TWI737605B - 用於抗肺癌，包括ｎｓｃｌｃ及其他癌症的免疫治療的新穎胜肽及胜肽的組合 - Google Patents

Abstract

本發明涉及用於免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本發明涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽（刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激 T 細胞和轉入患者的疫苗複合物的活性藥物成分）聯合使用的腫瘤相關 T 細胞 (CTL) 肽表位。與主要組織相容性複合體 (MHC) 分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性 T 細胞受體和其他結合分子的靶標。

Description

用於抗肺癌，包括NSCLC及其他癌症的免疫治療的新穎胜肽及胜肽的組合

本發明涉及用於免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本發明涉及癌症的免疫療法。本發明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽（刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激 T 細胞和轉入患者的疫苗複合物的活性藥物成分）聯合使用的腫瘤相關 T  細胞 (CTL) 肽表位。與主要組織相容性複合體 (MHC) 分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性 T 細胞受體和其他結合分子的靶標。

本發明涉及數種新型肽序列及其變體，它們源自人腫瘤細胞的 HLA-I 類和 HLA-II 類分子，可用于引發抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物中或作為開發藥物/免疫活性化合物和細胞的目標。

在男性和女性中，癌症相關死亡的大多數均為肺癌。在世界範圍內，就發生率和死亡率而言，肺癌都是最常見的癌症。2012 年，有超過 180 萬的新發病例（占癌症總發病人數的 13%），160 萬人死於肺癌 （占癌症總死亡人數的 20%）。肺癌是 87 個國家中男性、26 個國家中女性癌症死亡的首要原因。超過三分之一的新診斷病例在中國。發生率最高的地區為北美、歐洲和東亞 (World Cancer Report, 2014)。

自 1987 年以來，每年死於肺癌的女性超過了死於乳腺癌。從 1991 年至 2003 年，男性的死亡率持續下降，每年約下降 1.9%。女性肺癌死亡率在連續增長幾十年後正趨於平穩。肺癌死亡率的這些趨勢反映了過去 30 年吸煙率的下降。

根據美國國立癌症研究所 (NCI) 的資料，預計 2013 年美國有 23 萬新發病例，16 萬死於肺癌。

根據之前的經驗，小細胞肺癌與非小細胞肺癌 (NSCLC) 區分， 後者包括組織學類型的腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。然而，在過去的十年中，由於遺傳學的主要差異以及對特定治療的反應，腺癌和鱗狀細胞癌的區別已被越來越多地認識。因此，依據驅動和保持肺腫瘤發生的特定遺傳改變，根據分子學亞型，肺癌被進一步分類 (Travis et al., 2013)。

預後一般較差。在所有肺癌患者中，10%-15% 的患者在確診後存活五年。肺癌患者生存期差是因為（至少部分因為）80% 的患者在確診時就有轉移，一半以上的患者有遠距離轉移 (SEER Stat facts, 2014)。在發病時，30-40% 的 NSCLC 病例處於四期，60% 的 SCLC 病例處於四期。

肺癌的 1 年相對存活率在 1975-1979 年期間為 35%，至 2010 年，略上升至 44%，這主要是由於手術技術的改進和組合療法的使用。然而，所有階段的肺癌組合在一起，5 年存活率僅為 17%。對於疾病在檢出時仍為局部性的病例，存活率為 54%；但是僅有 16% 的肺癌在此早期得到確診 (SEER Stat facts, 2014)。

治療選擇根據癌症的類型（小細胞和非小細胞肺癌）和階段進行確定，包括手術、放療、化療、靶向生物治療，如貝伐單抗 (AVASTIN^® ) 和埃羅替尼 (TARCEVA^® )。對於局部癌，通常選擇外科手術治療。最近的研究表明，手術後化療可提高早期非小細胞肺癌的存活率。由於該疾病在發現時通常已經擴散，因此，常常使用放射和化療，有時與手術聯合使用。單一化療或放化療結合是治療小細胞肺癌的通常選擇；採用這一方案，有很大比例的患者獲得緩解，在一些接受手術的病例中，緩解為持久緩解 (S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011)。

晚期肺癌也對傳統的化療產生耐藥。然而，最近的研究進展依賴於組織學和遺傳學在治療方法上取得令人興奮的進步。審查水準為：旨在區分 KRAS 的密碼子 12 和 13 突變以及密碼子 12 特定突變確定的不同氨基酸取代的輔助化療試驗 (Shepherd et al., 2013)。

為了擴大 NSCLC 的治療方案，已經研究了或正在研究不同的免疫治療方法。雖然用 L-BLP25 或 MAGEA3 進行疫苗接種未能證明在 NSCLC 患者中疫苗介導的生存優勢，但是同種異體細胞源性疫苗在臨床研究中表現出有希望的結果。此外，針對神經節苷脂、表皮生長因子受體和其他幾個抗原的進一步接種試驗目前正在進行中。增強患者抗腫瘤 T 細胞反應的另一策略包括使用特異性抗體阻斷抑制性 T 細胞受體或其配體。目前，正在臨床試驗中評估上述幾種抗體（包括 ipilimumab、nivolumab、pembrolizumab、MPDL3280A 和 MEDI-4736）在 NSCLC 中的治療潛力 (Reinmuth et al., 2015)。

考慮到治療癌症相關的嚴重副作用和費用，通常有必要確定可用於治療癌症的因子，尤其是肺癌，包括 NSCLC。通常也有必要確定代表癌症生物標誌物的因子，尤其是肺癌，從而更好地診斷癌症、評估預後和預測治療成功性。

癌症免疫治療代表了癌症細胞特異性靶向作用的一個選項，同時最大限度地減少副作用。癌症免疫療法利用存在的腫瘤相關抗原。

腫瘤相關抗原 (TAA) 的目前分類主要包括以下幾組： a) 癌-睾丸抗原：T 細胞能夠識別的最先確認的 TAA 屬於這一類抗原，由於其成員表達于組織學相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睾丸的精母細胞/精原細胞中、偶爾在胎盤中，因此，它最初被稱為癌-睾丸 (CT) 抗原。由於睾丸細胞不表達 HLA I 類和 II 類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被 T 細胞識別，因此在免疫學上可考慮為具有腫瘤特異性。CT 抗原大家熟知的例子是 MAGE 家族成員和 NY-ESO-1。 b) 分化抗原：腫瘤和正常組織（腫瘤源自該組織）都含有 TAA。大多數已知的分化抗原發現於黑色素瘤和正常黑色素細胞中。許多此類黑色素細胞譜系相關蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用於癌症的免疫治療。例子包括，但不僅限於，黑色素瘤的酪氨酸酶和 Melan-A/MART-1 或攝護腺癌的 PSA。 c) 過量表達的 TAA：在組織學相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表達的 TAA，一般表達水準較低。有可能許多由正常組織加工和潛在表現的表位低於 T 細胞識別的閾值水準，而它們在腫瘤細胞中的過量表達能夠通過打破先前確立的耐受性而引發抗癌反應。這類 TAA 的典型例子為 Her-2/neu、生存素、端粒酶或 WT1。 d) 腫瘤特異性抗原：這些獨特的 TAA 產生于正常基因（如 β-catenin、CDK4 等）的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉化和/或進展相關。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應風險的情況下誘導很強的免疫反應。另一方面，這些 TAA 在多數情況下只與其上確認了有 TAA 的確切腫瘤相關，並且通常在許多個體腫瘤之間並不都共用 TAA。在含有腫瘤特定（相關）同種型蛋白的情況下，如果肽源自腫瘤（相關）外顯子也可能出現肽腫瘤特異性（或相關性）。 e) 由異常翻譯後修飾產生的 TAA：此類 TAA 可能由腫瘤中既不具有特異性也不過量表達的蛋白產生，但其仍然具有腫瘤相關性（該相關性由主要對腫瘤具有活性的翻譯後加工所致）。此類 TAA 產生於變糖基化模式的改變，導致腫瘤產生針對 MUC1 的新型表位或在降解過程中導致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。 f) 腫瘤病毒蛋白：這些 TTA 是病毒蛋白，可在致癌過程中發揮關鍵作用，並且由於它們是外源蛋白（非人源蛋白），所以能夠激發 T 細胞反應。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤 16 型病毒蛋白、E6 和 E7，它們在宮頸癌中表達。

基於 T 細胞的免疫治療靶向作用于主要組織相容性複合體 (MHC) 分子表現的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。腫瘤特異性 T 淋巴細胞所識別的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。

MHC 分子有兩類：MHC I 類和 MHC II 類。MHC I 類分子由一條 α 重鏈和 β-2-微球蛋白，MHC II 類分子由一條 α 和一條 β 鏈組成。其三位構造形成一個結合槽，用於與肽進行非共價相互作用。

大部分有核細胞上都可發現 MHC-I 類分子。他們表現主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物 (DRIP) 和較大肽裂解生成的肽。然而，源自內體結構或外源性來源的肽也經常在 MHC-I 類分子上發現。這種 I-類分子非經典表現方式在文獻中被稱為交叉表現 (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990)。MHC II 類分子主要發現于專業抗原表現細胞 (APC) 上，並且主要表現，例如，在內吞作用過程中由 APC 佔據並且隨後被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。

肽和 MHC I 類的複合體由負載相應 T 細胞受體 (TCR) 的 CD8 陽性 T 細胞進行識別，而肽和 MHC II 類分子的複合體由負載相應 TCR 的 CD4 陽性輔助 T 細胞進行識別。因此，TCR、肽和 MHC 按照 1:1:1 的化學計量呈現，這一點已是共識。

CD4 陽性輔助 T 細胞在誘導和維持 CD8 陽性細胞毒性 T 細胞的有效反應中發揮重要作用。腫瘤相關抗原 (TAA) 衍生的 CD4 陽性 T 細胞表位的識別對開發能引發抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要 (Gnjatic et al., 2003)。在腫瘤部位，T 輔助細胞維持著對細胞毒性 T 細胞 (CTL) 友好的細胞因子環境 (Mortara et al., 2006) 並吸引效應細胞，如 CTL、天然殺傷 (NK) 細胞、巨噬細胞和粒細胞 (Hwang et al., 2007)。

在沒有炎症的情況下，MHC II 類分子的表達主要局限於免疫系統細胞，尤其是專業抗原表現細胞 (APC)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。在癌症患者的腫瘤細胞中發現有 MHC II  類分子的表達 (Dengjel et al., 2006)。

本發明的拉長（較長）肽可作為 MHC-II 類活性表位。

MHC-II 類表位活化的輔助 T 細胞在編排抗腫瘤免疫的 CTL 效應子功能中發揮著重要作用。觸發 T_H1 細胞反應的輔助 T 細胞表位支援 CD8 陽性殺傷 T 細胞的效應子功能，其中包括直接作用於腫瘤細胞的細胞毒性功能（該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/MHC 複合體）。這樣，腫瘤相關 T 輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽結合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物的活性藥物成分。

哺乳動物（如小鼠） 模型顯示，即使沒有 CD8 陽性 T 淋巴細胞，CD4 陽性 T 細胞也能通過分泌干擾素-γ (IFNγ) 抑制血管生成而足以抑制腫瘤的表現 (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999)。沒有 CD4 T細胞作為直接抗腫瘤效應因子的證據 (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014)。

由於 HLA II 類分子的組成性表達通常僅限於免疫細胞，因此，直接從原發腫瘤中分離 II 類肽之前被認為是不可能的事。然而，Dengjel 等人成功地在腫瘤中直接識別了多個 MHC II 類表位 (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1)。

由於 CD8 依賴型和 CD4 依賴型這兩種反應共同並協同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表徵由 CD8+ T 細胞（配體：MHC I 類分子 + 肽表位）或 CD4 陽性 T 輔助細胞（配體：MHC II 類分子）識別的腫瘤相關抗原對開發腫瘤疫苗非常重要。

對於MHC I 類肽觸發（引發）細胞免疫反應的肽，它也必須與 MHC 分子結合。這一過程依賴於 MHC 分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態性。MHC-I 類-結合肽的長度通常為 8-12 個氨基酸殘基，並且在其與 MHC 分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基（「錨」）。這樣，每個 MHC 的等位基因都有「結合基序」，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合 。

在 MHC-I 類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些 MHC-I 類分子結合，而且它們之後還必須能被 T 細胞負載的特異性 T 細胞受體 (TCR) 識別。

對於被 T 淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用於治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健康組織表達，或表達數量相對較少。在一個優選的實施方案中，與正常健康組織相比，所述肽應在腫瘤細胞中過度表現。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現於一種腫瘤中，而且濃度（即每個細胞的相應肽拷貝數目）高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自直接參與因細胞週期控制或凋亡抑制中的其功能而發生的正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標 (Singh-Jasuja et al., 2004)。至關重要的是，表位存在於抗原氨基酸序列中，以確保這種來自腫瘤相關抗原的肽（「免疫原性肽」）可導致體外或體內 T 細胞反應。

基本上，任何能與 MHC 分子結合的肽都可能充當一個 T 細胞表位。誘導體外或體內 T 細胞反應的前提是存在具有相應 TCR 的 T 細胞並且不存在對該特定表位的免疫耐受性。

因此，TAA 是基於 T 細胞療法（包括但不限於腫瘤疫苗）研發的起點。識別和表徵 TAA 的方法通常基於對患者或健康受試者 T細胞的使用情況，或基於腫瘤與正常組織肽之間差別轉錄特性或差別表達模式的產生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過量表達或選擇性表達的基因的識別並不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確資訊。這是因為，有著相應 TCR 的 T 細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水準，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，在本發明的一非常優選的實施例中，只選擇那些針對可發現功能性和/或增殖性 T 細胞情況的過量表現或選擇性表現肽，這一點非常重要。這種功能性 T 細胞被定義為在以特異性抗原刺激後能夠克隆地擴展並能夠執行效應子功能（「效應子 T 細胞」）的 T 細胞。

在通過根據本發明的特定 TCR（例如可溶性 TCR）和抗體或其他結合分子（支架）靶向作用於肽-MHC 的情況下，潛在肽的免疫原性是次要的。在這些情況下，表現是決定因素。

在本發明的第一方面，本發明涉及一種肽，包含選自包括 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的組的一個氨基酸序列、或該序列的與  SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 具有至少 77%，優選至少 88% 同源（優選至少 77% 或至少 88% 相同）的一種變體序列（其中所述變體與 MHC 結合和/或誘導 T 細胞與所述肽發生交叉反應），或其藥用鹽（其中所述肽不是潛在全長多肽）。

本發明進一步涉及本發明的一種肽，包含選自包括 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:162 優選為 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的組的一個序列、或與 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 具有至少 77%、優選至少 88% 同源性（優選為至少 77% 或至少 88% 相同）的一種變體，其中所述肽或其變體的總長度為 8 至 100 個、優選為 8 至 30 個、最優選為 8 至 20 個氨基酸。

下表顯示了根據本發明的肽、它們各自的 SEQ ID NO、以及這些肽的可能源（潛在）基因。表 1 和表 4 中的所有肽均與 HLA-A*02 結合。表 2 中的所有肽均與 HLA-A*24 結合。表 3 和表 5 中的所有肽均與 HLA-DR 結合。表 4 和表 5 中的肽之前在大型列表中披露，作為高通量篩查結果，錯誤率高，或使用演算法計算出，但之前與癌症毫無關聯。表 6、表 7 和表 8 中的肽是可與本發明其他肽組合使用的其他肽。表 9 和 10 中的肽還可用於診斷和/或治療各種其他惡性疾病，這些疾病涉及過量表達或過度表現各潛在多肽。 表 1：本發明中的肽

表 2：本發明中的其他肽

表 3：本發明中的 HLA-DR 肽

表 4：本發明中的其他肽，之前與癌症無已知的關聯

表 5：本發明中的其他 HLA-DR 肽，之前與癌症無已知的關聯

表 6：用於個性化癌症療法的其他肽

表 7：用於例如個性化癌症療法的其他肽

表 8：用於例如個性化癌症療法的 HLA-DR 肽

本發明還一般涉及本發明的肽用於治療增殖性疾病，例如，腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、白血病（AML、CLL）、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、食道癌包括胃食管交界處癌 (OSCAR)、膽囊癌和膽管癌 (GBC_CCC)、膀胱癌 (UBC)、子宮癌 (UEC)。

特別優選的是本發明的肽（單獨或組合），其選自包括 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的組。更優選的是所述肽（單獨或組合）選自包括 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:14（見表 1）和 SEQ ID NO:23 至 SEQ ID NO:47（見表 2）的組，並且其用於肺癌（包括 NSCLC）、腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、白血病（AML、CLL）、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、食道癌包括胃食管交界處癌 (OSCAR)、膽囊癌和膽管癌 (GBC_CCC)、膀胱癌 (UBC)、子宮癌 (UEC)、優選為肺癌包括 NSCLC 的免疫治療。

如示下面的表 9、9-2 和表 10、10-2 所示，其中本發明的許多肽也發現於其他腫瘤中，因此也可用於其他適應症的免疫治療。另請參閱圖 1 和實例 1。 表 9：本發明的 HLA-A*02 肽及其在其他增殖性疾病（特別是其他癌性疾病）中的特定用途。該表顯示，對於其他腫瘤類型的選定肽，發現他們過量表現（特定表現）於 5% 以上測定的腫瘤樣本，或表現於 5% 以上測定的腫瘤樣本且幾何學平均值腫瘤與正常組織的比值大於 3。

表9-2：本發明的 HLA-A*02 肽及其在其他增殖性疾病（特別是其他癌性疾病）中的特定用途（表 9 修訂版）。該表（如表 9）顯示，對於其他腫瘤類型的選定肽，發現他們過量表現（特定表現）於 5% 以上測定的腫瘤樣本，或表現於 5% 以上測定的腫瘤樣本且幾何學平均值腫瘤與正常組織的比值大於 3。過度表現定義為與最高表現的正常樣本相比，腫瘤樣本中的表現更高。經過度表現的正常組織有：脂肪組織、腎上腺、血細胞、血管、骨髓、腦、軟骨、食道、眼、膽囊、心臟、腎、大腸、肝、肺、淋巴結、神經、胰腺、甲狀旁腺、腹膜、垂體、胸膜、唾液腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、胸腺、甲狀腺、氣管、輸尿管、膀胱。

SCLC=小細胞肺癌，RCC=腎癌，CRC =結腸或直腸癌，GC =胃癌， HCC = 肝癌，PC =胰腺癌，PrC=攝護腺癌，BRCA =乳腺癌，MCC = 梅克爾細胞癌，OC =卵巢癌，NHL=非霍奇金淋巴瘤，AML=急性骨髓性白血病，CLL=慢性淋巴細胞白血病。   表 10：本發明的 HLA-A*24 肽及其在其他增殖性疾病（特別是其他癌性疾病）中的特定用途。該表顯示，對於其他腫瘤類型的選定肽，發現它們過量表現（特定表現）於 5% 以上測定的腫瘤樣本，或表現於 5% 以上測定的腫瘤樣本且幾何學平均值腫瘤與正常組織的比值大於 3。

表10-2：本發明的 HLA-A*24 肽及其在其他增殖性疾病（特別是其他癌性疾病）中的特定用途（表 10 修訂版）。該表（如表 10）顯示，對於其他腫瘤類型的選定肽，發現他們過量表現（特定表現）於 5% 以上測定的腫瘤樣本，或表現於 5% 以上測定的腫瘤樣本且幾何學平均值腫瘤與正常組織的比值大於 3。過度表現定義為與最高表現的正常樣本相比，腫瘤樣本中的表現更高。經過度表現的正常組織有：腎上腺、動脈、腦、心臟、腎、大腸、肝、肺、胰腺、垂體、皮膚、脾、胃、胸腺。

GC =胃癌，HCC=肝癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 7、14、15、18、94、95、97、98、101、102、105、106、111、112、117、118、120、121、122、123、126、127、128、130、131、132、136、138、139、143、146、147、150、28、29、42、47、50、54、56、59、66、67 和 161 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療腎癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 8、9、15、16、20、94、98、100、103、104、111、114、117、118、120、127、129、132、135、138、139、145、149、150、151、29、36、37、41、45、54、59、70、73、79、80 和 82 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療腦癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 2、4、18、94、105、113、114、115、117、120、124、126、128、130、131、132、134、137、138、144、146、149、153、26、31、33、36、41、42、44、49、50、56、58、63、67、77、78、85、159、160 和 161 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療胃癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 2、7、11、13、94、96、98、99、100、111、113、114、115、116、117、118、120、121、122、123、124、125、126、128、129、130、131、132、137、138、139、144、145、146、149 和 152 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療結直腸癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 7、8、9、11、15、16、18、19、20、21、94、96、98、99、101、104、111、113、114、115、117、118、119、120、121、126、129、131、132、135、136、138、139、143、149、150、152、26、27、28、29、37、38、39、41、44、46、50、51、52、56、58、59、60、61、62、63、66、67、69、70、71、72、73、75、76、77、79、81、82、84 和 161 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療肝癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 1、2、3、4、13、18、96、101、103、104、105、112、113、114、115、117、119、120、121、123、124、125、126、128、131、132、133、135、136、137、138、139、143、146 和 156 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療胰腺癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 8、10、16、18、114、128、139、143、153、27、37、41、43、53、59、61、67、72、76、78、80、82 和 84 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療攝護腺癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 9、15、96、97、120 和 127 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案中的肽聯合用於治療白血病（AML、CLL）。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 1、3、4、5、7、13、16、18、101、102、105、112、113、115、119、124、126、128、133、145 和 156 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療乳腺癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 95、98、100、104、138、149 和 151 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案中的肽聯合用於治療梅克爾細胞癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 4、5、9、16、19、20、94、98、112、115、117、118、128、130、132、134、138、139、144、146 和 148 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療黑色素瘤。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 4、8、9、10、16、18、94、98、99、100、101、102、104、105、111、113、114、115、117、118、120、121、123、124、125、126、128、129、130、131、132、134、137、138、139、142、143、144、148、149、150 和 152 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療卵巢癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 5、9、13、18、19、21、95、102、104、105、113、114、115、119、120、123、124、125、127、129、130、132、133、137、138、139、141、143、144、145、146、149、150、151、153、155、156 和 157 中任一項所述的本發明的至少一種肽與一種優選實施方案的肽聯合用於治療食管癌。

因此，本發明的另一個方面涉及根據 SEQ 序列號 13、25、113、114、115、120、121、128、159 和 161 中任一項所述的本發明的至少一種肽，優選為聯合用於治療乳肺癌（包括 NSCLC）。

因此，本發明的另一個方面涉及本發明中肽的用途 - 優選聯合用於治療選自肺癌（包括 NSCLC）、腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、白血病（AML、CLL）組中的增殖性疾病。

本發明還涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體 (MHC) I 或以拉長形式存在的例如長度變化的- MHC-II 類分子結合的能力。

本發明進一步涉及本發明中的肽，其中所述肽（每種肽）系由或基本系由根據 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:162，優選為 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的一個氨基酸序列組成。

本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。

本發明進一步涉及本發明的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與 HLA-DR 抗原相關不變鏈 (Ii) 的 N-端氨基酸融合，或與抗體（例如，樹突狀細胞特定抗體）或抗體的序列融合。

本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明的肽。本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為 DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。

本發明進一步涉及一種能表達和/或表達本發明核酸的表達載體。

本發明進一步涉及本發明的一種肽、本發明的一種核酸或本發明的一種治療疾病的藥用表達載體，特別是用於治療癌症。

本發明進一步涉及本發明中肽或本發明中所述肽複合體（含有 MHC）的特定抗體以及製造這些抗體的方法。

本發明進一步涉及本發明的 T 細胞受體 (TCR)，特別是可溶性TCR (sTCRs) 和加工為自體或異體 T 細胞的克隆 TCR，以及製造這些 TCR 的方法和載有所述 TCR 或所述 TCR 交叉反應的 NK 細胞的製造方法。

抗體和 TCR 是根據本發明的肽現有免疫治療用途的另外實施方案。

本發明進一步涉及含本發明核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其為抗原表現細胞，優選為樹突細胞。

本發明進一步涉及配製本發明一種肽的一種方法，所述方法包括培養本發明的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養基中分離肽。

本發明進一步涉及本發明中的所述方法，其中抗原通過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原表現細胞或人工抗原呈遞細胞表面的 I 或 II 類 MHC 分子。

本發明進一步涉及本發明的方法，其中抗原表現細胞由能表達含 SEQ ID NO.1 至 SEQ ID NO.110、優選為含 SEQ ID No. 1 至 SEQ ID No. 14、以及 SEQ ID No. 23 至 SEQ ID No.:47 所述肽的一個表達載體、或一個變體氨基酸序列組成。

本發明進一步涉及以本發明方法製造的啟動 T 細胞，其中所述 T 細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞表達含一種本發明氨基酸序列的多肽。

本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者按本發明方法製造的有效量 T 細胞。

本發明進一步涉及任何所述肽、本發明的核酸、本發明的表達載體、本發明的細胞、本發明的作為藥劑或製造藥劑的活化T淋巴細胞、T 細胞受體或抗體或其他肽-和/或肽-MHC 結合分子的用途。所述藥劑優選為具有抗癌活性。

優選情況為，所述藥劑為基於可溶性 TCR 或抗體的細胞治療藥物、疫苗或蛋白質。優選情況為，所述藥劑為獲得自可溶性 TCR 或抗體（例如，包含抗 CD3 抗體或一部分的 sTCR）的細胞治療藥物、疫苗或蛋白質。

本發明還一般涉及本發明的用途，其中所述癌細胞為肺癌（包括 NSCLC）腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、白血病（AML、CLL）、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、食管癌包括胃食管交界處癌 (OSCAR)、膽囊癌和膽管癌 (GBC、CCC) 、膀胱癌 (UBC)、子宮癌 (UEC) 細胞，優選為肺癌細胞。

本發明進一步涉及一種基於本發明肽的生物標誌物，在此成為「靶標」，其可用於診斷癌症，優選為肺癌（包括 NSCLC）。所述標誌物可以肽本身過度表現或相應基因過度表達。標誌物也可以用於預測治療成功的可能性，優選為免疫療法，最優選為靶向作用於該生物標誌物識別的相同靶標的免疫療法。例如，抗體或可溶性 TCR 可用於染色腫瘤切片以檢測是否存在相關肽與 MHC 複合。

或者，抗體具有進一步的效應子功能，如免疫刺激域或毒素。

本發明還涉及這些癌症治療中新靶點的用途。

膠原α-3 (VI) 鏈蛋白 (COL6A3) - COL6A3 編碼α-3鏈，這是 VI 型膠原蛋白的 3 個α鏈之一。該蛋白結構域已被證明與細胞外基質蛋白相結合，這是一種相互作用，可說明此膠原在組織基質成分中的重要性。通過在卵巢癌細胞中表達促進順鉑耐藥的 VI 型膠原而重組細胞外基質。膠原 VI 是否存在與腫瘤分級相關，它是卵巢癌的一種預後因子  (Sherman-Baust et al., 2003)。COL6A3 在結直腸腫瘤  (Smith et al., 2009a)、唾液腺癌  (Leivo et al., 2005) 過量表達，在胃癌中差異表達 (Yang et al., 2007)。COL6A3 已被確定為含腫瘤特異性剪接變體的七種基因之一。經驗證的腫瘤特異性剪接變化高度一致，從而能夠使正常和癌症樣本明顯區分，甚至可明確區分腫瘤不同分期 (Thorsen et al., 2008)。

溶質載體家族 6（氨基酸轉運）成員14 (SLC6A14)  - SLC6A14 編碼溶質載體家族 6 成員 14 (SLC6A14)。SLC6A14 是一種氨基酸轉運體，是溶質載體家族 6 的一員。該家族的成員為鈉和氯依賴性氨基酸/神經遞質轉運體。SLC6A14 轉運中性和陽離子氨基酸。轉運體在正常組織中低水準表達 (Sloan and Mager, 1999)。SLC6A14 被證明在宮頸癌 (Gupta et al., 2006)、結直腸 (Gupta et al., 2005) 和雌激素受體 (ER) 陽性乳腺癌 (Karunakaran et al., 2011) 組織和細胞系以及肝細胞瘤細胞  (Fuchs et al., 2004) 中上調。雖然 SLC6A14 在相應的正常組織/細胞中表達很低，但是癌細胞上調 SLC6A14 以滿足他們對這些氨基酸的需求增加。α-甲基-DL-色氨酸 (α-MT)——SLC6A14 的選擇性阻斷劑，誘導氨基酸剝奪，並導致 ER 陽性乳腺癌細胞系中的凋亡 (Karunakaran et al., 2011)。

雙重特異性磷酸酶 4 (DUSP4)  - 由 DUSP4 基因編碼的蛋白質是雙重特異性蛋白磷酸酶亞家族的一員。DUSP4 滅活 ERK1、ERK2 和 JNK，在各種組織中表達，並且位於細胞核中。根據報告，與非惡性乳腺癌樣本中相比，DUSP4（別名 MKP2）在惡性樣本中過度表達 (Wang et al., 2003)。在結腸癌症患者微陣列資料集中，發現 DUSP4 表達為差異表達，在 BRAF 突變腫瘤中表達最高。此外，高 DUSP4 與較差的整體存活率相關 (De, V et al., 2013)。

糖蛋白（跨膜）nmb (GPNMB) -  基因 GPNMB 編碼 I 型跨膜糖蛋白。GPNMB 已經顯示在大部分不同癌症類型中表達，並通過促進腫瘤細胞遷移、侵襲和轉移形成主要增加腫瘤侵襲性。在分子水準上，已表明 GPNMB 可增加 MMP-2、3 和 9 的表達，且本身受 p53 調節 (Metz et al., 2005; Metz et al., 2007; Rose et al., 2007; Fiorentini et al., 2014)。高水準的 GPNMB 與 SCLC、GBM 和 ccRCC 的總生存期下降進一步相關 (Qin et al., 2014; Li et al., 2014; Kuan et al., 2006)。

角蛋白，II 型細胞骨架 80 (KRT80)  - KRT80 編碼角蛋白 80 (KRT80)。KRT80 在幾乎所有類型的上皮細胞中被發現，與晚期組織或細胞分化相關。含中間絲的 KRT80 位於靠近橋粒斑的細胞邊緣，並且只在進入終末分化的細胞內，KRT80 呈細胞質分佈 (Langbein et al., 2010)。

染色體結構維持蛋白 4 (SMC4) - SMC4 蛋白是凝聚蛋白的核心組成部分，在染色質凝聚中發揮作用，還與細胞核仁分離、DNA 修復和染色質支架的維持相關 (Cervantes et al., 2006)。

溶質載體家族 1（谷氨酸/中性氨基酸轉運體）成員 4 (SLC1A4) - SLC1A4 是一種氨基酸轉運體，介導小中性氨基酸鈉的依賴性交換（綜述 (Kanai et al., 2013)）。與鱗狀細胞癌相比，SLC1A4 被描述為被顯著更多的食管腺癌表達(Younes et al., 2000)。SLC1A4 在攝護腺癌細胞中的表達顯示增加，以回應於雄激素治療 (Wang et al., 2013a)。

角蛋白 5 (KRT5)、角蛋白 6A (KRT6A)、角蛋白 6B (KRT6B)、角蛋白 6C (KRT6C) - KRT5、KRT6A、KRT6B 和 KRT6C 為同源角蛋白的蛋白質，他們是中間絲蛋白。角蛋白被廣泛地用作腫瘤診斷的標記蛋白，因為他們的表達模式涉及惡性腫瘤的起源組織（綜述 (Karantza, 2011)）。在正常情況下，KRT6A 和 KRT6B 似乎通過隔離從而抑制親遷徙 Src 激酶的活性來抑制細胞遷移。該機制是否也適用於癌細胞仍未進行研究 (Rotty and Coulombe, 2012)。KRT5/6染色作為幾種標記物之一被提出，在 NSCLC 中區分低分化腺癌和鱗狀細胞癌 (Zhao et al., 2014b; Xu et al., 2014)。肺神經內分泌腫瘤的 KRT5/6 也呈陰性 (Zhang et al., 2014)。

趨化因子（C-C 基序）配體 18（肺和啟動調節）(CCL18)  - 這種抗菌基因是聚集在 17 號染色體上的幾種半胱氨酸-半胱氨酸 (CC) 細胞因子基因之一。該基因編碼的細胞因子顯示了對於幼稚 T 細胞、CD4+ 和 CD8+ T 細胞和未活化淋巴細胞的趨化活性，但對於單核細胞或粒細胞沒有趨化活性。腫瘤組織和血液中 CCL18 水準上調已在癌症中進行了描述，CCL18 血清水準已被作為幾種腫瘤類型的生物標誌物提出。在多種情況下，顯示晚期腫瘤類型與預後不良相關（例如胃癌 (Wu et al., 2013a)、 乳腺癌 (Chen et al., 2011; Narita et al., 2011)、攝護腺癌 (Chen et al., 2014)、膀胱癌 (Urquidi et al., 2012)）。CCL18 的血清水準相比健康對照而言在 NSCLC  患者中增加。另外，血清水準增加預測腺癌患者的生存時間下降 (Plones et al., 2012)。CCL18 是 12-蛋白血清生物標誌物的一部分，可確定 NSCLC (Ostroff et al., 2010)。

基質金屬肽酶 12（巨噬細胞彈性蛋白酶）(MMP12) - MMP12，也稱為人類金屬肽酶 (HME) 或巨噬細胞金屬肽酶 (MME)，是其降解彈性蛋白能力被識別的一種鋅內肽酶。除此之外，它具有廣泛範圍的底物，延伸到其它基質蛋白（如膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖）和非基質蛋白質（如α-1-抗胰蛋白酶）。哮喘、肺氣腫和慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 時，MMP12 可能有助於肺泡破壞和氣道重塑 (Cataldo et al., 2003; Wallace et al., 2008)。MMP12 牽涉巨噬細胞遷移，並且因為它可從纖溶酶原中產生血管抑素，因而有助於抑制血管生成 (Chakraborti et al., 2003; Chandler et al., 1996; Sang, 1998)。像其他金屬蛋白酶一樣，MMP12 參與生理過程，如：胚胎發生、傷口癒合和月經週期 (Chakraborti et al., 2003; Labied et al., 2009)，而且參與組織破壞的病理過程。雖然資料是基於一些情況下少數患者，但文獻中有充分的證據表明 MMP12 往往在癌症中過度表達 (Denys et al., 2004; Hagemann et al., 2001; Ma et al., 2009; Vazquez-Ortiz et al., 2005; Ye et al., 2008)。但是，關於 MMP12 對臨床參數和預後影響的資料是有爭議的。雖然它可能參與基質溶解從而參與轉移，但也可以通過產生血管抑素抑制腫瘤生長，這負面影響血管生成 (Gorrin-Rivas et al., 2000; Gorrin Rivas et al., 1998; Kim et al., 2004)。對於肺癌，MMP12 表達的後果是有爭議的。根據報告，在炎症引發的肺重塑中，上皮細胞中過度表達 MMP12。MMP12 上調可能在肺氣腫到肺癌過渡中發揮作用 (Qu et al., 2009)。動物研究表明，基質或巨噬細胞表達 MMP12 抑制肺腫瘤的生長 (Acuff et al., 2006; Houghton et al., 2006)。但是，也有報告表明，肺腫瘤 MMP12 過度表達與切除後復發、轉移性疾病和較短的無復發生存期有關 (Cho et al., 2004; Hofmann et al., 2005)。

