KR20140084020A - 나노입자 종양 백신 - Google Patents

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KR20140084020A
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라밀라 필립
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미다테크 리미티드
이뮤노토프, 인코포레이티드.
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Abstract

본 발명은 종양을 치료하고 CTL 반응을 생성하는 것을 포함하는, 포유동물 개체에서 종양의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 백신, 뿐만 아니라 상기 백신을 사용하는 방법을 제공한다. 백신은 복수의 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체, 염 또는 희석제를 포함한다. 입자는 금속 및/또는 반도체 원자를 포함하는 코어; 및 코어에 공유적으로 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나를 포함하며, 여기서 상기 복수의 적어도 제1 리간드가 제1 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 탄수화물 모이어티를 포함하고, 상기 복수의 적어도 제2 리간드가 제2 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 에피토프 펩티드를 포함하며, 상기 제2 링커는 펩티드 부분 및 비-펩티드 부분을 포함하며, 이때, 상기 펩티드 부분은 서열 X1X2Z1을 포함하며, 여기서 X1은 A 및 G로부터 선택된 아미노산이고; X2는 A 및 G로부터 선택된 아미노산이며; Z1은 Y 및 F로부터 선택된 아미노산이다.

Description

나노입자 종양 백신{Nanoparticle Tumour Vaccines}
본 발명은 펩티드-기반 백신 전략, 특히 T 세포 반응을 자극하기 위한 나노입자-매개된 펩티드의 전달에 유용한 물질 및 조성물에 관한 것이다. 백신 전략은 폐암 종양과 같은 종양의 치료적 및 예방적 처치에 관한 것이다.
세포독성 T 림프구(CTL)는 암성(cancerous) 세포 또는 감염된 세포를 일차적으로 인식하고 사멸시킴으로써 뿐만 아니라, 면역 시스템 상에 다양한 효과를 매개할 수 있는 사이토카인으로서 지칭된 가용성 분자를 분비시킴으로써 기능하는 특성화된 T 세포이다. 증거는 종양-특이적 CTL 반응을 자극하도록 설계된 면역요법은 암을 제어하는데 효과적일 것임을 제안한다. 예를 들면, 인간 CTL은 육종(Slovin, S. F. et al., J. Immunol., 137:3042-3048, (1987)), 신장 세포암(Schendel, D. J. et al., J. Immunol., 151:4209-4220, (1993)), 결장 직장암(Jacob, L. et al., Int. J. Cancer, 71:325-332, (1997)), 난소 암종(Ioannides, C. G. et al., J. Immunol., 146:1700-1707, (1991))(Peoples, G. E. et al., Surgery, 114:227-234, (1993)), 췌장 암종(Peiper, M. et al., Eur.J.Immunol., 27:1115-1123, (1997); Wolfel, T. et al., Int.J.Cancer, 54:636-644, (1993)), 두경부의 편평 종양(Yasumura, S. et al., Cancer Res., 53:1461-1468, (1993)), 및 폐의 편평 암종(Slingluff, C. L. Jr et al., Cancer Res., 54:2731-2737, (1994); Yoshino, I. et al., Cancer Res., 54:3387-3390, (1994))을 인식하는 것이 밝혀졌다. 인간 종양-반응성 CTL의 대다수의 보고는 암에 관한 것이었다(Boon, T. et al., Ann.Rev.Immunol., 12:337-365, (1994)). 종양 퇴축을 매개하는 종양-특이적 CTL의 능력은 인간(Rosenberg, S. A. et al., N.Engl.J.Med., 319:1676-1680, (1988))과 동물 모델(Celluzzi, C. M. et al., J.Exp.Med., 183:283-287, (1996); Mayordomo, J. I. et al., Nat.Med., 1:1297-1302, (1995); Zitvogel, L. et al., J.Exp.Med., 183:87-97, (1996))둘 모두에서 종양 치료에 관하여 이로운 효과를 가지는 경향이 있는 증가된 CTL 활성을 지시하는 방법을 제안한다.
CTL이 암성 세포에 반응하여 사멸시키거나 사이토카인을 분비하기 위해서 CTL은 우선 세포를 암성이 있는 것으로 인식해야 한다. 이러한 과정은 CTL의 표면 상에 위치한 T 세포 수용체와 암성 세포의 표면에 위치하는 MHC-펩티드 복합체로서 일반적으로 지칭되는 것과의 상호작용을 수반한다. MHC(주요 조직적합성 복합체)-인코딩된 분자는 2가지 유형으로 세분화되고, 클래스 I 및 클래스 II MHC-인코딩된 분자로서 지칭된다. 인간 면역 시스템에서, MHC 분자는 인간 30 백혈구 항원(HLA)로서 지칭된다. 염색체 6 상에 위치한 MHC 내에, 클래스 I MHC 분자에 대해 인코딩하는 3개의 상이한 유전자 자리가 있다. 이들 유전자자리에서 인코딩된 MHC 분자는 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C로서 지칭된다. 이들 유전자자리 각각에서 인코딩될 수 있는 유전자는 극도로 다형성이므로, 따라서 집단 내 상이한 개체는 이들 세포의 표면 상에 상이한 클래스 I MHC 분자를 발현한다. HLA-Al, HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7, 및 HLA-B8은 이들 유전자자리로부터 발현될 수 있는 상이한 클래스 I MHC 분자의 예이다. 본 발명은 HLA-A1, HLA-A2, 또는 HLA-Al 1 분자, HLA-A1 상위유형(supertype), HLA-A2 상위유형, 및 HLA-All 상위유형과 관련된 펩티드에 관한 것이다. 상위유형은 적어도 하나의 공유된 에피토프에 존재하는 HLA 분자의 그룹이다. 본 발명은 HLA 분자와 관련된 펩티드, 및 유전자 및 단백질로부터 유래되는 이들 펩티드에 관한 것이다.
MHC 분자와 관련된 펩티드는, 단백질이 전형적으로 클래스 I MHC 분자와 관련되는 경우, 세포 내에서 만들어진 단백질로부터 유래될 수 있거나(Rock, K. L. and Golde, U., Ann. Rev. Immunol., 17:739-779, (1999)), 또는 단백질이 전형적으로 클래스 II MHC 분자와 관련되는 경우에, 세포 외부로부터 획득되는 단백질로부터 유래될 수 있다(Watts, C., Ann. Rev. Immunol., 15:821-850, (1997)). 암-특이적 CTL 반응을 유발하는 펩티드는 가장 전형적으로 클래스 I MHC 분자와 관련된다. 클래스 I MHC 분자와 관련된 펩티드는 전형적으로 9개 아미노산 길이이지만, 최소 8개 아미노산 길이 내지 최대 14개 아미노산 길이로 다양할 수 있다. 그의 결합 펩티드와 함께 클래스 I MHC 분자, 또는 그의 결합 펩티드와 함께 클래스 II MHC 분자는 MHC-펩티드 복합체로서 지칭된다.
온전한 단백질이 펩티드로 분해되는 과정은 항원 처리로서 지칭된다. 항원 처리의 2가지 주요 경로는 세포 내에서 일어난다(Rock, K. L. and Golde, U., Ann.Rev.Immunol., 17:739-779, (1999); Watts, C., Ann.Rev.Immunol., 15:821-850, (1997)). 수지상 세포, 대식세포 및 B 세포와 같은 항원 제시 세포인 세포로 크게 제한되는 첫번째 경로는 전형적으로 세포 내로 파고사이토스(phagocytose)되거나 엔도사이토스(endocytose)되는 단백질을 분해한다. 이 경로에서 유래된 펩티드는 전형적으로 클래스 II MHC 분자에 결합한다. 항원 처리의 두번째 경로는 모든 세포의 몸체(body)에 본질적으로 존재한다. 이 두번째 경로는 일차적으로 세포 내에서 만들어진 단백질을 분해하고, 이 경로로부터 유래된 펩티드는 일차적으로 클래스 I MHC 분자에 결합한다. 이는 본 명세서에 지칭되는 항원 처리의 이 제2 경로로부터의 펩티드이다. 이 후자의 경로에 의한 항원 처리는 세포질에서 폴리펩티드 합성 및 단백질 분해를 수반한다. 그후 생산된 펩티드는 신규하게 합성된 클래스 I MHC 분자와 관련된 세포의 소포체 내로 이동하고, 생성된 MHC-펩티드 복합체는 그후 세포 표면으로 이동된다. 막으로부터 유래된 펩티드 및 분비된 단백질은 또한 클래스 I MHC 분자와 관련될 수 있다. 일부 경우에서, 이들 펩티드는 시그널 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단되는 단백질의 시그널 서열과 상응한다. 다른 경우에서, 막 및 분비된 단백질의 일부 분획은 소포체로부터 나중에 처리가 일어나는 세포질로 이동되는 것으로 여겨진다.
일단 클래스 I MHC 분자에 결합하고 세포의 표면 상에 제시되면, 펩티드는 CTL 상의 항원-특이적 수용체에 의해 인식된다. 클래스 I MHC 분자 자체의 아주 적은 발현은, 항원성 펩티드가 클래스 I MHC 분자에 결합하지 않는 경우, 표적 세포를 사멸시키도록 CTL을 촉발하기에 불충분하다. CTL에 의해 인식된 펩티드를 확인하기 위한 몇몇 방법이 개발되었고, 각각의 방법은 이에 결합된 펩티드와 함께 적절한 클래스 I MHC 분자를 발현하는 세포만을 인식하고 사멸시키는 CTL의 능력에 의존한다(Rosenberg, S. A., Immunity, 10:281-287, (1999)). 이러한 펩티드는 (예를 들면, 박테리아 또는 바이러스에 의한 세포의 감염 이후) 병원체와 같은 비-자가 근원(non-self source) 또는 암성 세포와 같은 세포 내의 자가-유래된 단백질로부터 유래될 수 있다. 암성 세포에서 자가-유래된 단백질 근원의 예는 문헌 (Gilboa, E., Immunity, 11:263-270, (1999); Rosenberg, S. A., Immunity, 10:281-287, (1999))에서 검토되었고, (i) 돌연변이된 유전자; (ii) 대안적인 오프 리딩 프레임 또는 인트론-액손 경계를 통해서와 같이 비정상적으로 발현된 유전자; (iii) 종양 및 고환에서만 선택적으로 발현되는 정상 유전자; 및 (iv) 종양 및 정상 세포 카운터파트에서 발현되는 정상 분화 유전자를 포함한다.
문헌 [Oberg et al ., 2011, European Journal of Cell Biology, Vol. 90, pp. 582-592]은 Toll-유사 수용체 (TLR) 리간드에 의한 T 세포 활성화의 조절을 기술한다. 문헌 [McKee et al ., 2005, Journal of Translational Medicine, Vol. 3, p. 35]은 T 세포 항원항체결합력(avidity) 및 종양 인식과 관련되는 연루(implication) 및 치료적 전략에 대해 검토한다.
WO 2011/025572은 암의 예방, 치료 및 진단을 위한 CTL-유도성 면역원을 기술한다.
종양의 치료를 위한 펩티트-기반 백신 요법의 설계 및 개발을 위한 유의미한 도전은 제시되는 펩티드가 클래스 I MHC 분자에 결합하여, 이에 따라 CTL 반응을 자극하도록 항원 처리 장치를 통한 에피토프-함유 펩티드의 전달이다. 흔한 경우에 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 하나 이상의 애쥬번트의 투여가 필요하다. 다수의 애쥬번트가 예컨대, 인간 사용에 너무 독성인 것으로 고려된다.
암의 치료를 위한 많은 제품이 개발되었음에도 불구하고, 이미 알려진 물질에 비해 개선된 특성을 갖는 물질에 대한 높은 요구가 여전히 존재한다. 특히, 백신접종의 분야에서, 고도로 면역원성이고, 쉽게 재생가능하며, 아주 효과적이지만 심각한 부작용을 야기하지 않는 제품을 제공할 필요가 있다.
WO 2006/037979은 항원 및 애쥬번트를 포함하는 나노입자, 및 면역원성 구조를 기술한다.
본 발명자들은 특정한 링커를 통해 나노입자에 결합된 펩티드가 MHC에 펩티드가 결합되고 CTL 반응을 유도하도록 항원 제시 세포(APC)에 의해 처리되고 내재화되는 능력을 나타냄을 밝혀냈다. 특히, 나노입자를 통해 전달된 종양 항원 관련된(TAA) 펩티드는 애쥬번트 부재시에도 높은 항원항체결합력 종양-특이적 CTL 반응을 자극할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 포유동물 개체에서 종양의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 백신을 제공하며, 상기 백신은 복수의 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체, 염 또는 희석제를 포함하며, 적어도 하나의 상기 나노입자는 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다:
(i) 금속 및/또는 반도체 원자를 포함하는 코어;
(ii) 상기 코어에 공유적으로 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나,
여기서 상기 복수의 적어도 제1 리간드가 제1 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 탄수화물 모이어티를 포함하거나 글루타티온을 포함하고, 상기 복수의 적어도 제2 리간드가 제2 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 에피토프 펩티드를 포함하며,
상기 제2 링커는 펩티드 부분 및 비-펩티드 부분을 포함하고,
이때, 상기 펩티드 부분은 서열 X1X2Z1을 포함하며, 여기서
X1은 A 및 G로부터 선택된 아미노산이고;
X2는 A 및 G로부터 선택된 아미노산이며;
Z1은 Y 및 F로부터 선택된 아미노산이며,
여기서, 상기 에피토프 펩티드는 종양-관련 항원(TAA)의 적어도 일부분을 형성하거나, 이로부터 유래된 것이다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 제2 링커의 비-펩티드 부분은 C2-C15 알킬 및/또는 C2-C15 글리콜, 예를 들면 티오에틸기 또는 티오프로필기를 포함한다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 제1 리간드 및/또는 상기 제2 리간드는 황-함유기, 아미노-함유기, 인산염-함유기 또는 산소-함유기를 통해 코어에 공유적으로 결합된다.
상기 제2 링커의 펩티드 부분은 (i) AAY; 및 (ii) FLAAY(서열번호 91)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 특정한 경우에서, 제2 링커는 하기로 구성되는 군으로부터 선택된다:
(i) HS-(CH2)2-CONH-AAY;
(ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAY;
(iii) HS-(CH2)3-CONH-AAY;
(iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAY;
(v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY; 및
(vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY,
여기서, 상기 제2 링커는 링커의 비-펩티드 부분의 티올기를 통해 상기 코어에 공유적으로 결합된다.
