KR20140057613A - 변형된 미생물 이를 테면 피치아 파스토리스(pichia pastoris)에서 다수의 아단위 단백질들, 이를 테면 항체의 고역가 및 고순도 생산을 위한 다중-복사체 전략 - Google Patents

Abstract

변형된 세포들에서 이종기원의 다수의 아단위 단백질들을 생산하는 방법들이 공개된다. 구체적으로, 본 명세서는 분비될 수 있는 또는 분비될 수 없는 항체 및 다수의 다른 아단위 단백질들을 포함하는 다수의 아단위 단백질들을 더 높은 산출량으로 생산하고, 바람직하지 못한 부산물들의 생산은 감소시키는 개선된 방법들이 제공된다. 예시적인 구체예들에서, 변형된 세포들은 효모, 가령, 메틸영양성 효모 이를 테면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.

Description

변형된 미생물 이를 테면 피치아 파스토리스(PICHIA PASTORIS)에서 다수의 아단위 단백질들, 이를 테면 항체의 고역가 및 고순도 생산을 위한 다중-복사체 전략{MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS}

관련된 출원의 공시

본 출원은 2011년 8월 19일자 제출된 "피치아 파스토리스(PICHIA PASTORIS)와 같은 변형된 미생물에서 항체와 같은 다수의 아단위 단백질들의 고역가 및 고순도 생산을 위한 다수의 복사체 전략 "이라는 제목의 미국 일련 번호 61/525,307 (대리인 서류 번호. 67858.730200)를 우선권으로 주장하며, 2012년 5월8일자로 제출된 피치아 파스토리스(PICHIA PASTORIS)와 같은 변형된 미생물에서 항체와 같은 다수의 아단위 단백질들의 고순도 생산"이라는 제목의 미국 일련 번호 13/466,795 (대리인 서류 번호 75820.711001)의 연속-일부 출원이며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

본 출원은 EFS-Web을 통하여 2012년 8월 16일자로 만들어진 43,651 바이트 크기를 가진 파일명 "67858o730201.txt"의 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

분야

본 명세서는 변형된 세포에서 이종기원(heterologous)의 단백질들을 생산하는 방법들에 일반적으로 관계된다. 구체적으로, 본 명세서는 분비되거나 또는 분비되지 않을 수 있는 항체 및 기타 다수의 아단위 단백질들 이를 테면 호르몬들과 수용체들을 포함하는, 다수의 아단위 단백질들을 더 높은 산출량으로 생산하고 그리고 원하지 않은 부산물의 생산은 감소시킨 개선된 방법을 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 변형된 세포들은 효모, 이를 테면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)이다.

통상적인 항체는 2개의 동일한 경쇄와 2개의 동일한 중쇄를 포함하는 사량체(tetrameric) 단백질이다. 다양한 목적으로 천연 재료로부터 충분한 양으로 특이적 유형의 순수한 인간 항체를 정제하는 것이 어렵거나 또는 불가능할 것이다. 결과적으로, 생물공학적 그리고 제약 회사는 항체를 대규모로 제조하기 위하여 제조합 DNA-기반 방법으로 선회하였다. 기능성 항체의 생산은 일반적으로 2가지 폴리펩티드의 합성에 관계할 뿐만 아니라, N-말단 분비 신호 서열의 단백질 분해성 프로세싱; 폴리펩티드의 적절한 폴딩 및 사량체로의 어셈블리; 이황화결합의 형성을 포함하는 다수의 해독후-사건을 포함하고; 그리고 전형적으로 특이적 N-연계된 당화(glycosylation)를 포함한다. 이들 모든 사건들은 진핵세포 분비 경로에서 진핵세포들에 독특한 세포기관 복합체를 발생한다.

이러한 복합체 단백질들의 재조합 합성은 매우 흔하게 이용되는 배양된 포유류 세포들과 함께, 생물학적으로 활성 물질을 생산하기 위하여 더 고차원의 진행세포들의 배양에 전형적으로 의존하였다. 그러나, 포유류 조직 배양-기초된 생산 체계는 미생물 발효 방법과 관련하여 막대한 추가 비용을 발생시키고, 복잡함을 유발시킨다. 추가적으로, 포유류 세포 배양으로부터 유도된 산물들은 배양된 세포 또는 배양에 이용된 동물-유도된 산물, 이를 테면 혈청에 존재할 수 있는 포유류 병원균들(바이러스 포함)로부터 확실히 해방되도록 하기 위한 추가 안전성 테스트를 요구할 수 있다.

사전 작업은 연구, 진단, 및 치료 용도에 잠재적으로 적합한 기능성 항체를 생산하기 위하여 비용-효과적인 플렛포옴으로써 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 확립하기 위한 도움을 받는다. 공동-소유의 미국 특허 제7,935,340호 및 제7,927,863호 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 재조합 단백질들의 발현을 위하여 세포 밀도, 배양액(broth) 용적, 기질 공급 속도, 그리고 반응의 각 단계의 길이를 포함하는 P. 파스토리스(P. pastoris)의 기획 및 최적화를 위한 방법들에 대해서는 문헌에 또한 공지되어 있다. Zhang et al., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63 참고.

재조합 다수의 아단위 단백질들은 배양된 세포들로부터 만들어질 수 있지만, 바람직하지 못한 부산물들 또한 만들어질 수 있다. 예를 들면, 배양된 세포들은 유리(free) 단량체들, 부정확한 화학량론을 가진 복합체들, 또는 바람직하지 못한 또는 비정상적 당화를 보유한 단백질들과 함께 바람직한 다수의 아단위 단백질들을 만들 수 있다. 바람직한 다수의 아단위 단백질의 정제는 생산 비용을 증가시킬 수 있고, 그리고 정제와 관련된 단계들은 활성 복합체들의 전체 생산산출량을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 정제 후에도 바람직하지 못한 부산물들이 우려되는 수준의 양으로 존재할 수 있다. 예를 들면, 당화된 부산물들은 투여후 면역 반응의 위험을 증가시킬 수 있는 양으로 존재할 수 있고, 비정상적 복합체 또는 응집체들이 특이적 활성을 감소시킬 수 있으며, 또한 잠재적인 면역발생원이 될 수 있다.

요약

본 명세서는 다수의 아단위 단백질들 이를 테면 항체, 호르몬들 및 수용체들 그리고 기타 다수의 아단위 복합체들을 더 높은 산출량으로 재조합 생산할 수 있는 개선된 방법들 및 조성물을 제공한다. 이들 다단위(multiunit) 폴리펩티드는 동일한 또는 상이한 2개 또는 그 이상의 아단위를 포함할 수 있다(이를 테면, 동종 또는 이종고분자성 폴리펩티드). 예시적인 구체예들에서, 분비된 또는 세포내 이러한 다수의 아단위 단백질들의 산출량은 본 명세서에서 기술된 방법들을 이용하여 최소한 50%, 최소한 100%, 또는 그 이상 (통상적인 방법들과 비교하여)으로 증가될 수 있다.

본 발명은 바람직하지 못한 부산물들의 생산은 감소되면서, 항체 및 기타 다수의 아단위 단백질들의 재조합 생산을 제공하는 개선된 방법들 및 물질을 또한 공개한다. 예시적인 구체예들에서, 바람직하지 못한 부산물은 당화된 단백질, 이를 테면 당화된 항체 중쇄일 수 있으며, 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하면 초기 풍부함과 비교하여(통상적인 방법들과 비교하여), 이의 상대적 풍부함은 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 80% , 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 96%, 최소한 97%, 최소한 98%, 최소한 99%까지 감소되거나, 또는 탐지불가능한 수준으로 낮아질 수 있다. 상대적 풍부함이 이렇게 감소될 수 있는 예시적인 바람직하지 못한 부산물들은 바람직한 다수의 아단위 복합체와는 상이한 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 보유하는 하나 또는 그 이상의 종을 포함할 수 있다. 예를 들면, 겉보기 분자량은 화학량론, 폴딩, 복합체 어셈블리, 및/또는 당화에서의 차이에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 이러한 바람직하지 못한 부산물들은 크기 압출 크로마토그래피 및/또는 겔 전기영동을 이용하여 탐지될 수 있고, 그리고 바람직한 다수의 아단위 복합체보다 더 높은 또는 더 낮은 겉보기 분자량을 보유할 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 바람직하지 못한 부산물들은 환원 조건에서 탐지될 수 있다. 다른 예시적인 구체예들에서, 바람직하지 못한 부산물들은 비-환원 조건들하에서 탐지될 수 있다.

예시적인 구체예들에서, 본 명세서는 항체 및 기타 다수의 아단위 복합체들을 더 높은 산출량으로 재조합 생산하기 위한 개선된 방법들과 조성물을 또한 제공한다. 예시적인 구체예들에서, 산출량은 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 최소한 10%, 최소한 20%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 100%, 또는 그 이상 (통상적인 방법들과 비교하여)으로 증가될 수 있다.

예시적인 구체예들에서, 다수의 아단위 단백질들이 생산될 수 있는 숙주 세포는 효모, 예를 들면 피치아(Pichia) 종 이를 테면 P. 파스토리스(P. pastoris) 또는 또다른 메틸영양성(methylotrophic) 효모, 또는 사카로미세스(Saccharomyces) 종 이를 테면 S. 세레비시에(S. cerevisiae), 또는 또다른 효모 이를 테면 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces) (가령, S. 폼베(S. pombe))일 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 메틸영양성 효모의 다른 예로는 피치아 앙구스타(Pichia angusta) (한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로 당업계에 또한 알려짐), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera), 오가테아 니트라토아베르사(Ogataea nitratoaversa), 그리고 칸디다 보이드니(Candida boidnii)를 포함한다.

한 측면에서, 본 명세서은 바람직한 항체 또는 기타 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 높은 산출량으로 생산하는 숙주 세포를 확인하는 개선된 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 최소한 두 가지 숙주 세포들을 포함하고 이 각각 숙주 세포는 전술한 다수의 아단위 복합체 (가령, 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄)의 아단위들의 발현을 제공하는 유전자를 포함하고; (b) 전술한 각 숙주 세포를 다수의 아단위 복합체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포들에서 유전자는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체중 최소한 하나의 아단위의 상이한 발현 수준을 제공하며; (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생성된 다수의 아단위 복합체의 산출량을 측정하고; 그리고 (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 많은 산출량을 생산하는 숙주 세포는 더 큰 산출량으로 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는 숙주 세포로 확인된다.

또다른 측면에서, 본 명세서는 바람직한 항체 또는 다른 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 높은 순도로 생산하는 숙주 세포를 확인하는 개선된 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함할 수 있다: (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위 (가령, 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄) 발현을 제공하는 유전자를 각각 포함하는 최소한 두 가지 숙주 세포들을 포함하고 ; (b) 전술한 각 숙주 세포를 다수의 아단위 복합체의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하고, 이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포들에서 이 유전자들은 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위의 상이한 수준을 제공하고; (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생산된 전술한 다수의 아단위 복합체의 순도를 측정하고; 그리고 (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 큰 순도를 생산하는 숙주 세포는 더 큰 순도의 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는 숙주 세포로 확인된다.

이 숙주 세포는 진핵세포, 이를 테면 효모 세포, 이를 테면 메틸영양성 효모, 이를 테면 피치아(Pichia) 속의 효모일 수 있다. 피치아(Pichia) 속의 예시적인 메틸영양성 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 그리고 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)를 포함한다. 이 숙주 세포는 교배(mating), 가령, 각 반수체가 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 최소한 하나의 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 함유하는 2개의 반수체 효모 세포들을 교배함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들면, 다수의 반수체 세포들은 전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위의 공지의, 상이한 숫자의 복사체를 함유하도록 생성될 수 있고, 반수체 세포들의 상이한 조합의 교배는 이배체(diploid) 세포들의 패널을 신속하게 만들 수 있으며, 이들 각 이배체 세포는 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 유전자의 사전-선택된 수의 복사체를 포함한다. 추가적으로, 다수의 이배체 세포들은 전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위의 공지된 상이한 숫자의 복사체를 함유하도록 생산될 수 있고, 이배체 세포들의 상이한 조합 간에 교배로 사배체(tetraploid) 세포들의 패널이 신속하게 만들어질 수 있으며, 이들 각 이배체 세포는 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 유전자의 사전-선택된 수의 복사체를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 피치아(Pichia) 속의 메틸영양성 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)이다. 이 숙주 세포는 이배체 또는 사배체 세포일 수 있다.

바람직한 다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위, 이를 테면 전술한 바람직한 항체 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드하는 전술한 유전자중 최소한 하나는 유도성 또는 구성 프로모터, 이를 테면 CUP1 (배지에서 구리 수준에 의해 유도됨; Koller et al., Yeast 2000; 16: 651-656 참고), 테트라사이클린 유도성 프로모터 (가령, Staib et al., Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Jan. 2008, p. 146-156 참고), 티아민 유도성 프로모터, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 이로부터 유도된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 그리고 조류 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다.

바람직한 다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위들, 이를 테면 전술한 바람직한 항체 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드하는 전술한 유전자들중 최소한 하나는 유도성 또는 구성 프로모터, 이를 테면 CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 그리고 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 이로부터 유도된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 그리고 조류 프로모터의 조절하에 발현될 수 있다.

이 숙주 세포는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 배양 배지로 분비할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 전술한 숙주 세포 안에 유지될 수 있고, 이로부터 단리될 수 있다.

전술한 숙주 세포는 이배체, 사배체 세포, 또는 다배수체(polyploid)일 수 있다.

이 방법은 전술한 숙주 세포들 또는 배양 배지로부터 전술한 다수의 아단위 복합체를 정제하는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 전술한 숙주 세포들의 세포내 성분, 세포질, 핵질, 또는 막으로부터 정제될 수 있다.

바람직한 다수의 아단위 복합체는 항체, 이를 테면 단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 이 항체는 임의의 항원에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

전술한 인간화된 항체는 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 양, 또는 소 기원의 항체일 수 있다.

전술한 인간화된 항체는 토끼 기원의 항체일 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 단가(monovalent), 이가(bivalent), 또는 다가(multivalent) 항체를 포함할 수 있다.

전술한 항체는 전술한 배양으로부터 단백질 A 및/또는 단백질 G 친화력에 의해 정제될 수 있다.

전술한 패널에서 전술한 진핵세포중 최소한 하나에서 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 유전자중 최소한 하나는 전술한 진핵세포에서 발현에 대하여 최적화될 수 있다.

전술한 패널에서 최소한 두 가지 숙주 세포들은 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 상이한 수의 복사체를 포함할 수 있는데, 가령, 바람직한 항체 중쇄 및/또는 전술한 바람직한 항체 경쇄를 인코드하는 유전자의 상이한 수의 복사체를 포함할 수 있다.

전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 최소한 두 가지 복사체, 가령, 바람직한 항체 중쇄 및/또는 전술한 바람직한 항체 경쇄를 인코드하는 유전자의 최소한 두 가지 복사체를 포함할 수 있다.

전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체 (이를 테면 바람직한 항체 중쇄 또는 바람직한 항체 경쇄)의 아단위를 인코드하는 유전자를 포함할 수 있는데, 이 유전자의 발현은 전술한 패널에서 상이한 숙주 세포내 대응하는 유전자의 발현을 구동시키는 프로모터와는 상이한 프로모터에 의해 구동될 수 있다.

전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위를 인코드하는 하나 이상의 서열을 포함하는 다시스트론성(polycistronic) 유전자를 포함할 수 있다.

바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함할 수 있는데, 이 항체는 임의의 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 예시적인 비-제한적인 예로는 IL-6, TNF-알파, CGRP, PCSK9, 또는 NGF를 포함한다.

바람직한 다수의 아단위 복합체는 임의의 유형의 항체를 포함할 수 있다. 예시적인 항체 유형은 임의의 포유류 종, 가령, 인간, 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 양, 소 등의 항체를 포함한다. 바람직하게는, 이 항체는 인간 항체 또는 토끼 기원일 수 있는 인간화된 항체다. 바람직한 항체는 단가, 이가, 또는 다가 항체일 수 있다.

전술한 패널에서 전술한 숙주 세포들의 최소한 하나에서 바람직한 항체의 경쇄 및/또는 중쇄와 같은 바람직한 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 전술한 유전자의 최소한 하나는 전술한 숙주 세포에서 발현을 위하여 최적화될 수 있다(가령, 바람직한 코돈을 선택함으로써 및/또는 코돈 선별을 통한 AT 비율을 변경시킴으로써).

작업 실시예에서 나타낸 것과 같이, 일부 구체예들에서, 이 항체의 산출량 및 순도는 경쇄에 비하여 더 많은 중쇄 복사체를 가지는, 중쇄에 비하여 더 많은 경쇄 복사체를 가지는, 또는 동일한 수의 경쇄 및 중쇄 복사체를 가지도록 발현시키기 위하여 숙주 세포들의 사용에 의해 추가 최적화될 수 있다.

전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체, 이를 테면 바람직한 항체의 순도는 전술한 숙주 세포에 의해 생산된, 당화안된, 예측된 겉보기 유체역학 반경 및/또는 겉보기 분자량을 보유한 복합체 안에 포함된 (가령, 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정), 예측된 이화학전기이동 운동성 (가령, 겔 전기영동, 이를 테면 SDS-PAGE, 및 선택적으로 웨스턴(Western) 블랏팅에 의해 탐지됨)을 보유하는 바람직한 다수의 아단위 복합체를 측정함으로써, 및/또는 다수의 아단위 복합체의 특이적 활성 (가령, 바람직한 항체의 표적에 특이적 결합)을 특정함으로써 평가될 수 있다.

바람직한 다수의 아단위 복합체는 항체일 수 있고, 그리고 전술한 항체의 산출량은 예측된 겉보기 분자량 또는 유체역학 반경을 보유하는 복합체 이외의 항체 복합체에 포함된 임의의 산물-연합된 변형을 차감하고, 및/또는 전술한 바람직한 항체의 표적에 특이적으로 결합하지 못한 것을 차감함으로써, 전술한 숙주 세포에 의해 생산된 바람직한 항체의 양의 측정하고, 평가될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 명세서은 바람직한 다수의 아단위 복합체, 이를 테면 바람직한 항체를 재조합에 의해 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 이때 전술한 숙주 세포는 본 명세서에서 기술된 임의의 방법에 의해 더 큰 산출량 및/또는 순도로 바람직한 항체를 생산하는 숙주 세포로써 확인되며; 그리고 (b) 전술한 숙주 세포는 전술한 경쇄 및 중쇄 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 배양된다. 이 방법은 전술한 바람직한 항체의 정제를 더 포함할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 명세서는 바람직한 다수의 아단위 복합체, 이를 테면 바람직한 항체를 재조합적으로 생산하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 다음을 포함한다: (a) 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자의 다수의 복사체를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 이 숙주 세포는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 전술한 유전자의 오직 단일 복사체를 포함하는 동계의(isogenic) 숙주 세포와 비교하여 더 큰 산출량 및/또는 순도로 바람직한 항체를 생산하고; 그리고 (b) 전술한 숙주 세포는 전술한 경쇄 및 중쇄 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 배양된다. 이 방법은 전술한 바람직한 항체의 정제를 더 포함할 수 있다.

전술한 방법들은 2012년 5월 8일자로 제출된, 변형된 미생물 이를 테면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 다수의 아단위 단백질들 이를 테면 항체의 고-순도 생산"이라는 제목의 공동-소유 미국 출원 일련 번호 13/466,795 (대리인 서류 번호 75820.711001)(이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에서 기술된 방법들 및/또는 조건들을 이용하여 배양하는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 전술한 배양은 배양에 에탄올 볼루스(bolus)를 약 1% w/w의 최종 농도로 추가하는 것을 포함할 수 있다.

예를 들면, 명세서의 측면은 다수의 아단위 복합체를 생산하는 다음을 포함하는 방법을 제공한다: (a) 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 유전자의 다수의 복사체를 포함하는 진핵세포를 포함하는 배양물을 제공하고; (b) 전술한 배양물에 에탄올 볼루스를 추가하고; 그리고 (c) 전술한 다수의 아단위 복합체를 생산하기 위하여 전술한 배양물을 배양한다.

에탄올 볼루스는 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 안정적인 이황화결합의 형성을 강화시킬 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 최소한 하나의 이황화결합을 포함하는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 보유할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 항체를 포함할 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 하나 또는 그 이상의 산물-연합된 변이체의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 크기 압출 크로마토그래피 또는 겔 전기영동에 의해 탐지되었을 때, 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체보다 더 높은 또는 더 낮은 겉보기 분자량을 보유하는 산물-연합된 변이체의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 정도를 벗어난 화학량론을 가지는 복합체들의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 정도를 벗어난 이황화결합을 보유하는 복합체들의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 환원된 시스테인을 보유하는 복합체들의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 정도를 벗어난 당화를 보유하는 복합체들의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

이 방법은 중쇄간 이황화결합의 형성 또는 안정성을 조절할 수 있다.

이 방법은 경쇄와 중쇄를 연결하는 이황화결합의 형성 또는 안정성을 조절할 수 있다.

이 방법은 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 동일한 방법과 비교하여 하나 또는 그 이상의 산물-연합된 변이체의 상대적인 풍부함을 감소시킬 수 있다.

전술한 산물-연합된 변이체는 하나 또는 그 이상의 H1L1, H2L1, 및 H4L4 산물-연합된 변이체를 포함할 수 있다.

이 방법은 전술한 에탄올 볼루스가 없을 때 달성되는 전술한 방법과 비교하여 전술한 항체의 순도를 증가시킨다.

단계 (b)는 단계 (c)에 앞서 달성될 수 있다.

단계 (b)는 단계 (c)에 후속적으로 달성될 수 있다.

단계 (b)는 단계 (c)와 동시에 달성될 수 있다.

단계 (b)는 전술한 배양물에서 약 0.01% 내지 약 4% (w/v)의 에탄올 농도를 초래할 수 있다.

단계 (b)는 전술한 배양물에서 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%의 에탄올 농도를 초래할 수 있다.

단계 (b)는 전술한 배양물에서 최소한 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.10%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.6%, 0.6%, 0.7%, 0.8% 또는 0.9% (w/v)의 에탄올 농도를 초래할 수 있다.

단계 (b)는 많아야 약 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.8%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.35%, 0.3%, 0.25%, 0.2%, 또는 0.15% (w/v)인 에탄올 농도를 초래할 수 있다.

단계 (b)는 에탄올을 전술한 배양물에 추가, 에탄올을 포함하는 운반체를 전술한 배양물에 추가, 에탄올을 포함하는 배지 또는 운반체에 전술한 세포들을 추가, 또는 배양 배지의 일부를 대체하는 것을 포함할 수 있다.

전술한 에탄올 볼루스는 1 내지 20 분 사이의 기간에 걸쳐 배양 배지에 추가될 수 있다.

단계 (c)는 전술한 세포들에 산소를 제공하는 것을 포함할 수 있다.

전술한 산소의 제공은 전술한 배양물을 교반시키는 것을 포함할 수 있다.

전술한 산소의 제공은 산소를 포함하는 가스 혼합물에 전술한 배양물을 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.

단계 (c)는 전술한 배양물에 탄소 원천을 포함하는 사료(feed)를 추가하는 것을 포함할 수 있다.

전술한 사료는 최소한 하나의 발효가능한 탄소 원천을 포함할 수 있다.

전술한 사료는 하나 또는 그 이상의 포도당, 에탄올, 구연산염, 소르비톨, 크실로오스, 트레할로스, 아라비노즈, 갈락토오즈, 프락토오즈, 멜리비오스, 락토즈, 말토즈, 람노즈, 리보즈, 만노즈, 만니톨, 그리고 라피노즈를 포함할 수 있다.

이 방법은 단계 (c) 동안 상위 설정점과 하위 설정점 사이에서 에탄올 농도를 유지시키는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 하위 설정점(lower set point)은 약 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.10%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.6%, 0.6%, 0.7%, 0.8% 또는 0.9% (w/v)일 수 있다.

전술한 상위 설정점(upper set point)은 약 4%, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.8%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.35%, 0.3%, 0.25%, 0.2%, 또는 0.15% (w/v)일 수 있다.

전술한 상위 설정점은 많아야 약 1.5%, 1.4%, 1.3, 1.2%, 또는 1.1% (w/v)일 수 있다.

이 방법은 단계 (c) 동안 설정점에서 에탄올 농도를 유지시키는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 설정점은 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 또는 1.5% (w/v)일 수 있다.

단계 (c)는 전술한 배양물에서 약 0.01% 내지 약 4%, 약 0.02% 내지 약 3.75%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.08% 내지 약 3.25%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.2% 내지 약 2.75%, 약 0.3% 내지 약 2.5%, 약 0.4% 내지 약 2.25%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.6% 내지 약 1.75%, 약 0.7% 내지 약 1.5%, 또는 약 0.8% 내지 약 1.25%의 에탄올 농도를 유지시키는 것을 포함한다.

전술한 배양물에서 에탄올 농도는 전술한 세포들에 의해 에탄올 생산을 조절하거나 또는 에탄올을 전술한 배양물에 추가함으로써 유지될 수 있다.

에탄올의 생산 조절 단계는 포도당 농도의 조절, 산소 이용성, 교반 강도, 가스 압력, 공급된 공기 또는 다른 기체 혼합물의 유동 속도, 배양물의 점성, 배양물의 밀도, 공급된 공기 또는 다른 기체 혼합물 안에 산소의 농도 및 온도중 하나 또는 그 이상을 조절하는 것을 포함할 수 있다.

단계 (a)와 단계 (b) 사이에 시간은 약 72 시간 미만, 약 48 시간 미만, 약 24 시간 미만, 약 12 시간 미만, 약 9 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4 시간 미만, 약 3 시간 미만, 약 90 분, 약 30 분, 약 5 분, 또는 약 1 분 미만일 수 있다.

단계 (b)와 단계 (c)의 시간은 약 10 시간 미만, 약 9 시간 미만, 약 8 시간 미만, 약 7 시간 미만, 약 6 시간 미만, 약 5 시간 미만, 약 4 시간 미만, 약 3 시간 미만, 약 2 시간 미만, 약 90 분 미만, 약 80 분 미만, 약 70 분 미만, 약 60 분 미만, 약 50 분 미만, 약 40 분 미만, 약 30 분 미만, 약 20 분 미만, 약 10 분 미만, 약 5 분 미만, 또는 약 1 분 미만일 수 있다.

단계 (a)의 배양물은 탄소 원천을 전술한 배양에 추가하고, 이 탄소 원천이 고갈될 때까지 전술한 배양물을 배양함으로써 만들어질 수 있다.

전술한 탄소 원천은 다음중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 글리세롤, 포도당, 에탄올, 구연산염, 소르비톨, 크실로오스, 트레할로스, 아라비노즈, 갈락토오즈, 프락토오즈, 멜리비오스, 락토즈, 말토즈, 람노즈, 리보즈, 만노즈, 만니톨, 및 라피노즈.

탄소 원천의 고갈은 전술한 진핵세포의 대사 활성의 감소를 탐지함으로써 결정될 수 있다.

전술한 진핵세포의 대사 활성의 전술한 감소는 전술한 진핵세포에 의한 산소 소비의 감소를 탐지하고, 배양물에서 pH 증가를 탐지하고, 세포 습중량의 안정화를 탐지하고, 또는 배양물에서 암모니아 농도의 증가를 탐지함으로써 확인될 수 있다.

전술한 진핵세포에 의한 산소 소비의 전술한 감소는 전술한 배양물에서 용존 산소의 농도 증가를 탐지함으로써 확인될 수 있다.

전술한 진핵세포는 효모 세포들을 포함할 수 있다.

전술한 효모 세포들은 메틸영양성 효모를 포함할 수 있다.

전술한 메틸영양성 효모는 피치아(Pichia) 속일 수 있다.

피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.

피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 다음으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 및 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera).

전술한 다수의 아단위 복합체의 발현을 위하여 제공되는 유전자는 하나 또는 그 이상의 게놈 좌에 통합에 통합될 수 있다.

최소한 하나의 전술한 유전자 좌(genomic locus)는 pGAP 좌, 3' AOX TT 좌; PpURA5; OCH1; AOX1; HIS4; GAP; pGAP; 3' AOX TT; ARG; 그리고 HIS4 TT 좌로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위를 인코드하는 최소한 하나의 유전자는 유도성 또는 구성 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다.

전술한 유도성 프로모터는 AOX1, CUP1, 테트라사이클린 유도성, 티아민 유도성, 및 FLD1 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위를 인코드하는 유전자들의 최소한 하나는 CUP1, AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, 이로부터 유도된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 그리고 조류 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다.

전술한 진핵세포는 이배체, 사배체 세포, 또는 다배수체일 수 있다.

