JP2018530998A6 - ライブラリー正規化のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
本開示は、核酸ライブラリー、たとえばシーケンシングライブラリーを正規化するための方法、組成物、およびキットを提供する。本発明により、複数の核酸分子から高存在種を除去する方法が提供される。本発明により、正規化核酸ライブラリーの生成方法が提供される。いくつかの実施形態では、本願に開示される方法、組成物およびキットは、ライブラリー正規化におけるssDNAおよびdsDNA画分の物理的および酵素的分離の使用を回避することができる。
Description
関連出願
本出願は、2015年9月11日出願の米国仮特許出願第62/217,220号明細書に基づき、その米国特許法第119条(e)の利益を主張する。関連出願の内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年9月11日出願の米国仮特許出願第62/217,220号明細書に基づき、その米国特許法第119条(e)の利益を主張する。関連出願の内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
多くの用途、特にシーケンシングおよびライブラリーのスクリーニングでは、研究者はサンプルまたはライブラリー内の核酸カタログ全体を評価したいと考える。しかしながら、サンプル(たとえば、cDNAライブラリー)中の核酸は、しばしば、数桁に及ぶ広範な濃度範囲にある。これは、サンプルを完全に評価するのに必要なシーケンシングまたはスクリーニングの量を大幅に増加させる。これを克服するために、研究者はしばしば、新しい分子を調べるのに要する余分な労力が少なくなるよう、異なる核酸の濃度がすべて同様の濃度である正規化ライブラリーで作業したいと考える。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、少なくとも1つの高存在種を含む第1の複数の核酸分子とハイブリダイズさせること、複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、結合部分を含む、第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を生成すること、第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および1つ以上の固体担体上に固定された、結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、第1の複数の核酸分子に対する再アニールされた相補鎖を除去して第2の複数の核酸分子を生成すること、を含み、第2の複数の核酸分子における少なくとも1つの高存在種の含有量が、第1の複数の核酸分子における少なくとも1つの高存在種の含有量と比較して減少する、複数の核酸分子から高存在種を除去する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。いくつかの実施形態では、結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、捕捉分子はストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、方法は、第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖の少なくとも1つにつき第2の鎖を合成して、第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、1つ以上の複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成は、複数の第2のオリゴヌクレオチドを第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは複数の第2のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第1の複数の核酸分子は、複数の高存在種を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種は、第1の複数の核酸分子の少なくとも50%に相当する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種は、第1の複数の核酸分子の少なくとも60%に相当する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種は、第1の複数の核酸分子の少なくとも70%に相当する。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種の含有量の減少は、少なくとも80%である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種の含有量の減少は、少なくとも90%である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種の含有量の減少は、少なくとも95%である。いくつかの実施形態では、少なくとも1つの高存在種の含有量の減少は、少なくとも99%である。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子は、複数の高存在種を含む。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の高存在種は、第2の複数の核酸分子の50%未満に相当する。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の高存在種は、第2の複数の核酸分子の40%未満に相当する。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の高存在種は、第2の複数の核酸分子の30%未満に相当する。いくつかの実施形態では、第1の複数の核酸分子は、複数の低存在種を含む。いくつかの実施形態では、複数の低存在種は、第1の複数の核酸分子の10%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の低存在種は、第1の複数の核酸分子の5%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の低存在種は、第1の複数の核酸分子の1%未満に相当する。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子は、複数の低存在種を含む。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の低存在種は、第2の複数の核酸分子の少なくとも5%に相当する。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の低存在種は、第2の複数の核酸分子の少なくとも10%に相当する。いくつかの実施形態では、第2の複数の核酸分子中の複数の低存在種は、第2の複数の核酸分子の少なくとも20%に相当する。いくつかの実施形態では、第1の複数の核酸分子のそれぞれまたは第2の複数の核酸分子のそれぞれは、確率バーコードを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第2の複数の核酸分子をシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の高存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの50%未満である。いくつかの実施形態では、複数の高存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの40%未満である。いくつかの実施形態では、複数の高存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの30%未満である。いくつかの実施形態では、複数の低存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも5%である。いくつかの実施形態では、複数の低存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも10%である。いくつかの実施形態では、複数の低存在種のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも20%である。いくつかの実施形態では、方法は、部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のブロッカーは、第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のブロッカーは、第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列とのハイブリダイゼーションを妨げる。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、結合部分を含む、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および1つ以上の固体担体上に固定された、結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、複数の標的核酸に対する再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、正規化核酸ライブラリーを生成する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基を含む。いくつかの実施形態では、結合部分はビオチンである。いくつかの実施形態では、捕捉分子はストレプトアビジンである。いくつかの実施形態では、方法は、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖の1つ以上につき第2の鎖を合成して、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を含む、1つ以上の複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、合成は、複数の第2のオリゴヌクレオチドを複数の標的核酸の複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む。いくつかの実施形態では、複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは複数の第2のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、複数の低存在標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸は、複数の標的核酸の10%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸は、複数の標的核酸の5%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸は、複数の標的核酸の1%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーは、複数の低存在標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の少なくとも5%に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の少なくとも10%に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の少なくとも20%に相当する。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、複数の高存在標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸は、複数の標的核酸の少なくとも50%に相当する。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸は、複数の標的核酸の少なくとも60%に相当する。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸は、複数の標的核酸の少なくとも70%に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在種の含有量は、少なくとも80%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在種の含有量は、少なくとも90%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在種の含有量は、少なくとも95%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在種の含有量は、少なくとも99%減少する。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーは、複数の高存在標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の50%未満に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の40%未満に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の複数の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリー中の複数の標的核酸の30%未満に相当する。いくつかの実施形態では、複数の第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれまたは複数の第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、確率バーコードを含む。いくつかの実施形態では、方法は、正規化核酸ライブラリーをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの50%未満である。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの40%未満である。いくつかの実施形態では、複数の高存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの30%未満である。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも5%である。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも10%である。いくつかの実施形態では、複数の低存在標的核酸のシーケンシングリードは、全シーケンシングリードの少なくとも20%である。いくつかの実施形態では、方法は、部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数のブロッカーは、第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、複数のブロッカーは、第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸はmRNAを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸はミトコンドリアmRNAを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸はリボソームタンパク質mRNAを含む。いくつかの実施形態では、低存在標的核酸は、転写物の数が最も少ない7,000個の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、低存在標的核酸は、転写物の数が最も少ない4,000個の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、低存在標的核酸は、転写物の数が最も少ない2,000個の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、複数の第1のオリゴヌクレオチドは、標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、複数の第1のオリゴヌクレオチドは、非標的特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、cDNAを含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、ゲノムDNAを含む。いくつかの実施形態では、高存在標的核酸は、短いタンデム反復配列を含む。いくつかの実施形態では、高存在標的核酸は、テロメア配列を含む。いくつかの実施形態では、高存在標的核酸は、セントロメア配列を含む。いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、単一細胞由来である。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、非正規化核酸ライブラリーにおいて結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、結合部分を含む、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および複数の標的核酸に対する再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、正規化核酸ライブラリーを生成する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、非正規化核酸ライブラリーは、1つ以上の高存在標的核酸および1つ以上の低存在標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの少なくとも50%に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの少なくとも60%に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの少なくとも70%に相当する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の1つ以上の高存在標的核酸の含有量は、少なくとも80%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の1つ以上の高存在標的核酸の含有量は、少なくとも90%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の1つ以上の高存在標的核酸の含有量は、少なくとも95%減少する。いくつかの実施形態では、正規化核酸ライブラリー中の1つ以上の高存在標的核酸の含有量は、少なくとも99%減少する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの10%未満に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの5%未満に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、非正規化核酸ライブラリーの1%未満に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの少なくとも5%に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの少なくとも10%に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の低存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの少なくとも20%に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの50%未満に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの40%未満に相当する。いくつかの実施形態では、1つ以上の高存在標的核酸は、正規化核酸ライブラリーの30%未満に相当する。いくつかの実施形態では、非正規化核酸ライブラリーはcDNAライブラリーである。いくつかの実施形態では、非正規化核酸ライブラリーはゲノムライブラリーである。いくつかの実施形態では、非標準化核酸ライブラリーは、単一細胞核酸ライブラリーである。
一態様では、本開示は、cDNAライブラリーの二本鎖cDNAの一方の鎖が結合部分を含む、非対称標識二本鎖cDNAライブラリーを生成すること、ライブラリー中の二本鎖cDNAの鎖を変性および部分的に再アニールして、それにより結合部分を含む再アニールされたcDNA分子、結合部分を含む一本鎖分子、および結合部分を欠く一本鎖分子の混合物を生成すること、ならびに、結合部分を含む分子を除去し、前期結合部分を欠く一本鎖分子を残して、正規化ライブラリーを作製すること、を含む核酸ライブラリーの正規化方法を提供する。いくつかの実施形態では、生成は、結合部分を含むプライマーを用いてmRNAを第1のcDNA鎖に逆転写することを含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、確率バーコードを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第1のcDNA鎖に相補的な第2のcDNA鎖を生成して、それにより二本鎖cDNAを生成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成は、結合部分を含むプライマーを用いてDNA分子上でプライマー伸長を実施し、それにより二本鎖cDNAを生成することを含む。いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、結合部分は、二本鎖cDNAのセンス鎖に結合される。いくつかの実施形態では、結合部分は、二本鎖cDNAのアンチセンス鎖に結合される。いくつかの実施形態では、変性は、二本鎖cDNAを加熱することを含む。いくつかの実施形態では、変性は、二本鎖cDNAの少なくとも50%を変性させることを含む。いくつかの実施形態では、変性は、二本鎖cDNAの少なくとも90%を変性させることを含む。いくつかの実施形態では、再アニールされたcDNAは、非常に高存在の核酸種に由来する。いくつかの実施形態では、再アニールされたcDNAの鎖は、より低存在の核酸種由来の二本鎖cDNAライブラリーの鎖の少なくとも2倍の速さで再アニールする。いくつかの実施形態では、再アニールされたcDNAの鎖は、より低存在の核酸種由来の二本鎖cDNAライブラリーの鎖の少なくとも5倍の速さで再アニールする。いくつかの実施形態では、再アニールされたcDNAの鎖は、より低存在の核酸種由来の二本鎖cDNAライブラリーの鎖よりも高い存在量で再アニールする。いくつかの実施形態では、除去は、分子を固体担体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、固体担体は、結合部分に結合する捕捉部分を含む。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、固体担体はビーズである。いくつかの実施形態では、固体担体は磁性である。いくつかの実施形態では、再アニールされたcDNAは二本鎖である。いくつかの実施形態では、結合部分を欠く一本鎖分子は、除去において除去された一本鎖の相補体である。いくつかの実施形態では、方法は、正規化ライブラリーを増幅することをさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅は、正規化ライブラリー中の一本鎖核酸から二本鎖核酸を生成することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、アダプターを二本鎖核酸に付加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、アダプターの付加は、アダプターを二本鎖核酸に結合することを含む。いくつかの実施形態では、アダプターの付加は、アダプターを増幅により二本鎖核酸に導入することを含む。いくつかの実施形態では、アダプターはシーケンシングフローセル配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、二本鎖核酸をシーケンシングすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、正規化ライブラリー中で最も高存在の種は、正規化ライブラリー中の最も低存在の種と比べ、多くとも20倍存在量が高い。いくつかの実施形態では、正規化ライブラリー中で最も高存在の種は、正規化ライブラリー中の最も低存在の種と比べ、多くとも10倍存在量が高い。いくつかの実施形態では、正規化ライブラリー中で最も高存在の種は、正規化ライブラリー中の最も低存在の種と比べ、多くとも5倍存在量が高い。
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に特定的に示される。本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるであろう。
本明細書で言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、それぞれ参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同程度に、全ての目的のために参照により組み込まれる。