溶酶體相關膜蛋白 3 (LAMP3) - LAMP3 是一種發現於溶酶體區室的 I 型跨膜蛋白，具有一個小胞質結構域和一個高度糖基化管腔域 (Wilke et al., 2012)。數種癌症均報告了 LAMP3 上調，但是，腫瘤細胞本身表達 LAMP3 還沒有被證實。LAMP3 (+) DC 特別在含有增殖 T 淋巴細胞的侵襲性腫瘤邊緣形成簇中檢測到，因而被提出可反映局部抗腫瘤免疫應答，例如，對於腎細胞癌 (Middel et al., 2010)、食管鱗狀細胞癌 (Liu et al., 2010)、結直腸癌 (Yuan et al., 2008; Sandel et al., 2005) 和黑素瘤 (Ladanyi et al., 2007)。轉錄資料的薈萃分析表明，低肺癌 LAMP3 表達水準可能與較短的總生存期相關 (Lindskog et al., 2014)。

著絲粒蛋白 N (CENPN) – CENPN 基因編碼的蛋白質形成核小體相關複合體的一部分，並且對於動粒裝配很重要。CENPN 識別一種著絲粒特異性組蛋白變體 (CENP-A)，因而需要確定很多其他著絲粒蛋白的募集位點 (Carroll et al., 2009)。CENPN 和核小體相關複合體 (NAC) 的耗竭不損害雙極紡錘體形成，但會導致染色體板集合缺陷 (McClelland et al., 2007)。CENPN 與其他的 NAC 蛋白一起被募集到 DNA 雙鏈斷裂處，因此，此複合體被提出在 DNA 修復中發揮作用 (Zeitlin et al., 2009)。

原膠原賴氨酸，2-酮戊二酸 5-雙加氧酶 2 (PLOD2) - 由該基因編碼的蛋白質是定位於粗面內質網瀦泡的膜結合同二聚體酶。該基因的編碼區突變與布魯克徵候群相關。根據描述，PLOD2 在結直腸癌 (Nicastri et al., 2014)、多發性骨髓瘤 (Slany et al., 2014) 和子宮頸癌 (Rajkumar et al., 2011) 中上調，並於與骨轉移形成相關 (Blanco et al., 2012)。研究顯示，膠質母細胞瘤 (Dong et al., 2005) 以及乳腺癌 (Gilkes et al., 2013) 和肝細胞癌中，PLOD2 表達升高與不良預後有關，其中在肝細胞癌中，它也與腫瘤大小增加並形成肝內轉移相關 (Noda et al., 2012)。

基質金屬蛋白酶 1 (MMP1) - MMP1 是基質金屬蛋白酶 (MMP) 家族的一員。一般情況下，MMP 在血管功能調節、重塑和血管生成中起重要作用。通過 ECM 和其他細胞外分子的降解，它們促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的遷移和侵襲，並影響血管細胞增殖和凋亡 (Chen et al., 2013)。MMP1 過度表達已在幾個癌症類型中進行了描述，並與血管生成、侵襲和不良預後相關。例如，MMP1 水準升高已經被描述為結腸癌存活率的一個獨立因素 (Langenskiold et al., 2013)，腫瘤和基質中 MMP1 表達與乳腺癌的腫瘤進展和較差預後相關 (Bostrom et al., 2011)。MMP1 水準已被證明在肺癌患者的血漿和腫瘤組織中升高，並與較晚期別和存活率下降相關 (Li et al., 2010b)。一項薈萃分析證實，MMP1-1607 1G/2G 多態性與罹患肺癌風險增加相關 (Xiao et al., 2012)。

角蛋白10 (KRT10)、角蛋白12 (KRT12)、角蛋白13 (KRT13)、角蛋白14 (KRT14)、角蛋白15 (KRT15)、角蛋白16 (KRT16)、角蛋白17 (KRT17)、角蛋白19 (KRT19)  - 同源角蛋白KRT10、KRT12、KRT13、KRT14、KRT15、KRT16、KRT17 和 KRT19 是中間絲蛋白。一些角蛋白與幹細胞特性相關，例如 KRT14 被認為是癌幹細胞標誌物 (Hatina and Schulz, 2012; Schalken and van, 2003)。KRT15 用作識別和定位表皮幹細胞的標誌物 (Adhikary et al., 2013; Troy et al., 2011)，KRT17 在毛髮凸起基底層的幹細胞中表達 (Bragulla and Homberger, 2009)。針對不同癌症類型對不同角蛋白的表達模式進行了分析，上調和下調均有報告。例如，高水準 KRT17 與較差預後 (Wang et al., 2013b; Escobar-Hoyos et al., 2014)  和較晚期別 (Kim et al., 2012) 相關。對於 KRT13，多數研究表明在癌性組織中下調 (Hourihan et al., 2003; Ida-Yonemochi et al., 2012)，KRT13 的表達在鱗狀細胞轉化過程中似乎被 KRT17 的表達替代 (Mikami et al., 2011)。對於 KRT10 和 KRT15，在癌症中上調和下調均被不同的研究證實。KRT19 常在許多癌症類型中過度表達，並與轉移和不良生存期相關 (Zong et al., 2012; Lee et al., 2012)。KRT12 在角膜上皮細胞中表達。角膜顯示角蛋白 12（被認為是分化標誌物）下調 (Zhang et al., 2010b)。

黏蛋白16，細胞表面 (MUC16) - MUC16 在幾個膜結合黏蛋白中最大。MUC16 是單次跨膜蛋白，具有高度糖基化胞外結構域。MUC16 是一種腫瘤相關抗原，裂解自卵巢癌細胞表面，脫落到血液中並用作監測卵巢癌的生長的成熟生物標誌物 (Bafna et al., 2010)。MUC16 表達水準增加已在肺鱗狀細胞癌中被證實 (Wang et al., 2014)。此外，高 MUC16 血清水準與 NSCLC 患者生存期縮短相關 (Yu et al., 2013; Cedres et al., 2011)。與其他生物標記物組合，MUC16 可能是肺癌亞型基因表達標誌的一部分 (Li et al., 2012)。

整合素 α-2（CD49B，VLA-2 受體的α2亞基）(ITGA2) - ITGA2 編碼膠原和相關蛋白的跨膜受體的α亞基。少量研究報告，ITGA2 在癌症中失調，其中含有水準升高和下降的證據：在胰腺導管腺癌中，ITGA2 被低甲基化和過度表達，表達升高與不良預後相關 (Nones et al., 2014)。與此相反，攝護腺癌中 ITGA2 下調已得到證明 (Shaikhibrahim et al., 2011)。乳腺癌和攝護腺癌中，ITGA2 表達下降與轉移形成和較差生存率有關(Ramirez et al., 2011)。

嗅素樣 2B (OLFML2B) - OLFML2B 屬於嗅素蛋白家族，其為細胞外糖蛋白，主要參與化學感受纖毛分化、早期神經形成、神經管背部化、神經肌肉信令、突觸小泡胞吐作用和青光眼的發病。OLFM2B 轉錄物可在小鼠的不同組織中檢測到，包括肺、胃和攝護腺，但在肝臟中沒有檢測到 (Furutani et al., 2005)。OLFML2B 基因定位於染色體 1q23.3，這在關聯研究中被證明是精神分裂症的易感性基因位點  (Puri et al., 2007)。

三十四肽重複結構域 13 (TTC13) - TTC13 屬於三十四肽重複 (TPR) 結構域蛋白質家族。TPR 結構域似乎對於伴侶功能、細胞週期、轉錄和蛋白轉運很重要，含有 TPR 基序的蛋白通常與多蛋白複合體相關 (Blatch and Lassle, 1999)。TCC13 基因定位於染色體 1q42.2。染色體 1q42.2-43 在一項相關分析研究中被描述為攝護腺癌的一種假定易感基因位點 (Berthon et al., 1998)，但這無法在進一步的研究中針對更大患者人群得到證實 (Singh, 2000; Gibbs et al., 1999)。

胞質分裂作用因子 2 (DOCK2) - 由 DOCK2 基因編碼的蛋白質屬於 CDM 蛋白家族。DOCK2 已知是淋巴細胞遷移和趨化的重要因子。外顯子組和全基因組測序研究確認，在結直腸癌、食管腺癌和胰腺導管內乳頭狀粘液性腫瘤中有 DOCK2 基因內突變 (Yu et al., 2014; Dulak et al., 2013; Furukawa et al., 2011)。此外，DOCK2 被證明在兒童星形細胞瘤樣本中差異表達，因此可能代表這種疾病的一個相關治療靶點 (Zhao et al., 2014a)。

脊髓灰質炎病毒受體相關 1（皰疹病毒進入介體 C） (PVRL1) - PVRL1 編碼黏附蛋白，其在上皮細胞和內皮細胞黏附連接和緊密連接的組織中發揮作用。PVRL1 基因定位到染色體 11q23，這是被發現在腺樣囊性癌中擴增的區域 (Zhang et al., 2013)。由於細胞黏附的重要功能，PVRL1 與細胞侵襲和遷移特性調節以及上皮-間質轉化相關，這些是腫瘤發生的重要進程。PVRL1 被確定為子宮頸癌鱗狀細胞癌亞型的標誌特性的一部分 (Imadome et al., 2010)。相對于正常甲狀腺組織，PVRL1 表達被發現在甲狀腺腫瘤中增加，並在乳頭狀甲狀腺癌進一步增加 (Jensen et al., 2010)。PVRL1/2 的表達與急性骨髓性白血病的更好的預後相關 (Graf et al., 2005)。

FK506 結合蛋白 10，65 kDa (FKBP10)  - FK506-結合蛋白 10 (FKBP10) 屬於 FKBP 類肽基脯氨醯順/反異構酶家族。它位於內質網，並充當分子伴侶 (Ishikawa et al., 2008; Patterson et al., 2000)。它是在肺發育中高度表達，並且在肺損傷後可以以協調的方式被細胞外基質蛋白重新啟動 (Patterson et al., 2005)。

ATP 結合盒，亞族 C (CFTR/MRP)，成員 1 (ABCC1) - 由 ABCC1 基因編碼的蛋白是ATP 結合盒 (ABC) 轉運體超家族中的一員。ABC 蛋白質跨越細胞內外膜運輸各種分子。ABCC1 在正常和腫瘤細胞中起著重要的藥物外排泵角色 (Chen and Tiwari, 2011)。幾項研究描述了不同腫瘤類型中 ABCC1 的過度表達，在許多情況下，發現 ABCC1 表達水準與腫瘤分期、轉移和較差預後相關（例如在乳腺癌、攝護腺癌和肺癌中） (Deeley et al., 2006)。針對中國患者的一項研究確定了 ABCC1 基因的 SNP 可增加 NSCLC 的易感性 (Yin et al., 2011)。另一項研究報告，ABCC1 SNP 和 NSCLC 患者的無進展生存期之間相關 (Lamba et al., 2014)。

花生四烯酸 15-脂氧化酶 B 型 (ALOX15B) - ALOX15B 編碼參與脂肪酸氫過氧化物產生的結構相關非血紅素鐵雙加氧酶的脂氧合酶家族的一員。ALOX15B（更常稱為 15 LOX-2）及其酶促產物 15-S-羥酸 (15S-HETE) 在腫瘤發展中的作用已經在攝護腺癌中進行最深入的研究。幾項研究已經證明，與正常組織或細胞系相比，ALOX15B 的表達水準以及 15S-HETE 的產生水準都在攝護腺癌中下降 (Hu et al., 2013; Shappell et al., 2001)。在正常的肺中，ALOX15B 表達僅限於 II 型肺細胞。表達在 NSCLC 升高，ALOX15B 水準與腫瘤分級以及腫瘤細胞增殖指數之間被描述為呈逆相關 (Gonzalez et al., 2004)。

鞘磷脂磷酸二酯酶，酸樣 3B (SMPDL3B) - SMPDL3B 是在足細胞中表達的鞘磷脂磷酸二酯酶，其表達與糖尿病腎病和局灶性節段性腎小球硬化有關。腎臟疾病中 SMPDL3B 表達下降與細胞骨架重構和細胞凋亡相關 (Merscher and Fornoni, 2014)。SMPDL3B 基因映射到染色體 1p35.3。

穀氨醯胺-果糖-6-磷酸轉氨酶 2 (GFPT2) - GFPT2 參與神經突向外生長、早期神經元細胞發育、神經肽信令/合成和神經受體 (Tondreau et al., 2008)。GFPT2 遺傳變異與 II 型糖尿病和糖尿病腎病有關 (Zhang et al., 2004)。此外，GFPT2 SNP 的關聯性表明參與氧化途徑調製的基因可能是糖尿病慢性腎功能不全的主要原因 (Prasad et al., 2010)。GFPT2 基因的 DNA 甲基化在主要急性淋巴細胞白血病 (ALL) 樣本中進行了驗證。多 CpG 島甲基化的患者總生存率較差 (Kuang et al., 2008)。GFPT2 在穀氨醯胺代謝中發揮作用，觀察到在間充質細胞系中更高度表達。穀氨醯胺代謝可能在腫瘤進展中發揮重要作用，細胞代謝途徑的抑制劑可以是一種表觀遺傳療法 (Simpson et al., 2012)。

DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 框解旋酶 5 (DDX5) - DDX5 (P68) 是一種 ATP 依賴性 RNA 解旋酶，在剪接、rRNA 加工和核糖體生物發生、miRNA 加工以及轉錄調控中發揮作用。DDX5 是多種因子的轉錄共啟動因子，這些因子在癌症發展中發揮作用，如雄激素受體、p53 和 Runx2。DDX5 已被證明在許多不同的癌症類型中過度表達，例如結直腸癌、乳腺癌、攝護腺癌、神經膠質瘤、肝細胞癌和白血病 (Dai et al., 2014; Fuller-Pace, 2013)。

烯醇酶 1，(α)  (ENO1) -  ENO1 基因編碼烯醇化酶α(ENOA)，這是三種烯醇酶蛋白之一，其他分別為烯醇酶-β和烯醇酶-γ。ENO1/ENOA 過度表達在許多癌症類型中被證明 (Capello et al., 2011)。ENOA 是一種金屬酶，其在磷酸烯醇丙酮酸鹽合成糖酵解中起作用。ENOA 水準升高與 NSCLC 患者較差的生存期相關 (Chang et al., 2006)。同樣，另一項研究證實 ENO1 在一組預後差的肺腺癌患者中表達上調 (Pernemalm et al., 2013)。ENOA 已被證明為腫瘤相關抗原，抗 ENOA 抗體以及特異性 ENOA T 細胞已在胰腺癌患者被檢測到 (Cappello et al., 2009)。ENOA 自身抗體也在 NSCLC 患者中檢測到，ENOA 表達已被證明在 NSCLC 組織中增加 (He et al., 2007; Li et al., 2006)。

殺傷細胞凝集素樣受體亞家族 D，成員 1 (KLRD1) - KLRD1，更常稱為 CD94，與NKG2 分子相關，以形成在自然殺傷 (NK) 細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 上表達的異二聚體。抑制受體 KLRD1 (CD94):NKG2A 被證明在腫瘤浸潤淋巴細胞中過度表達，例如腎細胞癌和子宮頸癌，這可能導致抗腫瘤免疫應答受損 (Schleypen et al., 2003; Sheu et al., 2005)。同樣，HLA-E——KLRD1 (CD94):NKG2A 配體在腫瘤細胞上過度表達可能還有助於腫瘤免疫逃逸 (Bossard et al., 2012; Gooden et al., 2011)。

膠原蛋白，XII 型，α1 (COL12A1) - COL12A1 基因編碼 XII 型膠原蛋白的 α 鏈，而XII 型膠原蛋白是 FACIT（三螺旋區不連續的纖維相關性膠原蛋白）膠原蛋白的家族成員。XII 型膠原蛋白是 I 型膠原蛋白中存在的一種同源三聚體，被認為可修飾膠原蛋白 I 纖維與周圍基質之間的相互作用 (Oh et al., 1992)。COL12A1 可能參與基底膜調節，為原纖維和其他基質組分之間提供特異性分子橋 (Thierry et al., 2004)。COL12A1 在心臟、胎盤、肺、骨骼肌和胰腺 (Dharmavaram et al., 1998) 以及多種結締組織包括關節和

軟骨 (Gregory et al., 2001; Walchli et al., 1994; Watt et al., 1992) 中表達。與較低或無微衛星不穩定性的穩定組相比，COL12A1 在高微衛星不穩定性的腫瘤中下調 (Ortega et al., 2010)。

ATP 結合盒，亞族 A (ABC1)，成員 13 (ABCA13) - 在人類中，跨膜轉運體的 ATP 結合盒 (ABC) 家族至少有 48 個基因和 7 個基因亞族。所預測的 ABCA13 蛋白由 5058 個氨基酸殘基組成，因此該蛋白是迄今為止所描述的最大 ABC 蛋白 (Prades et al., 2002)。Knight  等人確定 ABCA13 蛋白在小鼠和人海馬和皮層中表達，這兩個區域均與精神分裂症和雙相性精神障礙相關 (Knight et al., 2009)。ABCA13 基因映射到染色體7p12.3，該區域包含影響胰腺的遺傳性疾病（Shwachman-Diamond 徵候群）以及參與 T 細胞腫瘤侵襲和轉移 (INM7) 的位點，因此，該基因是這些疾病的定位候選基因 (Prades et al., 2002)。

細胞週期蛋白 B2 (CCNB2) - CCNB2 是與主要的細胞週期調控激酶 CDK1 (CDC2) 相關聯的幾個細胞週期蛋白之一。細胞週期蛋白水準在細胞週期期間轉錄調節，提供 CDK1 不同水準的活性和特異性，從而控制細胞週期進程。細胞週期蛋白 B2 的表達由腫瘤抑制基因 p53 和 BRCA1 調節，這兩個基因通過抑制細胞週期蛋白 B2 轉錄而起作用 (Quaas et al., 2012; De et al., 2011)。CCNB2 上調在幾個腫瘤類型中進行了描述，如宮頸癌 (Espinosa et al., 2013; Rajkumar et al., 2011)、膀胱癌 (Lu et al., 2010)、結直腸癌 (Park et al., 2007)、星形細胞瘤 (Liu et al., 2013) 和膠質母細胞瘤 (Hodgson et al., 2009)。CCNB2 表達水準與乳腺癌預後差相關，並被確定為生存的獨立預後標誌物 (Shubbar et al., 2013)。CCNB2 在 NSCLC 中過度表達 (Hofmann et al., 2004)，被確定為肺腺癌患者預後不良的獨立預測因子，但不是鱗狀細胞癌的預測因子 (Takashima et al., 2014)。

MutS 同源物 6 (MSH6) - MSH6 編碼 DNA 錯配修復 MutS 家族的一員。MSH 蛋白，包括 MSH6，在複製過程中識別基因組序列的錯誤，以防止損壞鏈的複製並修復單鏈斷裂 (Conde-Perezprina et al., 2012)。在幾種癌症中，MSH6 突變和錯誤的 DNA 錯配修復機制 (MMR) 進行了描述（例如結直腸癌 (Sameer et al., 2014; Vilar and Gruber, 2010; Silva et al., 2009; Kastrinos and Syngal, 2007; Davidson, 2007)、胰腺癌 (Solomon et al., 2012)、卵巢癌 (Xiao et al., 2014)、乳腺癌 (Mahdi et al., 2013)）。

PRP3 前 mRNA 加工因子 3 同源物（釀酒酵母）(PRPF3) - PRPF3 編碼前 mRNA 加工因子 3。PRPF3 介導針對剪接體的核 RNA 衰變機制的募集 (Nag and Steitz, 2012)。PRPF3 通過轉錄因子 HNF4α的胎兒/癌症特異性剪接變體在肝細胞癌中上調 (Niehof and Borlak, 2008)。

溶血卵磷脂醯基轉移酶 1 (LPCAT1) - LPCAT1 催化溶血磷脂醯膽鹼 (LPC) 轉化至磷脂醯膽鹼。此外，LPCAT1 能夠把溶血 PAF（烷基化 LPC）轉換成血小板活化因子 (PAF)。LPCAT1 過度表達在結直腸癌 (Mansilla et al., 2009)、肝細胞癌 (Morita et al., 2013)、乳腺癌 (Abdelzaher and Mostafa, 2015)、攝護腺癌 (Xu et al., 2013; Grupp et al., 2013; Zhou et al., 2012) 和肺癌 (Wu et al., 2013b) 中進行過描述。LPCAT1 過度表達促進體外細胞增殖、遷移和侵襲 (Morita et al., 2013)。

SON 的下游鄰居  (DONSON) – DONSON 編碼 SON 的下游鄰居 (DONSON)。DONSON 是一種中心體蛋白，其水準在細胞週期期間被調節，在 S 期達到峰值。DONSON 是形成適當的有絲分裂紡錘體所需的，似乎在 DNA 損傷應答中起作用  (Fuchs et al., 2010)。目前無癌症相關的文獻。

苯並咪唑出芽抑制解除同源物 1 β（酵母）(BUB1B) - BUB1B 編碼 BUB1 絲分裂步驟的絲氨酸/蘇氨酸激酶 B，這是一種絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶。它的功能是作為一種有絲分裂調節劑，通過其在有絲分裂步驟中的作用並建立適當的微管著絲粒黏附，從而確保染色體精確分離。據報告，BUB1B 在各種腫瘤中表達既有上調也有下調。總體上，更多文獻報告 BUB1B 在癌症中過度表達，腫瘤進展和預後不良的關聯性也進行了描述，例如鼻咽癌 (Huang et al., 2012a)、扁桃體癌 (Hannisdal et al., 2010)、乳腺癌 (Maciejczyk et al., 2013)、卵巢上皮癌 (Lee et al., 2009) 和胰膽型腺癌 (Gladhaug et al., 2010)。同樣，BUB1B 蛋白減少與攝護腺癌更長的存活期有關 (Cirak et al., 2013)。

寡聚高爾基複合體 4 (COG4) - COG4 是寡聚蛋白複合體的組分，涉及高爾基體的結構和功能。相互作用的研究表明，COG4 作為該複合體的核心組分，在複合體的裝配/功能中持有重要作用 (Loh and Hong, 2004)。COG 亞基 COG4、6 和 8 可與定義的高爾基 SNARE 相互作用，並參與高爾基體內囊泡分揀特異性的定義  (Willett et al., 2013)。此外，COG 複合體已顯示可調節高爾基糖基化機制的維護 (Pokrovskaya et al., 2011)。

蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）26S 亞基，非 ATP 酶，14 (PSMD14) - PSMD14 是 26S 蛋白酶體——通過泛素途徑降解靶向破壞蛋白質的多蛋白複合體的組分。19S 複合體內 PSMD14 蛋白複合體 (19S cap; PA700) 負責蛋白酶體降解期間的基質去泛素化 (Spataro et al., 1997)。蛋白酶體亞基的異常表達和功能障礙參與惡性轉化以及對各種細胞毒性藥物的細胞抗性。PSMD14 在哺乳動物細胞的過度表達影響細胞增殖和對細胞毒性藥物（如長春堿、順鉑和多柔比星）的反應  (Spataro et al., 2002)。siRNA 轉染的 PSMD14 下調對細胞活力有相當大的影響，引起 G0-G1 期細胞阻滯，最終導致衰老 (Byrne et al., 2010)。

RAD54 同源物 B（釀酒酵母）(RAD54B) - DNA 修復和重組蛋白 RAD54B 是在人類由RAD54B 基因編碼的一種蛋白質。RAD54 結合至雙鏈DNA，並在存在 DNA 時顯示 ATP 酶活性。人類 RAD54B 蛋白是 RAD54 蛋白質的旁系，在同源重組中起著重要的作用。同源重組 (HR) 對於 DNA 雙鏈斷裂 (DSB) 的準確修復很重要 (Sarai et al., 2008)。已知在癌症中體細胞突變基因 RAD54B 的敲減導致哺乳動物細胞中染色體不穩定 (CIN)  (McManus et al., 2009)。RAD54B 升高的基因表達與 GBM 患者中較短的至疾病進展時間和不良 OS 有關 (Grunda et al., 2010)。 捲曲家族受體 1 (FZD1)、捲曲家族受體 2 (FZD2)、捲曲家族受體 7 (FZD7) -

基因 FZD2、FZD1 和 FZD7 均來自「捲曲」基因家族；該基因家族的成員編碼 7-跨膜結構域蛋白，他們是 Wnt 信號傳導蛋白的受體。FZD2 基因的表達似乎受發育調節，在胎兒腎臟、肺臟以及成人結腸和卵巢中呈高水準表達 (Sagara et al., 1998; Zhao et al., 1995)。FZD1 蛋白包含信號肽、 N-末端細胞外區域富含半胱氨酸的結構域、7 個跨膜結構域以及一個 C 端 PDZ 結構域結合基序。FZD1 轉錄物在各種組織中表達，包括肺、心臟、腎臟、胰腺、攝護腺和卵巢 (Sagara et al., 1998)。結果發現捲曲 1 和 2 受體的表達在乳腺癌中上調 (Milovanovic et al., 2004)。FZD7 蛋白含有 N 末端信號序列、10 個半胱氨酸殘基（典型的 Fz 家族成員的富含半胱氨酸胞外結構域）、7 個跨膜結構域以及有一個PDZ結構域結合基序的細胞內 C-端尾部。在低分化人食管癌中，FZD7 基因表達可能下調 APC 功能，增強β-連環蛋白介導的信號 (Sagara et al., 1998; Tanaka et al., 1998)。

無翅型 MMTV 整合位點家族，成員 5A (WNT5A) - 通常情況下，Wnt5a 調節多種細胞功能，如增殖、分化、遷移、黏附和極性 (Kikuchi et al., 2012)。它是在未分化的人胚胎幹細胞中表達 (Katoh, 2008)。WNT5A 被列為非轉化 WNT 家族成員，其在腫瘤發生中的作用仍不明確。它在某些癌症（甲狀腺、腦、乳腺和結直腸癌）中顯示出腫瘤抑制活性，但是在肺、胃和攝護腺癌中異常上調 (Li et al., 2010a)。致癌 WNT5A 在癌症幹細胞中啟動經典 WNT 信令以進行自我更新，在腫瘤間質介面的啟動非經典 WNT 信令以進行侵襲和轉移 (Katoh and Katoh, 2007)。WNT5A 的表達在各種腫瘤實體中進行了描述。例如，在 28% 的攝護腺癌病例中觀察到了 Wnt5a 的異常蛋白表達，其促進腫瘤侵襲性  (Yamamoto et al., 2010)。此外，WNT5A 過度表達被描述為與卵巢癌 (Badiglian et al., 2009)、黑色素瘤 (Da Forno et al., 2008; Weeraratna et al., 2002)、GBM (Yu et al., 2007)、肺癌 (Huang et al., 2005) 和胰腺癌 (Ripka et al., 2007) 的較差預後和/或腫瘤分級增加相關。在 HCC 中，似乎經典 Wnt 信號通路有助於腫瘤啟動和非典型信號傳導至腫瘤進展 (Yuzugullu et al., 2009)。

成纖維細胞活化蛋白 α (FAP) - 成纖維細胞活化蛋白 (FAP) 是一種屬於絲氨酸蛋白酶家族的 II 型整合膜糖蛋白。FAPα的推定絲氨酸蛋白酶活性和其體內誘導模式可能提示，該分子在發育、組織修復和上皮癌發生的過程中所起的作用為控制成纖維細胞生長或上皮-間充質相互作用 (Scanlan et al., 1994)。大多數正常成人組織和良性上皮性腫瘤顯示很少或沒有可檢測到的 FAP 表達。但是，FAP 表達在惡性乳房、結直腸、肺、皮膚和胰腺腫瘤 90% 以上的基質，傷口愈合成纖維細胞、軟組織肉瘤和一些胎兒間充質細胞中被檢測到。FAP 通過細胞黏附和遷移過程以及 ECM 成分的快速降解在癌細胞生長和轉移中發揮潛在作用。因此，它存在於侵入 ECM 的腫瘤細胞和參與血管生成的內皮細胞，但在相同類型的非活動細胞中不表達 (Dolznig et al., 2005; Kennedy et al., 2009; Rettig et al., 1993; Rettig et al., 1994; Scanlan et al., 1994; Zhang et al., 2010a)。

細胞週期蛋白 B1 (CCNB1) – CCNB1 編碼週期細胞蛋白 B1，是與 CDK1/CDC2 相關以促進有絲分裂進展的幾個有絲分裂細胞週期蛋白之一。CNB1 過度表達在許多癌症類型中進行了描述，並且與腫瘤進展和預後不良相關，例如結直腸癌 (Li et al., 2003)、乳腺癌 (Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009)、NSCLC (Cooper et al., 2009) 和食管鱗狀細胞癌 (Huang et al., 2014)。此外，在胃癌中，CCNB1 表達與區域淋巴結轉移和較差臨床預後相關 (Begnami et al., 2010; Fujita et al., 2012)。針對 CCNB1 的抗體在肺癌或攝護腺癌患者中檢測到，並被提議作為肺癌早期檢測的生物標誌物 (Egloff et al., 2005; Zhang et al., 2003)。

ATP 酶、Ca⁺⁺ 轉運、心肌、快速收縮 1 (ATP2A1)，ATP 酶、Ca⁺⁺ 轉運、心肌、快速收縮 2 (ATP2A2) - 這兩個基因 (ATP2A1和ATP2A2) 均編碼 SERCA Ca (2+)-ATP 酶。肌漿網 (SR) 1/ER 鈣 ATP 酶 (SERCA) 是鈣泵，在整個 SR/ER 膜結合 ATP 水解和鈣轉運體 (MacLennan et al., 1997)。SERCA 由三個同源基因編碼：SERCA1 (ATP2A1)、SERCA2 (ATP2A2) 和 SERCA3 (Wu et al., 1995)。出現的一些證據表明，SERCA 也可能對細胞凋亡、分化和細胞增殖的過程有直接的影響 (Chami et al., 2000; Ma et al., 1999; Sakuntabhai et al., 1999)。編碼 SERCA1 的 ATP2A1 的突變導致一些常染色體隱性形式的布羅迪氏病，其特徵在於運動期間肌肉鬆弛性受損加重 (Odermatt et al., 1996)。ATP2A2 是與毛囊角化病相關的 ATP 酶，這是一種罕見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，其特徵在於異常角質化和棘層松解 (Huo et al., 2010)。ATP2A2 的種系改變可能導致易患肺癌和結腸癌，ATP2A2 基因受損可能參與癌變  (Korosec et al., 2006)。在小細胞肺癌 (H1339) 和腺癌肺癌 (HCC) 細胞系中，ER Ca2+- 含量與正常人支氣管上皮相比下降。Ca2+- 含量下降與把鈣泵送至 ER 內的 SERCA 2 表達降低有關 (Bergner et al., 2009)。ATP2A2 可能是結直腸癌 (CRC) 患者的潛在預後標誌物。它在迴圈腫瘤細胞 (CTC) 中被檢測，術後復發與基因過度表達顯著相關 (Huang et al., 2012b)。

纖連蛋白 1 (FN1) - FN1 編碼纖連蛋白，這是一種糖蛋白，以可溶二聚體形式存在於血漿、以二聚體或多聚體形式存在于細胞表面並存在於細胞外基質。據報告，在大多數腫瘤中，FN1 主要由癌相關成纖維細胞 (CAF) 和內皮細胞表達，而不是腫瘤細胞表達 (Berndt et al., 2010)。FN1 水準升高已經在一些癌症類型中進行了報告，且與預後不良或癌症進展有關，例如膽囊癌 (Cao et al., 2015)、攝護腺癌 (von et al., 2013) 和腎細胞癌 (Steffens et al., 2012; Waalkes et al., 2010)。FN1 也牽涉肺癌發病的刺激，包括細胞生長、化學耐藥和凋亡抑制（綜述見 (Ritzenthaler et al., 2008)）。

胰島素樣生長因子 2 mRNA 結合蛋白 3 (IGF2BP3) - IGF2BP3 是胰島素樣生長因子-II mRNA 結合蛋白家族中的一員，涉及 mRNA 定位、轉換及翻譯控制。該蛋白包含數個 KH（鉀同源）結構域，這些結構域在 RNA 結合中起著重要作用，並已知參與 RNA 合成和代謝。表達主要在胚胎發育期間發生，並在一些腫瘤中有描述。因此，IGF2BP3 被認為是一種癌胚蛋白 (Liao et al., 2005)。IGF2BP3 可能通過增強 IGF-II 蛋白合成以及通過穩定 CD44 mRNA 誘導細胞黏附和侵襲從而促進腫瘤細胞增殖 (Findeis-Hosey and Xu, 2012)。此外，IGF2BP3 表達在許多人類腫瘤中進行了研究，越來越多的證據表明，它介導遷移、浸潤、細胞存活和腫瘤轉移 (Jeng et al., 2009; Kabbarah et al., 2010; Li et al., 2011; Liao et al., 2011; Lu et al., 2011; Hwang et al., 2012; Samanta et al., 2012)，也可能參與血管生成 (Suvasini et al., 2011; Chen et al., 2012)。在肺腺癌中，在中度或低分化腺癌中可檢測到較高頻率的 IGF2BP3 表達，這可能與侵襲性生物學行為相關 (Findeis-Hosey et al., 2010; Beljan et al., 2012; Findeis-Hosey and Xu, 2012)。 層粘連蛋白，γ2 (LAMC2) -

層粘連蛋白（細胞外基質糖蛋白家族）是基底膜的主要非膠原成分。它們牽涉多種生物學過程，包括細胞黏附、分化、遷移、信令、神經突向外生長和轉移。LAMC2 基因編碼層粘連蛋白-5 γ2 鏈（層粘連蛋白-5 的一部分），這是基底膜區的主要成分之一。LAMC2 在胃癌中經常由啟動子去甲基化上調 (Kwon et al., 2011)。LAMC2 被發現在異向性黑素瘤區域與缺血性黑色素瘤區域過度表達 (Lugassy et al., 2009)。LAMC2 是膀胱癌轉移的生物標誌物，其表達水準與腫瘤分級相關 (Smith et al., 2009b)。LAMB3 和 LAMC2 基因在 32 個 NSCLC  細胞系 21 個中共表達 (66%)，但在 13 個 SCLC 細胞系僅在 1 個中共表達 (8%)。LAMB3 和 LAMC2 基因的共表達也在檢測的所有 4 個原發性 NSCLC 細胞中觀察到，但在相應的非癌肺細胞中沒有觀察到 (Manda et al., 2000)。

