades en el medio de cultivo.
61. El método de la reivindicación 60, donde dicho complejo de múltiples subunidades se purifica de dicho medio de cultivo.
62. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo monoespecifico o biespecífico.
63. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado o un fragmento de estos.
64. El método de la reivindicación 63, donde dicho anticuerpo humanizado es de origen de ratón, rata, conejo, cabra, oveja o vaca.
65. El método de la reivindicación 62, donde dicho anticuerpo humanizado es de origen de conejo.
66. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo monovalente, bivalente o multivalente.
67. El método de la reivindicación 4 o cualquiera de las reivindicaciones 61 a 66, donde dicho anticuerpo se purifica de dicho cultivo por afinidad por proteina A y/o proteina G.
68. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde al menos uno de los genes que facilitan la expresión de una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades en al menos una de dichas células eucariotas en dicho panel se optimiza para expresión en dicha célula eucariota.
69. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo y la pureza de dicho anticuerpo se evalúa midiendo la fracción del anticuerpo producida por dicha célula eucariota que está contenida en complejos de anticuerpos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, está contenida en complejos de anticuerpo que tienen el peso molecular esperado y/o que se une específicamente a una diana de dicho anticuerpo.
70. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo y el rendimiento de dicho anticuerpo se evalúa determinando la cantidad de anticuerpo producida por dicha célula eucariota descontando cualquier variante asociada con productos que está anormalmente glicosilada, contenida en complejos de anticuerpo que no sean complejos que tienen el radio hidrodinámico aparente esperado, contenida en complejos de anticuerpos que tienen el peso molecular esperado y/o que no logran unirse específicamente a la diana de dicho anticuerpo.
71. El método de la reivindicación 58 o 59, donde el peso molecular de dichos complejos de anticuerpos se determina por SDS-PAGE no reducida.
72. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo, dicho método también comprende purificar dicho anticuerpo.
73. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicha célula de cultivo produce una titulación de anticuerpo de sobrenadante de al menos 100 mg / L, al menos 150 mg / L, al menos 200 mg / L, al menos 250 mg / L, al menos 300 mg / L, entre 100 y 300 mg / L, entre 100 y 500 mg / L, entre 100 y 1000 g / L, al menos 1000 mg / L, al menos 1250 mg/litro, al menos 1500 mg/litro, al menos alrededor de 1750 mg/litro, al menos alrededor de 2000 mg/litro, al menos alrededor de 10000 mg/litro o más.
74. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde una o más subunidades de dicho complejo de múltiples subunidades se expresan a partir de más de una copia de gen.
75. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo que se expresa entre 1-10 copias de un gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo y de 1-10 copias de un gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo.
76. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde los genes que facilitan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades se integran en el genoma de dichas células.
77. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-75, donde los genes que facilitan la expresión de dicho complejo de múltiples subunidades están contenidos en un elemento extracromosómico, plásmico o cromosoma artificial.
78. El método de la reivindicación 76 o 77, donde dichas células comprenden más copias del gen que facilita la expresión de la cadena ligera de dicho anticuerpo que copias del gen que facilita la expresión de la cadena pesada de dicho anticuerpo.
79. El método de la reivindicación 76 o 76, donde la cantidad respectiva de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y la cantidad de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células es: 2 y 2, 2 y 3, 3 y 3, 3 y 4, 3 y 5, 4 y 3, 4 y 4, 4 y 5, 4 y 6, 5 y 4, 5 y 5, 5 y 6o 5 y 7.
80. El método de la reivindicación 76 o 77, donde la cantidad respectiva de copias del gen que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo y la cantidad de copias del gen que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo en dichas células es: 2 y 1, 3 y 1, 4 y 1, 5 y 1, 6 y 1, 7 y 1, 8 y 1, 9 y 1, 10 y 1, 1 y 2, 2 y 2, 3 y 2, 4 y 2, 5 y 2, 6 y 2, 7 y 2, 8 y 2, 9 y 2, 10 y 2, 1 y 3, 2 y 3, 3 y 3, 4 y 3, 5 y 3, 6 y 3, 7 y 3, 8 y 3, 9 y 3, 10 y 3, 1 y 4, 2 y 4, 3 y 4, 4 y 4, 5 y 4, 6 y 4, 7 y 4, 8 y 4, 9 y 4, 10 y 4, 1 y 5, 2 y 5, 3 y 5, 4 y 5, 5 y 5, 6 y 5, 7 y 5, 8 y 5, 9 y 5, 10 y 5, 1 y 6, 2 y 6, 3 y 6, 4 y 6, 5 y 6, 6 y 6, 7 y 6, 8 y 6, 9 y 6, 10 y 6, 1 y 7, 2 y 7, 3 y 7, 4 y 7, 5 y 7, 6 y 7, 7 y 7, 8 y 7, 9 y 7, 10 y 7, 1 y 8, 2 y 8, 3 y 8, 4 y 8, 5 y 8, 6 y 8, 7 y 8, 8 y 8, 9 y 8, 10 y 8, 1 y 9, 2 y 9, 3 y 9, 4 y 9, 5 y 9, 6 y 9, 7 y 9, 8 y 9, 9 y 9, 10 y 9, 1 y 10, 2 y 10, 3 y 10, 4 y 10, 5 y 10, 6 y 10, 7 y 10, 8 y 10, 9 y 10, 10 y 10.
81. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el cultivo del paso (c) se cultiva en un medio de producción.
82. El método de la reivindicación 81, donde dicho medio de producción es un medio mínimo.
83. El método de la reivindicación 81, donde dicho medio mínimo no tiene agentes selectivos.
84. El método de la reivindicación 81, donde dicho medio mínimo no tiene aminoácidos preformados u otras biomoléculas complejas.