바람직하게는, 에피토프 펩티드는 상기 제2 링커의 상기 펩티드 부분에 그의 N-말단을 통해 결합된다. 따라서, 상기 제2 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:
(i) HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
(ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
(iii) HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
(iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
(v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2; 및
(vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2,
여기서, Z2는 상기 에피토프 펩티드를 나타낸다.
바람직하게는, 에피토프 펩티드는 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하거나 클래스 I MHC 분자에 결합하도록 처리될 수 있다.
에피토프 펩티드는 8 내지 40개 아미노산 잔기, 예를 들면 8 내지 12개 아미노산 잔기로 구성될 수 있다. 에피토프 펩티드는 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 자극하도록 클래스 I MHC 분자에 의해 제시될 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, TAA는 폐암 항원일 수 있다. 상기 폐암은 소세포 폐 암종 및 비-소세포 폐 암종 및 선암으로부터 선택될 수 있다.
일부 경우에서 에피토프 펩티드는 서열번호 1 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이들 에피토프 펩티드는 WO 2011/025572에 상세히 기술되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참조로서 명확히 포함된다. 특히, 에피토프 펩티드는 하기 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다:
VLVPVLVMV (서열번호 82);
KIYQWINEL (서열번호 29);
KLGEFAKVLEL (서열번호 33);
GMYGKIAVMEL (서열번호 19);
KLIPFLEKL (서열번호 34); 및
RLLEVPVML (서열번호 67).
본 발명에 따른 일부 경우에서, 상기 제1 리간드의 탄수화물 모이어티는 단당류 및/또는 이당류를 포함한다. 특히, 상기 탄수화물 모이어티는 글루코스, 만노스, 푸코스 및/또는 N-아세틸글루코사민을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 상기 복수의 리간드는 상기 에피토프 펩티드를 포함하는 하나 이상의 리간드 뿐만 아니라, 글루코스, N-아세틸글루코사민 및 글루타티온으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 상기 복수의 리간드는 상기 에피토프 펩티드를 포함하는 상기 리간드 뿐만 아니라, 하기를 포함한다:
(a) 글루코스;
(b) N-아세틸글루코사민;
(c) 글루타티온;
(d) 글루코스 및 N-아세틸글루코사민;
(e) 글루코스 및 글루타티온;
(f) N-아세틸글루코사민 및 글루타티온(glutathionie); 또는
(g) 글루코스, N-아세틸글루코사민 및 글루타티온.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 상기 제1 링커는 C2-C15 알킬 및/또는 C2-C15 글리콜을 포함한다. 특히, 상기 제1 리간드는 티올 황 원자를 통해 코어에 공유적으로 부착된 2'-티오에틸-α-D-글루코피라노사이드 또는 2'-티오에틸-β-D-글루코피라노사이드를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 나노입자는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개 또는 적어도 50개의 탄수화물-함유 리간드 및/또는 글루타티온 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 나노입자는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 에피토프-함유 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 탄수화물-함유 리간드 및/또는 글루타티온 리간드 대 에피토프-함유 리간드의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위 내, 예를 들면 10:1 내지 30:1의 범위 내이다.
나노입자의 코어의 직경은 1 nm 내지 5 nm 범위 내일 수 있다. 그의 리간드를 포함하는 나노입자의 직경은 5 nm 내지 20 nm, 선택적으로 5 nm 내지 15 nm 또는 8 nm 내지 10 nm 범위 내일 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 적어도 1개의 나노입자는 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드를 포함하며, 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드의 각각의 에피토프 펩티드는 상이하다. 상기 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드의 에피토프 펩티드는 각각 상이한 폐암 TAA의 적어도 일부분을 형성하거나 각각 이로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 백신은 제1 에피토프 펩티드-함유 리간드를 갖는 상기 나노입자의 제1 종 및 제2 에피토프 펩티드-함유 리간드를 갖는 상기 나노입자의 제2 종을 포함하며, 상기 제1 및 제2 종의 에피토프 펩티드는 상이하다. 특히, 상기 나노입자의 제1 및 제2 종의 각각의 에피토프 펩티드는 각각 상이한 폐암 TAA의 적어도 일부분을 형성하거나 각각 이로부터 유래될 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 백신은 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 10개의 상이한 종의 나노입자의 풀을 포함하며, 각각의 종은 상이한 에피토프 펩티드를 갖는다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 백신은 적어도 하나의 애쥬번트를 더 포함할 수 있다. 애쥬번트는 적어도 하나의 나노입자의 코어에 공유적으로 부착될 수 있다. 애쥬번트는 (S)-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH("Pam3Cys")를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 일부 경우에서, 백신은 실질적으로 애쥬번트 비함유이거나 유일한 애쥬번트 효과가 나노입자에 의해 제공된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 의약품으로 사용하기 위한 본 발명의 제1 측면에 따라 정의된 바와 같은 백신을 제공한다. 백신은 포유동물 개체(예컨대, 인간 개체)에서 폐암과 같은 암의 치료의 예방적 또는 치료적 방법에 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 표유동물 개체에서 폐암과 같은 암의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 약제의 제조에 있어 이전 특허청구범위 중 임의의 하나에서 정의된 바와 같은 백신의 용도를 제공한다.
본 발명의 백신은 림프 흡수를 통해 투여될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 따른 백신의 예방적 또는 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암(예컨대, 폐암)의 예방적 또는 치료적 처치의 방법을 제공한다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 생성하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법을 제공한다:
(i) 본 발명의 제1 측면에 따라 정의된 바와 같은 백신과 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 접촉시키는 단계로서, 상기 에피토프 펩티드가 상기 APC의 클래스 I MHC 분자 상에 제시되도록 하는 것인 단계; 및
(ii) 적어도 하나의 CTL 세포와 (i)의 상기 적어도 하나의 APC를 접촉시키는 단계로서, 상기 CTL 세포가 상기 APC에 의해 활성화되어 상기 에피토프 펩티드에 특이적인 CTL 반응을 생성하도록 하는 단계.
APC는 상기 백신의 존재하에 배양되고, 동시적으로 또는 순차적으로, 상기 CTL 세포와 공동-배양될 수 있다. 일부 경우에서, APC는 상기 CTL 세포와 공동-배양되기 전에 백신과 접촉된 후 세척 단계로 적용될 수 있다. 포유동물 개체에게 CTL 세포를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 본 측면의 방법에 따른 일분 경우에서, 상기 적어도 하나의 CTL 세포가 클래스 I MHC 분자 상에 표시된 상기 에피토프 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 대해 더 높은 항원항체결합력을 나타내며, 이때 상기 더 높은 항원항체결합력은 나노입자에 결합되지 않은 유리 펩티드 형태의 동일한 에피토프 펩티드와 접촉된 APC에 의해 활성화된 CTL 세포에 의해 표시된 상기 MHC-펩티드 복합체에 대한 항원항체결합력에 비해 더 높다.
본 발명은 조합이 명백히 허용할 수 없거나 분명히 회피하도록 명시된 곳을 제외하고 기술된 측면 및 바람직한 양상의 조합을 포함한다. 이들 및 추가적인 측면 및 본 발명의 실시양태는 하기에 추가적으로 상세히 기술되며 수반되는 실시예 및 도면을 참조하여 기술된다.
도 1은 24-웰 플레이트에 접종하고 밤새 부착되도록 한 GNP:LKb 세포로부터의 SIINFEKL(서열번호 87) 제시를 보여준다. 다음으로, GNP를 당량의 1ug/mL 펩티드(녹색), 0.1ug/mL(파란색), 또는 0.01ug/mL(붉은색)으로 자극(pulse)하였다. 2시간 후, 세포를 세척하고, 25.D1.16(Angel) 항체로 표지한 유동세포 분석법에 적용하거나(A-D), 밤새 공동-배양을 위해 B3Z CTL와 조합하였다(E). 다음날, 세포를 용해하고 베타-갈락토시다제 활성을 측정하였다.
도 2: 유리 펩티드 제제와 비교한 GNP 제시: (A-B) GNP 8 및 9를 15개 분획으로 Sephadex 컬럼에 의해 분리시킨 후, 단백질 수준에 대한 UV 흡수에 의해 분석하였다. 도 2A의 붉은선(원으로 표시함)은 유리 펩티드 단독을 나타낸다. (C-H) LKb 세포를 언급된 농도(1ug/mL 펩티드(녹색), 0.1ug/mL(푸른색), 또는 0.01ug/mL(붉은색)에서 GNP 또는 상응하는 유리 펩티드로 2시간 동안 자극하였다.판독출력(readout)은 유동세포 분석법(C-F) 또는 B3Z 분석(G-H)을 사용한다. (I-N) LKb를 얼음상(I-K) 또는 37℃(L-N)에서 2시간 동안 언급된 유리 펩티드로 자극하였다. 다음으로, 세포를 SIINFEKL(서열번호 87)의 제시를 위해 유동세포 분석법으로 분석하였다. 히스토그램의 붉은 부분은 비자극된 세포와 비교하는 경우 양성 염색을 나타낸다.
도 3: 유리 펩티드가 없는 제제로부터 GNP 제시: (A-B) GNP 8 및 9의 새로운 제시를 15개 분획으로 Sephadex G-50 컬럼에 의해 분리시킨 후, 단백질의 수준에 대한 UV 흡수에 의해 분석하였다. 화살표는 추가 사용을 위해 풀링된(pool) 분획을 나타낸다. (C-E,F) LKb 세포를 언급된 농도(1ug/mL 펩티드(녹색), 또는 0.1ug/mL(붉은색))에서 언급된 이전 GNP 제제(기존 GNP) 또는 (A 및 B)로부터의 신규 제제(신규 GNP)로 2시간 동안 자극하였다. 판독출력은 유동세포 분석법(C-E) 또는 B3Z 분석(F)을 사용한다
도 4: 개별 폐암 항원을 갖는 GNP로 면역접종된 HLA 형질전환 마우스에 대한 백만개 비장세포(splenocyte) 당 IFN-감마 생산성 세포의 수에 의해 측정된 CTL 반응을 보여준다.
도 5: 3개의 상이한 폐암 항원을 갖는 풀링된 GNP로 면역접종된 HLA 형질전환 마우스에 대한 백만개 비장세포 당 IFN-감마 생산성 세포의 수에 의해 측정된 CTL 반응을 보여준다.
도 6: 풀링된 유리 펩티드 대조군에 비해 6개의 상이한 폐암 항원을 갖는 풀링된 GNP로 자극한 후 105 인간 PBMC 당 IFN-감마 생산성 세포의 수를 보여준다.
도 7: (A-B) 폐 항원(KIY, KLG, GMY)을 HLA-A2 형질전환 마우스 모델에서 생체내 CTL의 활성화에 대해 Glc, GlcNAc, GSH 코로나를 갖는 NP에서 시험한 IFN-감마 ELISpot 분석 결과를 보여준다. Glc, GlcNAc, GSH 코로나를 갖는 NP 중에 풀링된 3개 폐 펩티드(KIY, KLG, GMY) 또는 유리 풀링된 펩티드+몬타니드(montanide)를 마우스를 면역화하기 위해 사용하였다. 3회 면역접종 후, 면역접종된 마우스로부터의 비장세포를 다양한 표적 세포(T2 - 빈 HLA-A2+ 세포, N 폐 - HLA-A2+ 정상 폐, HLA-A2+ 폐암 세포 - H522, 5865, 5944)와 혼합하여 분석에서 IFN-감마 분비를 측정하였다.
도 8: (A-D) (A) 글루코스 NP, (B) GlcNAc NP, (C) GSH NP, 및 (D) 유리 펩티드 + 애쥬번트의 경우 펩티드 부하된 T2 세포 뿐만 폐 종양 세포에 대하여 비장세포에서 항원 특이적 CTL 탈과립화 마커 CD107a 분석을 보여준다.
본 발명을 기술함에 있어, 하기의 용어들이 사용될 것이며, 하기에 지시된 바와 같이 정의되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "나노입자"는 나노머 규모를 갖는 입자를 나타내며, 임의의 형태의 제한을 수반하지 않는 것으로 의도된다. 특히, "나노입자"는 나노구, 나노튜브, 나노박스, 나노다발, 나노막대 등을 포함한다. 특정한 실시양태에서 본 명세서에 포함된 나노입자 및/또는 나노입자 코어는 일반적으로 다면체 또는 구형 기하학적 구조를 갖는다.
복수의 탄수화물-함유 리간드를 포함하는 나노입자는 예를 들면, WO 2002/032404, WO 2004/108165, WO 2005/116226, WO 2006/037979, WO 2007/015105, WO 2007/122388, WO 2005/091704(각각의 전체 내용이 참조로서 본 명세서에 명백히 포함됨)에 기술되어 있으며, 이러한 나노입자는 본 발명에 따라 용도를 발견할 수 있다. 게다가, 유기 화합물(예컨대, 티올-금 결합)과 함께 기능화된 산화철 페라이트(화학식 XFe2O4를 가짐, X = Fe, Mn 또는 Co임)의 자성 코어를 포함하는 금-코팅된 나노입자는 EP2305310(전체 내용이 참조로서 본 명세서에 명백히 포함됨)에 기술되어 있으며 본 명세서에 따른 나노입자들/나노입자 코어로서 사용하기 위해 구체적으로 고려된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "코로나"는 나노입자의 노출된 표면을 부분적으로 또는 완전히 덮을 수 있는 층 또는 코팅을 나타낸다. 코로나는 적어도 하나의 탄수화물 모이어티, 하나의 계면활성제 성분 및/또는 하나의 글루타티온 성분을 포함하는 복수의 리간드를 포함한다. 따라서, 코로나는 금속 코어를 둘러싸거나 부분적으로 둘러싸는 유기층인 것으로 고려될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 코로나는 나노입자의 코어를 부동태화시키는 것을 제공하고/하거나 이에 참여한다. 따라서, 특정한 경우에서, 코로나는 금속-함유 코어를 실질적으로 안정화시키기 위해 충분히 완전한 코팅층을 포함할 수 있다. 그러나, 예를 들면 코어 표면을 단지 부분적으로 코팅하는 코로나를 포함할 수 있는 귀중한 금속으로 코팅된 금속-산화물 함유 내부 코어를 포함하는 코어를 갖는 특정한 나노입자가 본 명세서에 구체적으로 고려된다. 특정한 경우에서 코로나는 본 발명의 나노입자의 수용성과 같은 가용성을 촉진한다.