大多数のライブラリー正規化戦略は、2つの原理のうちの1つに基づいている。第1の原理は、ライブラリーを、供給源生物由来のゲノムDNAなどの、配列が一様に表される別の核酸セットにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした画分を保持することである。他方の原理は、溶液ハイブリダイゼーションの濃度依存性に依存する。一組のdsDNA分子が変性すると、それらは元の濃度の二乗に比例した速度で再ハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物およびキットは、混合物を変性させ、部分的に再アニールすることのみを可能にすることによって、ライブラリー正規化にこの特性を利用する。比例的に、高濃度種の多くはdsDNAに再ハイブリダイズし、存在量のより低い種は主に一本鎖のままとなる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物およびキットは、ライブラリー正規化におけるssDNAおよびdsDNA画分の物理的および酵素的分離の使用を回避することができる。最初のライブラリーの調製中、ライブラリーは、結合部分を有する一方の末端で非対称に標識される(たとえば、1つの5’ビオチン化プライマーおよび他の非標識プライマーを用いたPCRによって)。変性および部分的な再アニーリングの後、標識された鎖のすべてを常磁性ストレプトアビジンビーズなどの支持マトリックス上に捕捉し、結合および非結合画分を分離する。高存在の配列は、主に再ハイブリダイズされ、両方の鎖は結合画分中に除去される。しかしながら、低存在の配列は、再ハイブリダイズしにくいため、標識された鎖の相補体は非結合画分に存在する。非結合画分は、正規化ライブラリーに相当し、直接使用されうるか、または下流への適用のためにさらに増幅されうる。
定義
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語はすべて、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、とくに文脈上明確に規定されていない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」には、複数の参照語が包含される。本明細書での「or(または)」の意味はいずれも、とくに明記されていない限り、「and/or(および/または)」を包含することが意図される。
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語はすべて、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、とくに文脈上明確に規定されていない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」には、複数の参照語が包含される。本明細書での「or(または)」の意味はいずれも、とくに明記されていない限り、「and/or(および/または)」を包含することが意図される。
本明細書で用いられる場合、「関連付けられる」または「〜に関連付けられる」という用語は、ある時点で2つ以上の種が共配置されているとして同定可能であることを意味しうる。関連付けは、2つ以上の種が類似の容器内にあることを意味しうる。関連付けは、インフォマティクス的関連付けでありうる。この場合、たとえば、2つ以上の種に関するディジタル情報が記憶され、かつその情報を用いてこれらの種の1つ以上が共配置されたことを決定可能である。関連付けはまた、物理的関連付けでありうる。いくつかの場合には、2つ以上の関連付けられる種は、互いにまたは共通の固体もしくは半固体の表面に「テザー連結」、「結合」、または「固定」される。関連付けは、ビーズなどの固体または半固体の支持体に標識を結合するための共有結合手段または非共有結合手段を意味しうる。関連付けは、標的と標識とのハイブリダイゼーションを含みうる。
本明細書で用いられる場合、「相補的」という用語は、2つのヌクレオチド間の精密なペアリングの能力を意味しうる。たとえば、核酸の所与の位置のヌクレオチドが他の核酸のヌクレオチドと水素結合可能である場合、2つの核酸はその位置で互いに相補的であるとみなされる。2つの一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する場合には「部分的」でありうるし、一本鎖分子間のすべてに相補性が存在する場合には完全でありうる。第1のヌクレオチド配列が第2のヌクレオチド配列に相補的である場合、第1のヌクレオチド配列は第2の配列の「相補体」であるといえる。第1のヌクレオチド配列が第2の配列の逆(すなわち、ヌクレオチドの順序が逆)の配列に相補的である場合、第1のヌクレオチド配列は第2の配列の「逆相補体」であるといえる。本明細書で用いられる場合、「相補体」、「相補的」、および「逆相補体」という用語は、同義的に用いることが可能である。ある分子が他の分子にハイブリダイズしうる場合、それはハイブリダイズしている分子の相補体でありうることが、本開示から理解される。
本明細書で用いられる場合、「ディジタルカウンティング」という用語は、サンプル中の標的分子の数を推定する方法を意味しうる。ディジタルカウンティングは、サンプル中の標的に関連付けられたユニーク標識の数を決定する工程を含みうる。この確率的方法は、分子をカウントする問題を、同一の分子の位置決定および同定の問題から、所定の標識のセットの検出に関する一連のあり/なしのディジタル問題に変換する。
本明細書で用いられる場合、「標識」という用語は、サンプル内の標的に関連付けられる核酸コードを意味しうる。標識は、たとえば、核酸標識でありうる。標識は、全体または一部が増幅可能な標識でありうる。標識は、全体または一部がシーケンス可能標識でありうる。標識は、個別に同定可能な天然核酸の一部でありうる。標識は、既知の配列でありうる。標識は、核酸配列の接合(たとえば、天然配列と非天然配列との接合)を含みうる。本明細書で用いられる場合、「標識」という用語は、「インデックス」、「タグ」、または「標識タグ」という用語と同義的に用いうる。標識は、情報を伝達可能である。たとえば、種々の実施形態では、標識は、サンプル同一性、サンプル源、細胞同一性、および/または標的を決定するために使用可能である。
本明細書で用いられる場合、「非枯渇リザーバー」という用語は、多種多様な標識から構成された確率バーコードのプールを意味しうる。非枯渇リザーバーは、非枯渇リザーバーが標的のプールに関連付けられる場合、各標的がユニーク確率バーコードに関連付けられる可能性が高くなるように、多数の異なる確率バーコードを含みうる。各標識標的分子のユニーク性は、ランダム選択の統計により決定可能であり、標識の多様性と比較してコレクション中の同一の標的分子のコピー数に依存する。得られる標識標的分子のセットのサイズは、バーコーディングプロセスの確率的性質により決定可能であり、次いで、検出された確率バーコードの数の解析は、元のコレクションまたはサンプル中に存在する標的分子の数の計算を可能にする。存在する標的分子のコピー数とユニーク確率バーコードの数との比が低い場合、標識標的分子はきわめてユニークである(すなわち、2つ以上の標的分子が1つの所与の標識で標識される確率は非常に低い)。
本明細書で用いられる場合、「核酸」とは一般的に、ポリヌクレオチド配列またはその断片を意味しうる。核酸はヌクレオチドを含みうる。核酸は細胞に対して外因性または内因性でありうる。核酸は細胞フリー環境中に存在しうる。核酸は遺伝子またはその断片でありうる。核酸はDNAでありうる。核酸はRNAでありうる。核酸は1つ以上のアナログ(たとえば、修飾された骨格、糖または核酸塩基)を含みうる。アナログのいくつかの例としては、限定されるものではないが、5−ブロモウラシル、ペプチド核酸、ゼノ核酸、モルホリノ体、ロックド核酸、グリコール核酸、トレオース核酸、ジデオキシヌクレオチド、コルジセピン、7−デアザ−GTP、フルオロフォア(たとえば、糖に結合されたローダミンまたはフルオレセイン)、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、蛍光塩基アナログ、CpGアイランド、メチル−7−グアノシン、メチル化ヌクレオチド、イノシン、チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、キューオシン、およびワイオシンが挙げられる。「核酸」、「ポリヌクレオチド、「標的ポリヌクレオチド」、および「標的核酸」は、同義的に用いうる。
核酸は、新しいまたは向上した特徴(たとえば、向上した安定性)を有する核酸を提供するために1つ以上の修飾(たとえば、塩基修飾、骨格修飾)を含みうる。核酸は核酸アフィニティータグを含みうる。ヌクレオシドは塩基−糖の組合せでありうる。ヌクレオシドの塩基部分はヘテロ環塩基でありうる。かかるヘテロ環塩基の2つの最も一般的なクラスはプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドでありうる。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドでは、リン酸基は、糖の2’、3’、または5’ヒドロキシル部分に結合可能である。核酸を形成する際、リン酸基は、隣接ヌクレオシドを互いに共有結合して線状高分子化合物を形成可能である。ひいては、この線状高分子化合物のそれぞれの末端をさらに連結して環状化合物を形成可能である。しかしながら、線状化合物が一般に好適である。そのほかに、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有しうるので、完全二本鎖または部分二本鎖の化合物を生成するようにフォールディングしうる。核酸内では、リン酸基は、通常、核酸のヌクレオシド間骨格を形成するものとして称されうる。核酸の結合または骨格は、3’→5’ホスホジエステル結合でありうる。
核酸は、修飾骨格および/または修飾ヌクレオシド間結合を含みうる。修飾骨格は、骨格中にリン原子を保持するものおよび骨格中にリン原子を有していないものを含みうる。リン原子を中に含有する好適な修飾核酸骨格は、たとえば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートや5’−アルキレンホスホネートなどのメチルや他のアルキルのホスホネート、キラルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホルアミデートやアミノアルキルホスホルアミデートなどのホスホルアミデート、ホスホロジアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、および通常3’−5’結合、2’−5’結合アナログを有するボラノホスフェート、ならびに1つ以上のヌクレオチド間結合が3’→3’、5’→5’、または2’→2’結合である逆極性を有するものを含みうる。
核酸は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または1つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環のヌクレオシド間結合により形成されるポリヌクレオチド骨格を含みうる。これらは、モルホリノ結合(ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される)、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合N、O、S、およびCH2構成部分を有する他のものを含みうる。
核酸は核酸ミメティックを含みうる。「ミメティック」という用語は、フラノース環のみまたはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方が非フラノース基で置き換えられているポリヌクレオチドを含むことを意図することがあり、フラノース環のみの置換えは、糖サロゲートであるとして称されうる。ヘテロ環塩基部分または修飾ヘテロ環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために保持可能である。かかる核酸の1つはペプチド核酸(PNA)でありうる。PNAでは、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格とくにアミノエチルグリシン骨格で置換え可能である。ヌクレオチドは保持可能であり、かつ骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。PNA化合物中の骨格は、PNAにアミド含有骨格を与える2つ以上の結合されたアミノエチルグリシン単位を含みうる。ヘテロ環塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合可能である。
核酸はモルホリノ骨格構造を含みうる。たとえば、核酸は、リボース環の代わりに6員モルホリノ環を含みうる。これらの実施形態のいくつかでは、ホスホロジアミデートまたは他の非ホスホジエステルのヌクレオシド間結合によりホスホジエステル結合を置換え可能である。
核酸は、モルホリノ環に結合されたヘテロ環塩基を有する結合されたモルホリノ単位(すなわちモルホリノ核酸)を含みうる。結合基は、モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を結合可能である。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質とのより少ない望ましくない相互作用を有しうる。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、核酸の非イオン性ミミックでありうる。モルホリノクラス内のさまざまな化合物は、異なる結合基を用いて連結可能である。ポリヌクレオチドミメティックのさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸(CeNA)として称されうる。核酸分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環で置換え可能である。CeNA DMT保護ホスホロアミダイトモノマーは、ホスホロアミダイト化学を用いたオリゴマー化合物合成のために調製および使用が可能である。核酸鎖中へのCeNAモノマーの取込みは、DNA/RNAハイブリッドの安定性を増加可能である。CeNAオリゴアデニレートは、天然複合体に類似した安定性を有する核酸相補体との複合体を形成可能である。さらなる修飾は、2’−ヒドロキシル基が糖環の4’炭素原子に結合されて2’−C,4’−C−オキシメチレン結合を形成することにより二環式糖部分を形成するロックド核酸(LNA)を含みうる。結合は、2’酸素原子と4’炭素原子とを架橋するメチレン(−CH2−),基(式中、nは1または2である)でありうる。LNAおよびLNAアナログは、相補的核酸との非常に高い二本鎖熱安定性(Tm=+3〜+10℃)、3’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、および良好な溶解性を示しうる。
核酸はまた、核酸塩基(単に「塩基」ということが多い)の修飾または置換を含みうる。本明細書で用いられる場合、「非修飾」または「天然」の核酸塩基は、プリン塩基(たとえば、アデニン(A)およびグアニン(G))ならびにピリミジン塩基(たとえば、チミン(T)、シトシン(C)、およびウラシル(U))を含みうる。修飾核酸塩基は、他の合成および天然の核酸塩基、たとえば、5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよび他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン、および2−チオシトシン、5−ハロウラシルおよびシトシン、5−プロピニル(−C=C−CH3)ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾウラシル、シトシン、およびチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、および他の8−置換アデニンおよびグアニン、5−ハロとくに5−ブロモ、5−トリフルオロメチルおよび他の5−置換ウラシルおよびシトシン、7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン、2−F−アデニン、2−アミノアデニン、8−アザグアニンおよび8−アザアデニン、7−デアザグアニンおよび7−デアザアデニン、ならびに3−デアザグアニンおよび3−デアアデニンを含みうる。修飾核酸塩基は、三環式ピリミジン、たとえば、フェノキサジンシチジン(1H−ピリミド(5,4−b)(1,4)ベンゾオキサジン−2(3H)−オン)、フェノチアジンシチジン(1H−ピリミド(5,4−b)(1,4)ベンゾチアジン−2(3H)−オン)、置換フェノキサジンシチジン(たとえば、9−(2−アミノエトキシ)−H−ピリミド(5,4−(b)(1,4)ベンゾオキサジン−2(3H)−オン)などのG−クランプ、カルバゾールシチジン(2H−ピリミド(4,5−b)インドール−2−オン)、ピリドインドールシチジン(Hピリド(3’,’:4,5)ピロロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン)を含みうる。
本明細書で用いられる場合、「準対称確率バーコード付き核酸」は、本開示の確率バーコード、および一緒にハイブリダイズしてパンハンドル構造(たとえば、サプレッションPCR用)を形成できる程度に対称であるが同一であるとは限らない末端、を含む分子を指しうる。準対称確率バーコード付き核酸は、対称核酸のように挙動しうるが、非対称配列を有する。
本明細書で用いられる場合、「サンプル」という用語は、標的を含む組成物を意味しうる。本開示の方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適なサンプルとしては、細胞、単一細胞、組織、器官、または生物が挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「サンプリングデバイス」または「デバイス」という用語は、サンプルのセクションの採取および/または基材上へのセクションの配置を行いうるデバイスを意味しうる。サンプルデバイスとは、たとえば、蛍光活性化細胞選別(FACS)機、セルソーター機、生検針、生検デバイス、組織切片化デバイス、マイクロ流体デバイス、ブレードグリッド、および/またはミクロトームを意味しうる。
本明細書で用いられる場合、「固体担体」という用語は、複数の確率バーコードを結合しうる離散した固体または半固体の表面を意味しうる。固体担体は、核酸を(たとえば共有結合または非共有結合で)固定しうるプラスチック、セラミック、金属、または高分子材料(たとえばヒドロゲル)で構成された任意のタイプの中実、多孔性、または中空のスフェア、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成体を包含しうる。固体担体は、球状(たとえばマイクロスフェア)でありうるかまたは非球状もしくは不規則形状、たとえば、立方体形、直方体形、角錐形、円柱形、円錐形、扁球形、ディスク形などを有しうる離散粒子を含みうる。アレイ状に離間して配置された複数の固体担体は、基材を含まないこともありうる。固体担体は、「ビーズ」という用語と同義的に用いうる。本明細書で用いられる場合、「固体担体」および「基材」は同義的に用いうる。
本明細書で用いられる場合、「確率バーコード」という用語は、本開示の標識を含むポリヌクレオチド配列を意味しうる。確率バーコードは、確率バーコーディングに使用可能なポリヌクレオチド配列でありうる。確率バーコードは、サンプル中の標的を定量可能である。確率バーコードは、標識を標的に関連付けた後に起こりうるエラーの制御に使用可能である。たとえば、確率バーコードは、増幅またはシーケンシングのエラーを評価可能である。標的に関連付けられた確率バーコードは、確率バーコード標的または確率バーコードタグ標的と呼ぶことが可能である。
本明細書で用いられる場合、「確率バーコーディング」という用語は、核酸のランダム標識化(たとえばバーコーディング)を意味しうる。確率バーコーディングは、標識を標的に関連付けて関連付けられた標識を定量するために再帰的ポアソンストラテジーを利用可能である。本明細書で用いられる場合、「確率バーコーディング」という用語は、「確率標識化」と同義的に用いうる。
本明細書で用いられる場合、「標的」という用語は、確率バーコードに関連付け可能な組成物を意味しうる。本開示の方法、デバイス、およびシステムによる分析に好適な例示的な標的としては、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、マイクロRNA、tRNAなどが挙げられる。標的は一本鎖または二本鎖でありうる。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質でありうる。いくつかの実施形態では、標的は脂質である。本明細書で用いられる場合、「標的」は、「種」と同義的に用いうる。
「逆転写酵素」という用語は、逆転写酵素活性を有する(すなわち、RNA鋳型からのDNAの合成を触媒する)酵素のグループを意味しうる。一般的には、かかる酵素としては、限定されるものではないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、細菌逆転写酵素、グループIIイントロン由来逆転写酵素、およびそれらの突然変異体、変異体、または誘導体が挙げられる。非レトロウイルス逆転写酵素としては、非LTRレトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、およびグループIIイントロン逆転写酵素が挙げられる。グループIIイントロン逆転写酵素の例としては、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)Ll.LtrBイントロン逆転写酵素、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)TeI4cイントロン逆転写酵素、またはジオバチルス・ステアロサーモフィラス(Geobacillus stearothermophilus)GsI−IICイントロン逆転写酵素が挙げられる。他のクラスの逆転写酵素としては、多くのクラスの非レトロウイルス逆転写酵素(すなわち、レトロン、グループIIイントロン、およびとくに多様性生成レトロエレメント)が挙げられうる。
高存在種を除去する方法
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、複数の核酸分子から高存在種を除去する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種の含有量を減少させることができる。本明細書で用いられる場合、「有意に除去する」とは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%またはそれ以上の低存在種または中存在種を複数の核酸分子から除去することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種および中存在種を除去することができる。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、複数の核酸分子から高存在種を除去する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種の含有量を減少させることができる。本明細書で用いられる場合、「有意に除去する」とは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%またはそれ以上の低存在種または中存在種を複数の核酸分子から除去することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種および中存在種を除去することができる。
本明細書で用いられる場合、「種」とは、互いに同一もしくは相補的であるか、互いにハイブリダイズすることができるか、同じ遺伝子座からの転写物であるか、または同じタンパク質もしくはその断片などをコードする、複数の核酸分子中のポリヌクレオチド(たとえば、一本鎖ポリヌクレオチド)を示す。いくつかの実施形態では、種のメンバーは、互いにまたはその相補体と、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%相同である。いくつかの実施形態では、種のメンバーは、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、種のメンバーは中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、種のメンバーは、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、種のメンバーは同じ遺伝子座に由来する転写物であり、転写物は同じまたは異なる長さでありうる。種は、いくつかの実施形態では、cDNAまたはmRNAである。
本明細書で用いられる場合、「高存在種」は、複数の核酸中に高い存在量で存在する種を示し、たとえば、種は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、またはそれ以上の複数の核酸分子に相当する。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1,000、またはそれ以上の高存在種でありうる。いくつかの実施形態では、全ての高存在種の合計は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、またはそれ以上の複数の核酸分子に相当する。いくつかの実施形態では、高存在種は、1つ以上のリボソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、高存在種は、1つ以上のミトコンドリアタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、高存在種は、1つ以上のハウスキーピングタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
本明細書で用いられる場合、「中存在種」は、複数の核酸の少なくとも1つの種よりも低く、複数の核酸の少なくとも1つの他の種よりも高い存在量で複数の核酸中に存在する種を示す。いくつかの実施形態では、中存在種は、約10%、5%、4%、3%、2%、1%、0.1%、0.01%、または上記の値のうち任意の2つの間の範囲の、複数の核酸分子に相当しうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1,000、またはそれ以上の中存在種でありうる。いくつかの実施形態では、全ての中存在種の合計は、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約10%、約20%、約30%、または上記の値のうち任意の2つの間の範囲の、複数の核酸分子に相当する。
