CN103957943A - 纳米颗粒肿瘤疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于哺乳动物受试者中的肿瘤的预防性或治疗性处理的疫苗，以及使用所述疫苗的方法，该方法包括处理肿瘤和产生CTL应答。所述疫苗包含多个纳米颗粒和药学可接受的载体、盐或稀释剂。所述纳米颗粒包含包含金属和/或半导体原子的核心；以及包含共价连接至核心的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至核心的碳水化合物部分，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至核心的表位肽。第二接头包含肽部分和非肽部分，其中所述第二接头的所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：X1为选自A和G的氨基酸；X2为选自A和G的氨基酸；且Z1为选自Y和F的氨基酸，并且其中所述表位肽形成肿瘤相关抗原(TAA)的至少一部分或者来自肿瘤相关抗原(TAA)。

Description

纳米颗粒肿瘤疫苗
发明领域
本发明涉及用于基于肽的疫苗方案中的物质和组合物，特别是为了刺激T细胞应答的肽的纳米颗粒-介导的递送。疫苗方案针对肿瘤例如肺癌肿瘤的治疗性和预防性处理。
发明背景
细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是特化的T细胞，其主要通过识别和杀死癌细胞或感染的细胞发挥功能，但也通过分泌称为细胞因子的、能够调解对免疫系统的多种影响的可溶性分子发挥功能。有证据暗示旨在刺激肿瘤特异性CTL应答的免疫疗法将有效地控制癌症。例如，已经表明人CTL识别肉瘤(Slovin,S.F.et al.,J.Immunol.,137:3042-3048,(1987))，肾细胞癌(Schendel,D.J.et al.,J.Immunol.,151:4209-4220,(1993))，大肠癌(Jacob,L.et al.,Int.J.Cancer,71:325-332,(1997))，卵巢癌(Ioannides,C.G.et al.,J.Immunol.,146:1700-1707,(1991))(Peoples,G.E.et al.,Surgery,114:227-234,(1993))，胰腺癌(Peiper,M.et al.,Eur.J.Immunol.,27:1115-1123,(1997)；Wolfel,T.et al.,Int.J.Cancer,54:636-644,(1993))，头颈部的鳞状肿瘤(Yasumura,S.et al.,Cancer Res.,53:1461-1468,(1993))，和肺的鳞癌(Slingluff,C.L.Jr et al.,Cancer Res.,54:2731-2737,(1994)；Yoshino,I.et al.,Cancer Res.,54:3387-3390,(1994))。对人类肿瘤反应性CTL的最大数量的报道与癌症相关。(Boon,T.et al.,Ann.Rev.Immunol.,12:337-365,(1994))。肿瘤特异性CTL在人(Rosenberg,S.A.et al.,N.Engl.J.Med.,319:1676-1680,(1988))和动物模型(Celluzzi,C.M.et al.,J.Exp.Med.,183:283-287,(1996)；Mayordomo,J.I.et al.,Nat.Med.,1:1297-1302,(1995)；Zitvogel,L.et al.,J.Exp.Med.,183:87-97,(1996))中调节肿瘤消退的能力,暗示针对增加CTL活性的方法很可能对肿瘤处理具有有益影响。
为了使CTL杀死癌细胞或响应于癌细胞而分泌细胞因子，所述CTL必须首先识别该细胞正在癌变。这个过程包括位于CTL的表面上的T细胞受体与位于癌细胞表面上的统称为MHC-肽复合物的相互作用。MHC(主要组织相容性复合体)编码的分子已经被细分为两类，并且被称为I类和II类MHC编码的分子。在人的免疫系统中，MHC分子被称为人30白细胞抗原(HLA)。在MHC中位于染色体6上的是编码MHCⅠ类分子的三种不同的基因座。在这些基因座被编码的MHC分子称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。能够在每个这些基因座上被编码的基因是极其多态的，因此群体中的不同个体在他们的细胞表面上表达不同的MHC I类分子。HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-B7和HLA-B8是可以从这些基因座表达的不同的MHC I类分子的例子。本公开包括与HLA-A1、HLAA2或HLA-Al1分子、HLA-A1超型、HLA-A2超型和HLA-All超型关联的肽。超型是呈递至少一个共同表位的一组HLA分子。本公开包括与HLA分子关联的肽，且包括与衍生这些肽的基因和蛋白质关联的肽。
与MHC分子关联的肽既可以来自于细胞中制造的蛋白质，在这种情况下，它们通常与MHC I类分子关联(Rock,K.L.and Golde,U.,Ann.Rev.Immunol.,17:739-779,(1999))，也可以来自于从细胞外获得的蛋白质，在这种情况下，它们通常与MHC II类分子关联(Watts,C.,Ann.Rev.Immunol.,15:821-850,(1997))。唤起癌症特异性CTL应答的肽最通常与MHC I类分子关联。与MHC I类分子关联的肽长度通常为9个氨基酸，但可以由8个氨基酸的最小长度到14个氨基酸的最大长度之间变化。MHC I类分子与其相结合的肽，或者MHC II类分子与其相结合的肽称作MHC-肽复合物。
完整的蛋白质被降解成肽的过程称作抗原加工。抗原加工的两条主要通路发生于细胞内(Rock,K.L.and Golde,U.,Ann.Rev.Immunol.,17:739-779,(1999)；Watts,C.,Ann.Rev.Immunol.,15:821-850,(1997))。一条通路，其主要局限于抗原呈递细胞例如树突状细胞、巨噬细胞和B细胞的细胞中，所述通路降解通常吞噬或内吞进细胞内的蛋白质。来自于这条通路的肽通常与MHC II类分子结合。抗原加工的第二条通路存在于体内基本上所有的细胞。这条第二通路主要降解制造于细胞内的蛋白质，并且来自于这条通路的肽主要与MHC I类分子结合。本文所指的正是来自抗原加工的第二通路的肽。通过后一条通路的抗原加工包括细胞质中的多肽合成和蛋白水解作用。生产的肽接着被转运至细胞的内质网中，与新合成的MHC I类分子关联，所得到的MHC-肽复合物接着被转运至细胞表面。来自于膜和分泌蛋白质的肽也可以与MHC I类分子关联。在一些情况下，这些肽对应于由信号肽酶切割自蛋白质的蛋白质的信号序列。在其他情况下，认为膜的一些级分和分泌的蛋白质从内质网被转运至细胞质中，在那里加工随后发生。
一旦结合至MHCⅠ类分子并呈现于细胞表面上，所述肽被CTL上的抗原特异性受体识别。如果抗原肽不与MHC I类分子相结合，仅仅表达MHC I类分子本身不足以触发CTL以杀死靶细胞。已经开发了几种方法以鉴定被CTL识别的肽，每种方法依靠CTL识别和只杀死那些表达肽与其结合的适当的MHC I类分子的能力(Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287,(1999))。这样的肽可以来自非自源，例如病原体(如在细胞被细菌或病毒感染后)或者来自于细胞内自我衍生的蛋白质，例如癌细胞。癌细胞中自我衍生的蛋白质的来源的例子已被回顾(Gilboa,E.,Immunity,11:263-270,(1999)；Rosenberg,S.A.,Immunity,10:281-287,(1999))并包括:(i)突变基因；(ii)异常表达的基因例如一种备选的开放读码框架或通过内含子-外显子边界；(iii)选择性地只在肿瘤和睾丸中表达的正常基因；及(iv)在肿瘤和正常细胞相应物中表达的正常的分化基因。
Oberg et al.,2011,European Journal of Cell Biology,Vol.90,pp.582-592，描述了通过Toll-样受体(TLR)配体对T细胞活化的调控。McKee et al.,2005,Journal of Translational Medicine,Vol.3,p.35，回顾了与T细胞的亲和力和肿瘤的识别相关的影响和治疗方案。
WO2011/025572描述了用于癌症的预防、处理和诊断的诱导CTL的免疫原。
用于处理肿瘤的基于肽的疫苗疗法的设计和开发的显著挑战，是含表位的肽经由抗原加工机制的递送，从而使得所述肽被呈递结合至MHCI类分子并由此刺激CTL应答。经常的情况是，为了诱导有效的免疫应答，一种或多种佐剂的施用是必要的。许多佐剂被认为毒性太大，例如不适和人类使用。
虽然许多产品已被开发用于癌症的处理，但对与已知的物质相比具有改进的特性的物质仍有高需求。特别是在免疫接种领域，有必要提供高免疫原性、容易再现并高效的但不引起严重副作用的产品。
WO2006/037979描述了包含抗原和佐剂的纳米颗粒，及免疫原性结构。
发明概述
本发明人已经发现，经由特定接头结合至纳米颗粒的肽展现出被抗原呈递细胞(APC)内化和加工的能力，从而使得所述肽结合至MHC并诱导CTL应答。特别是，经由纳米颗粒递送的肿瘤抗原相关的(TAA)肽能够刺激高亲和力的肿瘤特异性CTL应答，即使在不存在佐剂的情况下。
相应地，在第一个方面本发明提供了用于哺乳动物受试者中癌症的预防性或治疗性处理的疫苗，所述疫苗包含多个纳米颗粒和药学可接受的载体、盐或稀释剂，所述纳米颗粒中的至少一种包含：
(i)包含金属和/或半导体原子的核心；
(ii)包含共价连接至所述核心的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至所述核心的碳水化合物部分或其中所述多个中的所述第一配体包含谷胱甘肽，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至所述核心的表位肽，所述第二接头包含：
肽部分和非肽部分，其中所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：
X1为选自A和G的氨基酸；
X2为选自A和G的氨基酸；和
Z1为选自Y和F的氨基酸。
并且其中所述表位肽形成肿瘤相关抗原(TAA)的至少一部分或来自肿瘤相关抗原(TAA)。
在依照本发明的一些情况下，第二接头的非肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇，例如乙硫酯基团或硫丙基团。
在依照本发明的一些情况下，第一配体和/或所述第二配体经由含硫基团、含氨基的基团、含磷酸基团或含氧基团共价连接至核心。
所述第二接头的所述肽部分包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：(i)AAY；和(ii)FLAAY(SEQ ID NO:91)。在特定情况下，所述第二接头选自：
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAY；
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAY；
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY；
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAY；
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY；和
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY，
其中所述第二接头经由所述接头的非肽部分的硫醇基团共价连接至所述核心。
优选地，所述表位肽经由其N-末端连接至所述第二接头的所述肽部分。因此，所述第二配体可以选自：
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2；
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2；
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2；
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2；
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2；和
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2，
其中Z2代表所述表位肽。
优选地，所述表位肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子结合，或者能够经过加工从而与MHC I类分子结合。
所述表位肽由8至40个氨基酸残基的序列组成，例如8至12个氨基酸残基的序列。所述表位肽能够被MHC I类分子呈递从而刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
在依照本发明的在一些情况下，所述TAA是肺癌抗原。所述肺癌可以选自:小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌。
所述表位肽在一些情况下可以包含选自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列组成。这些表位肽在WO2011/025572中详加描述，其全部内容明确通过引用合并入本文。特别地，所述表位肽可以包含选自以下的氨基酸序列和由选自以下的氨基酸序列组成：
VLVPVLVMV(SEQ ID NO:82)；
KIYQWINEL(SEQ ID NO:29)；
KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)；
GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:19)；
KLIPFLEKL(SEQ ID NO:34)；和
RLLEVPVML(SEQ ID NO:67).