나노입자
나노입자는 작은 입자, 예를 들면 리간드를 고정시키기 위한 기질로서 사용될 수 있는 금속 또는 반도체 원자의 클러스터이다.
바람직하게는, 나노입자는 평균 직경 0.5 내지 50 nm, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 10 nm, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5 nm, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 3nm 및 더욱더 바람직하게는 0.5 내지 2.5 nm를 갖는 코어를 가진다. 코어 뿐만 아니라 리간드가 고려되는 경우, 바람직하게는 입자의 전체 평균 직경은 5.0 내지 100 nm, 더욱 바람직하게는 5 내지 50 nm 및 가장 바람직하게는 5 내지 10 nm이다. 평균 직경은 투과 전자 현미경과 같은 당해 분야에 잘 알려진 기술을 사용해 측정될 수 있다.
코어 물질은 금속 또는 반도체일 수 있으며 한가지 이상의 원자로 형성될 수 있다. 바람직하게는, 코어 물질은 Au, Fe 또는 Cu로부터 선택된 금속이다. 나노입자 코어는 또한 Au/Fe, Au/Cu, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd 및 Au/Fe/Cu/Gd를 포함하는 합금으로부터 형성될 수 있으며, 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 코어 물질은 가장 바람직한 물질인 Au와 더불어, Au 및 Fe이다. 나노입자의 코어는 약 100 내지 500 원자(예컨대, 금 원자)를 포함하여 나노미터 범위에 코어 직경을 제공한다. 다른 특히 유용한 코어 물질은 NMR 활성인 하나 이상의 원자로 도핑(dope)되어, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 NMR을 사용해 나노입자가 검출가능하게 한다. NMR 활성 원자의 예는 Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 및 란탄족원소+3, 또는 본 명세서에 다른 부분에서 기술된 양자점을 포함한다.
반도체 원자를 포함하는 나노입자 코어는 양자점으로서 작용할 수 있는 나노미터 규모 반도체 결정으로서 검출될 수 있는데, 즉 나노입자 코어는 빛을 흡수하여, 이에 따라 물질 내의 전자를 더 높은 에너지 수준으로 여기시키며, 이후에 물질의 빈도 특징에서 빛의 광자를 방출한다. 반도체 코어 물질의 예는 셀렌화 카드뮴, 황화 카드뮴, 카드뮴 텔레늄이다. 또한 황화 아연과 같은 아연 화합물이 포함된다.
일부 실시양태에서, 나노입자의 코어는 자성일 수 있으며, 선택적으로 부동태 금속 원자와 함께 조합되는 자성 금속 원자를 포함할 수 있다. 예로써, 부동태 금속은 금, 플라튬, 은 또는 구리일 수 있으며, 자성 금속은 철 또는 가돌리늄일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 부동태 금속은 금이며 자성 금속은 철이다. 이 경우에서, 코어 내의 부동태 금속 원자 대 자성 금속 원자의 비율은 편리하게 약 5:0.1 내지 2:5이다. 더욱 바람직하게는 비율은 약 5:0.1 내지 약 5:1이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "부동태 금속(passive metal)"은 자성 특성을 보이지 않으며 산화에 대해 화학적으로 안정한 금속을 나타낸다. 부동태 금속은 반자성체(diamagnetic) 또는 초상자성체(superparamagnetic)일 수 있다. 바람직하게는, 이러한 나노입자는 초상자성체이다.
상자성체(paramagnetic) 금속을 포함하는 코어를 가지는 나노입자의 예는 Mn+2, Gd+3, Eu+2, Cu+2, V+2, Co+2, Ni+2, Fe+2, Fe+3 및 란탄족원소+ 3를 포함하는 나노입자를 포함한다.
MnFe(스피넬 페라이트) 또는 CoFe(코발트 페라이트)와 같은 물질로부터 형성될 수 있는 다른 자성 나노입자는 상기 정의된 바와 같은 추가의 코어 물질의 첨가 없이 또는 이의 첨가와 함께 나노입자(자성 유액) 내로 형성될 수 있다. 이러한 나노입자를 생성하기 위한 자가-조립성 부착 화학반응의 예는 문헌 [Biotechnol. Prog., 19:1095-100 (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:9828-33 (2003), J. Colloid Interface Sci. 255:293-8 (2002)]에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노 입자 또는 이의 리간드는 검출가능한 표지를 포함한다. 표지는 나노입자 또는 리간드의 코어의 요소일 수 있다. 표지는 나노입자의 그 요소의 본래 특성 또는 검출가능한 추가적인 모이어티에 결합, 접합 또는 연관되기 때문에 검출가능할 수 있다. 표지의 바람직한 예는 형광성 그룹, 방사성핵종, 자성 표지 또는 염료인 표지를 포함한다. 형광성 그룹은 플루오레세인, 로다민 또는 테트라메틸 로다민, Texas-Red, Cy3, Cy5, 등을 포함하며, 형광성 표지의 여기 및 라만 분산 분광법을 사용해 방출된 빛을 검출함으로써 검출될 수 있다(Y.C. Cao, R. Jin, C. A. Mirkin, Science 2002, 297: 1536-1539).
일부 실시양태에서, 나노입자는 방사성핵종에 의해, 예를 들면 PET, SPECT를 사용함으로써, 방출된 방사성활성을 사용하는 나노입자를 검출하는데 사용하기 위해, 또는 요법을 위해, 즉 표적 세포를 사멸하기 위해, 방사성 핵종을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용을 위해 용이하게 조정될 수 있는 당해 분야에서 통상적으로 사용된 방사성핵종의 예는 TcO4 -이 가장 안정하다고 하더라도 다양한 산화 상태에서 존재하는 99 mTc; 32P 또는 33P; 57Co; 59Fe; Cu2 + 염으로서 흔히 사용되는 67Cu; Ga3 + 염으로서 흔히 사용되는 67Ga, 예컨대 시트르산 갈륨; 68Ge; 82Sr; 99Mo; 103Pd; In3 + 염으로서 일반적으로 사용되는 111In; 요오드 나트륨으로서 일반적으로 사용되는 125I 또는 131I; 137Cs; 153Gd; 153Sm; 158Au; 186Re; 염화 탈륨과 같은 Tl+ 염으로서 일반적으로 사용되는 201Tl; 39Y3 +; 71Lu3 +; 및 24Cr2 +을 포함한다. 표적 또는 추적자로서 방사성핵종의 일반적인 사용은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 측면 내에서 사용하기 위해 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다. 방사성핵종은 나노입자의 코어를 도핑(dope)시킴으로써 또는 나노입자 상에 고정된 리간드의 일부로서 존재하는 표지로서 코어를 포함함으로써 가장 쉽게 적용될 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명의 나노입자, 또는 다른 종과 이들의 상호작용의 결과물은 상기 나타낸 바와 같은 나노입자와 연관된 표지를 사용하거나 그들의 특성을 적용시킴으로써 당해 분야의 잘 알려진 많은 기술을 사용하여 검출될 수 있다. 나노입자를 검출하는 이들 방법은 예를 들면, 단순한 시각 검사에 의해 또는 빛 산란(나노입자를 함유하는 용액의 투과율)을 사용함으로써, 다른 종에 결합하는 경우 발생하는 응집을 검출하는 것부터, 나노입자를 시각화하기 위한 투과형 전자 현미경(TEM) 또는 원자력 현미경(AFM)와 같은 복잡한 기술을 사용하는 것까지 다양할 수 있다. 금속 입자를 검출하기 위한 추가적인 방법은 보통 광학 방사선에 의해 야기된, 금속의 표면에서 전자의 여기인 플라즈몬 공명을 적용하는 것이다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상은 금속(예컨대, Ag 또는 Au) 및 공기 또는 물과 같은 유전체 물질의 인터페이스에 존재한다. SPR에서 변화에 따라 분석물이 인터페이스의 굴절률을 변화시키는 나노입자의 표면 상에 고정된 리간드에 결합하는 것이 발생한다. SPR의 추가적인 장점은 실시간 상호작용을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다는 것이다. 상기 언급된 바와 같이, NMR 활성인 원자를 포함하거나 이로 도핑되면, 이 기술은 당해 기술분야에 잘 알려진 기술을 사용해, 시험관내 또는 생체내 둘 모두에서 입자를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 나노입자는 또한 은의 나노입자-촉진된 환원(I)을 사용하는 정량적 시그널 증폭에 기반한 시스템을 사용하여 검출될 수 있다. 형광 분광법은 나노입자가 형광 프로브로서 리간드를 포함하는 경우 사용될 수 있다. 또한, 탄수화물을 동위원소 표지시키는 것은 이의 검출을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.
투여 및 치료
본 발명의 나노입자-함유 백신 및 조성물은 장관 또는 비경구 경로를 포함하는, 임의의 수의 상이한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 비경구 투여는 다음의 경로에 의한 투여를 포함한다: 정맥, 피부 또는 피하, 비강, 근육내, 안구내, 상피, 복강내 및 국부(피부, 안구, 직장, 비강, 흡입, 및 에어로솔을 포함함), 및 직장 전신성 경로를 포함한다.
투여는 예를 들면, 주사에 의해, 또는 표피의 외층을 통해 그의 경피 통과를 가속화시키는 전달 건(gun)을 사용하여 탄도학적으로 수행될 수 있다. 그후, 나노입자는 예를 들면, 림프계를 통해 이동함에 따라 성숙하는 수지상 세포에 의해 취해져, 에피토프 펩티드가 유래되거나 일부분으로 형성되는 에피토프 펩티드 및/또는 항원에 대한 면역 반응 및 백신 접종의 조절을 유도하게 된다. 나노입자는 또한 에어로솔 내에서 전달될 수 있다. 이는 작은 크기의 나노입자에 의해 가능해진다.
본 발명의 나노입자의 특별히 작은 크기는 세포 및 조직에 전달하는데 큰 장점이 있는데, 표적 또는 치료적 분자에 연결되는 경우 조차도 세포에 의해 취해질 수 있기 때문이다. 따라서, 나노입자는 APC에 의해 내면화될 수 있으며, 에피토프 펩티드는 클래스 I MHC를 통해 처리되고 제시된다.
본 발명의 나노입자는 고체 또는 액체 조성물의 형태일 수 있는 약학 조성물로서 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 일부 종류의 담체, 예를 들면 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 애쥬번트 또는 비활성 희석제, 또는 물, 석유, 동물성 오일 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 일반적으로 적어도 0.1중량%의 화합물을 함유한다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서 주사의 경우, 유효 성분은 발열원 비함유이며 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태 내에 존재할 것이다. 당업자는 예를 들면, 화합물 또는 이의 유도체의 용액, 예컨대 생리학적 염수, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일로 제조된 분산액을 사용해 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다.
하나 이상의 화합물에 추가하여, 선택적으로 다른 유효 성분과 조합하여, 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 등장화제, 보존제 또는 항산화제 또는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 독성이 없어야 하며 유효 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 명확한 특성은 투여 경로, 예컨대 경구 또는 비경구에 따라 달라질 수 있다.
액체 약학 조성물은 전형적으로 약 3.0 내지 9.0, 더욱 바람직하게는 약 4.5 내지 8.5 및 더욱더 바람직하게는 약 5.0 내지 8.0의 pH를 갖도록 제형화된다. 조성물의 pH는 아세트산염, 시트르산염, 인산염, 석신산염, Tris 또는 히스티딘과 같은 완충제의 사용에 의해 유지될 수 있으며, 전형적으로 약 1 mM 내지 50 mM 범위 내에서 적용될 수 있다. 조성물의 pH는 다르게는 생리학적으로 허용가능한 산 또는 염기를 사용함으로써 조정될 수 있다.
보존제는 일반적으로 미생물 성장을 지연시키기 위해 약학 조성물에 포함되어, 조성물의 저장 수명을 연장시키고, 다수회 사용 포장을 가능하게 한다. 보존제의 예는 페놀, 메타-크레솔, 벤질 알코올, 파라-하이드록시벤조산 및 이의 에스테르, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 염화 벤잘코늄 및 염화 벤제토늄을 포함한다. 보존제는 전형적으로 약 0.1 내지 1.0 %(w/v) 범위 내에서 적용된다.
바람직하게는, 약학 조성물은 예방적 유효량 또는 치료적 유효량으로(경우에 따라, 예방이 요법인 것으로 고려될 수 있다고 하더라도) 개체에게 주어지며, 이는 개체에게 이점을 나타내기에 충분한 양이다. 전형적으로, 이는 개체에게 이점을 제공하는 치료적으로 유용한 활성을 야기하게 될 것이다. 투여되는 화합물의 실제량, 및 투여 속도 및 투여의 시간경과는 치료되는 상태의 성질 및 중증도에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예컨대 용량에 대한 결정 등은 일반의사 및 다른 의학 박사의 책임 범위 내이며, 전형적으로 치료되는 질병, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜은 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA); Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾을 수 있다. 예로써, 조성물은 바람직하게는 체중 kg 당 약 0.01 내지 100 mg의 활성 화합물, 더욱 바람직하게는 체중의 약 0.5 내지 100 mg/kg의 용량으로 환자에게 투여된다.
종양의 치료가 고려되는 경우, 치료는 환자에게서 종양의 효과를 완화시키기 위해 의사에 의해 선택되는 임의의 수단을 포함한다. 따라서, 종양의 완전한 경감이 바람직한 목표이긴 하지만, 효과적인 치료는 또한 전이를 포함하는 종양의 성장 속도를 감소시키는 것 뿐만 아니라 종양의 부분적인 경감을 달성할 수 있는 임의의 수단을 포함할 것이다. 이러한 수단은 삶의 질을 지속시키고/지속시키거나 강화시키고 질환의 증상을 완화시키는데 효과적일 수 있다.
