JP2018530998A - ライブラリー正規化のための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年9月11日出願の米国仮特許出願第62/217,220号明細書に基づき、その米国特許法第119条(e)の利益を主張する。関連出願の内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
とくに定義がない限り、本明細書で用いられる技術用語はすべて、本開示が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、とくに文脈上明確に規定されていない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」には、複数の参照語が包含される。本明細書での「or(または)」の意味はいずれも、とくに明記されていない限り、「and/or(および/または)」を包含することが意図される。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、複数の核酸分子から高存在種を除去する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種または中存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種の含有量を減少させることができる。本明細書で用いられる場合、「有意に除去する」とは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%またはそれ以上の低存在種または中存在種を複数の核酸分子から除去することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、複数の核酸分子から低存在種を有意に除去することなく、複数の核酸分子から高存在種および中存在種を除去することができる。
本明細書に開示される複数の核酸分子は、様々な核酸分子を含みうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、DNA分子、RNA分子、ゲノムDNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、siRNA分子、またはそれらの組み合わせを含むことができ、二本鎖または一本鎖でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、少なくとも100、少なくとも1,000、少なくとも10,000、少なくとも20,000、少なくとも30,000、少なくとも40,000、少なくとも50,000、少なくとも100,000、少なくとも1,000,000、またはそれ以上の種を含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、単一細胞または複数の細胞などのサンプル由来でありうる。いくつかの実施形態では、複数の核酸分子は、複数の単一細胞などの複数のサンプルからプールすることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される方法は、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを複数の核酸分子とハイブリダイズさせることを含む。様々な結合部分が、本明細書に開示される方法および組成物に使用されうる。たとえば、結合部分は、結合対の一部であってもよい。いくつかの実施形態では、結合部分は、オリゴヌクレオチドに付加される官能基でありうる。いくつかの実施形態では、結合部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、またはそれらの任意の組み合わせでありうる。
いくつかの実施形態では、高存在種の含有量を減少させることは、後に二本鎖核酸分子の部分的な再アニーリングが続く、変性を含んでもよく、その後、1つ以上の固体担体上に固定された、結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、複数の標的核酸に対する再アニールされた相補鎖を除去することが続く。
本開示は、ライブラリー正規化のための方法を提供する。本開示の方法は、核酸サンプルに対して行うことができる。核酸サンプルは、核酸を含みうる。サンプルは、本開示のサンプル由来であってもよい。サンプルは、単一細胞であってもよい(たとえば、核酸サンプルは単一細胞からの核酸であってもよい)。核酸サンプルは、RNA、DNA、またはRNAおよびDNAの両方を含みうる。サンプルの核酸は、一本鎖、二本鎖、または一本鎖および二本鎖の両方の混合物であってもよい。いくつかの場合には、サンプルの核酸の全てまたは大部分が一本鎖である。
非正規化ライブラリー(たとえば、標的核酸cDNAを含む)は、変性されうる。変性は、サンプルを加熱すること、サンプルを有機溶媒(たとえば、DMSまたはホルムアミド)で処理すること、サンプルの塩濃度を変化させること、および/またはサンプルのpHを変化させることを含む、様々な方法で行われうる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、変性および部分的な再アニーリングにおけるブロッカーの使用を提供する。本明細書で用いられる場合、ブロッカーは、ライブラリーのユニバーサル配列(たとえば、ユニバーサルプライマー配列、ユニバーサルシーケンシングフローセル配列)にハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド配列を示す。ブロッカーは、遺伝子配列を考慮することなく、それらのユニバーサル領域を介した部分的な再アニーリングにおいて、標的/アンプリコンが異なる遺伝子と一緒にアニールするのを防ぐのに使用しうる。
核酸増幅反応は、正規化標的核酸分子の複数のコピーを生成するために1回以上行いうる。増幅は、複数の標的核酸配列が同時に増幅される条件で、多重方式で行いうる。増幅反応は、核酸分子にシーケンシングアダプターを付加するために使用しうる。増幅反応は、存在するのであればサンプル標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、細胞および/または分子標識の少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、サンプルタグ、細胞標識、空間標識、分子標識、標的核酸、またはそれらの組合せの少なくとも一部を増幅する工程を含みうる。増幅反応は、複数の核酸の少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、または100%を増幅する工程を含みうる。本方法は、サンプル標識、細胞標識、空間標識、および/または分子標識を含む標的−バーコード分子のcDNAコピーを1つ以上生成するためにcDNA合成反応を1回以上行う工程をさらに含みうる。
非正規化ライブラリー(または正規化ライブラリー)の一本鎖分子は、たとえば、二本鎖分子の生成およびフローセルシーケンシングアダプターの組み込み(たとえば、ライゲーションおよび/またはハイブリダイゼーション、ならびにPCRによって)を含みうる、シーケンシングのために調整されうる。
異なる確率標識核酸の数を決定する工程は、標識標的、空間標識、分子標識、サンプル標識、および細胞標識、または任意の産物(たとえば、標識アンプリコン、標識cDNA分子)の配列を決定する工程を含みうる。増幅標的はシーケンシングに供されてもよい。確率標識核酸またはその任意の産物の配列を決定する工程は、サンプル標識、空間標識、細胞標識、分子標識の少なくとも一部、および/または確率標識標的の少なくとも一部、それらの相補体、それらの逆相補体、またはそれらの任意の組合せの配列を決定するためにシーケンシング反応を行なう工程を含みうる。
