JP6081356B2 - 安全で機能的なヒト化抗βアミロイド抗体 - Google Patents

安全で機能的なヒト化抗βアミロイド抗体 Download PDF

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Description

本出願は、２０１０年７月３０日出願の米国仮特許出願第６１／４００，６５０号に対する優先権を主張し、ここにその全体が参照により援用される。
１．序論
本発明は、アミロイドーシス、アルツハイマー病などのアミロイドタンパク質に関連した疾患及び異常についての安全かつ機能的な処置のための方法及び組成物に関連する。
２．発明の背景
アミロイドーシスは、単一の疾患の実体ではなく、むしろ一つ以上の臓器または身体のシステムに蓄積するアミロイドと呼ばれるろう様澱粉様タンパク質の細胞外の組織沈着を特徴とする進行性の病気のプロセスの多様なグループである。アミロイド沈着物が蓄積するにつれて、それらは臓器又は体組織の正常な機能を妨害し始める。アミロイドーシスには少なくとも１５の異なる種類がある。主要な形態は、既知の前駆症状の無い原発性アミロイドーシス、他の状態の後の続発性アミロイドーシス、及び遺伝性アミロイドーシスである。
続発性アミロイドーシスは、結核などの慢性感染症又は炎症性疾患、家族性地中海熱と呼ばれる細菌感染症、骨感染症（骨髄炎）、関節リウマチ、小腸の炎症（肉芽腫性回腸炎）、ホジキン病及びハンセン病の最中に発生する。
アミロイド沈着は、アミロイドＰ（五角形）成分（ＡＰ）、正常血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）に関連する糖タンパク質、及び硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、結合組織の複合糖質が含まれる。アミロイド物質の約９０％を占めているアミロイド蛋白フィブリルは、タンパク質のいくつかの異なるタイプの一つを含んでいる。これらのタンパク質は、アミロイドタンパク質の独特な染色特性をもたらすコンゴレッドの結合部位を示すユニークなタンパク質立体構造である、いわゆる「β−プリーツ」シートのフィブリルに折り畳むことができる。
老化の多くの疾患がアミロイド様タンパク質に基づくか又は関連付けられており、部分的には、疾患の病因並びに進行に寄与するアミロイド又はアミロイド様物質の細胞外沈着の蓄積により特徴付けられる。これらの疾患には、限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）などの神経学的障害；グアムパーキンソン認知症を含む。アミロイド様タンパク質に基づくか又は関連付けられている他の疾患は、進行性核上性麻痺、多発性硬化症；クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症型糖尿病；老人性心アミロイドーシス；内分泌腫瘍、黄斑変性症などの眼障害を含むその他があげられる。
これらの疾患の病因は多様であり得るが、それらの特徴的な沈着物は、しばしば多くの共有分子成分が含まれる。かなりの程度まで、これは炎症促進性経路の局所的活性化に起因し得、それによって活性化された補体成分、急性期反応物質、免疫変調成分、および他の炎症性メディエーターの同時沈着につながる (McGeer et al., 1994)。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、主にアミロイド斑、脳内のタンパク質の異常な沈着物の蓄積によって引き起こされると考えられている神経疾患である。発症した個体の脳に見られるアミロイドの最も頻度の高い種類は、主にＡβ原線維で構成されている。科学的な証拠はプラーク中のβ−アミロイドタンパク質の産生および蓄積の増加がＡＤの発症および進行に寄与する神経細胞死につながることを示している。重要な脳領域の神経細胞の消失は、順番に、神経伝達物質の減少及び記憶障害を生じる。プラークの蓄積に主に関与するタンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）及び２つのプレセニリン（プレセニリンＩおよびプレセニリンＩＩ）を含む。恒常的に発現し、酵素β及びγセクレターゼによってほとんどの細胞において分解されるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の逐次切断は、３９から４３アミノ酸Ａβペプチドの放出をもたらす。ＡＰＰの分解はプラーク中に凝集するそれら傾向を恐らく増加させる。それは、特に、そのＣ末端での２つの非常に疎水性のアミノ酸残基に起因する凝集体を構築する高い性質を持っているＡβ（１−４２）の断片である。従って、Ａβ（１−４２）断片は、ＡＤにおける老人斑の形成の開始に主に関与し、かつ原因であって、それゆえ、高い病理学的可能性を持っていると考えられている。
従って、ＡＤ患者においてアミロイド斑及び／又はびまん性の既存のプラークの形成を防ぐ治療薬の必要性が存在する。特に必要なものは、アミロイド又はアミロイド様ペプチドの繊維の凝集に関連するプラークの形成などの疾患の生理学的症状に対抗することができる薬剤である。
βアミロイドに対する受動免疫は、ＡＤに対する治療的処置として、ますます望ましい戦略となっている。受動免疫の有効性は、抗抗体（Ａｂ）療法がプラーク負荷を低減し、行動障害を反転することが示されているＡＤのトランスジェニック動物モデルで実証されている。細胞毒性Ｔ細胞の超活性化、抗体による能動免疫化のリスクを克服するにもかかわらず、受動免疫はミクログリア細胞のＦＧ受容体媒介性過剰活性化及び補体活性化のリスクを伴い、これは、不適切な炎症促進性応答および血管原性浮腫の一因となるかもしれない。
抗アミロイドβ抗体は、例えば、２００７年６月２１日公開の国際公開第２００７／０６８４１２号；２００８年５月２２日公開の国際公開第２００８／０６０３６４号；２００７年６月２１日公開の国際公開第２００７／０６８４１２号；２００７年６月２１日公開の国際公開第２００７／０６８４１２号；２００７年６月２１日公開の国際公開第２００７／０６８４１２号；２００７年６月２１日公開の国際公開第２００７／０６８４１２号；２００８年１２月２４日公開の国際公開第２００８／１５６６２１号；２００８年１２月２４日公開の国際公開第２００８／１５６６２１号；２００８年１２月２４日公開の国際公開第２００８／１５６６２１号に記載されている（表２も参照）。
ＡＤなどのアミロイドーシスを有する患者の抗βアミロイドによる処置中に観察された副作用は、髄膜炎や髄膜脳炎などの炎症性副作用、及び脳における体液の増加（脳浮腫）を含む。アミロイドーシスに伴う合併症を低減または排除する治療法が必要とされている。
３．発明の概要
本発明の新規な組成物及び方法は、アルツハイマー病（ＡＤ）などのアミロイドーシスに対する受動免疫療法においてより安全な治療の選択肢を提供する。本発明は、以前から知られている、Ａβモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療薬と比較して、有害な副作用を回避しながら、効果的な中和能力ならびに減少したエフェクター機能を有する抗Ａβ抗体は、Ａβ毒性を減少させるとすることの発見に部分的に基づいている。特に、本発明者は、ＭＡＢＴとして知られるＩｇＧ４アイソタイプのヒト化抗Ａβモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ミクログリアの活性化の上のＦｃγ受容体媒介性過剰活性化のリスクを低減させて補体活性化を避けることが見いだされたことを発見している。ＭＡＢＴは、Ａβ１−４２及びＡβ１−４０の複数の形式に高い親和性で結合し、Ａβ１−４２オリゴマー誘発細胞毒性から保護され、インビトロ及びインビボの両方においてミクログリアによる神経毒性Ａβの取込みを媒介される。同じ抗原結合可変ドメインを含むヒトＩｇＧ１野生型サブクラスへと等しい結合親和力を持つＡβに比較すると、ＭＡＢＴは、ミクログリアにおけるストレス活性化ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ＭＡＰＫ）の活性化の減少を示し、炎症促進性メディエーターの放出の減少を誘導した。
本発明はまた、ＡＤにおける抗Ａβ抗体媒介性の神経保護のためのミクログリア細胞におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の予想外の役割に一部基づいていまる。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性は、一般的に炎症促進性であると考えられているので、ＡＤなどのアミロイドーシスの病原性炎症状態に寄与すると考えられるであろう。しかし、驚くべきことに、ミクログリア細胞における中等度のｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化は、病原性炎症状態の発生なしに抗Ａβ抗体媒介性の神経保護の一因となる。
本明細書で提供されるのは、限定されないが、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスの安全な処置及び／又は予防の方法及び組成物である。アミロイドーシスは、限定されるものでないが、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症症候群などの神経疾患、並びに進行性核上性麻痺、多発性硬化症、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、成人発症型糖尿病、老人性心アミロイドーシス、内分泌腫瘍、及びその他、黄斑変性症、皮質視覚障害、緑内障、視神経ドルーゼン、視神経症、視神経炎、白内障、眼アミロイドーシス及び格子状ジストロフィーなどの眼障害を含む、アミロイド様タンパク質に基づいているか又は関連付けられている他の疾患を含む。
特に、本明細書で提供されるのは、ミクログリア細胞におけるｐ３８ＭＡＰキナーゼの中等度の活性化を引き起こすように修飾されたか又は選択されたエフェクター領域をもつ抗Ａβ抗体である。本明細書で更に提供されるのは、限定されないが、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスの処置および予防のための方法であり、その用量及び／又は投与レジメンは、ミクログリア細胞中でそのｐ３８ＭＡＰキナーゼが中等度レベルで活性化されるように選択される。特定の実施態様では、安全かつ機能的な抗Ａβ抗体はＩｇＧ４抗体のエフェクター領域を有している。あるより特定の実施態様では、安全かつ機能的な抗Ａβ抗体はＩｇＧ４抗体のＣＨ２領域を有している。ある特定の実施態様では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の中等度レベルは、毒性のβ−アミロイドオリゴマーのみによるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル以上であるが、毒性のβ−アミロイドオリゴマーと併用したＩｇＧ１抗Ａβ抗体によるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル未満である。ある実施態様において、抗Ａβ抗体のエフェクター領域は、そのエフェクター機能が低下するように改変されている。ある実施態様において、改変はアミノ酸置換及び／又は欠失を生じる任意の遺伝子変異であり得る。
更に与えられるのは、抗Ａβ抗体の安全性を向上させるための方法である。一実施態様において、前記非ＩｇＧ４抗Ａβ抗体の定常領域をＩｇＧ４抗体由来の定常領域と置換することを含む、非ＩｇＧ４抗Ａβ抗体の安全性を改善するための方法が与えられる。その他の実施態様において、前記非ＩｇＧ４抗体の定常領域を非ＩｇＧ１抗体由来の定常領域と置換することを含む、非ＩｇＧ４抗体の安全性を改善するための方法が与えられる。特定の実施態様において、非ＩｇＧ４抗βアミロイド抗体の安全性を改善するための方法は、ＩｇＧ１抗Ａβ抗体の安全性を改善するためである。
本明細書において更に与えられるのは、限定されないが、アルツハイマー病を含む、アミロイドーシスを処置及び／又は予防するために、抗Ａβ抗体をそれらの安全性と機能性について試験するための細胞培養に基づいたアッセイ系である。ある実施態様において、ミクログリア細胞が毒性β−アミロイドオリゴマー及びその試験抗Ａβ抗体と共にインキュベートされる。ミクログリア細胞へのβアミロイドの抗Ａβ抗体媒介性取り込みは、例えばベータアミロイドのクリアランスを媒介することにおける抗体の機能性を実証している。ミクログリア細胞の中等度レベルでの抗Ａβ抗体媒介ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化は、抗体の両方が機能性で安全であることを示している。ある実施態様では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の中等度レベルは、毒性のβ−アミロイドオリゴマーのみによるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル以上であるが、野生型のエフェクター機能のレベルを有するＩｇＧ１抗Ａβ抗体（すなわち、未修飾ＩｇＧ１定常領域）によるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル未満である。この細胞培養ベースのアッセイ系は、Ａβの神経毒性から神経細胞を保護する能力について、抗Ａβ抗体を試験するために使用することができる。更に、この細胞培養ベースのアッセイ系は、中等度レベルでｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化を引き起こする能力について、抗Ａβ抗体を試験するために使用することができる。
ある実施態様において、細胞培養ベースのアッセイシステムは、さらに神経細胞が含まれる。毒性β−アミロイドオリゴマー、試験抗Ａβ抗体、ミクログリア細胞との共インキュベーション時のニューロンの生存率は、試験抗Ａβ抗体の機能性を示している。
ある実施態様において、細胞培養ベースのアッセイ系は、初代皮質細胞培養である。初代皮質細胞培養物は、毒性β−アミロイドオリゴマー及びその試験抗Ａβ抗体と共にインキュベートされる。ミクログリア細胞へのβアミロイドの抗Ａβ抗体媒介性取り込みは、例えばベータアミロイドのクリアランスを媒介することにおける抗体の機能性を示している。ミクログリア細胞の中等度レベルでの抗Ａβ抗体媒介ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化は、抗体の機能性及び安全性の両方を実証している。
本明細書で更に提供されるのは、限定されないが、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスの処置及び／又は予防のための安全で機能的な抗体である。ある実施態様において、Ａβに結合する非ＩｇＧ４ヒト化抗体の可変領域は、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域と結合される。他の実施態様において、Ａβに結合するＩｇＧ１ヒト化抗体の可変領域は、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域と結合される。ある実施態様において、Ａβに結合する非ＩｇＧ４ヒト化抗体のＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ２ドメインと置換される。他の実施態様において、Ａβに結合するＩｇＧ１ヒト化抗体のＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ２ドメインと置換される。ある実施態様において、定常領域の定常領域はＩｇＧ１抗体に由来し、ここでそのＩｇＧ１抗体の定常領域は、修飾された定常領域はエフェクター機能が低減したか又は除去されるように修飾される。
他の実施態様において、限定されないが、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスの処置及び／又は予防のために方法が与えられ、ここではｐ３８ ＭＡＰキナーゼがミクログリア細胞において中等度レベルで活性化されるように、ＩｇＧ１抗Ａβ抗体が抗炎症剤と組み合わせて投与される。ある特定の実施態様では、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化の中等度レベルは、毒性のβ−アミロイドオリゴマーのみによるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル以上であるが、抗炎症剤無しでオリゴマー単独の存在下にてエフェクター機能の正常レベルを有するＩｇＧ１抗Ａβ抗体によるｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性化のレベル未満である。
３．１ 用語
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書で用いる場合、互換的であり、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸で構成される生体分子を意味するものと定義される。
本明細書で用いる「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、「１つまたは複数の」を意味し、文脈が不適切である場合を除き、複数を含むものと定義される。
用語「アミロイドーシス」は、アミロイド又はアミロイド様タンパク質に関連するか又は引き起こされる疾患及び障害の群を指し、限定されないが、アミロイドプラークによるものを含み、モノマー、フィブリル、又は高分子状態、又は3つの任意の組み合わせのアミロイド様タンパク質の存在又は活性により引き起こされる疾患及び障害を含む。そのような疾患は、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知機能障害（ＭＣＩ）などの認知記憶能力の消失によって特徴付けられる疾患または状態、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）、グアムパーキンソン認知症などの神経疾患を含むが、これらに限定されない疾患などの続発性アミロイドーシスおよび加齢性アミロイドーシス；及び進行性核上性麻痺、多発性硬化症などのアミロイド様タンパク質に基づくまたはそれに関連する他の疾患；クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病、内分泌腫瘍、および老人性心アミロイドーシス；ならびにβ−アミロイド沈着による黄斑変性症、ドルーゼン関連性の視神経症、および白内障を含む様々な眼疾患を含むが、これらに限定されない。
本明細書で用いる「検出すること」又は「検出された」という用語は、免疫化学的方法または組織学的方法といった生体分子の検出のための公知の方法を用いることを意味し、調査中の生体分子の存在又は濃度を質的又は量的に決定することを指す。
「アミロイドβ」、「アミロイドベータ」、「Ａβ」又は「β−アミロイド」とは、当技術分野で認知されている用語であり、アミロイドβタンパク質およびペプチド、並びに修飾体、断片およびそれらの任意の機能的等価物を指し、それらはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解性切断によって生成され得、限定されないが、Ａβ１−３８、Ａβ１−３９、Ａβ１−４０、Ａβ１−４１、Ａβ１−４２、及びＡβ１−４３を含む、アミロイド病態に関与するか又は関連のあるＡＰＰのそれらの断片を含む。
上述したアミロイドβペプチドの構造及び配列は当業者に周知であり、前記ペプチドを生産する方法又はそれらを脳および他の組織から抽出する方法は、例えば、Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984)に記載されている。更に、アミロイドβペプチドは様々な形態で市販されてもいる。
「単離された」とは、天然の状態で存在する構成要素の少なくとも一部を含まない生体分子を意味する。
本明細書で用いる「抗体」または「抗体」という用語は、当技術分野で認知されている用語であり、公知の抗原と結合する分子または分子の活性断片を指すと理解され、用語「免疫グロブリン」又は「免疫グロブリン分子」及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と特異的に結合する結合部位を含む免疫グロブリンの部分と同義的に使用される。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのカッパおよびラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子によっても実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドを含むタンパク質である。軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、それぞれ、順に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥをそれぞれ定める、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類される。重鎖のサブクラスも公知である。例えば、ヒトにおけるＩｇＧ重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブクラスのいずれかであり得る。
本明細書で用いる場合、抗体に対して「特異的に結合する」とは、それが構造的に異なる抗原に結合するよりも大きい親和性で、抗体がその標的抗原に結合するということを意味する。
典型的な免疫グロブリン構造単位は、テトラマーを含むことが公知である。各々のテトラマーは、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各々の対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端は、抗原認識に主として関与する約１００から１１０又はそれより多くのアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの部分を指す。
抗体は、全長のインタクトな抗体として、または様々なペプチダーゼ又は化学物質による消化によって産生される多くの十分に特徴付けられた断片として存在する従って、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域中のジスルフィド結合より下で消化し、それ自体ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂのダイマーである、Ｆ（ａｂ’）２を産生する。Ｆ（ａｂ’）２を穏和な条件下で還元してヒンジ領域中のジスルフィド連結を破壊し、それによってＦ（ａｂ’）２ダイマーをＦａｂ’単量体に変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的には、ヒンジ領域の一部を持つＦａｂ断片である（その他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照）。 様々な抗体断片が、インタクトな抗体の消化の観点から定められているが、当業者は、種々の抗体断片のいずれかを、化学的にか又は組換えＤＮＡ方法論を利用することによるかのいずれかでデノボ合成し得るということを理解するであろう。したがって、本明細書で用いる場合の、抗体という用語には、抗体全体の修飾によって産生されるかもしくはデノボ合成されるかのいずれかの抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法論を用いることによって得られる抗体及び断片も含まれる。
用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、二重特異性抗体、サル化抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体、並びにそれらの活性断片を含む。既知の抗原と結合する分子の活性断片の例には、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物、及び上述した抗体および断片の任意のもののエピトープ結合性断片を含む、分離された軽鎖および重鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ／ｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。これらの活性断片は、数多くの手法によって導き出すことができる。例えば、モノクローナル抗体をペプシンなどの酵素で切断して、ＨＰＬＣゲル濾過に供することができる。続いて、Ｆａｂ断片を含む適切な画分を収集して、膜濾過などによって濃縮することができる。抗体の活性断片の単離についての一般的な手法に関する更なる記述については、例えば、Khaw, B. A. et al. J. Nucl. Med. 23:1011-1019 (1982)；Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121:663-69, Academic Press, 1986を参照のこと。
組換えによって作製された抗体は、従来の全長抗体、タンパク質分解による消化由来の公知の活性抗体断片、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）などの独特の活性抗体断片、ドメイン欠失抗体などであってもよい。Ｆｖ抗体は、サイズが約５０Ｋｄでありかつ軽鎖及び重鎖の可変領域を含む。単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、直接的に連結されているか又はペプチドをコードするリンカーによって連結されているかのいずれかのＶＨ及びＶＬコード配列を含む核酸から発現し得る、共有結合的に連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883を参照。抗体Ｖ領域由来の、自然に凝集されているが化学的に分離されている軽および重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位と実質的に同様の３次元構造に折り畳まれると考えられるｓｃＦｖ分子に変換するための多くの構造。例えば、米国特許第５０９１５１３号、同第５１３２４０５号、及び同第４９５６７７８号を参照。