在依照本发明的在一些情况下，所述第一配体的碳水化合物部分包含单糖和/或二糖。特别地，所述碳水化合物部分可以包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
在依照本发明的在一些情况下，所述多个配体包含选自下述的一个或多个配体：葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，另外还包含所述表位肽的一个或多个配体。
在依照本发明的在一些情况下，所述多个配体包含：
(a)葡萄糖；
(b)N-乙酰氨基葡萄糖；
(c)谷胱甘肽；
(d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖；
(e)葡萄糖和谷胱甘肽；
(f)N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或
(g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽，
除了所述配体包含一种表位肽。
在依照本发明的在一些情况下，所述第一接头包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。特别地，所述第一配体包含经由硫醇硫原子共价附着至核心的2’-硫乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2’-硫乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50种含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体。
在依照本发明的在一些情况下，所述纳米颗粒包含至少1、至少2、至少3、至少4或至少5种含表位肽的配体。
在依照本发明的在一些情况下，含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体与含表位肽的配体的摩尔比的范围为5:1至100:1，例如的范围为10:1至30：1。
所述纳米颗粒的核心的直径的范围为1nm至5nm。所述纳米颗粒包括其配体的直径的范围为5nm至20nm，任选地5nm至15nm或8nm至10nm。
在依照本发明的在一些情况下，所述至少一种纳米颗粒包含至少两种含表位肽的配体，并且其中至少两种含表位肽的配体各自的表位肽不同。所述至少两种含表位肽的配体的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自来自不同的肺癌TAA。
在依照本发明的在一些情况下，所述疫苗包含具有第一含表位肽的配体的第一种类的所述纳米颗粒和具有第二含表位肽的配体的第二种类的所述纳米颗粒，其中所述第一和第二种类的表位肽不同。特别地，所述第一和第二种类的纳米颗粒各自的表位肽可以形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自来自不同的肺癌TAA。
在依照本发明的在一些情况下，所述疫苗可以包含至少3个、至少4个、至少5个或至少10个不同种类的纳米颗粒的合并库，各种类具有不同的表位肽。
在依照本发明的在一些情况下，所述疫苗可以进一步包含至少一种佐剂。所述佐剂可以共价附着至至少一种纳米颗粒的核心。所述佐剂可以包含(S)-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-半胱氨酸-(S)-丝氨酸(S)-赖氨酸4-OH(“Pam3Cys”)。
在依照本发明的在一些情况下，所述疫苗基本上不含佐剂或由纳米颗粒提供唯一的佐剂功效。
在进一步方面，本发明提供了依照本发明的第一个方面所定义的疫苗，其在药物中使用。所述疫苗可用于在哺乳动物受试者(如人受试者)中癌症例如肺癌的处理的预防性或治疗性方法中使用。
在进一步方面，本发明提供了前述权利要求中任一项所定义的疫苗在制备用于预防性或治疗性处理哺乳动物受试者中的癌症例如肺癌的药物中的用途。
本发明的疫苗可以用于经由淋巴摄取的施用
在进一步方面，本发明提供了预防性或治疗性处理癌症(例如肺癌)的方法，其包含对有此需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据本发明的第一个方面的疫苗。
在进一步方面，本发明提供了用于产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的体外或体内方法，其包含：
(i)使至少一种抗原呈递细胞(APC)与根据本发明的第一个方面所定义的疫苗接触，从而使得所述表位肽被呈递到所述APC的MHC I类分子上；和
(ii)使所述至少一个(i)中的APC与至少一个CTL细胞接触，从而使得所述CTL细胞由所述APC激活以产生对所述表位肽特异性的CTL应答。
所述APC可以在所述疫苗存在下进行培养，并且同时或相继地，与所述CTL细胞共培养。在一些情况下，所述APC在与疫苗接触后、与所述CTL细胞共培养前接受洗涤步骤。所述方法可以进一步包含对哺乳动物受试者施用CTL细胞。
在依照本发明的这一方面的方法的一些情况下，所述至少一个CTL细胞对于包含呈现在MHC I类分子上的所述表位肽的MHC-肽复合物展现出更高的亲和力，其中所述更高的亲和力与对于由APC所激活的CTL细胞所展现的MHC-肽复合物的亲和力相比更高，所述APC已经与不连接至纳米颗粒的游离肽形式的相同的表位肽接触。
本发明包括所述方面和优选特征的组合，除了其中此类组合明显不允许或陈述为特别避免之外。本发明的这些和进一步方面和实施方案在下文且就伴随实施例和附图而言进一步详细描述。
附图简述
图1显示了来自GNP的SIINFEKL(SEQ ID NO：87)呈递：将LKb细胞接种到24孔板中，并使其附着过夜。接着，GNP被脉冲到1ug/mL(绿色)、0.1ug/mL(蓝色)或0.01ug/mL(红色)当量的肽。两小时后，洗涤细胞，并用25.D1.16(Angel)的抗体标签而进行(A-D)流式细胞仪，或(E)结合B3Z CTL过夜共培养。第二天，裂解细胞并测量β-半乳糖苷酶的活性。
图2：GNP呈递对比游离肽呈递：(A-B)GNP8和9用Sephadex柱分离成15个级分，接着用UV吸收就蛋白质水平对其分析。图2A中的红线(用圆圈表示)仅代表游离肽。(C-H)以标注浓度的标注的GNP或相应的游离肽脉冲LKb细胞2小时(1ug/mL肽(绿色)、0.1ug/mL(蓝色)或0.01ug/mL(红色))。用(C-F)流式细胞仪或(G-H)B3Z测定法读数。(I-N)以标注的游离肽在冰上(I-K)或在37℃(L-N)脉冲LKb2小时。接着，用流式细胞仪就SIINFEKL(SEQ ID NO:87)的呈递分析细胞。直方图的红色部分代表对比非脉冲细胞的阳性染色。
图3：来自缺乏游离肽的制备物的GNP呈递：(A-B)GNP8和9的新制备物用Sephadex G-50柱分离成15个级分，接着用UV吸收就蛋白质水平对其分析。箭头指示哪些级分合并以供进一步使用。(C-E,F)以标注浓度(1ug/mL肽(绿色)或0.1ug/mL(红色))的标注的GNP先前制备物(旧GNP)或来自(A和B)的较新制备物(新GNP)脉冲LKb细胞2小时。用(C-E)流式细胞仪或(F)B3Z测定法读数。
图4：显示了由每百万脾细胞的IFN-γ生产细胞的数量来测量的，对用GNP并用个体肺癌抗原免疫的HLA转基因小鼠的CTL应答。
图5：显示了由每百万脾细胞的IFN-γ生产细胞的数量来测量的，对用合并的GNP并用三种不同的肺癌抗原免疫的HLA转基因小鼠的CTL应答。
图6：显示用合并的GNP并用六种不同的肺癌抗原刺激后的每105人PBMC的IFN-γ生产细胞的数量，与混合的游离肽对照组对比。
图7：(A-B)显示了IFN-γELISpot测定法结果，在所述测定法中肺癌抗原(KIY、KLG、GMY)在NP中用Glc、GlcNAc、GSH冠测试在HLA-A2转基因小鼠模型中的体内CTL的活化。NP中合并的三种肺肽(KIY、KLG、GMY)连同Glc、GlcNAc、GSH冠或游离合并肽+montanide用来免疫小鼠。3次免疫后，取自经免疫的小鼠的脾细胞与各种靶细胞(T2–空HLA-A2+细胞、N肺–HLA-A2+正常肺、HLA-A2+肺肿瘤细胞–H522、5865、5944)混合以在ELISpot测定法中测量IFN-γ分泌。
图8：(A-D)显示了脾细胞中响应于装载肽的T2细胞以及肺肿瘤细胞，关于(A)葡萄糖NP、(B)GlcNAc NP、(C)GSH NP和(D)游离肽+佐剂的抗原特异性CTL脱粒标记物CD107a分析。
发明详述
在描述本发明中，将采用下述术语并且意在如下所示定义。
如本文使用的，“纳米颗粒”指具有纳米级别的颗粒，并且不意于表达任何特别形状限制。特别地，“纳米颗粒”包含纳米球、纳米管、纳米盒、纳米簇、纳米棒等。在特定实施方案中，本文考虑的纳米颗粒和/或纳米颗粒核心一般具有多面体或球体几何学。
包含多个含碳水化合物的配体的纳米颗粒已在例如WO2002/032404、WO2004/108165、WO2005/116226、WO2006/037979、WO2007/015105、WO2007/122388、WO2005/091704(其各自的完整内容特别通过引用合并入本文)中描述，并且此类纳米颗粒可以依照本发明使用。此外，包含由有机化合物官能化(例如经由硫醇-金键)的氧化铁铁氧体(具有式XFe2O4，其中X＝Fe、Mn或Co)的磁核心的金涂布纳米颗粒在EP2305310(其完整内容特别通过引用合并入本文)中描述，并且特别考虑作为纳米颗粒/纳米颗粒核心依照本发明使用。
如本文使用的，“冠”指层或涂层，其可以部分或完全覆盖纳米颗粒核心的暴露表面。冠包括多个配体，其包括至少一个碳水化合物部分、一个表面活性剂部分和/或一个谷胱甘肽部分。因此，冠可以视为围绕或部分围绕金属性核心的有机层。在特定实施方案中，冠提供和/或参与纳米颗粒的核心的钝化。因此，在特定情况下，冠可以包括基本上稳定化含金属核心的足够完全的涂布层。然而，本文特别考虑具有核心的特定纳米颗粒，例如那些包括由贵金属涂布的含金属氧化物的内核心的，其可以包括仅部分涂布核心表面的冠。在特定情况下，冠促进本发明的纳米颗粒的溶解性，如水溶性。
纳米颗粒
纳米颗粒是例如金属或半导体原子的簇的小颗粒，其可以用作固定化配体的底物。
优选地，所述纳米颗粒具有的核心具有0.5-50nm之间的平均直径，更优选0.5-10nm之间，更优选0.5-5nm之间，还更优选0.5-3nm之间且仍然更优选0.5-2.5nm之间。除核心之外还考虑配体时，优选地所述颗粒的总平均直径在5.0-100nm之间，更优选5-50nm之间且最优选5-10nm之间。平均直径可以使用本领域中熟知的技术例如透射电子显微镜测量。