腦內皮細胞黏附分子 (CERCAM) – CERCAM 定位于內皮細胞的表面 (Starzyk et al., 2000)，被映射到染色體 9q34.11 上，這是 9q 上的一個備選區域，確定為與家族性特發性脊柱側凸相關 (Miller et al., 2012)。CEECAM1 基因在神經系統和在幾個分泌組織（如唾液腺、胰腺、肝臟和胎盤）中廣泛轉錄 (Schegg et al., 2009)。CERCAM 蛋白在結構上類似於 ColGalT 酶 GLT25D1 和 GLT25D2。但是，雖然它的功能仍然未知，但是似乎在功能上與相關 GLT25D1 蛋白不同，而該蛋白沒有諸如 GLT25D1 和 GLT25D2 蛋白質的糖基轉移酶的功能 (Perrin-Tricaud et al., 2011)。

基質重塑相關蛋白 5  (MXRA5) - MXRA5，也稱為adlican，編碼黏附蛋白聚糖，屬於一組參與細胞外基質重塑和細胞-細胞黏附的基因  (Rodningen et al., 2008)。雖然 MXRA5 在癌症中的作用未知，但是 MXRA5 體細胞突變已經在來自各種組織（如皮膚、腦、肺和卵巢）的腫瘤中確認。在 adlican (MXRA5) 上進行的 RT-PCR 證實了相比正常結腸組織在結腸癌中過度表達的微陣列結果（13 個結直腸腫瘤和 13 個正常組織） (Zou et al., 2002)。在最近的一項研究中，基質重塑有關蛋白 5 是 NSCLC 中第二大最常見的突變基因（第一大為 TP53） (Xiong et al., 2012)。

ADAM 金屬肽酶域 8 (ADAM8) - ADAM8 是 ADAM（解聯蛋白和金屬蛋白酶域） 家族的一員。許多 ADAM 種類（包括 ADAM8）在人惡性腫瘤中表達，它們參與生長因子活性和整合功能的調節，導致促進細胞生長和侵襲 (Mochizuki and Okada, 2007)。ADAM8 的表達與 EGFR 呈正相關。兩者均主要表達於細胞質內和細胞膜上 (Wu et al., 2008)。ADAM8 在檢測的絕大多數肺癌中大量表達。ADAM8 的外源性表達增加哺乳動物細胞的遷移活性，這表明 ADAM8 可能在肺癌的發展中起著明顯作用 (Ishikawa et al., 2004)。ADAM8 與肺癌的預後不良相關 (Hernandez et al., 2010)。ADAM8 過度表達與較短的患者生存期有關，這是 RCC 遠端轉移的良好預測因子 (Roemer et al., 2004b; Roemer et al., 2004a)。此外，ADAM8 的表達水準和蛋白酶活性與神經膠質瘤細胞侵襲活性相關，這表明ADAM8 可能在腦癌腫瘤侵襲中發揮顯著作用 (Wildeboer et al., 2006)。

黑色素瘤抗原家族 F，1 (MAGEF1) - MAGE（黑素瘤相關抗原）超家族的大部分已知成員在腫瘤、睾丸和胎兒組織中表達，這被描述為癌症/睾丸表達模式（MAGE 亞組I）。MAGE 亞組 I 的肽已被成功地用於肽和 DC 疫苗接種 (Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999)。與此相反，一些 MAGE 基因（MAGE 亞組 II），如 MAGEF1，在所測試的所有成年和胎兒組織中普遍表達，也在許多腫瘤類型，包括卵巢癌、乳腺癌、子宮頸癌、黑素瘤和白血病中表達 (Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999)。儘管如此， MAGEF1 的過度表達可在 NSCLC (Tsai et al., 2007)  以及 79% 臺灣結直腸癌症患者佇列中檢測到 (Chung et al., 2010)。

小核糖核蛋白 200kDa (U5)  (SNRNP200) - mRNA 前剪接是由剪接體催化，剪接體是專門 RNA 和蛋白質亞基組成的複合體，可以消除轉錄 mRNA 前段的內含子。剪接體由小核 RNA 蛋白質 (snRNP) U1、U2、U4、U5 和 U6 以及大約 80 個保守蛋白質一起組成。SNRNP200 是 U4/U6 雙工解旋所需的基因，解旋是剪接體催化活化所必需的基因 (Maeder et al., 2009)。在心臟、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺中檢測到了 SNRNP200 的表達 (Zhao et al., 2009a)。SNRNP200 突變最近被發現與常染色體顯性色素性視網膜炎 (adRP) 相關 (Benaglio et al., 2011; Liu et al., 2012)。

TPX2，微管相關，同源物（非洲爪蟾） (TPX2) - TPX2 是一個紡錘體裝配因子。它是有絲分裂紡錘體和凋亡期間微管正常裝配所需的。TPX2 是染色質和/或著絲點相關微管成核所需的 (Bird and Hyman, 2008; Moss et al., 2009)。新合成 TPX2 是幾乎所有 Aurora A 活化和對卵母細胞成熟過程中體內 p53 充分合成和磷酸化所需的 (Pascreau et al., 2009)。TPX2 是一種細胞週期相關蛋白，在多種腫瘤類型中過度表達，如腦膜瘤 (Stuart et al., 2010)、喉鱗狀細胞癌 (SCCL) (Cordes et al., 2010)、口腔鱗狀細胞癌 (SCC)  (Shigeishi et al., 2009)、肝細胞癌 (HCC) (Satow et al., 2010)、胰腺腫瘤 (Warner et al., 2009)、卵巢癌 (Ramakrishna et al., 2010)、肺鱗狀細胞癌 (Lin et al., 2006; Ma et al., 2006)。它是經常與 Aurora-A 共同過表達，形成具有致癌性質的新功能單元 (Asteriti et al., 2010)。TPX2 表達是肺癌的預後指標 (Kadara et al., 2009)。

β 誘導的轉化生長因子，68kDa (TGFBI) - TGFBI 最先被認定為人肺腺癌細胞株的 TGF-β 誘導基因。它能編碼分泌出的細胞外基質蛋白，該蛋白被認為作用於細胞黏附物和細胞外基質成分。正常情況下，TGFBI 的表達主要存在于成纖維細胞、角質形成細胞和肌肉細胞 (Bae et al., 2002)。TGFBI 在幾個實體腫瘤中過度表達，如結腸癌 (Kitahara et al., 2001)、胰腺癌  (Schneider et al., 2002) 和腎癌 (Ivanov et al., 2008)。TGFBI 在肺癌中下調 (Zhao et al., 2004; Shao et al., 2006)，減少了肺腫瘤細胞的轉移可能性，當過度表達時促進凋亡細胞死亡 (Zhao et al., 2006)。在 NSCLC 樣本中，觀察到了 TGFBI 表達升高與對化療反應之間有很強的相關性 (Irigoyen et al., 2010)。

細胞週期蛋白依賴性激酶 4 (CDK4)/細胞週期蛋白依賴性激酶 6 (CDK6) - CDK4 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員。它是蛋白激酶複合體的催化亞基，對於細胞週期 G1 期的進展很重要。這種激酶的活性局限於細胞週期期間G1 至 S 期過渡期，其表達主要控制在轉錄水準上 (Xiao et al., 2007)。CDK4 和 CDK6 酶及其調節劑（例如，細胞週期蛋白）在胚胎發育、體內平衡和癌症發生中起著關鍵作用 (Graf et al., 2010)。在肺癌組織中，CDK4 蛋白的表達水準相對于正常組織顯著升高 (P ＜0.001)。CDK4 表達較高的患者總生存時間明顯短於 CDK4 表達低的患者。多因素分析表明，CDK4 表達水準是肺癌患者生存期的獨立預後指標 (P ＜0.001)。另外，抑制 CDK4 表達也顯著升高細胞週期調節因子 p21 基因的表達 (Wu et al., 2011)。在表達內源性 K-ras 癌基因的肺細胞中，消融 CDK4 而不是 Cdk2 或 CDK6 誘導立即的衰老反應。這樣的反應不會發生於表達單個等位基因 Cdk4 的肺部，也不會發生於其他 K-ras基因表達組織中。電腦斷層掃描可檢測的晚期腫瘤靶向 Cdk4 等位基因也誘導衰老並阻止腫瘤進展 (Puyol et al., 2010)。

多能聚糖 (VCAN) - VCAN 基因是聚集蛋白聚糖/多能聚糖蛋白聚糖家族的一員。VCAN 已知與細胞外基質中的一些分子相關，包括透明質酸、腱生蛋白、纖蛋白-1、纖連蛋白、CD44 和 L-選擇蛋白、原纖維蛋白、整聯蛋白和鏈結蛋白 (Zheng et al., 2004)。VCAN 在多種組織中表達。它在組織發育的早期階段高度表達，並且在組織成熟後其表達降低。其表達也在傷口修復和腫瘤生長期間升高 (Ghosh et al., 2010)。RNA 干擾敲減 VCAN 的人肺腺癌 (A549) 細胞在體內顯著抑制腫瘤生長，但在體外不抑制 (Creighton et al., 2005)。VCAN 是 p53 基因的直接靶標。VCAN 高表達也在早期攝護腺癌和乳腺癌的腫瘤周圍基質組織中發現，並與侵襲性腫瘤行為相關 (Yoon et al., 2002)。

泛素結合酶 E2S (UBE2S) - UBE2S 是促進有絲分裂退出的 APC 輔助因子。它的消耗延長藥物誘導的有絲分裂阻滯並抑制有絲分裂滑脫 (Garnett et al., 2009)。UBE2S 在常見的人類癌症中過度表達。在食管癌中，UBE2S 與腫瘤負荷程度顯著相關。其陽性與新輔助治療反應不佳和較差的生存期有關聯 (Chen et al., 2009)。在 UBE2S 啟動子中，確定了早期生長反應-1 (EGR-1) 和血清應答因子 (SRF) 結合位點。這些因子的過度表達增加了癌細胞增殖所需的 UBE2S 表達增加 (Lim et al., 2008)。

含 SET 和 MYND 結構域蛋白 3 (SMYD3) - 據報告，SMYD3（組蛋白 H3 賴氨酸 4 特異性甲基轉移酶）上調在結直腸癌 (CRC) 和肝細胞癌 (HCC) 的增殖中發揮關鍵作用。另一項研究表明 SMYD3 表達在絕大多數乳腺癌組織中也升高。與 CRC 和 HCC 一樣，小干擾 RNA 對該基因的 SMYD3 壓制導致乳腺癌細胞生長抑制，這表明 SMYD3 表達增加也是乳腺癌細胞增殖所必需的 (Hamamoto et al., 2006)。通過 RNA 干擾敲減 SMYD3 下調了 c-Met 的表達，並抑制 HGF 誘導的細胞遷移和侵襲 (Zou et al., 2009)。SMYD3 在 HeLa 細胞增殖和遷移/侵襲中起著關鍵作用，並且它可能是人類宮頸癌一個有用的治療靶標 (Wang et al., 2008)。 肌張力異常蛋白 (DST) -

DST (BPAG1-e) 編碼黏附連接斑塊蛋白質的血小板溶素蛋白家族的一員。BPAG1-E 在上皮組織中表達，錨固含角蛋白中間絲至半橋粒 (HDS) 。HD 是促進分層和複雜上皮細胞中上皮基質黏附的多蛋白黏附複合體。其功能的調節在各種生物過程中至關重要，例如，傷口癒合期間角化細胞的分化和遷移以及腫瘤侵襲，在此過程中細胞從基質分離並獲得一個能動表型 (Litjens et al., 2006)。惡性黑色素瘤是侵襲性最強的腫瘤類型之一。BPAG1 在人黑色素瘤細胞系（A375 和 G361）和正常人類黑素細胞中表達。黑色素瘤患者血清中抗 BPAG1 自身抗體的水準比健康志願者血清中的水準顯著提高 (p＜0.01)。抗 BPAG1 自身抗體可能黑色素瘤診斷的一個有前途的標誌物 (Shimbo et al., 2010)。DST 與乳腺癌侵襲有關 (Schuetz et al., 2006)。BPAG1 基因可能參與鼻咽癌 (NPC) 的增殖、凋亡、侵襲和轉移 (Fang et al., 2005)。

溶質載體家族 34（磷酸鈉），成員 2 (SLC34A2) - SLC34A2 是 pH 敏感型鈉依賴性磷酸轉運體。高分化腫瘤中 SLC34A2 基因表達上調可能反映卵巢致癌期間細胞分化過程，可作為卵巢癌診斷和預後的潛在標誌物 (Shyian et al., 2011)。RT-PCR 證實在乳頭狀甲狀腺癌中 SLC34A2 表達增加 (Kim et al., 2010b)。與正常組織相比，乳腺癌組織中 SLC34A2 的基因表達也顯著增加 (Chen et al., 2010)。

細胞黏合素 C（健生蛋白）(TNC) - 細胞黏合素 C (TNC) 是一種細胞外基質蛋白，在與遷移活性升高密切相關的過程中高度上調，這些過程如：胚胎發展 (Bartsch et al., 1992)、傷口癒合 (Mackie et al., 1988) 及腫瘤進程 (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003)。另外，TNC 在具有高增殖指數的腫瘤血管中多量表達，這表明，TNC 參與瘤血管生成 (Kim et al., 2000)。TNC 過度表達已在以下癌症中進行了進一步的報告：結腸癌  (De et al., 2013)；腺樣囊性癌，它與最差的預後有關  (Siu et al., 2012)；鼻咽纖維血管瘤，它可能促進血管生成 (Renkonen et al., 2012)；晚期黑色素瘤 (Fukunaga-Kalabis et al., 2010)；胰腺癌，它發揮著增殖、遷移和轉移作用 (Paron et al., 2011)。

內質網鈣結合蛋白 1、EF-手型鈣結合結構域 (RCN1)，內質網鈣結合蛋白 3、EF-手型鈣結合結構域 (RCN3) - 內質網鈣結合蛋白 1 是一種位於 ER 內腔中的鈣結合蛋白。免疫組化檢查證實 RCN 在胎兒和成人的各種器官中廣泛分佈，主要分佈於內分泌和外分泌器官。RCN 過度表達可能在腫瘤發生、腫瘤侵襲和耐藥性方面發揮作用 (Fukuda et al., 2007)。內質網鈣結合蛋白 1 (RCN1) 是內皮 (EC) 和攝護腺癌 (PCa) 細胞系中的細胞表面相關蛋白。細胞表面上的 RCN1 表達被腫瘤壞死因子α治療骨髓內皮細胞上調 (Cooper et al., 2008)。RCN1 在結直腸癌 (CRC) 中上調，局限於癌細胞或癌細胞附近的基質細胞。它可能是新的備選 CRC 標誌物 (Watanabe et al., 2008)。RCN3 是定位於分泌途徑的多種 EF 手型鈣結合蛋白 CREC（Cab45/內質網鈣結合蛋白/ERC45/鈣腔蛋白）家族的一員 (Tsuji et al., 2006)。在少突膠質細胞瘤中，RCN3 表明是一種潛在的重要候選基因。雖然關於 RCN3 的功能知之甚少 (Drucker et al., 2009)。

鹼性核蛋白 1 (BNC1) - 鹼性核蛋白是一種具有高度限制組織分佈的鋅指蛋白 (Tseng, 1998)。迄今為止，鹼性核蛋白主要在分層扁平上皮基底角質形成細胞（皮膚、口腔上皮、食管、陰道和角膜）以及睾丸和卵巢配子細胞中檢測到 (Tseng and Green, 1994; Weiner and Green, 1998)。現在有相當多的證據表明，鹼性核蛋白是 rRNA 基因 (rDNA) 的細胞類型特異性轉錄因子。鹼性核蛋白的鋅指在 rDNA 啟動子內與三個進化上保守的位點相互作用 (Iuchi and Green, 1999; Tseng et al., 1999)。經 CpG 甲基化的表觀遺傳調控在腫瘤發生以及癌症治療反應中起重要作用。BNC1 在抗輻射 H1299 人非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞系中低甲基化。H1299 細胞中 BNC1 mRNA 表達的抑制也降低了這些細胞對電離輻射的抗性 (Kim et al., 2010a)。在慢性淋巴細胞白血病 (CLL) 樣本中也檢測到 BNC1 的異常 DNA 甲基化 (Tong et al., 2010)。在腎細胞癌 (RCC) 中，BNC1 的甲基化與預後較差有關，與腫瘤大小、期別或分級無關 (Morris et al., 2010)。

轉化，含酸性捲曲螺旋蛋白 3 (TACC3) - TACC3 存在於 CH-TOG（結腸和肝腫瘤過度表達基因）和內涵蛋白的複合體，它們是在著絲粒纖維中交聯的微管。TACC3在某些增殖性組織中表達，包括睾丸、肺、脾、骨髓、胸腺和外周血白細胞。TACC3 表達在某些人類腫瘤類型中改變。在細胞中，TACC3 位於中心體和紡錘體微管，而不是星體微管 (Hood and Royle, 2011)。TACC3 表達與 p53 表達有關，腫瘤中 TACC3 與 p53 高表達的患者具有比腫瘤中兩種免疫染色法檢測表達水準都低的患者預後明顯較差 (P = 0.006)。這表明，TACC3 上升可能有利於 NSCLC 增殖並有助於腫瘤進展，同時 TACC3 表達是 NSCLC 臨床結局的一個強有力的預後指標 (Jung et al., 2006)。Tacc3 可能是 Notch 信號傳導途徑的負調控因子 (Bargo et al., 2010)。

山核桃素樣 3（果蠅）(PCNXL3) - 山核桃素樣蛋白 3 (PCNXL3) 是一種多通膜蛋白；它屬於山核桃素家族。PCNXL3 基因被映射至染色體11q12.1-q13區域。三種新的人類腫瘤相關易位中斷點均位於標誌物 D11S4933 和 D11S546 之間的染色體11q13區域。因而，PCNXL3 可能是一種 11q13 相關疾病基因 (van et al., 2000)。

Drosha 酶，核糖核酸酶 III 型 (DROSHA) - Drosha 酶是一種負責發起微 RNA (miRNA) 加工的 2 類核糖核酸酶III型酶，miRNA 由細胞天然表達的短小 RNA 分子，通過與 RNA 誘導的沉默複合體 (RISC) 相互作用來誘導作為 RNAi 途徑一部分的互補信使 RNA (mRNA) 的分裂而調節多種其他基因。微小 RNA分子被合成為長 RNA 初級轉錄物（稱作 pri-miRNA），其通過 Drosha 裂解以產生約 70 個堿基對長的特徵性莖-環結構（稱為 pre-miRNA）(Lee et al., 2003)。Drosha 作為一種被稱為微處理複合體的蛋白複合體的一部分存在，其中還包含雙鏈 RNA 結合蛋白 Pasha（也稱為 DGCR8）(Denli et al., 2004)，這對於 Drosha活性是必需的，並且能夠結合正確加工所需要的 pri-miRNA 的單鏈片段 (Han et al., 2006)。人類 Drosha 酶於 2000 年克隆出來，那時它被定為參與核糖體 RNA 前體加工的核 dsRNA 核糖核酸酶 (Wu et al., 2000)。Drosha 酶是首個被發現和克隆的人類核糖核酸酶 III 型酶。參與 miRNA 加工和活性的其他兩個人類酶為 Dicer 酶和 Argonaute 蛋白。Drosha 和 Pasha 均位於細胞核，在那裏 pri-miRNA 加工為 pre-miRNA。然後，後者進一步通過核糖核酸酶 Dicer 酶加工進入細胞質的成熟 miRNA (Lee et al., 2003)。Drosha 酶和其他 miRNA 加工酶可能是癌症預後的重要酶 (Slack and Weidhaas, 2008)。

細胞分裂週期 6 同源物（釀酒酵母）(CDC6) - CDC6 蛋白在 DNA 複製早期步驟中充當調控器。它在細胞週期 G1 期期間位於細胞核，但在 S 期開始轉運至細胞質中。另外，CDC6 在高等真核細胞中通過與 ATR 相互作用來調節複製步驟活化 (Yoshida et al., 2010)。CDC6 對 DNA 複製非常關鍵，其失調參與腫瘤發生。研究發現，通過 RNA 干擾 (RNAi) 的 CDC6 下調阻止細胞增殖，促進細胞凋亡 (Lau et al., 2006)。CDC6 被發現在數種癌症中過度表達。過度表達 CDC6 的癌症類型為胃癌 (Tsukamoto et al., 2008)、腦腫瘤 (Ohta et al., 2001)、口腔鱗狀細胞癌 (Feng et al., 2008)、子宮頸癌 (Wang et al., 2009) 和惡性間皮瘤 (Romagnoli et al., 2009)。

脫碘酶，碘化甲腺氨酸，II 型 (DIO2) - 由 DIO2 基因編碼的蛋白質屬於碘化甲腺氨酸脫碘酶家族。它在甲狀腺中高表達，並可能顯著導致格雷夫斯病和甲狀腺腺瘤患者甲狀腺 T3 產生的相對增加 (Meyer et al., 2008); (de Souza Meyer et al., 2005))。基因表達模式在向上和向下進展類型的鼻咽癌 (NPC) 之間顯著不同。DIO2 基因的表達在向下進展型癌症（向下 = 遠端轉移）中高於向上進展型癌症（顱底局部生長和侵襲），這可能與 NPC 的轉移可能性密切相關 (Liang et al., 2008a)。DIO2 mRNA 以及 DIO2 活性在腦腫瘤中表達 (Murakami et al., 2000)。肺中 D2 活性存在于並類似于外周肺和肺癌組織  (Wawrzynska et al., 2003)。

驅動蛋白家族成員 26B (KIF26B) - 驅動蛋白是屬於存在於真核細胞中一類動力蛋白的蛋白質。驅動蛋白沿微管絲移動，並且通過 ATP 水解獲得力量（因此驅動蛋白為 ATP 酶）。Kif26b，一種驅動蛋白家族基因，是 Sall1 的下游靶標 (Nishinakamura et al., 2011)。Kif26b 對腎發育至關重要，因為其調節與輸尿管芽接觸的間充質細胞的黏附。Kif26b 體外過度表達通過與非肌肉肌球蛋白的相互作用導致細胞黏附增加 (Terabayashi et al., 2012; Uchiyama et al., 2010)。

絲氨酸蛋白酶抑制劑，分化體 B（卵清蛋白），成員3 (SERPINB3) - 鱗狀細胞癌抗原 (SCCA)，也稱為 SERPINB3，是絲氨酸蛋白酶抑制劑 (serpin) 高分子量家族的一員 (Suminami et al., 1991)。在頭頸部組織癌症和其他上皮癌中報告有高水準表達 (Torre, 1998)。根據報告，與腫瘤周圍組織相比，SCCA 在腫瘤組織中過度表達，這表明其作為 HCC 組織學檢測潛在標誌物的作用 (Pontisso et al., 2004)。絲氨酸蛋白酶抑制劑 B3/B4，特別是絲氨酸蛋白酶抑制劑 B4，似乎在異常上皮細胞增殖中發揮著重要作用。絲氨酸蛋白酶抑制劑 B3/B4 的評估可能在預測疾病進展中有預後價值，特別是對於肺癌易感性增加的患者 (Calabrese et al., 2012)。一方面，SCCA1 (SERPINB3) 抑制溶酶體損傷誘導的細胞死亡，另一方面，它通過啟動獨立於死亡受體凋亡途徑的胱天蛋白酶-8 而使細胞對 ER 應激敏感 (Ullman et al., 2011)。一些研究結果表明，SERPINB3 在表皮屏障破壞的引導中起重要作用。SERPINB3 可能是表皮屏障功能的關鍵決定因素  (Katagiri et al., 2010)。

細胞週期蛋白依賴性激酶 1 (CDK1) - CDC2（細胞分裂週期 2)，也稱為 p34^cdc2 或Cdk1（細胞週期蛋白依賴性激酶 1），屬於絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族 Cdk，在細胞週期調控中發揮著關鍵作用 (Vermeulen et al., 2003)。在多種癌症中發現有 CDC2 過量表達，雖然根據 (Vermeulen et al., 2003) 的資料其他細胞週期蛋白(如，細胞週期蛋白)的表達失調更加頻繁。針對 NSCLC 的 CDC2 過度表達進行了描述 (Xu et al., 2011; Zhang et al., 2011)。Perumal 等人 (2012) 報告 CDC2 過度表達與預後不良相關 (Perumal et al., 2012)。此外，一項研究表明，臨床上可使用 CDC2 作為早期非小細胞肺癌復發的預測因子 (Kubo et al., 2014)。

膠原蛋白，XI 型，α1 (COL11A1) - COL11A1 編碼 XI 型膠原蛋白（較小的纖維狀膠原蛋白）兩個α鏈之一。根據報告，COL11A1 在幾種癌症中，例如結直腸癌 (Freire et al., 2014)、乳腺癌 (Ellsworth et al., 2009)、胃癌 (Zhao et al., 2009b)、膀胱腫瘤 (Ewald et al., 2013) 中上調。卵巢癌中 COL11A1 的表達與癌症復發和生存期較差有關。COL11A1 的敲減減少了小鼠體外細胞遷移、侵襲和腫瘤進展 (Cheon et al., 2014; Wu et al., 2014b)。根據微陣列分析結果，與健康對照組相比，COL11A1 被發現在不吸煙女性肺癌患者的肺組織中差異表達 (Lv and Wang, 2015)。

膠原蛋白，I 型，α2 (COL1A2) - COL11A2 編碼 I 型膠原蛋白的親α2 鏈，三螺旋結構包括兩個 α1 鏈和一個α2 鏈。在胃癌樣本中，COL1A2 被發現相比正常組織上調 (Yan et al., 2014; Yang et al., 2007)，並與較晚的分期相關 (Yasui et al., 2004)。據報告，COL1A2 在骨肉瘤 (Wu et al., 2014a)、晚期膀胱癌 (Fang et al., 2013)、頭頸部/口腔鱗狀細胞癌 (HNOSCC) (Ye et al., 2008) 和髓母細胞瘤（兒童中最常見的惡性腦腫瘤）中上調 (Liang et al., 2008b)。

骨膜素，成骨細胞特異性因子 (POSTN) - POSTN，該基因編碼與成束蛋白家族具有相似性的蛋白，參與細胞存活和血管生成，已成為各種類型人類癌症腫瘤進展的一種很有前途的標誌物 (Ruan et al., 2009)。骨膜素蛋白質或 mRNA 高表達在大多數實體瘤中檢測到，包括乳腺癌 (Zhang et al., 2010c)、結腸癌  (Kikuchi et al., 2008)、頭頸癌  (Kudo et al., 2006)、胰腺癌 (Kanno et al., 2008)、乳頭狀甲狀腺癌 (Puppin et al., 2008)、攝護腺癌 (Tischler et al., 2010)、卵巢癌 (Choi et al., 2010)、肺癌  (Takanami et al., 2008)、肝癌 (Utispan et al., 2010) 以及食管鱗狀細胞癌 (Kwon et al., 2009)。骨膜素在肺癌中異常高表達，與血管生成、侵襲和轉移有關 (Takanami et al., 2008)。A549 非小細胞肺癌  (NSCLC) 細胞骨膜素的沉寂抑制腫瘤細胞生長和減少細胞侵襲 (Wu et al., 2013c)。

含 AT 鉤，DNA 結合基序 1 (AHDC1) - 該基因編碼含有兩個 AT-鉤（可能在 DNA 結合中起作用）的蛋白質。這種基因的突變與腦視覺缺陷相關  (Bosch et al., 2015)。採用全基因組測序法，AHDC1 新發截斷突變在徵候群表現的語言發育遲緩、肌張力低下和睡眠呼吸暫停的患者中確定。突變最有可能導致這種遺傳性徵候群 (Xia et al., 2014)。

凋亡誘導因子，線粒體相關，2 (AIFM2) - 該基因編碼結合單鏈 DNA 的黃素蛋白氧化還原酶，且被認為在出現細菌和病毒 DNA 時可促進凋亡。AIFM2 沒有充分表徵，但是有限的證據表明，它可能充當腫瘤抑制因子。AIFM2 表達由腫瘤抑制基因 p53 活化，p53 的異位表達已被證明可誘導細胞凋亡。此外，AIM2 表達顯示在一系列人類腫瘤（包括腎、胃、結直腸以及其他癌症樣本）中下調 (Ohiro et al., 2002; Wu et al., 2004)。但是，在基因敲除的小鼠模型中，AIFM2 不是 p53 依賴性腫瘤抑制所需要的 (Mei et al., 2006)。在細胞培養中，AIFM2 參與介導腺苷誘導的細胞凋亡 (Yang et al., 2011)。

6號染色體開放閱讀框 132 (C6orf132) - C6orf132 編碼 6 號染色體開放閱讀框 132。基因C6orf132 位於染色體 6p21.1 上  (Mungall et al., 2003)。這種基因的功能尚不清楚。

CCZ1 液泡蛋白運輸和生物合成相關同源基因（釀酒酵母）(CCZ1)，CCZ1 液泡蛋白運輸和生物合成相關同源基因 B（釀酒酵母）(CCZ1B) - CCZ1 編碼 CCZ1 液泡蛋白質運輸和生物合成相關基因同源基因（釀酒酵母）。CCZ1B 編碼 CCZ1 液泡蛋白質運輸和生物合成相關基因同源基因 B（釀酒酵母）。CCZ1 和 CCZ1B 被確定為（通過比較蛋白質組學）在秀麗隱杆線蟲中進化上保守的人基因 (Lai et al., 2000)。基因 CCZ1 和 CCZ1B 位於染色體 7p22.1 上 (Hillier et al., 2003)。CCZ1 似乎通過在吞噬小體中募集 GTP 酶 RAB7A7 在溶酶體生物發生和吞噬小體成熟中起作用 (Nieto et al., 2010)。CCZ1B 基因是一個未表徵的基因。

膠原蛋白，V 型，α2 (COL5A2) - 該基因編碼低豐度纖維膠原蛋白之一的α鏈。根據報告，與鄰近的非癌組織相比，COL5A2 在結直腸癌組織樣本中上調 (Fischer et al., 2001)。導管原位癌 (DCIS)、浸潤性導管癌 (IDC) 和乳腺癌患者基質的對應樣本顯示，COL5A2 在 IDC 中表達升高 (Vargas et al., 2012)。骨肉瘤中，COL5A2 被報告為上調，在腫瘤發生中起重要作用 (Wu et al., 2014)。

聚集亞家族成員 12 (COLEC12) - 該基因編碼 C-凝集素家族的一員，該家族具有膠原蛋白樣序列和糖識別結構域。COLEC12 蛋白是一種清道夫受體，這是一種顯示與宿主防禦相關的多個功能的細胞表面糖蛋白。COLEC12 基因表明是未分化甲狀腺癌可能的候選生物標誌物 (Espinal-Enriquez et al., 2015)。COLEC12 在 HER2 陽性乳腺癌細胞系 BT474 中差異表達，可能促進曲妥單抗的效率 (von der Heyde et al., 2015)。

套體素蛋白複合體，亞基γ1 (COPG1) - COPG1 編碼套體素複合體 1 (COPI) 的蛋白質亞基。COPI 膜泡介導逆行運輸（從高爾基體返回至 ER）和高爾基體內運輸。COPI 套體的胞漿前體是七聚體套體素複合體，可被認為由兩個亞複合體組成。第一由β-，γ-，δ- 和 ξ-COP 亞基組成，它們與 AP 網格蛋白接頭亞基遠親同源  (Watson et al., 2004)。EGFR 的 EGF 依賴性核運輸通過從高爾基體到 ER 的逆行運輸調節，其涉及 EGFR 與γ-COP（COPI 套體素的亞基之一）的關聯性 (Wang et al., 2010b)。通過免疫組化方法，COPG1 被證實在肺癌衍生內皮細胞和癌性肺細胞中大量表達  (Park et al., 2008)。

CSNK2A2 - 酪蛋白激酶 II 亞基α-啟動因子是在人體中由 CSNK2A2 基因編碼的酶。一項回顧性研究表明，CSNK2A1 可能是 NSCLC 患者完全切除後獨立於淋巴結轉移狀態的有用預後標誌物 (Wang et al., 2010c)。CSNK2A2 與晚期人類結直腸癌的腫瘤進展相關 (Nibbe et al., 2009)。

表達樹突細胞七通跨膜蛋白 (DCSTAMP) - 該基因編碼主要在樹突細胞中表達的七通跨膜蛋白。所編碼的蛋白參與樹突狀細胞的一系列免疫功能。DCSTAMP 已被確定為在乳頭狀甲狀腺癌中差異表達的基因 (Lee et al., 2009)，隨後被證實在這些樣本中表達水準升高 (Kim et al., 2010)。

先天性角化不良 1，dyskerin (DKC1) - DKC1 基因在兩個不同複合體中發揮作用。Dyskerin 介導核糖體和小核 RNA 上尿苷的修飾以及端粒酶 RNA 組分 (TERC) 的穩定化。在人類腫瘤中，dyskerin 表達被發現與 rRNA 修飾和 TERC 水平均相關 (Penzo et al., 2015)。此外，dyskerin 過度表達與各種腫瘤類型（例如 HCC）的預後不良相關 (Liu et al., 2012)。

雙特異性酪氨酸 (Y)-磷酸化調節激酶 2 (DYRK2)/雙特異性酪氨酸 (Y)-磷酸化調節激酶 4 )(DYRK4) - DYRK2 和 DYRK4 屬於 Dyrk 蛋白激酶家族（有 5 個成員的哺乳動物家族），其參與細胞分化、增殖和存活的調節  (Papadopoulos et al., 2011)。DYRK2 通過降解 Snail 控制乳腺癌的上皮-間充質轉換 (Mimoto et al., 2013)。DYRK2 調控 p53 以誘導細胞凋亡並增強對 DNA 損傷的回應：在暴露于基因毒性應激後，DYRK2 易位到細胞核並通過磷酸化啟動 p53 (Meulmeester and Jochemsen, 2008; Taira et al., 2007)。DYRK4 基因映射到染色體 12p13.32，其被描述為 CRC 的一個易感基因，因為 CCND2基因受到了影響  (Jia et al., 2013; Peters et al., 2013)。一些研究強調了 DYRK4 在神經元分化中的作用 (Leypoldt et al., 2001; Slepak et al., 2012)。

ERO1 樣（釀酒酵母）ERO1L - ERO1 樣蛋白α是在人類中由 ERO1L 基因編碼的蛋白質。ERO1-α是存在於內質網和缺氧條件下被誘導的氧化酶。ERO1-α在多種腫瘤類型中呈過度表達。此外，癌症相關 ERO1-α通過氧化折疊調節MHC I 類分子的表達 (Kukita et al., 2015)。研究表明，hERO1-α在癌症細胞中的表達與預後較差相關聯，因此可能是乳腺癌患者的預後因子 (Kutomi et al., 2013)。在自然人類腫瘤中，ERO1L mRNA 在與 VEGF 表達上調一致的缺氧微環境中被專門誘導。研究表明，通過 siRNA 對 ERO1L 產生減少導致 VEGF 分泌的顯著抑制，使增殖能力受損並增強細胞凋亡  (May et al., 2005)。