이 방법은 전술한 진핵세포 또는 배양 배지로부터 전술한 다수의 아단위 복합체를 정제하는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 전술한 진핵세포의 세포내성분, 세포질, 핵질, 또는 막으로부터 정제될 수 있다.

전술한 진핵세포는 전술한 다수의 아단위 복합체를 배양 배지로 분비한다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 전술한 배양 배지로부터 정제될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체를 포함한다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

전술한 인간화된 항체는 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 양, 또는 소의 기원일 수 있다.

전술한 인간화된 항체는 토끼 기원일 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 단가, 이가, 또는 다가 항체를 포함할 수 있다.

전술한 항체는 단백질 A 및/또는 단백질 G 친화력에 의해 전술한 배양물로부터 정제될 수 있다.

전술한 패널에서 전술한 진핵세포들중 최소한 하나에서 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 최소한 하나의 유전자는 전술한 진핵세포에서 발현에 대해 최적화될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 항체를 포함할 수 있고, 그리고 전술한 항체의 순도는 전술한 진핵세포에 의해 생산되는 예측된 겉보기 유체역학 반경을 보유하는 항체 복합체에 포함될 수 있는, 예측된 분자량을 보유하는 항체 복합체에 포함될 수 있는, 및/또는 전술한 항체의 표적에 특이적으로 결합하는 이 항체의 분획을 측정함으로써 평가될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 항체를 포함할 수 있고, 그리고 전술한 항체의 산출량은 비정상적으로 당화될 수 있는, 예측된 겉보기 유체역학 반경을 보유하는 항체 복합체에 포함된, 예측된 분자량을 보유하는 항체 복합체에 포함된 항체 복합체 이외의 항체 복합체에 포함된, 및/또는 전술한 항체의 표적에 특이적으로 결합하지 못한 임의의 산물-연합된 변이체를 차감하여 전술한 진핵세포에 의해 생산된 항체의 양을 측정함으로써 평가될 수 있다.

전술한 항체 복합체들의 분자량은 비-환원 SDS-PAGE에 의해 결정될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 항체를 포함할 수 있고, 전술한 방법은 전술한 항체를 정제하는 것을 더 포함할 수 있다.

전술한 배양 세포는 최소한 100 mg/L, 최소한 150 mg/L, 최소한 200 mg/L, 최소한 250 mg/L, 최소한 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L, 최소한 1000 mg/L, 최소한 1250 mg/리터, 최소한 1500 mg/리터, 최소한 약 1750 mg/리터, 최소한 약 2000 mg/리터, 최소한 약 10000 mg/리터, 또는 그 이상의 상청액 항체 역가를 생산할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위는 하나 이상의 유전자 복사체로부터 발현될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 전술한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개 복사체와 전술한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개의 복사체로부터 발현될 수 있는 항체를 포함할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체의 발현을 제공하는 유전자들은 전술한 세포들의 게놈 안으로 통합될 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체의 발현을 위하여 제공되는 유전자는 염색체이외의 요소(element), 플라스미드, 또는 인공 염색체 상에 함유될 수 있다.

전술한 세포들은 전술한 항체의 중쇄 발현을 제공하는 유전자 복사체보다는 전술한 항체의 경쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체를 더 많이 포함할 수 있다.

전술한 세포들에서 전술한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수와 전술한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수는 각각 다음과 같을 수 있다: 2와 2, 2와 3, 3과 3, 3과 4, 3과 5, 4와 3, 4와 4, 4와 5, 4와 6, 5와 4, 5와 5, 5와 6, 또는 5와 7.

전술한 세포들에서 전술한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수와 전술한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수는 각각 다음과 같을 수 있다: 2와 1, 3과 1, 4와 1, 5와 1, 6과 1, 7과 1, 8과 1, 9와 1, 10과 1, 1과 2, 2와 2, 3과 2, 4와 2, 5와 2, 6과 2, 7과 2, 8과 2, 9와 2, 10과 2, 1과 3, 2와 3, 3과 3, 4와 3, 5와 3, 6과 3, 7과 3, 8과 3, 9와 3, 10과 3, 1과 4, 2와 4, 3과 4, 4와 4, 5와 4, 6과 4, 7과 4, 8과 4, 9와 4, 10과 4, 1과 5, 2와 5, 3과 5, 4와 5, 5와 5, 6과 5, 7과 5, 8과 5, 9와 5, 10과 5, 1과 6, 2와 6, 3과 6, 4와 6, 5와 6, 6과 6, 7과 6, 8과 6, 9와 6, 10과 6, 1과 7, 2와 7, 3과 7, 4와 7, 5와 7, 6과 7, 7과 7, 8과 7, 9와 7, 10 과 7, 1과 8, 2와 8, 3과 8, 4와 8, 5와 8, 6과 8, 7과 8, 8과 8, 9와 8, 10과 8, 1과 9, 2와 9, 3과 9, 4와 9, 5와 9, 6과 9, 7과 9, 8과 9, 9와 9, 10과 9, 1과 10, 2와 10, 3과 10, 4와 10, 5와 10, 6과 10, 7과 10, 8과 10, 9와 10, 10과 10.

단계 (c)의 배양물은 생산 배지에서 성장될 수 있다.

전술한 생산 배지는 최소(minimal) 배지일 수 있다.

전술한 최소 배지는 선택성 물질들이 부족하다.

전술한 최소 배지는 사전-형성된 아미노산들 또는 기타 복합체 생물분자들이 부족하다.

생산 배지는 복합체 배지일 수 있다.

복합체 배지는 하나 또는 그 이상의 효모 추출물, 콩 펩톤, 및 기타 식물 펩톤을 포함할 수 있다.

단계 (c)의 배양물은 높은 세포 밀도로 성장될 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 50 g/L일 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 100 g/L일 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 300 g/L일 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 400 g/L일 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 500 g/L일 수 있다.

전술한 높은 세포 밀도는 최소한 750 g/L일 수 있다.

효모 세포들은 최소한 20회 배증(doublings)을 위하여 배양되었고, 전술한 최소한 20회 배증이후 전술한 다수의 아단위 복합체의 발현 수준은 높게 유지시킨다.

단계 (c)의 세포들은 최소한 50회 배증을 위하여 배양되었고, 전술한 최소한 50회 배증이후 전술한 다수의 아단위 복합체의 발현 수준은 높게 유지시킨다.

단계 (c)의 세포들은 최소한 100회 배증을 위하여 배양되었고, 전술한 최소한 100회 배증이후 전술한 다수의 아단위 복합체의 발현 수준은 높게 유지시킨다.

전술한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위는 분비 신호를 포함할 수 있다.

전술한 다수의 아단위 복합체는 항체를 포함할 수 있다.

해당 방법은 최소한 100 mg/L, 최소한 150 mg/L, 최소한 200 mg/L, 최소한 250 mg/L, 최소한 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L 또는 1000 mg/L 초과 가령, 1200 mg/L 정도로 높은, 10,000 mg/L 정도로 높은, 또는 더 높은 상청액 항체 역가를 생산할 수 있다.

또다른 측면에서, 본 명세서는 전술한 임의의 방법에 의해 바람직한 다수의 아단위 복합체, 이를 테면 바람직한 항체를 더 높은 산출량 및/또는 순도로 생산하는 숙주 세포로써 확인된 숙주 세포를 제공한다. 이 숙주 세포는 피치아(Pichia) 속, 이를 테면 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포의 이배체 또는 사배체 세포일 수 있다. 또다른 측면에서, 본 명세서는 전술한 숙주 세포로부터 유도된 이배체 또는 사배체 효모 배양물을 제공한다. 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체, 이를 테면 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄의 아단위의 발현을 제공하는 유전자들은 전술한 숙주 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있다. 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 아단위들, 이를 테면 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 제공하는 유전자는 염색체이외의 요소, 플라스미드, 또는 인공 염색체 상에 함유될 수 있다. 바람직한 다수의 아단위 복합체가 항체인 경우, 이 숙주 세포는 중쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복사체보다는 경쇄의 발현을 제공하는 유전자의 복사체를 더 많이 포함할 수 있다. 예시적인 구체예들에서, 이 숙주 세포는 경쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개 복사체와 중쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개의 복사체를 포함할 수 있다. 전술한 숙주 세포에서 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체수와 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수는 각각 다음과 같을 수 있다: 2와 2, 2와 3, 3과 3, 3과 4, 3과 5, 4와 3, 4와 4, 4와 5, 4와 6, 5와 4, 5와 5, 5와 6, 또는 5와 7. 중쇄 및 경쇄 유전자 복사체 수의 추가 예시적인 조합은 도 37에서 열거되고 있으며, 이 도면에서 식별자 H2xL1, H3xL1, H4xL1, H5xL1, H6xL1, H7xL1, H8xL1, H9xL1, H10xL1, H1xL2, H2xL2, H3xL2, H4xL2, H5xL2, H6xL2, H7xL2, H8xL2, H9xL2, H10xL2, H1xL3, H2xL3, H3xL3, H4xL3, H5xL3, H6xL3, H7xL3, H8xL3, H9xL3, H10xL3, H1xL4, H2xL4, H3xL4, H4xL4, H5xL4, H6xL4, H7xL4, H8xL4, H9xL4, H10xL4, H1xL5, H2xL5, H3xL5, H4xL5, H5xL5, H6xL5, H7xL5, H8xL5, H9xL5, H10xL5, H1xL6, H2xL6, H3xL6, H4xL6, H5xL6, H6xL6, H7xL6, H8xL6, H9xL6, H10xL6, H1xL7, H2xL7, H3xL7, H4xL7, H5xL7, H6xL7, H7xL7, H8xL7, H9xL7, H10xL7, H1xL8, H2xL8, H3xL8, H4xL8, H5xL8, H6xL8, H7xL8, H8xL8, H9xL8, H10xL8, H1xL9, H2xL9, H3xL9, H4xL9, H5xL9, H6xL9, H7xL9, H8xL9, H9xL9, H10xL9, H1xL10, H2xL10, H3xL10, H4xL10, H5xL10, H6xL10, H7xL10, H8xL10, H9xL10, H10xL10을 보유하는 균주들을 포함하는, 중쇄 및/또는 경쇄 유전자의 최대 10개 복사체를 보유하는 조합이 열거된다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄 유전자 복사체의 명시된 숫자는 직렬식으로(tandemly) 단일 좌, 또는 다수의 좌 (하나 이상의 복사체를 함유할 수 있는 임의의 또는 모든 좌)로 통합될 수 있다. 임의선택적으로, 각 게놈 좌는 단지 3개 또는 4개의 직렬식으로 통합된 유전자 복사체를 함유할 수 있고, 이로 인하여 증식 및/또는 항체 생산하는 동안 복사체 수의 안정성을 촉진시킬 수 있다.

배양은 대부분 전형적으로 세포들에게 에너지 원천, 산소 및 영양분을 제공하는 것과 관련된다. 재조합 단백질들의 발현을 위하여 P. 파스토리스(P. pastoris) 발효를 기획 및 세포 밀도, 배양액 용적, 기질 공급 속도의 최적화 및 반응의 각 단계의 길이를 포함한 최적화 방법들이 문헌에 또한 공지되어 있다. Zhang et al., "Rational Design and Optimization of Fed-Batch and Continuous Fermentations" in Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology, vol. 389, Humana Press, Totowa, N.J., pgs. 43-63. 배양물에는 산소를 포함하는 기체 혼합물, 이를 테면, 산소 공급과 함께 또는 산소 공급 없는 대기가 제공된다. 효모 배양물은 배양 배지에서 배양될 수 있는데, 이 배지는 최소 배지일 수 있고, 선택성 물질들이 없을 수 있고, 및/또는 사전-형성된 아미노산들 또는 기타 복합체 생물분자들이 없을 수 있다. 배양 배지는 복합체 배지 (가령, 효모 추출물 및/또는 식물 펩톤(들)을 함유하는)일 수도 있다. 이 배지는 질소 원천 (가령, 염화 메틸아민, NH4SO4, 효모 추출물, 콩 펩톤, 기타 식물 펩톤, 등)을 포함할 수 있다. 예시적인 최소 배지는 최소 덱스트로오즈 배지 (MD) (1.34% 효모 질소 베이스(YNB) (w/o 아미노산들), 4 × 10^-5% 바이오틴, 그리고 2% 포도당), 완충된 최소 글리세롤 복합체 배지 (BMGY) (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 1% 글리세롤, 1.34% YNB (w/o 아미노산들), 4 × 10-5% 바이오틴 그리고 100 mM 인산칼륨(pH 6.0))을 포함한다. 배지는 하나 또는 그 이상의 염(이를 테면 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (이를 테면 인산칼륨, 트리스(Tris), 또는 HEPES), 뉴클레오시드 (이를 테면 아데노신 및 티미딘), 항생제 (가령, 오염물질의 성장을 억제 또는 선택성 지표들의 유지를 위하여 추가됨), 미량 요소들, 그리고 포도당 또는 또다른 에너지 원천을 포함할 수 있다. 임의의 보충물 및 대체물이 당업계에 숙련자들에게 알려진 적절한 농도로 또한 포함될 수 있다.

배양물은 높은 세포 밀도, 이를 테면 최소한 50 g/L, 최소한 100 g/L, 최소한 300 g/L, 최소한 400 g/L, 최소한 500 g/L, 또는 최소한 700 g/L로 성장될 수 있다. 이들 배양물 밀도는 제한하기 위함이 아닌 설명을 위함이며, 적절한 배양물 밀도는 당업계 숙련자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

효모 세포들은 최소한 20 배증이 되도록 배양되며, 전술한 최소한 20 배증이후 전술한 항체의 높은 발현 수준은 유지될 수 있다.

효모 세포들은 최소한 50 배증이 되도록 배양되며, 전술한 최소한 50 배증이후 전술한 항체의 높은 발현 수준은 유지될 수 있다.

효모 세포들은 최소한 100 배증이 되도록 배양되며, 전술한 최소한 100 배증이후 전술한 항체의 높은 발현 수준은 유지될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 명세서는 전술한 임의의 방법에 따라 생산된 안정적인 이배체 피치아(Pichia) 효모 배양물을 함유하는 배양 배지를 제공하고, 이때 배양 배지는 최소한 약 50 mg/리터, 100 mg/리터, 500 mg/리터, 750 mg/리터, 1000 mg/리터, 1250 mg/리터, 1500 mg/리터, 1750 mg/리터, 2000 mg/리터, 또는 그 이상의 전술한 바람직한 항체의 발현 수준을 포함할 수 있다. 이들 산출량 값은 제한을 위한 것이 아니라 설명을 위한 것이다. 임의선택적으로, 산출량은 예를 들면 Zhang et al. (2007), 상기,에서 설명된 방법들과 일반적인 방식을 이용하여 최적화될 수 있다. 예를 들면, 산출량은 온도, pH, 배지 조성물 (가령, 탄소 원천, 탄소 원천 농도, 두 가지 또는 그 이상 탄소 원천의 혼합물, 질소 원천 및 농도, KH₂PO₄, K₂HPO₄, MgSO₄, 황산칼륨, 구연산 나트륨염, 황산칼륨, 구연산 나트륨염을 포함하는 염 및 영양분의 농도, 미량 금속들 이를 테면 염화 코발트, 황산제이구리, 요오드화 나트륨, 황산망간, 몰리브덴산 나트륨염, 붕산, 염화 아연, 황산제일철, 비타민 이를 테면 바이오틴, 이노시톨, 티아민, 펩톤, 효모 추출물, 카사미노 산, 요소, 인산암모늄 또는 기타 암모늄 이온, L-아르기닌-히드로클로라이드), 시간, 배양 밀도, 산소처리, 그리고 산출량에 영향을 주는 다른 인자들을 변화시킴으로써 최적화될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량, 발현 및/또는 순도는 일부 경우에서 바람직한 설정점, 가령, 약 15℃ 내지 약 30 ℃, 이를 테면 약 17 ℃ 내지 약 25 ℃과 같은 설정점에서 그 온도를 유지함으로써 개선될 수 있다). 이론에 제한시키려는 의도는 없지만, 온도를 조절하면 폴딩과 해독후 프로세싱 경로를 통한 세포내 이동을 지원할 수 있고, 및/또는 세포의 프로테아제 활성을 감소시킬 수 있다. 유사하게, 일부 경우에서 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량, 발현 및/또는 순도는 배양 배지의 pH를 바람직한 설정점, 가령, pH 3 내지 pH 8 사이 이를 테면 pH 4 내지 pH 7에 유지시킴으로써 개선될 수 있다.

또다른 측면에서, 본 명세서는 전술한 바람직한 항체를 배양 배지로 발현시키는 전술한 방법에 따라 생산된 안정적인 이배체 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 배양물을 함유하는 배양 배지를 제공하는데, 이때 전술한 배양물 안에 전술한 이배체 세포들의 세포 밀도는 최소한 약 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 700 g/L 또는 그 이상일 수 있다. 이들 배양물 밀도는 한정시키기 위함이 아니라 설명을 위한 것이며, 적절한 배양물 밀도는 당업계 숙련자들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

전술한 항체 또는 다른 다수의 아단위 단백질의 최소한 하나의 아단위는 분비 신호, 이를 테면 S. 닭 라이소자임 (CLY) 신호 펩티드; CLY-L8; S. 세레비시에(S. cerevisiae) 전화효소 (SUC2) 신호 펩티드; MF-알파 (Prepro); MF-알파 (Pre)-apv; MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR; MF-알파 (Prepro)-(EA)3; αF 신호 펩티드; KILM1 신호 펩티드; 억제성 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩티드; A. 나이거(niger) GOX 신호 펩티드; 쉬반이노시메스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 글루코아밀라제 유전자 (GAM1) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열 없는 인간 혈청 알부민(HSA) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열과 함께 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드; ISN 신호 펩티드; IFN 신호 펩티드; HGH 신호 펩티드; 피토헤마글루티닌 (PHA); 누에(Silkworm) 라이소자임; 인간 라이소자임 (LYZ1); 액티빈 수용체 유형-1; 액티빈 유형 II 수용체; P. 파스토리스(P. pastoris) 면역글로블린 결합 단백질 (PpBiP); 인간 항체 3D6 경쇄 리더; 그리고 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

2개의 반수체 효모 세포들을 교배시킴으로써 숙주 세포가 생성될 수 있는데, 이들 각 반수체 세포들은 전술한 항체 또는 다른 다수의 아단위 단백질의 하나 또는 그 이상의 아단위를 인코드하는 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 함유한다.

도 1은 바람직한 항체 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드하는 유전자의 특정 목표 수의 복사체를 함유하는 반수체 균주를 획득하는 예시적인 방법과 경쇄 및 중쇄 유전자의 특정 목표수의 복사체로부터 바람직한 항체를 발현시키는 이배체 균주의 패널을 획득하기 위하여 반수체 균주들을 교배시키는 예시적인 방법의 총람을 제공한다.
도 2는 Ab-A의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수가 증가된 것을 포함하는 선택된 이배체 균주들로부터 H3xL3 균주에 비교하여 상대적인 전체 항체 산출량을 그래프로 설명한다. H3xL3 산출량을 100%으로 설정하고, 상대적인 전체 배양액(broth) 항체 역가는 H3xL4, H3xL3, H4xL4, H4xL6, H5xL4, H5xL5, 및 H5xL7의 순서로 항체 전체 복사체 수가 증가되면 일반적으로 증가되었다.
도 3은 Ab-B의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수가 증가된 것을 포함하는 균주들로부터 H3xL3 균주에 비교하여 상대적인 전체 항체 산출량을 그래프로 설명한다. H3xL3 항체 산출량을 100%으로 설정하고, 상대적인 전체 배양액 항체 역가는 H3xL3, H3xL4, H4xL3, H4xL5, 및 H4xL6의 순서로 항체 전체 복사체 수가 증가되면 일반적으로 증가되었다.
도 4는 Ab-C의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수가 증가된 것을 포함하는 균주들로부터 H3xL3 균주에 비교하여 상대적인 전체 항체 산출량을 그래프로 설명한다. H3xL3 항체 산출량을 100%으로 설정하고, 상대적인 전체 배양액 항체 역가는 Ab-C-H3xL4, Ab-C-H4xL3, Ab-C-H4xL4, Ab-C-H4xL5, Ab-C-H5xL5, Ab-C-H5xL4, Ab-C-H5xL6, 및 Ab-C-H6xL5의 순서로 항체 전체 복사체 수가 증가되면 일반적으로 증가되었다.
도 5A-E는 H4xL4 및 H4xL6 균주들로부터 생산된 Ab-A의 단백질-A 포획 용출액(eluate)의 순도는 HPLC에 의해 측정된 것을 보여준다. 15.5분에서 이동된 산물-연합된 변이체의 수준(전체 통합된 면적의 비율로 측정됨)은 5배 이상 감소되었다(H4xL4에서 8.81로부터 H4xL6에서 1.58%로 낮아졌다).
도 6A-E는 H4xL3 및 H4xL5 균주들로부터 생산된 Ab-B의 단백질-A 포획 용출액의 순도는 HPLC에 의해 측정된 것을 보여준다. 15.5분에서 이동된 산물-연합된 변이체의 수준(전체 통합된 면적의 비율로 측정됨)은 59% 감소되었다(H4xL3에서 6.26%로부터 H4xL5에서 2.54%로 낮아졌다).
도 7A-E는 HexL3 및 H5xL5 균주들로부터 생산된 Ab-C의 단백질-A 포획 용출액의 순도는 HPLC에 의해 측정된 것을 보여준다. 15.2분에서 16.1분으로 이동된 산물-연합된 변이체의 수준(전체 통합된 면적의 비율로 측정됨)은 약 39% 감소되었다(H3xL3에서 6.55%로부터 H5xL5에서 4.00%로 낮아졌다).
도 8은 H4xL4 및 H4xL6 균주들로부터 생산된 Ab-A의 착색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 관찰된 "낮은-운동성 산물-연합된 변이체" (화살표)는 더 높은 경쇄 복사체 수를 가진 균주로부터의 조제물(preparation)에서 덜 풍부하였다.
도 9는 H4xL5 및 H4xL6 균주들로부터 생산된 단백질-A 정제된 Ab-B의 착색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. Ab-A에서와 같이, 관찰된 "낮은-운동성 산물-연합된 변이체" (화살표)는 더 높은 경쇄 복사체 수를 가진 균주로부터의 조제물에서 덜 풍부하였다.
도 10은 H3xL3 및 H5xL5 균주들로부터 생산된 단백질-A 정제된 Ab-C의 착색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. Ab-A 및 Ab-B에서와 같이, 관찰된 "낮은-운동성 산물-연합된 변이체" (화살표)는 더 높은 항체 쇄 복사체 수를 가진 균주로부터의 조제물에서 덜 풍부하였다.
도 11은 인간 Fc에 관련된 당화된 단백질로써 낮은-운동성 산물-연합된 변이체의 확인을 보여준다(렉틴 컬럼에 의한 이의 선택성 풍부함과 항-Fc 항체에 의한 특이적 인지에 의해 설명됨). 항체 조제물 ("로드(Load)")은 렉틴 수지에 결합되었고, 용리되었다("렉틴 용출액"). SDS-PAGE (도 11A)는 렉틴 컬럼에 의해 낮은-운동성 산물-연합된 변이체의 선택성 풍부함을 설명한다. 항-HuFc 항체 (도 11A)를 이용한 웨스턴 블랏팅은 낮은-운동성 산물-연합된 변이체를 탐지하였는데, 이것이 최소한 부분적인 인간 Fc 서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 이 산물-연합된 변이체는 "당-중쇄 변이체(glyco-heavy variant)"으 지칭된다. 추가적으로, 이 산물-연합된 변이체의 양은 균주 H4xL3과 비교하여 균주 H4xL5의 항체 제조물에서 뚜렷하게 감소되었다.
도 12A-D 및 13A-D는 HPLC (대략적으로 15.5 분의 유지 시간(retention time)을 가짐)에 의해 관찰된 산물-연합된 변이체는 렉틴 컬럼 용출액에서 선택적으로 풍부함을 설명하는데, 이것은 당-중쇄 변이체가 이 산물-연합된 변이체의 구성분임을 나타낸다. 항체 Ab-B는 H4xL3 및 H4xL5 균주들로부터 조제되었다.
도 14는 Ab-A 또는 Ab-B를 위한 항체 중쇄 서열이 pGAP 좌 (좌(Locus) # 1)로 표적 통합에 이용된 구조체의 지도를 보여준다.
도 15는 Ab-A 또는 Ab-B를 위한 항체 경쇄 서열이 pGAP 좌 (좌(Locus) # 1)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 16은 Ab-A 또는 Ab-B를 위한 항체 중쇄 서열이 HIS4 TT 좌 (좌(Locus) # 2)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 17은 Ab-A 또는 Ab-B를 위한 항체 경쇄 서열이 HIS4 TT 좌 (좌(Locus) # 2)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 18은 Ab-C를 위한 항체 중쇄 서열이 AOX1 TT 좌 (좌(Locus) # 1)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 19는 Ab-C를 위한 항체 경쇄 서열이 AOX1 TT 좌 (좌(Locus) # 1)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 20은 Ab-C를 위한 항체 중쇄 서열이 HIS4 TT 좌 (좌(Locus) # 2)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 21은 Ab-C를 위한 항체 경쇄 서열이 HIS4 TT 좌 (좌(Locus) # 2)로의 표적 통합에 이용되는 구조체의 지도를 보여준다.
도 22는 단일 좌에 통합된 항체 복사체 수와 서든 블랏에 의해 탐지가능한 예측된 단편 크기 간에 상관관계를 설명한다.
도 23 및 24는 Ab-A 쇄들을 인코드하는 유전자로 변형된 다수의 분리체에서 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자 각각의 복사체 수를 탐지하는데 이용된 서든 블랏을 보여준다.
도 25-27은 변형된 반수체 균주들의 교배에 의해 생산된 이배체 균주들의 패널에서 pGAP (도 25-26)와 HIS4 TT (도 27) 좌에 존재하는 Ab-A 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수를 확인하는데 이용된 서던 블랏을 나타낸다.
도 28A-B은 Ab-B 쇄들을 인코드하는 유전자로 변형된 다수의 분리체에서 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자 각각의 복사체 수를 탐지하는데 이용된 서든 블랏을 보여준다.
도 29-31은 변형된 반수체 균주들의 교배에 의해 생산된 이배체 균주들의 패널에서 pGAP (도 29-30)와 HIS4 TT (도 31) 좌에 존재하는 Ab-B 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수를 확인한 서던 블랏을 나타낸다.
도 32-33은 Ab-C 쇄들을 인코드하는 유전자로 변형된 다수의 분리체에서 항체 중쇄 유전자 및 경쇄 유전자 각각의 복사체 수를 탐지하는데 이용된 서든 블랏을 보여준다.
도 34-36은 변형된 반수체 균주들의 교배에 의해 생산된 이배체 균주들의 패널에서 3' AOX TT (도 34-35)와 HIS4 TT (도 36) 좌에 존재하는 Ab-C 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수를 확인한 서던 블랏을 나타낸다.
도 37은 본 명세서의 구체예에 따라 이용될 수 있는 경쇄 및 중쇄 유전자 복사체 수의 예시적인, 비-제한적인 조합을 설명한다.
도 38은 Ab-A 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 서열 및 이들이 인코드하는 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라 여기에 포함된 CDR 서열들을 나타낸다.
도 39는 Ab-B 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 서열 및 이들이 인코드하는 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라 여기에 포함된 CDR 서열들을 나타낸다.
도 40은 Ab-C 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 서열 및 이들이 인코드하는 폴리펩티드 서열을 나타낸다.

본 명세서는 바람직한 이종기원의 다수의 아단위 복합체의 증가된 산출량을 생산살 수 있는 및/또는 개선된 순도를 보유하는 바람직한 이종기원의 다수의 아단위 복합체를 생산할 수 있는 숙주 세포를 만들고 이를 식별하는 방법들을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이종기원의 다수의 아단위 복합체는 항체 또는 항체 단편, 이를 테면 2개 중쇄 아단위와 2개 중쇄 아단위를 포함하는 인간화된 항체다. 바람직한 숙주 세포들은 효모를 포함하고, 특히 바람직한 효모는 메틸영양성 효모 균주들, 가령, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) (피치아 앙구스타(Pichia angusta)), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera), 및 기타(가령, 미국 특허 4,812,405, 4,818,700, 4,929,555, 5,736,383, 5,955,349, 5,888,768, 및 6,258,559 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)를 포함한다. 이 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들면, 유전자 복사체 수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포들의 패널은 개별 아단위 유전자의 복사체 수를 변화시킨 것을 포함하는 세포들을 교배함으로써 만들어질 수 있다 (이들 복사체 수는 교배에 앞서 아는 것이 바람직하다).