本明細書で用いられる場合、「低存在種」は、複数の核酸中に低い存在量で存在する種を示し、たとえば、種は、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%未満、またはそれ以下の、複数の核酸分子に相当する。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1,000、またはそれ以上の低存在種でありうる。いくつかの実施形態では、全ての低存在種の合計は、20%未満、10%未満、5%未満、4%未満、3%未満、2%未満、1%未満、0.1%未満、またはそれ以下の複数の核酸分子に相当する。いくつかの実施形態では、低存在種は、1つ以上の転写因子をコードするポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、高存在種は、1つ以上のT細胞レセプターをコードするポリヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、高存在種は、1つ以上の抗体をコードするポリヌクレオチドを含みうる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から、1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。たとえば、本明細書に開示される方法および組成物は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも500、少なくとも1,000、またはそれ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から、1つ以上の高存在種それぞれの含有量を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から、1つ以上の高存在種のうち少なくとも1つの含有量を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から、高存在種の合計の含有量を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%減少させることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から、1つ以上の高存在種それぞれの含有量を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から、高存在種の合計の含有量を、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、1つ以上の低存在種をそれぞれ、少なくとも、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、1つ以上の低存在種のうち少なくとも1つを、少なくとも、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、低存在種の合計を、少なくとも、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、1つ以上の中存在種のうち少なくとも1つを、少なくとも、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、中存在種の合計を、少なくとも、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物は、複数の核酸分子から中存在種をそれぞれ、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%保持しつつ、複数の核酸分子から1つ以上の高存在種の含有量を減少させることができる。
複数の核酸分子
本明細書に開示される複数の核酸分子は、様々な核酸分子を含みうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、DNA分子、RNA分子、ゲノムDNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、siRNA分子、またはそれらの組み合わせを含むことができ、二本鎖または一本鎖でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも30,000、少なくとも40,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000、少なくとも1,000,000、またはそれ以上の種を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、単一細胞または複数の細胞などのサンプル由来でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、複数の単一細胞などの複数のサンプルからプールすることができる。
本明細書に開示される複数の核酸分子は、様々な核酸分子を含みうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、DNA分子、RNA分子、ゲノムDNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、siRNA分子、またはそれらの組み合わせを含むことができ、二本鎖または一本鎖でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも30,000、少なくとも40,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000、少なくとも1,000,000、またはそれ以上の種を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、単一細胞または複数の細胞などのサンプル由来でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、複数の単一細胞などの複数のサンプルからプールすることができる。
いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、非正規化核酸ライブラリー、部分的に正規化核酸ライブラリー、または、cDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリーなどの他の方法によって正規化された核酸ライブラリーを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、それぞれ単一細胞に相当する複数の非正規化核酸ライブラリーから構築された、プールされた非正規化核酸ライブラリーなどの、プールされた非正規化核酸ライブラリーを含みうる。いくつかの実施形態では、非正規化核酸ライブラリーはcDNAライブラリーである。いくつかの実施形態では、非正規化核酸ライブラリーはゲノムライブラリーである。いくつかの実施形態では、非標準化核酸ライブラリーは、単一細胞核酸ライブラリーである。本明細書で用いられる場合、「単一細胞核酸ライブラリー」は、単一細胞に由来するゲノムDNAまたはmRNA分子などの核酸分子の集合を意味する。いくつかの実施形態では、単一細胞核酸ライブラリーは、核酸分子が、当該核酸分子が由来する単一細胞を同定するための細胞標識を含む、複数の単一細胞に由来する核酸分子の集合を示しうる。
いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、高存在種を除去する前に増幅に供しうる。たとえば、複数の核酸分子は、増幅された核酸ライブラリーを含みうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、各核酸分子の少なくとも2個、少なくとも4個、少なくとも8個、少なくとも16個、少なくとも100個、少なくとも1,000個またはそれ以上の、各核酸分子のコピーを含みうる。
結合部分
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを複数の核酸分子とハイブリダイズさせることを含む。様々な結合部分が、本明細書に開示される方法および組成物に使用されうる。たとえば、結合部分は、結合対の一部であってもよい。いくつかの実施形態では、結合部分は、オリゴヌクレオチドに付加される官能基でありうる。いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはそれらの任意の組み合わせでありうる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを複数の核酸分子とハイブリダイズさせることを含む。様々な結合部分が、本明細書に開示される方法および組成物に使用されうる。たとえば、結合部分は、結合対の一部であってもよい。いくつかの実施形態では、結合部分は、オリゴヌクレオチドに付加される官能基でありうる。いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはそれらの任意の組み合わせでありうる。
本明細書に開示される結合部分は、捕捉分子などの捕捉部分に結合することができる。いくつかの実施形態では、結合部分および捕捉分子は、結合対のメンバー、たとえば、ビオチン/ストレプトアビジンでありうる。捕捉分子は、ビーズ、微粒子、またはナノ粒子などの固体担体上に固定しうる。
いくつかの実施形態では、第1のオリゴヌクレオチドは、結合部分を含む複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成するように、伸長することができる。いくつかの実施形態では、第2の鎖は、二本鎖核酸分子を生成するように、相補鎖上の結合部位に結合するプライマーを用いて合成することができる。
変性/部分的再アニーリングによる高存在種の含有量減少
いくつかの実施形態では、高存在種の含有量を減少させることは、後に二本鎖核酸分子の部分的な再アニーリングが続く、変性を含んでもよく、その後、1つ以上の固体担体上に固定された、結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、複数の標的核酸に対する再アニールされた相補鎖を除去することが続く。
いくつかの実施形態では、高存在種の含有量を減少させることは、後に二本鎖核酸分子の部分的な再アニーリングが続く、変性を含んでもよく、その後、1つ以上の固体担体上に固定された、結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、複数の標的核酸に対する再アニールされた相補鎖を除去することが続く。
変性は、二本鎖核酸分子を加熱すること、二本鎖核酸分子を有機溶媒(たとえば、DMSまたはホルムアミド)で処理すること、二本鎖核酸分子の塩濃度を変化させること、および/または二本鎖核酸分子のpHを変化させることを含む、様々な方法で行われる。
変性後、一本鎖核酸分子は部分的に再アニールすることができる。部分的な再アニーリングは、任意の方法で行うことができ、たとえば、氷上での急速冷却、塩濃度の変化(たとえば、塩濃度を変性に用いられる量から元に戻す)、および/またはpHの変化(たとえば、pHを変性に用いられるレベルから元に戻す)などが挙げられる。
再アニーリングの程度は、様々な要因に応じて調整することができ、要因としては、除去される種のタイプ(たとえば、高存在種および/または中存在種)、除去される高存在種の望ましい割合、および/または保持される中存在種もしくは低存在種の割合が含まれるが、これらに限定されるものではない事が理解されうる。いずれかの特定の理論に拘束されるものではないが、同じアニール条件下では、より高存在の種(たとえば、高存在種)は、より低存在の種(たとえば、中存在種および低存在種)よりも速くアニールすると考えられる。たとえば、再アニーリング工程の温度、塩濃度、pH、および/または持続時間を変更することによって、除去される高存在種の割合および/または保持される中存在種または低存在種の割合が調整されうる。いくつかの実施形態では、再アニーリング工程の温度、塩濃度、pH、および/または持続時間は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の高存在種が再アニールされるように調整されうる。いくつかの実施形態では、再アニーリング工程の温度、塩濃度、pH、および/または持続時間は、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%の中存在種または低存在種が一本鎖のままであるように調整されうる。
図1は、本開示の方法の一実施形態を示す。サンプルは、複数の核酸を含みうる。核酸のいくつかは高存在106であってもよく、核酸のいくつかはより低存在105であってもよい。核酸は、結合部分120で非対称に標識された二本鎖cDNAライブラリー125に変換することができる。たとえば、核酸105/106は、逆転写されたmRNAでありうる。第2の鎖の合成は、結合部分120を含むプライマー(たとえば、遺伝子特異的プライマーまたはランダムマルチマープライマー)を使用して実施することができ、それにより非対称標識二本鎖核酸ライブラリー125を生成する。別の例では、核酸105/106はDNAであってもよい。DNAは、結合部分120を含むプライマーを用いて伸長することができ、それにより非対称標識二本鎖cDNAライブラリー125を生成する。二本鎖cDNAライブラリーは、高存在二本鎖cDNA種116および低存在二本鎖cDNA種115を含みうる。二本鎖cDNAライブラリー125は、アダプター130/135にライゲートすることができ、それにより非正規化ライブラリー125を生成する。
二本鎖cDNAライブラリー125は熱変性させることができ、それにより二本鎖cDNAの鎖が分離される。熱変性されたライブラリーは、再アニール(たとえば、部分的な再アニール)140されうる。より高存在の核酸106は、より低存在の核酸105よりも速くアニールできる。変性および部分的な再アニーリングの結果、前記結合部分142を含む再アニールされた二本鎖cDNA、前記結合部分143を含む一本鎖分子、および前記結合部分144を欠く一本鎖分子、を含む種の混合物141が得られうる。
変性および再アニールされたライブラリーは、固体担体145に接触させうる。固体担体は、非対称標識二本鎖cDNA115/116の結合部分120に結合できる捕捉部分を含みうる。結合部分120を含む核酸は、固体担体によって結合されうる。これらの核酸は、前記結合部分142を含む再アニールされた二本鎖cDNA、前記結合部分143を含む一本鎖分子を含みうる。磁石は、核酸に結合した固体担体145を除去するのに用いられうる。
残留核酸150は、アニールしなかった種の相補物に相当する(たとえば、これは結合部分を含む一本鎖の相補物であり、固体担体によって除去されたが、濃度が低かったため、その一本鎖分子とアニールしなかった)。残留核酸150は、結合部分120を含まなくてもよい。残留核酸150は、シーケンシングのためのアダプターで増幅および/またはライゲートされうる。これらの核酸は、正規化ライブラリーに相当する。いくつかの場合には、ライブラリーの正規化は、当該ライブラリーを正規化するための酵素学の使用(たとえば、ヌクレアーゼ)を必要としなくてもよい。
ライブラリー正規化の方法
本開示は、ライブラリー正規化のための方法を提供する。本開示の方法は、核酸サンプルに対して行うことができる。核酸サンプルは、核酸を含みうる。サンプルは、本開示のサンプル由来であってもよい。サンプルは、単一細胞であってもよい(たとえば、核酸サンプルは単一細胞からの核酸であってもよい)。核酸サンプルは、RNA、DNA、またはRNAおよびDNAの両方を含みうる。サンプルの核酸は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖および二本鎖の両方の混合物であってもよい。いくつかの場合には、サンプルの核酸の全てまたは大部分が一本鎖である。
本開示は、ライブラリー正規化のための方法を提供する。本開示の方法は、核酸サンプルに対して行うことができる。核酸サンプルは、核酸を含みうる。サンプルは、本開示のサンプル由来であってもよい。サンプルは、単一細胞であってもよい(たとえば、核酸サンプルは単一細胞からの核酸であってもよい)。核酸サンプルは、RNA、DNA、またはRNAおよびDNAの両方を含みうる。サンプルの核酸は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖および二本鎖の両方の混合物であってもよい。いくつかの場合には、サンプルの核酸の全てまたは大部分が一本鎖である。
核酸サンプルは、異なる存在量の標的核酸(すなわち、核酸種、本明細書では標的核酸と同義的に用いられる)を含みうる。たとえば、核酸サンプルは、高存在の標的(たとえば、アクチン、GapDH、グロビン、ハウスキーピング遺伝子)を含みうる。核酸サンプルは、低存在の標的(たとえば、幹細胞もしくは循環腫瘍細胞(CTC)からの希少標的、または低発現遺伝子)を含みうる。核酸サンプルは、高存在および低存在の標的の混合物を含みうる。
サンプルの核酸は、結合部分を含むプライマーと接触させて二本鎖cDNAを生成しうる。いくつかの実施形態では、核酸はRNAであってもよく、プライマーは逆転写プライマーであってもよい。逆転写プライマーはRNAを逆転写することができ、それによりRNA−cDNAハイブリッドを生成する(たとえば、第1の鎖の合成)。第2の鎖は、標準的な第2の鎖の合成技術を用いて生成することができる。第1のcDNA鎖は、結合部分を含みうる。第2の鎖は、第1の鎖の相補鎖であってもよい。第2の鎖は、結合部分を含まなくてもよい。このcDNAは、非対称標識cDNA(たとえば、cDNAの一方の鎖が結合部分で標識されている)と称されうる。
サンプルの核酸がDNAである場合、結合部分を含むプライマーを核酸に接触させて第1の鎖(たとえば、DNAテンプレートに対する相補鎖)を生成しうる。第1の鎖は、結合部分を含みうる。いくつかの場合には、プライマーは、第1の鎖に対して相補的な第2の鎖を生成しうる。第2の鎖は、結合部分を含まなくてもよい。
RNAまたはDNA開始テンプレートのいずれかを用いた場合、その結果として、鎖の一方が結合部分を含み、他方の鎖が相補体である、非対称標識二本鎖cDNA分子が生じうる。非対称に標識された二本鎖cDNA分子のグループは、非正規化ライブラリーと称されうる。
いくつかの実施形態では、結合部分は、ライブラリーの生成後に生じる増幅反応(たとえば、第1の鎖、第2の鎖、アダプターライゲーション)を介して加えられる。図3に示すように、核酸(たとえば、mRNA、DNA)305は、分子標識(すなわち、分子インデックス)310、サンプル標識(すなわち、細胞標識、サンプルインデックス)315、およびユニバーサル標識(すなわち、ユニバーサルプライマー結合配列)320を含むプライマーを用いて、逆転写または伸長しうる。生成物は、ネステッド遺伝子特異的プライマー330およびユニバーサル標識320に結合するユニバーサルプライマー335を用いて当該生成物が増幅される、最初のネステッドPCR増幅反応325を受けることができ、それによりアンプリコンを生成する。いくつかの場合には、アンプリコンは、ネステッドPCRプライマー345およびユニバーサル標識320に結合する結合部分355を含むユニバーサルプライマー350を使用して、2回目の増幅を受けうる。増幅反応は、結合部分で非対称に標識されたアンプリコン(たとえば、ネステッドPCRアンプリコン)を生成しうる。図3は、結合部分を付加するための代表的な増幅スキームを示す。結合部分は、逆転写時、第2の鎖合成時、アダプターライゲーションの前、アダプターライゲーションの後、および/または任意のPCR増幅工程などの、任意の工程で加えられうる。結合部分を含むプライマーは、ライブラリー調製スキームの複数の工程で使用されうる。
結合部分は、結合パートナーを有する任意の小分子であってもよい。結合部分の例としては、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、タンパク質結合セグメントまたは構造、および核酸結合セグメントまたは構造などが含まれる。
本明細書に記載の方法および組成物は、ライブラリー正規化におけるssDNAおよびdsDNA画分の物理的および酵素的分離の課題に対処するものである。図5Aおよび図5Bに示すように、非正規化ライブラリー500は、高存在種505および低存在種510を含む。最初のライブラリーの調製において、当該ライブラリー、または当該ライブラリーの一部は、一つの末端において結合部分515(ビオチンなど)で非対称に標識される。標識された二本鎖核酸分子520は変性530され、高存在種535および低存在種540を含む一本鎖核酸分子を生成する。一本鎖核酸分子は、部分的に再アニール550され、高存在種の二本鎖分子555を形成するが、低存在種は一本鎖560のままである。変性および部分的再アニーリングの後、標識された鎖のすべてが、常磁性ストレプトアビジンビーズなどの支持マトリックス565上に捕捉され、結合および非結合画分が分離される570。高存在の配列は、主に再ハイブリダイズされ、両方の鎖は結合画分中に除去される。しかしながら、低存在の配列は、再ハイブリダイズされないため、標識された鎖の相補体は非結合画分に存在する。一本鎖高存在種575および一本鎖低存在種580を含む非結合画分は、正規化ライブラリー585に相当し、直接使用されうるか、または下流への適用のためにさらに増幅590されうる。
変性および部分的再アニーリング
非正規化ライブラリー(たとえば、標的核酸cDNAを含む)は、変性されうる。変性は、サンプルを加熱すること、サンプルを有機溶媒(たとえば、DMSまたはホルムアミド)で処理すること、サンプルの塩濃度を変化させること、および/またはサンプルのpHを変化させることを含む、様々な方法で行われうる。
非正規化ライブラリー(たとえば、標的核酸cDNAを含む)は、変性されうる。変性は、サンプルを加熱すること、サンプルを有機溶媒(たとえば、DMSまたはホルムアミド)で処理すること、サンプルの塩濃度を変化させること、および/またはサンプルのpHを変化させることを含む、様々な方法で行われうる。
いくつかの場合には、変性はサンプルを加熱することによって行われる。変性は、少なくとも50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、もしくは95℃またはそれ以上の温度で行うことができる。変性は、高くとも50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、もしくは95℃、またはそれ以上の温度で行うことができる。変性は、少なくとも1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、またはそれ以上で行うことができる。変性は、長くとも1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、もしくは10分、またはそれ以上で行うことができる。変性は、cDNAの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%の変性をもたらしうる。変性は、cDNAの多くとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%の変性をもたらしうる。変性は、核酸の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、または100%を一本鎖形態としうる。
変性されたサンプルは、再アニールされうる。変性されたサンプルは、部分的に再アニールされうる。部分的な再アニーリングは、任意の方法で行うことができ、たとえば、氷上での急速冷却、塩濃度の変化(たとえば、塩濃度を変性に用いられる量から元に戻す)、および/またはpHの変化(たとえば、pHを変性に用いられるレベルから元に戻す)などが挙げられる。いくつかの場合には、部分的な再アニーリングは、変性されたサンプルを(たとえば、氷上で)冷却することを含む。部分的な再アニーリングは、変性されたサンプルの鎖の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%の再アニーリングを含みうる。部分的な再アニーリングは、変性されたサンプルの鎖の多くとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%の再アニーリングを含みうる。高存在核酸からの鎖の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%は、部分的な再アニーリングの工程において再アニールされうる。高存在核酸からの鎖の多くとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%は、部分的な再アニーリングの工程において再アニールされうる。低存在核酸からの鎖の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%は、部分的な再アニーリングの工程において再アニールされうる。低存在核酸からの鎖の多くとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%または100%は、部分的な再アニーリングの工程において再アニールされうる。
より高存在の種からの鎖は、より低存在の種からの鎖より、少なくとも50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、もしくは500%またはそれ以上速く再アニールされうる。より高存在の種からの鎖は、より低存在の種からの鎖より、多くとも50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、もしくは500%またはそれ以上速く再アニールされうる。より高存在の種からの鎖は、より低存在の種からの鎖の少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍またはそれ以上を再アニールしうる。より高存在の種からの鎖は、より低存在の種からの鎖の多くとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍またはそれ以上を再アニールしうる。
再アニーリングの後、サンプルは、複数の二本鎖分子、結合部分を含む複数の一本鎖分子、および結合部分を含まなくてもよい複数の一本鎖分子を含みうる。二本鎖分子は、結合部分を含みうる1つの鎖および結合部分を含まない1つの鎖を含みうる。