核心材料可以是金属或半导体且可以由多于一种类型的原子形成。优选地，所述核心材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核心也可由包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd的合金形成，并且可以在本发明中使用。优选的核心材料是Au和Fe，而最优选的金属为Au。纳米颗粒的核心优选地包含约100–500个的原子(例如金原子)以提供在纳米范围内的核心直径。其他特别有用的核心材料掺入一种或多种NMR活性的原子，其允许使用NMR在体外和体内检测所述纳米颗粒。NMR活性原子的例子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3，或本申请别处所描述的量子点。
包含半导体原子的纳米颗粒核心可被检测为能够充当量子点的纳米级别的半导体晶体，即它们可以吸收光从而激发材料中的电子至更高的能量水平，随后在材料的频率特性释放光的光子。半导体核心材料的一个例子是硒化镉、硫化镉和碲化镉。另外还包括锌化合物，如硫化锌。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒的核心可以是磁性的和包含磁性金属原子，任选地与钝态金属原子组合。举例为证，所述钝态金属可以是金、铂、银或铜，所述磁性金属可以是铁或钆。在优选的实施方案中，钝态金属是金而磁性金属是铁。在这种情况下，方便起见核心中钝态金属原子与磁性金属原子的比例在约5:0.1-约2:5之间。更优选地，该比例在约5:0.1-约5:1之间。如本文使用的，术语“钝态金属”指不显示磁性质并且对氧化化学稳定的金属。钝态金属可以是反磁性或超顺磁性。优选地，此类纳米颗粒是超顺磁性的。
具有包含顺磁性金属的核心的纳米颗粒的例子包括包含Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和镧系元素+3的那些。
其他磁性纳米颗粒可由例如MnFe(尖晶石铁素体)的金属形成或者CoFe(钴铁素体)可以形成纳米颗粒(磁性流体，其加入或不加入以上定义的核心材料)。用于制造此类纳米颗粒的自组装附着化学的例子在Biotechnol.Prog.,19:1095-100(2003)、J.Am.Chem.Soc.125:9828-33(2003)和J.Colloid Interface Sci.255:293-8(2002)中给出。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒或其配体包含可检测标签。该标签可以是纳米颗粒或配体的核心的元素。该标签可被检测，是因为纳米颗粒的那个元素的固有属性或可通过与其他可被检测的部分连接、缀合或关联。标签的优选例子包括的标签为：荧光基团、放射性核心素、磁性标签或染料。荧光基团包括荧光素、若丹明或四甲基若丹明、德克萨斯-红、Cy3、Cy5等，并且可以使用拉曼散射光谱法通过荧光标签的激发和发射光的检测来检测(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science2002,297:1536-1539)。
在一些实施方案中，纳米颗粒可以包含在检测纳米颗粒中使用的放射性核心素，其使用由该放射性核心素发射的放射性活度，例如通过使用PET、SPECT、或用于疗法，例如用于杀死靶细胞。可容易地适应在本发明中使用的本领域中常用的放射性核心素例子包括99mTc，其存在多种氧化态，尽管最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；通常用作Cu2+盐的67Cu；常用作Ga3+盐的67Ga，例如柠檬酸镓；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；一般用作In3+盐的111In；一般用作碘化钠的125I或131I；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；一般用作Tl+盐例如氯化铊的201Tl；39Y3+；71Lu3+；和24Cr2+。放射性核心素作为标签和示踪物的一般用途是本领域熟知的且技术人员可容易地使其适应在本发明的各方面中使用。所述放射性核心素可以这样最容易地采用，即通过掺入所述纳米颗粒核心或将它们包括在作为固定化在纳米颗粒上的配体的部分而存在的标签。
另外地或备选地，本发明的纳米颗粒，或它们与其他种类相互作用的结果可使用许多本领域公知的技术来检测，所述技术使用上述与纳米颗粒相关联的标签或通过采用它们的属性。检测纳米颗粒的这些方法的范围可以从检测纳米颗粒结合到其他种类时导致的聚集，例如通过简单的目视检查或通过使用光散射(含纳米颗粒溶液的透射率)，到使用复杂的技术如透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)以可视化所述纳米颗粒。检测金属颗粒的进一步方法是采用等离子共振，该等离子共振是在金属表面上电子的激发，其通常由光辐射引起。表面等离子共振(SPR)的现象存在于金属(例如Ag或Au)与介电材料例如空气或水的界面。与固定化在纳米颗粒表面上的配体结合的分析物改变所述界面的折射率时，发生SPR中的变化。SPR的进一步优点是它可以用于监测实时相互作用。如上所述，如果纳米颗粒包括或掺入有NMR活性的原子，那么此项技术可以在体外或体内检测颗粒时使用，其中使用本领域熟知的技术。对纳米颗粒的检测也可以使用基于定量信号放大的系统，该系统使用纳米颗粒促进的对银的还原(I)。如果所述纳米颗粒包括作为荧光探针的配体，则可使用荧光光谱法。同样，对碳水化合物的同位素标签可以用来方便它们的检测。
施用和处理
本发明的含纳米颗粒的疫苗组合物可以通过任意数量的不同途径施用于患者，其包括肠内或肠胃外途径。肠胃外施用包括通过下述途径的施用：静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌肉内、眼内、经上皮、腹膜内和局部(包括皮肤、眼、直肠、鼻、吸入和气雾剂)，以及直肠全身性途径。
施用的执行通过例如注射或冲击地使用递送枪以加速它们的透皮通道穿过表皮的外层。所述纳米颗粒接着可以被例如树突状细胞摄取，所述纳米颗粒当它们通过淋巴系统迁移时成熟，导致对免疫应答的调节和针对表位肽和/或表位肽来自其中或形成其一部分的抗原的免疫接种。纳米颗粒也可以以气雾剂递送。纳米颗粒的小粒度使其成为可能。
本发明的纳米颗粒的超小尺寸对于递送至细胞和组织中是很大的优势，因为它们即使当连接至靶向或治疗性分子时仍可以被细胞摄取。因此，纳米颗粒可被APC内化，表位肽被加工和经由MHC I类被呈递。
本发明的纳米颗粒可被配制成可能是固体或液体组合物形式的药物组合物。此种组合物将通常包含某种形式的载体，例如固体载体如明胶或佐剂或惰性稀释剂，或者液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、或二醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此种组合物和制备物通常含有至少0.1wt％的化合物。
对于静脉内，皮肤或皮下注射，或者注射在痛苦部位，活性成分将以不经肠道的可接受的水溶液的形式，其是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员完全能够使用例如所述化合物或其衍生物的溶液以制备合适的溶液，例如在生理盐水中，以甘油、液体聚乙二醇或油制备的分散物。
除了一种或多种化合物，任选地与其他活性成分组合，所述组合物可以包含一种或多种药学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂，等渗剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此种材料应该是无毒的，并且不应与活性成分的功效干涉。所述载体或其他材料的确切性质可取决于施用的途径，例如口服或不经肠道。
液体药学组合物通常配制成具有在约3.0-9.0之间的pH，更优选在约4.5-8.5之间并且仍然更优选在约5.0-8.0之间。组合物的pH可以通过使用缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸来维持，通常采用的范围从约1mM-50mM。组合物的pH可以另外通过使用生理学可接受的酸或碱来调节。
防腐剂通常包括在药物组合物中以延缓微生物生长，延长组合物的保质期并且允许多次使用的包装。防腐剂的例子包括苯酚、间甲酚、苄醇、对羟基苯甲酸及其酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲烃铵氯化物和苄索氯铵。防腐剂通常采用的范围为约0.1-1.0％(w/v)。
优选地，所述药学组合物以预防有效量或治疗有效量(视情况而定，虽然预防可被视为治疗)给个体，这足以显示出对个体有利。通常，这将引起对个体有利的治疗上有用的活性。所施用的化合物的实际量，以及施用的速率和时间过程将取决于所处理的病症的性质和严重程度。处理的处方例如剂量决定等在全科医生和其它医生的责任范围内，并且通常考虑所处理的病症、个体患者的情况、递送位点、施用方法和医生已知的其他因素。上述技术和方案的例子可以在Handbook of Pharmaceutical Additives,2nd Edition(eds.M.Ash andI.Ash)，2001(Synapse Information Resources,Inc.,Endicott,NewYork,USA)；Remington’s Pharmaceutical Sciences,20th Edition,2000,pub.Lippincott,Williams&Wilkins；以及Handbook ofPharmaceutical Excipients,2nd edition,1994中找到。举例为证，组合物优选地施用于患者的剂量是每kg体重的活性化合物在约0.01-100mg之间，并且更优选地在体重的0.5-10mg/kg之间。
可以理解，就处理肿瘤而言，处理包括医师采取任何缓解肿瘤对患者的影响的措施。因此，尽管肿瘤的完全缓解是一个期望的目标，有效的处理将也包括能够实现肿瘤的部分缓解，以及减缓肿瘤包括癌转移的生长速率的任何措施。此种措施可有效延长和/或提高生活质量以及缓解疾病的症状。
免疫疗法
本发明的组合物，例如权利要求中定义的疫苗，可以用于疾病如癌症的预防和处理，且更特殊地用于免疫疗法。