本明細書に使用される確率バーコードは、標的に確率標識(たとえば、バーコード、タグ)を付けるために使用しうるポリヌクレオチド配列を示す。確率バーコードは1つ以上の標識を含みうる。例示的な標識としては、限定されるものではないが、ユニバーサル標識、細胞標識、分子標識、サンプル標識、プレート標識、空間標識、および/またはプレ空間標識が挙げられる。確率バーコードは、当該確率バーコードを固体担体に結合しうる5’アミンを含みうる。確率バーコードは、1つ以上のユニバーサル標識、1つ以上の次元標識、1つ以上の空間標識、1つ以上の細胞標識、および/または1つ以上の分子標識を含みうる。確率バーコード内のそれぞれの様々な標識の位置は異なりうる。たとえば、ユニバーサル標識は最も5’側の標識でありうる。分子標識は最も3’側の標識でありうる。空間標識、次元標識、および細胞標識は任意の順序でありうる。いくつかの実施形態では、ユニバーサル標識、空間標識、次元標識、細胞標識、および分子標識は任意の順序である。確率バーコードは標的結合領域を含みうる。標的結合領域は、サンプル中の標的(たとえば、標的核酸、RNA、mRNA、DNA)と相互作用可能である。たとえば、標的結合領域は、mRNAのポリAテールと相互作用可能なオリゴdT配列を含みうる。いくつかの場合には、確率バーコードの標識(たとえば、ユニバーサル標識、次元標識、空間標識、細胞標識、および分子標識)は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20ヌクレオチドまたはそれ以上分離しうる。
本明細書に開示される確率バーコードは、固体担体(たとえば、ビーズ、基材)に結合されてもよい。本明細書で用いられる場合、「テザー連結」、「結合」、および「固定」という用語は、同義的に用いられて、確率バーコードを固体担体に結合するための共有結合または非共有結合の手段を意味しうる。さまざまな異なるいずれの固体担体も、プレ合成された確率バーコードを結合するためのまたは確率バーコードをin situ固相合成するための固体担体として使用しうる。
本明細書に記載のように、複数の核酸分子は、サンプル、たとえば細胞サンプルから得られうるか、またはそれ由来でありうる。本開示の方法に使用されるサンプルは1細胞以上を含みうる。サンプルとは1細胞以上を意味しうる。いくつかの実施形態では、細胞は、癌組織、たとえば、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、脳癌、黒色腫、非黒色腫皮膚癌などから摘出された癌細胞である。いくつかの場合には、細胞は、癌に由来するが体液から採取される(たとえば循環腫瘍細胞)。癌の例としては、限定されるものではないが、腺腫、腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、小細胞癌、大細胞未分化癌、軟骨肉腫、および線維肉腫が挙げられる。
本開示は、サンプルのライブラリー正規化のための方法を提供する。ライブラリー正規化の方法は、任意のライブラリーサンプル調製方法と組み合わせることができる。ライブラリー正規化の方法は、本発明の確率バーコーディング方法と組み合わせることができる。確率バーコーディングは、特定の標的分子を追跡および/または計数することができるように、固有のバーコードを有する個々の核酸分子(たとえば、mRNA分子)をインデックスするために使用することができる。
たとえば、細胞、器官、または組織薄片を含むサンプルは、確率バーコードに接触可能である。固体担体は浮動性でありうる。固体担体は半固体または固体のアレイに埋込み可能である。確率バーコードは固体担体に関連付け可能である。確率バーコードは個別のヌクレオチドでありうる。確率バーコードは基材に関連付け可能である。確率バーコードが標的にごく近接している場合、標的は確率バーコードにハイブリダイズ可能である。確率バーコードは、各識別可能な標的を本開示の識別可能な確率バーコードに関連付けできるように非枯渇比で接触可能である。標的と確率バーコードとの効率的関連付けを保証するために、標的は確率バーコードに架橋可能である。
細胞および確率バーコードの分配後、細胞は標的分子を遊離するように溶解可能である。細胞溶解は、さまざまな手段のいずれかにより、化学的もしくは生化学的手段により、浸透圧ショックにより、または熱溶解、機械溶解、もしくは光学溶解により達成しうる。細胞は、界面活性剤(たとえば、SDS、Liドデシルスルフェート、Triton X−100、Tween−20、もしくはNP−40)、有機溶媒(たとえば、メタノールもしくはアセトン)、または消化酵素(たとえば、プロテイナーゼK、ペプシンまたはトリプシン)、あるいはそれらの任意の組合せを含む細胞溶解緩衝液の添加により溶解しうる。標的と確率バーコードとの関連付けを向上させるために、たとえば、温度の低下および/またはライセートの粘度の増加により、標的分子の拡散速度を変化させることが可能である。
細胞の溶解およびそれからの核酸分子の放出の後、核酸分子は、共局在化された固体担体の確率バーコードにランダムに関連付けうる。関連付けは、たとえば、標的核酸分子の相補的部分への確率バーコードの標的認識領域のハイブリダイゼーションを含みうる(たとえば、確率バーコードのオリゴdTは、標的のポリAテールと相互作用可能である)。ハイブリダイゼーションに使用されるアッセイ条件(たとえば、緩衝液pH、イオン強度、温度など)は、特定の安定なハイブリッドの形成を促進するように選択可能である。
本開示は、逆転写を用いて確率標的−バーコードコンジュゲートを生成する方法を提供する。確率標的−バーコードコンジュゲートは、確率バーコードと標的核酸の全部または一部の相補的配列と(すなわち、確率バーコード付きcDNA分子)を含みうる。関連付けられたRNA分子の逆転写は、逆転写酵素と共に逆転写プライマーを添加することにより行いうる。逆転写プライマーは、オリゴdTプライマー、ランダムヘキサヌクレオチドプライマー、または標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーでありうる。オリゴdTプライマーは、たとえば、12〜18ヌクレオチド長でありうるとともに、哺乳動物mRNAの3’末端の内因性ポリAテールに結合可能である。ランダムヘキサヌクレオチドプライマーは、さまざまな相補的部位でmRNAと結合しうる。標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には対象のmRNAを選択的にプライミングする。
本開示のライブラリー正規化方法を実施するためのキットが本明細書に開示される。キットは、結合部分を含む第2の鎖合成プライマーを含みうる。キットは、第2の鎖合成プライマー上の結合部分に結合できる捕捉部分を含む固体担体を含みうる。キットは、固体担体を捕捉する磁石を含みうる。キットは、増幅反応を浄化するための試薬(たとえば、AmpureXPビーズおよび/または精製スピンカラム)を含みうる。キットは、シーケンシングフローセル配列を含むアダプターおよび/またはプライマーを含みうる。キットは、逆転写反応やプライマー伸長反応などの核酸伸長反応を行うために試薬(たとえば、酵素、プライマー、dNTP、NTP、RNアーゼ阻害剤、または緩衝液)をさらに含んでもよい。キットは、増幅反応によりシーケンシングライブラリーを調製するために試薬(たとえば、酵素、ユニバーサルプライマー、シークエンシングプライマー、標的特異的プライマー、または緩衝液)をさらに含んでもよい。
