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Description
最終バルク溶液はバイアルに充填されて、使用時まで−２０℃で保存される。１本のバイアルは、０．５７８ｍｇの各ペプチドを含有する７００μＬの溶液を含有する。この内、５００μＬ（ペプチドあたりおよそ４００μｇ）が、皮内注射のために適用される。
４×１２．５ｎｇの異なるビオチンｐＭＨＣ存在下で、８００，０００個のビーズ／２００μｌが９６ウェルプレート内で被覆され、洗浄されて、引き続いて２００μｌの容量中で、６００ｎｇのビオチン抗ＣＤ２８が添加された。５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を添加した２００μｌのＴＣＭ中で、１×１０６のＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０ ５個の洗浄被覆ビーズと、３７℃で３日間にわたり同時インキュベートすることで、９６ウェルプレート内で刺激が開始された。次に８０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加した新鮮ＴＣＭで培地の半分を交換し、３７℃で４日間にわたり培養が継続された。この刺激サイクルが、合計３回実施された。条件あたり８種の異なるｐＭＨＣ分子を使用するｐＭＨＣ多量体読み取りでは、５種の異なる蛍光色素への共役を包含するわずかな修正を加えて、以前記載されたような（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）二次元コンビナトリアルコーディングアプローチが使用された。最後に、Ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ近赤外染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＣＤ８−ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１（ＢＤ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および蛍光性ｐＭＨＣ多量体による細胞の染色によって多量体解析が実施された。解析では、適切なレーザーおよびフィルターを装着したＢＤ ＬＳＲＩＩ ＳＯＲＰ血球計数器が使用された。ペプチド特異的細胞は、全ＣＤ８＋細胞の百分率として計算された。多量体解析の評価は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して実施された。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球の生体外初回刺激は、陰性対照刺激と比較することで検出された。１人の健常ドナーの少なくとも１つの評価可能生体外刺激ウェルが、生体外刺激後に、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株を含有することが認められれば、所与の抗原の免疫原性が検出された（すなわちこのウェルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞中の特異的多量体＋の少なくとも１％を含有し、特異的多量体＋細胞の百分率は、負の制御刺激の中央値の少なくとも１０倍であった）。
Claims (39)
- 配列番号３０および配列番号３０と少なくとも８８％相同的なその変異配列、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０、および配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０と少なくとも８８％相同的なその変異配列の群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドであって、前記変異体が主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子と結合し、および／またはＴ細胞を前記変異体ペプチドと交差反応させ；前記ペプチドが完全長ポリペプチドでない、ペプチド。
- ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子に結合する能力を有し、前記ＭＨＣに結合すると、ＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞によって認識されることができるようになる、請求項１に記載のペプチド。
- そのアミノ酸配列が、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０ののいずれか１つに記載の一続きのアミノ酸を含んでなる、請求項１または２に記載のペプチドまたはその変異体。
- 前記ペプチドまたはその変異体が、８〜１００、好ましくは８〜３０、より好ましくは８〜１６のアミノ酸の全長を有し、最も好ましくは前記ペプチドが、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなり、またはそれから本質的になる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
- 前記ペプチドが、修飾され、および／または非ペプチド結合を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
- 前記ペプチドが、特にＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端アミノ酸を含んでなる融合タンパク質の一部である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体をエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
- 請求項７に記載の核酸を発現する、発現ベクター。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸または請求項８に記載の発現ベクターを含んでなり、好ましくは樹状細胞などの抗原提示細胞である、組換え宿主細胞。