출원인들은 배양물이 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 안정적인 높은 복사체 수를 유지할 수 있다는 예상치 못한 사실을 발견하였다. 작업 실시예들은 항체 중쇄 및 경쇄-인코드 유전자를 최대 6 또는 7개 복사체까지 유지하는 세포를 설명한다. 이들 세포는 장기간 배양 기간 동안에 조차도 바람직한 항체를 안정적으로 발현시킬 수 있다. 추가적으로, 세포들은 장기간 배양 기간 이후에도 바람직한 다수의 아단위 복합체의 높은 산출량과 발현을 유지시킬 수 있다.

바람직한 구체예에서, 이 숙주 세포는 이종기원의 단백질 아단위를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 유전자의 하나 이상의 복사체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 아단위 유전자의 다수의 복사체는 하나 또는 그 이상의 염색체 좌로 직렬로 통합될 수 있다. 직렬로 통합된 유전자 복사체는 다수의 아단위 복합체의 생산을 위한 배양 동안 안정적인 수의 복사체로 바람직하게 유지된다. 예를 들면, 하기에서 설명되는 실시예들에서, 유전자 복사체 수는 경쇄 및 중쇄 항체 유전자의 3 내지 4개 직렬로 통합된 복사체를 함유하는 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주의 경우 일반적으로 안정적이었다.

이종기원의 단백질 아단위를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 유전자는 숙주 세포의 하나 또는 그 이상의 염색체 좌로 바람직하게 통합된다. 유전자간(intergenic) 서열, 프로모터 서열, 코딩 서열, 종료 서열, 조절 서열, 등을 포함하는 임의의 적합한 염색체 좌가 통합에 이용될 수 있다. P. 파스토리스(P. pastoris)에서 이용될 수 있는 예시적인 염색체 좌는 PpURA5; OCH1 ; AOX1 ; HIS4; 그리고 GAP를 포함한다. 인코딩 유전자들은 표적이 아닌 하나 또는 그 이상의 무작위 염색체 좌로 또한 통합될 수 있다. 바람직한 구체예들에서, 염색체 좌는 pGAP 좌, 3'AOX TT 좌 그리고 HIS4 TT 좌로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 예시적인 구체예들에서, 이종기원의 단백질 아단위를 인코드하는 유전자는 하나 또는 그 이상의 염색체이외의 요소, 예를 들면 하나 또는 그 이상의 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.

예시적인 구체예들에서, 다수의 아단위 단백질은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상 동일하지 않는 아단위를 포함할 수 있다. 추가적으로, 각 아단위는 다수의 아단위 단백질 각각에 하나 또는 그 이상의 횟수로 존재할 수 있다. 예를 들면, 다수의 아단위 단백질은 다중-특이적 항체 이를 테면, 2개의 동일하지 않은 경쇄와 2개의 동일하지 않은 중쇄를 포함하는 이중-특이적 항체일 수 있다. 유전자 복사체 수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포들의 패널은 개별 아단위 유전자의 가변적 복사체 수를 함유하는 세포들을 교배시킴으로써 신속하게 생성될 수 있다. 패널에서 각 균주로부터 항체 생산은 이를 테면 바람직하지 못한 부산물들에 비교하여 바람직한 다수의 아단위 단백질의 산출량 또는 바람직한 다수의 아단위 단백질의 순도와 같은 특징에 근거하여 추가 용도를 위한 균주를 식별하기 위하여 평가될 수 있다.

아단위는 단일시스트론성 유전자(monocistronic genes), 다시스트론성 유전자, 또는 이의 임의의 조합으로부터 발현될 수 있다. 각 다시스트론성 유전자는 동일한 소단위의 다수 복사체를 포함할 수 있고, 또는 각 상이한 아단위의 하나 또는 그 이상의 복사체를 포함할 수 있다.

피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 조작에 이용되는 예시적인 방법(배양, 변형 및 교배 방법 포함)은 미국 20080003643, 미국 20070298500, 및 미국 20060270045를 포함하는 공개된 출원들과, Higgins, D. R., and Cregg, J. M., Eds. 1998. Pichia Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J., 그리고 Cregg, J. M., Ed., 2007, Pichia Protocols (2nd edition), Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, N.J.에 공개되어 있으며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

이용될 수 있는 예시적인 발현 카세트는 분비 신호를 인코드 하는 서열에 융합된 글리세르알데히드 데히드로게나제 유전자 (GAP 유전자) 프로모터, 이어서 발현되는 유전자의 서열, 이어서 P. 파스토리스(P. pastoris) 알코올 산화효소 I 유전자 (AOX1)로부터 파스토리스(P. pastoris) 전사 종료 신호를 인코드하는 서열로 구성된다. 제오신(Zeocin) 저항성 표식 유전자는 더 높은 수준의 제오신 수준에 저항성인 형질변환체를 선택함으로써 균주에서 발현 벡터의 다수 통합된 복사체를 함유하는 균주들을 농축시키게 하는 수준을 제공할 수 있다. 유사하게, G418 또는 카나마이신(Kanamycin) 저항성 표식 유전자는 더 높은 수준의 게네티신(Geneticin) 또는 카나마이신에 저항성인 형질변환체를 선택함으로써 균주에서 발현 벡터의 다수 통합된 복사체를 함유하는 균주들을 농축시키게 하는 수단을 제공하는데 이용될 수 있다.

이용될 수 있는 숙주 균주들은 영양요구성(auxotrophic) P. 파스토리스(P. pastoris) 또는 기타 피치아(Pichia) 균주들, 예를 들면, met1, lys3, ura3 및 ade1 또는 기타 영양요구성-연관된 유전자에서 돌연변이를 보유하는 균주들을 포함한다. 바람직한 돌연변이는 임의의 상당한 빈도로 복귀돌연변이체(revertants)를 생성시킬 수 없고, 바람직하게는 부분적인 또는 더더욱 바람직하게는 완전한 결실 돌연변이체다. 바람직하게는, 자가영양성(prototrophic) 이배체 또는 사배체 균주들은 영양요구성 균주들의 상보성 세트의 교배에 의해 만들어진다.

반수체 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 형질변형과 P. 파스토리스(P. pastoris) 성 주기의 유전적 조작은 Pichia Protocols (1998, 2007), 상기에서 설명된 것과 같이 실시될 수 있다.

형질변환에 앞서, 이 숙주 세포 안에 표적 좌 안으로 벡터의 통합을 지휘하기 위하여 각 발현 벡터는 표적 게놈 좌(가령, GAP 프로모터 서열)에 상동성인 영역 안에서 제한효소 절단에 의해 선형화될 수 있다. 각 벡터의 시료는 전기천공 또는 다른 방법에 의해 바람직한 균주들의 배양물로 개별적으로 변형될 수 있고, 그리고 성공적인 형질변환체는 선택성 표지, 가령, 항생제 저항성 또는 영양요구성 상보 수단에 의해 선택될 수 있다. 분리체는 선택성 조건하에 단일 콜로니에 대해 선택되고, 스트리크(streaked)되고, 그 다음 각 균주로부터 추출된 게놈 DNA상에 검사하여 서든 블랏(Southern Blot) 또는 PCR 분석에 의해 다수의 아단위 복합체의 아단위(가령, 바람직한 항체)를 인코드하는 유전자의 복사체 수를 확인하였다. 임의선택적으로, 예측된 아단위 유전자 산물의 발현은 가령, FACS, 웨스턴 블랏(Western Blot), 콜로니 리프트 및 면역블랏(colony lift and immunoblot), 그리고 당업계에 공지되어 있는 기타 수단들에 의해 확인될 수 있다. 임의선택적으로, 반수체 분리체들은 추가적인 이종기원의 유전자들을 도입시키기 위하여, 가령, 상이한 좌에 통합된 동일한 아단위의 추가 복사체, 및/또는 상이한 아단위의 복사체를 도입시키기 위하여 추가 횟수로 변형된다. 그 다음 반수체 균주들을 교배하여 다중-단백질 복합체를 합성할 수 있는 이배체 균주들(또는 더 높은 배수체의 균주들)을 만든다. 각 예측된 아단위 유전자의 존재는 서든 블랏팅(Southern blotting), PCR, 및 당업계에 공지되어 있는 다른 탐지 수단에 의해 확인될 수 있다. 바람직한 다중-단백질 복합체가 항체인 경우, 이의 발현은 콜로니 리프트/면역블랏 방법(Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)에 의해 및/또는 FACS에 의해 확인될 수 있다 .

이 형질변환 프로토콜은 이종기원의 유전자를 제 2 좌로 표적을 삼도록 임의선택적으로 반복되며, 제 2 좌는 제 1 좌로 표적화되는 것과 동일한 유전자 또는 상이한 유전자일 수 있다. 제 2 좌로 통합되는 구조체가 제 1 좌에 의해 인코드된 서열과 동일한 또는 매우 유사한 단백질을 인코드할 때, 이의 서열은 제 1 좌로 바람직하지 못한 통합 가능성을 감소시키도록 변화될 수 있다. 예를 들면, 제 2 좌로 통합되는 서열은 프로모터 서열, 종료 서열, 코돈 용도에서 차이를 가질 수 있으며, 및/또는 제 1 좌로 통합되는 서열과 비교하여 다른 용인가능한 서열 차이를 가질 수 있다.

P. 파스토리스(P. pastoris) 반수체 균주들을 교배하기 위하여, 교배되는 각 균주는 교배 플레이트 상에서 함께 연결될 수 있다. 예를 들면, 다수의 교배는 이의 성장에 적합한 플레이트상에서 교배되도록 각 균주를 스트리킹(streaking)함으로써 동시에 편리하게 실행될 수 있고, 교배 짝은 제 2 플레이트에서 스트리킹될 수 있다(바람직하게는 플레이트는 풍부한 배지, 이를 테면 YPD임). 전형적으로, 30℃에서 하루 또는 이틀 항온처리한 후, 2개 플레이트로부터의 세포는 교배 플레이트 상에서 십자교체 방식으로 복제 플레이트화될 수 있어, 각 균주 쌍은 한 쌍의 원래 스크리크 라인의 교차점에서 교배되는 기회를 가지도록 공동-플레이트화되는 그물망 패턴이 생성된다. 그 다음 교배 플레이트를 항온처리(가령, 30℃에서)하여 균주들 사이에 교배 시작을 촉진시킨다. 약 2일 후, 교배 플레이트 상에 세포들을 바람직한 이배체 균주들에 대해 선택성이 배지상에 스트리크되거나, 패취되거나 복제 플레이트화될 수 있다(가령, 교배된 균주들은 상보적 영양요구성을 가질 때, 드롭-아웃(drop-out) 또는 최소 배지 플레이트가 이용될 수 있다). 바람직한 이배체 균주들의 선택성 성장을 허용하도록 적절한 기간(가령, 약 3일) 동안 이들 플레이트들을 항온처리(가령, 30℃에서)할 수 있다. 발생된 콜로니들을 선택하고, 각 이배체 균주를 단리하고 정제하기 위하여 단일 콜로니에 대해 선택 및 스트리크할 수 있다.

본 발명의 방법에 이용되는 발현 벡터들은 변형된 효모 균주들을 식별하기 위한 선택성 영양요구성 또는 약물 표지를 포함하는 효모 특이적 서열을 더 포함할 수 있다. 약물 표지는 효모 숙주 세포에서 벡터의 복사체 수를 증폭시키기는 추가 이용될 수 있는데, 가령, 약물의 상승된 농도에서 세포들을 배양하고, 이로 인하여 상승된 저항성 유전자의 수준을 발현시키는 형질변환체를 선택한다.

예시적인 구체예에서, 이종기원의 단백질 아단위들을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 유전자가 유도성 프로모터에 연결된다. 적합한 예시적인 프로모터는 알코올 산화효소 1 유전자 프로모터, 포름알데히드 데히드로게나제 유전자(FLD; 미국 공개 번호 2007/0298500 참고), 그리고 당업계에 공지되어 있는 기타 유도성 프로모터를 포함한다. 알코올 산화효소 1 유전자 프로모터는 대부분의 흔한 탄소 원천, 이를 테면 포도당, 글리세롤, 또는 에탄올에서 효모의 성장 동안 상당히 억제되지만, 그러나 메탄올에서 성장하는 동안 상당히 유도된다(Tschopp et al., 1987; 미국 특허 4,855,231, Stroman, D. W., et al). 외부 단백질들을 생산하기 위하여, 균주들은 생물자원을 생산하도록 억압 탄소 원천에서 처음에 성장되며, 그 다음 유일한(또는 주요) 탄소 및 에너지 원천으로써 메탄올로 이동시켜 외부 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 조절 체계의 한 가지 장점은 유전자의 발현 산물이 세포에 독성이 되는 외부 유전자로 변형된 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들은 억압 조건하에서 성장시킴으로써 유지될 수 있다는 것이다.

또다른 예시적인 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 이종기원의 유전자는 조절된 프로모터에 연결될 수 있으며, 이 유전자의 발현 수준은 적절한 조건하에서 상향조절될 수 있다. 예시적인 조절된 프로모터는 CUP1 프로모터 (배지 안에 구리 수준에 의해 유도됨), 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터, 그리고 FLD1 프로모터를 포함한다.

본 명세서의 많은 부분이 항체의 생산을 설명하지만, 여기에서 설명되는 방법은 다른 다수의 아단위 복합체들에게도 용이하게 적용된다. 이론에 의해 제한되지는 않지만, 다수의 아단위 복합체들의 산풀량 및 순도는 아단위의 농도 및화학량론에 상당히 영향을 받을 수 있고, 이는 다시 각 아단위의 생산을 담당하는 유전자들의 발현 수준에 의해 영향을 받는다고 믿고 있다. 본 명세서에서 공개된 이 방법들은 2개 또는 그 이상의 상이한 아단위를 포함하는 임의의 재조합 다수의 아단위 복합체의 산출량 및/또는 순도를 개선시키는데 바로 이용될 수 있다. 추가적으로, 본 방법은 다중-단백질 복합체들의 생산에 국한되지 않고, 텔로메라제(telomerase), hnRNPs, 리보좀, snRNPs, 신호 인식 미립자, 원핵 및 진핵 RNase P 복합체들, 그리고 다수의 별개의 단백질 및/또는 RNA 아단위들을 함유하는 기타 복합체들을 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체와의 사용에도 또한 용이하게 개조될 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 다수의 아단위 복합체를 발현시키는 숙주 세포가 생성될 수 있다. 예를 들면, 유전자 복사체 수의 상이한 조합을 함유하는 이배체 또는 사배체 효모 세포들의 패널은 개별 아단위 유전자의 복사체 수가 변화된 세포들을 교배시킴으로써 생성될 수 있다(복사체의 수는 교배에 앞서 아는 것이 바람직하다).

정의

본 발명은 특정 방법, 프로토콜, 세포 계통, 동물 종 또는 속, 그리고 설명된 시약들에 제한되지 않으며, 이러한 것들은 변화될 수 있음을 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에서 이용된 용어는 특정 구체예들만을 설명하기 위함이지, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 의도는 없으며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

본 명세서에서 이용된 것과 같이, 단수형("a"), 그리고("and"), 정관사("the")은 내용에서 명백하게 반하는 언급이 없는 한 복수 대상들을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 관한 언급은 이러한 세포의 다수를 포함하고, "단백질"에 관한 언급은 하나 또는 그 이상의 단백질들 및 당업계에 숙련자들에게 공지된 이의 등가물들에 관한 언급을 포함한다. 본 명세서에서 이용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 명백한 언급이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

볼루스 ( bolus ) 추가: 본 명세서, " 볼루스 추가"는 배양된 세포들과 접촉하는 물질 (이를 테면 에탄올), (예를 들면, 배양 배지 안에)의 농도의 급격한 변화를 일반적으로 말한다. 예를 들면, 이 물질은 배양된 세포들에게 단일 추가, 1회 이상의 연속 추가, 및/또는 일정 시간에 걸쳐(가령, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, 또는 120 분에 걸쳐) 추가될 수 있다. 이 물질은 또한 배양 배지를 부분적으로 또는 완전하게 대체됨으로써 추가될 수 있는데, 예를 들면 이 세포들을 농축시키고(원심분리, 여과, 침전(settling), 또는 기타 방법들을 이용), 배지의 일부 또는 전부를 제거하고, 그리고 물질을 추가하거나, 또는 세포들을 물질이 함유된 배지에 추가한다. 이 물질은 운반체 (가령, 배양 배지, 물, 염 등)와 혼합될 수 있다. 예를 들면, 에탄올의 볼루스 추가는 순수 또는 농축된 에탄올 (가령, 100%, 95%, 70%, 50%, 60%, 40%, 30%, 20%, 등)을 원하는 농도가 만들어지도록 충분한 양으로 배양 배지에 추가하는 것을 포함할 수 있다. 또다른 예로써, 이 세포들은 에탄올을 함유하는 배지에 추가될 수 있는데, 가령, 에탄올을 함유하는 배지에 세포들을 포함하는 접종물을 추가한다.

볼루스 농도: 본 명세서에서, " 볼루스 농도"는 물질 (가령, 에탄올)의 볼루스 추가로 인하여 생성된 농도를 일반적으로 지칭한다.

교배 역량있는(competent) 효모 종: 본 발명에서, 배양에서 성장될 수 있는 임의의 이배체 또는 사배체 효모를 광범위하게 포괄한다. 이러한 효모 종은 반수체, 이배체, 또는 기타 다배수체 형태로 존재할 수 있다. 주어진 배수성(ploidy) 세포들은 적절한 조건하에서 그 형태로 무한대의 수가 생성되도록 증식될 수 있다. 이배체 세포들은 또한 분열하여 반수체 세포들을 형성할 수 있다. 이배체 균주들의 추가 교배 또는 융합을 통하여 순차적 교배는 사배체 균주들을 만들 수 있다. 본 발명은 반수체 효모 뿐만 아니라, 예를 들면, 교배 또는 융합 (가령, 스페로플라스트(spheroplast) 융합)에 의해 생성된 이배체 또는 다른 다배수체 효모 세포들의 이용을 고려한다.

본 발명의 한 구체예에서, 교배 역량있는 효모는 아릭시오지마(Arxiozyma) 속을 포함하는 사카로미세타세(Saccharomycetaceae) 패밀리; 아스코보트리오지마(Ascobotryozyma); 씨테로미세스(Citeromyces); 데바르요미세스(Debaryomyces); 데케라(Dekkera); 에레모테시움(Eremothecium); 이사트켄키아(Issatchenkia); 카자체스타니아(Kazachstania); 글루에베로미세스(Kluyveromyces); 코다마에아(Kodamaea); 로데로미세스(Lodderomyces); 파치솔렌(Pachysolen); 피치아(Pichia); 사카로미세스; 사투르니스포라(Saturnispora); 테트라피시스포라(Tetrapisispora); 토루라스포라(Torulaspora); 윌리옵시스(Williopsis); 그리고 자이소사카로미세스(Zygosaccharomyces)의 구성원이다. 본 발명에 잠재적으로 유용한 다른 유형의 효모는 에로비아(Yarrowia); 로도스로리디움(Rhodosporidium); 칸디다(Candida); 한세눌라(Hansenula); 필로바시움(Filobasium); 스포리디오볼루스(Sporidiobolus); 부레라(Bullera); 류코스포리디움(Leucosporidium) 그리고 필로바시델라(Filobasidella)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 교배 역량있는 효모는 피치아(Pichia) 속 또는 또다른 메틸영양요구성(methylotroph)의 구성원이다. 본 발명의 추가 바람직한 구체예에서, 피치아(Pichia) 속의 교배 역량있는 효모는 다음 종들중 하나이다 : 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 그리고 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) (피치아 앙구스타(Pichia angusta)). 본 발명의 특별히 바람직한 구체예에서, 피치아(Pichia) 속의 교배 역량있는 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 종이다.

반수체 효모 세포: 정상적인 게놈 (염색체) 보충물의 각 유전자의 하나의 복사체를 보유하는 세포.

배수체(Polyploid) 효모 세포: 정상적인 게놈 (염색체) 보충물의 하나 이상의 복사체를 보유하는 세포.

이배체 효모 세포: 2개의 반수체 세포의 융합(교배) 과정에 의해 전형적으로 형성되는 정상적인 게놈 보충물의 필수적 모든 유전자의 2개 복사체(대립형질)를 보유하는 세포.

사배체 효모 세포: 2개의 반수체 세포의 융합(교배) 과정에 의해 전형적으로 형성되는 정상적인 게놈 보충물의 필수적 모든 유전자의 4개 복사체(대립형질)를 보유하는 세포. 사배체는 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 상이한 발현 카세트를 운반할 수 있다. 이러한 사배체는 동형접합체 이체성(homozygotic heterothallic) a/a 및 알파/알파 이배체의 선택적 교배에 의해 S. 세레비시에(S. cerevisiae)에서 획득될 수 있고, 그리고 영양요구성 이배체를 획득하기 위하여 반수체의 연속 교배에 의해 피치아(Pichia)에서 획득될 수 있다. 예를 들면, [met his] 반수체는 [ade his] 반수체와 교배되어 이배체 [his]를 획득할 수 있고; 그리고 [met arg] 반수체는 [ade arg] 반수체와 교배되어 이배체 [arg]를 획득할 수 있고; 그 다음 이배체 [his]는 이배체 [arg]와 교배되어 사배체 원영양체(prototroph)를 획득할 수 있다. 이배체 세포들의 장점들 및 용도에 대한 언급은 사배체 세포들에게 또한 적용될 수 있음을 당업계 숙련자들은 이해할 것이다.

효모 교배: 2개 효모 세포들이 융합되어 하나의 효모 세포를 형성하는 과정. 융합된 세포들은 반수체 세포들 또는 더 높은 배수성의 세포들일 수 있다(가령, 사배체 세포를 만들기 위하여 이배체 세포 2개를 교배).

감수분열(Meiosis): 이배체 효모 세포가 감소성 분할을 하여 4개의 반수체 포자 산물을 형성하는 과정. 각 포자는 그 다음 성장하여 반수체의 무성생식적으로(vegetatively) 성장하는 세포계를 형성할 수 있다.

선택성 지표: 선택성 지표는 예를 들면 형질변환 사건을 통하여 유전자를 제공받은 세포에서 성장 표현형(물리적인 성장 특징)을 부여하는 유전자 또는 유전자 단편이다. 이 선택성 지표는 선택성 지표 유전자를 제공받지 못한 세포들이 성장할 수 없는 조건하에서 세포들이 선택성 성장 배지에서 생존하고 성장하도록 한다. 선택성 지표 유전자들은 일반적으로 몇 가지 유형에 속하는데, 양성 선택성 지표 유전자, 이를 테면 항생제 또는 다른 약물에 대한 저항성을 세포에게 부여하는 유전자, 2가지 온도 민감성("ts") 돌연변이체를 교배할 때 또는 하나의 ts 돌연변이체가 변형되는 온도; 음성 선택성 지표 유전자, 이를 테면 생합성 유전자를 보유하지 않는 모든 세포들이 요구하는 특이적 영양분이 없는 배지에서 성장할 수 있는 능력을 세포에게 부여하는 생합성 유전자, 또는 세포에게 야생형 유전자를 보유하지 않는 세포들에 의해 성장하지 못하는 능력을 부여하는 돌연변이된 생합성 유전자; 그리고 이와 유사한 것을 포함한다. 적합한 지표들은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: ZEO; NEO (G418); LYS3; MET1; MET3a; ADE1; ADE3; URA3; 그리고 이와 유사한 것들.

통합된(Integrated): 유기체의 염색체에 공유적으로 연결된 유전자 요소 (전형적으로 이종기원의 유전자 요소).

직렬로 통합된(tandemly integrated): 염색체에서 인접 위치에 통합된 유전자 요소의 2개 또는 그 이상의 복사체. 2개 또는 그 이상의 복사체는 필수적으로 지향성(orientation)을 가지지는 않는다; 가령, 전사된 유전자들의 경우, 일부 복사체는 왓슨(Watson) 가닥으로부터 전사되고, 그리고 다른 복사체들은 크리크(Crick) 가닥으로부터 전사될 수 있다.

숙주 세포: 본 명세서의 내용에서, 용어 숙주 세포는 이종기원의 유전자를 보유하는 세포(가령, 진핵세포, 이를 테면 피치아(Pichia) 세포)를 지칭한다. 예를 들면, 이종기원의 유전자는 바람직한 다수의 아단위 복합체, 단백질 폴딩 (가령, 샤프롱(chaperone)), 발현, 또는 분비에 관련된 유전자, 및/또는 또다른 바람직한 유전자의 발현을 위하여 제공될 수 있다. 이종기원의 유전자는 진핵세포의 게놈에 통합되거나 또는 염색체이외의 요소 이를 테면 플라스미드 또는 인공 염색체에 함유될 수 있다.

발현 벡터: 이들 DNA 벡터는 표적 숙주 세포 안에 외부 단백질의 발현을 위하여 조작을 촉진시킬 수 있는 요소들을 보유한다. 편의를 위하여, 형질변환용 DNA의 서열 및 생산이 우선 세균 숙주 가령 대장균(E. coli)에서 먼저 실행되며, 그리고 항상 벡터들은 복제의 세균 원점 및 세균성 선별 지표를 포함하는 이러한 조작을 촉진시키기 위한 서열을 포함할 것이다. 선별 지표들은 선택성 배양 배지에서 성장된 변형된 숙주 세포들의 생존 또는 성장에 필수적인 단백질들을 인코드한다. 이 선별 유전자를 보유하는 벡터로 변형안된 숙주 세포들은 이 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 전형적으로 선별 유전자들은 (a) 항생제 또는 다른 독성에 저항성을 부여하는, (b) 보충물 영양요구성 결합, 또는 (c) 복합체 배지에서 이용가능하지 않는 주요 영양분의 단백질을 인코드한다. 예시적인 벡터와 효모의 형질변환 방법들은 예를 들면, Burke, D., Dawson, D., & Stearns, T. (2000). Methods in yeast genetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press에서 설명되며, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

본 발명의 방법들에 이용되는 발현 벡터들은 변형된 효모 균주들을 확인하기 위한 선택성 영양요구성 또는 약물 지표를 포함하는 효모 특이적 서열을 더 포함할 수 있다. 약물 지표는 효모 숙주 세포 안에서 벡터의 복사체 수의 증폭을 선택하는데 더 이용될 수 있다.

관심 서열을 코딩하는 폴리펩티드는 효모 세포들에서 폴리펩티드의 발현을 제공하는 전사 및 해독 조절 서열에 일반적으로 작동가능하도록 연계된다. 이들 벡터 성분은 다음중 하나 또는 그 이상의 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 인헨서 요소, 프로모터, 그리고 전사 종료 서열. 폴리펩티드의 분비용 서열 가령 신호 서열, 및 이와 유사한 것이 또한 포함될 수 있다. 복제의 효모 원점은 발현 벡터가 대개 효모 게놈 안으로 통합되기 때문에 선택적이다.