本実施例は、ネステッドPCRを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ライブラリーは熱変性される。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。
ライブラリー正規化は、全トランスクリプトーム増幅から生成されたライブラリーで実施されうる。全トランスクリプトーム増幅は、アダプターライゲーション方法を用いて実施されうる。標的はポリAテールを含む。標的はmRNAである。標的は確率バーコードにハイブリダイズする。確率バーコードは、多数の標識を含む。たとえば、確率バーコードは、標的特異的領域(たとえば、mRNAのポリAテールに結合するためのオリゴdT)、分子標識、細胞標識、および第1のユニバーサル標識を含む。確率バーコードは、逆転写酵素を用いて逆転写され、それにより標識cDNA分子を生成する。過剰な確率バーコードは、分解酵素で処理される。分解酵素は、エキソヌクレアーゼである。
本実施例は、ブロッカーを用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、ビオチン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびビオチン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅される。この反応は、一方の末端にビオチン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。ブロッカーがライブラリーに追加される。ライブラリーは熱変性される。ブロッカーは、アンプリコンのユニバーサル標識に結合する。ライブラリーを冷却して、部分的な再アニーリングを誘導する。部分的な再アニーリングにおいて、高存在のアンプリコンは、より低存在のアンプリコンより速く再アニールする。部分的な再アニーリングは、プライマー中の任意の配列(たとえば、分子、サンプル、ユニバーサル標識)よりも、標的配列によって、より多く進められる。
本実施例は、固体担体を用いたライブラリー正規化のための方法を提供する。オリゴdT配列、分子標識、サンプル標識およびユニバーサル標識を含むプライマーを用いて、複数のmRNAが複数のcDNAに逆転写される。cDNAは、遺伝子特異的リバースプライマーおよびユニバーサルプライマー(たとえば、ユニバーサル標識に結合するもの)を使用して第1の増幅反応で増幅され、それによりアンプリコンの第1のセットを生成する。ユニバーサルプライマーは、アジドまたはアルキン部分を含みうる。アンプリコンの第1のセットは、第2の遺伝子特異的ネステッドPCRプライマーおよびアジドまたはアルキン部分を含むユニバーサルプライマーを用いて、第2の増幅反応において増幅されうる。この反応は、一方の末端にアジドまたはアルキン部分を含む、非対称に標識されたアンプリコンを生成する。
Claims (113)
- 結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、少なくとも1つの高存在種を含む第1の複数の核酸分子とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長して結合部分を含む、前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記第1の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記第1の複数の核酸分子に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
1つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記第1の複数の核酸分子に対する前記再アニールされた相補鎖を除去して第2の複数の核酸分子を生成すること、を含み、
第2の複数の核酸分子中の少なくとも1つの高存在種の含有量は、第1の複数の核酸分子中の少なくとも1つの高存在種の含有量と比較して減少する、
複数の核酸分子から高存在種を除去する方法。 - 前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、請求項1に記載の方法。
- 前記結合部分がビオチンである、請求項2に記載の方法。
- 前記捕捉分子がストレプトアビジンである、請求項3に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖の少なくとも1つにつき第2の鎖を合成して、前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖を含む、1つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成が、複数の第2のオリゴヌクレオチドを前記第1の複数の核酸分子に対する複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子が、複数の高存在種を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも50%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも60%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種が、前記第1の複数の核酸分子の少なくとも70%に相当する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも80%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも90%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも95%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの高存在種の含有量の減少が、少なくとも99%である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子が、前記複数の高存在種を含む、請求項9〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の50%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の40%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の高存在種が、前記第2の複数の核酸分子の30%未満に相当する、請求項17に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子が、複数の低存在種を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の10%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の5%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記複数の低存在種が、前記第1の複数の核酸分子の1%未満に相当する、請求項21に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子が、前記複数の低存在種を含む、請求項21〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも5%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも10%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子中の前記複数の低存在種が、前記第2の複数の核酸分子の少なくとも20%に相当する、請求項25に記載の方法。