再アニールされたサンプルは、固体担体と接触させることができる。固体担体は、捕捉部分を含みうる。捕捉部分は、結合部分に結合しうる。たとえば、結合部分がビオチンである場合、捕捉部分はストレプトアビジンであってもよい。固体担体は、たとえば、樹脂、スラリー、ビーズ、樹脂、ヒドロゲル、半固体担体、不溶性担体、および/または半固体担体であってもよい。いくつかの場合には、固体担体は樹脂である。
固体担体は物理的性質を有してもよい。たとえば、固体担体は、特定のpH条件、塩条件、および/または温度条件において可溶性であってもよい。固体担体は、磁性、強磁性、および/または常磁性であってもよい。
固体担体は、結合部分を含む再アニールしたサンプルの分子に結合しうる。固体担体は、二本鎖cDNA(たとえば、結合部分を含む)に結合しうる。固体担体は、一本鎖非アニール鎖(たとえば、結合部分を含む)に結合しうる。
固体担体は、サンプルの精製に用いることができる。固体担体は、サンプル(すなわち、上清)から(たとえば、遠心分離、磁性によって)分離されうる。残りのサンプル(すなわち、上清)は、正規化ライブラリーと称されうる。正規化ライブラリーは、結合部分を含まなくてもよい一本鎖核酸分子を含みうる。一本鎖核酸分子は、方法の部分的な再アニーリング工程においてアニールしなかった分子であってもよい。
正規化ライブラリーは、非正規化ライブラリーと比較して、相対的により等しい量の、より低存在の種およびより高存在の種を含みうる。たとえば、非正規化ライブラリーと比較して、正規化ライブラリーにおいて、より高存在の種は、より低存在の種の少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、もしくは20倍またはそれ以上多い。非正規化ライブラリーと比較して、正規化ライブラリーにおいて、より高存在の種は、より低存在の種の多くとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、もしくは20倍またはそれ以上多い。非正規化ライブラリーと比較して、正規化ライブラリーにおいて、より低存在の種は、より高存在の種の少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、もしくは20倍またはそれ以上多い。非正規化ライブラリーと比較して、正規化ライブラリーにおいて、より低存在の種は、より高存在の種の多くとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、もしくは20倍またはそれ以上多い。
ブロッカーの使用
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、変性および部分的な再アニーリングにおけるブロッカーの使用を提供する。本明細書で用いられる場合、ブロッカーは、ライブラリーのユニバーサル配列(たとえば、ユニバーサルプライマー配列、ユニバーサルシーケンシングフローセル配列)にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド配列を示す。ブロッカーは、遺伝子配列を考慮することなく、それらのユニバーサル領域を介した部分的な再アニーリングにおいて、標的/アンプリコンが異なる遺伝子と一緒にアニールするのを防ぐのに使用しうる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、変性および部分的な再アニーリングにおけるブロッカーの使用を提供する。本明細書で用いられる場合、ブロッカーは、ライブラリーのユニバーサル配列(たとえば、ユニバーサルプライマー配列、ユニバーサルシーケンシングフローセル配列)にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド配列を示す。ブロッカーは、遺伝子配列を考慮することなく、それらのユニバーサル領域を介した部分的な再アニーリングにおいて、標的/アンプリコンが異なる遺伝子と一緒にアニールするのを防ぐのに使用しうる。
ブロッカーの例示的な使用を図4に示す。第1の標的405および第2の標的410はそれぞれ、ユニバーサル配列415/420および結合部分421を含みうる。いくつかの場合には、変性および部分的な再アニーリングにおいて、異なる配列を有する標的405/410は、それぞれが含むユニバーサル配列415/420を介して、一緒にアニールしうる。ブロッカーは、これが発生するのを防ぐために使用することができる。サンプルは、ブロッカー430と接触425させることができる。ブロッカー430は、標的の1つ以上のユニバーサル配列にハイブリダイズしうる。1つ以上の異なるタイプのブロッカー430を使用しうる。ブロッカーは、鎖をそれらの遺伝子配列を介して関連付け(たとえば、ハイブリダイズ)させることによって部分的再アニーリングを助けうる。このようにして、本開示のライブラリー正規化方法を助けるためにブロッカーを使用することができる。
ブロッカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10またはそれ以上のヌクレオチド長でありうる。ブロッカーは、長くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10またはそれ以上のヌクレオチド長でありうる。ブロッカーは、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または100%の相補性でその標的にハイブリダイズしうる。ブロッカーは、多くとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90または100%の相補性でその標的にハイブリダイズしうる。
いくつかの実施形態では、本開示のライブラリー正規化方法は、固体担体上で実施されうる。たとえば、ライブラリーのアンプリコンが、クリックケミストリーに関与する分子の1つ(たとえば、アジド−アルキン環化付加のためのアジド、アルキン)で非対称に標識されたライブラリーを生成しうる。固体担体は、クリックケミストリーにおいて他の分子を含みうる。たとえば、アンプリコンはアルキンを含んでもよく、固体担体はアジドを含んでもよい。アンプリコンは、(たとえば、クリックケミストリーによって)固体担体に結合させることができる。固体担体は加熱されてもよく、それにより結合したアンプリコンの変性を誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、より高存在のアンプリコンは、固体担体に結合した分子に再アニールしうる。より低存在のアンプリコンは、溶液中に残されうる(たとえば、遠心分離、磁性、クロマトグラフィーによって)。固体担体は、溶液から除去することができ、それにより正規化ライブラリーが残る。
増幅
核酸増幅反応は、正規化標的核酸分子の複数のコピーを生成するために1回以上行いうる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される条件で、多重方式で行いうる。増幅反応は、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加するために使用しうる。増幅反応は、存在するのであればサンプル標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、細胞および/または分子標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、サンプルタグ、細胞標識、空間標識、分子標識、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、複数の核酸の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%を増幅する工程を含みうる。本方法は、サンプル標識、細胞標識、空間標識、および/または分子標識を含む標的−バーコード分子のcDNAコピーを1つ以上生成するためにcDNA合成反応を1回以上行う工程をさらに含みうる。
核酸増幅反応は、正規化標的核酸分子の複数のコピーを生成するために1回以上行いうる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される条件で、多重方式で行いうる。増幅反応は、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加するために使用しうる。増幅反応は、存在するのであればサンプル標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、細胞および/または分子標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、サンプルタグ、細胞標識、空間標識、分子標識、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、複数の核酸の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%を増幅する工程を含みうる。本方法は、サンプル標識、細胞標識、空間標識、および/または分子標識を含む標的−バーコード分子のcDNAコピーを1つ以上生成するためにcDNA合成反応を1回以上行う工程をさらに含みうる。
いくつかの実施形態では、増幅はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて行いうる。本明細書で用いられる場合、PCRとは、DNAの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のDNA配列のin vitro増幅を行う反応を意味しうる。本明細書で用いられる場合、PCRは、その反応の派生形、たとえば、限定されるものではないが、RT−PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、定量PCR、多重PCR、ディジタルPCR、およびアセンブリーPCRを包含しうる。
標識核酸の増幅は非PCRベースの方法をも含みうる。非PCRベースの方法の例としては、限定されるものではないが、多重置換増幅(MDA)、転写媒介増幅(TMA)、全トランスクリプトーム増幅(WTA)、全ゲノム増幅(WGA)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、リアルタイムSDA、ローリングサークル増幅、またはサークル−サークル増幅が挙げられる。他の非PCRベースの増幅方法としては、DNAもしくはRNA標的を増幅するためのDNA依存性RNAポリメラーゼ駆動RNA転写増幅またはRNA指向DNA合成および転写の多重サイクル、リガーゼ連鎖反応(LCR)、およびQβレプリカーゼ(Qβ)法、パリンドロームプローブの使用、鎖置換増幅、制限エンドヌクレアーゼを用いたオリゴヌクレオチド駆動増幅、プライマーが核酸配列にハイブリダイズされかつ得られた二本鎖が伸長反応および増幅の前に切断される増幅方法、5’エキソヌクレアーゼ活性の欠如した核酸ポリメラーゼを用いた鎖置換増幅、ローリングサークル増幅、および分岐伸長増幅(RAM)が挙げられる。いくつかの場合には、増幅は、環化転写物を生成しうる。
サプレッションPCRは、本開示の増幅方法に使用可能である。サプレッションPCRは、増幅に使用されるプライマーが全リピートまたはリピートの一部に対応する場合に非効率的増幅に起因して末端逆方向リピートがフランキングするある特定のサイズ未満の分子が選択的に排除されることを意味しうる。この理由は、断片の相補的末端の生産的PCRプライマーアニーリングおよび非生産的自己アニーリングとの間の平衡にありうる。一定サイズのフランキング末端逆方向リピートでは、インサートが短いほど、サプレッション効果が強くなり、その逆も成り立つ。同様に、一定インサートサイズでは、末端逆方向リピートが長いほど、サプレッション効果が強い。
サプレッションPCRは、PCR増幅の前にDNA断片の末端にライゲートされるアダプターを使用可能である。融解およびアニーリングの後、鎖の5’末端および3’末端に自己相補的アダプターを有する一本鎖DNA断片は、PCR時に断片の増幅を抑制する抑制的「テニスラケット」形構造を形成可能である。
いくつかの場合には、本明細書に開示される方法は、確率標識アンプリコンを生成するために標識核酸(たとえば、標識RNA、標識DNA、標識cDNA)上でポリメラーゼ連鎖反応を行う工程をさらに含む。確率標識アンプリコンは二本鎖分子であってもよい。二本鎖分子は、二本鎖RNA分子、二本鎖DNA分子、またはDNA分子にハイブリダイズされたRNA分子を含みうる、またはそれらの分子でありうる。二本鎖分子の一方または両方の鎖は、サンプル標識、空間標識、細胞標識、および/または分子標識を含みうる。確率標識アンプリコンは、一本鎖分子でありうる。一本鎖分子は、DNA、RNA、またはそれらの組合せを含みうる。本開示の核酸は、合成核酸または改変核酸を含みうる。
増幅は、1つ以上の非天然ヌクレオチドの使用を含みうる。非天然ヌクレオチドは、光不安定性またはトリガー性のヌクレオチドを含みうる。非天然ヌクレオチドの例としては、限定されるものではないが、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ核酸、およびロックド核酸(LNA)、さらにはグリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)が挙げられうる。非天然ヌクレオチドは、増幅反応の1サイクル以上に添加しうる。非天然ヌクレオチドの添加は、増幅反応の特定のサイクルまたは時点で産物を同定するために使用しうる。
増幅反応を1回以上行う工程は、1つ以上のプライマーの使用を含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15ヌクレオチドまたはそれ以上を含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、もしくは15ヌクレオチドまたはそれ以上を含みうる。1つ以上のプライマーは、12〜15ヌクレオチド未満を含みうる。1つ以上のプライマーは、複数の確率標識標的の少なくとも一部にアニールしうる。1つ以上のプライマーは、複数の確率標識標的の3’末端または5’末端にアニールしうる。1つ以上のプライマーは、複数の確率標識標的の内部領域にアニールしうる。内部領域は、複数の確率標識標的の3’末端から少なくとも約50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900、または1000ヌクレオチドでありうる。1つ以上のプライマーは、プライマーの一定パネルを含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも1つ以上のカスタムプライマーを含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも1つ以上の対照プライマーを含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも1つ以上の遺伝子特異的プライマーを含みうる。
1つ以上のプライマーは、本開示の任意のユニバーサルプライマーを含みうる。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライマー結合部位にアニールしうる。1つ以上のカスタムプライマーは、第1のサンプル標識、第2のサンプル標識、空間標識、細胞標識、分子標識、標的、またはそれらの任意の組合せにアニールしうる。1つ以上のプライマーは、ユニバーサルプライマーおよびカスタムプライマーを含みうる。カスタムプライマーは、1つ以上の標的を増幅するように設計しうる。標的は、1つ以上のサンプル中の全核酸のサブセットを含みうる。標的は、1つ以上のサンプル中の全確率標識標的のサブセットを含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも96カスタムプライマーまたはそれ以上を含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも960カスタムプライマーまたはそれ以上を含みうる。1つ以上のプライマーは、少なくとも9600カスタムプライマーまたはそれ以上を含みうる。1つ以上のカスタムプライマーは、2つ以上の異なる標識核酸にアニールしうる。2つ以上の異なる標識核酸は、1つ以上の遺伝子に相当しうる。
任意の増幅スキームを本開示の方法に使用可能である。たとえば、1スキームでは、第1ラウンドのPCRは、遺伝子特異的プライマーおよびユニバーサルIlluminaシーケンシングプライマー1配列に対するプライマーを用いて分子(たとえば、ビーズに結合されたもの)を増幅可能である。第2ラウンドのPCRは、Illuminaシーケンシングプライマー2配列がフランキングするネステッド遺伝子特異的プライマーとユニバーサルIlluminaシーケンシングプライマー1配列に対するプライマーとを用いて第1のPCR産物を増幅可能である。第3ラウンドのPCRは、P5とP7とサンプル指標インデックスとを付加してPCR産物をIlluminaシーケンシングライブラリーにする。150bp×2シーケンシングを用いたシーケンシングは、リード1上の細胞標識および分子インデックス、リード2上の遺伝子、ならびにインデックス1リード上のサンプルインデックスを明らかにしうる。
増幅は1ラウンド以上で実施可能である。いくつかの場合には、複数ラウンドの増幅が行われる。増幅は2ラウンド以上の増幅を含みうる。第1の増幅は遺伝子特異的領域を生成する伸長off X’でありうる。第2の増幅は、新たに形成された鎖にサンプル核酸がハイブリダイズする場合に起こりうる。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは核酸分子の末端で行う必要はない。いくつかの実施形態では、より長い核酸のインタクト鎖内の標的核酸にハイブリダイズして増幅する。たとえば、ゲノムDNAまたはmRNAのより長いセクション内の標的。標的は、ポリヌクレオチドの末端から50nt超、100nt超、または1000nt超にありうる。
アダプターライゲーションを含むライブラリーの調製
非正規化ライブラリー(または正規化ライブラリー)の一本鎖分子は、たとえば、二本鎖分子の生成およびフローセルシーケンシングアダプターの組み込み(たとえば、ライゲーションおよび/またはハイブリダイゼーション、ならびにPCRによって)を含みうる、シーケンシングのために調整されうる。
非正規化ライブラリー(または正規化ライブラリー)の一本鎖分子は、たとえば、二本鎖分子の生成およびフローセルシーケンシングアダプターの組み込み(たとえば、ライゲーションおよび/またはハイブリダイゼーション、ならびにPCRによって)を含みうる、シーケンシングのために調整されうる。
いくつかの実施形態では、アダプターは、二本鎖核酸にライゲートされうる。アダプターは、本開示の第1のユニバーサルプライマー配列、本開示の第2のユニバーサルプライマー配列、および制限エンドヌクレアーゼ結合部位、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。いくつかの場合には、アダプターは、本開示の第2のユニバーサルプライマー配列および制限エンドヌクレアーゼ結合部位を含む。
本明細書で使用される「アダプター」という用語は、核酸の末端に結合しうる、少なくとも10、15、20または25塩基の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを示す。アダプター配列は、たとえば、プライミング部位、プライミング部位の相補体、ならびに、エンドヌクレアーゼ、共通配列およびプロモーターの認識部位を用いて合成されてもよい。アダプターは、完全にまたは実質的に二本鎖であってもよい。二本鎖アダプターは、少なくとも部分的に相補的な2つのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。アダプターは、一方または両方の鎖でリン酸化されていても、またはリン酸化されていなくてもよい。アダプターは、オーバーハング(たとえば、制限酵素またはポリメラーゼ酵素によって生成される)と完全にまたは部分的に相補的な二本鎖部分および一本鎖オーバーハング部分を有することができる。アダプターにおけるオーバーハングは、たとえば、4〜8塩基であってもよい。たとえば、DNAが制限酵素EcoRIで消化される場合、得られる二本鎖フラグメントは、一本鎖オーバーハング5’−AATT−3’にいずれかの末端で隣接し、一本鎖オーバーハング5’−AATT−3’を有するアダプターは、オーバーハング領域間の相補性を介してフラグメントにハイブリダイズする。アダプターのフラグメントへのこの「粘着末端」ハイブリダイゼーションは、アダプターのフラグメントへのライゲーションを促進するが、平滑末端ライゲーションも可能である。平滑末端は、たとえば、クレノウフラグメントのエキソヌクレアーゼ活性を用いて、粘着末端に変換しうる。たとえば、DNAをPvuIIで消化する場合、平滑末端は、dTTPおよびdCTPの存在下でクレノウを有するフラグメントをインキュベートすることによって、2塩基対オーバーハングに変換しうる。オーバーハングはまた、オーバーハングを埋めるか、オーバーハングを除去することによって、平滑末端に変換されてもよい。
アダプターは、本開示の二本鎖cDNAにライゲートされてもよい。ライゲーションの方法は、平滑末端および粘着末端を有する二本鎖DNAまたはRNAにおいて、並置された5’リン酸末端と3’ヒドロキシル末端との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する、T4DNAリガーゼの使用、相補的な標的DNAにハイブリダイズする2つの隣接するオリゴヌクレオチドの、並置された5’リン酸末端と3’ヒドロキシル末端との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する、TaqDNAリガーゼの使用、付着末端を含有する二本鎖DNAにおいて、並置された5’−リン酸末端と3’−ヒドロキシル末端との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する、大腸菌(E.coli)DNAリガーゼの使用、および3’から5’へのホスホジエステル結合の形成を介して、5’リン酸末端核酸ドナーの3’ヒドロキシル末端核酸アクセプターへのライゲーションを触媒する、基質が一本鎖RNAおよびDNAならびにジヌクレオシドピロリン酸を含有するT4RNAリガーゼの使用、または当該技術分野で記載される任意の他の方法を含みうる。異なる酵素は異なるオーバーハングを生成し、アダプターのオーバーハングは、選択された制限酵素によって生成されたフラグメントにライゲートするよう標的化しうる。
いくつかの実施形態では、二本鎖アダプターが使用され、アダプターの1つの鎖のみが二本鎖cDNAにライゲートされる。アダプターの1つの鎖のライゲーションは、選択的にブロックされうる。ライゲーションをブロックするために、たとえば、アダプターの1つの鎖は、アダプターのその鎖の5’末端と標的核酸の3’末端との間に、1つ以上のヌクレオチドのギャップを導入するように設計しうる。アダプターの5’末端からリン酸が存在しないことで、その5’末端の、利用可能な3’OHへのライゲーションがブロックされうる。
シーケンシング
異なる確率標識核酸の数を決定する工程は、標識標的、空間標識、分子標識、サンプル標識、および細胞標識、または任意の産物(たとえば、標識アンプリコン、標識cDNA分子)の配列を決定する工程を含みうる。増幅標的はシーケンシングに供されてもよい。確率標識核酸またはその任意の産物の配列を決定する工程は、サンプル標識、空間標識、細胞標識、分子標識の少なくとも一部、および/または確率標識標的の少なくとも一部、それらの相補体、それらの逆相補体、またはそれらの任意の組合せの配列を決定するためにシーケンシング反応を行なう工程を含みうる。
異なる確率標識核酸の数を決定する工程は、標識標的、空間標識、分子標識、サンプル標識、および細胞標識、または任意の産物(たとえば、標識アンプリコン、標識cDNA分子)の配列を決定する工程を含みうる。増幅標的はシーケンシングに供されてもよい。確率標識核酸またはその任意の産物の配列を決定する工程は、サンプル標識、空間標識、細胞標識、分子標識の少なくとも一部、および/または確率標識標的の少なくとも一部、それらの相補体、それらの逆相補体、またはそれらの任意の組合せの配列を決定するためにシーケンシング反応を行なう工程を含みうる。
核酸(たとえば、増幅核酸、標識核酸、標識核酸のcDNAコピーなど)の配列の決定は、限定されるものではないが、合成シーケンシング(SBS)、ハイブリダイゼーションシーケンシング(SBH)、ライゲーションシーケンシング(SBL)、定量漸進蛍光ヌクレオチド付加シーケンシング(QIFNAS)、ステップワイズライゲーションおよび切断、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、分子ビーコン、TaqManレポータープローブ消化、パイロシーケンシング、蛍光in situシーケンシング(FISSEQ)、FISSEQビーズ、ウォッブルシーケンシング、多重シーケンシング、重合コロニー(POLONY)シーケンシング、ナノグリッドローリングサークルシーケンシング(ROLONY)、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ(たとえば、オリゴライゲーションアッセイ(OLA)、ライゲート線状プローブとローリングサークル増幅(RCA)リードアウトとを用いた単一テンプレート分子OLA、ライゲートパドロックプローブ、またはライゲート環状パドロックプローブとローリングサークル増幅(RCA)リードアウトとを用いた単一テンプレート分子OLA)などをはじめとするさまざまなシーケンシング法を用いて行ってもよい。
いくつかの場合には、標識核酸またはその任意の産物の配列を決定する工程は、ペアエンドシーケンシング、ナノ細孔シーケンシング、高スループットシーケンシング、ショットガンシーケンシング、色素ターミネーターシーケンシング、多重プライマーDNAシーケンシング、プライマウォーキング、サンガージデオキシシーケンシング、マキサム・ギルバートシーケンシング、パイロシーケンシング、真単一分子シーケンシング、またはそれらの任意の組合せを含む。代替的に、標識核酸またはその任意の産物の配列は、電子顕微鏡法または化学増感電界効果トランジスター(chemFET)アレイにより決定しうる。