- 医療において使用するための請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、または請求項９に記載の宿主細胞。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドを提示する、または請求項７に記載の核酸を発現する、または請求項８に記載の発現ベクターを有する、請求項９に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記ペプチドまたはその変異体を前記宿主細胞またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を製造する方法。
- Ｔ細胞を適切な抗原提示細胞の表面に、または抗原提示細胞を模倣する人工コンストラクトの表面に発現される抗原負荷ヒトクラスＩまたはＩＩ ＭＨＣ分子に、前記Ｔ細胞を抗原特異的様式で活性化するのに十分な時間にわたり、生体外で接触させるステップを含んでなり、前記抗原が、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドである、活性化Ｔリンパ球を製造するインビトロ法。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する細胞を選択的に認識する、請求項１２に記載の方法によって製造される活性化Ｔリンパ球。
- 請求項１３で定義される活性Ｔ細胞の有効数を患者に投与するステップを含んでなる、その標的細胞が、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドを提示する患者において、標的細胞を死滅させる方法。
- ＭＨＣ分子と結合すると、好ましくは請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を特異的に認識する、特に可溶性または膜結合抗体である、抗体。
- がんを治療するためのまたはがん治療薬の製造における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項９に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１５に記載の抗体の使用。
- がんが、ペプチド配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０がそれに由来するタンパク質の過剰発現を示す、肺がん、脳がん、乳がん、結腸直腸がん、食道がん、腎がん、肝臓がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん、メラノーマ、メルケル細胞がん、白血病（ＡＭＬ、ＣＬＬ）、およびその他の腫瘍の群から選択される、請求項１６に記載の使用。
- （ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体、請求項７に記載の核酸、請求項８に記載の発現ベクター、請求項１０に記載の細胞、請求項１３に記載の活性化Ｔリンパ球、または請求項１５に記載の抗体を含有する医薬組成物を溶液中に、または凍結乾燥形態で含んでなる容器；
（ｂ）任意選択的に、前記凍結乾燥製剤のための希釈剤または再構成溶液を含有する第２の容器；
（ｃ）任意選択的に、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１６２からなる群から選択される少なくとももう１つのペプチド；および
（ｄ）任意選択的に、（ｉ）前記溶液の使用、または（ｉｉ）前記凍結乾燥製剤の再構成および／または使用のための取扱説明書
を含んでなるキット。 - （ｉｉｉ）緩衝液、（ｉｖ）希釈剤、（Ｖ）フィルター、（ｖｉ）針、または（Ｖ）シリンジの１つまたは複数をさらに含んでなる、請求項１８に記載のキット。
- 前記ペプチドが、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０からなる群から選択される、請求項１８または１９に記載のキット。
- ａ）前記個々の患者からの腫瘍サンプルによって提示される、腫瘍関連ペプチド（ＴＵＭＡＰ）を同定するステップと；
ｂ）ａ）で同定された前記ペプチドを正常組織との比較で腫瘍における免疫原性および／または過剰提示について予備選別されたペプチド貯蔵庫と比較するステップと；
ｃ）少なくとも１つのペプチドを前記患者において同定されたＴＵＭＡＰと一致する前記貯蔵庫から選択するステップと；
ｄ）ステップｃ）に基づいて、個別化ワクチンを）調合するステップと
を含んでなる、個別化抗がんワクチンを製造する方法。 - 前記ＴＵＭＡＰが、
ａ１）前記腫瘍サンプルからの発現データを前記腫瘍サンプルの組織型に相当する正常組織サンプルからの発現データと比較して、前記腫瘍サンプルにおいて過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質を同定するステップと；
ａ２）前記発現データを前記腫瘍サンプル中のＭＨＣクラスＩ／またはクラスＩＩ分子と結合するＭＨＣリガンドの配列と相関させて、前記腫瘍によって過剰発現されまたは異常に発現されるタンパク質に由来するＭＨＣリガンドを同定するステップと
によって同定される、請求項２１に記載の方法。 - 結合ペプチドを前記腫瘍サンプルから単離されたＭＨＣ分子から溶出させて、前記溶出したリガンドを配列決定することで、ＭＨＣリガンドの配列が同定される、請求項２１または２２に記載の方法。
- 前記腫瘍サンプルの組織型に対応する前記正常組織が、前記同一患者から得られる、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドが、
ａａ．正常組織または組織群と比較して、悪性組織において過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ａｂ．ステップａａで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ａｃ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用する生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップと；または
ｂａ．質量分析を使用してＨＬＡリガンドを前記腫瘍サンプルから同定するステップと；
ｂｂ．正常組織または組織群と比較して、悪性組織において過剰発現される遺伝子を同定するステップを含んでなる、マイクロアレイまたは配列決定ベース発現プロファイリングなどの高度並列法によって、ゲノム規模メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）発現解析を実施するステップと；