結合部位とは、抗原結合に関与する抗体分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。抗体可変領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）として知られるより保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と称される３つの極めて相違するストレッチを含む。抗体分子中で、軽鎖の３つの超可変領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）ならびに重鎖の３つの超可変領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）は、互いに対して３次元空間で抗原結合表面またはポケットを形成するように配置されている。それゆえに、抗体結合部位は、抗体のＣＤＲを構成するアミノ酸および結合部位ポケットを構成する任意のフレームワーク残基に相当する。
結合部位を構成する特定の抗体中のアミノ酸残基のアイデンティティーを、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。例えば、抗体ＣＤＲを、Kabatらによって最初に定義された超可変領域として同定してもよい("Sequences of Proteins of Immunological Interest," E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G and Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.eduを参照)。また、ＣＤＲの位置を、Chothiaおよびその他によって最初に記載された構造的ループ構造として同定してもよい（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989)、およびTramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)参照）。その他の方法として、KabatとChothiaの折衷でかつオックスフォード分子（Oxford Molecular）のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ）を用いて得られる「ＡｂＭ定義」またはMacallumら（「Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography」, J Mol Biol. 1996 Oct 11;262(5):732-45）によるＣＤＲの「接触定義」が含まれる。
キメラ抗体は、抗体の１つまたは複数の領域が第一の種由来の抗体からであり、かつ抗体の１つまたは複数の領域が第二の異なる種由来の抗体からであるものである。一実施態様において、キメラ抗体は、霊長類免疫グロブリン由来の領域を含む抗体である。ヒトの臨床使用のためのキメラ抗体は典型的には、ヒト抗体由来の定常領域と共に、非ヒト動物、例えば、齧歯類由来の可変領域を有すると理解されている。それに対して、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の可変フレームワーク領域の大部分または全ておよびヒト抗体由来の定常領域全てと共に、非ヒト抗体由来のＣＤＲを用いている。ヒトキメラ抗体は典型的には、齧歯類抗体由来の可変領域を有すると理解されている。典型的なヒトキメラ抗体は、齧歯類抗体に由来する重鎖および軽鎖両方の可変領域と共に、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を有する。キメラ抗体は、ヒト定常領域の天然型アミノ酸配列および天然型齧歯類可変領域配列に対する若干の変化を含んでもよい。キメラ抗体およびヒト化抗体を、ＣＤＲ接合アプローチ（例えば、米国特許第５８４３７０８号；同第６１８０３７０号；同第５６９３７６２号；同第５５８５０８９号；同第５５３０１０１号参照）、鎖シャッフリング戦略（例えば、米国特許第５５６５３３２号；Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:8910-8915参照）、分子モデリング戦略（米国特許第５６３９６４１号参照）などを含む当技術分野において周知の方法で調製してもよい。
２つ又はそれ以上の鎖の抗体の場合に本明細書で用いるような「ヒト化抗体」は、少なくとも１つの鎖がヒト化されている抗体である。ヒト化抗体鎖は、フレームワーク領域の１つまたは複数がヒトである可変領域を有する。単鎖であるヒト化抗体は、フレームワーク領域の１つまたは複数がヒトである可変領域を、鎖が有する抗体である。ヒト化抗体鎖またはその断片の可変領域の非ヒト部分は、非ヒト起源、特に典型的には齧歯類起源の、非ヒト抗体に由来する。ヒト化抗体に対する非ヒトの寄与は、典型的には、１つ（または複数）のヒト免疫グロブリンに由来するフレームワーク領域中に散在する少なくとも１つのＣＤＲ領域の形態で与えられる。更に、フレームワーク支持残基を改変し、結合親和性を保存してもよい。
「ヒト化抗体」は更に、定常領域（例えば、軽鎖の場合には、少なくとも１つの定常領域またはその部分、および重鎖の場合には、好ましくは３つの定常領域）を含んでもよい。ヒト化抗体の定常領域は、存在する場合には、通常起源はヒトである。「ヒト化抗体」を入手するための方法は当業者に周知である（例えば、Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照）。ヒト化抗体を、例えばウサギおよびマウスなどの大型動物における親和性が成熟したヒト様ポリクローナル抗体の生産を可能にする、新規な遺伝子操作アプローチによって入手することもできる。例えば、米国特許第６６３２９７６号を参照。
本明細書で用いる場合の「定常領域」又は省略された「ＣＲ」という用語は、免疫グロブリンの定常領域遺伝子を指す。定常領域遺伝子は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分をコードする。キメラヒト抗体及びヒト化抗体について、典型的には非ヒト（例えば、マウス）の定常領域を、ヒト定常領域によって置換する。対象のキメラ抗体又はヒト化抗体の定常領域は典型的には、ヒト免疫グロブリンに由来する。重鎖定常領域を５つのアイソタイプ：アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミューのいずれかより選択することができる。更に、（重鎖のＩｇＧサブクラスなどの）様々なサブクラスの重鎖は、異なるエフェクター機能に関与し、したがって所望の重鎖定常領域を選ぶことによって、所望のエフェクター機能を持つ抗体を産生することができる。本発明の範囲内で使用し得る定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、特にガンマ１（ＩｇＧ１）アイソタイプ、ガンマ３（ＩｇＧ３）、及び特にガンマ４（ＩｇＧ４）のＦｃ領域である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型、好ましくはカッパ型であり得る。一実施態様において、軽鎖定常領域は、ヒトカッパ定常鎖であり（Heiter et al. (1980) Cell 22:197-207）かつ重定常鎖は、ヒトIgG4定常鎖である。
「モノクローナル抗体」という用語もまた、当技術分野で良く認識されており、単一のクローン化された抗体産生細胞の産物である抗体を指す。モノクローナル抗体は典型的には、通常の短寿命の抗体産生性Ｂ細胞を、癌細胞（時には「不死」細胞と呼ばれる）などの急速増殖性細胞と融合させることによって作製される。その結果得られるハイブリッド細胞またはハイブリドーマは、急速に増殖して、抗体を産生するクローンを作り出す。
本発明の目的において、「モノクローナル抗体」は、完全な単クローン性にはまだ達していない母クローン(mother clone)によって産生される抗体を含むものとも理解されるべきである。
本発明による抗体は、（多価の場合に）同一なその結合部位の各々を有すると理解される、免疫グロブリンもしくは抗体であってもよく、または代わりになるものとして、二重特異性抗体又は多重特異性抗体であってもよい。
「二重特異性抗体」または「二重機能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の連結を含む種々の方法で産生することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553（1992）を参照。「多重特異性」または「多重機能性抗体」は、２つ以上の異なる重／軽鎖対および２つ以上の異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。多重特異性抗体は、二重特異性抗体と同じ様々な方法を用いて生成することができる。
「断片」という用語は、インタクトな又は完全な抗体又は抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体又は抗体鎖の一部又は部分を指す。断片は、インタクトな又は完全な抗体又は抗体鎖の、化学的又は酵素的な処置によって得ることができる。断片は、組換え手段によって得ることもできる。例示的な断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、及び／又はＦｖ断片が含まれる。「抗原結合断片」という用語は、抗原に結合するか、又はインタクトな抗体と（すなわち、それらが由来したインタクトな抗体と）抗原結合（すなわち、特異的結合）を競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。結合断片を、組換えＤＮＡ技術によるか、又はインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的な切断によって産生する。結合断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、単鎖、および単鎖抗体が含まれる。
「断片」は、別のポリペプチドの、アミノ酸配列の少なくとも５つの連続的なアミノ酸残基、少なくとも１０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも１５の連続的なアミノ酸残基、少なくとも２０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも２５の連続的なアミノ酸残基、少なくとも４０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも５０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも６０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも７０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも８０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも９０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも１００の連続的なアミノ酸残基、少なくとも１２５の連続的なアミノ酸残基、少なくとも１５０の連続的なアミノ酸残基、少なくとも１７５の連続的なアミノ酸残基、少なくとも２００の連続的なアミノ酸残基、または少なくとも２５０の連続的なアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドも指す。特定の実施態様において、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
「抗原」という用語は、抗体に結合することができる実体またはその断片を指す。免疫原は、生物、特に動物、より具体的にはヒトを含む哺乳動物で免疫応答を誘発することができる抗原を指す。抗原という用語には、（接触しているかまたは抗原中にあり抗原性または抗原決定基に関与する接触を支持するのに重要な役割を果たしている）抗原の一部を指す、抗原決定基またはエピトープとして知られる領域が含まれる。
本明細書で用いる場合、「可溶性」という用語は、水性溶液中に部分的または完全に溶解することを意味する。
また本明細書で用いる場合、「免疫原の」という用語は、免疫原の抗原に対して向けられる、抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞の産生を誘発する物質を意味する。
本明細書で使用する用語の免疫原性とは、レシピエントに投与したときに免疫応答（体液性または細胞性）を誘発する抗原の能力の尺度を指す。免疫応答が起こるのは、個体が、投与された本発明の免疫原性組成物に対して十分な抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を産生して、処置しようとする障害が和らいだり緩和されたりする場合である。
「低下した免疫原性」を有するヒト化抗体とは、親抗体、例えば、マウス抗体と比べて低下した免疫原性を示すヒト化抗体を指す。
「親の抗体の結合特性を実質的に保持する」ヒト化抗体とは、そのようなヒト化抗体を産生するのに用いた親抗体によって認識される抗原に特異的に結合する能力を保持するヒト化抗体を指す。幾つかの実施態様において、ヒト化抗体は、親抗体と同じかまたは実質的に同じ抗原結合親和性および結合活性（avidity）を示すであろう。ある実施態様において、抗体の親和性は、親抗体の親和性の１０％未満ではなく、約３０％未満ではなく、又は５０％未満ではないであろう。抗原結合親和性をアッセイするための方法は、当技術分野において周知であり、かつ５０％（half-maximal）結合アッセイ法、競合アッセイ法、及びスキャッチャード解析を含む。好適な抗原結合アッセイ法を本出願で記載する。
本明細書で用いる場合、「保存的変化」は、天然型タンパク質と比較した場合に、実質的に立体構造又は抗原性が中立であり、それぞれ、突然変異体ポリペプチドの三次構造の最小限の変化をもたらすか、または突然変異体ポリペプチドの抗原決定基の最小限の変化をもたらす改変を指す。本発明の抗体および抗体断片に言及する場合、保存的変化は、抗体を対象の受容体に結合することができないようにしないアミノ酸置換を意味する。当業者は、立体構造および抗原性が中立である高い可能性を維持しつつ、どのアミノ酸置換を行うことができるかを予測することができると考えられる。そのような指針は、例えば、Berzofsky, (1985) Science 229:932-940およびBowie et al. (1990) Science 247:1306-1310で提供されている。考慮されるべき、立体構造および抗原性の中立性を維持する可能性に影響を及ぼす要因として、限定されないが、（ａ）疎水性残基はタンパク質の内部に位置する可能性がより高いので、疎水性アミノ酸の置換が抗原性に影響を及ぼす可能性はあまり高くないということ；（ｂ）置換されたアミノ酸は天然型アミノ酸を構造的に模倣するので、物理化学的に類似したアミノ酸の置換が立体構造に影響を及ぼす可能性はあまり高くないということ；および（ｃ）そのような保存によって、アミノ酸配列が機能的な重要性を有し得るということが示唆されるので、進化的に保存された配列の改変は立体構造に悪影響を及ぼす可能性が高いということが含まれる。当業者は、微小補体固定法（microcomplement fixation methods）（Wasserman et al. (1961) J. Immunol. 87:290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol. 11:928-936）などの、しかしこれらに限定されない、周知のアッセイ法を用いて、および立体構造依存的なモノクローナル抗体を用いる結合研究（Lewis et al. (1983) Biochem. 22:948-954）を通じて、タンパク質立体構造の改変を評価することができるであろう。
用語「治療的に機能的な量（therapeutically functional amount）」という用語は、ヒトまたは動物に投与された場合に、ヒトまたは動物で治療的効果をもたらすのに十分である、抗体の量を指す。機能的な量は、日常的な手順に従って当業者により容易に決定される。
本明細書で用いる場合、「処置する」、「防止する(prevent)」、「防止する(preventing)」、および「防止(prevention)」という用語は、予防的または治療的薬剤の投与が結果としてもたらす、被検体における障害の1つまたは複数の症状の再発または発症の防止を意味する。
抗βアミロイド抗体の文脈において用語「安全で機能的な量」は、抗βアミロイド抗体の量を指す。アルツハイマー病患者に投与した場合、患者において新たなアミロイドプラークの形成を減少又は防止し、患者におけるアミロイドプラークの負荷を軽減し、及び／又は患者の認知能力を低下させるかまたは劣化を防止し、または向上させ、炎症性副作用、例えば、髄膜炎及び髄膜脳炎など副作用、及び脳における体液蓄積（脳浮腫）は観察されず、又は任意の副作用は患者の処置が中断されなければならないほど深刻ではないことを特徴とする。ある実施態様において、新しいアミロイドプラークの形成は、未処置のコントロールに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％減少する。ある実施態様において、新しいアミロイドプラークの負荷は、未処置のコントロールに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％減少する。ある実施態様において、患者の認知能力の低下は、未処置のコントロールに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％減少する。ある実施態様において、患者の認知能力の低下は、未処置のコントロールに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％改善される。
用語「非ＩｇＧ１抗体」は、非ＩｇＧ１抗体がその野生型エフェクター機能を保持したＩｇＧ１定常領域を持っていないことを除いて、次のアイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの一つの何れかの定常領域を持つ抗体を指す。特定の実施態様において、非ＩｇＧ１抗体はＩｇＧ４抗体である。他の特定の実施態様では、非ＩｇＧ１抗体は、得られた抗体のエフェクター機能が、野生型ＩｇＧ１抗体に対して減少または除去されるように変異したＩｇＧ１抗体由来の定常領域を有する。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化という文脈における用語「中等度のレベル」は、ヒト化非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の欠損下でｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化のレベルを超えるが、ヒト化非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体と同じＫｄでβアミロイドに結合する同じ濃度のＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の存在下でｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化のレベル未満であるｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化のレベルを指す。
４．図面の説明
特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願公開のコピーは、必要な料金の請求および支払いと同時に官庁によって提供されるであろう。
実施例６．１および６．２において記載される実験に対応するグラフおよび免疫組織化学的画像を示す。抗Ａβ ＭＡＢＴモノクローナル抗体は、異なるＡβペプチドに高度な親和性で結合し、また、抗凝集特性を有する。Ａβ ＥＬＩＳＡは、ヒトおよびマウスＡβ１−４２およびヒトＡβ１−４０に結合するｍＭＡＢＴ（Ａ）およびＭＡＢＴ（Ｂ）を比較するために使用した。ＭＡＢＴはまた、異なるＡβ１−４２集合状態への結合についても試験した（Ｃ）。ＭＡＢＴは、トランスジェニックＡＰＰマウス（Ｄ 上パネル）からの脳切片およびヒトＡＤ側頭葉新皮質切片（Ｄ 下パネル）中に存在するＡβプラークに結合する。インビトロにおける機能性は、ＭＡＢＴが、Ａβ１−４２凝集を妨げ、あらかじめ形成されたＡβ１−４２凝集体を隠す能力によって示された。Ａβ１−４２凝集の阻害およびあらかじめ形成されたＡβ１−４２凝集体の脱凝集は、ＴｈＴベースのアッセイ法において１０：１モル比（Ａβ１−４２対モノクローナル抗体）を使用して実証された（Ｅ）。コントロールとして、Ｎ末端エピトープを有する抗Ａβ ＩｇＧモノクローナル抗体を使用した。結果は、３つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。ＭＡＢＴはまた、方法（Ｆ）において記載されるように、多量体のＡβ集合体への結合に際してのＴｈＴ蛍光に依存しないＡβ１−４２自己集合アッセイ法においても試験した。２つのアッセイ法の平均値（±ＳＥＭ）を示す。 実施例６．３において記載される実験に対応するグラフおよび免疫細胞化学的画像を示す。ＭＡＢＴは、初代混合皮質培養物に対するＡβ１−４２オリゴマーの細胞毒性を阻害する。Ｐ１ラットからの混合皮質細胞は、１００μｇ／ｍＬのＭＡＢＴまたはＩｇＧコントロールモノクローナル抗体ありまたはなしで、２．５または５μＭ Ａβ１−４２オリゴマーにより処置した（Ａ）。ＭＴＴアッセイ法は、方法の部において記載されるように、細胞生存度を決定するために使用した。５つの独立した実験の平均値（±ＳＥＭ）を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。代謝活性のマーカーとしてＡＴＰ産生を測定する、類似のアッセイ法において、細胞は、２００μｇ／ｍＬのＭＡＢＴありまたはなしで、１０μＭのＡβ１−４２オリゴマーにより処置した（Ｂ）。結果は、２つの独立したアッセイ法の平均値（±ＳＥＭ）を示す。長期のＡβ１−４２オリゴマー処置後の神経毒性は、形態学的解析によって試験した（Ｃ）。上記の細胞は、５０μｇ／ｍＬのＭＡＢＴありまたはなしで、１０μＭ Ａβ１−４２オリゴマーにより４日間処置し、続いて、ＴｕＪ１およびＤＡＰＩにより染色した。 実施例６．４において記載される実験に対応するグラフおよび免疫細胞化学的画像を示す。神経突起に結合するＡβ１−４２オリゴマーは、抗Ａβ ＩｇＧ４モノクローナル抗体によって低減した。Ｐ１ラットからの混合皮質細胞は、３０分間（示す）または１８時間（示さず）、１００μｇ／ｍＬのＭＡＢＴまたはＩｇＧコントロールありまたはなしで、２μＭのＡβ１−４２オリゴマーにより処置した。図は、左から右に、バッファーコントロール、Ａβ１−４２オリゴマー、およびＭＡＢＴありのＡβ１−４２オリゴマーによる処置を示す（Ａ）。ＤＡＰＩは、細胞核を標識するために使用した；ニューロン特異的チューブリンに対する抗体、ＴｕＪ１は、ニューロンを標識するために使用した；抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０）は、β−アミロイドを標識するために使用した。下列は、３つのマーカーをすべて示すのに対して、上列は、ＡβおよびＤＡＰＩのみを示す。２つの挿入図は、神経突起へのＡβ１−４２オリゴマーの結合（左）およびＭＡＢＴモノクローナル抗体によるこの結合の阻害（右）を示す。蛍光の定量的測定値は、３０分間の処置および１８時間の処置について示す（Ｂ）。２つの実験の平均の結果（±ＳＥＭ）を示す。ＨｙＬｉｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８によりタグをつけたＡβ１−４２は、ＭＡＢＴが神経突起へのＡβ１−４２の結合を阻害したことを確証した。Ｐ１ラットからの皮質培養物は、ＨｙＬｉｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８によりタグをつけたＡβ１−４２を使用した以外は、（Ａ）に記載されるように処置した（Ｃ）。Ａβ１−４２標識サンプルは、上位のパネルに示す。ＤＡＰＩ染色サンプルは、下位のパネルに示す。代表的な１つの実験を示す。Ａβ１−４２蛍光を定量化し、２つの独立した実験の平均値（±ＳＤ）を示す（Ｄ）。Ａβ１−４２の細胞内蓄積は、方法（Ｅ）において記載されるように、トリプシン処理細胞に対してＡβ１−４２についてＥＬＩＳＡを実行することによってアッセイした。３つの実験の平均の結果（±ＳＥＭ）を示す。ＭＡＢＴによる処置に際して、Ａβ１ ４２オリゴマーは、（Ｆ）において示されるように、ミクログリアに似ている細胞によって取り込まれるように見えた。ＤＡＰＩは、細胞核を標識するために使用した；抗Ａβ抗体は、β−アミロイドを標識するために使用した。 実施例６．５において記載される実験に対応するグラフおよび共焦点画像を示す。Ａβ１−４２オリゴマーは、ＭＡＢＴ処置に際して、ミクログリアの中に、ＦｃＲ媒介性のメカニズムによって取り込まれた。共焦点画像処理は、ＭＡＢＴと複合体を形成したＡβ１−４２オリゴマーがミクログリアの中に取り込まれることを示すために使用した。ＤＡＰＩは、ミクログリア自体を示すために細胞核を標識するために使用した；抗Ａβ抗体は、Ａβ１−４２オリゴマーを標識するために使用した（Ａ）。先端から末端の薄片は、Ｚ−ｓｔａｃｋから与えられた三次元画像から得た。共焦点画像処理は、材料および方法の下で実施例の部において記載されるように、Ａβ（周辺）について標識し、ＤＡＰＩ（中央）により染色した混合皮質細胞に対して実行した。ミクログリアは、同定し、細胞内位置を示す一連の共焦点スタックを通して最大蛍光強度についてスキャンし（Ｂ）、最小閾値を超える蛍光シグナルの総面積を定量化した（Ｃ）。グラフ上の各マークは、単一の細胞内で染色されたＡβの総面積を表す。最低２０の細胞を、各処置条件について分析した。データは、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続くＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較を使用して比較した。平均値（±ＳＥＭ）を示す。ミクログリア（Ｉｂａ１＋）は、ＭＡＢＴと複合体を形成したＡβ１−４２を取り込む細胞型として確証された（Ｄ）。Ｉｂａ１は、ミクログリアについてのマーカーとして使用し、ＨｙＬｉｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８標識Ａβ１−４２は、Ａβ１−４２ Ａを示すために使用し、ＤＡＰＩは、細胞核を示すために使用した。Ｉｂａ１およびＡβ１−４２の共存を示す。異なるＩｇＧモノクローナル抗体によるＡβ１−４２オリゴマー内部移行は、ＦｃγＲ結合と関係する。ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８への特異な結合は、結合アッセイ法において確証された（Ｅ）。抗Ａβモノクローナル抗体は、Ａβ１−４２オリゴマー毒性に対する十分な保護効果のためにＦｃγＲ結合を必要とする。