KR20170137119A - 비소세포 폐암(nsclc) 및 기타 암을 비롯한 폐암에 대한 면역 요법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합 - Google Patents

비소세포 폐암(nsclc) 및 기타 암을 비롯한 폐암에 대한 면역 요법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합 Download PDF

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KR20170137119A
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안드레아 마르
토니 바인쉥크
올리버 슈르
옌스 프리췌
하르프리트 싱
클라우디아 바그너
율리아 라이볼트
콜레테 송
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이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 면역 요법 방법에서의 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역 요법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 종양 연관 T 세포 에피톱을 단독 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 자극하거나 혹은 T 세포를 생체외 자극하여 환자로 전달하는 것과 관련된다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또한 그러한 펩티드는 항체, 용해성 T 세포 수용체 및 기타 결합 분자의 표적일 수도 있다.

Description

비소세포 폐암(NSCLC) 및 기타 암을 비롯한 폐암에 대한 면역 요법에서의 사용을 위한 펩티드 및 펩티드의 조합
본 발명은 면역 요법에 사용되는 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암의 면역 요법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 종양 연관 T 세포 에피톱을 단독으로 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 역할 가능한 기타 종양 연관 펩티드들과 병용하여 항종양 면역 반응을 자극하거나 혹은 T 세포를 생체외 자극하여 환자에게 전달하는 것과 관련된다. 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합된 펩티드 또는 그러한 펩티드는 항체, 용해성 T 세포 수용체 및 기타 결합 분자의 표적일 수도 있다.
본 발명은 항종양 면역 반응을 이끌어내는데 필요한 백신 조성물에 혹은 약학적/면역학적 활성 화합물 및 세포의 개발에 필요한 표적으로서 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 분자로부터 유래하는 몇몇 신규 펩티드 서열들 및 이들의 변이체들에 관한 것이다.
폐암은 남성과 여성에서 가장 큰 암-관련 사망의 이유이다. 세계적으로 폐암은 발병률 및 사망률에서 가장 흔한 암이다. 2012년의 경우, 180만 건이 넘는 신규 사례가 있었으며(총 암 발생률의 13%), 폐암에 의한 사망은 160만명이었다(총 암 사망의 20%). 폐암은 남자는 87개 국가에서 여자는 26개 국가에서 각각 암 사망의 제일 원인이다. 새로 진단된 모든 사례의 3분의 1 이상이 중국에서 발생했다. 최고의 발생률은 북미, 유럽 및 동아시아였다(World Cancer Report, 2014).
1987년 이후 매년 유방암으로 사망한 여자보다 폐암으로 사망한 여자가 더 많았다. 남성 사망률은 1991년에서 2003년 사이 매년 약 1.9%씩 상당하게 감소했다. 여성 폐암 사망률은 수십 년 동안의 지속적인 증가 후 안정기에 접근하고 있다. 폐암 사망률의 이런 경향은 지난 30여 년간의 흡연률 감소를 반영한다.
미국 암 연구소(NCI)에 의하면, 2013년 미국에서 신규 폐암 발생 건수 및 폐암에 의한 사망 건수는 각각 230,000 건 및 160,000 건으로 추정된다.
역사적으로 소세포 폐암종은 비소세포 폐암종(NSCLC)과 구별되어왔으며, 후자에는 선암종, 편평 세포 암종 및 거대 세포 암종의 조직학적 유형들이 포함된다. 하지만 지난 십 년 동안 선암종과 편평 세포 암종 사이의 차이에 대한 인식이 계속 증가되어 왔는데, 그 이유는 유전학에서의 커다란 차이 및 특정 요법에 대한 반응 때문이다. 따라서 폐암은 나날이 분자 아형에 따라 세분화되고 있으며, 이는 폐 종양 발생을 주도하고 유지하는 특정한 유전적 변형에 입각한다(Travis et al., 2013).
예후는 일반적으로 불량하다. 폐암에 걸린 모든 사람 가운데 10 내지 15%가 진단 후 5년 동안 생존한다. 폐암 환자의 나쁜 생존율은 적어도 부분적으로 80%의 환자가 전이성 질병으로 진단을 받고 있으며 과반수는 원격 전이를 갖는 것에 기인한다(SEER Stat facts, 2014). 제시 당시, NSCLC 사례의 30 내지 40%가 IV 단계이고 SCLC의 60%가 IV 단계이다.
폐암의 1년 상대적 생존율은 1975 내지 1979년에는 35%에서 2010년에는 44%로 약간 증가했고, 이것은 대부분 수술 기법과 병용된 요법의 개선 때문이다. 그러나, 모든 단계를 합한 5년 생존율은 17% 밖에 되지 않는다. 질병이 국소화되었을 때 발견된 경우에는 생존율이 54%이다. 하지만, 16%의 폐암만이 이 초기 단계에서 진단된다(SEER Stat facts, 2014).
치료 옵션은 암의 유형(소세포 또는 비소세포) 및 단계에 따라 결정되고 수술, 방사선 요법, 화학요법, 및 베바시주맙(아바스틴(AVASTIN, 등록상표)) 및 엘로티닙(타르세바(TARCEVA, 등록상표))과 같은 표적 생물학적 요법 등을 포함한다. 국소 암에서는 수술이 일반적인 선택이다. 최근의 연구는 초기 단계의 비소세포 폐암에서의 생존율은 수술에 따른 화학 요법으로 인해 개선된다는 것을 보였다. 질병이 발견되는 시간에 이미 확산되었기 때문에, 방사선 요법과 화학 요법이, 때때로는 수술과 함께 종종 사용된다. 화학요법만 또는 방사선과 병용하는 요법은 소세포 폐암에서 사용되는 일반적인 치료 방법이며, 이 처방을 통해, 환자의 큰 비율이 완화를 경험하고, 이것은 일부 사례에서는 오래 지속된다(S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011).
진행된 폐암 또한 기존 화학요법에 대해 내성을 보인 바 있다. 하지만 최근의 발전 내용은 조직학 및 유전학에 의존하는 요법의 흥미로운 진전을 초래했다. KRAS의 코돈 12 및 13의 돌연변이 사이뿐만 아니라 코돈 12에서의 특정한 돌연변이에 의해 결정되는 여러 아미노산의 치환 사이의 차별화를 위해 설계된 보조 화학요법의 시도가 면밀한 검토의 수준에 대한 예를 보여준다(Shepherd et al., 2013).
NSCLC를 위한 치료 옵션의 확대를 위해, 여러 면역치료 접근 방식들을 연구했으며 아직 조사 중에 있다. NSCLC 환자에서 L-BLP25 혹은 MAGEA3에 의한 면역접종은 백신 매개에 의한 생존율 이점을 보여주는데 실패했지만, 동종이행 세포주에서 유래한 백신은 임상 연구에서 촉망되는 결과를 보여주었다. 그 밖에 갱글리오사이드, 표피 성장 인자 수용체 및 몇몇 다른 항원을 표적으로 하는 추가의 면역접종 시험이 현재 진행 중이다. 환자의 항종양 T 세포 반응을 강화시키는 대체 전략은 차단 억제 T 세포 수용체 혹은 특정 항체와 이의 리간드로 구성된다. NSCLC에서의 이필리루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MPDL3280A 및 MEDI-4736을 비롯한 몇몇 항체의 치료 가능성이 현재 임상 시험에서 평가 중이다(Reinmuth et al., 2015).
암 치료와 연관된 중증의 부작용과 비용을 고려하면, 일반적인 암 및 특히 NSCLC를 포함한 폐암의 치료시 사용가능한 요인들을 파악할 필요가 있다. 또한 일반적인 암 및 특히 폐암에 대한 바이오마커를 나타내는 요인들, 암의 보다 나은 진단과 예후의 평가 및 치료 성공의 예측을 초래하는 요인들을 파악할 필요도 있다.
암의 면역 요법이란 부작용은 최소화하면서 암 세포에 특이적으로 표적화하는 옵션을 나타낸다. 암 면역 요법에서는 종양 관련 항원을 이용한다.
종양 관련 항원(TAA)의 현재 분류는 다음과 같은 주요 군을 포함한다:
a) 암-고환 항원: 이미 확인되어 T 세포에 의해 인식된 첫 번째 TAA는 이 종류에 속하고, 이는 그 구성원의 발현이 조직학적으로 인간 종양과 다르며, 정상 조직 중, 고환의 정모 세포/정원 세포에만 있으며, 때로는 태반에 있기 때문에 최초에 암-고환(CT) 항원이라고 불렸다. 고환 세포가 클래스 I 또는 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이 항원들은 정상 세포에 있는 T 세포에 의해 인식될 수 없으며 면역학적으로 종양-특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원의 잘 알려진 예로는 MAGE 구성원 및 NY-ESO-1이 있다.
b) 분화 항원: 이러한 TAA는 종양과 종양이 발생한 정상 세포 사이에 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원은 흑색종과 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 이러한 많은 멜라닌 세포 계통-관련 단백질은 멜라닌의 생합성과 관련되어 있으며 따라서 종양 특이적은 아니지만 암 면역치료에 널리 사용된다. 예로는, 흑색종을 위한 티로시나아제 및 Melan-A/MART-1 또는 전립선암을 위한 PSA가 있고 이에 국한되지 않는다.
c) 과발현된 TAA: 일반적으로 발현 수준이 낮은 많은 정상 조직뿐만 아니라 조직학적으로 다른 유형의 종양에서 유전자를 암호화하는 널리 발현된 TAA가 발견된다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 많은 에피톱이 T 세포 인식의 임계치 수준보다 낮을 수 있고, 종양 세포에서 T 세포의 과발현은 이전에 확립된 내성을 중단시켜 항암 반응을 개시할 수 있다. 이 클래스 TAA의 유력한 예로는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라제 또는 WT1이 있다.
d) 종양 특이적 항원: 이러한 독특한 TAA는 정상 유전자의 돌연변이로써 발생한다(예컨대 β-카네틴, CDK4 등). 이러한 분자 변경의 일부는 종양 형질전환 및/또는 진행과 관련되어 있다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 강한 면역 반응을 정상 조직에 대한 자가 면역 반응 위험성 없이 유도할 수 있다. 반면에, 대부분의 경우 이러한 TAA가 발견되어 일반적으로 많은 개별 종양에서 대개 공유되지 않은 해당 종양에만 적절하다. 종양 특이적(연관된) 아형을 갖는 단백질의 경우 펩티드가 종양(관련) 엑손으로부터 비롯된다면 펩티드의 종양-특이성(또는 연관성) 또한 발생할 수 있다.
e) 비정상 번역 후 변형에서 발생하는 TAA: 이러한 TAA는 종양에서 특이적이 아니고 과발현되지도 않는 단백질에서 발생할 수 있지만 종양에서 주로 활동적인 번역 후 과정에 의해 종양과 관련된다. 이 클래스의 예는 종양 특이적일 수도 있고 아닐 수도 있는 분해 과정 동안 단백질 스플라이싱과 같은 이벤트 또는 MUC1의 경우 종양의 새로운 에피톱으로 이끄는 변형된 당화 패턴에서 발생한다.
f) 종양 바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 그들이 이질적이기 때문에(인간 태생이 아닌), T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이런 단백질의 예로는 인간 유두종 타입 16 바이러스 단백질, 및 경부 암종에서 발현하는 E6과 E7이 있다.
T 세포 기반의 면역 요법은 종양-관련 혹은 종양-특이적 단백질로부터 유래된 펩티드 에피톱을 표적으로 하고, 이는 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 의해 제시된다. 종양 특정이적 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉 그들의 에피톱은, 발현되고, 같은 원조의 변형없는 세포들에 비해서, 각각의 종양의 세포에서 대개 상향조절된 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유도된 분자일 수 있다.
MHC-분자에는 두 클래스가 있으며, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II이다. MHC 클래스 I 분자는 알파 중쇄와 베타-2-저분자글로불린으로 구성되어 있고, MHC 클래스 II 분자는 알파와 베타 쇄로 구성되어 있다. 이들의 3차원 형태는 결합 홈을 형성하고, 이는 펩티드와의 비공유결합에 사용된다.
MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 찾을 수 있다. 이는 대부분 내인 단백질, 결손 리보솜 생성물(DRIP)과 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 생성된 펩티드를 제시한다. 하지만 엔도솜 구획이나 외생 출처로부터 유래된 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 발견된다. 이러한 비고전적 방식의 클래스 I 제시를 문헌에서는 교차-제시라고 칭한다(Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 찾아 볼 수 있으며, 이들은 주로 APC에 의해 섭취된 외인 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하고(예를 들어 세포내이입 동안), 이는 후에 처리된다.
펩티드와 MHC 클래스 I 분자의 복합물은 적당한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8-양성 T 세포에 의해서 인식이 되는 반면, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합물은 적당한 TCR을 갖는 CD4-양성 조력 T 세포에 의해 인식이 된다. 이로써 TCR, 펩티드 및 MHC가 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.
CD4-양성 보조 T 세포는 CD8-양성 세포 독성 T 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는데 중요한 역할을 한다. 종양 관련 항원(TAA)에서 유도된 CD4-양성 T 세포 에피톱의 동정은 항-종양 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 개발에 아주 중요하다(Gnjatic et al., 2003). 종양 부위에서, 보조 T 세포는, 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 사이토킨 주위 환경을 지원하고(Mortara et al., 2006), 효과기 세포, 예를 들어 CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식 세포, 과립구를 유치한다(Hwang et al., 2007).
염증이 없는 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히 전문적 항원-제시 세포(APC), 예를 들어, 단핵 세포, 단핵 세포-유도된 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 밝혀졌다(Dengjel J, et al.).
본 발명의 신장(더 기다란) 펩티드는 HLA 클래스 II 활성 에피톱으로 작용할 수 있다.
MHC 클래스 II에 의해 활성화된 조력 T 세포는 항-종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는데 중요한 역할을 한다. CD8-양성 살해 T 세포의 TH1 유형 지원 효과기 기능의 조력 T 세포 반응을 일으키는 조력 T 세포 에피톱은, 세포 표면에 종양-관련 펩티드/MHC 복합체를 보이는 종양 세포에 대한 세포 독성 기능을 포함한다. 이런 식으로 종양-관련 조력 T 세포 펩티드 에피톱은, 따로 또는 다른 종양-관련 펩티드와 함께, 항-종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성의 활성 약학 원료로 사용될 수 있다.
예를 들어, 생쥐 같은 포유류 동물 모델에서는 심지어 CD8-양성 T 림프구의 부재 하에서도, CD4-양성 T 세포가 인터페론-감마(IFN-gamma)의 분비에 의한 혈관신생의 저해를 통한 종양의 억제 징후에 충분하다는 것이 보여졌다(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). CD4 T 세포가 직접적 항종양 작용기라는 증거가 있다(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
이전에는 HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 일반적으로 면역 세포로 제한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양에서 직접 단리하는 것은 가능하지 않다고 간주되었다. 그러나, 뎅겔(Dengjel) 등은 MHC 클래스 II 에피톱을 종양에서 직접적으로 식별하는데 성공했다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).
CD8 및 CD4에 의존하는 두 유형의 반응이 함께 상승작용에 의해 항종양 효과에 기여함으로써, CD8+ T 세포(리간드: MHC 클래스 I 분자 + 펩티드 에피톱) 또는 CD4-양성 조력 T 세포(리간드: MHC 클래스 II 분자 + 펩티드 에피톱)에 의해 인식되는 종양-관련 항원의 식별 및 특성화가 종양 백신의 개발에 중요하다.
MHC 클래스 I 펩티드가 세포 면역 반응을 촉발(유도)하려면 MHC-분자에도 결합해야 한다. 이 과정은 MHC-분자의 대립형질 및 그 펩티드의 아미노산 서열의 특정한 다형성에 의존한다. MHC-클래스-I-결합 펩티드는 대개 길이가 8 내지 12개의 아미노산 잔기이며 대개 그 서열 내에 MHC-분자와 상응하는 결합 홈과 상호작용하는 두 개의 보존 잔기("고정")를 포함하고 있다. 이렇게 함으로써 각 MHC 대립형질은 어떤 펩티드가 결합 홈에 특이적으로 결합할 수 있는가를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.
MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정한 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하고 또한 추후 특이한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있어야 한다.
종양-특이 또는 연관 항원으로서 T 림프구에 의해 단백질이 인식되고, 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하고 비교적 소량일지라도 건강한 정상 조직에 의해서는 발현되어서는 안 된다. 바람직한 구현에서, 펩티드는 건강한 정상 조직과 비교하여 종양 세포에 의해 과다 제시되어야 한다. 더욱이 각각의 항원이 하나의 유형의 종양에서뿐만 아니라 높은 농도로 나타나는 것이 바람직하다(즉 세포마다 펩티드의 각각의 카피 수). 종양-특이적 및 종양-관련 항원은 흔히 기능 때문에(예를 들어 세포 주기 관리 또는 세포자멸의 억제) 정상 세포를 종양 세포로 형질전환하는 것과 직접 관련된 단백질에서 유도된다. 또한, 형질전환을 직접적으로 일으키는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으므로 간접적으로 종양과 연관될 수 있다. 이러한 간접적 종양-관련 항원은 백신 접근법의 표적이 될 수도 있다(Singh-Jasuja et al., 2004). 에피톱이 항원의 아미노산 서열에 나타나는 것이 중요하고, 종양 관련 항원에서 유도된 그러한 펩티드("면역성 펩티드")는 시험관 내 또는 생체 내 T 세포반응을 유도해야 한다.
기본적으로, MHC 분자에 결합할 수 있는 임의의 펩티드는 T 세포 에피톱으로서 기능할 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 T 세포 반응을 유도하는 전제 조건은 상응하는 TCR이 있는 T 세포의 존재와 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성의 부재이다.
따라서, TAA는 종양 백신으로 제한되지 않지만 이를 포함하는 T 세포 기반 요법의 개발에 있어서 시작점이 된다. TAA의 식별과 특성화의 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상에서 단리될 수 있는 T 세포의 사용에 기반되거나, 또는 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로파일이나 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 기반한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서 과발현되거나 그런 조직 또는 세포주에서 선택적으로 발현되는 유전자의 식별은 면역 치료에서 이런 유전자에서 전사된 항원의 이용에 대한 정밀한 정보를 제공하지 않는다. 이것은 상응하는 TCR이 있는 T 세포가 나타나야 하고 이 특정 에피톱에 대한 면역 내성이 없거나 최소화되어야 하므로 이러한 항원의 에피톱의 개개의 소집단만이 그런 적용에 적합하기 때문이다. 따라서 본 발명의 매우 바람직한 구현에서, 기능성 및/또는 증식성 T 세포가 발견될 수 있는 과발현된 또는 선택적으로 발현된 펩티드만 선택하는 것이 중요하다. 이러한 기능성 T 세포는 특이적 항원에 의해 자극되었을 때 클론에 의해 확대되고 효과기 기능을 실행할 수 있는 T 세포("효과기 T 세포")로 정의된다.
본 발명에 따른 특이적 TCR(예를 들어 용해성 TCR) 및 항체 혹은 다른 결합 분자(골격)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적인 것이다. 이러한 경우, 제시가 결정 요인이다.
본 발명의 제 1 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 110 또는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체 서열로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것으로, 상기 변이체는 MHC에 결합하고/하거나 상기 펩티드와 교차 반응하는 T세포를 유도하고, 상기 펩티드는 기저의 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 162, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 110 또는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 대해 적어도 77%, 바람직하게는 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 적어도 77% 또는 적어도 88% 동일한) 이의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 본 발명의 펩티드에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이는 8 내지 100, 바람직하게는 8 내지 30, 가장 바람직하게는 8 내지 20의 아미노산이다.
하기 표에는 본 발명에 따른 펩티드와 각각의 서열번호 및 이 펩티드의 예상 공급원(기저) 유전자가 나와 있다. 표 1 및 표 4의 모든 펩티드는 HLA-A*02에 결합한다. 표 2의 펩티드는 모두 HLA-A*24와 결합한다. 표 3 및 표 5의 펩티드는 모두 HLA-DR과 결합한다. 표 4 및 표 5에 나와있는 모든 펩티드는 오류 비율이 높은 고처리량 선별의 결과로서 대규모 목록으로 이전에 공개되었거나 다른 알고리즘을 사용하여 계산된 바 있으나 이전에는 전혀 암과 연관된 적은 없다. 표 6, 표 7, 및 표 8의 펩티드는 본 발명의 다른 펩티드와의 조합으로 유용할 수 있는 추가의 펩티드이다. 표 9 및 표 10의 펩티드는 해당되는 기저 폴리펩티드의 과발현 또는 과다 제시가 관여하는 다양한 악성 종양의 진단 및/또는 치료에 있어서도 유용하다.
[표 1]
본 발명에 따른 펩티드
Figure pct00001
[표 2]
본 발명에 따른 추가 펩티드
Figure pct00002
Figure pct00003
[표 3]
본 발명에 따른 HLA-DR 펩티드
Figure pct00004
[표 4]
이전에 알려진 암 연관이 없는 본 발명에 따른 추가 펩티드
Figure pct00005
[표 5]
이전에 알려진 암 연관이 없는 본 발명에 따른 추가 HLA-DR 펩티드
Figure pct00006
[표 6]
예를 들어 개인화 암 요법에 유용한 다른 펩티드
Figure pct00007
[표 7]
예를 들어 개인화 암 요법에 유용한 다른 펩티드
Figure pct00008
[표 8]
예를 들어 개인화 암 요법에 유용한 HLA-DR 펩티드
Figure pct00009
본 발명은 또한 예를 들어 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 위식도 접합부(OSCAR)의 암을 포함하는 식도암, 담낭암 및 담관암종(GBC_CCC), 방광암(UBC), 자궁암(UEC)과 같은 증식성 질병의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
특히 바람직한 것은 본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성된 군으로부터 선택된 단독 혹은 조합의 펩티드이다. 보다 바람직한 것은 서열번호 1 내지 서열번호 14(표 1 참조) 및 서열번호 23 내지 서열번호 47(표 2 참조)로 구성된 펩티드들 및 폐암(NSCLC 포함), 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 위식도 접합부(OSCAR)의 암을 포함하는 식도암, 담낭암 및 담관암종(GBC_CCC), 방광암(UBC), 자궁암(UEC), 및 바람직하게는 NSCLC를 포함하는 폐암의 면역 요법에서 이들의 사용이다.
하기 표 9, 9-2 및 표 10 및 10-2에 나와 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 다수의 펩티드는 다른 종양 유형에서도 발현되고 따라서 다른 적응증의 면역 요법에서 사용될 수도 있다. 도 1 및 실시예 1 또한 참조한다.
[표 9]
본 발명에 따른 HLA-A*02 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서 그 구체적 사용. 이 표는 선택된 펩티드들에 있어서, 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 과다 제시를 보이거나 또는 정상 조직 대 기하 평균 종양의 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 제시를 보이는 추가 종양 유형을 보여준다.
Figure pct00010
Figure pct00011
[표 9-2]
본 발명에 따른 HLA-A*02 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서 이의 구체적 사용(표 9의 변경). 표 9와 같이 이 표는 선택된 펩티드들에 있어서, 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 과다 제시(특이적 제시 포함)를 보이거나 또는 정상 조직 대 기하 평균 종양의 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플들이 5% 초과에서 제시를 보이는 추가 종양 유형을 보여준다. 과다 제시는 가장 높은 제시를 가진 정상 샘플에 비해 종양 샘플에 대한 더 높은 제시로서 정의된다. 과다 제시를 시험한 정상 조직들은 다음과 같다: 지방 조직, 부신, 혈액 세포, 혈관, 골수, 뇌, 연골, 식도, 눈, 담낭, 심장, 신장, 대장, 간, 폐, 림프절, 신경, 췌장, 부갑상선, 복막, 뇌하수체, 흉막, 침샘, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 흉선, 갑상선, 기관, 요관 및 방광.
Figure pct00012
[표 10]
본 발명에 따른 HLA-A*24 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서 그 구체적 사용. 이 표는 선택된 펩티드들에 있어서, 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 과다 제시를 보이거나 또는 정상 조직 대 기하 평균 종양의 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 제시를 보이는 추가 종양 유형을 보여준다.
Figure pct00013
[표 10-2]
본 발명에 따른 HLA-A*24 펩티드 및 다른 증식성 질병, 특히 다른 암 질병에서 그 구체적 사용(표 10의 변경). 표 10과 같이, 이 표는 선택된 펩티드들에 있어서, 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 과다 제시(특이적 제시 포함)를 보이거나 또는 정상 조직 대 기하 평균 종양의 비율이 3보다 큰 측정된 종양 샘플들의 5% 초과에서 제시를 보이는 추가 종양 유형을 보여준다. 과다 제시는 가장 높은 제시를 가진 정상 샘플에 비해 종양 샘플에 대한 더 높은 제시로서 정의된다. 과다 제시를 검사한 정상 조직들은 다음과 같다: 부신, 동맥, 뇌, 신장, 대장, 간, 폐, 췌장, 부갑상선, 피부, 비장, 위, 흉선.
Figure pct00014
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 신장암의 치료를 위한 서열번호 7, 14, 15, 18, 94, 95, 97, 98, 101, 102, 105, 106, 111, 112, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 126, 127, 128, 130, 131, 132, 136, 138, 139, 143, 146, 147, 150, 28, 29, 42, 47, 50, 54, 56, 59, 66, 67 및 161 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 뇌암의 치료를 위한 서열번호 8, 9, 15, 16, 20, 94, 98, 100, 103, 104, 111, 114, 117, 118, 120, 127, 129, 132, 135, 138, 139, 145, 149, 150, 151, 29, 36, 37, 41, 45, 54, 59, 70, 73, 79, 80 및 82 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 위암의 치료를 위한 서열번호 2, 4, 18, 94, 105, 113, 114, 115, 117, 120, 124, 126, 128, 130, 131, 132, 134, 137, 138, 144, 146, 149, 153, 26, 31, 33, 36, 41, 42, 44, 49, 50, 56, 58, 63, 67, 77, 78, 85, 159, 160 및 161 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 결장직장암의 치료를 위한 서열번호 2, 7, 11, 13, 94, 96, 98, 99, 100, 111, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 137, 138, 139, 144, 145, 146, 149 및 152 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명은 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 실시예에서 간암의 치료를 위한 서열번호 7, 8, 9, 11, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 94, 96, 98, 99, 101, 104, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 126, 129, 131, 132, 135, 136, 138, 139, 143, 149, 150, 152, 26, 27, 28, 29, 37, 38, 39, 41, 44, 46, 50, 51, 52, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 76, 77, 79, 81, 82, 84 및 161 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 췌장암의 치료를 위한 서열번호 1, 2, 3, 4, 13, 18, 96, 101, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 117, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 143, 146 및 156 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 전립선암의 치료를 위한 서열번호 8, 10, 16, 18, 114, 128, 139, 143, 153, 27, 37, 41, 43, 53, 59, 61, 67, 72, 76, 78, 80, 82 및 84 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 백혈병(AML, CLL)의 치료를 위한 서열번호 9, 15, 96, 97, 120 및 127 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 유방암의 치료를 위한 서열번호 1, 3, 4, 5, 7, 13, 16, 18, 101, 102, 105, 112, 113, 115, 119, 124, 126, 128, 133, 145 및 156 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 메르켈 세포 암종의 치료를 위한 서열번호 95, 98, 100, 104, 138, 149 및 151 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 흑색종의 치료를 위한 서열번호 4, 5, 9, 16,19, 20, 94, 98, 112, 115, 117, 118, 128, 130, 132, 134, 138, 139, 144, 146 및 148 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 난소암의 치료를 위한 서열번호 4, 8, 9, 10, 16, 18, 94, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 105, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 128, 129, 130, 131, 132, 134, 137, 138, 139, 142, 143, 144, 148, 149, 150 및 152 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 식도암의 치료를 위한 서열번호 5, 9, 13, 18, 19, 21, 95, 102, 104, 105, 113, 114, 115, 119, 120, 123, 124, 125, 127, 129, 130, 132, 133, 137, 138, 139, 141, 143, 144, 145, 146, 149, 150, 151, 153, 155, 156 및 157 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 하나의 합쳐진 바람직한 구현에서 폐암(NSCLC 포함)의 치료를 위한 서열번호 13, 25, 113, 114, 115, 120, 121, 128, 159 및 161 중 어느 하나에 따라 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
따라서 본 발명의 또 다른 양태는 폐암(NSCLC 포함), 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL)의 군으로부터 선택된 증식성 질병의, 바람직하게는 병용 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 길이 변이체와 같은 긴 형태의 MHC 클래스 II의 분자와 결합하는 능력을 가진 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (각각) 서열번호 1 내지 서열번호 162, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된 펩티드이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 변형되고/되거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부이고, 특히 HLA-DR 항원-결합 항원-연관된 불변쇄(Ii)에 융합되거나 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 그 서열 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있거나 발현하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질병의 치료와 의학, 특히 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 혹은 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 대해 특이적인 항체 또는 본 발명에 따른 상기 펩티드와 MHC와의 복합체 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체(TCR), 특히 용해성 TCR(sTCR) 및 상동성 또는 동종이형 T 세포로 조작된 복제된 TCR 및 이러한 수용체의 제조 방법은 물론 상기 TCR을 함유하거나 상기 TCR과 교차반응하는 NK 세포 또는 기타 세포들에 관한 것이다.
항체 및 TCR은 즉시 가용한 본 발명에 따른 펩티드의 면역치료적 사용의 추가 구현이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 항원 제시 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 110, 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 14 및 서열번호 23 내지 서열번호 47 또는 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있거나 발현하는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제공된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따라 생산된 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 임의의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 활성화된 T 림프구, T 세포 수용체 또는 항체, 또는 본 발명에 따른 다른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC-결합 분자를 약제로서 또는 약제의 제조에서의 사용에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다.
바람직하게는 상기 약제는 세포 요법, 백신 또는 가용성 TCR 또는 항체, 예를 들어 항-CD3 항체나 그 일부를 포함하는 가용성 TCR로부터 유래하는 단백질이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암 세포는 폐암(NSCLC 포함), 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 위식도 접합부(OSCAR)의 암을 포함하는 식도암, 담낭암 및 담관암종(GBC_CCC), 방광암(UBC), 자궁암(UEC), 및 바람직하게는 폐암의 세포이다.
본 발명은 또한 여기서 "표적"이라 칭하고 암, 바람직하게는 폐암(NSCLC 포함)의 진단에 사용할 수 있는 본 발명에 따른 펩티드에 근거하는 바이오마커에 관한 것이다. 마커는 펩티드 자체의 과다 제시 혹은 상응하는 유전자의 과발현일 수 있다. 또한 마커는 치료, 바람직하게는 면역 요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 파악된 동일한 표적을 대상으로 하는 면역 요법의 성공 확률을 예측하는데 사용할 수도 있다. 예를 들어, 항체 혹은 용해성 TCR은 MHC와의 복합체에서 관심 있는 펩티드의 존재를 검출하기 위해 종양의 부분들 염색에 사용할 수 있다.
임의적으로 그 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가의 효과기 기능을 갖는다.
본 발명은 또한 암 치료의 맥락에서 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
콜라겐 알파-3(VI)쇄 단백질(COL6A3) - COL6A3은 VI형 콜라겐의 3개 알파쇄 가운데 하나인 알파-3쇄를 암호화한다. 그 단백질 도메인은 세포의 기질 단백질과 결합하는 것으로 나타났으며, 이는 기질 성분의 조직에 있어서 이 콜라겐의 중요성을 설명하는 상호작용이다. 콜라겐 VI의 과발현을 통한 세포외 기질의 재형성은 난소암 세포에서 시스플라틴 내성에 기여한다. 콜라겐 VI의 존재는 난소암 예후 인자인 종양 등급과 상관관계가 있었다(Sherman-Baust et al., 2003). COL6A3은 결장직장 종양(Smith et al., 2009a)과 침샘 암종(Leivo et al., 2005)에서 과발현되고, 위암에서는 차등 발현된다(Yang et al., 2007). COL6A3은 종양 특이적 스플라이스 변이체를 갖는 7개의 유전자 가운데 하나로 확인되었다. 검증된 종양 특이적 스플라이성 변형은 고도의 일관성이 있어, 정상 샘플과 암 샘플의 분명한 분리를 가능케 하고 일부 사례에서는 다른 종양 병기의 단리도 가능했다(Thorsen et al., 2008).
용질 운반과 6(아미노산 전달체), 구성원 14(SLC6A14) - SLC6A14는 용질 운반과 6, 구성원 14(SLC6A14)를 암호화한다. SLC6A14는 아미노산 전달체이며 용질 운반과 6의 구성원이다. 이 과의 구성원들은 나트륨 및 염소 의존성 아미노산/신경전달물질 전달체이다. SLC6A14는 중성 및 양이온성 아미노산을 수송한다. 이 전달체는 정상 조직에서는 낮은 수준으로 발현된다(Sloan and Mager, 1999). SLC6A14는 경부암(Gupta et al., 2006), 결장직장암(Gupta et al., 2005) 및 에스트로젠 수용체(ER)-양성 유방암(Karunakaran et al., 2011)의 조직 및 세포주는 물론 간암 세포(Fuchs et al., 2004)에서 상향 조절되는 것으로 나타났다(Fuchs et al., 2004). SLC6A14는 상응하는 정상 조직/세포에서 최소한으로 발현되는 반면, 암 세포는 이러한 아미노산에 대한 증가된 수요를 충족시키기 위해 SLC6A14를 상향조절한다. 알파-메틸-DL-트립토판(알파-MT)은 SLC6A14의 선택적 차단제이며 아미노산 박탈을 유도했으며 ER-양성 유방암 세포주에서 세포자멸사를 유발했다(Karunakaran et al., 2011).
이중 특이성 포스타파제 4(DUSP4) - DUSP4 유전자에 의해 암호화되는 단백질로서 이중 특이성 단백질 포스타파제 아과의 구성원이다. DUSP4는 ERK1, ERK2 및 JNK를 비활성화시키며 다양한 조직에서 발현되고 핵에 국소화된다. DUSP4(별칭 MKP2)는 비음성 유방암 샘플과 비교할 때 음성 샘플에서 과발현되는 것으로 보고된 바 있다(Wang et al., 2003). 결장직장암 환자의 마이크로어레이 데이터 세트에서, DUSP4 발현은 차등 발현되고 BRAF 돌연변이된 종양에서 가장 높게 발현되는 것으로 나타났다. 더욱이 높은 DUSP4는 더 나쁜 전체 생존율과 관련이 있었다(De, V et al., 2013).
당단백질(막횡단) nmb(GPNMB) - 유전자 GPNMB는 I형 막횡단 당단백질을 암호화한다. GPNMB는 여러 암 유형들의 커다란 패널 상에 발현되고 종양 세포의 이동, 침입 및 전이 형성의 자극에 의한 종양의 공격성을 주로 증가시키는 것으로 나타난 바 있다. 분자 수준에서는 GPNMB가 MMP-2, 3 및 9의 발현을 증가시키고 자신은 p53에 의해 조절되는 것으로 나타났다(Metz et al., 2005; Metz et al., 2007; Rose et al., 2007; Fiorentini et al., 2014). 높은 수준의 GPNMB는 SCLC, GBM 및 ccRCC에서 전체 생존율의 감소와도 상관관계가 있다(Qin et al., 2014; Li et al., 2014; Kuan et al., 2006).
케라틴, II형 세포골격 80(KRT80) - KRT80은 케라틴 80(KRT80)을 암호화한다. KRT80은 실제로 모든 유형의 상피에서 발견된 바 있으며 진행된 조직 또는 세포 분화와 관련이 있다. 중간 섬유를 함유하는 KRT80은 결합판에 가까운 세포 가장자리에 위치하고, KRT80은 말단 분화에 들어가는 세포에서만 세포질 분배를 채택한다(Langbein et al., 2010).
염색체 4의 구조적 유지(SMC4) - SMC4 단백질은 염색질 응축에서 역할을 하는 콘덴신 복합체의 핵심 구성요소이며 핵소체 단리, DNA 복구 및 염색질 골격의 유지와도 연관지어졌다(Cervantes et al., 2006).
용질 운반과 1(글루탐산염/중성 아미노산 전달체), 구성원 4(SLC1A4) - SLC1A4는 소형 중성 아미노산의 나트륨 의존 교환을 매개하는 아미노산 전달체이다((Kanai et al., 2013)에서 검토됨). SLC1A4는 편평 세포 암종에 비해 식도 선암종에서 유의하게 더 발현되는 것으로 묘사되었다(Younes et al., 2000). 전립선암 세포에서의 SLC1A4의 발현은 안드로겐 치료에 대해 반응하고 증가된 것으로 나타났다(Wang et al., 2013a).
케라틴 5(KRT5), 케라틴 6A(KRT6A), 케라틴 6B(KRT6B), 케라틴 6C(KRT6C) - KRT5, KRT6A, KRT6B 및 KRT6C는 상동성 케라틴 단백질로서 중간 섬유 단백질이다. 케라틴의 발현 패턴은 악성종양의 근원 조직에 관련되어 있으므로, 케라틴은 종양 진단에서의 표지자 단백질로서 방대하게 사용된다((Karantza, 2011)에서 검토됨). KRT6A 및 KRT6B는 정상 상황 하에서 전이동 Src 키나제를 단리하여 활성을 억제함으로써 세포 이동을 억제하는 것으로 보인다. 이 기전이 암 세포에서도 작용하는지 여부는 조사된 바 없다(Rotty and Coulombe, 2012). KRT5/6 염색은 NSCLC에서 편평 세포 암종으로부터 불량하게 분화된 선암종을 분별하는 몇몇 표지자들의 하나로서 제안된 바 있다(Zhao et al., 2014b; Xu et al., 2014). 폐 신경 내분비 종양은 또한 KRT5/6에 대해 음성이다(Zhang et al., 2014).