면역요법
특허청구범위에서 정의된 바와 같은 백신과 같은 본 발명의 조성물은 암과 같은 질환의 예방 및 치료를 위해, 더욱 특히 면역요법을 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "백신접종"은 백신접종된 개체에 의해 외래물질(foreign)로서 인식되므로 적합한 제형에서 면역원성인 소량의 항원의 예컨대, 피하, 피내, 근육내, 경구 또는 비강내 경로를 통한 투여로 인해 특이적 면역 반응이 유도되는 활성 면역접종을 의미한다. 따라서 항원은 항원에 대하여 특이적 면역 반응을 조성하기 위한 면역 시스템을 대한 "촉발제(trigger)"로서 사용된다.
본 발명에 따라서, 백신접종은 치료적이거나 예방적일 수 있다. 예로써, 암을 앓지 않는 개체의 백신접종을 통해 암 질환의 발발에 대해 예방적 보호를 달성하는 것이 가능할 수 있다. 이러한 예방적 백신접종이 적용될 수 있는 개인에 대한 예는, 본 출원이 이러한 개체에 제한되지 않는다 하더라도, 암 질환을 발병할 위험이 증가한 개체이다. 암의 위험이 있는 환자는 일차성 종양 또는 전이로서 이미 발병한 암을 가질 수 있거나, 암에 대한 병인(predisposition)을 보일 수 있다.
본 발명에 따른 암 환자의 활성 면역접종의 경우, 나노 입자는 전형적으로 백신으로서 제형화된다. 바람직하게는, 이러한 약학 제제는, 예로써, 보조제, 완충제, 염 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 약학 제제는 예를 들면, 암 환자에서 전이 형성과 같은 암-연관 상태의 예방 및 요법을 위해 사용될 수 있다. 그렇게 하는 동안, 항원-제시 세포는 TAA에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 생체내 또는 또한 생체외에서 특이적으로 조절된다.
특이적 항원 또는 항원 조합에 의한 활성 면역접종의 경우, 보통 저농도, 예컨대 0.01　㎍ 내지 10　mg 범위인 면역원성 양 내이지만, 용량 범위는 100 내지 500 mg 범위까지 증가될 수 있는 면역원 - 천연 TAA 또는 그의 에피토프, 모방체 또는 네오에피토프 모방체 - 을 함유하는 백신 제형이 사용된다. 예를 들면, 외래물질 종의 서열에 의해 또는 유도체화에 의해 결정되는 백신접종 항원의 면역원성에 의존하거나, 또는 각각 사용된 보조 물질 또는 애쥬번트에 또한 의존하여, 적절한 면역원성 용량이 예를 들면, 0.01 ㎍ 내지 1 mg, 바람직하게는 100 ㎍ 내지 500 ㎍의 범위 내에서 선택될 수 있다. 그러나, 연장된 시간에 걸쳐 유기체로 전달되는 데포(depot) 백신은 또한 예를 들면, 적어도 1 mg 내지 100 mg 이상인 훨씬 많은 양의 백신접종 항원을 함유한다.
농도는 투여된 현탁된 백신 또는 액체의 양에 의존할 것이다. 백신은 보통 0.01 내지 1 ㎖, 바람직하게는 0.1 내지 0.75 ㎖ 범위의 부피를 갖는 즉시 사용 시린지 또는 앰플 중에 제공된다.
백신의 성분의 백신접종 항원은 바람직하게는 피하, 근육내 및 피내 또는 경피 투여에도 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 중에 존재한다. 추가적인 투여의 방식은 점막 경로, 예를 들면, 비강 또는 경구 투여에 의한 백신접종을 통해 기능한다. 고체 물질이 백신 제형에 대한 보조제로서 적용되는 경우, 보조제와 함께 백신 항원의 예를 들면, 흡착물질, 또는 현탁된 혼합물이 각각 투여될 것이다. 특정한 실시양태에서, 백신은 수성 용매 중에 용액 또는 액체 백신으로서 존재한다.
바람직하게는, 종양의 백신접종 유닛은 적합한 즉시 사용 시린지 또는 앰플에서 미리 제공된다. 백신의 안정한 제형은 즉시 사용 형태로 알맞게 상용화될 수 있다. 내약성이 개선된 티메로살 또는 다른 보존제와 같은 보존제의 함량이 필수적으로 요구되는 것은 아니라고 하더라도, 냉장 온도 내지 실온까지의 저장 온도에서 더 긴 안정성을 위해 제형 중에 제공될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 백신은 또한 동결 또는 냉동 건조된 형태 중에 제공될 수 있고, 요구되는 바에 따라, 각각 해동 또는 재구성될 수 있다.
본 발명에 따른 특정한 경우에서, 본 발명의 백신의 면역원성은 애쥬번트를 적용함으로써 증가될 수 있다. 본 목적을 위해, 고체 물질 또는 액체 백신 애쥬번트, 예를 들면 수산화 알루미늄(Alu-Gel) 또는 인산 알루미늄, 성장 인자, 림포카인, 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론, 또는 보체 인자, 예컨대 C3d, 추가적으로 리포솜 제제, 또는 이미 강한 면역 반응이 생성된 면역 시스템에 대한 추가적인 항원을 가진 제형, 예컨대 파상풍 톡소이드, 박테리아 톡신, 예컨대 슈도모나스(Pseudomonas) 엑소톡신, 및 지질 A 및 리포폴리사카라이드의 유도체가 사용된다.
특정한 경우에서는, 추가적인 애쥬번트가 사용되지 않으며, 특히 본 명세서에 기술된 실시예는 CTL 반응의 효과적인 생성이 임의의 추가된 애쥬번트 없이(참고: 일반적으로 하나 이상의 애쥬번트와 함께 투여된 유리 펩티드) 본 발명의 나노입자를 사용해 달성된다는 것을 보여준다. 이는 특정한 경우에 이로운 점이 많은데, 많은 애쥬번트가 독성이거나 다르게는 인간에 사용하기에 부적절하기 때문이다.
에피토프 펩티드
본 발명에 따른 특정의 바람직한 경우에서, 에피토프 펩티드는 하기 표 1에서 개시된 아미노산을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
특정한 경우에서, 에피토프 펩티드(들)은 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다:
VLVPVLVMV (서열번호 82);
KIYQWINEL (서열번호 29);
KLGEFAKVLEL (서열번호 33);
GMYGKIAVMEL (서열번호 19);
KLIPFLEKL (서열번호 34); 및
RLLEVPVML (서열번호 67).
하기의 내용은 예로써 제시되며 특허청구범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1 - 나노입자의 합성 및 특성화
시험 리간드 및 이의 식별 번호는 하기에 나타낸다(분자량);
SIINFEKL (963) (서열번호 87)
SIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1021)
FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1280) (서열번호 88)
FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1587) (서열번호 89)
AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (1325) (서열번호 90)
HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL (1051)
HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL (1309)
HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL (1616)
HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1356)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL (1471)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL (1732)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL (2034)
HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL (1774)
시험 NP는 10μ몰 염화 금(Aldrich 484385), 티오 에틸 링커(GlcC2)를 포함한 30μ몰 글루코스 및 1.5μ몰 펩티드 리간드(변수 1.5-3mg)를 사용해 합성하였다.
다음의 방법을 사용하였다: 1.5μ몰 펩티드를 2㎖ 메탄올 중에 용해시킨 후, 200㎕ 메탄올 중에 30μ몰 GlcC2를 첨가하고, 10μ몰 Au를 함유하는 116㎕의 수성 염화 금을 첨가하였다. 샘플을 30초 동안 와류시키고, 대략 5분 동안 흔들어 준 후, 총 30초 동안 빠르게 와류시키고, 200㎕의 1M NaBH4를 첨가하고, 튜브를 밀봉한 후 1.5시간 동안 살살 흔들었다.
샘플을 벤치(bench) 회전시키고, 상층액을 제거하고, 어두운 펠렛을 2㎖ 물 중에 용해시킨 후, 10kDa 비바스핀(vivaspin)으로 이동시켜 5 Krpm으로 각각 8분 동안 2㎖ 물로 총 4회 세척하였다. 나노입자(NP)를 비바스핀으로부터 제거하고 물과 함께 500㎕로 만든 후, 15 Krpm 벤치 회전으로 주입하여 임의의 큰 응집물을 제거하였다.
하우스 분석(house assay)에 의한 회전/생산 후 금 함량은 하기에 나타내며, 100% 수율은 1.97mg이다;
Figure pct00009
NP 3, 4 및 5는 거의 완전한 큰 응집을 보였으며, 이들 응집물에 DMSO를 첨가해도 이들 입자들이 가용화되지 않았다.
남아있는 NP 샘플을 재회전시켜 임의의 추가적인 응집물을 제거하고, 다음 분석, 구체적으로 금 및 펩티드 함량 분석을 위해 분할량(aliquot)을 취하였다. 하나의 분할량을 물을 포함해 500㎕로 만들고, 날짜를 매겨, 표지하고, 이들을 나중에 HLA 제시(presentation) 시험을 위해 사용하였다.
HLA 제시에 대한 이들 500㎕ 샘플의 최종 분석은 하기와 같이 나타냈다;
Figure pct00010
* BSA 표준
** 펩티드 표준
사용된 리간드 비율은 2 펩티드가 대략 100Au 원자의 각각의 NP에 이론적으로 부착되어야 했고, 상기 데이터는 대략 6-8 펩티드/100Au 원자를 제안한다. 이는 단순히 NP 결합 펩티드의 펩티드 측정을 위해 사용한 BCA 방법(및 BSA 표준)의 인공물 때문이거나 아마도 펩티드 리간드 부착때문일 수 있다.
펩티드 함량의 분석은 중요하기도 하고, 이 경우 복잡하며, BCA 방법을 사용하였다. 운이 없게도, 금 NP는 높은 uv/vis 흡광도를 보였으므로, 추가로 시험 샘플을 시험함으로써, NP의 분할량을 또한 물 중에서 측정하고, 물에 대해 블랭크(blank)하여 BCA 분석에서 사용된 파장 565 nm에서 이들의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 시험 샘플 BCA 분석 값의 대략 20%에 도달하였고, 개별적으로 보정하였다. 그러나, 이러한 보정은 BCA 분석에 적용된 펩티드 NP가 BCA 특이적 성분의 상부에서 유리 NP에 대해 나타난 동일한 흡광도를 여전히 유지할 것임을 추정한다. 이것은 순수한 금 NP에서 나타난 높은 소거 계수와 일치한다.
상기 표에서, *은 초기에 중량 기준으로 BSA 표준과 관련된 정량화를 나타내며, 다음에 펩티드 몰 기준으로 전환된다. ** 컬럼에서는, 개개의 펩티드 리간드를 표준으로서 사용하였다.
유리 형태 NP 결합 펩티드를 분해하기 위한 시도로 PBS 용출에 의한 Sephadex G-50을 사용하는 초기 분석은 일차적으로 NP6를 사용해 수행하였는데, 유리 리간드가 거의/전혀 NP 제제를 오염시키지 않음을 제안한다. 모든 NP 결합 리간드를 방출시키기 위해 요오드를 사용하였고, 요오드는 도 1의 경우 분획 16+에서 나타나기 시작했다.
그후, 요오드 처리 전과 후 더 큰 분획 크기 및 동량의 NP를 사용하였고, 요오드는 분획 10에서 피크를 갖는 펩티드 용출물을 방출하였는데, 이 물질은 표준 펩티드보다 더 적게 나타났는데 이는 후자가 산화된/이량체이기 때문이다. 개개의 보정은 또한 NP6로부터의 비 펩티드 흡광도에 대해 적용하였는데, 보정된 NP6 및 NP6+요오드에 대해 곡선 하부 거의 등가 면적을 수득하였다.
NP8 및 12의 생산
NP8 및 12는 상기 방법에 의해 성공적으로 생산하였으며, 하기 주어진 정량화는 결국 (총 제제의 60%)인 500㎕ 샘플이 이후에 사용되었음을 나타낸다;
Figure pct00011
*쿠마시 방법에 의해 결정
NP 2-5의 반복 생산
NP 2-5는 합성 단계에서 95%가 아닌 75% 메탄올을 사용해 변이에 의해 생산하였다. NP2는 이전과 같이 '정상' NP를 생산하였고, NP 3, 4 및 5는 이전과 같이 응집물을 형성하였는데, 이들 응집물은 물, 10% 아세트산, PBS, DMSO 또는 DMF 중에 가용성이 아니었지만, 300mM NaOH에서는 총 NP 가용화를 실제로 유도하였다.
추가적인 합성은 Sephadex G-50을 사용해 수행하여 임의의 유리 펩티드를 제거하였다. 이들 NP는 하기와 같은 변화를 제외하고는 주어 상기와 같이 만들었다:
유리 펩티드는 MeOH 중에 완전히 가용성이 아니므로, 2㎖ MeOH 외에도 100㎕ 물을 추가하고, 추가로 완전한 펩티드 가용화를 일으키는데 요구되는 P8의 경우 70㎕ 1MNaOH 및 P9의 경우 단지 20㎕ NaOH를 첨가하였다. NaOH는 NP 합성과 양립가능하며, 물 및 알칼리는 보로하이드리드 환원 후 최종 MeOH %를 NP8 및 NP9의 경우 각각 82 및 83.5%로 감소시켰다.
초기 회전 하강(spin down) 이후 환원 후이나 비바스핀 이전에, 추가의 세척 단계가 포함되며, 이는 2㎖ MeOH 및 100 ㎕의 1MNaCl로 수행하였다.
비바스핀 후, 각각의 제제의 절반을 PBS로 용출된 Sephadex G-50 컬럼에 주입하고, 분획을 수집하고 분할량을 BCA에 의해 단백질에 대해 측정하고, 주요 단백질성 피크의 기밀 풀(tight pool)을 풀링한 후, 용매 변화를 일으키기 위한 물 세척과 함께 비바스핀으로 재주입하였다.
단지 절반의 NP 제제가 G-5O을 통과하였고, 얻어진 프로파일 및 풀은 유리 펩티드가 본질적으로 없는 것을 확인하였다. NP 갈색 착색화는 분획 12까지 시각적으로 나타날 수 있었는데, 50ul 스톡 제제의 별개 시험은 동일한 조건 하에서 재수행하고, 515 nm 흡광도를 측정하고(Au NP를 검출할 것이지만, 유리 펩티드는 검출하지 않을 것임) NP가 G-50 컬럼에서 점차 사라지는 경우 표시한다.