序列相似性家族 83，成員A (FAM83A) - FAM83A 被確定在幾個不同癌組織類型中升高 (Cipriano et al., 2014)。但是，FAM83A 的功能尚不清楚  (Boyer et al., 2013)。FAM83A 在肺癌中被預測為一種腫瘤特異性基因，其在肺癌樣本中表達已被實驗證實。在腺癌中表達特別高 (Li et al., 2005)。其他人報告了與肺癌疾病進展相關 (Liu et al., 2008)。

脆性 X 智力低下，常染色體同源物 1 (FXR1) - 由 FXR1 基因編碼的蛋白是一種 RNA 結合蛋白，與功能上相似的蛋白質 FMR1 和 FXR2 相互作用。FXR1在多種人類疾病（包括癌症）中表達失調。FXR1 充當癌基因，這可能會增加癌細胞的增殖、遷移和侵襲 (Jin et al., 2015)。FXR1 是 NSCLC 一種新的癌基因，FXR1 其調節功能的方式是在肺癌細胞兩個相同的擴增子內與兩種其他癌基因——蛋白激酶 C，ι (PRKCI) 和上皮細胞轉化 2 (ECT2) 形成一種新的複合體 (Qian et al., 2015b)。據報告，NSCLC 中 FXR1 表達增加是預測存活差的候選生物標誌物，可能代表一種新的治療靶標。此外，FXR1 表達在多種人類癌症中與臨床結果差有關，這表明該 RNA 結合蛋白較廣泛地牽涉癌症進展 (Qian et al., 2015a)。

G2/M 期特異性 E3 泛素蛋白連接酶 (G2E3) - G2/M 期特異性E3 泛素-蛋白連接酶是在人體中被 G2E3 基因編碼的酶。G2E3 在細胞質和細胞核之間穿梭，集中在核仁並重新定位至核質，以回應 DNA 損傷。G2E3 是一個雙功能泛素連接酶，是早期胚胎形成過程中預防細胞凋亡所需的 (Brooks et al., 2008)。一些研究結果表明，G2E3 是 DNA 損傷應答和細胞存活的分子決定因素，並且其損耗使腫瘤細胞對 DNA 損傷治療敏感 (Schmidt et al., 2015b)。此外，G2E3 丟失觸發凋亡並減少癌細胞增殖。因此，G2E3 充當一種存活因子 (Schmidt et al., 2015a)。

鳥苷酸結合蛋白 5 (GBP5) - 人鳥苷酸結合蛋白5 (hGBP5) 屬於干擾素-γ誘導大 GTP 酶家族，因促炎性細胞因子導致的高感應而被熟知 (Wehner and Herrmann, 2010)。hGBP5 存在於三種剪接變體中，形成兩種不同的蛋白質，其中所述的腫瘤特異性蛋白的 C 端被截短 97 個氨基酸 (Fellenberg et al., 2004)。

穀氨醯胺酶 (GLS) – GLS 基因編碼 K 型線粒體穀氨醯胺酶。穀氨醯胺酶 (GLS) 將穀氨醯胺轉換為谷氨酸，在癌細胞代謝、生長和增殖中起著關鍵作用。一些研究表明，GLS 是腫瘤發生和支援小分子所需要的，且 GLS 基因抑制作為 GLS 腫瘤細胞自主依賴性靶向作用的可能方法以用於癌症治療 (Xiang et al., 2015)。GLS 剪接變體的暫態敲減表明，GAC 損失對 NSCLC 腫瘤細胞生長產生最不利的影響 (van den Heuvel et al., 2012)。在結腸癌 (Huang et al., 2014a)、肝細胞癌 (Yu et al., 2015) 和胰腺導管腺癌 (PDA) (Chakrabarti et al., 2015) 中，GLS1 的表達被上調並與臨床病理因素相關。

熱休克 70kDa 蛋白 2 (HSPA2) - HSPA2 已被確定為在一亞組人類癌症中以正常水準表達的潛在促癌蛋白，如乳腺癌 (Mestiri et al., 2001)、子宮頸癌 (Garg et al., 2010a)、膀胱上皮癌 (Garg et al., 2010c)、鼻咽癌 (Jalbout et al., 2003) 和惡性腫瘤 (Chouchane et al., 1997)。在來自幾種人類癌症細胞系中也觀察到了一定程度的 HSPA2 基因活性 (Scieglinska et al., 2008)，而癌症細胞中 HSPA2 基因的沉寂導致生長停滯和致瘤性降低 (Rohde et al., 2005; Xia et al., 2008)。此外，HSPA2 基因多態性與罹患肺癌風險增加相關 (Wang et al., 2010a)。HSPA2 的過度表達與乳腺癌、宮頸癌和膀胱尿路上皮癌的細胞增殖增加、分化差、淋巴結轉移相關 (Garg et al., 2010a; Garg et al., 2010c; Mestiri et al., 2001)。

熱休克 70kDa 蛋白 8 (HSPA8) -  HSPA8 基因編碼熱休克蛋白 70 家族 Hsc70 的一員，該家族包含熱誘導和組成性表達的成員。HSPA8 與新生多肽結合以促進正確的蛋白質折疊 (Beckmann et al., 1990)。HSC70 作為分子伴侶，輔助蛋白質合成、折疊、裝配、細胞室之間轉運以及降解 (Bukau and Horwich, 1998; Hartl and Hayer-Hartl, 2002)。HSC70 在非惡性乳腺細胞以及乳腺癌細胞中表達 (Kao et al., 2003; Vargas-Roig et al., 1998)，HSP/HSC70 在化療耐藥癌細胞中過度表達 (Ciocca et al., 1992; Lazaris et al., 1997) 存進了對這些蛋白可能的臨床指標進行研究 (Ciocca and Calderwood, 2005)。這一分泌的 hsc70 伴侶在細胞增殖中發揮潛在作用，可能導致過度表達組織蛋白酶 D 癌症細胞的更高比例的腫瘤生長 (Nirde et al., 2010)。此外 Ruisin 等人報告了該基因多態性與肺癌風險之間有關 (Rusin et al., 2004)。

熱休克 70kDa 蛋白 1A (HSPA1A) - HSPA1A，也稱為 HSP72，被證明在癌症中強烈上調，並通過抑制 p53 依賴性和 p53 非依賴性衰老途徑而在腫瘤細胞生長中發揮關鍵作用 (Sherman, 2010)。在 RCC (Atkins et al., 2005) 和胃腸癌 (Wang et al., 2013a) 中過度表達，其中後者顯示與淋巴結和遠端轉移的進展、浸潤和存在有顯著相關性。

熱休克 70kDa 蛋白 1B (HSPA1B) - HSPA1B，也稱為 HSP70-2，編碼睾丸特異性熱休克蛋白 70-2，對於精母細胞和癌細胞的生長是必不可少的 (Hatfield and Lovas, 2012)。不同的研究表明，HSP70-2 在宮頸癌 (Garg et al., 2010b)、腎細胞癌 (Singh and Suri, 2014) 和膀胱癌的疾病進展中起著重要作用，基因內多態性與胃癌發展相關 (Ferrer-Ferrer et al., 2013)。有些功能性 HSPA1B 變體與肺癌風險和生存相關。這些 Hsp 70 基因變體可能會為預測肺癌風險和預後提供有用的生物標誌物 (Szondy et al., 2012; Guo et al., 2011)。

熱休克 70kDa 蛋白 1 樣 (HSPA1L) - 熱休克 70 kDa 蛋白 1L 是在人體中由染色體 6 上的 HSPA1L 基因編碼的蛋白。雖然它與 HSPA1A 和 HSPA1B 具有很近的同源性，但是調節不同且不是可熱誘導的 (Ito et al., 1998)。基因內多態性與攝護腺癌的易感性和預後 (Sfar et al., 2010) 以及肝細胞癌易感性 (Medhi et al., 2013) 有關。

熱休克 70kDa 蛋白 6 (HSP70B') (HSPA6) - 熱休克蛋白 (Hsp) 70B' 是嚴格可誘導的人 Hsp70 伴侶蛋白，在大多數細胞中很少有或沒有基礎表達水準 (Noonan et al., 2007)。HSPA6，也被稱為 熱休克蛋白 70B'，顯示在膠質母細胞瘤細胞 (Huang et al., 2014b) 中通過 Y15 處理和頭頸部癌細胞 (Narita et al., 2002) 熱休克而上調。HSPA6 水準高可能與 HCC 的早期復發相關 (Yang et al., 2015)。

熱休克蛋白 70kDa 7 (HSP70B) (HSPA7) - HSPA7 是一種假基因。

HSPA（熱休克 70kDa）結合蛋白，細胞質輔助伴侶分子 1 (HSPBP1) - 熱休克結合蛋白HspBP1 是 Hsp70 輔伴侶分子家族的一員。HspBP1 是一種輔助伴侶分子，結合並調節伴侶分子 Hsp70。HspBP1 和Hsp70 水準在乳腺癌患者的血清中均顯著高於健康個體血清中的水準 (Souza et al., 2009)。HSPBP1 在白血病患者中過度表達 (Sedlackova et al., 2011)。HspBP1 在人 HCV-HCC 中上調，這種增加與 Hsp70 水準增加相關 (Yokoyama et al., 2008)。

含 GTP 酶啟動蛋白 IQ 基序 1 (IQGAP1) - IQGAP1，也被稱為 p195，是在人體中由 IQGAP1 基因編碼的普遍表達的蛋白質。IQGAP1 是幾個不同細胞過程，特別是細胞骨架重排的關鍵介體。最近的研究表明 IQGAP1 在癌症中的潛在作用，這由在一系列腫瘤中觀察到的 IQGAP1 過度表達和不同的膜定位而得到證明 (Johnson et al., 2009)。IQGAP1 過度表達可能在胰腺癌發生和進展中發揮重要作用 (Wang et al., 2013c)。抑制 IQGAP1 表達減少了食管鱗狀細胞癌 (ESCC) 中的腫瘤細胞生長、遷移和侵襲。 (Wang et al., 2014c)。此外，卵巢癌幹細胞樣細胞 (CSC-LCS) 分化期間 IQGAP1 表達增加參與侵略性細胞行為，這可能導致卵巢癌轉移 (Huang et al., 2015a)。

整聯蛋白，β6 (ITGB6) - ITGB6 是整聯蛋白的子類型，只在上皮細胞表面表達，並且是細胞外基質蛋白的受體 (Weinacker et al., 1994)。一項研究發現，相對于正常組織，ITGB6 在所研究的 10 種腫瘤類型中表達增加。據報告，子宮、皮膚、食管、頭頸部鱗狀細胞癌的 ITGB6 表達頻率最高。值得注意的是，ITGB6 抗體介導的阻斷抑制體內腫瘤進展  (Van Aarsen et al., 2008)。ITGB6 已被開發為腫瘤特異性藥物遞送的靶標，並增強結腸癌的治療療效 (Liang et al., 2015; Zhao-Yang et al., 2008)。在乳腺癌中，無論是 mRNA 或蛋白質的 ITGB6 高表達均與很差的生存和遠處轉移增加有關。ITGB6 靶向抗體抑制乳腺癌小鼠模型的腫瘤生長 (Allen et al., 2014)。

賴氨酸 (K)-特異性脫甲基酶 6B (KDM6B) - KDM6B，也稱為 JMJD3，是在人體中由KDM6B 基因編碼的組蛋白脫甲基酶。KDM6B 通過組蛋白 3 賴氨酸 27 殘基的去甲基化而影響轉錄調控。KDM6B 表達低是手術切除結直腸癌患者預後差的獨立預測因子 (P = 0.042) (Yokoyama et al., 2008)。此外，KDM6B 過度表達通過啟動線粒體依賴性凋亡並通過減弱 NSCLC 細胞侵襲轉移級聯而抑制細胞生長 (Ma et al., 2015)。另一方面，KDM6B 在腎透明細胞癌 (ccRCC) 呈高水準表達，並與 ccRCC 預後差呈正相關。KDM6B 敲減能在體外抑制 ccRCC 腫瘤形成 (Li et al., 2015)。此外，KDM6B 的失調控可能有助於通過抑制 p53 途徑形成神經膠質瘤，導致終端分化阻滯 (Ene et al., 2012)。

角蛋白 9，I 型 (KRT9) - 角蛋白 9 是一種 I 型角蛋白，在人體中由 KRT9 基因編碼。它僅發現於手掌和腳底的終末分化表皮中。編碼本蛋白的突變導致表皮掌蹠角化病  (Reis et al., 1994)。KRT9 在 HCC 中上調。這種過度表達可能在 HCC 轉移中起著至關重要的作用，並且可以作為預測 HCC 轉移的一個潛在血清標誌物 (Fu et al., 2009)。

LINE1 反轉錄轉座元素 1 (L1RE1) -  L1RE1 基因，也被稱為 LRE1，編碼「LINE」（長散佈核元素）反轉錄轉座元素 (LRE)，這是一種含有自主轉座子活性的移動 DNA 序列。根據報告，LINE1 反轉錄轉座子家族在許多癌症中低甲基化，反映了基因組的普遍甲基化狀態 (Ostertag and Kazazian, Jr., 2001)。一個長散佈核元素重複區域 LRE1 位於 22q11-q12，是普遍甲基化狀態不變的指標  (Chalitchagorn et al., 2004; Ostertag and Kazazian, Jr., 2001)。一些資料表明，LRE1 相對甲基化是頭頸部鱗狀細胞癌 (HNSCC) 的一個獨立後生生物標誌物 (Hsiung et al., 2007)。

層粘連蛋白，β3 (LAMB3) - LAMB3 編碼層粘連蛋白的 β3 亞基，其與α和 γ 亞基一起形成層粘連蛋白 5。在甲狀腺乳頭狀癌 (PTC)  (Barros-Filho et al., 2015)、宮頸鱗狀細胞癌（宮頸 SCC） (Yamamoto et al., 2013) 和口腔鱗狀細胞癌 (OSCC) (Tanis et al., 2014) 中 LAMB3 上調。基因陣列和生物資訊學分析提示 LAMB3 是參與肺癌的關鍵基因。該基因的敲減抑制人肺癌細胞體外和體內侵襲和轉移。LAMB3 在肺癌患者中過度表達，其表達與淋巴結轉移相關 (Wang et al., 2013b)。

溶酶體蛋白跨膜 5 (LAPTM5) - LAPTM5 基因編碼與溶酶體相關的細胞內小泡膜蛋白。LAPTM5 在肺癌中異常甲基化，甲基化與腫瘤分化狀態相關 (Cortese et al., 2008)。LAPTM5 陽性囊泡與神經母細胞瘤的自發消退過程中發生的程序性細胞死亡密切相關 (Inoue et al., 2009)。CD1e 蛋白參與樹突狀細胞中脂質抗原的表現。LATPM5 控制 CD1e 泛素化或可溶性溶酶體 CD1e 蛋白的產生 (Angenieux et al., 2012)。

微小染色體維持複合體成分 4 (MCM4) - 由 MCM4 基因編碼的蛋白質是啟動真核基因組複製所必需的高度保守的微小染色體維持蛋白 (MCM) 中的一個。MCM4 在膀胱癌 (Zekri et al., 2015) 下調，與正常肺組織相比，在肺腺癌中差異表達 (Zhang et al., 2014)。MCM4 過度表達與乳腺癌患者較短生存相關 (Kwok et al., 2015)。

微小染色體維持複合體成分 5 (MCM5) - MCM5 涉及 DNA 複製和細胞週期調控。MCM5 高表達水準被證明與口腔鱗狀細胞癌 (Yu et al., 2014)、子宮頸癌 (Das et al., 2013)、胃癌 (Giaginis et al., 2011) 和結腸癌 (Burger, 2009) 的進展和較差預後相關。

黑素麴菌素 (MREG) – MREG 通過逆行微管依賴性黑素體運輸的調節在細胞內黑素體分佈中起作用 (Wu et al., 2012) (Ohbayashi et al., 2012)。此外，MREG 還在色素摻入到黑素調節中發揮作用 (Rachel et al., 2012)。雌激素受體陽性的乳腺癌細胞中，MREG 顯示通過 其 3' 非編碼區的 miRNA-26 靶向作用。但是，MREG 直接參與 miRNA-26 介導的細胞增殖不能得到證實 (Tan et al., 2014)。

NODAL 調節劑 1 (NOMO1)/NODAL 調節劑 2 (NOMO2)/NODAL 調節劑 3 (NOMO3) - NOMO1、NOMO2 和 NOMO3 基因是位於染色體 16 臂 p 上複製區域的三個高度相似的基因。這些基因編碼可能具有相同功能的密切相關蛋白質。NOMO1 被確認為在皮膚 T 細胞淋巴瘤 (CTCL) 細胞系 HuT78 中的過度表達基因 (Lange et al., 2009)。NOMO1 是 Nodal 信號傳導的拮抗劑。Nodal 是轉化生長因子-β (TGF-β) 超家族的信號傳導因子，在脊椎發育中起著關鍵作用 (Haffner et al., 2004)。

核孔蛋白 153kDa (NUP153) - 核孔蛋白 153 (Nup153)，是核孔複合體 (NPC) 的一個組成部分，涉及 NPC 與核纖層的相互作用。Nup153 耗竭誘導戲劇性細胞骨架重排，其損害人乳腺癌細胞的遷移 (Zhou and Pante, 2010)。NUP153 核孔蛋白調節細胞核與細胞質之間的特異性蛋白分佈，有趣的是，包括 TGFβ信號傳導的轉導因子 SMAD2  (Xu et al., 2002)。最近，一些分析顯示了胰腺癌核孔蛋白 NUP153 可能的新式致癌功能（表面上通過調製 TGFβ 信令） (Shain et al., 2013)。

PERP、TP53 凋亡效應子 (PERP) – PERP 是編碼橋粒蛋白的 p53/p63 調節基因，該蛋白在細胞-細胞黏附和腫瘤抑制中起著關鍵作用。PERP 表達的喪失與過渡至鱗狀細胞癌 (SCC) 以及口腔 SCC 患者局部復發增加相關 (Kong et al., 2013)。PERP 表達在許多人類乳腺癌細胞系中降低 (Dusek et al., 2012)。一些研究表明，Perp 缺乏通過增強細胞存活、橋粒損失和炎症促進癌症發生 (Beaudry et al., 2010)。PERP 是 p53 基因的細胞凋亡相關靶標，單獨活化足以誘導細胞凋亡途徑，導致細胞死亡 (Chen et al., 2011)。

推定同源結構域轉錄因子 1 (PHTF1) /推定同源結構域轉錄因子 2 (PHTF2) - PHTF1（推定同源域轉錄因子）是位於人類基因組 1p11-P13 的推定同源基因。這種基因是進化上保守的，並主要表達於睾丸 (Manuel et al., 2000)。作為一種轉錄因子，PHTF1 基因主要參與如 DNA 依賴性轉錄的生物過程並調節生物過程。PHTF1過度表達負責調節 T 細胞急性淋巴細胞白血病 (T-ALL) 細胞系的細胞增殖和凋亡。PHTF1可以是腫瘤抑制樣基因，用於觸發 PHTF1-FEM1b-Apaf-1 細胞凋亡途徑的治療靶標 (Huang et al., 2015b)。

推定同源結構域轉錄因子 2 是在人體中由 PHTF2 基因編碼的蛋白質。PHTF2 主要在肌肉中表達，位於人類基因組7q11.23-q21 (Manuel et al., 2000)。

包含普列克底物蛋白同源結構域，家族 M（有 RUN 結構域）成員1 (PLEKHM1) - 由 PLEKM1 基因編碼的蛋白質是骨吸收必不可少的，並且在破骨細胞囊泡運輸中可能發揮重要作用。這種基因的突變與常染色體隱性遺傳骨硬化型 6 (OPTB6) 相關 (van et al., 2004)。研究表明 PLEKHM1為上皮性卵巢癌的候選易感基因 (Permuth-Wey et al., 2013)。

磷脂轉移蛋白 (PLTP) - 磷脂轉移蛋白 (PLTP) 在炎症調節中起重要作用。一些資料表明，PLTP 在巨噬細胞中具有抗炎能力 (Vuletic et al., 2011)。此外，PLTP 在調節三醯基脂質 A 與脂蛋白的關聯性中必不可少，從而導致其殘留時間延長和其促炎和抗癌特性放大 (Gautier et al., 2010)。PLTP 在乳腺癌患者中差異表達，可能與化療反應相關 (Chen et al., 2012)。

蛋白磷酸酶 2，調節亞基 B''，α (PPP2R3A) - 該基因編碼蛋白磷酸酶 2 的其中一種調節亞基。蛋白磷酸酶 2（以前命名 2A 類型）是四種主要絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶之一，牽涉細胞生長和分裂的負控制 (Ruediger et al., 2001)。PPP2R3A 在兒童急性淋巴細胞白血病 (ALL) 中頻繁甲基化 (Dunwell et al., 2009)。

PTC7 蛋白磷酸酶同源物（釀酒酵母）(PPTC7) - PPTC7 編碼 PTC7 蛋白磷酸酶同源物，位於染色體 12q24.11。PPTC7 最近被確定為回應於環境毒素的新易感基因 (Zhu et al., 2015)。

蛋白激酶，DNA 活化的催化多肽 (PRKDC) – PRKDC 編碼 DNA 依賴性蛋白激酶 (DNA-PK) 的催化亞基，DNA-PK 是 PI3/PI4 激酶家族的一員。研究表明，PRKDC 可經 Akt/GSK3 通路穩定 c-Myc 癌蛋白 (An et al., 2008)。PRKDC 的啟動與 HCC 增殖、基因組不穩定性和微血管密度正相關，與細胞凋亡和患者生存負相關 (Evert et al., 2013)。

蛋白酶體（前體、巨蛋白因子）亞基，α-型，4 (PSMA4) - PSMA4 編碼蛋白酶亞基α4，其在非溶酶體途徑中以ATP /泛素依賴的過程裂解肽。PSMA4 基因的單核苷酸多態性與中國漢族人群肺癌風險相關 (Wang et al., 2015)。另一方面，根據報告，PSMA4 基因的單核苷酸多態性不是非小細胞肺癌易感性的主要促成因素 (Yongjun Zhang et al., 2013)。此外，與正常肺組織相比，觀察到 PSMA4 在肺腫瘤中過度表達。PSMA4 表達的下調降低蛋白酶活性並誘導細胞凋亡 (Liu et al., 2009)。

蛋白酪氨酸磷酸酶，非受體型 13 (PTPN13) - 該基因編碼蛋白酪氨酸磷酸酶 (PTP) 家族的一員。PTP 是信號傳導分子，調節多種細胞過程，包括細胞生長、分化、有絲分裂週期和致癌性轉化。PTPN13 被發現與 Fas 受體相互作用，因此可能在 Fas 介導的程序性細胞死亡中起作用。此外，PTPN13 與 GTP 酶啟動蛋白相互作用，因此可作為 Rho 信號傳導途徑的調節因子。在血液惡性腫瘤中，PTPN13 具有矛盾的作用，分別抑制或促進淋巴瘤和骨髓性白血病的腫瘤生長 (Wang et al., 2014b)。這可通過 PTPN13 抵消致癌酪氨酸激酶活性的能力及其抑制與 Fas 死亡受體相互作用來解釋 (Freiss and Chalbos, 2011)。在乳腺癌中，PTPN13 被視為乳腺腫瘤回應於抗雌激素的獨特標誌物，並且是啟動腫瘤細胞凋亡刺激物的潛在治療靶標 (Freiss et al., 2004)。Fas/PTPN13 結合的抑制可能為開發抗癌藥物提供良好的靶標 (Takahashi and Kataoka, 1997)。

RAS p21 蛋白活化劑 2 (RASA2) - RAS p21 蛋白活化劑 2 編碼 GTP 酶啟動蛋白 GAP1家族的一員。作為 RAS 功能的抑制劑，RASA2 增強 RAS 蛋白的弱內在 GTP 酶活性，導致 RAS 的非活性 GDP 結合形式，從而控制細胞增殖和分化。取決於精確遺傳改變、其基因內的位置以及它對蛋白質功能施加的影響，RASA2 在理論上可用作任一個癌基因或作為腫瘤抑制基因 (Friedman, 1995)。輕度應急條件下，RASA2 由胱天蛋白酶-3 裂解，這形成片段，稱為N 片段刺激抗死亡信令。當胱天蛋白酶-3 活性進一步增加時，這會產生一個片段，稱為 N2，它不再保護細胞。另一方面，全長 RASA2 通過避免受失活磷酸酶影響而促成 Akt 活性 (Cailliau et al., 2015)。在乳腺癌中，應啟動化的胱天蛋白酶-3 可能通過片段 N2 的產生有助於抑制轉移 (Barras et al., 2014)。RASA2 被確認為在 5% 黑色素瘤中突變的腫瘤抑制基因 (Arafeh et al., 2015)。

免疫球蛋白 κ J 區重組信號結合蛋白 (RBPJ) - 免疫球蛋白 κ J 區重組信號結合蛋白編碼對於 Notch 信號傳導途徑重要的轉錄調控因子。當不與 Notch 蛋白結合時， RBPJ 充當抑制劑，當與Notch 蛋白結合時， RBPJ  充當活化劑。它被認為通過募集含有組蛋白去乙醯或組蛋白乙醯化酶蛋白的染色質重塑複合體至Notch 信號通路而發揮作用。異種移植物小鼠模型顯示，RBPJ 敲減抑制致瘤性並降低腫瘤體積，表明組織缺氧可通過上調 RBPJ 促進 Smoothened 轉錄以誘導胰腺癌細胞的增殖、侵襲性和腫瘤發生 (Onishi et al., 2016)。RBPJ 敲減導致細胞生長顯著下降的作用也在攝護腺癌和肺癌細胞中發現，這表明RBPJ 表達可能是治療人類癌症一個有前途的治療方式 (Xue et al., 2015; Lv et al., 2015)。此外，RBPJ 過度表達促進橫紋肌肉瘤細胞的錨定依賴性生長 (Nagao et al., 2012)。RBPJ 介導的 Notch 信號傳導對樹突細胞依賴性抗腫瘤免疫應答也是至關重要的 (Feng et al., 2010)。

含 9 樣的無菌 α 基序結構域 (SAMD9L) - SAMD9L 編碼含有 9 樣無菌 α 基序結構域並位於染色體 7q21.2。SAMD9 和 SAMD9L 基因具有共同的基因結構，並以 60% 的氨基酸同一性編碼蛋白質，表明有抑制炎症通路的作用。SAMD9L 定位於早期內涵體，充當核內體融合促進者。SAMD9L 基因的單倍不足有助於骨髓轉化，SAMD9L被確定為候選髓腫瘤抑制基因 (Nagamachi et al., 2013)。SAMD9L 敲減顯著促進細胞增殖和肝細胞癌細胞系的集落形成，這是因為 SAMD9L 的沉寂使細胞週期進程的 G1-S 期過渡並導致 Wnt /β-連環蛋白通路的活性升高。最近發現強調了體細胞突變導致 SAMD9L 失活的腫瘤抑制作用，並在人類癌症中表達降低 (Wang et al., 2014a)。與健康對照人群相比，SAMD9L 在轉移性黑素瘤患者的 T 和 B 細胞群中表現出表達顯著降低 (Critchley-Thorne et al., 2007)。

剪接因子 3b，亞基 3，130kDa (SF3B3) - SF3B3 編碼剪接因子 3b 蛋白複合體的亞基 3。SF3B3 過度表達與雌激素受體陽性乳腺癌中整體存活和內分泌性顯著相關 (Gokmen-Polar et al., 2015)。

表面活性蛋白 A1 (SFTPA1)/表面活性蛋白 A2 (SFTPA2) - 這些基因編碼肺表面活性蛋白，這些蛋白是稱為膠原凝集素的 C 型凝集素亞家族的一員。SFTPA 結合於脂質和微生物表面上發現的特定碳水化合物部分，並在表面活性劑穩態和呼吸道病原體的防禦中發揮至關重要的作用。這些基因的突變與特發性肺纖維化有關。肺癌特異性基因標誌，含有 SFTPA1 和 SFTPA2 基因，從其他癌症樣本中準確分辨肺癌 (Peng et al., 2015)。EGFR 突變在有 SFTPA 表達的肺腺癌中比那些沒有 SFTPA 表達的肺腺癌中明顯更常見 (Jie et al., 2014)。SFTPA 通過調節腫瘤相關巨噬細胞的極化而抑制肺癌進展 (Mitsuhashi et al., 2013)。肺上皮細胞突變 SFTPA2 的表達導致潛在 TGF-β1 和 TGF-β1 介導的 EMT 分泌  (Maitra et al., 2012)。此外，攝護腺癌的發展可能與 SFTPA 水準降低有關 (Kankavi et al., 2014)。

溶質載體家族 25（線粒體載體；腺嘌呤核苷酸轉位分子）成員 31 (SLC25A31)/溶質載體家族 25（線粒體載體；腺嘌呤核苷酸轉位分子）成員 4 (SLC25A4)/溶質載體家族 25（線粒體載體；腺嘌呤核苷酸轉位分子）成員 5 (SLC25A5)/溶質載體家族 25（線粒體載體；腺嘌呤核苷酸轉位分子）成員 6 (SLC25A6) - 溶質載體家族 25 的蛋白質​​為 ADP/ATP 載體，在線粒體中針對基質 ATP 交換胞質ADP。它們用作易位 ADP/ATP 的門控孔，並形成嵌於內線粒體膜的同型二聚體。過度表達該基因家族的細胞已被證明可顯示抗凋亡表型。此基因家族的抑制表達顯示可誘導凋亡，抑制腫瘤生長。雖然 SLC25A4 優先存在於分化組織中，並且專門針對肌肉和大腦存在，但是 SLC25A5 在增生組織（如腫瘤）中表達。SLC25A6 是普遍表達，SLC25A31 存在於肝細胞和生殖細胞中 (Dolce et al., 2005)。特別是 SLC25A5 有助於癌變。由於 SLC25A5 表達與腫瘤線粒體生物能密切相關，所以，這是癌症個體化治療和抗癌策略開發的有前途的靶標 (Chevrollier et al., 2011)。此外，SLC25A31 穩定的過度表達保護癌症細胞免受氯尼達明和星形孢菌素細胞凋亡影響，與 Bcl-2 表達無關。因此，在人 SLC25 同種型子家族中發現二分現象，SLC25A4 和 SLC25A6 異構體有促凋亡功能，而 SLC25A5 和 SLC25A31 異構體使細胞死亡誘導刺激物不敏感 (Gallerne et al., 2010)。

SP140 核體蛋白 (SP140) - SP140 編碼 SP140 核體蛋白，位於染色體 2q37.1 上。SP140被證明在喉鱗狀細胞癌中上調 (Zhou et al., 2007)。SP140 與慢性淋巴細胞性白血病 (Lan et al., 2010)、多發性骨髓瘤 (Kortum et al., 2015) 和急性早幼粒細胞性白血病 (Bloch et al., 1996)有關。

信號轉導器和轉錄活化劑 1，91kDa (STAT1) - STAT1 被酪氨酸磷酸化活化以應答所有干擾素 (Decker et al., 2002)，並有助於 Th1 細胞分化 (Schulz et al., 2009)。在分子水準上，STAT1 通過其能力增加細胞週期蛋白依賴性激酶抑制劑 p21Cip1 的表達或降低 c-myc 的表達來抑制接受 IFN-γ 治療的小鼠和人腫瘤細胞的增殖 (Ramana et al., 2000)。STAT1 的抗腫瘤活性通過其抑制小鼠模型中的血管生成和腫瘤轉移的能力進一步得到支持 (Huang et al., 2002)。STAT1 mRNA 水準增加被證明是分子信號的一部分，與激素受體陰性和三陰性乳腺癌患者的轉移結果預後較好有關 (Yau et al., 2010)。

跨膜蛋白 43 (TMEM43) - 該基因編碼跨膜蛋白43。該基因的缺陷是家族性致心律失常性右心室發育不良型 5 (ARVD5) 的原因，該疾病也稱為致心律失常性右室心肌病型 5 (ARVC5)。ARVD 是一種遺傳疾病，其特徵為室性心動過速、心力衰竭、心源性猝死和纖維脂肪替代心肌細胞 (Siragam et al., 2014)。TMEM43 可能在內核膜通過組織蛋白質複合體保持核膜結構中具有重要作用 (Bengtsson and Otto, 2008)。

拓撲異構酶 (DNA) II α170kDa (TOP2A) /拓撲異構酶 (DNA) II β 180kDa (TOP2B) - TOP2A 和 TOP2B 編碼一種 DNA 拓撲異構酶的高度同源亞型，這種酶能夠控制和改變轉錄過程中 DNA 的拓撲狀態。這種核酶參與諸如染色體凝集、染色單體分離以及減輕 DNA 轉錄和複製過程中產生的扭轉應力等過程。TOP2A 是細胞增殖所必需的，並在快速生長細胞中高表達，而 TOP2B 不是生長所必需的並且最近顯示涉及治療相關的繼發惡性腫瘤 (Toyoda et al., 2008)。TOP2A 被發現在若干癌症類型中過度表達（例如，惡性胸膜間皮瘤 (Roe et al., 2010)、惡性神經鞘瘤 (Kresse et al., 2008)、肺腺癌細胞 (Kobayashi et al., 2004)、膀胱癌 (Simon et al., 2003)、膠質母細胞瘤  (van den Boom et al., 2003)）。TOP2B 參與 DNA 轉錄、複製、重組和有絲分裂，除了 TOP1 外，它代表屬於該拓撲異構酶基因家族的第二個 NUP98 融合伴侶基因 (Nebral et al., 2005)。

類胰蛋白酶 α/β1 (TPSAB1)/類胰蛋白酶 β2 (TPSB2) - 類胰蛋白酶α/β1 (TPSAB1) 和類胰蛋白酶 β2 (TPSB2) 與其他兩種胰蛋白酶同種型一起，由肥大細胞表達。類胰蛋白酶已被顯示是涉及哮喘和其他過敏性和炎性疾病的發病機理的介質。通過肥大細胞分泌的類胰蛋白酶具有促血管發生功能，並有助於腫瘤血管形成。類胰蛋白酶通過蛋白酶活化受體-2 (PAR-2) 的活化而起作用，另外有助於細胞外基質降解，從而也促進血管生長。另外，腫瘤組織中出現類胰蛋白酶陽性的肥大細胞與幾個癌症類型的血管發生相關 (Ammendola et al., 2014)。據報告，類胰蛋白酶陽性肥大細胞水準在攝護腺癌中升高，與微血管密度、腫瘤分期和較短的生存期相關 (Nonomura et al., 2007; Stawerski et al., 2013)。同樣地，類胰蛋白酶陽性的肥大細胞也與胃癌 (Zhao et al., 2012; Ribatti et al., 2010) 以及肺腺癌 (Imada et al., 2000; Takanami et al., 2000) 的腫瘤階段和血管生成相關。