케모카인(C-C 모티브) 리간드 18 폐 및 활성화-조절(CCL18) - 이 항균성 유전자는 염색체 17의 q암 상에 모여 있는 몇몇 Cys-Cys(CC) 사이토카인 유전자의 하나이다. 이 유전자에 의해 암호화되는 사이토카인은 미접촉 T 세포, CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 비활성화된 림프구의 화학주성 활동도를 발휘하지만 단핵구나 과립구에 대해서는 그렇지 않다. 종양 조직 및 혈액 모두에서 CCL18 수준의 상향 조절이 암에서 묘사된 바 있으며, CCL18 혈청 수준은 일부 암 유형의 바이오마커로서 제안된 바 있다. 여러 사례에서, 진행성 종양 단계와 불량한 예후 사이의 상관관계가 보여진 바 있다(예를 들어 위암(Wu et al., 2013a), 유방암(Chen et al., 2011; Narita et al., 2011), 전립선암(Chen et al., 2014), 방광암(Urquidi et al., 2012)). NSCLC 환자에서 CCL18의 혈청 수준은 건강한 대조군에 비해 증가했다. 그 밖에 선암종 환자에서의 혈청 수준의 증가는 감소된 생존 시간을 예측케 했다(Plones et al., 2012). CCL18은 NSCLC 확인을 위해 제안된 12-단백질 혈청 바이오마커 패널의 일부이다(Ostroff et al., 2010).
기질 메탈로펩시다제 12(대식세포 엘라스타제)(MMP12) - MMP12는 인간 메탈로엘라스타제(HME) 또는 대식세포 메탈로엘라스타제(MME)로 알려져 있으며 엘라스틴을 분해하는 능력으로 인식되는 아연 엔도펩티다제이다. 이 밖에도 광범위한 기질 범위를 가지며, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 프로테오글리칸과 같은 다른 기질 단백질 및 알파-1-안티드립신과 같은 비기질 단백질로 확장된다. 천식, 폐기종 및 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)에서, MMP12는 폐포 파괴와 기도 재형성에 기여할 수 있다(Cataldo et al., 2003; Wallace et al., 2008). MMP12는 대식세포 이동에 관여한 것으로 나타났으며, 플라스미노겐으로부터 혈관 생성 억제 인자를 생성할 수 있으므로, 혈관 생성의 억제에 기여한다(Chakraborti et al., 2003; Chandler et al., 1996; Sang, 1998). 다른 메탈로프로티나제와 같이, MMP12는 배아 형성과 같은 생리학적 과정, 상처 치유 및 월경 주기(Chakraborti et al., 2003; Labied et al., 2009)는 물론 조직 파괴의 병리학적 과정에도 관여한다. 데이터는 몇 가지 사례에서 소수의 환자에 근거하지만, MMP12가 흔히 암에서 과발현된다는 충분한 문헌 증거가 있다(Denys et al., 2004; Hagemann et al., 2001; Ma et al., 2009; Vazquez-Ortiz et al., 2005; Ye et al., 2008). 하지만 임상적 매개변수와 예후에 미치는 MMP12 과발현의 영향에 대한 데이터는 논란의 여지가 있다. 이것이 기질 용해 따라서 전이에 관여할 수 있는 반면, 혈관생성 억제 인자의 생산을 통해 종양을 억제할 수도 있으며, 이는 혈관형성에 부정적인 영향을 미친다(Gorrin-Rivas et al., 2000; Gorrin Rivas et al., 1998; Kim et al., 2004). 폐암에서 MMP12 발현의 결과에는 논란의 여지가 있다. 상피 세포에서 MMP12 과발현이 염증 유발의 폐 재형성으로 보고된 바 있다. MMP12 상향조절은 폐기종에서 폐암으로의 이행에 대한 역할을 할 수 있다(Qu et al., 2009). 동물 연구에 의하면 간질이나 대식세포에 의한 MMP12 발현은 폐 종양 성장의 억제를 시사한다(Acuff et al., 2006; Houghton et al., 2006). 하지만 폐 종양에서 MMP12 과발현은 재발, 전이성 질병 및 절제 후 보다 짧은 무재발 생존 기간과 상관관계가 있다는 보고가 또한 있다(Cho et al., 2004; Hofmann et al., 2005).
리소좀-연관 막 단백질 3(LAMP3) - LAMP3은 작은 세포질 영역 및 심하게 글리코실화된 관강내 영역을 가진 리소좀 구획에서 발견되는 I형 막횡단 단백질이다(Wilke et al., 2012). LAMP3의 상향조절은 몇몇 암에서 보고된 바 있지만, 종양 세포 자체에 의한 LAMP3의 발현은 나타난 바 없다. LAMP3(+) DC는 증식하는 T-림프구와 군집을 형성하는 침습성 종양의 가장자리에서 특히 검출된 바 있으며 그에 따라 예를 들어, 신장 세포 암종(Middel et al., 2010), 식도 평평 세포 암종(Liu et al., 2010), 결장직장 암종(Yuan et al., 2008; Sandel et al., 2005)은 물론 흑색종(Ladanyi et al., 2007)에서 국소적 항종양 면역 반응을 반영하도록 제안된 바 있다. 전사체학의 메타 분석에서 폐암에서 낮은 수준의 LAMP3 발현은 보다 짧은 전체 생존율과 연관될 수 있음을 시사했다(Lindskog et al., 2014).
동원체 단백질 N(CENPN) - CENPN 유전자에 의해 암호화되는 이 단백질은 뉴클레오솜-연관 복합체의 부분을 형성하고 동원체 조립에 중요하다. CENPN은 동원체 특이적 히스톤 변이체(CENP-A)를 인식하고 그에 따라 다수의 다른 동원체 단백질들에 대한 모집 부위를 정하는 데 요구된다(Carroll et al., 2009). CENPN 및 뉴클레오솜-연관 복합체(NAC)의 다른 단백질들의 고갈은 양극 방추 형성에 장애가 되지 않지만 염색체 회합에서의 결함을 유도한다(McClelland et al., 2007). CENPN은 다른 NAC 단백질들과 함께 DNA 두 가닥 절단 시 모집되고 그에 따라 이 복합체는 DNA 복구에서 역할을 수행하도록 제안된 바 있다(Zeitlin et al., 2009).
프로콜라겐-리신, 2-옥소글루타레이트 5-디옥시제나제 2(PLOD2) - 이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 거친면 세포질 세망의 수조에 국한되는 막결합 동종이합체이다. 이 유전자의 암호 부분에서의 돌연변이는 브루크 증후군과 연관이 있다. PLOD2 상향조절은 결장직장암(Nicastri et al., 2014), 다발성 골수종(Slany et al., 2014) 및 경부암(Rajkumar et al., 2011)에서 설명된 바 있으며, 뼈 전이 형성과 연관되었다(Blanco et al., 2012). PLOD2 발현의 상승과 불량한 예후의 상관관계는 아교포세포종(Dong et al., 2005)은 물론 유방암(Gilkes et al., 2013) 및 간세포 암종에서 보여진 바 있으며, 후자의 경우 증가된 종양 크기 및 간내 전이의 형성과도 연관되었다(Noda et al., 2012).
기질 메탈로펩티다제 1(MMP1) - MMP1은 기질 메탈로프로티나제(MMP)의 일부이다. 일반적으로 MMP는 혈관 기능, 재형성 및 혈관형성의 조절에서 필수적 기능을 수행한다. 이것은 ECM 및 다른 세포의 분자들의 분해를 통해 내피 세포와 혈관의 평활 근육 세포의 이동과 침입을 용이하게 하고 혈관 세포의 증식 및 세포자멸사에 영향을 미친다(Chen et al., 2013). MMP1 과발현은 몇몇 암 유형에서 설명된 바 있으며 혈관생성, 침입 및 불량한 생존과 연관되었다. 예를 들어, 상승된 MMP1 수준은 결장암(Langenskiold et al., 2013)에서 생존의 독립적 인자로서 설명된 바 있으며, 종양 및 간질에서의 MMP1 발현은 유방암에서 종양 진행 및 불량한 예후와 관련이 있다(Bostrom et al., 2011). 폐암 환자에서 MMP1 수준은 혈장과 종양 조직 모두에서 상승했으며 진행 단계 및 감소된 생존율과 연관이 있다고 나타난 바 있다(Li et al., 2010b). 메타 분석에 의하면 MMP1-1607 1G/2G 다형성과 폐암 발생의 위험 증가 사이에 관련 있음이 확인된 바 있다(Xiao et al., 2012).
케라틴 10(KRT10), 케라틴 12(KRT12), 케라틴 13(KRT13), 케라틴 14(KRT14), 케라틴 15(KRT15), 케라틴 16(KRT16), 케라틴 17(KRT17), 케라틴 19(KRT19) - 상동성 케라틴 단백질인 KRT10, KRT12, KRT13, KRT14, KRT15, KRT16, KRT17 및 KRT19는 중간 섬유 단백질이다. 일부 케라틴은 암 줄기 세포 표지자로서 간주되는 KRT14와 같은 줄기 세포 성질과 연관된 바 있다(Hatina and Schulz, 2012; Schalken and van, 2003). KRT15는 표피 줄기 세포의 확인 및 표적을 위한 표지자로서 사용되고(Adhikary et al., 2013; Troy et al., 2011), KRT17은 털 팽창의 기저층에서 줄기 세포를 통해 발현된다(Bragulla and Homberger, 2009). 다른 케라틴의 발현 패턴이 다양한 암 유형에서 분석된 바 있으며, 상승 및 하향 조절이 보고되었다. 예를 들어, KRT17의 높은 수준은 불량한 예후(Wang et al., 2013b; Escobar-Hoyos et al., 2014) 및 진행 단계와 연관된 바 있다(Kim et al., 2012). KRT13의 경우, 대다수의 연구는 암성 조직에서의 하향조절을 시사하고(Hourihan et al., 2003; Ida-Yonemochi et al., 2012), 또한 편평 세포의 변형 동안 KRT13의 발현은 KRT17의 발현으로 교체되는 것으로 보인다(Mikami et al., 2011). KRT10 및 KRT15의 경우, 암에서의 상향 및 하향 조절 모두 다수의 연구에서 잘 보여진 바 있다. KRT19는 다수의 암 유형에서 과발현되는 것으로 일관성있게 보고되고 또한 전이 및 불량한 예후와 연관지어진 바 있다(Zong et al., 2012; Lee et al., 2012). KRT12는 각막 상피에서 발현된다. 각막은 분화 표지자로서 간주되는 케라틴 12의 하향조절을 잘 보여준다(Zhang et al., 2010b).
뮤신 16, 세포 및 관련(MUC16) - MUC16은 몇몇 막 결합 뮤신 가운데 가장 크다. MUC16은 심하게 글리코실화된 세포외 영역이 있는 일회 통과 막횡단 단백질이다. MUC16은 난소암 세포의 표면으로부터 단리되어 혈액으로 들어간 다음 난소암의 성장 모니터링을 위한 확립된 바이오마커로서 사용되는 종양 관련 항원이다(Bafna et al., 2010). MUC16 발현의 증가된 수준은 폐 편평 세포 암종에서 잘 보여진 바 있다(Wang et al., 2014). 그 밖에 NSCLC 환자에서 MUC16의 높은 혈청 수준은 짧아진 생존 기간과 상관관계가 있는 것으로 나타났다(Yu et al., 2013; Cedres et al., 2011). MUC16은 다른 바이오마커와 병용하는 경우 폐암 아형에 대한 유전자 발현 특징의 일부일 수 있다(Li et al., 2012).
인테그린, 알파 2(CD49B, VLA-2 수용체의 알파 2 서브유닛)(ITGA2) - ITGA2는 콜라겐과 관련있는 단백질에 대한 막횡단 수용체의 알파 서브유닛을 암호화한다. 제한된 수의 연구를 통해 암에서 ITGA2의 조절곤란은 상승된 수준은 물론 감소된 경우에 대한 증거와 함께 보고된 바 있다. 췌장관 선암종에서, ITGA2가 저메틸화되고 과발현되었으며, 상승된 발현은 불량한 생존율과 연관이 있었다(Nones et al., 2014). 이와 반대로 ITGA2의 하향 조절이 전립선 암종에서 나타난 바 있다(Shaikhibrahim et al., 2011). 유방암과 전립선암에서 ITGA2의 감소된 발현은 전이 형성 및 불량한 생존율과 연관이 있었다(Ramirez et al., 2011).
올팍토메딘-유사 2B(OLFML2B) - OLFML2B는 올팍토메딘 단백질과에 속하고, 이는 세포외 당단백질로서 화학감각 섬모의 분화, 조기 신경발생, 신경관의 등측화, 신경근 신호전달, 연접 수포의 세포외 배출 및 녹내장의 발병기전에 주로 관여한다. OLFM2B 전사물은 마우스의 폐, 위, 전립선 등 다양한 조직에서 검출될 수 있으나 간에서는 부재하다(Furutani et al., 2005). OLFML2B 유전자는 염색체 1q23.3에 대해 지도화되는데, 이는 연관 연구에서 정신분열증의 감수성 자리인 것으로 보여진 바 있다(Puri et al., 2007).
테트라트리코펩티드 반복 영역 13(TTC13) - TTC13 단백질을 함유하는 테트라트리코펩티드 반복(TPR) 영역과에 속한다. TPR 영역은 기능, 세포 주기, 전사 및 단백질 전달에 중요한 것으로 보이며, 단백질을 함유하는 TPR 모티프는 흔히 멀티 단백질 복합체와 연관이 있다(Blatch and Lassle, 1999). TCC13 유전자는 유전자 1q42.2에 대해 지도화된다. 한 연계 분석 연구에서 염색체 1q42.2-43은 잠정 선행유전자의 자리로서 설명되었지만(Berthon et al., 1998), 이것은 추가 연구에서 더 큰 환자 모집단에서 확인할 수 없었다(Singh, 2000; Gibbs et al., 1999).
세포 분열시 데디케이터 2(DOCK2) - DOCK2 유전자가 암호화하는 단백질은 CDM 단백질과에 속한다. DOCK2는 림프구 이동 및 화학주성에 대해 중요한 인자로 알려져있다. 엑솜 및 전체 게놈 시퀸싱 연구를 통해, 결장직장암, 식도 선암종 및 췌장의 췌관내 유두상 점액 종양에서 DOCK2 유전자의 돌연변이가 확인되었다(Yu et al., 2014; Dulak et al., 2013; Furukawa et al., 2011). 더욱이, DOCK2는 소아의 성상세포종 샘플에서 차등적으로 발현되는 것으로 나타났으며 따라서 이 질병을 위한 흥미로운 치료 표적일 수 있다(Zhao et al., 2014a).
폴리오바이러스 수용체-관련 1(헤르페스 바이러스 유입 매개자 C)(PVRL1) - PVRL1은 상피 및 내피 세포에서 유착 연접 및 밀착 연접의 조직에서 역할을 수행하는 유착 단백질을 암호화한다. PVRL1 유전자는 선양 낭성 암종에서 증폭되는 것으로 나타난 바 있는 부위인 염색체 11q23에 대해 지도화된다(Zhang et al., 2013). 세포 유착에서 중요한 기능을 하는 PVRL1은 세포 침습성 및 이동성은 물론 또한 상피-중간엽 이행과도 연관지어진 바 있으며, 두 가지 과정 모두 종양 발전에 중요하다. PVRL1은 경부암에서 편평 세포 암종 아형의 시그내처 프로필의 일부로서 확인되었다(Imadome et al., 2010). PVRL1 발현은 정상 갑상선 조직에 비해 갑상선 종양에서 증가했으며 유두 갑상선암에서 더욱 증가한 것으로 나타났다(Jensen et al., 2010). PVRL1/2 발현은 급성 골수성 백혈병에서 보다 유리한 예후와 연관이 있다(Graf et al., 2005).
FK506 결합 단백질 10, 65 kDa(FKBP10) - FK506-결합 단백질 10(FKBP10)은 FKBP형 펩티딜-프롬일 시스-트란스 이소머라아제과에 속한다. 이것은 세포질 그물에 위치하고 분자 샤페론으로 작용한다(Ishikawa et al., 2008; Patterson et al., 2000). 이는 폐 발육에서 고도로 발현되고, 폐 손상 후 세포의 기질 단백질로써 조율된 방식으로 재활성화시킬 수 있다(Patterson et al., 2005).
ATP-결합 카세트, 아과 C(CFTR/MRP), 구성원 1(ABCC1) - ABCC1 유전자에 의해 암호화되는 이 단백질은 ATP-결합 카세트(ABC) 전달체 상과의 구성원이다. ABC 단백질은 세포외 및 세포내 막에 걸쳐 다양한 분자를 수송한다. ABCC1은 정상 및 종양 세포 모두에서 약물 배출 펌프로서 중요한 역할을 수행한다(Chen and Tiwari, 2011). 몇몇 연구는 ABCC1의 과발현을 여러 종양 유형에서 설명한 바 있으며, 다수의 사례에서 ABCC1 발현 수준과 종양의 병기, 전이 및 불량한 예후 사이의 관계가 발견된 바 있다(예를 들어 유방암, 전립선암 및 폐암)(Deeley et al., 2006). 중국인 환자를 대상으로 한 연구에서는 ABCC1 유전자에서 SNP가 NSCLC의 감수성을 증가시키는 것으로 파악되었다(Yin et al., 2011). 다른 연구에서는 ABCC1 SNP와 NSCLC 환자의 무진행 생존과의 관계가 보고된 바 있다(Lamba et al., 2014).
아라키돈산 15-리폭시게나제, B형(ALOX15B) - ALOX15B는 지방산 과산화수소의 생산에 관여하는 구조적으로 관련된 비헴 철 디옥시게나제의 리폭시게나제과의 구성원을 암호화한다. 15-LOX-2로서 더 잘 알려진 ALOX15B 및 이의 효소 생성물인 15-S-하이드록시에이코사테트라에논산(15S-HETE)이 종양 발육에서 수행하는 역할은 전립선암에서 가장 집중적으로 연구되었다. 몇몇 연구에서 ALOX15B 발현 수준은 물론 15S-HETE 생산의 수준은 정상 조직이나 세포주에 비해 전립선암에서 유의하게 감소됨을 잘 보여주었다(Hu et al., 2013; Shappell et al., 2001). 정상 폐에서 ALOX15B 발현은 II형 폐포세포로 제한된다. NSCLC에서 발현이 상승되고, ALOX15B 수준과 종양 등급은 물론 종양 세포 증식 지수 사이의 역상관관계가 설명된 바 있다(Gonzalez et al., 2004).
스핑고미엘린 포스포디에스터라제, 산-유사 3B(SMPDL3B) - SMPDL3B는 발세포에서 발현되는 스핑고미엘린 포스포디에스터라제이며, 그 발현은 당뇨성 신장병과 국소분절 사구체경화증과 연관지어진 바 있다. 신장 질병에서 SMPDL3B의 감소된 발현은 액틴 세포골격 재형성 및 세포자멸사와 연관지어진 바 있다(Merscher and Fornoni, 2014). SMPDL3B 유전자는 염색체 1p35.3에 대해 지도화된다.
글로타민-과당-6-포스페이트 트랜스아미나제 2(GFPT2) - GFPT2는 신경돌기의 외성장, 조기 뉴론 세포 발육, 뉴로펩티드 신호전달/합성 및 뉴론 수용체에 관여한다(Tondreau et al., 2008). GFPT2의 유전적 변이체는 제 2형 당뇨병 및 당뇨병성 신장질환과 연관이 있다(Zhang et al., 2004). 더욱이 GFPT2에서 SNP의 연관은 산화 경로의 변조에 관여하는 유전자가 당뇨병성 만성 신부전에 대한 주요 기여 요인일 수 있음을 시사한다(Prasad et al., 2010). GFPT2 유전자의 DNA 메틸화는 원발성 급성 림프성 백혈병(ALL) 샘플에서 검증되었다. 복수의 CpG 섬의 메틸화를 갖는 환자는 총 생존 기간이 더 나빴다(Kuang et al., 2008). GFPT2는 글루타민 대사에서 역할을 수행하고, 중간엽 세포주에서 보다 고도로 발현되는 것으로 관찰되었다. 글루타민 대사는 종양 진행에서 중요한 역할을 수행할 수 있으며, 세포 대사 경로의 억제제는 후성적 요법의 형태일 수 있다(Simpson et al., 2012).
DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp) 박스 헬리카제 5(DDX5) - DDX5(p68)는 스플라이싱, rRNA 처리 및 리보솜 생물 발생, miRNA 처리는 물론 전사 조절에서 역할을 수행하는 ATP 의존 RNA 헬리카제이다. DDX5는 안드로젠 수용체, p53 및 Runx2와 같은 암 진행에서 역할을 수행하는 몇몇 인자들의 전사 공동활성화 인자이다. DDX5의 과발현은 여러 암 유형에서 잘 나타난 바 있으며, 그 예로는 결장직장암, 유방암, 전립선암, 신경아교종, 간세포 암종, 백혈병이 있다(Dai et al., 2014; Fuller-Pace, 2013).
에놀라제 1(알파)(ENO1) - ENO1 유전자는 3개의 에놀라제 단백질 가운데 하나인 에놀라제-알파(ENOA)를 암호화하고 나머지는 각각 에놀라제-베타 및 -감마를 암호화한다. ENO1/ENOA 과발현은 다수의 암 유형에서 잘 보여진 바 있다(Capello et al., 2011). ENOA는 포스포에놀피루브산의 합성의 해당작용에서 기능하는 금속 효소이다. NSCLC 환자에서 상승한 ENOA 수준은 불량한 생존율과 상관관계가 있었다(Chang et al., 2006). 이와 유사하게 다른 연구에서는 폐 선암종 환자의 불량한 예후군에서 ENO1 발현의 상향조절을 잘 보여주었다(Pernemalm et al., 2013). ENOA는 종양 관련 항원으로 잘 보여진 바 있으며, 항-ENOA 항체는 물론 ENOA 특이적 T 세포는 췌장 선암종 환자에서 검출된 바 있다(Cappello et al., 2009). ENOA에 대한 자가항체는 NSCLC 환자에서도 검출된 바 있으며, NSCLC 조직에서의 ENOA 발현은 증가한 것으로 나타났다(He et al., 2007; Li et al., 2006).
살해 세포 렉틴-유사 수용체 아과 D, 구성원 1(KLRD1) - KLRD1은 CD94로 더 잘 알려져 있으며, 자연 살해(NK) 세포 및 세포 독성 T 림프구(CTL) 상에서 발현되는 헤테로다이머를 형성하는 NKG2 분자와 연관된다. 억제 수용체 KLRD1(CD94):NKG2A는 예를 들어 신장 세포 암종 및 경부암 등의 종양-침윤 림프구에서 과발현되는 것으로 나타났으며, 이는 손상된 항종양 면역 반응에 기여할 수 있다(Schleypen et al., 2003; Sheu et al., 2005). 이와 유사하게, 종양 세포 상에서 KLRD1(CD94):NKG2A 리간드인 HLA-E의 과발현은 종양 면역 탈출에 추가로 기여할 수 있다(Bossard et al., 2012; Gooden et al., 2011).
콜라겐, XII형, 알파 1(COL12A1) - COL12A1 유전자는 FACIT(중단된 삼중 나선을 가진 피브릴-연관 콜라겐) 콜라겐과의 구성원인 XII형 콜라겐의 알파쇄를 암호화한다. XII형 콜라겐은 I형 콜라겐과 연관하여 발견되는 호모트라이머이며, 이러한 연관은 콜라겐 I 피브릴과 주위 기질 사이의 상호작용을 변경시키는 것으로 사료된다(Oh et al., 1992). COL12A1은 피브릴과 기타 기질 성분 사이의 특정 분자 가교를 제공하는 기저막 조절에 관여할 수 있다(Thierry et al., 2004). COL12A1은 심장, 태반, 폐, 골격 근육 및 췌장(Dharmavaram et al., 1998) 및 관절 및 골단 연골 등 다양한 결합 조직(Gregory et al., 2001; Walchli et al., 1994; Watt et al., 1992)에서 발현된다. COL12A1은 미소부수체 불안정성이 낮거나 없는 안정한 군과 비교할 때 미소부수체 불안정성이 높은 종양에서 하향조절되었다(Ortega et al., 2010).
ATP-결합 카세트, 아과 A(ABC1), 구성원 13(ABCA13) - 인간에서 막횡단 수송체의 ATP-결합 카세트(ABC)과는 적어도 48개의 유전자와 7개의 유전자 아과를 갖는다. ABCA13 단백질은 5,058개의 아미노산 잔기로 구성되어 현재까지 설명된 가장 큰 ABC 단백질일 것으로 예상된다(Prades et al., 2002). 나이트(Knight) 등은 ABCA13 단백질이 마우스와 인간의 태아 및 피질에 발현되고, 두 영역 모두 정신분열증 및 양극성 장애와 관련 있는 것으로 결정했다(Knight et al., 2009). ABCA13 유전자는 염색체 7p12.3에 위치하는데, 이는 췌장에 영향을 미치는 유전적 질병(슈와크만-다이아몬드 증후군)을 포함하는 영역은 물론 T 세포 종양 침습 및 전이(INM7)에 연관된 위치이므로, 이러한 병리의 위치 후보이다(Prades et al., 2002).
사이클린 B2(CCNB2) - CCNB2는 주요 세포 주기-조절 키나제 CDK1(CDC2)과 연관되는 몇 가지 사이클린의 하나이다. 사이클린 수준은 세포 주기에 걸쳐 전사적으로 조절되어 다른 수준의 활성도와 특이성을 CDK1에 대해 제공함으로써 세포 주기 진행을 조절한다. 사이클린 B2의 발현은 사이클린 B2 전사를 억압하여 작용하는 종양 억제 유전자들인 p53 및 BRCA1에 의해 조절된다(Quaas et al., 2012; De et al., 2011). CCNB2 상향 조절은 경부암(Espinosa et al., 2013; Rajkumar et al., 2011), 방광암(Lu et al., 2010), 결장직장암(Park et al., 2007), 별아교세포종(Liu et al., 2013), 및 아교모세포종(Hodgson et al., 2009)과 같은 몇몇 종양 유형에서 설명된 바 있다. CCNB2 발현 수준은 유방암에서의 불량한 예후와 연관이 있었으며 생존에 대한 독립적인 예후 표지자로서 파악되었다(Shubbar et al., 2013). CCNB2는 NSCLC에서 과발현되고(Hofmann et al., 2004), 편평 세포 암종 환자는 아니지만 폐선암종 환자에서는 불량한 예후의 독립적 예측자로서 파악되었다(Takashima et al., 2014).
MutS 호몰로그 6(MSH6) - MSH6은 DNA 불일치 복구 MutS과의 구성원을 암호화한다. MSH6을 포함하는 MSH 단백질들은 복제 동안 게놈 서열에서의 오류를 인식함으로써, 손상된 가닥의 중복을 방지하고 한가닥 절단을 복구한다(Conde-Perezprina et al., 2012). 몇몇 종류의 암에서는, MSH6에서의 돌연변이 및 오류성 DNA 불일치 복구 절차(MMR)가 묘사되었다(예를 들어 결정직장암(Sameer et al., 2014; Vilar and Gruber, 2010; Silva et al., 2009; Kastrinos and Syngal, 2007; Davidson, 2007), 췌장암(Solomon et al., 2012), 난소암(Xiao et al., 2014), 유방암(Mahdi et al., 2013)).
PRP3 pre-mRNA 처리 인자 3 호몰로그(사카로마이세스 세레비지애)(PRPF3) - PRPF3은 pre-mRNA 처리 인자 3을 암호화한다. PRPF3은 핵 RNA 붕괴 절차의 유인을 스플라이시오솜에 매개한다(Nag and Steitz, 2012). PRPF3은 전사 인자 HNF4알파의 태아/암-특이적 스플라이스 변이체를 통해 간세포 암종에서 상향조절된다(Niehof and Borlak, 2008).
리소포스파티딜콜린 아실전이효소 1(LPCAT1) - LPCAT1은 리소포스파티딜-콜린(LPC)의 포스파티딜콜린으로의 전환을 촉매한다. 또한, LPCAT1은 리소-PAF(알킬화 LPC)를 혈소판 활성화 인자(PAF)로 전환시킬 수 있다. LPCAT1 과발현은 결장직장암(Mansilla et al., 2009), 간세포 암종(Morita et al., 2013), 유방암(Abdelzaher and Mostafa, 2015), 전립선암(Xu et al., 2013; Grupp et al., 2013; Zhou et al., 2012) 및 폐암(Wu et al., 2013b)에서 설명된 바 있다. LPCAT1 과발현은 시험관내 세포의 증식, 이동 및 침윤을 자극시켰다(Morita et al., 2013).
SON의 하류 근접(DONSON) - DONSON은 SON의 하류 근접(DONSON)을 암호화한다. DONSON은 중심체 단백질이며 그 수준은 세포 주기에 걸쳐 조절되고 S기 동안 최고치에 도달한다. DONSON은 적절한 유사분열 방추의 형성에 요구되고 DNA 손상 반응에서 역할을 수행하는 것으로 보인다(Fuchs et al., 2010). 암 관련 문헌은 가용하지 않다.
벤즈이미다졸 1 호몰로그 베타(효모)에 의한 비억제 발아(BUB1B) - BUB1B는 세린/트레오닌-단백질 키나제인 BUB1 유사분열 체크포인트 세린/트레오닌 키나제 B를 암호화한다. 이것은 유사분열 체크포인트 및 적절한 미세관-동원체 부착의 확립에서의 역할을 통해 염색체의 정확한 단리를 확인하는 유사분열 조절인자로서 기능한다. BUB1B 발현의 상향 및 하향 조절 모두 다양한 종양에서 보고된 바 있다. 일반적으로 더 많은 문헌이 암에서 BUB1B의 과발현에 대해 보고하고 있으며, 종양 진행 및 불량한 예후와의 연관 또한 설명된 바 있는데 그 예로는 코인두 암종(Huang et al., 2012a), 편도 암종(Hannisdal et al., 2010), 유방암(Maciejczyk et al., 2013), 상피 난소암(Lee et al., 2009), 및 췌담도형 선암종(Gladhaug et al., 2010)이 있다. 이와 유사하게, 전립선암에서 BUB1B 단백질은 더 긴 생존 기간과 연관이 있었다(Cirak et al., 2013).
올리고머 골지 복합체 4의 성분(COG4) - COG4는 골지 기관의 구조 및 기능에 관여하는 올리고머 단백질 복합체의 성분이다. 상호작용 연구에 따르면 COG4는 이 복합체의 핵심 성분의 역할을 하고 복합체의 조립/기능에서 중심적 역할을 한다는 것을 시사한다(Loh and Hong, 2004). COG 서브유닛인 COG4, 6, 및 8은 정의된 골지 SNARE와 상호작용할 수 있으며, 골지 내에서 수포 분류의 특이성 정의에 관여한다(Willett et al., 2013). 더욱이, COG 복합체는 골지 글리코실화 기구의 유지를 조절하는 것으로 나타난 바 있다(Pokrovskaya et al., 2011).
프로테아좀(프로솜, 마크로페인) 26S 서브유닛, 비-ATPase, 14(PSMD14) - PSMD14는 유비퀴틴 경로에 의해 파괴 표적이 된 단백질을 분해시키는 멀티 단백질 복합체인 26S 프로테아솜의 성분이다. 19S 복합체(19S cap; PA700) 내의 PSMD14 단백질은 프로테아좀 분해 동안 기질의 탈유비퀴틴화 수행을 책임진다(Spataro et al., 1997). 프로테아좀 서브유닛의 이상 발현과 기능이상은 악성 형질 전환과 다양한 세포독성 약물에 대한 세포 내성에 관여한 바 있다. 포유류 세포에서 PSMD14의 과발현은 세포 증식 및 빈블라스틴, 시스플라틴 및 독소루비신과 같은 세포독성 약물에 대한 반응에 영향을 미친다(Spataro et al., 2002). siRNA 감염에 의한 PSMD14의 하향조절은 세포활성에 상당한 영향을 가하여 G0-G1 기에서 세포의 정지를 유래했으며 궁극적으로 노화를 유도한다(Byrne et al., 2010).
RAD54 호몰로그 B(사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae))(RAD54B) - DNA 회복 및 재조합 단백질인 RAD54B는 인간에서 RAD54B 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. RAD54는 두 가닥 DNA에 결합하여 DNA 과정에서 ATPase 활성도를 나타낸다. 인간 RAD54B 단백질은 RAD54 단백질의 파랄로그이며, 상동 재조합에서 중요한 역할을 한다. 상동 재조합(HR)은 DNA 이중쇄 절단(DSB)의 정확한 회복에 필수적이다(Sarai et al., 2008). 암에서 체세포 변이가 되는 것으로 알려진 유전자인 RAD54B의 녹다운(knockdown)은 포유동물 세포에서 염색체 불안전성(CIN)을 유발한다(McManus et al., 2009). RAD54B 상승 유전자 발현은 보다 짧은 진행까지의 기간 및 GBM 환자에서 불량한 OS와 유의하게 연관이 있다(Grunda et al., 2010).
프리즐드과 수용체 1(FZD1), 프리즐드과 수용체 2(FZD2), 프리즐드과 수용체 7(FZD7) - FZD2, FZD1 및 FZD7 유전자는 모두 '프리즐드(frizzled)' 유전자과로부터 유래한다. 이 유전자과의 구성원들은 Wnt 신호전달 단백질의 수용체인 7-막횡단 도메인 단백질을 암호화한다. FZD2 유전자의 발현은 발육적으로 조절되는 것처럼 보이며, 태아의 신장과 폐 및 성인의 결장과 난소에서 높은 수준으로 발현된다(Sagara et al., 1998; Zhao et al., 1995). FZD1 단백질은 단일 펩티드, N-말단 세포외 영역에서 시스테인-풍부 도메인, 7개 막횡단 도메인 및 C-말단 PDZ 도메인-결합 모티프를 포함한다. FZD1 전사물은 폐는 물론 심장, 신장, 췌장, 전립선 및 난소 등의 다양한 조직에서 발현된다(Sagara et al., 1998). 프리즐드 1 및 2 수용체의 발현은 유방암에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Milovanovic et al., 2004). FZD7 단백질에는 N-말단 신호 서열, Fz과 구성원들로 이루어진 시스테인-풍부 세포외 도메인에서 전형적인 10개의 시스테인 잔기, 7개의 잠재적 막횡단 도메인 및 PDZ 도메인-결합 모티프를 갖는 세포 내 C-말단 꼬리가 포함된다. FZD7 유전자 발현은 불량하게 분화된 인간 식도 암종에서 APC 기능을 하향조절하고 베타-카테닌-매개 신호를 강화시킬 수 있다(Sagara et al., 1998; Tanaka et al., 1998).
무날개형(Wingless-type; Wnt) MMTV 통합 부위과, 구성원 5A(WNT5A) - 일반적으로 Wnt5a는 증식, 분화, 이동, 부착 및 극성과 같은 다양한 세포 기능을 조절한다(Kikuchi et al., 2012). 이것은 분화되지 않은 배아 줄기 세포에서 발현된다(Katoh, 2008). WNT5A는 발암에서 그 역할이 여전히 모호한 비형질변환 WNT족의 구성원으로 분류된다. 이것은 일부 암(갑상선, 뇌, 유방 및 결장직장)에서는, 종양 억제제 활성도를 나타내지만, 폐, 위 및 전립선의 암에서는 이상하게 상향조절된다(Li et al., 2010). 암유전자 WNT5A는 암 줄기 세포에서 자가 재생을 위해 표준 WNT 신호 전달 및 종양-간질 경계면에서는 침입과 전이를 위해 비표준 WNT를 각각 활성화한다(Katoh and Katoh, 2007). WNT5A의 발현은 다양한 종양 객체에 대해 설명된 바 있다. 예를 들어, Wnt5a의 비정상적 단백질 발현은 공격성을 자극시키는 전립선 암의 28%에서 관찰되었다(Yamamoto et al., 2010). 더욱이 WNT5A 과발현은 난소암(Badiglian et al., 2009), 흑색종(Da Forno et al., 2008; Weeraratna et al., 2002), GBM(Yu et al., 2007), 폐암(Huang et al., 2005) 및 췌장암(Ripka et al., 2007)에서의 불량한 예후 및/또는 증가하는 종양 등급과 연관 있는 것으로 설명된다. HCC에서는 표준 Wnt 신호전달 경로가 종양 개시에 및 비표준 신호전달이 종양 진행에 각각 기여하는 것일 수 있다(Yuzugullu et al., 2009).
섬유모세포 활성화 단백질, 알파(FAP) - 섬유모세포 활성화 단백질(FAP)은 세린 프로테아제과에 속하는 II형 내재성 막 당단백질이다. FAP 알파의 추정 세린 프로테아제 활성도와 그 생체 내 유도 양상은, 발육과 조직 회복 및 상피 발암 시 섬유모세포의 성장이나 상피-중간엽 상호작용에서 이 분자의 역할을 지적할 수 있다(Scanlan et al., 1994). 대부분의 정상 성인의 조직과 양성 상피 종양에는 검출가능한 FAP 발현이 거의 없거나 전무하다. 하지만 FAP 발현은 90%가 넘는 악성의 유방, 직장결장, 폐, 피부 및 췌장 종양의 기질, 치유되는 상처의 섬유모세포, 연조직 육종 및 일부 태아 중간엽 세포에서 검출된다. FAP는 세포 부착과 이동 과정은 물론 ECM 성분의 신속한 분해를 통해 암의 성장과 전이에서 잠재적인 역할을 한다. 따라서 이는 ECM을 침입하는 종양 세포 및 혈관형성에 관여하는 상피 세포에는 존재하지만 동일한 유형의 비활성 세포에서는 발현되지 않는다(Dolznig et al., 2005; Kennedy et al., 2009; Rettig et al., 1993; Rettig et al., 1994; Scanlan et al., 1994; Zhang et al., 2010a).
사이클린 B1(CCNB1) - CCNB1은 CDK1/CDC2와 연관하여 유사분열 진행을 자극하는 몇몇 유사분열 사이클린의 하나인 사이클린 B1을 암호화한다. CNB1 과발현은 다수의 암 유형에서 묘사된 바 있으며, 예를 들어 결장직장 암종(Li et al., 2003), 유방암(Aaltonen et al., 2009; Agarwal et al., 2009), NSCLC(Cooper et al., 2009), 및 식도 편평 세포 암종(Huang et al., 2014)에서와 같이 종양 진행 및 불량한 예후와 연관이 있었다. 또 위암에서, CCNB1 발현은 림프절 부위의 전이 및 불량한 임상적 예후와 연관이 있었다(Begnami et al., 2010; Fujita et al., 2012). 폐암 또는 전립선암 환자에서 CCNB1에 대항하는 항체들이 검출된 바 있으며 폐암의 조기 진출을 위한 바이오마커로서 제안된 바 있다(Egloff et al., 2005; Zhang et al., 2003).