ｂｃ．前記同定されたＨＬＡリガンドを前記遺伝子発現データと比較するステップと； ｂｄ．ステップｂｃで検出された、選択的に発現されまたは過剰発現される遺伝子によってコードされる、ペプチドを選択するステップと；
ｂｅ．ステップｂｄから選択されたＴＵＭＡＰを腫瘍組織上で再検出し、健常組織上の検出欠如または希な検出が、ｍＲＮＡレベルにおける過剰発現の関連性を裏付けるステップと；
ｂｆ．健常ドナーまたは前記患者からのヒトＴ細胞を使用する生体外免疫原性アッセイを含んでなる、前記選択されたペプチドによる生体内Ｔ細胞応答の誘導を判定するステップと
に基づいて同定される、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。 - 前記貯蔵庫に包含される前記ペプチドの免疫原性が、生体外免疫原性アッセイ、個々のＨＬＡ結合についての患者免疫モニタリング、ＭＨＣ多量体染色、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび／または細胞内サイトカイン染色を含んでなる方法によって判定される、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記貯蔵庫が、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１６２からなる群から選択される複数のペプチドを含んでなる、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個々の患者からの正常な対応する組織と比較して、前記腫瘍サンプルに特有の少なくとも１つの変異を同定するステップと、前記ワクチンへの包含のために、または細胞療法の作成のために、前記変異と関連があるペプチドを選択するステップとをさらに含んでなる、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの変異が、全ゲノム配列決定によって同定される、請求項２８に記載の方法。
- ＨＬＡリガンドと反応性である、好ましくは可溶性または膜結合Ｔ細胞受容体であって、前記リガンドが配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する、Ｔ細胞受容体。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０と少なくとも８８％同一である、請求項３０に記載のＴ細胞受容体。
- 前記アミノ酸配列が、配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０のいずれかからなる、請求項３０または３１に記載のＴ細胞受容体。
- 前記Ｔ細胞受容体が可溶性分子として提供され、任意選択的に、免疫刺激ドメインまたは毒素などのさらなるエフェクター機能を保有する、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体。
- 請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＴＣＲをエンコードする核酸であって、任意選択的に異種プロモーター配列と結合する、核酸。
- 請求項３４に記載の核酸を発現する能力がある、発現ベクター。
- 請求項３４に記載の核酸、または請求項１５に記載の抗体をコードする核酸、または請求項３５に記載の発現ベクターを含んでなる、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞である、宿主細胞。
- 請求項３６に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記Ｔ細胞受容体を前記宿主細胞および／またはその培養液から単離するステップとを含んでなる、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。
- ａ）配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０からなる群から選択されるペプチド；
ｂ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチドＭＨＣ複合体と反応性のＴ細胞受容体；
ｃ）ａ）に記載のペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲ抗原関連不変鎖（Ｉｉ）のＮ末端のアミノ酸１〜８０とを含んでなる融合タンパク質；
ｄ）ａ）〜ｃ）のいずれかをコードする核酸、または前記核酸を含んでなる発現ベクター；
ｅ）ｄ）の発現ベクターを含んでなる宿主細胞；
ｆ）抗原特異的様式でＴ細胞を活性化するのに十分な時間にわたり、Ｔ細胞を適切な抗原提示細胞の表面に発現されるａ）に記載のペプチドと生体外で接触させるステップを含んでなる方法、ならびに自己または他の患者にこれらの活性化Ｔ細胞を移入する方法によって得られる、活性化Ｔリンパ球；
ｇ）ａ）に記載のペプチドおよび／またはペプチド−ＭＨＣ複合体および／またはａ）に記載のペプチドを提示する細胞と反応性であり、例えば、免疫活性化ドメインまたは毒素との融合によって潜在的に修飾されている、抗体、または可溶性Ｔ細胞受容体；
ｈ）配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１１０からなる群から選択されるペプチドおよび／または配列番号３０、または、配列番号１〜配列番号２９、配列番号３１〜配列番号１６２からなる群から選択されるペプチドとＭＨＣ分子の複合体を認識する、アプタマー；
i）ａ）〜ｈ）のいずれかに記載の結合または標識ペプチドまたはスキャフォールド
からなる群から選択される、少なくとも１つの活性成分と、薬学的に許容できる担体、および任意選択的に、薬学的に許容可能な賦形剤および／または安定剤とを含んでなる医薬組成物。 - 請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を好ましくはＭＨＣ分子と結合する請求項１〜６のいずれか一項に記載のペプチドまたはその変異体を特異的に認識する、アプタマー。
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