在本发明中，术语“免疫接种”表示主动免疫，即因施用而产生的特异性免疫应答的诱导，该施用为例如经由皮下、皮内、肌肉内、口或经鼻途径的少量的抗原，该抗原被所接种个体识别为外源的，因此在合适的配方中是免疫原性的。因此抗原被用作免疫系统的“触发”，以建立针对该抗原的特异性免疫应答。
依照本发明，免疫接种可以是治疗性或预防性的。举例为证，也许能够通过对不患癌症的个体进行免疫接种而达到针对癌症疾病的出现的预防性保护。可能应用此种预防性接种疫苗的个体的例子是具有罹患癌症的风险增加的个体，尽管这种应用不限于此种个体。处于癌症风险的患者可以已经产生肿瘤，无论是作为原发肿瘤还是转移灶，或者显示出癌症的倾向。
对于依照本发明的癌症患者的主动免疫，纳米颗粒通常配制成疫苗。优选地，此种药学制备物含有药学可接受的载体，举例，其可进一步包含辅助物质、缓冲液、盐和/或防腐剂。所述药学制备物可以，例如用于癌症相关病况的预防和疗法，如癌症患者中的转移形成。这样，抗原呈递细胞在体内或也在离体被特别调制从而产生针对的TAA的免疫应答。
对于以特定抗原或抗原组合的主动免疫，通常使用含有免疫原的疫苗制剂-免疫原无论是天然的TAA或其表位，模拟物或新表位模拟物，-多半是在低浓度时，例如免疫原性量的范围从0.01μg-10mg，但是剂量范围可提高到范围为100-500mg。取决于例如由外来种类的序列或通过衍生化决定的免疫接种抗原的免疫原性，或也取决于分别使用的辅助物质或佐剂，所述合适的免疫原性剂量可选择在例如的范围为0.01μg-1mg，优选100μg-500μg。但是，将在一个长时期内被递送至生物体的储库疫苗也含有高得多的疫苗抗原量，例如至少1mg-100mg以上。
浓度将取决于施用的液体或悬浮疫苗的量。疫苗通常提供在即时可用的注射器或安瓿内，具有的体积范围从0.01-1ml，优选0.1-0.75ml。
疫苗的组分的免疫接种抗原优选是以药学可接受的载体存在，其适合于皮下、肌内以及还有皮内或透皮施用。施用的进一步模式经由粘膜通道例如经鼻或经口施用的免疫接种发挥作用。如果采用固体物质作为用于疫苗制剂的辅助剂，例如疫苗抗原的被吸附物或悬浮混合物将分别与辅助剂一起施用。在特定的实施方案中，疫苗作为水性溶剂中的溶液或液体疫苗存在。
优选地，肿瘤疫苗的免疫接种单元已在合适的即可使用的注射器或安瓿中提供。所述疫苗的稳定制剂可以有利地以即可使用的形式投放市场。尽管并不一定需要防腐剂如硫柳汞或具有改善的耐受性的其他防腐剂的组分，但为了从冷冻温度升至室温的储存温度下的较长的稳定性，它可提供于制剂中。但是依照本发明的疫苗也可以以冷冻或冻干形式提供，并且也可按要求分别被解冻或重构。
在依照本发明的特定情况下，本发明的疫苗的免疫原性可通过采用佐剂而增加。出于这个目的，使用固体物质或液体疫苗佐剂，例如氢氧化铝(Alu-Gel)或磷酸铝、生长因子、淋巴因子、细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、γ干扰素或补体因子如C3d，其他脂质体制备物，又或者针对其免疫系统已经产生强烈的免疫应答的带有额外抗原的制剂，如破伤风类毒素、细菌毒素如假单胞菌外毒素和脂质A及脂多糖的衍生物。
在特定情况下，不需要采用额外佐剂，特别地，本文所描述的例子显示了CTL应答的有效产生通过使用无任何额外佐剂的本发明的纳米颗粒来实现(参见通常与一种或多种佐剂施用的游离肽)。这在特定环境下是非常有利的，因为一些佐剂被认为是有毒的，或者不适合人类使用。
表位肽
在依照本发明的特定优选的情况下，所述表位肽可以包含以下表1中列出的氨基酸序列或由以下表1中列出的氨基酸序列组成。
在特定情况下，所述表位肽可以包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：
VLVPVLVMV(SEQ ID NO:82)；
KIYQWINEL(SEQ ID NO:29)；
KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)；
GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:19)；
KLIPFLEKL(SEQ ID NO:34)；和
RLLEVPVML(SEQ ID NO:67)。
下文作为例子呈现且不应解释为对于权利要求的范围的限制。
实施例
实施例1-纳米颗粒的合成与表征
测试配体和它们的识别号给出如下(分子wt)；
SIINFEKL(963)(SEQ ID NO:87)
SIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1021)
FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH  (1280)(SEQ ID NO:88)
FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH  (1587)(SEQ ID NO:89)
AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH   (1325)(SEQ ID NO:90)
HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL  (1051)
HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL   (1309)
HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL   (1616)
HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL   (1356)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL   (1471)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL   (1732)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL   (2034)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL   (1774)
使用10μmole氯化金(Aldrich484385)、30μmole具有硫代乙接头的葡萄糖(GlcC2)和1.5μmole肽配体(变量1.5-3mg)合成测试NP。
使用下述方法：将1.5μmole肽溶于2ml甲醇中，接着加入在200μl甲醇中的30μmole GlcC2和116μl含10μmoleAu的水氯化金。将该样品涡旋30秒，振荡约5分钟，然后在快速涡旋共30秒时加入200μl的1MNaBH4，密封试管，然后轻柔振荡1.5小时。
将样品在工作台上旋转除去上清液并将黑色团块溶于2ml水中，然后将其转移至10kDa vivaspin，并用2ml水洗涤总共4次，每次在5Krpm8分钟。将纳米颗粒(NP)从vivaspins移出，用水制成500μl，它们接着接受15Krpm工作台旋转以除去任何大的聚集物。
内部分析显示旋转/生产后的金含量低于100％，产量将是1.97mg；
NP 总mgAu
2 1.14
3 0.03
4 0.00
5 0.05
6 1.34
7 1.06
9 1.59
10 1.69
11 1.37
13 1.49
Glc 1.02
NP3、4和5显示了大的近乎完全聚集作用，向这些聚集物加入DMSO未能溶解这些颗粒。
重新旋转剩余NP样品以除去任何进一步聚集物，并取等分试样允许后续分析，特别是金和肽含量。一个等分试样用水制成500μl，注明日期并贴上标签，这些随后用于HLA呈递测试。
如下是就HLA呈递对这些500μl样品的最终分析；
NP 总μmole Au nmole肽* nmole肽**
2 1.46 166 106
3 - - -
4 - - -
5 - - -
6 3.09 348 263
7 3.36 287 219
9 4.77 508 286
10 442 256 372
NP 总μmole Au nmole肽* nmole肽**
11 3.26 235 830
13 4.19 386 1083
Glc 3.11 nd nd
*BSA Std
**肽Std
使用这样的配体比例，从而使得2个肽应该理论上附着至约100个Au原子的每个NP，上文数据暗示约6-8个肽/100个Au原子。这可能仅仅是用于NP结合的肽或者或许附着的肽配体的肽测量的BCA方法(和BSA标准)的人工结果。
对肽含量的分析既至关重要，在这种情况下也错综复杂，使用所述BCA方法。不幸的是金NP呈现大的uv/vis吸光度，因此除了运行测试样品，NP的等分试样也在水中和空白对照水中进行测量以测定其在BCA测定法中使用的565nm波长的吸光度，该吸光度占到所述测试样品BCA测定法的值的约20％且对其单独进行校正。但是这种校正假设接受BCA分析的肽NP将始终保持与BCA特定组分之上的游离NP所见的相同吸光度；这与从仅从纯金NP所见的高消光系数一致。
上文表中*指涉及最初基于重量的BSA标准再转换为肽的摩尔的定量关系，在**列中单个的肽配体作为标准使用。
使用Sephadex G-50以PBS洗脱而尝试溶解游离形式NP结合肽的初步分析主要以NP6执行，其暗示少/无游离配体正污染所述NP制备物。使用碘释放所有NP结合配体，所述碘开始出现在图1中的级分16+中。
然后使用碘处理之前和之后的较大级分大小和当量的NP，以级分10中的峰洗脱所述碘释放肽，这种材料看起来比标准肽更小，很可能因为后者是氧化的/二聚化的。个体校正也适用于来自NP6的非肽吸光度，就经校正的NP6和NP6+碘获取曲线下的近当量面积。
NP8和12的生产
NP8和12通过上述方法成功制造，下文给出的定量代表随后使用的500μl样品，其又是(60％的总制备物)；
NP μmoleAu nmole肽*
8 5.28 175
12 3.21 65
*通过考马斯亮蓝法测定
NP2-5的重复生产
NP2-5通过在合成阶段使用75％的甲醇而非95％的变化而制造。NP2产生如前的‘正常’NP，NP3、4和5作为之前形成的聚集物，这些聚集物不溶于水，10％醋酸、PBS、DMSO或DMF，然而300mMNaOH确实导致总NP溶液化。
额外的合成使用Sephadex G-50进行以除去任何游离肽。这些NP按照如上制造，但进行以下更改：
游离肽不完全溶解于MeOH，所以除了2ml MeOH，另外加入100μl水，对于P8需要70μl的1MNaOH，而对于P9只需要20μlNaOH以实现充分的肽溶液化。NaOH与NP合成相容，水和碱将NP8和NP9的硼氢化钠还原后的最终MeOH％分别降低至82和83.5％。