ATPase, Ca++ 수송, 심근, 신속 연축 1(ATP2A1), ATPase, Ca++ 수송, 심근, 신속 연축 2(ATP2A2) - 두 유전자(ATP2A1 및 ATP2A2)는 SERCA Ca(2+)-ATPase를 암호화한다. 근육세포질세망(SR)1/ER 칼슘 ATPase(SERCA)는 SR/ER 막에 걸쳐 ATP 가수분해와 칼슘 운반을 결합시키는 칼슘 펌프이다(MacLennan et al., 1997). SERCA는 3개의 상동성 유전자에 의해 암호화된다: SERCA1(ATP2A1), SERCA2(ATP2A2), 및 SERCA3(Wu et al., 1995). 일부 출현된 증거에 의하면, SERCA는 세포자멸사, 분화 및 세포 증식의 과정에 대한 직접적인 영향이 있을 수 있다(Chami et al., 2000; Ma et al., 1999; Sakuntabhai et al., 1999). SERCA1을 암호화하는 ATP2A1에서의 돌연변이는 일부 보통염색체 열성 형태의 브로디씨병을 유발하고, 이 병은 운동 동안 근육 이완의 증가하는 장애에 의해 특징으로 한다(Odermatt et al., 1996). ATP2A2는 비정상 각화 및 극세포 분리를 특징으로 하는 희귀한 보통염색체 우성 유전 피부병인 다리에 병(Darier disease)과 연관있는 ATPase이다(Huo et al., 2010). ATP2A2는 생식세포 계열 변형은 폐 및 대장암에 취약하게 할 수 있으며, 손상된 ATP2A2 유전자는 발암에 관여할 수 있다(Korosec et al., 2006). 소세포 폐암(H1339) 및 선암종 폐암(HCC) 세포주에서, ER Ca2+-함량은 정상인의 기관지 상피에 비해 감소되었다. 감소된 Ca2+-함량은 ER로 칼슘 펌핑하는 SERCA 2의 감소된 발현과 상관관계가 있었다(Bergner et al., 2009). ATP2A2는 대장결장암 CRC 환자에 대한 잠재적인 예후 표지자일 수 있다. 이것은 순환 종양 세포(CTC)에서 검출되었으며, 수술 후 재발은 유전자 과발현과 유의하게 상관관계가 있었다(Huang et al., 2012).
피브로넥틴 1 (FN1) - FN1은 혈장에서 용해성 이량체로 존재하고 또한 세포 표면과 세포의 기질에서 이량체 혹은 다량체로 존재하는 당단백질인 피브로넥틴을 암호화한다. 대부분의 종양에서 FN1은 종양 세포가 아니라 암연관 섬유모세포(CAF) 및 상피 세포에 의해 주로 발현되는 것이 보고된 바 있다(Berndt et al., 2010). FN1의 상승된 수준은 일부 암 유형에서 보고되고, 예를 들어 담낭암(Cao et al., 2015), 전립선암(von et al., 2013), 및 신장 세포 암종(Steffens et al., 2012; Waalkes et al., 2010)에서의 불량한 예후나 암 진행과 연관이 있다고 보고된 바 있다. FN1은 세포 성장, 화학내성 및 세포자멸사의 억제 등 폐암의 발병기전에 대한 자극에도 관여한 바 있다(Ritzenthaler et al., 2008)).
인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA 결합 단백질 3(IGF2BP3) - IGF2BP3은 인슐린-유사 성장 인자-II mRNA-결합 단백질과의 구성원이며, mRNA 국소화, 전환 및 번역 제어에 관련된다. 이 단백질은 몇몇 KH(K-상동성) 도메인을 포함하는데 이들은 RNA 결합에 중요하고 RNA 합성 및 대사에 관여하는 것으로 알려져 있다. 과발현은 주로 배아 발육 동안 발생하고 일부 종양에 대해 묘사된 바 있다. 따라서 IGF2BP3은 종양태아성 단백질로 간주된다(Liao et al., 2005). IGF2BP3은 IGF-II 단백질 합성의 강화 및 CD44 mRNA의 안정화를 통한 세포 부착 및 침입의 유도에 의해 종양 세포 증식을 자극시킬 수 있다(Findeis-Hosey and Xu, 2012). 더욱이 IGF2BP3의 발현은 다수의 인간의 신생물에 대해 연구되어 이동, 침입, 세포 생존 및 종양 전이를 매개한다는 증거가 늘고 있으며(Jeng et al., 2009; Kabbarah et al., 2010; Li et al., 2011; Liao et al., 2011; Lu et al., 2011; Hwang et al., 2012; Samanta et al., 2012) 또한 혈관형성에도 관여할 수 있다(Suvasini et al., 2011; Chen et al., 2012). 폐 선암종에서, IGF2BP3 발현은 중간이나 낮은 정도로 분화된 선암종에서 보다 높은 빈도로 검출될 수 있는데, 이는 공격적인 생물학적 거동과 연관이 있을 수 있다(Findeis-Hosey et al., 2010; Beljan et al., 2012; Findeis-Hosey and Xu, 2012).
라미닌, 감마 2(LAMC2) - 라미닌은 세포의 기질 당단백질족이며, 기저막의 주요 비콜라겐 성분이다. 이것은 세포 부착, 분화, 이동, 신호전달, 신경돌기 외성장 및 전이 등의 다양한 생물학적 과정에 관여한 바 있다. LAMC2 유전자는 라미닌-5 감마 2 쇄를 암호화하고, 이 쇄는 라이브-5의 일부로서 기저막 구역의 주요 성분의 하나이다. LAMC2는 위암에서 자극자 탈메틸화에 의해 빈번히 상향조절되었다(Kwon et al., 2011). LAMC2는 무혈관 흑색종 영역 대비 혈관 영양성 흑색종 영역에서 과발현되는 것으로 나타났다(Lugassy et al., 2009). LAMC2는 방광암 전이의 바이오마커이며, 그 발현 수준은 종양 등급과 연관이 있었다(Smith et al., 2009b). LAMB3 및 LAMC2 유전자는 32개 비-SCLC 세포주 가운데 21개에서 공동발현되었지만(66%), 13개 SCLC 세포주 가운데에서는 단 1개에서 발현되었다(8%). LAMB3 및 LAMC2 유전자의 공동 발현은 검사한 4건의 원발성 비-SCLC 세포 모두에서도 관찰되었으나 상응하는 비암성 폐 세포에서는 관찰되지 않았다(Manda et al., 2000).
대뇌 세포 부착 분자(CERCAM) - CERCAM은 내피 세포의 표면에 포함되고(Starzyk et al., 2000) 특발 가족성 척추측만증과 관련된 것으로 파악된 9q 상의 후보 영역인 염색체 9q34.11에 지도화된다(Miller et al., 2012). CEECAM1 유전자는 신경계 및 침샘, 췌장, 간 및 태반과 같은 일부 분비 조직에서 널리 전사된다(Schegg et al., 2009). CERCAM 단백질은 ColGalT 효소인 GLT25D1 및 GLT25D2와 구조적으로 유사하다. 하지만 그 기능은 아직 알려져 있지 않더라도, 관련된 GLT25D1 단백질과 기능적으로 다르게 보이며, 그 단백질은 GLT25D1 및 GLT25D2 단백질과 같은 글리코실 트랜스퍼라아제로서 기능하지 않는다(Perrin-Tricaud et al., 2011).
기질-재구축 연관 5(MXRA5) - MXRA5는 아들리칸으로도 알려져 있으며 부착 프로테오글리칸을 암호화하고 ECM 재구축 및 세포-세포 부착에 관여하는 유전자과에 속한다(Rodningen et al., 2008). 암에서 MXRA5의 기능은 알려져 있지 않지만, MXRA5에서 체세포 돌연변이는 피부, 뇌, 폐 및 난소와 같은 다양한 조직으로부터 얻은 종양에서 확인된 바 있다. RT-PCR은 아들리칸(MXRA5)에 대해 수행했으며, 정상 결장 조직에 비해 결장암에서의 과발현의 마이크로어레이 발견이 확인되었다(13개 직장결장 종양 및 13개의 정상 조직)(Zou et al., 2002). 최근 연구에서 매트릭스-재구축 연관 5는 NSCLC에서 두 번째로 가장 빈번히 변이되는 유전자였다(첫 번째는 TP53)(Xiong et al., 2012).
ADAM 금속 펩시다제 도메인 8(ADAM8) - ADAM8은 ADAM(디스인테그린 및 금속 펩시다제 도메인)과의 구성원이다. ADAM8을 포함하는 다수의 ADAM 종들은 인간 악성 종양에서 발현되는데, 성장 인자 활동과 인테그린 기능의 조절에 관여하여 세포 성장과 침입의 자극을 초래한다(Mochizuki and Okada, 2007). ADAM8의 발현은 EGFR과 양의 상관관계가 있었다. 두 가지 모두 세포질과 세포막에서 주로 발현되었다(Wu et al., 2008). ADAM8은 검사한 폐암의 대부분에서 충분히 발현되었다. ADAM8의 외인성 발현은 포유동물 세포의 이동 활성도를 증가시켰으며, 이는 ADAM8이 폐암의 진행에서 유의한 역할을 할 수 있음을 나타낸다(Ishikawa et al., 2004). ADAM8은 폐암의 불량한 예후와 연관된 바 있다(Hernandez et al., 2010). ADAM8의 과발현은 보다 짧은 환자의 생존과 연관이 있었으며, RCC에서 원격 전이에 대한 양호한 예측자였다(Roemer et al., 2004b; Roemer et al., 2004a). 그 밖에 ADAM8의 발현 수준과 프로테아제 활성은 신경아교종의 침입 활성과 상관관계가 있었으며, 이는 ADAM8이 뇌암에서 종양 침입의 유의한 역할을 할 수 있음을 나타낸다(Wildeboer et al., 2006).
흑색종 항원과 F, 1(MAGEF1) - MAGE(흑색종-연관 항원) 상과의 알려진 대부분 구성원은 종양, 고환 및 태아 조직에서 발현되고, 이는 암/고환 발현 패턴(MAGE 아과 I)으로 묘사된 바 있다. MAGE 아군 I의 펩티드는 펩티드와 DC 백신 접종에서 성공적으로 사용되어 왔다(Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999). 이와는 반대로, MAGEF1과 같은 일부 MAGE 유전자들(MAGE 소집단 II)은 시험된 모든 성인과 태아의 조직에서 및 난소, 유방, 경부, 흑색종 및 백혈병 등의 다수의 종양 유형에서 흔히 발현된다(Nestle et al., 1998; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1999; Marchand et al., 1995; Thurner et al., 1999). 그럼에도 MAGEF1의 과발현은 NSCLC(Tsai et al., 2007) 및 대만의 결장직장암 환자의 코호트의 79%(Chung et al., 2010)에서 검출할 수 있었다.
작은 핵 리보핵산단백 200 kDa(U5)(SNRNP200) - pre-mRNA 스플라이싱은 전사된 pre-mRNA 단편으로부터 인트론을 제거하는 특화된 RNA와 단백질 서브유닛의 복합체인 스플라이시오솜에 의해 촉매된다. 이 스플라이시오솜은 소핵 RNA 단백질(snRNP) U1, U2, U4, U5 및 U6, 및 약 80개의 보존된 단백질과 함께 구성된다. SNRNP200은 스플라이시오솜의 촉매 활성화에 필수적인 단계인 U4/U6 듀플렉스의 감김풀기에 요구되는 유전자이다(Maeder et al., 2009). SNRNP200 발현은 심장, 뇌, 태반, 폐, 간, 골격 근육, 신장 및 췌장에서 검출되었다(Zhao et al., 2009). SNRNP200에서의 돌연변이는 보통염색체 우성 색소성 망막염(adRP)과 연관 있는 것으로 최근에 발견되었다(Benaglio et al., 2011; Liu et al., 2012).
TPX2, 미세관-연관, 호몰로그(Xenopus laevis)(TPX2) - TPX2는 방추 조립 요인이다. 이것은 유사분열 방추 및 세포자멸사 시 미세관의 정상 조립에 요구된다. TPX2는 크로마틴 및/또는 동원체 의존 미세관 핵형성에 요구된다(Bird and Hyman, 2008; Moss et al., 2009). 새로 합성된 TPX2는 거의 모든 오로라 A 활성화 및 난모세포 성숙화 시 p53 생체 내 p53 전장합성과 인산화에 요구된다(Pascreau et al., 2009). TPX2는 다수의 종양 유형에서 과발현되는 세포 주기-연관 단백질이며, 수막종(Stuart et al., 2010), 후두의 편평 세포 암종(SCCL)(Cordes et al., 2010), 구강 편평 세포 암종(SCC)(Shigeishi et al., 2009), 간세포 암종(HCC)(Satow et al., 2010), 췌장 종양(Warner et al., 2009), 난소암(Ramakrishna et al., 2010), 폐의 편평 세포 암종(Lin et al., 2006; Ma et al., 2006) 등이 있다. 이것은 흔히 오로라 A와 함께 공동-과발현됨으로써 암유전자 성질을 갖는 신규 기능 단위를 발생시킨다(Asteriti et al., 2010). TPX2 발현은 폐암에서 예후 지표이다(Kadara et al., 2009).
형질전환 성장 인자, 베타-유도, 68kDa(TGFBI) - TGFBI는 인간 폐 선암종 세포주에서 TGF-베타-유도 가능 유전자로서 처음 확인되었다. 이것은 분비된 세포외 기질 단백질을 위해 암호화하는데, 이는 세포 부착과 세포외 기질 성분에 대해 작용하는 것으로 사료된다. TGFBI의 발현은 정상적으로 섬유모 세포, 각질형성 세포 및 근육 세포에서 주로 발견된다(Bae et al., 2002). TGFBI는 결장(Kitahara et al., 2001), 췌장(Schneider et al., 2002) 및 신장(Ivanov et al., 2008)과 같은 몇몇 고형 종양에서 과발현된다. TGFBI는 폐암에서 하향조절되고(Zhao et al., 2004; Shao et al., 2006), 폐 종양 세포의 전이 잠재성을 감소시키고(Wen et al., 2011) 또한 과발현 시 세포자멸사에 의한 세포사에 기여한다(Zhao et al., 2006). NSCLC 샘플에서 상승된 TGFBI 발현과 화학요법에 대한 반응 사이의 강력한 연관이 관찰되었다(Irigoyen et al., 2010).
사이클린-의존 키나제 4(CDK4), 사이클린-의존 키나제 6(CDK6) - CDK4는 Ser/Thr 단백질 키나제과의 구성원이다. 이는 단백질 키나아제 복합체의 촉매 서브유닛으로서 세포 주기 G1기의 진행에 중요하다. 이 키나아제의 활성은 세포 주기 G1에서 S기 이행으로만 제한되고 그 발현은 일차적으로 전사 수준에서 조절된다(Xiao et al., 2007). CDK4 및 CDK6 효소 및 그 조절 인자, 즉, 사이클린은 배아형성, 항상성 및 발암에서 중대한 역할을 수행한다(Graf et al., 2010). 폐암 조직에서 CDK4 단백질의 발현 수준은 정상 조직에 비해 유의하게 증가했다(P < 0.001). CDK4 발현이 더 높은 환자들은 CDK4 발현이 낮은 환자보다 총 생존 기간이 뚜렷이 더 짧았다. 다변수 분석에 의하면 CDK4 발현의 수준은 폐암 환자의 생존율에 대한 독립적인 예후 지수임을 시사한다(P < 0.001). 더욱이 CDK4 발현의 억제는 세포 주기 조절인자인 p21의 발현도 유의하게 상승시킨다(Wu et al., 2011a). 내인성 K-Ras 종양유전자를 발현하는 폐 세포에서, Cdk2나 Cdk6가 아닌 Cdk4의 절제는 즉각적인 노화 반응을 유도한다. 단일 Cdk4 대립형질을 발현하는 폐나 다른 K-Ras-발현 조직에서는 이러한 반응이 발생하지 않는다. 전산화 단층촬영 스캔으로 검출이 가능한 진행성 종양에서의 Cdk4 대립형질의 표적화 또한 노화를 유도하고 종양 진행을 방지한다(Puyol et al., 2010).
베르시칸(VCAN) - VCAN은 아그레칸/베르시칸 프로테오글리칸과의 구성원이다. VCAN은 히알루로난, 테나스킨, 피불린-1, 피브로넥틴, CD44 및 L-셀렉틴, 피브랄린, 인테그린 및 링크 단백질은 포함하는 세포의 기질에서 다수의 분자들과 연관 있는 것으로 알려져 있다(Zheng et al., 2004). VCAN은 다양한 조직에서 발현된다. 조직 발육의 초기 단계에서 고도로 발현되고, 그 발현은 조직 성숙화 이후 감소한다. 그 발현은 또한 상처 치유와 종양 성장 동안 상승한다(Ghosh et al., 2010). VCAN의 인간 폐선암종(A549) 세포에 대한 RNA 간섭에 의한 녹다운(knockdown)은 생체 내에서 종양 성장을 상당히 억제했으나 시험관 내에서는 그렇지 않았다(Creighton et al., 2005). VCAN은 p53의 직접 표적이다. VCAN의 높은 발현은 초기 전립선암과 유방암의 종양주위 간질 조직에서도 발견되었으며, 이는 공격적인 종양 행위와 연관이 있다(Yoon et al., 2002).
유비퀴틴-접합 효소 E2S(UBE2S) - UBE2S는 유사분열 종결을 자극시키는 APC 보조 인자이다. 이의 고갈은 약물-의존 유사분열 정지를 연장시키고 유사분열 이탈을 억제시킨다(Garnett et al., 2009). UBE2S는 흔한 인간 암에서 과발현된다. 식도암에서 UBE2S는 종양 부하의 정도와 유의하게 연관된다. 이것의 양성은 신보강 요법에 대한 불량한 반응 및 악화된 생존과 연관이 있었다(Chen et al., 2009). UBE2S 자극자에서, 조기 성장 반응-1(Egr-1)은 혈청 반응 인자(SRF)에 대한 결합 부위가 확인되었다. 이 인자들의 과발현은 암세포 증식에 요구되는 UBE2S 발현을 증가시켰다(Lim et al., 2008).
SET 및 MYND 도메인 함유 3(SMYD3) - 히스톤 H3 리신-4-특이적 메틸전이효소인 SMYD3의 상향 조절은 결장직장 암종(CRC) 및 간세포 암종(HCC)의 증식에서 주요 역할을 하는 것으로 이미 보고되었다. 다른 연구에서는, 대다수의 유방암 조직들에서 SMYD3 발현 또한 상승하는 것을 밝혀냈다. CRC 및 HCC와 유사하게, 이 유전자에 대한 작은 간섭 RNA에 의한 SMYD3의 발현 억제는 유방암 세포의 억제된 성장을 초래했으며, 이는 SMYD3 발현의 증가 또한 유방암 세포의 증식에 필수적임을 시사한다(Hamamoto et al., 2006). RNA 간섭에 의한 SMYD3의 녹다운은 c-Met 발현을 하향 조절하고 HGF에 의해 유도되는 세포 이동과 침입을 억제한다(Zou et al., 2009). SMYD3은 HeLa 세포 증식 및 이동/침입에 있어서 중대한 역할을 수행하고, 인간 자궁경부 암종에 있어서 유용한 치료 표적이 될 수 있다(Wang et al., 2008b).
디스토린(DST) - DST(BPAG1-e)는 부착 연접 플라크 단백질의 플라킨 단백질 족의 구성원을 암호화한다. BPAG1-e는 상피 세포에서 발현되는데 케라틴 함유 중간 필라멘트를 반결합체(HD)에 고정시킨다. HD는 중층 및 복합 상피에서 상피 간질 부착을 자극하는 다중단백질 부착 복합체이다. 이들의 기능의 변조는 상처 치유와 암종침입 시 각질 세포의 분화 및 이동과 같은 다양한 생물학적 프로세스에서 중대하고, 그 세포가 기질로부터 단리되어 운동성 표현형을 취득하게 된다(Litjens et al., 2006). 악성 흑색종은 가장 공격적인 유형의 종양에 속한다. BPAG1은 인간 흑색종 세포주(A375 및 G361) 및 정상 인간 멜라닌세포에서 발현된다. 흑색종 환자의 혈청에서 항BPAG1 자동 항체의 수준은 건강한 자원자의 혈청의 수준보다 유의하게 더 높았다(p<0.01). 항BPAG1 자동 항체는 흑색종의 진단을 위한 유망한 표지자일 수 있다(Shimbo et al., 2010). DST는 유방암 침윤과 연관되었다(Schuetz et al., 2006). BPAG1 유전자는 코인두 암종 NPC의 증식, 세포자멸사, 침입 및 전이에 관여할 가능성이 있다(Fang et al., 2005).
용질 운반체 과 34(인산 나트륨), 구성원 2(SLC34A2) - SLC34A2는 pH에 민감한 나트륨 의존성 인산염 전달체이다. 충분히 분화된 종양에서 SLC34A2 유전자 발현의 상향조절은 난소 발암 과정의 세포 분화를 반영할 수 있으며 난소암 진단 및 예후의 가능한 표지자의 역할을 할 수 있다(Shyian et al., 2011). RT-PCR은 유두 갑상선암에서 SLC34A2 발현의 증가를 확인했다(Kim et al., 2010b). 정상 조직과 비교해서 유방암 조직들 사이에서 SLC34A2의 유의하게 증가된 유전자 발현도 있었다(Chen et al., 2010a).
테나신 C(TNC)(헥사브라키온)는 태아 발육(Bartsch et al., 1992), 상처 치유(Mackie et al., 1988) 및 신생물(Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003) 과정과 같은 상승된 이동 활성과 밀접하게 연관된 과정에서 고도로 상향조절되는 세포외 기질 단백질이다. 더욱이 TNC는 높은 증식 지수를 갖는 종양 혈관에서 과발현되는데, 이 지수는 TNC가 신생물 혈관형성에 관여함을 나타낸다(Kim et al., 2000). TNC의 과발현은 또한 결장암(De et al., 2013), 최악의 예후와 연관된 바 있는 선낭 낭성 암종(Siu et al., 2012), 혈관형성을 자극할 가능성이 있는 유년 비인두 혈관섬유종(Renkonen et al., 2012), 진행성 흑색종(Fukunaga-Kalabis et al., 2010), 증식, 이동 및 전이에서 역할을 수행하는 췌장암(Paron et al., 2011)으로부터 보고된 바 있다.
레티큘로칼빈 1, EF-핸드 칼슘 결합 도메인(RCN1)/레티큘로칼빈 3, EF-핸드 칼슘 결합 도메인(RCN3) - 레티큘로칼빈 1은 ER의 내강에 위치한 칼슘-결합 단백질이다. 면역조직 화학 검사에 의하면 태아와 성인의 다양한 기관 특히 내분비와 외분비 기관에서 RCN의 광범위한 분포를 잘 보여주었다. RCN의 과발현은 종양형성과 종양 침입 및 약물 내성에서 역할을 수행할 수 있다(Fukuda et al., 2007). 레티큘로칼빈 1(RCN1)은 내피(EC) 및 전립선암(PCa) 세포주 모두에서 세포 표면 관련 단백질이다. 세포 표면에서 RCN1 발현은 골수 내피 세포의 종양 괴사 인자 알파 치료에 의해 상향조절되었다(Cooper et al., 2008). RCN1은 결장직장 암종(CRC)에서 상향조절되고 암세포나 암세포 부근의 간질 세포에 국한되었다. 이는 CRC 표지자의 신규 후보일 수 있다(Watanabe et al., 2008). RCN3은 분비 경로에 국한되는 복수의 EF-핸드 Ca2 +-결합 단백질들이 CREC(Cab45/레티큘로칼빈/ERC45/칼루메닌)과의 구성원이다(Tsuji et al., 2006). 희돌기 교종에서 RCN3은 잠재적으로 중요한 후보 유전자로서 제안된다. 하지만 RCN3의 기능에 대해 거의 알려진 바가 없다(Drucker et al., 2009).
바소뉴클린 1(BNC1) - 바소뉴클린은 고도로 제약된 조직 분포를 갖는 아연-핑거 단백질이다(Tseng, 1998). 이제까지 바소뉴클린은 주로 층화된 편평 상피(피부, 구강 내피, 식도, 질 및 각막)의 기저 각질 세포 및 고환과 난소의 생식 발생 세포에서 검출된 바 있다(Tseng and Green, 1994; Weiner and Green, 1998). 현재 바소뉴클린이 rRNA 유전자(rDNA)의 세포-유형-특이적 전사 인자라는 상당한 증거가 있다. 바소뉴클린의 아연 핑거는 rDNA 자극제 내부에서 3개의 진화적으로 보전된 부위와 상호작용한다(Iuchi and Green, 1999; Tseng et al., 1999). CpG 메틸화에 의한 후성적 조절은 종양형성은 물론 암 요법에 대한 반응에서 중요한 역할을 갖는다. BNC1은 방사선저항의 H1299 인간 비소세포 폐암(NSCLC) 세포주에서 저메틸화되었다. H1299 세포에서 BNC1 mRNA 발현의 억제는 이 세포들의 이온화 방사능에 대한 저항 또한 감소시켰다(Kim et al., 2010a). BNC1의 이상 DNA 메틸화 또한 만성 림프병 백혈병(CLL) 샘플에서 검출되었다(Tong et al., 2010). 신장 세포 암종(RCC)에서, BNC1의 메틸화는 종양 크기나 병기 또는 등급과 무관하게 더 불량한 예후와 연관이 있었다(Morris et al., 2010).
변형성, 산성 코일화-코일 함유 단백질 3(TACC3) - TACC3은 ch-TOG(대장 및 간 종양 과발현된 유전자) 및 동원체 섬유에서 미세관을 교차결합시키는 클라트린과의 복합체에 존재한다. TACC3은 고환, 폐, 비장, 골수, 가슴샘 및 말초 혈액 백혈구 등의 일부 증식성 조직에서 발현된다. TACC3 발현은 일부 인간 종양 유형에서 변형된다. 세포 내에서 TACC3은 중심체와 방수 미세관 모두에 위치하지만 별미 세관은 아니다(Hood and Royle, 2011). TACC3 발현은 p53 발현과 상관관계가 있었으며, 그 종양이 TACC3 및 p53을 고도로 발현시킨 환자의 경우 두 면역 염색에 대한 저수준 발현을 갖춘 환자보다 예후가 유의하게 더 불량했다(P = 0.006). 이는 TACC3의 증가가 증식적 이점을 NSCLC에 부여하고 종양 진행에 기여할 수 있으며 또한 TACC3 발현은 NSCLC에서 임상적 결과의 강력한 예후 지표임을 시사하는 것이다(Jung et al., 2006). Tacc3은 노치 신호전달 경로의 부정적인 조절인자일 수 있다(Bargo et al., 2010).
페카넥스-유사 3(Drosophila)(PCNXL3) - 페카넥스-유사 단백질 3(PCNXL3)은 멀티패스 막 단백질이고; 이는 페카넥스 과에 속한다. PCNXL3 유전자는 염색체 영역 11q12.1-q13에 대해 지도화되었다. 세 개의 신규 인간 종양-연관 변위 변곡점은 표지자 D11S4933과 D11S546 사이의 염색체 11q13 영역에 위치했다. 따라서 PCNXL3은 11q13-연관된 질병 유전자일 수 있다(van et al., 2000).
드로셔, 리보핵산 분해 효소 III형(DROSHA) - 드로셔는 microRNA(miRNA) 또는 RNAi 경로의 일환으로써 상보적 전령 RNA(mRNA)의 분할을 유도하기 위해 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)와 상호작용으로써 광범위한 기타 유전자들을 조절하는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 짧은 RNA 분자의 처리 개시에 책임이 있는 클래스 2 RNase III 효소이다. microRNA 분자는 pri-miRNA로 알려진 긴 RNA 초기 전사체로서 합성되고, 이는 드로셔에 의해 분할되어 pre-miRNA로 알려진 약 70개 길이의 염기쌍으로 된 특정적인 줄기-루프 구조를 생성한다(Lee et al., 2003). 드로셔는 마이크로프로세서 복합체로 불리는 단백질 복합체의 일부로 존재하고, 이중 가닥 RNA 결합 단백질 파셔(또는 DGCR8) 또한 포함하는데(Denli et al., 2004), 이는 드로셔 활성도에 필수적이며 적합한 처리에 요구되는 miRNA 1차 전구체(pri-miRNA)의 단일가닥 조각들을 결합시킬 수 있다(Han et al., 2006). 인간 드로셔는 리보솜 RNA 전구체의 처리에 관여하는 핵 dsRNA 리보뉴클레아제로서 확인된 2000년에 클로닝되었다(Wu et al., 2000). 드로셔는 최초로 확인되어 클론된 인간 RNase III 효소이다. miRNA의 처리와 활성도에 참여하는 다른 두 가지 인간 효소는 다이서(Dicer) 및 아르고노트(Argonaute) 단백질이다. 드로셔와 파셔 모두 miRNA 1차 전구체(pri-miRNA)에서 miRNA 2차 전구체(pre-miRNA)로의 처리가 발생하는 세포 핵에 국한된다. 이후 후자의 분자는 세포질에서 RNase 다이서에 의해 성숙한 miRNA로 더욱 처리된다(Lee et al., 2003). 드로셔 및 다른 miRNA 처리 효소들은 암 예후에 중요할 수 있다(Slack 및 Weidhaas, 2008).
세포 분열 주기 6 호몰로그(사카로마이세스 세레비지애)(CDC6) - CDC6 단백질은 DNA 복제의 조기 단계에서 조절인자로 기능한다. 이 단백질은 세포 주기 G1 동안 세포 핵이 국한되지만 S기 시작 시 세포질로 전위된다. 더욱이 CDC6은 고등의 진핵 세포에서는 ATR과의 상호작용을 통해 복제-체크포인트 활성화를 조절하는 것으로 사료된다(Yoshida et al., 2010). CDC6은 DNA 복제에 필수적이며, 그 조절 완화는 발암에 관여한다. RNA 간섭(RNAi)에 의한 CDC6의 하향 조절은 세포 증식을 방지하고 세포자멸사를 자극시키는 것으로 발견되었다(Lau et al., 2006). CDC6의 과발현은 몇몇 암에서 발견되었다. CDC6이 과발현되는 암의 유형에는 위암(Tsukamoto et al., 2008), 뇌암(Ohta et al., 2001), 구강 편평 세포 암종(Feng et al., 2008), 경부 암종(Wang et al., 2009b) 및 악성 중피종(Romagnoli et al., 2009)이 있다.
탈요오드 효소, 요오드티로닌, II형(DIO2) - DIO2 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 요오드티로닌 탈요오드 효소과에 속한다. 이것은 갑상선에서 고도로 발현하고, 그레이브스씨 병 및 갑상선종 환자에서 갑상선 T3 생산의 상대적인 증가에 유의하게 기여할 수 있다(Meyer et al., 2008; de Souza Meyer et al., 2005). 그 유전자 발현 양상은 코인두 암종(NPC)의 상향 및 하향 유형 사이에 상당한 차이가 있다. DIO2 유전자의 발현은 상향 진행 유형(두개저의 국소 성장 및 침입)보다 하향 진행 유형(하향 = 원격 전이)에서 더 높으며, 이는 NPC의 전이 가능성과 밀접한 관계가 있을 수 있다(Liang et al., 2008). DIO2 mRNA는 물론 DIO2 활성은 뇌 종양에서 발현된다(Murakami et al., 2000). 폐에서 D2 활성은 존재하고 말초 폐 및 폐암 조직과 유사하다(Wawrzynska et al., 2003).
키네신과 구성원 26B(KIF26B) - 키네신은 진핵 세포에서 발견되는 모터 단백질 등급에 속하는 단백질이다. 키네신은 미세소관 섬유를 따라 이동하고 ATP의 가수분해에 의해 힘을 받는다(따라서 키네신은 ATPases임). Kif26b는 키네신과 유전자로서 Sall1의 하류 표적이다(Nishinakamura et al., 2011). Kif26b는 요관싹과 접촉하는 간염 세포의 부착을 조절하기 때문에 신장 발육에 필수적이다. 시험관 내 Kif26b의 과발현은 비근육 미오신과의 상호작용을 통해 세포 부착의 증가를 초래했다(Terabayashi et al., 2012; Uchiyama et al., 2010).
세르핀 펩티다제 억제제, clade B(난알부민), 구성원 3(SERPINB3) - 편평 세포 암종 항원(SCCA)은 SERPINB3으로도 불리며, 세린 프로테아제 억제제(세르핀) 고분자량과의 구성원이다(Suminami et al., 1991). 머리와 목 조직 및 기타 상피 암에서 높은 농도가 보고된 바 있다(Torre, 1998). SCCA는 종양 주위 조직에 비해 종양 조직에서 과발현되는 것으로 보고되었으며, 이는 HCC의 조직학적 검출을 위한 가능한 표지자로서의 역할을 시사한다(Pontisso et al., 2004). 세르핀 B3/B4 특히 세르핀 B4는 이상 상피 증식에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 세로핀 B3/B4의 평가는 특히 폐암에 대해 증가된 감수성을 가진 환자에서 질병 진행의 예측에 대한 예후 가치를 가질 수 있다(Calabrese et al., 2012). 한편으로는 SCCA1(SERPINB3)은 리소좀 손상에 의해 유도되는 세포사를 억제하는 반면, 죽음 수용체 세포자멸사 경로와 무관하게 카스파아제-8 활성화에 의해 ER 스트레스에 대해 세포를 감작화한다(Ullman et al., 2011). 일부 발견 내용에 의하면 SERPINB3은 표피 장벽 이상에 있어 중요한 역할을 한다. SERPINB3은 표피의 장벽 기능에 대한 중대한 결정인자일 수 있다(Katagiri et al., 2010).
시클린-의존 키나제 1(CDK1) - CDC2(세포 분열 주기 2)는 p34cdc2 또는 CDK1(시클린-의존 키나제 1)로도 알려져 있으며, 세린/트레오닌 단백질 키나제의 과인 CDK에 속하고 세포 주기 제어에서 주요 역할을 수행한다(Vermeulen et al., 2003). 문헌(Vermeulen et al., 2003)에 의하면 사이클린과 같은 다른 세포 주기 단백질의 발현은 훨씬 더 빈번히 조절곤란 됨에도 불구하고 CDC2의 과발현은 몇몇 암에서 발견되었다. CDC2의 과발현은 NSCLC에 대해 설명된 바 있다(Xu et al., 2011; Zhang et al., 2011). 페루말(Perumal) 등(2012)은 CDC2의 과발현은 불량한 예후와 상관관계가 있었다고 보고했다(Perumal et al., 2012). 더욱이, 한 연구에서는 조기의 비소세포 폐암에서 재발의 예측인자로서 CDC2의 가능한 임상적 사용을 시사했다(Kubo et al., 2014).
콜라겐, XI형, 알파 1(COL11A1) - COL11A1은 부수적 원섬유성 교원질인 XI형 콜라겐의 알파쇄 2개 가운데 1개를 암호화한다. COL11A1은 몇몇 암에서 상향 조절되는 것으로 보고되었다. 예를 들어 결장직장암(Freire et al., 2014), 유방암(Ellsworth et al., 2009), 위암(Zhao et al., 2009b), 방광 종양(Ewald et al., 2013). 난소암에서 COL11A1의 발현은 암 재발 및 불량한 생존율과 연계되었다. COL11A1의 녹다운은 실험관내 마우스의 세포 이동, 침입 및 종양 진행의 감소를 초래했다(Cheon et al., 2014; Wu et al., 2014b). COL11A1은 마이크로어레이 분석에 근거할 때 건강한 대조에 비해 비흡연 여성 폐암 환자의 폐 조직에서 차등 발현되는 것으로 발견되었다(Lv and Wang, 2015).
콜라겐, 타입 I, 알파 2(COL1A2) - COL1A2는 그 삼중 나선이 2개의 알파쇄와 1개의 알파 2쇄로 구성된 I형 콜라겐의 프로알파2(pro-알파2) 쇄를 암호화한다. 위암 샘플의 경우 COL1A2는 정상 조직에 비해 상향조절되는 것으로 발견되었으며(Yan et al., 2014; Yang et al., 2007) 또한 진행 단계와 연관이 있었다(Yasui et al., 2004). COL1A2는 골육종(Wu et al., 2014a), 진행 단계의 방광암(Fang et al., 2013), 두경부/구강 편평 세포 암종(HNOSCC)(Ye et al., 2008), 및 아동에서 가장 흔한 악성 뇌종양인 속질모세포종(Liang et al., 2008b)에서 상향조절되는 것으로 보고되었다.
페리오스틴, 골모세포 특이적 인자(POSTN) - POSTN은 파시클린과에 대한 유사성을 갖는 단백질을 암호화하고 세포 생존과 혈관생성에 관여하는 유전자이며, 다양한 유형의 인간 암에서 종양 진행의 유망한 표지자로서 출현했다(Ruan et al., 2009). 페리오스틴 단백질이나 mRNA의 높은 발현이 대부분의 고형암에서 검출되었으며, 여기에는 유방(Zhang et al., 2010b), 대장(Kikuchi et al., 2008), 두경부(Kudo et al., 2006), 췌장(Kanno et al., 2008), 유두 갑상선(Puppin et al., 2008), 전립선(Tischler et al., 2010), 난소(Choi et al., 2010), 폐(Takanami et al., 2008) 및 간(Utispan et al., 2010)의 암종 및 식도 편평 세포 암종(Kwon et al., 2009)이 포함된다. 페리오스틴은 폐암에서 비정상적으로 높게 발현되고, 혈관형성, 침입 및 전이와 상관관계가 있다(Takanami et al., 2008). A549 비소세포 폐암(NSCLC)의 세포에서 페리오스틴의 침묵은 종양 세포 성장을 억제하고 세포 침윤을 감소시킨다(Wu et al., 2013).
AT 후크, DNA 결합 모티프, 함유 1(AHDC1) - 이 유전자는 DNA 결합에서 기능할 가능성이 있는 AT-후크 2개를 포함하는 단백질을 암호화한다. 이 유전자에서의 돌연변이는 대뇌의 시각 장애와 연관이 있었다(Bosch et al., 2015). 전장 엑솜 시퀀싱을 사용하여, AHDC1 드노보 절삭 돌연변이를 증후군 표현성 언어 지연, 근육 긴장 저하 및 무호흡증이 있는 개인에서 확인했다. 돌연변이는 이러한 유전적 증후군을 유발할 가능성이 가장 크다(Xia et al., 2014).