高スループットシーケンシング法、たとえば、Roche454、Illumina Solexa、ABI−SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、Pacific Bioscience、Helicos、Polonatorプラットフォームなどのプラットフォームを用いたサイクリックアレイシーケンシングを利用することも可能である。シーケンシングは、MiSeqシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、HiSeqシーケンシングを含みうる。
確率標識標的は、生物のゲノムの遺伝子の約0.01%から生物のゲノムの遺伝子の約100%までに相当する核酸を含みうる。たとえば、サンプルの相補的配列を含有する遺伝子をキャプチャーすることにより、複数のマルチマーを含む標的相補的領域を用いて、生物のゲノムの遺伝子の約0.01%から生物のゲノムの遺伝子の約100%までをシーケンス可能である。いくつかの実施形態では、標識核酸は、生物のトランスクリプトームの転写物の約0.01%から生物のトランスクリプトームの転写物の約100%までに相当する核酸を含む。たとえば、サンプルのmRNAをキャプチャーすることにより、ポリTテールを含む標的相補的領域を用いて、生物のトランスクリプトームの転写物の約0.501%から生物のトランスクリプトームの転写物の約100%までをシーケンス可能である。
シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ヌクレオチドもしくは塩基対またはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの多くとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、100ヌクレオチドもしくは塩基対またはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの少なくとも約200、300、400、500、600、700、800、900、1,000ヌクレオチドもしくは塩基対またはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの多くとも約200、300、400、500、600、700、800、900、1,000ヌクレオチドもしくは塩基対またはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの少なくとも約1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、もしくは10,000ヌクレオチドまたは塩基対あるいはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、標識核酸および/または確率バーコードの多くとも約1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、もしくは10,000ヌクレオチドまたは塩基対あるいはそれ以上のシーケンシングを含みうる。
シーケンシングは、少なくとも約200、300、400、500、600、700、800、900、1,000シーケンシングリード/ランまたはそれ以上のシーケンシングを含みうる。シーケンシングは、多くとも約200、300、400、500、600、700、800、900、1,000シーケンシングリード/ランまたはそれ以上のシーケンシングを含みうる。いくつかの場合には、シーケンシングは、少なくとも約1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、もしくは10,000シーケンシングリード/ランまたはそれ以上を含みうる。いくつかの場合には、シーケンシングは、多くとも約1,500、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、もしくは10,000シーケンシングリード/ランまたはそれ以上を含みうる。シーケンシングは、少なくとも0.1億、0.5億、1億、1.5億、2億、2.5億、3億、3.5億、4億、4.5億、5億、5.5億、6億、6.5億、7億、7.5億、8億、8.5億、9億、9.5億、もしくは10億シーケンシングリード/ランまたはそれ以上を含みうる。シーケンシングは、多くとも0.1億、0.5億、1億、1.5億、2億、2.5億、3億、3.5億、4億、4.5億、5億、5.5億、6億、6.5億、7億、7.5億、8億、8.5億、9億、9.5億、もしくは10億シーケンシングリード/ランまたはそれ以上を含みうる。シーケンシングは、全体として少なくとも1億、2億、3億、4億、5億、6億、7億、8億、9億、10億、11億、12億、13億、14億、15億、16億、20億、30億、40億、もしくは50億シーケンシングリードまたはそれ以上を含みうる。シーケンシングは、全体として多くとも1億、2億、3億、4億、5億、6億、7億、8億、9億、10億、11億、12億、13億、14億、15億、16億、20億、30億、40億、もしくは50億シーケンシングリードまたはそれ以上を含みうる。シーケンシングは、約1,600,000,000シーケンシングリード/ラン以下を含みうる。シーケンシングは、約200,000,000リード/ラン以下を含みうる。
本開示の方法によって作製された正規化ライブラリー中では、非正規化ライブラリー中よりも、より低存在の(たとえば、より希少な)転写物をより容易に同定することができる。正規化ライブラリー中の、より低存在の転写物のシーケンシングリードは、非正規化ライブラリー中よりも、より大部分の総リードを含みうる。正規化ライブラリー中の、より低存在の転写物のシーケンシングリードは、非正規化ライブラリー中の同じ転写物のリードと比較して、少なくとも50%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%もしくは500%またはそれ以上のリードを含みうる。正規化ライブラリー中の、より低存在の転写物のシーケンシングリードは、非正規化ライブラリー中の同じ転写物のシーケンシングリードの少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、もしくは6倍またはそれ以上でありうる。
確率バーコード
本明細書に使用される確率バーコードは、標的に確率標識(たとえば、バーコード、タグ)を付けるために使用しうるポリヌクレオチド配列を示す。確率バーコードは1つ以上の標識を含みうる。例示的な標識としては、限定されるものではないが、ユニバーサル標識、細胞標識、分子標識、サンプル標識、プレート標識、空間標識、および/またはプレ空間標識が挙げられる。確率バーコードは、当該確率バーコードを固体担体に結合しうる5’アミンを含みうる。確率バーコードは、1つ以上のユニバーサル標識、1つ以上の次元標識、1つ以上の空間標識、1つ以上の細胞標識、および/または1つ以上の分子標識を含みうる。確率バーコード内のそれぞれの様々な標識の位置は異なりうる。たとえば、ユニバーサル標識は最も5’側の標識でありうる。分子標識は最も3’側の標識でありうる。空間標識、次元標識、および細胞標識は任意の順序でありうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は任意の順序である。確率バーコードは標的結合領域を含みうる。標的結合領域は、サンプル中の標的(たとえば、標的核酸、RNA、mRNA、DNA)と相互作用可能である。たとえば、標的結合領域は、mRNAのポリAテールと相互作用可能なオリゴdT配列を含みうる。いくつかの場合には、確率バーコードの標識(たとえば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチドまたはそれ以上分離しうる。
本明細書に使用される確率バーコードは、標的に確率標識(たとえば、バーコード、タグ)を付けるために使用しうるポリヌクレオチド配列を示す。確率バーコードは1つ以上の標識を含みうる。例示的な標識としては、限定されるものではないが、ユニバーサル標識、細胞標識、分子標識、サンプル標識、プレート標識、空間標識、および/またはプレ空間標識が挙げられる。確率バーコードは、当該確率バーコードを固体担体に結合しうる5’アミンを含みうる。確率バーコードは、1つ以上のユニバーサル標識、1つ以上の次元標識、1つ以上の空間標識、1つ以上の細胞標識、および/または1つ以上の分子標識を含みうる。確率バーコード内のそれぞれの様々な標識の位置は異なりうる。たとえば、ユニバーサル標識は最も5’側の標識でありうる。分子標識は最も3’側の標識でありうる。空間標識、次元標識、および細胞標識は任意の順序でありうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は任意の順序である。確率バーコードは標的結合領域を含みうる。標的結合領域は、サンプル中の標的(たとえば、標的核酸、RNA、mRNA、DNA)と相互作用可能である。たとえば、標的結合領域は、mRNAのポリAテールと相互作用可能なオリゴdT配列を含みうる。いくつかの場合には、確率バーコードの標識(たとえば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチドまたはそれ以上分離しうる。
確率バーコードは1つ以上のユニバーサル標識を含みうる。1つ以上のユニバーサル標識は、確率バーコードのセット中のすべての確率バーコードで同一でありうる(たとえば、所与の固体担体に結合される)。いくつかの実施形態では、1つ以上のユニバーサル標識は、複数のビーズに結合されるすべての確率バーコードで同一でありうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識は、シーケンシングプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含みうる。シークエンシングプライマーは、ユニバーサル標識を含む確率バーコードをシーケンスするために使用可能である。シークエンシングプライマー(たとえば、ユニバーサルシークエンシングプライマー)は、高スループットシークエンシングプラットフォームに関連付けられるシークエンシングプライマーを含みうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識は、PCRプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含みうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識は、シークエンシングプライマーおよびPCRプライマーにハイブリダイズ可能な核酸配列を含みうる。シーケンシングプライマーまたはPCRプライマーにハイブリダイズ可能なユニバーサル標識の核酸配列は、プライマー結合部位として参照しうる。ユニバーサル標識は、確率バーコードの転写を開始するために使用しうる配列を含みうる。ユニバーサル標識は、確率バーコードまたは確率バーコード内の領域を伸長させるために使用しうる配列を含みうる。ユニバーサル標識は、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長もしくはそれ以上でありうる。ユニバーサル標識は、少なくとも約10ヌクレオチドを含みうる。ユニバーサル標識は、多くとも約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーまたは修飾ヌクレオチドは、担体からの確率バーコードの切断除去を可能にするユニバーサル標識配列の一部である。本明細書で用いられる場合、ユニバーサル標識は、「ユニバーサルPCRプライマー」と同義的に用いうる。
確率バーコードは次元標識を含みうる。次元標識は、確率標識化が行われた次元に関する情報を提供する核酸配列を含みうる。たとえば、次元標識は、標的に確率バーコードが付された時点に関する情報を提供可能である。次元標識は、サンプルの確率バーコーディングの時点に関連付け可能である。次元標識は、確率標識化の時点で活性化可能である。異なる時点で異なる次元標識を活性化可能である。次元標識は、標的、標的のグループ、および/またはサンプルに確率バーコードを付けた順序に関する情報を提供する。たとえば、細胞集団は、細胞周期のG0期に確率バーコードを付けることが可能である。細胞は、細胞周期のG1期に確率バーコードで再びパルスすることが可能である。細胞は、細胞周期のS期に確率バーコードで再びパルスすることが可能であり、他の時期も同様である。各パルス時(たとえば、細胞周期の各期)の確率バーコードは、異なる次元標識を含みうる。こうして、次元標識は、細胞周期のどの期に標的に標識したかに関する情報を提供する。次元標識は、多種多様な生物時間を精査することが可能である。例示的な生物時間としては、限定されるものではないが、細胞周期、転写(たとえば転写開始)、および転写物分解が挙げられうる。他の例として、薬剤治療および/または療法の前および/または後にサンプル(たとえば、細胞、細胞集団)に確率標識を付けることが可能である。識別可能な標的のコピー数の変化は、薬剤および/または療法に対するサンプルの反応の指標でありうる。
次元標識は活性化可能でありうる。活性化可能な次元標識は、特定の時点で活性化可能である。活性化可能な次元標識は、構成的に活性化可能である(たとえば、オフに切り替わらない)。活性化可能な次元標識は、可逆的に活性化可能である(たとえば、活性化可能な次元標識は、オン・オフの切替えが可能である)。次元標識は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回またはそれ以上可逆的に活性化可能である。次元標識は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回またはそれ以上可逆的に活性化可能である。次元標識は、蛍光、光、化学的イベント(たとえば、切断、他の分子のライゲーション、修飾(たとえば、ペグ化、SUMO化、アセチル化、メチル化、脱メチル化、脱アセチル化)の追加、光化学的イベント(たとえば、光ケージング)、および非天然ヌクレオチドの導入により活性化可能である。
次元標識は、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるすべての確率バーコードで同一でありうるが、異なる固体担体(たとえばビーズ)では異なりうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、または100%は、同一の次元標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%は、同一の次元標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも95%は、同一の次元標識を含みうる。
複数の固体担体(たとえばビーズ)には、106程度またはそれ以上のユニーク次元標識配列が存在してもよい。次元標識は、少なくとも約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。次元標識は、多くとも約300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4ヌクレオチド長またはそれ以下もしくは以上であってもよい。次元標識は、約5〜約200ヌクレオチドを含んでもよい。次元標識は、約10〜約150ヌクレオチドを含んでもよい。次元標識は、約20〜約125ヌクレオチド長を含んでもよい。
確率バーコードは空間標識を含みうる。空間標識は、確率バーコードに関連付けられる標的分子の空間配向に関する情報を提供する核酸配列を含みうる。空間標識は、サンプル中の座標に関連付け可能である。座標は固定座標でありうる。たとえば、座標は基材を基準にして固定可能である。空間標識は二次元または三次元のグリッドを基準にしうる。座標はランドマークを基準にして固定可能である。ランドマークは空間内で同定可能である。ランドマークはイメージング可能な構造体でありうる。ランドマークは生物学的構造体たとえば解剖学的ランドマークでありうる。ランドマークは細胞ランドマーク(たとえばオルガネラ)でありうる。ランドマークは、非天然ランドマーク、たとえば、色コード、バーコード、磁性、蛍光、放射能、またはユニークなサイズもしくは形状のような同定可能な識別子を有する構造体でありうる。空間標識は、物理的パーティション(たとえば、ウェル、容器、またはドロップレット)に関連付け可能である。いくつかの場合には、空間内の1つ以上の位置にコードを付けるために複数の空間標識が一緒に使用される。
空間標識は、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるすべての確率バーコードで同一でありうるが、異なる固体担体(たとえばビーズ)では異なりうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、または100%は、同一の空間標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%は、同一の空間標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも95%は、同一の空間標識を含みうる。
複数の固体担体(たとえばビーズ)には、106程度またはそれ以上のユニーク空間標識配列が存在してもよい。空間標識は、少なくとも約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上であってもよい。空間標識は、多くとも約300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4ヌクレオチド長またはそれ以下もしくは以上であってもよい。空間標識は、約5〜約200ヌクレオチドを含んでもよい。空間標識は、約10〜約150ヌクレオチドを含んでもよい。空間標識は、約20〜約125ヌクレオチド長を含んでもよい。
確率バーコードは細胞標識(すなわち、サンプル標識)を含んでもよい。本明細書で用いられる場合、用語「サンプル標識」および「細胞標識」は、同義的に用いてもよい。細胞標識は、どの標的核酸がどの細胞に由来したかを決定するための情報を提供する核酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞標識は、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるすべての確率バーコードで同一であるが、異なる固体担体(たとえばビーズ)では異なる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、または100%は、同一の細胞標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも60%は、同一の細胞標識を含みうる。いくつかの実施形態では、同一の固体担体上の確率バーコードの少なくとも95%は、同一の細胞標識を含みうる。
複数の固体担体(たとえばビーズ)には、106程度またはそれ以上のユニーク細胞標識配列が存在可能である。細胞標識は、少なくとも約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。細胞標識は、多くとも約300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4ヌクレオチド長またはそれ以下もしくは以上でありうる。細胞標識は、約5〜約200ヌクレオチドを含みうる。細胞標識は約10〜約150ヌクレオチドを含みうる。細胞標識は、約20〜約125ヌクレオチド長を含みうる長でありうる。
確率バーコードは分子標識を含みうる。分子標識は、確率バーコードにハイブリダイズされた標的核酸種の特定のタイプに関する情報の同定を提供する核酸配列を含みうる。分子標識は、確率バーコード(たとえば標的結合領域)にハイブリダイズされた標的核酸種の特定の存在に対するカウンターを提供する核酸配列を含みうる。いくつかの実施形態では、分子標識のさまざまなセットが所与の固体担体(たとえば、ビーズ)に結合される。いくつかの実施形態では、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるユニーク分子標識配列は106程度またはそれ以上存在可能である。いくつかの実施形態では、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるユニーク分子標識配列は105程度またはそれ以上存在可能である。いくつかの実施形態では、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるユニーク分子標識配列は104程度またはそれ以上存在可能である。いくつかの実施形態では、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるユニーク分子標識配列は103程度またはそれ以上存在可能である。いくつかの実施形態では、所与の固体担体(たとえばビーズ)に結合されるユニーク分子標識配列は102程度またはそれ以上存在可能である。分子標識は、少なくとも約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。分子標識は、多くとも約300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、12、10、9、8、7、6、5、4ヌクレオチド長またはそれ以下でありうる。
確率バーコードは標的結合領域を含みうる。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、標的(たとえば、標的核酸、標的分子、たとえば、分析される細胞核酸)、たとえば、特定の遺伝子配列に特異的にハイブリダイズする核酸配列を含みうる。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、特定の標的核酸の特定の位置に結合(たとえばハイブリダイズ)しうる核酸配列を含みうる。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、制限部位オーバーハング(たとえば、EcoRI付着末端オーバーハング)への特異的なハイブリダイゼーションが可能な核酸配列を含みうる。次いで、確率バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートしうる。
確率バーコードは標的結合領域を含みうる。標的結合領域は、対象の標的にハイブリダイズ可能である。たとえば、標的結合領域は、ポリアデニル化末端を含むmRNAにハイブリダイズ可能なオリゴdTを含みうる。標的結合領域は遺伝子特異的でありうる。たとえば、標的結合領域は、標的の特定の領域にハイブリダイズするように構成可能である。標的結合領域は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。標的結合領域は、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。標的結合領域は5〜30ヌクレオチド長でありうる。確率バーコードが遺伝子特異的標的結合領域を含む場合、確率バーコードは遺伝子特異的確率バーコードとして参照可能である。
標的結合領域は非特異的標的核酸配列を含みうる。非特異的標的核酸配列は、標的核酸の特定の配列に依存せずに複数の標的核酸に結合しうる配列を意味しうる。たとえば、標的結合領域は、ランダムマルチマー配列を含みうるかまたはmRNA分子のポリAテールにハイブリダイズするオリゴdT配列を含みうる。ランダムマルチマー配列は、たとえば、ランダムダイマー、ランダムトリマー、ランダムクアトラマー、ランダムペンタマー、ランダムヘキサマー、ランダムセプタマー、ランダムオクタマー、ランダムノナマー、ランダムデカマー、または任意の長さのより高次のランダムマルチマーの配列でありうる。いくつかの実施形態では、標的結合領域は、所与のビーズに結合されたすべての確率バーコードで同一である。いくつかの実施形態では、所与のビーズに結合された複数の確率バーコードの標的結合領域は、2つ以上の異なる標的結合配列を含みうる。標的結合領域は、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長もしくはそれ以上でありうる。標的結合領域は、多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。
確率バーコードは、確率バーコードのオリエント(たとえばアライメント)のために使用可能なオリエント性を含みうる。確率バーコードは、等電点電気泳動用の部分を含みうる。異なる確率バーコードは、異なる等電点電気泳動点を含みうる。こうした確率バーコードをサンプルに導入した場合、サンプルは、確率バーコードを既知の形態にオリエントするために等電点電気泳動を行うことが可能である。こうして、オリエント性は、サンプルで確率バーコードの既知のマップを作成するために使用可能である。例示的なオリエント性としては、電気泳動移動度(たとえば、確率バーコードのサイズに基づく)、等電点、スピン、伝導率、および/またはセルフアセンブリーが挙げられうる。たとえば、確率バーコードは、セルフアセンブリーのオリエント性を含むことができ、または活性化時に特定のオリエンテーションにセルフアセンブル可能である(たとえば、核酸ナノ構造)。
確率バーコードは親和性を含みうる。空間標識は親和性を含みうる。親和性は、他のエンティティー(たとえば細胞レセプター)への確率バーコードの結合を促進可能な化学的および/または生物学的部分に含まれうる。たとえば、親和性は抗体を含みうる。抗体は、サンプル上の特定の部分(たとえばレセプター)に特異的でありうる。抗体は、確率バーコードを特定の細胞型または分子に案内可能である。特定の細胞型もしくは分子および/またはその近傍にある標的は、確率標識化が可能である。抗体は確率バーコードを特定の位置に案内可能であるので、親和性はまた、空間標識のヌクレオチド配列に加えて空間情報を提供可能である。抗体は治療用抗体でありうる。抗体はモノクローナル抗体でありうる。抗体はポリクローナル抗体でありうる。抗体はヒト化しうる。抗体はキメラでありうる。抗体はネイキッド抗体でありうる。抗体は融合抗体でありうる。
抗体は、全長(すなわち、天然に存在するかもしくは通常の免疫グロブリン遺伝子断片組換えプロセスにより形成される)免疫グロブリン分子(たとえばIgG抗体)または免疫グロブリン分子の免疫活性(すなわち特異的結合)部分たとえば抗体フラグメントを意味しうる。