선택적이기는 하지만, 본 발명의 한 구체예에서, 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위는 배양배지로 발현된 폴리펩티드의 분비를 제공하는 분비 서열에 작동가능하도록 연계되거나 또는 융합되며, 이로써 이종기원의 다수의 아단위 복합체의 수확 및 정제가 용이할 수 있다. 더더욱 바람직하게는, 분비 서열은 이를 테면 코돈 선별을 통하여 바람직한 코돈을 선택하거나 및/또는 AT 비율을 변경시킴으로써, 숙주 세포(가령, 효모 이배체 세포들)로부터 폴리펩티드의 최적화된 분비를 제공한다. 분비 효율 및/또는 안정성은 분비 서열의 선택에 의해 영향을 받을 수 있고, 그리고 최적의 분비 서열은 상이한 단백질들간에 다양할 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다(가령, Koganesawa et al., Protein Eng. 2001 Sep;14(9):705-10 참고, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다). 많은 잠재적으로 적합한 분비 신호들은 당업계에 공지되어 있으며, 특정 이종기원의 다수의 아단위 복합체의 산출량 및/또는 순도에 미치는 이들의 효과에 대해 용이하게 테스트될 수 있다. 임의의 분비 서열이 잠재적으로 이용될 수 있는데, 효모 및 다른 종의 분비된 단백질에 존재하는 것들 뿐만 아니라 조작된 분비 서열이 포함된다. 이용되는 예시적인 분비 서열은 다음을 포함할 수 있다: 닭 라이소자임 (CLY) 신호 펩티드 (MRSLLILVLCFLPLAALG (서열 번호:31)), CLY-L8 (MRLLLLLLLLPLAALG (서열 번호:32)), S. 세레비시에(S. cerevisiae) 전화효소 (SUC2) 신호 펩티드 (MLLQAFLFLLAGFAAKISA (서열 번호:33)), MF-알파 (Prepro) (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR (서열 번호:34)), MF-알파 (Pre)-apv (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APV (서열 번호:35)), MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVSLEKR (서열 번호:36)), MF-알파 (Prepro)-(EA)3 (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-EGVSLEKR-EAEAEA (서열 번호:37)), αF 신호 펩티드 (MRFPSIFTAVLFAASSALA-APVNTTTE-DETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKE-EGVSLEKR (서열 번호:38)), KILM1 신호 펩티드 (MTKPTQVLVRSVSILFFITLLHLVVALNDVAGPAETAPVSLLPR (서열 번호:39)), 억제성 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩티드 (MFSPILSLEIILALATLQSVFA (서열 번호:40)), A.나이져(A. niger) GOX 신호 펩티드 (MQTLLVSSLVVSLAAALPHYIR (서열 번호:41)), 쉬반이노시메스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 글루코아밀라제 유전자 (GAM1) 신호 펩티드 (MIFLKLIKSIVIGLGLVSAIQA (서열 번호:42)), 프로(pro)-서열이 있는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드(MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR (서열 번호:43)), 프로(pro)-서열이 없는 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드(MKWVTFISLLFLFSSAYS (서열 번호:44)), ISN 신호 펩티드 (MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (서열 번호:45)), IFN 신호 펩티드 (MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCDLP (서열 번호:46)), HGH 신호 펩티드 (MAADSQTPWLLTFSLLCLLWPQEPGA (서열 번호:47)), 피토헤마글루티닌 (PHA) (MKKNRMMMMIWSVGVVWMLLLVGGSYG (서열 번호:48)), 누에(Silkworm) 라이소자임 (MQKLIIFALVVLCVGSEA (서열 번호:49)), 인간 라이소자임 (LYZ1) (MKALIVLGLVLLSVTVQG (서열 번호:50)), 액티빈 수용체 유형-1 (MVDGVMILPVLIMIALPSPS (서열 번호:51)), 액티빈 유형 II 수용체 (MGAAAKLAFAVFLISCSSG (서열 번호:52)), P. 파스토리스(P. pastoris) 면역글로블린 결합 단백질 (PpBiP) (MLSLKPSWLTLAALMYAMLLVVVPFAKPVRA (서열 번호:53)), 그리고 인간 항체 3D6 경쇄 리더 (MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (서열 번호:54)). Hashimoto et al., Protein Engineering vol. 11 no. 2 pp.75-77, 1998; Oka et al., Biosci Biotechnol Biochem. 1999 Nov; 63(11):1977-83; Gellissen et al., FEMS Yeast Research 5 (2005) 1079-1096; Ma et al., Hepatology. 2005 Dec;42(6):1355-63; Raemaekers et al., Eur J Biochem. 1999 Oct 1;265(1):394-403; Koganesawa et al., Protein Eng. (2001) 14 (9): 705-710; Daly et al., Protein Expr Purif. 2006 Apr;46(2):456-67 ; Damasceno et al., Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:381-389; 그리고 Felgenhauer et al., Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(16):4927, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다). 다수의 아단위 복합체는 분비 신호에 작동가능하도록 연계된 또는 융합없이 배양 배지로 또한 분비될 수 있다. 예를 들면, 일부 이종기원의 폴리펩티드는 분비 신호에 연계되지 않고 또는 융합되지 않고도 없이 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현될 때 배양배지로 분비된다는 것이 설명되었다. 추가적으로, 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 다수의 아단위 복합체는 숙주 세포들로부터 정제될 수 있다(이것은 예를 들면, 복합체가 잘 분비되지 않는 경우에 바람직할 수 있다).

바람직한 다수의 아단위 복합체를 포함하는 배지 또는 세포들은 배양물로부터 회수될 수 있다. 임의선택적으로, 분비된 단백질들이 정제될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 포함하는 세포들은 기계적, 화학적, 효소적, 및/또는 삼투 방법들을 이용하여(가령, 액화 질소로 동결, 균질화기를 이용, 스페로플라스팅, 초음파분쇄, 유리 비드 존재하에서 교반, 세제(detergents)의 이용 등) 용해될 수 있다. 바람직한 다수의 아단위 복합체는 당업계에 공지되어 있는 방법들을 이용하여 농축되고, 여과되고, 투석될 수 있다. 바람직한 다수의 아단위 복합체는 예를 들면, 이의 분자량(가령, 크기 압출 크로마토그래피), 등전점(가령, 등전점 전기영동(isoelectric focusing)), 이화학전기이동 운동성 (가령, 겔 전기영동), 소수성 상호작용 크로마토그래피(가령, HPLC), 전하(가령, 이온 교환 크로마토그래피), 친화력 (가령, 항체, 결합의 경우 단백질 A, 단백질 G에 결합, 및/또는 바람직한 항체가 결합하는 에피토프에 결합), 및/또는 당화 상태(가령, 렉틴 결합 친화력에 의해 탐지된)에 기초되어 정제될 수 있다. 다수의 단계들은 바람직한 수준의 순도를 획득하기 위하여 실행될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 바람직한 다수의 아단위 복합체는 면역글로블린 불변 도메인을 포함하고, 단백질 A 또는 단백질 G 친화력, 크기 압출 크로마토그래피, 그리고 렉틴에 대한 결합 부족(당화된 형태를 제거하기 위하여)을 이용하여 정제될 수 있다. 임의선택적으로 A 프로테아제 억제제, 이를 테면 페닐 메틸 술포닐 플로라이드(PMSF)는 정제과정 동안 단백질분해성 분해를 저해시키기 위하여 추가될 수 있다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능성 상관관계에 놓여질 때 "작동가능하도록 연계되어"있다. 예를 들면, 신호 서열용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레-단백질로 발현된다면 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하도록 연계되며; 프로모터 또는 인헨서는 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하도록 연계된다. 일반적으로, "작동가능하도록 연계된"이란 연계된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하고, 리딩 프레임 안에 있음을 의미한다. 그러나, 인헨서들은 인접해있을 필요가 없다. 연계(Linking)는 통상적인 제한부위에서 결찰에 의해 또는 대안으로 당업계에 숙련자들에게 친숙한 PCR/재조합 방법을 통하여 이루어질 수 있다(Gateway® Technology; Invitrogen, Carlsbad Calif.). 이러한 부위들이 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어뎁터(adapters) 또는 링커들이 통상적인 방식에 따라 이용될 수 있다. 바람직한 핵산 (작동가능하도록 연계된 서열을 포함하는 핵산 포함)이 화학적 합성에 의해 또한 만들어질 수 있다.

프로모터는 작동가능하도록 연계된 특정 핵산 서열의 전사 및 해독을 조절하는 구조 유전자의 시작 코돈의 상류(5') (일반적으로 약 100 내지 1000bp 이내)에 위치된 해독안된 서열이다. 이러한 프로모터는 몇 가지 부류에 속한다: 유도성, 구성, 및 억제성 프로모터 (억제제의 부재에 반응하여 전사 수준을 증가). 유도성 프로모터는 배양 조건들에서의 일부 변화, 가령, 영양분의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화와 같은 일부 변화에 반응하여 이들의 관리하에 DNA로부터 증가된 전사 수준을 개시할 수 있다.

효모 프로모터 단편은 상동성 재조합을 위한 부위로써 그리고 효모 게놈의 동일한 부위로 발현 벡터 통합 부위로 기능을 할 수 있다; 대안으로 선택성 지표는 상동성 재조합을 위한 부위로 이용된다. 피치아(Pichia) 형질변환은 Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385에서 설명되며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

피치아(Pichia)로부터 적합한 프로모터의 예는 CUP1 (배지 안에 구리 수준에 의해 유도됨), 테트라사이클린 유도성 프로모터, 티아민 유도성 프로모터, AOX1 프로모터 (Cregg et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:1316-1323); ICL1 프로모터 (Menendez et al. (2003) Yeast 20(13):1097-108); 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 프로모터 (GAP) (Waterham et al. (1997) Gene 186(1):37-44); 그리고 FLD1 프로모터 (Shen et al. (1998) Gene 216(1):93-102)를 포함한다. GAP 프로모터는 강력한 구성 프로모터이며, CUP1, AOX 및 FLD1 프로모터는 유도성이다. 각 전술한 참고자료는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

기타 효모 프로모터는 ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, Pyk, 및 이로부터 유도된 키메라 프로모터를 포함한다. 추가적으로, 본 발명에 이용되는 비-효모 프로모터는 이를 테면 포유류, 곤충, 식물, 파충류, 양서류, 바이러스, 그리고 조류 프로모터가 이용될 수 있다. 가장 전형적으로 프로모터는 포유류 프로모터 (발현된 유전자에 잠재적으로 내생성인)를 포함하거나 또는 효모 시스템에서 효과적인 전사를 제공하는 효모 또는 바이러스 프로모터를 포함할 것이다.

관심 폴리펩티드는 재조합에 의해 직접적으로 생성될 수 있을 뿐만 아니라 이종기원의 폴리펩티드, 가령 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 보유하는 기타 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로 만들어질 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분이거나, 또는 벡터 안으로 삽입되는 폴리펩티드 코딩 서열의 일부 일 수 있다. 선택된 이종기원의 신호 서열은 바람직하게는 이 숙주 세포 안에서 이용가능한 표준 경로중 하나를 통하여 인지되고 처리되는 것이다. S. 세레비시에(S. cerevisiae) 알파 인자 프레-프로(pre-pro) 신호가 P. 파스토리스(P. pastoris)로부터 다양한 재조합 단백질들의 분비에 효과적인 것으로 증명되었다. 기타 효모 신호 서열은 알파 교배 인자 신호 서열, 전화효소 신호 서열, 그리고 기타 분비된 효모 폴리펩티드로부터 유도된 신호 서열을 포함한다. 추가적으로, 이들 신호 펩티드 서열은 이배체 효모 발현 시스템 안에서 강화된 분비를 제공하도록 조작될 수 있다. 기타 관심 분비 신호들은 또한 포유류 신호 서열을 포함하는데, 이것은 분비되는 단백질에 대해 이종기원일 수 있거나, 또는 분비되는 단백질에 대한 고유(native) 서열일 수 있다. 신호 서열은 프레(pre)-펩티드 서열을 포함하며, 일부 경우들에서 프로(pro)펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 많은 신호 서열이 당업계에 공지되어 있는데, 면역글로블린 쇄에서 발견되는 신호 서열, 가령, K28 프레프로톡신(preprotoxin) 서열, PHA-E, FACE, 인간 MCP-1, 인간 혈청 알부민 신호 서열, 인간 Ig 중쇄, 인간 Ig 경쇄, 및 이와 유사한 것을 포함한다. 예를 들면, Hashimoto et. al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); 그리고 Kobayashi et. al. Therapeutic Apheresis 2(4) 257 (1998) 참고, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

전사는 전사 활성제(activator) 서열을 이 벡터안에 삽입시킴으로써 증가될 수 있다. 이들 활성제는 DNA의 시스(cis)-작용 요소들로써, 보통 약 10 내지 300 bp이며, 프로모터 작용하여 이의 전사를 증가시킨다. 전사 인헨서들은 상대적으로 지향성 및 위치 독립적으로, 인트론 안에 전사 단위의 5' 및 3'에서 발견되며, 뿐만 아니라 코딩 서열 자체에서도 발견된다. 인헨서는 코딩 서열에 대해 5' 또는 3' 위치에서 발현 벡터 안으로 접목(spliced)될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5'위치에 위치된다.

진핵 숙주 세포들에서 이용되는 발현 벡터들은 또한 전사의 종료 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열을 또한 함유할 수 있다. 이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNA들 또는 cDNA들의 비해독된 영역에서 해독 종료 코돈에 대해 3'으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역들은 mRNA의 비해독된 영역에서 폴리아데닐화된 단편으로써 전사된 뉴클레오티드 분절들을 함유한다.

하나 또는 그 이상의 상기 열거된 성분들을 보유하는 적합한 벡터의 작제는 표준 결찰(ligation) 기술 또는 PCR/재조합 방법들을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편들이 절단되고, 맞춰지고(tailored), 그리고 요구되는 플라스미드를 만들기 위하여 바람직한 형태로 재결찰되거나, 또는 재조합 방법들을 통하여. 작제된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위하여, 결찰 혼합물들을 이용하여 숙주 세포들을 형질변환시키고, 적절한 항생제 저항성(가령, 암피실린 또는 제오신)에 의해 성공적인 형질변환체가 선택된다. 형질변환체로부터 플라스미드를 준비하고, 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 분석되고 및/또는 서열화된다.

단편들의 제한 및 결차에 대안으로, att 부위들과 재조합 효소들에 기초한 재조합 방법들을 이용하여 벡터 안으로 DNA 서열을 삽입시킬 수 있다. 이들 방법들은 예를 들면, Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949에서 설명되며; 그리고 당업계 숙련자들에게 공지되어 있다. 이러한 방법들은 람다 및 대장균(E. coli)-인코드된 재조합 단백질 혼합물에 의해 중재되는 분자간 DNA 재조합을 이용한다. 재조합은 상호작용 DNA 분자들의 특이적 부착(att) 부위 사이에서 일어난다. att 부위에 대한 설명은 Weisberg and Landy (1983) Site-Speficifc Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250을 참고한다. 재조합 부위의 측면 DNA 분절들이 스위치되고, 재조합 후, att 부위들은 각각의 부모 벡터에서 제공한 서열을 포함하는 하이브리드 서열이다. 재조합은 임의의 위상의 DNA 간에 발생할 수 있다. 전술한 각 참고자료는 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

Att 부위들은 적절한 벡터 안으로 관심 서열을 결찰시킴으로써; 특이적 프라이머를 이용함으로써 att B 부위들을 함유하는 PCR 산물들을 생성시킴으로써; 부위들을 함유하는 적절한 벡터 안으로 클론된 cDNA 라이브러리를 생성시킴으로써; 그리고 이와 유사한 방법에 의해 관심 서열 안으로 도입될 수 있다.

단일시스트론성 그리고 다시스트론성 유전자. 단일시스트론성 유전자는 오직 단일 단백질만을 해독하는 유전적 정보를 함유하는 RNA를 인코드한다. 다시스트론성 유전자는 하나 이상의 단백질을 해독하는 유전적 정보를 함유하는 mRNA를 인코드한다. 다시스트론성 유전자에 인코드된 단백질은 동일한 또는 상이한 서열 또는 이의 조합을 보유할 수 있다. 이중시스트론성(Dicistronic 또는 bicistronic)은 2개 단백질을 인코드하는 다시스트론성 유전자를 지칭한다. 다시스트론성 유전자들은 임의선택적으로 해독의 캡(cap)-독립적 시작을 촉진시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 내부 리보좀 진입 부위(IRES) 요소들을 포함하고, 이는 mRNA 분자의 5' 단부에 결합된 5'-캡 구조에 독립적인 하류 단백질 코딩 영역의 해독을 구동시킬 수 있는 위치에 있을 수 있다. 임의의 공지된 IRES 서열 (가령, 원점에서 바이러스, 진핵, 또는 인공적인)이 이용될 수 있다. 예를 들면, 이용된 유전자간 영역(IGR)에서 크리켓 마비 바이러스 IRES 서열은 Thompson et al. (2001) PNAS 98:12972-12977에서 설명된 것과 같이 이용될 수 있다. 임의선택적으로, IRES 기능은 유전적 변경은 가령, eIF2 키나아제 GCN2의 구성 발현을 야기시킴으로써 또는 붕괴된 2개의 개시제 tRNA(met) 유전자를 파괴시킴으로써 강화될 수 있다(id.).

본 명세서에서 이용된 것과 같이 폴딩(folding)은 폴리펩티드 및 단백질들의 3차원 구조를 지칭하는데, 여기에서 아미노산 잔기들 사이의 상호작용은 이 구조를 안정화시키도록 작용한다. 비-공유적 상호작용은 구조를 결정함에 있어서 중요하지만, 보통 관심 단백질은 2개 시스테인 잔기 사이에 형성된 분자간- 및/또는 분자내 공유적 이황화결합을 보유할 것이다. 자연적으로 생성되는 단백질들 및 폴리펩티드 또는 이의 유도체들 및 변이체들의 경우, 적합한 폴딩은 전형적으로 최적의 생물학적 활성을 초래하는 전형적으로 배열이며, 그리고 활성, 가령 리간드 결합, 효소 활성 등에 대한 분석으로 편리하게 모니터될 수 있다.

일부 경우들에서, 예를 들면 바람직한 산물은 합성 기원의 것인 경우, 생물학적 활성에 기초된 분석은 의미가 덜 할 것이다. 이러한 분자들의 적합한 폴딩은 물리적 성질, 활동적 고려, 모델링 연구 및 이와 유사한 것들에 근거하여 결정될 수 있다.

발현 숙주는 폴딩 및 이황화결합 형성, 이를 테면 폴다아제(foldases), 샤프롱(chaperoning), 등을 강화시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 효소를 인코드하는 서열을 도입시킴으로써 더 변형될 수 있다. 이러한 서열은 당업계에 공지되어 있는 벡터, 지표들 등을 이용하여 효모 숙주 세포에서 구성적으로 또는 유도적으로 발현될 수 있다. 바람직하게는, 바람직한 발현 패턴에 충분한 전사 조절 요소들을 포함하는 서열은 표적화된 방법을 통하여 효모 게놈에 안정적으로 통합된다.

예를 들면, 진핵 PDI는 단백질 시스테인 산화 및 이황화결합 이성체화(isomerization)의 효과적인 촉매일 뿐만 아니라, 샤프롱 활성을 또한 나타낸다. PDI의 공동-발현은 다수의 이황화결합을 보유하는 활성 단백질들의 생산을 촉진시킬 수 있다. BIP (면역글로블린 중쇄 결합 단백질); 시클로필린(cyclophilin); 그리고 이와 유사한 것들의 발현 또한 관심대상이다. 본 발명의 한 구체예에서, 다수의 아단위 복합체는 교배에 의해 생성된 효모 균주로부터 발현될 수 있고, 이때 각 반수체 부모 균주들은 별개의 폴딩 효소를 발현시키는데, 가령 한 균주는 BIP를 발현시킬 수 있고, 또다른 균주는 PDI 또는 이의 조합을 발현시킬 수 있다.

용어 "바람직한 단백질" 또는 "표적 단백질"은 호환적으로 이용되며, 본 명세서에서 기술된 이종기원의 다수의 아단위 단백질 이를 테면 인간화된 항체 또는 이의 결합 부분을 일반적으로 지칭한다.

용어 "항체"는 에피토프에 꼭 맞고 이를 인지하는 특이적 모양을 가진 임의의 폴리펩티드 쇄-보유 분자를 포함하며, 이때 하나 또는 그 이상의 비-공유적 결합 상호작용은 분자 구조와 에피토프 사이에 복합체를 안정화시킨다. 원형( archetypal) 항체 분자는 면역글로블린이며, 그리고 모든 원천, 가령 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 닭, 기타 포유류들, 닭, 기타 조류 등으로부터 모든 유형의 면역글로블린, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 등이 "항체"로 간주된다. 본 발명에 따라 출발물질로써 유용한 항체를 생산하는 바람직한 원천은 토끼다. 다수의 항체 코딩 서열이 설명되었으며; 그리고 당업계에 공지되어 있는 방법들에 의해 다른 것들이 만들어질 수 있다. 이의 예로는 키메라 항체, 인간 항체 및 기타 비-인간 포유류 항체, 인간화된 항체, 단일 쇄 항체 이를 테면 scFvs, 카멜바디(camelbodies), 나노바디(nanobodies), IgNAR (상어로부터 유도된 단일 쇄 항체), 작은-모듈의 면역약물(SMIPs), 그리고 항체 단편들, 이를 테면 Fabs, Fab', F(ab')₂ 및 이와 유사한 것들을 포함한다. Streltsov V A, et al., Structure of a shark IgNAR antibody variable domain and modeling of an early-developmental isotype, Protein Sci. 2005 November; 14(11):2901-9. Epub 2005 Sep. 30; Greenberg A S, et al., A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks, Nature. 1995 Mar. 9; 374(6518):168-73; Nuttall S D, et al., Isolation of the new antigen receptor from wobbegong sharks, and use as a scaffold for the display of protein loop libraries, Mol Immunol. 2001 August; 38(4):313-26; Hamers-Casterman C, et al., Naturally occurring antibodies devoid of light chains, Nature. 1993 Jun. 3; 363(6428):446-8; Gill D S, et al., Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds, Curr Opin Biotechnol. 2006 December; 17(6):653-8. Epub 2006 Oct. 19 참고. 전술한 각 참고자료는 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

예를 들면, 항체 또는 항원 결합 단편들은 유전자 조작에 의해 만들어질 수 있다. 이 기술에서, 다른 방법과 함께, 항체-생성 세포들은 바람직한 항원 또는 면역원에 민감화된다. 항체 생성 세포들로부터 단리된 메신져 RNA는 PCR 증폭을 이용하여 cDNA를 만드는데 주형으로 이용된다. 각 벡터가 초기 항원 특이성을 유지하는 하나의 중쇄 유전자와 하나의 경쇄 유전자를 보유하는 벡터들의 라이브러리는 증폭된 면역글로블린 cDNA의 적절한 절단편들을 발현 벡터 안으로 삽입시킴으로써 만들어진다. 조합 라이브러리는 중쇄 유전자 라이브러리와 경쇄 유전자 라이브러리를 복합시킴으로써 구축된다. 이로써 중쇄 및 경쇄를 공동-발현시키는 (항체 분자의 Fab 단편 또는 항원 결합 단편을 닮은) 클론의 라이브러리가 된다. 이들 유전자를 운반하는 벡터는 숙주 세포 안으로 공동-형질감염된다. 항체 유전자 합성은 형질감염된 숙주에서 유도될 때, 중쇄 및 경쇄 단백질들은 자가-어셈블리되어 항원 또는 면역원으로 선별함으로써 탐지될 수 있는 활성 항체를 만든다.

관심 서열을 코딩하는 항체는 고유 서열, 뿐만 아니라 유전자 코드의 축퇴에 의해 공개된 핵산의 서열과는 동일하지 않는 핵산 및 이의 변이체들에 의해 인코드된 것들을 포함한다. 변이성 폴리펩티드는 아미노산 (aa) 치환, 추가 또는 결손을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존성 아미노산 치환 또는 비-필수 아미노산들을 제거하는 치환, 이를 테면 당화 부위를 변경시키거나, 또는 기능에 필수적이지 않은 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기의 대체 또는 결손에 의해 잘못된 폴딩을 최소화하기 위한 것일 수 있다. 단백질의 특정 영역 (가령, 기능성 도메인, 촉매성 아미노산 잔기들, 등)의 생물학적 활성을 유지 또는 강화되도록 변이체들이 기획될 수 있다. 변이체들은 본 명세서에서 기술된 폴리펩티드의 단편들, 특히 생물학적으로 활성 단편들 및/또는 기능성 도메인에 대응하는 단편들을 또한 포함한다. 클론된 유전자들의 시험관 돌연변이생성을 위한 기술들 또한 공지되어 있다. 본 발명에는 단백질 분해에 저항성을 개선시키거나 또는 용해도 성질을 최적화시키거나 또는 이들에게 치료 물질로써 좀더 적합하도록 통상적인 분자 생물학적 기술을 이용하여 변형된 폴리펩티드 또한 포함된다.

키메라 항체는 재조합 수단에 의해 한 종의 항체 생성 세포들로부터 획득된 가변성 경쇄 및 중쇄 영역들(V_L 및 V_H)과 또다른 종으로부터 획득된 불변 경쇄 및 중쇄 영역들을 복합함으로써 만들어질 수 있다. 전형적으로 키메라 항체는 설치류 또는 토끼 가변 영역들과 인간 불변 영역들을 이용하여 주로 인간 도메인을 가진 항체를 생산한다. 이러한 키메라 항체의 생산은 당업계에 공지되어 있으며, 표준 수단(가령, 미국 특허5,624,659에서 설명된 것과 같음, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다)에 의해 획득될 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 인간 불변 영역들은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 또는 IgG19 불변 영역으로부터 선택될 수 있음이 더 고려된다.

인간화된 항체는 인간에 좀더 유사한 면역글로블린 도메인들을 보유하도록 작제되며, 이 동물로부터 유도된 항체의 상보성-결정 부위만을 통합한다. 단클론 항체의 가변 영역의 초-가변 루프의 서열을 신중하게 검사하고, 인간 항체 쇄의 구조에 이들을 맞춤으로써 획득된다. 안면과 관련된(facially) 복합체이지만, 이 공정은 확실히 진행된다. 가령, 미국 특허 6,187,287 참고, 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 항체를 인간화시키는 방법들은 등록된 미국 특허 7935340에서 이미 설명되었으며, 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다. 일부 경우에서, 추가 토끼 골격 잔기가 활성을 유지하는데 요구되는지 여부의 결정이 필수적이다. 일부 경우들에서, 인간화된 항체는 친화력 또는 활성의 상실을 최소화시키기 위하여 보유되는 일부 주요한 토끼 골격을 여전히 요구한다. 이들 경우에서, 바람직한 활성을 보유하기 위하여 인간 생식계통 서열로부터 다시 원래 토끼 아미노산으로의 단일 또는 다수의 골격 아미노산들을 변화시킬 필요가 있다. 이러한 변화는 어떤 토끼 잔기들이 친화력 및 활성을 보존하는데 필요한지를 결정하기 위하여 실험적으로 결정된다.

전체 면역글로블린 (또는 이들의 재조합 대응부)에 추가하여, 에피토프 결합 부위를 포함하는 면역 글로블린 단편들(가령, Fab', F(ab')₂, 또는 다른 단편들)이 합성될 수 있다. "단편" 또는 최소 면역글로블린은 재조합 면역글로블린 기술을 이용하여 기획될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용하기 위한 "Fv" 면역글로블린은 융합된 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 합성함으로써 만들어질 수 있다. 항체의 조합 또한 관심대상인데, 가령 2개의 별개 Fv 특이성을 포함하는 디아바디(diabodies)가 있다. 본 발명의 또다른 구체예에서 SMIPs (작은 분자 면역약제), 카벨바디, 나노바디, 및 IgNAR이 면역글로블린 단편에 포괄된다.

면역글로블린 및 이의 단편들은 가령 효과물질 모이어티 이를 테면 화학적 링커들, 탐지가능한 모이어티, 이를 테면 형광 염료, 효소들, 독소들, 기질들, 생물발광 물질들, 방사능활성 물질들, 화학발광 모이어티 및 이와 유사한 것들, 또는 특이적 결합 모이어티, 이를 테면 본 발명의 방법 및 조성물에 이용된 스트렙타아비딘, 아비딘, 또는 바이오틴, 및 이와 유사한 것들을 추가하기 위하여 해독후-변형될 수 있다. 추가적인 효과물질 분자들의 예는 하기에서 제공된다.

산물-연합된 변이체: 바람직한 산물 및 이 바람직한 산물에 관현된 조제물에 존재하는 바람직한 산물 (가령, 바람직한 다수의 아단위 복합체) 이외의 산물. 예시적인 산물-연합된 변이체는 절두된(truncated) 또는 연장된(elongated) 펩티드들, 바람직한 당화이외의 당화를 보유하는 산물들 (가령, 당화된 산물이 바람직한 경우하면, 임의의 당화된 산물은 산물-연합된 변이체로 간주될 것이다), 비정상적인 화학량론, 부적절한 어셈블리, 비정상적인 이황화물 연계, 비정상적인 또는 불완전한 폴딩, 응집, 프로테아제 절단, 또는 기타 비정상을 가지는 복합체를 포함한다. 예시적인 산물-연합된 변이체는 분자량(가령, 크기 압출 크로마토그래피에 의해 탐지됨), 등정점(가령, 등전점 전기영동에 의해 탐지됨), 이화학전기이동 운동성 (가령, 겔 전기영동에 의해 탐지됨), 인산화 상태(가령, 질량분석에 의해 탐지됨), 질량비에 변화 (가령, 질량분석에 의해 탐지됨), 단백질 분해 단편들의 양 또는 실증 (가령, 질량분석 또는 겔 전기영동에 의해 탐지됨), 소수성 (가령, HPLC에 의해 탐지됨), 전하(가령, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 탐지됨), 친화력 (가령, 항체의 경우, 단백질 A, 단백질 G, 및/또는 바람직한 항체가 결합하는 에피토프에 결합으로 탐지됨), 그리고 당화 상태(가령, 렉틴 결합 친화력에 의해 탐지됨)중 하나 또는 그 이상에서 변경을 나타낼 수 있다. 바람직한 단백질이 항체인 경우, 용어 산물-연합 변이체는 당-중쇄 변이체 및/또는 절반 항체 종들(하기에서 설명됨)을 포함할 수 있다.