풀링된 최종 물질은 하기 조성을 가졌다;
Figure pct00012
이론적인 값은 44 리간드/100Au, NP 형성 시점에서 2개 리간드 사이에 무작위 경쟁 및 Au 수율을 추정함으로써 결정하였다.
요오드를 사용한 NP 리간드 방출
완전한 리간드 방출을 유도하기 위해, NP9의 분할량을 4배 부피 과량의 1M KI와 혼합하고, 4일 동안 4℃에서 방치하였다. 4일 후, 물질을 원심분리하고, 맑은 상청액을 G-50에 통과시키고, 분획을 수집하고, BCA에 의해 분석하였다. 분석된 KI 후 NP9의 양은 NP9 단독의 경우 사용된 것에 정확히 2배였으며(1.1의 보정을 내부-분석 흡광도 차이에 대해 적용하였음), 면적은 거의 정확히 2:1인 것으로 밝혀졌는데, 이는 완전한 리간드 제거를 제안한다. 방출된 리간드의 양은 2개의 표준 펩티드 9 및 BSA와 함께 쿠마시 및 BCA의 2가지 분석을 사용해 정량화하였고, 하기에 표로 나타낸다.
Figure pct00013
표 안의 데이터는 전체 제제에 대한 총 기대 수율 이하로 보정하였다.
결론적으로, 펩티드-함유 NP가 합성되었다. 펩티드 NP는 단순히 Sephadex G-50 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 유리 펩티드를 필수적으로 오염시키지 않는다.
요오드를 성공적으로 사용하여 NP 결합 펩티드를 방출시키고, 정량적 수율 데이터를 수득하였다.
실시예 2 - 제시( presentation ) 분석의 평가
T 세포 수용체(TCR)는 T 림프구 표면에 존재하며 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 측면에서 펩티드를 인식한다(1). 일반적으로, 항원 제시 세포(APC)는 단백질을 처리하고 이를 빈 MHC로 운송하기 위한 장치를 함유한다. CD4+ T 세포가 MHC 클래스 II(MHCII)를 인식하는 반면, CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I(MHCI)에 반응한다. 통상적으로, MHCII 펩티드는 세포외부 환경의 엔도사이토스된(endocytosed) 성분으로부터 유래된다. 반면, MHCI는 세포내 공급원으로부터 처리된 펩티드를 로딩한다(1, 2).
SIINFEKL(서열번호 87), 즉 난백알부민(OVA)으로부터 유래된 펩티드 에피토프는 H-2Kb로 명명된 쥐 MHCI 대립형질의 측면에서 제시된다(3). OVA이 H-2Kb를 발현하는 쥐 세포에서 발현되는 경우, SIINFEKL(서열번호 87)은 통상적으로 제시된다. 그러나, OVA이 외인성으로 공급되는 경우, SIINFEKL은 MHCI 교차-제시로서 알려진 대안적인 처리에 의해 제시될 수 있다(4, 5). 실제로, OVA로 면역화된 일배체형-부합된(haplotype-matched) 마우스는 SIINFEKL(서열번호 87)에 대한 면역우세 반응을 생성한다.
그러므로, 통상적이고 대안적인 MHCI 제시에 대한 이해를 증진하고자 이 펩티드의 제시를 분석하기 위해 많은 시약을 개발하였다. 이들 시약은 나노입자 내의 펩티드의 잠재적인 화학적 결합을 이용한 실험에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 마우스 세포주에서 어떤 결합이 가장 용이하게 처리되는지를 밝혀낼 수 있다.
결과 및 논의
제시의 측정으로서의 유동세포 분석법
나노입자에 대한 에피토프 결합을 분석하기 위해, 본 발명자들은 우선 나노입자로부터 방출된 에피토프의 제시를 위한 판독출력(readout) 분석을 최적화하였다. 이를 위하여, LKb 세포 내의 SIINFEKL(서열번호 87) 제시를 평가하였다. 이전 언급한 바와 같이, 하나 이상의 시약이 존재한다. 시험한 두가지 방법 중에, 하나는 유동세포 분석법을 기반으로 하고, 다른 하나는 세포를 기반으로 한다. 유동세포 분석법 기반 방법은 다양한 양의 SIINFEKL(서열번호 87) 펩티드로 LKb 세포를 자극하는 것으로 시작한다. Kb 분자 표면에 펩티드가 결합할 수 있도록 충분한 시간을 준 후, 세포를 세척하고 SIINFEKL:Kb 복합체에 대해 특이적인 25.D1.16 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 다음으로, 세포를 2차 표지하고, 배경 판독으로서 비자극된 세포를 사용하는 세포유동 분석법으로 적용시켰다. 이 방법은 세포가 최소 5 ng/㎖로 자극된 경우 표면 복합체를 검출하였음을 확인하였다.
항원 제시의 측정으로서 T 세포 활성화
에피토프-특이적 항원 제시의 다른 형태는 MHCI 펩티드 복합체에 의한 T 세포 활성화의 측정이다. 여기서, 본 발명자들은 Kb의 측면에서 SIINFEKL(서열번호 87)을 인식하는 B3Z(T 세포주에 특이적인 OVA 펩티드)를 사용하였다. 편리한 수단으로서, 이 T 세포주는 NFAT 프로모터와 함께 클로닝된 β-갈락토시다제를 함유한다. 펩티드 인식 및 T 세포 활성화 시, β-갈락토시다제는 발현되고 검출가능한 기질의 전환은 T 세포에 대한 항원 제시의 훌륭한 수단으로서 작용한다.
본 방법을 평가하기 위해, 본 발명자들은 상기와 같은 유사한 실험을 수행하였다. LKb 세포를 SIINFEKL 펩티드로 자극하고, 세척한 후, 밤새 B3Z T 세포주로 공동-인큐베이션시켰다. 다음날, 세포를 용해시키고, β-갈락토시다제를 발광성 기질을 사용해 측정하였다. 예상한 바와 같이, 본 발명의 분해능은 대략 5 ng/㎖의 검출 한계를 갖는 이전 방법과 유사하였다.
그러므로, 양 방법은 대략 동일한 분해능을 나타내고 나노입자-펩티드 작제물의 평가에서 사용하기 위해 선택하였다.
재료 및 방법
세포주
LKb 세포는 마우스 섬유아세포이며 일차 세포주를 사용하였다. 구체적으로 쥐 H-2Kb 분자를 안정하게 발현하는 L929 세포이다.
합성 펩티드
합성 SIINFEKL(OVA 257-264)(서열번호 87) 펩티드는 Genscript USA(Piscataway, NJ)로부터 구입하였다. 펩티드는 DMSO 중에 5mg/mL로 재현탁시키고, 도면에서 나타낸 농도에서 세포 상으로 자극시켰다.
T 세포 하이브리도마
SIINFEKL:Kb-특이적 T 하이브리도마(B3Z)는 펩티드-MHC 클래스 I 복합체의 인식 시 β-갈락토시다제를 발현하며, 이전에 기술되었다(3, 6). T 세포 하이브리도마는 완전 RPMI에 더하여 10% FCS 및 0.05 mM 2-ME에서 유지하였다. 제조자의 설명서에 따라 발광성 기질 Galactolight Plus(Applied Biosystems, Foster City, CA) 을 사용해 활성화를 측정하였다. 빛 강도는 TopCount NXT 플레이트 판독기(Perkin Elmer, Waltham, MA)를 사용해 측정하였다.
유동세포 분석법
LKb 세포는 다양한 양의 SIINFEKL(서열번호 87) 펩티드로 처리하였다. 2시간 인큐베이션시킨 후, 세포를 수집하고, PBS로 1회 세척한 후, 얼음 상에서 25.D1.16 배양 상청액(H-2Kb에 복합된 SIINFEKL에 대해 특이적인 모노클론 항체)(7)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그후 세포를 PBS 중에 2회 세척하고, FITC-표지된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Caltag Laboratories, Burlingham, CA)와 함께 얼음상에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 최종적으로, 세포를 PBS로 2회 세척하고, Guava EasyCyte Plus Flow Cytometer(Millipore, Billerica, MA) 상에서 유동세포 분석법을 위해 PBS+.1% BSA 중에 재현탁시키고 수반하는 소프트웨어를 사용해 분석하였다.
항원 제시 분석
유동세포 분석법 또는 세포-기반 방법을 사용해 SIINFEKL(서열번호 87) 제시를 분석하기 위해, 본 발명자들은 2시간 동안 37℃에서 15mL 원뿔 중에 LKb 세포를 자극하였다. 이 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 1회 세척한 후, 유동세포 분석법을 사용해 검출하기 위해 적용하거나 1:1의 작용기 대 표적 비율로 B3Z 세포에 첨가하였다.
참조문헌
1. Vyas, J. M., A. G. Van der Veen, and H. L. Ploegh. 2008. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature reviews 8:607-618.
2. Hansen, T. H., and M. Bouvier. 2009. MHC class I antigen presentation: learning from viral evasion strategies. Nature reviews 9:503-513.
3. Shastri, N., and F. Gonzalez. 1993. Endogenous generation and presentation of the ovalbumin peptide/Kb complex to T cells. Journal of Immunology 150:2724-2736.
4. Amigorena, S., and A. Savina. 2010. Intracellular mechanisms of antigen cross presentation in dendritic cells. Current opinion in immunology 22:109-117.
5. Blanchard, N., and N. Shastri. 2010. Cross-presentation of peptides from intracellular pathogens by MHC class I molecules. Annals of the New York Academy of Sciences 1183:237-250.
6. Tewari, M. K., G. Sinnathamby, D. Rajagopal, and L. C. Eisenlohr. 2005. A cytosolic pathway for MHC class II-restricted antigen processing that is proteasome and TAP dependent. Nature immunology 6:287-294.
7. Porgador, A., J. W. Yewdell, Y. Deng, J. R. Bennink, and R. N. Germain. 1997. Localization, quantitation, and in situ detection of specific peptide-MHC class I complexes using a monoclonal antibody. Immunity 6:715-726.
실시예 3 - 나노입자-펩티드 제시 분석
하기 나열된 시험 리간드를 작제하고, 상기 기술된 링커 화학 반응에 의해 금 나노입자(GNP)에 부착하였다.
1. SIINFEKL (서열번호 87)
2. SIINFEKL-N-(CH2)2-SH
3. FLSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (서열번호 88)
4. FLAAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (서열번호 89)
5. AAYSIINFEKL-N-(CH2)2-SH (서열번호 90)
6. HS(CH2)2-CONH-SIINFEKL
7. HS(CH2)2-CONH-FLSIINFEKL
8. HS(CH2)2-CONH-FLAAYSIINFEKL
9. HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL
10. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-SIINFEKL
11. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLSIINFEKL
12. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYSIINFEKL
13. HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYSIINFEKL
쥐 MHCI 분자 H-2Kb의 측면에서 제시된 난백알부민으로부터 유래된 에피토프인 SIINFEKL(서열번호 87)을 2가지 방법을 사용해 측정하였다. 첫번째 방법은 SIINFEKL/MHCI 복합체를 인식하는 "Angel"로서도 지칭된, 25.D1.16로 명명된 TCR-유사 항체를 사용하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 활성화될 때 빛 방출 기질에 의해 측정된 베타-gal을 발현하는, NFAT(CTL 시그널링 분자) 프로모터 하에 베타-갈락토시다제를 발현하는 B3Z, SIINFEKL(서열번호 87) 펩티드 특이적 CTL 하이브리도마를 사용해 제시를 평가하였다.
A. GNP의 분석
GNP와 연관된 SIINFEKL(서열번호 87)을 처리 및 제시하기 위한 세포의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 L-Kb 쥐 섬유아세포를 사용하였다. 도 1에서 증명된 바와 같이, GNP 8, 9, 12, 및 13은 훌륭한 처리 및 제시를 나타냈다. 이는 유동세포 분석법(도 1A-D - 처리) 및 CTL-기반 방법(도 1E - 제시) 둘 모두에 대한 경우인 것을 확인하였다. 따라서, FLAAYSIINFEKL(서열번호 89) 및 AAYSIINFEKL(서열번호 90)은 우수한 시험관내 SIINFEKL (서열번호 87) 처리를 나타냈다(밑줄 친 부분은 링커의 펩티드 부분을 나타냄). 또한, 1E에서 도시한 바와 같이, HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH 화학반응은 HS(CH2)2-CONH 보다 더 잘 처리된 것을 확인하였다. 그러나, HS(CH2)2-CONH은 여전히 아주 효율적으로 처리된 것을 확인하였다. 추가적으로, 본 발명자들은 0.01 ㎍/㎖에서 검출되지 않는 제시의 용량-의존적 감소를 언급한다.
B. 유리 펩티드의 분석
나노입자 샘플에 존재하는 임의의 유리 펩티드의 가능한 영향을 고려하는 것이 중요했다(도 2A-B). 그러므로, 본 발명자들은 각각의 제제로부터의 상응하는 유리 펩티드가 얼마나 효율적으로 제시되는지 평가하였다. 이전 실험과 유사하게, LKb 세포를 2시간 동안 3가지 농도의 GNP 또는 유리 펩티드로 자극하였다. 제시는 유동세포 분석법(도 2C-F) 또는 B3Z 분석(도 2G-H)에 의해 평가하였다. 이들 결과로부터, 본 발명자들은 유리 펩티드가 잘 제시되었음을 추론하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 이들 유리 펩티드의 제시를 위해 처리가 필요한지 여부를 시험하고자 하였다. 시험은 37℃와 비교해 얼음 상에서 펩티드를 자극하는 것을 필요로 한다. 37℃에서는, 세포는 펩티드를 취할 수 있고 엔도좀 내로 펩티드를 처리하지만, 얼음 상에서는, 펩티드는 단지 처리없이 표면 상에 운송될 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 링커를 포함하는 유리 펩티드는 일반적으로 처리가 필요하지만, 링커를 포함하지 않는 펩티드는 임의의 처리 없이 제시될 수 있음을 관찰하였다(도 2I-N).