抗体は抗体フラグメントでありうる。抗体フラグメントは、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、sFvなどの抗体の一部でありうる。抗体フラグメントは、全長抗体により認識される同一の抗原に結合可能である。抗体フラグメントは、抗体の可変領域からなる単離された断片、たとえば、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」フラグメントならびに軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーにより接続された組換え一本鎖ポリペプチド分子(「scFvタンパク質」)を含みうる。例示的な抗体としては、限定されるものではないが、癌細胞に対する抗体、ウイルスに対する抗体、細胞表面レセプター(CD8、CD34、CD45)に結合する抗体、および治療用抗体が挙げられうる。
本開示の細胞標識および/または任意の標識は、エラー訂正能力を提供するように設計される規定の長さたとえばそれぞれ7ヌクレオチド(いくつかのハミングエラー訂正コードで使用されるビットの数と等価である)の核酸サブ配列のユニークセットをさらに含みうる。7ヌクレオチド配列を含むエラー訂正サブ配列のセットは、当該セット中の配列における任意の対の組み合わせが、定義された「遺伝的距離」(または不適正塩基の数)を示すように設計することができ、たとえば、エラー訂正サブ配列のセットは、3ヌクレオチドの遺伝的距離を示すように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、エラー訂正コードの生成に使用される核酸サブ配列の長さはさまざまであってもよい。たとえば、少なくとも3ヌクレオチド長、少なくとも7ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、または少なくとも31ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、他の長さの核酸サブ配列をエラー訂正コードの生成に使用されてもよい。
本開示の確率バーコードは、エラー訂正のためにエラー訂正配列(たとえば、ハミングコード)をその中に含みうる。ハミングコードは、1ビットエラーの訂正が可能な固有冗長性に基づいてユニーク二進コードを同定する算術プロセスを意味しうる。たとえば、ハミングコードは、核酸増幅時に起こる単一ヌクレオチドエラーをスクリーニングするために核酸バーコードにマッチさせうる。それにより、ハミングコードを用いた単一ヌクレオチドエラーの同定は、核酸バーコードの訂正を可能にしうる。
確率バーコードが2つ以上のあるタイプの標識(たとえば、2つ以上の細胞標識または2つ以上の分子標識)を含む場合、標識はリンカー標識配列を散在させうる。リンカー標識配列は、少なくとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。リンカー標識配列は、多くとも約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド長またはそれ以上でありうる。いくつかの場合には、リンカー標識配列は12ヌクレオチド長である。リンカー標識配列は、確率バーコードの合成を促進可能である。リンカー標識は、エラー訂正(たとえばハミング)コードを含みうる。
固体担体
本明細書に開示される確率バーコードは、固体担体(たとえば、ビーズ、基材)に結合されてもよい。本明細書で用いられる場合、「テザー連結」、「結合」、および「固定」という用語は、同義的に用いられて、確率バーコードを固体担体に結合するための共有結合または非共有結合の手段を意味しうる。さまざまな異なるいずれの固体担体も、プレ合成された確率バーコードを結合するためのまたは確率バーコードをin situ固相合成するための固体担体として使用しうる。
本明細書に開示される確率バーコードは、固体担体(たとえば、ビーズ、基材)に結合されてもよい。本明細書で用いられる場合、「テザー連結」、「結合」、および「固定」という用語は、同義的に用いられて、確率バーコードを固体担体に結合するための共有結合または非共有結合の手段を意味しうる。さまざまな異なるいずれの固体担体も、プレ合成された確率バーコードを結合するためのまたは確率バーコードをin situ固相合成するための固体担体として使用しうる。
いくつかの場合には、固体担体はビーズである。ビーズは、核酸を(たとえば共有結合または非共有結合で)固定しうるプラスチック、セラミック、金属、または高分子材料で構成された任意のタイプの中実、多孔性、または中空のスフェア、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似の構成体を包含しうる。ビーズは、球状(たとえばマイクロスフェア)でありうるかまたは非球状もしくは不規則形状、たとえば、立方体形、直方体形、角錐形、円柱形、円錐形、扁球形、ディスク形などを有しうる離散粒子を含みうる。ビーズは非球状の形状でありうる。
ビーズは、限定されるものではないが、常磁性材料(たとえば、マグネシウム、モリブデン、リチウム、およびタンタル)、超常磁性材料(たとえば、フェライト(Fe3O4、マグネタイト)ナノ粒子)、強磁性材料(たとえば、鉄、ニッケル、コバルト、それらのいくつかの合金、およびいくつかの希土類金属化合物)、セラミック、プラスチック、ガラス、ポリスチレン、シリカ、メチルスチレン、アクリルポリマー、チタン、ラテックス、セファロース、アガロース、ヒドロゲル、ポリマー、セルロース、ナイロン、ならびにそれらの任意の組合せなどのさまざまな材料を含みうる。
ビーズの直径は変化してもよく、たとえば、5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、もしくは50μmでありうる。ビーズの直径は、多くとも約5μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、または50μmでありうる。ビーズの直径は、基材のウェルの直径に関連付け可能である。たとえば、ビーズの直径は、ウェルの直径よりも10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100%長いもしくは短い長さでありうる。ビーズの直径は、ウェルの直径よりも多くとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100%長いまたは短い長さでありうる。ビーズの直径は、細胞(たとえば、基材のウェルに閉じ込められた単一細胞)の直径に関連付けうる。ビーズの直径は、細胞の直径よりも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、もしくは300%またはそれ以上長いまたは短い長さでありうる。ビーズの直径は、細胞の直径よりも多くとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、もしくは300%またはそれ以上長いまたは短い長さでありうる。
ビーズは、本開示の基材への埋込みおよび/または結合が可能である。ビーズは、ゲル、ヒドロゲル、ポリマー、および/またはマトリックスへの埋込みおよび/または結合が可能である。基材(たとえば、ゲル、マトリックス、スキャフォールド、またはポリマー)内のビーズの空間位置は、位置アドレスとして機能可能なビーズ上の確率バーコードに存在する空間標識を用いて同定可能である。
ビーズの例としては、限定されるものではないが、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Dynabead(登録商標)、MACS(登録商標)マイクロビーズ、抗体コンジュゲートビーズ(たとえば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ)、プロテインAコンジュゲートビーズ、プロテインGコンジュゲートビーズ、プロテインA/Gコンジュゲートビーズ、プロテインLコンジュゲートビーズ、オリゴdTコンジュゲートビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、およびBcMag(商標)カルボキシ末端磁気ビーズが挙げられうる。
ビーズは、1つの蛍光光学チャネルまたは複数の光学チャネルで蛍光を発するように量子ドットまたは蛍光色素への関連付け(たとえばそれらによる含浸)が可能である。ビーズは、常磁性または強磁性にするために酸化鉄または酸化クロムへの関連付けが可能である。ビーズは同定可能でありうる。ビーズは、カメラを用いてイメージング可能である。ビーズは、ビーズに関連付けられた検出可能なコードを有しうる。たとえば、ビーズは、RFIDタグを含みうる。ビーズは、任意の検出可能なタグ(たとえば、UPCコード、電子バーコード、エッチング識別子)を含みうる。ビーズは、たとえば、有機または無機の溶液中での膨潤に起因してサイズ変化しうる。ビーズは疎水性でありうる。ビーズは親水性でありうる。ビーズは生体適合性でありうる。
固体担体(たとえばビーズ)は可視化可能である。固体担体は可視化タグ(たとえば蛍光色素)を含みうる。固体担体(たとえばビーズ)は識別子(たとえば数)でエッチング可能である。識別子は固体担体(たとえばビーズ)のイメージングにより可視化可能である。
固体担体は、不溶性、半可溶性、または不溶性の材料を意味しうる。固体担体は、それに結合されたリンカー、スキャフォールド、ビルディングブロック、または他の反応性部分を含む場合、「官能基化」としても参照可能であり、一方、固体担体は、それに結合されたかかる反応性部分が欠如している場合、「非官能基化」でありうる。固体担体は、たとえば、マイクロタイターウェル方式、カラムなどのフロースルー方式、またはディップスティックの場、溶液中に遊離した状態で利用可能である。
固体担体は、メンブレン、ペーパー、プラスチック、被覆表面、フラット表面、ガラス、スライド、チップ、またはそれらの任意の組合せを含みうる。固体担体は、樹脂、ゲル、マイクロスフェア、または他の幾何学構成体の形態をとりうる。固体担体は、シリカチップ、マイクロ粒子、ナノ粒子、プレート、アレイ、キャピラリー、フラット担体、たとえば、ガラス繊維フィルター、ガラス表面、金属表面(鋼、金銀、アルミニウム、シリコン、および銅)、ガラス担体、プラスチック担体、シリコン担体、チップ、フィルター、メンブレン、マイクロウェルプレート、スライド、マルチウェルのプレートもしくはメンブレン(たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリビニリデンジフルオリドで形成される)を含むプラスチック材料、および/またはウエハ、コーム、ウエハ(たとえばシリコンウエハ)などのフラット表面のピットもしくはナノリットルウェルのアレイのピンもしくはニードル(たとえば、コンビナトリアル合成もしくは分析に好適なピンのアレイ)もしくはビーズ、フィルターボトムを備えたもしくは備えていないピットを有するウエハを含みうる。
固体担体は、ポリマーマトリックス(たとえば、ゲル、ヒドロゲル)を含みうる。ポリマーマトリックスは、細胞内空間(たとえば、オルガネラの周り)を透過可能でありうる。ポリマーマトリックスは、循環システム全体にわたりポンプ操作可能でありうる。
いくつかの実施形態では、固体担体は生物学的分子でありうる。たとえば、固体担体は、核酸、タンパク質、抗体、ヒストン、細胞区画、脂質、炭水化物などでありうる。生物学的分子である固体担体は、増幅、翻訳、転写、分解、および/または修飾(たとえば、ペグ化、SUMO化、アセチル化、メチル化)が可能である。生物学的分子である固体担体は、生物学的分子に結合された空間標識に加えて空間および時間の情報を提供可能である。たとえば、生物学的分子は、非修飾である場合、第1のコンフォメーションを含みうるが、修飾された場合、第2のコンフォメーションに変化しうる。さまざまなコンフォメーションで本開示の確率バーコードを標的に露出可能である。たとえば、生物学的分子は、生物学的分子のフォールディングによってアクセス不能になる確率バーコードを含みうる。生物学的分子が修飾(たとえばアセチル化)されると、生物学的分子は、コンフォメーションを変化させて確率標識を露出可能である。修飾のタイミングは、本開示の確率バーコーディングの方法に他の時間次元を提供可能である。
別の実施例では、本開示の確立バーコードを含む生物学的分子は、細胞の細胞質に位置しうる。活性化時、生物学的分子は、核に移動可能であり、その後、確率バーコーディングを行うことが可能である。こうして、生物学的分子の修飾は、確率バーコードにより同定される標的に対して追加の空間−時間情報のコード付けを可能にする。
次元標識は、生物学的イベント(たとえば細胞分裂)の空間−時間に関する情報を提供可能である。たとえば、次元標識は第1の細胞に添加可能であり、第1の細胞は分裂して第2の娘細胞を生成可能であり、第2の娘細胞は次元標識のすべてもしくは一部を含みうるかまたはまったく含まないこともある。次元標識は原細胞および娘細胞で活性化可能である。こうして、次元標識は、識別可能な空間で確率バーコーディングの時間に関する情報を提供可能である。
サンプル
本明細書に記載のように、複数の核酸分子は、サンプル、たとえば細胞サンプルから得られうるか、またはそれ由来でありうる。本開示の方法に使用されるサンプルは1細胞以上を含みうる。サンプルとは1細胞以上を意味しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、癌組織、たとえば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌などから摘出された癌細胞である。いくつかの場合には、細胞は、癌に由来するが体液から採取される(たとえば循環腫瘍細胞)。癌の例としては、限定されるものではないが、腺腫、腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫、および線維肉腫が挙げられる。
本明細書に記載のように、複数の核酸分子は、サンプル、たとえば細胞サンプルから得られうるか、またはそれ由来でありうる。本開示の方法に使用されるサンプルは1細胞以上を含みうる。サンプルとは1細胞以上を意味しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、癌組織、たとえば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌などから摘出された癌細胞である。いくつかの場合には、細胞は、癌に由来するが体液から採取される(たとえば循環腫瘍細胞)。癌の例としては、限定されるものではないが、腺腫、腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫、および線維肉腫が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞は、ウイルスに感染していてウイルスオリゴヌクレオチドを含有する細胞である。いくつかの実施形態では、ウイルス感染は、二本鎖DNAウイルス(たとえば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス)、一本鎖(+鎖または「センス」)DNAウイルス(たとえば、パルボウイルス)、二本鎖RNAウイルス(たとえば、レオウイルス)、一本鎖(+鎖またはセンス)RNAウイルス(たとえば、ピコルナウイルス、トガウイルス)、一本鎖(鎖またはアンチセンス)RNAウイルス(たとえば、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス)、一本鎖(生活環でDNA中間体を有する(+鎖またはセンス)RNAウイルス)RNA−RTウイルス(たとえば、レトロウイルス)、および二本鎖DNA−RTウイルス(たとえば、ヘパドナウイルス)からなる群から選択されるウイルスにより引き起こされうる。例示的なウイルスとしては、限定されるものではないが、SARS、HIV、コロナウイルス、エボラ、マラリア、デング熱、C型肝炎、B型肝炎、およびインフルエンザが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞は細菌である。これらは、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌のいずれかを含みうる。本開示の方法、デバイス、およびシステムを用いて分析しうる細菌の例としては、限定されるものではないが、アクチノメズラエ属(Actinomedurae)、アクチノマイセス・イスラエリー(Actinomyces israelii)、バチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、クロストリジウム・ボツリナム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ノカルディア属(Nocardia)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルム(Staphylococcus epiderm)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)などが挙げられる。グラム陰性菌細として菌は、限定されるものではないが、アフピア・フェリス(Afipia felis)、バクテリオデス属(Bacteriodes)、バルトネラ・バチリホルミス(Bartonella bacilliformis)、ボルタデラ・ペルツッシス(Bortadella pertussis)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ボレリア・リカレンチス(Borrelia recurrentis)、ブルセラ(Brucella)、カリマトバクテリウム・グラヌロマチス(Calymmatobacterium granulomatis)、カンピロバクター属(Campylobacter)、エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、ガードネレラ属(Gardnerella)バギナリス(vaginalis)、ヘモフィリウス・アエジプチウス(Haemophilius aegyptius)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilius ducreyi)、ヘモフィラス・インフルエンジアエ(Haemophilius influenziae)、ヘリオバクター・ピロリ(Heliobacter pylori)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、ナイセリア・メニンジティディア(Neisseria meningitidia)、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プロビデンシア・スツルチ(Providencia sturti)、シュードモナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・エンテリディス(Salmonella enteridis)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、シゲラ・ボイディイ(Shigella boydii)、ストレプトバシラス・モニリフォルミス(Streptobacillus moniliformis)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、ビブリオ・コレラエ(Vibrio cholerae)、エルシニア・エンテロコリティカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)などが挙げられる。他の細菌としては、マイコバクテリウム・アビウム(Myobacterium avium)、ミオバクテリウム・レプレ(Myobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Myobacterium tuberculosis)、バルトネラ・ヘンセラエ(Bartonella henseiae)、クラミジア・シッタシ(Chlamydia psittaci)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、コクシエラ・バーネッティイ(Coxiella burnetii)、マイコプラズマ・ニューモニアエ(Mycoplasma pneumoniae)、リケッチア・アカリ(Rickettsia akari)、リケッチア・ロワゼキイ(Rickettsia prowazekii)、リケッチア・リケッチイ(Rickettsia rickettsii)、リケッチア・ツツガムシ(Rickettsia tsutsugamushi)、リケッチア・ティフィー(Rickettsia typhi)、ウレアプラズマ・ウレアリティカム(Ureaplasma urealyticum)、ディプロコッカス・ニューモニエ(Diplococcus pneumoniae)、エールリキア・シャフィンシス(Ehrlichia chafensis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、髄膜炎菌属(Meningococci)などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞は菌類である。本開示の方法、デバイス、およびシステムを用いて分析しうる限定されない菌類の例としては、アスペルギルス属(Aspergilli)、カンジダエ属(Candidae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、コクシジオイデス・イミティス(Coccidioides immitis)、クリプトコッカス属(Cryptococci)、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
いくつかの実施形態では、細胞は原生動物または他の寄生生物である。本開示の方法、デバイス、およびシステムを用いて分析される寄生生物の例としては、限定されるものではないが、バランチジウム・コリ(Balantidium coli)、クリプトスポリジウム・パルバム(Cryptosporidium parvum)、シクロスポラ・カヤタネンシス(Cyclospora cayatanensis)、エンセファリトゾア属(Encephalitozoa)、エントアメーバ・ヒストリティカ(Entamoeba histolytica)、エンテロシトゾーン・ビネウシ(Enterocytozoon bieneusi)、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)、リーシュマニア属(Leishmaniae)、プラスモジウム属(Plasmodii)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、トリパノソーマ属(Trypanosomae)、トラペゾイドアメーバ(trapezoidal amoeba)、ワーム(たとえば、蠕虫)、とくに、寄生虫、たとえば、限定されるものではないが、線形動物門(Nematoda)(回虫、たとえば、鞭虫、鉤虫、蟯虫、回虫、糸状虫など)、多節条虫亜綱(Cestoda)(たとえば、サナダムシ))が挙げられる。
本明細書で用いられる場合、「細胞」という用語は、1細胞以上を意味しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、正常細胞、たとえば、さまざまな発生段階のヒト細胞またはさまざまな器官もしくは組織型のヒト細胞(たとえば、白血球、赤血球、血小板、上皮細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア細胞、線維芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、配偶子、または心臓、肺、脳、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、胸腺、膀胱、胃、結腸、小腸の細胞)である。いくつかの実施形態では、細胞は、未分化ヒト幹細胞または分化誘導されたヒト幹細胞でありうる。いくつかの実施形態では、細胞は、胎児ヒト細胞でありうる。胎児ヒト細胞は、胎児を有する妊娠母体から得られうる。いくつかの実施形態では、細胞は希少細胞である。希少細胞は、たとえば、循環腫瘍細胞(CTC)、循環上皮細胞、循環内皮細胞、循環子宮内膜細胞、循環幹細胞、幹細胞、未分化幹細胞、癌幹細胞、骨髄細胞、前駆細胞、フォーム気泡、間葉細胞、栄養芽細胞、免疫系細胞(宿主またはグラフト)、細胞断片、細胞オルガネラ(たとえば、ミトコンドリアまたは核)、病原体感染細胞などでありうる。
いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト細胞、たとえば、他のタイプの哺乳動物細胞(たとえば、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウシ、またはウマ)である。いくつかの実施形態では、細胞は、他のタイプの動物または植物細胞である。他の実施形態では、細胞は、任意の原核細胞または真核細胞でありうる。
いくつかの実施形態では、第1の細胞サンプルは、疾患や病態を有していない人から得られ、第2の細胞サンプルは、疾患または病態を有する人から得られる。いくつかの実施形態では、人は異なる。いくつかの実施形態では、人は同一であるが、細胞サンプルは異なる時点で得られる。いくつかの実施形態では、人は患者であり、細胞サンプルは患者サンプルである。疾患または病態は、癌、細菌感染、ウイルス感染、炎症性疾患、神経変性疾患、菌類病、寄生虫性疾患、遺伝障害、またはそれらの任意の組合せでありうる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法に使用するのに好適な細胞は、直径約2マイクロメートル〜約100マイクロメートルのサイズ範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも2マイクロメートル、少なくとも5マイクロメートル、少なくとも10マイクロメートル、少なくとも15マイクロメートル、少なくとも20マイクロメートル、少なくとも30マイクロメートル、少なくとも40マイクロメートル、少なくとも50マイクロメートル、少なくとも60マイクロメートル、少なくとも70マイクロメートル、少なくとも80マイクロメートル、少なくとも90マイクロメートル、または少なくとも100マイクロメートルの直径を有していてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、多くとも100マイクロメートル、多くとも90マイクロメートル、多くとも80マイクロメートル、多くとも70マイクロメートル、多くとも60マイクロメートル、多くとも50マイクロメートル、多くとも40マイクロメートル、多くとも30マイクロメートル、多くとも20マイクロメートル、多くとも15マイクロメートル、多くとも10マイクロメートル、多くとも5マイクロメートル、または多くとも2マイクロメートルの直径を有していてもよい。細胞は、たとえば、約5マイクロメートル〜約85マイクロメートルの範囲内の任意の値の直径を有していてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、約10マイクロメートルの直径を有する。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞をビーズおよび/またはマイクロウェルに関連付ける前にソートされる。たとえば、細胞は、蛍光活性化細胞ソーティングまたは磁気活性化細胞ソーティングまたはたとえばフローサイトメトリーによりソート可能である。細胞はサイズによりフィルターされてもよい。いくつかの場合には、リテンテートは、ビーズに関連付けられる細胞を含有する。いくつかの場合には、フロースルーは、ビーズに関連付けられる細胞を含有する。