在还原后初始旋转后，但是在vivaspin前包括额外的洗涤步骤，其以2ml MeOH和100μl的1M NaCl来执行。
进行vivaspin后，各制备物的一半进行Sephadex G-50柱的用PBS洗脱，收集级分并通过BCA就蛋白质对等分试样进行测量，主要蛋白质峰的邻近库被合并，并接着再接受vivaspin以水洗涤以实现溶剂改变。
只有一半的NP制备物通过G-50，发现该生成物概况和合并库没有游离肽。该NP棕色着色可以直观地看到多至级分12，在相同条件下重新运行储用制备物中的50ul单独运行，并测量515nm吸光度(其将检测Au NP而非游离肽)且给出了是否NP在G-50柱减弱的指示。
最终混合的材料具有以下规格；
NP8 NP9
体积ml 0.5 0.5
进行BCA的肽(BSA std)μg/ml 638 490
理论上的肽　μg/ml 225 118
Au mg/ml 1.30 0.81
通过假设44个配体/100个Au、NP形成时两个配体间的随机竞争和Au产量测定所述理论值。
与碘化物的NP配体释放
将NP9的等分试样与4倍体积过量的1M KI混合，并在4℃放置4天以导致完全的配体释放。4天之后，所述材料进行离心，并且使干净的上清液通过G-50且收集级分并进行BCA测定法。经KI测定后的NP9的量正是那些单独用于NP9的两倍(1.1的校正应用于测定法间吸光度的差异)，发现该面积几乎正是2:1，其暗示完全的配体去除。释放的配体的量使用2个测定法进行定量；考马斯亮蓝和BCA协同2个标准肽9和BSA，并且列表如下。
使用的蛋白质std 考马斯亮蓝μg BCAμg
BSA 377 611
P9 2210 1062
表中数据已校正至整个制备物的总预期产量。
最后，已经合成含肽NP。通过简单使用Sephadex G-50凝胶过滤层析使得所述肽NP基本上不含污染的游离肽。成功使用碘化物以释放NP结合肽，并给出定量的产量数据。
实施例2–呈递测定法的评估
T细胞受体(TCR)在T淋巴细胞的表面上，并在主要组织相容性复合体(MHC)的环境下识别肽(1)。一般而言，抗原呈递细胞(APC)含有加工蛋白质并将它们装载到空的MHC上的机制。而CD4+T细胞识别MHC II类(MHCII)，CD8+T细胞对MHC I类(MHCI)作出应答。以往，MHCII肽来自细胞外环境的细胞内吞组分。与此相反，MHCI装载来自细胞内源的经加工肽(1,2)。
SIINFEKL(SEQ ID NO：87)，是来自卵白蛋白(OVA)的肽表位，在称为H-2Kb的鼠MHCI等位基因的环境下被呈递(3)。如果OVA在表达H-2Kb的鼠细胞中被表达，SIINFEKL(SEQ ID NO：87)被常规呈递。然而，如果OVA由外源提供，SIINFEKL可以由称为MHCI交叉呈递的备选方法呈递(4，5)。事实上，以OVA免疫的单倍型匹配小鼠产生对SIINFEKL(SEQ ID NO:87)的免疫显性应答。
因此，许多试剂已被开发出来以测定此种肽的呈递以致力于推进对常规和备选MHCI呈递的理解。这些试剂可用于纳米颗粒中肽的潜在化学键的实验。因此，我们可以发现哪个键在小鼠细胞系中最容易加工。
结果与讨论
流式细胞仪作为呈递的测量
为了分析连接至纳米颗粒的表位，我们首先优化了用于从纳米颗粒中释放的肽的呈递的读出测定。出于这一目的，对LKb细胞中SIINFEKL(SEQ ID NO:87)呈递进行评估。如前所述，存在一种以上的试剂。进行测试的两种方法中，一种是基于流式细胞仪，而另一种是基于细胞。基于流式细胞仪的方法始于用不同量的SIINFEKL(SEQ ID NO:87)肽脉冲LKb细胞。允许肽有结合至表面Kb分子的足够时间后，用对SIINFEKL:Kb复合物特异性的25.D1.16抗体洗涤和孵育细胞。然后所述细胞进行二次标记，并接受使用非脉冲的细胞作为背景读数的流式细胞仪分析。发现当用少至5ng/mL脉冲所述细胞时，所述方法检测到表面复合物。
T细胞活化作为抗原呈递的测量
表位-特异性的抗原呈递的另一种形式是对由MHCI肽复合物的T细胞活化的测量。在此，我们使用B3Z(OVA肽特异性T细胞系)，其在Kb的环境下识别SIINFEKL(SEQ ID NO:87)。作为一种方便的测量，此T细胞系含有以NFAT启动子克隆的β-半乳糖苷酶。肽识别和T细胞活化后，β-半乳糖苷酶被表达并且可检测底物的转化作为抗原呈递至T细胞的极好测量。
为评估所述方法，我们执行了与上述相似的实验。LKb细胞用SIINFEKL肽进行脉冲、洗涤并接着用B3Z T细胞系共同孵育过夜。第二天，裂解细胞，并使用发光底物测量β-半乳糖苷酶。如所预期，此方法的分辨率与检测极限为约5ng/mL的前述方法相似。
因此，这两种方法都显示出大致相同的分辨率并被选定用于评估纳米颗粒-肽构造。
材料和方法
细胞系
LKb细胞是小鼠成纤维细胞，并曾是使用的主线。具体而言，它们是稳定表达鼠H-2Kb分子的L929细胞。
合成肽
合成的SIINFEKL(OVA257-264)(SEQ ID NO：87)的肽购自Genscript USA(Piscataway,NJ)。肽在DMSO中重悬至5mg/mL并以图中表示的浓度脉冲至细胞上。
T细胞杂交瘤
SIINFEKL:Kb-特异性T杂交瘤(B3Z)当识别肽-MHC I类复合体时表达β-半乳糖苷酶，其已在上文中描述(3,6)。T细胞杂交瘤维持在添加10％FCS和0.05mM2-ME的完全RPMI中。活化使用发光底物Galactolight Plus(Applied Biosystems,Foster City,CA)依照制造商的说明测量。光强度使用TopCount NXT平板阅读器(PerkinElmer,Waltham,MA)测量。
流式细胞仪
LKb细胞用数量不等的SIINFEKL(SEQ ID NO:87)肽进行处理。2小时的孵育后，收集细胞，用PBS洗涤一次，并接着用25.D1.16培养上清液在冰上孵育1小时(对SIINFEKL特异性的单克隆抗体与H-2Kb形成复合)(7)。然后将细胞在PBS中洗涤两次并在冰上用FITC标记的山羊抗-小鼠IgG二抗(Caltag Laboratories,Burlingham,CA)孵育30分钟。最后，将细胞用PBS洗涤两次并在PBS+.1％BSA中重悬以用于Guava EasyCyte Plus上的流式细胞仪(Millipore,Billerica,MA)并使用附带软件进行分析。
抗原呈递测定法
为了使用流式细胞仪或基于细胞的方法测定SIINFEKL(SEQ IDNO：87)呈递，我们在15mL锥形瓶中在37℃脉冲LKb细胞2小时。此次孵育后，将细胞用PBS洗涤一次并随后接受使用流式细胞仪的检测，或者将其以效应物与靶标比为1:1加入至B3Z细胞。
参考文献
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实施例3-纳米颗粒-肽的呈递测定法
构建下文列出的测试配体并通过上文描述的接头化学附着至金纳米颗粒(GNP)。
1.SIINFEKL  (SEQ ID NO:87)
2.SIINFEKL-N-(CH2)2-SH
3.FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH  (SEQ ID NO:88)
4.FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH  (SEQ ID NO:89)
5.AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH  (SEQ ID NO:90)
6.HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL
7.HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL
8.HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL
9.HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL
10.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL
11.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL
12.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL
13.HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL
SIINFEKL(SEQ ID NO：87)是来自卵清蛋白的表位，其在鼠MHCI分子H-2Kb的环境下被呈递并使用两种方法测量。一种方法利用称为25.D1.16的TCR-样抗体，也称作“天使”，其识别SIINFEKL/MHCI复合物。另外，我们使用B3Z测评呈递，所述B3Z为SIINFEKL(SEQ ID NO：87)肽特异性的CTL杂交瘤，其在NFAT(CTL传信分子)启动子下表达β-半乳糖苷酶，其活化后表达通过发光底物测量的β-半乳糖苷酶。
A.GNP的分析
为测评细胞加工和呈递与GNP相连的SIINFEKL(SEQ ID NO：87)的能力，我们使用L-Kb鼠成纤维细胞。如图1所证实，GNP8、9、12和13显示了良好的加工和呈递。在流式细胞仪(图1A-D-加工)和基于CTL的方法(图1E–呈递)中都有此情况。因此，FLAAYSSIINFEKL(SEQ ID NO:89)和AAYSIINFEKL(SEQ ID NO:90)展现出优异的体外SIINFEKL(SEQ ID NO：87)加工(下划线部分显示接头的肽部分)。同样如图1E阐明，发现HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH化学上比HS(CH2)2-CONH更好地加工。然而，仍发现对HS(CH2)2-CONH的加工非常有效。此外，我们注意到呈递的剂量依赖性降低，其在0.01μg/mL没有检测到。
B.游离肽的分析
考虑存在于纳米颗粒样品中任何游离肽可能的影响(图2A-B)是重要的。因此，我们评估来自各个制备物的相应游离肽如何有效地呈递。与以往的实验相似，LKb细胞以3种浓度的GNP或游离肽脉冲2小时。呈递通过流式细胞仪(图2C-F)或B3Z测定法测评(图2G-H)。从这些结果我们推断游离肽被良好呈递。最后，我们试图测试加工对于这些游离肽的呈递是否必要。一个测试需要肽在冰上的脉冲与在37℃的脉冲比较。在37℃下，细胞可以摄取肽并在内涵体中对其进行加工，但是在冰上，肽只能不经加工装载至表面上。确实，我们观察到有接头的游离肽一般需要加工而没有接头的肽可不经过任何加工被呈递(图2I-N)。