예시적인 산물-연합된 변이체는 정도를 벗어난 이황화결합을 함유하는 변이 형태를 포함한다. 예를 들면, 대부분 IgG1 항체 분자들은 중쇄 및 경쇄 모두에서 IgG 도메인의 폴딩을 안정화시키는 총 16개의 쇄내(intra-chain) 및 쇄간(inter-chain) 이황화결합 다리에 의해 안정화되는데, 반면 쇄간 이황화 결합 다리는 중쇄와 경쇄의 연합을 안정화시킨다. 기타 항체 유형들은 유사하게 특징적인 안정화 쇄내 및 쇄간 이황화결합을 보유한다. 더욱이, 일부 항체 (본 명세서에서 기술된 Ab-A 및 Ab-B 포함)는 비-정규적(non-canonical) 이황화결합으로 지칭되는 추가 이황화결합을 보유한다. 따라서, 정도를 벗어난 쇄간 이황화결합은 안정화된 공유 연계, 및/또는 추가 아단위에 이황화물 연계가 없기 때문에, 비정상적인 복합체 화학량론을 초래할 수 있다. 추가적으로, 정도를 벗어난 이황화결합 (쇄간 또는 쇄내이건 간에)은 이 항체의 구조적 안정성을 감소시킬 수 있고, 이것은 감소된 활성, 감소된 안정성, 응집물을 형성하는 경향의 증가, 및/또는 증가된 면역원성을 초래할 수 있다. 정도를 벗어난 이황화결합을 보유하는 산물-연합된 변이체는 비-환원된 변성 SDS-PAGE, 모세관 전기영동, cIEX, 질량 분석 (임의선택적으로 자유 시스테인으로의 양적 이동을 만들기 위한 화학적 변형과 함께), 크기 압출 크로마토그래피, HPLC, 광 산란에서의 변화, 그리고 당업계에 공지되어 있는 임의의 기타 적합한 방법들을 포함하는 다양한 방식에서 탐지될 수 있다. 가령, The Protein Protocols Handbook 2002, Part V, 581-583, DOI: 10.1385/1-59259-169-8:581 참고.

절반(half) 항체, 절반-항체 종, 또는 H1L1은 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 항체를 포함하지만, 제 2 중쇄 및 경쇄 항체 쇄에 공유 연계가 없는 단백질 복합체를 지칭한다. 2개의 절반 항체는 일부 조건하에서 비-공유적 연합을 유지할 수 있다(이는 온전한 항체에 유사한 거동을 제공할 수 있다, 가령, 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정된 겉보기 분자량). 유사하게, H2L1은 2개의 중쇄 항체와 한 개의 경쇄 항체를 포함하지만, 제 2 경쇄 항체에 공유 연계가 없는 단백질 복합체를 지칭하고; 이들 복합체는 또한 또다른 경쇄 항체와 비-공유적으로 연합될 수 있다(그리고 이는 온전한 항체에 유사한 거동을 제공한다). 온전한 항체와 같이, 절반 항체 종 및 H2L1 종들은 환원 조건하에서 개별 중쇄 및 경쇄로 해리될 수 있다. 절반 항체 종 및 H2L1 종들은 비-환원된 SDS-PAGE 겔상에서 온전한 항체보다 더 낮은 겉보기 분자량으로 이동하는 종으로 탐지될 수 있는데, 가령, H1L1은 온전한 항체의 겉보기 분자량 (가령, 약 75 kDa)의 대략 절단으로 이동된다.

당(glyco)-중쇄 변이체는 항체 조제물에 때로 존재하고, 그리고 최소한 부분적인 Fc 서열을 보유하는 당화된 산물-연합된 변이체를 지칭한다. 당-중쇄 변이체는 SDS-PAGE에서 관찰가능한 감소된 이화학전기이동 운동성(보통의 중쇄와 비교하여), 렉틴 결합 친화력, 항-Fc 항체에 결합, 그리고 크기 압출 크로마토그래피에 의해 측정되었을 때 당-중쇄 변이체를 함유하는 항체 복합체의 더 높은 겉보기 분자량에 의해 특징화된다. 2011년 8월 31일자로 제출된 미국 가출원 일련번호 61/525,307 (대리인 서류 번호 67858.730200), 이는 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

용어 "바람직한 분비된 이종기원의 폴리펩티드를 안정적으로 발현시키는 또는 연장된 시간 동안 발현시키는 다배수체 효모"는 최소한 수일 내지 1주, 더 바람직하게는 최소한 한 달, 더더 바람직하게는 최소한 1-6 개월, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1년 이상 임계치 발현 수준, 전형적으로 최소한 50-500 mg/리터 ( 배양에서 약 90시간 후) 그리고 바람직하게는 실질적으로 이 이상 동안 전술한 폴리펩티드를 분비하는 효모 배양물을 지칭한다.

용어 "바람직한 양의 재조합 폴리펩티드를 분비하는 다배수체 효모 배양물"은 안정적으로 또는 연장된 기간동안 최소한 최소한 50-500 mg/리터, 그리고 가장 바람직하게는 500-1000 mg/리터 또는 그 이상을 분비하는 배양물을 지칭한다.

폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 코드에 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 해독으로 폴리펩티드 서열을 생산하면 (이를 테면, 이 폴리뉴클레오티드 서열은 이 폴리펩티드 서열을 "인코드"한다) 이 폴리펩티드 서열에 "대응하며(corresponds)", 두 개의 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 인코드하면, 하나의 폴리뉴클레오티드 서열은 또다른 폴리뉴클레오티드 서열에 "대응한다".

DNA 구조체의 "이종기원의" 영역 또는 도메인은 자연계 더 큰 분자와의 현합을 찾아볼 수 없는 더 큰 DNA 분자내에 DNA의 식별가능한 분절이다. 따라서, 이종기원의 영역이 포유류 유전자를 인코드할 때, 이 유전자는 원천 유기체의 게놈에서 포유류 게놈 DNA의 측면에 있지 않는 DNA에 의해 측면에 있을 수 있다. 이종기원의 영역의 또다른 예는 코딩 서열 자체가 자연계에서 볼 수 있는 구조체다(가령, 게놈 코딩 서열이 인트론, 또는 자연적 유전바와 상이한 코돈을 보유하는 합성 서열을 포함하는 cDNA). 대립형질 변이들 또는 자연적으로 생성되는 돌연변이 사건들은 본 명세서에서 정의된 DNA의 이종기원의 영역을 발생시키지 않는다.

"코딩 서열"은 단백질 또는 펩티드 서열에 대응하는 또는 인코드하는 코돈의 인-프레임(in-frame) 서열이다(유전적 코드 관점에서). 서열 또는 이들의 상보성 서열이 동일한 아미노산 서열을 인코드하는 경우, 2개의 코딩 서열은 서로 대응한다. 적절한 조절 서열과 연합된 코딩 서열은 전사되고, 폴리펩티드로 해독될 수 있다. 폴리아데닐화 신호 및 전사 종료 서열은 코딩 서열의 3'에 보통 위치될 것이다. "프로모터 서열"은 세포 안에서 RNA 중합효소에 결합하고, 그리고 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 시작할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열은 코딩 서열의 전사에 영향을 주는 조절 분자(가령, 전사 인자들)의 결합을 위한 추가 부위를 전형적으로 보유한다. RNA 중합효소가 세포 안에서 프로모터 서열에 결합하고, 이 코딩 서열을 mRNA로 전사시키고, 이는 다시 이 코딩 서열에 의해 인코드된 단백질로 해독될 때, 코딩 서열은 프로모터 서열의 "조절하에" 있거나 또는 "작동가능하도록 연계된다".

벡터들은 외부 물질, 이를 테면 DNA, RNA 또는 단백질을 유기체 또는 숙주 세포 안으로 도입시키기 위하여 이용된다. 전형적인 벡터들은 재조합 바이러스 (폴리뉴클레오티드의 경우)와 리포좀(폴리펩티드의 경우)을 포함한다. "DNA 벡터"는 또다른 폴리뉴클레오티드 분절이 부착될 수 있어, 부착된 분절의 복제를 야기하는 레플리콘(replicon), 이를 테면 플라스미드, 파아지 또는 코스미드다. "발현 벡터"은 적합한 숙주 세포에 의한 폴리펩티드 합성을 지시하는 조절 서열을 포함하는 DNA 벡터다. 이것은 보통 RNA 중합효소에 결합하고, mRNA의 전사를 시작하는 프로모터를 의미하고, 뿐만 아니라 리보좀 결합 부위 및 개시 신호에 결합하여 mRNA를 폴리펩티드(들)로 해독을 지시하는 프로모터를 의미한다. 적절한 부위 및 정확한 판독 틀에서 폴리뉴클레오티드 서열이 발현 벡터로 통합되고, 이어서 벡터에 의해 적합한 숙주 세포의 형질변환으로 전술한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 폴리펩티드가 생산될 수 있다.

폴리뉴클레오티드 서열의 "증폭(amplification)"은 특정 핵산 서열의 다수 복사체의 시험관 생산이다. 증폭된 서열은 DNA 형태다. 이러한 증폭을 실행하는 다양한 기술들이 다음의 문헌들에서 설명되며, 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다: Van Brunt 1990, Bio/Technol., 8(4):291-294; 그리고 Gill and Ghaemi, Nuelcosides Nucleotides Nucleic Acids. 2008 Mar;27(3):224-43. 중합효소 쇄 반응 또는 PCR은 핵산 증폭의 표준이며, 본 명세서에서 PCR의 이용은 다른 적합한 증폭 기술의 예로 간주되어야 한다.

대부분 척추동물(포유류 포함)에서 항체의 일반적인 구조는 현재 잘 이해되고 있다(Edelman, G. M., Ann. N.Y. Acad. Sci., 190: 5 (1971)). 통상적인 항체는 분자량 대략적으로 23,000 daltons 분자량의 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 ("경쇄")과 분자량 53,000-70,000인 2개의 동일한 중쇄("중쇄")로 구성된다. 이 4개의 쇄는 "Y" 모양으로 이황화결합에 의해 연결되며, 이때 경쇄는 "Y" 구성의 입에서 시작되는 중쇄를 떠받들고 있다. "Y" 구성에서 "분기(branch)" 부분은 F_ab 영역으로 지정되며; "Y" 구성의 자루 부분은 F_C 영역으로 지정된다. 아미노산 서열 방향(orientation)은 "Y" 구성의 상단에서 N-말단으로부터 각 쇄의 바닥인 C-말단으로 이어진다. N-말단은 항원을 유도하는 항원에 특이성을 보유하는 가변 영역을 보유하고, 길이가 대략적으로 100개 아미노산이며, 경쇄와 중쇄 사이에, 그리고 항체간에 약간 변화가 있다.

가변 영역은 각 쇄에서 쇄의 나머지 길이까지 연장되고, 특정 항체 분류 안에서 이 항체의 특이성(이를 테면, 항원이 항체를 유도하는)으로 변화되지 않는 불변 영역에 연계된다. 면역글로블린 분자의 분류를 결정하는 불변 영역의 5가지 공지된 주요 분류가 있다(감마, 뮤(mu), 알파, 델타, 그리고 입실론 중쇄 불변 영역에 대응하는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE). 불변 영역 또는 분류(class)는 이 항체의 불변 영역 또는 보체의 활성화를 포함하는 후속 효과물질의 기능(Kabat, E. A., Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd Ed., p. 413-436, Holt, Rinehart, Winston (1976)), 그리고 기타 세포 반응(Andrews, D. W., et al., Clinical Immunobiology, pp 1-18, W. B. Sanders (1980); Kohl, S., et al., Immunology, 48: 187 (1983))을 결정하고; 한편 가변 영역은 이와 반응하게 되는 항원을 결정한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 각 중쇄 분류는 카파 또는 람다 경쇄와 짝을 이룰 수 있다. 경쇄 및 중쇄는 서로 공유적으로 결합되고, 두 중쇄의 "꼬리" 부분은 면역글로블린이 하이브리도마 또는 B 세포들에 의해 생성될 때 공유 이황화물 연계에 의해 서로 결합된다.

"가변성 영역" 또는 "VR"이란 표현은 항원에 항체가 결합할 때 직접적으로 관계되는 항체의 각 중쇄와 경쇄 쌍 안에 도메인을 지칭한다. 각 중쇄는 한 단부에 가변성 도메인 (V_H)에 이서 다수의 불변 도메인을 보유한다. 각 경쇄는 한 단부에 가변성 도메인 (V_L)을 가지고, 다른 단부에 불변 도메인을 가진다; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제 1 불변 도메인과 정렬되며, 경쇄 가변성 도메인은 중쇄의 가변성 도메인과 정렬된다.

"상보성 결정 영역", "초가변성 영역" 또는 "CDR" 이란 표현은 항체의 경쇄 또는 중쇄의 가변성 영역에서 발견되는 하나 또는 그 이상의 초-가변성 또는 상보성 결정 영역을 지칭한다(See Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987) 참고). 이들 표현은 Kabat et al에 의해 정의된 초가변성 영역들 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat E., et al., US Dept. of Health and Human Services, 1983) 또는 항체의 3차원 구조에서 초가변성 루프(Chothia and Lesk, J Mol. Biol. 196 901-917 (1987)참고)를 포함한다. 각 쇄에서 CDR들은 골격 영역에 근접하도록 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR들은 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR들 안에 이 항체-항원 상호작용에서 CDR에 의해 이용되는 주요 접촉 잔기들을 나타내는 선택성 결정 영역들(SDR)로 설명된 선택 아미노산들이 있다(Kashmiri, S., Methods, 36:25-34 (2005)).

"골격 영역" 또는 "FR" 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변성 영역내에 하나 또는 그 이상의 골격을 나타낸다(Kabat, E. A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). 이들 표현은 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변성 영역내에 CDR들 사이에 끼워져 있는 아미노산 서열 영역을 포함한다.

"안정적인 복사체 수(copy number)"라는 표현은 연장된 시간(이를 테면 최소한 하루, 최소한 일주일, 또는 최소한 한 달, 또는 그 이상)에 걸쳐 또는 증식 생성의 연장된 수 (가령, 최소한 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 또는 1000회 생성, 또는 그 이상)에 걸쳐 유전자(이를 테면, 항체 쇄 유전자)의 복사체 수를 실질적으로 유지하는 숙주 세포를 지칭한다. 예를 들면, 주어진 시점 또는 생성 수에서, 배양물에서 최소한 50%, 그리고 바람직하게는 최소한 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상의 세포들은 출발 세포와 동일한 유전자 복사체 수를 유지할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체의 각 아단위 (가령, 항체)의 안정적인 복사체 수를 포함한다.

"안정적으로 발현되다"라는 표현은 연장된 시간(이를 테면 최소한 하루, 최소한 일주일, 또는 최소한 한 달, 또는 그 이상)에 걸쳐 또는 증식 생성의 연장된 수 (가령, 최소한 30, 40, 50, 75, 100, 200, 500, 또는 1000회 생성, 또는 그 이상)에 걸쳐 유전자 또는 단백질 (이를 테면 항체)의 유사한 발현 수준을 유지시키는 숙주 세포를 지칭한다. 예를 들면, 주어진 시점 또는 생성 수에서, 유전자 또는 단백질의 생산율 또는 산출량은 초기 생산율의 최소한 50%, 바람직하게는 최소한 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 또는 그 이상일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체 (가령, 항체)를 안정적으로 발현시킨다.

실시예들

다음의 실시예들은 대상 발명을 어떻게 만들고 이용하는지에 대한 완벽한 공개 및 설명과 함께 당업계 숙련자들에게 제공하기 위하여 제시되며, 발명으로 간주되는 범위를 제한하고자 함은 아니다. 이용되는 숫자(가령 양, 온도, 농도, 등)에 대해 정확성을 확보하기 위한 시도들이 있었지만, 일부 실험적 오류 및 편차들이 허용되어야 한다. 다른 언급이 없는 한, 부분은 중량부이며, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이며; 그리고 압력은 대기 또는 대기압에 준한다.

실시예 1

중쇄 및 경쇄 유전자 복사체 수를 변화시킴으로써 증가된 항체 산출량

본 실시예는 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 생산된 재조합 항체의 산출량은 중쇄 및 경쇄 유전자들의 복사체 수를 변화시킴으로써 상당히 증가될 수 있음을 설명한다. 구체적으로, 본 실시예는 본 방법들이 이러한 균주들을 생산하는 표적화된 교배를 허용한다는 것을 설명한다. 중쇄 및 경쇄 유전자들의 상이한 복사체 수로부터 인간화된 항체를 각각 발현시키는 이배체 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 패널들이 생성되었고, 그리고 더 높은 항체 산출량을 만드는 유전자 복사체 수의 조합을 확인하기 위하여 테스트되었다. 도 1은 이배체 균주들의 패널을 효과적으로 만드는데 이용되는 방법들의 총람이다(상세한 방법들은 하기 실시예 4에서 제공된다). 간략하게 설명하자면, 반수체 균주들은 분비 신호에 융합된 프로모터의 조절하에서 중쇄 또는 경쇄 유전자를 인코드하는 유전자들로 변형되었다. P. 파스토리스(P. pastoris) 게놈 안에 특정 유전자 좌에 통합을 위하여, 표적화된 좌의 상동성 서열내에 이 플라스미드가 선형화되었다. 본 실시예에서, 비록 다른 좌들이 또한 이용될 수 있지만, 구조물은 pGAP, 3'AOX TT 및 HIS4 TT 좌로 통합되었다. 이 항체의 다수의 직렬로 통합된 복사체들을 보유하는 형질변환체들은 서든 블랏에 의해 확인되었고, 그리고 경쇄 및 중쇄 유전자의 명시된 수의 복사체를 보유하는 반수체 균주들이 추가 사용을 위하여 선택되었다. 임의선택적으로, 동일한 항체 쇄 유전자의 추가 복사체들은 반수체 균주의 제 2 좌로 통합되었다. 이들 반수체 균주의 교배로 다양한 조합으로 경쇄 및 중쇄 유전자의 명시된 수를 보유하는 이배체 균주들이 효과적으로 생산되었다. 교배 후, 이배체 균주들의 유전자 복사체 수는 서든 블랏팅으로 실증되었다.

이들 방법을 이용하여, 3가지 인간화된 항체, Ab-A, Ab-B, 그리고 Ab-C를 인코드하는 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 이배체 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들이 생성되었다. 이 항체 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열은 도 38 (Ab-A), 도 39 (Ab-B, 그리고 도 40 (Ab-C))에 나타낸다. Ab-A, Ab-B 및 Ab-C는 3가지 상이한 토끼 항체로부터 유도된 인간화된 항체다. Ab-C는 Ab-A 및 Ab-B보다는 상이한 항원에 특이적이다.

이배체 균주들은 다음의 표 1, 2 및 3에 요약된다. 각 균주 식별자의 접두사는 생산된 항체를 나타내고, H와 L 다음의 숫자는 중쇄 및 경쇄 유전자들의 각 통합된 복사체 수를 지칭한다. 예를 들면, 균주 지명 Ab-A-H3xL4는 중쇄 유전자의 3개 복사체와 경쇄 유전자의 4개 복사체를 함유하는 Ab-A를 발현시키는 균주임을 알 수 있다. 컬럼들은 pGAP로 라벨화되고, 3'AOX TT 및 HIS4 TT는 각 해당 좌에 통합된 유전자 복사체 수를 나타낸다. 각 좌는 2회 열거되는데, 이는 상동성 염색체로의 통합을 반영한다(하나는 각 부모 반수체 균주로부터 기원됨).

선택된 이배체 균주들은 실시예 5에서 설명된 것과 같이 항체 생산 및 분비를 발생시키는 조건하에서 생물배양기에서 배양된다. 각 항체 쇄는 GAP 프로모터의 조절하에 있었고, 이의 발현은 포도당의 일부를 에탄올로 전환시키는(낮은 산소 이용성) 조건하에서 글리세롤 탄소 원천을 포도당 탄소 원천으로 전환시킴으로써 상향조절되었다. 분비 서열에 각 항체 쇄 유전자의 프레임내 융합으로 발현된 항체는 배양 배지로 분비되었다. 배양 배지는 대략적으로 90 시간의 성장(T90)에서 회수되었고, 항체 산출량은 실시예 6에서 설명된 것과 같이 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 측정되었다.

T90에서 선택된 Ab-A를 발현시키는 균주들로부터 상대적인 항체 산출량은 하기 표 1의 가장 오른쪽 컬럼에 나타내며, 그리고 도 2에서 도표로 설명된다. H3xL3 균주가 기준으로 이용되었고, 이의 발현 산출량이 100%로 설정되었다. 전체 배양액 항체 역가는 Ab-A-H3xL4, Ab-A-H3xL3, Ab-A-H4xL4, Ab-A-H4xL6, Ab-A-H5xL4, Ab-A-H5xL5, 및 Ab-A-H5xL7의 순서로 일반적으로 항체 복사체 수와 함께 증가되었다. 3가지 Ab-A-H5 균주 모두의 산출량은 양쪽 Ab-A-H4 균주들의 산출량을 초과하였고, 이는 2가지 Ab-A-H3 균주들의 산출량을 초과하였다. 주어진 중쇄 복사체 수에서 전체 산출량 또한 경쇄 복사체 수의 증가와 함께 증가되었는데, 단 예외적으로 H3xL4의 산출량은 H3xL3의 산출량보다 약 13% 더 낮았다.

Ab-B를 발현시키는 균주들로부터 유사한 산출량 결과를 획득하였고, 이것은 하기 표 2의 가장 오른쪽 컬럼에 나타내며, 도 3에서 도면으로 설명된다. H3xL3 균주가 기준으로 이용되었고, 이의 발현 산출량이 100%로 설정되었다. Ab-A와 같이, Ab-B의 산출량은 Ab-B-H3xL3, Ab-B-H3xL4, Ab-B-H4xL3, Ab-B-H4xL5, 및 Ab-B-H4xL6의 순서로, 일반적으로 항체 복사체 수와 함께 증가되었다. 3가지 Ab-B-H4 균주 모두의 산출량은 양쪽 Ab-B-H3 균주들의 산출량을 초과하였다.

유사하게 항체 복사체 수의 증가는 일반적으로 항체 Ab-C의 산출량을 증가시켰고, 이는 표 3의 가장 오른쪽 컬럼에 나타내며, 도 4에서 도면으로 설명된다. 항체 산출량은 Ab-C-H3xL4, Ab-C-H4xL3, Ab-C-H4xL4, Ab-C-H4xL5, Ab-C-H5xL5, Ab-C-H5xL4, Ab-C-H5xL6, 및 Ab-C-H6xL5의 순서로, 일반적으로 항체 복사체 수와 함께 증가되었다. 산출량 증가는 5개 또는 그 이상의 중쇄 복사체를 가지는 균주들 사이에서 상대적으로 완만하였다. 추가적으로, Ab-C-H6xL6 균주는 Ab-C-H6xL5와 Ab-C-H5xL6 균주들과 비교하여 산출량에서 실질적인 감소를 나타내었고, 이 균주의 산출량은 Ab-C-H4xL4 균주와 필적하였다.

이들 결과에서 3가지 상이한 항체의 산출량은 중쇄 및 경쇄 유전자들의 복사체 수를 변경함으로써 상당히 증가될 수 있음이 설명되었다. 더욱이, 결과들은 중쇄 및 경쇄 유전자들의 변화되는(특정된) 복사체 수를 함유하는 균주들의 패널은 중쇄 유전자의 특정된 수의 복사체를 함유하는 반수체 균주들과 경쇄 유전자의 특정된 수의 복사체를 함유하는 반수체 균주들을 교배시킴으로써 생성될 수 있음을 설명한다. 보여진 균주들중에서, 산출량은 배이상이 될 수 있다(가령, 도 2, 균주들 H3xL4와 H5xL7 비교). 비록 본 실시예에서 더 낮은 수의 유전자 복사체를 함유하는 균주들이 포함되지 않았지만, 개선 정도는 이러한 균주들에 상대적으로 훨씬 더 크다는 것이 예측된다. 더욱이, 산출량은 최적 값을 추가하는 복사체 수의 경우 감소될 수 있지만, 구체화된 것을 벗어나 유전자 복사체 수를 더 증가시킴으로써 추가 개선이 획득될 수 있다.

실시예 2

중쇄 및 경쇄 유전자 복사체 수를 변화시킴으로써 증가된 항체 순도

본 실시예는 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 생산된 재조합 항체의 순도는 중쇄 및 경쇄 유전자들의 복사체 수를 변화시킴으로써 상당히 증가될 수 있음을 설명한다. 중쇄 및 경쇄 유전자들의 변화되는(특정된) 복사체 수를 함유하는 균주들은 중쇄 유전자의 특정된 수의 복사체를 함유하는 반수체 균주들과 경쇄 유전자의 특정된 수의 복사체를 함유하는 반수체 균주들을 교배시킴으로써 생성될 수 있다. 비교된 균주들 사이에서, 바람직하지 못한 부산물들의 전반적인 생산은 대략적으로 20% 감소되었다. 추가적으로, 단일 가장 풍부한 부산물의 생산은 비교된 균주들 사이에서 최대 약 82% 감소되었음이 설명되었다.

항체 순도는 배양 배지로부터 분비된 항체의 단백질-A 정제에 이어서, 실시예 6에서 설명된 방법들을 이용한 HPLC에 의해 측정되었다. 시료는 어셈블리된 복합체에 영향을 주는 비정상 (이를 테면 정확하지 않는 화학량론, 부적절한 어셈블리, 응집, 프로테아제 절단, 그리고 기타 비정상)의 탐지를 허용함으로써, 어셈블리된 항체 복합체를 보존하는 것으로 예측되는 고유 조건에서 유지되었다. 전체적인 순도는 예측된 항체에 대응하는 피크 (약 16.7 분 유지 시간)에서 관찰되는 전체 신호의 비율을 측정함으로써 결정되었다. 균주 Ab-A-H4xL4 (도 5A 및 도 5B에서 확대도면) 및 Ab-A-H4xL6 (도 5C 및 도 5D에서 확대도면)의 Ab-A 조제물에 대해 예시적인 HPLC 추적을 나타낸다. 전체 탐지된 신호는 주요 피크에 앞선 용리 (0 내지 14.6 분 유지 시간), 주요 산물 변이체 피크 (15.5 분 유지 시간), 예측된 항체 피크 (16.7 분 유지 시간), 그리고 예측된 항체 피크 (18 내지 22 분)이후 용리에 대응하는 각 4개 추적 영역에 대해 정량화된다(도 5E). Ab-A-H4xL4로부터 이 항체 조제물의 순도는 약 83.7%이었고, 균주 Ab-A-H4xL6으로부터 이 항체 조제물의 순도는 약 87.0%이었다. 이 측정에 의해, 전반적인 불순물 수준은 경쇄 유전자의 복사체 수의 증가에 의해 약 20%(16.3% 에서 13%로) 감소되었다. 주요 산물 변이체 피크 (15.5 분 유지 시간)의 풍부함은 경쇄 유전자의 복사체 수의 증가로 인하여 8.81%에서 1.58%로 (82% 감소됨) 급격하게 감소되었다.

Ab-B 조제물의 HPLC 분석에서 유사한 결과들이 획득되었다. 균주들 Ab-B-H4xL3의 항체 조제물 (도 6A 및 도 6B의 확대도면)과 Ab-B-H4xL5 (도 6C 및 도 6D에서 확대도면)에 대한 예시적인 HPLC 추적을 나타낸다. Ab-B-H4xL3의 항체 조제물의 순도는 약 90.05%이었고, 균주 Ab-B-H4xL5의 항체 조제물의 순도는 약 92.18%이었다. 이 측정에 의해, 전반적인 불순물 수준은 경쇄 유전자의 복사체 수의 증가에 의해 약 21%(10% 에서 7.8%로) 감소되었다. Ab-A와 같이, 주요 산물 변이체는 약 15.5 분의 유지 시간을 가진 피크를 보유하였다. 이 주요 변이체의 풍부함은 경쇄 유전자의 복사체 수의 증가에 의해 약 59% (6.26% 에서 2.54%로) 감소되었다(도 6E).

Ab-C 조제물의 순도 또한 HPLC에 의해 분석되었다. 균주 Ab-C-H3xL3 (도 7A 및 도 7B의 확대도면) 및 Ab-C-H5xL5 (도 7C 및 도 7D의 확대도면)의 항체 조제물에 대한 예시적인 HPLC 추적을 나타낸다. 주요 산물 변이체는 15.2 내지 16.1 분의 유지 시간을 가진 피크를 보유하였다. 이 주요 변이체의 풍부함은 경쇄 유전자의 복사체 수의 증가에 의해 약 39% (6.55% 에서 4.00%로) 감소되었다(도 7E).