85. El método de la reivindicación 81, donde el medio de producción es un medio complejo.
86. El método de la reivindicación 85, donde el medio de complejo comprende uno o más de extracto de levadura, peptona de soja y otras peptonas vegetales.
87. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde el cultivo del paso (c) se cultiva a una densidad celular alta.
88. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 50 g/L.
89. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 100 g/L.
90. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 300 g/L.
91. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 400 g/L.
92. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 500 g/L.
93. El método de la reivindicación 87, donde dicha densidad celular alta es al menos 750 g/L.
94. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde las células de levadura se cultivan durante al menos 20 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 20 duplicaciones.
95. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde las células del paso (c) se cultivan durante al menos 50 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 50 duplicaciones.
96. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde las células del paso (c) se cultivan durante al menos 100 duplicaciones y mantienen altos niveles de expresión de dicho complejo de múltiples subunidades luego de dichas al menos 100 duplicaciones.
97. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde al menos una subunidad de dicho complejo de múltiples subunidades comprende una señal de secreción.
98. El método de la reivindicación 97, donde dicho complejo de múltiples subunidades comprende un anticuerpo.
99. El método o composición de la reivindicación 97 o 98, donde la señal de secreción comprende uno o más polipéptidos que se seleccionan del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 414 a 437 y cualquier combinación de estas.
100. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no es ninguno de los anticuerpos descritos en la solicitud provisional estadounidense N° 61/418,832, presentada el 1 de diciembre de 2010, PCT/US11/62963, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,295, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/309,153, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,665, presentada el 1 de diciembre de 2011, serie estadounidense N° 13/308,831, presentada el 1 de diciembre de 2011.
101. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no es Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF y Ab21-NGF o un fragmento Fab2 o Fabl de estos.
102. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no contiene al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) contenidas en cualquiera de los siguientes anticuerpos: Abl-NGF, Ab2-NGF, Ab3-NGF, Ab4-NGF, Ab5-NGF, Ab6-NGF, Ab7-NGF, Ab8-NGF, Ab9-NGF, AblO-NGF, Abll-NGF, Abl2-NGF, Abl3-NGF, Abl4-NGF, Abl5-NGF, Abl6-NGF, Abl7-NGF, Abl8-NGF, Abl9-NGF, Ab20-NGF o Ab21-NGF y que opcionalmente tiene especificidad de unión a NGF.
103. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no comprende o consiste en las secuencias de polipéptidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NO: 51 y 401, respectivamente, SEQ ID NO: 53 y 402, respectivamente, SEQ ID NO: 405 y 406, respectivamente y SEQ ID NO: 407 y 408, respectivamente .
104. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no comprende un anticuerpo que contiene al menos una, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o al menos las seis CDR de SEQ ID NO: 55, 56, 57, 58, 59 y 60 y que opcionalmente tenga especificidad de unión por NGF.
105. El método de cualquiera de las reivindicaciones que anteceden, donde dicho complejo de múltiples subunidades no comprende ninguno de los anticuerpos o secuencias codificantes de anticuerpos descritas en la presente en las secciones con el titulo "Anticuerpos anti-NGF y fragmentos de unión de estos que tienen actividad de unión con NGF" y "Polinucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo anti-NGF.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111973740A (zh) * 2014-03-21 2020-11-24 泰华制药国际有限公司 针对降钙素基因相关肽的拮抗剂抗体及其使用方法
TW202140776A (zh) * 2016-04-26 2021-11-01 美商美國泰福生技股份有限公司 細胞培養基
GB201803832D0 (en) * 2018-03-09 2018-04-25 Syndermix Ag Methods and compositions for lectin production
CN108913732B (zh) * 2018-07-31 2022-02-08 华东理工大学 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4855231A (en) 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4818700A (en) 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4812405A (en) 1986-02-18 1989-03-14 Phillips Petroleum Company Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
AU6445894A (en) 1993-03-19 1994-10-11 Duke University Method of treatment of tumors with an antibody binding to tenascin
IL114909A (en) 1994-08-12 1999-10-28 Immunomedics Inc Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5955349A (en) 1996-08-26 1999-09-21 Zymogenetics, Inc. Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US6730499B1 (en) 1998-07-03 2004-05-04 Research Corporation Technologies, Inc. Promoter for the Pichia pastoris formaldehyde dehydrogenase gene FLD1
WO2000056903A2 (en) * 1999-03-22 2000-09-28 Zymogenetics, Inc. IMPROVED METHODS FOR PRODUCING PROTEINS IN TRANSFORMED $i(PICHIA)
US6258559B1 (en) 1999-03-22 2001-07-10 Zymogenetics, Inc. Method for producing proteins in transformed Pichia
US7560249B2 (en) * 2000-12-13 2009-07-14 Unilever Bestfoods, North America, Division Of Conopco, Inc. Method for the production of a heterologous protein by a fungus
SI1678314T1 (sl) 2003-10-22 2013-01-31 Keck Graduate Institute Metode za sintetiziranje heteromultimernih polipeptidov pri kvasovkah s strategijo razmnoĺ˝evanja haploidnih celic
WO2008063302A2 (en) * 2006-10-10 2008-05-29 Keck Graduate Institute Novel p. pastoris pastoris promoters, and the use thereof to direct expression of proteins in yeast, preferably using a haploid mating strategy
SI2164514T1 (sl) 2007-05-21 2017-04-26 Alderbio Holdings Llc Protitelesa proti IL-6 in njihova uporaba
CA2688829A1 (en) 2007-05-21 2008-11-27 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies
AU2011336470B8 (en) * 2010-12-01 2017-09-14 Alderbio Holdings Llc Anti-NGF compositions and use thereof

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