C. 유리 펩티드가 없는 제제의 분석
유리 펩티드를 오염시키는 가능한 영향을 증명하는 결과를 고려하여, 정제된 제제를 만들었다. 정제는 모든 유리 펩티드를 제거하는 Sephadex G-50 컬럼을 사용하여 GNP(8 및 9) 상에서 수행하였다(도 3A-B). 마지막으로, 상기 실험을 동일한 분석에서 이전 및 새로운 제제를 사용해 반복하였다. 본 발명자들은 2시간의 인큐베이션을 밤새 기간으로 연장하였는데, 이는 SIINFEKL 제시를 위해 충분한 것으로 나타났다(데이터 도시하지 않음). 유동세포 분석법 분석시에는, 본 발명자들은 유리 펩티드가 없는 샘플이 펩티드를 함유하는 것 만큼 잘 작용함을 관찰하였다(도 3C-E). 다음으로, 이들 결과를 B3Z 분석을 사용해 확인하였다(도 3F). 그러므로, GNP 8 및 9가 MHCI의 제시를 위한 항원 제시 세포에 대한 펩티드 전달을 위한 실현가능한 선택사항으로 작용함이 분명하다.
D. 결론
·GNP 8, 9, 12 및 13은 다른 것들과 비교할 때 매우 잘 처리되고 제시되었다.
·이는 시험관내 SIINFEKL(서열번호 87) 제시의 경우 최상인 서열 FLAAYSIINFEKL(서열번호 89) 및 AAYSIINFEKL(서열번호 90)에 상응한다(링커의 펩티드 부분은 밑줄로 나타냄).
·HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH 화학반응은 HS(CH2)2-CONH 보다 더 잘 처리된다. 그러나, HS(CH2)2-CONH은 또한 비용면에서 더 효과적이면서 매우 잘 처리된다.
·유리 펩티드를 오염시키는 것은 제시를 야기할 수 있다.
·유리 펩티드가 없는 새로운 제제도 잘 처리되고 제시된다.
·이는 GNP 8 및 9가 SIINFEKL(서열번호 87)의 제시를 위해 잘 처리됨을 제안한다.
실시예 4 - 나노입자에 의해 전달된 폐암 항원은 생체내에서 종양 특이적 면역 반응을 생성한다
나노입자-펩티드 작제물의 합성
시험 리간드 및 이의 식별 번호는 하기에 나타낸다(분자량, 친수성 점수);
1. L1 HS(CH2)2-CONH-AAYVLVPVLVMV (1463, -1.3) (서열번호 92)
2. L2 HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL (1601, -0.7) (서열번호 93)
3. L3 HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL (1641, -0.1) (서열번호 94)
4. L4 HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL (1605, -0.6) (서열번호 95)
5. L5 HS(CH2)2-CONH-AAYKLIPFLEKL (1495, -0.3) (서열번호 96)
6. L6 HS(CH2)2-CONH-AAYRLLEVPVML (1463, -0.6) (서열번호 97)
7. P9 HS(CH2)2-CONH-AAYSIINFEKL (1462, -0.4) (서열번호 98)
시험 NP는 10μ몰 염화 금(Aldrich 484385), 티오 에틸 링커(GlcC2)를 포함한 30μ몰 글루코스 및 1.5μ몰 펩티드 리간드(변수 2.0-2.5mg)를 사용해 합성하였다.
다음의 방법을 사용하였다: 1.5μ몰 펩티드를 2㎖ 메탄올 중에 용해시킨 후, 200㎕ 메탄올 중에 30μ몰 GlcC2를 첨가하고, 10μ몰 Au를 함유하는 116㎕의 수성 염화 금을 첨가하였다. 샘플을 30초 동안 와류시키고, 대략 5분 동안 흔들어 준 후, 총 30초 동안 빠르게 와류시키고, 200㎕의 1M NaBH4를 첨가하고, 튜브를 밀봉한 후 1.5시간 동안 살살 흔들었다.
샘플을 벤치 회전시키고, 상청액을 제거하고, 재현탁된 어두운 펠렛을 1㎖ 95% MeOH/물 중에 용해시키고, 와류시킨 후, 재원심분리하였다. 상청액을 다시 제거하고, NP를 물 중에 용해시킨 후, 미리세척한 10kDa 비바스핀으로 옮겨, 5Krpm에서 각각 8분 동안 2㎖ 물로 총 4회 세척하였다. NP를 비바스핀으로부터 제거하고 물과 함께 600㎕로 만든 후, 15Krpm 벤치 스핀으로 주입하여 임의의 큰 응집물을 제거하였다.
회전/생산 후 금 함량은 하기에 나타내며 100% 수율은 2.17mg이다(분석에 의해 결정됨);
Figure pct00014
메탄올 중 일부 리간드의 가용성은, 특히 1 및 4의 경우, 열등하였지만, L1이 여전히 일부 용해되지 않은 펩티드 물질을 가졌음에도 불구하고, 산성 염화 금의 추가로 인해 더 맑은 용액이 일반적으로 수득되었다. 모든 NP는 회전 하강하지 못한 어느 정도의 응집물을 가졌는데, 이들은 제거되고, 46.5 내지 79.3%의 최종의 더 낮은 Au 수율을 설명한다.
이러한 일련의 NP는 유리 펩티드 감염을 감소시키기 위해 생산 후 추가의 세척 단계를 거쳤다.
BCA 분석을 사용하여 NP에 부착된 펩티드 물질을 정량화하고, 데이터는 하기에 나타내며, 모든 샘플/표준은 3가지 측정의 평균으로서 나타낸다;
BCA 데이터 블랭크 보정된 표준
BSA 2 ㎍ 0.165
BSA 4 ㎍ 0.311
BSA 8 ㎍ 0.566
L2 1.92 ㎍ 0.209
L3 2.14 ㎍ 0.159
L4 2.40 ㎍ 0.300
L5 2.14 ㎍ 0.151
Figure pct00015
*이 보정은 NP가 565nm에서 일부 흡광도를 가짐으로써 적용된다.
**샘플 L1, L6 및 NP9는 2㎍ BSA 표준(std)을 사용해 정량화하였는데, 낮은 수준에서 이들 펩티드가 이 분석에서 사용된 PBS 중에 불가용성이기 때문이다. 남아있는 4개의 NP는 그의 개별 유리 펩티드 표준을 사용하였다. 분석은 1㎕ 동량, 600㎕ 총 prep 크기로 수행하였다.
차후 시험에서 사용된 물질을 하기 표에 나타내며, 모든 값은 mg/㎖로서 나타낸다.
Figure pct00016

규모 확대 배치( scaled - up batch )의 합성
시험 리간드 및 이의 식별 번호는 하기에 나타낸다(분자량, 친수성 점수);
1. L2 HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL (1601, -0.7) (서열번호 93)
2. L3 HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL (1641, -0.1) (서열번호 94)
3. L4 HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL (1605, -0.6) (서열번호 95)
4. Glc
시험 NP는 상기 기술된 바와 같지만, 3배 더 큰 규모에서, 30μ몰 염화 금(Aldrich 484385), 티오 에틸 링커(GlcC2)를 포함한 90μ몰 글루코스 및 4.5μ몰 펩티드 리간드(변수 7.2-7.5mg)를 사용해 합성하였다.
다음의 방법을 사용하였다; 4.5μ몰 펩티드를 6㎖ 메탄올 중에 용해시키고, 이어서 600㎕ 메탄올 중에 90μ몰 GlcC2를 첨가하고, 30μ몰의 Au를 함유하는 348㎕의 수성 염화 금을 첨가하고, 50㎖ 플라스틱 팔콘(falcon)을 반응 용기로서 사용하였다. 샘플을 30초 동안 와류시키고, 대략 5분 동안 흔들어준 후, 가능한 한 빠른 와류하에서 총 30초 동안 600㎕의 1M NaBH4를 첨가하고, 튜브를 밀봉한 후, 1.5 시간 동안 살살 흔들었다.
샘플을 벤치 회전시키고, 상청액을 제거하고, 재현탁된 어두운 펠렛을 1㎖ 95% MeOH/물 중에 용해시키고, 와류시킨 후, 재원심분리하였다. 상청액을 다시 제거하고, NP를 물 중에 용해시킨 후, 미리세척한 10kDa 비바스핀으로 옮겨, 5Krpm에서 각각 8분 동안 2㎖ 물로 총 4회 세척하였다. NP를 비바스핀으로부터 제거하고 물과 함께 1㎖로 만든 후, 15Krpm 벤치 스핀으로 주입하고, 그후 새로운 튜브로 옮겨 임의의 큰 응집물을 제거하였다.
회전/생산 후 금 함량은 하기에 나타내며 100% 수율은 5.91mg이다(분석에 의해 결정됨);
Figure pct00017
모든 NP는 회전 하강하지 못한 어느 정도의 응집물을 가졌는데, 이들은 제거되고, 대략 75%의 최종의 Au 수율을 설명한다.
이러한 일련의 NP는 유리 펩티드 감염을 감소시키기 위해 생산 후 추가의 세척 단계를 거쳤다.
BCA 분석을 사용하여 NP에 부착된 펩티드 물질을 정량화하고, 데이터는 하기에 나타내며, 모든 샘플/표준은 3가지 측정의 평균으로서 나타낸다;
BCA 데이터 블랭크 보정된 표준
BSA 2 ㎍ 0.138
BSA 4 ㎍ 0.260
Figure pct00018
*이 보정은 NP가 565nm에서 일부 흡광도를 가짐으로써 적용된다.
**샘플은 2 g BSA 표준을 사용해 정량화하고, 분석은 0.5㎕, 대략 1㎖ 총 prep 크기로 수행하였다.
면역접종 방법론
인간 HLA 형질전환 마우스는 부착된 폐암 항원 에피토프 펩티드(상기 기술된 바와 같이 합성됨)를 갖는 금 나노입자(GNP)로 면역접종시켰다. CTL은 펩티드-부하된 표적(T2) 및 폐 종양 세포(Lung T1 = SCLC; Lung T2 = NSCLC; Lung T3 = 선암)에 대해 분석하였다. 대조군은 항원 비자극된 T2 및 N lung = 정상 폐 세포였다.
면역접종 스케쥴은 10일 간격으로 3회 면역접종(부분적 i.d. 및 부분적 s.c.)으로 구성하였고, 마지막 면역접종 후 8일째 비장을 꺼낸 후 분석하였다. GNP는 첨가된 애쥬번트가 없었지만, 유리 펩티드는 면역접종을 위해 몬타니드(montanide) 애쥬번트(불완전 프로인트 애쥬번트)와 함께 혼합하였다. 생체내 연구의 경우, 주사 당 10 ㎍/마우스를 사용하였다. 유리 펩티드는 동일한 농도로 사용하였다.
CTL 반응은 백만개 비장세포 당 IFN-감마 생산성 세포의 수에 의해 측정하였다.
폐암 항원들
Figure pct00019

면역접종 결과 및 결론
도 4는 백만개 비장세포 당 IFN-감마 생산성 세포의 수에 의해 측정된 CTL 반응의 결과를 보여준다. 폐암 항원은 생체내에서 종양-특이적 면역 반응을 생성하는 것으로 밝혀진 GNP 상에 존재한다.
도 5는 풀링된 GNP로 면역접종 후 백만개 비장세포 당 IFN-감마 생산성 세포의 수에 의해 측정된 CTL 반응의 결과를 보여주며, 풀은 3개의 상이한 폐암 항원(GMY, KLG 및 KIY로 칭명됨)을 갖는 나노입자를 포함한다.
GMY는 하기 리간드를 갖는 GNP를 나타낸다:
HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL(서열번호 95)
KLG는 하기 리간드를 갖는 GNP를 나타낸다:
HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL(서열번호 94)
KIY는 하기 리간드를 갖는 GNP를 나타낸다:
HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL(서열번호 93)
유리 펩티드 대조군은 링커 및 GNP("풀링된 유리 펩티드")가 부재하는 동일한 3개의 에피토프 펩티드의 풀로 구성된다.
도 5에서 나타낸 바와 같이, 종양 특이적 CTL 반응은 풀링된 유리 펩티드 대조군과 비교할 때 GNP 면역접종된 마우스에서 현저히 더 높았다. 펩티드 자극된 표적 반응은 비교할만 한 것으로 밝혀졌다. 임의의 이론에 의해 구속받고자 함 없이, GNP-결합된 펩티드는 유리 펩티드와 비교해 높은 항원항체결합력 CTL을 자극할 수 있다고 현재 여겨지고 있다.
높은 항원항체결합력 종양 특이적 T 세포 반응에 대한 필요조건은 서브도미넌트(subdominant) 에피토프(중등 및 저 MHC 결합 친화성)가 높은 항원항체결합력 CTL을 생성하는데 더욱 효과적임을 나타낸다. 본 명세서에서 시험된 에티토프는 천연적으로 존재하며, 중등 및/또는 저 친화성 에피토프인 경향이 있다. APC에 표적되는 것으로 고려되는 NP에서 저 농도의 서브도미넌트 에피토프의 조합 때문에, 본 발명의 결과는 높은 항원항체결합력 CTL의 생성을 제안한다.
인간 PBMC 시험관내 분석 결과 및 결론
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 6개 폐암 항원(VLV, KIY, KLG, GMY, KLI 및 RLL로 칭명됨)의 풀을 함유하는 GNP로 자극하였다. 이들 명칭은 하기의 부착된 리간드를 갖는 GNP와 상응한다(명칭에 상응하는 밑줄쳐진 부분):
HS(CH2)2-CONH-AAYVLVPVLVMV (서열번호 92)
HS(CH2)2-CONH-AAYKIYQWINEL (서열번호 93)
HS(CH2)2-CONH-AAYKLGEFAKVLEL (서열번호 94)
HS(CH2)2-CONH-AAYGMYGKIAVMEL (서열번호 95)
HS(CH2)2-CONH-AAYKLIPFLEKL (서열번호 96)
HS(CH2)2-CONH-AAYRLLEVPVML (서열번호 97)
사용된 GNP-펩티드 용량은 10㎍/㎖/천만개 세포이다.
풀링된 유리 펩티드는 50㎍/㎖/천만개 세포의 용량으로 대조군으로서 사용하였다.
도 6에서 나타낸 바와 같이, 종양 특이적이며 펩티드 자극된 표적 CTL 반응은 GNP 자극된 PBMC에서 현저히 더 높았다. 이것은 시험관내에서 GNP가 종양 특이적 면역 반응을 생성하는 것을 통해 폐암 항원이 전달되었음을 보여준다.