- 前記第1の複数の核酸分子のそれぞれまたは前記第2の複数の核酸分子のそれぞれが、確率バーコードを含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の複数の核酸分子をシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの50%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの40%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の高存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの30%未満である、請求項30に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも5%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも10%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在種の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも20%である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、請求項37に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、請求項38に記載の方法。
- 結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを、複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
1つ以上の固体担体上に固定された、前記結合部分に特異的に結合する捕捉分子によって、前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。 - 前記結合部分が、ビオチン、ストレプトアビジン、ヘパリン、アプタマー、クリックケミストリー部分、ジゴキシゲニン、第1級アミン、カルボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、ケトン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される官能基である、請求項40に記載の方法。
- 前記結合部分がビオチンである、請求項41に記載の方法。
- 前記捕捉分子がストレプトアビジンである、請求項42に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖の1つ以上につき第2の鎖を合成して、前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、1つ以上の前記複数の二本鎖核酸分子を生成することをさらに含む、請求項40〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成が、複数の第2のオリゴヌクレオチドを前記複数の標的核酸の前記複数の相補鎖にハイブリダイズさせ、前記複数の第2のオリゴヌクレオチドを伸長させることを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドがユニバーサルプライマー結合部位を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記複数の二本鎖核酸分子を増幅することをさらに含む、請求項44〜46のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、複数の低存在標的核酸を含む、請求項40〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の10%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の5%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の1%未満に相当する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の低存在標的核酸を含む、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも5%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも10%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の少なくとも20%に相当する、請求項52に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、複数の高存在標的核酸を含む、請求項40〜55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも50%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも60%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸が、前記複数の標的核酸の少なくとも70%に相当する、請求項56に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも80%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも90%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも95%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在種の含有量が、少なくとも99%減少する、請求項56〜59に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸の前記正規化核酸ライブラリーが、前記複数の高存在標的核酸を含む、請求項56〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の50%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の40%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリー中の前記複数の標的核酸の30%未満に相当する、請求項64に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドのそれぞれまたは前記複数の第2のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、確率バーコードを含む、請求項40〜67に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリーをシーケンシングして複数のシーケンシングリードを生成することをさらに含む、請求項40〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの50%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの40%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の高存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの30%未満である、請求項69に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも5%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも10%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の低存在標的核酸の前記シーケンシングリードが、全シーケンシングリードの少なくとも20%である、請求項69〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記部分的な再アニーリング工程中に複数のブロッカーを追加することをさらに含む、請求項40〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位にハイブリダイズする、請求項76に記載の方法。