Ｐ１ラットからの混合皮質細胞は、ＭＡＢＴ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１、またはＩｇＧ１コントロールｍＡｂありまたはなしで、Ａβ１ ４２オリゴマーにより処置した（Ｆ）。グラフは、５つの独立した実験からの、Ａβ１−４２オリゴマー処置細胞と比較した、細胞生存の平均値（±ＳＥＭ）％の増加を示す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続くＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較を使用して行った。 実施例６．６において記載される実験に対応するグラフおよび免疫細胞化学的画像を示す。Ａβ１−４２オリゴマーと複合体を形成した場合、野生型の主鎖を有するＩｇＧ１の添加は、Ａβ１−４２オリゴマー処置ミクログリアについて示されたものを超えて、ｐ３８活性化を著しく増加させた。Ｐ１ラットからの混合皮質細胞は、１００μｇ／ｍＬ ＭＡＢＴ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、またはＭＡＢＴ−ＩｇＧ１野生型ありまたはなしで、３０分間、１０μＭ Ａβ１−４２オリゴマーにより処置した。Ａβに結合しないＩｇＧ１モノクローナル抗体は、コントロールとして使用した。ｐ３８ＭＡＰＫの活性は、方法（Ａ）において記載されるように、リン酸化特異的ＥＬＩＳＡによって測定した。４つの独立した実験の平均値（±ＳＥＭ）を示す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続くＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較を使用して行った。モノクローナル抗体と複合体を形成したＡβ１−４２オリゴマーによるｐ３８ＭＡＰＫの活性化は、ミクログリアに対して特異的であった（Ｂ）。細胞は、上記に記載されるように処置し、続いて、ホスホｐ３８ＭＡＰＫについて、Ｉｂａ１（ミクログリア）により、およびＤＡＰＩ（細胞の核）により染色した。図は、左から右に、バッファーコントロール、Ａβ１−４２オリゴマー、およびＭＡＢＴありのＡβ１−４２オリゴマーによる処置を示す。ホスホｐ３８ＭＡＰＫおよびＩｂａ１の共存は、右の挿入図に示す。ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスからの純粋なミクログリアは、ミクログリア特異的ｐ３８活性を確証するために使用した（Ｃ）。ホスホｐ３８単独の染色は、上位のパネルに示し、ホスホｐ３８と一緒のＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰシグナル（ミクログリア）は、下位のパネルに示す。ｐ３８ＭＡＰＫ活性は、Ａβ１−４２オリゴマー毒性に対するＭＡＢＴの十分な保護効果に必要とされた。Ｐ１ラットからの混合皮質細胞は、ｐ３８特異的阻害剤である１μＭ ＳＢ２３９０６３の存在または非存在下において、１０μＭ Ａβ１−４２オリゴマー単独でまたは１００μｇ／ｍｌ ＭＡＢＴもしくはＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａと一緒に処置した（Ｄ）。ＭＴＴ読み取りを使用する細胞毒性アッセイ法は、２４時間後に実行した。４つの実験の平均値（±ＳＥＭ）を示す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続くＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較を使用して行った。 実施例６．６において記載される実験に対応するグラフを示す。ＦｃγＲに対するＩｇＧ１の高度な親和性は、ミクログリアによるＡβ１−４２媒介性の炎症促進性放出を低減する際にＩｇＧ１をそれほど効果的でないものにする。豊富なミクログリアによるＴＮＦαの放出は、処置の２４時間後に測定した（方法を参照されたい）。３つの独立した実験の平均値（±ＳＥＭ）を示す。統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、その後に続くＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較を使用して行った。 実施例６．１において記載される実験に対応するグラフを示す。ＡＰＰマウスモデルにおけるプラーク負荷の低減および非空間記憶の改善。二重ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウスにおけるプラーク負荷パーセンテージ（Ａ）およびプラークの平均の数（Ｂ）は、ＭＡＢＴモノクローナル抗体のマウスバージョンであるｍＭＡＢＴによる長期にわたる受動免疫後に測定した。ＰＢＳを注射した動物は、コントロール（ＰＢＳ）としての役割を果たした。チオフラビンＳ（ＴｈＳ）は、高密度プラークを染色するために使用した（方法を参照されたい）。機能性は、ｍＭＡＢＴの２回の投与後に、単一トランスジェニックｈＡＰＰ突然変異体マウスにおいて実証された（Ｃ）。記憶想起（ｒｅｃａｌｌ ｍｅｍｏｒｙ）の尺度としての認識インデックス（ＲＩ）は、新規な物体認識試験を使用して研究した（方法を参照されたい）。ＰＢＳを注射した動物は、コントロール（ＰＢＳ）としての役割を果たした。グラフ上の各円は、個々のマウスを表す。平均値（±ＳＤ）を示す、＊Ｐ＜０．０１。 実施例６．１において記載される実験に対応するウェスタンブロットを示す。神経毒性Ａβ１−４２は、低分子量および高分子量オリゴマーの混合物である。神経毒性Ａβ１−４２オリゴマーは、調製し（方法を参照されたい）、Ａβ１−４２オリゴマー媒介性神経毒性に対するモノクローナル抗体処置の効果をアッセイするインビトロにおける実験に使用した。Ａβ１−４２オリゴマーを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ ４−１２％勾配ゲル上に流し、ニトロセルロース膜に移し、抗Ａβ抗体（クローン６Ｅ１０）によりブロットした。 実施例６．２において記載される実験に対応するグラフを示す。中央ドメイン指向性ＭＡＢＴは、ＡｐｏＥ４とのＡβ１−４２の相互作用を阻害する。ＥＬＩＳＡは、組換えヒトＡｐｏＥ４に対するＡβ１−４２の結合に対する、抗Ａβ Ｎ末端（クローン６Ｅ１０およびＷＯ２）、Ｃ末端（クローンＧ２−１１）、または中央ドメイン（ＭＡＢＴ）モノクローナル抗体の効果を評価するために使用した。ＩｇＧモノクローナル抗体なしのシグナルの阻害パーセントを示す。 実施例６．５において記載される実験に対応するグラフおよび免疫細胞化学的画像を示す。架橋ＭＡＢＴ ＩｇＧ４モノクローナル抗体は、ＩｇＧ１野生型と比較した場合、結合活性を低減した。架橋抗Ａβ ＩｇＧ１野生型は、ポジティブ非Ａβ結合ＩｇＧ１コントロールに類似する活性で、すべてのＦｃＲγ受容体に結合した。ＭＡＢＴおよびＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａの両方は、ＭＡＢＴ−Ａβ ＩｇＧ１および非Ａβ結合ＩｇＧ１ポジティブコントロールと比較して、すべてのＦｃγＲへの結合を実質的に低減した。これらの発見は、ヒトＩｇＧ４抗体（Ｇｅｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）およびＤ２６５Ａ突然変異を持つＩｇＧ１抗体（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ２００１）について公開されたデータと一致している。 抗βアミロイド抗体により処置したＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるＡβプラークのインビボにおける画像処理を実行したことを示す。ＭＡＢＴの全身性の投薬は、インビボにおいて個々のアミロイドプラークを調整する。ＡＰＰ／ＰＳ１動物におけるアミロイドプラークは、Ｉ．Ｐ．注射したメトキシ−Ｘ０４により標識し、インビボ二光子顕微鏡法によって視覚化し、複数の週にわたって追跡した（Ａ）。ある期間にわたるプラーク体積の相対的な変化は、最初の画像処理セッションからの増加倍数としてプロットした（Ｂ）。平均して、個々のプラークサイズは、ＭＡＢＴによる全身性の投薬後に体積が減少した（×プラーク、２匹の動物）。
４．１ 配列の説明
配列番号１ ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＣＤＲ１）
配列番号２ ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列（ＣＤＲ２）
配列番号３ ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列
配列番号４ ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域（ＣＤＲ１）のアミノ酸配列
配列番号５ ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域（ＣＤＲ２）のアミノ酸配列
配列番号６ ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列
配列番号７ ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号８ ＭＡＢＴヒト化軽鎖のアミノ酸配列
配列番号９ ヒト化ＭＡＢＴ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
配列番号１０ ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１ ＭＡＢＴヒト化重鎖のアミノ酸配列
配列番号１２：ＩＧガンマ−４鎖 Ｃ領域−修飾のアミノ酸配列
配列番号１３：ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のＣＤＲ２のヌクレオチド配列
配列番号１４：ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のＣＤＲ３のヌクレオチド配列
配列番号１５：ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域のＣＤＲ１のヌクレオチド配列
配列番号１６：ＭＡＢＴヒト化軽鎖可変領域のヌクレオチド配列
配列番号１７：ＭＡＢＴヒト化軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号１８：ＭＡＢＴヒト化軽鎖定常領域のヌクレオチド配列
配列番号１９：ＭＡＢＴヒト化重鎖可変領域のヌクレオチド配列
配列番号２０：ＭＡＢＴヒト化重鎖のヌクレオチド配列
配列番号２１：ＭＡＢＴヒト化重鎖定常領域のヌクレオチド配列
配列番号２２：ＨＣＤＲ２に先行する典型的なアミノ酸配列
５． 詳細な説明
抗アミロイドベータ抗体を試験するための細胞ベースのアッセイ系および抗アミロイドベータ抗体による患者の処置をモニターし、調節するための方法が下記に記載される。神経保護薬の安全性または効能を試験するための細胞ベースのアッセイ系および神経保護薬による患者の処置をモニターし、調節するための方法もまた、下記に記載される。さらに、安全で機能的な抗体およびそのような安全で機能的な抗体をアルツハイマー病の処置に使用するための方法もまた、下記に記載される。医薬調製物および投与の形態もまた記載される。
５．１ 細胞ベースのアッセイ系
アミロイドーシスの処置のための抗体または他の薬剤の安全性および機能性を試験するためのインビトロにおける細胞ベースのアッセイ系が、本明細書で提供される。ある実施態様において、アミロイドーシス、その病理学的形態をしたアミロイドタンパク質、ならびに免疫エフェクター細胞（例えばナチュラルキラー細胞、ミクログリア細胞などのマクロファージ、好中球、および肥満細胞）によって影響を及ぼされる細胞（「標的細胞」）は、試験抗体の存在下および非存在下においてインキュベートされる。抗体の安全性および機能性を試験するために測定することができるパラメーターは標的細胞の生存率、免疫エフェクター細胞の中へのアミロイドタンパク質の内部移行、および免疫エフェクター細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化を含む。ある実施態様において、安全で機能的な抗体は、最大の内部移行およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の中等度の活性化をもたらす。
より特定の実施態様において、アミロイドーシスは、アルツハイマー病であり、アミロイドタンパク質は、βアミロイドであり、免疫エフェクター細胞は、ミクログリア細胞であり、標的細胞は、ニューロンである。特定の実施態様において、細胞は、混合培養物を作り出すために既存の細胞株から得られる。他の実施態様において、混合細胞培養物は、初代皮質培養物である（Ｍｅｂｅｒｇ＆Ｍｉｌｌｅｒ ２００３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７１：１１１−１２７）。ある実施態様において、混合細胞培養物は、ラット、マウス、またはチンパンジーからの初代皮質培養物である。ある実施態様において、初代皮質培養物は、皮質生検材料または脊髄生検材料によってヒト患者から得られる。
ニューロンおよびミクログリア細胞を含む混合細胞培養物は、βアミロイドタンパク質と共にインキュベートされる。一実施態様において、βアミロイドタンパク質は、βアミロイドオリゴマーとして提供される。次のパラメーターは、このアッセイ系において測定することができる：（１）ニューロンの生存率は、例えば代謝回転によって決定することができ、この代謝回転は、例えば、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のミトコンドリア酸化またはＡＴＰ放出によって決定することができる：（２）ミクログリアの中へのβ−アミロイドオリゴマー内部移行は、例えば、βアミロイドタンパク質に対する免疫細胞化学またはβアミロイドタンパク質のタギングならびに直接的な測定および／または視覚化によって決定することができる；ならびに（３）ｐ３８ ＭＡＰＫ経路の活性化は、例えば、リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ（「ホスホｐ３８」）に対するＥＬＩＳＡによって決定することができる。
ある実施態様において、βアミロイドおよび安全で機能的な抗体の存在下におけるニューロンの生存率は、安全で機能的な抗体の非存在下におけるニューロンの生存率と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または少なくとも５００％増加する。
ある実施態様において、安全で機能的な抗体の存在下におけるミクログリアの中へのβアミロイドの内部移行は、安全で機能的な抗体の非存在下における内部移行率と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または少なくとも５００％増加する。
ある実施態様において、βアミロイドおよび安全で機能的な抗体の存在下におけるミクログリアにおけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、βアミロイドの存在下であるが、安全で機能的な抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化と比較して、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％増加する。より特定の実施態様において、βアミロイドおよび安全で機能的な抗体の存在下におけるミクログリアにおけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、βアミロイドの存在下であるが、安全で機能的な抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化と比較して、１０％〜３０％増加する。さらに、βアミロイドおよび安全で機能的な抗体の存在下におけるミクログリアにおけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗βアミロイド抗体の存在下において活性化されるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ未満であるが、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％増加する。
ある実施態様において、βアミロイドの病理学的形態、例えばオリゴマーβアミロイド、試験抗体、およびミクログリア細胞は、抗体の安全性および機能性を決定するためにインキュベートされる。次のパラメーターは、このアッセイ系において測定することができる：（１）ミクログリアの中へのβアミロイドオリゴマー内部移行は、例えば、βアミロイドタンパク質に対する免疫細胞化学またはβアミロイドタンパク質のタギングによって決定することができる；および（２）ｐ３８ ＭＡＰＫ経路の活性化は、例えば、ホスホｐ３８に対するＥＬＩＳＡによって決定することができる。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を決定するために、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。ある実施態様において、リン酸化ｐ３８ ＭＡＰキナーゼに特異的に結合する抗体によるＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、または免疫細胞化学は、リン酸化、つまり活性化ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのレベルを決定するために使用される。ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの核局在化の程度を決定するために、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼに特異的に結合する抗体を使用する免疫細胞化学によって決定される。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの核局在化の程度が高度であるほど、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化のレベルは高度である。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の他の構成要素の活性化は、測定することができる。ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの下流標的の発現レベルは、患者におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を決定するために測定することができる。そのような下流標的は、９０ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ｐｐ９０ｒｓｋ）；（ＲＳＫ）ファミリー：ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＭＮＫ１／２、およびＭＳＫ１／２；ならびにＥｌｋ−１、ＡＴＦ２、ＳＴＡＴ３、およびＣＲＥＢなどの核翻訳因子を含むが、これらに限定されない。下流標的の発現レベルは、これらに限定されないが、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、またはポリメラーゼ連鎖反応などの当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。
５．２ 処置のモニターおよび調節
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、βアミロイドなどのアミロイドタンパク質に特異的に結合する、安全で機能的な抗体により処置されている患者の、ミクログリア細胞などの免疫エフェクター細胞においてモニターされる。免疫エフェクター細胞は、当業者に知られている任意の方法によって患者から得ることができる。特定の実施態様において、ミクログリア細胞は、皮質生検材料または脊髄生検材料によって得られる。免疫エフェクター細胞は、当業者に知られている任意の方法によって培養において維持することができる。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、神経保護薬などの薬剤により処置されている患者の、ミクログリア細胞などの免疫エフェクター細胞においてモニターされる。ある、より特定の実施態様において、患者は、アルツハイマー病などのアミロイドーシスについて処置されている。ある、さらにより特定の実施態様において、患者は、タクリン（ＣＯＧＮＥＸ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、ドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）、リバスチグミン（ＥＸＥＬＯＮ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、ガランタミン（ＲＥＭＩＮＹＬ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、またはメマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）により処置されている。
ある実施態様において、投与量および／または投与レジメンは、ミクログリア細胞のｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が、βアミロイドオリゴマーの存在下において、中等度レベルとなる、つまり、抗体の非存在下においてよりも高度となり、βアミロイドに特異的に結合するＩｇＧ１抗体の存在下においてよりも低度となるように、患者について調節される。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が中等度レベルを超える場合、投薬量は低減されるおよび／または投与頻度は低減される。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が中等度レベル未満である場合、投薬量は増加させるおよび／または投与頻度は増加させる。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の変調成分は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を中等度レベルに調節するために、安全で機能的な抗体と同時投与される。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が中等度レベルを超える場合、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の阻害剤は、同時投与することができる。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が中等度レベル未満である場合、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の活性剤は、同時投与することができる。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の例証となる阻害剤は、４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（４−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］フェノール（「ＳＢ ２０２１９０」）；４−［５−（４−フルオロフェニル）−２−［４−（メチルスルホニル）フェニル］１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ピリジン（「ＳＢ ２０３５８０」）；およびトランス−４−［４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシ−４−ピリミジニル）−１Ｈ−イミダゾール−１−イル］シクロヘキサノール（「ＳＢ ２３９０６３」）ならびにその薬学的に好適な誘導体を含む。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の例証となる活性剤は、アニソマイシン、ＭＫＫ、Ｒａｃ、Ｃｄｃ４２、およびＰＡＫ１、ＩＬ−１、ＩＬ−１受容体、ＴＮＦ、ＬＰＳ、ＴＲＡＦ６、ならびにＴＡＢ１／２を含む。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの中等度の活性化レベルは、安全で機能的な抗体の非存在下における患者のミクログリア細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を超える、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％である。
ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を決定するために、当業者に知られている任意の方法を使用することができる。ある実施態様において、リン酸化ｐ３８ ＭＡＰキナーゼに特異的に結合する抗体によるＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、または免疫細胞化学は、リン酸化、つまり活性化ｐ３８ ＭＡＰキナーゼのレベルを決定するために使用される。ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの核局在化の程度を決定するために、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼに特異的に結合する抗体を使用する免疫細胞化学によって決定される。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの核局在化の程度が高度であるほど、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化のレベルは高度である。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼシグナル経路の他の構成要素の活性化は、測定することができる。