Ab-A (도 8), Ab-B (도 9), 및 Ab-C (도 10) 조제물에서 산물 변이체들은 단백질 겔상에서 시각화되었다. 시료들은 변성 및 환원 조건을 겪기 때문에, 이 방법은 개별 항체 쇄 구성에 영향을 주는 비정상을 탐지할 수 있지만, 다른 유형의 비정상을 탐지할 수는 없을 것으로 예상된다 (이를 테면 부적절한 화학량론, 응집, 프로테아제 절단, 부적절한 이황화물 연계, 또는 기타 어셈블리 오류를 보유하는 복합체들). 이 항체는 실시예 7에서 설명된 것과 같이 단백질-A 친화력 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 그 다음 SDS-PAGE에 의해 해리되었고, 그리고 코마시 블루(Coomassie Blue) 착색되었다. 예측된 것과 같이, 주요 밴드들은 중쇄 및 경쇄의 예측된 분자량에 대응되었다(도 8에서 순수 기준 항체가 로드된 "기준(Reference)"로 라벨된 선에 의해 확인됨). 각 시료에서 단일 주요 산물-연합된 변이체가 용이하게 확인가능하였다(도 8, 9, 및 10, "낮은-운동성 산물-연합된 변이체"로 라벨된 부분 화살표). 낮은-운동성 산물-연합된 변이체는 중쇄와 비교하여 감소된 이화학전기이동 운동성을 보유하였다. 산물-연합된 변이체의 양은 경쇄의 더 많은 수의 복사체를 함유하는 균주들의 항체 조제물, 특히, Ab-A-H4xL4 균주 (도 8)와 비교하여 Ab-A-H4xL6 균주의 Ab-A 조제물, Ab-B-H4xL5 균주와 비교하여 Ab-B-H4xL6 균주의 Ab-B 조제물(도 9), 그리고 Ab-C-H3xL3 균주와 비교하여 Ab-C-H5xL5 균주의 Ab-C 조제물에서 시각적으로 감소되었다.

따라서, 3가지 상이한 항체의 경우, 불순물을 탐지하는 두 가지 보충 방법 (HPLC 및 SDS-PAGE) 모두 이 항체 경쇄의 증가된 복사체 수로 인하여 항체 순도가 개선되었음을 설명하였다. 추가 실험들(하기 실시예 3에서 설명됨)은 당화된 중쇄 변이체("당-중쇄 변이체")은 이들 두 방법에 의해 탐지되는 주요 산물-연합된 변이체의 구성원임을 설명하였다.

실시예 3

중쇄 및 경쇄 유전자 복사체 수를 변화시킴으로써 당화된 중쇄 변이체의 생산 감소

본 실시예는 앞선 실시예에서 재조합 항체의 조제물에서 관측된 가장 풍부한 산물-연합된 변이체를 특징화한다. 구체적으로, 이 산물-연합된 변이체는 인간 Fc의 최소한 일부분을 보유하는 당화된 폴리펩티드 ("당-중쇄 변이체")로 나타났다. 이 당-중쇄 변이체의 생산은 경쇄 유전자의 복사체 수가 증가된 균주에서 감소된 것을 보여주었다. 당단백질들은 당화된 형태보다 잠재적으로 면역원성을 더 나타내기 때문에 이들의 생산을 감소시키기 위하여 숙주 세포를 조장하는 것이 일부 의도된 용도에서 특히 바람직할 수 있다.

앞선 실시예에서 설명된 낮은-운동성 산물-연합된 변이체는 렉틴-함유 수지에 이의 특이적 결합에 의해 당단백질임이 설명되었다. 2가지 Ab-B 조제물(H4xL5 및 H4xL3 균주들로부터)로부터 당단백질을 정제하였고, 실시예 8에서 설명된 방법을 이용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅에 의해 분석되었다. 도 11A는 SDS-PAGE와 코마시 블루 착색에 의해 로드된 물질(좌측 패널, "로드(Load)")과 렉틴 컬럼 용출액 (우측 패널, "렉틴 용출액)의 분석을 나타낸다. 3가지 주요 밴드가 렉틴 컬럼 용출액에서 탐지되었다: 낮은-운동성 산물-연합된 변이체 (화살표), 및 경쇄와 중쇄 폴리펩티드. 로드된 물질 (도 11A, 좌측 패널)과 비교하였을 때, 낮은-운동성 산물-연합된 변이체 (화살표)는 렉틴 컬럼 용출액 (도 11A, 우측 패널)에서 상당히 풍부하였다. 이들 결과에서 낮은-운동성 산물-연합된 변이체는 당단백질임을 나타내었다. 추가적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드의 공동-정제는 낮은-운동성 산물-연합된 변이체가 이들 폴리펩티드와 물리적으로 연합되어 있음을 강력하게 암시한다. 도 11B는 양고추냉이 과산화효소에 공액된 항-HuFc 항체 (1:10,000에서 염소 항HuFC-HRP)와 함께 웨스턴 블랏팅에 의해 로디된 물질(좌측 패널, "로드(Load)")과 렉틴 컬럼 용출액 (우측 패널, "렉틴 용출액")을 추가 특징화시킨 것을 보여준다. 이 항체는 예측된 것과 같이(도 11B, 하부 밴드), 인쇄 중쇄 폴리펩티드에 포함된 Fc 서열에 특이적으로 결합되었다. 낮은-운동성 산물-연합된 변이체가 특이적으로 탐지되었는데(도 11B, 화살표), 이 변이체가 중쇄의 Fc 서열의 최소한 일부분을 보유한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 낮은-운동성 산물-연합된 변이체로부터의 웨스턴 신호는 렉틴 컬럼 용출액에 상당히 풍부한데, 렉틴-풍부한 밴드와 Fc-보유 밴드가 동일함을 확인한다. 따라서, 낮은-운동성 산물-연합된 변이체는 중쇄의 Fc 부분을 최소한 포함하는 당단백질, 경쇄 및 중쇄를 보유하는 복합체와 연합 가능성과 함께, 중쇄의 Fc 부분을 최소한 포함하는 당단백질이었다고 결론내리며, 본 명세서에서 "당-중쇄 변이체"로 지칭된다.

당-중쇄 변이체의 상대적인 풍부성은 Ab-B-H4xL3과 비교하여 균주 Ab-B-H4xL5의 조제물에서 또한 감소되었음을 보여주었다. 각 균주로부터 준비된 단백질-A 정제된 항체는 코마시 착색된 겔 (도 11A, 좌측 패널)에서 비교되었고, 당-중쇄 변이체의 풍부성은 H4xL5 조제물에서 시각적으로 감소되었다. 이들 결과와 일관되게, H4xL5 조제물에서 당-중쇄 변이체의 풍부성은 렉틴 컬럼 용출액에서 (H4xL3 조제물)과 비교하여 또한 시각적으로 감소되었다(도 11A, 우측 패널). 당-중쇄 변이체가 항-HuFc 항체로 탐지되었을 때 동일한 결과들이 관찰되었다(도 11B). 이들 결과에서 당-중쇄 변이체의 생산은 항체 쇄 유전자들의 복사체 수를 변화시킴으로써 조절될 수 있음을 나타낸다.

하기 실시예 8에서 설명된 방법들을 이용하여 렉틴-정제된 Ab-B 조제물들은 HPLC에 의해 분석되었다. 렉틴 정제에 앞서, 주요 피크는 H4xL3 (도 12A 및 도 12B의 확대 도면) 및 H4xL5 (도 13A 및 도 13B의 확대 도면) 균주들 모두로부터의 조제물에 대한 예측된 항체 (약 16.7 분 유지 시간)에 대응되었다. 양쪽 조제물 모두에서, 관찰된 가장 풍부한 산물-연합된 변이체는 약 15.5 분의 유지 시간을 보유하였다. 렉틴 정제 이후, 산물-연합된 변이체는 H4xL3 (도 12C 및 도 12D의 확대 도면) 및 H4xL5 (도 13C 및 도 13D의 확대 도면) 균주들 모두로부터의 조제물에서 상당히 풍부하였고, 그리고 우세하였다. 렉틴 컬럼 용출액에서 상당히 풍부하였기 때문에, 환원된 단백질 겔을 이용하여 관찰된 당-중쇄 형태는 15.5 분의 유지 시간을 보유하는 산물-연합된 변이체의 구성분이었다는 결론을 내렸다.

도 12 및 도 13에서 예측된 피크와 당-중쇄 피크에 포함된 총 물질(mass)의 분획을 하기 표 4에 나타낸다. 렉틴 정제에 앞서 항체 조제물의 비교 ("Load" 컬럼)는 항체 순도의 정량적 평가 및 당 중쇄 형태의 우세함을 제공한다. H4xL5 조제물에서 당 중쇄 형틔 상대적인 풍부성 (2.7%)은 H4xL3 조제물에서의 풍부성의 절반보다 적었다 (6%).

이와 함께, 이들 결과는 당화된 중쇄의 비율이 중쇄 및 경쇄 유전자 복사체 수를 변화시킴으로써 변경될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 경쇄 및 중쇄 유전자 복사체 수의 조절은 바람직한 경우, 당화된 항체 생산의 감소에 영향을 줄 수 있고, 이는 선택된 반수체 균주들의 직접 교배에 의해 실행될 수 있다.

실시예 4

항체 유전자의 변화되는 복사체 수를 보유하는 세포 패널 생성 방법들

본 실시예는 이종기원의 다수의 아단위 단백질의 각 아단위를 인코드하는 유전자의 복사체 수를 변화시키고, 그리고 유전자 복사체 수의 변화로부터 다수의 아단위 단백질을 발현시키는 이배체 세포들의 패널을 만들기 위하여 변형된 세포들을 교배시키는 것을 포함하는, 변형된 효모 세포들의 패널 생산에 이용되는 방법들을 설명한다. 도 1은 균주 생성 방법의 개요를 나타낸다.

중쇄 및 경쇄용 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현 벡터의 구축

경쇄 및 중쇄 단편들은 상업적으로 합성되었고, pGAP 발현 벡터 안으로 서브클론되었다(도 14, 15, 18, 및 20). pGAP 발현 벡터는 GAP 프로모터를 이용하여 면역글로블린 쇄의 발현을 구동시킨다. 추가적으로, 이 벡터는 공통적인 요소들, 이를 테면 복제의 세균 원점 및 항생제 저항성에 대한 발현 카세트를 포함한다. Ab-A 및 Ab-B의 경우, GAP 프로모터 서열 (길이가 약 500개 염기쌍)이 이 좌로의 표적화 통합에 이용되었다. 이 벡터는 P. 파스토리스(P. pastoris)에서 항생제 G418에 저항성을 부여하는 카나마이신 저항성 유전자의 복사체를 포함한다. Ab-C의 경우에, AOX1 전사 종료 서열 (길이가 약 350개 염기쌍)이 이 좌로의 표적화 통합에 이용되었다. 이 벡터는 Sh ble 유전자의 복사체를 포함하는데, 이 유전자는 , 항생제 Zeocin™ (플레오마이신)에 저항성을 부여한다. G418 및 Zeocin™은 이들의 게놈 안에 통합된 바람직한 발현 벡터를 포함하는 균주들을 선별하는 수단을 제공한다. 최종적으로, Ab-A, Ab-B 및 Ab-C의 경우에, 제 2 라운드의 통합에 이용된 벡터는 이 좌로 표적화 통합에 이용된 HIS4 전사 종료자 주변의 660개 염기쌍의 P. 파스토리스(P. pastoris) 게놈 서열 (도 13, 14, 16, 및 17)을 포함한다. Ab-A 및 Ab-B의 경우에, 제 2 라운드의 형질변환을 위하여 이용된 벡터는 Sh ble 유전자의 복사체를 포함한다. Ab-C의 경우, 제 2 라운드의 통합에 이용된 벡터는 카나마이신 저항성 유전자를 포함한다.

반수체 met1 및 lys3 숙주 균주들 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로 발현 벡터들의 형질변환

P. 파스토리스(P. pastoris) 세포들은 Pichia Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, Cregg, JM, Ed. 2007. Humana Press, Totowa, NJ)으로부터 변형된 프로토콜에 따라 전기천공에 의해 변형되었다. 변형된 균주들은 JC231 (Lys^-) 또는 JC239 (Met^-)로부터 유도되었다. 3-mL YPD (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로오즈) 배양물은 각 숙주 세포에 대해 P. 파스토리스(P. pastoris) 콜로니와 함께 접종되었고, 30℃에서 교반시키면서 하룻밤동안 성장하도록 두었다. 이들 배양물은 0.01의 OD₆₀₀에서 출발하여 2L Thomson 쉐이크 플라스크 안에 400-mL YPD 배양물을 접종하는데 이용되었다. OD₆₀₀가 1.0-2.0에 도달되면 세포들을 수확하고, 0.2M HEPES (pH 8.0) 및 0.025M DTT를 함유하는 100 mL YPD 배지에 재현탁시켰다. 30 분 동안 30℃에서 세포들이 항온처리되었고, 용적은 1M 냉각 소르비톨을 이용하여 최대 400mL가 되도록하였다. 세포들은 400 mL 1M 냉각 소르비톨에서 한번 세척되었고, 이어서 30 mL 냉각 소르비톨에서 3회 세척된 후, 최종 용적으로 1 mL의 1M 냉각 소르비톨에서 재현탁되었다.

Ab-A 또는 Ab-B의 GAP 프로모터로의 바람직한 통합의 경우, 형질변환에 앞서, 각 벡터(도 14-15)는 P. 파스토리스(P. pastoris) 게놈의 GAP 프로모터 좌로 벡터의 통합을 지시하기 위하여 AvrII 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 GAP 프로모터 서열 안에서 선형화시켰다. Ab-C를 AOX1 전사 종료자의 바람직한 통합을 위하여, 각 벡터 (도 18-19)는 BsiWI (중쇄의 경우) 또는 PvuII (경쇄의 경우)를 이용하여 3'AOX TT 서열 안에서 선형화시켰다. Ab-A 및 Ab-B의 경우, 성공적인 형질변환체는 G418을 함유하는 YPDS (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로오즈, 2% 한천, 1M 소르비톨) 한천 플레이트 상에서 선별되었다. Ab-C의 경우, 성공적인 형질변환체는 Zeocin™을 함유하는 YPDS 한천 플레이트에서 선별되었다. 이것은 제 1 좌 통합으로 지칭된다. Ab-A 및 Ab-C의 경우, 형광 활성화된 세포 소팅(FACS)을 이용하여 중쇄 또는 경쇄의 더 많은 복사체를 함유하는 클론을 풍부하게 하였다. 간략하게 설명하자면, 대략적으로 5 mL PBS에서 형질변환 플레이트를 긁어내었다. 세포들은 중쇄 또는 경쇄에 특이적인 형광 탐지 항체로 착색되었다. 관심 유전자는 분비 신호에 융합되었지만, 양성 세포들은 FACS에 의해 탐지가능하였고, 이는 세포 표면에서 일부 단백질의 최소한 일시적 유지에 의해 명백하였다. 착색된 세포들의 상위 20-40%가 소트되었고, 이를 이용하여 25 mL BYED (3% 효모 추출물, 4% 무수 덱스트로오즈, 1.34% 효모 질소 베이스, 0.004% 바이오틴, 및 100 mM 인산칼륨) 쉐이크 플라스크 배양물을 접종하였다. 교반시키면서 30℃에서 하룻밤 동안 성장시킨 후, 세포를 수확하고, 착색시키고, 그리고 FACS를 이용하여 두 번째 농축시켰다. 착색된 세포들의 상위 10-20%는 G418 (Ab-A의 경우) 또는 Zeocin™ (Ab-C의 경우)을 함유하는 YPD 플레이트 상에 단일 콜로니로 스트리크되었다. FACS 풍부함 분석은 Ab-B의 경우에 생략되었다.

구조체의 복사체의 다양한 수가 표적이된 좌에 직렬로 통합되었다(도 22에서 설명됨). 반수체 균주들에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수는 서든 블랏 분석에 의해 결정되었다. 간략하게 설명하자면, 게놈 DNA는 통합 부위의 측면 서열을 절단하는 제한 효소로 절단되었고, 아가로즈 겔 전기영동에 의해 해리되었고, 막으로 이동되고, 그리고 통합 서열로 구성된 프로브에 혼성화되었다. 제한 단편의 크기는 통합된 복사체의 수와 함께 1차원적으로 증가된다(도 22 참고). 통합에 앞서 게놈 제한 단편의 크기가 Y이고, 통합된 서열의 길이가 X라면, 그 다음 N 복사체의 통합 후 단편 크기는 Y + NX일 것이다. 이 상관관계를 이용하여 형질변환체당 복사체의 수는 탐지된 단편의 길이로부터 결정되었다.

바람직한 복사체 수를 가진 반수체 균주들을 교배시키고, 그 다음 BYNB (1.34% 효모 질소 베이스, 2.5% 한천, 2% 덱스트로오즈, 0.1M 인산칼륨 pH 6.0) 한천 플레이트 상에서 영양요구성 지표들(이를 테면, Lys 및 Met) 부재하에 이들의 성장하는 능력에 대하여 선별되었다. 그 다음 생성된 이배체 클론은 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수를 확인하기 위하여 서든 블랏에 의해 분석되었다. 전체 길이 단일클론 항체를 발현시키는 이배체 클론은 4% 효모 추출물을 함유하는 1mL의 BSM (기초 염 배지, 10 g/L 구연산 나트륨염 이사화물, 36.4 g/L 일염기성 인산암모늄, 18.2 g/L 황산칼륨, 12.8 g/L 일염기성 인산칼륨, 3.7 g/L 황산마그네슘 7수화물, 40 g/L 덱스트로오즈, 40 g/L 효모 추출물, 4.35 mL/L PTM1 용액, pH 6.0)를 포함하는 딥-웰 플레이트에서 48시간 성장에 의해 추가 특징화되었다. 그 다음 상청액안에 항체 농도는 바이오레이어 인터페로메트리(biolayer interferometry) 단백질 A 바이오센서(Octet, ForteBio)를 이용하여 정량화되었다.

제 2 게놈 좌로의 통합을 위하여, 역량있는 세포들은 상기 설명된 프로토콜에 따라 중쇄 또는 경쇄의 미리-결정된 복사체 수를 보유하는 반수체 균주들을 이용하여 준비되었다. HIS4 TT 좌로의 바람직한 통합을 위하여, 각 발현 벡터 (도 16-17 및 20-21)는 이 좌로의 통합을 지시하기 위하여 Sca1 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 HIS4 TT 통합 서열 안에서 선형화되었다. Ab-A 및 Ab-B의 경우, 성공적인 형질변환체는 Zeocin™을 함유하는 YPDS 한천 플레이트 상에서 선별되었다. Ab-C의 경우, 성공적인 형질변환체는 G418을 함유하는 YPDS 한천 플레이트 상에서 선별되었다. HIS4 TT 좌에 통합된 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수는 서든 블랏을 이용하여 결정되었다. 상기에서 설명된 것과 같이 반수체 균주들이 교배되었으며, 이배체 균주들이 선별되었다. 최종 서든 블랏을 실행하여 각 통합 좌에서 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수를 확인하였다. 발현을 모니터하기 위하여 단백질 A 바이어센서를 이용하여 클론이 선별되었다(Octet, ForteBio).

서든 블랏팅(Southern blotting)

서든 블랏 분석에 의해 반수체 균주들에 대한 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수들이 결정되었다. YPD 한천 플레이트로부터 단일 콜로니가 선별되었고, 이를 이용하여 3-mL YPD 배양물을 접종하였다. 배양물은 포화될 때까지 30℃에서 하룻밤동안 항온처리되었다. MasterPure Yeast DNA Purification Kit (Epicentre)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 각 배양물 1.8mL로부터 게놈 DNA가 추출되었다. pGAP 좌의 경우, 1㎍의 DNA가 Cla I로 절단되었고, 0.8% TAE 아가로스 겔 상에서 분리되었다. 전기영동후, 겔은 변성 완충액(0.5M NaOH; 1.5M NaCl)으로 45 분간 처리되었고, 30분간 중화 완충액(0.5M 트리스-HCl, pH 7.2; 1.5M NaCl; 1mM EDTA)으로 처리되다. 그 다음 DNA는 모세관 작용에 의해 양전하를 띈 나일론 막 (BioRad)으로 이동되었고, UV 교차연결제(crosslinker)에 의해 고정되었다. 막은 pGAP 서열에 대응하는 디옥시게닌(DIG)-라벨된 DNA 프로브를 이용하여 41℃에서 하룻밤 동안 혼성화되었다. 막은 높은 엄격성(stringency) 조건하에서 세척되었고, DIG High Prime Labeling and Detection Kit (Roche Applied Science)를 이용하여 탐지되었다. 혼성화된 밴드들은 X-선 필름에 막을 노출시킴으로써 시각화되었다.

3'AOX TT 또는 HIS4 TT 좌에 통합된 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수는 상기에서 설명된 단계에 따라 약간의 변형과 함께 서든 블랏을 이용하여 결정되었다. AOX1 전사 종료 좌의 경우, HindIII 제한 엔도뉴클레아제는 게놈 DNA 절단을 위하여 이용되었고, 3'AOX TT 서열에 대응하는 DIG-라벨된 프로브가 혼성화에 이용되었다. HIS4 TT 좌의 경우, SspI 제한 엔도뉴클레아제는 게놈 DNA 절단에 이용되었고, HIS4 TT 서열에 대응하는 DIG-라벨된 프로브가 혼성화에 이용되었다.

전술한 방법을 이용하여, 개별 아단위의 다양한 복사체 수를 함유하는 형질변환체의 패널, 예를 들면, 항체 중쇄의 3, 4, 5, 그리고 6개 복사체를 함유하는 H3, H4, H5 및 H6로 라벨된 균주, 그리고 항체 경쇄의 3 내지 7개 복사체를 함유하는 L3 내지 L7이 라벨된 균주들이 획득된다. 그 다음 이들 형질변환체는 교배되어, 경쇄 및 중쇄 유전자의 변화되는 복사체 수를 보유하는 이배체를 획득하고, 유전자 복사체 수는 서든 블랏에 의해 임의선택적으로 재확인된다. 경쇄 및 중쇄 유전자의 알고있는 변화되는 복사체수를 이배체 세포들이 이에 의해 만들어진다. 임의선택적으로, 관심 항체를 발현시키는 클론은 발현을 모니터하기 위하여 바이오레이어 인터페로메트리(biolayer interferometry) 단백질 A 바이오센서(Octet, ForteBio)를 이용하여 선택되었다. 생성된 반수체 및/또는 이배체 균주들의 냉동 비축물이 전형적으로 만들어지고, 그리고 성숙 항체의 산출량, 생산율 그리고 순도 평가를 위하여 형질변환체들이 증식된다.

Ab-A를 인코딩하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 변화되는 복사체 수를 함유하는 P. 파스토리스(P. Pastoris) 균주들의 패널 생성

상기 설명된 방법들을 이용하여 경쇄 및 중쇄 유전자의 복사체의 가변성 수를 포함하는 Ab-A의 발현을 위한 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 패널이 만들어졌다. 중쇄 유전자의 2 내지 5개 복사체와 경쇄 유전자의 2 내지 7개 복사체를 함유하는 총 13개 이배체 균주들이 생성되었다. 우선, 경쇄 및 중쇄 유전자의 한정된 수의 복사체를 포함하는 반수체 균주들이 만들어졌고(각 반수체 균주는 Lys^- 또는 Met^-이다), 그 다음 경쇄 및 중쇄 유전자의 공지의 수의 복사체를 포함하는 이배체 원영양체 균주들을 만들기 위하여 이들 반수체 균주간에 교배가 이용되었다. 각 발현 카세트는 분비 신호를 인코드하는 서열에 융합된 글리세르알데히드 데히드로게나제 유전자 (GAP 유전자) 프로모터, 이어서 발현될 유전자의 서열, 그리고 P. 파스토리스(P. pastoris) 알코올 산화효소 I 유전자 (AOX1)로부터 P. 파스토리스(P. pastoris) 전사 종료 신호를 인코드하는 서열 단독 또는 HIS4 TT 서열과 연합된 서열이 연결된다 (도 14-21에서 설명됨).

pGAP 좌에 통합된 Ab-A 중쇄를 인코드하는 유전자를 함유하는 형질변환체는 식별자 Hc47 내지 Hc60를 부여받았다. 정제된 게놈 DNA는 pGAP 좌의 측면 부위들을 절단하는 제한 효소로 절단되었으며, 서든 블랏팅(라벨된 pGAP 서열을 이용)을 이용하여 상기에서 설명된 것과 같이 각 균주에서 통합된 복사체의 수를 결정하였다(도 23). 라인 1과 2개의 최우측 라인들은 라벨된 DNA 사다리(ladders) (블랏의 좌측 모서리에 단편 크기가 기재됨)를 포함한다. 라인 2부터 15는 각각 균주들 Hc47 내지 Hc60에 대응된다. 블랏의 우측 모서리에 라벨 A부터 C는 통합된 서열의 1개 내지 3개 복사체를 각 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 균주 Hc58 및 Hc51에서 탐지된 단편은 이들 균주가 중쇄 유전자의 2개 및 3개 복사체를 각 포함함을 나타내었다. 교배용으로 균주 Hc58 및 Hc51이 선택되었다.

유사하게, pGAP 좌로 또한 통합된 Ab-A 경쇄를 인코드하는 유전자의 게놈 복사체의 다양한 수를 포함한 반수체 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 패널이 만들어졌다. 이 균주들에게는 식별자 Lc1 부터 Lc27까지가 할당되었다. 정제된 게놈 DNA는 pGAP 좌의 측면 부위들을 절단하는 제한 효소로 절단되었으며, 서든 블랏팅(라벨된 pGAP 서열을 이용)을 이용하여 상기에서 설명된 것과 같이 각 균주에서 통합된 복사체의 수를 결정하였다(도 24). 라인 1과 22는 라벨된 DNA 사다리(블랏의 좌측 모서리에 단편 크기가 기재됨)를 포함한다. 라인 2부터 21 그리고 23부터 29는 각각 균주들 Lc1 내지 Lc27에 대응된다. 블랏의 우측 모서리에 라벨 A부터 F는 통합된 서열의 1개 내지 5개 복사체 그리고 5개 이상의 복사체를 각 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 균주들 Lc17, Lc7, 및 Lc27에서 탐지된 단편은 이들 균주가 경쇄 유전자의 2개, 3개 및 4개 복사체를 각 포함함을 나타내었다. 교배용으로 균주 Lc17, Lc7, 및 Lc27이 선택되었다.

패널에서 이용가능한 경쇄 및 중쇄 유전자 복사체 수를 더 증가시키기 위하여, 추가 유전자 복사체가 제 2 좌에 통합되었다. 따라서, 특정하게 통합된 유전자의 전체 복사체 수는 통합 좌 모두로부터 복사체의 수를 더하여 계산된다. 구체적으로, Ab-A 중쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체는 pGAP 좌에 통합된 Ab-A 중쇄 유전자의 3개 복사체를 이미 보유하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 중쇄 유전자의 1개 또는 2개의 추가 복사체가 도입되어, 총 4개 또는 5개 복사체가 된다. 유사하게, Ab-A 경쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체는 pGAP 좌에 통합된 Ab-A 경쇄 유전자의 3개 복사체를 이미 보유하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 중쇄 유전자의 1개 내지 4개의 추가 복사체가 도입되어, 총 4개 내지 7개 복사체가 된다.

중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 균주들의 교배에 의해 이배체 균주들이 만들어졌다. 중쇄 유전자의 2 내지 5개 복사체와 경쇄 유전자의 2 내지 7개 복사체를 포함하는 총 13개 상이한 균주들이 생성되었다. 각 이배체 균주의 경우에, 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수는 균주 식별자 (가령, Ab-B-H4xL5는 중쇄 유전자의 4개 복사체와 경쇄 유전자의 5개 복사체를 나타낸다)에서 나타나고, 그리고 유전자가 발현되는 좌는 상기 표 1에서 확인된다.