세포자멸사 유도 인자, 미토콘드리아-연관 2(AIFM2) - 이 유전자는 한가닥 DNA와 결합하고 박테리아 및 바이러스 DNA의 존재 하에서 세포자멸사에 기여하는 것으로 사려되는 플라빈 단백질 산화환원 효소를 암호화한다. AIFM2는 잘 특성화되지 않지만, 제한된 증거에 의하면 종양 억제인자로서 기능할 수 있음을 시사한다. AIFM2는 종양 억제인자 p53에 의해 활성화되고, p53의 이소성 발현은 세포자멸사의 유도를 잘 보여준다. 더욱이, AIFM2 발현은 신장, 위, 결장직장 및 기타 암의 샘플을 포함하는 인간 종양의 패널에서 하향조절되는 것으로 나타났다(Ohiro et al., 2002; Wu et al., 2004). 하지만 녹아웃(knockout) 마우스 모델의 경우, AIFM2는 p53-의존 종양 억제에 요구되지 않았다(Mei et al., 2006). 세포 배양에서, AIFM2는 아데노신-유도 세포자멸사의 매개에 관여한다(Yang et al., 2011).
염색체 6 오픈 리딩 프레임 132(C6orf132) - C6orf132는 염색체 오픈 리딩 프레임 132를 암호화한다. 유전자 C6orf132는 염색체 6p21.1에 위치한다(Mungall et al., 2003). 이 유전자의 기능은 아직 알려진 바 없다.
CCZ1 액포 단백질 이동 및 생물 발생 연관 호몰로그(사카로마이세스 세레비지애)(CCZ1), CCZ1 액포 단백질 이동 및 생물 발생 연관 호몰로그 B(사카로마이세스 세레비지애)(CCZ1B) - CCZ1은 CCZ1 세포 단백질 이동 및 생물 발생 연관 호몰로그(사카로마이세스 세레비지애)를 암호화한다. CCZ1B는 CCZ1 액포 단백질 이동 및 생물발생 연관 호몰로그 B(사카로마이세스 세레비지애)를 암호화한다. CCZ1 및 CCZ1B는 비교 단백질체학에 의해 예쁜꼬마선충에서 진화적으로 보존된 인간 유전자로서 확인되었다(Lai et al., 2000). CCZ1 및 CCZ1B 유전자는 염색체 7p22.1에 위치한다(Hillier et al., 2003). CCZ1은 포식소체에 대해 GTPase RAB7A7을 모집함으로써 리소좀 생물발생 및 포식소체 성숙 과정에서 작용하는 것으로 보인다(Nieto et al., 2010). CCZ1B 유전자는 비특성화된 유전자이다.
콜라겐, V형, 알파 2(COL5A2) - 이 유전자는 풍부하지 않은 원섬유 아교질의 알파 쇄를 암호화한다. COL5A2는 주위의 비암성 조직에 비해 결장직장암 샘플에서 상향조절되는 것으로 보고되었다(Fischer et al., 2001). 유관 상피내암종(DCIS), 침윤성 관상피암(IDC) 및 유방암 환자의 간질과 찍지은 샘플에서 IDC의 COL5A2에 대한 상승된 발현이 드러났다(Vargas et al., 2012). 골육종에서 COL5A2는 상향조절되고 종양 형성에 중요한 것으로 보고되었다(Wu et al., 2014).
콜렉틴 아과 구성원 12(COLEC12) - 이 유전자는 콜라겐-유사 서열 및 탄수화물 인지 부위를 소유하는 단백질인 C-렉틴과의 구성원을 암호화한다. COLEC12 단백질은 스캐빈저 수용체이며, 숙주 방어와 연관된 몇몇 기능을 나타내는 세포 표면 당단백질이다. COLEC12 유전자는 미분화 갑상선암의 가능한 바이오마커 후보로 제안되었다(Espinal-Enriquez et al., 2015). COLEC12는 HER2-양성 위암 세포주 BT474에서 차등 발현되었으며 트라스투주맙 효율에 기여할 수 있다(von der Heyde et al., 2015).
코토머 단백질 복합체, 서브유닛 감마 1(COPG1) - COPG1은 코토머 복합체 1(COPI)의 단백질 서브유닛을 암호화한다. COPI-도포된 수포는 골지로부터 ER로의 역행성 이동 및 골지내 이동을 매개한다. COPI의 세포질 전구체는 칠합체 코트머 복합체로서 2개의 하위복합체로서 사료될 수 있다. 첫째는 AP 클라트린 어댑터 서브유닛에 원격으로 상동성인 베타-, 감마-, 델타- 및 제타-COP 서브유닛들로 구성된다(Watson et al., 2004). EGFR의 EGF-의존 핵 운반은 골지로부터 ER로의 역행 이동에 의해 조절되고, 여기에는 EGFR과 COPI 코토머의 서브유닛의 하나인 감마 COP와의 연관이 관여한다(Wang et al., 2010b). 면역 조직화학에 의해, COPG1은 폐암 유래 내피 세포와 암성 폐 세포에서 풍부하게 발현되는 것으로 확인되었다(Park et al., 2008).
CSNK2A2 - 카세인 키나제 II 서브유닛 알파-프라임은 인간에서 CSNK2A2 유전자에 의해 암호화되는 효소이다. 한 소급 적용되는 연구는 NSCLC 환자에서 림프절 전이 상태와 무관하게 완전 절제 후 CSNK2A1이 유용한 예후 표지자일 수 있음을 보여주었다(Wang et al., 2010c). CSNK2A2는 말기의 인간 결장 직장암에서 종양 진행과 연관되었다(Nibbe et al., 2009).
가지세포 발현 7 막횡단 단백질(DCSTAMP) - 이 유전자는 수지상 세포에서 주로 발현되는 7회 통과 막횡단 단백질을 암호화한다. 암호화된 단백질은 수지상 세포에 의해 실행되는 광범위한 면역학적 기능에 관여한다. DCSTAMP는 갑상선 유두암에서 차등 발현되는 유전자로 확인된 바 있으며(Lee et al., 2009), 그에 따라 이러한 샘플에서 상승된 수준으로 발현되는 것으로 확인되었다(Kim et al., 2010).
선천성 이상각화증 1, 디스케린(DKC1) - DKC1 유전자는 2개의 뚜렷한 복합체에서 기능한다. 디스케린은 리보좀 및 소형 핵 RNA 상에서 우리딘의 변형 및 텔로머라제 RNA 성분(TERC)의 안정화를 모두 매개한다. 인간 종양에서, 디스케린의 발현은 rRNA 변형과 TERC 수준과의 연관이 있는 것으로 나타났다(Penzo et al., 2015). 더욱이 디스케린 과발현은 HCC 등의 다양한 종양 유형에서 불리한 예후와 연계된 바 있다(Liu et al., 2012).
이중-특이성 티로신-(Y)-인산화 조절 키나제 2(DYRK2)/이중-특이성 티로신-(Y)-인산화 조절 키나제 4(DYRK4) - DYRK2 및 DYRK4는 Dyrk 단백질 키나제과(5개 구성원의 포유류과)에 속하고, 이는 세포 분화, 증식 및 생존에 관여한다(Papadopoulos et al., 2011). DYRK2는 Snail 분해에 의해 유방암에서 상피-간엽 전환을 제어한다(Mimoto et al., 2013). DYRK2는 p53을 조절하여 세포자멸사를 유도하고 DNA에 대한 반응을 강화시킨다. DYRK2는 유전독성 부하에 대한 노출 시 핵으로 전위되고 인산화에 의해 p53을 활성화시킨다(Meulmeester and Jochemsen, 2008; Taira et al., 2007). DYRK4 유전자는 CCDN2 유전자가 영향을 받는 CRC에 대한 감수성 위치로 알려진 염색체 12p13.32에 지도화된다(Jia et al., 2013; Peters et al., 2013). 일부 연구에서는 신경원 분화에서 DYRK4의 역할을 강조했다(Leypoldt et al., 2001; Slepak et al., 2012).
ERO1-유사(사카로마이세스 세레비지애) ERO1L - ERO1-유사 단백질 알파는 인간에서 ERO1L 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. ERO1-α는 소포체 내 존재하는 산화 효소이며 저산소증 하에서 유도된다. ERO1-α는 다양한 유형에서 과발현된다. 더욱이 암-연관 ERO1-α는 산화 접힘을 통해 MHC 클래스 I 분자의 발현을 조절한다(Kukita et al., 2015). 암 세포에서 hERO1-α의 발현은 더 나쁜 예후와 연관이 있으므로 유방암 환자에서 예후 인자가 될 수 있음이 시사된 바 있다(Kutomi et al., 2013). 자연적 인간 종양에서, ERO1L mRNA는 저산소증 매개 환경에서 특이적으로 유도되었으며 이는 상향조절된 VEGF 발현의 그것과 일치한다. siRNA를 통한 ERO1L 생산의 감소는 VEGF 분비의 유의한 억제, 절충되는 증식 능력 및 강화된 세포자멸사를 유도하는 것으로 보여진 바 있다(May et al., 2005).
서열 유사성 83과, 구성원 A(FAM83A) - FAM83A는 몇몇 다양한 암 조직 유형에서 상승되는 것으로 판정되었다(Cipriano et al., 2014). 하지만 FAM83A의 기능은 여전히 불분명하다(Boyer et al., 2013). FAM83A는 폐암에서 종양 특이적 유전자로 예측되었으며, 그 발현은 폐암 샘플에서 실험적으로 확인된 바 있다. 발현은 선암종에서 특히 높았다(Li et al., 2005). 다른 연구에서는 폐암 질환의 진행과의 상관관계를 보고했다(Liu et al., 2008).
유약 X 정신 지체, 보통염색체 호몰로그 1(FXR1) - FXR1 유전자에 의해 암호화된 이 단백질은 기능적으로 유사한 단백질인 FMR1 및 FXR2와 상호작용하는 RNA 결합 단백질이다. FXR1은 암 등 다양한 인간 질환에서 탈조절된다. FXR1은 암세포의 증식, 이동 및 침윤을 증가시킬 수 있는 종양유전자로서 작용했다(Jin et al., 2015). FXR1은 NSCLC에서 신규 암 유전자이며, FXR1은 다른 2개의 종양 유전자, 즉, 단백질 키나제 C, 이오타(PRKCI) 및 폐암 세포에서 동일한 앰플리콘 내에서 상피 세포 형질전환 2(ECT2)와 신규 복합체를 형성하여 조절 기능을 실행한다(Qian et al., 2015b). NSCLC에서 증가된 FXR1 발현은 불량한 생존율을 예측하는 후보 바이오마커이며 신규 치료 표적일 수 있다고 보고된 바 있다. 그 밖에 FXR1 발현은 다수의 인간 암에서 불량한 임상적 결과와 상관관계가 있으며, 이는 암 진행에서 이 RNA 결합 단백질의 더 광범위한 관여를 시사한다(Qian et al., 2015a).
G2/M-기 특이적 E3 유비퀴틴 단백질 리가아제(G2E3) - G2/M 특이적 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제는 인간에서 G2E3 유전자에 의해 암호화되는 효소이다. G2E3은 세포질과 핵 사이를 이동하고, 핵소체에 국소화되고 DNA 손상에 대한 반응으로 핵질에 재국소화된다. G2E3은 조기 배아발생 시 세포자멸사의 방지에 필수적인 이중 기능 유비퀴틴 리가아제이다(Brooks et al., 2008). 일부 결과는 G2E3가 DNA 손상 반응 및 세포 생존의 분자 결정인자이며 또한 그 손실은 DNA-손상 처리에 대한 종양 세포를 감작시킨다고 시사하고 있다(Schmidt et al., 2015b). 더욱이 G2E3의 손실은 세포자멸사와 암세포 증식의 감소를 유발시켰다. 따라서 G2E3은 생존 인자로서 작용한다(Schmidt et al., 2015a).
구아닐레이트 결합 단백질 5(GBP5) - 인간 구아닐레이트 결합 단백질 5(hGBP5)는 인터페론-감마-유도가능 큰 GTPase과에 속하고, 이는 전염증성 사이토카인에 의한 높은 유도로 잘 알려져 있다(Wehner and Herrmann, 2010). hGBP5는 2개의 다른 단백질을 형성하는 3개의 스플라이스 변이체로 존재하고, 그 가운데 종양-특이적인 것은 97개 아미노산에 의해 C-말단 절단된다(Fellenberg et al., 2004).
글루타미나아제(GLS) - GLS 유전자는 K형 미토콘드리아 글루타미나아제를 암호화한다. 글루타미나아제(GLS)는 글루타민을 글루탄산염으로 전환시키며, 암세포 대사, 성장 및 증식에서 주요 역할을 수행한다. 일부 연구에서는 GLS가 종양 발생에 요구되고 작은 분자를 지지하고 또한 GLS의 유전적 억제가 암 요법을 위해 GLS에 대한 종양 세포-자율적 의존성을 표적으로 하는 가능한 접근 방식임을 잘 보여준다(Xiang et al., 2015). GLS 스플라이스 변이체의 일과성 녹다운은 GAC의 손실이 NSCLC 암 세포 성장에 대해 가장 유해한 영향을 미쳤음을 나타냈다(van den Heuvel et al., 2012). GLS1의 발현은 상향조절되고, 결장직장암(Huang et al., 2014a), 간세포 암종(HCC)(Yu et al., 2015) 및 췌장관 선암종(PDA)에서 임상병리학적 요인들과 상관관계가 있다(Chakrabarti et al., 2015).
열충격 70 kDa 단백질 2(HSPA2) - HSPA2는 유방암(Mestiri et al., 2001), 자궁경부암(Garg et al., 2010a), 표재성 방광암(Garg et al., 2010b), 코인두 암종(Jalbout et al., 2003) 및 악성 종양(Chouchane et al., 1997)과 같은 인간 암의 하위조합에서 비정상적 수준으로 발현되는 잠재적 암자극 단백질로서 확인된 바 있다. HSPA2 유전자 활성의 일부 수준은 몇몇 인간 암으로부터 유래된 세포주에서도 관찰되었지만(Scieglinska et al., 2008), 암세포에서 HSPA2 유전자의 침묵은 성장 억제 및 암형성 가능성의 감소로 이어졌다(Rohde et al., 2005; Xia et al., 2008). 더욱이 HSPA2의 다형성은 폐암 전개의 위험 증가와 연관이 있다(Wang et al., 2010b). HSPA2의 과발현은 인간 유방암, 자궁경부암 및 표재성 방광암에서 증가된 세포 증식, 불량한 분화 및 림프절 전이와 상관관계가 있다(Garg et al., 2010a; Garg et al., 2010b; Mestiri et al., 2001).
열충격 70 kDa 단백질 8(HSPA8) - HSPA8 유전자는 열충격 단백질 70과 Hsc70의 구성원을 암호화하고, 이는 열 유도성 및 기본구성적으로 발현되는 구성원 모두를 함유한다. HSPA8은 발생기의 폴리펩티드와 결합하고 단백질 합성, 접기, 세포 구획 사이의 교통 및 열화를 지지한다(Beckmann et al., 1990). Hsc70은 분자 섀퍼론으로서 기능하고 단백질 합성, 접기, 조립, 세포 구획 사이의 수송 및 분해를 지지한다(Bukau and Horwich, 1998; Hartl & Hayer-Hartl, 2002). Hsc70은 비음성 유선 세포는 물론 유방암 세포에서 발현되고(Kao et al., 2003; Vargas-Roig et al., 1998) 항암제 내성 암세포에서 Hsp/hsc70의 과발현(Ciocca et al., 1992; Lazaris et al., 1997)은 이 단백질들의 가능한 임상적 표지자에 관한 연구를 자극시킨 바 있다(Ciocca & Calderwood, 2005). 세포 증식에서 카텝신 D를 과발현하는 암세포의 더 높은 종양 성장을 설명할 수 있는 이 분비된 hsc70 섀퍼론의 가능한 역할이 존재한다(Nirde et al., 2010). 더욱이 뤼신(Ruisin) 등은 이 유전자의 다형성과 이 유전자의 폐암 위험 사이의 연관을 보고했다(Rusin et al., 2004).
열충격 70 kDa 단백질 1A(HSPA1A) - HSPA1A는 HSP72로도 알려져 있으며, 암에서 강력히 상향조절되고 p53-의존 및 p53-비의존 노화 경로를 억제함으로써 종양 세포 성장에 대한 중대한 역할을 하는 것으로 나타났다(Sherman, 2010). 과발현은 RCC(Atkins et al., 2005) 및 위장관 암종(Wang et al., 2013a)에서 설명되고, 후자는 림프절의 진행, 증식 및 존재 및 원격 전이와 유의한 상관관계를 보였다.
열충격 70 kDa 단백질 1B(HSPA1B) - HSPA1B는 HSP70-2로도 알려져 있으며, 정모세포 및 암세포의 성장에 필수적인 고환 특이적 열충격 단백질 70-2를 암호화한다(Hatfield and Lovas, 2012). 다른 연구들은 자궁경부암(Garg et al., 2010b), 신장 세포 암종(Singh and Suri, 2014) 및 방광암의 질병 진행에서 HSP70-2의 중요한 역할을 시사하고, 유전자 내의 다형성은 위암의 발전과 연관이 있다(Ferrer-Ferrer et al., 2013). 일부 기능적 HSPA1B 변이체는 폐암의 위험 및 생존과 연관이 있다. 이러한 Hsp70 유전 변이체들은 폐암의 위험 및 예후를 예측하는 유용한 바이오마커를 제안할 수 있다(Szondy et al., 2012; Guo et al., 2011).
열충격 70 kDa 단백질 1-유사(HSPA1L) - 열충격 70 kDa 단백질 1L은 인간에서 염색체 6 상의 HSPA1L에 의해 암호화되는 단백질이다. 이는 HSPA1A 및 HSPA1B에 대한 밀접한 상동성을 공유하지만, 다르게 조절되고 열 유도성이 아니다(Ito et al., 1998). 유전자 내의 다형성은 전립선암의 감수성과 예후(Sfar et al., 2010) 및 간세포 암종의 감수성(Medhi et al., 2013)과 연관된다.
열충격 70 kDa 단백질 6(HSP70B')(HSPA6) - 열충격 단백질(Hsp) 70B'는 인간 Hsp70 섀퍼론으로 엄격히 유도가능하고 대부분의 세포에서 기저 발현 수준은 거의 없거나 전혀 없다(Noonan et al., 2007). HSPA6은 열충격 단백질 70B'로도 알려져 있으며 아교모세포종 세포에서는 Y15 치료에 의해(Huang et al., 2014b) 및 두부 및 경부 암세포에서는 열 충격에 의해(Narita et al., 2002) 각각 상향조절되는 것으로 나타났다. 높은 수준의 HSPA6은 HCC의 더 이른 재발과 연관이 있을 수 있다(Yang et al., 2015).
열충격 70 kDa 단백질 7(HSP70B)(HSPA7) - HSPA7은 유사유전자이다.
HSPA(열충격 70 kDa) 결합 단백질, 세포질 분자 섀퍼론 1(HSPBP1) - 열충격 결합 단백질 HspBP1은 Hsp70 분자 섀퍼론과의 구성원이다. HspBP1은 섀퍼론 Hsp70에 결합하고 이를 조절하는 분자 섀퍼론이다. HspBP1 및 Hsp70의 수준은 건강한 개인의 혈청에 비해 유방암 환자의 혈청에서 유의하게 더 높았다(Souza et al., 2009). HSPBP1은 백혈병 환자에서 과발현되었다(Sedlackova et al., 2011). HspBP1은 인간 HCV-HCC에서 상향조절되었으며 이는 Hsp70 수준의 증가와 상관관계가 있는 증가였다(Yokoyama et al., 2008).
IQ 모티프 함유 GTPase 활성화 단백질 1(IQGAP1) - IQGAP1은 p195로도 알려져 있으며, 인간에서 IQGAP1 유전자에 의해 암호화되는 아주 흔히 발현되는 단백질이다. IQGAP1은 몇몇 뚜렷한 세포 공정 특히 세포골격 재배열에서 주요 매개인자이다. 최근 연구에서는 암에서 IQGAP1의 가능한 역할이 관여된 바 있으며, 이는 다양한 종양에서 관찰된 IQGAP1의 과발현 및 원거리 막 국소화에 의해 지지된다(Johnson et al., 2009). IQGAP1의 과발현은 췌장암의 발생 및 진행에서 중요한 역할을 수행할 수 있다(Wang et al., 2013c). 식도 편평세포 암종(ESCC)에서 IQGAP1 발현의 억제는 종양 세포의 성장, 이동 및 침입을 감소시켰다(Wang et al., 2014c). 더욱이 난소암 줄기 세포-유사 세포(CSC-LC)의 분화 동안 IQGAP1 발현의 증가는 공격적인 세포 행위와 연관되고, 이는 난소암의 전이에 기여할 수 있다(Huang et al., 2015a).
인테그린, 베타 6(ITGB6) - ITGB6은 상피 세포의 표면에서 배타적으로 발현되는 인테그린의 아형이며 세포의 기질 단백질의 수용체이다(Weinacker et al., 1994). 한 연구에서는 연구된 10가지 인간 종양 유형에서 ITGB6의 발현은 정상 조직에 비해 증가했다. ITGB6 발현의 가장 높은 빈도는 경부, 피부, 식도 및 두경부의 편평 암종에서 보고되었다. 참조할 것은 ITGB6의 항체-매개 차단은 생체 내 종양 진행을 억제했다(Van Aarsen et al., 2008). ITGB6은 직장 암종에서 종양-특이적 약물의 전달 및 강화된 치료 효능을 위한 표적으로서 이용된 바 있다(Liang et al., 2015; Zhao-Yang et al., 2008). 유방암에서 ITGB6의 mRNA 혹은 단백질의 높은 발현이 매우 불량한 생존과 원격 부위로의 전이 증가와 연관이 있었다. ITGB6을 표적으로 하는 항체는 유방암 마우스 모델에서 종양 성장을 억제했다(Allen et al., 2014).
리신(K) 특이적 탈메틸효소 6B(KDM6B) - KDM6B는 JMJD3으로도 알려져 있으며 인간에서 KDM6B 유전자에 의해 암호화되는 히스톤 탈메틸효소이다. KDM6B는 히스톤 3의 탈메틸화 리신 27 잔기에 의해 전사 조절에 영향을 준다. 외과적으로 절단된 CRC 환자에서 낮은 KDM6B 발현은 불량한 예후의 독립적 예측인자였다(P = 0.042)(Yokoyama et al., 2008). 더욱이 NSCLC 세포에서 KDM6B의 과발현은 미토콘드리아-의존 세포자멸사의 개시 및 침입-전이 케스케이드의 완화에 의해 세포 성장을 억제했다(Ma et al., 2015). 반면에, 투명 세포 신장 세포 암종(ccRCC)에서 KDM6B는 발현 수준이 높으며 불량한 ccRCC 예후와 긍정적으로 상관관계가 있다. KDM6B의 녹다운은 시험관 내 ccRCC 종양 발생을 억제시킬 수 있다(Li et al., 2015). 더욱이 KDM6B의 조절완화는 p53 경로의 억제를 통해 교종 형성에 기여할 수 있으며 이는 종말 분화에 대한 차단을 초래한다(Ene et al., 2012).
케라틴 9, I형(KRT9) - 케라틴 9는 인간에서 KRT9 유전자에 암호화되는 I형 사이토케라틴이다. 이것은 손바닥과 발바닥의 종말 분화된 상피에서만 발견된다. 이 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이는 표피박리 손발바닥 각질 피부증을 유발한다(Reis et al., 1994). KRT9는 HCC에서 상향조절되었다. 이러한 과발현은 HCC 전이에서 중대한 역할을 수행할 수 있으며 HCC 전이의 예측을 위한 잠재적 혈청 표지자로서 사용이 가능하다(Fu et al., 2009).
LINE1 역전이 인자 1(L1RE1) - L1RE1 유전자는 LRE1로도 알려져 있으며 '라인(LINE)'(길게 산재된 핵 요소) 역전이 인자(LRE), 즉, 자율 역전이 활동도를 갖춘 이동성 DNA 서열을 암호화한다. LINE1 레트로트랜스포존과는 다수의 암에서 저메틸화되는 것으로 보고되었으며, 게놈에서 통괄 메틸화 상태를 반영한다(Ostertag and Kazazian, Jr., 2001). 하나의 라인(LINE) 반복 부위를 의미하는 LRE1은 22q11-q12 상에 위치하고 총괄 메틸화 상태의 일관적인 지표이다(Chalitchagorn et al., 2004; Ostertag and Kazazian, Jr., 2001). 일부 데이터는 LRE1 상대적 메틸화가 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)의 독립적 후생 바이오마커임을 시사한다(Hsiung et al., 2007).
라미닌, 베타 3(LAMB3) - LAMB3은 라미닌의 베타 3 서브유닛을 암호화하고, 이는 알파 및 감마 서브유닛과 함께 라미닌-5를 형성한다. LAMB3은 다음에서 상향조절되었다: 유두상 갑상선 종양(PTC)(Barros-Filho et al., 2015), 경부 편평 세포 암종(cervical SCC)(Yamamoto et al., 2013) 및 구강 편평 세포 암종(OSCC)(Tanis et al., 2014). 유전자 어레이 및 생물정보학 분석은 LAMB3이 폐암에 관여하는 주요 유전자임을 시사한다. 이 유전자의 녹다운은 인간 폐암 세포의 침입 및 전이를 시험관 내 및 생체 내에서 억제했다. LAMB3은 폐암 환자에서 과발현되었으며, 그 발현은 림프성 전이와 상관관계가 있다(Wang et al., 2013b).
리소좀 단백질 막횡단 5(LAPTM5) - LAPTM5 유전자는 리소좀과 연관된 세포내 수포 상의 막 단백질을 암호화한다. LAPTM5는 폐암에서 비정상적으로 메틸화되고, 메틸화는 종양의 분화 상태와 상관관계가 있었다(Cortese et al., 2008). LAPTM5-양성 수포의 축적은 신경모세포종의 자발적 퇴행 동안 발생하는 프로그래밍된 세포사와 밀접하게 연관이 있었다(Inoue et al., 2009). CD1e 단백질은 수지상 세포에서 지질 항원의 제시에 참여한다. LATPM5는 CD1e 유비퀴틴화 혹은 용해성 리소좀 CD1e 단백질의 생성을 제어한다(Angenieux et al., 2012).
미니염색체 유지 복합체 성분 4(MCM4) - MCM4 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 진핵 게놈 복제의 개시에 필수적인 고도로 보존된 미니염색체 유지 단백질(MCM) 가운데 하나이다. MCM4는 방광암에서 하향조절되었으며(Zekri et al., 2015), 정상 폐조직과 비교하여 폐 선암종에서 차등 발현되었다(Zhang et al., 2014). MCM4 과발현은 유방암 환자에서 더 짧은 생존 기간과 연관이 있었다(Kwok et al., 2015).
미니염색체 유지 복합체 성분 5(MCM5) - MCM5는 DNA 복제 및 세포 주기 조절에 관여한다. MCM5의 과발현 수준은 다음에서 진행 및 더 불량한 예후와 연관 있는 것으로 나타났다: 구강 편평 세포 암종(Yu et al., 2014), 경부암(Das et al., 2013), 위암(Giaginis et al., 2011) 및 결장암(Burger, 2009).
멜라노레귤린(MREG) - MREG는 세포내 멜라노좀 분배에서 역할을 수행하고(Wu et al., 2012), 이는 역행 미세소관-의존 멜라노좀 운반의 조절을 통해 이루어진다(Ohbayashi et al., 2012). 더욱이 MREG는 또한 멜라노좀으로의 색소 통합의 조절에서 기능한다(Rachel et al., 2012). MREG는 에스트로겐 수용체-양성 유방암에서 그 3'UTR에 있는 miRNA-26에 의해 표적화되는 것으로 나타났다. 하지만 MREG의 miRNA-26 매개 세포 증식에 대한 직접적 관여는 잘 보여줄 수 없었다(Tan et al., 2014).
NODAL 조절인자 1(NOMO1)/NODAL 조절인자 2(NOMO2)/NODAL 조절인자 3(NOMO3) - NOMO1, NOMO2 및 NOMO3 유전자들은 염색체 16의 p 암에 위치한 중복 부위의 3개의 고도로 유사한 유전자이다. 이 세 유전자들은 같은 기능을 가질 수 있는 밀접하게 관련된 단백질을 암호화한다. NOMO1은 피부 T 세포 림프종(CTCL) 세포주 HuT78에서 과발현된 유전자로서 확인되었다(Lange et al., 2009). NOMO1은 결절 신호전달의 길항제이다. 결절은 변환 성장 인자-베타(TGF베타) 아과의 신호 전달 인자이며 척추 발육에서 주요 역할을 한다(Haffner et al., 2004).
뉴클레오포린 153kDa(NUP153) - 뉴클레오포린 153(Nup153)은 핵공 복합체(NPC)의 성분으로 NPC와 핵판 사이의 상호작용에 관여한 바 있다. Nup153 소실은 인간 유방 암종 세포에서 세포 이동의 장애를 초래하는 극적인 세포 골격 재배열을 유도한다(Zhou and Pante, 2010). NUP153 뉴클레오프린은 핵과 세포질 사이의 특정 단백질을 조절하고, 흥미롭게도 TGFβ 신호전달의 유도인자인 SMAD2가 포함된다(Xu et al., 2002). 최근의 일부 분석은 췌장암에서 새롭고 잠재적인 뉴클레오포린 NUP153의 종양원성 기능(표면상으로는 TGFβ 신호 전달의 조절에 의해)을 밝혔다(Shain et al., 2013).
PERP, TP53 세포자멸 효과기(PERP) - PERP는 세포-세포 부착과 종양 억제에서 중대한 역할을 수행하는 데스모졸 단백질을 암호화하는 p53/p63-조절된 유전자이다. 구강 SCC 환자에서 PERP 발현의 손실은 편평 세포 암종(SCC)으로의 전이 및 증가한 국소적 재발과의 상관관계가 있다(Kong et al., 2013). 다수의 인간 유방암 세포주에서 PERP 발현이 감소되었다(Dusek et al., 2012). 일부 연구는 PERP-결핍이 세포 생존, 데스모좀 손실 및 염증의 강화에 의해 암을 자극시켰다고 시사했다(Beaudry et al., 2010). PERP는 p53의 세포자멸사-연관 표적이며, 그 활성화 자체만으로 세포사를 유도하는 세포자멸사 경로를 유도하는데 충분하다(Chen et al., 2011).
추정 호메오도메인 전사 인자 1(PHTF1)/추정 호메오도메인 전사 인자 2(PHTF2) - PHTF1(추정 호메오도메인 전사 인자)은 인간 게놈에서 1p11-p13에 위치한 추정 호메오박스이다. 이 유전자는 진화적으로 보존되고 고환에서 주로 발현된다(Manuel et al., 2000). PHTF1 유전자는 전사 인자로서 DNA-의존 전사의 같은 생물학적 과정 및 생물학적 과정의 조절에 주로 관여한다. PHTF1 과발현은 T 세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 세포주에서 세포 증식과 세포자멸사의 조절에 대한 책임이 있다. PHTF1은 종양-억제인자 유사 유전자 및 PHTF1-FEM1b-Apaf-1 세포자멸사 경로의 유도를 위한 치료 표적일 수 있다(Huang et al., 2015b).
추정 호메오 도메인 전사 인자 2는 인간에서 PHTF2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. PHTF2는 주로 근육에서 발현되고 인간 게놈에서 7q11.23-q21에 위치한다(Manuel et al., 2000).
플렉스트린 호몰로지 도메인 함유, M 과(RUN 도메인 포함) 구성원 1(PLEKHM1) - PLEKM1 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 뼈 흡수에 필수적이며, 파골세포에서 수포 운반을 위한 중대한 역할을 수행할 수 있다. 이 유전자에서의 돌연변이는 보통 염색체의 열성 골화석증 6형(OPTB6)과 연관된다(van et al., 2004). PLEKHM1은 상피 난소암의 감수성 유전자의 후보로서 제안되었다(Permuth-Wey et al., 2013).
인지질 전달 단백질(PLTP) - 인지질 전달 단백질(PLTP)은 염증의 조절에서 중요한 역할을 수행한다. 일부 데이터는 PLTP가 대식세포에서 항염증 능력을 갖는다(Vuletic et al., 2011). 더욱이 PLTP는 트리아실 지질 A와 지질 단백질과의 연관을 위한 매개에서 필수적이며, 이는 그 동거 시간의 연장 및 그 전염증성 및 항암 물성의 확대를 초래한다(Gautier et al., 2010). PLTP는 유방암 환자에서 차등적으로 발현되었으며 화학요법 반응과 연관될 수 있다(Chen et al., 2012).
단백질 인산분해효소 2, 조절 서브유닛 B'', 알파(PPP2R3A) - 이 유전자는 단백질 인산분해효소 2의 조절 서브유닛 가운데 하나를 암호화한다. 단백질 인산 분해 효소 2(이전에는 2A형으로 명명)는 4개의 주요 Ser/Thr 인산 분해 효소 가운데 하나이며 세포 성장 및 분열에 대한 음성적 통제에 관여한다(Ruediger et al., 2001). PPP2R3A는 아동 급성 림프모구성 백혈병(ALL)에서 빈번히 메틸화되었다(Dunwell et al., 2009).
PTC7 단백질 인산 분해 효소 호몰로그(사카로마이세스 세레비지애)(PPTC7) - PPTC7은 PTC7 단백질 인산 분해 효소 호몰로그를 암호화하고 염색체 12q24.11에 위치한다. PPTC7은 최근에 환경적 독물에 대한 반응에서 신규 감수성 유전자로서 확인되었다(Zhu et al., 2015).
단백질 키나제, DNA-활성화, 촉매 폴리펩티드(PRKDC) - PRKDC는 PI3/PI4-키나제과의 구성원인 DNA-의존 단백질 키나제(DNA-PK)의 촉매적 서브 유닛을 암호화한다. PRKDC는 Akt/GSK3 경로를 통해 c-Myc 종양 단백질을 안정화시킬 수 있다(An et al., 2008). PRKDC의 활성화는 HCC 증식, 게놈 불안정성 및 미세혈관 밀도와 양의 상관관계가 있었으며 세포자멸사 및 환자의 생존과 양의 상관관계가 있었다(Evert et al., 2013).
프로테아좀(프로좀, 매크로페인) 서브유닛, 알파형, 4(PSMA4) - PSMA4는 프로테아좀 서브유닛 알파 4를 암호화하고 이는 비리소좀 경로에서 ATP/유비퀴틴-의존 과정 동안 펩티드를 단리한다. PSMA4 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성은 중국 한족에서의 폐암 위험과 연관지어진 바 있다(Wang et al., 2015). 반면에, PSMA4 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성은 비소세포 폐암이 감수성에 대한 주요 기여인자가 아님이 보고된 바 있다(Yongjun Zhang et al., 2013). 더욱이 PSMA4의 과발현은 정상 폐 세포에 비해 폐 종양에서 관찰되었다. PSMA4 발현의 하향 조절은 프로테아좀 활동도를 감소시키고 세포자멸사를 유도했다(Liu et al., 2009).
단백질 티로신 인산분해 효소, 비수용체 13형(PTPN13) - 이 유전자는 단백질 티로신 인산분해 효소(PTP)과의 구성원을 암호화한다. PTP들은 세포 성장, 분화, 유사분열 주기 및 종양 변환 등 다양한 세포 과정을 조절하는 신호전달 분자이다. PTPN13은 Fas 수용체와 상호작용하는 것으로 나타났으며 따라서 Fas 매개 프로그래밍된 세포사에서 역할을 할 수 있다. 더욱이 PTPN13은 GTPase-활성화 단백질과 상호작용하므로 Rho 신호전달 경로의 조절인자로서 기능할 수 있다. 혈액 악성 종양에서 PTPN13은 림프종 및 골수성 백혈병에서 각각 종양 성장을 억제하거나 자극시키는 모순되는 영향을 미친다(Wang et al., 2014b). 이것은 발암성 티로신 키나제의 활성에 대항하는 PTPN13의 능력 및 Fas 죽음 수용체와의 억제 상호작용에 의해 설명할 수 있다(Freiss and Chalbos, 2011). 유방암에서 PTPN13은 항에스트로겐에 대한 유방 종양 반응의 고유한 표지 및 종양 세포에서 세포자멸사 자극을 활성화시키는 가능한 치료 표적으로 간주되었다(Freiss et al., 2004). Fas/PTPN13 결합의 억제는 항암 약물의 개발을 위한 양호한 표적을 제공할 수 있다(Takahashi and Kataoka, 1997).
RAS p21 단백질 활성인자 2(RASA2) - RAS p21 단백질 활성인자 2는 GTPase-활성화 단백질의 GAP1과의 구성원을 암호화한다. RAS 기능의 억제인자로서 작용하는 RASA2는 RAS 단백질의 약한 내인성 GTPase 활동도를 강화시키며 이는 RAS의 비활성 GDP-결합 형태를 초래하는데 그 결과 세포의 증식 및 분화에 대한 통제를 허용한다. RASA2의 정밀한 유전적 변경, 유전자 내의 위치 및 단백질 기능에 미치는 영향에 따라, 이론적으로 RASA2는 종양유전자로서 혹은 종양 억제인자 유전자로서 기능할 수 있다(Friedman, 1995). RASA2는 경미한 능력 조건 하에서 카스파제-3에 의해 단리되고 이는 항사멸 신호전달을 자극하는 단편 N이라 부르는 단편을 생성한다. 카스파제-3 활동도가 더욱 증가하면, 이는 N2라 부르는 단편을 생성하는데 이것은 더 이상 세포를 보호하지 않는다. 반면에, 전장 RASA2는 비활성 인산분해효소로부터 Akt를 차단하여 그 활동도를 유지하게 한다(Cailliau et al., 2015). 유방암에서 스트레스-활성 카스파제-3은 단편 N2의 생성을 통해 전이의 억제에 기여할 수 있다(Barras et al., 2014). RASA2는 5%의 흑색종에서 돌연변이된 종양-억제 유전자로서 확인되었다(Arafeh et al., 2015).