含三重基序 11 (TRIM11) - 含三重基序蛋白 11 是一種在人體中被 TRIM11 基因編碼的蛋白質。TRIM11 已知參與中樞神經系統的發育和破壞人體肽（阿爾茨海默狀神經元損傷抑制劑）的穩定性 (Niikura et al., 2003)。TRIM11 在高分級膠質瘤中過度表達，促進細胞增殖、侵襲、轉移和神經膠質腫瘤生長 (Di et al., 2013)。

暫態受體電位陽離子通道，亞家族 M，成員 2 (TRPM2) - 由該基因編碼的蛋白質是受細胞內游離 ADP-核糖調節的鈣可滲透陽離子通道。TRPM2 可能參與在一定條件下介導細胞凋亡 (Ishii et al., 2007; Cao et al., 2015)。但是，其對細胞生長增殖的作用較不明確，並且可能依賴于細胞培養條件和可變剪接同種型的表達 (Chen et al., 2014)。在黑色素瘤和攝護腺癌中，腫瘤富集 TRPM2 反義轉錄物已得到確認，其與細胞凋亡和臨床結果相關 (Orfanelli et al., 2015)。

微管蛋白 γ 複合體相關蛋白 3 (TUBGCP3) - 微管蛋白 γ 複合體相關蛋白 3 是多亞基 γ 微管蛋白複合體的一部分，對於真核細胞中的微管成核至關重要 (Lynch et al., 2014)。細胞質 γ 微管蛋白複合體通過一組所謂的 γ 微管蛋白複合體結合蛋白針對中心體或其他微管組織中心 (Schiebel, 2000)。研究發現，膠質母細胞瘤細胞中與正常人星形細胞相比，TUBGCP3 轉錄物表達顯著上升，TUBGCP3 免疫反應性比在正常大腦中顯著上升。TUBGCP3 也與微血管增殖和信號傳導途徑相互作用有關，導致惡性表型 (Draberova et al., 2015)。此外，TUBGCP3 被發現在近四倍體比在二倍體套細胞淋巴瘤樣本中表達顯著更高 (Neben et al., 2007)。

泛素樣調節劑啟動酶 6 (UBA6) - 泛素樣調節劑啟動酶 6 是在人體中由 UBA6 基因編碼的蛋白質。UBA6 是在睾丸中表達量最大的泛素啟動酶。此外，它是對 DNA 損傷的細胞應答所必需的 (Moudry et al., 2012)。

異嗜性和多變逆轉錄病毒受體 1 (XPR1) - XPR1 是包含 180 個殘基長的氨基末端 SPX 結構域的一個多通路膜分子（命名為 SYG1、PHO81 和 XPR1）。據報告，XPR1 可介導磷酸鹽輸出 (Giovannini et al., 2013)。破骨細胞分化後發現 XPR1 mRNA 轉錄增加 (Sharma et al., 2010)。最初，XPR1 被描述為反轉錄病毒受體，被異嗜性和多變 MLV（X-MLV 和 P-MLV）二個 γ 逆轉錄病毒使用，可以感染人類細胞以及各種其他物種，例如小鼠和鳥類 (Kozak, 2010; Martin et al., 2013)。

含鋅指 BED 型 5 (ZBED5)  - 含鋅指 BED 型 5 的特徵在於編碼主要來自查理樣 DNA 轉座子的序列，但是，它好像不是一個活躍的 DNA 轉座子，因為它兩側沒有終端反向重複序列。ZBED5 與 Buster DNA 轉座子相關，在系統發育上與其他 ZBED 分開。ZBED 基因在脊椎組織中廣泛表達，他們一起調節顯著多樣性的功能 (Hayward et al., 2013)。

鋅指蛋白 697 (ZNF697) -  ZNF697 基因編碼鋅指蛋白 697，其位於染色體 1p12 上並可能在 DNA 結合中起作用 (Yu et al., 2011)。

是否能刺激免疫反應取決於是否存在被宿主免疫系統視為異物的抗原。發現腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統干預腫瘤生長的可能性。目前，針對癌症免疫治療，正在探索利用免疫系統的體液和細胞進行免疫的各種機制。

細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的 T-細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是 CD8 陽性 T 細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+ 能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物 (DRIP) 的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體 (MHC) 所載的肽中所含的I類分子。人 MHC 分子也稱為人白細胞-抗原 (HLA)。

除非另有說明，否則本文使用的所有術語定義如下。

術語「T 細胞反應」是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和啟動。對於 MHC I 類限制性細胞毒性 T 細胞，效應子功能可能為溶解肽脈衝的、肽前體脈衝的或天然肽表現的靶細胞、分泌細胞因子，優選為肽誘導的干擾素-γ，TNF-α 或 IL-2，分泌效應分子，優選為肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。

本文所用「肽」這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的 α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。這些肽的長度優選為 9 個氨基酸，但至短可為 8 個氨基酸長度，至長可為 10、11、12 或 13 個氨基酸長度或更長，如果為 MHC-II 類肽時（本發明肽的拉長變體），至長可為  14、15、16、17、18 、19 或 20 個氨基酸長度或更長。

因此，「肽」這一術語應包括一系列氨基酸殘基的鹽，通常通過相鄰氨基酸的 α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。優選的情況是，鹽為肽的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸（三氟乙酸）鹽。必須注意的是，本發明肽的鹽與其體內狀態的肽基本上不同，因為該不是體內的鹽。

術語「肽」應也包括「寡肽」。本文使用的術語「寡肽」是指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的 α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。寡肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小於 30 個氨基酸殘基，約長於 15 個氨基酸。

「多肽」這一術語是指一系列氨基酸殘基，通常通過相鄰氨基酸的 α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。多肽的長度對於本發明來說並不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，「多肽」這一術語是指包含多於約 30 個氨基酸殘基的分子。

一種肽、寡肽、蛋白質或編碼該分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」（因此是本發明中的一種「免疫原」）。在本發明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導 T 細胞反應的能力。因此，「免疫原」是一種能夠誘導免疫反應的分子，並且在本發明的情況下，是一種能誘導 T 細胞反應的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽與 MHC 的複合體、和/或用於提高特異性抗體或 TCR 抗性的蛋白。

I 類 T 細胞「表位」要求的是一種結合至 MHC I 類受體上的短肽，從而形成一種三元複合體（MHC I 類 α鏈、β-2-微球蛋白和肽），其可以通過 T 細胞負載匹配 T 細胞受體與具有適當親和力的 MHC/肽複合物結合來識別。結合至 MHC I 類分子的肽的典型長度為 8-14 個氨基酸，最典型為 9 個氨基酸長度。

在人類中，有三種編碼 MHC I 類分子的不同基因位點（人 MHC分子也是指定的人白細胞抗原 (HLA)）：HLA-A、HLA-B 和 HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02 和 HLA-B*07 是可從這些基因位點表達的不同 MHC I 類等位元基因的實例。 表 11：HLA-A*02 和 HLA-A*24 和最常見 HLA-DR 血清類型的表達頻率 F。頻率根據 Mori 等人 (Mori et al., 1997) 使用的 Hardy-Weinberg 公式 F = 1 – (1-Gf)² 改編，從美國人群範圍內的單體型頻率中推導出。由於連鎖不平衡，某些 HLA-DR 等位基因內的 A*02 或 A*24 組合與其預期單一頻率相比，可能是濃縮的或頻率較低。有關詳細資訊，請參閱 Chanock 等人的文獻 (Chanock et al., 2004)。

本發明的肽，優選當如本文描述納入本發明的疫苗時與 HLA-A*02 和 HLA-A*24 結合。本發明的 MHC II 類肽與幾種不同的 HLA II 類分子結合，並被稱為混雜結合劑（泛結合肽）。疫苗還可能包括泛結合 MHC II 類肽。因此，本發明的疫苗可用於治療 A*02 或 A*24 陽性患者中的癌症，但不因為這些肽的廣泛結核性而必須選擇 II 類 MHC 同種異型。

如果本發明的 A*02 肽與本發明的 A*24 肽組合，與單獨的 MHC I 類等位基因相比，可治療更高比例的患者群體。雖然在大多數人群中，低於 50% 的患者可由單獨的等位基因來解決問題，但是本發明中一種含 HLA-A*24 和 HLA-A*02 表位的疫苗可以治療任何相關人群中至少 60% 的患者。具體來說，各區域中，以下比例的患者這些等位基因中的至少一個有肯定效果：美國 61%、西歐 62%、中國 75%、韓國 77%、日本 86%（根據 www.allelefrequencies.net 計算）。

在一項優選的實施方案中，術語「核苷酸序列」系指去氧核苷酸的雜聚物。

編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發明蛋白的 DNA 片段由 cDNA 片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節元素的重組轉錄單元中被表達。

如本文所用的術語「肽的核苷酸編碼」系指對肽進行核苷酸序列編碼，其中該肽包括與將由用於產生 TCR 的樹突細胞或另一細胞系統所表達該序列的生物系統相容的人工（人造）啟動和停止密碼子。

本文提到的核酸序列既包括單鏈核酸也包括雙鏈核酸。因此，除非本文另有所指，否則，例如對於 DNA，具體的序列是該序列的單鏈 DNA、該序列與其互補序列的雙工（雙鏈 DNA）以及該序列的互補序列。

「編碼區」這一術語是指在基因的天然基因組環境中天然或正常編碼該基因的表達產物的那部分基因，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區域。

編碼區可來自非突變（「正常」）基因、突變基因或異常基因，甚至還可以來自 DNA 序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的 DNA 合成方法合成。

「表達產物」這一術語是指多肽或蛋白，它是基因和遺傳碼退化並因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的翻譯產物。

「片段」這一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區的 DNA 的一部分，其表達產物與完整編碼區表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性。

「DNA 片段」這一術語是指一種 DNA 聚合物，以單獨的片段形式或一種較大 DNA 結構的組分形式存在，它們從至少分離過一次的 DNA 中以基本純淨的形式獲得，即不含污染性內源性材料，並且獲得的數量或濃度能夠使用標準生化方法，例如使用克隆載體，進行識別、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此類片段以開放閱讀框架（未被內部未翻譯序列打斷）或內含子（通常表現于真核基因中）的形式存在。未翻譯 DNA 序列可能存在於開放閱讀框架的下游，在那裏其不會干預編碼區的操縱或表達。

「引物」這一術語表示一種短核酸序列，其可與一個 DNA 鏈配對，並在 DNA 聚合酶開始合成去氧核糖核酸鏈之處提供一個游離的 3'-OH 末端。

「啟動子」這一術語表示參與 RNA 聚合酶的結合從而啟動轉錄的 DNA 區域。

術語「分離」表示一種物質從其原來的環境（例如，如果是天然發生的則是天然環境）中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，並且由於該載體或組合物不是其天然環境的一部分，因此它仍然是分離的。

本發明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以「純化」的形式存在。術語「純化」並非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的製劑，相關領域技術人員能理解這些術語。例如，各個從已用傳統方法純化為具有電泳同質性的 cDNA 庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數量級，優選為兩或三個數量級，更優選為四或五個數量級。此外，明確涵蓋所述多肽的純度優選為 99.999%，或至少為 99.99% 或 99.9%；甚而適宜為以重量計 99% 或更高。

根據本發明公開的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以「濃縮的形式」存在。本文使用的術語「濃縮」是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約 2、5、10、100 或 1000 倍，有優勢的是，按重量計為 0.01%，優選為至少 0.1%。也明確考慮到，按重量計約為 0.5%、1%、5%、10% 和 20% 的濃縮製劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本發明的其他材料可有優勢地以濃縮或分離的形式存在。「活性片段」這一術語是指產生免疫反應的片段（即具有免疫原性活性），通常是一種肽、多肽或核酸序列的片段，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起或在載體中給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應採用的形式是在接受動物（如：人）體內刺激 T 細胞反應。或者，「活性片段」也可用於誘導體外 T 細胞反應。

本文使用的「部分」(portion)、「節段」(segment)、「片段」(fragment) 這幾個術語，當與多肽相關地使用時是指殘基的連續序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個較大序列的子集。例如，如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶（如胰蛋白酶或糜蛋白酶）進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節段或片段。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。

根據本發明，術語「等同度百分比」或「等同百分比」，如果指的是序列，則表示在待對比序列（「被對比序列」）與所述序列或請求項的序列（「參考序列」）對準之後將被對比序列與所述序列或請求項的序列進行比較。然後根據下列公式計算等同度百分比： 等同度百分比= 100 [1 -(C/R)] 其中 C 是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數量，其中 (i) 參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸； (ii) 參考序列中每個空隙，以及 (iii) 參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異以及 (iiii) 必須在對準序列的第 1 位置開始對準； 並且 R 是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數目。

如果「被對比序列」和「參考序列」之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等於或大於指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低於指定等同度百分比的對準。

因此，如上所述，本發明提出了一種肽，其包括選自 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 群組的一個序列、或與 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 具有 88% 同源性的其變體、或誘導與該肽發生T細胞交叉反應的一個變體。本發明所述的肽具有與主要組織相容性複合體 (MHC) I 或所述肽拉長版本的 II 類分子結合的能力。

在本發明中，「同源性」一詞系指兩個氨基酸序列之間的同一度（參見上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的「同源」是通過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對後確定的。此類序列同源性可通過使用 ClustalW 等演算法創建一個排列而進行計算。也可用使用一般序列分析軟體，更具體地說，是 Vector NTI、GENETYX 或由公共資料庫提供的其他工具。

本領域技術人員能評估特定肽變體誘導的 T 細胞是否可與該肽本身發生交叉反應 (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997)。

發明人用給定氨基酸序列的「變體」表示，一個或兩個氨基酸殘基等的側鏈通過被另一個天然氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈取代而發生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列（由 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 組成）的肽大致同樣的方式與 HLA 分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持（如沒有提高）其能與 HLA-A*02 或 -DR 等合適 MHC 分子的結合槽相互作用和結合，以及至少維持（如沒有提高）其與啟動 T細胞的 TCR 結合的能力。

隨後，這些 T 細胞可與細胞和殺傷細胞發生交叉反應，這些細胞表達多肽（其中包含本發明中定義的同源肽的天然氨基酸序列）。正如科學文獻和資料庫 (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997) 中所述，HLA-A 結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與 HLA 結合槽的結合模序相稱的核心序列，其定義由構成結合槽的多肽鏈的極性、電物理、疏水性和空間特性確定。因此，本領域技術人員能夠通過保持已知的錨殘基來修飾 SEQ ID No: 1 至 SEQ ID NO:110 提出的氨基酸序列，並且能確定這些變體是否保持與 MHC I 或 II 類分子結合的能力。本發明的變體保持與啟動 T 細胞的 TCR 結合的能力，隨後，這些 T 細胞可與表達一種包含本發明定義的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的細胞發生交叉反應並殺死該等細胞。

如果無另有說明，那麼本文公開的原始（未修飾）肽可以通過在肽鏈內的不同（可能為選擇性）位點上取代一個或多個殘基而被修飾。優選情況是，這些取代位於氨基酸鏈的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。

在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團 1 — 小脂肪族、非極性或略具極性的殘基 (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly)；基團 2 — 極性、帶負電荷的殘基及其醯胺 (Asp, Asn, Glu, Gln) ；基團 3 — 極性、帶正電荷的殘基 (His, Arg, Lys) ；基團 4 — 大脂肪族非極性殘基 (Met, Leu, Ile, Val, Cys) 以及基團 5 — 大芳香殘基 (Phe, Tyr, Trp)。

較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有鹼性性質的氨基酸所取代。然而，這種「激進」取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。

當然，這種取代可能涉及普通 L-氨基酸之外的其他結構。因此，D-氨基酸可能被本發明的抗原肽中常見的 L-氨基酸取代，也仍在本公開的範圍之內。此外，非標準氨基酸（即，除了常見的天然蛋白原氨基酸）也可以用於取代之目的，以生產根據本發明的免疫原和免疫原性多肽。

如果在一個以上位置上的取代發現導致肽的抗原活性基本上等於或大於以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的疊加或協同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過 4 個。

基本上由本文所指氨基酸序列組成的一種肽可能有一個或兩個非錨定氨基酸（見下面錨基序相關內容）被交換，而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體 (MHC) –I 或 II 類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。在另一實施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列組成的肽中，一個或兩個氨基酸可與其保守交換夥伴交換（見下文），而不存在這種情況，即相比於未修飾的肽，與人類主要組織相容性複合體 (MHC) –I 或 II 類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。

這些基本不與 T 細胞受體互動的氨基酸殘基可通過取代其他幾乎不影響 T 細胞反應並不妨礙與相關 MHC 結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發明的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或部分或其變體的肽（發明人所用的這個術語包括寡肽或多肽）。 表 12：根據 SEQ ID NO: 1、2 和 4 的 HLA-A*02 肽的優選變體和基序

表 12B：根據 SEQ ID NO: 13的 HLA-A*02 肽的優選變體和基序

表 13：根據 SEQ ID NO: 23、24 和 25 的 HLA-A*24 肽的優選變體和基序

較長（拉長）的肽也可能適合。MHC I 類表位（通常長度為 8 至 11 個氨基酸）可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。兩側有實際表位的殘基優選為在加工過程中幾乎不影響暴露實際表位所需蛋白裂解的殘基。

本發明的肽可被拉長多達四個氨基酸，即 1、2、3 或 4 個氨基酸，可按照 4:0 與 0:4之間的任何組合添加至任意一端。本發明的拉長組合可見表 14 。 表 14：本發明肽的拉長組合

拉伸/延長的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉長可用于增強所述肽的穩定性或溶解性。

因此，本發明所述的表位可能與天然腫瘤相關表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來自參考肽的不超過四個殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。

在一項替代實施方案中，肽的一邊或雙邊被拉長 4 個以上的氨基酸，優選最多 30 個氨基酸的總長度。這可形成 MHC-II 類結合肽。結合至 MHC II 類肽可通過本領域中已知的方法進行測試。

因此，本發明提出了 MHC I 類表位的肽和變體，其中所述肽或抗體的總長度為 8 至 100 個、優選為 8 至 30 個、最優選為 8 至 14 個氨基酸長度（即 10、11、12、13、14 個氨基酸，如果為拉長 II 類結合肽時，長度也可為 15、16、17、18 、19 、20、21 或 22 個氨基酸）。

當然，本發明的肽或變體能與人主要組織相容性複合體 (MHC) I 或 II 類分子結合。肽或變體與 MHC 複合物的結合可用本領域內的已知方法進行測試。

優選情況是，當本發明的肽特異性 T 細胞相比於取代肽受到檢測時，如果取代肽在相對於背景肽溶解度增加達到最大值的一半，則該肽濃度不超過約 1 mM，優選為不超過約 1 µM，更優選為不超過約 1 nM，再優選為不超過約 100 pM，最優選為不超過約 10 pM。也優選為，取代肽被 一個以上的 T細胞識別，最少為 2 個，更優選為 3 個。

在本發明的一個特別優選實施方案中，肽系由或基本系由根據 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 110 所選的氨基酸序列組成。

基本由「...組成」系指本發明的肽，除了根據 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO: 110 中的任一序列或其變體組成外，還含有位於其他 N 和/或 C 端延伸處的氨基酸，而它們不一定能形成作為 MHC 分子表位的肽。

但這些延伸區域對有效將本發明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發明的一實施例中，該肽為融合蛋白的一部分，含來自 NCBI、GenBank 登錄號 X00497 的 HLA-DR 抗原相關不變鏈（p33，以下稱為「Ii」）的 80 個 N-端氨基酸等。在其他的融合中，本發明的肽可以被融合到本文所述的抗體、或其功能性部分，特別是融合入抗體的序列，以便所述抗體進行特異性靶向作用，或者，例如進入本文所述的樹突狀細胞特異性抗體。

此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩定性和/或與 MHC 分子結合，從而引發更強的免疫反應。肽序列的該類優化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。

在反式肽鍵氨基酸中，肽 (-CO-NH -) 並未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽 (retro-inverso peptidomimetics) 可通過本領域已知的方法製備，例如：Meziere 等人在 (Meziere et al., 1997) 中所述的方法，以引用的方式併入本文。這種方法涉及製備包含骨架（而並非側鏈）改變的模擬肽。Meziere 等人 (Meziere et al., 1997) 的研究顯示，這些類比肽有利於 MHC 的結合和輔助性 T 細胞的反應。以 NH-CO 鍵替代 CO-NH 肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。

非肽鍵為-CH₂ -NH、-CH₂ S-、-CH₂ CH₂ -、-CH=CH-、-COCH₂ -、-CH(OH)CH₂ -和 -CH₂ SO-等。美國 4897445 號專利提出了多肽鏈中非肽鍵 (-CH₂ -NH) 的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及通過氨基醛和一種含 NaCNBH₃ 的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。

含上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，苄氧羰基、丹醯基等疏水基團或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙醯基或 9-芴甲氧羰基可能位於肽的氨基末端。此外，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。

另外，本發明中的所有肽都可能經合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助於增加本發明肽的穩定性、生物利用度和/或結合作用。

同樣，本發明中的肽或變體可在合成肽之前或之後通過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在 R. Lundblad 所著的《 Chemical Reagents for Protein Modification》 (3rd ed. CRC Press, 2004) (Lundblad, 2004) 中有概述，以參考文獻的方式併入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制，但其包括（但不限於）通過以下方法修飾：醯基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以 2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS) 三硝基苯基化氨基團、通過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來醯亞胺反應，與碘乙酸或碘乙醯胺羧甲基化、在鹼性 pH 值下與氰酸鹽甲氨醯化。在這方面，技術人員參考了《Current Protocols In Protein Science》 (Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) ) (Coligan et al., 1995) 中第 15 章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。

簡言之，修飾蛋白質的精氨醯殘基等往往基於於鄰二羰基化合物（如苯甲醯甲醛、2,3 –丁二酮以及 1,2-烯巳二酮）的反應而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基的反應。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此，有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) 等公司的網站含有具體試劑的資訊。

蛋白質中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。伍德沃德氏試劑 K 可用於修飾特定的谷氨酸殘基。N-（3-二甲氨基丙基）-N´-乙基-碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內交聯。例如：焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用 4-羥基-2-壬烯醛進行修飾。賴氨酸殘基與其他α-氨基團的反應，例如，有利於肽結合到蛋白/肽的表面或交聯處。賴氨酸聚是多（乙烯）乙二醇的附著點，也是蛋白質糖基化的主要修飾位點。蛋白質的蛋氨酸殘基可通過碘乙醯胺、溴乙胺、氯胺 T 等被修飾。

四硝基甲烷和 N-乙醯基咪唑可用於酪氨酸殘基的修飾。經二酪氨酸形成的交聯可通過過氧化氫/銅離子完成。

對色氨酸修飾的最近研究中使用了 N-溴代琥珀醯亞胺、2-羥基-5-硝基苄溴或 3-溴-3-甲基-2- (2 –硝苯巰基) -3H-吲哚 (BPNS-糞臭素)。

當蛋白與戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯用於配製水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長迴圈半衰期。針對免疫治療的變態反應原化學修飾往往通過氰酸鉀的氨基甲醯化實現。

一種肽或變體，其中肽被修飾或含非肽鍵，優選為本發明的實施例。一般來說，肽和變體（至少含氨基酸殘基之間的肽聯接）可使用 Lukas 等人 (Lukas et al., 1981) 以及此處引用的參考文獻所披露的固相肽合成 Fmoc-聚醯胺模式進行合成。芴甲氧羰基 (Fmoc) 團對 N-氨基提供臨時保護。使用 N, N-二甲基甲醯胺中的 20% 二甲基呱啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重複分裂。由於它們的丁基醚 (在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯 (在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物 (在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物 (在半胱氨酸的情況下) 及 4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺醯基衍生物 (在精氨酸的情況下)，側鏈功能可能會受到保護。只要穀氨醯胺和天冬醯胺為 C-末端殘基，側鏈氨基功能保護所使用的是由 4,4'-二甲氧基二苯基團。固相支撐基於聚二甲基丙烯醯胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯醯胺（骨架單體）、雙丙烯醯乙烯二胺（交聯劑）和 N-丙烯醯肌胺酸甲酯（功能劑）構成。使用的肽-樹脂聯劑為酸敏感的 4 -羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預製對稱酸酐衍生物加入，但是天冬醯胺和穀氨醯胺除外，它們使用被逆轉的 N, N-二環己基碳二亞胺/1-羥基苯並三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應用茚三酮、硝基苯磺酸或 isotin 測試程序監測。合成完成後，用濃度為 95% 含 50% 清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結合使用對肽進行合成是可能的（例如，請參閱 (Bruckdorfer et al., 2004) 以及本文引用的參考文獻）

三氟乙酸用真空中蒸發、隨後用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序（水相凍幹後，該程序制得不含清道夫混合物的肽）清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從 Calbiochem-Novabiochem（英國諾丁漢）獲得。

純化可通過以下技術的任何一種或組合方法進行，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及（通常）反相高效液相色譜法（如使用乙腈/水梯度分離）。

可以使用薄層色譜法、電泳特別是毛細管電泳、固相萃取（CSPE）、反相高效液相色譜法、酸解後的氨基酸分析、快原子轟擊（FAB）質譜分析以及MALDI和ESI-Q-TOF質譜分析進行肽分析。

為了選擇過度表現的肽，計算了表現圖，其顯示樣本中位元表現量以及複製變化。該特點使相關腫瘤實體的樣本與正常組織樣本的基線值並列。可通過計算調節線性混合效應模型 (Pinheiro et al., 2015) 的 p 值將以上每個特點併入過度表現分數中，從而通過假髮現率 (Benjamini and Hochberg, 1995) 調整多項檢驗。

對於通過質譜法對 HLA 配體的識別和相對定量，對來自衝擊冷凍組織樣本的 HLA 分子進行純化並對  HLA 相關肽進行分離。分離的肽分開，並通過線上納米-電噴霧-電離 (nanoESI) 液相色譜- 譜 (LC-MS) 實驗進行鑒定。由此產生的肽序列的驗證方法是，將肺癌 (NSCLC) 樣本（N = 91 個 A*02 陽性樣本，N = 80 個 A*24 陽性樣本）中記錄的天然 TUMAP 的片段模式與相同序列相應合成參考肽的片段模式進行比較。由於這些肽被直接鑒定為原發性腫瘤 HLA 分子的配體，因此這些結果為獲得自 155 名肺癌 (NSCLC) 患者的原發性癌症組織上確定肽的天然加工和表現提供了直接證據。

發現管道 XPRESIDENT^® v2.1（例如，參見 US 2013-0096016，並在此通過引用將其整體併入本文）考慮到識別和選擇相關過量表現的候選肽疫苗，這基於與幾種不同的非癌組織和器官相比癌症或其他受感染組織的 HLA 限制肽水準直接相對定量結果。這通過以下方法實現：使用專有資料分析管道處理的 LC-MS 採集資料、結合序列識別演算法、譜聚類、計算離子、保留時間調整、充電狀態卷積以及正態化而開發無標記差異化定量方法。

為每種肽和樣本確立了表現水準，包括誤差估計值。腫瘤組織大量表現的肽以及腫瘤與非腫瘤組織和器官中過量表現的肽已經得到確定。

對來自肺癌 (NSCLC) 組織樣本的 HLA 肽複合物進行純化，並且對  HLA 相關肽使用 LC-MS 進行分離和分析（見實施例）。本申請中包含的所有 TUMAP 使用原發性肺癌 (NSCLC) 樣本的方法進行鑒定，確認其在原發性肺癌 (NSCLC) 上的表現。

在多個肺癌 (NSCLC) 和正常組織上確定的 TUMAP 用無標記 LC-MS 資料的離子計數方法進行量化。該方法假定肽的 LC-MS 信號區域與樣本中其豐度相關。各種 LC-MS 實驗中肽的所有量化信號在集中趨勢基礎上進行正常化，根據每個樣品進行平均，併合併入柱狀圖（被稱為表現圖）。表現圖整合了不同分析方法，如：蛋白資料庫檢索、譜聚類、充電狀態卷積（除電）和保留時間校準和正態化。

此外，發現管道 XPRESIDENT^® v2.x 可對癌症或其他感染組織上的 MHC-肽，優選為 HLA 限制性肽進行直接的絕對定量。簡言之，總細胞計數根據被分析的組織樣本的總 DNA 含量來計算。組織樣本中 TUMAP 的總肽量用 nanoLC-MS/MS 測定為天然 TUMAP 的比率以及TUMAP 同位素標記版本的已知量，稱為內部標準。TUMAP 分離效率確定方法：把肽：所有選定 TUMAP 的 MHC 在 TUMAP 分離程序儘早的時間點加入組織裂解液，並在肽分離成後完成後通過 nanoLC-MS/MS 檢測。總細胞計數和總肽量根據每份組織樣本三次測量值來計算。所述肽特異性分離效率計算為三次重複測量 10 次加標實驗的平均值（見實施例和表 22）。

本發明提出了有利於治療癌腫/腫瘤，優選為治療過量表現或只表現本發明肽的肺癌。這些肽由質譜分析法直接顯示出，而由 HLA 分子自然表現于人原發性人肺癌 (NSCLC) 樣本中。

與正常組織相比，癌症中高度過量表達肽來源的許多源基因/蛋白質（也指定為「全長蛋白」或「潛在蛋白」）- 本發明相關的「正常組織」是健康肺細胞或其他正常組織細胞，這表明腫瘤與這些源基因的高度關聯性（見實施例 2）。此外，這些肽本身也在腫瘤組織中過度表現（本發明相關的「腫瘤組織」是指來自肺癌 (NSCLC) 患者的樣本），但不在正常組織中過度表現（見實施例 1）。

HLA 結合肽能夠被免疫系統識別，特別是 T 淋巴細胞。T 細胞可破壞表現被識別 HLA/肽複合體的細胞（如：表現衍生肽的肺癌細胞）。

本發明的所有肽已被證明具有刺激 T 細胞反應的能力，並過量表現，因而可用于製備本發明的抗體和/或 TCR，例如可溶性 TCR（參見實施例 3 和實施例 4）。此外，肽與相應的 MHC 組合時，也可用于製備本發明的抗體、其特異性結合片段、抗體樣黏合劑和/或 TCR，特別是 sTCR。各個方法均為技術人員所熟知，並在各個文獻中可找到。因此，本發明的肽可用于在患者中產生免疫反應，從而能夠毀滅腫瘤細胞。患者的免疫反應能夠通過直接給予患者所述肽或前體物質（如，加長肽、蛋白或編碼這些肽的核酸），較理想是與加強免疫原性的製劑相結合，而進行誘導。源自該治療性疫苗的免疫反應預期能夠高度特異性地對抗腫瘤細胞，因為本發明的目標肽在正常組織上表現的複製數目較少，防止患者發生對抗正常細胞的不良自體免疫反應的風險。

本發明的另一方面提出了製備識別特異性肽-MHC複合物的可溶性 T 細胞受體 (sTCR) 的一種方法。這種可溶性 T 細胞受體可從特異性 T 細胞克隆中產生，並且它們的親和力可以通過互補決定區靶向誘變而增加。為了 T 細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示（美國2010/0113300，(Liddy et al., 2012)）。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩定 T 細胞受體之目的，可通過非天然二硫鍵、其他共價鍵（單鏈 T 細胞受體）或通過二聚化結構域連接 α 和 β 鏈 (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999)。T 細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因子（參見US 2013/0115191）、結構域招募效應細胞，如抗 CD3 域等，以便對靶細胞執行特定的功能。此外，它可能表達於用於過繼轉移的 T 細胞。進一步的資訊可在 WO 2004/033685A1 和 WO 2004/074322A1 中找到。 sTCR 的組合在 WO 2012/056407A1 中進行了描述。WO 2013/057586A1 中公開了製備的其他方法。

「藥物組合物」是指適合在醫療機構用於人體的組合物。優選地，藥物組合物為無菌狀態，並根據 GMP 指南生產。

藥物組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽（也參見上文）。此處使用的「藥用鹽」系指所公開的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，用與適合的酸反應的游離堿（通常其中的中性藥物有一個中性–NH₂ 基團）製備酸式鹽。適合製備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上表現的酸性基團的堿鹽製劑使用藥用堿基進行製備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。

在特別優選的實施方案中，藥物組合物包括乙酸（醋酸鹽），三氟乙酸鹽或鹽酸（氯化物）形式的肽。

本發明中所述的藥劑優選為一種免疫治療藥劑，例如，一種疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p. 和 i.v. 注射方式全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞（隨後再將這些細胞注入到患者中），或體外用於從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群（然後再將細胞重新給予患者）。如果核酸體外注入細胞，可能有益於細胞轉染，以共同表達免疫刺激細胞因子（如白細胞介素-2）。肽可完全單獨給藥，也可與免疫刺激佐劑相結合（見下文）、或與免疫刺激細胞因子聯合使用、或以適當的輸送系統給藥（例如脂質體）。該肽也可共軛形成一種合適的載體（如鑰孔蟲戚血藍蛋白 (KLH) 或甘露）到合適的載體 （參閱WO 95/18145 及   (Longenecker et al., 1993)）。肽也可能被標記，可能是融合蛋白，或可能是雜交分子。在本發明中給出序列的肽預計能刺激 CD4 或 CD8 T 細胞。然而，在有 CD4 T-輔助細胞的幫助時，CD8 T細胞刺激更加有效。因此，對於刺激 CD8 T 細胞的 MHC-I 類表位，一種雜合分子的融合夥伴或片段提供了刺激 CD4 陽性 T 細胞的適當表位。CD4- 和 CD8 刺激表位為本領域所熟知、並包括本發明中確定的表位。

一方面，疫苗包括至少含有 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優選為 2 至 50 個、更優選為 2 至 25 個、再優選為 2 至 20 個、最優選為 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 、13、14、15、16、17 或 18 個肽。肽可能從一個或多個特定 TAA 中衍生，並且可能與 MHC I 類分子結合。

另一方面，本發明提出了一種編碼本發明中肽或肽變體的核酸（如多聚核苷酸）。多聚核苷酸可能為，例如，DNA、cDNA、PNA、RNA 或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩定形式（如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸），並且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵並含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發明提出了一種可根據本發明表達多肽的表達載體。

對於連接多核苷酸，已經開發出多種方法，尤其是針對 DNA，可通過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向 DNA 片段加入補充性均聚物軌道，之後 DNA 片段被插入到載體 DNA。然後，通過補充性均聚物尾巴的氫鍵結合，將載體和 DNA 片段結合，從而形成重組 DNA 分子。

含有一個或多個酶切位點的合成接頭為 DNA 片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內切酶的合成接頭可通過多種管道購得，其中包括從國際生物技術公司（International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, 美國）購得。

編碼本發明多肽的 DNA 理想修飾方法是使用 Saiki 等人 (Saiki et al., 1988) 所採用的聚合酶鏈反應方法。此方法可用於將 DNA 引入合適的載體（例如，通過設計合適的酶切位點），也可用於本領域已知的其他有用方法修飾 DNA。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優選。