ある実施態様において、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの下流標的の発現レベルは、患者におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を決定するために測定することができる。そのような下流標的は、９０ｋＤａリボソームＳ６キナーゼ（ｐｐ９０ｒｓｋ）；（ＲＳＫ）ファミリー：ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＭＮＫ１／２、およびＭＳＫ１／２；ならびにＥｌｋ−１、ＡＴＦ２、ＳＴＡＴ３、およびＣＲＥＢなどの核翻訳因子を含むが、これらに限定されない。下流標的の発現レベルは、これらに限定されないが、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、または例えばＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子転写物の検出などの当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。
さらに、患者におけるアルツハイマー病の処置のために抗β−アミロイド抗体の安全性および機能性を評価する方法が、本明細書で提供される。ある実施態様において、ミクログリア細胞は、患者から得ることができる。特定の実施態様において、ミクログリア細胞は、抗β−アミロイド抗体による患者の処置が始まる前に、患者から得ることができる。患者からのミクログリア細胞は、標準の当技術分野において知られている技術を使用して、細胞培養において維持することができる。
ある実施態様において、患者からのミクログリア細胞は、抗β−アミロイド抗体およびβ−アミロイドオリゴマーと共にインキュベートされる。次のパラメーターを決定することができる：ミクログリア細胞への抗体−βアミロイド複合体の結合；ミクログリア細胞の中への抗体−βアミロイド複合体の内部移行；および／またはミクログリア細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化。
コントロールは、抗β−アミロイド抗体単独で（つまりβ−アミロイドオリゴマーなしで）；および／またはβ−アミロイドオリゴマー単独で（つまり抗体なしで）；および／またはβ−アミロイドオリゴマーの存在下においてＩｇＧ１抗β−アミロイド抗体と共に、患者からのミクログリア細胞をインキュベートすることによって実行することができる。ある実施態様において、抗β−アミロイド抗体は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化が、β−アミロイドオリゴマーの存在下であるが、安全で機能的な抗体の非存在下における患者のコントロールミクログリア細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を超える、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％である場合、安全で機能的である。ある実施態様において、抗β−アミロイド抗体は、ミクログリア細胞の中へのβ−アミロイド内部移行が、モノクローナル抗体ＭＡＢＴを超えるまたはそれ未満の、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％である場合、安全で機能的である（６章を参照されたい）。
５．３ 安全で機能的な抗体
ある実施態様において、処置されることとなるアミロイドーシスのアミロイドタンパク質に特異的に結合する抗体の定常領域は、安全で機能的な抗体を提供するために修飾するまたは置換することができる。ある実施態様において、結果として生じる抗体の定常領域は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、および肥満細胞などの免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に中等度の活性で結合する。ある実施態様において、結果として生じる抗体は、中等度レベルで、つまり、抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を超えるが、同じ結合特異性を有する同じ濃度のＩｇＧ１抗体の存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化未満のレベルで、免疫エフェクター細胞におけるｐ３８ ＭＡＰＫ経路を活性化する。ある実施態様において、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）以外の可変領域もまた、安全で機能的な抗体を提供するために修飾することができる。そのような抗体およびそのような抗体を含む医薬組成物を生成するための方法もまた、本明細書で提供される。
抗原結合特異性は、それぞれ抗体の軽鎖および重鎖の可変領域中に埋め込まれている相補性決定領域（「ＣＤＲ」）によって提供される。本明細書で提供される安全で機能的な抗体の構築のために使用することができる抗体定常領域およびＣＤＲを取り囲むフレームワーク領域は、５．３．１章において記載されるものを含む。ある実施態様において、安全で機能的な抗体の構築のために使用することができるＣＤＲまたは可変領域は、表２において記載される抗体に由来し得る。
ある実施態様において、ヒトβアミロイドに特異的に結合する、知られている抗体のＣＤＲ（下記の表２を参照されたい）は、ヒトＩｇＧ４の定常領域と組み合わされ、抗体のＣＤＲの間のフレームワーク領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧのフレームワーク領域と置換される。ある実施態様において、知られているヒト化抗βアミロイド抗体、例えばバピネオズマブまたはソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）の可変領域は、ヒトＩｇＧ４の定常領域と組み合わされる。
５．３．１ 定常領域
本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための抗体定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む任意のアイソタイプに由来し得る。ある実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための抗体定常領域は、サブタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に由来し得る。
同様に、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための抗体重鎖領域のフレームワーク領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む任意のアイソタイプに由来し得る。ある実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための抗体フレームワーク領域は、サブタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に由来し得る。
特定の実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための定常領域は、アイソタイプＩｇＧに由来し得る。さらにより特定の実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のための定常領域は、アイソタイプＩｇＧ４に由来し得る。
特定の実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のためのフレームワーク領域は、アイソタイプＩｇＧに由来し得る。さらにより特定の実施態様において、本明細書で提供される安全で機能的な抗体の生成のためのフレームワーク領域は、アイソタイプＩｇＧ４に由来し得る。
ある実施態様において、安全で機能的な抗体の重鎖の定常領域は、異なるアイソタイプまたはサブタイプからのキメラ定常領域である。特定の実施態様において、重鎖の定常領域は、ＩｇＧ４のエフェクター機能に関与するＩｇＧ４重鎖定常領域のその部分およびＩｇＧの異なるサブタイプの間のキメラである。特定の実施態様において、重鎖の定常領域は、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域のＣＨ２ドメインおよびＩｇＧの異なるサブタイプの間のキメラである。
ある実施態様において、キメラ定常領域は、下記に記載されるように、Ｆｃγに対する中等度の結合活性を有する。ある実施態様において、キメラ定常領域は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路活性が、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系によって決定されるように中等度レベルとなるように、ミクログリアなどの免疫エフェクター細胞の中への内部移行を媒介する。
ある実施態様において、定常領域は、突然変異を導入することによって最適化される。突然変異は、組換えＤＮＡ技術を使用して、定常領域の中に導入することができる。ある実施態様において、結果として生じる抗体は、高レベルでミクログリア細胞の中へのβアミロイドの内部移行を促進するが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、中等度レベルである。内部移行の率およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系を使用して決定することができる。ある実施態様において、変異した定常領域を有する抗体は、下記に記載されるように、Ｆｃ受容体に対する中等度の結合活性を有する。
ある実施態様において、定常領域は、グリコシル化パターンを改変することによって最適化される。グリコシル化パターンは、抗体が合成されるおよび／またはグリコシル化されているアミノ酸（例えばＡｓｎ２９７）を変異させる発現系によって改変することができる。ある実施態様において、結果として生じる抗体は、高レベルでミクログリア細胞の中へのβアミロイドの内部移行を促進するが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、中等度レベルである。内部移行の率およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系を使用して決定することができる。ある実施態様において、改変されたグリコシル化パターンを有する定常領域を有する抗体は、下記に記載されるように、Ｆｃ受容体に対する中等度の結合活性を有する。
ある実施態様において、定常領域は、そのＦｃ受容体に対する中等度の結合活性を有する。例証となるＦｃ受容体およびそれぞれの主な抗体リガンドは、表１において記載される。抗体リガンドおよびＦｃ受容体の間の結合活性は、当業者に知られている任意の方法を使用して決定することができる。結合親和性を測定する例示的な方法は、ＥＬＩＳＡアッセイ法およびＢＩＡＣＯＲＥ解析を含むが、これらに限定されない。あるより特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、免疫エフェクター細胞の中への抗体抗原複合体の内部移行を媒介するＦｃ受容体である。ある、さらにより特定の実施態様において、Ｆｃ受容体は、ミクログリア細胞上に発現されるＦｃγ受容体である。
ある実施態様において、抗体定常領域は、アイソタイプＩｇＧであり、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。安全で機能的な抗体の生成のための定常領域は、Ｆｃγ受容体に対する結合活性の１０％〜３０％；２０％〜４０％、３０％〜５０％、４０％〜６０％、５０％〜７０％、６０％〜８０％、または７０％〜９０％のＦｃγ受容体に対するＩｇＧ１の結合活性を有する。特定の実施態様において、アルツハイマー病の処置のための安全で機能的な抗体の生成のための定常領域は、Ｆｃγに対するＩｇＧ１の結合活性の１５％〜２５％またはより具体的には約２０％である。
ある実施態様において、抗Ａβ抗体のエフェクター領域は、抗体のエフェクター機能が低減されるまたは除去されるように修飾される。修飾は、アミノ酸置換および／または欠失をもたらす任意の遺伝子変異であり得る。より特定の実施態様において、定常領域は、エフェクター機能が低減されたまたは除去された修飾ＩｇＧ１定常領域である。そのような修飾は、例えば、ここにその全体が参照により援用される２０００年７月２０日公開の国際特許出願公開ＷＯ ００／４２０７２において記載されるように導入することができる。ある実施態様において、そのＦｃ受容体に結合する修飾定常領域を有する抗体の能力は、未修飾定常領域と比べて低減される。他の実施態様において、定常領域およびそのＦｃ受容体の間の結合は、改変されないが、エフェクター細胞の存在下における細胞毒性などのエフェクター機能は、未修飾定常領域と比べて低減される。
５．３．２ 可変領域
ある実施態様において、βアミロイドおよび／またはその病理学的形態（複数可）に特異的に結合することが知られている抗体の可変領域は、安全で機能的な抗体の生成のために使用することができる。あるより特定の実施態様において、βアミロイドおよび／またはその病理学的形態（複数可）に特異的に結合することが知られているヒト化抗体の可変領域は、安全で機能的な抗体の生成のために使用することができる。ある実施態様において、可変領域は、非ＩｇＧ４ヒト化抗体から得られる。特定の実施態様において、可変領域は、非ＩｇＧ４ヒト化抗体から得られ、ＩｇＧ４定常領域は、定常領域として使用される。
興味のあるアミロイドタンパク質に結合することが知られている抗体のＣＤＲは、本明細書で記載される方法において有用な安全で機能的な抗体の生成のために使用することができる。ある実施態様において、βアミロイドおよび／またはその病理学的形態（複数可）に特異的に結合することが知られている抗体のＣＤＲは、そのような安全で機能的な抗体の生成のために使用することができる。
そのＣＤＲまたは可変領域を使用することができる、例証となる抗体は、表２において記載されるものを含むが、これらに限定されない。
特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体のＣＤＲは、以下のとおりである：重鎖のＣＤＲ１は、配列番号１のアミノ酸配列を有する；重鎖のＣＤＲ２は、配列番号２のアミノ酸配列を有する；重鎖のＣＤＲ３は、配列番号３のアミノ酸配列を有する；軽鎖のＣＤＲ１は、配列番号４のアミノ酸配列を有する；軽鎖のＣＤＲ２は、配列番号５のアミノ酸配列を有する；軽鎖のＣＤＲ３は、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
他の特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。より特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
他の特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。より特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
さらにより特定の実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、本発明の安全で機能的な抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
一実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有し、本発明の安全で機能的な抗体の重鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一であるアミノ酸配列を有する。
ｍＭＡＢＴ抗体のＣＤＲＬ２配列（「ＫＶＳＮＲＦＳ」（配列番号５））は、抗体活性に悪影響を及ぼすことなく、わずかに修飾されてもよい。保存的置換は、位置５０でのＫに対するＲおよび位置５３でのＮに対するＳの交換を通して行ってもよい。それゆえ、２つの代替のＣＤＲＬ２配列は、それぞれ、「ＲＶＳＮＲＦＳ」および「ＫＶＳＳＲＦＳ」である。これらは、それぞれ、ｍＭＡＢＴ ＶＫ−ＲおよびｍＭＡＢＴ ＶＫ−Ｓのように、他の変化を有していないマウスＶＫ配列の中に組み込まれる。
５．３．３ 抗体の構築
ある実施態様において、アミロイドタンパク質またはβアミロイドなどのその病理学的形態に特異的に結合する抗体のＣＤＲは、本発明の安全で機能的な抗体と適合する定常領域を有する抗体の中に配置される（５．３．１章）。ある実施態様において、アミロイドタンパク質またはβアミロイドなどのその病理学的形態に特異的に結合する抗体の可変領域は、本発明の安全で機能的な抗体と適合する定常領域と組み合わされる（５．３．１章）。
ヒト化抗体を構築する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ヒト化抗体を生成する方法は、ＷＯ２００８／０１１３４８として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７３５０４において記載されており、ここにその全体が参照により援用される。
５．３．４ 安全性に対する試験
アルツハイマー病の抗βアミロイド抗体による処置中に観察された副作用は、髄膜炎や髄膜脳炎などの炎症性副作用、及び脳における体液の増加（脳浮腫）を含む。他の副作用は、有害な免疫反応、つまり、投与された抗βアミロイド抗体に対する患者による免疫反応を含む。
５．３．４．１ 有害な免疫反応
抗βアミロイド抗体を受けた患者においてモニターすることができる１つの副作用は、抗体に対する抗体応答である。そのような有害な免疫反応の大きさを検出する、モニターする、または定量化するための当業者に知られている任意の技術を使用することができる。そのような抗体応答は、抗体が抗βアミロイド抗体に結合する場合に起こる。可溶性抗原が血管コンパートメントにおける抗体と組み合わさる場合、それらは、様々な臓器の血管床中に非特異的に捕捉される循環免疫複合体を形成し得、血清病、血管炎、血管炎を有する全身性エリテマトーデス腎炎（ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、または糸球体腎炎などのいわゆる免疫複合体病を引き起こす。
免疫複合体病は、当技術分野において知られている任意の方法を使用して検出および／またはモニターすることができる。例えば、免疫複合体試験は、免疫複合体病の重症度を推定するために血液中の循環免疫複合体を実証するために使用することができる。免疫複合体試験は、当業者に知られている任意の方法によって実行することができる。特に、免疫複合体試験は、米国特許第４，１４１，９６５号、米国特許第４，２１０，６２２号、米国特許第４，２１０，６２２号、米国特許第４，３３１，６４９号、米国特許第４，５４４，６４０号、米国特許第４，７５３，８９３号、および米国特許第５，８８８，８３４号において記載される任意の１つまたは複数の方法を使用して実行することができ、これらのそれぞれは、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。
他の方法は、抗体に対する抗イディオタイプ抗体を検出するための、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイの使用である。Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists;Clarke, W. and Dufour, D. R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W;Presta 米国特許第６７３７０５６号;Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612);WO96/13590;およびWO96/29605を参照されたい。
５．３．４．２ 浮腫
抗βアミロイド抗体を受けた患者においてモニターすることができる１つの副作用は、例えばＭＲＩスキャン、ＤＣＥ−ＭＲＩスキャン、ＰＥＴスキャン、および／またはＣＴスキャンによって評価してもよい浮腫、特に脳浮腫である。浮腫の大きさを検出する、モニターする、または定量化するための当業者に知られている任意の技術を使用することができる。浮腫はまた、浮腫の動物モデルにおいて測定されてもよい。そのような方法において、浮腫体積（対側半球体積のうちの同側半球体積の半球体積）が、計算される。
ＣＴおよびＴ１強調ＭＲＩで、脳浮腫は、低信号または高信号病変として視覚化することができる。脳脊髄液などの高度な水含有量を有する脳浮腫および他の構造は、Ｔ２強調ＭＲＩで高信号である。脳浮腫が、等信号または高信号バックグラウンドに対して高信号病変として明確に視覚化されるので、液体減衰反転回復ＭＲ画像は、付加的な情報を提供する。
５．３．４．３ 髄膜炎
抗βアミロイド抗体を受けた患者においてモニターすることができる１つの副作用は、髄膜炎である。髄膜炎の大きさを検出する、モニターする、または定量化するための当業者に知られている任意の技術を使用することができる。運動および感覚機能；神経機能；聴覚および会話；視覚；協調およびバランス；精神状態；ならびに気分または行動における変化を評価するために設計される一連の試験を含む神経学的検査を行ってもよい。神経系の機能は、音叉、小さな光、反射ハンマー（ｒｅｆｌｅｘ ｈａｍｍｅｒ）、およびピンなどのアイテムの助けを借りて、強さおよび感覚の試験を通して評価してもよい。
脳および脊髄を取り囲み、保護する脳脊髄液の分析は、急性および慢性炎症を検出することができる。脊椎穿刺（または腰椎穿刺）として知られている手順において、少量の脳脊髄液が、下背に挿入される特殊な針によって摘出される。皮膚は、サンプリングに先立って局所麻酔薬により麻痺させる。健康な人々において十分に清澄である体液は、細菌または血液の存在を検出するためにならびにグルコースレベル（低グルコースレベルは細菌性または真菌性髄膜炎の徴候である）および白血球（白血球数の上昇もまた、感染症の徴候である）を測定するために試験される。手順は、通常病院において行われ、約４５分かかる。
非侵襲性画像処理手順は、髄膜炎診断を得るために日常的に使用される。そのようなコンピューター支援画像処理は、脳炎；内出血または出血；および髄膜炎に関連し得る他の脳異常の徴候を明らかにすることができる。ＣＴスキャンとして知られているコンピューター断層撮影法は、骨、臓器、および組織の急速で明確な二次元画像を産生するために、Ｘ線およびコンピューター技術を組み合わせる。時々、脳中の異なる組織を目立たせて、かつ髄膜の炎症を検出するために、造影剤が、血流の中に注射される。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、組織、臓器、骨、および神経を含む身体構造の詳細な画像を産生するために、コンピューターによって生成される電波および強力な磁石を使用する。造影剤は、より多くの細部を明らかにするために試験に先立って注射されてもよい。髄膜炎診断を支援するために使用される他の画像処理技術は、超音波である。
脳波測定法またはＥＥＧは、頭蓋を通して脳中の電気的活性をモニターすることによって、髄膜炎に関連する異常な脳波を同定することができる。ＥＥＧは、脳の炎症を診断するのを助けるために使用される。
５．３．５ 機能性に対する試験
５．３．５．１ 神経心理学的試験
本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、1つまたは複数の神経心理学的試験を使用して評価することができる。例示的な神経心理学的試験は、下記に記載され、限定を伴うことなく、The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (「CERAD」;例えばMorris JC, Mohs RC, Rogers H, Fillenbaum G, Heyman A. Consortium to establish a registry for Alzheimer’s disease (CERAD) clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer’s disease. Psychopharmacol Bull. 1988;24(4):641-52; Morris JC, Heyman A, Mohs RC, Hughes JP, van Belle G, Fillenbaum G, Mellits ED, Clark C. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part I. Clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 1989 Sep; 39(9):1159-65;およびWelsh K, Butters N, Hughes J, Mohs R, Heyman A. Detection of abnormal memory decline in mild cases of Alzheimer’s disease using CERAD neuropsychological measures. Arch Neurol. 1991 Mar;48(3):278-81を参照されたい)によって確立されたものを含む。