いくつかの実施形態では、サンプルは免疫細胞を含む。免疫細胞は、たとえば、T細胞、B細胞、リンパ系幹細胞、骨髄系前駆細胞、リンパ球、顆粒球、B細胞前駆体、T細胞前駆体、ナチュラルキラー細胞、Tc細胞、Th細胞、プラズマ細胞、免疫記憶細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、単球、樹状細胞および/またはマクロファージ、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。
T細胞は、T細胞クローンであってもよく、T細胞クローンは、単一のT細胞に由来するT細胞または同一のTCRを有するT細胞を示しうる。T細胞は、T細胞クローン、および全てが同じ標的(たとえば、抗原、腫瘍、ウイルス)を認識しうる異なるTCRを有するT細胞の混合集団、を含みうるT細胞株の一部であってもよい。T細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、および腫瘍を含む、多くの供給源から得ることができる。T細胞は、フィコール(Ficoll)分離を使用するなど、対象から採取した血液の単位から得ることができる。個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球搬出によって得ることができる。アフェレーシスによる生成物は、T細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含む、リンパ球を含みうる。目的の細胞を単離するために、細胞を洗浄し、培地に再懸濁することができる。
T細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、たとえば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離によって、末梢血リンパ球から単離することができる。CD28+、CD4+、CDC、CD45RA+、およびCD45RO+T細胞などのT細胞の特定の亜集団は、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。たとえば、T細胞は、所望のT細胞のポジティブ選択に十分な時間で、DYNABEADS(登録商標)M−450 CD3/CD28 T、またはXCYTE DYNABEADS(商標)などの、抗CD3/抗CD28(すなわち、3×28)−コンジュゲートビーズを用いたインキュベーションによって単離されうる。免疫細胞(たとえば、T細胞およびB細胞)は、抗原特異的でありうる(たとえば、腫瘍特異的。
いくつかの実施形態では、細胞は、B細胞、リンパ節由来の活性化B細胞、リンパ芽球様細胞、休止B細胞、または、たとえばリンパ腫由来の、腫瘍B細胞などの、抗原提示細胞(APC)としうる。APCは、B細胞または表面にBCRCタンパク質の少なくとも1つを発現する濾胞樹状細胞を示しうる。
確率バーコーディングおよびライブラリー正規化の方法
本開示は、サンプルのライブラリー正規化のための方法を提供する。ライブラリー正規化の方法は、任意のライブラリーサンプル調製方法と組み合わせることができる。ライブラリー正規化の方法は、本発明の確率バーコーディング方法と組み合わせることができる。確率バーコーディングは、特定の標的分子を追跡および/または計数することができるように、固有のバーコードを有する個々の核酸分子(たとえば、mRNA分子)をインデックスするために使用することができる。
本開示は、サンプルのライブラリー正規化のための方法を提供する。ライブラリー正規化の方法は、任意のライブラリーサンプル調製方法と組み合わせることができる。ライブラリー正規化の方法は、本発明の確率バーコーディング方法と組み合わせることができる。確率バーコーディングは、特定の標的分子を追跡および/または計数することができるように、固有のバーコードを有する個々の核酸分子(たとえば、mRNA分子)をインデックスするために使用することができる。
確率バーコーディングの方法は、サンプルにごく近接して確率バーコードを配置する工程、サンプルを溶解する工程、識別可能な標的と確率バーコードとを関連付ける工程、標的を増幅する工程、および/または標的をディジタルカウントする工程を含みうる。図2は、本開示の確率バーコード方法の例示的な実施形態を示す。サンプル(たとえば、サンプル切片、薄いスライス、および/または細胞)は、確率バーコードを含む固体担体と接触可能である。サンプル中の標的は、確率バーコードに関連付け可能である。固体担体は捕集可能である。cDNA合成は固体担体上で実施可能である。cDNA合成は固体担体から離れて実施可能である。cDNA合成は、合成される新しいcDNA標的分子中に標識情報を確率バーコード中の標識から組み込むことにより標的−バーコード分子を生成可能である。標的−バーコード分子はPCRを用いて増幅可能である。標的−バーコード分子上の標的および確率バーコードの標識の配列は、シーケンシング法により決定可能である。
サンプルと確率バーコードとの接触
たとえば、細胞、器官、または組織薄片を含むサンプルは、確率バーコードに接触可能である。固体担体は浮動性でありうる。固体担体は半固体または固体のアレイに埋込み可能である。確率バーコードは固体担体に関連付け可能である。確率バーコードは個別のヌクレオチドでありうる。確率バーコードは基材に関連付け可能である。確率バーコードが標的にごく近接している場合、標的は確率バーコードにハイブリダイズ可能である。確率バーコードは、各識別可能な標的を本開示の識別可能な確率バーコードに関連付けできるように非枯渇比で接触可能である。標的と確率バーコードとの効率的関連付けを保証するために、標的は確率バーコードに架橋可能である。
たとえば、細胞、器官、または組織薄片を含むサンプルは、確率バーコードに接触可能である。固体担体は浮動性でありうる。固体担体は半固体または固体のアレイに埋込み可能である。確率バーコードは固体担体に関連付け可能である。確率バーコードは個別のヌクレオチドでありうる。確率バーコードは基材に関連付け可能である。確率バーコードが標的にごく近接している場合、標的は確率バーコードにハイブリダイズ可能である。確率バーコードは、各識別可能な標的を本開示の識別可能な確率バーコードに関連付けできるように非枯渇比で接触可能である。標的と確率バーコードとの効率的関連付けを保証するために、標的は確率バーコードに架橋可能である。
サンプルの2つの識別可能な標的が同一のユニーク確率バーコードに接触可能である確率は、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、もしくは10−1またはそれ以上でありうる。サンプルの2つの識別可能な標的が同一のユニーク確率バーコードに接触可能である確率は、多くとも10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、もしくは10−1またはそれ以上でありうる。同一の細胞の同一の遺伝子の2つの標的が同一の確率バーコードに接触可能である確率は、10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、もしくは10−1またはそれ以上でありうる。同一の細胞の同一の遺伝子の2つの標的が同一の確率バーコードに接触可能である確率は、多くとも10−6、10−5、10−4、10−3、10−2、もしくは10−1またはそれ以上でありうる。
いくつかの場合には、細胞集団の細胞は、本開示の基材のウェル内に分離(たとえば単離)可能である。細胞集団は分離前に希釈可能である。細胞集団は、基材のウェルの少なくとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100%が単一細胞を収容するように希釈可能である。細胞集団は、基材のウェルの多くとも1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100%が単一細胞を収容するように希釈可能である。細胞集団は、希釈集団中の細胞の数が基材上のウェルの数の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100%になるように希釈可能である。細胞集団は、希釈集団中の細胞の数が基材上のウェルの数の1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、もしくは100%になるように希釈可能である。いくつかの場合には、細胞集団は、細胞の数が基材中のウェルの数の約10%になるように希釈される。
基材のウェル中への単一細胞の分配はポアソン分布に従いうる。たとえば、基材のウェルが2細胞以上を有する確率は、少なくとも0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10%またはそれ以上でありうる。基材のウェルが2細胞以上を有する確率は、少なくとも0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10%またはそれ以上でありうる。基材のウェル内への単一細胞の分配はランダムでありうる。基材のウェル内への単一細胞の分配は非ランダムでありうる。細胞は、基材のウェルが1細胞のみを収容するように分離可能である。
細胞溶解
細胞および確率バーコードの分配後、細胞は標的分子を遊離するように溶解可能である。細胞溶解は、さまざまな手段のいずれかにより、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解により達成しうる。細胞は、界面活性剤(たとえば、SDS、Liドデシルスルフェート、Triton X−100、Tween−20、もしくはNP−40)、有機溶媒(たとえば、メタノールもしくはアセトン)、または消化酵素(たとえば、プロテイナーゼK、ペプシンまたはトリプシン)、あるいはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解しうる。標的と確率バーコードとの関連付けを向上させるために、たとえば、温度の低下および/またはライセートの粘度の増加により、標的分子の拡散速度を変化させることが可能である。
細胞および確率バーコードの分配後、細胞は標的分子を遊離するように溶解可能である。細胞溶解は、さまざまな手段のいずれかにより、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解により達成しうる。細胞は、界面活性剤(たとえば、SDS、Liドデシルスルフェート、Triton X−100、Tween−20、もしくはNP−40)、有機溶媒(たとえば、メタノールもしくはアセトン)、または消化酵素(たとえば、プロテイナーゼK、ペプシンまたはトリプシン)、あるいはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解しうる。標的と確率バーコードとの関連付けを向上させるために、たとえば、温度の低下および/またはライセートの粘度の増加により、標的分子の拡散速度を変化させることが可能である。
標的核酸分子への確率バーコードの結合
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後、核酸分子は、共局在化された固体担体の確率バーコードにランダムに関連付けうる。関連付けは、たとえば、標的核酸分子の相補的部分への確率バーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションを含みうる(たとえば、確率バーコードのオリゴdTは、標的のポリAテールと相互作用可能である)。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(たとえば、緩衝液pH、イオン強度、温度など)は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択可能である。
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後、核酸分子は、共局在化された固体担体の確率バーコードにランダムに関連付けうる。関連付けは、たとえば、標的核酸分子の相補的部分への確率バーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションを含みうる(たとえば、確率バーコードのオリゴdTは、標的のポリAテールと相互作用可能である)。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(たとえば、緩衝液pH、イオン強度、温度など)は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択可能である。
結合は、確率バーコードの標的認識領域と標的核酸分子の一部とのライゲーションをさらに含みうる。たとえば、標的結合領域は、制限部位オーバーハング(たとえば、EcoRI付着末端オーバーハング)への特異的ハイブリダイゼーションが可能でありうる核酸配列を含みうる。アッセイ手順は、制限部位オーバーハングを生成するために制限酵素(たとえばEcoRI)で標的核酸を処置する工程をさらに含みうる。次いで、確率バーコードは、制限部位オーバーハングに相補的な配列を含む任意の核酸分子にライゲートしうる。リガーゼ(たとえばT4DNAリガーゼ)は2つの断片を連結するために使用しうる。
複数の細胞(または複数のサンプル)の標識標的(たとえば、標的−バーコード分子)は、たとえば、確率バーコードおよび/または標的−バーコード分子が結合されたビーズを回収することにより後続的にプール可能である。結合された標的−バーコード分子の固体担体ベースのコレクションの回収は、磁気ビーズおよび外部印加磁界の使用により実現しうる。標的−バーコード分子をプールした後、すべてのさらなる処理を単一反応槽内で進行させうる。さらなる処理は、たとえば、逆転写反応、増幅反応、切断反応、解離反応、および/または核酸伸長反応を含みうる。さらなる処理反応は、マイクロウェル内で、すなわち、複数の細胞の標識標的核酸分子を最初にプールすることなく、行いうる。
逆転写
本開示は、逆転写を用いて確率標的−バーコードコンジュゲートを生成する方法を提供する。確率標的−バーコードコンジュゲートは、確率バーコードと標的核酸の全部または一部の相補的配列と(すなわち、確率バーコード付きcDNA分子)を含みうる。関連付けられたRNA分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより行いうる。逆転写プライマーは、オリゴdTプライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーでありうる。オリゴdTプライマーは、たとえば、12〜18ヌクレオチド長でありうるとともに、哺乳動物mRNAの3’末端の内因性ポリAテールに結合可能である。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、さまざまな相補的部位でmRNAと結合しうる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には対象のmRNAを選択的にプライミングする。
本開示は、逆転写を用いて確率標的−バーコードコンジュゲートを生成する方法を提供する。確率標的−バーコードコンジュゲートは、確率バーコードと標的核酸の全部または一部の相補的配列と(すなわち、確率バーコード付きcDNA分子)を含みうる。関連付けられたRNA分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより行いうる。逆転写プライマーは、オリゴdTプライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーでありうる。オリゴdTプライマーは、たとえば、12〜18ヌクレオチド長でありうるとともに、哺乳動物mRNAの3’末端の内因性ポリAテールに結合可能である。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、さまざまな相補的部位でmRNAと結合しうる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には対象のmRNAを選択的にプライミングする。
確率バーコード付きcDNA分子は、増幅(たとえば、ユニバーサルおよび/または遺伝子特異的プライマーによる)および本開示のライブラリー正規化方法などの下流方法に供されうる。
キット
本開示のライブラリー正規化方法を実施するためのキットが本明細書に開示される。キットは、結合部分を含む第2の鎖合成プライマーを含みうる。キットは、第2の鎖合成プライマー上の結合部分に結合できる捕捉部分を含む固体担体を含みうる。キットは、固体担体を捕捉する磁石を含みうる。キットは、増幅反応を浄化するための試薬(たとえば、AmpureXPビーズおよび/または精製スピンカラム)を含みうる。キットは、シーケンシングフローセル配列を含むアダプターおよび/またはプライマーを含みうる。キットは、逆転写反応やプライマー伸長反応などの核酸伸長反応を行うために試薬(たとえば、酵素、プライマー、dNTP、NTP、RNアーゼ阻害剤、または緩衝液)をさらに含んでもよい。キットは、増幅反応によりシーケンシングライブラリーを調製するために試薬(たとえば、酵素、ユニバーサルプライマー、シークエンシングプライマー、標的特異的プライマー、または緩衝液)をさらに含んでもよい。
本開示のライブラリー正規化方法を実施するためのキットが本明細書に開示される。キットは、結合部分を含む第2の鎖合成プライマーを含みうる。キットは、第2の鎖合成プライマー上の結合部分に結合できる捕捉部分を含む固体担体を含みうる。キットは、固体担体を捕捉する磁石を含みうる。キットは、増幅反応を浄化するための試薬(たとえば、AmpureXPビーズおよび/または精製スピンカラム)を含みうる。キットは、シーケンシングフローセル配列を含むアダプターおよび/またはプライマーを含みうる。キットは、逆転写反応やプライマー伸長反応などの核酸伸長反応を行うために試薬(たとえば、酵素、プライマー、dNTP、NTP、RNアーゼ阻害剤、または緩衝液)をさらに含んでもよい。キットは、増幅反応によりシーケンシングライブラリーを調製するために試薬(たとえば、酵素、ユニバーサルプライマー、シークエンシングプライマー、標的特異的プライマー、または緩衝液)をさらに含んでもよい。
確率バーコードアッセイを実施するためのキットが本明細書に開示される。キットは、サスペンジョン内の個別の固体担体が本開示の複数の結合された確率バーコードを含む条件で、1つ以上の固体担体サスペンジョン剤を含みうる。キットは、固体担体に結合されていなくてもよい確率バーコードを含みうる。キットは、確率バーコーディングアッセイを行うために、たとえば、溶解緩衝液、濯ぎ緩衝液、またはハイブリダイゼーション緩衝液などの試薬をさらに含んでもよい。キットは、逆転写反応やプライマー伸長反応などの核酸伸長反応を行うために試薬(たとえば、酵素、プライマー、dNTP、NTP、RNアーゼ阻害剤、または緩衝液)をさらに含んでもよい。キットは、増幅反応によりシーケンシングライブラリーを調製するために試薬(たとえば、酵素、ユニバーサルプライマー、シークエンシングプライマー、標的特異的プライマー、または緩衝液)をさらに含んでもよい。
本開示のキットは、一般に、本明細書に記載の方法の1つ以上を行うための説明書を含みうる。キットに含まれる説明書は、パッケージング材料に固定可能であるか、または添付文書として含みうる。説明書は典型的には文書または印刷物であるが、そのように限定されるものではない。かかる説明書を保存してそれをエンドユーザーに伝達すること可能ないずれの媒体も、本開示により企図される。かかる媒体としては、限定されるものではないが、電子記憶媒体(たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(たとえば、CD ROM)、RFタグなどが挙げられる。本明細書で用いられる場合、「説明書」という用語は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含みうる。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されたが、そのような実施形態が単なる例示として提供されることは、当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実施において採用されうることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内の方法および構造が特許請求の範囲に包含されることが意図される。
実施例1:ネステッドPCRを用いたライブラリー正規化
本実施例は、ネステッドPCRを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ライブラリーは熱変性される。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。
本実施例は、ネステッドPCRを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ライブラリーは熱変性される。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。
部分的に再アニールされたライブラリーは、ストレプトアビジン部分を含む固体担体と接触させることができる。ストレプトアビジンは、ライブラリーの鎖上のビオチン部分に結合することができる。再アニールされたアンプリコンはビオチンを含み、ストレプトアビジンによって除去される。ビオチンを含む再アニールされなかった鎖もストレプトアビジンによって除去される。残りの鎖は、存在量がより低く、ビオチンを有する鎖の相補鎖である配列に相当する。これらの鎖は、正規化ライブラリーに相当する。
ライブラリーはPCRプライマーで再生される。PCRプライマーは、シーケンシングフローセルプライマー配列を含みうる。正規化ライブラリーがシーケンスされる。
実施例2:全トランスクリプトーム増幅によるライブラリー正規化
ライブラリー正規化は、全トランスクリプトーム増幅から生成されたライブラリーで実施されうる。全トランスクリプトーム増幅は、アダプターライゲーション方法を用いて実施されうる。標的はポリAテールを含む。標的はmRNAである。標的は確率バーコードにハイブリダイズする。確率バーコードは、多数の標識を含む。たとえば、確率バーコードは、標的特異的領域(たとえば、mRNAのポリAテールに結合するためのオリゴdT)、分子標識、細胞標識、および第1のユニバーサル標識を含む。確率バーコードは、逆転写酵素を用いて逆転写され、それにより標識cDNA分子を生成する。過剰な確率バーコードは、分解酵素で処理される。分解酵素は、エキソヌクレアーゼである。
ライブラリー正規化は、全トランスクリプトーム増幅から生成されたライブラリーで実施されうる。全トランスクリプトーム増幅は、アダプターライゲーション方法を用いて実施されうる。標的はポリAテールを含む。標的はmRNAである。標的は確率バーコードにハイブリダイズする。確率バーコードは、多数の標識を含む。たとえば、確率バーコードは、標的特異的領域(たとえば、mRNAのポリAテールに結合するためのオリゴdT)、分子標識、細胞標識、および第1のユニバーサル標識を含む。確率バーコードは、逆転写酵素を用いて逆転写され、それにより標識cDNA分子を生成する。過剰な確率バーコードは、分解酵素で処理される。分解酵素は、エキソヌクレアーゼである。
標識されたcDNA分子は、第2の鎖の合成を起こし、それにより二本鎖の標識されたcDNA分子を生成する。第2の鎖の合成は、標識されたcDNA分子−mRNAハイブリッドを、標識されたcDNA分子にハイブリダイズしたmRNAをニックすることができるニッキング酵素(たとえばRNaseH)と接触させることにより行われ、それによりニックの入ったmRNAを生成する。ニックの入ったmRNAをプライマーとして使用し、ポリメラーゼ(たとえば、DNAポリメラーゼI)を用いて伸長させ、それにより第1の鎖の配列を組み込む。ポリメラーゼは、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性を含む。ポリメラーゼは、第2の鎖の合成のためのプライマーとして働く下流mRNAニックを分解する。リガーゼを用いて伸長した配列を一緒にライゲートし、それにより第2の鎖(たとえば、二本鎖標識cDNA分子)を生成する。
二本鎖標識cDNA分子は、第1のユニバーサル標識に相補的な配列を含む。二本鎖標識cDNA分子をアダプターと接触させる。アダプターは二本鎖である。アダプターは、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む。アダプターは、第2のユニバーサルプライマー配列(第1のものと同じもの)を含む。アダプターは、3’オーバーハングを含む。アダプターは、二本鎖標識cDNA分子の3’ヒドロキシルにライゲートしうる遊離5’リン酸(P)を含む。アダプターは、二本鎖標識cDNA分子1558の両方の鎖にライゲートする。