재조합 신호 결합 단백질용 면역글로불린 카파 J 부위(RBPJ) - 재조합 신호 결합 단백질용 면역글로불린 카파 J 부위는 노치 신호전달 경로에서 중요한 전사 조절인자를 암호화한다. RBPJ는 노치 단백질에 결합되지 않을 때는 억제인자로서 및 노치 단백질에 결합될 때는 활성인자로서 각각 작용한다. 이것은 히스톤 탈아시틸화 효소 혹은 히스톤 아세틸화 효소를 함유하는 염색질 리모델링 복합체를 노치 신호전달 경로 유전자로 모집하여 기능하는 것으로 사료된다. 이종이식 마우스 모델에서는, RBPJ 녹다운은 종양원성을 억제시키고 종양 부피를 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 저산소증 RBPJ의 상향조절을 통해 부드러워진 전사를 자극하여 췌장암에서의 증식, 침입 및 종양 생성을 유도하는 것을 시사한다(Onishi et al., 2016). RBPJ 녹다운에 의해 세포 성장의 상당한 증가를 초래하는 효과는 전립선암과 폐암 세포에서도 발견되었으며, 이는 RBPJ 발현이 인간 암의 치료를 위한 유망한 치료 접근방식일 수 있음을 시사한다(Xue et al., 2015; Lv et al., 2015). 더욱이 RBPJ의 과발현은 횡문근육종 세포의 고정-독립적 성장을 자극했다(Nagao et al., 2012). RBPJ-매개 노치 신호전달 또한 수지상 세포-의존 항종양 면역 반응에 필수적이다(Feng et al., 2010).
무균 알파 모티프 도메인 함유 9-유사(SAMD9L) - SAMD9L은 무균 알파 모티프 도메인 함유 9-유사를 암호화하고 염색체 7q21.2에 위치한다. SAMD9 및 SAMD9L 유전자는 공통된 유전자 구조를 공유하고 60% 아미노산 정체성을 가진 단백질을 암호화하는데 제안된 역할은 염증성 경로의 억제이다. SAMD9L은 조기 엔도솜에 국소화되고 엔도솜 융합 자극인자로서 작용한다. SAMD9L 유전자의 반수부족은 골수성 전환에 기여하고, SAMD9L은 골수성 종양 억제 유전자 후보로서 확인되었다(Nagamachi et al., 2013). SAMD9L의 침묵이 세포 주기 진행에서 G1-S 이행을 자극시켰으며 Wnt/베타-카테닌 경로의 활동도 상승을 유도함으로써, SAMD9L 녹다운은 간세포 암종 세포주의 세포 증식 및 집락 형성을 유의하게 자극시켰다. 최근의 발견 내용은 인간 암에서 체세포 변이 및 감소된 발현에 의한 SAMD9L 비활성화의 종양-억제 역할을 강조한다(Wang et al., 2014a). SAMD9L은 건강한 대조 개인에 비해 전이성 흑색종 환자의 T 및 B 세포 모집단에서 유의하게 감소된 발현을 보여주었다(Critchley-Thorne et al., 2007).
스플라이싱 인자 3b, 서브유닛 3, 130 kDa(SF3B3) - SF3B3은 스플라이싱 인자 3b 단백질 복합체의 서브유닛 3을 암호화한다. SF3B3의 과발현은 에스트로겐 수용체-양성 유방암에서 전체 생존율 및 내분비 내성과 유의하게 상관관계가 있다(Gokmen-Polar et al., 2014).
표면활성제 단백질 A1(SFTPA1)/표면활성제 단백질 A2(SFTPA2) - 이 유전자들은 콜렉틴이라 부르는 C-형 렉틴 아과의 구성원인 폐 표면활성제 단백질을 암호화한다. SFTPA는 지질과 미생물의 표면에서 발견되는 특정 탄수화물 잔기에 결합하여 표면활성제 항상성 및 호흡 병원체에 대한 방어에서 필수적 역할을 수행한다. 이러한 유전자의 돌연변이는 특발성 폐섬유증과 연관된다. SFTPA1 및 SFTPA2 유전자를 함유하는 폐암-특이적 유전자 시그내처를 통해 폐암이 다른 암 샘플로부터 정확하게 구별되었다(Peng et al., 2015). EGFR 돌연변이는 SFTPA 발현이 없는 폐 선암종보다 그 발현이 있는 선암종에서 유의하게 더 흔했다(Jie et al., 2014). SFTPA는 종양-연관 대식세포의 분극을 조절하여 폐암 진행을 억제한다(Mitsuhashi et al., 2013). 폐 상피 세포에서 돌연변이 SFTPA2의 발현은 잠복성 TGF-베타 1 및 TGF-베타 1 매개 EMT의 분비를 유도한다(Maitra et al., 2012). 더욱이 전립선암의 발전은 SFTPA의 감소된 수준과 관련이 있을 수 있다(Kankavi et al., 2014).
용질 운반체과 25(미토콘드리아 운반체; 아데닌 뉴클레오티드 전위자), 구성원 31(SLC25A31)/용질 운반체과 25(미토콘드리아 운반체; 아데닌 뉴클레오티드 전위자), 구성원 4(SLC25A4)/용질 운반체과 25(미토콘드리아 운반체; 아데닌 뉴클레오티드 전위자), 구성원 5(SLC25A5)/용질 운반체과 25(미토콘드리아 운반체; 아데닌 뉴클레오티드 전위자), 구성원 6(SLC25A6) - 용질 운반체과 25의 단백질들은 미토콘드리아에서 세포질 ADP를 기질 ATP와 교환시키는 ADP/ATP 운반체이다. 이들은 ADP/ATP를 전위하고 미토콘드리아 내막에 내장된 동종이합체를 형성하는 개폐 통로로서 작용한다. 이 유전자과를 과발현하는 세포는 항세포자멸 표현형을 표시하는 것으로 나타난 바 있다. 이 유전자과의 억제된 발현은 세포자멸사를 유도하고 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다. SLC25A4는 분화된 조직에서 우선적으로 존재하고 근육 및 뇌에 특이적인 반면, SLC25A5는 종양과 같은 증식하는 조직에서 발현된다. SLC25A6은 흔히 발현되고 SLC25A31은 간과 생식 세포에 존재한다(Dolce et al., 2005). 특히 SLC25A5는 발암에 기여한다. SLC25A5의 발현은 종양의 미토콘드리아 생체 에너지학에 밀접하게 연계되므로, 이는 암 치료의 개별화 및 항암 전략의 개발을 위한 유망한 표적이다. 더욱이 SLC25A31의 안정된 과발현은 Bcl-2 발현과 무관하게 이오니다민 및 스타우로스포린 세포자멸사로부터 암세포를 보호했다. 따라서 인간 SLC25 아형에는 세포자멸사 유발인자로서 기능하는 SLC25A4 및 SLC25A6 동종형이 확인되는 반면, SLC25A5 및 SLC25A31 동종형은 세포가 세포사를 유도하는 자극에 내성을 갖도록 한다(Gallerne et al., 2010).
SP140 핵체 단백질(SP140) - SP140은 SP140 핵체 단백질을 암호화하고 염색체 2q37.1에 위치한다. SP140은 후두 편평세포 암종에서 상향조절되는 것으로 나타났다(Zhou et al., 2007). SP140은 만성 림프구성 백혈병(Lan et al., 2010), 다발골수종(Kortum et al., 2015) 및 급성 전골수구성 백혈병(Bloch et al., 1996)과 연관이 있다.
전사 신호 변환기 및 활성인자 1, 91 kDa(STAT1) - STAT1은 모든 인터페론에 대한 반응으로 티로신 인산화에 의해 활성화되고(Decker et al., 2002), Th1 세포 분화에 기여한다(Schulz et al., 2009). 분자 수준에서는 STAT1은 사이클린-의존 키나아제 억제 인자인 p21Cip1을 증가시키거나 c-myc 발현을 감소시키는 그 능력에 의해 IFN-γ로 치료한 마우스와 인간에서 종양 세포의 증식을 억제시킨다(Ramana et al., 2000). STAT1의 항종양 활성은 마우스 모델에서 혈관 형성 및 종양 전이를 억제하는 그 능력에 의해 더욱 지지된다(Huang et al., 2002). STAT1 mRNA 양 증가는 호르몬 수용체 음성 및 삼중 음성 유방암 환자의 전이 예측력과 상관된 분자지표로 시사되었다(Yau et al., 2010).
막횡단 단백질 43(TMEM43) - 이 유전자는 막횡단 단백질 43을 암호화한다. 이 유전자의 결함은 가족성 부정맥 유발성 무심실 형성이상 5형(ARVD5)의 원인이 되고, 이는 부정맥 유발성 우심실심근병증 5형(ARVC5)으로도 알려져 있다. ARVD는 유전성 질환으로 그 특징은 심실 빈맥, 심부전, 급성 심장사 및 심근세포의 섬유지방 대체이다(Siragam et al., 2014). TMEM43은 내핵막에서 단백질 복합체를 조직하여 핵피막 구조의 유지에 중요한 역할을 할 수 있다(Bengtsson and Otto, 2008).
토포이소머라아제(DNA) II 알파 170 kDa(TOP2A)/토포이소머라아제(DNA) II 베타 180 kDa(TOP2B) - TOP2A 및 TOP2B는 전사 동안 DNA의 위상 상태를 제어 및 변경하는 효소인 DNA 토포이소머라아제의 고도로 상동성인 동종형을 암호화한다. 이 핵 효소는 염색체 응축, 염색질 단리 및 DNA 전사 및 복제 동안 발생하는 비틀림 응력의 방출과 같은 과정에 관여한다. TOP2A는 세포 증식에 필수적으로 강력히 성장하는 세포에서 고도로 발현되는 반면, TOP2B는 성장에서 비필수적이고 최근에 치료-연관 이차 악성종양에 연구된 바 있다(Toyoda et al., 2008). TOP2A는 몇몇 세포 유형에서 과발현되는 것으로 발견된 바 있다(예를 들어 악성 중피종(Roe et al., 2010), 악성 말초 신경초 종양(Kresse et al., 2008), 폐 선암종 세포(Kobayashi et al., 2004), 방광암(Simon et al., 2003), 아교모세포종(van den Boom et al., 2003)). TOP2B는 DNA 전사, 복제, 재조합 및 유사분열에 관여하고, TOP1 외에 토포이소머라아제 유전자과에 속하는 2차 NUP98 융합 짝 유전자를 대표한다(Nebral et al., 2005).
트립신 분해효소 알파/베타 1(TPSAB1)/트립신 분해효소 베타 2(TPSB2) - 트립신 분해효소 알파/베타 1(TPSAB1) 및 트립신 베타 2(TPSB2)는 다른 2개의 트립신 분해효소 동종형과 함께 비만 세포에 의해 발현된다. 트립신 분해효소는 천식 및 기타 알레르기성 및 염증성 질환의 발병기전에 관여한 바 있다. 비만 세포에 의해 분비된 트립신 분해효소는 혈관 신생 자극 인자를 가지며 종양 혈관화에 기여한다. 트립신 분해효소는 단백분해효소-활성화 수용체-2(PAR-2)의 활성화에 의해 작용하고 세포의 기질 분해에 추가적으로 기여하고 이로써 혈관 성장 또한 용이하게 한다. 더욱이 종양 조직에서 트립신분해효소-양성 비만 세포의 존재는 몇몇 암 유형에서 혈관생성과 상관관계가 있다(Ammendola et al., 2014). 전랍선암에서 트립신분해효소-양성 비만 세포의 상승된 수준이 보고된 바 있으며, 미세혈관 밀도, 종양 단계 및 더 짧은 생존 기간과 상관관계가 지어진 바 있다(Nonomura et al., 2007; Stawerski et al., 2013). 이와 유사하게, 트립신분해효소-양성 비만 세포는 또한 위암(Zhao et al., 2012; Ribatti et al., 2010)은 물론 폐선암종(Imada et al., 2000; Takanami et al., 2000)에서도 종양 단계 및 혈관생성과 연관이 있다.
트리파르타이트 모티프 함유 11(TRIM11) - 트리파르타이트 모티프 함유 11은 TRIM11 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. TRIM11은 중추 신경계의 발육에 관여하고, 알츠하이머-유사 신경 발작의 억제제인 휴마닌을 불안정화하는 것으로 알려진 바 있다(Niikura et al., 2003). TRIM11은 고도 신경아교종에서 과발현되고 증식, 침입, 이동 및 아교세포 종양 성장을 자극한다(Di et al., 2013).
일과성 수용기 전위 양이온 채널, M 아과, 구성원 2(TRPM2) - 이 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 유리 세포내 ADP-리보스에 의해 조절되는 칼슘-투과성 양이온 채널이다. TRPM2는 일부 조건 하에서 세포자멸사의 매개에 관여할 수 있다(Ishii et al., 2007; Cao et al., 2015). 하지만 이것의 세포 성장 증식에 대한 영향은 덜 분명하고 세포 배양 조건 및 교대로 스플라이싱되는 동종형의 발현에 의존할 수 있다(Chen et al., 2014). 흑색종 및 췌장암에서, 종양이 풍부한 TRPM2 안티센스 전사물은 세포자멸사 및 임상적 결과와 상관관계가 있는 것으로 파악된 바 있다(Orfanelli et al., 2015).
튜불린 감마 복합체 연관 단백질 3(TUBGCP3) - 튜불린 감마 복합체 연관 단백질 3은 진핵 세포에서 미세관 핵형성에 중대한 멀티-서브유닛 감마-튜불린 복합체의 일부이다(Lynch et al., 2014). 세포질 감마-튜불린 복합체는 소위 감마-튜불린 복합체 결합 단백질의 조합을 통해 동원체 혹은 기타 미세관 조직 센터를 표적으로 한다(Schiebel, 2000). 정상 인간 성상세포에 대해 아교모세포종 세포에서 TUBGCP3 전사물의 발현에 대한 유의한 증가가 발견되었으며 TUBGCP3 면역반응성은 정상 뇌에 비해 상당히 증가했다. TUBGCP3은 미세혈관 증식 및 음성 표현형을 유도하는 신호전달 경로와의 상호작용과도 연관이 있었다(Draberova et al., 2015). 더욱이 TUBGCP3은 이배체 외투 세포 림프종 샘플보다 거의 4배체에서 유의하게 더 높게 발현되는 것으로 나타났다(Neben et al., 2007).
유비퀴틴-유사 조절인자 활성 효소 6(UBA6) - 유비퀴틴-유사 조절인자 활성 효소는 인간에서 UBA6 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. UBA6은 유비퀴틴-활성 효소로서 고환에서 가장 풍부히 발현된다. 더욱 이것은 DNA 손상에 대한 세포 반응을 위해 요구된다(Moudry et al., 2012).
친이종 및 폴리트로픽 레트로바이러스 수용체 1(XPR1) - XPR1은 180개 잔기 길이의 아미노 말단 SPX 도메인을 포함하는 막 분자이다(SYG1, Pho81 및 XPR1에 따라 명명됨). XPR1은 인산염 유출을 매개하는 것으로 보고된 바 있다(Giovannini et al., 2013). 파골세포 분화 시, XPR1 mRNA 전사물은 증가하는 것으로 나타났다(Sharma et al., 2010). 원래, XPR1은 인간 세포는 물론 마우스나 조류와 같은 다양한 다른 종들을 감염시킬 수 있는 2가지 감마레트로바이러스 및 친이종 및 폴리트로픽 MLV(X-MLV 및 P-MLV)에 의해 사용되는 레트로바이러스 수용체로서 설명되었다(Kozak, 2010; Martin et al., 2013).
아연 핑거 BED형 함유 5(ZBED5) - 아연 핑거 BED형 함유 5는 찰리 유사(Charlie-like) DNA 트랜스포존으로부터 대부분 유리하는 암호화 서열에 의해 특징지워지지만, 역방위 말단 반복에 의해 측면이 쌓이지 않으므로 활성 DNA 트랜스포존으로는 보이지 않는다. ZBED5는 버스터(Buster) DNA 트랜스포손과 관련이 있으며 다른 ZBED로부터 계통발생학적으로 단리된다. ZBED 유전자는 척추동물 조직에서 광범위하게 발현되고, 이들은 함께 뚜렷이 다양한 기능들을 조절한다(Hayward et al., 2013).
아연 핑거 단백질 697(ZNF697) - ZNF697 유전자는 1p12에 위치하고 DNA 결합에 역할을 수행할 수 있는 아연 핑거 단백질 697을 암호화한다(Yu et al., 2011).
면역 반응 자극은 숙주 면역계가 외부 물질로 인식하는 항원의 존재에 의존한다. 종양 관련 항원의 발견은 숙주의 면역계를 종양 성장에 개입하는 데 사용할 가능성을 제기했다. 면역계의 체액성 및 세포성 지류를 이용하는 다양한 기전이 현재 암 면역 치료에서 탐색되고 있다.
세포 면역 반응의 특정 요소들은 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. T 세포의 종양 침투 세포 군락 또는 말초 혈액에서의 단리는 이러한 T 세포가 암에 대해 자연 면역 방어로써의 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 시토졸에 자리잡은 단백질 또는 불완전 리보솜 생성물(DRIPS)에서 파생된 보통 8 내지 10개의 아미노산 잔기로 이루어진 주조직적합 복합체(MHC)를 가진 펩티드의 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 특히, 이 반응에서 중요한 역할을 한다. 인간의 MHC-분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다.
본원에 사용된 것처럼, 달리 언급하지 않는 한, 모든 용어는 아래 제시와 같이 정의된다.
"T-세포 반응"이란 특이적 증식과 시험관 내 또는 생체 내에서 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포 독성 T 세포의 경우, 효과기 기능이 펩티드 펄스, 펩티드 전조 펄스 또는 자연적 펩티드 제시 표적 세포들의 용해, 시토카인의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 인터페론 감마, TNF 알파, 또는 IL-2, 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에서 유도되는 그랜자임 또는 퍼로린 또는 탈과립일 수 있다.
"펩티드"란 용어는 여기서 인접 아미노산의 알파 아미노 기와 카보닐 기 사이에 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지정하기 위해 사용한다. 펩티드는 아미노산 9개의 길이가 바람직하지만 아미노산 8개까지 짧을 수도 있고 10, 11, 12 또는 13개까지 길 수도 있으며, MHC 클래스 II 펩티드의 경우(본 발명의 펩티드의 연장된 변이체) 그 길이가 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산일 수 있다.
더욱이 "펩티드"라는 용어는 알파 아미노 기와과 인접 아미노산의 카보닐 기 사이의 펩티드 결합으로 보통 서로 연결되는 아미노산 잔기의 서열에 의한 염을 포함한다. 바람직하게는 이 염은 예를 들어 염화물 또는 아세트산염(삼분화 아세트산염)과 같은 약학적으로 허용되는 펩티드의 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드가 생체 내에서 염이 아니므로 생체 내 상태의 펩티드와는 실질적으로 다르다는 점을 유의해야 한다.
"펩티드"라는 용어는 "올리고펩티드"도 포함한다. 여기에서 "올리고펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기와 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 올리고펩티드의 길이는 올바른 에피톱이 유지되는 이상 중요하지 않다. 올리고펩티드는 일반적으로 30개 아미노산 보다 길이가 짧고, 15개 아미노산 보다 길다.
"폴리펩티드"라는 용어는 인접 아미노산의 알파 아미노 기와 카보닐 기 사이에서 일반적으로 펩티드 결합으로 연결되는, 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용된다. 본 발명에서 폴리펩티드의 길이는 정확한 에피톱들이 유지되는 이상 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고 펩티드와 다르게, 폴리펩티드는 약 30개 아미노산 잔기 이상의 분자를 가지고 있는 것을 언급한다.
이런 분자의 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 또는 폴리뉴클레오티드 암호화는 면역 반응을 유도할 수 있으면 "면역성"(따라서 본 발명에서의 "면역원")이다. 본 발명의 경우, 면역성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 특정하게 정의된다. 따라서, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이고, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, 펩티드와 MHC의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 항체에 대한 TCR을 높이는데 사용되는 단백질일 수 있다.
클래스 I T 세포 "에피톱"은 적당한 친화력을 가진 MHC/펩티드 혼합물에 결합하는 T 세포 수용체에 일치하는 T 세포에 의해 인식되는 삼항 복합물(MHC 클래스 I 알파 쇄, 베타-2-미세글로블린 및 펩티드)을 생성하는 클래스 I 또는 II MHC 수용체에 결합하는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 일반적으로 길 이가 8 내지 14개 아미노산이며, 대개 일반적으로 길이가 9개 아미노산이다.
인간에는 MHC 클래스 I 분자를 암호화하는 세 개의 유전자 부위가 있다(인간의 MHC 분자도 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지정된다(HLA)): HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02, 및 HLA-A*07은 유전자 부위에서 발현할 수 있는 다른 MHC 클래스 I 대립형질의 예이다.
[표 11]
HLA-A*02, HLA-A*24 및 가장 빈번한 HLA-DR 혈청형의 발현 빈도. 빈도는 모리(Mori) 등의 문헌으로부터 조정된 미국 인구 내에서의 일배체형 빈도 Gf로부터 유추되고(Mori et al., 1997), 하디-와인버그 공식 F = 1 - (1-Gf)2를 사용한다. A*02 또는 A*24와 일부 HLA-DR 대립형질의 조합은 강화되거나 연관 불평형으로 인해 단일 빈도보다 덜 빈번할 수 있다. 자세한 내용은 샤녹(Chanock) 등의 문헌을 참조한다(Chanock et al., 2004).
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본 발명의 펩티드는 바람직하게는 여기서 설명한 바와 같이 본 발명의 백신에 포함되는 경우 HLA-A*02 및 HLA-A*24에 결합한다. 본 발명의 MHC 클래스 II 펩티드는 몇몇 HLA 클래스 II 분자에 결합하고 무차별 결합제(범-결합 펩티드)로 불린다. 백신은 범-결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수도 있다. 따라서 본 발명의 백신은 A*02 또는 A*24 양성인 환자의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 반면, MHC 클래스 II 동종형에 대한 선택은 이 펩티드의 범-결합 성격으로 인해 필요하지 않다.
본 발명의 A*02 펩티드가 다른 대립형질, 본 발명의 A*24 펩티드와 조합되는 경우, 모든 환자 모집단에서 MHC 클래스 I 대립형질 하나만을 취급하는 것에 비해 더 높은 비율의 치료가 가능하다. 대부분의 모집단에서 하나의 대립형질만으로는 환자의 50% 미만을 해결할 수 있는 반면, HLA-A*24 및 HLA-A*02로 구성되는 백신은 임의의 관련있는 모집단에서 적어도 환자의 60% 치료가 가능하다. 구체적으로 환자의 다음 백분율은 다양한 지역에서 적어도 하나의 이러한 대립형질에 대해 양성이 된다: 미국 61%, 서부 유럽 62%, 중국 75%, 한국 77%, 일본 86%(www.allelefrequencies.net의 자료로부터 계산됨).
한 바람직한 구현에서 용어 "뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드의 헤테로폴리머를 언급한다.
특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 암호화는 자연적으로 발생하거나 합성 구축될 수도 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 암호화하는 DNA 절편은 cDNA 조각들과 짧은 올리고뉴클레오티드 연결기, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드에서 미생물이나 바이러스 오페론에서 유도된 조절 요소를 구성하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공하기 위해서 조립된다.
여기서 사용되는 용어 "펩티드를 암호화(또는 암호화)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 제조에 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드에 대한 뉴클레오티드 서열 암호화를 지칭한다.
여기서 사용되는 핵산 서열에 대한 언급에는 한 가닥 및 두 가닥 핵산 모두가 포함된다. 따라서, 예를 들어 DNA의 경우 특정 서열이란 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 보완이 있는 이러한 서열의 중복(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 언급한다.
용어 "암호화 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 발현 생성물에 대해 자연스럽게 또는 정상적으로 암호화하는 유전자의 부분을 언급한다(즉, 유전자 본래의 발현 생성물에 대한 생체 내 영역 암호화).
암호화 영역은 비변이("정상적")이거나 변이 또는 개조된 유전자에서 찾을 수 있거나, 심지어는 DNA 서열, 또는 DNA 합성 기술을 보유한 제조업자에게 잘 알려진 방법을 사용해서 실험실에서 전적으로 합성된 유전자에서 찾을 수 있다.
용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 및 유전적 암호화 퇴화 및 이에 따른 동일 아미노산 암호화으로 인해 초래된 어떤 핵산 서열 암호화 생성물을 의미한다.
암호화 서열을 말할 때, 용어 "단편"은 발현 제품이 완전한 암호화 영역의 발현 생성물과 같은 생물학적 기능이나 활동을 유지하는 완전한 암호화 영역보다 적은 부분의 DNA를 언급한다.
용어 "DNA 분절"은 최소한 한번 이상의 상당히 순수한 형태로 단리된 DNA에서 유도된 단편의 형태, 또는 큰 DNA 구조의 구성 요소로서 DNA 중합체를 언급한다. 여기서 순수한 형태는 내인성 오염 물질이 없고 분절 및 표준 생화학 방법, 예를 들어, 복제 벡터에 따른 그 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도를 언급한다. 이러한 분절은 일반적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일 서열이 암호화 영역의 조작이나 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하단에 나타날 수 있다.
용어 "프라이머"는 하나의 표준 DNA와 짝을 이룰 수 있는 짧은 핵산 서열을 의미하고 DNA 폴리머라아제가 디옥시리보 뉴클레오티드 쇄 합성을 시작하는 자유 3'-OH 말단을 제공한다.
용어 "프로모터"는 전사를 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 뜻한다.
용어 "단리"는 그 물질이 원래의 환경(예를 들어, 자연적으로 발생하는 경우에는 자연 환경)에서 제거되는 것을 뜻한다. 예를 들어, 자연 발생하는 살아 있는 동물에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않지만, 자연계에서 공존하는 물질의 부분 또는 전체에서 단리되는 같은 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 제거된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 운송체 및/또는 이러한 폴리뉴클레오티드의 부분이거나 폴리펩티드는 구성의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 구성이 자연 환경의 일부가 아닐 때 여전히 단리될 수 있다.
본 발명에서 개시된 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역성의 폴리펩티드는 "순수한" 형태일수도 있다. 용어 "정제"는 절대적인 순도를 필요로 하지 않는다. 오히려, 그것은 상대적인 정의를 의도하고, 관련된 당업자들이 이해하는 용어로써 상당히 정제된 제제 또는 부분적으로 정제된 제제를 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리에서 단리된 각각의 클론은 전기 영동 동일성으로 통상적으로 정제된다. 시작 물질 또는 자연 물질의 최소한 하나 이상의 순서, 바람직하게 2 또한 3개 순서, 및 더 바람직하게는 4 또는 5개 순서의 크기로 정제가 명시적으로 심사숙고된다. 또한 바람직하게는 중량으로 99.999%, 또는 최소한 99.99% 또는 99.9%; 및 심지어는 바람직하게 99%보다 큰 순도를 가진 특허청구범위에 기재된 폴리펩티드는 명시적으로 심사숙고된다.
본 발명에 개시된 핵산과 폴리펩티드 발현 생성물은, 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 가진 발현 벡터뿐만 아니라, "강화된 형태"일 수 있다. 여기에서 사용되는 것처럼, 용어 "강화"는 물질의 농도가 (예를 들어) 최소한 그것의 자연적 농도의 최소한 2, 5, 10, 100, 또는 1000배 정도이고, 유리하게는 0.01 중량%, 바람직하게는 최소한 약 0.1 중량% 정도임을 의미한다. 약 0.5 중량%, 1 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 및 20 중량% 강화된 제제도 심사 숙고된다. 서열, 구축물, 벡터, 클론, 및 본 발명의 다른 물질들은 유리하게 강화된 또는 단리된 형태가 될 수 있다. 용어 "활성 단편"은 예를 들어 토끼 또는 쥐 및 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게 따로 또는 선택적으로 적당한 보조제와 함께 또는 매개체로서 투여했을 때 면역 반응을 생성하고 (즉, 면역성 활동이 있는) 인간과 같은 수용체 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태로 면역 반응을 나타내는 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 단편을 의미한다. 다르게는, "활성 단편"은 또한 시험관 내 T 세포 반응을 유도하기 위해서 사용될 수도 있다.
여기에서 사용되는, "부분", "분절" 및 "단편" 이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용될 때, 서열이 더 큰 서열의 하위 집합을 형성하는 경우 아미노산 잔기와 같은 잔기의 지속적인 서열을 언급한다. 예를 들어, 만약에 폴리펩티드가 트립신이나 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제로 처리된다면, 그런 처리로 인해 생기는 올리고펩티드는 폴리펩티드의 시작 부분, 분절 또는 단편을 나타낼 것이다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용될 때, 이러한 용어들은 일반적인 엔도뉴클레아제 중 어떤 것과 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 처리에 의해 생성된 생성물을 언급한다.
본 발명에 따라, 서열을 언급할 때 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일한"은 설명되거나 명시된 서열("기준 서열")에 비교될 서열("비교 서열")의 정렬 후 서열이 명시된 또는 설명된 서열에 비교되는 것을 언급한다. 백분율 동일성은 하기 공식에 따라서 결정된다:
백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]
여기서 C는 기준 서열과 비교 서열 사이의 정렬의 길이에 대한 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이고, 이때
(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산이 없는 기준 서열에 각 염기 또는 아미노산,
(ii) 기준 서열의 각 차이, 및
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산
은 차이를 구성하고,
(iiii) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하고;
R은 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열에서의 염기 또는 아미노산의 수이고 기준 서열에 생긴 공백도 염기 또는 아미노산 개수로 계산된다.
상기 계산된 백분율 동일성에 대한 비교 서열과 기준 서열 사이에 존재하는 정렬이 특정 최소 백분율과 같거나 더 크면 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 정렬이 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대해 특정한 최소 백분율 동일성이 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 대해 88% 상동성인 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I의 분자에 결합하는 능력 또는 신장된 버전의 상기 펩티드가 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는다.
본 발명에서, "상동"이라는 용어는 두 개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 일치 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 일컫는다. 전술한 "상동"은 비교될 두 개의 서열을 최적 상태에서 나란히 정렬하여 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동 관계는 예를 들어 클로스탈(Clustal)W 알고리즘을 이용하여 정렬을 만들어 계산할 수 있다. 일반적으로 사용이 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로 벡터 NTI, GENETYX 또는 다른 도구들은 공용 데이터베이스에서 제공된다.
이 분야의 당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해서 유도된 T 세포가 그 펩티드 자체와 교차 반응할 수 있을지를 평가할 수 있을 것이다(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
주어진 아미노산 서열의 "변이체"에 의해, 발명자들은 예를 들어, 하나 또는 두 개의 아미노산 잔기의 측쇄가 변경되어 그 펩티드가 여전히 서열번호 1 내지 서열번호 110의 아미노산 서열로 구성된 펩티드와 실질적으로 같은 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다(예를 들어 그들을 자연적으로 발생하는 다른 아미노산 잔기 또는 다른 측쇄로 교체할 수 있다). 예를 들어, 펩티드는 변형에 의해 HLA-A*02 또는 DR과 같은 적합한 MHC 분자의 결합 홈과 상호 작용하여 결합하는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지하고 마찬가지로 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력이 향상되지 않으면 적어도 유지할 수 있다.
이들 T 세포는 그 결과로 본 발명의 한 양태에서 정의된 바 있는 동족의 펩티드의 자연 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이러한 세포를 죽일 수 있다. 과학 문헌 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997)에서 얻을 수 있듯이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 수용기의 결합 모티프에 일치하는 핵심 고정 잔기이며 이는 결합 홈을 이루고 있는 폴리펩티드의 극성, 전기 물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서 이 분야의 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지함으로써 서열번호 1 내지 서열번호 110에 정해진 아미노산 서열을 변형할 수 있고 이러한 변이체들이 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지를 결정할 수 있어야 한다. 이 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하고, 이는 그 결과로 본 발명의 양태에서 동족의 펩티드라고 정의된 자연 아미노산 서열을 포함하고 있는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응을 하고 이 세포를 죽일 수 있다.
여기에서 밝혀진 본래(변형되지 않은) 펩티드는 달리 언급되지 않는 이상 펩티드 쇄의 다른, 가능하게는 선택적인 부위에서 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게 이러한 치환은 아미노산 쇄의 말단에 위치한다. 그런 치환은, 예를 들어, 소수성의 아미노산이 다른 소수성의 아미노산으로 치환되는 것처럼, 보존적일 수 있다. 심지어 더 보존적인 것은 류신이 이소류신으로 치환되는 것 같이, 같거나 비슷한 크기와 화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환되는 것이다. 자연적으로 발생하는 동종 단백질의 종족에서의 서열 변화의 연구에서, 특정 아미노산의 치환은 다른 것들보다 더 자주 용인되고 있으며, 이들은 본래의 아미노산과 치환 사이에서 크기, 전하, 극성, 및 소수성이 비슷한 상관관계를 보이며, 이것은 "보존적 치환"를 정의하는데 기본이 된다.
여기서 보존적 치환은 아래의 다섯 개 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1- 작은 지방성, 무극성 또는 약간 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2- 극성, 음성 하전된 잔기와 그 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3- 극성, 양성 하전된 잔기(His, Arg, Lys); 군 4- 큰, 지방성, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 군 5- 큰, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).
덜 보존적 치환은 알라닌을 이소류신 잔기로 치환하는 것처럼, 비슷한 성질이지만 크기가 어느 정도 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 아주 비보존적인 치환은 산성 아미노산을 극성, 또는 심지어 염기성 아미노산으로 치환하는 것을 포함할 수도 있다. 그러나 이러한 "급진적" 치환은 화학적 작용이 완전히 예측 불가능하고 급진적 치환은 단순한 화학 원리에서 예측 가능하지 않은 뜻밖의 발생이 있을 수 있기 때문에 효과가 없다고 기각할 수는 없다.
물론, 이런 치환은 일반적인 L-아미노산 외 다른 구조를 포함할 수 있다. 따라서, D-아미노산을 본 발명의 항원 펩티드에서 흔히 발견되는 L-아미노산으로 교체할 수 있고 여기에서 공개를 통해 계속 포함시킬 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 흔히 자연적으로 발생하는 단백질성 아미노산이 아닌) 역시 본 발명에 따라 면역성과 면역성 폴리펩티드를 생산하기 위해서 치환될 수 있다.
아래에서 정의된 것과 상당히 동일하거나 더 큰 항원 활성이 있는 펩티드의 하나 이상의 위치에서 치환이 발견되면, 이러한 치환의 조합은 조합된 치환이 펩티드의 항원성에 추가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 내는지 결정하기 위해 시험된다. 최대, 펩티드에서 4 곳 이상의 위치에서 동시에 치환될 수 없을 것이다.
본원에서 명시한 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드는, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 비앵커 아미노산(앵커 모티프에 대해서는 아래 참조)이 교환되도록 할 수 있다. 또 다른 구현에서는, 본 문서에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드에 있어서, 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스-I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 비변형 펩티드에 비하여 상당히 변경되거나 또는 부정적으로 영향받음 없이 하나 또는 두 개의 아미노산이 그에 대한 보존적 교환 파트너(다음을 참조)와 교환될 수 있다.
T 세포 수용체와 상호작용하는 데에 상당히 기여를 하지 않는 아미노산 잔기들은 이와 결합됨으로써 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련된 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 교체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열 또는 그 한 부분 또는 주어진 변이체를 포함하는(발명자들이 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다고 일컫는) 어떠한 펩티드가 될 수도 있다.
[표 12]
서열번호 1, 2 및 4에 따른 HLA-A*02 펩티드의 바람직한 변이체 및 모티프
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
[표 12-2]
서열번호 13에 따른 HLA-A*02 펩티드의 바람직한 변이체 및 모티프
Figure pct00020
[표 13]
서열번호 23, 24 및 25에 따른 HLA-A*24 펩티드의 바람직한 변이체 및 모티프
Figure pct00021
더 긴(연장된) 펩티드도 적합할 수 있다. 대개 길이가 8 내지 11개의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피톱이 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피톱을 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성이 있다. 실제 에피톱은 양측에 있는 잔기를 처리하는 동안 실제 에피톱을 노출하는데 필요한 단백질 분해 절단에 실질적으로 영향을 주지 못하는 잔기이다.
본 발명의 펩티드는 아미노산을 최대 4개까지 연장할 수 있는데 즉, 1, 2, 3 및 4개의 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 임의의 조합으로 양쪽 어디로든 추가될 수 있다. 본 발명에 따른 신장의 조합은 표 14에서 찾을 수 있다.
[표 14]
본 발명의 펩티드들의 연장에 대한 조합
Figure pct00022
연장/신장을 위한 아미노산은 해당 단백질의 원래 서열의 펩티드나 기타 모든 아미노산일 수 있다. 연장은 펩티드의 안정성이나 용해성 강화를 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 에피톱은 자연적으로 발생하는 종양 관련 또는 종양 특정 에피톱과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 항원성 활성을 갖는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 다른 잔기를 가지고 있는 에피톱을 포함할 수 있다.
대안적인 구현에서, 펩티드는 한쪽 혹은 양쪽으로 4개 이상의 아미노산, 바람직하게는 총 30개의 아미노산 길이만큼 연장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드를 초래할 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험할 수 있다.
따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피톱의 펩티드와 변이체를 제공하고 여기서 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100개의 아미노산 사이이며, 바람직하게는 8 내지 30개의 아미노산 사이이며, 가장 바람직하게는 8 내지 14개의 아미노산 사이이며, 이는 즉 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개의 아미노산이다. 신장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우 그 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개의 아미노산일 수도 있다.
물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖게 된다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체에 대한 결합은 당업계의 방법에 의해 시험할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 특이적 펩티드의 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험될 때, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성할 때의 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게 약 1 μM 이하, 더 바람직하게 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게 약 100 pM 이하, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 치환 펩티드가 하나 이상, 최소 2개, 보다 바람직하게 3개의 개별 T 세포에 의해 인식되는 것 또한 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 구현에서 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 따라 구성되거나 본질적으로 구성된 펩티드이다.
"본질적으로 구성되는"이란 서열번호 1 내지 서열번호 110에 따른 서열 또는 변이체 외에도 본 발명에 따른 펩티드가 N- 및/또는 C-말단에 추가적으로 위치하고 있는 아미노산을 MHC 분자 에피톱에 대한 에피톱으로 기능하는 펩티드의 한 부분으로 반드시 형성하지 않는 아미노산들을 포함하는 것을 의미해야 한다.