一実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃａｌｅ−Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｔｅｓｔ(「ADAS-Cog」;例えばRosen WG, Mohs RC, Davis KL. A new rating scale for Alzheimer’s disease. Am J Psychiatry. 1984 Nov;141(11):1356-64; Ihl R, Brinkmeyer J, Janner M, Kerdar MS. A comparison of ADAS and EEG in the discrimination of patients with dementia of the Alzheimer type from healthy controls. Neuropsychobiology. 2000 Jan;41(2):102-7;およびWeyer G, Erzigkeit H, Kanowski S, Ihl R, Hadler D. Alzheimer’s Disease Assessment Scale: reliability and validity in a multicenter clinical trial. Int Psychogeriatr. 1997 Jun;9(2):123-38を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒａｔｉｎｇ Ｓｃａｌｅ(「BEHAVE-AD」;例えばReisberg B, Borenstein J, Salob SP, Ferris SH, Franssen E, Georgotas A. Behavioral symptoms in Alzheimer’s disease: phenomenology and treatment. J Clin Psychiatry. 1987 May;48 Suppl:9-15を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｂｌｅｓｓｅｄ−Ｄｅｍｅｎｔｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−Ｍｅｍｏｒｙ−Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ(例えばBlessed G, Tomlinson BE, Roth M. The association between quantitative measures of dementia and of senile change in the cerebral grey matter of elderly subjects. Br J Psychiatry. 1968 Jul;114(512):797-811を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｓｔ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｂａｔｔｅｒｙ(「CANTAB」;例えばSwainson R, Hodges JR, Galton CJ, Semple J, Michael A, Dunn BD, Iddon JL, Robbins TW, Sahakian BJ. Early detection and differential diagnosis of Alzheimer’s disease and depression with neuropsychological tasks. Dement Geriatr Cogn Disord. 2001;12:265-280; Fray PJ, Robbins TW. CANTAB battery: proposed utility in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 1996 Jul-Aug; 18(4):499-504;およびRobbins TW, James M, Owen AM, Sahakian BJ, McInnes L, Rabbitt P. Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB): a factor analytic study of a large sample of normal elderly volunteers. Dementia. 1994 Sep-Oct;5(5):266-81を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｃｌｏｃｋ Ｄｒａｗ Ｔｅｓｔ(例えばSunderland T, Hill JL, Mellow AM, Lawlor BA, Gundersheimer J, Newhouse PA, Grafman JH. Clock drawing in Alzheimer’s disease. A novel measure of dementia severity. J Am Geriatr Soc. 1989 Aug;37(8):725-9;およびLee H, Swanwick GR, Coen RF, Lawlor BA. Use of the clock drawing task in the diagnosis of mild and very mild Alzheimer’s disease. Int Psychogeriatr. 1996 Fall;8(3):469-76を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｓｃａｌｅ ｆｏｒ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｄｅｍｅｎｔｉａ(「CSDD」; Alexopoulos GS, Abrams RC, Young RC, Shamoian CA. Cornell Scale for Depression in Dementia. Biol Psychiatry. 1988 Feb 1;23(3):271-84)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｃａｌｅ(「GDS」;例えばBurke WJ, Roccaforte WH, Wengel SP. The short form of the Geriatric Depression Scale: a comparison with the 30-item form. J Geriatr Psychiatry Neurol. 1991 Jul-Sep;4(3):173-8を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｍｉｎｉ Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ(「MMSE」;例えばFolstein MF, Folstein SE, and McHugh PR. ”Mini-Mental State”: a practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res. 1975; 12:189-198; and Cockrell JR, and Folstein MF. Mini-Mental State Examination (MMSE). Psychopharm Bull. 1988;24(4):689-692を参照されたい)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ(「NPI」; Cummings JL, Mega M, Gray K, Rosenberg-Thompson S, Carusi DA, Gornbein J. The Neuropsychiatric Inventory: comprehensive assessment of psychopathology in dementia. Neurology. 1994 Dec;44(12):2308-14; Cummings JL. The Neuropsychiatric Inventory: assessing psychopathology in dementia patients. Neurology. 1997 May;48(5 Suppl 6):S10-6)を使用して評価することができる。
他の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、７ Ｍｉｎｕｔｅ Ｓｃｒｅｅｎ(例えばSolomon PR, Pendlebury WW. Recognition of Alzheimer’s disease: the 7 Minute Screen. Fam Med. 1998 Apr;30(4):265-71; and Solomon PR, Hirschoff A, Kelly B, Relin M, Brush M, DeVeaux RD, Pendlebury WW. A 7 minute neurocognitive screening battery highly sensitive to Alzheimer’s disease. Arch Neurol. 1998 Mar;55(3):349-55を参照されたい)を使用して評価することができる。
５．３．５．２ インビボにおける画像処理
本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、対象においてインビボにおける画像処理を使用して評価することができる。
画像処理試薬は、患者の体内に静脈内注射によってまたは頭蓋内注射によって脳の中に直接または頭蓋を通して穴を空けることによって投与することができる。試薬の投薬量は、処置方法に関しては同じ範囲内にあるべきである。典型的には、試薬は、標識されるが、いくつかの方法において、親和性を有する最初の試薬は非標識であり、第２の標識剤は、最初の試薬に結合するように使用される。標識の選択は、検出の平均値に依存する。例えば、蛍光標識は、光学的検出に好適である。常磁性の標識の使用は、外科的介入を伴わない断層撮影法の検出に好適である。放射性標識もまた、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を使用して検出することができる。
処置の機能性は、対応するベースライン値に対する標識された位置の数、サイズ、および／または強度を比較することによって評価することができる。ベースライン値は、アルツハイマー病を有していない個体の集団における平均レベルを示すことができる。その代わりに、ベースライン値は、同じ患者において決定された以前のレベルを示すことができる。例えば、ベースライン値は、処置を始める前に患者において決定することができ、測定値は、その後、ベースライン値と比較することができる。ベースラインと比べた値の減少は、処置に対するポジティブな応答を伝えることができる。
抗β−アミロイド抗体はまた、Ａβの切断型形態が脳脊髄液または他の体内組織もしくは体液中に存在するかどうかを決定するのに有用である。ベースラインと比べた患者における減少したレベルのそのような形態の存在は、処置に対するポジティブな応答を伝えることができる。
（１）陽電子放射断層法
一実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、アルツハイマー病の病態生理をモニターするために、陽電子放射断層法（ＰＥＴ）と共にプローブとして放射性標識トレーサーを使用することによって評価することができる。(例えばNagren et al. 2009, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer’s disease, published online December 22, 2009を参照されたい)。例えば、炭素１１標識Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｂは、アミロイドプラーク負荷を画像化するためにＰＥＴと共に放射性トレーサーとして使用することができる(例えばRinne 2010, Lancet Neurology 9:363-372を参照されたい)。アミロイドプラーク負荷のＰＥＴ画像処理のための他のトレーサーは、１８Ｆ標識スチルベンおよびスチリルピリジン(例えばKung et al. 2010, Journal of Medicinal Chemistry 53:933-941を参照されたい);１８Ｆ標識ベンゾチアゾール（ＢＴＡ）−誘導体３’−１８ＦＦＰＩＢ；コンゴレッド誘導体ＳＢ−１３の１１Ｃおよび１８Ｆ標識バージョン；ならびにアミノナフチル誘導体１８ＦＦＤＤＮＰ(例えばHenriksen et al. 2008, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Suppl 1:S75-81を参照されたい)を含む。
（２）磁気共鳴画像法
一実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用することによって評価することができる。ＭＲＩは、中枢神経系における体積変化を評価するために(例えばFagan et al. 2009, Annals of Neurology 65:176-183を参照されたい)および血管原性浮腫を定量化するために(例えばBlack et al. 2010, Alzheimer Disease and Associated Disorders 24:198-203を参照されたい)、使用することができる。
５．３．５．３ 動物モデル
一部の実施態様において、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、アルツハイマー病のモデルを使用して、インビボにおいて試験することができる。アルツハイマー病のそのような動物モデルは、当技術分野において周知であり、限定を伴うことなく、マウス、ラット、および霊長類を使用するモデルを含む。
アルツハイマー病の例示的なマウスモデルは、ＴｇＣＲＮＤ８マウス(例えばChishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001); Janus, C. et al., Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer’s disease. Nature 408, 979-982 (2000)を参照されたい)を含む。ＴｇＣＲＮＤ８マウスは、ヒトにおいてアルツハイマー病を引き起こすことが知られている２つのミスセンス突然変異（ＫＭ６７０／６７１ＮＬおよびＶ７１７Ｆ）を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質導入遺伝子（ＡＰＰ６９５）を発現する。約３月齢時に、これらのマウスは、脳のＡβレベルの上昇および脳の細胞外アミロイドプラークの数の増加が伴う進行性の空間学習欠損を示す。６月齢までに、ＡβのレベルならびにＴｇＣＲＮＤ８マウスの脳におけるアミロイドプラークの形態、密度、および分布は、確立されたアルツハイマー病のヒトの脳において見られるものに類似する。アルツハイマー病のヒト患者でのように、マウスモデルの生化学的、行動的、および神経病理学的特徴には、死亡率の加速が伴う。アルツハイマー病の他の例示的なマウスモデルは、当技術分野において知られており、そのようなマウスは、市販されている(例えば、The Jackson Laboratoryのウェブサイトで入手可能なAlzheimer’s Disease Mouse Model Resourceを参照されたい)。
アルツハイマー病のための霊長類モデルもまた、当技術分野において知られている(例えばWenk, 1993, Behavioural Brain Research 57(2):117-122;およびFainman et al., 2007, American Journal of Medical Genetics 144B(6):818-819を参照されたい)。
動物モデルにおけるそのようなアルツハイマー病の処置後に、処置の機能性は、限定を伴うことなく、下記に記載されるものを含む、技術分野において知られている方法を使用して評価することができる。
（１）生存個体数調査
マウスの生存率は、死亡の発生毎に生存率を算出し、したがって、小さなサンプルサイズにとってそれを好適にするＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して評価することができる。生存の解析のために、マウスは、コントロールグループおよび処置グループにグループ化することができ、グループの間の比較は、例えばＴａｒｏｎｅ−Ｗａｒｅ検定を使用して評価することができる。
（２）Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験は、以前に記載されるように実行することができる(例えばMorris, R. Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci Methods 11, 47-60 (1984)を参照されたい)。この手順において、マウスは、水で満たされた円形のプール中に配置することができ、逃避台は、水の表面直下に浸水している。動物が近位の視覚的な手掛りに向けて進むことによってそれを見つけることができるように、目に見えるマーカーを台上に配置することができる（その代わりに、台の位置をマークするための形式的な手掛りがない、より複雑な形態の試験をマウスに与えることができる。この形態において、マウスは、台の遠位の視覚的な手掛りと比べた位置を学習しなければならない）。マウスが水中にとどまる時間の長さは、認知能力に反比例する。
例示的な試験は以下のとおりである：マウスは、予備訓練なしで１日目に台が隠されたＭｏｒｒｉｓ水迷路試験を受ける。マウスは、１日当たり６回のトライアルで３日間試験することができる。４日目に、台をプールから撤去することができ、各マウスは、１回の３０秒間の水泳プローブトライアル（ｐｒｏｂｅ ｔｒｉａｌ）を与えられる。最後の日に、マウスは、それらの水泳能力、視力、および一般的な認知を評価するために手掛り試験を施すことができる。手掛り試験は、試験に使用されるものとは異なる四分円に配置されている台により構成することができ、旗でタグをつけることができる。動物に、６０秒間、台を見つけさせることができる。台を見つけない動物は、空間記憶の最終解析において使用されない。行動的なデータは、薬物または遺伝子型および反復尺度因子（ｒｅｐｅａｔｅｄ ｍｅａｓｕｒｅ ｆａｃｔｏｒ）としての訓練セッションにより、要因分散分析（ＡＮＯＶＡ）の混合モデルを使用して分析することができる。
（３）自発運動活性
自発運動活性は、知られているアプローチを使用して、例えばロータロッド（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用して評価することができる。例えば、マウスは、以前に記載された(例えばMasliah, et al. (2000)を参照されたい)ロータロッドにおいて２日間分析することができる。そのような解析において、最初の日に、マウスは、５回のトライアルのために訓練することができる：第１回は１０ｒｐｍ、第２回は２０ｒｐｍ、および第３〜第５は４０ｒｐｍで。２日目に、マウスは、４０ｒｐｍで７回のトライアルについてそれぞれ試験することができる。トライアルの間、マウスは、円柱上に個々に配置することができ、回転速度は、ある期間にわたって適切な速度まで増加させる。マウスがロッド上にとどまる時間の長さ（落下潜時（ｆａｌｌ Ｌａｔｅｎｃｙ））を記録することができ、運動機能の尺度として使用することができる。
（４）脳のアミロイド負荷
脳のアミロイド負荷は、以下のように試験することができる：試験動物からの脳を摘出することができ、一方の半球を、４％パラホルムアルデヒド中に固定することができ、正中矢状面（ｍｉｄ ｓａｇｉｔｔａｌ ｐｌａｎｅ）でパラフィンろう中に包埋することができる。序列性の一様な無作為切片のセットを生成するために、５マイクロメートルの連続切片を、全半球にわたって収集することができる。５０マイクロメートルの間隔の切片のセットを、解析のために使用することができる（１０〜１４切片／セット）。プラークは、ギ酸による抗原回復および一次抗βアミロイド抗体（例えばＤａｋｏ Ｍ−０８７２）とのインキュベーション、その後に続く二次抗体（例えばＤａｋｏ ＳｔｒｅｐｔＡＢＣｃｏｍｐｌｅｘ／ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｋｉｔ）後に、同定することができる。最終産物は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）により視覚化することができ、例えばルクソールファストブルーにより対比染色することができる。アミロイドプラーク負荷は、例えば、Ｌｅｉｃａ顕微鏡およびＨｉｔａｃｈｉ ＫＰ−Ｍ１Ｕ ＣＣＤビデオカメラと接続したＬｅｃｏ ＩＡ−３００１画像解析ソフトウェアを使用して評価することができる。Ｏｐｅｎｌａｂ画像処理ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）は、続いて、プラーク数およびプラーク面積決定のために、顕微鏡写真を２値画像に変換するために使用することができる。
（５）血漿および脳のアミロイドベータ
アミロイドベータのレベルは、血漿および脳において以下のように決定することができる：半分の脳のサンプルは、緩衝スクロース溶液、その後に続く、可溶性アミロイドベータレベルについての０．４％ジエチルアミン／１００ｍＭ ＮａＣｌか、または総Ａβの単離についての冷ギ酸中のいずれかでホモジナイズすることができる。中和後に、サンプルは、希釈し、市販されているキット（例えばＢＩＯＳＯＵＲＣＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって提供されるもの）を使用して、Ａβについて分析することができる。ウェスタンブロット解析は、Ａβ種について尿素ゲルを使用してすべての画分について実行できる(例えばWiltfang, J. et al., Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated Abeta peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer’s disease and in patients with chronic neuroinflammation J Neurochem 81, 481-496 (2002)を参照されたい)。アミロイドベータは、例えば６Ｅ１０（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）およびＥｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｎｓｃｅｎｃｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出することができる。
（６）脳におけるＡＰＰの解析
ＡＰＰは、脳において以下のように検出することができる：マウスの半分の脳のサンプルは、ホモジナイズし、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＥＧＴＡならびに０．４％ＤＥＡ（ジエチルアミン）／１００ｍＭ ＮａＣｌと混合されたプロテアーゼ阻害剤カクテル中で１０９，０００ｘｇで回転させることができる。上清は、モノクローナル抗体を使用して、ウェスタンブロッティングによってＡＰＰレベルについて分析することができ、ペレットは、例えば、以前に記載されるモノクローナル抗体Ｃ１／６．１によりＡＰＰホロタンパク質について分析することができる(例えばChishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001); and Janus, C. et al., A.beta. peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer’s disease. Nature 408, 979-982 (2000)を参照されたい)。
（７）長期増強
電場電位は、標準の手順を使用して、マウス海馬のＣＡ１部において記録することができる（例えばSarvey, J M, Burgard E C & Decker G. Long-term potentiation: studies in the hippocampal slice. J Neurosci Methods 28, 109-124 (1989); and Stanton, P K & Sarvey J M. Norepinephrine regulates long-term potentiation of both the population spike and dendritic EPSP in hippocampal dentate gyrus. Brain Res Bull. 18, 115-119 (1987)を参照されたい）。マウスの脳は、摘出することができ、各半球からの海馬は、単離することができ、これから、切片を調製することができる（例えば３５０μｍ冠状切片を作製することができる）。切片は、ＮａＣｌ−ＣＳＦを含む保持チャンバーに移すことができ、１時間を超える時間、回復させた。一度、チャンバー中に配置されたら、切片は、オリゴマーＡβを保存するために、１５ｍｌのＡＣＳＦを含む閉ループによって継続的に灌流することができる。２０分間の安定したベースラインの後に、１ｍｌの１５×濃縮７ＰＡ２条件培地を、灌流ループに添加することができる。双極性刺激電極（例えばＷｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔ．によって提供されるもの）は、ベースライン刺激およびテタヌス（ｔｅｔａｎｕｓ）を伝えるためにＳｃｈａｆｆｅｒ側枝中に配置することができる。ＡＣＳＦを含むホウケイ酸ガラス記録用電極は、刺激電極からおよそ７５〜２００μｍに位置づけることができる。刺激の強度（典型的には１０〜２０μＡｍｐ）は、最大の電場電位応答の２５〜４０％を得るために設定することができる。試験刺激は、０．０５Ｈｚで伝えることができる。長期増強を誘導するために、４テタヌス（１秒間に１００Ｈｚ）を５分間隔で伝えることができる。電場電位応答は、例えばＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂを使用して、１０倍増幅させることができる。データは、１０ｋＨｚでサンプリングし、２ｋＨｚでフィルタリングすることができる。トレースは、例えばｐＣｌａｍｐ ９．２を使用して分析することができる。電場電位のスロープは、全応答のおよそ１０〜６０％を使用して推定することができる。
（８）シナプトフィジン定量化
シナプトフィジン免疫組織化学的染色は、パラホルムアルデヒド固定された処置マウスおよびコントロールマウスの、３つの均一に間隔を置いた矢状切片に対して実行することができる。切片は、例えば抗シナプトフィジンＩｇＧ（１：４０；Ｒｏｃｈｅ、Ｌａｖａｌ、ＰＱ）によりシナプトフィジンについて免疫標識することができる。デジタル画像を取り込み、分析することができる。各切片内で、海馬のＣＡ１領域の３つの無作為に選ばれた海馬のＣＡ１領域の１００μｍ２面積は、シナプトフィジン反応性の細胞体および終末ボタンについて数えることができる。結果は、１００μｍ２当たりの反応性の体および終末ボタンの数の平均値として表現することができる(例えばChen, F. et al. Carboxyl-terminal fragments of Alzheimer beta-amyloid precursor protein accumulate in restricted and unpredicted intracellular compartments in presenilin 1-deficient cells. J Biol. Chem. 275, 36794-36802 (2002); Phinney, A. et al., No hippocampal neuron or synaptic bouton loss in learning-impaired aged β-amyloid precursor protein-null mice. Neuroscience 90, 1207-1216 (1999)を参照されたい)。
（９）条件づけ味覚嫌悪