之後，DNA （或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA）可能表達於合適的宿主，從而製成含本發明肽或變體的多肽。因此，可根據已知技術使用編碼本發明肽或變體的 DNA，用本文所述方法適當修飾後，構建表達載體，然後表達載體用於轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本發明中的多肽。此類技術包括那些公開於，例如，美國專利 4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075 和 4,810,648。

編碼含本發明化合物多肽的 DNA （或在逆轉錄病毒載體情況下，RNA）可能被加入到其他多種 DNA 序列，從而引入到合適的宿主中。同伴 DNA 將取決於宿主的性質、DNA 引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。

一般來說，DNA 可以適當的方向和正確的表達閱讀框架附著到一種表達載體（如質粒）中。如有必要，該 DNA 可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節控制核苷酸序列連接，儘管表達載體中一般存在此類控制功能。然後，該載體通過標準方法被引入宿主。一般來說，並不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個 DNA 序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性（如抗生素耐藥性）進行編碼。

另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協同轉化所需的宿主細胞。

然後，本發明中的重組 DNA 所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養足夠長的時間，從而表達之後可回收的肽。

有許多已知的表達系統，包括細菌（如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌）、酵母（如酵母菌）、絲狀真菌（如曲黴菌）、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統可優選為哺乳動物細胞，如來自 ATCC 細胞生物學庫 (Cell Biology Collection) 中的 CHO 細胞。

典型的哺乳動物細胞組成型表達載體質粒包括 CMV 或含一個合適的多聚 A 尾巴的 SV40 啟動子以及抗性標誌物（如新黴素）。一個實例為從 Pharmacia 公司（Piscataway，新澤西，美國）獲得的 pSVL。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是 pMSG，也可以從 Pharmacia 公司獲得。有用的酵母質粒載體是 pRS403-406 和 pRS413-416，一般可從 Stratagene Cloning Systems 公司（La Jolla, CA 92037，美國）獲得。質粒 pRS403、pRS404、pRS405 和 pRS406 是酵母整合型質粒 (YIp)，並插入了酵母可選擇性標記物 HIS3、TRP1、LEU2 和 URA3。pRS413-416 質粒為酵母著絲粒質粒 (Ycp)。基於 CMV 啟動子的載體（如，來自於 Sigma-Aldrich 公司）提供了暫態或穩定的表達、胞漿表達或分泌，以及 FLAG、3xFLAG、c-myc 或 MATN 不同組合物中的 N-端或 C-端標記。這些融合蛋白可用於檢測、純化及分析重組蛋白。雙標融合為檢測提供了靈活性。

強勁的人巨細胞病毒 (CMV) 啟動子調控區使得 COS 細胞中的組成蛋白表達水準高達 1 mg/L。對於較弱的細胞株，蛋白水準一般低於 0.1 mg/L。SV40 複製原點的出現將導致 DNA 在 SV40 複製容納性 COS 細胞中高水準複製。例如，CMV 載體可包含細菌細胞中的 pMB1（pBR322 的衍生物）複製原點、細菌中進行氨苄青黴素抗性選育的 鈣-內醯胺酶基因、hGH polyA 和 f1 的原點。含前胰島素原引導 (PPT) 序列的載體可使用抗 FLAG 抗體、樹脂和板引導 FLAG 融合蛋白分泌到進行純化的培養基中。其他與各種宿主細胞一起應用的載體和表達系統是本領域熟知眾所周知的。

在另一個實施方案中，對本發明的兩個或更多的肽或肽變體進行編碼，因此，以一個連續順序（類似於「一串珠子」的構建體）表達。在達到目標，所述肽或肽變體可能通過連接子氨基酸的延伸處（例如LLLLLL）連接或融合一起，也可能他們之間沒有任何附加的肽而被連接。這些構建體也可用於癌症治療，可誘導涉及 MHC I 和 MHC II 類分子的免疫應答。

本發明還涉及一種宿主細胞，其以本發明的多核苷酸載體構建轉化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株 DH5（從 Bethesda Research Laboratories 公司（Bethesda, MD, 美國）獲得）和 RR1（從美國菌種保藏中心（ATCC, Rockville, MD, 美國），ATCC 編號31343 獲得）。首選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優選為脊椎動物細胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括 YPH499、YPH500 和 YPH501，一般可從 Stratagene Cloning Systems 公司（La Jolla, CA 92037, 美國）獲得。首選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞為 ATCC 中的 CCL61 細胞、NIH 瑞士小鼠胚胎細胞 NIH/3T3 為 ATCC 中的 CRL 1658 細胞、猴腎源性 COS-1 細胞為 ATCC 中的 CRL 1650 細胞以及人胚胎腎細胞的 293 號細胞。首選昆蟲細胞為 Sf9 細胞，可用杆狀病毒表達載體轉染。有關針對表達選擇合適宿主細胞的概要，可從教科書 (Paulina Balbás and Argelia Lorence 《Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols》Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9) 和本領域技術人員知道的其他文獻中查到。

含本發明 DNA 結構的適當宿主細胞的轉化可使用大家熟知的方法完成，通常取決於使用載體的類型。關於原核宿主細胞的轉化，請參見，例如，Cohen 等人的文獻 (Cohen et al., 1972) 和 (Green and Sambrook, 2012)。酵母細胞的轉化在 Sherman 等人的文章 (Sherman et al., 1986) 中進行了描述。Beggs (Beggs, 1978) 中所述的方法也很有用。對於脊椎動物細胞，轉染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和 DEAE-葡聚糖或脂質體配方，可從 Stratagene Cloning Systems 公司或 Life Technologies 公司（Gaithersburg, MD 20877，美國）獲得。電穿孔也可用於轉化和/或轉染細胞，是本領域用於轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。

被成功轉化的細胞（即含本發明 DNA 結構的細胞）可用大家熟知的方法（如 PCR）進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。

應瞭解，本發明中的某些宿主細胞用於製備本發明中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原表現細胞（如樹突狀細胞）可用于表達本發明中的肽，使他們可以加載入相應的 MHC 分子中。因此，本發明提出了含本發明中核酸或表達載體的一種宿主細胞。

在一個優選實施方案中，宿主細胞為抗原表現細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原表現細胞。2010 年 4 月 29 日，美國食品和藥物管理局 (FDA) 批准載有含攝護腺酸性磷酸酶 (PAP) 的重組融合蛋白可用於治療無症狀或症狀輕微的轉移性 HRPC  (Rini et al., 2006; Small et al., 2006)。

另一方面，本發明提出了一種配製一種肽及其變體的方法，該方法包括培養宿主細胞和從宿主細胞或其培養基中分離肽。

在另一個實施方案中，本發明中的肽、核酸或表達載體用於藥物中。例如，肽或其變體可製備為靜脈 (i.v.) 注射劑、皮下 (s.c.) 注射劑、皮內 (i.d.) 注射劑、腹膜內 (i.p.) 注射劑、肌肉 (i.m.) 注射劑。肽注射的優選方法包括 s.c.、i.d.、i.p.、i.m. 和 i.v. 注射。DNA 注射的優選方法為 i.d.、i.m.、s.c.、i.p. 和 i.v. 注射。例如，給予 50 µg 至 1.5 mg，優選為 125 µg 至 500 µg 的肽或 DNA，這取決於具體的肽或 DNA。上述劑量範圍在以前的試驗中成功使用 (Walter et al., 2012)。

用於主動免疫接種的多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被於載體或輸送系統。核酸可能為 DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。這種核酸的設計和引入方法為本領域所熟知。例如，文獻中有其概述  (Teufel et al., 2005)。多核苷酸疫苗很容易製備，但這些載體誘導免疫反應的作用模式尚未完全瞭解。合適的載體和輸送系統包括病毒 DNA 和/或 RNA，如基於腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統。非病毒輸送系統包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，是 DNA 輸送所屬領域內熟知的系統。也可使用物理輸送系統，如通過「基因槍」。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含刺激 T 細胞進行上述 CDR 的表位。

本發明的藥劑也可能包括一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質（例如，通過 CD8-陽性 T 細胞和輔助 T(T_H ) 細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發明的藥劑有用。適合的佐劑包括（但不僅限於）1018ISS、鋁鹽、AMPLIVAX^® 、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的 TLR5 配體、FLT3 配體、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特 (ALDARA^® )、resiquimod、ImuFact IMP321、白細胞介素 IL-2、IL-13、IL-21、干擾素 α 或 β，或其聚乙二醇衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune^® 、LipoVac、MALP2、MF59、單磷醯脂A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、水包油和油包水乳狀液、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、PepTel^® 載體系統、基於聚丙交酯複合乙交酯 [PLG] 和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白 SRL172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、YF-17D、VEGF trap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的 Aquila 公司的 QS21 刺激子，以及其他專有佐劑，如：Ribi's Detox、Quil 或 Superfos。優選佐劑如：弗氏佐劑或 GM-CSF。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑（如 MF59）及其製備方法進行了描述  (Allison and Krummel, 1995)。也可能使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移（如，TNF-），加速樹突狀細胞成熟為 T 淋巴細胞的有效抗原表現細胞（如，GM-CSF、IL-1 和 IL-4）（美國 5849589號專利，特別以其完整引用形式併入本文），並充當免疫佐劑（如 IL-12、IL-15、IL-23、IL-7、IFN-α、IFN-β） (Gabrilovich et al., 1996)。

據報告，CpG 免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束， CpG 寡核苷酸可通過 Toll 樣受體 (TLR) （主要為 TLR9）啟動先天（非適應性）免疫系統從而起作用。CpG 引發的 TLR9 活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致 T_H1 細胞的活化增強以及細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 生成加強，甚至 CD4 T 細胞説明的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持 TLR9 活化作用誘發的 T_H1 偏移，這些佐劑如：正常促進 TH2 偏移的明礬或弗氏不完全佐劑 (IFA)。CpG 寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起製備或聯合給藥時，表現出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似製劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發強反應尤為必要。他們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數量級，在有些實驗中，對不含CpG 的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應 (Krieg, 2006)。美國 6406705 B1 號專利對 CpG 寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。一種 CpG TLR9 拮抗劑為 Mologen 公司（德國柏林）的 dSLIM（雙幹環免疫調節劑），這是本發明藥物組合物的優選成分。也可使用其他如 TLR 結合分子，如：RNA 結合 TLR7、TLR8 和/或 TLR9。

其他有用的佐劑例子包括（但不限於）化學修飾性 CpG （如 CpR、Idera）、dsRNA 模擬物，如，Poly(I:C) 及其衍生物（如：AmpliGen、Hiltonol、多聚-(ICLC)、多聚 (IC-R)、多聚 (I:C12U)）、非 CpG 細菌性 DNA 或 RNA 以及免疫活性小分子和抗體，如：環磷醯胺、舒尼替單抗、貝伐單抗^® 、西樂葆、NCX-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF Trap、ZD2171、AZD2171、抗-CTLA4、免疫系統的其他抗體靶向性主要結構（如：抗-CD40、抗-TGFβ、抗-TNFα受體) 和 SC58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發明中有用的佐劑和添加劑的數量和濃度。

首選佐劑是抗-CD40、咪喹莫特、瑞喹莫德、GM-CSF、環磷醯胺、舒尼替尼、貝伐單抗、干擾素α、CpG 寡核苷酸及衍生物、多聚(I:C)及衍生物、RNA、西地那非和PLG或病毒顆粒的微粒製劑。

本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，沙格司亭）、環磷醯胺、咪喹莫特、resiquimod 和干擾素-α。

本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子製劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF，沙格司亭）、環磷醯胺、咪喹莫特和 resimiquimod。在本發明藥物組合物的一個優選實施方案中，佐劑為環磷醯胺、咪喹莫特或 resiquimod。更優選的佐劑是 Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、聚-ICLC (Hiltonol^® ) 和抗CD40 mAB或其組合物。

此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如：緩衝劑、結合劑、衝擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞因子。可用於此類組合物的更多輔料可在從 A. Kibbe 所著的 Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000) 等書中獲知。此組合藥物可用於阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病。例如，EP2112253 中有示例製劑。

重要的是要認識到，通過本發明的疫苗引發的免疫應答在不同的細胞階段和開發的不同階段攻擊癌症。而且不同的癌症相關信號通路被攻擊。這相對於其他疫苗的優勢，這些疫苗只針對一個或幾個靶標，這可能會導致腫瘤很容易適應於攻擊（腫瘤逃逸）。此外，並非所有的個體腫瘤都表達相同模式的抗原。因此，幾個腫瘤相關肽的組合確保了每個腫瘤都承擔至少一些靶標。該組合物以這樣的方式設計，預期每個腫瘤可表達幾種抗原並覆蓋腫瘤生長和維持所需要的幾種獨立的途徑。因此，疫苗可易於「現成的」用於較大患者群體。這意味著，預選擇接受疫苗治療的患者可限制為 HLA 分型，無需抗原表達的任何額外的生物標誌物評估，但仍然確保多個靶標同時被誘導的免疫應答攻擊，這對於療效很重要  (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012)。

本文所用的「支架」一詞是指與（如抗原）決定因子特異性結合的分子。在一項實施方案中，支架是能夠引導其所連接的實體（例如，（第二）抗原結合部分） 至目標靶點，例如，至特定類型的腫瘤細胞或承載抗原決定簇的腫瘤基質（如根據目前申請中肽和 MHC 的複合體）。在另一項實施例中，支架能夠通過其靶抗原（例如 T 細胞受體複合體抗原）啟動信號通路。支架包括但不限於抗體及其片段，抗體的抗原結合區，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，結合的蛋白包括至少一個錨蛋白重複序列​​基元和單域抗原結合 (SDAB) 分子、適體、（可溶）TCR 和（經修飾的）細胞，例如同種異體或自體 T 細胞。為了評估某個分子是否是結合至靶點的支架，可進行結合測定。

「特定」結合系指，與其他天然肽-MHC 複合體相比，該支架與感興趣的肽-MHC複合體更好地結合，結合程度為，擁有能夠殺死承載特定靶點細胞的活性分子的支架不能夠殺死無特定靶點但表現一個或多個其他肽-MHC複合體的另一細胞。如果交叉反應性肽-MHC 的肽並不是天然的，即，並非來自人 HLA-多肽組，則結合至其他肽-MHC 複合體是無關緊要的。評估靶細胞殺傷的測試在本領域中是公知的。它們應該含有未改變的肽-MHC 表現的靶細胞（原發細胞或細胞系）或載有肽的細胞進行，以便達到天然肽-MHC 的水準。

各支架可包括一個標記，其通過確定是否存在或不存在標籤所提供的信號可檢測到結合支架。例如，該支架可用螢光染料或任何其他適用的細胞標記分子進行標記。此類標記分子是本領域中公知的。例如，通過螢光染料進行的螢光標記可通過螢光或鐳射掃描顯微術或流式細胞術提供結合適體的視覺化。

各支架可與第二個活性分子（例如 IL-21、抗 CD3、抗 CD28）共軛。

關於多肽支架的進一步資訊，可參閱，例如，在  WO 2014/071978A1 背景技術部分，並作為參考文獻引用。

本發明還涉及適體。適體（例如，參見 WO 2014/191359 及其中引用的文獻）是短的單鏈核酸分子，其可以折疊為所定義的三維結構並識別特定的靶標結構。它們似乎是開發靶向治療的合適替代方法。適體已顯示可選擇性與具有高親和力和特異性的複合體靶標相結合。

識別細胞表面分子的適體在過去十年內已經確定，並為開發診斷和治療方法提供了手段。由於適體已顯示幾乎無毒性和免疫原性，因此，它們是生物醫學應用中有前景的候選物質。事實上適體，例如攝護腺特異性膜抗原識別適體，已被成功地用於靶向治療並在體內模型的異種移植物中顯示出功能。此外，認識到特定腫瘤細胞系的適體也已確定。

可選擇 DNA 適體來揭示各種癌細胞的廣譜識別屬性，特別是那些來自於實體瘤的細胞，而非致瘤和主要健康細胞不被識別。如果所識別的適體不僅識別腫瘤特異性子類型，而且與一系列腫瘤相互作用，這使適體適用于作為所謂的廣譜診斷和治療手段。

此外，用流式細胞儀對細胞結合行為的研究顯示，適體在納摩爾範圍內顯示出很好的親和力。

適體用於診斷和治療目的。此外，也可能顯示，一些適體被腫瘤細胞吸取，因而可作為抗癌劑靶向遞送的分子賦形劑，例如 siRNA 進入腫瘤細胞。

可選擇適體針對複合體的靶標，如細胞和組織以及包含、優選包括根據任何 SEQ ID NO 1 至 SEQ ID NO 110 的一個序列、根據當前發明的肽複合體與 MHC 分子，使用細胞 SELEX（通過指數富集的配體系統進化）技術。

本發明中的肽可用于生成和開發出針對 MHC/肽複合物的特定抗體。這些抗體可用於治療，將毒素或放射性物質靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的（如 PET）將放射性核素靶向病變組織。這可有助於檢測小轉移灶或確定病變組織的大小和準確位置。

因此，本發明的另一方面是提出產生特異性結合至與 HLA 限制性抗原絡合的 I 或 II 類人主要組織相容性複合體 (MHC) 的一種重組抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與 HLA 限制性抗原絡合的 (MHC) I 或 II 類分子對包含表達所述主要組織相容性說複合體 (MHC) I 或 II 類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將 mRNA 分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述 mRNA 分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體特異性地結合至與 HLA 限制性抗原絡合的所述人主要組織相容性說複合體 (MHC) I 或 II 類。

本發明的另一方面提出一種抗體，其特異性結合至與一種 HLA 限制性抗原絡合的 I 或 II 類人主要組織相容性說複合體 (MHC)，其中該抗體優選為多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體和/或嵌合抗體。

產生這種抗體和單鏈 I 類主要組織相容性複合物的相應方法，以及產生這些抗體的其他工具在 WO 03/068201、WO 2004/084798、WO 01/72768、WO 03/070752 以及出版物 (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) 中進行了披露，為了本發明之目的，所有參考文獻通過引用被完整地併入本文。

優選地，該抗體與複合體的結合親和力低於 20 納摩爾，優選為低於 10 納摩爾，這在本發明情況下也被視為具有「特異性」。

本發明涉及一種肽，包含選自 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的組的一個序列或該序列的與 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 具有 88% 同源性（優選為相同）的一種變體，或誘導與所述變異肽發生 T 細胞交叉反應的一種變體，其中，所述肽不是基本的全長多肽。

本發明進一步涉及一種肽，包含選自 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的組的一個序列、或與 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 具有至少 88% 同源性（優選為相同）的一種變體，其中所述肽或變體的總長度為 8 至 100 個、優選為 8 至 30 個、最優選為 8 至 14 個氨基酸。

本發明進一步涉及本發明的肽，其具有與主要組織相容性複合體 (MHC) I 或 II 類分子結合的能力。

本發明進一步涉及本發明中的肽，其中肽系由或基本系由根據  SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的一個氨基酸序列組成。

本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽（在化學上）被修飾和/或包含非肽鍵。

本發明進一步涉及本發明的肽，其中該肽為融合蛋白的一部分，特別包括 HLA-DR 抗原相關不變鏈 (Ii ) 的 N-端氨基酸，或其中該肽與一種抗體（例如，樹突狀細胞特定抗體）融合。

本發明進一步涉及一種核酸，其編碼本發明所述肽，前提是該肽並非完整（完全）的人蛋白。

本發明進一步涉及一種本發明的核酸，為 DNA、cDNA、PNA、RNA，也可能為其組合物。

本發明進一步涉及一種能表達本發明核酸的表達載體。

本發明進一步涉及本發明的一種肽、本發明的一種核酸或本發明的一種藥用表達載體，特別是用於治療肺癌。

本發明進一步涉及含本發明核酸或本發明表達載體的一種宿主細胞。

本發明進一步涉及本發明的宿主細胞，其為抗原表現細胞，優選為樹突細胞。

本發明進一步涉及配製本發明一種肽的一種方法，所述方法包括培養本發明的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養基中分離肽。

本發明進一步涉及本發明中的方法，其中抗原通過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達於合適抗原表現細胞表面的 I 或 II 類 MHC 分子。

本發明進一步涉及本發明的方法，其中該抗原表現細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的肽或所述變體氨基酸序列。

本發明進一步涉及以本發明方法製造的啟動 T 細胞，其中所述 T 細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞異常表達含一種本發明氨基酸序列的多肽。

本發明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者本發明的有效量 T 細胞。

本發明進一步涉及任何所述肽、本發明的一種核酸、本發明的一種表達載體、本發明的一種細胞、本發明一種作為藥劑或製造藥劑的啟動細胞毒性 T 淋巴細胞的用途。本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。

本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中該藥劑為一種疫苗。本發明進一步涉及一種本發明的用途，其中藥劑可有效抗癌。

本發明還一般涉及本發明的用途，其中所述癌細胞為肺癌細胞或其他實體或血液腫瘤細胞，如：腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、白血病（AML、CLL）、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、食管癌包括胃食管交界處癌 (OSCAR)、膽囊癌和膽管癌 (GBC、CCC) 、膀胱癌 (UBC) 和子宮癌 (UEC) 細胞。

本發明進一步涉及一種基於本發明肽的特定標誌物蛋白和生物標誌物，在此成為「靶標」，其可用於診斷和/或判斷肺癌的預後。本發明還涉及這些供癌症治療使用的新靶點。

本文中術語「抗體」為廣義上的定義，既包括多克隆也包括單克隆抗體。除了完整或「全部」的免疫球蛋白分子，「抗體」這一術語還包括這些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段（如，CDR、Fv、Fab 和 Fc 片段）或聚合物，只要它們表現出本發明的任何期望屬性（例如，肺癌標誌物（多）肽的特異性結合、將毒素傳遞給肺癌細胞標誌物基因表達水準增加時的肺癌細胞和/或抑制肺癌標誌物多肽的活性）。

只要有可能，本發明的抗體可從商業來源購買。本發明的抗體也可能使用已知的方法制得。技術人員會瞭解全長肺癌標誌物多肽或其片段可用于製備本發明的抗體。用於產生本發明抗體的多肽可部分或全部地由天然源經純化而得，也可利用重組 DNA 技術生產。

例如，本發明的編碼肽的 cDNA，例如，該肽為根據 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 多肽的肽，或其中一個變體或片段，可在原核細胞中（如：細菌）或真核細胞（如：酵母、昆蟲或哺乳動物細胞）中表達，之後，可純化重組蛋白，並用於產生一種特異性結合用於產生本發明抗體的肺癌標誌物多肽的單克隆或多克隆抗體製劑。

本領域的技術人員會認識到，兩種或兩種以上不同集合的單克隆抗體或多克隆抗體能最大限度地增加獲得一種含預期用途所需的特異性和親和力（例如，ELISA 法、免疫組織化學、體內成像、免疫毒素療法）的抗體的可能性。根據抗體的用途，用已知的方法對其期望活性進行測試（例如，ELISA 法、免疫組織化學、免疫治療等；要獲取產生和測試抗體的進一步指導，請參閱，例如，Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)。例如，該抗體可用 ELISA 法或免疫印跡法、免疫組織化學染色福馬林固定的肺癌組織或冰凍的組織切片進行檢測。在初次體外表徵後，用於治療或體內診斷用途的抗體根據已知的臨床測試方法進行檢測。

此處使用的術語「單克隆抗體」系指從大量同質抗體中獲得的一種抗體，即，由相同的抗體組成的抗體群，但可能少量表現的自然突變除外。此處所述的單克隆抗體具體包括「嵌合」抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與從特定物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和分類型抗體的相應序列相同（同質），同時，剩餘鏈與從其他物種中獲得的抗體或屬於特定抗體類型和子類型抗體的相應序列以及這些抗體的片段相同（同質），只要他們表現出預期的拮抗活性（美國 4816567 號專利，其在此以其整體併入）。

本發明的單克隆抗體可能使用雜交瘤方法制得。在雜交瘤方法中，老鼠或其他適當的宿主動物，通常用免疫製劑以引發產生或能產生將特異性結合至免疫製劑的抗體。或者，淋巴細胞可在體外進行免疫。

單克隆抗體也可由 DNA 重組方法制得，如：美國 4816567 號專利所述。編碼本發明單克隆抗體的 DNA 可很容易地使用傳統程序進行分離和測序（例如：通過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）。

體外方法也適用於製備單價抗體。抗體消化以產生抗體的片段，尤其是 Fab 片段，可以通過使用本領域已知的常規技術完成。例如，可以通過使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的實施例在 WO 94/29348和美國 4342566 號專利中有描述。抗體的木瓜蛋白酶消化通常產生兩種相同的抗原結合性片段，稱為 Fab 片段（每個片段都有一個抗原結合點）和殘餘 Fc 片段。胃蛋白酶處理產生 aF(ab')₂ 片段和 pFc' 片段。

抗體片段，不論其是否附著於其他序列，均可包括特定區域或特定氨基酸殘基的插入、刪除、替換、或其他選擇性修飾，但前提是，片段的活性與非修飾的抗體或抗體片段相比沒有顯著的改變或損害。這些修飾可提供一些額外的屬性，如：刪除/添加可與二硫鍵結合的氨基酸，以增加其生物壽命、改變其分泌特性等。在任何情況下，抗體片段必須擁有生物活性的特性，如：結合活性、調節結合域的結合力等。抗體的功能性或活性區域可通過蛋白特定區域的基因突變、隨後表達和測試所表達的多肽進行確定。這些方法為本行業技術人員所熟知，可包括編碼抗體片段的核酸的特定位點基因突變。

本發明的抗體可進一步包括人源化抗體或人抗體。非人（如：鼠）抗體的人源化形式為嵌合抗體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段（如：Fv、Fab、Fab' 或抗體的其他抗原結合序列），其中包含從非人免疫球蛋白中獲得的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體互補決定區 (CDR) 的殘基被來自非人物種（供體抗體）（如具有與其特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠或兔子）CDR 的殘基取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白的 Fv 框架 (FR) 殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體可能還包括既非受體抗體、也非輸入 CDR 或框架序列中發現的殘基。一般來說，人源化抗體將包括幾乎所有的至少一個、通常為二個可變域，其中，全部或幾乎全部的 CDR 區域均對應於非人免疫球蛋白的區域並且全部或幾乎全部的 FR區域均為人免疫球蛋白相同序列的區域。理想情況是，人源化抗體還將包括至少免疫球蛋白恒定區 (Fc) 的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區的一部分。

人源化非人抗體的方法為本行業所熟知。一般來說，人源化抗體具有一個或多個從非人源頭引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基往往被稱為「輸入」殘基，通常從「輸入」可變域中獲得。人源化基本上可以通過將齧齒動物 CDR 或 CDR 序列取代為相應的人抗體序列而完成。因此，這種「人源化」抗體為嵌合抗體（美國 4816567 號專利），其中大大少於完整的人可變域被來自於非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中有些 CDR 殘基以及可能的一些 FR 殘基被來自齧齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。

可使用免疫後在內源性免疫球蛋白產生缺失時能產生完整人抗體的轉基因動物（如：小鼠）。例如，它被描述為，嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區域基因的純合性缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。在此種系變種小鼠中人種系免疫球蛋白基因陣列的轉移在抗原挑戰後將導致人抗體的生成。人抗體也可在噬菌體展示庫中產生。

本發明的抗體優選為通過藥用載體的形式給予受試者。通常，在製劑中使用適量的藥用鹽，以使製劑等滲。藥用載體的例子包括生理鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的 pH 值優選為約 5 至8，更優選為約 7 至7.5。此外，載體還包括緩釋製劑，如：含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質，其中基質為有形物品形式，如：薄膜、脂質體或微粒。本行業的技術人員熟知，某些載體可能為更優選，取決於例如，抗體的給藥途徑和濃度。

該抗體可通過注射（如：靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內）或通過輸注等其他方法給予受試者、患者或細胞，確保其以有效的形式傳輸到血液中。這些抗體也可以通過瘤內或瘤周途徑給予，從而發揮局部和全身的治療作用。局部或靜脈注射為優選。

抗體給藥的有效劑量和時間表可根據經驗確定，並且作出此類決定屬本行業的技術範圍內。本行業的技術人員會明白，必須給予的抗體劑量根據以下因素會有所不同，例如：接受抗體的受試者、給藥途徑、使用的抗體以及其他正在使用的藥物的特定類型。單獨使用的抗體的通常日劑量可能為約 1 µg/kg 至最多 100 mg/kg 體重或更多，這取決於上述因素。給予抗體，優選為治療肺癌後，治療抗體的療效可通過技術人員熟知的不同方法評估。例如：接受治療的受試者肺癌的大小、數量和/或分佈可使用標準腫瘤成像技術進行監測。因治療而給予的抗體與不給予抗體時的病程相比，可阻止腫瘤生長、導致腫瘤縮小、和/或阻止新腫瘤的發展，這樣的抗體是一種有效治療肺癌的抗體。

本發明的另一方面提出了製備識別特異性肽-MHC複合物的可溶性 T 細胞受體 (sTCR) 的一種方法。這種可溶性 T 細胞受體可從特異性 T 細胞克隆中產生，並且它們的親和力可以通過互補決定區靶向誘變而增加。為了 T 細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示（美國2010/0113300， (Liddy et al., 2012)）。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩定 T 細胞受體之目的，可通過非天然二硫鍵、其他共價鍵（單鏈 T 細胞受體）或通過二聚化結構域連接 α 和 β 鏈 (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999)。T 細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因子（參見US 2013/0115191）、域招募效應細胞，如抗 CD3 域等，以便對靶細胞執行特定的功能。此外，它可能表達於用於過繼轉移的 T 細胞。進一步的資訊可在 WO 2004/033685A1 和 WO 2004/074322A1 中找到。 sTCR 的組合在 WO 2012/056407A1 中進行了描述。WO 2013/057586A1 中公開了製備的進一步的方法。

此外，可用本發明的肽和/或 TCR 或抗體或其他結合分子在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌症的診斷。

該抗體或 TCR 也可用於體內診斷實驗。一般來說，抗體用放射性核素標記（如：¹¹¹ In、⁹⁹ Tc、¹⁴ C、¹³¹ I、³ H、³² P 或³⁵ S），從而可免疫閃爍掃描法使腫瘤局限化。在一實施方案中，其中的抗體或片段與兩個或兩個以上選自包括上述蛋白的組的蛋白質靶標的細胞外域結合，並且親和力值 (Kd) 低於 1 x 10µM。

診斷用抗體可通過各種影像學方法使用適合檢測的探針進行標記。探針檢測方法包括但不限於，螢光、光、共聚焦和電鏡方法；磁共振成像和光譜學技術；透視、電腦斷層掃描和正電子發射斷層掃描。合適的探針包括但不限於，螢光素、羅丹明、曙紅及其它螢光團、放射性同位素、黃金、釓和其他稀土、順磁鐵、氟-18 和其他正電子發射放射性核素。此外，探針可能是雙功能或多功能的，並且用一種以上的上述方法可進行檢測。這些抗體可用所述的探針直接或間接進行標記。抗體探針的連接，包括探針的共價連接、將探針融合入抗體、以及螯合化合物的共價連接從而結合探針、以及其他本行業熟知的方法。對於免疫組織化學方法，疾病組織樣本可能是新鮮或冷凍或可能包埋於石蠟中以及用福馬林等防腐劑固定。固定或包埋的切片包括與標記一抗和二抗接觸的樣本，其中該抗體用於檢測原位 蛋白的表達。

本發明的另一方面包括一種體外製備啟動的 T 細胞的方法，該方法包括將 T 細胞與載有抗原的人 MHC 分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原表現細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動 T 細胞，其中所述抗原為根據本發明所述的一種肽。優選情況是足夠量的抗原與抗原表現細胞一同使用。

優選情況是，哺乳動物細胞的TAP 肽轉運載體缺乏或水準下降或功能降低。缺乏 TAP 肽轉運載體的適合細胞包括 T2、RMA-S 和果蠅細胞。TAP 是與抗原加工相關的轉運載體。

人體肽載入的缺陷細胞株 T2 從屬美國菌種保藏中心（ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852，美國）目錄號 CRL1992；果蠅細胞株 Schneider 2 號株從屬 ATCC 目錄 CRL 19863；小鼠 RMA-S 細胞株 Ljunggren 等人描述過 (Ljunggren and Karre, 1985)。

優選情況是，宿主細胞在轉染前基本上不表達 MHC I 類分子。刺激因子細胞還優選為表達對 T 細胞共刺激信號起到重要作用的分子，如，B7.1、B7.2、ICAM-1 和 LFA 3 中的任一種分子。大量 MHC I 類分子和共刺激分子的核酸序列可從 GenBank 和 EMBL 資料庫中公開獲得。

當 MHC I 類表位用作一種抗原時，T 細胞為 CD8 陽性 T 細胞。

如果抗原表現細胞受到轉染而表達這種表位，則優選的細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO:110 的肽或變體氨基酸序列。

可使用其他一些方法來體外生成 T 細胞。例如，自體腫瘤浸潤性淋巴細胞可用于生成 CTL。Plebanski 等人在 (Plebanski et al., 1995) 使用自體外周血淋巴細胞 (PLB) 制得 T 細胞。另外，也可能用肽或多肽脈衝處理樹突狀細胞或通過與重組病毒感染而製成自體 T 細胞。此外，B 細胞可用於製備自體 T細胞。此外，用肽或多肽脈衝處理或用重組病毒感染的巨噬細胞可用於配製自體 T 細胞。S. Walter 等人在 (Walter et al., 2003) 中描述了通過使用人工抗原表現細胞 (aAPC) 體外啟動 T 細胞，這也是生成作用於所選肽的T 細胞的一種合適方法。在本發明中，根據生物素：鏈黴素生物化學方法通過將預製的MHC：肽複合物耦合到聚苯乙烯顆粒（微球）而生成 aAPC。該系統實現了對 aAPC 上的 MHC 密度進行精確調節，這使得可以在血液樣本中選擇地引發高或低親合力的高效抗原特異性 T 細胞反應。除了 MHC：肽複合物外，aAPC 還應攜運含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-CD28 抗體。此外，此類基於 aAPC 的系統往往需要加入適當的可溶性因子，例如，諸如白細胞介素- 12 的細胞因子。

也可用同種異體細胞制得 T 細胞，在 WO 97/26328 中詳細描述了一種方法，以參考文獻方式併入本文。例如，除了果蠅細胞和 T2 細胞，也可用其他細胞來表現肽，如 CHO 細胞、杆狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘感染的靶細胞。此外，也可使用植物病毒（例如，參閱 Porta 等人在  (Porta et al., 1994) 中描述了將豇豆花葉病毒開發為一種表現外來肽的高產系統。

被啟動的 T 細胞直接針對本發明中的肽，有助於治療。因此，本發明的另一方面提出了用本發明前述方法制得的啟動 T 細胞。

按上述方法製成的啟動 T 細胞將會有選擇性地識別異常表達含 SEQ ID NO:1 至 SEQ ID NO 110 氨基酸序列的多肽。

優選情況是，T 細胞通過與其含 HLA/肽複合物的 TCR 相互作用（如，結合）而識別該細胞。T 細胞是殺傷患者靶細胞方法中有用的細胞，其靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽。此類患者給予有效量的啟動 T 細胞。給予患者的 T 細胞可能源自該患者，並按上述方法啟動（即，它們為自體 T 細胞）。或者，T 細胞不是源自該患者，而是來自另一個人。當然，優選情況是該供體為健康人。發明人使用「健康個人」系指一個人一般狀況良好，優選為免疫系統合格，更優選為無任何可很容易測試或檢測到的疾病。