실시예 5 - 상이한 나노입자 코로나의 비교
다양한 코로나를 갖는 NP의 합성:
2.25μ몰의 펩티드를 3㎖ 메탄올 중에 용해시키고(3개의 개별 폐 기반 펩티드 항원이 시험됨 + 블랭크), 이어서 300㎕ 중에 45μ몰 GlcC2(C2 링커를 갖는 글루코스)를 첨가하고, 15μ몰 Au를 함유하는 100㎕의 수성 염화 금을 첨가하였다. 샘플을 30초 동안 와류시키고, 대략 5분 동안 흔들어준 후, 총 30초 동안 빠르게 와류시키고, 300㎕의 1M NaBH4를 첨가하고, 튜브를 밀봉한 후, 1.5 시간 동안 가볍게 흔들어주었다.
샘플를 벤치 회전시켜 상청액을 제거하고, 어두운 펠렛을 1 ㎖ 90% MeOH/물 중에 재현탁시키고, 와류시킨 후, 재원심분리하였다. 상청액을 다시 제거한 후, 추가의 90% MeOH/물 세척을 수행하였다. 최종 NP 펠렛을 물 중에 용해시킨 후, 미리세척한 10kDa 비바스핀으로 이동시키고, 4k g에서 각각 8분 동안 총 4회 동안 2 ㎖ 물 세척하였다. NP를 물로 비바스핀으로부터 제거한 후, 18k g 벤치 회전으로 주입하여 임의의 큰 응집물을 제거하였다. 샘플을 물 중에 최종 부피 1 ㎖로 만들었다.금 함량을 측정하고, CN 처리 전과 후 둘 모두에서 C18 HPLC에 의한 차이를 통해 펩티드 함량을 측정하였다.
이 기본 방법은 하기의 코로나 변형으로 2회 이상 수행하였다;
i. 모든 3개의 펩티드 제제 + 대조군에 대해 45μ몰 GlcC2 대신에, 33.75μ몰 GlcC2 및 11.25μmole GlcNAcC2(C2 링커를 갖는 N-아세틸글루코사민)을 사용하였다.
ii. 모든 3개의 펩티드 제제 + 대조군에 대해 45μ몰 GlcC2 대신에, 4.5μ몰 GlcC2 및 40.5μ몰 글루타티온을 사용하였고, 글루타티온은 가용화를 위해 더 높은 물 비율을 필요로 하였다(25/75%).
그러므로 하기에 "GlcNAc"로 칭명된 나노입자는 글루코스-함유 및 N-아세틸글루코사민-함유 리간드 둘 모두를 갖는 코로나를 포함한다.
그러므로 하기에 "GSH"로 칭명된 나노입자는 글루코스-함유 및 글루타티온 리간드 둘 모두를 갖는 코로나를 포함한다. 글루타티온(GSH)은 세포 산화 상태를 조절하기 위해 사용된 완전히 천연인 트리펩티드이고, 이는 또한 비용-효율적이며, 글루코스-함유 리간드의 코로나에 의해 제공된 높은 수용성와 유사한 방식으로 나노입자에 대해 높은 수용성을 제공하는 하전된 표면을 제공한다. 하기 "GSH"로 칭명된 나노입자는 또한 글루코스 C2 리간드를 포함하고, 임의의 이론에 의해 구속받고자 함 없이, 본 발명자들은 GSH가 C2Glc에 대한 필요조건을 완전히 대체할 수 있을 것으로 믿는다.
HLA-A2 형질전환 마우스 모델 연구:
HLA-A2 형질전환 마우스 모델에서 생체내 CTL의 활성화에 대해 폐 항원(KIY, KLG, GMY)을 Glc, GlcNAc, GSH 코로나를 갖는 NP에서 시험하였다.
상기한 바와 같이, 명칭 "KIY", "KLG" 및 "GMY"는 하기와 상응한다:
각각,
HS(CH2)3-CONH-AAYKIYQWINEL (서열번호 93)
HS(CH2)3-CONH-AAYKLGEFAKVLEL (서열번호 94)
HS(CH2)3-CONH-AAYGMYGKIAVMEL (서열번호 95).
이 실시예에서 C3 (프로필) 링커는 리간드의 비-펩티드 부분으로서 적용된 반면, AAY는 에피토프 펩티드인 링커의 펩티드 부분; 각각 KIYQWINEL(서열번호 29), KLGEFAKVLEL(서열번호 33) 및 GMYGKIAVMEL(서열번호 19)로서 적용되었음을 언급한다.
각각 Glc, GlcNAc, GSH 코로나를 갖는 NP 중에 풀링된 3개의 폐 펩티드(KIY, KLG, GMY), 또는 유리 풀링된 펩티드+몬타니드를 마우스를 면역접종하기 위해 사용하였다. 유리 펩티드는 AAY 링커 부분의 부재하에서 사용하였는데, 즉, 유리 펩티드는 KIYQWINEL(서열번호 29), KLGEFAKVLEL(서열번호 33) 및 GMYGKIAVMEL(서열번호 19)이었다.
3회 면역접종 후, 비장세포를 IFN-감마 ELISpot 분석에서 펩티드 및 폐 종양 특이적 CTL에 대해 평가하고 유동세포계수법에 의해 CD107a 탈과립화를 평가하였다.
면역접종된 마우스로부터의 비장세포를 다양한 표적 세포(T2 - 빈 HLA-A2+ 세포, N lung - HLA-A2+ 정상 폐, HLA-A2+ 폐 종양 세포 - H522, 5865, 5944)와 혼합하여 ELISpot 분석에서 IFN-감마 분비를 측정하였다. 도 7A 및 7B에서 나타낸 데이터는 CTL이 NP 중에 모든 3개의 코로나에 의해 활성화되었음을 나타낸다. 그러나, 펩티드 특이적 활성화는 GlcNAc NP 면역접종된 마우스에서 더 높았다. 중요하게, 모든 3개의 코로나는 종양 특이적 반응의 등가 수준을 유도하였다. 임의의 애쥬번트가 없는 펩티드-부하된 NP는 몬타니드-51 애쥬번트를 갖는 유리 펩티드에 비해 같거나 더 높은 반응을 유도하였다.
항원 특이적 활성화 마커(CD8/CD107a) 분석
IFN-감마 반응에 추가하여, 항원 특이적 CTL 탈과립 마커 CD107a 분석은 펩티드 부하된 T2 세포 뿐만 아니라 폐 종양 세포에 대하여 비장세포에서 평가하였다.
도 8A-8D에서 나타낸 데이터는 임의의 애쥬번트 없이 모든 3개의 코로나를 갖는 NP가 유리 펩티드+몬타니드-51 애쥬번트에 반대되는 바와 같이 활성 항원 특이적 CTL을 유도하였음을 나타낸다. 더욱 중요하게는, 펩티드-부하된 NP는 애쥬번트를 갖는 유리 펩티드에 비해 더 높은 종양 특이적 CTL 활성화를 유도하였다. 코로나들 중에, GSH는 Glc 및 GlcNAc와 비교하는 경우 더 높은 CTL 활성화를 유도하였다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함되며, 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허 출원은 그 전체가 참조로서 포함되도록 구체적이며 개별적으로 명시된 바와 같이 동일한 정도로 모든 목적을 위해 포함된다.
본 명세서에 기술된 구체적 실시양태는 제한 목적이 아니라, 예시 목적으로 제공된다. 임의의 본 명세서의 하부-제목은 단지 편의상 포함되며, 어떠한 경우에도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
<110> Midatech Limited Immunotope, Inc. <120> Nanoparticle Tumour Vaccines <130> IPA140290-GB <150> US 61/531,730 <151> 2011-09-07 <160> 99 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Glu Tyr Asp Asn Phe Phe Gln His Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Leu Ile Leu Glu Pro Ser Leu Tyr Thr Val 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Leu Leu Gly Leu Asp Ala Val Gln Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Asp Val Pro Glu Arg Gly Leu Ile 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ile Asn Thr Asp Gly Ala Val Asn Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Asp Leu Asp Pro Glu Ala Val Arg Gly Ala Leu 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Pro Phe Ala Phe Ile His Lys Ile 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Gln Phe Gln Lys Val Leu Ser Leu 1 5 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens 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29 Lys Ile Tyr Gln Trp Ile Asn Glu Leu 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Lys Leu Ala Asp Met Leu Thr Glu Ile Thr Leu 1 5 10 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Lys Leu Phe Asp Ile Arg Pro Ile Trp 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Lys Leu Phe Ile Gly Gly Leu Ser Phe 1 5 <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Lys Leu Gly Glu Phe Ala Lys Val Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Lys Leu Ile Pro Phe Leu Glu Lys Leu 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Lys Leu Asn Glu Ile Asn Glu Lys Ile 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Lys Leu Ser Leu Val Ala Ala Met Leu 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Lys Leu Thr Ser Thr Val Met Leu Trp 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Lys Leu Tyr Glu Phe Val His Ser Phe 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Lys Leu Tyr Pro Trp Ile 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50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Leu Trp Pro Asp Ile Gly Val Pro Ile 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Asp Arg Val Leu Leu His Val 1 5 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Met Glu Ala Ala Met Lys Gly Leu Val Gln Glu 1 5 10 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Met Gly Phe Lys Pro Leu Val Leu 1 5 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Met Leu Asp Leu His Cys Asp Lys Ile 1 5 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Met Thr Tyr Asp Gly Asn Asn Pro Val Thr 1 5 10 <210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Met Val Asp Asn Pro Leu Asn Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Asn Lys Asp Asn Asp Lys Leu Ile 1 5 <210> 58 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Asn Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly 1 5 10 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Gln Ala Leu Ala Gln Lys Gly Leu Tyr Val Thr 1 5 10 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 23 <400> 60 Gln Ile Asn Ala Met Asn Ser Asp Ile Leu Glu 1 5 10 <210> 61 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gln Ile Asn Glu Gln Val Glu Lys Leu 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Gln Leu Asp Glu Leu Asn Gln Lys Leu 1 5 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Val His Lys Arg Gly Val Val Glu Tyr Glu Ala 1 5 10 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Arg Ile Ile Lys Trp Leu Tyr Ser Ile 1 5 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Arg Ile Asn Thr Val Ser Leu Lys Glu Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Arg Leu Phe Pro Leu Ser Gly His Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Arg Leu Leu Glu Val Pro Val Met Leu 1 5 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ser Ile Met Ser Ile Asp Lys Ala Val Thr 1 5 10 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ser Leu Asp Arg Tyr Ile Lys Ile 1 5 <210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Leu Phe Ala Gly Gly Met Leu Arg Val 1 5 10 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ser Leu Met Gln Cys Trp Gln Leu 1 5 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ser Leu Val Ala Lys Asp Asn Gly Ser Leu 1 5 10 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ser Leu Val Leu Arg Lys Leu Asp His Leu 1 5 10 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ser Pro Ala Leu Ala Leu Pro Asn Leu Ala Asn 1 5 10 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ser Ser Ser Gly Leu Ile Ser Ser Leu Asn Glu Ile 1 5 10 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Thr Cys Phe Asn Leu Leu Asp Leu 1 5 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Thr Leu Thr Val Gly Thr Asn Gly Gly Leu Lys 1 5 10 <210> 78 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Thr Leu Val Gln Leu Pro Asn Gly Gln Thr Val 1 5 10 <210> 79 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Thr Val Phe Val Leu Asp Asp Gly Thr Val 1 5 10 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Thr Val Met Met Gly Lys Lys Leu 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Val Leu Gly Ala Val Met Ile Val Met Val 1 5 10 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Val Leu Val Pro Val Leu Val Met Val 1 5 <210> 83 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Val Met Leu Pro Asp Asn Gln Ser Leu 1 5 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Tyr Ile Asn Gln Ser Lys Ala Ile Asp Tyr Glu Ala 1 5 10 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Tyr Leu Leu Arg Val Val Leu Lys Thr 1 5 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Tyr Val Glu Phe Thr Arg Ser Leu Phe Val Asn 1 5 10 <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 87 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 88 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 88 Phe Leu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 89 Phe Leu Ala Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 90 Ala Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 91 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Peptide portion of linker <400> 91 Phe Leu Ala Ala Tyr 1 5 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 92 Ala Ala Tyr Val Leu Val Pro Val Leu Val Met Val 1 5 10 <210> 93 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 93 Ala Ala Tyr Lys Ile Tyr Gln Trp Ile Asn Glu Leu 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 94 Ala Ala Tyr Lys Leu Gly Glu Phe Ala Lys Val Leu Glu Leu 1 5 10 <210> 95 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 95 Ala Ala Tyr Gly Met Tyr Gly Lys Ile Ala Val Met Glu Leu 1 5 10 <210> 96 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 96 Ala Ala Tyr Lys Leu Ile Pro Phe Leu Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 97 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 97 Ala Ala Tyr Arg Leu Leu Glu Val Pro Val Met Leu 1 5 10 <210> 98 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic sequence: Test ligand <400> 98 Ala Ala Tyr Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 99 <211> 4 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 99 Ser Ile Ile Asn 1

Claims (63)

  1. 포유동물 개체에서 종양의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 백신으로서, 상기 백신은 복수의 나노입자 및 약학적으로 허용가능한 담체, 염 또는 희석제를 포함하며, 적어도 하나의 상기 나노입자는 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는 백신:
    (i) 금속 및/또는 반도체 원자를 포함하는 코어;
    (ii) 상기 코어에 공유적으로 결합된 복수의 리간드를 포함하는 코로나,
    여기서 상기 복수의 적어도 제1 리간드가 제1 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 탄수화물 모이어티를 포함하거나 글루타티온을 포함하고, 상기 복수의 적어도 제2 리간드가 제2 링커를 통해 코어에 공유적으로 결합된 에피토프 펩티드를 포함하며,
    상기 제2 링커는 펩티드 부분 및 비-펩티드 부분을 포함하고,
    이때, 상기 펩티드 부분은 서열 X1X2Z1을 포함하며, 여기서
    X1은 A 및 G로부터 선택된 아미노산이고;
    X2는 A 및 G로부터 선택된 아미노산이며;
    Z1은 Y 및 F로부터 선택된 아미노산이며,
    여기서, 상기 에피토프 펩티드는 종양-관련 항원(TAA)의 적어도 일부분을 형성하거나, 이로부터 유래된 것임.