条件づけ味覚嫌悪（ＣＴＡ）は、処置の実施前後に動物の認知機能を試験するために使用される非常に感度がよく、周知で、標準の試験である。ＣＴＡは、味などの新規な刺激と病気を関連させるための学習についての動物の能力を試験するために使用され、動物は、新規な刺激に対する後の再曝露に際して新規な味を避ける。ＣＴＡは、様々な皮質および皮質下レベルの脳を含む。ともに嫌悪行動をもたらす上行性および下行性の情報を連結する連合は、相互に連絡するユニットのいずれかに影響を及ぼす変化によって弱化または強化し得る。連合学習の形態として、ＣＴＡの強さは、少し例を挙げると、新規な経口刺激（例えば非新規な刺激は回避的に条件付けることができない）、もたらされる「病気」の程度（毒性）、反復（訓練）の数、反対の欲求（口渇など）を含む、多くの変数によって決定される。種々様々の化学的および物理的物質は、用量依存的な方式でＣＴＡをもたらすことができるが、塩化リチウムは、倦怠感および食欲不振を確実にもたらす。自然に存在する病気のように、リチウムは、サイトカイン放出を含めて、上記に記載される経路を刺激することによってＣＴＡをもたらす。
（１０）Ｂａｒｎｅｓ迷路
Ｂａｒｎｅｓ迷路は、テーブルの周囲に円形の穴を有する円形のテーブルからなる。各穴の下に、落下箱と呼ばれる箱に向けたスロットがある。迷路における動物のゴールは、上部が開いており、テーブルの上部の穴のうちの１つを通って到達することができる箱である落下箱に到達することである。テーブルの表面上への曝露は、負の強化としての役割を果たし、試験対象が避難所を捜し求めるように動機づける。有効な唯一の避難所は、落下箱であり、試験対象はこれに逃げなければならない。試験対象が迷路に慣れるように、対象は、避難の手助けによって落下箱の中に誘導される。４〜５回の実行後に、正常な試験対象は、落下穴を直ちに位置づけることができる。台のまわりに設定された固定された視覚的な手掛りは、トライアルの間に齧歯類に方角を知らせる役割を果たす。
成績は、対象がする間違いの数、つまり、対象が、その鼻を落下箱を含まない円形の穴の中に突き出すまたはその頭部をその上にとどまらせる回数によって典型的には測定される。間違い／トライアルの数における減少の率は、すべての対象にわたって測定される。他の成績値もまた、測定することができる、例えば、各齧歯類が用いる戦略は、無作為（無作為に各穴をチェック）、序列性（あるパターンで各穴をチェック）、または空間的（落下箱を有する穴への一直線の移動）としてスコア化することができる。
（１１）遅延見本合わせ
遅延見本合わせ（ＤＭＴ）手順は、実験動物における空間認識記憶を評価するために一般に使用される。例示的なプロトコールにおいて、対象は、２つの引き込み式のレバーおよび飼料ペレットディスペンサーが装備されたチャンバー中に配置される。ある期間の後に、サンプルレバーが提示され、対象は、飼料を得るためにレバーを押さなければならない。続いて、レバーは引っ込められ、異なる期間の遅延後に、両方のレバーは、再び提示され、対象は、選ぶことを要求される。マッチング条件下で、正確な応答は、以前に提示されているレバーを押すことであり、飼料ペレットの受渡によって報酬を与えられる。不正確な応答は、ハウスのライトが切られる５秒間の中断時間により罰せられる。作動記憶は、対象の正確および不正確な応答の数を分析することによって決定される。
（１２）ミクログリア活性化
ミクログリアの活性化は、アルツハイマー病の処置において有益な役割を果たすことができる。したがって、本明細書で記載されるアルツハイマー病処置の機能性は、ミクログリア活性化を測定するための知られている方法を使用して評価することができる(例えばHiguchi, 2009, Current Alzheimer Research 6:137-143を参照されたい)。そのような方法は、コントロール対象と比較した、処置対象のミクログリア活性化のレベルを決定するために、ＰＥＴ画像処理を含む、上記に記載されるものなどの画像処理技術を利用する。
５．４ 処置の方法
安全で機能的な抗体を使用する、アルツハイマー病を含むがこれに限定されない、アミロイドーシスの安全で機能的な処置のための方法が本明細書で提供される。ある実施態様において、方法は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼが免疫エフェクター細胞において中等度レベルで活性化されるように、用量および／または投与レジメンを使用する、アミロイドタンパク質および／または凝集体などのその病理学的形態に特異的に結合する非ＩｇＧ１抗体の投与を含む。この部において使用される、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化に関する「中等度レベル」という用語は、同じ結合特異性を有するが、ＩｇＧ１抗体の定常領域を有する抗体の非存在下においてよりも高度となるが、その抗体の存在下においてよりも低度となるレベルを意味する。ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化のレベルは、５．１章において記載されるように決定することができる。
ある実施態様において、アミロイドタンパク質および／または凝集体などのその病理学的形態に特異的に結合する非ＩｇＧ１抗体は、ミクログリア細胞などの免疫エフェクター細胞の中へのアミロイドベータタンパク質などの標的抗原の最大の内部移行および中等度レベルのｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化をもたらす用量および／または投与レジメンを使用して投与される。ある実施態様において、抗体は、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼが中等度レベルで活性化されるように、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の変調成分と組み合わせて投与される。
ある実施態様において、本明細書の方法により使用されることとなる非ＩｇＧ１抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域を有する抗体である。ある実施態様において、非ＩｇＧ１抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ２ドメインと共にＩｇＧ抗体の定常領域を有する。ある実施態様において、ヒトβアミロイドに特異的に結合する、知られている非ヒト化抗体のＣＤＲ（下記の表２を参照されたい）は、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域と組み合わされ、抗体のＣＤＲの間のフレームワーク領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などのヒトＩｇＧ抗体のフレームワーク領域と置換される。ある実施態様において、知られているヒト化抗βアミロイド抗体、例えばバピネオズマブまたはソラネズマブの可変領域は、ヒトＩｇＧ４抗体の定常領域と組み合わされる。
ミクログリアの中へのβアミロイド内部移行およびｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化は、当業者に知られている任意の技術を使用して測定することができる。ある実施態様において、アルツハイマー病を含むが、これに限定されないアミロイドーシスの処置において使用されることとなる本発明の安全で機能的な抗体の投薬量は、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系を使用して決定される。特に、投薬量は、ミクログリアの中へのβアミロイドの内部移行が最大となるように調節されるが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗βアミロイド抗体の存在下において活性化されるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ未満であるが、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％活性化される。
ある実施態様において、アルツハイマー病を含むが、これに限定されないアミロイドーシスの処置において使用されることとなる本発明の安全で機能的な抗体の投与プログラムは、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系を使用して決定される。特に、投薬量は、ミクログリアの中へのβアミロイドの内部移行が最大となるように調節されるが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、ＩｇＧ１アイソタイプ抗βアミロイド抗体の存在下において活性化されるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ未満であるが、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％活性化される。
ある実施態様において、本発明の安全で機能的な抗体の投薬量は、ミクログリアの中へのβアミロイドの内部移行が最大となるように調節されるが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化レベルを超えて、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％活性化される。
ある実施態様において、アルツハイマー病を含むが、これに限定されないアミロイドーシスの処置において使用されることとなる本発明の安全で機能的な抗体の投与レジメは、５．１章において記載される細胞ベースのアッセイ系を使用して決定される。特に、投薬量は、ミクログリアの中へのβアミロイドの内部移行が最大となるように調節されるが、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化は、抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化レベルを超えて、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％活性化される。
特定の実施態様において、アミロイドーシスは、アルツハイマー病であり、アミロイドタンパク質は、β−アミロイドであり、免疫エフェクター細胞は、ミクログリア細胞である。方法および組成物は、特にアルツハイマー病についてより詳細に記載されるが、これらの方法および組成物は、例えば軽度認知機能障害（ＭＣＩ）などの認知記憶能力の消失によって特徴付けられる疾患または状態を含むアルツハイマー病（ＡＤ）、レビー小体型認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（オランダ型）などの神経疾患を含むが、これらに限定されない疾患などの続発性アミロイドーシスおよび加齢性アミロイドーシス；グアムパーキンソン認知症；ならびに進行性核上性麻痺、多発性硬化症などのアミロイド様タンパク質に基づくまたはそれに関連する他の疾患；クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病、ＨＩＶ関連認知症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）、封入体筋炎（ＩＢＭ）、成人発症型糖尿病、内分泌腫瘍、および老人性心アミロイドーシス；ならびにβ−アミロイド沈着による黄斑変性症、ドルーゼン関連性の視神経症、および白内障を含む様々な眼疾患を含むが、これらに限定されないアミロイドーシスの処置および予防に一般的に適用可能である。特定の実施態様において、アミロイドーシスは、アルツハイマー病であり、患者は、ヒト患者である。
ある実施態様において、アルツハイマー病は、本明細書で提供される安全で機能的な抗体ならびにアルツハイマー病の処置に現在使用されている、１つまたは複数の次の薬物、タクリン（ＣＯＧＮＥＸ、Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、ドネペジル（ＡＲＩＣＥＰＴ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）、リバスチグミン（ＥＸＥＬＯＮ、Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ）、ガランタミン（ＲＥＭＩＮＹＬ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、およびメマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）などの組み合わせを使用して処置される。
５．５ 医薬調製物および投与
本明細書で（５．２章）提供される安全で機能的な抗体は、生理学的に許容できる製剤中で調製することができ、知られている技術を使用して、薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／または賦形剤を含んでいてもよい。例えば、本明細書で記載される安全で機能的な抗体は、治療用組成物を形成するために、薬学的に許容できる担体、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わされる。好適な医薬担体、希釈剤、および／または賦形剤は、当技術分野において周知であり、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などを含む。
本明細書で提供される医薬組成物の製剤は、当業者に知られている標準の方法論に従って達成することができる。
本明細書で提供される医薬組成物は、好適で、薬学的に機能的な用量で、固体、液体、またはエアロゾルの形態で対象に投与してもよい。固体組成物の例は、丸剤、クリーム剤、および植え込み型の投薬ユニットを含む。丸剤は、経口で投与してもよい。治療用クリーム剤は、局所的に投与してもよい。植え込み型の投薬ユニットは、局部的に、例えば腫瘍部位に投与してもよい、または治療用組成物の規則正しい放出のために、例えば皮下に植え込まれてもよい。液体組成物の例は、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内注射に適した製剤ならびに局所的および眼内投与のための製剤を含む。エアロゾル製剤の例は、肺への投与のための吸入器製剤を含む。
組成物は、投与の標準のルートによって投与してもよい。一般に、組成物は、局所的、経口、直腸、経鼻、皮内、腹腔内、非経口（例えば静脈内、皮下、または筋肉内）ルートによって投与してもよい。さらに、組成物は、生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスの中に組み込まれてもよく、ポリマーは、送達が望まれる付近に、例えば腫瘍の部位に植え込まれる。方法は、単一用量の投与、所定の時間間隔での反復用量の投与、および所定の期間の間の持続投与を含む。
本明細書で使用される徐放性マトリックスは、酵素もしくは酸／塩基加水分解によってまたは溶解によって分解できる物質、通常ポリマーから作製されるマトリックスである。一度、体内に挿入されたら、マトリックスは、酵素および体液が作用する。徐放性マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリラクチド酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドコグリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、ならびにシリコーンなどの生体適合性物質によって望ましいように選ばれる。本発明の目的に一般に用いられる生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチドコグリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）のうちのいずれか１つのマトリックスを含むが、これらに限定されない。
組成物の投薬量が、例えば処置されている状態、使用される特定の組成物、ならびに患者の体重、サイズ、性別、および健康状態などの他の臨床的因子、体表面積、投与されることとなる特定の化合物または組成物、同時に投与されている他の薬物、ならびに投与のルートなどの様々な因子に依存するであろうということは、当業者に周知である。
組成物は、生物活性物質または化合物、特に、本発明による抗体と一緒に、酸化ストレスに対する化合物、抗アポトーシス化合物、金属キレート剤、ピレンゼピンおよび代謝産物などのＤＮＡ修復の阻害剤、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（３ＡＰＳ）、１，３−プロパンジスルフォネート（１，３ＰＤＳ）、α−セクレターゼ活性剤、β−およびγ−セクレターゼ阻害剤、タウタンパク質、神経伝達物質、β−シートブレーカー、βアミロイド除去／減少細胞構成要素のための誘引物質、ピログルタミン酸化アミロイドベータ３〜４２を含むＮ末端切断型βアミロイドの阻害剤、抗炎症分子、例えばクロザピン、ジプラシドン、リスペリドン、アリピプラゾール、もしくはオランザピンなどの「非定型抗精神病薬」、またはタクリン、リバスチグミン、ドネペジル、および／もしくはガランタミンなどのコリンエステラーゼ阻害剤（ＣｈＥＩ）、任意のアミロイドまたはタウ修飾剤を含むＭ１アゴニストおよび他の薬物、例えばビタミンＢ１２、システイン、アセチルコリンの前駆体、レシチン、コリン、イチョウ、アセチル−Ｌ−カルニチン、イデベノン、プロペントフィリン、またはキサンチン誘導体などの栄養補助剤、ならびに任意選択で、薬学的に許容できる担体および／または希釈剤および／または賦形剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む他の組成物ならびに疾患の処置のための手順と組み合わせて投与してもよい。
投与は、一般的に、非経口的、例えば静脈内となる。非経口投与のための調製物は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水性溶媒は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルを含むが、これらに限定されない。水性溶媒は、生理食塩水および緩衝媒質を含む水、アルコール／水溶液、エマルション、または懸濁液からなる群から選ばれてもよい。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、および塩化ナトリウム、乳酸リンガー、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、体液および栄養補液、電解質補液（リンガーデキストロースに基づくものなど）、および他を含む。例えば抗菌薬、酸化防止剤、キレート化剤、不活性ガスなどの保存剤もまた、存在してもよい。
医薬組成物は、例えば、特にヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性の担体をさらに含んでいてもよい。さらなる生理活性物質は、その意図される使用に依存して本発明の医薬組成物中に存在してもよい。
結合標的が脳中に位置する場合、本発明のある実施態様は、血液脳関門を横断するための抗体またはその活性断片を提供する。ある神経変性疾患は、血液脳関門の透過性の増加に関連し、その結果、抗体またはその活性断片を脳に容易に導入することができる。血液脳関門が無傷のままである場合、物理的方法、脂質ベースの方法、ならびに受容体およびチャネルベースの方法を含むが、これらに限定されないいくつかの当技術分野において知られているアプローチは、それを介して分子を輸送するために存在する。
血液脳関門を介して抗体またはその活性断片を輸送するための物理的方法は、完全に血液脳関門を回避することまたは血液脳関門中に開口部を作り出すことによるものを含むが、これらに限定されない。回避方法は、脳の中への直接的な注射(例えばPapanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)を参照されたい)および脳中に送達デバイスを植え込むこと(例えばGill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003);およびGliadel Wafers(商標), Guildford Pharmaceuticalを参照されたい)を含むが、これらに限定されない。関門中に開口部を作り出すための方法は、超音波(例えば米国特許公開第２００２／００３８０８６号を参照されたい)、浸透圧(例えば高張マンニトールの投与によって(Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)))、例えばブラジキニンまたは透過剤（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）Ａ−７による透過処理（例えば米国特許第５，１１２，５９６号、第５，２６８，１６４号、第５，５０６，２０６号、および第５，６８６，４１６号を参照されたい）、ならびに抗体または抗原結合断片をコードする遺伝子を含むベクターによる、血液脳関門にまたがるニューロンのトランスフェクション（例えば米国特許公開第２００３／００８３２９９号を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
血液脳関門を介して抗体またはその活性断片を輸送するための脂質ベースの方法は、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合断片につながれているリポソーム中に抗体もしくはその活性断片をカプセル化すること（例えば米国特許出願公開第２００２００２５３１３号を参照されたい）および低密度リポタンパク質粒子（例えば米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号を参照されたい）またはアポリポタンパク質Ｅ（例えば米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号を参照されたい）において抗体またはその活性断片をコーティングすることを含むが、これらに限定されない。
血液脳関門を介して抗体またはその活性断片を輸送するための受容体およびチャネルベースの方法は、血液脳関門の透過性を増加させるためにグルココルチコイド遮断薬を使用すること（例えば米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、第２００３／０１６２６９５号、および第２００５／０１２４５３３号を参照されたい）；カリウムチャネルを活性化すること（例えば米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照されたい）、ＡＢＣ薬物トランスポーターを阻害すること（例えば米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照されたい）；トランスフェリンにより抗体をコーティングすることおよび１つまたは複数のトランスフェリン受容体の活性を調整すること（例えば米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照されたい）、ならびに抗体をカチオン化すること（例えば米国特許第５，００４，６９７号を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。
当業者は、それ以上、その日常的な実験作業を使用しないで、本明細書で記載される、本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識するまたは確認することができるであろう。そのような等価物は、次の請求項によって包含されるように意図される。
あたかも個々の刊行物または特許もしくは特許出願がそれぞれ、すべての目的のためにその全体が参照によって援用されるように具体的にかつ個々に示されるのと同じ程度まで、本明細書で引用される参考文献はすべて、それらの全体がすべての目的のために参照によって本明細書で援用される。
本発明は、本明細書で記載される特定の実施態様によって範囲が限定されるものではない。実際、本明細書で記載されるものに加えての本発明の様々な改変形態は、先の記載および添付の図から当業者に明白になるであろう。そのような改変形態は、添付される請求項の範囲内にあることが意図される。
６． 実施例
６．１ 複数のＡβ立体構造に等しく結合するヒト化ＩｇＧ４抗体の同定
マウス抗Ａβモノクローナル抗体は、以前に記載されるように(Muhs et al., 2007)、リポソームワクチン製剤を使用してＡβペプチド抗原によりマウスを免疫することによって生成した。いくつかの基準は、複数のＡβ種に結合するためのおよび小さな細胞毒性ペプチド凝集体へのＡβ１−４２の集合を阻害するための能力を含めて、候補抗体を選択するために使用した。ＩｇＧ２ｂ主鎖（ｍＭＡＢＴ）を有するモノクローナルマウスｍＡｂは、アルツハイマー病の単一トランスジェニックマウス突然変異体ヒトＡＰＰおよび二重トランスジェニックマウス突然変異体ヒトＡＰＰ／ＰＳ１モデルの両方を使用するインビボにおける機能性研究のために選択した。ｍＭＡＢＴによる処置は、記憶を改善し、プラーク負荷を低減した（図７を参照されたい）。ｍＭＡＢＴは、さらに親和性成熟させ、ヒトＩｇＧ４主鎖上にヒト化した（結果として生じる抗体もまた「ＭＡＢＴ」と呼ばれる）。インビトロにおいてＡβへのＭＡＢＴの結合を試験するために、一連の異なるＡβ１−４２調製物を作製し、特徴付けた。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単離された単量体およびオリゴマーＡβ１−４２画分、成熟Ａβ１−４２繊維から、サイズが二量体および三量体からより高分子量の多量体にまで及ぶ、非常に神経毒性のＡβ１−４２オリゴマー集合体のより複雑な混合物にまで及んだ（図８を参照されたい）。異なるＡβ１−４２ペプチド調製物へのＭＡＢＴの結合は、ＥＬＩＳＡによって測定し、ｍＡＢＴに類似して、異なるＡβ１−４２集合体状態の間で非常に類似していることが示された（図１Ａ〜Ｃ）。
ＭＡＢＴは、続いて、ヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を発現するトランスジェニックマウスの脳中のＡβプラークへのおよびヒトＡＤ脳切片中のアミロイドプラークへの結合について試験した。ｈＡＰＰトランスジェニックマウス（図１Ｄ上）およびＡＤ脳（図１Ｄ下）の両方におけるアミロイドプラークは、ＭＡＢＴモノクローナル抗体により免疫装飾した（ｉｍｍｕｎｏｄｅｃｏｒａｔｅ）。まとめると、これらのデータは、ＡＤ脳中に存在する可溶性神経毒性ＡβオリゴマーおよびＡβ集合体の両方へのＭＡＢＴ結合の強力な証拠を提供する。
６．２ 病理学的Ａβ集合の阻害およびあらかじめ形成されたプロトフィブリルＡβ１−４２ペプチドの脱凝集