C.缺乏游离肽的制备物的分析
考虑到证实了污染的游离肽的可能影响的结果，制造纯化的制备物。纯化使用Sephadex G-50柱在GNP(8和9)上进行以除去所有游离肽(图3A-B)。最后，使用以往和较新的制备物以同样的测定法重复上述实验。我们将两小时的孵育延长至过夜期，其已显示对于SIINFEKL呈递是足够的(数据未显示)。经流式细胞仪分析后，我们观察到缺乏游离肽的样品与含肽的那些同样起作用(图3C-E)。这些结果接着由B3Z测定法加以确定(图3F)。因此，很显然GNP8和9充当将肽递送至抗原呈递细胞用于MHCI呈递的可行选择。
D.结论
·对GNP8、9、12和13加工且较之其他呈递很好。
·这对应于序列FLAAYSIINFEKL(SEQ ID NO:89)和AAYSIINFEKL(SEQ ID NO:90)，所述序列是用于体外SIINFEKL(SEQ ID NO:87)呈递最好的(下划线部分显示接头的肽部分)。
·HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH化学上比HS(CH2)2-CONH更好加工。然而，HS(CH2)2-CONH也能很好加工且性价比更高。
·污染的游离肽可以引发呈递。
·缺乏游离肽的较新制备物也可加工并良好呈递。
·这暗示了GNP8和9能有效加工用于SIINFEKL(SEQ ID NO:87)的呈递。
实施例4-经由纳米颗粒递送的肺癌抗原在体内产生肿瘤特异性免疫应答
纳米颗粒-肽构造的合成
测试配体和它们的识别号给出如下(分子wt，亲水性得分)；
1.L1HS(CH2)2-CONH-AAYVLVPVLVMV(1463,-1.3)(SEQ ID NO:92)
2.L2HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL(1601,-0.7)(SEQ ID NO:93)
3.L3HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL  (1641,-0.1)(SEQ ID NO:94)
4.L4HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL  (1605,-0.6)(SEQ ID NO:95)
5.L5HS(CH2)2-CONH-AAYKLIPFLEKL  (1495,-0.3)(SEQ ID NO:96)
6.L6HS(CH2)2-CONH-AAYRLLEVPVML  (1463,-0.6)(SEQ ID NO:97)
7.P9HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL  (1462,-0.4)(SEQ ID NO:98)
使用10μmole氯化金(Aldrich484385)、30μmole具有硫代乙烷基接头的葡萄糖(GlcC2)和1.5μmole肽配体(变量2.0-2.5mg)合成测试NP。
使用下述方法：将1.5μmole肽溶于2ml甲醇中，接着加入在200μl甲醇中的30μmole GlcC2和116μl含10μmoleAu的水氯化金。将该样品涡旋30秒，振荡约5分钟，然后在快速涡旋共30秒时加入200μl的1MNaBH4，密封试管，然后轻柔振荡1.5小时。将样品在工作台上旋转除去上清液并将黑色团块溶于1ml95％MeOH/水中，涡旋并接着再次离心，然后再次除去所述上清液并将NP溶于水中然后将其转移至经预洗涤的10kDa vivaspin，并用2ml水洗涤4次，每次在5Krpm8分钟。将纳米颗粒(NP)从vivaspins移出，用水制成600μl，它们接着接受15Krpm工作台旋转以除去任何大的聚集物。
显示旋转/生产后的金含量低于100％，产量将是2.17mg(由测定法测定)
NP 总mg Au
1 1.15
2 1.31
3 1.67
4 1.29
5 1.01
6 1.32
NP9 1.72
一些配体在甲醇中的溶解度差，特别是对于1和4，但加入酸性氯化金后通常得到较清澈的溶液，尽管L1仍然有一些未溶解的肽物质。所有NP具有可以被旋转沉降的一定程度的聚集物，这些被除去并占到整体较低Au产量的46.5-79.3％。这一系列的NP生产后具有额外的洗涤步骤以减少污染的游离肽。
用BCA测定法定量附着至NP的肽物质，如下数据显示所有样品/标准显示为三次测定的平均值；
BCA数据空白校正标准
BSA2μg   0.165
BSA4μg   0.311
BSA8μg   0.566
L21.92μg   0.209
L32.14μg   0.159
L42.40μg   0.300
L52.14μg   0.151
*当NP在565nm处具有一定吸光度时应用此校正。
**样品L1、L6和NP9使用2μg BSA std进行定量，因为这些肽在低浓度不溶解于用于此测定法的PBS，剩余的4个NP使用他们各自的游离肽标准。测定法在1μl当量、600μl总预备大小执行。
表显示了随后测试中使用的材料，值均显示为mg/ml。
NP 金水平mg/ml 理论预期的肽mg/ml 实际测量的肽mg/ml
L1 1.92 0.58 0.50
L2 2.18 0.63 1.33
L3 2.78 0.67 1.25
L4 2.15 0.63 1.12
NP 金水平mg/ml 理论预期的肽mg/ml 实际测量的肽mg/ml
L5 1.68 0.58 0.65
L6 2.20 0.58 0.63
NP9 2.87 0.53 1.63
放大批次的合成
测试配体和它们的识别号给出如下(分子wt，亲水性得分)；
1.L2HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL  (1601,-0.7)(SEQ ID NO:93)
2.L3HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL  (1641,-0.1)(SEQ ID NO:94)
3.L4HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL  (1605,-0.6)(SEQ ID NO:95)
4.Glc
依照如上所述合成测试NP，但以3倍的更大规模，所述合成使用30μmole氯化金(Aldrich484385)、90μmole具有硫代乙烷基接头(GlcC2)的葡萄糖和4.5μmole的肽配体(变量7.2-7.5mg)。
使用下述方法：将4.5μmole肽溶于6ml甲醇中，接着加入在600μl甲醇中的90μmole GlcC2和348μl含30μmoleAu的水氯化金，将50ml塑料瓶用作反应物容器。将该样品涡旋30秒，振荡约5分钟，然后近可能快速涡旋共30秒时加入600μl的1MNaBH4，密封试管，然后轻柔振荡1.5小时。将样品在工作台上旋转除去上清液并将黑色团块重悬溶于1ml95％MeOH/水中，涡旋并将其再离心。再次除去上清液并将NP溶于水中，然后将其转移至经预洗涤的10kDa vivaspin，并用2ml水洗涤共4次，每次在5Krpm8分钟。将NP从vivaspins移出，用水制成1ml，它们接着接受15Krpm工作台旋转并接着转移至新试管以除去任何大的聚集物。
内部分析显示旋转/生产后的金含量低于100％，产量将是5.91mg(由测定法测定)；
NPL 总mg Au
2 4.60
3 4.65
4 4.60
Glc 4.29
所有NP具有可以被旋转沉降的一定程度的聚集物，这些被除去并占到整体Au产量的约75％。
这一系列的NP生产后具有额外的洗涤步骤以减少污染的游离肽。
用BCA测定法定量附着至NP的肽物质，如下数据显示所有样品/标准显示为三次测定的平均值；
BCA数据空白校正的标准
BSA2μg  0.138
BSA4μg  0.260
*当NP在565nm处具有一定吸光度时应用此校正。
**样品使用2g BSA std进行定量，测定法在0.5μl、约1ml总制备体积执行。
免疫方法论
用附着着肺癌抗原表位肽的(依照如上所述合成)金纳米颗粒(GNP)免疫人HLA转基因小鼠。针对装载肽的靶标(T2)和肺肿瘤细胞(LungT1＝SCLC；Lung T2＝NSCLC；Lung T3＝腺癌)测定CTL。对照为抗原非脉冲的T2和N肺＝正常肺细胞。
所述免疫程序由3次免疫组成(i.d.部分和s.c.部分)，间隔10天并且最后一次免疫后8天并在测定前取出脾。所述GNP不加入佐剂，但是对于免疫所述游离肽与montanide佐剂(不完全Freund的佐剂)混合。对于体内研究，每次注射使用10μg/小鼠。所述游离肽以相同的浓度使用。
CTL应答通过每百万脾细胞的IFN-γ生产细胞的数量来测量。
肺癌抗原
免疫结果和结论
图4显示了由每百万脾细胞的IFN-γ生产细胞的数量测量的CTL应答的结果。发现呈递在GNP上的肺癌抗原在体内产生肿瘤-特异性免疫应答。
图5显示了由用合并的GNP免疫后的每百万脾细胞的IFN-γ生产细胞的数量来测量的CTL应答的结果，所述合并的库包含具有三种不同的肺癌抗原的纳米颗粒(命名为GMY、KLG和KIY)
GMY代表具有以下配体的GNP：
HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:95)
KLG代表具有以下配体的GNP：
HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:94)
KIY代表具有以下配体的GNP：
HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL(SEQ ID NO:93)
游离肽对照由缺少接头和GNP的同样三种表位肽的合并库组成(“混合的游离肽”)。
如图5所示，用GNP免疫的小鼠的肿瘤特异性CTL应答显著高于所述合并的游离肽对照的肿瘤特异性CTL应答。经所述肽脉冲的靶标应答被发现是具有可比性的。不希望受任何理论的束缚，目前认为GNP-结合的肽对比游离肽可以刺激高亲和力的CTL。
对于高亲和力的肿瘤特异性T细胞应答的要求表明次要表位(中等和低MHC结合的亲和力)更有效地产生高亲和力的CTL。本文测试的表位被自然呈递，且很可能是中和/或低亲和力的表位。考虑到据信靶向APC的NP中低浓度的次要表位的组合，所述呈递结果暗示高亲和力的CTL的产生。
人PBMC体外测定法的结果和结论
人外周血单核心细胞(PBMC)由含6种肺癌抗原(命名为VLV、KIY、KLG、GMY、KLI和RLL)的合并库的GNP刺激。这些命名对应于具有以下配体附着的GNP(下划线部分对应于所述命名)：
HS(CH2)2-CONH-AAYVLVPVLVMV  (SEQ ID NO:92)
HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL  (SEQ ID NO:93)
HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL  (SEQ ID NO:94)
HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL  (SEQ ID NO:95)
HS(CH2)2-CONH-AAYKLIPFLEKL  (SEQ ID NO:96)
HS(CH2)2-CONH-AAYRLLEVPVML  (SEQ ID NO:97)
所使用的GNP-肽的剂量为10μg/ml/10百万个细胞。
合并的游离肽以50μg/ml/1千万个细胞的剂量用于作为对照。
如图6所示，肿瘤特异性和经肽脉冲的靶标CTL应答在经GNP刺激的PBMC中显著要高。这表明经由GNP递送的肺癌抗原在体外产生肿瘤特异性免疫应答。
实施例5-不同的纳米颗粒冠的比较
具有各种冠的NP的合成：
将2.25μmole肽溶于3ml甲醇中(三种个体基于肺的肽抗原接受测试+一个空白)，接着加入在300μl甲醇中的45μmole GlcC2(具有C2接头的葡萄糖)和100μl含15μmoleAu的水氯化金。将该样品涡旋30秒，振荡约5分钟，然后在快速涡旋共30秒时加入300μl的1MNaBH4，密封试管，然后轻柔振荡1.5小时。
将样品在工作台上旋转除去上清液并将黑色团块重悬于1ml90％MeOH/水中，涡旋并将其再离心。然后再次除去上清液并第二次执行另外的90％MeOH/水洗涤。将最终NP团块溶于水中并接着将其转移至经预洗涤的10kDa vivaspin，并用2ml水洗涤共4次，每次在4k g以8分钟。用水将NP从vivaspins移出，令它们接着接受18k g工作台旋转以除去任何大的聚集物。样品用水制成1ml的最终体积。测定金含量，CN处理前和CN处理后用C18HPLC的差异的肽含量。
这一基础方法用以下的冠变体再进行两次；
i.将33.75μmole GlcC2和11.25μmole GlcNAcC2(具有一个C2接头的N-乙酰氨基葡萄糖)而不是45μmole GlcC2用于所有三个肽制备物+对照。
ii.将4.5μmole GlcC2和40.5μmole谷胱甘肽而不是45μmoleGlcC2用于所有3个肽制备物+对照，谷胱甘肽需要更高的水的比率以增溶(25/75％)。
下面命名为“GlcNAc”的纳米颗粒因此包含具有含葡萄糖和含N-乙酰氨基葡萄糖的配体两者的冠。
下面命名为“GSH”的纳米颗粒因此包含具有含葡萄糖和含谷胱甘肽配体两者的冠。谷胱甘肽(GSH)是用于调节细胞氧化状态的全天然三肽，它也具有成本效益并提供了为纳米颗粒提供高水溶性的带电表面，其方式与由含葡萄糖配体的冠所提供的高水溶性类似。虽然下面命名为“GSH”的所述纳米颗粒也包括葡萄糖C2配体，并且不希望受到任何理论的束缚，本发明人认为该GSH可以完全代替对于C2Glc的要求。
HLA-A2转基因小鼠模型的研究：
肺癌抗原(KIY、KLG、GMY)在NP中用Glc、GlcNAc、GSH冠进行测试，用于在HLA-A2转基因小鼠模型中体内的CTL的活化。
如上所述，命名“KIY”、“KLG”和“GMY”各自对应于：
HS(CH2)3-CONH-AAYKIYQWINEL(SEQ ID NO:93)
HS(CH2)3-CONH-AAYKLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:94)
HS(CH2)3-CONH-AAYGMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:95)。
请注意，在这个例子中C3(丙基)接头被用作所述配体的非肽部分，而AAY被用作接头的肽部分；KIYQWINEL(SEQ ID NO：29)、KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO：33)和GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO：19)分别为所述表位肽。
NP中用Glc、GlcNAc、GSH冠各自合并的3个肺肽(KIY、KLG、GMY)或者游离合并的肽+montanide用于免疫小鼠。所述游离肽在缺少AAY接头部分时使用，例如所述游离肽曾是KIYQWINEL(SEQ IDNO:29)、KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)和GMYGKIAVMEL(SEQID NO:19)。
3次免疫接种后，在IFN-γELISpot测定法中就肽和肺肿瘤特异性CTL评估脾细胞，并利用流式细胞仪评估CD107a脱颗粒标记。
在ELISpot测定法中将来自经免疫的小鼠的脾细胞与各种靶细胞(T2-空HLA-A2+细胞、N肺-HLA-A2+正常肺、HLA-A2+肺肿瘤细胞-H522、5865、5944)混合来测量IFN-γ分泌物。图7A和7B中所示的数据表明CTL由NP中所有三种冠激活。
然而，肽特异性活化在经GlcNAc NP免疫的小鼠中更高。重要的是，所有这三种冠诱导同等水平的肿瘤特异性应答。不具有任何佐剂的装载肽的NP与具有montanide-51佐剂的游离肽相比诱导相等或更高的应答。
抗原特异性活化标记(CD8/CD107a)分析
除了IFN-γ应答，抗原特异性CTL脱颗粒标记CD107a分析在脾细胞中以响应于装载肽的T2细胞以及肺肿瘤细胞来评估。
图8A-8D中所示的数据表明不加任何佐剂的具有所有三种冠的NP诱导活性的抗原特异性CTL，这与游离肽+montanide-51佐剂不同。更重要地，装载肽的NP比加佐剂的游离肽诱导更高的肿瘤特异性CTL活化。在这些冠中，与Glc和GlcNAc相比，GSH诱导更高的CTL活化。
本文引用的所有参考文献整体且为了所有目的通过引用合并入本文，其程度与每个单个出版物或专利或专利申请特别且单个指出通过引用整体合并一样。
本文描述的具体实施方案提供作为例子而不是限制。本文的任何子标题仅为了方便起见而包括，并且不应解释为以任何方式限制公开内容。

Claims (63)

1.一种疫苗，其用于在哺乳动物受试者中的肿瘤的预防性或治疗性处理，所述疫苗包含多个纳米颗粒和药学可接受的载体、盐或稀释剂，至少一种所述纳米颗粒包含：
(i)包含金属和/或半导体原子的核心；
(ii)包含共价连接至所述核心的多个配体的冠，其中所述多个中的至少第一配体包含经由第一接头共价连接至所述核心的碳水化合物部分或包含谷胱甘肽，并且其中所述多个中的至少第二配体包含经由第二接头共价连接至所述核心的表位肽，所述第二接头包含：
肽部分和非肽部分，其中所述肽部分包含序列X1X2Z1，其中：
X1为选自A和G的氨基酸；
X2为选自A和G的氨基酸；和
Z1为选自Y和F的氨基酸。
并且其中所述表位肽形成肿瘤相关抗原(TAA)的至少一部分或者来自肿瘤相关抗原(TAA)。
2.根据权利要求1的疫苗，其中第二接头的所述非-肽部分包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。
3.根据权利要求1或权利要求2的疫苗，其中所述第一配体和/或所述第二配体经由含硫基团、含氨基基团、含磷酸基团或含氧基团共价连接至所述核心。
4.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述第二接头的所述肽部分包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：
(i)AAY；和
(ii)FLAAY(SEQ ID NO:91)。
5.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述第二接头选自：
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAY；
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAY；
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAY；
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAY；
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY；和
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY，
其中所述第二接头经由接头的非-肽部分的硫醇基团共价连接至所述核心。
6.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述表位肽经由其N-末端连接至所述第二接头的所述肽部分。
7.根据权利要求6的疫苗，其中所述第二配体选自：
(i)HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2；
(ii)HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2；
(iii)HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2；
(iv)HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2；
(v)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2；和
(vi)HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2，
其中Z2代表所述表位肽。
8.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述表位肽与主要组织相容性复合体(MHC)I类分子相结合，或者能够经过加工从而与MHC I类分子相结合。
9.根据权利要求8的疫苗，其中所述表位肽由8至40个氨基酸残基的序列组成。
10.根据权利要求9的疫苗，其中所述表位肽由8至12个氨基酸残基的序列组成。
11.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中表位肽能够被MHCI类分子呈递从而刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答。
12.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述TAA是肺癌抗原。