각 이배체 균주들의 다수 분리체는 교배에 의해 생성되었고, 추가 분석을 위하여 특정 분리체들을 선택하기에 앞서 서든 블랏팅에 의해 복사체 수가 실증되었다. 도 25는 Ab-A-H3xL3, Ab-A-H3xL4, Ab-A-H2xL3, 및 Ab-A-H2xL2 균주들의 후보들(각각 라인 2-6, 7-11, 12-15, 및 16-19)에 대한 유잔자 복사체 수를 실증하기 위한 pGAP 좌의 서든 블랏을 보여주며, 별표는 추가 이용을 위하여 선택된 후보를 나타낸다. 라인 1은 라벨된 DNA 사다리(단편 크기는 블랏의 좌측 모서리에 기록되어 있다)를 포함한다. 블랏의 우측 모서리에 라벨 A, C, 및 E는 경쇄 유전자의 각 2 내지 4개 복사체를 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타내며, 라벨 B 및 D는 중쇄 유전자의 각 2 또는 3개 복사체를 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 26은 표 1에 나타낸 균주들의 분리체에 대하여 pGAP 좌에서 유전자 복사체 수의 실증을 위한 서븐 블랏을 보여주며, 별표는 추가 이용을 위하여 선택된 후보를 나타낸다. 블랏의 우측 모서리에 라벨 A, C, 및 E는 중쇄 유전자의 각 1 내지 3개 복사체를 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타내며, 라벨 B 및 D는 경쇄 유전자의 각 2 또는 3개 복사체를 포함하는 균주로부터 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 유사하게, 도 27은 이 좌에 통합된(표 1에서 확인됨) 항체 유전자를 포함하는 것으로 예측된 이들 균주들에 대하여 HIS4 TT 좌에서 유전자 복사체 수의 실증을 위한 서든 블랏을 보여준다(표 1에서 확인됨). 블랏의 우측 모서리에서 라벨 A는 내생성 HIS4 TT 좌를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, 라벨 B, D, F, 및 G는 경쇄 유전자의 1 내지 4개 복사체를 포함하는 각 균주의 단편의 예측된 크기를 나타내고, 라벨 C 및 E는 중쇄 유전자의 1 또는 2개 복사체를 포함하는 각 균주의 예측된 크기를 나타낸다.

Ab-B를 인코드하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 다양한 복사체 수를 포함하는 P. 파스토리스(P. Pastoris) 균주들의 패널 생성

Ab-B (pGAP 좌로 표적화됨)의 중쇄 및 경쇄를 인코드하는 유전자들을 포함하는 반수체 균주들은 Ab-A에 대하여 설명된 동일한 방법을 기본적으로 이용하여 생성되었다. 서든 블랏(pGAP 서열 프로브 사용)으로 Ab-B 중쇄 유전자 (도 28A)의 2개 및 3개 복사체를 포함하는 각각 포함하는 균주 Hc3 및 Hc4, 그리고 Ab-B 경쇄 유전자 (도 28B)의 2 내지 5개 복사체를 각각 포함하는 균주 Lc5, Lc11, Lc12, 및 Lc9가 확인되었다. 도 28A에서, 블랏의 우측 측면에서 라벨 A, C, E, 및 G는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 0개 내지 3개 복사체를 각각 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 도 28B에서, 블랏의 좌측 측면에서 라벨 A, B, D, F, H, 및 I는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 경쇄 유전자의 0개 내지 5개 복사체를 각각 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 별표는 추가 교배를 위하여 선택된 반수체 균주들을 나타낸다.

패널에서 이용가능한 중쇄 유전자의 복사체 수를 더 증가시키기 위하여, Ab-B 중쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체 수는 pGAP 좌에 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 3개 복사체를 이미 포함하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 중쇄 유전자의 1개 또는 2개의 추가 복사체가 도입되어, 총 4개 또는 5개 복사체가 도입되었다. 유사하게, Ab-B 경쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체 수는 pGAP 좌에 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 3개 복사체를 이미 포함하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 중쇄 유전자의 1개 내지 4개의 추가 복사체가 도입되어, 총 4개 내지 7개 복사체가 도입되었다.

그 다음 이배체 균주들은 중쇄 및 경쇄 유전자들을 포함하는 균주들을 교배함으로써 생성되었다. 중쇄 유전자의 2 내지 5개의 복사체와 경쇄 유전자의 2 내지 7개 복사체를 포함하는 총 14개 상이한 균주들이 생성되었다. 각 이배체 균주의 경우, 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수는 균주 식별자에 의해 표시되며 (가령, H4xL5는 중쇄 유전자의 4개 복사체와 경쇄 유전자의 5개 복사체를 나타냄), 그리고 이 유전자들이 발현되는 좌는 상기 표 2에서 확인된다. 이배체 균주들에서 유전자 복사체 수는 도 29-30 (pGAP 프로브) 및 도 31 (HIS4 TT 프로브)에 나타낸 서든 블랏에 의해 재확인되었다. 각 이배체 균주의 다수의 복사체들이 생성되었고, 그리고 도 29-31에서 별표는 추가 사용을 위하여 선택된 분리체를 나타낸다. 도 29에서, 블랏의 우측 측면에 라벨 A, C, 및 E는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 1 내지 3개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 라벨 B, D, F, 및 G는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 경쇄 유전자의 2 내지 5개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 30에서, 블랏의 우측 측면에 라벨 A, B, C, 및 E는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 0 내지 3개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 라벨 A 및 D는 pGAP 좌로 통합된 Ab-B 경쇄 유전자의 0개 및 3개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 31에서, 라벨 A, C, 및 E는 HIS4 TT 좌로 통합된 Ab-B 중쇄 유전자의 0 내지 2개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 라벨 A, B, D, F, 및 G는 HIS4 TT 좌로 통합된 Ab-B 경쇄 유전자의 0 내지 4개 복사체를 포함하는 각 단편의 예측된 크기를 나타낸다.

Ab-C를 인코드하는 경쇄 및 중쇄 유전자의 다양한 복사체 수를 포함하는 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 패널 생성

중쇄 및 경쇄를 인코드하는 복사체의 다양한 수를 포함하는 Ab-C의 발현을 위한 P. 파스토리스(P. pastoris) 균주들의 패널은 Ab-A 및 Ab-B에 대하여 설명된 동일한 방법을 기본적으로 이용하여 생성되었다. 서든 블랏(3'AOX TT 서열 프로브 사용)으로 Ab-C 중쇄 유전자의 1, 2, 3 및 4개 복사체를 각 포함하는 반수체 균주 Hc 19, Hc25, Hc13, 및 Hc17 (도 32), 그리고 Ab-C 경쇄 유전자의 1 내지 6개 복사체를 각 포함하는 균주 Lc7, Lc6, Lc11, Lc19, Lc15, 및 Lc17 (도 33)이 확인되었다. 도 32에서, 블랏의 우측면의 라벨 A, B, C, 및 D는 AOX1 전사 종료 좌에 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 1 내지 4개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 33에서, 블랏의 우측면의 라벨 A, B, C, D, E, 및 F는 AOX1 전사 종료 좌에 통합된 Ab-C 경쇄 유전자의 1 내지 6개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 별표는 추가 교배를 위하여 선택된 반수체를 나타내었다.

패널에서 이용가능한 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수를 더 증가시키기 위하여, 추가 유전자 복사체가 제 2 좌로 통합되었다. 따라서, 특이적으로 통합된 유전자의 전체 복사체 수는 양쪽 통합 좌로부터 복사체 수를 추가하여 산출된다. 구체적으로, Ab-C 중쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체는 AOX1 전사 종료 좌에 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 3 또는 4개의 복사체를 이미 포함하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 중쇄 유전자의 1개 또는 2개의 추가 복사체, 총 5개 또는 6개의 복사체가 도입된다. 유사하게, Ab-C 경쇄를 인코드하는 유전자의 추가 복사체는 AOX1 전사 종료 좌에 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 3 또는 4개의 복사체를 이미 포함하는 균주에서 HIS4 TT 좌로 통합되었고, 이로 인하여 경쇄 유전자의 2개의 추가 복사체, 총 5개 또는 6개의 복사체가 도입된다.

그 다음 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 반수체의 교배에 의해 이배체 균주들이 생성되었다. 중쇄 유전자의 3 내지 6개 복사체와 경쇄 유전자의 3 내지 6개 복사체를 포함하는 총 9개 상이한 균주들이 생성되었다. 각 이배체 균주의 경우, 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체의 수는 균주 식별자로 나타내며 (가령, Ab-C-H4xL5는 중쇄 유전자의 4개 복사체와 경쇄 유전자의 5개 복사체를 나타낸다) 그리고 유전자가 발현되는 좌는 상기 표 3에서 확인된다. 이배체 균주들의 유전자 복사체 수는 도 34-35 (3'AOX TT 프로브)와 도 36 (HIS4 TT 프로브)에 나타낸 서든 블랏으로 재확인되었다. 각 이배체 균주의 다수의 분리체가 생성되었고, 도 34-36에서 별표는 추가 이용을 위하여 선택된 분리체를 나타낸다. 도 34에서, 블랏의 우측의 라벨 B와 D는 AOX1 전사 종료 좌로 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 3개 또는 4개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 라벨 A, C, 및 E는 AOX1 전사 종료 좌로 통합된 Ab-C 경쇄 유전자의 3개 내지 5개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 35에서, 블랏의 우측의 라벨 A, C, 및 E는 AOX1 전사 종료 좌로 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 2개 내지 4개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, B 및 D는 AOX1 전사 종료 좌로 통합된 Ab-C 경쇄 유전자의 3개 및 4개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다. 도 36에서 라벨 A는 HIS4 TT 좌로 통합된 Ab-C 중쇄 또는 경쇄 유전자의 0개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, 라벨 B는 HIS4 TT 좌로 통합된 Ab-C 경쇄 유전자의 2개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타내고, 그리고 라벨 C는 HIS4 TT 좌로 통합된 Ab-C 중쇄 유전자의 2개 복사체를 포함하는 단편의 예측된 크기를 나타낸다.

Ab-C-H3xL3 발현 균주는 약간 상이한 방법을 이용하여 작제되었다. 형질변환에 앞서, 각 발현 벡터 (도 18-19)는 GAP 프로모터 좌로 벡터의 통합을 지시하기 위하여 AvrII를 이용하여 pGAP 서열에서 선형화되었다. 반수체 P. 파스토리스(P. pastoris) JC231 (Lys^-) 또는 JC239 (Met^-) 세포들은 그 다음 Pichia Protocols, Second Edition (Methods in Molecular Biology, Cregg, JM, Ed. 2007. Humana Press, Totowa, NJ)로부터 변형된 프로토콜에 따라 전기천공에 의해 선형화된 중쇄 또는 경쇄 벡터로 각각 개별적으로 변형되었다. 성공적인 형질변환체는 Zeocin™을 함유하는 YPDS 한천 플레이트 상에서 선택되었다. 전장의 Ab-C를 발현시키는 이배체 클론의 라이브러리를 생성시키기 위하여, 반수체 형질변환체를 모우고, 함께 혼합하고, 그리고 교배 배지 한천 플레이트상에 도말하였다. 이들은 30℃에서 24시간 동안 항온처리되었다. 그 다음 교배 플레이트로부터 세포들을 긁어내었고 이배체 클론을 선택하기 위하여 BYNB 한천 플레이트상에 스크리크하였다. 전장 항체를 발현시키는 각 이배체 클론의 능력은 콜로니 리프트/면역 블랏 방법에 의해 평가되었다(Wung et al. Biotechniques 21 808-812 (1996)). 간략하게 설명하자면, 플레이트에 막을 접촉시킴으로써 클론에 의해 생성된 분비된 항체를 니트로셀룰로오즈 막으로 이동시켰다. 염소 항-인간 F(ab')2 HRP (양고추냉이 과산화효소) 탐지 항체를 이용한 웨스턴 블랏 프로토콜을 이용하여 여과가 진행되었다. 화학적 발광 탐지를 이용하여, Ab-C의 상승된 수준을 발현시키는 콜로니들이 필름상에 가시화되었다. 300 μL의 BYPD (1% 효모 질소 베이스, 2% 펩톤, 2% 포도당, 0.1M 인산칼륨 pH 6, 그리고 50 μg/mL Zeocin™)을 함유하는 96-웰 플레이트 상에 이들 콜로니의 많은 분획이 선택되었다. 일정한 교반과 함께 30℃에서 60시간 동안 배양물이 성장되었다. 생성된 상청액들은 표준-효소-연계된 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 분석되었다. 이로부터, Ab-C의 높은 발현을 가진 단일 이배체 클론이 선택되었다. 중쇄 및 경쇄 유전자의 복사체 수를 결정하기 위한 서든 블랏 분석은 상기에서 설명되는 방법에 따라 최종 클론에서 실행되었다.

실시예 5

생물반응기에서 항체를 발현시키는 방법들

본 실시예는 추가 특징화 또는 사용을 위하여 생물반응기에서 항체를 생산하는 방법들을 설명한다.

우선, 다음의 영양소를 포함하는 배지((% w/v))를 이용하여 연구 세포 은행을 이용하여 접종물을 확장시켰다: 효모 추출물 3%, 무수 덱스트로오즈 4%, YNB 1.34%, 바이오틴 0.004% 그리고 100 mM 인산칼륨. 발효통에 접종물을 생성시키기 위하여, 세포 은행은 30℃ 및 300 rpm의 진탕 배양기(shaking incubator)에서 대략적으로 24 시간 확장되었다. 그 다음 10% 접종물이 1 L 멸균 성장 배지를 포함하는 Labfors 2.5L 작업 용적 용기에 추가되었다. 성장 배지는 다음의 영양소를 포함하였다: 황산칼륨 18.2 g/L, 인산암모늄 일염기 36.4 g/L, 인산칼륨 이염기 12.8 g/L, 7수화물 황산마그네슘 3.72 g/L, 구연산 나트륨염 이수화물 10 g/L, 글리세롤 40 g/L, 효모 추출물 30 g/L, PTM1 미량 금속 4.35 mL/L, 그리고 소포제(antifoam) 204 1.67 mL/L. PTM1 미량 금속 용액은 다음의 성분을 포함하였다: 황산제2구리 펜타수화물 6 g/L, 요오드화 나트륨 0.08 g/L, 황산망간 수화물 3 g/L, 몰리브덴산 나트륨염 이수화물 0.2 g/L, 붕산 0.02 g/L, 염화 코발트 0.5 g/L, 염화 아연 20 g/L, 황산제일철 7수화물 65 g/L, 바이오틴 0.2 g/L, 그리고 황산 5 mL/L.

생물반응기 처리 조절 매개변수는 다음과 같이 설정되었다: 교반 1000 rpm, 분당 기류 1.35 표준 리터, 온도 28℃ 그리고 pH (6에서)는 수산화암모늄을 이용하여 조절되었다. 산소 공급은 제공되지 않았다.

용존 산소 스파이크에 의해 나타나는 것과 같이 최초 글리세롤이 소비될 때까지 대략적으로 12 내지 16 시간 동안 발효 배양물이 성장되었다. 배양물은 용존된 산소가 고정된 후 대략적으로 3 시간 동안 굶주렸다. 기아(starvation) 기간 이후 반응기로 에탄올이 1%(w/v)에 도달할 때까지 에탄올이 볼루스 추가되었다. 15 내지 30 분 동안 발효 배양물이 평형이 되도록 하였다. 에탄올 볼루스 후 30분에 사료 추가가 시작되었고, 1 mL/min의 일정한 속도로 40 분간 설정되었으며, 그 다음 에탄올 감각 프로브 (Raven Biotech)를 이용하여 운용 나머지 동안 에탄올 농도를 1%에서 유지시키는 에탄올 센서에 의해 사료 펌프가 제어되었다. 사료는 다음의 성분을 포함하였다: 효모 추출물 50 g/L, 덱스트로오즈 일수화물 500 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L, 그리고 PTM1 미량 금속 12 mL/L. 임의선택적으로, 구연산 나트륨염 이수화물(0.5g/L) 또한 이 사료에 추가되었다. 총 발효 시간은 대략적으로 90 시간 (T90)이었다.

그 다음 항체 산출량은 단백질 A 친화력 컬럼을 갖춘, 분석용 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 결정되었다. 정제된 항체 시료를 이용하여 HPLC 피크에서 280nm (A₂₈₀)에서 광학 흡수를 통합시킴으로써 표준 곡선이 결정되었다.

실시예 6

HPLC에 의한 항체 산출량 및 순도 결정 방법들

단백질-A 정제된 항체 조제물의 순도를 분석하기 위하여, 크기 압출 고압 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)가 이용되었다. 간략하게 설명하자면, UV 탐지 기구와 함께 Agilent (Santa Clara, CA) 1200 Series HPLC가 이용되었다. 시료 분리를 위하여, Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA)의 TSKgel Guard SWx1 6x40 mM에 연결된 TSKgel GS3000SWx1 7.8x300 mM 컬럼이 이용되었다. 100 mM 인산 나트륨, 200 mM 염화나트륨 pH 6.5가 등용매(isocratic) 방식에서 0.5 mL/min의 유속으로 이동상으로 이용되었고, UV 215nm에서 흡수도가 모니터되었다. 시료의 주입에 앞서, 안정적인 기선이 획득될 때까지 컬럼은 평형화되었다. 시료는 이동상을 이용하여 1 mg/mL의 농도로 희석되었고, 30 μL 용적이 주입되었다. 컬럼 성능을 모니터하기 위하여, BioRad (Hercules, CA) 겔 여과 표준이 이용되었다.

실시예 7

단백질-A 친화력에 의한 항체 정제 방법들

피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 발현된 항체의 특징화를 위하여, 단백질 A 정제가 실행되었다. 간략하게 설명하자면, 수확된 발효 배양액으로부터 대략적으로 20 mL의 0.2μ정화된 상청액은 동량의 평형 완충액(20 mM 히스티딘 pH6)으로 희석되었다. 이 희석된 배양액으로부터 그 다음, 20 mL은 사전-평형화된 1 mL HiTrap MabSelect Sure 컬럼 (GE, Piscataway, NJ)상에 로드되었다. 이 컬럼은 30 컬럼 용적의 평형 완충액으로 후속적으로 세척되었다. 컬럼에 결합된 항체는 경사 단계를 이용하여 100% 용리 완충액(100 mM 구연산 pH 3.0)으로 용리되었다. 1 mL 분획을 수집하였고, 100μL의 2M 트리스 완충액 pH 8.0을 이용하여 즉시 중화되었다. 단백질을 함유하는 분획들은 280nM에서 흡수도를 측정함으로써 결정되었고, 그리고 단백질-함유 분획들이 모아졌다.

실시예 8

SDS-PAGE, 웨스턴 블랏팅 그리고 렉틴 컬럼 정제에 의해 불순물의 특징화 방법들

SE-HPLC는 상이한 균주들에서 중쇄 발현에 대한 경쇄 발현 비율에 의해 조정되는 산물-연합된 변이체의 정량화를 허용한다. 이 산물-연합된 변이체의 성질을 특징화하기 위하여, 우리는 친화력 렉틴 컬럼을 이용하여 웨스턴 블랏 분석 및 정제를 하였다. 간략하게 설명하자면, 웨스턴 블랏 분석을 위하여, 5μg 시료들은 NuPAGE 환원 물질 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 함께 LDS 시료 로딩 완충액에서 준비되었으며, 70C에서 10분간 가열되었다. 그 다음 시료의 4㎍ 등가물을 4-12% BisTris 구배 겔상에 로드시켰고, MES 운용(running) 완충액 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 전기영동에 의해 분리시켰다. 겔에서 분리된 단백질들은 I-Blot (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 니트로셀룰로오즈 막상에 블랏되었고, 60 분 동안 차단 용액 (DPBS-T [0.1% 트윈-20 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 DPBS 용액에 10% 분유 용액])에서 차단되었다. 차단된 막은 차단 용액에서 1:10,000 희석을 이용하여 염소-항-인간 FC 과산화효소 접합된 항체 (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc, West Grove, PA)와 함께 30분 동안 프로브되었다. 그 다음 블랏은 DPBS 0.1% 트윈 용액에서 5분간, 총 4회 세척되었다. 현상(development)을 위하여, ECL 상승(advance) 화학발광 시약(Amersham/GE, Piscataway, NJ)이 이용되었고, 영상은 CCD 카메라(Alpha Innotech/Cell Biosciences, Santa Clara, CA)를 이용하여 캡쳐되었다.

산물-연합된 변이체를 추가 특징화시키기 위하여, 아가로즈-결합된 갈안투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴 (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)를 이용하였다. 갈안투스 니발리스(Galanthus nivalis) 렉틴은 만노즈-함유하는 단백질에 결합하고, 결합을 위하여 Ca⁺⁺ 또는 Mn⁺⁺를 요구하지 않는 작은 분자량의 단백질이다. 결합을 위하여, 2 mL의 수지는 14 mL 의 DBS로 재현탁-원심분리에 의해 4회 세척되었다. 세척 후, 비드는 DPBS에서 최종 50% 슬러리 농도로 재현탁되었고, 400μL는 1.5 내지 4mg의 단백질을 함유하는 단백질-A 정제된 항체 시료에 추가되었다. 아가로즈-결합된 렉틴은 연속 혼합과 함께 2.5 시간 동안 실온에서 이 항체와 함께 항온처리되었다. 항온처리 종료시, 시료를 회전시키고, 상청액이 수거되고, "flow-thru"로 라벨화된다. 그 다음 비드들은 비어었는 Bio-Rad 드립 컬럼 (Hercules, CA)으로 이동되었으며, DPBS를 이용하여 중력에 의해 세척되었다. 이 시간에 0.5 mL를 이용한 세척 및 280nm 흡수도 관찰에 총 6mL이 이용되었다. 결합된 단백질은 0.2M 메틸-알파-D-만노피라노시드를 이용하여 용리되었다. 그 다음 시료, 로드 및 용리된 단백질들은 SDS-PAGE, 그리고 항-인간 Fc 특이적 시료를 이용한 웨스턴 블랏, 그리고 SE-HPLC에 의해 분석되었다. SDS-PAGE는 4%-12% 폴리아크릴아미드 구배, NuPAGE® MES SDS 운영 완충액 및 NuPAGE® LDS 시료 완충액(모두 Invitrogen, Carlsbad, Ca.의 제품)을 포함하는 미리 성형된 폴리아크릴아미드 겔(NuPAGE® Bis-Tris Gels)을 포함하는 것을 이용하여 제조업자의 지시에 따라 실행되었다. 로딩에 앞서, 제조업자의 지시에 따라 NuPAGE® 시료 환원 물질(Invitrogen, Carlsbad, Ca.)을 이용하여 시료는 환원되었다.

본 발명의 다양하게 설명된 구체예들의 상기 설명은 공개된 정확한 형태로 본 발명을 한정 또는 포괄시키려는 의도는 아니다. 본 발명의 특정 구체예 및 실시예들은 설명을 목적으로 기술되었지만, 본 발명의 범위 안에서 다양한 등가의 변형들이 가능하며, 이는 당업계 숙련자들이 인지할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 교시는 상기 설명된 실시예들 이외에 다른 목적들에도 적용될 수 있다.

본 발명은 전술한 설명 및 실시예에서 구체적으로 설명된 방식이외의 방식으로 실행될 수 있다. 본 발명의 수많은 변형 및 변화는 상기 교시 관점에서 가능하며, 따라서 첨부된 청구범위의 범위 안에 있다.

상기 설명에 의하여 본 발명에 대해 이러한 변화들 및 다른 변화들이 있을 수 있다. 일반적으로 다음의 청구범위에서, 이용된 용어는 명세서에서 공개된 특정 구체예들과 청구범위를 제한해서는 안된다. 따라서, 본 발명은 공개된 명세서에 의해 제한되지 않으며, 본 발명의 범위는 다음의 청구범위에 의하여 전적으로 결정된다.

항원-특이적 B 세포들의 클론 집단을 획득하는 방법에 관한 특정 교시는 2006년 5월 19일자로 제출된 미국 가특허출원 번호 60/801,412에 공개되며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

토끼-유도된 단클론 항체의 인간화 및 항원 결합 친화력을 유지하기 위한 바람직한 서열 변형에 관한 특정 교시는 2008년 5월 21일자로 제출된 국제 공개 WO/2008/144757에 대응하는 국제 출원 번호 PCT/US2008/064421, 발명의 명칭 "신규한 토끼 항체 인간화 방법들과 인간화된 토끼 항체"에 공개되어 있으며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

교배 역량있는 효모를 이용한 항체 또는 이의 단편을 생산하는 것과 관련된 특정 교세 및 대응하는 방법은 2006년 5월 8일자로 제출된 미국 특허 출원 번호11/429,053(미국 특허 출원 공개 번호 US2006/0270045)에 공개되어 있으며, 이의 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

배경, 요약, 상세한 설명 및 실시예에서 언급된 각 문헌을 포함하여 본 명세서에서 언급된 각 문헌(특허, 특허 출원, 논문, 요약서, 매뉴얼, 책 또는 기타 공개물 포함)의 전체 내용)은 이들 각각은 전문이 여기에 참고자료로 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> ALDERBIO HOLDINGS LLC Mitchell, Danielle M Garcia-Martinez, Leon F Ojala, Ethan W Inan, Mehmet McNeill, Patricia D Latham, John <120> MULTI-COPY STRATEGY FOR HIGH-TITER AND HIGH-PURITY PRODUCTION OF MULTI-SUBUNIT PROTEINS SUCH AS ANTIBODIES IN TRANSFORMED MICROBES SUCH AS PICHIA PASTORIS <130> 67858.730202 <140> tba <141> 2012-08-20 <150> 61/525,307 <151> 2011-08-19 <150> 13/466,795 <151> 2012-05-08 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Leu Asp Leu Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Val Ile Gly Ile Asn Asp Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 130 135 140 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 145 150 155 160 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 180 185 190 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Ala Arg 195 200 205 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 290 295 300 Gln Asp 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780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacgcc 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1080 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350 <210> 28 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Val Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Ile 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sequence <400> 29 gctatccaga tgacccagtc tccttcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc aggccagtca gagcattaac aatgagttat cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccaacag ggttatagtc tgaggaacat tgataatgct 300 ttcggcggag ggaccaaggt ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 360 ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 420 aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 480 aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 540 accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 600 catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg t 651 <210> 30 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized antibody sequence <400> 30 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Glu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Arg Asn 85 90 95 Ile Asp Asn Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 31 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 31 Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Gly <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 32 Met Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 33 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala <210> 34 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 34 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg 35 <210> 35 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 35 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val 20 <210> 36 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 36 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Ser Leu Glu Lys Arg 20 25 <210> 37 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 37 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Glu Gly Val Ser Leu 20 25 30 Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Ala 35 40 <210> 38 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 38 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln 20 25 30 Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe 35 40 45 Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu 50 55 60 Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val 65 70 75 80 Ser Leu Glu Lys Arg 85 <210> 39 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 39 Met Thr Lys Pro Thr Gln Val Leu Val Arg Ser Val Ser Ile Leu Phe 1 5 10 15 Phe Ile Thr Leu Leu His Leu Val Val Ala Leu Asn Asp Val Ala Gly 20 25 30 Pro Ala Glu Thr Ala Pro Val Ser Leu Leu Pro Arg 35 40 <210> 40 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 40 Met Phe Ser Pro Ile Leu Ser Leu Glu Ile Ile Leu Ala Leu Ala Thr 1 5 10 15 Leu Gln Ser Val Phe Ala 20 <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 41 Met Gln Thr Leu Leu Val Ser Ser Leu Val Val Ser Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Leu Pro His Tyr Ile Arg 20 <210> 42 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 42 Met Ile Phe Leu Lys Leu Ile Lys Ser Ile Val Ile Gly Leu Gly Leu 1 5 10 15 Val Ser Ala Ile Gln Ala 20 <210> 43 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 43 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20 <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 44 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 45 Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala 20 <210> 46 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 46 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro 20 <210> 47 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 47 Met Ala Ala Asp Ser Gln Thr Pro Trp Leu Leu Thr Phe Ser Leu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Trp Pro Gln Glu Pro Gly Ala 20 25 <210> 48 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 48 Met Lys Lys Asn Arg Met Met Met Met Ile Trp Ser Val Gly Val Val 1 5 10 15 Trp Met Leu Leu Leu Val Gly Gly Ser Tyr Gly 20 25 <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 49 Met Gln Lys Leu Ile Ile Phe Ala Leu Val Val Leu Cys Val Gly Ser 1 5 10 15 Glu Ala <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 50 Met Lys Ala Leu Ile Val Leu Gly Leu Val Leu Leu Ser Val Thr Val 1 5 10 15 Gln Gly <210> 51 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 51 Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Met Ile Ala Leu 1 5 10 15 Pro Ser Pro Ser 20 <210> 52 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 52 Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly <210> 53 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 53 Met Leu Ser Leu Lys Pro Ser Trp Leu Thr Leu Ala Ala Leu Met Tyr 1 5 10 15 Ala Met Leu Leu Val Val Val Pro Phe Ala Lys Pro Val Arg Ala 20 25 30 <210> 54 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Secretion signal peptide <400> 54 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ala Lys Cys 20

Claims (160)