그럼에도 불구하고, 이러한 추가된 아미노산은 본 발명에 따르면 세포 내로 효율적인 펩티드의 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현에서, 펩티드는 예를 들어 NCBI, 젠뱅크 수탁번호 X00497에서 유도된 것처럼 HLA-DR 항원 결합 불변 쇄(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N-말단 아미노산을 포함하고 있는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서는, 본 발명의 펩티드는 항체에 의해 특이적으로 표적화될 수 있도록 여기서 설명된 상기 항체나 그 기능적 일부 특히 항체의 서열에 대해 또는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 혹은 그 안으로 융합될 수 있다.
추가적으로, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자와의 결합성을 높여 더 강한 면역 반응을 일으킬 수 있도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 최적화를 위한 방법은 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 반대 펩티드 결합 또는 비-펩티드 결합을 도입하는 것이 있다.
역 펩티드 결합에서는 아미노산 잔기가 펩티드(-CO-NH-) 연결기로 결합되어 있지 않으나 펩티드 결합이 반대로 되어있다. 이러한 역-인버스 펩티드 모방형 물질은 이 분야에서 잘 알려진 방법으로 생성될 수 있으며, 이 방법의 예는 이 문헌의 참조 문헌으로 포함된 문헌(Meziere et al., 1997)에 설명되어 있다. 이 방법은 백본의 변경을 포함하지만, 측쇄의 방향을 바꾸지 않는 유사펩티드를 만드는 것을 포함한다. 문헌(Meziere et al., 1997)은 MHC 결합과 T 조력 세포 반응에서 이 유사 펩티드가 유용하다는 것을 보여준다. CO-NH 대신에 NH-CO 결합을 포함하고 있는 레트로 역위 펩티드는 단백질 가수 분해에 대한 저항력이 훨씬 높다.
비펩티드 결합의 예는 -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-, 및 -CH2SO-이다. 미국 특허 4,897,445는 기본 과정을 거쳐 합성된 폴리펩티드와 아미노 알데히드와 아미노산을 NaCNBH3 존재 하에 반응을 시켜 생성된 비-펩티드 결합을 포함한 폴리펩티드 쇄의 비펩티드 결합(-CH2-NH)을 위한 고체상 합성의 방법을 제공한다.
위에서 묘사된 서열로 이루어진 펩티드는 안정성, 생물가용성, 및/또는 펩티드의 결합을 증가시키기 위해 추가적인 화학 기를 아미노 및 또는 카복시 말단에 결합시킬 수도 있다. 예를 들어, 카보벤족실, 단실, 또는 t-부틸옥시카보닐 기 등 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 추가될 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카보닐 기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 또한, 소수성 기, t-부틸옥시카보닐, 또는 아미도 기 또한 펩티드의 카르복시 말단에 추가될 수 있다.
또한, 이 발명의 펩티드는 입체적 배치를 변화시키기 위해 생성될 수도 있다. 예를 들어, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신에 사용될 수도 있다. 더 나아가서, 본 발명의 펩티드의 적어도 하나의 아미노산 잔기가 비자연적으로 발생하는 아미노산 잔기와 치환될 수도 있다. 이와 같은 변화는 안정성, 생물가용성, 및/또는 본 발명의 펩티드의 결합을 증가시킬 수 있다.
유사하게, 이 발명의 펩티드 또는 변이체는 특정한 아미노산을 펩티드 생성 전 또는 후에 반응시킴으로써 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 이 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들어, 이 문헌의 참조 문헌에 포함되어 있는 문헌(R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004)에 잘 묘사되어 있다. 아미노산의 화학 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화 반응, 아미노산의 2,4,6-트리니트로벤젠 설폰화(TNBS)에 의한 트라이니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 퍼포민산에 의한 설피드릴 변형, 시스틴의 시스테릭산으로의 산화, 머큐리얼 유도체 생성, 다른 티올 화합물과 다이설피드 생성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드 아세트 아미드에 의한 카르복시메틸레이션 및 시안산 염에 알칼리성 산도에서의 의한 카르바밀화를 포함하지만 이에 국한 되지 않은 변형을 언급한다. 이에 관해서, 더 광대한 단백질의 화학 변형에 대한 방법론에 대해서는 당업자는 문헌(Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al., (John Wiley & Sons NY 1995-2000)(Coligan et al., 1995))의 15장을 참조하길 바란다.
간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기는 흔히 페닐글리옥산, 2,3-부탄디온 및 1,2-사이클로헥산디온과 같은 인접자리 디카르보닐 화합물과의 반응에 근거하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기와의 반응이다. 시스테인은 리신과 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형시킬 수 있다. 그 결과 다수의 시약들이 시스테인 변형에 사용 가능하다. 시그마-알드리치(http://www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사들의 웹사이트에서는 특정 시약에 관한 정보를 제공하고 있다.
단백질에서 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔하게 나타난다. 단백질에서 이황화 결합은 생물약제의 열 처리 동안 형성되어 산화될 수 있다. 우드워드의 시약 K는 특정 글루탐산 잔기의 변형에 사용될 수 있다. N-(3디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드를 사용하여 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이의 분자 내 가교를 형성할 수 있다. 예를 들어, 디메틸피로카보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 히스티딘은 4-하이드록시-2-노네날을 사용하여 변형시킬 수 있다. 리신 잔기와 다른 알파-아미노기의 작용은, 예를 들어, 펩티드의 표면 결합 또는 단백질/펩티드들의 가교에 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착 부위이며 단백질의 당화에서 중요 변형 부위이다. 단백질에서 메티오닌 잔기는 예를 들어 이오도아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민을 사용하여 변형시킬 수 있다.
테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용할 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교 형성은 과산화 수소/구리 이온으로써 성취할 수 있다.
트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서는 N-브로모숙신이미드, 브롬화 2-키드록시-5-니트로벤질 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.
PEG를 이용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변환은 히드로겔 준비시 사용되는 단백질을 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드와 교차 결합하는 동시 순환 반감기의 증가를 시키는 것과 흔히 관련되어 있다. 면역 치료를 위한 알레르겐의 화학적 변형은 종종 칼륨 시안산염의 카바밀화와 관련이 있다.
펩티드 또는 변이체, 여기에서 펩티드는 변환되었거나 또는 비-펩티드 결합을 포함하는 것이 본 발명 구현에서 바람직하다. 일반적으로 펩티드와 변이체(적어도 펩티드 연결기를 아미노산 잔기 사이에 포함하는 것들)는 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있으며, 이는 문헌(Lukas et al., 1981) 및 여기에 인용된 참조문헌에 공개되어 있다. 일시적인 N-말단 기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)에 의해 제공된다. 이렇게 염기 불안정한 보호 기의 반복적인 절단은 N, N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘를 이용하여 이루어진다. 측쇄 기능은 부틸 에테르(세린, 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카보닐 변이체(리신과 히스티딘의 경우), 트라이틸 변이체(아르기닌의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단의 잔기인 경우, 4,4'-디메톡시벤즈히드릴이 사용되어 측쇄 아미도 기능을 보호한다. 고체형 보조는 디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교 결합) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(기능 작용제)의 3개의 단량체로 만들어진 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반을 둔다. 펩티드 대 레진 절단 가능 연결 작용제로 사용되는 것은 산-불안정 4-하이드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N, N-디사이클로헥실-카보다이이미드/1-하이드록시벤조트리아졸에 의한 커플링 과정에 의해 추가되는 아스파라진과 글루타민을 제외하고 미리 생성된 대칭의 무수물 유도체로서 추가된다. 모든 커플링과 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 실험 과정에 의해 모니터링된다. 합성 완료 시에, 펩티드는 레진 기반에서 50% 스캐빈저 믹스를 포함한 95% 트리플루오로아세트산에 의한 측쇄 보호 기 제거와 동시에 절단된다. 일반적으로 사용되는 스캐빈저로는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하고, 정확한 선택은 합성되는 펩티드에 포함되어 있는 아미노산에 따라 결정된다. 펩티드의 합성에 있어서 고체상과 액체상 방법의 결합 또한 가능하다(예를 들어, (Bruckdorfer et al., 2004) 및 이 문헌에 인용된 참고문헌 참조).
트리플루오로아세트산은 진공 상태에서 증발된 후 디에틸에테르에 의한 분쇄에 의해 제거되어 조펩티드를 생성한다. 존재하는 임의의 스캐빈저는 수용액 상태에서 냉동건조에 의한 간단한 추출 과정에 의해 제거되어 스캐빈저가 없는 조펩티드를 생성한다. 펩티드 합성의 시약은 일반적으로 예를 들어 칼바이오켐-노바바이오켐(Calbiochem-Novabiochem. 노팅엄 소재)로부터 입수할 수 있다.
정제는 재 결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피 및 (보통) 예를 들어 아세토니트릴/물 구배 단리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피 등의 단일 방법 또는 이의 결합 방법에 의해 수행할 수 있다.
펩티드의 분석은 박막 크로마토그래피, 전기 영동법, 특히 모세관 전기 영동법, 고체상 추출법(CSPE), 고성능 역단계 액체 크로마토그래피, 산성 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 폭격 질량 분석법 및 MALDI와 ESI-QTOF 질량 분석법 등에 의해 이루어질 수 있다.
과다 제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간 샘플 제시는 물론 복제 변이를 보여주는 제시 프로필이 계산된다. 이 프로필은 관심 대상의 종양 개체 샘플을 정상 조직 샘플의 베이스라인에 병치된다. 그런 다음, 이 프로필 각각에 대해 선형 혼합효과 모형의 p-값을 계산하고(Pinheiro et al., 2015) 오류 발견율(Benjamini and Hochberg, 1995)에 대한 복수의 검사를 조절함으로써 과다 제시 점수에 통합될 수 있다.
질량 분석에 의한 HLA 리간드의 동정 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 샘플에서 얻은 HLA를 정제하고 HLA-연관 펩티드를 확인했다. 확인된 펩티드는 단리하여 그 서열을 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 실험에 의해 식별했다. 폐암(NSCLC) 샘플(N = 91개 A*02- 양성 샘플 및 N = 80개 A*24-양성 샘플)로부터 기록된 자연적 TUMAP의 분절 패턴을 동일한 서열을 가진 상응하는 합성 참조 펩티드의 분절 패턴과 비교하여, 얻어진 펩티드 서열을 확인했다. 이 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 그 결과는 155명의 폐암(NSCLC) 환자로부터 얻은 원발성 암 조직에 대해 식별된 펩티드의 자연적 처리와 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다.
발견 파이프라인 XPRESIDENT(등록상표) v2.1(예를 들어 전체가 여기에 포함되는 US 2013-0096016을 참고)은 몇 가지 다른 비암성 조직 및 기관에 비해 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기준으로 관련된 과다 제시된 펩티드 백신 후보의 식별과 선택을 허용한다. 이는 서열번호, 스펙트럼 집락화, 전화 이온 계수화, 정체 시간 정렬, 상태 디컨볼루션 및 정상화에 필요한 알고리즘을 조합시킨 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리하여 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 비표지 차등 정량화의 개발에 의해 성취되었다.
펩티드와 샘플 각각에 대한 오류 측정치 등 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과다 제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 기관이 식별된 바 있다.
폐암(NSCLC) 조직 샘플로의 HLA-펩티드 복합체를 정제했으며, HLA-관련 펩티드를 단리하여 LC-MS에 의해 분석했다(실시예 참조). 본 출원에 포함된 모든 TUMAP는 이러한 접근 방식으로써 샘플 상에서 식별하여 원발성 폐암(NSCLC)에 대한 제시를 확인했다.
복수의 폐암(NSCLC) 및 정상 조직에 대해 식별된 TUMAP를 비표지 LC-MS 데이터에 대한 이온-계수화를 사용하여 정량화했다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플에 과다한 존재와 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호들을 LS-MS 실험을 중심 경향에 근거하여 정상화하고 샘플 당 평균화하여 제시 프로필이라 부르는 막대 도표에 통합시켰다. 이 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군락화, 충전 상태 디컨벌루션(방전) 및 체류 시간 정렬 및 정상화와 같은 다른 분석 방법들을 통합시킨다.
더욱이, 발견 파이프라인 XPRESIDENT(등록상표) v2.x를 사용하면 암 혹은 다른 감염된 조직에서 MHC-, 바람직하게는 HLA-제약된 펩티드 수준의 직접 절대 정량화가 가능하다. 간단히 말하면 총 세포 수는 분석된 조직 샘플의 총 DNA 함량으로부터 계산되었다. 조직 샘플에서 TUMAP의 펩티드 총량은 자연 TUMAP에 대한 비율 및 소위 내부 표준으로 부르는 TUMAP의 동위원소 버전의 알려진 양으로서 나노 LC MS/MS에 의해 측정했다. TUMAP 단리의 효율은 TUMAP 단리 절차에서 가능한 가장 이른 시점에 모든 선택된 펩티드:MHC 복합체를 조직 용해물에 스파이킹 및 펩티드 단리 절차의 완료 후 나노LC-MS/MS에 의한 검출을 이용하여 결정했다. 총 세포 수와 펩티드의 총량은 조직 샘플당 3회 측정으로부터 계산했다. 펩티드 특이적 단리 효율은 10회의 스파이킹 실험을 진행하고 매회마다 3회 측정을 통해 평균을 내어 계산했다(실시예 및 표 22의 참조).
본 발명은 암/종양, 바람직하게는 본 발명의 펩티드를 과도하게 혹은 배타적으로 제시하는 폐암의 치료에 유용한 펩티드를 제공한다. 이 펩티드들은 원발성 인간 폐암(NSCLC) 샘플의 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 질량 분석법에 의해 나타났다.
펩티드가 유래하는 공급원 유전자/단백질("전장 단백질" 또는 "기저 단백질"로도 지정됨)의 다수는 공급원 유전자에 대한 고도의 종양 연관을 표출하는 정상 조직과 비교해서 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다 - 본 발명과 관련하여 "정상 조직"은 공급원 유전자와의 높은 정도의 종양 연관성을 발휘하는 종양-상응 유형의 건강한 폐 세포 혹은 기타 정상 조직 세포를 의미한다(실시예 2 참조). 게다가 펩티드 자체는 종양 조직에서 강력히 과다 제시된다 - 본 발명과 관련하여 "종양 조직"은 정상 조직상의 것이 아니라 폐암(NSCLC)을 앓는 환자의 샘플을 의미한다(실시예 1 참조).
HLA-결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해서 인식된다. T 세포는 인식된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포, 예를 들어 유도된 펩티드를 제시하는 폐암의 세포를 파괴할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 T 세포 반응을 자극할 수 있고/있거나 과다 제시되는 것으로 나타났으므로, 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 예를 들어 용해성 TCR의 생산에 사용될 수 있다(실시예 3, 실시예 4 참조). 더욱이 해당되는 MHC와 복합된 펩티드는 본 발명에 따른 항체, 특이적으로 결합하는 단편, 항체-유사 결합체 및/또는 TCR, 특히 sTCR의 생산에도 사용될 수 있다. 해당 방법들은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드의 직접적인 투여 또는 면역성을 강화할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 섞인 적당한 전구체 물질(예를 들어, 연장된 펩티드, 단백질, 또는 이러한 펩티드를 암호화하는 핵산)을 환자에게 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이런 치료 백신에서 생긴 면역 반응은 본 발명의 표적 펩티드가 비교가능한 복사 수로 정상 조직에서는 나타나지 않고, 환자의 정상 세포에 대한 기피되는 자기 면역 반응의 위험을 배제하기 때문에 종양 세포에 아주 특이적일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 용해성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용해성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하고, 그 친화력은 상보성 결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300(Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 목적 및 약물로서의 실용적인 용도의 경우, 알파 및 베타 쇄는, 예를 들어 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 및 항-CD3 도메인과 같은 효과기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발현될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407A1에 설명되어 있다. 이 생산의 추가 방법은 WO 2013/057586A1에 공개되어 있다.
"약학 조성물"이란 의학적 환경에서 인간에게 투여하는데 적합한 성분이다. 바람직하게는, 약학 조성물은 무균이며 GMP 지침에 따라 생산된다.
약학 조성물은 유리 형태 또는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 된 펩티드를 포함한다(상기 내용도 참조). 여기서 사용되는 것처럼, "약학적으로 허용가능한 염"은 펩티드가 제제의 산 또는 염기 염을 만들며 변형되는 공개된 펩티드의 유도체를 언급한다. 예를 들어, 산 염은 적당한 산과의 반응을 가진 자유 염기(일반적으로 중성 NH2 기가 있는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산 염을 준비할 때 적당한 산은 예를 들어, 염산, 브롬화 수소산, 황산, 질산, 인산과 같은 같은 무기산뿐만 아니라 초산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 수산, 말산, 말론산, 호박산, 말레산, 푸마르산, 주석산, 구연산, 벤조산, 계피산, 맨델릭산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등과 같은 유기산을 포함한다. 반대로, 펩티드에서 나타날 수 있는 산성 잔기의 염기 염의 준비는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민과 같은 약학적으로 허용가능한 염기를 사용한다.
특별히 바람직한 약학 조성물의 구현은 초산(아세트산염), 삼불화 초산 또는 염산(염화물)의 염으로의 펩티드를 가진다.
바람직하게는, 이 본 발명의 약제는 백신과 같은 면역 요법제이다. 이는 환자의 영향을 받은 기관에 직접적으로 투여될 수 있거나 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v.로서 전체적으로 투여되거나 또는 환자에게서 또는 나중에 환자에게 투여될 인간 세포주에 생체 외로 적용될 수도 있거나 또는 나중에 환자에게 다시 투여될 선택된 면역 세포의 부분 집단에 시험관 내로 사용될 수도 있다. 만약 핵산이 시험관 내에서 세포에 투여 되면, 인터루킨-2와 같은 면역 유도 시토카인과 함께 발현되는 것이 유용할 수도 있다. 펩티드는 상당히 순도가 높을 수도 있고, 또는 면역 유도 보조제(아래 참조)와 결합되어 있거나 또는 면역-유도 시토카인과 함께 사용되거나, 또는 리포좀과 같은 적당한 전달 체계와 함께 투여될 수도 있다. 펩티드는 또한 키홀 임펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난과 같은 적절한 운반체와 접합시킬 수도 있다(WO 95/18145 및 문헌(Longenecker et al., 1993) 참고). 펩티드는 표지를 붙일 수도 있으며 융합 단백질일 수 있고 하이브리드 분자일 수도 있다. 본 발명에서 그 서열이 제공된 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 기대된다. 하지만 CD8 세포의 자극은 CD4 보조 T 세포에 의해 제공되는 도움이 존재할 때 더 효율적이다. 따라서 CD8 T 세포를 자극하는 MHC 클래스 I 에피톱의 경우, 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 섹션은 CD4-양성 T 세포를 자극하는 에피톱을 적절하게 제공한다. CD4-와 CD8-자극 에피톱은 이 분야에서 잘 알려졌고 본 발명에서 식별된 것들을 포함한다.
한 양태에서, 이 백신은 서열번호 1 내지 서열번호 110을 명시하는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩티드 및 적어도 하나의 추가적인 펩티드, 바람직하게는 2개 내지 50개, 더 바람직하게는 2개 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개, 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 또는 그 이상의 특정한 TAA에서 유도되었고 이는 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 암호화하는 핵산(예를 들어 폴리뉴클레오티드)에 대한 정보를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이의 조합일 수 있으며, 한 가닥 및/또는 이중 가닥으로 되어 있을 수 있고, 또는 본래의 형태일 수도 또는 예를 들어 포스포로티오에이트 백본을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형으로 되어 있을 수도 있으며, 펩티드를 암호화하는 한 인트론을 포함할 수도 또는 그렇지 않을 수도 있다. 물론, 단지 자연적으로 일어나는 아미노산 잔기로 이루어지고 자연적으로 일어나는 펩티드 결합에 의해 결합이 된 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해서 암호화될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터에 대한 설명을 제공한다.
특히 DNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 벡터에 예를 들어 상보성 응집 말단을 이용하여 연결하는 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들어, 상보성 동종중합체 트랙트가 DNA 조각에 추가되어 이를 벡터 DNA에 삽입할 수 있다. 벡터와 DNA 조각은 이후 보완 동종중합체 꼬리와 함께 수소 결합을 이용하여 재조합 DNA 분자를 생성할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 제한 부위를 포함하는 합성 연결기는 DNA 분절과 벡터를 결합하는 다른 방법을 제시한다. 여러 가지의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 연결부위는 상업적으로 인터내셔날 바이오테크놀로지즈 인코포레이티드(International Biotechnologies Inc)(미국 코네티컷주 뉴 헤븐 소재)를 비롯한 곳에서 구입이 가능하다.
본 발명에서 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 문헌(Saiki et al., 1988)에 공개된 폴리머라아제 연쇄 반응을 이용한다. 이 방법은 예를 들어 적당한 제한 부위를 만들어 적당한 벡터로 DNA를 도입하는데 사용하거나 또는 당업계에서 알려져 있는 DNA를 다른 유용한 용도를 위해 변형하는 데에 사용될 수도 있다. 만약 바이러스 벡터가 사용된다면, 수두 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.
DNA(또는 레트로 바이러스 벡터일 경우, RNA)는 그 후 적당한 숙주에서 발현되고 이는 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 가지고 있는 폴리펩티드를 생성한다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 암호화하는 DNA는 알려진 기술과 여기에서 배울 수 있는 것을 고려하여 적절히 수정하여 적절한 숙주 세포를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성하도록 형질전환을 시키는 데 사용된다. 이러한 기법은 예를 들어 다음에 공개되어 있다: 미국 특허 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 및 4,810,648.
본 발명의 화합물을 만드는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터일 경우, RNA)는 많은 종류의 다른 DNA 서열과 결합되어, 적절한 숙주로의 도입을 유도할 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주로 도입하는 방법 및 에피솜 유지 또는 통합이 필요한 지에 따라 결정될 것이다.
보통, DNA는 발현을 위한 올바른 방향 및 올바른 리딩 프레임에 맞추어 플라스미드와 같은 발현 벡터로 삽입된다. 필요할 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적당한 전사 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수도 있다(하지만, 이 제어는 대부분의 경우 발현 벡터 내에 이미 존재한다). 벡터는 그 후 숙주로 기본적인 기술을 통해 도입된다. 보통, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지 않는다. 따라서, 형질전환된 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기술은 형질전환된 세포에서 선택이 가능한 특성(예를 들어 항생제 내성)을 암호화하는 DNA 서열을 필요한 제어 요소와 함께 발현 벡터에 통합시키는 것이다.
다른 방법으로는, 이러한 선택이 가능한 특성이 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 동시-형질전환하는 데에 사용된다.
발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 문서에서 기술된 내용을 고려하여 당업자가 이미 알고 있는 적절한 상태에서 충분한 시간 동안 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하고, 이는 후에 회복된다.
박테리아(예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)와 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들어 사카로마이세스 세레비지애), 사상균류(예를 들어 아스퍼길러스 스피시즈(Aspergillus spec .)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포 등의 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 그 체계는 ATCC 셀 바이올로지 콜렉션(ATCC Cell Biology Collection)에서 구할 수 있는 CHO 세포 등의 포유류 세포로 구성될 수 있다.
구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 CMV 또는 SV40 자극제와 적당한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항성 마커를 포함한다. 하나의 예는, 파마시아(Pharmacia)(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 구할 수 있는 pSVL이다. 유도가능 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며 이 또한 파마시아에서 구할 수 있다. 유용한 효소 플라스미드 벡터는 pRS403-406과 pRS413-416이며 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템스(스트라타젠 Cloning Systems)(미국 캘리포니아주 라호이아 소재)에서 구할 수 있다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIps)이며 이는 효소 선택 마커 HIS3, TRP1, LEU2와 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효소 동원체 플라스미드(Ycps)이다. (예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 입수한) CMV 프로모터 기반 벡터는 일시적인 또는 안정된 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT 등의 다양한 조합으로 N-말단 또는 C-말단 표지 등을 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 감지, 정제와 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 감지 시 유연성을 제공한다.
강한 인간 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 구성 단백질 발현 수준을 높게는 COS 세포에서 1 mg/L까지 구동한다. 좀 더 효능이 약한 세포주에서는, 단백질 수준이 전형적으로 약 0.1 mg/L 정도이다. SV40 복제 원점이 있음으로써 SV40, 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 DNA 복제의 수준이 높은 결과를 낳는다. CMV 벡터는 예를 들어 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1 원점, 박테리아에서 암피실린 저항 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH 폴리 A, 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리프로트립신 리더(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 FLAG 융합 단백질을 항-FLAG 항원, 레진, 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지로 분비하도록 방향을 정할 수가 있다. 다른 벡터와 발현 체계는 여러 가지의 숙주 세포 사용에 대해 널리 알려져 있다.
다른 구현에서는 본 발명의 2개 이상 펩티드나 펩티드 변이체가 암호화함으로써 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양" 구조와 유사). 그렇게 함으로써 펩티드나 펩티드 변이체는 예를 들어 LLLLLL과 같은 연결기 아미노산의 퍼짐에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있으며 또한 그 사이에 추가의 펩티드 없이 연결될 수 있다. 이러한 구성들은 암 요법에서도 사용할 수 있으며 MHC I 및 MHC II 모두가 연관되는 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성에 의해 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포가 몇몇의 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며, 보통 베테스다 리서치 래보래토리즈 인코포레이티드(Bethesda Research Laboratories Inc.)(미국 메릴랜드 주 베테스다 소재)에서 구할 수 있는 에스케리치아 콜라이 균주 DH5, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)(ATCC 번호 31343)에서 RR1이 입수가능하다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효소, 곤충, 포유류 세포를 포함하고, 생쥐, 쥐, 원숭이 또는 인간 섬유아세포와 대장 세포주 등의 척추 동물이 바람직하다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하고, 이는 대부분 스트라타진 클로닝 시스템스(미국 캘리포니아주 라호이아 소재)에서 구입이 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 ATCC에서 구입가능한 CCL61로 알려져 있는 중국 햄스터 난소 세포, CRL 1658로 알려져 있는 스위스 생쥐 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650 세포로 알려져 있는 원숭이 신장-유도 COS-1 세포와 293 세포로 알려져 있는 인간 배아 신장 세포를 들 수 있다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9 세포이며 이는 배큘로바이러스 발현 벡터에 의해 세포로 감염될 수 있다. 발현을 위한 적당한 숙주 세포의 선택에 대한 개관은 예를 들어 [Paulina Balbas and Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols," Part One, Second Edition, ISBN 978-1- 58829-262-9] 및 당해 분야의 숙련자에게 알려진 다른 문헌에서 찾을 수 있다.
적당한 세포 숙주를 본 발명의 DNA 구축물로 형질전환하는 것은 보통 사용되는 벡터의 유형이 따라 결정되는 잘 알려진 방법으로 완성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 대해서는 예를 들어 문헌(Cohen et al., 1972) 및 (Green and Sambrook, 2012)를 참조한다 . 효모 세포의 형질전환은 문헌(Sherman et al., 1986)에 설명되어 있다. 베그스(Beggs)의 방법(Beggs, 1978) 또한 유용하다. 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 감염시키는 시약, 예를 들어 칼슘 인산염과 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제제는 스트라타진 클로닝 시스템스 또는 라이프 테크놀로지즈 인코포레이티드(라이프 테크놀로지즈 Inc.)(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)에서 입수할 수 있다. 전기 천공법 역시 형질전환 및/또는 세포를 감염시키는 데에 유용하고 이는 효소 세포, 박테리아 세포, 곤충세포 및 척추동물 세포 형질전환에 잘 알려져 있다.
성공적으로 형질전환이 된 세포, 즉 본 발명의 DNA 구조를 가지고 있는 세포는 잘 알려진 PCR과 같은 기술로 식별된다. 다른 방법으로는, 상청액에 존재하는 단백질은 항생제를 사용함으로써 감지될 수 있다.
본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들어 박테리아, 효소 및 곤충 세포와 같은 세포는 본 발명의 펩티드의 준비에 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 하지만, 다른 숙주 세포 또한 특정한 치료 방법에 유용할 수도 있다. 예를 들어, 수지상 세포와 같은 항원-제시 세포는 적당한 MHC 분자에 로딩이 되도록 하는 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
바람직한 구현에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포이며, 특히 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선산 인산효소(PAP)를 함유하는 재조합 융합 단백질로 로딩된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)의 치료에 대해 미국 식품안전청(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인된 바 있다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 이의 변이체를 생산하는 방법, 숙주 세포를 배양하고 펩티드를 숙주 세포 또는 배지에서 단리하는 것을 포함한 생산 방법을 제공한다.
다른 구현에서는 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들어, 펩티드 또는 그의 변이체는 정맥 내(i.v.) 투여, 피부 하(s.c.) 투여, 피부 내(i.d.) 투여, 복강 내(i.p.) 투여, 근육 내(i.m.) 투여를 포함한다. 펩티드 투여의 바람직한 방법은 s.c., i.d., i.p., i.m., 및 i.v. 투여를 포함한다. DNA 투여의 바람직한 방법은 i.d., i.m., s.c., i.p. 및 i.v. 투여를 포함한다. 펩티드 또는 DNA의 50 μg 및 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg 사이의 용량이 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라서 투여될 수 있다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상실험에서 성공적으로 사용된 바 있다(Walter et al., 2012).
면역 접종에 사용된 폴리뉴클레오티드는 상당히 순도가 높거나 적당한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 이 업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들어 문헌(Teufel et al., 2005)이 제공하고 있다. 폴리뉴클레오티드 백신은 만들기가 쉽지만, 이들 벡터의 면역 반응을 유도하는 동작 모드는 완전히 이해가 되지 않았다. 적당한 벡터와 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 한 개 이상의 바이러스를 포함하는 혼성체 등의 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비-바이러스 전달 체계는 양이온 지질과 양이온 중합체를 포함하고 있으며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. "유전자-총(gene-gun)"을 통한 것과 같은 물리적 전달 또한 사용될 수 있다. 펩티드 또는 핵산에 의해 암호화 된 펩티드는 융합 단백질이 될 수도 있고, 예로서는 위에서 언급한 각각의 반대 CDR을 위한 T 세포를 유도하는 에피톱을 들 수 있다.
이 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응을 비특이적으로 향상시키거나 강력하게 하는 물질을 언급한다(예를 들어 항원에 대한 CD80-양성 T 세포 및 조력 T(TH) 세포에 의해서 중재된 면역 반응). 따라서 본 발명에서 보조제는 유용한 약제 구성이라고 할 수 있다. 적당한 보조제는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다: 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린에서 유도된 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(ALDARA, 등록상표), 레스퀴미드, ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOM, 주브이뮨(JuvImmune), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형과 수중유형 에멀전, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel(등록상표) 벡터 시스템, PLG와 덱스트란 극미립자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타글루칸, Pam3Cys, 사포닌에서 유도된 아퀼라스 QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물과 합성 세균의 세포 벽 모방제, 및 다른 리비의 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil), 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 독점 보조제 등이 있다. 프로인트(Freund) 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 몇몇 면역적 보조제(예를 들어 MF59)는 수지상 세포에 특이적이고, 그 제조 방법은 이전에 묘사된 바 있다(Allison and Krummel, 1995). 또한, 시토카인도 사용될 수 있다. 몇몇 시토카인은 수지상 세포의 림포이드 조직으로의 이동에 영향을 주는 것에 직접적으로 연관된 바 있으며(예를 들어 TNF-α), 이는 수지상 세포의 더 효율적인 T 림프구에 대한 항원 제시 세포로의 성장을 가속시키고(예를 들어 GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 5,849,589, 여기에 그 전문이 참조 문헌으로 포함됨) 면역보조제의 역할을 한다(예를 들어 IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-알파, IFN-베타)(Gabrilovich et al 1996).
CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 세팅에서 보조제의 효율성을 높이는 것으로 나타났다. 이 이론에 국한하지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 특히 TLR9를 통해 선천(비적응) 면역 반응을 활성화시킨다. CpG에 의해 유도된 TLR9의 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 넓은 종류의 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게 이는 수지상 세포의 성숙 및 차별화를 향상시키고 이는 TH1 세포의 활성화를 향상시키며 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성을 CD4 T 세포의 도움이 없을 때에도 향상시킨다. TLR9 자극에 의해 일어난 TH1 바이러스는 보통 TH2 바이러스를 자극시키는 alum 또는 비완성된 프로인트 보조제(Freund's adjuvant(IFA))와 같은 백신 보조제가 존재할 때도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 다른 보조제와 함께 제조되거나 함께 투여될 시 또는 특히 항원이 상대적으로 약할 때 강한 반응을 얻어 내기 위해 필요한 미세입자, 나노입자, 지질 에멀전 또는 비슷한 제약으로 되어 있을 경우 더 큰 보조제 활동을 보인다. 그들은 또한 면역 반응을 가속화시키고, 몇몇의 연구에서 보여진 바 있듯이 CpG가 없을 때 백신 전체 용량이 일으키는 항체 반응 수준으로 항원의 용량을 약 두 배 정도 줄일 수 있도록 한다(Krieg, 2006). 미국 특허 6,406,705 B1은 CpG 올리고뉴클레오티드, 비핵산 보조제 및 항원 특이 면역 반응을 일으키는 항원의 결합 사용에 대해 묘사한다. CpG TLR9 길항제는 몰로겐(Mologen)(독일 베를린 소재)에 의해 만들어진 dSLIM(이중 줄기 루프 면역조절제)이며 이는 본 발명의 제약 조성의 바람직한 성분이다. RNA 결합 TLR7, TLR8 및/또는 TLR9 등의 다른 TLR 결합 분자 또한 사용이 가능하다.
다른 유용한 보조제의 예는 다음을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 CpG(예를 들어 CpR, 이데라(Idera)), 폴리(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 그 유도체(예를 들어 앰프리젠(AmpliGen), 힐토놀(Hiltonol), 폴리-(ICLC), 폴리(IC-R), 폴리(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA 및 사이클로포스아미드, 수니티닙, 베바시주맙(Bevacizumab), 셀레브렉스, NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 안티-CTLA4와 같은 면역활성적인 작은 분자) 및 항체 및 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예를 들어 항-CD-40, 항-TGF베타, 항-TNF알파 수용체) 및 SC58175가 있으며 이는 치료적으로 또는 보조제의 역할을 할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 보조제와 첨가제의 양과 농도는 특별히 다른 실험할 필요 없이 숙련된 기술자에 의해서 쉽게 결정될 수 있다.
바람직한 보조제들은 항-CD40, 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 사이클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필, 및 PLG 혹은 비로솜 미립자 제제이다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인테페론 알파와 같은 콜로니 자극 인자로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 그래뉼로사이트 마크로파지 콜로니 자극 인자(GMCSF, 사르가라모스팀), 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 및 레시퀴모드로 구성되는 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 구현에서, 보조제는 사이클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 훨씬 더 바람직한 보조제는 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 폴리-ICLC(Hiltonol, 등록상표) 및 항-CD40 mAB 또는 이들의 조합들이다.
이 조성물은 피하, 피부내, 근육내 비경구 투약 또는 경구 투약에 사용된다. 이를 위해, 펩티드 및 임의적으로 다른 분자들을 약학적으로 허용되는, 바람직하게는 수용성 운반체에 용해 또는 현탁한다. 추가로, 이 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미료, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 또한 펩티드는 시토카인 같은 면역 자극 물질과 같이 투여될 수도 있다. 이러한 성분에 사용될 수 있는 방대한 부형제 목록은 예를 들어 다음에서 확인할 수 있다: [A. Kibbe, Handbook of Pharmaceurical (Kibbe, 2000)]. 이러한 조성물은 선종성 또는 암성 질병의 예방, 방지 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예시적 제제는 예를 들어 EP 2113253에서 찾을 수 있다.
본 발명에 따른 백신에 의해 일어나는 면역 반응이 다른 세포 단계 및 다른 개발 단계에서 암을 공격한다는 것을 인지하는 것이 중요하다. 더욱이 암과 연관된 다른 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이것은 단 하나 또는 몇몇 표적만을 다루며 종양으로 하여금 공격에 쉽게 적응하도록 유발할 수 있는(종양 탈출) 백신에 비해 이점으로 작용한다. 더욱이, 모든 개별 종양들이 같은 항원의 패턴을 발현하는 것은 아니다. 따라서 몇몇 종양 연관 펩티드들의 조합은 모든 개별 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 한다. 이 조성물은 각 종양이 몇 개의 항원을 발현할 것으로 기대되고 종양 성장 및 유지에 필요한 몇 개의 독립적 경로를 다루도록 설계되었다. 따라서 백신은 보다 큰 환자 모집단을 위해 "기성품"으로 쉽게 사용이 가능하다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택을 HLA 형 결정으로 제약할 수 있고, 항원 발현을 위해 어떠한 추가의 바이오마커 평가를 요구하지 않음을 의미하지만, 효능에 중요한 몇몇 표적들이 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격되도록 계속 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
여기서 사용된 "골격(scaffold)"이란 용어는 (예를 들어 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 언급한다. 한 구현에서, 골격은 그것이 부착되는 객체(예를 들어 (두 번째) 항원 결합 잔기)를 표적 부위, 예를 들어 특이한 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 간질(예를 들어 당장의 용도에 따른 펩티드와 MHC의 복합체)로 향하도록 지시할 수 있다. 또 다른 구현에서 골격은 그 표적 항원, 예를 들어 T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 그 단편, 항체 중쇄 변수 영역 및 항체 연쇄 변수 영역을 포함하는 항체의 도메인에 결합하는 항원, 적어도 하나의 앙키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (용해성) TCR 및 동종 또는 자가 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 어떤 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 검정을 수행할 수 있다.
"특이적" 결합이란 그 골격이 다른 자연적으로 발생하는 펩티드-MHC-복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC-복합체에 더 잘 결합하고, 그 정도는 특정 표적이 포함된 세포를 줄일 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특정 표적이 없는 다른 세포는 죽일 수 없으며 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 것을 의미한다. 교차-반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연적으로 발생하지 않는다면, 즉 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는다면, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 살해의 평가 검사는 당업계에 잘 알려져 있다. 이 검사는 변경되지 않는 펩티드-MHC 제시를 가진 표적 세포(일차 세포 혹은 세포주) 또는 자연적으로 발생되는 펩티드-MHC 수준이 도달되는 정도로 펩티드가 포함된 세포를 사용하여 수행해야 한다.