- 前記複数のブロッカーが、前記第1のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位または前記第2のオリゴヌクレオチドのユニバーサルプライマー結合部位とその相補配列との間のハイブリダイゼーションを妨げる、請求項77に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、mRNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、ミトコンドリアmRNAを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、リボソームタンパク質mRNAを含む、請求項79に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない7,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない4,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記低存在標的核酸が、転写物の数が最も少ない2,000個の遺伝子を含む、請求項79〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドが、標的特異的プライマーを含む、請求項40〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の第1のオリゴヌクレオチドが、標的非特異的プライマーを含む、請求項40〜84のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、cDNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、ゲノムDNAを含む、請求項40〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、短いタンデム反復配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、テロメア配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記高存在標的核酸が、セントロメア配列を含む、請求項88に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が、単一細胞由来である、請求項40〜91のいずれか一項に記載の方法。
- 非正規化核酸ライブラリーにおいて、結合部分を含む複数の第1のオリゴヌクレオチドを複数の標的核酸とハイブリダイズさせること、
前記複数の第1のオリゴヌクレオチドを伸長させて、前記結合部分を含む、前記複数の標的核酸に対する複数の相補鎖を生成すること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を含む、複数の二本鎖核酸分子を変性させること、
前記複数の標的核酸に対する前記複数の相補鎖を部分的に再アニールすること、および
前記複数の標的核酸に対する前記再アニールされた相補鎖を除去すること、を含み、
前記複数の標的核酸の正規化核酸ライブラリーが生成される、
正規化核酸ライブラリーの生成方法。 - 前記非正規化核酸ライブラリーが、1つ以上の高存在標的核酸および1つ以上の低存在標的核酸を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも50%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも60%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの少なくとも70%に相当する、請求項94に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも80%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも90%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも95%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記正規化核酸ライブラリー中の前記1つ以上の高存在標的核酸の含有量が、少なくとも99%減少する、請求項94〜97のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの10%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの5%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記非正規化核酸ライブラリーの1%未満に相当する、請求項94〜101のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも5%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも10%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の低存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの少なくとも20%に相当する、請求項94〜104のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの50%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの40%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の高存在標的核酸が、前記正規化核酸ライブラリーの30%未満に相当する、請求項94〜107のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーがcDNAライブラリーである、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーがゲノムライブラリーである、請求項93〜110のいずれか一項に記載の方法。
- 前記非正規化核酸ライブラリーが単一細胞核酸ライブラリーである、請求項93〜112のいずれか一項に記載の方法。
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