根據本發明，CD8-陽性 T 細胞的體內靶細胞可為腫瘤細胞（有時表達 MHC-II 類抗原）和/或腫瘤周圍的基質細胞（腫瘤細胞）（有時也表達 MHC-II 類抗原； (Dengjel et al., 2006)）。

本發明所述的 T 細胞可用作治療性組合物中的活性成分。因此，本發明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發明中氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者上述有效量的 T 細胞。

發明人所用的「異常表達」的意思還包括，與正常表達水準相比，多肽過量表達，或該基因在源自腫瘤的組織中未表達，但是在該腫瘤中卻表達。「過量表達」系指多肽水準至少為正常組織中的 1.2 倍；優選為至少為正常組織中的 2 倍，更優選為至少 5 或 10 倍。

T 細胞可用本領域已知的方法制得（如，上述方法）。

T 細胞繼轉移方案為本領域所熟知的方案。綜述可發現於：Gattioni et al. 和 Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006)。

本發明的另一個方面包括使用與 MHC 複合的肽，以生成 T 細胞受體，其核酸被克隆並被引入至宿主細胞，優選為 T 細胞。然後，該通過基因工程改變的 T 細胞可轉給患者用於癌症治療。

本發明的任一分子（即肽、核酸、抗體、表達載體、細胞，啟動 T 細胞、T 細胞受體或編碼核酸）都有益於治療疾病，其特點在於細胞逃避免疫反應的打擊。因此，本發明的任一分子都可用作藥劑或用於製造藥劑。這種分子可單獨使用也可與本發明中的其他分子或已知分子聯合使用。

本發明還涉及一種套件，其包括： (a) 一個容器，包含上述溶液或凍乾粉形式的藥物組合物； (b) 可選的第二個容器，其含有凍乾粉劑型的稀釋劑或重組溶液；和 (c) 可選的（i）溶液使用或（ii）重組和/或凍幹製劑使用的說明。

該套件還步包括一個或多個 (iii) 緩衝劑，(iv) 稀釋劑，(v) 過濾液，(vi) 針，或 (v) 注射器。容器最好是瓶子、小瓶、注射器或試管，可以為多用途容器。藥物組合物最好是凍幹的。

本發明中的套件優選包含一種置於合適容器中的凍幹製劑以及重組和/或使用說明。適當的容器包括，例如瓶子、西林瓶 (如雙室瓶)、注射器 (如雙室注射器) 和試管。該容器可能由多種材料製成，如玻璃或塑膠。試劑盒和/或容器最好有容器或關於容器的說明書，指明重組和/或使用的方向。例如，標籤可能表明凍幹劑型將重組為上述肽濃度。該標籤可進一步表明製劑用於皮下注射。

存放製劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重複給予（例如，2-6 次）重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑（如碳酸氫鈉溶液）的第二個容器。

稀釋液和凍幹製劑混合後，重組製劑中的肽終濃度優選為至少 0.15 mg/mL/肽 (=75µg)，不超過 3 mg/mL/肽 (=1500µg)。該套件還可包括商業和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。

本發明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發明所述的藥物組合物製劑，該製劑可有其他成分（例如，其他化合物或及其藥物組合物），也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。

優選情況是，本發明的套件包括與本發明的一種製劑，包裝後與第二種化合物（如佐劑（例如 GM-CSF）、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑）或其藥物組合物聯合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置於單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優選為水溶液，更優選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑後轉換為液體，最好放置於另一個不同的容器中。

治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛裝固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優選情況是，治療套件將包含一個設備（如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等），使得可注射本發明的藥物（本套件的組合物）。

本發明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服（腸道）、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經皮給藥。優選為皮下給藥，最優選為皮內給藥，也可通過輸液泵給藥。

由於本發明的肽從肺癌中分離而得，因此，本發明的藥劑優選用於治療肺癌。

本發明進一步涉及為個體患者製備個體化藥物的一種方法，其中包括：製造含選自預篩選 TUMAP 儲存庫至少一種肽的藥物組合物，其中藥物組合物中所用的至少一種肽選擇為適合於個體患者。在一項實施方案中，藥物組合物為一種疫苗。該方法也可以改動以產生下游應用的 T 細胞克隆物，如：TCR 隔離物或可溶性抗體和其他治療選擇。

「個體化藥物」系指專門針對個體患者的治療，將僅用於該等個體患者，包括個體化活性癌症疫苗以及使用自體組織的過繼細胞療法。

如本文所述，「儲存庫」應指已經接受免疫原性預篩查和/或在特定腫瘤類型中過量表現的一組或一系列肽。「儲存庫」一詞並不暗示，疫苗中包括的特定肽已預先製造並儲存於物理設備中，雖然預期有這種可能性。明確預期所述肽可以用於新製造每種個體化疫苗，也可能被預先製造和儲存。儲存庫（例如，資料庫形式）由腫瘤相關肽組成，其在各種 HLA-A HLA-B 和 HLA-C 等位元基因肺癌患者的腫瘤組織中高度過度表達。其可能含有包括 MHC I 類和 MHC II 類肽或拉長的 MHC I 類肽。除了從幾種肺癌組織中採集的腫瘤相關肽外，儲存庫還可能包含 HLA-A*02 和 HLA-A*24 標記肽。這些肽可對 TUMAP 誘導的 T 細胞免疫進行量化比較，從而可得出疫苗抗腫瘤反應能力的重要結論。其次，在沒有觀察到來自患者「自身」抗原 TUMAP 的任何疫苗誘導的 T 細胞反應時，它們可作為來自「非自身」抗原的重要陽性對照肽。第三，它還可對患者的免疫功能狀態得出結論。

儲存庫的 TUMAP 通過使用一種功能基因組學方法進行鑒定，該方法結合了基因表達分析、質譜法和 T 細胞免疫學 (XPresident^® )。該方法確保了只選擇真實存在于高百分比腫瘤但在正常組織中不表達或僅很少量表達的 TUMAP 用於進一步分析。對於初始肽的選擇，患者的肺癌樣本和健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析： 1. 惡性材料的 HLA  配體用質譜法確定 2. 使用全基因組信使核糖核酸 (mRNA) 表達分析法用於確定惡性腫瘤組織（肺癌）與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。 3. 確定的 HLA 配體與基因表達資料進行比較。腫瘤組織上過度表現或選擇性表現的肽，優選為第 2 步中檢測到的選擇性表達或過量表達基因所編碼的考慮為多肽疫苗的合適候選 TUMAP。 4. 文獻檢索以確定更多證據以支持確認為 TUMP 的肽的相關性 5. 過度表達在 mRNA 水準的相關性由腫瘤組織第 3 步選定的 TUMAP 重新檢測而確定，並且在健康組織上缺乏（或不經常）檢測。 6. 為了評估通過選定的肽誘導體內 T 細胞反應是否可行，使用健康供體以及肺癌患者的人 T 細胞進行體外免疫原性測定。

一方面，在將所述肽加入儲存庫之前，對其進行篩查以瞭解免疫原性。舉例來說（但不限於此），納入儲存庫的肽的免疫原性的確定方法包括體外 T 細胞啟動，具體為：用裝載肽/MHC 複合物和抗 CD28 抗體的人工抗原表現細胞反復刺激來自健康供體的 CD8+ T 細胞。

這種方法優選用於罕見癌症以及有罕見表達譜的患者。與含目前開發為固定組分的多肽雞尾酒相反的是，儲存庫可將腫瘤中抗原的實際表達於疫苗進行更高程度的匹配。在多目標方法中，每名患者將使用幾種「現成」肽的選定單一肽或組合。理論上來說，基於從 50 抗原肽庫中選擇例如 5 種不同抗原肽的一種方法可提供大約 170萬 種可能的藥物產品 (DP) 組分。

在一方面，選擇所述肽用於疫苗，其基於個體患者的適合性，並使用本發明此處或後文所述的方法。

HLA 表型、轉錄和肽組學資料從患者的腫瘤材料和血液樣本中收集，以確定最合適每名患者且含有「儲存庫」和患者獨特（即突變）TUMAP 的肽。將選擇的那些肽選擇性地或過度表達于患者腫瘤中，並且可能的情況下，如果用患者個體 PBMC 進行檢測，則表現出很強的體外免疫原性。

優選的情況是，疫苗所包括的肽的一種確定方法包括：(a) 識別由來自個體患者腫瘤樣本表現的腫瘤相關肽 (TUMAP)；(b) 將 (a) 中鑒定的肽與上述肽的儲存庫（資料庫）進行比對；且 (c) 從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的儲存庫（資料庫）中選擇至少一種肽。例如，腫瘤樣本表現的 TUMAP 的鑒定方法有：(a1) 將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及 (a2) 將表達資料與結合到腫瘤樣本中 I 類 MHC 和/或 II 類分子的 MHC 配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的 MHC 配體。優選情況是，MHC 配體的序列的確定方法是：洗脫來自腫瘤樣本分離的 MHC 分子結合肽，並測序洗脫配體。優選情況是，腫瘤樣本和正常組織從同一患者獲得。

除了使用儲存庫（資料庫）模型選擇肽以外，或作為一種替代方法，TUMAP 可能在新患者中進行鑒定，然後列入疫苗中。作為一種實施例，患者中的候選 TUMAP 可通過以下方法進行鑒定：(a1) 將來自腫瘤樣本的表達資料與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達資料相比對，以識別腫瘤組織中過量表達或異常表達的蛋白；以及 (a2) 將表達資料與結合到腫瘤樣本中 I 類 MHC 和/或 II 類分子的 MHC 配體序列想關聯，以確定來源於腫瘤過量表達或異常表達的蛋白質的 MHC 配體。作為另一實施例，蛋白的鑒定方法為可包含突變，其對於腫瘤樣本相對于個體患者的相應正常組織是獨特的，並且 TUMAP 可通過特異性靶向作用於變異來鑒定。例如，腫瘤以及相應正常組織的基因組可通過全基因組測序方法進行測序：為了發現基因蛋白質編碼區域的非同義突變，從腫瘤組織中萃取基因組 DNA 和 RNA，從外周血單核細胞 (PBMC) 中提取正常非突變基因組種系 DNA。運用的 NGS 方法只限于蛋白編碼區的重測序（外顯子組重測序）。為了這一目的，使用供應商提供的靶序列富集試劑盒來捕獲來自人樣本的外顯子 DNA，隨後使用 HiSeq2000（Illumina公司）進行測序。此外，對腫瘤的 mRNA 進行測序，以直接定量基因表達，並確認突變基因在患者腫瘤中表達。得到的數以百萬計的序列讀數通過軟體演算法處理。輸出列表中包含突變和基因表達。腫瘤特異性體突變通過與 PBMC 衍生的種系變化比較來確定，並進行優化。然後，為了儲存庫可能測試新確定的肽瞭解如上所述的免疫原性，並且選擇具有合適免疫原性的候選 TUMAP 用於疫苗。

在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽通過以下方法確定：(a) 用上述方法識別由來自個體患者腫瘤樣本表現的腫瘤相關肽 (TUMAP)；(b) 將 (a) 中鑒定的肽與進行腫瘤（與相應的正常組織相比）免疫原性和過量表現預篩查肽的儲存庫進行比對；(c) 從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的儲存庫中選擇至少一種肽；及 (d) 可選地在 (a) 中選擇至少一種新確定的肽，確認其免疫原性。

在一個示範實施方案中，疫苗中所含肽通過以下方法確定：(a) 識別由來自個體患者腫瘤樣本表現的腫瘤相關肽 (TUMAP)；以及 (b) 在 (a) 中選擇至少一種新確定的肽，並確認其免疫原性。

一旦選定了用於個體化肽疫苗的肽時，則產生疫苗。該疫苗優選為一種液體製劑，包括溶解於 20-40% DMSO 之間，優選為約 30-35% DMSO，例如，約 33% DMSO 中的個體肽。

列入產品的每種肽都溶於 DMSO 中。單個肽溶液濃度的選擇取決於要列入產品中的肽的數量。單肽-DMSO 溶液均等混合，以實現一種溶液中包含所有的肽，且濃度為每肽~2.5 mg/ml。然後該混合溶液按照1：3比例用注射用水進行稀釋，以達到在 33% DMSO 中每肽0.826 mg/ml 的濃度。稀釋的溶液通過 0.22 μm 無菌篩檢程序進行過濾。從而獲得最終本體溶液。

最終本體溶液填充到小瓶中，在使用前儲存於-20℃下。一個小瓶包含 700 μL 溶液，其中每種肽含有 0.578 mg。其中的 500 μL（每種肽約 400 μg）將用於皮內注射。

本發明的肽除了用於治療癌症，也可用於診斷。由於肽由肺癌細胞產生，並且已確定這些肽在正常組織中不存在或水準較低，因此這些肽可用於診斷癌症是否存在。

血液樣本中組織活檢物含請求項的肽，可有助於病理師診斷癌症。用抗體、質譜或其他本領域內已知的方法檢測某些肽可使病理師判斷該組織樣本為惡性的還是炎症或一般病變，也可用作肺癌的生物標誌物。肽基團的表現使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。

對病變標本中肽的檢測使得能對免疫系統治療方法的利益進行判斷，特別是如果 T- 淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。MHC 表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監視。因此，肽的表現表明，分析過的細胞並沒有利用這種機制。

本發明的肽可用於分析淋巴細胞對肽的反應（如 T 細胞反應），或抗體對肽或 MHC 分子絡合的肽發生的反應。這些淋巴細胞反應可以作為預後指標，決定是否採取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代反應指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療中，淋巴細胞對肽發生的反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具，如，用於檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。

下列描述優選方案的實施例將對本發明進行說明，並參照隨附圖表（但是不僅限於此）。考慮到本發明的目的，文中引用的所有參考文獻通過引用的方式併入在本文中。

實施例 1 細胞表面表現的腫瘤相關肽的識別和定量 組織樣本

患者的腫瘤組織獲得自海德堡大學醫院和慕尼克大學醫院。正常（健康）組織獲得自 Bio-Options Inc., CA, USA、BioServe, Beltsville, MD, USA、Capital BioScience Inc., Rockville, MD, USA、Geneticist Inc., Glendale, CA, USA、日內瓦大學醫院、海德堡大學醫院、京都府立醫科大學 (KPUM)、大阪市立大學 (OCU)、慕尼克大學醫院、ProteoGenex Inc., Culver City, CA, USA、蒂賓根大學醫院。

所有患者在手術或屍檢前都獲得了書面知情同意。切除後組織立即進行冷休克處理，在分離 TUMAP 前儲存於 -70°C 或以下。從組織樣本中分離 HLA 肽

根據方案 (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999) 略加修改，使用HLA-A*02特異性抗體BB7.2、HLA-A、HLA-B、HLA­C特異性抗體W6/32、CNBr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉澱法獲得了冷休克組織樣本的 HLA 肽庫。質譜分析

獲得的 HLA 肽庫根據其疏水性用反相色譜 (nanoAcquity UPLC system, Waters) 分離，洗脫肽用裝有電噴霧源的 LTQ- velos 融合雜交質譜 (ThermoElectron) 進行了分析。肽庫被直接載入填充有 1.7 µm C18 反相材料 (Waters) 的分析用熔煉石英微毛細管柱（75 µm 內徑x 250 mm），應用流速為 400 nL 每分鐘。隨後，使用來自流速為 300 nL每分鐘、濃度為10% 至 33% 溶劑 B 中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑 A（含0.1% 甲酸的水）和溶劑 B（含0.1 % 甲酸的乙腈）。金鍍膜玻璃毛細管 (PicoTip, New Objective) 用於引入到納升電噴霧源。使用前 5 (TOP5) 策略在資料依賴模式下操作 LTQ-Orbitrap 質譜儀。簡言之，首先以高精確品質完全掃描在 orbitrap 開始一個掃描週期 (R= 30 000)，之後用先前選定離子的動態排除技術在 orbitrap 中對 5 種含量最為豐富的前體離子進行 MS/MS 掃描 (R = 7500)。串聯質譜以 SEQUEST 和另一種手動控制器進行解讀。生成的自然肽破碎模式與合成序列相同參考肽的破碎模式進行比較後，確保了被識別的肽序列。

無標記相對 LC-MS定量通過離子計數（即通過LC-MS功能提取和分析）來進行 (Mueller et al., 2007)。該方法假定肽的 LC-MS 信號區域與樣本中其豐度相關。提取的特徵通過充電狀態去卷積和保留時間校準進行進一步處理  (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008)。最後，所有的 LC-MS 特徵與序列鑒定結果交叉引用，以將不同樣本和組織的定量資料與肽呈遞特徵結合。定量資料根據集中資料以兩層方式進行正態化處理，以說明技術和生物學複製變異。因此，每個被識別的肽均可與定量資料相關，從而可得出樣本和組織之間的相對定量。此外，對候選肽獲得的所有定量資料進行手動檢查，以確保資料的一致性，並驗證自動化分析的準確度。對於每種肽，計算了表現圖，其顯示樣本平均表現量以及複製變化。這些特徵使肺癌樣本與正常組織樣本的基線值並列。

示範性過度表現肽的表現譜示於圖 1 中。示範性肽的表現分數見表 15 和表 16。 表 15：表現分數。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過量表現 (+++)、與一系列正常（健康）組織相比在腫瘤上高度過量表現 (++) 或與一系列正常組織相比在腫瘤上過量表現 (+) 的 HLA-A*02 肽。

表 16：表現分數。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過量表現 (+++)、與一系列正常組織相比在腫瘤上高度過量表現 (++) 或與一系列正常組織相比在腫瘤上過量表現 (+) 的 HLA-A*24 肽。

實施例 2 編碼本發明肽的基因的表達譜

與正常細胞相比在腫瘤細胞上一種肽過度表現或特定表現足夠其在免疫治療中有效使用，一些肽為腫瘤特異性的，儘管存在其源蛋白也存在于正常組織中。但是，mRNA 表達譜增加了免疫治療目標肽選擇中其他級別的安全性。特別是對於具有高安全性風險的治療選擇，諸如親和力成熟的 TCR，理想的目標肽將來源於對該腫瘤獨一無二且不出現于正常組織中的蛋白。RNA 來源與製備

手術切除組織標本按如上所述（參見實施例 1）在獲得每名患者的書面知情同意後提供。手術後立即速凍腫瘤組織標本，之後在液態氮中用杵臼勻漿。使用 TRI 試劑（Ambion 公司, Darmstadt，德國）之後用 RNeasy（QIAGEN公司，Hilden，德國）清理從這些樣本中製備總 RNA；這兩種方法都根據製造商的方案進行。

健康人體組織中的總 RNA 從商業途徑獲得（Ambion公司，Huntingdon，英國；Clontech公司，海德堡，德國； Stratagene 公司，阿姆斯特丹，荷蘭；BioChain 公司，Hayward, CA, 美國）。混合數個人（2 至 123 個人）的 RNA，從而使每個人的 RNA 得到等加權。

所有 RNA 樣本的品質和數量都在 Agilent 2100 Bioanalyzer 分析儀（Agilent 公司， Waldbronn，德國）上使用 RNA 6000 Pico LabChip Kit 試劑盒（Agilent 公司）進行評估。微陣列實驗

所有腫瘤和正常組織的 RNA 樣本都使用 Affymetrix Human Genome (HG) U133A 或HG-U133 Plus 2.0Affymetrix 寡核苷酸晶片（Affymetrix 公司，Santa Clara，CA，美國）進行基因表達分析。所有步驟都根據 Affymetrix 手冊進行。簡言之，如手冊中所述，使用 SuperScript RTII （Invitrogen 公司）以及 oligo-dT-T7 引物（MWG Biotech公司，Ebersberg, 德國）從 5–8 µg RNA中合成雙鏈 cDNA。用 BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit （ENZO Diagnostics 公司， Farmingdale, NY, 美國）進行 U133A 測定或用 GeneChip IVT Labelling Kit （Affymetrix 公司）進行 U133 Plus 2.0 測定，之後用鏈黴親和素-藻紅蛋白和生物素化抗鏈黴素蛋白抗體（Molecular Probes 公司，Leiden，荷蘭）進行破碎、雜交和染色，這樣完成體外轉錄。用 Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) 或 Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0) 對圖像進行掃描，用 GCOS 軟體（Affymetrix公司）在所有參數默認設置情況下對資料進行分析。為了實現標準化，使用了 Affymetrix 公司提供的 100 種管家基因 (housekeeping gene)。相對表達值用軟體給定的 signal log ratio 進行計算，正常腎組織樣本的值任意設置為 1.0。本發明的代表性源基因在肺癌中高度過量表達的表達譜如圖 2 所示。進一步代表性基因的表達分數見表 17 和表 18。   表 17：表達分數。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過量表達 (+++)、與一系列正常組織相比在腫瘤上高度過量表達 (++) 或與一系列正常組織相比在腫瘤上過量表達 (+) 的基因的HLA-A*02 肽。

表 18：表達分數。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過量表達 (+++)、與一系列正常組織相比在腫瘤上高度過量表達 (++) 或與一系列正常組織相比在腫瘤上過量表達 (+) 的基因的HLA-A*24 肽。

實施例 3 MHC-I 類表現肽的體外免疫原性

為了獲得關於本發明 TUMAP 的免疫原性資訊，發明人使用體外 T 細胞擴增分析方法進行了研究，其中該分析方法基於使用裝載肽/MHC 複合物和抗CD28 抗體的人工抗原表現細胞 (aAPC) 進行反復刺激。用這種方法，發明人可顯示出本發明目前為止 84 種 HLA-A*02 限制 TUMAP 具有免疫原性，這表明這些肽為對抗人 CD8+ 前體 T 細胞的 T 細胞表位（表 19）。CD8+ T 細胞體外啟動

為了用載有肽-MHC複合物 (pMHC) 和抗 CD28 抗體的人工抗原表現細胞進行體外刺激，發明人首先從 University clinics Mannheim, Germany 中獲取健康供體 CD8 微珠 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany) 通過積極選擇白細胞清除術後新鮮HLA-A*02 產物而分離出 CD8+ T 細胞。

PBMC 和分離出的 CD8+ 淋巴細胞使用前在 T 細胞培養基 (TCM) 中培養，培養基包括 RPMI- Glutamax （Invitrogen公司，Karlsruhe，德國）並補充 10% 熱滅活人 AB 血清（PAN-Biotech 公司，Aidenbach，德國）、100U/ml 青黴素/ 100 µg/ml 鏈黴素（Cambrex公司，Cologne，德國），1mM 丙酮酸鈉（CC Pro公司，Oberdorla，德國）和20 µg/ml  慶大黴素（Cambrex公司）。在此步驟，2.5 ng/ml 的 IL-7 （PromoCell公司，Heidelberg，德國） 和 10 U / ml 的 IL- 2（Novartis Pharma 公司，Nürnberg，德國）也加入 TCM。

對於pMHC/抗-CD28 塗層珠的生成、T 細胞的刺激和讀出，使用每刺激條件四個不同 pMHC 分子以及每個讀出條件 8 個不同的 pMHC 分子在高度限定的體外系統中進行。

純化的共刺激小鼠 IgG2a 抗人 CD28 抗體 9.3  (Jung et al., 1987) 使用製造商 （Perbio公司，波恩，德國）推薦的 N-羥基琥珀醯亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為 5.6 µm的鏈黴抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒（Bangs Labooratories，伊利諾州，美國）。

用於陽性和陰性對照刺激物的 pMHC 分別為A*0201/MLA-001（從 Melan-A/MART-1中修飾制得的肽ELAGIGILTV (SEQ ID NO.163)）和A*0201/DDX5-001（從 DDX5 中獲得的YLLPAIVHI (SEQ ID NO.164)）。

800.000 珠/200 µl 包裹於含有 4 x 12.5 ng 不同生物素-pMHC 的 96 孔板、進行洗滌，隨後加入體積為 200 µl 的 600 ng生物素抗-CD28。在 37℃ 下，在含 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) 的 200 µl TCM 中共培養 1x10⁶ CD8+T 細胞與 2x10⁵ 的清洗塗層珠 3 天，從而啟動刺激。之後，一半培養基與補充 80 U/ml IL-2 的新鮮 TCM 進行交換，並且培養在 37℃ 下持續 4 天。這種刺激性週期總共進行 3 次。對於使用每條件 8 種不同 pMHC 分子的 pMHC 多聚體讀出，二維組合編碼方法如前述使用 (Andersen et al., 2012)，稍作修飾，涵蓋耦合至 5 種不同的螢光染料。最後，用 Live/dead near IR 染料（Invitrogen公司，Karlsruhe，德國）、CD8-FITC  抗體克隆 SK1（BD公司，Heidelberg，德國）和螢光 pMHC多聚體而執行多聚體分析。對於分析，使用了配有合適鐳射儀和篩檢程序的 BD LSRII SORP 細胞儀。肽特異性細胞以占總 CD8+ 細胞的百分比形式進行計算。多聚體分析結果使用 FlowJo 軟體 (Tree Star 公司，Oregon，美國) 進行評估。特定多聚體+ CD8+淋巴細胞的體外填裝用與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激後發現含有特異性 CD8+ T 細胞株（即該孔包含至少 1% 特定多聚體+ CD8+ T 細胞，並且特定多聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數的 10 倍），則檢測給定抗原的免疫原性。肺癌肽體外免疫原性

對於受到測試的 HLA-I 類肽，可通過肽特異性 T 細胞株的生成證明其體外免疫原性。TUMAP 特異性多聚體對本發明的 3 種肽染色後流式細胞儀檢測的典型結果如圖 3 所示，同時也含有相應的陰性對照資訊。本發明 84 種肽的結果匯總於表 19。     表 19：本發明中 HLA-A*02肽的體外免疫原性。 申請人對本發明的肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。 ＜20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; ＞= 70 % = ++++

表 20：本發明中 HLA-A*24肽的體外免疫原性。 申請人對本發明的肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。 ＜20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; ＞= 70 % = ++++

實施例 4 肽的合成

所有的肽通過使用 Fmoc 策略以標準、廣為接受的固相肽合成法合成。每個肽的身份和純度已使用質譜和 RP-HPLC 分析法確定。用凍幹法（三氟乙酸鹽）獲得白色至類白色的肽，純度為 ＞85%。所有的 TUMAP 優選作為三氟乙酸鹽或乙酸鹽進行給藥，其他藥用鹽形式也可以。 實施例 5MHC 結合測定

本發明基於 T 細胞療法的候選肽進一步測試其 MHC 結合能力（親和性）。單個肽-MHC 複合體通過 UV-配體交換產生，其中，紫外線敏感肽經紫外線照射後裂解，與分析的相關肽交換。只有能夠有效地結合並穩定肽接受 MHC 分子的候選肽才能阻止 MHC 複合物的解離。為了確定交換反應的產率，將基於穩定 MHC 複合物輕鏈 (β2m) 的檢測結果進行 ELISA 測定。檢測總體上按照 Rodenko 等人在 (Rodenko et al., 2006) 中描述的方法進行。

96 孔 Maxisorp 板 (NUNC) 在室溫下在 PBS 中以 2ug/ml 鏈黴包被過夜，用 4 倍洗滌並在37°C 下在含封閉緩衝液的 2% BSA 中封閉 1 小時。折疊的 HLA-A*02:01/MLA-001 單體作為標準品，涵蓋 15-500ng/ml 的範圍。紫外線交換反應的肽-MHC 單體在封閉緩衝液中稀釋100倍。樣本在 37°C下孵育 1 小時，洗滌四次，在 37°C 下以 2ug/ml HRP 綴合抗-β2m 溫育 1 小時，再次洗滌，並以 NH₂ SO₄ 封堵的 TMB 溶液進行檢測。在 450nm 處測量吸收。在生成和產生抗體或其片段時和/或 T 細胞受體或其片段時，通常優選顯示為高交換產率（優選為高於50%，最優選為高於75%）的候選肽，這是因為它們對MHC分子表現出足夠的親合力，並能防止 MHC 複合物的解離。 表 21：MHC-I 類結合分數 ＜20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 75 %= +++; ＞= 75 % = ++++

實施例 6 細胞表面表現的腫瘤相關肽的絕對定量

黏合劑例如抗體和/或 TCR 的產生是一個費力的過程，其可以僅針對一些選定靶標進行。在腫瘤相關和特異性肽的情況下，選擇標準包括但不限於排除表現於細胞表面上肽的表現和濃度。除了如實施例 1 中所述肽的分離和相對定量，發明人也分析了每個細胞的絕對肽拷貝數。實體腫瘤樣本中每個細胞的 TUMAP 拷貝數定量需要分離 TUMAP 的絕對定量、TUMAP 分離效率和分析的組織樣本細胞計數。實驗步驟如下所述。Nano LC-MS/MS 肽定量

對於通過質譜法對肽的準確定量，使用內標法生成每種肽的校準曲線。內標是每種肽的雙同位素標記的變體，即，TUMAP合成中納入 2 個同位素標記的氨基酸。它與腫瘤相關肽僅在品質上不同，但在其他的物理化學性質方面無差異 (Anderson et al., 2012)。內標被摻入到每個 MS 樣本，所有 MS 信號均標準化為內標 MS信號，以平衡 MS 實驗之間潛在的技術差異。校準曲線用至少三種不同的矩陣繪製，即，來自于類似於常規 MS 樣本的天然樣本的 HLA 肽洗脫液，並且每個制備品以重複 MS 運行進行測量。對於評價，MS信號被標準化為內標信號，校準曲線通過 logistic 回歸計算。對於來自組織樣本的腫瘤相關肽的定量，各樣本也摻有內標，MS信號標準化為內標並使用該肽校正曲線進行定量。肽 /MHC 分離的效率

對於任何蛋白質純化過程，來自組織樣本蛋白的分離與相關蛋白的一定損失相關聯。為了確定 TUMAP 分離的效率，針對選定為絕對定量的所有 TUMAP 產生了肽/MHC複合體。為了能夠區別天然肽/MHC複合體與加樣物，使用了單同位素標記版本的 TUMAP，即 TUMAP 合成期間納入  1 個同位素標記的氨基酸。這些複合物被摻入新製備的組織裂解物中，例如，在 TUMAP 分離過程中最早可能時間點，然後在之後的親和純化中像天然肽/MHC複合物被獲取。因此，測量單標記 TUMAP 的恢復可得到個體 TUMAP 分離效率相關的結論。分離效率使用少量樣本進行分析，且這些組織樣本可比較。與此相反，個體肽之間的分離效率不同。這表明，分離效率雖然只在有限數量的樣本中進行測定，但可外推至任何其他組織制備品中。但是，由於分離效率不能從一種肽外推至其他肽，因此，有必要單獨分析每個 TUMAP。固體、冷凍組織中細胞計數的測定

為了確定經過絕對肽定量的組織樣本的細胞數，發明人採用了 DNA 含量分析。此方法適用于不同來源的廣泛樣本，最重要的是，冷凍樣本 (Forsey and Chaudhuri, 2009; Alcoser et al., 2011; Silva et al., 2013)。在肽分離方案期間，組織樣本被加工為均勻的裂解物，從中取一小等份裂解物。樣本等分為三份，從中分離 DNA（QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden，德國）。每次 DNA 分離的總 DNA 含量至少重複兩次使用基於螢光的 DNA 定量測定法（Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt，德國）進行定量。為了計算細胞數，生成來自單個健康血細胞等分試樣的DNA標準曲線，使用一系列指定的細胞數。標準曲線用於計算每次 DNA 分離的總 DNA 含量的總細胞含量。用於肽分離的組織樣本的平均總細胞計數，在考慮裂解物等份的已知體積和總裂解物體積的情況下進行推算。每細胞的肽拷貝數

使用前述實驗的資料，發明人以總肽量除以樣本總細胞計數計算得出每個細胞的 TUMAP 拷貝數，隨後除以分離效率。選定肽的細胞拷貝數如表22所示。 表 22：絕對拷貝數。該表列出了 NSCLC 腫瘤樣本中絕對肽定量的結果。針對每種肽，每個細胞的中位元拷貝數表示：＜100  = +; ＞=100 = ++; ＞=1,000 +++; ＞=10,000 = ++++。 提示樣本數量，其中提供評估的高品質 MS 數據。

實施例7

HLA II類T細胞增殖檢測

以下實驗總結了選定MHC II類TUMAP的T細胞增殖測定結果。測試的10個肽抗原中的9個呈陽性免疫原性。21個可評估T細胞樣本中的11個對至少一種肽表現出陽性反應。個體肽抗原在最多6個供體中刺激CD4+ T細胞增殖。這些數位與同一檢測中測試的五個參考肽結果具有可比性，且在臨床疫苗試驗環境下證實了大多數患者的免疫原性。因此，可以得出結論，新測試肽也很有可能在疫苗試驗中誘導 T 細胞反應。

為了總結選定肽的可能性尤其是作為備選疫苗的可能性，使用 ProImmune 公司的商業 T 細胞增殖測定法分析 T 細胞增殖來確定其體外免疫原性。

健康供體 CD8 耗竭血細胞樣本用選定的肽進行了測試。誘導 CD4⁺ T 細胞增殖的肽可能導致出現輔助 T 細胞免疫應答，因此，這些肽被認為具有免疫原性。使用羧基琥珀醯亞胺酯 (CFSE) 標記對 CD4⁺ T 細胞的增殖進行確定。在增殖細胞中，CFSE 均勻地分佈到分裂細胞。因此，在分析的細胞中增殖可測定為 CFSE 螢光減少。 表 23 選定 HLA II 類肽。

測試原理

來自健康人供體的外周血單核細胞 (PBMC) 樣本基於 HLA-DRB1 等位基因表達選自ProImmune 細胞庫。CD8⁺ T 細胞在使用前從供體血液樣本耗盡以避免假陽性反應。剩餘的 CD4⁺ T 細胞用 CFSE 標記，隨後用 5μM 每個所選肽進行孵育。每個肽在六個複製孔中進行測試。背景在每板上六個未刺激的對照孔中進行測量。

經過 7 天孵育後，細胞用抗 CD4 抗體共染色，並通過流式細胞術分析。增殖程度通過測量 CFSE 強度下降程度來確定。

流式細胞儀資料使用 FlowJo 軟體（Tree Star 公司) 進行評估。流式細胞儀分析結果以 CD4⁺ 不顯著人群與總 CD4⁺ 人群之比表示。增殖程度表示為高於背景的刺激百分比，即抗原刺激 CD4⁺ CFSE dim 細胞的比例減去未刺激對照孔 CD4⁺ CFSE dim 細胞的比例。對於每個樣本，計算每次重複的平均值以及相應的平均值標準誤差 (SEM)。供體的選擇