生成物は、1つ以上のWTA増幅プライマーを使用して増幅される。WTA増幅プライマーの1つは、ビオチン部分を含む。WTA増幅プライマーの1つは、ビオチン部分を含まない。生成物は、一方の鎖が線形増幅され、一方の鎖が指数関数的増幅されるように増幅される。線形増幅された鎖は、一方の末端に増幅可能なユニバーサル配列を含む。指数関数的増幅が可能な鎖は、両末端にユニバーサル配列を含み、その一方の末端はビオチン部分を含む。WTA増幅による生成物は、実施例1に記載したようにライブラリー正規化プロトコルに供される。
実施例3:ライブラリー正規化におけるブロッカーの使用
本実施例は、ブロッカーを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅される。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ブロッカーがライブラリーに追加される。ライブラリーは熱変性される。ブロッカーは、アンプリコンのユニバーサル標識に結合する。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。部分的な再アニーリングは、プライマー中の任意の配列(たとえば、分子、サンプル、ユニバーサル標識)よりも、標的配列によって、より多く進められる。
本実施例は、ブロッカーを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅される。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ブロッカーがライブラリーに追加される。ライブラリーは熱変性される。ブロッカーは、アンプリコンのユニバーサル標識に結合する。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。部分的な再アニーリングは、プライマー中の任意の配列(たとえば、分子、サンプル、ユニバーサル標識)よりも、標的配列によって、より多く進められる。
部分的に再アニールしたライブラリーを、ストレプトアビジン部分を含む固体担体と接触させる。ストレプトアビジンは、ライブラリーの鎖上のビオチン部分に結合することができる。再アニールされたアンプリコンはビオチンを含み、ストレプトアビジンによって除去される。ビオチンを含む再アニールされなかった鎖もストレプトアビジンによって除去される。残りの鎖は、存在量がより低く、ビオチンを有する鎖の相補鎖である配列に相当する。これらの鎖は、正規化ライブラリーに相当する。
ライブラリーはPCRプライマーで再生される。PCRプライマーは、シーケンシングフローセルプライマー配列を含みうる。正規化ライブラリーがシーケンスされる。
実施例4:固体担体上のライブラリー正規化
本実施例は、固体担体を用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、アジドまたはアルキン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびアジドまたはアルキン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にアジドまたはアルキン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。
本実施例は、固体担体を用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、アジドまたはアルキン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびアジドまたはアルキン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にアジドまたはアルキン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。
ライブラリーは、クリックケミストリーを使用して固体担体に結合される。固体担体は、クリックケミストリーに関与する相補的分子を含む。たとえば、アンプリコンがアルキンを含む場合、固体担体はアジドを含む。ライブラリーは熱変性される。いくつかの場合には、ブロッカーが導入される。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。
再アニールされたアンプリコンは、クリックケミストリーを介して固体担体に結合される。固体担体は(たとえば、遠心分離または磁気によって)除去される。残りの鎖(たとえば、再アニールされなかったもの)は、アジドまたはアルキン部分を含まない。残りの鎖は、存在量がより低く、アジドまたはアルキンを有する鎖の相補鎖である配列に相当する。これらの鎖は、正規化ライブラリーに相当する。
ライブラリーはPCRプライマーで再生される。PCRプライマーは、シーケンシングフローセルプライマー配列を含みうる。正規化ライブラリーがシーケンスされる。
以上に記載の実施形態の少なくともいくつかでは、実施形態で使用される1つ以上のエレメントは、他の実施形態で互換的に使用可能である。ただし、かかる交換が技術的に実現可能である場合に限る。特許請求された主題の範囲から逸脱することなく、以上に記載の方法および構造に種々の他の省略、追加、および変更を行いうることは、当業者であれば分かるであろう。かかる変更および変化はすべて、添付の特許請求の範囲に規定される主題の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に記載の実質的に任意の複数形および/または単数形の用語の使用に関連して、文脈上および/または適用上適切であれば、当業者は複数形から単数形へおよび/または単数形から複数形への変換が可能である。明確にするために種々の単数形/複数形の入替えを本明細書に明示的に記述しうる。
一般的には、本明細書とくに添付の特許請求の範囲(たとえば添付の特許請求の範囲の本文)で用いられる用語は「オープン」用語であることが一般に意図されることは当業者であれば理解されよう(たとえば、「including(〜を含む)」という用語は「〜を含むがこれらに限定されるものではない」と解釈すべきであり、「having(〜を有する)」という用語は「少なくとも〜を有する」と解釈すべきであり、「includes(〜を含む)」という用語は「〜を含むがこれらに限定されるものではない」と解釈すべきであるなど)。さらに、導入クレームレシテーションの特定数が意図される場合、かかる意図は請求項で明示的にリサイトされ、かかるレシテーションの不在下ではかかる意図は存在しないことは当業者であれば理解されようたとえば、理解の一助として、以下の添付の特許請求の範囲は、クレームレシテーションを導入するために導入語句「at least one(少なくとも1つ)」および「one or more(1つ以上)」の使用を含みうる。しかしながら、かかる語句が用いられたとしても、不定冠詞「a」または「an」によるクレームレシテーションの導入が、かかる導入クレームレシテーションを含む任意の特定の請求項を、一方のかかるレシテーションを含む実施形態のみに限定することを意味するものと解釈すべきでない。たとえ同一の請求項が導入語句「one or more(1つ以上)」または「at least one(少なくとも1つ)」と不定冠詞たとえば「a」または「an」とを含む場合でさえも、そのように解釈すべきでない(たとえば、「a」および/または「an」は「at least one(少なくとも1つ)」または「one or more(1つ以上)」を意味するものと解釈すべきである)。定冠詞を用いてクレームレシテーションを導入する場合にも、同じことが当てはまる。そのほかに、たとえ特定数の導入クレームレシテーションが明示的にリサイトされたとしても、かかるレシテーションは少なくともリサイトされた数を意味すると解釈すべきであることは当業者であれば分かるであろう(たとえば、「2つのレシテーション」という他の修飾語を含まないベアのレシテーションは、少なくとも2つのレシテーションまたは2つ以上レシテーションを意味する)。さらに、「A、B、およびCの少なくとも1つ」に類似した条件が用いられる場合、一般的には、かかる構成は当業者がその条件を理解する意味であることが意図される(たとえば、「A、B、およびCの少なくとも1つを有する系」は、限定されるものではないが、A単独、B単独、C単独、AとBの両方、AとCの両方、BとCの両方、および/またはAとBとCの全部などを有する系を含であろう)。「A、B、またはCの少なくとも1つなど」に類似した条件が用いられる場合、一般的には、かかる構成は当業者がその条件を理解する意味であることが意図される(たとえば、「A、B、またはCの少なくとも1つを有する系」は、限定されるものではないが、A単独、B単独、C単独、AとBの両方、AとCの両方、BとCの両方、および/またはAとBとCの全部などを有する系を含であろう)。さらに、2つ以上の代替用語を表す実質上任意の選言的な語および/または語句は、明細書、請求項、または図面にかかわらず、用語の1つ、用語のいずれか、または用語の両方を含む可能性が企図されると理解すべきであることは当業者であれば理解されよう。たとえば、「AまたはB」という語句は「A」または「B」または「AおよびB」の可能性を含むものと理解されよう。
そのほかに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループにより記述される場合、それにより、本開示は、マーカッシュグループの任意の個別のメンバーまたはメンバーのサブグループにより記述されることは当業者であれば分かるであろう。
当業者であれば理解されるであろうが、あらゆる目的で、たとえば、明細書の提供に関して、本明細書に開示された範囲はすべて、あらゆる可能なサブ範囲およびそのサブ範囲の組合せをも包含する。いずれの列挙された範囲も、十分に記述されたものとしてかつその範囲が少なくとも2等分、3等分、4等分、5等分、10等分などされうるものとして容易に認識可能である。たとえば、限定されるものではないが、本明細書で考察した各範囲は、下3分の1、中3分の1、上3分の1に容易に分解可能である。同様に、当業者であれば理解されるであろうが、「〜まで」、「少なくとも〜」、「〜超」、「〜未満」などの表現はすべて、リサイトされた数を含み、以上で考察したように後続的にサブ範囲に分解可能な範囲を意味する。最終的に、当業者であれば理解されるであろうが、範囲は各個別のメンバーを含む。したがって、たとえば、1〜3個の物品を有するグループは、1、2、または3個の物品を有するグループを意味する。同様に、1〜5個の物品を有するグループは、1、2、3、4、または5個の物品を有するグループを意味し、他も同様である。
Claims (113)
- 結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、少なくとも1つの高存在種を含む第1の複数の核酸分子とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長して結合部分を含む、前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記第1の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記第1の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
1つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記第1の複数の核酸分子に対する前記再アニールされた相補鎖を除去して第2の複数の核酸分子を生成すること、を含み、
第2の複数の核酸分子中の少なくとも1つの高存在種の含有量は、第1の複数の核酸分子中の少なくとも1つの高存在種の含有量と比較して減少する、
複数の核酸分子から高存在種を除去する方法。 - 前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、請求項1に記載の方法。
- 前記結合部分がビオチンである、請求項2に記載の方法。
- 前記捕捉分子がストレプトアビジンである、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖の少なくとも1つにつき第2の鎖を合成して、前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、1つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成が、複数の第2のオリゴヌクレオチドを前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子が、複数の高存在種を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも50%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも60%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも70%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも80%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも90%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも95%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも99%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子が、前記複数の高存在種を含む、請求項9〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の50%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の40%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の30%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子が、複数の低存在種を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の10%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の5%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の1%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子が、前記複数の低存在種を含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも5%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも10%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも20%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子のそれぞれまたは前記第2の複数の核酸分子のそれぞれが、確率バーコードを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子をシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの50%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの40%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの30%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも5%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも10%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも20%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、請求項37に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、請求項38に記載の方法。
- 結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
1つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。 - 前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、請求項40に記載の方法。
- 前記結合部分がビオチンである、請求項41に記載の方法。
- 前記捕捉分子がストレプトアビジンである、請求項42に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖の1つ以上につき第2の鎖を合成して、前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、1つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成が、複数の第2のオリゴヌクレオチドを前記複数の標的核酸の前記複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、複数の低存在標的核酸を含む、請求項40〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の10%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の5%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の1%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の低存在標的核酸を含む、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも5%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも10%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも20%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、複数の高存在標的核酸を含む、請求項40〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも50%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも60%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも70%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも80%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも90%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも95%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも99%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の高存在標的核酸を含む、請求項56〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の50%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の40%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の30%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、確率バーコードを含む、請求項40〜67に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリーをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、請求項40〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの50%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの40%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの30%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも5%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも10%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも20%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、請求項40〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、請求項76に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、請求項77に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、mRNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、ミトコンドリアmRNAを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、リボソームタンパク質mRNAを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない7,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない4,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない2,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドが、標的特異的プライマーを含む、請求項40〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドが、標的非特異的プライマーを含む、請求項40〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、cDNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、ゲノムDNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、短いタンデム反復配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、テロメア配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、セントロメア配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、単一細胞由来である、請求項40〜91のいずれか一項に記載の方法。
- 非正規化核酸ライブラリーにおいて、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。 - 前記非正規化核酸ライブラリーが、1つ以上の高存在標的核酸および1つ以上の低存在標的核酸を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも50%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも60%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも70%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも80%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも90%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも95%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも99%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの10%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの5%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの1%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも5%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも10%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも20%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの50%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの40%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの30%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーがcDNAライブラリーである、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーがゲノムライブラリーである、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーが単一細胞核酸ライブラリーである、請求項93〜112のいずれか一項に記載の方法。
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