インビトロにおけるデータは、抗Ａβ抗体が、Ａβと結合した場合、病理学的高次Ａβ集合体の形成を予防し、あらかじめ形成されたＡβ凝集体を反転させることができることを実証した(Legleiter et al., 2004; Solomon et al., 1997)。ＭＡＢＴモノクローナル抗体の結合エピトープは、Ａβ１−４２のアミノ酸１４〜２３にマッピングされ、それゆえ、自己会合、後のオリゴマー化、およびＡβ１−４２ β−シート集合の中心に関与する、Ａβ１−４２の主な疎水性カチオンセグメントと重複する(Pike et al., 1993; Esler et al., 1996; Haass and Selkoe, 2007)。インビトロにおけるＡβ１−４２凝集に対するＭＡＢＴの効果は、アミロイド集合を妨げないが、β−シートが豊富な小さなアミロイド凝集体への結合に際して蛍光を発する染料であるチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を使用して試験された（Levine, III, 1993）。Ａβ１−４２のＮ末端に対して向けられる（したがって、自己集合ドメインを形成する中心のアミノ酸と重複しない）コントロール抗Ａβモノクローナル抗体と比較した場合、ＭＡＢＴは、Ａβ１−４２凝集に対する強力な阻害効果（図１Ｅ 左パネル）およびあらかじめ凝集していたＡβ１−４２ペプチドの消失（図１Ｅ 右パネル）を実証した。ＡβのＮ末端に対して向けられるコントロールモノクローナル抗体は、両方のアッセイ法において、抗中央ドメインＭＡＢＴモノクローナル抗体と比較して、約半分の阻害活性を有した。ＭＡＢＴを抗Ｃ末端抗Ａβモノクローナル抗体と比較した場合、同様の結果が得られた（示さず）。これらのインビトロにおけるアッセイ法は、ＴｈＴが、Ａｂｅｔａ１−４２ペプチドの広範囲のβ−シートに結合する能力に基づく（Ｌｅｖｉｎｅ， ＩＩＩ， １９９３）。それゆえ、これが、β−シートが豊富なＡβ１−４２へのＴｈＴ結合の、考えられるモノクローナル抗体媒介性の置換による人為的結果ではなかったことを確証するために、ＴｈＴ蛍光ではなく、固定された非標識Ａβ１−４２上に凝集するまたは自己集合する標識Ａβ１−４２の能力に依存するアッセイ法を実行した。類似の結果が、このアッセイ法において得られた、すなわち、ＭＡＢＴは、用量依存的な方式でＡβ１−４２の自己集合を予防した（図１Ｆ）。これらのデータは、ＭＡＢＴなど、Ａβの中央ドメインに対して向けられる抗体が、このアッセイ法において、Ａβの他のドメインを標的にする抗体と比べて、Ａβ１−４２原線維伸長および／または凝集に対して最も強い阻害効果もたらすことを実証する。
可溶性Ａβ１−４２オリゴマーが、可溶性および膜結合型の両方の他のタンパク質に結合する能力は、その毒性の一因となることが示された(Strittmatter et al., 1993; Liu et al., 2009)。Ａβ１−４２とのＡｐｏＥ４の相互作用部位には、アミノ酸１８〜２８を必要とする(Strittmatter et al., 1993)。組換えヒトＡｐｏＥ４へのＡβ１−４２の結合に対するＭＡＢＴの効果を、インビトロにおいて試験し、Ａβ１−４２のＮまたはＣ末端に特異的なモノクローナル抗体と比較した。飽和濃度のＡｐｏＥ４およびＡβ１−４２を使用した条件下で、ＭＡＢＴは、８０％を超える、Ａβ１−４２およびＡｐｏＥ４の相互作用を阻害し、試験した他のモノクローナル抗体のいずれよりも大きかった（図９を参照されたい）。要約すると、これらのデータは、ＭＡＢＴが、毒性の生物活性集合体状態へのＡβ１−４２のさらなるオリゴマー化を予防し、既に凝集しているまたはプラーク結合Ａβ１−４２を消失させることを示す。さらに、中心に位置する結合エピトープにより、ＭＡＢＴは、ＡｐｏＥなどの他のタンパク質へのＡβペプチドの相互作用について競合し、したがって、自己会合を含む、Ａβの中央のドメインにおけるアミノ酸を必要とするＡβとの相互作用を遮断することができる。
６．３ インビトロにおけるＡβ１−４２オリゴマーの神経毒性効果のＭＡＢＴ媒介性の中和
ＭＡＢＴモノクローナル抗体についての治療上の機能性を示す生化学的なおよびインビボにおける機能性データにより、初代細胞培養モデルにおけるＭＡＢＴモノクローナル抗体の効果を、細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーを使用して試験した。Ｐ１ラットからの初代皮質培養物を増殖させ、遊離Ａβ１−４２オリゴマーまたはＭＡＢＴと複合体を形成したオリゴマーにより処置した。非特異的ＩｇＧモノクローナル抗体は、すべての実験においてコントロールとして使用した。２４時間にわたる２．５または５μＭ Ａβ１−４２オリゴマーによる皮質培養物の処置は、細胞生存度の指標である、ＭＴＴのミトコンドリア酸化によって測定される代謝回転の減少をもたらした（図２Ａ）。毒性からの完全なレスキューは、ＭＡＢＴの存在下において５μＭまでのＡβ１−４２オリゴマー濃度について観察された（１：７．５のＭＡＢＴ対Ａβ１−４２オリゴマーのモル比）。これらの結果を確認するために、ＡＴＰ放出を、ルミネセンスアッセイ法を使用して測定し、これもまた、ＭＡＢＴの同様の細胞保護的な効果を示した（図２Ｂ）。Ａβ１−４２媒介性のニューロンの細胞死に対するＭＡＢＴの効果をさらに評価するために、マウス胎児皮質ニューロンを培養で６日間維持し、４日間、ＭＡＢＴありまたはなしでＡβ１−４２により処置した。コントロール培養物は、健康な形態を示した（図２Ｃ、左端のパネル）。４日間のＡβ１−４２による処置は、軸索変性をもたらし、軸索の総数の減少を引き起こした（図２Ｃ、中央のパネル）。Ａβ１−４２およびＭＡＢＴの組み合わせにより処置した細胞は、コントロール細胞に類似しているように見えた（図２Ｃ、右端のパネル）。これらの結果は、抗ＡβＭＡＢＴモノクローナル抗体が、生存度の急性のＡβ１−４２オリゴマー媒介性の損失からのラット皮質培養物およびＡβ１−４２誘発変性からの胎児マウス皮質ニューロンの両方を保護することができたことを実証する。
６．４ 細胞膜とのＡβ１−４２オリゴマーの相互作用は、抗ＡβＭＡＢＴ ｍＡｂによって阻害される
Ａβペプチド、特に凝集中間体（Bateman et al., 2007）は、細胞膜中に存在する様々な脂質およびタンパク質に関連することが知られている。ＭＡＢＴが、ニューロンへのＡβ１−４２オリゴマーの結合を低減するまたはさらに遮断することによってその神経保護効果を及ぼし得るかどうかを試験した。膜結合型Ａβについての蛍光免疫染色を実行した。Ａβ１−４２オリゴマーを、３０分間または１８時間、混合皮質培養物に適用し、この後に、培養物は、Ａβについておよびニューロン特異的クラスＩＩＩβ−チューブリンに対する抗体、ＴｕＪ１により染色した。Ａβ１−４２オリゴマーによる皮質ニューロンの処置は、ニューロンとの、特に神経炎のプロセスとのＡβの強力な関連をもたらした（図３Ａ、中央のパネルおよび挿入図）。ＭＡＢＴとの同時処置は、ニューロンとのＡβ１−４２オリゴマーの相互作用、特に神経突起への結合を遮断した。この効果は、早くも３０分で即座に明白となり（図３Ａおよび３Ｂ）、処置の少なくとも１８時間、存続した（図３Ｂ）。Ｎ末端抗ＡβｍＡｂ（クローン６Ｅ１０）を、Ａβ１−４２オリゴマーについて染色するために発明者らのアッセイ法において使用し（図３Ａ）、ＭＡＢＴおよび染色のために使用した検出モノクローナル抗体の間の干渉についての可能性を低減したが、これらの結果は、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８蛍光標識Ａβ１−４２を使用して確認した。この直接標識したＡβ１−４２ペプチドによる皮質培養物の処置は、ＭＡＢＴが、初代皮質培養物において、神経突起へのＡβ１−４２の結合を低減したという結論をさらに支持した（図３Ｃおよび３Ｄ）。
ニューロン内のＡβ１ ４２の蓄積は、著しく、ニューロンの機能障害の一因となることが示された(Casas et al., 2004; Wirths et al., 2001; Cleary et al., 2005; Oddo et al., 2003)。Ａβ１−４２の細胞内蓄積は、ＥＬＩＳＡアッセイ法を使用してトリプシン処理細胞において決定した。この解析は、ＭＡＢＴがＡβ１−４２オリゴマーの内部移行を６０％を超えて低減することを実証した（図３Ｅ）。予想外に、蛍光免疫研究からの観察もまた、ＭＡＢＴの存在下において、神経突起から離れて、ミクログリアに似ていた細胞プロファイルに向かう、Ａβ１−４２オリゴマーの関連における変化があったことを示した（図３Ｆ）。
６．５ Ａβ１−４２オリゴマーのミクログリアの取り込み
ＭＡＢＴ／Ａβ１−４２複合体形成およびＡβ１−４２のミクログリアの取り込みとの間の関係を調査した。ＭＡＢＴと複合体を形成したＡβ１−４２オリゴマーがミクログリアによって取り込まれることを確証するために、処置した混合ニューロン培養物に対する共焦点画像処理を実行した。Ａβ１−４２オリゴマーにより単独で処置した細胞と比較した場合、ＭＡＢＴが、ミクログリアである可能性が高い細胞プロファイルの中へのＡβ１−４２オリゴマーの急速な取り込みを媒介したことが分かった（図４Ａ）。これは、早くも処置の３０分後に即座に明白となった。ミクログリアは、ＡＰＰマウスにおいて損なわれている機能であるＡβの取り込みおよび分解において重大な役割を果たす（Hickman et al., 2008）。抗Ａβ免疫療法と比べて、Ａβプラークが除去される１つの可能性のあるメカニズムが、Ａβに結合する抗ＡβのＦｃγＲ結合特性を通してのものであることが提唱された。（Koenigsknecht-Talboo et al., 2008）。しかしながら、ミクログリアによる抗Ａβ／Ａβ複合体の取り込みおよびＦｃγＲ活性化は、これらの細胞が活性化されるようになるのを引き起こし得る。
ニューロンに対するＡβ１−４２オリゴマーの直接的な細胞毒性の克服に加えて、治療用抗Ａβ抗体は、理想的には、そのような炎症誘発性の応答が結果としてもたらす負の効果における著しい減少と共に、著しく低減された炎症誘発性の応答を有するであろう。それゆえ、ＭＡＢＴは、同じ抗原結合配列を持つが、多様なＦｃγＲ結合親和性を有する異なるＩｇＧ主鎖を含み、それゆえ、異なるミクログリア活性化潜在能力を含む抗体と比較した。これらは、十分なＦｃγＲ結合能力を有するヒトＩｇＧ１野生型（ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１）およびＦｃγＲ結合を劇的に低減するＤ２６５Ａ突然変異を持つヒトＩｇＧ１主鎖（ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ）（Shields et al., 2001）を含んだ。試験した主鎖変異体はすべて、表面プラズモン共鳴を使用して確証されるように、Ａβ１−４２に同様の親和性で結合した。
続いて、これらの異なるモノクローナル抗体主鎖がミクログリアの中にＡβ１−４２オリゴマーを内部移行する能力は、Ａβ１−４２オリゴマー処置初代皮質ミクログリアに対して共焦点画像処理を使用して比較した。Ａβ１−４２オリゴマー内部移行が、ＦｃγＲ結合とかなり関係したことが分かり、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１＞ＭＡＢＴ＞ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａであった（図４Ｂおよび４Ｃ）。ミクログリアが、実際、モノクローナル抗体と複合体を形成したＡβ１−４２を取り込む細胞であることを確証するために、研究は、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８タグつきＡβ１−４２を使用して繰り返し、ミクログリアマーカーＩｂａ１について同時染色した。ＭＡＢＴまたはＭＡＢＴ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体への結合に際して、タグつきＡβ１−４２は、Ｉｂａ１＋ミクログリア中で豊富になった（図４Ｄ）。ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体と組み合わせてＡβ１−４２により処置した細胞培養物において、ミクログリアは、より多くの凝縮した核およびより明るいＩｂａ１染色の特徴を有し、より大きな抗原／抗体媒介性のミクログリア活性化を示唆した。ＦｃγＲ結合差異を確証するために、低親和性ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８への異なる架橋ＩｇＧ ｍＡｂの結合を測定し、結合の階層を同定し、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ＞ＭＡＢＴ＞ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａであった（図４Ｅ）。ＦｃγＲファミリーの他のメンバーへの結合は、図１０に示す。
異なるＩｇＧモノクローナル抗体主鎖は、混合初代皮質培養物において、Ａβ１ ４２オリゴマー媒介性毒性を反転させるそれらの能力について試験した。ＭＡＢＴおよびＭＡＢＴ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体の両方について存在する機能的なＦｃγＲ結合活性は、Ａβ１−４２オリゴマー媒介性毒性の完全な反転に必要とされた（図４Ｆ）。ＦｃγＲ結合機能性を欠くＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａモノクローナル抗体は、Ａβ１−４２オリゴマー媒介性細胞性毒性の反転に対して有意でない傾向のみを示した。驚くべきことに、ＩｇＧ４ ＭＡＢＴモノクローナル抗体と比較して、より大きなＦｃγＲ結合親和性を有するＭＡＢＴ−ＩｇＧ１野生型モノクローナル抗体は、ＭＡＢＴと比較した場合、より小さな保護効果の傾向があった。したがって、ミクログリアＦｃγＲへの結合が十分なレスキューに必要とされるが、ＭＡＢＴと比較したＦｃγＲへのＭＡＢＴ−ＩｇＧ１主鎖の結合の増強は、望まれないミクログリア活性化をもたらし得、これは、結果的に、Ａβ１−４２オリゴマー媒介性神経毒性に対する全体的な保護の低減になり得る。
６．６ ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１野生型主鎖は、炎症促進性ミクログリア応答につながる
その活性化状態が抗Ａβモノクローナル抗体によって改変される、Ａβ１−４２オリゴマー誘発毒性の下流メディエーターを同定するための試みにおいて、いくつかの候補シグナル経路を検査した。神経毒性およびミクログリア活性化の一因となることにおけるｐ３８ＭＡＰＫの役割は、広く立証されている（Li et al., 2004; Wang et al., 2004）。ｐ３８ＭＡＰＫ活性化は、Ａβ１−４２オリゴマー単独でまたは抗ＡβＭＡＢＴ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、もしくはＡβ１−４２オリゴマーに結合しないコントロールＩｇＧ１と組み合わせて、処置した初代混合皮質培養物において検査した。細胞をＡβ１−４２オリゴマーにより処置した場合、ｐ３８ＭＡＰＫは、１５分以内に活性化され（示さず）、３０分で最大に到達した。異なるモノクローナル抗体との組み合わせに際して、ＩｇＧ１野生型主鎖を持ち、ＦｃγＲに対する最も大きな結合親和性を有するＭＡＢＴ−ＩｇＧ１のみが、ホスホｐ３８ＭＡＰＫ特異的ＥＬＩＳＡによってさらに示されるように、Ａβ１−４２オリゴマー誘発ｐ３８ＭＡＰＫ活性を増加させた（図５Ａ）。様々な抗Ａβ抗体が、Ａβ１−４２に対する同様の親和性により結合するので、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体は、ＭＡＢＴと同じ程度まで毒性Ａβ１−４２オリゴマーを中和するはずである。しかしながら、ＩｇＧ１主鎖のより大きなＦｃγＲ結合親和性は、ニューロンなどのＡβ１−４２オリゴマーの作用に対して非常に感受性の細胞に対して有害になり得るミクログリア活性化をもたらし得る。Ａβ１−４２オリゴマーと複合体を形成したＭＡＢＴモノクローナル抗体は、Ａβ１−４２オリゴマー誘発ｐ３８ＭＡＰＫ活性を低減せず、むしろ、より高度な活性に対する傾向を示し、この抗体による部分的なＦｃγＲ活性化を反映した。
これらの最初のアッセイ法がニューロンおよびグリア細胞の両方を含む混合皮質培養物において総ｐ３８ＭＡＰＫ活性を測定したように、検出されたｐ３８ＭＡＰＫ活性が、細胞をＡβ１−４２オリゴマーおよびＭＡＢＴの組み合わせにより処置した場合、ミクログリアに対して特異的であったかどうかについての疑問について試験した。細胞は先のように処置したが、今回、ホスホｐ３８ＭＡＰＫ活性は、ミクログリアマーカーＩｂａ１と共に蛍光免疫染色によって検査した。ＭＡＢＴまたはＭＡＢＴ−ＩｇＧ１モノクローナル抗体と複合体を形成したＡβ１−４２オリゴマーによる処置に際して、ホスホｐ３８ＭＡＰＫについてポジティブに染色される細胞のおよそ９３％は、Ｉｂａ１＋であった（図５Ｂ）。ミクログリアにおいてｐ３８ＭＡＰＫの活性化を確認するために、精製したミクログリアを、同じ方法で処置した。これらの条件下で、ミクログリアにおけるＡβ１−４２／ＩｇＧ複合体媒介性のｐ３８ＭＡＰＫ活性化は、即座に同定された（図５Ｃ）。
Ａβ１−４２オリゴマー媒介性神経毒性に対するｐ３８ＭＡＰＫ活性化の寄与を検討するために、細胞を、第二世代のｐ３８ＭＡＰＫ特異的阻害剤により、続いて、Ａβ１−４２オリゴマー単独でまたはＭＡＢＴもしくは低ＦｃγＲ結合ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａモノクローナル抗体と組み合わせて処置した。予想外に、ＭＴＴシグナルにおけるＭＡＢＴ媒介性の増加は、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤の存在下において、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａのものまで低減し、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害に際してＭＡＢＴ媒介性のレスキュー機能における減少を示した（図５Ｄ）。ｐ３８ＭＡＰＫ阻害は、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａモノクローナル抗体と複合体を形成したＡβ１−４２オリゴマーにより処置した細胞に対して効果を有しなかった。これらの結果は、ＭＡＢＴモノクローナル抗体が、Ａβ１−４２オリゴマー単独で見られるものを超えてｐ３８ＭＡＰＫレベルを著しく誘導しないが、ｐ３８ＭＡＰＫ活性化は、ＭＡＢＴ媒介性の神経保護において役割を果たすことを実証する。理論によって拘束されないが、混合培養物系におけるこの活性の細胞標的は、ミクログリア細胞である。
ミクログリア活性の増加を、より直接、下流の炎症促進性の読み取りに連結するために、ミクログリアが豊富な初代細胞培養物によるＴＮＦα放出を測定した（＞６１％ Ｉｂａ１＋、示さず）。豊富なミクログリアによる炎症促進性ＴＮＦαの放出は、Ａβ１−４２オリゴマーにより処置した場合、試験したすべての抗Ａβモノクローナル抗体の存在下において低減された（図６）。しかしながら、最も大きな効果は、ＭＡＢＴの存在下において観察された。したがって、抗Ａβ ＩｇＧ４モノクローナル抗体は、抗Ａβ ＩｇＧ１モノクローナル抗体と比較して、より望ましいプロファイルを有し、ミクログリアによる神経保護効果およびＡβ貪食を促進する能力を、限られたミクログリア活性化と組み合わせることができる。
６．７ 材料および方法
６．７．１ 細胞培養調製物
ラット初代皮質培養物は、Ｍｅｂｅｒｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（Meberg and Miller, 2003）によって記載されるように、出生後１日目にＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から調製した。小脳および髄膜を摘出し、皮質は、切断して、小さな部分にし、溶解バッファーにおいて３７℃で酵素分解により分離した（パパイン、ＣａＣｌ２、ＥＤＴＡ、およびＨＥＰＥＳ；すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから）。ＤＮアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加して１０分間おいた。溶解後に、分散した皮質ニューロンは、ポリＬ−リシン（０．０１％；モル重量１５０，０００〜３００，０００；Ｓｉｇｍａ）コーティング６ウェル、２４ウェル、または９６ウェル組織培養プレート上で平板培養した。免疫細胞化学については、細胞は、２４ウェルプレート中、コーティングガラスカバーガラス上で増殖させた。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２で、加湿インキュベーターにおいて、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）、Ｂ２７補助剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加したフェノールレッドなしのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。培養の１時間３０分後に、培地は、アストロサイト条件培地と置換した。培養のさらに４日後に、細胞増殖は、２．５μＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のシトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）による処置によって遮断した。これらの培養条件下で、細胞の２０％は、ＮｅｕＮ／ＤＡＰＩ染色によってニューロンとして同定された（示さず）。その他に述べられない限り、混合皮質培養物を使用する実験は、インビトロでの培養日数（「ＤＩＶ」）６で一般的に実行した。皮質および海馬から調製された豊富なミクログリアは、上記の皮質培養物について記載されるように採取した。皮質および海馬は、高度なグルコースを含むＤＭＥＭ中に置き、１０ｍＬピペットによる、続いて注射器によるピペット操作によってホモジナイズした。ホモジネートは、１，０００ｘｇで３分間、遠心分離し、続いて、１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含む、高度なグルコースを含む、あらかじめ温められたＤＭＥＭ（ミクログリア培地）中で再懸濁した。細胞懸濁液は、次に、Ｔ７５組織培養フラスコに移し、１週間、３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいて維持した。フラスコは、付着細胞からミクログリアを分離するために振盪させ、収集し、ＤＭＥＭ中で洗浄した。結果として生じる細胞は、１ｍＬミクログリア培地中で再懸濁し、数え、５×１０４細胞／ウェルで平板培養した。ミクログリア濃縮度を確証するために、細胞は、アストログリアマーカーおよびミクログリアマーカーＧＦＡＰおよびＩｂａ１によりそれぞれ染色した。６０％を超える細胞は、Ｉｂａ１についてポジティブに染色され、ＧＦＡＰおよびＩｂａ１の両方について染色される細胞はなかった。純粋なミクログリアは、出生後３日目に、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から調製した。皮質および海馬を解剖し、１０ｍＬピペットを使用し、続いて１８ゲージ針により、高度なグルコースを含むＤＭＥＭ中で粉砕した。ホモジネートは、１，０００ｇで３分間、遠心分離し、続いて、高度なグルコース、１０％ＦＢＳ、およびペニシリン／ストレプトマイシンを含む、あらかじめ温められたＤＭＥＭ（ミクログリア培地）中で再懸濁した。細胞懸濁液は、次に、Ｔ７５組織培養フラスコに移し、７〜１０日間、３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーターにおいて維持した。ミクログリアは、振盪によって単離し、収集し、ＤＭＥＭ中で洗浄した。結果として生じる細胞は、１ｍＬミクログリア培地中で再懸濁し、数え、実験で使用するために５×１０４細胞／ウェルで組織培養処置ガラスチャンバースライド上で平板培養した。
６．７．２ 抗Ａβ抗体の生成
ＩｇＧ４抗Ａβモノクローナル抗体ＭＡＢＴは、以前に記載されるように（Muhs et al., 2007）調製したワクチンによりマウスを免疫することによって生成されたマウスＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体（ｍＭＡＢＴ）のヒト化形態である。
６．７．３ ＦｃγＲ結合
ヒトＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）のパネルへの試験抗体の結合は、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ヒトＦｃγＲ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．、ＣＡ）は、Ｃ末端にＧｌｙ／６×Ｈｉｓ／グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ポリペプチドタグを有する受容体γ鎖の細胞外ドメインを含む融合タンパク質である。ヒトＩｇＧ１フレームワークを有するモノクローナル抗体は、この実験においてポジティブコントロール（ＩｇＧ１コントロール）として使用した。プレートは、４℃で、一晩、０．０５Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）中でマウスモノクローナル抗ＧＳＴ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）によりコーティングした。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．５％ＢＳＡ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むアッセイバッファーによる遮断後に、プレートは、１時間、室温で、ＦｃγＲと共にインキュベートした。ヒトＦｃγＲは、抗ＧＳＴコーティングとの相互作用によってプレートに固定した。抗ＡβＭＡＢＴ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、またはＩｇＧ１コントロールモノクローナル抗体の階段希釈は、ＰＢＳ中１０％Ｂｌｏｃｋｅｒ Ｃａｓｅｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を含むアッセイバッファー中で調製した。希釈したサンプルは、高親和性受容体（ＦｃγＲＩａ）について単量体形態または低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａ）について多量体形態として適用した。試験抗体の多量体形態は、およそ３：１のモル比で、試験モノクローナル抗体とヤギ抗ヒトκ鎖（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）のＦ（ａｂ’）２断片を架橋することによって生成した。プレートは、２時間、室温で、ＦｃγＲと共にインキュベートした。プレートは、各インキュベーションステップ後にＰＢＳおよび０．０５％ ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄バッファーにより３回洗浄した。ＦｃγＲに結合した抗体は、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片により検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）は、基質としての役割を果たした。プレートは、発色現像を可能にするために１５〜約２０分間、室温でインキュベートした。反応は、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４により終わらせ、６５０ｎｍでの参照と共に４５０ｎｍでの吸収度を、プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）上で測定した。結合曲線は、それぞれのサンプル吸収度に対して、二通りのサンプル希釈溶液からの平均吸光度をプロットすることによって生成した。