  2. 제1항에 있어서, 제2 링커의 상기 비-펩티드 부분이 C2-C15 알킬 및/또는 C2-C15 글리콜을 포함하는 것인 백신.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 리간드 및/또는 상기 제2 리간드가 황-함유기, 아미노-함유기, 인산염-함유기 또는 산소-함유기를 통해 코어에 공유적으로 결합된 것인 백신.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 링커의 상기 펩티드 부분이 하기로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것인 백신:
    (i) AAY; 및
    (ii) FLAAY(서열번호 91).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 링커는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 백신:
    (i) HS-(CH2)2-CONH-AAY;
    (ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAY;
    (iii) HS-(CH2)3-CONH-AAY;
    (iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAY;
    (v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAY; 및
    (vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAY,
    여기서, 상기 제2링커는 링커의 비-펩티드 부분의 티올기를 통해 상기 코어에 공유적으로 결합됨.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프 펩티드가 상기 제2 링커의 상기 펩티드 부분에 그의 N-말단을 통해 결합되는 것인 백신.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제2 리간드가 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 백신:
    (i) HS-(CH2)2-CONH-AAYZ2;
    (ii) HS-(CH2)2-CONH-FLAAYZ2;
    (iii) HS-(CH2)3-CONH-AAYZ2;
    (iv) HS-(CH2)3-CONH-FLAAYZ2;
    (v) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-AAYZ2; 및
    (vi) HS-(CH2)10-(CH2OCH2)7-CONH-FLAAYZ2,
    여기서, Z2는 상기 에피토프 펩티드를 나타냄.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프 펩티드가 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하거나 클래스 I MHC 분자에 결합하도록 처리될 수 있는 것인 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 에피토프 펩티드가 8 내지 40개 아미노산 잔기의 서열로 구성되는 것인 백신.
  10. 제9항에 있어서, 상기 에피토프 펩티드가 8 내지 12개 아미노산 서열로 구성되는 것인 백신.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 펩티드가 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 자극하도록 클래스 I MHC 분자에 의해 제시될 수 있는 것인 백신.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, TAA가 폐암 항원인 것인 백신.
  13. 제12항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종 및 선암으로부터 선택되는 것인 백신.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 에피토프 펩티드가 서열번호 1 내지 86으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것인 백신.
  15. 제14항에 있어서, 에피토프 펩티드가 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하거나 이로 구성되는 것인 백신:
    VLVPVLVMV (서열번호 82);
    KIYQWINEL (서열번호 29);
    KLGEFAKVLEL (서열번호 33);
    GMYGKIAVMEL (서열번호 19);
    KLIPFLEKL (서열번호 34); 및
    RLLEVPVML (서열번호 67).
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 (i) 내지 (iii)인 것인 백신:
    (i) 상기 제1 리간드의 탄수화물 모이어티가 단당류 및/또는 이당류를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 복수의 리간드가 글루타티온 황 원자를 통해 나노입자의 코어에 공유적으로 결합된 적어도 하나의 글루타티온 리간드를 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 복수의 리간드는 하기를 포함한다:
    (a) 글루코스;
    (b) N-아세틸글루코사민;
    (c) 글루타티온;
    (d) 글루코스 및 N-아세틸글루코사민;
    (e) 글루코스 및 글루타티온;
    (f) N-아세틸글루코사민 및 글루타티온; 또는
    (g) 글루코스, N-아세틸글루코사민 및 글루타티온.
  17. 제16항에 있어서, (i)에서 상기 탄수화물 모이어티가 글루코스, 만노스, 푸코스 및/또는 N-아세틸글루코사민을 포함하는 것인 백신.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 링커가 C2-C15 알킬 및/또는 C2-C15 글리콜을 포함하는 것인 백신.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리간드가 티올 황 원자를 통해 코어에 공유적으로 부착된 2'-티오에틸-β-D-글루코피라노사이드 또는 2'-티오에틸-α-D-글루코피라노사이드를 포함하는 것인 백신.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자는 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개 또는 적어도 50개의 탄수화물-함유 리간드 및/또는 글루타티온 리간드를 포함하는 것인 백신.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 나노 입자는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 에피토프 펩티드-함유 리간드를 포함하는 것인 백신.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 탄수화물-함유 리간드 및/또는 글루타티온 리간드 대 에피토프 펩티드-함유 리간드의 몰비는 5:1 내지 100:1 범위 내인 것인 백신.
  23. 제22항에 있어서, 탄수화물-함유 리간드 대 에피토프 펩티드-함유 리간드의 몰비는 10:1 내지 30:1 범위 내인 것인 백신.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자의 코어 직경은 1 nm 내지 5 nm 범위 내인 것인 백신.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 리간드를 포함하는 나노입자의 직경은 5 nm 내지 20 nm, 선택적으로 5 nm 내지 15 nm 또는 8 nm 내지 10 nm 범위 내인 것인 백신.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 코어는 Au, Ag, Cu, Pt, Pd, Fe, Co, Gd 및 Zn, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 금속을 포함하는 것인 백신.
  27. 제26항에 있어서, 코어는 Au, Ag, Pt, Pd 및 Cu, 또는 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 부동태 금속(passive metal)을 포함하는 것인 백신.
  28. 제27항에 있어서, 코어는 Au/Fe, Au/Ag, Au/Cu, Au/Ag/Cu, Au/Pt, Au/Pd, Au/Ag/Cu/Pd, Au/Gd, Au/Fe/Cu, Au/Fe/Gd 및 Au/Fe/Cu/Gd로 구성된 군으로부터 선택된 금속의 조합을 포함하는 것인 백신.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 코어는 자성인 것인 백신.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 코어는 Mn2 +, Gd3 +, Eu2 +, Cu2 +, V2+, Co2 +, Ni2 +, Fe2 +, Fe3 + 및 란탄족원소3 +로 구성된 군으로부터 선택된 NMR 활성 원자를 더 포함하는 것인 백신.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 코어는 반도체를 포함하는 것인 백신.
  32. 제31항에 있어서, 반도체는 셀렌화 카드뮴, 황화 카드뮴, 카드뮴 텔레늄 및 황화 아연으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 백신.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 코어는 양자점으로서 작용할 수 있는 것인 백신.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 나노입자는 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드를 포함하며, 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드의 각각의 에피토프 펩티드는 상이한 것인 백신.
  35. 제34항에 있어서, 상기 적어도 2개의 에피토프 펩티드-함유 리간드 각각의 에피토프 펩티드는 상이한 폐암 TAA의 적어도 일부분을 형성하거나 각각 이로부터 유래되는 것인 백신.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 제1 에피토프 펩티드-함유 리간드를 갖는 상기 나노입자의 제1 종 및 제2 에피토프 펩티드-함유 리간드를 갖는 상기 나노입자의 제2 종을 포함하며, 상기 제1 및 제2 종의 에피토프 펩티드는 상이한 것인 백신.
  37. 제36항에 있어서, 상기 나노입자의 제1 및 제2 종의 각각의 에피토프 펩티드는 상이한 폐암 TAA의 적어도 일부분을 형성하거나 각각 이로부터 유래되는 것인 백신.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 10개의 상이한 종의 나노입자의 풀을 포함하며, 각각의 종은 상이한 에피토프 펩티드를 갖는 것인 백신.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 애쥬번트를 더 포함하는 백신.
  40. 제39항에 있어서, 애쥬번트는 적어도 하나의 나노입자의 코어에 공유적으로 부착되는 것인 백신.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 애쥬번트는 (S)-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser(S)-Lys4-OH("Pam3Cys")를 포함하는 것인 백신.
  42. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 실질적으로 애쥬번트 비함유이거나 유일한 애쥬번트 효과가 나노입자에 의해 제공되는 것인 백신.
  43. 의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 백신.
  44. 포유동물 개체에서 암의 예방적 또는 치료적 처치에 사용하기 위한 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 백신.
  45. 제44항에 있어서, 상기 암은 폐암을 포함하는 것인 백신.
  46. 제45항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종 및 선암으로부터 선택되는 것인 백신.
  47. 포유동물 개체에서 암의 예방적 또는 치료적 처치를 위한 약제의 제조에 있어 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 백신의 용도.
  48. 제47항에 있어서, 상기 암은 폐암을 포함하는 것인 용도.
  49. 제48항에 있어서, 상기 암은 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종 및 선암으로부터 선택되는 것인 용도.
  50. 상기 백신 또는 약제가 림프 흡수를 통해 투여하기 위한 것인, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 백신 또는 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  51. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 백신의 예방적 또는 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유동물 개체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방적 또는 치료적 처치 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 암이 폐암인 것인 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 폐암이 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종 및 선암으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제51항 또는 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 림프 흡수를 위한 부위에 투여되는 것인 방법.
  55. 하기 단계를 포함하는 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 생성하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법:
    (i) 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 백신과 적어도 하나의 항원 제시 세포(APC)를 접촉시키는 단계로서, 상기 에피토프 펩티드가 상기 APC의 클래스 I MHC 분자 상에 제시되도록 하는 단계; 및
    (ii) 적어도 하나의 CTL 세포와 (i)의 상기 적어도 하나의 APC를 접촉시키는 단계로서, 상기 CTL 세포가 상기 APC에 의해 활성화되어 상기 에피토프 펩티드에 특이적인 CTL 반응을 생성하도록 하는 단계.
  56. 제55항에 있어서, APC가 상기 백신의 존재하에 배양되고, 동시적으로 또는 순차적으로, 상기 CTL 세포와 공동-배양되는 것인 시험관내 방법.
  57. 제56항에 있어서, APC가 상기 CTL 세포와 공동-배양되기 전에 백신과 접촉된 후 세척 단계로 적용되는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 포유동물 개체에게 CTL 세포를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
  59. 제55항에 있어서, 상기 백신이 하기로 구성되는 군으로부터 선택된 투여 경로에 의해 전달되는 것인 생체내 방법:
    림프 흡수의 부위에서, 또는 근처에서, 포유동물 개체의 장기 또는 조직 내로의 주사;
    스프레이 또는 겔을 통한 비강 전달;
    스프레이 또는 겔 또는 경구적으로 용해가능한 필름을 통한 볼 전달;
    용해가능한 필름을 통한 경구 전달;
    백신을 포함하는 패치를 통한 경피 전달; 및
    백신을 포함하는 조성물의 흡입 전달.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신은 상이한 에피토프 펩티드를 갖는 나노입자의 풀을 포함하는 것인 방법.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL 반응이 하나 이상의 사이토카인의 생산을 포함하는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인이 인터페론 감마(IFN-감마)를 포함하는 것인 방법.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 CTL 세포가 클래스 I MHC 분자 상에 표시된 상기 에피토프 펩티드를 포함하는 MHC-펩티드 복합체에 대해 더 높은 항원항체결합력(avidity)을 나타내며, 상기 더 높은 항원항체결합력은 나노입자에 결합되지 않은 유리 펩티드 형태의 동일한 에피토프 펩티드와 접촉된 APC에 의해 활성화된 CTL 세포에 의해 표시된 상기 MHC-펩티드 복합체에 대한 항원항체결합력에 비해 더 높은 것인 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014MN00433A (ko) 2011-09-07 2015-06-19 Midatech Ltd
WO2014046807A1 (en) * 2012-09-20 2014-03-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydrophobic shielding for enhanced nanoparticle stability
US20150064107A1 (en) * 2013-09-04 2015-03-05 King's College London Imaging agent
EP2921179A1 (en) * 2014-03-17 2015-09-23 Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) Micellar nanoparticles containing antitumoral glycosides
GB201507030D0 (en) 2015-04-24 2015-06-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Immunotherapy against lung cancers, in particular NSCLC
CN108588020B (zh) * 2018-03-30 2021-09-14 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种含有硒元素的近红外ii区量子点的新应用
WO2020250153A1 (en) * 2019-06-11 2020-12-17 Pharmaexceed S.R.L. Nanoparticles for use in the redirection against the tumour of a non-tumour-specific immune response, based on a pre-existing immunity
EP3909612A1 (en) 2020-05-12 2021-11-17 Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG Composition of nanoparticles

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0025414D0 (en) 2000-10-16 2000-11-29 Consejo Superior Investigacion Nanoparticles
GB0313259D0 (en) 2003-06-09 2003-07-16 Consejo Superior Investigacion Magnetic nanoparticles
ES2242528B1 (es) 2004-03-25 2006-12-01 Consejo Sup. Investig. Cientificas Nanoparticulas magneticas de metales nobles.
EP2330208B1 (en) 2004-05-24 2017-10-18 Midatech Ltd. Nanoparticles comprising RNA ligands
WO2006037979A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Midatech Limited Nanoparticles comprising antigens and adjuvants and immunogenic structure
CN101123990A (zh) * 2004-10-01 2008-02-13 Mida科技有限公司 包含抗原和佐剂的纳米颗粒，和免疫原性结构
EP1919507A2 (en) * 2005-08-04 2008-05-14 Thomas William Rademacher Nanoparticles comprising antibacterial ligands
US8425915B2 (en) * 2006-04-13 2013-04-23 Midatech Limited Nanoparticles for providing immune responses against infectious agents
EP2161279A1 (en) * 2008-08-29 2010-03-10 Centre National de la Recherche Scientifique Synthetic peptides corresponding to overlapping neutralizing determinants in the CBD1 epitope induce broadly neutralizing antibodies
RU2016137258A (ru) * 2009-04-01 2018-12-13 Юниверсити Оф Майами Композиции вакцин и способы их применения
EP2470200B1 (en) 2009-08-26 2017-03-15 Immunotope, Inc. Cytotoxic t-lymphocyte-inducing immunogens for prevention, treatment, and diagnosis of cancer
EP2305310A1 (en) 2009-09-25 2011-04-06 Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biomateriales - CIC biomaGUNE Gold -coated magnetic glyconanoparticles functionalised with proteins for use as diagnostic and therapeutic agents
TWI485245B (zh) * 2010-01-25 2015-05-21 Oncotherapy Science Inc 經修飾之ｍｅｌｋ胜肽及含此胜肽之疫苗
IN2014MN00433A (ko) * 2011-09-07 2015-06-19 Midatech Ltd

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