13.根据权利要求12的疫苗，其中所述肺癌选自：小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌。
14.根据权利要求12或权利要求13的疫苗，其中所述表位肽包含选自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列或由选自SEQ ID NO:1至86的氨基酸序列组成。
15.根据权利要求14的疫苗，其中所述表位肽包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：
VLVPVLVMV(SEQ ID NO:82)；
KIYQWINEL(SEQ ID NO:29)；
KLGEFAKVLEL(SEQ ID NO:33)；
GMYGKIAVMEL(SEQ ID NO:19)；
KLIPFLEKL(SEQ ID NO:34)；和
RLLEVPVML(SEQ ID NO:67)。
16.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中：
(i)所述第一配体的碳水化合物部分包含单糖和/或二糖；和/或
(ii)所述多个配体包含经由谷胱甘肽硫原子共价连接至纳米颗粒的核心的至少一个谷胱甘肽配体；和/或
(iii)所述多个配体包含：
(a)葡萄糖；
(b)N-乙酰氨基葡萄糖；
(c)谷胱甘肽；
(d)葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖；
(e)葡萄糖和谷胱甘肽；
(f)N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽；或
(g)葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖和谷胱甘肽。
17.根据权利要求16(i)的疫苗，其中所述碳水化合物部分包含葡萄糖、甘露糖、海藻糖和/或N-乙酰氨基葡萄糖。
18.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述第一接头包含C2-C15烷基和/或C2-C15二醇。
19.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述第一配体包含经由硫醇硫原子共价附着至核心的2'-硫乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷或2'-硫乙基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
20.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中纳米颗粒包含至少10、至少20、至少30、至少40或至少50种含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体。
21.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中纳米颗粒包含至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5种含表位肽的配体。
22.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中含碳水化合物的配体和/或谷胱甘肽配体与含表位肽的配体的摩尔比的范围为5:1至100:1。
23.根据权利要求22的疫苗，其中含碳水化合物的配体与含表位肽的配体的摩尔比的范围为10:1至30:1。
24.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中纳米颗粒的核心的直径的范围为1nm至5nm。
25.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中纳米颗粒包括其配体的直径的范围为5nm至20nm，任选地5nm至15nm，或8nm至10nm。
26.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中核心包含选自下述的金属：Au、Ag、Cu、Pt、Pd、Fe、Co、Gd和Zn或其任何组合。
27.根据权利要求26的疫苗，其中核心包含选自下述的钝态金属：Au、Ag、Pt、Pd和Cu或其任何组合。
28.根据权利要求27的疫苗，其中核心包含选自下述的金属的组合：Au/Fe、Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd。
29.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中核心是磁性的。
30.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中核心进一步包含选自下述的NMR活性原子：Mn2+、Gd3+、Eu2+、Cu2+、V2+、Co2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和镧系元素3+。
31.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中核心包含半导体。
32.根据权利要求31的疫苗，其中半导体选自：硒化镉、硫化镉、碲化镉和硫化锌。
33.根据权利要求31或权利要求32的疫苗，其中核心能够作为量子点。
34.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中至少一种纳米颗粒包含至少两种含表位肽的配体，并且其中至少两种含表位肽的配体各自的所述表位肽不同。
35.根据权利要求34的疫苗，其中所述至少两种含表位肽的配体的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或各自来自不同的肺癌TAA。
36.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其中所述疫苗包含具有第一含表位肽的配体的第一种类的所述纳米颗粒和具有第二含表位肽的配体的第二种类的所述纳米颗粒，其中所述第一和第二种类的表位肽不同。
37.根据权利要求36的疫苗，其中所述第一和第二种类纳米颗粒各自的表位肽各自形成不同的肺癌TAA的至少一部分或者各自来自不同的肺癌TAA。
38.根据权利要求36或权利要求37的疫苗，其包含至少3、至少4、至少5或至少10个不同种类的纳米颗粒的合并库，各个种类具有不同的表位肽。
39.根据前述权利要求中任一项的疫苗，其进一步包含至少一种佐剂。
40.根据权利要求39的疫苗，其中所述佐剂共价附着至至少一个纳米颗粒的核心。
41.根据权利要求39或权利要求40的疫苗，其中所述佐剂包含(S)-(2,3-双(棕榈酰氧基)-(2RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH(“Pam3Cys”)。
42.根据权利要求1至38中任一项的疫苗，其中所述疫苗基本上不含佐剂或其中由纳米颗粒提供唯一的佐剂功效。
43.前述权利要求中任一项中所定义的疫苗，用于在药物中使用。
44.前述权利要求中任一项所定义的疫苗，其用于在处理哺乳动物受试者中的癌症的预防性或治疗性方法中使用。
45.根据权利要求44使用的疫苗，其中所述癌症包含肺癌。
46.根据权利要求45使用的疫苗，其中所述肺癌症选自：小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌。
47.前述权利要求中任一项中所定义的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物受试者中的癌症的预防性或治疗性处理。
48.根据权利要求47的用途，其中所述癌症包含肺癌。
49.根据权利要求48的用途，其中所述肺癌选自：小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌。
50.根据权利要求1至46的疫苗或根据权利要求47至49中任一项的用途，其中所述疫苗或药物用于经由淋巴摄取的施用。
51.一种预防性或治疗性处理癌症的方法，其包含对有此需要的哺乳动物受试者施用预防或治疗有效量的根据权利要求1至42中任一项所定义的疫苗。
52.根据权利要求51的方法，其中所述癌症是肺癌。
53.根据权利要求52的方法，其中所述肺癌选自：小细胞肺癌、非小细胞肺癌和腺癌。
54.根据权利要求51至53中任一项的方法，其中所述疫苗在用于淋巴摄取的位点进行施用。
55.一种产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的体外或体内方法，其包含：
(i)使至少一种抗原呈递细胞(APC)与权利要求1至42中任一项所定义的疫苗接触，从而使得所述表位肽被呈递到所述APC的MHC I类分子上；和
(ii)使所述至少一个(i)中的APC与至少一个CTL细胞接触，从而使得所述CTL细胞由所述APC激活以产生对所述表位肽特异性的CTL应答。
56.根据权利要求55的体外方法，其中APC是在所述疫苗存在下进行培养，并且同时或相继地，与所述CTL细胞共培养。
57.根据权利要求56的方法，其中APC在与疫苗接触后、与所述CTL细胞共培养前接受洗涤步骤。
58.根据权利要求57的方法，其进一步包含对哺乳动物受试者施用CTL细胞。
59.根据权利要求55的体内方法，其中所述疫苗由选自下述的施用途径递送：
在淋巴摄取的位点或其附近向哺乳动物受试者的器官或组织中注射；
经由喷雾或凝胶的鼻腔递送；
经由喷雾或凝胶或口服可溶解膜的颊递送；
经由可溶解膜的口腔递送；
经由掺入疫苗的贴片的透皮递送；和
包含疫苗的组合物的吸入递送。
60.根据权利要求55至59中任一项的方法，其中所述疫苗包含具有不同表位肽的纳米颗粒的合并库。
61.根据权利要求55至60中任一项的方法，其中所述CTL应答包含一种或多种细胞因子的生产。
62.根据权利要求61的方法，其中所述一种或多种细胞因子包含干扰素γ(IFN-γ)。
63.根据权利要求55至62中任一项的方法，其中所述至少一个CTL细胞对于包含呈现在MHC I类分子上的所述表位肽的MHC-肽复合物展现出更高的亲和力，其中所述更高的亲和力相较于对于由APC所激活的CTL细胞所展现的MHC-肽复合物的亲和力更高，所述APC已经以不连接至纳米颗粒的游离肽的形式与相同的表位肽接触。
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