６．７．４ インビボにおける機能性研究
２つの研究を、インビボにおける機能性評価のために実行した。記憶想起を測定するために、群当たり１２匹の突然変異体ヒトＡＰＰマウスは、ＭＡＢＴモノクローナル抗体またはビヒクルコントロール（ＰＢＳ）の２回のｉ．ｐ．注射を受けた。第２の注射の１日後に、記憶想起は、記載されるように（Dewachter et al., 2002）、新規な物体認識タスク（ＯＲＴ）を使用して研究した。認識インデックス（ＲＩ）は、海馬を要する非空間記憶の尺度である、新規なおよび３時間前に観察した物体の両方を探索するのに費やされた時間に対する新規な物体を探索するのに費やされた時間の比として定義した。個別の研究において、二重トランスジェニックアミロイドプラークポジティブ突然変異体ヒトＡＰＰ／ＰＳ１マウスは、皮質プラーク負荷に対するモノクローナル抗体投与の効果を測定するために使用した。マウスは、１６週間にわたって５００μｇ ＭＡＢＴモノクローナル抗体を毎週、ｉ．ｐ．注射し、その後、皮質プラーク負荷を測定した。脳を解剖し、右大脳半球は、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド中で一晩、液浸固定し、矢状ｖｉｂｒａｔｏｍｅ切片（４０μｍ）を、遊離浮遊インキュベーション（ｆｒｅｅ ｆｌｏａｔｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）のために切断し、染色まで０．１％アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ中で４℃で保存した。異なるレベルの５つの切片を、チオフラビンＳにより高密度プラークについて染色した。切片は、染色および盲検法による定量化のために無作為化した。画像は、Ｓｏｎｙ ＤＸＣ−９１００Ｐカメラを装備したＬｅｉｃａ ＤＭＲ顕微鏡により得、Ｌｅｉｃａ Ｑ−Ｗｉｎソフトウェアを使用してコンピューターにより分析した。顕微鏡についての光強度およびコンデンサー設定は、画像取得プロセスの全体にわたって一定に維持した。海馬台の領域は、チオフラビンＳ染色においてアミロイド負荷の自動定量化のために選択した。
６．７．５ 毒性Ａβ１−４２オリゴマーの調製
Ａβ１−４２ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）は、ＨＦＩＰ中で溶解し、超音波処理し、室温で一晩、振盪させた。続いて、一定分量を、アルゴンのフロー下で乾燥させ、真空乾燥させ、使用まで単量体Ａβ１−４２ペプチドフィルムとして−８０℃で保存した。ペプチドフィルムの１６５μｇ一定分量を、７μＬ ＤＭＳＯ、８５μＬ ＰＢＳ、および９μＬの２％ＳＤＳ中に再懸濁し、３７℃で６時間、インキュベートした。続いて、３００μＬの水を添加し、３７℃での一晩のインキュベーション後に、Ａβ１−４２オリゴマーは、４℃で１時間、９００μＬの３３％メタノール ４％酢酸水溶液により沈殿させ、１０分間、１６，２００ｇで遠心分離した。上清を除去し、Ａβ１−４２オリゴマーは、１μｇ／μＬの最終濃度に向けてＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＣｌ溶液中に再懸濁する前に乾燥させた。
６．７．６ Ａβ１−４２細胞毒性アッセイ法
Ａβ１−４２オリゴマーの細胞毒性を、ＤＩＶ ５で混合皮質培養物に対して試験した。１００μｇ／ｍＬの最終濃度の抗体はすべて、細胞の処置前に、３７℃で、無血清細胞培養培地中で３０分間、Ａβ１−４２オリゴマーと共に共インキュベートした。いくつかの実験については、混合皮質培養物は、Ａβ１−４２オリゴマーによる処置前に、強力な第二世代のｐ３８阻害剤である、１μＭ ＳＢ２３９０６３により１時間、あらかじめ処置した。細胞生存度を評価するために、標準化された３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイ法（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を、メーカーの指示に従って実行した。様々な処置に応じる細胞生存度を評価するために、標準化された３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元アッセイ法（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を実行した。手短に言えば、処置の最後の３時間、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）において増殖させた細胞は、ＭＴＴ染料溶液と共にインキュベートし、青色ホルマザン産物の生成は、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して５７０および６９０ｎｍで吸収度を読み取ることによって測定した。結果は、Ａβ１−４２オリゴマー処置細胞に対する生存の増加パーセンテージとして提示する。ＭＡＢＴモノクローナル抗体がＡβ１−４２オリゴマー誘発の変性からニューロンを保護する能力はまた、蛍光免疫を使用するインビトロにおけるアッセイ法においても評価した。胎児の１７．５日目マウス皮質ニューロンは、単離し、分離し、Ｂ２７補助剤ありのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地においてインビトロにおいて培養した。Ａβ１−４２は、Ａβ１−４２単量体ペプチドフィルムについて上記に記載されるように調製し、その後、１０μＬのＤＭＳＯを、ペプチドを溶解するために添加した。続いて、７８．６μＬのＨａｍ’ｓ−Ｆ１２培地を添加し、２５μＭのＡβ１−４２ペプチド溶液を、細胞処置前に４８時間、４℃でインキュベートした。細胞は、全体で９日間、増殖させ、３日目および処置の日に栄養を与えた。処置については、５０μｇ／ｍＬのＭＡＢＴありまたはなしの２μＭのＡβ１−４２を、５日目または６日目に添加し、同じ体積のＤＭＳＯ−Ｆ１２のみは、ビヒクルコントロールとして使用した。９日目に、処置の３日または４日後に、ニューロンを固定し、抗βチューブリン抗体であるＴｕＪ１により染色した。ＦＩＴＣ標識二次抗体は、蛍光顕微鏡法を使用して微小管を視覚化するために使用した。
６．７．７ 免疫組織化学
ＡＤ患者および年齢が一致した非ＡＤコントロール（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｃｌｙｄｅｂａｎｋ、ＵＫ）からのパラフィン封入側頭葉脳切片（２０μｍ）は、免疫組織化学染色のために使用した。脱パラフィン切片は、ギ酸を使用する抗原回復にかけ、続いて、初代抗体として５０μｇ／ｍＬ ＭＡＢＴにより標識した。ヤギ抗ヒトビオチン化ＩｇＧは、二次抗体として使用した。染色は、ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）により行い、封入は、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤を使用して行った。画像は、ＺｅｉｓｓからのＬＳＭ ７００倒立顕微鏡上で得た。
６．７．８ Ａβ１−４２ ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡによって細胞内Ａβ１−４２蓄積を測定するために、初代皮質培養物は、６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で処置し、その後、それらは、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジン酸トリナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなり、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファー中での溶解前に洗浄し、トリプシン処理した（Bateman et al., 2007）。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ）によって決定した。高感度Ａβ１−４２特異的ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．、Ｚｕｒｉｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、メーカーの指示に従って、細胞溶解産物Ａβ１−４２を測定するために使用した。
６．７．９ 免疫細胞化学および共焦点画像処理
細胞は、ガラス製のカバーガラス上で増殖させた。処置後に、細胞は、ＰＢＳにより直ちに洗浄し、続いて、２０分間、４％パラホルムアルデヒドにより固定した。徹底的な洗浄後に、細胞は、−２０℃で１０分間、１００％メタノール中に浸した。続いて、それらは、再び洗浄し、室温で１時間、１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳである遮断溶液中でインキュベートした。一次抗体による一晩のインキュベーション後に、細胞は、２時間洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、続いて洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇゴールド褪色防止剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、スライドガラス上にマウントした。落射蛍光および共焦点画像は、６３×レンズを使用して、ＺｅｉｓｓからのＬＳＭ ７００倒立顕微鏡上で得た。蛍光強度は、飽和した落射蛍光像によって描かれた細胞体において測定した。Ｚ−ｓｔａｃｋは、ＩｍａｇｅＪ １．４２（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、フリーウェア）を使用して、三次元画像にし、これから、標識タンパク質を含む先端から末端の薄片を得た。ＨｙＬｉｔｅ Ｆｌｕｏｒ−４８８タグつきＡβ１−４２により処置した細胞は、一次または二次抗体をＡβ１−４２を標識するために使用しなかった以外は、同じ方法で処置した。
６．７．１０ ホスホｐ３８ ＥＬＩＳＡ
ラット皮質培養物は、ポリＬ−リシンコーティング６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）上に接種し、ＤＩＶ ５で使用した。他に示されない限り、細胞は、３０分間、１００μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ありまたはなしで、２μＭ Ａβ１−４２オリゴマーにより処置した。いくつかのアッセイ法において、細胞は、第二世代のｐ３８阻害剤ＳＢ２３９０６３により１時間あらかじめ処置した。アニソマイシンは、ポジティブコントロールとして使用した。処置は、細胞を氷上に配置し、培地を吸引することによって停止させた。細胞は、冷ＰＢＳにより洗浄し、細胞スクレーパーを使用して採取し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭオルトバナジン酸トリナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなり、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファー中で溶解した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）によって決定した。ｐ３８ＭＡＰＫ活性化の半定量的尺度については、ラットホスホｐ３８ＭＡＰＫ比色分析ＥＬＩＳＡキットをメーカーの指示に従って使用した（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）。プレートは、３７０ｎｍで、分光光度マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）上で読み取った。いくつかの実験については、ホスホｐ３８は、免疫細胞化学を使用してアッセイした。
６．７．１１ ＴＮＦα放出
ミクログリアが豊富なラット皮質培養物（総ＤＡＰＩ＋細胞のうち＞６０％Ｉｂａ１＋）は、６時間および２４時間、１００μｇ／ｍＬ抗体ありまたはなしで１０μＭ Ａβ１−４２オリゴマーにより処置した。１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）は、ポジティブコントロール刺激として使用した。細胞上清は、示す時点で取り出し、０．２μｍフィルターを通過させ、メーカーの指示に従って、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅラットＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ１Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＴＮＦαについて試験した。
さらに、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰ Ｐ３の子からの純粋なミクログリア培養物は、２４時間、１μｇ／ｍｌ ＬＰＳにより、１０μＭ Ａβ１−４２オリゴマー単独でもしくは１００μｇ／ｍｌ抗ＡβＭＡＢＴ、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１、ＭＡＢＴ−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、コントロールＩｇＧ１と組み合わせてまたは抗体単独で処置した。細胞上清は、採取し、０．２μｍフィルターを通過させ、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘマウス２３−ｐｌｅｘアッセイ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を実行した。
６．７．１２ 統計解析
統計解析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン５（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して行った。データは、示されるように、平均値±標準偏差（ＳＤ）または平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示する。データは、適宜、スチューデントのｔ検定、Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ多重比較が後続する一元配置ＡＮＯＶＡ、またはウィルコクソン順位和ノンパラメトリック検定法によって分析した。＜０．０５のＰ値は、統計的有意差を示すために得た。
６．７．１３ アミロイドプラークのインビボにおける画像処理
頭蓋窓（ｃｒａｎｉａｌ ｗｉｎｄｏｗ）は、最初の画像処理セッション２週間前に、以前に記載されるように（Ｔｒａｃｈｔｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ ２００２、Ｈｏｌｔｍａａｔ ｅｔ ａｌ ２００９）、１０月齢ＡＰＰ ｈＡＰＰ（Ｖ７１７Ｉ）／ＰＳ１マウスの体性感覚皮質上に植え込んだ。各画像処理セッションの２４時間前に、動物に、個々のアミロイドプラークを視覚化するために１０ｍｇ／ｋｇメトキシ−Ｘ０４ Ｉ．Ｐ．を注射し（Ｋｌｕｎｋ ｅｔ ａｌ ２００２）、画像処理の直前に、血管を視覚化するために、ＡｎｇｉｏＳｅｎｓｅ６８０（ＶｉｓＥｎ Ｍｅｄｉｃａｌ）によりＩ．Ｖ．注射した。各画像処理セッションについて、動物は、イソフルラン−酸素混合物により麻酔をかけ、ヘッドポスト（ｈｅａｄ ｐｏｓｔ）を使用して顕微鏡にマウントした。画像は、４０×ＮＡ ０．８対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）の後焦点面に約３０ｍＷを送る８２０ｎｍに合わせたＴｉ：サファイアレーザー（ＭａｉＴａｉ ＤｅｅｐＳｅｅ；Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ）を使用して、二光子レーザー走査顕微鏡（Ｕｌｔｉｍａ ｉｎ ｖｉｖｏ；Ｐｒａｉｒｉｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって収集した。血管系のパターンは、日々、再現性よく、対物レンズに関するマウスの位置を決めるために使用し、個々のアミロイドプラークを数週間にわたって画像化するのを可能にした。個々のプラークの体積は、所与のプラークのまわりに描かれた興味のある領域内のバックグラウンドを超えるピクセルの数の合計によって推定した。バックグラウンドは、アミロイドプラーク付近に描かれた興味のある領域内の平均ピクセル強度および２つの標準偏差として定義される。第４および第８の画像処理セッション後に、動物は、６０ｍｇ／ｋｇ ＭＡＢＴによりＩ．Ｐ．投薬した。
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Claims (17)

  1. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の安全性を試験する方法であって、
    ａ．細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーおよび非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体と共にミクログリア細胞をインキュベートすることと、
    ｂ．ミクログリア細胞中におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を測定することと、
    ｃ．非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体がミクログリア細胞中において中等度レベルのｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を誘発する場合に該非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体を安全であると同定することと
    を含み、ここでｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化の中等度レベルが、細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマー存在下、該非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の非存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化のレベルより高いが、細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーおよびβアミロイドに特異的に結合するＩｇＧ１抗体の存在下におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化のレベルより低いレベルであり、該ＩｇＧ１抗体がヒトＩｇＧ１定常領域を含むものである、方法。
  2. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の存在または非存在下において、ミクログリア細胞による細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーの取り込みを測定することにより、非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の神経保護活性を試験するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の存在下におけるミクログリア細胞による細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーの取り込みが、非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の非存在下におけるミクログリア細胞による細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーの取り込みと比較して増加することが、該非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が神経保護活性を有することを示す、請求項２に記載の方法。
  4. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体がβアミロイド沈着に関連するアミロイドーシスの治療に対して安全且つ機能的である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  5. アミロイドーシスがアルツハイマー病である、請求項４に記載の方法。
  6. ミクログリア細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化の中等度レベルが、細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーの存在下であるが非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体の非存在下におけるミクログリア細胞におけるｐ３８ ＭＡＰキナーゼ活性化を、５％〜１５％；１０％〜２０％；１５％〜２５％；２０％〜３０％；３５％〜４５％；４０％〜５０％；または４５％〜５５％超える場合に、該非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が安全であると示される、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
  7. ｄ．初代混合皮質細胞培養物を得る工程と、
    ｅ．細胞毒性Ａβ１−４２オリゴマーおよび非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体と共に細胞培養物をインキュベートする工程と、
    ｆ．ニューロンの生存率を測定する工程と
    を更に含む、請求項２または３に記載の方法。
  8. ニューロンの生存率が、ＭＴＴのミトコンドリア酸化によって決定される代謝回転によって測定される、請求項７に記載の方法。
  9. ニューロンの生存率が、ＡＴＰ放出によって測定される、請求項７に記載の方法。
  10. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が、
    ａ．配列番号４のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲ１；配列番号５のアミノ酸配列、ＲＶＳＮＲＦＳのアミノ酸配列、またはＫＶＳＳＲＦＳのアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲ２；および／または配列番号６のアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ ＣＤＲ３；および／または
    ｂ．配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲ１；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲ２；および／または配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ ＣＤＲ３
    を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  11. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  12. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  13. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  14. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体が、ＩｇＧ４抗体のエフェクター領域を有している、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  15. ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体がヒトＩｇＧ１アイソタイプを有することを除いて、該ＩｇＧ１抗体が非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体と同一である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  16. 非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体がヒトＩｇＧ４アイソタイプを有し、ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体がヒトＩｇＧ１アイソタイプを有することを除いて、該ＩｇＧ１抗体が非ＩｇＧ１抗βアミロイド抗体と同一である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
  17. ＩｇＧ１抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
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