각 골격은 라벨이 제공하는 신호의 존재나 부재를 판단함으로써 결합된 골격이 검출 가능하도록 제공하는 라벨링을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 골격은 형광 염료나 임의의 다른 해당되는 세포 마커 분자를 사용하여 라벨링이 가능하다. 그러한 마커 분자는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 형광 라벨링은 (예를 들어 형광 염료에 의해 제공되는) 형광이나 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포 분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.
각 골격은 IL-21, 항-CD3, 항-CD28과 같은 두 번째 활성 분자와 접합될 수 있다.
폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는 예를 들어 WO 2014/071978 A1의 배경 부분과 거기에 인용된 참조 문헌을 참조한다.
본 발명은 또한 압타머에 관한 것이다. 압타머란(예를 들어 WO 2014/191359 및 여기에 인용된 문헌을 참조) 정의된 삼차원적 구조로 접힐 수 있으며 특정 표적 구조를 인지할 수 있는 짧은 단일 가닥 핵산 분자이다. 이것은 표적 요법의 개발에 필요한 적합한 대안인 것으로 보여진 바 있다. 압타머는 높은 친화성 및 특이성으로써 다양한 복합체 표적에 선택적으로 결합하는 것으로 나타난 바 있다.
세포 표면에 위치한 분자를 인지하는 압타머가 지난 십 년 동안 동정된 바 있으며 진단 및 치료 접근 방식을 개발하기 위한 수단을 제공한다. 압타머가 독성 및 면역원성을 거의 소유하지 않는 것으로 나타난 바가 있으므로, 생존의학적 용도를 위한 유력한 후보이다. 정말로 압타머, 예를 들어 전립선 특이적 막-항원을 인지하는 압타머는 표적 대상의 요법을 위해 성공적으로 사용되어 왔으며 또한 생체 모델에서의 이종이식에 기능적인 것으로 나타난 바 있다. 더욱이 특이적 종양 세포주를 인지하는 압타머가 동정된 바 있다.
DNA 압타머는 다양한 암 세포 및 특히 고형 종양으로부터 유래하는 것들을 위한 광범위 인지 성질을 밝히기 위해 선택가능한 반면에, 비종양형성의 및 원발성의 건강한 세포는 인지되지 않는다. 동정된 압타머가 특이적 종양 아형을 인지할 뿐만 아니라 일련의 종양과 상호작용한다면, 이로 인해 압타머는 소위 광범위 진단 및 치료에 적용될 수 있다.
더욱이 유세포 분석을 사용한 세포 결합 거동의 조사에 의하면 압타머는 nM 범위에서 매우 양호하고 뚜렷한 친화성을 드러내는 것으로 나타났다.
압타머는 진단 및 치료 목적으로 유용하다. 더욱이 일부 압타머는 종양 세포에 의해 섭취되고 따라서 종양 세포 안으로의 siRNA와 같은 항암제의 표적 인도를 위한 분자 부형제로서 기능이 가능함을 보여줄 수 있다.
압타머는 세포와 조직과 같은 복합체 표적 및 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 110 사이의 어느 것에 따른 서열로 구성되고 본 발명에 따른 펩티드와 MHC 분자와의 복합체에 대하여, cell-SELEX(지수적 증식에 의한 리간드의 체계적 진화) 기법을 사용하여 선택이 가능하다.
본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는데 사용될 수 있다. 이들은 병변 조직에 치료, 독성 물질 표적화 또는 방사능 물질로 사용될 수 있다. 이런 항체의 또 다른 사용은 PET 같은 이미지 목적을 위해 병변 조직의 방사성 핵종을 표적화할 수도 있다. 이 사용은 작은 전이를 감지하거나 병변 조직의 크기와 정확한 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있다.
따라서 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체의 생산 방법을 제공하는 것으로, 이 방법은 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 용해성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로써 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유동물의 면역화; 상기 비인간 포유동물의 세포를 생산하는 항체로부터 mRNA 분자의 단리; 상기 mRNA 분자에 의해 암호화된 단백질 분자를 표시하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생산; 및 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 적어도 하나의 파지의 단리를 포함하고 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합되는 상기 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 클래스 II와 특이적으로 결합하는 상기 항체를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합되는 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것으로 이 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 양특이성 항체 및/또는 키메라 항체이다.
그러한 항체 및 단일 쇄 클래스 I 주조직적합 복합체의 생산을 위한 해당 방법들은 물론 이러한 항체의 생산을 위한 다른 도구들은 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 및 출판물(Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003)에 공개되어 있으며, 이들은 본 발명의 목적을 위해 그 전문이 참조문헌에 명백히 포함되어 있다.
바람직하게는 항체는 20 nM 미만, 복합체에 대해서 바람직하게는 10 nM 미만의 결합 친화력으로써 복합체와 결합하는데, 이는 또한 본 발명의 맥락에서 "특이적"으로 간주된다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호 1내지 서열번호 110에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체 또는 상기 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드는 기저 전장 폴리펩티드가 아니다.
본 발명은 또한 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성되는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 펩티드 또는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 대해 적어도 88% 상동성인(바람직하게는 동일한) 그 변이체에 관한 것으로, 상기 펩티드 또는 변이체는 전체 길이가 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 8 내지 14개인 아미노산이다.
본 발명은 또한 인간 주조직적합 복합체(MHC) 클래스 I 또는 II의 분자에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 110에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 또는 본질적으로 구성된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 상기 펩티드는 (화학적으로) 변형되고/되거나 비펩티드 결합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로 펩티드는 융합 단백질의 일부이고, 특히 HLA-DR 항원 연관 불변 쇄(Ii)에 융합되거나 또는 펩티드는 예를 들어 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은 항체에(또는 안으로) 융합된다.
본 발명은 또한 본 발명이 따른 펩티드를 암호화하는 핵산에 관한 것으로, 단 펩티드가 완전한 (전부) 인간 단백질은 아니다.
본 발명은 또한 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 의학에서의 특히 폐암의 치료에서의 사용을 위한 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 전에 설명한 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항원 제시 세포 및 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 펩티드 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포의 배양과 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터 펩티드의 단리를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 충분한 수량의 항원을 항원 제시 세포와 접촉시킴으로써 항원이 적합한 항원 제시 세포의 표면에 발현된 클래스 I 또는 II MHC 분자 위에 로딩된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 관한 것으로, 항원 제시 세포가 서열번호 1 내지 서열번호 110을 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 활성화된 T 세포에 관한 것으로, 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
본 발명은 또한 표적 세포가 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자에서 그 표적 세포를 죽이는 방법에 관한 것으로, 그 방법은 본 발명에 따른 효과적인 수의 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 설명한 임의의 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 또는 본 발명에 따른 활성화된 세포 독성 T 림프구를 약제로서 또는 약제의 제조 시 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 백신이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로 상기 약제가 암에 대해 활성을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 사용에 관한 것으로, 상기 암세포는 폐암 세포 또는 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL), 비호지킨 림프종(NHL), 위식도 접합부(OSCAR)의 암을 포함하는 식도암, 담낭암 및 담관암종(GBC_CCC), 방광암(UBC), 자궁암(UEC)과 같은 기타 고형 혹은 혈액 종양 세포이다.
본 발명은 또한 폐암의 진단 및/또는 예후에 사용할 수 있는 여기서 "표적"으로 부르는, 본 발명에 따른 펩티드에 근거한 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 암 치료를 위해 이러한 신규 표적들의 사용에 관한 것이다.
용어 "항체" 또는 "항체들"은 여기에서 광범위한 의미로 사용되고, 다클론 및 단클론 항체를 둘 다 포함한다. 무손상 또는 "온전한" 면역글로불린 분자 외에도, "항체"란 용어에는 그러한 면역글로불린 분자들의 단편(예를 들어 CDRs, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체 및 면역글로불린 분자의 인간화 버전이 포함되는데, 단 이들은 본 발명에 따른 바람직한 물성들(예를 들어 폐암 마커 (폴리)펩티드의 특이적 결합, 암 마커 유전자를 발현하는 폐암 세포로 증가된 수준의 독소 전달 및/또는 폐암 마커 폴리펩티드의 활성도 억제)의 어느 것이라도 발현한다.
가능한 한, 본 발명의 항체는 상용 공급원에서 구입해야 한다. 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 통해서 만들어 질 수도 있다. 당업자는 전장 폐암 마커 플리펩티드 혹은 이들의 단편이 본 발명의 항체 생성에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 항체를 생성하는 데에 사용될 폴리펩티드는 자연적인 원천에서 부분적으로 또는 완전히 정화될 수 있으며, 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 만들어 질 수도 있다.
예를 들어, 서열번호 1 내지 서열번호 110의 폴리펩티드에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 cDNA 또는 그 변이체나 단편은 원핵 세포(예를 들어 박테리아) 또는 진핵 세포(예를 들어 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 재조합 단백질은 그 후 정제되고 본 발명에 따른 항체 생성에 사용되는 폐암 마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제조에 사용될 수 있다.
당업자는 두 개 이상의 다른 단클론 또는 다클론 항체의 조합의 생성을 의도하는 사용(예를 들어 ELISA, 면역조직화학, 생체 내 이미징, 면역 독소 요법)에 요구되는 특이성 및 친화성을 갖는 항체의 획득 가능성을 최대화함을 인식할 것이다. 이 항체들은 그 항체들이 사용되는 목적에 의거하여 알려진 방법에 의해 바라는 활성도에 대해 시험된다(예를 들어 ELISA, 면역조직화학, 면역 요법 등; 항체의 생성과 시험에 관한 추가 지침은 다음을 참고한다(예를 들어 Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). 예를 들어, 항체는 ELISA 검정, 웨스턴 블롯, 포르말린 고정 폐암 면역조직화학 염색 또는 동결 조직 절개에서 시험할 수 있다. 치료 또는 생체 내 진단용을 위한 항체는 초기의 시험관 내 특성화 이후, 알려진 임상 시험 방법에 따라 시험한다.
"단클론 항체"라는 용어는 여기서 실질적으로 균등질 항체 개체군에서 획득이 된 것을 언급한다. 즉, 이 개체군이 포함하는 각각의 항체는 자연적으로 일어날 수 있는 소수의 변이체를 제외하고는 동일하다. 단클론 항체는 여기서 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부분이 특정한 종 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체의 서열과 상응하거나 일치하고, 쇄의 나머지 부분은 다른 종 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에서 유도된 항체, 및 이러한 항체의 단편의 서열과 상응하거나 일치하고, 희망하는 상반되는 활동성을 보여주는 "키메릭(chimeric)" 항체를 포함한다(미국 특허 4,816,567, 전문이 여기에 포함됨).
본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 준비될 수 있다. 하이브리도마 방법에서는, 생쥐 또는 다른 적당한 숙주 동물이 보통 면역성을 주는 작용제에 의해 면역되어, 면역성을 주는 작용제에 특정적으로 결합하는 항체를 생산하거나 이를 생산할 수 있는 능력을 가지고 있는 림프구를 유도해 낸다. 다른 방법으로는, 림프구는 시험관 내에서 면역될 수도 있다.
단클론 항체는 미국 특허번호 4,816,567에 설명된 것과 같은 재조합 DNA 방법들에 의해서도 만들어질 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 암호화하는 DNA는 손쉽게 단리되고 전통적인 방법을 사용하여 염기 서열 분석이 가능하다(예를 들어 마우스 유래 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특정하게 결합할 수 있는 능력이 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
시험관 내 방법 또한 1가의(monovalent) 항체를 준비하는 데에 적당하다. 이 분야에서 잘 알려진 방법을 사용하여 항체를 절편화시켜 항체의 단편을 특히 여기서는 Fab 단편을 생산할 수 있다. 예를 들어, 파파인을 사용하여 절편화가 이루어질 수 있다. 파파인 소화의 예는 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 설명되어 있다. 항체의 파파인 소화는 보통 각각 하나의 항원 결합 위치 및 남은 Fe 단편을 포함한 Fab 단편의 동일한 두 개의 항원 결합 단편을 생산한다. 펩신 처리는 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편을 생산한다.
항체 단편도, 다른 서열과 붙어 있든 그렇지 않든 간에, 이 단편의 활동력이 변경되지 않은 항체 또는 항체 단편에 비교할 시, 현저하게 바뀌거나 또는 손상이 되지 않는 한, 삽입, 삭제, 치환, 또는 특정한 위치의 또는 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 이황화물 결합의 능력이 있는 아미노산의 제거/추가, 생물적 생명의 증가, 분비 특징의 변화 등의 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우에도, 항체 단편은 결합성, 결합 도메인에서의 결합 조정 등의 생물작용 성질을 소유하고 있어야 한다. 항체의 기능적인 또는 활동적인 범위는 단백질의 특정한 지역의 돌연변이 생성, 발현 및 이 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법은 이 분야의 기술자가 손쉽게 알 수 있는 기술이며 이는 항체 단편을 암호화하는 핵산의 위치-특정 돌연변이 생성을 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더욱 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비-인간(예를 들어 쥐과 동물) 항체는 최소의 비-인간 면역글로불린 항체에서 유도된 서열을 포함하는 키메릭 면역글로불린항체, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항체의 항원 결합의 결과)이다. 인간화된 항체는 상보성 결정 영(CDR)의 잔기가 생쥐, 쥐 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여 항체)의 CDR의 잔기로 바뀐 요구되는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 인간 면역글로불린(공여 항체)이다. 몇몇의 예에서는, 인간 면역글로불린의 Fv 구조(FR) 잔기가 상응하는 비-인간 잔기로 교체된다. 인간화된 항체는 수납 항체 또는 수입된 CDR 또는 구조 서열의 어디에서도 찾을 수 없는 서열을 포함하기도 한다. 보통, 인간 항체는 변이성 도메인을 적어도 하나 또는 거의 대부분 두 개를 포함하고, 모든 또는 실질상 모든 CDR 범위는 비-인간 면역글로불린에 상응하고 모든 또는 실질상 모든 구조 범위는 인간 면역글로불린 일치 서열이다. 인간화된 항체는 이상적으로 적어도 보통 인간 면역 글로불린의 면역글로불린 불변 범위(Fc)의 한 부분 또한 포함할 것이다.
이 분야에서 비인간 항체를 인간화하는 방법은 잘 알려져 있다. 보통, 인간화된 항체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비-인간 근원에서 이에 도입된다. 이 비-인간 아미노산 잔류들은 종종 "수입" 잔기이라고 일컬어지며, 이는 대개 "수입" 변수 도메인에서 출처한다. 인간화는 본질적으로 설치류의 CDR 또는 상응하는 인간 항체 서열의 CDR 서열을 인간의 것으로 교체하는 것으로 실행될 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이며(US 4,816,567), 온전한 인간 변수 도메인보다 훨씬 적게 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 대체된다. 실제적으로, 인간화된 항체는 보통 몇몇의 CDR 잔기 및 가능하게는 몇몇의 구조 잔기가 이 설치류의 유사한 영역의 잔기와 치환된 인간 항체이다.
면역되었을 때, 내생의 면역글로불린 생성이 없는 중에 전체 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자 변형 동물(예를 들어 생쥐)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 배선 돌연변이 생쥐의 항체의 중쇄 결합 영역 유전자 동형 삭제는 내생 항체 생산의 완전한 억제 결과를 가져온다. 이러한 배선 돌연변이 생쥐로의 인간 배선 면역글로불린 유전자 정렬 이입은 항원이 존재할 때 인간 항체 생산의 결과를 낳을 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생산될 수 있다.
발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체에 의해서 피험자에게 투여된다. 보통, 적당한 약학적으로 허용가능한 염이 제형을 등장 상태로 만들기 위해 제형에 사용된다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는, 링거 용액(Ringer's solution) 및 포도당 용액이 있다. 이 용액의 pH 값은 바람직하게는 약 5 내지 약 8 사이이며, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5 사이이다. 더 많은 담체는 항체를 포함하는 세포간질이 막, 리포좀 또는 미세입자와 같은 형태로 되어 있는 고체 소수성 중합체 반투성의 세포간질과 같은 지속적인 방출 준비를 포함한다. 예를 들어, 투여 방법 및 투여되는 항체의 농도에 따라 어떤 담체가 더 바람직한지는 이 분야의 당업자에게는 명백할 것이다.
항체는 피험자, 환자 또는 세포에 주사(예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내), 또는 주입과 같은 혈액으로서의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있는 다른 방법으로 투여될 수 있다. 항체는 국소뿐만이 아니라 전신의 치료 효과를 얻기 위해 종양 내 또는 종괴 주위의 방법으로도 투여될 수도 있다. 국소 또는 정맥내 주사가 바람직하다.
항체 투여의 효율적인 용량과 스케줄은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 이 분야의 기술 중의 하나다. 이 분야의 당업자는 투여되는 항체의 용량은 예를 들어 이 항체를 받는 대상, 투여 방법, 사용되는 특정한 항체의 종류 및 투여되는 다른 약들에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용될 시 전형적인 항체의 일일 용량은 1 μg/kg 내지 100 mg/kg으로 다를 수 있으며, 위에 언급된 요인을 고려할 때 이보다 더 높을 수도 있다. 바람직하게는 폐암의 치료를 위한 항체의 투여 후, 이 분야의 당업자들에게 알려진 다양한 방법으로 이 치료 항체의 효능을 평가할 수 있다. 예를 들어, 치료를 받고 있는 시험대상자의 폐암의 크기, 수, 및/또는 분포 등을 표준 종양 영상 기술을 이용하여 모니터할 수 있다. 항체의 투여가 없을 경우 일어날 수 있는 종양의 성장을 정지시켜, 종양을 오그라들게 하고, 또는 새로운 종양의 성장을 예방하는 치료의 목적으로 투여된 항체는 효과있는 폐암의 치료라고 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 특이적 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 용해성 T 세포 수용체(sTCR)의 생산 방법을 제공하는 것이다. 이러한 용해성 T 세포 수용체는 특이적 T 세포 클론으로부터 생성 가능하고, 그 친화력은 상보성 결정 부위를 표적으로 하는 돌연변이유발성에 의해 증가시킬 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적 상, 파지 디스플레이를 사용할 수 있다(US 2010/0113300,(Liddy et al., 2012)). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화 목적 상 및 약물로서의 실용적인 용도의 경우, 알파 및 베타 쇄는, 예를 들어 비정상적 이황화 결합, 기타 공유 결합(단일-쇄 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 시토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참고), 및 항-CD3 도메인과 같은 작용기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 더욱이 이것은 입양 전달에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685 A1 및 WO 2004/074322 A1에서 찾을 수 있다. sTCR의 조합은 WO 2012/056407 A1에 설명되어 있다. 이 생산에 관한 추가 방법들은 WO 2013/057586 A1에 공개되어 있다.
그 밖에, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합하는 분자는 병리학자에 의한 생검 샘플에 근거하는 암의 진단을 확인하는데 사용이 가능하다.
항체 또는 TCR은 생체 내의 진단 분석에 사용될 수도 있다. 보통, 항체는 방사성핵종으로 라벨이 되고(예를 들어 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P 또는 35S) 면역 섬광 조형술을 사용하여 그 종양이 국소화될 수 있다. 하나의 구현에서는, 항체 또는 그 단편은 상기 언급된 단백질들로 구성된 군으로부터 선택된 단백질에 대한 두 개 또는 그 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합을 하고 친화성 값(Kd)은 1 x 10 μM 보다 낮다.
진단의 용도로 사용되는 항체는 여러 가지의 영상 방법으로 감지될 수 있는 적당한 프로브로 라벨이 될 수 있다. 프로브의 감지 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경, 자기 공명 단층 촬영 영상 및 분광기 형광 투시법, 전산화 단층 촬영과 양전자 방사 단층 촬영기를 포함하지만 이에 국한되지 않는 방법을 들 수 있다. 적당한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신과 다른 형광체, 방사성 동위 원소, 금, 가돌리늄과 다른 란탄계열 원소, 상자성체의 이온, 플루오르-18 및 다른 양전자 방출 방사성 핵종 등을 포함하지만, 이에 국한되지 않는 것을 들 수 있다. 또한, 프로브는 두 개의 또는 그 이상의 기능을 가지고 있을 수 있으며, 여기에 나열된 하나 이상의 방법으로 감지될 수 있다. 이러한 항체는 직접적으로 또는 간접적으로 여기에 나열된 프로브로 라벨이 될 수 있다. 이렇게 항체와 프로브를 연결하는 것으로는 이 분야에서 잘 알려진 것들 중에 프로브의 공유원자 연결, 프로브의 항체로의 편입, 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트 화합물의 공유원자 연결 등을 들 수 있다. 면역조직 화학을 위해서, 질병 조직 샘플은 신선하거나 냉동되었거나 또는 파라핀에 포매되어 포르말린과 같은 방부제로 고정되어 있을 수 있다. 고정되었거나 포매되어 있는 샘플을 포함하고 있는 조직 절편은 라벨된 1차 항체와 2차 항체와 접촉되고 여기서 그 항체는 원위치 단백질 발현의 감지를 위해 사용된다.
본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포와 항원 적재된 적당한 항원-제시 세포의 표면에서 T 세포를 항원이 본 발명의 펩티드라고 할 때 항원 특정 방식으로서 활성화시키는 데 충분한 시간 동안에 발현되는 인간 클래스 I 또 는 II MHC 분자의 접촉을 포함하는 시험관 내의 방법으로 생성하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 충분한 양의 항원이 항원-제시 세포와 함께 사용된다.
바람직하게는, 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나, 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적당한 세포로는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 들 수 있다. TAP이란 항원 처리에 관련된 트랜스포터를 일컷는다.
인간 펩티드 적재 결핍 세포주 T2는 ATCC 타입 컬쳐 콜렉션(미국 메릴랜드주 파크로운 드라이브 소재)에서 카탈로그 번호 CRL 1992로 구입이 가능하고, 초파리 세포주 Schneider 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863으로 구입이 가능하고, 생쥐 RMA-S 세포주는 문헌(Ljunggren and Karre, 1985) 등에서 묘사가 된바 있다.
바람직하게는, 숙주 세포는 감염전에 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 자극기 세포는 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA 3과 같은 T 세포를 위한 공동-자극 신호의 제공에 중요한 분자를 발현하는 것 또한 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 II 분자의 핵산 서열 및 동시자극 분자의 서열은 젠뱅크와 EMBL 데이터베이스에서 공개적으로 제공된다.
MHC 클래스 I 에피톱이 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8-양성 CTL이다.
만약 항원 제시 세포가 이러한 에피톱을 발현하도록 감염되었다면, 바람직하게는 그 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 110을 포함하는 펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 포함하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.
T 세포를 시험관 내에서 생성하는 몇몇의 다른 방법도 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가 종양-침윤 림프구를 CTL 생성에 사용할 수 있다. 문헌(Plebanski et al., 1995)에서는 T 세포의 준비에 자기 말초 혈액(PLB) 림프구를 사용했다. 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리 펩티드로 펄스시키거나, 또는 재조합 바이러스에 의한 감염에 의해 자가 조직 T 세포의 생산이 가능하다. 또한, B 세포는 자가 조직 T 세포의 생산에서 사용할 수 있다. 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스된 또는 재조합된 바이러스에 의해 감염된 대식 세포가 자가 조직 T세포의 준비 시 사용될 수 있다. 문헌(Walter et al., 2003)에서는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관 내 T 세포의 프라이밍을 묘사하고, 이는 역시 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적절한 방법일 수 있다. 본 발명에서, aAPC는 미리 생성된 MHC:펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면과 커플링을 시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 생화학을 이용함으로써 생성되었다. 이 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도를 제어할 수 있도록 허용하고, 이는 항원-특정 T 세포 반응을 혈액 샘플에서 높은 효율성으로 고- 또는 저-결합력을 선택적으로 유도해낼 수 있게 한다. MHC:펩티드 합성체를 제외하고, aAPC는 그들의 표면에 커플된 항-CD28 항원과 같은 동시-자극 활동을 가지고 다른 단백질을 운반해야 한다. 더욱이 이러한 aAPC-기반 체계는 종종 예를 들어, 인터루킨-12와 같은 시토카인 등 적당한 용해 요소의 첨가를 요구한다.
동종이계 세포는 T 세포의 준비에 역시 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에 더 자세하게 묘사되어 있으며, 여기에 참조 문헌으로 포함되어 있다. 예를 들어, 초파리 세포와 T2 세포에 추가적으로, CHO 세포, 배큘로바이러스-감염 곤충 세포, 박테리아, 효모, 백시니아-감염된 표적 세포 등과 같은 다른 세포들도 항원을 제시하는 데에 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스가 사용될 수도 있으며(예를 들어, 문헌(Porta et al., 1994)), 이는 외부 펩티드의 제시를 위한 카우피 모자이크바이러스의 높은 수확 체계로서 개발에 대해 묘사한다.
이 실험의 펩티드에 대해 활성화된 T 세포는 치료에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 더 나아간 양태는 앞서 말한 발명의 방법으로 획득할 수 있는 활성화된 T 세포에 대한 내용을 제공한다.
위에서 말한 방법으로 생성된 활성화된 T 세포는 서열번호 1 내지 서열번호 110의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.
바람직하게는, T 세포는 그의 TCR을 HLA/펩티드-합성체(예를 들어 결합)와 상호작용을 함으로서 이런 세포를 인식한다. 이 T 세포는 효율적인 활성화된 T 세포의 수가 투여되었을 시 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이는 데 유용하다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 묘사된 바와 같이 환자에게 유도되고 활성화된다(즉, 이는 자가 조직 T 세포다). 다른 방법으로는, T 세포는 환자에게 유도가 안 되고, 다른 개인에서 유도된다. 물론, 이 개인이 건강한 개인인 것이 바람직하다. 발명자들이 말하는 "건강한 개인"이라고 함은 개인이 전체적으로 좋은 건강을 가지고 있으며, 바람직하게는 충분한 면역 체계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는, 손쉽게 실험되고 감지될 수 있는 어떤 질병도 겪고 있지 않다는 것이다.
생체 내에서, 본 발명에 따른 CD4-양성 T 세포는 종양 세포(이들은 가끔 MHC 클래스 II를 발현하기도 한다)이거나 또는 종양을 감싸고 있는 간질성 세포(종양 세포)(이는 가끔 MHC 클래스 II를 또한 발현하기도 한다)이다(Dengjel et al., 2006).
본 발명의 T 세포는 활성적인 치료 구성의 성분으로 사용될 수도 있다. 따라서, 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자의 표적 세포를 죽이고 환자에게 위에 정의된 바처럼 효율적인 T 세포의 수를 투여하는 방법을 제공한다.
발명자는 "비정상적으로 발현되는"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 수준에 비교했을 때 과발현되거나 또는 유전자가 종양이 유도된 조직에서는 침묵적이지만(silent) 종양에서는 발현되는 것도 의미한다. 발명자는 "과발현"이라는 구절에 의해, 폴리펩티드가 정상 조직에서 존재하는 수준의 적어도 1.2배 이상으로 존재하는 것을 말하고, 바람직하게는 적어도 2배, 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다.
T 세포는 예를 들어 위에서 묘사된 바와 같은 방법으로 얻어질 수 있다.
흔히 T 세포의 입양 전송이라고 불리는 것에 대한 프로토콜은 이 업계에서 잘 알려져 있다. 리뷰는 다음에서 찾을 수 있다: 문헌(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
본 발명의 다른 양태에는 그 핵산이 클로닝되어 숙주 세포, 바람직하게는 T 세포로 도입되는 T 세포 수용체를 생성하기 위해 MHC와 복합체가 되는 펩티드의 사용이 포함된다. 이러한 조작된 T 세포는 따라서 암 치료를 위해 환자로 이전할 수 있다.
본 발명의 모든 분자, 즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 암호화하는 핵산은 면역 반응을 피할 수 있는 성질을 가진 세포에 의해 특징지어지는 질병의 치료에 유용하다. 따라서 본 발명에 포함되어 있는 어떤 분자든지 약제로 사용되거나 약제를 만드는 데에 사용될 수 있다. 이 분자는 단독으로 사용될 수도 있고, 어떤 알려진 분자와 함께 결합하여 사용될 수도 있다.
본 발명은 다음을 포함한 키트(kit)를 포함한다:
(a) 위에 묘사된 바와 같은 약학 조성물을 용액 또는 동결건조된 형태로 포함하고 있는 용기;
(b) 임의적으로, 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 둘째 용기; 및
(c) 임의적으로, (i) 용액의 사용 혹은 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 지시.
이 키트는 하나 이상의 (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (v) 주사기를 더욱 포함할 수 있다. 그 용기는 바람직하게 병, 바이알, 주사기 또는 시험관이며; 다용도 용기일 수 있다. 약학적 조성은 바람직하게는 동결건조된다.
본 발명에 사용되는 키트는 바람직하게는 동결건조되어 있는 약제를 적당한 용기와 이들의 재구성 및/또는 사용에 관한 설명서를 함께 포함한다. 적당한 용기는 예를 들어, 병, 바이알(예를 들어 듀얼 챔버 바이알), 주사기(듀얼 챔버 주사기 등) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재질로서 형성할 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 사용법을 표시하는 지시 내용을 그 용기 상에 또는 그와 연관하여 포함한다. 예를 들어, 라벨 상에서 동결건조된 제형을 상기 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 지시할 수 있다. 라벨은 또한 약제가 피하투여가 가능한지 아니면 유용한지를 보여줄 수도 있다.
제형을 포함한 용기는 재구성된 약제의 반복된 투여를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다(예를 들어 2 내지 6회의 투여). 키트는 또한 적당한 희석제(예를 들어 중탄산 용액)를 포함하는 두 번째의 용기를 포함할 수도 있다.
희석제와 동결건조된 약제를 섞었을 때, 재구성된 제형의 최종 펩티드 농도가 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(= 75 μg)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(= 1500 μg)를 넘지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 패키지 삽입 및 사용 설명서 등의 사용자의 입장에서 필요한 것을 더 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명에 따른 약학 조성물을 포함하는 하나의 용기를 다른 제품과 함께 또는 단독으로 포함하거나(예를 들어 다른 화합물들 또는 이 다른 화합물들의 약학 조성물) 각각의 조성물을 각자 다른 용기에 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 키트는 다음과 같은 두 번째의 화합물 또는 그들의 약학 조성물과 함께 투여될 수 있는 약학 조성물을 포함한다: 보조제(예를 들어 GM-CSF), 화학요법제, 자연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생 제제 또는 억제제, 괴사유도제 또는 킬레이터. 키트의 조성물은 미리 혼합되어 있을 수도 있고 또는 각각의 조성물이 각각 따로 용기에 담겨 있을 수도 있다. 키트의 조성물은 하나 또는 그 이상의 액체 용액에 제공될 수도 있고, 바람직하게는 수용액, 더욱 바람직하게는 무균 수용액에 제공된다. 키트의 조성물은 적당한 용해제를 첨가함으로써 액체로 바뀔 수 있는 고체로 제공될 수도 있고, 바람직하게는 이는 다른 용기에 담겨 제공된다.
치료 키트의 용기는 바이알, 실험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체나 액체를 담을 수 있는 다른 어떤 용기일 수 있다. 보통, 하나 이상의 구성물이 있을 경우, 키트는 두 번째의 물약병 또는 다른 용기를 포함하고, 이는 각각의 복용을 가능하게 한다. 키트는 약학적으로 허용가능한 액체를 포함하고 있는 용기를 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 현재 키트의 조성물인 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구를 포함한다(예를 들어 하나 또는 그 이상의 바늘, 주사기, 안약 투입제, 피펫 등).
본 제형은 구강(경구), 비강, 안약 형태의, 피하의, 피내, 근육내, 혈관내 또는 경피 등 어떠한 투여 형태로든 펩티드 투여에 적당한 약제이다. 바람직하게는, 그 투여는 s.c.이며, 가장 바람직하게 i.d. 투여는 주입 펌프에 의할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 폐암으로부터 단리되었으므로, 본 발명의 약제는 바람직하게는 폐암의 치료에 사용된다.
본 발명은 또한 사전선별된 TUMAP의 창고에서 선택된 적어도 하나의 펩티드로 이루어진 약학 조성물의 제조를 포함하는 개별 환자를 위한 개인화 약학 (조성물)의 생산 방법에 관한 것으로, 그 약학 조성물에 사용되는 상기 적어도 하나의 펩티드는 개별 환자의 적합성을 위해 선택된다. 한 구현에서 이 약학 조성물은 백신이다. 이 방법은 TCR 단리와 같은 하류 용도를 위한 T 세포 클론의 생산 혹은 용해성 항체 및 다른 치료 옵션에도 적응할 수 있다.
"개인화 약학"이란, 활성적으로 개인화된 암 백신 및 자가 환자 조직을 사용하는 적응적 세포 세포 요법을 포함하는 한 명의 개별 환자의 치료를 위해서만 사용되는 그러한 개별 환자를 위해 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미해야 한다.
여기에서 사용되는 용어 "창고"란 특정한 종양 유형에서 면역원성 및/또는 과다 제시에 대해 사전선별된 펩티드의 군 또는 조합을 지칭해야 한다. 용어 "창고"는 백신에 포함된 특정 펩티드가 사전 제조되어 물리적 시설에 보관되었음을 함축하는 의도가 아니다(하지만 그러한 가능성은 고려된다). 생산된 각 개인화된 백신을 위해 펩티드들이 새로 제조될 수 있거나 사전 제조되어 저장될 수 있음이 명백히 고려된다. 창고(예를 들어 데이터베이스의 형태로서)는 다양한 HLA-A HLA-B 및 HLA-C 대립형질을 갖는 폐암 환자들의 종양 조직에서 고도로 과발현된 종양 연관된 펩티드들로 구성된다. 이는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 펩티드 또는 연장된 MHC 클래스 I 펩티드를 포함할 수 있다. 창고는 몇몇 폐암 조직들로부터 수집된 종양 연관 펩티드 외에도, HLA-A*02 및 HLA-A*24 마커 펩티드를 포함할 수 있다. 이 펩티드들은 TUMAP에 의해 유도된 T 세포 면역성의 크기에 대한 정량적인 비교를 허용하므로 백신의 항종양 반응을 이끌어내는 용량에 관한 중요한 결론을 도출할 수 있다. 둘째, 어떤 환자에서 "자가" 항원으로 유래한 TUMAP에 대한 인체의 백신-유도 T 세포 반응이 관찰되지 않는 경우, 이것은 "비-자가" 항원으로부터 유래한 중요한 양성 대조 펩티드로서 기능한다. 및 셋째로, 이것은 환자의 면역능력 상태에 대한 결론의 도출을 가능케 한다.
창고의 TUMAP는 유전자 발현 분석, 질량 분석 및 T 세포 면역학(XPresident, 등록상표)이 조합된 통합 기능적 유전체 접근방식을 사용하여 동정된다. 이 접근 방식은 정상 조직에서 발현되지 않거나 최소한으로만 발현되는 것이 아닌 고비율의 종양에서 실제로 존재하는 TUMAP만을 추가 분석을 위해 선택한다는 것을 보증한다. 초기 펩티드 선택을 위해, 환자의 폐암 샘플 및 건강한 공여자의 샘플들을 단계적 접근 방식으로 분석했다:
1. 악성 물질의 HLA 리간드를 질량분석법으로 확인했다.
2. 전장 유전체 전령 리보핵산(mRNA)의 발현 분석을 사용하여, 정상 기관 및 조직과 비교하여 악성 조직폐암)에서 과발현되는 유전자를 확인했다.
3. 동정된 HLA 리간드들을 유전자 발현 데이터와 비교했다. 2 단계에서 감지된 종양 조직 상에 과다 제시되거나 선택적으로 제시된 바람직하게는 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자들에 의해 암호화된 펩티드들은 멀티-펩티드 백신의 적절한 TUMAP 후보로서 간주되었다.
4. TUMAP로서 동정된 펩티드의 관련성을 지지하는 추가 증거를 파악하기 위해 문헌 연구를 수행했다.
5. mRNA 수준에서의 과발현의 타당성은 3단계에서 종양 조직으로부터 선택된 TUMAP의 재검출 및 건강한 조직에 대한 검출의 결여(낮은 빈도)에 의해 확인했다.
6. 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도가 가능한지 여부를 평가하기 위해, 건강한 공여자는 물론 폐암 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역원성 검사를 수행했다.
한 측면에서는, 펩티드들이 창고에 포함되기 전에 면역원성에 대해 사전선별된다. 제한이 아니라 한 예로서, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포를 가진 건강한 공여자의 CD8+ T 세포를 반복적으로 자극하는 시험관 내 T 세포 초회감작을 포함하는 방법을 사용하여 창고에 포함된 펩티드의 면역원성을 결정한다.
이 방법은 희귀한 암과 드문 발현 프로필을 갖는 환자에 대해 선호된다. 현재 개발되고 있는 고정된 성분을 갖는 멀티-펩티드 칵테일과 대비할 때, 창고는 종양에서 항원의 실제 발현과 백신과의 훨씬 더 높은 정합을 허용한다. 선택된 하나의 또는 몇몇 "재고(off-the-shelf)" 펩티드들의 조합을 다중표적 접근 방식으로 각 환자에 대해 사용한다. 이론상으로, 예를 들어 50개 라이브러리로부터 선택된 5개의 다른 항원 펩티드 선택에 근거한 접근방법은 이미 약 1700만 가지의 가능한 약품(DP) 성분을 초래할 것이다.
한 양태에서, 이 펩티드는 여기서 또는 다음에 설명된 본 발명에 따른 방법에 근거하여 백신의 포함 여부가 선택된다.
HLA 표현형, 전사체학 및 펩티도믹스 데이터는 환자의 종양 물질과 혈액 샘플로부터 수집하여 "창고"와 환자 고유의(즉 돌연변이된) TUMAP를 포함하는 각 환자에 대해 가장 적절한 펩티드를 동정한다. 환자 종양에서 선택적으로 발현되거나 과발현되는 펩티드를 선택하게 되고, 이는 가능한 경우 환자의 개별 PBMC로써 시험했을 때 강한 시험관 내 면역원성을 나타낸다.