1. 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 많은 산출량으로 생산하는 숙주 세포를 확인하는 방법에 있어서:
   (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 유전자를 각각 포함하는 최소한 두 가지 숙주 세포를 포함하고;
   이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포는 2개의 부모 세포의 교배 또는 융합에 의해 각각 생성되며, 이때 각 부모 세포는 최소한 하나의 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 포함하고;
   (b) 다수의 아단위 복합체를 발현시키기 위하여 전술한 각 숙주 세포를 배양하고, 이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포에서 유전자는 전술한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위의 상이한 발현 수준을 제공하며;
   (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생산되는 다수의 아단위 복합체의 산출량을 측정하고; 그리고
   (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 큰 산출량을 생성하는 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 많은 산출량으로 생산하는 숙주 세포로 확인하는 것을 포함하는, 방법.
2. 청구항 1의 방법에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 그리고 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 전술한 유전자는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자를 포함하는, 방법.
3. 청구항 1의 방법에 있어서, 스크린된 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 포함하는 아단위를 인코드하는 유전자의 상이한 복사체 수 조합을 발현시키는 숙주 세포를 포함하는, 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 15개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
5. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 12개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
6. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 10개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
7. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 8개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
8. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 6개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
9. 청구항 3에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 항체인 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 10개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
10. 청구항 1-9중 임의의 한 항에 있어서, 숙주 세포들은 이배체의 효모 세포인, 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 전술한 이배체의 효모는 피치아(Pichia) 세포들인, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 전술한 피치아(Pichia)는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포들인, 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 전술한 이배체 효모 세포는 메틸영양성 효모, 피치아(Pichia) 속의 효모, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)인, 방법.
14. 더 높은 순도의 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는 숙주 세포를 확인하는 방법에 있어서:
    (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 유전자를 각 포함하는 최소한 두 가지 숙주 세포를 포함하고;
    이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포는 2개의 부모 세포의 교배 또는 융합에 의해 각각 생성되며, 이때 각 부모 세포는 최소한 하나의 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 포함하고;
    (b) 다수의 아단위 복합체를 발현시키기 위하여 전술한 각 숙주 세포를 배양하고, 이때 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포에서 유전자는 전술한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위의 상이한 발현 수준을 제공하며;
    (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생산되는 다수의 아단위 복합체의 순도를 측정하고; 그리고
    (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 큰 순도를 생성하는 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 큰 순도로 생산하는 숙주 세포로 확인하는 것을 포함하는, 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 전술한 유전자는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 유전자를 포함하는, 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 전술한 순도는 하나 또는 그 이상의 당화된 항체 쇄의 상대적인 비율을 측정함으로써 결정되는, 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 전술한 하나 또는 그 이상의 당화된 항체 쇄는 당-중쇄 변이체를 포함하는, 방법.
18. 청구항 1의 방법에 있어서, 스크린된 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 포함하는 아단위를 인코드하는 유전자의 상이한 복사체 수 조합을 발현시키기는 숙주 세포를 포함하는, 방법.
19. 청구항 14에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 15개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
20. 청구항 14에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 12개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
21. 청구항 14에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 10개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
22. 청구항 14에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 8개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
23. 청구항 13에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 6개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
24. 청구항 14에 있어서, 숙주 세포들의 패널은 항체인 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 각 유전자의 최대 10개 복사체를 발현시키는 세포들을 포함하고, 그리고 다른 아단위(들)과 비교하여 각 아단위의 모든 가능한 복사체 수의 조합을 실질적으로 나타내는, 방법.
25. 청구항 14-24중 임의의 한 항에 있어서, 숙주 세포들은 이배체의 효모 세포인, 방법.
26. 청구항 25에 있어서, 전술한 이배체의 효모는 피치아(Pichia) 세포들인, 방법.
27. 청구항 26에 있어서, 전술한 피치아(Pichia)는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포들인, 방법.
28. 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 많은 산출량으로 생산하는 숙주 세포를 확인하는 방법에 있어서:
    (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 유전자를 각각 포함하는 최소한 두 가지 숙주 세포를 포함하고;
    (b) 다수의 아단위 복합체를 발현시키기 위하여 전술한 각 숙주 세포를 배양하고;
    (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생산되는 다수의 아단위 복합체의 산출량을 측정하고; 그리고
    (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 큰 산출량을 생성하는 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 많은 산출량으로 생산하는 숙주 세포로 확인하는 것을 포함하는, 방법.
29. 청구항 28에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 전술한 유전자는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자를 포함하는, 방법.
30. 더 높은 순도의 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는 숙주 세포를 확인하는 방법에 있어서:
    (a) 숙주 세포들의 패널을 제공하고, 전술한 패널은 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 유전자를 각 포함하는 최소한 두 가지 숙주 세포를 포함하고;
    (b) 다수의 아단위 복합체를 발현시키기 위하여 전술한 각 숙주 세포를 배양하고;
    (c) 전술한 각 숙주 세포에 의해 생산되는 다수의 아단위 복합체의 순도를 측정하고; 그리고
    (d) 전술한 숙주 세포들의 패널에서 또다른 숙주 세포보다 더 큰 순도를 생성하는 숙주 세포는 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 큰 순도로 생산하는 숙주 세포로 확인하는 것을 포함하는, 방법.
31. 청구항 30에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 전술한 유전자는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 및 중쇄를 인코드하는 유전자를 포함하는, 방법.
32. 청구항 31에 있어서, 전술한 순도는 하나 또는 그 이상의 당화된 항체 쇄의 상대적인 비율을 측정함으로써 결정되는, 방법.
33. 청구항 32에 있어서, 전술한 하나 또는 그 이상의 당화된 항체 쇄는 당-중쇄 변이체를 포함하는, 방법.
34. 청구항 28-33중 임의의 한 항에 있어서, 숙주 세포들은 이배체의 효모 세포인, 방법.
35. 청구항 34에 있어서, 전술한 이배체 효모 세포는 메틸영양성 효모, 피치아(Pichia) 속의 효모, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)인, 방법.
36. 청구항 34 또는 35에 있어서, 전술한 숙주 세포들의 패널은 전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위를 인코드하는 상이한 수의 복사체를 포함하는 반수체 세포들의 교배 또는 융합에 의해 생성되며, 이로 인하여 전술한 교배로 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 유전자의 상이한 수의 복사체를 포함하는 이배체 세포들이 생산되는, 방법.
37. 청구항 36에 있어서, 다수의 아단위 복합체의 아단위들의 발현을 제공하는 전술한 유전자들은 전술한 반수체 세포들의 게놈에 통합되는, 방법.
38. 청구항 28-33중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 다배수체 효모 세포인, 방법.
39. 청구항 28-33중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 사배체 효모 세포인, 방법.
40. 청구항 39에 있어서, 전술한 이배체 효모 세포는 메틸영양성 효모, 피치아(Pichia) 속의 효모, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 또는 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)인, 방법.
41. 청구항 39 또는 40에 있어서, 전술한 숙주 세포들의 패널은 전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위를 인코드하는 상이한 수의 복사체를 포함하는 반수체 세포들의 교배 또는 융합에 의해 생성되며, 이로 인하여 전술한 교배로 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 유전자의 상이한 수의 복사체를 포함하는 사배체 세포들이 생산되는, 방법.
42. 청구항 41에 있어서, 다수의 아단위 복합체의 아단위들의 발현을 제공하는 전술한 유전자들은 전술한 이수체 세포들의 게놈에 통합되는, 방법.
43. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 전술한 확인된 숙주 세포는 생산 배양물을 발달시키기 위하여 이용되는, 방법.
44. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 진핵세포인, 방법.
45. 청구항 44에 있어서, 전술한 진핵세포는 효모 세포인, 방법.
46. 청구항 45에 있어서, 전술한 부모 세포들은 각 반수체, 이배체 또는 다배수체 효모 세포들인, 방법.
47. 청구항 45 또는 46에 있어서, 전술한 효모 세포는 메틸영양성 효모인, 방법.
48. 청구항 47에 있어서, 전술한 메틸영양성 효모는 피치아(Pichia) 속의 효모인, 방법.
49. 청구항 48에 있어서, 피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 방법.
50. 청구항 48에 있어서, 피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 및 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
51. 청구항 48에 있어서, 다수의 아단위 복합체의 아단위의 발현을 제공하는 전술한 유전자는 pGAP, 3' AOX TT, PpURA5, OCH1, AOX1, HIS4, GAP, ARG, 및 HIS4 TT 좌로 구성된 군으로부터 선택쇤 하나 또는 그 이상의 게놈 좌에 통합되는, 방법.
52. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위를 인코드하는 전술한 유전자중 최소한 하나는 유도성 또는 구성 프로모터의 제어하에서 발현되는, 방법.
53. 청구항 52에 있어서, 전술한 유도성 프로모터는 GAP, CUP1, AOX1, 및 FLD1 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
54. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 다수의 아단위 복합체의 전술한 아단위를 인코드하는 전술한 유전자둥 최소한 하나는 AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 이로부터 유도된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 그리고 조류 프로모터으로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에서 발현되는, 방법.
55. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 이배체 또는 사배체 세포인, 방법.
56. 전술한 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 전술한 세포들 또는 배양 배지로부터 정제된, 방법.
57. 청구항 56에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 세포내 성분, 세포질, 핵질, 또는 전술한 세포들의 막으로부터 정제된, 방법.
58. 청구항 56에 있어서, 전술한 숙주 세포는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 배양 배지로 방출시키는, 방법.
59. 청구항 58에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 전술한 배양 배지로부터 정제되는, 방법.
60. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체인, 방법.
61. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 최소한 두 가지 숙주 세포들은 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 복사체의 상이한 수들을 포함하는, 방법.
62. 청구항 61에 있어서, 전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위를 인코드하는 전술한 유전자의 최소한 두 개 복사체를 포함하는, 방법.
63. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위를 인코드하는 유전자를 포함하고, 이 유전자의 발현은 전술한 패널의 상이한 숙주 세포에서 대응하는 유전자의 발현을 구동시키는 프로모터와는 상이한 프로모터에 의해 구동되는, 방법.
64. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 패널에서 최소한 하나의 숙주 세포는 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 하나 이상의 서열을 포함하는 다시스트론성 유전자를 포함하는, 방법.
65. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 IL-6, TNF-알파, CGRP, PCSK9, 또는 NGF에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 방법.
66. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
67. 청구항 66에 있어서, 전술한 인간화된 항체는 마우스, 쥐, 토끼, 염소, 양, 또는 소 기원의 항체인, 방법.
68. 청구항 66에 있어서, 전술한 인간화된 항체는 토끼 기원의 항체인, 방법.
69. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 단가, 이가, 또는 다가 항체를 포함하는, 방법.
70. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 패널에서 전술한 숙주 세포들중 최소한 하나에서 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위 발현을 제공하는 전술한 유전자들중 최소한 하나는 전술한 숙주 세포에서 발현에 대하여 최적화된, 방법.
71. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하며, 전술한 바람직한 항체의 순도는 전술한 숙주 세포에 의해 생산되는 비-당화된, 예측된 겉보기 유체역학 반경을 보유하는 항체 복합체에 포함되고, 및/또는 전술한 바람직한 항체의 표적에 특이적으로 결합하는 바람직한 항체의 분획을 측정함으로써 평가되는, 방법.
72. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 이때 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 전술한 바람직한 항체의 산출량은 당화된, 예측된 겉보기 유체역학 반경을 보유하는 복합체 이외의 항체 복합체에 포함된, 및/또는 전술한 바람직한 항체의 표적에 특이적으로 결합하지 못한 임의의 산물-연합된 변이체를 제함으로써 전술한 숙주 세포에 의해 생산된 바람직한 항체의 양을 결정함으로써 평가되는, 방법.
73. 바람직한 다수의 아단위 복합체를 재조합에 의해 생산하는 방법에 있어서:
    (a) 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 하나 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하고, 이때 전술한 숙주 세포는 전술한 청구항들중 임의의 한 항의 방법에 의해 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 높은 산출량 및/또는 순도로 생산하는 숙주 세포로 확인되며; 그리고
    (b) 전술한 숙주 세포를 배양시켜 전술한 다수의 아단위 복합체가 발현되는 것을 포함하는, 방법.
74. 청구항 73에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는, 방법.
75. 청구항 74에 있어서, 전술한 바람직한 항체의 정제를 더 포함하는, 방법.
76. 청구항 74 또는 75에 있어서, 전술한 숙주 세포는 최소한 100 mg/L, 최소한 150 mg/L, 최소한 200 mg/L, 최소한 250 mg/L, 최소한 300 mg/L, 100 내지 300 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 100 내지 1000 mg/L, 최소한 1000 mg/L, 최소한 1250 mg/리터, 최소한 1500 mg/리터, 1750 mg/리터, 2000 mg/리터, 또는 그 이상의 항체 역가를 생산하는, 방법.
77. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 20 세대(generation) 동안 안정적인, 방법.
78. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 50 세대(generation) 동안 안정적인, 방법.
79. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 100 세대(generation) 동안 안정적인, 방법.
80. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 500 세대(generation) 동안 안정적인, 방법.
81. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 1000 세대(generation) 동안 안정적인, 방법.
82. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위들의 최소한 하나를 인코드하는 유전자 복사체는 2개 또는 그 이상 좌로 통합된, 방법.
83. 전술한 항들중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위들의 최소한 하나를 인코드하는 유전자 복사체는 3개 또는 그 이상 좌로 통합된, 방법.
84. 청구항 82 또는 83의 방법에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 5개 복사체를 포함하는, 방법.
85. 청구항 82 또는 83의 방법에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 4개 복사체를 포함하는, 방법.
86. 청구항 82 또는 83의 방법에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 3개 복사체를 포함하는, 방법.
87. 청구항 1 내지 86중 임의의 방법에 의해 바람직한 다수의 아단위 복합체를 더 높은 산출량 및/또는 순도로 생산하는 숙주 세포로 확인된 숙주 세포에 있어서, 이때 전술한 숙주 세포는 2개 부모 세포의 교배 또는 융합에 의해 생산되며, 이때 각 부모 세포는 최소한 하나의 전술한 다수 복합체의 아단위들을 인코드하는 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 포함하는, 숙주 세포.
88. 청구항 77에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 각각 인코드하는 2개의 상이한 유전자의 각각 최소한 하나의 복사체는 전술한 숙주 세포의 2개의 상동상 염색체의 동일한 좌로 통합되는, 숙주 세포.
89. 청구항 87 또는 88에 있어서, 숙주 세포는 피치아(Pichia) 속의 이배체 또는 사배체 세포인, 숙주 세포.
90. 청구항 89에 있어서, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포인, 숙주 세포.
91. 청구항 87-90중 임의의 한 항에 따른 숙주 세포로부터 유도된 이배체 또는 사배체 효모 배양물.
92. 청구항 87-91에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 발현을 제공하는 유전자들중 최소한 하나는 전술한 숙주 세포의 게놈에 통합된, 숙주 세포.
93. 청구항 87-92중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 발현을 제공하는 유전자들중 최소한 하나는 하나 또는 그 이상의 염색체이외의 요소, 플라스미드, 또는 인공 염색체에 포함된, 숙주 세포.
94. 청구항 87-93중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는, 숙주 세포.
95. 청구항 94에 있어서, 전술한 숙주 세포는 전술한 바람직한 항체의 중쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체보다 전술한 바람직한 항체의 경쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체를 더 많이 포함하는, 숙주 세포.
96. 청구항 94에 있어서, 전술한 숙주 세포는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체보다 전술한 바람직한 항체의 중쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체를 더 많이 포함하는, 숙주 세포.
97. 청구항 94에 있어서, 전술한 숙주 세포는 전술한 바람직한 항체의 경쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체와 전술한 바람직한 항체의 중쇄 발현을 제공하는 유전자의 복사체를 동일한 수로 포함하는, 숙주 세포.
98. 청구항 94에 있어서, 전술한 바람직한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개 복사체와 전술한 바람직한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 1-10개 복사체를 포함하는, 숙주 세포.
99. 청구항 94에 있어서, 전술한 바람직한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수와 전술한 바람직한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수는 각각 다음과 같은, 숙주 세포: 2와 2, 2와 3, 3과 3, 3과 4, 3과 5, 4와 3, 4와 4, 4와 5, 4와 6, 5와 4, 5와 5, 5와 6, 또는 5와 7.
100. 청구항 94에 있어서, 전술한 바람직한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수와 전술한 바람직한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 수는 각각 다음과 같은, 숙주 세포: 2와 1, 3과 1, 4와 1, 5와 1, 6과 1, 7과 1, 8과 1, 9와 1, 10과 1, 1과 2, 2와 2, 3과 2, 4와 2, 5와 2, 6과 2, 7과 2, 8과 2, 9와 2, 10과 2, 1과 3, 2와 3, 3과 3, 4와 3, 5와 3, 6과 3, 7과 3, 8과 3, 9와 3, 10과 3, 1과 4, 2와 4, 3과 4, 4와 4, 5와 4, 6과 4, 7과 4, 8과 4, 9 와 4, 10과 4, 1과 5, 2와 5, 3과 5, 4와 5, 5과 5, 6 과 5, 7과 5, 8과 5, 9와 5, 10과 5, 1과 6, 2와 6, 3과 6, 4와 6, 5와 6, 6과 6, 7과 6, 8과 6, 9와 6, 10과 6, 1과 7, 2와 7, 3과 7, 4와 7, 5와 7, 6과 7, 7과 7, 8과 7, 9와 7, 10과 7, 1과 8, 2와 8, 3과 8, 4와 8, 5와 8, 6과 8, 7과 8, 8과 8, 9와 8, 10과 8, 1과 9, 2와 9, 3과 9, 4과 9, 5와 9, 6과 9, 7과 9, 8과 9, 9와 9, 10과 9, 1과 10, 2와 10, 3과 10, 4와 10, 5와 10, 6과 10, 7과 10, 8과 10, 9와 10, 10과 10.
101. 청구항 87-100중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 20 세대 동안 안정적인, 숙주 세포.
102. 청구항 87-100중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 50 세대 동안 안정적인, 숙주 세포.
103. 청구항 87-100중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 100 세대 동안 안정적인, 숙주 세포.
104. 청구항 87-100중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 500 세대 동안 안정적인, 숙주 세포.
105. 청구항 87-100중 임의의 한 항에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 유전자의 복사체 수 및/또는 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 산출량은 1000 세대 동안 안정적인, 숙주 세포.
106. 청구항 87-105중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위들중 최소한 하나를 인코드하는 유전자 복사체는 2개 또는 그 이상의 좌에 통합된, 숙주 세포.
107. 청구항 87-105중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위들중 최소한 하나를 인코드하는 유전자 복사체는 3개 또는 그 이상의 좌에 통합된, 숙주 세포.
108. 청구항 106 또는 107에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 5개 복사체를 포함하는, 숙주 세포.
109. 청구항 104 또는 105에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 4개 복사체를 포함하는, 숙주 세포.
110. 청구항 106 또는 107에 있어서, 각 좌는 주어진 아단위의 3개 복사체를 포함하는, 숙주 세포.
111. 청구항 91에 있어서, 생산 배지에서 성장되는 효모 배양물.
112. 청구항 111에 있어서, 전술한 생산 배지는 최소 배지인, 효모 배양물.
113. 청구항 112에 있어서, 전술한 최소 배지는 선택성 물질들이 결핍된, 효모 배양물.
114. 청구항 112에 있어서, 전술한 최소 배지는 사전-형성된 아미노산들 또는 다른 복합체 생물분자들이 결핍된, 효모 배양물.
115. 청구항 91에 있어서, 높은 세포 밀도로 성장되는, 배양물.
116. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 50 g/L인, 배양물.
117. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 100 g/L인, 배양물.
118. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 300 g/L인, 배양물.
119. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 400 g/L인, 배양물.
120. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 500 g/L인, 배양물.
121. 청구항 115에 있어서, 전술한 높은 세포 밀도는 최소한 750 g/L인, 배양물.
122. 청구항 91에 있어서, 효모 세포들은 최소한 20 배증(doubling)을 위하여 배양되며, 그리고 전술한 최소한 20 배증 이후 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 높은 발현 수준이 유지되는, 배양물.
123. 청구항 91에 있어서, 효모 세포들은 최소한 50 배증을 위하여 배양되며, 그리고 전술한 최소한 50 배증 이후 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 높은 발현 수준이 유지되는, 배양물.
124. 청구항 91에 있어서, 효모 세포들은 최소한 100 배증을 위하여 배양되며, 그리고 전술한 최소한 100 배증 이후 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 높은 발현 수준이 유지되는, 배양물.
125. 청구항 122-124중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는, 배양물.
126. 청구항 1 내지 86중 임의의 한 방법에 따라 생산된 세포로부터 유도된 안정적인 이배체 피치아(Pichia) 효모 배양물을 포함하는 배양 배지에 있어서, 이때 배양 배지는 최소한 약 50 mg/리터, 100 mg/리터, 500 mg/리터 또는 1000 mg/리터, 1500 mg/리터 또는 그 이상인 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 발현 수준을 포함하는, 배양 배지.
127. 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 배양 배지로 발현시키는 청구항 1 내지 86중 임의의 한 방법에 따라 생산된 세포로부터 안정적인 이배체 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 배양물을 포함하는 배양 배지에 있어서, 이때 전술한 배양물에서 전술한 이배체 세포들의 세포 밀도는 최소한 약 50 g/L, 100 g/L, 300 g/L, 400 g/L, 500 g/L, 700 g/L, 또는 그 이상, 배양 배지.
128. 청구항 126 또는 127에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는, 배양 배지.
129. 전술한 청구항중 임의의 하나의 방법 또는 조성물에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위는 분비 신호를 포함하는 방법 또는 조성물.
130. 청구항 129에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는 방법 또는 조성물.
131. 청구항 129 또는 130에 있어서, 분비 신호는 닭 라이소자임 (CLY) 신호 펩티드; CLY-L8; S. 세레비시에(S. cerevisiae) 전화효소 (SUC2) 신호 펩티드; MF-알파 (Prepro); MF-알파 (Pre)-apv; MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR; MF-알파 (Prepro)-(EA)3; αF 신호 펩티드; KILM1 신호 펩티드; 억제성 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩티드; A.나이져(A. niger) GOX 신호 펩티드; 쉬반이노시메스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 글루코아밀라제 유전자 (GAM1) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열과 함께 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열없이 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드; ISN 신호 펩티드; IFN 신호 펩티드; HGH 신호 펩티드; 피토헤마글루티닌 (PHA); 누에(Silkworm) 라이소자임; 인간 라이소자임 (LYZ1); 액티빈 수용체 유형-1; 액티빈 유형 II 수용체; P. 파스토리스(P. pastoris) 면역글로블린 결합 단백질 (PpBiP); 인간 항체 3D6 경쇄 리더; 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 방법 또는 조성물.
132. 전술한 청구항중 임의의 하나의 방법 또는 조성물에 있어서, 전술한 부모 세포들은 각각 반수체, 이배체 또는 다배수체 효모 세포들인, 방법 또는 조성물.
133. 바람직한 다수의 아단위 복합체를 재조합적으로 생산하는 방법에 있어서,
     (a) 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 유전자의 2 내지 10개 복사체를 포함하는 숙주 세포를 제공하고; 그리고
     (b) 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 전술한 유전자들을 발현시키기 위하여 전술한 숙주 세포를 배양하고,
     이때 전술한 숙주 세포는 2개의 부모 세포의 교배 또는 융합에 의해 생성되며, 이때 각 부모 세포는 전술한 다수의 아단위 복합체의 하나 또는 그 이상의 아단위를 인코드하는 유전자의 하나 또는 그 이상의 복사체를 포함하는 것을 포함하는 방법.
134. 바람직한 다수의 아단위 복합체를 재조합적으로 생산하는 방법에 있어서,
     (a) 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 유전자의 2 내지 10개 복사체를 포함하는 숙주 세포를 제공하고; 그리고
     (b) 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 각 아단위를 인코드하는 전술한 유전자들을 발현시키기 위하여 전술한 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
135. 청구항 133 또는 134의 방법에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 각각 인코드하는 두 가지 상이한 유전자의 각각의 최소한 하나의 복사체는 전술한 숙주 세포의 2개의 상동성 염색체의 동일한 좌에 통합되는, 방법.
136. 청구항 133-135중 임의의 하나에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하는, 방법.
137. 청구항 133-136중 임의의 하나에 있어서, 이때 전술한 숙주 세포는 진핵세포인, 방법.
138. 청구항 137의 방법에 있어서, 전술한 진핵세포는 효모 세포인, 방법.
139. 청구항 138의 방법에 있어서, 전술한 효모 세포는 메틸영양성 효모인, 방법.
140. 청구항 139의 방법에 있어서, 전술한 메틸영양성 효모는 피치아(Pichia) 속의 효모인, 방법.
141. 청구항 140의 방법에 있어서, 이때 피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인, 방법.
142. 청구항 140의 방법에 있어서, 피치아(Pichia) 속의 전술한 메틸영양성 효모는 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 귀레르모르디(Pichia guillermordii), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 및 피치아 이노시토베라(Pichia inositovera)으로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
143. 청구항 140의 방법에 있어서, 전술한 다수의 아단위 복합체의 아단위들의 발현을 제공하는 최소한 하나의 전술한 유전자는 pGAP 좌 및 HIS4 TT 좌로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 게놈 좌에 통합된, 방법.
144. 청구항 133-143중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 인코드하는 최소한 하나의 전술한 유전자는 유도성 또는 구성 프로모터의 제어하에서 발현되는, 방법.
145. 청구항 144의 방법에 있어서, 전술한 유도성 프로모터는 GAP, AOX1, CUP1, 및 FLD1 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된, 방법.
146. 청구항 133-145중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 항체 경쇄 및/또는 중쇄를 인코드하는 최소한 하나의 전술한 유전자는 AOX1, ICL1, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAP), FLD1, ADH1, 알코올 데히드로게나제 II, GAL4, PHO3, PHO5, 및 Pyk 프로모터, 이로부터 유도된 키메라 프로모터, 효모 프로모터, 포유류 프로모터, 곤충 프로모터, 식물 프로모터, 파충류 프로모터, 양서류 프로모터, 바이러스 프로모터, 그리고 조류 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터의 제어하에 발현되는, 방법.
147. 청구항 133-146중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 이배체 또는 사배체 세포인, 방법.
148. 청구항 133-147중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 숙주 세포는 전술한 바람직한 항체를 배양 배지로 방출시키는, 방법.
149. 청구항 133-148중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 항체는 단일특이적 또는 이중특이적 항체인, 방법.
150. 청구항 133-149중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 항체는 IL-6, TNF-알파, CGRP, PCSK9, 또는 NGF에 특이적으로 결합하는, 방법.
151. 청구항 133-150중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체 또는 이의 단편인, 방법.
152. 청구항 151의 방법에 있어서, 전술한 인간화된 항체는 토끼 기원의 항체인, 방법.
153. 청구항 133-152중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 단가, 이가, 또는 다가 항체를 포함하는, 방법.
154. 청구항 133-153중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 유전자의 전술한 복사체중 최소한 하나는 전술한 숙주 세포에서 발현을 위하여 최적화된, 방법.
155. 청구항 133-154중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 전술한 바람직한 항체의 경쇄를 인코드하는 유전자의 복사체 수는 전술한 바람직한 항체의 중쇄를 인코드하는 유전자의 복사체의 전술한 수에 대등하거나 이보다 더 큰, 방법.
156. 청구항 133-155중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 각 유전자의 단일 복사체를 포함하는 균주보다 더 큰 산출량으로 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는, 방법.
157. 청구항 133-156중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 아단위를 인코드하는 각 유전자의 단일 복사체를 포함하는 균주보다 더 큰 손도로 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체를 생산하는, 방법.
158. 청구항 157의 방법에 있어서, 바람직한 다수의 아단위 복합체는 바람직한 항체를 포함하고, 전술한 순도는 당화된 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 양이 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드의 총량의 비율로 측정됨으로써 결정되는 방법.
159. 청구항 133-158중 임의의 한 항에 있어서, 전술한 바람직한 다수의 아단위 복합체의 최소한 하나의 아단위는 분비 신호를 포함하는, 방법.
160. 청구항 159의 방법에 있어서, 분비 신호는 닭 라이소자임 (CLY) 신호 펩티드; CLY-L8; S. 세레비시에(S. cerevisiae) 전화효소 (SUC2) 신호 펩티드; MF-알파 (Prepro); MF-알파 (Pre)-apv; MF-알파 (Pre)-apv-SLEKR; MF-알파 (Prepro)-(EA)3; αF 신호 펩티드; KILM1 신호 펩티드; 억제성 산 포스파타제 (PHO1) 신호 펩티드; A.나이져(A. niger) GOX 신호 펩티드; 쉬반이노시메스 오시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 글루코아밀라제 유전자 (GAM1) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열과 함께 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드; 프로(pro)-서열없이 인간 혈청 알부민 (HSA) 신호 펩티드; ISN 신호 펩티드; IFN 신호 펩티드; HGH 신호 펩티드; 피토헤마글루티닌 (PHA); 누에(Silkworm) 라이소자임; 인간 라이소자임 (LYZ1); 액티빈 수용체 유형-1; 액티빈 유형 II 수용체; P. 파스토리스(P. pastoris) 면역글로블린 결합 단백질 (PpBiP); 인간 항체 3D6 경쇄 리더; 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 방법.
     
     

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