供體按 HLA-DRB1 等位基因表達選擇。另外兩種 HLA II 類位點（DQ 和 DP）沒有被納入分析。相關 DRB1 等位元基因根據預測肽結合頻率基於 SYFPEITHI 演算法選擇 (Rammensee et al., 1999)。對於 HLA-DR，結合通過等於或大於 18 的 SYFPEITHI 結合預測分數來定義。此結合閾值分數基於對公佈的已知混雜 HLA-DR 配體的結合分數分析而被定義（表 24）。 表 24：經實驗證明與幾種 HLA-DR 等位基因結合的肽 HLA-DR 結合的 SYFPEITHI 預測分數。如果實驗證明與所示 DR 等位元基因結合，則只顯示預測分數。如果 DR 等位元基因的高解析度資訊缺失，則標記為*。如果實驗證明一個等位基因結合了，23/26 (89%) 的 SYFPEITHI 分數 ＞ = 18。

所有選擇肽中結合頻率超過 20% 的所有 DRB1 基因均被要求納入 ProImmune 的供體組。額外要求 4 個其他少見的 DRB1 等位基因（DRB1*10:01、DRB1*16:01、DRB1*08:01 和 DRB1*13:03）。組合供體組如表 26 所示。 表25 選定肽與含已知結合基序的各種HLA-DRB1等位基因的結合能力：SYFPEITHI得分超過17，則以1算作一個結合事件。最後一列顯示的是所有選定肽的結合事件百分比。

表26 供體組。21 個選定供體的HLA-DRB1 等位基因分佈

體外免疫原性結果

CD4⁺ T 細胞的抗原刺激增殖被認為是體外免疫原性的指標，並使用來自 ProImmune 的市售 T 細胞增殖測定法進行了研究。抗原刺激 CD4⁺ T 細胞增殖的程度以高於背景的刺激百分比表示。刺激超過背景 0.02% 以上的反應，SEM=2（即，兩個標準誤差值大於背景）被視為陽性。

10 個選定肽抗原中的9 個測試呈陽性（FN1-002 除外）。21 個可評估 T 細胞樣本中的11 個對至少一種肽表現出陽性反應（圖 4）。個體肽抗原在最多 6 個供體中刺激 CD4⁺ T 細胞增殖。體內與體外免疫原性的比較

T 細胞增殖分析包括 5 個肽，以已知體內免疫原性作為陽性對照。對於這些肽的體內免疫原性，採用 CD4 T 細胞的細胞內細胞因子染色 (ICS) 法在臨床試驗中使用接種過這些肽的患者的血樣進行測定。

原則上，ICS 測定法分析效應子功能有關的特異性 T 細胞的品質。因此，外周單核細胞 (PBMC) 在體外用相關肽、參考肽和陰性對照（此處為模擬）進行再刺激。在再刺激細胞進行染色檢查 IFN-γ、TNF-α、IL-2 和 IL-10 產生以及共刺激分子 CD154的表達後，在流式細胞儀上對染色細胞進行計數（圖 5）。

免疫原性分析顯示，在 16 名患者中接種 IMA950 肽（BIR-002 和 MET-005）的免疫應答為 100%（研究 IMA950-101），在 71 名患者中接種 IMA910 肽（CEA-006、TGFBI-004 和 MMP-001）的免疫應答為 44% 至 86%（研究 IMA910-101）（圖 6）。

體內免疫原性已知的肽的體外免疫原性結果與選定肽進行了比較（表 27）。分析表明，在 21 個接受研究的供體樣本中的 7 個，陽性對照肽刺激 CD4⁺ T 細胞增殖。在每個肽的最多 4 個供體樣本中，平均刺激反應的強度範圍高於背景 0.09 至 0.31%。例如，對於 BIR-002 的刺激強度為 0.24%。BIR-002 被認為在不同的臨床試驗中具有高度免疫原性。在針對表達不同 HLA-DR 等位基因的 19 名可評估患者進行的一項臨床試驗中，BIR-002 作為攝護腺癌特異性肽疫苗的組分進行了測試  (Feyerabend et al., 2009)。16 名 (84%) 患者有針對 BIR-002 的 CD4+ T 細胞應答 (Widenmeyer et al., 2008)，表明其高免疫原性潛力。在 IMA950 試驗中，100%  (N = 16) 的患者顯示了對 BIR-002 的免疫應答。

通過比較，除了 FN1-002 外，當前分析中所選肽刺激總共11 個受研究供體樣本中的 CD4⁺ T細胞增殖。因而，在每個肽的最多 6 個供體中，平均刺激反應的強度範圍高於背景 0.19 至 0.48%。這些值類似于高度免疫原性肽 BIR-002 刺激反應的強度。有趣的是，對於所有陽性對照肽，體外免疫原性測定陽性供體樣本的分數（範圍：4-19%）大大低於臨床試驗中對這些肽有免疫應答患者的分數（範圍：44- 100%）。這一觀察表明，當前在體外免疫原性測定設置相當保守，並很可能低估了臨床環境中肽的免疫原性。因此，可以預料，被研究的 10 個肽中有 9 個很可能在臨床試驗中誘發大多數患者的體內免疫應答。 表 27. 選定肽和具有已知體內免疫原性的陽性對照肽的 T 細胞增殖測定結果。

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無

在圖中，

圖 1 A-D 顯示了正常組織和 NSCLC 樣本中各種肽的過量表現。圖 1E-F顯示了所有的細胞系、正常組織和癌症組織，其中檢測出了典型肽 （FVFSFPVSV, SEQ ID NO:4 (A*02) 和 YYTKGFALLNF, SEQ ID NO:29 (A*24)）。圖 1A-基因：SLC6A14，肽：FLIPYAIML (A*02; SEQ ID NO.:2) - 從左至右的組織：1脂肪組織，3腎上腺，5動脈，3骨髓，8大腦，3乳房，13結腸，1十二指腸，7食管，2膽囊，5心，16腎臟，4白細胞樣本，21肝臟，1淋巴結，1卵巢，7胰腺癌，2周圍神經，1腹膜，1腦垂體，1胎盤，3 胸膜，6直肌，2唾液腺，3骨骼肌，3皮膚，2小腸，4脾，7胃，3睾丸，2胸腺，3甲狀腺，1輸尿管，2子宮，2靜脈，46肺，91 NSCLC。該肽也在胰腺癌、胃癌、結直腸癌、食管癌中找到（未顯示）。圖 1B-基因：COL6A3,肽：FLFDGSANL (A*02; SEQ ID NO.:13) - 從左至右的組織：1脂肪組織，3腎上腺，5動脈，3骨髓，8大腦，3乳房，13結腸，1十二指腸，7食管，2膽囊，5心，16腎臟，4白細胞樣本，21肝臟，1淋巴結，1卵巢，7胰腺癌，2周圍神經，1腹膜，1腦垂體，1胎盤，3 胸膜，6直肌，2唾液腺，3骨骼肌，3皮膚，2小腸，4脾，7胃，3睾丸，2胸腺，3甲狀腺，1輸尿管，2子宮，2靜脈，46肺，91 NSCLC。該肽也在攝護腺癌、乳腺癌、結直腸癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、胃癌 中找到（未顯示）。圖 1C-基因：CCL18，肽：VYTSWQIPQKF (A*24; SEQ ID NO.:23) - 從左至右的組織：2腎上腺，1動脈，4腦，1乳腺，5結腸，1心臟，13腎臟，9肝臟，3胰腺，1腦垂體，2直肌，3皮膚，1脾，12胃，1胸腺，2子宮，9肺，80 NSCLC。該肽也在攝護腺癌、胃癌中找到（未顯示出）。圖 1D-基因：CENPN，肽：RYLDSLKAIVF (A*24; SEQ ID NO.:28) - 從左至右的組織：2腎上腺，1動脈，4腦，1乳腺，5結腸，1心臟，13腎臟，9肝臟，3胰腺，1腦垂體，2直肌，3皮膚，1脾，12胃，1胸腺，2子宮，9肺，80 NSCLC。該肽也在肝癌、胃癌、RCC 中找到（未顯示）。圖 1E-基因：DUSP4，肽：FVFSFPVSV (A*02; SEQ ID NO.:4)  - 從左至右的組織：5胰腺細胞系，3皮膚，15正常組織（2食管，7肺，3脾，3胃），126癌組織（1腦癌，2乳腺癌，5結腸癌，5食管癌，2膽囊癌，8腎癌，5肝癌，58肺癌，11卵巢癌，9胰腺癌，2攝護腺癌，1直腸癌，4皮膚癌，12胃癌，1睾丸癌）。該組正常組織與 A-B 相同，但沒有檢測的組織未顯示。圖 1F-基因：PLOD2，肽：YYTKGFALLNF (A*24; SEQ ID NO.:29) - 從左至右的組織：30癌組織（1腦癌，3腎癌，2肝癌，22肺癌，2胃癌）。該組正常組織與 C-D 相同，但沒有檢測的組織未顯示。圖1G 顯示了正常組織和 NSCLC 樣本中 A*24 肽的過量表現。基因：LAMP3，肽：RFMDGHITF (A*24; SEQ ID NO.:25) - 從左至右的組織：2腎上腺，1動脈，4腦，1乳腺，5結腸，1心臟，13腎臟，9肝臟，3胰腺，1腦垂體，2直肌，3皮膚，1脾，12胃，1胸腺，2子宮，9肺，80 NSCLC。該肽也在攝護腺癌、胃癌中找到（未顯示）。

圖2 顯示了本發明的源基因的代表性表達特徵（與正常腎臟相比的相對表達），這些基因在一系列正常組織胰腺癌中以及 38 份肺癌樣本中高度過度表達或專門表達。從左到右的組織：腎上腺、動脈、骨髓、腦（全部）、乳腺、結腸、食管、心臟、腎（三份）、白細胞、肝、肺、淋巴結、卵巢、胰腺、胎盤、攝護腺、唾液腺腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、膀胱、宮頸、子宮、靜脈、1個正常（健康）肺樣品、38個  NSCLC 樣本。A) SMC4, B) LAMB3; C) MMP12, 和 D) CENPN。

圖 3顯示了示例性的免疫原性資料：肽特定多聚體染色後流式細胞儀結果。A) SLC1A4-001 (SEQ ID No. 12), B) IGF2BP3-001 (SEQ ID No. 120), C) LAMC2-001 (SEQ ID No. 121), D) COL6A3-008 (SEQ ID No. 13), 和 E) LAMP3-001 (SEQ ID No. 25)。

圖 4 顯示了抗原刺激 CD4⁺ T細胞增殖的結果：該圖顯示了每個肽的陽性供體的數目。

圖 5 顯示了在 II 級 ICS 測定中針對 CEA-006 的示例性疫苗誘導CD4 T細胞應答。體外致敏後，對患者36-031的 PBMC 進行了分析以瞭解 CD4 T 細胞對 CEA-006 的應答（上圖）並在V8/EOS 庫時間點模擬（下圖）。細胞用相應的肽刺激並分別採用活力、抗 CD3、抗 CD8、抗 CD4和效應標誌物染色（從右到左：CD154、TNF-α，干擾素-γ、IL-2、IL-10）。對活 CD4 T 細胞進行了分析，以瞭解一種或多種效應分子陽性細胞的比例。

圖 6 顯示了控制 II 類肽的免疫原性：本圖顯示了採用 ICS 在 16 例患者中針對 IMA950 肽、在 71 名患者中針對 IMA910 肽檢測了 5 個 II 類肽的免疫應答率。

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<110> 德商英麥提克生物技術股份有限公司(immatics biotechnologies GmbH)

<120> 用於抗肺癌，包括NSCLC及其他癌症的免疫治療的新穎胜肽及胜肽的組合

<140> 105112670

<150> US 62/152,258

<151> 2015-04-24

<150> GB 1507030.3

<151> 2015-04-24

<160> 177

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

＜400＞  2   Phe Leu Ile Pro Tyr Ala Ile Met Leu 1               5                       ＜210＞  3 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  3   Phe Leu Tyr Asp Val Val Lys Ser Leu 1               5                       ＜210＞  4 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  4   Phe Val Phe Ser Phe Pro Val Ser Val 1               5                         ＜210＞  5 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  5   Ala Leu Thr Ser Thr Leu Ile Ser Val 1               5                       ＜210＞  6 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  6   Ser Leu Gln Gly Ser Ile Met Thr Val 1               5                       ＜210＞  7 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  7   Asn Leu Leu Gln Val Leu Glu Lys Val 1               5                       ＜210＞  8 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  8   Ala Leu Leu Asn Ile Leu Ser Glu Val 1               5                       ＜210＞  9 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  9   Ala Leu Ser Gly Thr Leu Ser Gly Val 1               5                       ＜210＞  10 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  10   Lys Met Ala Gly Ile Gly Ile Arg Glu Ala 1               5                   10      ＜210＞  11 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  11   Tyr Leu Asn Val Gln Val Lys Glu Leu 1               5                       ＜210＞  12 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  12   Ile Val Asp Arg Thr Thr Thr Val Val 1               5                       ＜210＞  13 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  13   Phe Leu Phe Asp Gly Ser Ala Asn Leu 1               5                        ＜210＞  14 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  14   Leu Ile Gln Asp Arg Val Ala Glu Val 1               5                       ＜210＞  15 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  15   Glu Leu Asp Arg Thr Pro Pro Glu Val 1               5                       ＜210＞  16 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  16   Leu Ile Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Val 1               5                   10              ＜210＞  17 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  17   Thr Leu Leu Gln Glu Gln Gly Thr Lys Thr Val 1               5                   10            ＜210＞  18 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  18   Ile Leu Leu Thr Glu Gln Ile Asn Leu 1               5                       ＜210＞  19 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  19   Val Leu Thr Ser Asp Ser Pro Ala Leu 1               5                       ＜210＞  20 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  20   Leu Met Thr Lys Glu Ile Ser Ser Val 1               5                       ＜210＞  21 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  21   Val Leu Ser Ser Gly Leu Thr Ala Ala 1               5                       ＜210＞  22 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  22   Asn Leu Ile Asn Gln Glu Ile Met Leu 1               5                       ＜210＞  23 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  23   Val Tyr Thr Ser Trp Gln Ile Pro Gln Lys Phe 1               5                   10          ＜210＞  24 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  24   Asn Tyr Pro Lys Ser Ile His Ser Phe 1               5                       ＜210＞  25 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  25   Arg Phe Met Asp Gly His Ile Thr Phe 1               5                       ＜210＞  26 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  26   Arg Tyr Leu Glu Lys Phe Tyr Gly Leu 1               5                       ＜210＞  27 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  27   Arg Tyr Pro Pro Pro Val Arg Glu Phe 1               5                       ＜210＞  28 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  28   Arg Tyr Leu Asp Ser Leu Lys Ala Ile Val Phe 1               5                   10          ＜210＞  29 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  29   Tyr Tyr Thr Lys Gly Phe Ala Leu Leu Asn Phe 1               5                   10          ＜210＞  30 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  30   Lys Tyr Leu Glu Lys Tyr Tyr Asn Leu 1               5                         ＜210＞  31 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  31   Ser Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu 1               5                       ＜210＞  32 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  32   Glu Tyr Gln Pro Glu Met Leu Glu Lys Phe 1               5                   10      ＜210＞  33 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  33   Thr Tyr Ser Glu Lys Thr Thr Leu Phe 1               5                       ＜210＞  34 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  34   Val Phe Met Lys Asp Gly Phe Phe Tyr Phe 1               5                   10      ＜210＞  35 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  35   Thr Tyr Asn Pro Glu Ile Tyr Val Ile 1               5                       ＜210＞  36 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  36   Tyr Tyr Gly Asn Thr Leu Val Glu Phe 1               5                       ＜210＞  37 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  37   Arg Tyr Leu Glu Tyr Phe Glu Lys Ile 1               5                       ＜210＞  38 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  38   Val Phe Leu Asn Arg Ala Lys Ala Val Phe Phe 1               5                   10          ＜210＞  39 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  39   Lys Phe Leu Glu His Thr Asn Phe Glu Phe 1               5                   10      ＜210＞  40 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  40   Ile Tyr Asn Pro Ser Met Gly Val Ser Val Leu 1               5                   10          ＜210＞  41 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  41   Thr Tyr Ile Gly Gln Gly Tyr Ile Ile 1               5                       ＜210＞  42 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  42   Val Tyr Val Thr Ile Asp Glu Asn Asn Ile Leu 1               5                   10          ＜210＞  43 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  43   Arg Tyr Thr Leu His Ile Asn Thr Leu 1               5                         ＜210＞  44 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  44   Ile Tyr Asn Gln Ile Ala Glu Leu Trp 1               5                       ＜210＞  45 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  45   Lys Phe Leu Glu Ser Lys Gly Tyr Glu Phe 1               5                   10      ＜210＞  46 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  46   Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Phe Gly Ser Asn Phe 1               5                   10          ＜210＞  47 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  47   Arg Tyr Ile Ser Pro Asp Gln Leu Ala Asp Leu 1               5                   10          ＜210＞  48 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  48   Tyr Tyr Tyr Gly Asn Thr Leu Val Glu Phe 1               5                   10      ＜210＞  49 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  49   Gln Tyr Leu Phe Pro Ser Phe Glu Thr Phe 1               5                   10      ＜210＞  50 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  50   Leu Tyr Ile Gly Trp Asp Lys His Tyr Gly Phe 1               5                   10          ＜210＞  51 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  51   Asn Tyr Leu Leu Glu Ser Pro His Arg Phe 1               5                   10      ＜210＞  52 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  52   Ser Tyr Met Glu Val Pro Thr Tyr Leu Asn Phe 1               5                   10          ＜210＞  53 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  53   Ile Tyr Ala Gly Gln Trp Asn Asp Phe 1               5                       ＜210＞  54 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  54   Ala Tyr Lys Asp Lys Asp Ile Ser Phe Phe 1               5                   10      ＜210＞  55 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  55   Ile Tyr Pro Val Lys Tyr Thr Gln Thr Phe 1               5                   10      ＜210＞  56 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  56   Arg Tyr Phe Pro Thr Gln Ala Leu Asn Phe 1               5                   10        ＜210＞  57 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  57   Ser Tyr Ser Ile Gly Ile Ala Asn Phe 1               5                       ＜210＞  58 ＜211＞  13 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  58   Val Tyr Phe Lys Pro Ser Leu Thr Pro Ser Gly Glu Phe 1               5                   10                  ＜210＞  59 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  59   His Tyr Phe Asn Thr Pro Phe Gln Leu 1               5                       ＜210＞  60 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  60   Ser Tyr Pro Ala Lys Leu Ser Phe Ile 1               5                       ＜210＞  61 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  61   Arg Tyr Gly Ser Pro Ile Asn Thr Phe 1               5                       ＜210＞  62 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  62   Ala Tyr Lys Pro Gly Ala Leu Thr Phe 1               5                       ＜210＞  63 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  63   Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Asn Ile Trp 1               5                       ＜210＞  64 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  64   Val Tyr Pro Leu Ala Leu Tyr Gly Phe 1               5                       ＜210＞  65 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  65   Ile Tyr Gln Arg Trp Lys Asp Leu Leu 1               5                       ＜210＞  66 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  66   Asp Tyr Ile Pro Gln Leu Ala Lys Phe 1               5                       ＜210＞  67 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  67   Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly His Leu Ser Phe 1               5                   10              ＜210＞  68 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  68   Arg Tyr Leu Phe Val Val Asp Arg Leu 1               5                       ＜210＞  69 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  69   Thr Tyr Ala Ala Leu Asn Ser Lys Ala Thr Phe 1               5                   10            ＜210＞  70 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  70   Val Tyr His Ser Tyr Leu Thr Ile Phe 1               5                       ＜210＞  71 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  71   Thr Tyr Leu Thr Asn His Leu Arg Leu 1               5                       ＜210＞  72 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  72   Tyr Tyr Val Asp Lys Leu Phe Asn Thr Ile 1               5                   10      ＜210＞  73 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  73   Arg Tyr Leu His Val Glu Gly Gly Asn Phe 1               5                   10      ＜210＞  74 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  74   Glu Tyr Leu Pro Glu Phe Leu His Thr Phe 1               5                   10      ＜210＞  75 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  75   Ala Tyr Pro Asp Leu Asn Glu Ile Tyr Arg Ser Phe 1               5                   10              ＜210＞  76 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  76   Val Tyr Thr Glx Ile Gln Ser Arg Phe 1               5                       ＜210＞  77 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  77   Arg Tyr Leu Glu Ala Gly Ala Ala Gly Leu Arg Trp 1               5                   10              ＜210＞  78 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  78   Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  79 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  79   Arg Tyr Gly Gly Ser Phe Ala Glu Leu 1               5                       ＜210＞  80 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  80   Ala Tyr Leu Lys Glu Val Glu Gln Leu 1               5                       ＜210＞  81 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  81   Lys Tyr Ile Glu Ala Ile Gln Trp Ile 1               5                       ＜210＞  82 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  82   Phe Tyr Gln Gly Ile Val Gln Gln Phe 1               5                          ＜210＞  83 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  83   Glu Tyr Ser Asp Val Leu Ala Lys Leu Ala Phe 1               5                   10          ＜210＞  84 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  84   Thr Phe Asp Val Ala Pro Ser Arg Leu Asp Phe 1               5                   10          ＜210＞  85 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  85   Pro Phe Leu Gln Ala Ser Pro His Phe 1               5                       ＜210＞  86 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  86   Leu Ser Ala Asp Asp Ile Arg Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Asp Pro 1               5                   10                  15        Lys         ＜210＞  87 ＜211＞  19 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  87   Glu Gly Asp Ile Gln Gln Phe Leu Ile Thr Gly Asp Pro Lys Ala Ala 1               5                   10                  15        Tyr Asp Tyr                 ＜210＞  88 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  88   Asn Pro Val Ser Gln Val Glu Ile Leu Lys Asn Lys Pro Leu Ser Val 1               5                   10                  15        Gly         ＜210＞  89 ＜211＞  14 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  89   Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser 1               5                   10                      ＜210＞  90 ＜211＞  16 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  90   Asp Ala Val Gln Met Val Ile Thr Glu Ala Gln Lys Val Asp Thr Arg 1               5                   10                  15          ＜210＞  91 ＜211＞  18 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  91   Val Ala Arg Leu Pro Ile Ile Asp Leu Ala Pro Val Asp Val Gly Gly 1               5                   10                  15        Thr Asp             ＜210＞  92 ＜211＞  20 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  92   Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro Leu Asp Ile 1               5                   10                  15        Gly Gly Ala Asp             20      ＜210＞  93 ＜211＞  18 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  93   Ser Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro 1               5                   10                  15        Ser Val             ＜210＞  94 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  94   Ile Leu Val Asp Trp Leu Val Gln Val 1               5                       ＜210＞  95 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  95   Lys Ile Ile Gly Ile Met Glu Glu Val 1               5                       ＜210＞  96 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  96   Ala Met Gly Ile Ala Pro Pro Lys Val 1               5                       ＜210＞  97 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  97   Thr Leu Phe Pro Val Arg Leu Leu Val 1               5                       ＜210＞  98 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  98   Val Leu Tyr Pro His Glu Pro Thr Ala Val 1               5                   10      ＜210＞  99 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  99   Ala Leu Phe Gln Arg Pro Pro Leu Ile 1               5                       ＜210＞  100 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  100   Lys Ile Val Asp Phe Ser Tyr Ser Val 1               5                       ＜210＞  101 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  101   Leu Leu Leu Glu Ile Leu His Glu Ile 1               5                       ＜210＞  102 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  102   Ser Leu Leu Ser Glu Leu Gln His Ala 1               5                       ＜210＞  103 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  103   Lys Leu Leu Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Val 1               5                   10      ＜210＞  104 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  104   Ser Leu Val Ala Val Glu Leu Glu Lys Val 1               5                   10      ＜210＞  105 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  105   Ile Val Ala Glu Ser Leu Gln Gln Val 1               5                       ＜210＞  106 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  106   Ser Ile Leu Glu His Gln Ile Gln Val 1               5                       ＜210＞  107 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  107   Ala Leu Ser Glu Arg Ala Val Ala Val 1               5                        ＜210＞  108 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  108   Thr Leu Leu Asp Phe Ile Asn Ala Val 1               5                       ＜210＞  109 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  109   Asn Leu Ile Glu Val Asn Glu Glu Val 1               5                       ＜210＞  110 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  110   Ile Gln Leu Ile Val Gln Asp Lys Glu Ser Val Phe Ser Pro Arg 1               5                   10                  15      ＜210＞  111 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  111   Ser Leu Tyr Lys Gly Leu Leu Ser Val 1               5                       ＜210＞  112 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  112   Val Leu Ala Pro Leu Phe Val Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  113 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  113   Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val 1               5                         ＜210＞  114 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  114   Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val 1               5                        ＜210＞  115 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  115   Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  116 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  116   Lys Ile Gln Glu Met Gln His Phe Leu 1               5                       ＜210＞  117 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  117   Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Gln Val 1               5                       ＜210＞  118 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  118   Ser Leu His Phe Leu Ile Leu Tyr Val 1               5                       ＜210＞  119 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  119   Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val 1               5                       ＜210＞  120 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  120   Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val 1               5                       ＜210＞  121 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  121   Arg Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Leu 1               5                       ＜210＞  122 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  122   Lys Leu Ser Trp Asp Leu Ile Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  123 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  123   Gly Leu Thr Asp Asn Ile His Leu Val 1               5                       ＜210＞  124 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  124   Asn Leu Leu Asp Leu Asp Tyr Glu Leu 1               5                       ＜210＞  125 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  125   Arg Leu Asp Asp Leu Lys Met Thr Val 1               5                        ＜210＞  126 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  126   Lys Leu Leu Thr Glu Val His Ala Ala 1               5                         ＜210＞  127 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  127   Ile Leu Phe Pro Asp Ile Ile Ala Arg Ala 1               5                   10      ＜210＞  128 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  128   Thr Leu Ser Ser Ile Lys Val Glu Val 1               5                       ＜210＞  129 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  129   Gly Leu Ile Glu Ile Ile Ser Asn Ala 1               5                       ＜210＞  130 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  130   Lys Ile Leu Glu Asp Val Val Gly Val 1               5                       ＜210＞  131 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  131   Ala Leu Val Gln Asp Leu Ala Lys Ala 1               5                       ＜210＞  132 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  132   Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala 1               5                   10      ＜210＞  133 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  133   Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Lys Val 1               5                       ＜210＞  134 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  134   Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val 1               5                        ＜210＞  135 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  135   Ala Ile Asp Gly Asn Asn His Glu Val 1               5                       ＜210＞  136 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  136   Ala Leu Val Asp His Thr Pro Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  137 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  137   Phe Leu Val Asp Gly Ser Trp Ser Val 1               5                       ＜210＞  138 ＜211＞  11 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  138   Ala Leu Asn Glu Glu Ala Gly Arg Leu Leu Leu 1               5                   10          ＜210＞  139 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  139   Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu 1               5                         ＜210＞  140 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  140   Thr Leu Tyr Pro His Thr Ser Gln Val 1               5                       ＜210＞  141 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  141   Asn Leu Ile Glu Lys Ser Ile Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  142 ＜211＞  12 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  142   Val Leu Leu Pro Val Glu Val Ala Thr His Tyr Leu 1               5                   10              ＜210＞  143 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  143   Ala Ile Val Asp Lys Val Pro Ser Val 1               5                       ＜210＞  144 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  144   Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala 1               5                   10      ＜210＞  145 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  145   Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val 1               5                       ＜210＞  146 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  146   Phe Gln Tyr Asp His Glu Ala Phe Leu 1               5                       ＜210＞  147 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  147   Val Leu Phe Pro Asn Leu Lys Thr Val 1               5                       ＜210＞  148 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  148   Ala Leu Phe Gly Ala Leu Phe Leu Ala 1               5                       ＜210＞  149 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  149   Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala 1               5                   10      ＜210＞  150 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  150   Gly Val Leu Glu Asn Ile Phe Gly Val 1               5                        ＜210＞  151 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  151   Ala Val Val Glu Phe Leu Thr Ser Val 1               5                       ＜210＞  152 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  152   Ile Leu Gln Asp Arg Leu Asn Gln Val 1               5                         ＜210＞  153 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  153   Ala Leu Tyr Asp Ser Val Ile Leu Leu 1               5                       ＜210＞  154 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  154   Ile Leu Phe Glu Ile Asn Pro Lys Leu 1               5                       ＜210＞  155 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  155   Ala Leu Asp Glu Asn Leu His Gln Leu 1               5                       ＜210＞  156 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  156   Thr Val Ala Glu Val Ile Gln Ser Val 1               5                       ＜210＞  157 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  157   Lys Leu Phe Gly Glu Lys Thr Tyr Leu 1               5                       ＜210＞  158 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  158   Lys Leu Asp Glu Thr Asn Asn Thr Leu 1               5                       ＜210＞  159 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  159   Thr Tyr Lys Tyr Val Asp Ile Asn Thr Phe 1               5                   10       ＜210＞  160 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  160   Ser Tyr Leu Gln Ala Ala Asn Ala Leu 1               5                       ＜210＞  161 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  161   Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe 1               5                   10      ＜210＞  162 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  162   Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp 1               5                   10                  15        Thr       ＜210＞  163 ＜211＞  10 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  163   Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val  1               5                   10      ＜210＞  164 ＜211＞  9 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  164   Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1               5                      ＜210＞  165 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  165   Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1               5                   10                  15      ＜210＞  166 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  166   Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr 1               5                   10                  15        Gly         ＜210＞  167 ＜211＞  16 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  167   Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1               5                   10                  15          ＜210＞  168 ＜211＞  16 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  168   Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr 1               5                   10                  15          ＜210＞  169 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  169   Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His 1               5                   10                  15      ＜210＞  170 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  170   Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr 1               5                   10                  15      ＜210＞  171 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  171   Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1               5                   10                  15      ＜210＞  172 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  172   Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 1               5                   10                  15      ＜210＞  173 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  173   Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val 1               5                   10                  15      ＜210＞  174 ＜211＞  15 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  174   Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly 1               5                   10                  15      ＜210＞  175 ＜211＞  18 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  175   Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg 1               5                   10                  15        Leu Thr             ＜210＞  176 ＜211＞  17 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  176   Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg 1               5                   10                  15        Phe         ＜210＞  177 ＜211＞  13 ＜212＞  PRT ＜213＞  Homo sapiens   ＜400＞  177   Ala Lys Ala Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1               5                   10

Claims (23)

1. 一種肽，其由根據SEQ ID No.30的氨基酸序列所組成；或其一種藥用鹽，其中所述肽具有結合至人類主要組織相容性複合體(MHC)I類之一分子的能力。
2. 如請求項1所述的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。
3. 如請求項1所述的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分。
4. 如請求項3所述的肽，包含HLA-DR抗原相關不變鏈(Ii)的N-端氨基酸。
5. 一種T細胞受體(TCR)，與HLA配體反應，其中所述配體為根據SEQ ID NO：30的氨基酸序列所組成。
6. 如請求項5所述的T細胞受體(TCR)，其中所述T細胞受體(TCR)為重組可溶性或膜結合T細胞受體。
7. 如請求項5所述的T細胞受體(TCR)，其中所述配體為一肽-MHC複合物的部分。
8. 一種抗體，其特異性地識別根據請求項1至4任一項所述的肽。
9. 如請求項8所述的抗體，其中所述抗體為可 溶性或膜結合性抗體。
10. 如請求項8所述的抗體，其中所述抗體特異性地識別與MHC分子結合時的根據請求項1至4任一項所述的肽。
11. 一種核酸，編碼如請求項1至4任一項所述的一種肽、或如請求項5至7任一項所述的一種TCR或如請求項8至10任一項所述的一種抗體。
12. 如請求項11所述的核酸，連接到一個異源啟動子序列。
13. 一種表達載體，表達如請求項11或請求項12所述的一種核酸。
14. 一種重組宿主細胞，其包括如請求項1至4所述的肽、如請求項11或請求項12所述的核酸、或如請求項13所述的表達載體，其中所述宿主細胞為抗原提呈細胞，或其中所述宿主細胞為T細胞或NK細胞。
15. 如請求項14所述的重組宿主細胞，其中所述宿主細胞為樹突狀細胞。
16. 一種製備如請求項1至4任一項所述的肽、如請求項5至7任何一項所述的一種T細胞受體或如請求項8至10任何一項所述的抗體的方法，該方法包括培養如請求項14或請求項15所述的宿主 細胞，其表現如請求項1至4所述的肽或表達如請求項11或請求項12所述的核酸或請求項13所述的表達載體，以及從該宿主細胞或其培養基中分離出該肽或該TCR或該抗體。
17. 一種體外製備啟動的T淋巴細胞的方法，該方法包括將T細胞與載有抗原的人I類MHC分子進行體外接觸足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動T細胞，該人I類MHC分子在合適的抗原提呈細胞表面或人工類比的抗原提呈細胞結構表面上表達，其中所述抗原為請求項1所述的肽。
18. 一種啟動的T淋巴細胞，由如請求項17所述的方法製成，其有選擇性地識別一種細胞，該細胞表現包含請求項1給定氨基酸序列的多肽。
19. 一種藥物組合物，其包括選自下列組成的群組的至少一種活性成分：如請求項1至4任一項所述的肽、如請求項11或請求項12所述的核酸或請求項13所述的表達載體、如請求項14或請求項15所述的重組宿主細胞、如請求項18所述的啟動T淋巴細胞、如請求項8至10任一項所述的抗體或如請求項5至7任一項所述的T細胞受體；以及一藥用載體。
20. 如請求項19所述的藥物組合物，包括額 外藥用賦形劑和/或穩定劑。
21. 一種如請求項1至4任一項所述的肽、如請求項11或請求項12所述的核酸或請求項13所述的表達載體、如請求項14或請求項15所述的重組宿主細胞、如請求項18所述的啟動T淋巴細胞、如請求項8至10任一項所述的抗體或如請求項5至7任一項所述的T細胞受體在製造一種藥劑的用途，該藥劑可抵抗一癌症。
22. 如請求項21所述的用途，其中所述癌症選自下列所構成之群組：肺癌、腦癌、乳腺癌、結直腸癌、食管癌、腎癌、肝癌、卵巢癌、胰腺癌、攝護腺癌、胃癌、黑色素瘤、梅克爾細胞癌、和白血病(AML、CLL)。
23. 一種藥盒，包括：(a)一個容器，包含一種藥物組合物，該藥物組合物含有溶液或凍幹形式的如請求項1至4任一項所述的肽、如請求項11或請求項12所述的核酸或請求項13所述的表達載體、如請求項14或請求項15所述的重組宿主細胞、如請求項18所述的啟動的T淋巴細胞、如請求項8至10任一項所述的抗體或如請求項5至7任一項所述的T細胞受體；(b)一第二個容器，含有凍乾粉劑型的稀釋劑或 重組溶液；(c)至少再有一種的肽，選自由SEQ ID No.30與SEQ ID No.34所組成的群組，以及(d)(i)使用溶液或(ii)重組和/或使用凍乾粉劑型的說明書；及(e)進一步包括一個或多個(iii)緩衝劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。

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