바람직하게는 백신에 포함된 펩티드는, (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양-연관 펩티드들(TUMAP)의 동정; (b) 상기 (a)에서 동정된 펩티드를 위에 설명된 펩티드들의 창고(데이터베이스)와 비교; 및 (c) 그 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 창고(데이터베이스)로부터 적어도 하나의 펩티드 선택을 포함하는 방법에 의해 동정된다. 예를 들어, 종양 샘플에 의해 제시된 TUMAP는 다음에 의해 동정된다: (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교; 및 (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계 결정. 바람직하게는 종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자의 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드의 서열결정에 의해 MHC 리간드의 서열을 파악한다. 바람직하게는 종양 샘플과 정상 조직은 같은 환자로부터 얻는다.
창고(데이터베이스) 모델을 사용하는 펩티드의 선택 외에 또는 그 대안으로서, TUMAP를 새 환자에서 동정한 다음 백신에 포함시킬 수 있다. 한 예로서, 후보 TUMAP 환자에서, (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질의 파악을 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플에서 얻은 발현 데이터와 비교하고; (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 파악하기 위해, 발현 데이터를 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과 상관관계의 결정에 의해 동정할 수 있다. 다른 예로서, 개별 환자의 조직에 상응하는 정상 샘플에 대해 종양 샘플에서 고유한 돌연변이를 포함하는 단백질을 동정할 수 있으며, 돌연변이를 특이적으로 표적하는 TUMAP를 동정할 수 있다. 예를 들어, 종양 및 상응하는 정상 조직의 유전체에 대한 염기서열은 전체 유전체의 염기서열 결정에 의해 결정할 수 있다. 유전자의 단백질-암호화 영역에서 비동의 돌연변이의 발견을 위해, 유전체 DNA 및 RNA를 종양 조직으로부터 추출하고, 정상의 돌연변이 되지 않은 유전체의 종자계 DNA는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 추출한다. 이러한 적용 NGS 접근방법은 단백질 암호화 영역의 염기서열 재결정으로 제약된다(신유전체 염기서열 재결정). 이 목적을 위해, 업체가 공급하는 표적 강화 키트를 사용한 다음 예를 들어 HiSeq2000(일루미나(Illumina))에 의해 염기서열 결정에 의해 인간 샘플의 엑손 DNA를 포착한다. 그 밖에, 유전자 발현의 직접 정량화 및 돌연변이된 유전자가 환자의 종양에서 발현된다는 검증을 위해 종양 mRNA에 대한 염기 서열을 결정한다. 그에 따른 수백만의 서열 판독값은 소프트웨어 알고리즘을 통해 처리된다. 그 출력 목록에는 돌연변이와 유전자 발현이 포함된다. 종양-특이적 체세포 돌연변이는 PBMC-유래 생식세포의 변종과 비교하여 결정한 다음 우선순위화 된다. 다음에는 새로 동정된 펩티드를 위에 설명한 창고의 면역원성에 대해 시험할 수 있으며, 적절한 면역원성을 소유하는 후보 TUMAP를 선택하여 백신에 포함시킨다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 위에 설명한 방법으로 동정한다; (b) 상응하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성과 과다 제시에 대해 사전선별된 펩티드들의 창고를 이용하여 (a)에서 동정된 펩티드와 비교한다; (c) 환자에서 동정된 종양 연관 펩티드와 상관관계가 있는 적어도 하나의 펩티드를 창고에서 선택한다; 및 (d) 임의적으로, (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
하나의 예시적 구현에서, 백신에 포함되는 펩티드는 다음에 의해 동정된다: (a) 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드들(TUMAP)을 위에 설명하는 방법으로 동정한다; 및 (b) 상기 (a)에서 새로 동정된 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 그 면역원성을 확인한다.
개인화된 펩티드 기반 백신을 위한 펩티드들이 선택되면, 백신이 생산된다. 백신은 20 내지 40% DMSO 바람직하게는 약 33% DMSO와 같은 약 30 내지 35% DMSO에 용해된 개별 펩티드들로 구성된 액체 제형이다.
제품에 포함되는 펩티드는 각각 DMSO에 용해한다. 단일 펩티드 용액의 농도는 제품에 포함시킬 펩티드의 수에 따라 선택해야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액들을 동등한 비율로 혼합하여 제품에 포함시킬 모든 펩티드가 포함된 용액을 만드는데 그 농도는 펩티드 당 약 2.5 mg/ml이다. 그런 다음, 주사제용으로 33% DMSO에서 펩티드 당 0.826 mg/ml의 농도를 얻기 위해 혼합된 용액을 1:3의 비율로 물로 희석한다. 희석시킨 용액을 0.22 ㎛ 멸균 필터를 통해 여과시킨다. 최종 벌크 용액을 얻는다.
최종 벌크 용액을 바이알에 채워 사용 시까지 -20℃에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578 mg씩 포함하는 700 ㎕의 용액이 들어 있다. 여기서 500 ㎕(펩티드 당 약 400 μg)를 피내 주사로 투여하게 된다.
암 치료에 유용함에 덧붙여, 본 발명의 펩티드는 진단으로도 유용하다. 펩티드가 폐암 세포에서 생성되고 이런 펩티드가 정상 조직에서는 존재하지 않거나 더 낮은 수준으로 존재한다는 것이 결정되었기 때문에, 이런 펩티드는 암의 존재의 진단에 사용될 수 있다.
주장되는 펩티드의 혈액 샘플 내 조직 생체 검사에서의 존재는 암의 진단 시 병리학자를 도울 수 있다. 항체, 질량 분석, 또는 이 분야에 다른 알려진 방법의 수단을 통한 특정 펩티드의 탐지는 조직 샘플이 악성 또는 염증이 있는지 또는 일반적으로 병들어 있는지 또는 폐암의 바이오마커로서 사용가능한지 병리학자에게 알려줄 수 있다. 펩티드의 그룹의 존재는 병변 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 한다.
병변 조직 샘플의 펩티드의 탐지는 특히 만약 T 림프구가 작용 기전에 참여하는 것으로 알려져 있거나 기대할 때, 면역계를 포함한 치료의 이익에 대한 결정을 내릴 수 있게 한다. MHC 발현의 손실은 감염된 악성 세포가 면역 감시를 탈출하는 과정에서 잘 설명되는 기전이다. 펩티드의 존재는 이 기전이 분석된 세포에서 악용되지 않는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자에 합성된 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하는데 사용될 수 있다. 이런 림프구 반응은 추가 치료 단계에서 결정을 내릴 때 전조 마커로 사용될 수 있다. 이런 반응은 또한 림프구 반응을 여러 방법으로, 예를 들어, 단백질 백신, 핵산, 자가 조직 물질, 림프구의 양자 면역 전송을 유도하는 것을 목표로 하는 면역치료의 접근 방식에서 대리 마커로 사용될 수 있다. 유전자 치료 설정에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려할 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 후속 시험을 위한 중요한 도구가 될 수도 있다(예를 들어, 이식편대숙주 및 숙주대이식편병의 감지).
이제 본 발명은 그 바람직한 구현을 설명하는 다음의 실시예에서 및 동반되는 도면을 참조하여 묘사될 것이나, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 여기에 인용된 모든 참조 문헌들은 그 전문이 포함된다.
도 1a 내지 1d는 정상 조직 및 NSCLC 샘플에서 다양한 펩티드의 과다 제시를 보여준다. 도 1e 및 1f는 모든 세포주, 정상 조직 및 암 조직들을 보이며 여기서 예시적 펩티드들(FVFSFPVSV, 서열번호: 4 (A*02) 및 YYTKGFALLNF, 서열번호: 29 (A*24))이 검출된 바 있다. 도 1a - 유전자: SLC6A14, 펩티드: FLIPYAIML (A*02; 서열번호: 2) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 1개 지방 조직, 3개 부신, 5개 동맥, 3개 골수, 8개 뇌, 3개 유방, 13개 결장, 1개 십이지장, 7개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 4개 백혈구 샘플, 21개 간, 1개 림프절, 1개 난소, 7개 췌장, 2개 말초 신경, 1개 복막, 1개 뇌하수체, 1개 태반, 3개 흉막, 6개 직장, 2개 침샘, 3개 골격근, 3개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 3개 위, 3개 고환, 2개 흉선, 3개 갑상선, 1개 요관, 2개 정맥, 46개 폐, 91개 NSCLC. 펩티드는 췌장암, 위암, 결장직장암, 식도암에서도 발견되었다(도면에는 없음). 도 1b - 유전자: COL6A3, 펩티드: FLFDGSANL (A*02; 서역 식별 번호: 13) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 1개 지방 조직, 3개 부신, 5개 동맥, 3개 골수, 8개 뇌, 3개 유방, 13개 결장, 1개 십이지장, 7개 식도, 2개 담낭, 5개 심장, 16개 신장, 4개 백혈구 샘플, 21개 간, 1개 림프절, 1개 난소, 7개 췌장, 2개 말초 신경, 1개 복막, 1개 뇌하수체, 1개 태반, 3개 흉막, 6개 직장, 2개 침샘, 3개 골격근, 3개 피부, 2개 소장, 4개 비장, 3개 위, 3개 고환, 2개 흉선, 3개 갑상선, 1개 요관, 2개 정맥, 46개 폐, 91개 NSCLC. 이 펩티드는 전립선암, 유방암, 결장직장암, 간암, 흑색종, 난소암, 식도암, 췌장암, 위암에서도 발견되었다(도면에는 없음). 도 1c - 유전자: CCL18, 펩티드: VYTSWQIPQKF(A*24; 서열번호: 23) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 2개 부신, 1개 동맥, 4개 뇌, 1개 유방, 5개 결장, 1개 심장, 13개 신장, 9개 폐, 3개 췌장, 2개 직장, 3개 피부, 1개 비장, 12개 위, 1개 흉선, 2개 자궁 및 9개 폐, 80개 NSCLC. 이 펩티드는 전립선암, 위암에서도 발견되었다(도면에는 없음). 도 1d - 유전자: CENPN, 펩티드: RYLDSLKAIVF(A*24; 서열번호: 28) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 2개 부신, 1개 동맥, 4개 뇌, 1개 유방, 5개 결장, 1개 심장, 13개 신장, 9개 폐, 3개 췌장, 1개 뇌하수체, 2개 직장, 3개 피부, 1개 비장, 12개 위, 1개 흉선, 2개 자궁 및 9개 폐, 80개 NSCLC. 이 펩티드는 간암, 위암, RCC에서도 발견되었다(도면에는 없음). 도 1e - 유전자: DUSP4, 펩티드: FVFSFPVSV(A*02; 서열번호: 4) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 5개 췌장 세포주; 3개 피부, 15개 정상 조직(2개 식도, 7개 폐, 3개 비장, 3개 위), 126개 암 조직(1개 뇌암, 2개 유방암, 5개 결장암, 5개 식도암, 2개 담낭암, 8개 신장암, 5개 간암, 58개 폐암, 11개 난소암, 9개 췌장암, 2개 전립선암, 1개 직장암, 4개 피부암, 12개 위암, 1개 고환암). 정상 조직의 조합은 도 1a 및 1b와 동일하고 검출 없는 조직들은 도면에 나와 있지 않다. 도 1f - 유전자: PLOD2, 펩티드: YYTKGFALLNF(A*24; 서열번호: 29) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 30개 암 조직(1개 뇌암, 3개 신장암, 2개 간암, 22개 폐암, 2개 위암). 정상 조직의 조합은 도 1c 및 1d와 동일하고 검출되지 않은 조직들은 도면에 나와 있지 않다. 도 1g는 정상 조직 및 NSCLC 샘플에서 A*24 펩티드의 과다 제시를 보여준다. 유전자: LAMP3, 펩티드: RFMDGHITF(A*24; 서열번호: 25) - 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 2개 부신, 1개 동맥, 4개 뇌, 1개 유방, 5개 결장, 1개 심장, 13개 신장, 9개 간, 3개 췌장, 1개 뇌하수체, 2개 직장, 3개 피부, 1개 비장, 12개 위, 1개 흉선, 2개 자궁 및 9개 폐, 80개 NSCLC. 이 펩티드는 전립선암, 위암에서도 발견되었다(도면에는 없음).
도 2는 정상 조직 및 38개 폐암 샘플들의 패널에서 폐암에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현된 본 발명의 근원 유전자들의 예시적 발현 프로파일(정상 신장에 비한 상대적 발현)을 보여준다. 왼쪽부터 오른쪽까지의 조직들: 부신, 동맥, 골수, 뇌(전체), 유방, 결장, 식도, 심장, 신장, 백혈구 샘플, 간, 폐, 림프절, 난소, 췌장, 태반, 전립선, 침샘, 골격근, 피부, 소장, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 방광, 자궁 경부, 자궁, 정맥, 1개 정상(건강한) 폐 샘플, 38개 NSCLC 샘플. a) SMC4, b) LAMB3; c) MMP12 및 d) LAMP3.
도 3은 펩티드-특이적 다합체 염색 이후 예시적 면역원성 데이터: 유세포 측정 결과를 보여준다. a) SLC1A4-001(서열번호 12), b) IGF2BP3-001(서열번호 120), c) LAMC2-001(서열번호 121), d) COL6A3-008(서열번호 13) 및 e) LAMP3-001(서열번호 25).
도 4는 항원 자극된 CD4+ T 세포 증식의 결과를 보여준다: 숫자는 각 펩티드의 양성 공여자의 수를 보여준다.
도 5는 클래스 II ICS 측정에서 CEA-006에 대한 예시적 백신-유도 CD4 T 세포의 반응을 보여준다. 생체 내 감작 이후 환자 36-031의 PBMC를, CEA-006(위 패널) 및 모형(아래 패널)에 대한 CD4 T 세포 반응을 시점 풀 V8/EOS에서 분석했다. 세포를 상응하는 펩티드로 자극한 다음 생존율, 항-CD3, 항-CD8, 항-CD4 및 작용기 표지자(왼쪽에서 오른쪽으로: CD154, TNF-알파, IFN-감마, IL-2, IL-10)로 각각 염색했다. 하나 이상의 작용기 분자에 대해 양성인 세포의 비율을 생존하는 CD4 T 세포 에 대해 분석했다.
도 6은 대조용 클래스 II 펩티드의 면역원성을 보여준다: 이 도면은 16명의 IMA950 펩티드 환자 및 71명의 IMA910 펩티드 환자에게 ICS를 사용하여 검출된 5가지 클래스 II 펩티드에 대한 면역 반응률을 보여준다.
실시예
실시예 1
세포 표면에 제시한 종양 연관 펩티드의 동정 및 정량화
조직 샘플
환자의 종양 조직은 다음을 통해 제공되었다: 하이델베르크 대학 병원(University Hospital of Heidelberg). 정상 (건강한) 조직은 다음을 통해 제공되었다: 바이오-옵션스 인코포레이티드(Bio-Options Inc., 미국 캘리포니아주 소재); 바이오서브(BioServe, 미국 메릴랜드 주 벨트스빌 소재); 캐피탈 바이오사이언스 인코포레이티드(Capital BioScience Inc., 미국 메릴랜드 주 록빌 소재); 제네티시스트 인코포레이티드(Geneticist Inc., 미국 캘리포니아주 글렌데일 소재); 제네바 대학 병원(University Hospital of Geneva); 하이델베르크 대학 병원; 교토 전문 대학 의학부(KPUM); 오사카 시립 대학(OCU); 뮌헨 대학 병원(University Hospital Munich); 프로테오제넥스 인코포레이티드(ProteoGenex Inc., 미국 캘리포니아주 컬버시티 소재); 튀빙겐 대학 병원(University Hospital of Tubingen). 모든 환자의 고지에 의한 동의서가 수술 전 또는 부검 전에 제출되었다. 조직은 절제 직후 충격 동결되었으며 TUMAP의 단리까지 -70℃ 이하에서 보관되었다.
조직 샘플에서 HLA 펩티드의 단리
약간 변형된 프로토콜에 따라, 충격 동결된 조직 샘플의 HLA 펩티드 풀은 고형 조직의 면역 침전에 의해 HLA-A*02-특이 항체 BB7.2 또는 HLA-A, -B, -C-특이적 항체 W6/32, CNBr-활성화 세파로오스, 산성 처리와 한외 여과를 이용해 획득되었다(Falk, et al 1991; Seeger, et al. T 1999).
질량 분광분석법의 분석
얻어진 HLA 펩티드 풀은 그들의 소수성에 의해 역상 크로마토그래피를 이용하여 단리되었고(나노악퀴티 UPLC 시스템(nanoAcquity UPLC system), 워터스(Waters)) 용출된 펩티드는 ESI 공급원를 갖춘 LTQ-velos 및 융합 하이브리드 질량분광분석기(써모일렉트론(ThermoElectron))에 의해 분석되었다. 펩티드 풀은 분당 400 nL의 유량을 적용하여 1.7 μm C18 역상 물질(워터스)로 충전된 용융-실리카 마이크로모세관 컬럼(75 μm i.d. x 250 mm)에 바로 로딩된다. 이어서, 펩티드는 두-단계 180분-10% 내지 33%의 2개 용매 구배를 이용하여 단리되고, 여기서 유량은 분당 300 nL이다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 구배는 용매 A(물의 0.1% 포름산)와 용매 B(아세토니트릴의 0.1% 포름산)로 이루어져 있다. 금이 입혀진 유리 모세관(피코팁(PicoTip), 뉴 옵젝티브(New Objective))이 미세-ESI 공급원로의 도입에 사용되었다. LTQ-오비트랩(Orbitrap) 분광분석기가 TOP5 전략을 이용한 데이터-의존 모드에서 작동되었다. 간략하게, 스캔 사이클은 오비트랩의 높은 질량 정확도(R = 30,000)의 전스캔으로 시작되고, 이후 5개의 가장 많은 이전에 선택한 이온의 동적 배제에 의한 전조 이온에 대한 오비트랩(R = 7500)의 MS/MS 스캔이 이어졌다. 탠덤 질량 스펙트럼은 SEQUEST와 추가적인 수동 컨트롤에 의해 해석된다. 동정된 펩티드 서열은 생성된 자연 펩티드 분절 패턴과 합성을 서열-일치 참고 펩티드와의 비교를 통해 보증되었다.
비표지 상대적 LC-MS 정량화는 이온 계측, 즉, LC-MS 특징의 추출 및 분석에 의해 수행했다(Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 샘플 내의 풍부함과 상관관계가 있음을 가정한다. 추출된 특징은 전하 상태 디컨블루션 및 정체 시간 정렬에 의해 더욱 처리되었다(Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). 마지막으로 모든 LC-MS 특징은 서열 확인 결과와 상호 참조하여 다른 샘플과 조직의 정량 데이터를 펩티드 제시 프로필에 합쳤다. 이 정량 데이터를 중심 경향성에 따라 2단 형태로 정상화함으로써 기술적인 생물학적 복제 내에서의 변동을 고려했다. 따라서 동정된 펩티드는 하나씩 정량 데이터와 연관시키며 샘플과 조직 사이의 상대적 정량화를 허용할 수 있다. 그 밖에 펩티드 후보로부터 얻어진 모든 정량 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보증하고 자동화 분석의 정확성을 확인했다. 펩티드마다 평균 샘플 제시는 물론 복사 변이를 보여주는 제시 프로필을 계산했다. 이 프로필은 폐암 샘플을 정상 조직 샘플의 기준선에 병치한다.
과다 제시된 예시적인 펩티드의 제시 프로필이 도 1에 나와 있다. 예시적 펩티드의 제시 점수가 표 15 및 표 16에 나와 있다.
[표 15]
제시 점수. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다 제시된(+++), 정상(건강한) 조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다 제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다 제시된(+) HLA-A*02 펩티드를 나열한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
[표 16]
제시 점수. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다 제시된(+++), 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다 제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다 제시된(+) HLA-A*24 펩티드를 나열한다.
Figure pct00025
Figure pct00026
실시예 2
본 발명의 펩티드를 암호화하는 유전자의 발현 프로필
정상 세포와 비교한 종양 세포 상의 펩티드의 과다 제시 또는 특이적 제시는 면역 요법에서의 그 유용성에 충분하고 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 그 공급원 단백질에도 불구하고 종양-특이적이다. 여전히 mRNA 발현 프로필의 결정은 면역 요법을 위한 펩티드 표적의 선택에서 추가적 안정성 수준을 추가한다. 특히 친화성-성숙된 TCR과 같은 안정성 위험이 높은 치료적 옵션의 경우에는, 이상적 표적 펩티드는 종양에 고유하고 정상 조직에서는 없는 단백질로부터 유래될 것이다.
RNA 공급원 및 준비
외과적으로 제거된 조직 샘플은 위에서 지적한 바와 같이 각 환자로부터 서면 동의서를 받은 후 제공되었다(실시예 1 참조). 종양 조직 샘플은 수술 직후 스냅-냉동되었고 절구와 유봉을 이용하여 액체 질소 환경 아래에서 균질화되었다. 총 RNA는 트리졸(TRIzol)(인비트로젠(Invitrogen), 독일 칼스루에 소재)을 이용하여 샘플로부터 준비되었고 이는 RNeasy(퀴아젠(QIAGEN), 독일 힐덴 소재)에 의해 청소되었다; 이 두 개의 모든 방법은 제조업체의 설명서에 따라 실행되었다.
건강한 인간 조직의 총 RNA는 상업적으로 얻어졌다(암비온(Ambion), 영국 헌팅톤 소재; 클론테크(Clontech), 독일 하이델베르크 소재; 스트라타젠(Stratagene), 네덜란드 암스테르담 소재; 바이오체인(BioChain), 미국 캘리포니아주 헤이와드 소재). 여러 개인에서 얻어진 RNA(2에서 123명의 개인)는 각각의 개인에게 균등 가중치를 두어 섞어졌다. RNA 샘플의 양과 질은 아질런트(Agilent) 2100 생물분석기(아질런트, 독일 발트브론 소재)에 의해 RNA 6000 피코 랩칩 키트(아질런트)를 사용하여 분석되었다.
마이크로어레이 실험
모든 암과 정상 조직 RNA 샘플의 유전자 발현 분석은 어피메트릭스 휴먼 게놈(어피메트릭스 Human Genome)(HG) U133A 또는 HG-U133 플러스 2.0 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이(어피메트릭스(어피메트릭스), 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)에 의해 실행되었다. 모든 단계는 어피메트릭스의 사용설명서에 따라 실행되었다. 간단히, 이중가닥 cDNA는 슈퍼스크립트(SuperScript) RTII(인비트로젠)와 올리고-dT-T7 프라이머(엠더블유 바이오테크(MWG Biotech), 독일 에베르스베르크 소재)를 사용하여 사용설명서에 따라 총 RNA 5 내지 8 μg으로부터 합성되었다. 시험관 내 전사는 U133A 어레이를 위한 바이오어레이 고수율 RNA 트랜스크립트 라벨링 키트(엔조 디아그노스틱스 인코포레이티드(ENZO Diagnostics, Inc.), 미국 뉴욕주 파밍데일 소재) 또는 U133 플러스 2.0 어레이를 위한 유전자칩 IVT 라벨링 키트(어피메트릭스)를 사용하여 실행되었다. 이는 cRNA 단편화, 교배 및 스트렙트아비딘-피코에리트리틴 및 비오티닐화된 항-스트렙트아비딘 항체로의 염색으로 이어졌다(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 네덜란드 레이덴 소재). 이미지는 아질런트 2500A 유전자어레이 스캐너(U133A) 또는 어피메트릭스 유전자-칩 스캐너 3000(U133 플러스 2.0)를 이용 하여 스캔되었고, 데이터는 기본 세팅을 이용하여 GCOS 소프트웨어(어피메트릭스)를 통해 분석되었다. 정상화를 위해, 어피메트릭스에 의해 제공된 100개의 하우스키핑 유전자(housekeeping)가 사용되었다. 상대적인 발현 값은 시그널 로그 비율을 통해 계산되었고 정상 샘플의 값은 임의로 1.0으로 정해졌다. 본 발명의 폐암에서 고도로 과발현되는 또는 배타적으로 발현되는 근원 유전자의 예시적 발현 프로필이 제2도에 나와 있다. 추가의 예시적 유전자에 대한 발현 점수는 표 17 및 표 18에 나열된다.
[표 17]
발현 점수. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다 제시된(+++), 정상조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다 제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다 제시된(+) HLA-A*02 펩티드를 나열한다.
Figure pct00027
[표 18]
발현 점수. 이 표는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 매우 고도로 과다 제시된(+++), 정상조직의 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과다 제시된(++) 또는 정상 조직의 패널과 비교하여 종양에서 과다 제시된(+) HLA-A*24 펩티드를 나열한다.
Figure pct00028
실시예 3
MHC 클래스 I 제시 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명의 TUMAP의 면역원성에 대한 정보를 얻기 위해, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 갖는 CD8+ T 세포의 반복된 자극을 근거로 시험관 내 초회감작 검사를 사용하여 조사를 수행했다. 이 방법으로 본 발명자들은 지금까지 84개의 HLA-A*02제한된 본 발명의 TUMAP의 면역원성을 보여줄 수 있었으며, 이것은 이 펩티드들이 인간에 존재하는 CD8+ 전구 T 세포에 대한 T 세포 에피톱이라는 것을 보여주었다(표 19).
CD8+ T 세포의 시험관 내 초회감작
펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 로딩된 인공 항원 제시 세포에 의한 시험관 내 자극을 수행하기 위해, 독일 소재의 만하임 의과 대학(University clinics Mannheim)에서 동의서를 받은 건강한 공여자로부터의 CD8 마이크로비드(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotec), 독일 베르기슈-글라드바흐 소재)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구 성분 채집 산물로부터 CD8+ T 세포를 먼저 단리했다. PBMC 및 단리된 CD8+ 림프구는 10% 열 비활성화된 인간 AB 혈청(판-바이오테크(PAN-Biotech), 독일 아이덴바흐 소재), 100 U/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신(캅브렉스(Cambrex), 독일 콜롱 소재), 1 mM 피루브산 나트륨(씨씨 프로(CC Pro), 독일 오베르돌라 소재), 20 ㎍/ml 젠타마이신(캅브렉스)으로 보충된 RPMI-글루타맥스(인비트로젠, 독일 칼스루에 소재)로 구성된 T 세포 배지(TCM)에서 사용할 때까지 배양했다. 이 단계에서 2.5 ng/ml IL-7(프로모셀(PromoCell), 독일 하이델베르크 소재) 및 10 U/ml IL-2(노바티스 파르마(Novartis Pharma), 독일 뉘른베르크 소재) 또한 TCM에 추가했다. pMHC/항-CD28 코팅된 비드의 생성, T 세포 자극 및 판독은 고도로 정의된 시험관 내 체계에서 수행했으며, 자극 조건 당 4가지 다른 pMHC 분자 및 판독 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 각각 사용했다.
정제된 공동-자극 쥐 IgG2a 항인체 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조사가 권장하는 술폰-N-하이드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오틴닐화 했다(페르바이오(Perbio), 독일 본 소재). 사용된 비드는 스트렙티비딘으로 코팅된 직경 5.6 ㎛의 폴리스티렌 입자였다(방스 래보래토리즈(Bangs Laboratories), 미국 일리노이즈 소재).
양성 및 음성 대조 자극에 사용된 pMHC는 각각 A*0201/MLA-001(변형된 멜란-A/MART-1에서 얻은 펩티드 ELAGIGILTV(서열번호 163) 및 A*0201/DDX5-001(DDX5에서 얻은 YLLPAIVHI, 서열번호 164)였다.
800.000 비드/200 ㎕는 4 x 12.5 ng 비오틴-pMHC 존재 하에 96-웰 플레이트에서 코팅하고 세척한 다음 600 ng 비오틴 항-CD28를 첨가하여 200 ㎕의 부피로 만들었다. 1x106 CD8+ T 세포와 2x105의 세척하고 코팅한 비드를 5 ng/ml IL-12 (프로모셀)로 보충한 200 ㎕ TCM에서 및 37℃ 에서 3일 동안 배양함으로써 96-웰 플레이트에서의 자극을 개시했다. 배지의 반은 80 U/ml IL-2로 보충된 새로운 TCM에 의해 교환되고 배양은 37℃에서 4 일간 계속되었다. 이 자극 주기는 총 세 번 수행되었다. 조건 당 8가지 다른 pMHC 분자를 사용하여 pMHC 멀티머의 판독을 위해, 이미 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 2차원 조합대수적 코팅 접근 방식을 사용했으며, 5가지 다른 형광색소와의 결합을 허용하는 약간의 변형이 있었다. 마지막으로 멀티머 분석은 살아있는/죽은 세포를 근적외선(near IR) 염료(인비트로젠, 독일 칼스루에 소재), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, 독일 하이델베르크 소재) 및 형광 pMHC 멀티머로써 세포를 염색하여 수행했다. 분석에는 적절한 레이저 및 필터가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용했다. 펩티드 특이 세포는 총 CD8+ T 세포의 백분율로 계산되었다. 멀티머 분석의 평가는 FCS Express 소프트웨어(드 노보 소프트웨어)를 사용하여 수행되었다. 특정 멀티머+ CD8+ 림프구의 시험관 내 프라이밍은 음성 대조군 자극과 비교함으로써 검출했다. 주어진 항원의 면역성은 건강한 기증자의 최소한 하나의 시험관 내 자극된 평가 가능한 웰에 시험관 내 자극 후 CD8+ T 세포주가 포함되는 것으로 확인될 때 나타났다(즉, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 최소한 1%의 특정 다합체+를 가졌으며 특정 다합체+ 세포의 백분율은 음성 대조군 자극의 중간값보다 10배 이상이었다).
폐암 펩티드의 시험관 내 면역원성
실험된 HLA 클래스 I 펩티드에서, 시험관 내 면역원성은 펩티드 특정 T 세포주의 형성에 의해 입증될 수 있었다. 본 발명의 3개의 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 다합체 염색 이후 예시적 유세포 측정 결과 및 상응하는 음성 대조군이 도 3에 나와 있다. 본 발명의 84개의 펩티드에 대한 결과는 표 19에 요약되어 있다.
[표 19]
본 발명의 HLA-A*02 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명에서 실행한 펩티드에 대한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과. 20% 미만 = +; 21% 내지 49% = ++; 50% 내지 69% = +++; 70% 이상 = ++++
Figure pct00029
Figure pct00030
[표 20]
본 발명의 HLA-A*24 펩티드의 시험관 내 면역원성
본 발명에서 실행한 펩티드에 대한 시험관 내 면역원성 실험의 예시적 결과. 20% 미만 = +; 21% 내지 49% = ++; 50% 내지 69% = +++; 70% 이상 = ++++
Figure pct00031
Figure pct00032
실시예 4
펩티드의 합성
모든 펩티드는 Fmoc-전략을 사용하여 표준 및 잘 확립된 고체상 펩티드 합성으로써 합성되었다. 각 개별 펩티드의 정체와 순도로 질량 분석법과 분석 RP-HPLC에 의해 결정했다. 펩티드는 백색 내지 황백색 동결건조 배양물(삼불화아세트산 염) 및 >85%의 순도로서 얻어졌다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 삼불화아세트산 염 혹은 아세트산 염으로 투여되지만, 약학적으로 허용가능한 다른 염의 형태 또한 가능하다.
실시예 5
MHC 결합 검정
본 발명에 따른 T 세포 기반 요법의 후보 펩티드를 그 MHC 결합 능력(친화성)에 대해 추가로 시험했다. 개별 펩티드-MHC 복합체는 UV-리간드 교환에 의해 만들었으며, UV에 민감한 펩티드가 UV 조사 후 분할된 다음 분석된 관심 대상의 펩티드로 교환되었다. 펩티드 수용성 MHC 분자를 효과적으로 결합하고 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 막는다. 이 교환작용의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경쇄(β2m) 검출에 근거하여 ELISA를 수행했다. 이 검정은 문헌(Rodenko et al., 2006)에서 일반적으로 설명된 대로 수행했다.
96 웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 PBS에서 2 ug/ml 스트렙타비딘으로 밤새 코팅하고 4회 세척한 다음 블로킹 완충제를 함유하는 2% BSA에서 37℃ 및 30분 동안 블로킹을 진행했다. 되접기된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체가 표준의 역할을 했으며, 그 범위는 15 내지 500 ng/ml였다. UV-교환 반응을 위한 펩티드-MHC 단량체는 블로킹 완충액으로 100배 희석되었다. 샘플은 37℃에서 1시간 배양 후 4회 세척하고 2 ug/ml HRP 접합된 항-β2m으로 37℃에서 1시간 배양한 다음 NH2SO4로 정지시킨 TMB 용액으로 검출했다. 흡광은 450 nm에서 측정했다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 초과, 가장 바람직하게는 75% 초과)을 보이는 후보 펩티드가 일반적으로 항체나 그 단편 및/또는 T 세포 수용체나 그 단편의 생성 및 생성을 위해 선호되는데, 이는 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 보이며 MHC 복합체의 해리를 막기 때문이다.
[표 21]
MHC 클래스 I 결합 점수
20% 미만 = +; 20% 내지 49% = ++; 50% 내지 75% = +++; 75% 초과 = ++++
Figure pct00033
실시예 6
세포 표면에 제시된 종양 연관 펩티드의 절대 정량화
항체 및/또는 TCR과 같은 결합제의 생성은 시간이 많이 걸리는 과정이며, 일부의 선택된 표적에 대해서만 수행할 수 있다. 종양-연관 및 종양-특이적 펩티드의 경우, 선택 기준은 제시의 배타성 및 세포 표면 상에 제시된 펩티드의 밀도를 포함하지만 이로써 제한되지는 않는다. 실시예 1에서 설명되는 펩티드의 단리 및 상대적 정량화 외에도, 본 발명자는 설명된 바와 같이 세포 당 절대 펩티드 복제 수를 분석했다. 고형 종양 샘플에서 세포당 TUMAP 복제 수의 정량화는 단리된 TUMAP의 절대 정량화, TUMAP 단리의 효율 및 분석된 조직 샘플의 세포 수를 요구한다. 실험 단계는 다음에 설명된다.
나노 LC - MS / MS 에 의한 펩티드 정량
질량 분석법에 의한 펩티드의 정확한 정량화를 위해, 내부 표준법을 사용하여 각 펩티드의 검정 곡선을 생성했다. 내부 표준이란 각 펩티드의 2중-동위원소-표지 변이체이며, 즉 동위원소-표지 아미노산 2개를 TUMAP 합성에 포함시켰다. 이는 질량에서만 종양-연관 펩티드와 다를 뿐 다른 물리화학적 성질은 차이를 보이지 않는다(Anderson et al., 2012). 각 MS 샘플에 대해 내부 표준을 스파이킹하고, 모든 MS 신호는 내부 표준의 MS 신호에 대해 정규화하여 MS 실험 간 가능한 기술적 편차를 없앴다.
검정 곡선은 적어도 3가지 다른 매트릭스에서 작성했다. 즉, HLA 펩티드는 일상적 MS 샘플과 유사한 자연 샘플로부터 용출되고 각 제제는 이중 MS 실행을 통해 측정했다. 평가에서는, MS 신호를 내부 표준의 신호에 대해 정규화하고 검정 곡선은 로지스틱 회귀에 의해 계산했다.
조직 샘플에서 얻는 종양 연관 펩티드의 정량화에서는, 각 샘플을 내부 표준으로 스파이킹하고; MS 신호는 내부 표준에 대해 정규화한 다음 펩티드 검정 곡선을 사용하여 정량화했다.
펩티드/ MHC 단리의 효율
모든 단백질 정제 공정과 마찬가지로, 조직 샘플로부터의 단백질 단리는 관심 대상의 단백질에 대한 일정 손실과 연관된다. TUMAP 단리의 효율 결정을 위해, 절대 정량을 위해 선택된 모든 TUMAP에 대한 펩티드/MHC 복합체를 생성했다. 자연 펩티드/MHC 복합체로부터 스파이킹된 것을 구별할 수 있기 위해, TUMAP의 단일-동위원소-표지 버전을 사용했다. 즉, 하나의 동위원소-표지 아미노산을 TUMAP 합성에 포함시켰다. 이 복합체들을 신선하게 준비된 조직 용해물에 즉, TUMAP 단리 절차에서 가능한 가장 이른 시점에 스파이킹 한 다음 추후 친화성 정제에서 자연 펩티드/MHC 복합체와 같이 포획했다. 따라서 단일-표지 TUMAP의 회수 측정은 개별 자연 TUMAP의 단리 효율에 대한 결론을 허용한다.
단리의 효율은 적은 수의 샘플에서 분석했으며 이러한 조직 샘플들 사이에 유사했다. 이와 반대로 개별 펩티드 간의 단리 효율은 차이가 있다. 이것은 단리 효율은 그것이 제한된 수의 조직 샘플만을 통해 결정되는 것이라도 다른 조직의 제제로 외삽할 수 있음을 시사한다. 하지만 각 TUMAP는 개별적으로 분석하는 것이 필요한데 이는 단리 효율을 한 펩티드에서 다른 것으로 외삽할 수 없기 때문이다.
고체 동결 조직에서의 세포 수 결정
본 발명자는 절대 펩티드 정량화를 거친 조직 샘플의 세포 수 결정을 위해, DNA 함량 분석을 적용했다. 이 방법은 광범위한 다른 출처의 샘플들 및 가장 중요하게는 동결 샘플에 적용된다(Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). 펩티드 단리 프로토콜 동안, 조직 샘플을 동질의 용해물로 처리하고 이로부터 소량의 용해물을 일정 부분을 취한다. 이 일정 부분을 세 부분으로 나누며, 이로부터 DNA가 단리된다(퀴아Amp DNA 미니 키트, 퀴아젠, 독일 힐덴 소재). 각 DNA 단리물로부터 총 DNA 함량을 형광-기반 DNA 정량화 검정(쿠비 dsDNA HS 어세이 키트, 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 독일 다름슈타트 소재)을 사용하여 정량화하는데 이때 최소 2회 반복 측정한다. 세포 수의 계산을 위해, 1개의 건강한 혈액 샘플의 일정 부분들로부터 얻어진 DNA 표준 곡선(정의된 세포 수 범위 포함)을 생성한다. 이 표준 곡선을 사용하여, 각 DNA 단리물로부터 얻은 총 DNA 함량에서 총 세포 수를 계산한다. 펩티드 단리에 사용된 조직 샘플의 평균 총 세포 수를 외삽하고, 이때 용해 분별액의 알려진 용적과 총 용해물 용적을 고려한다.
세포 당 펩티드 복제 수
본 발명자는 상기 언급된 실험에서 얻는 데이터를 통해, 샘플의 펩티드 총량을 해당 샘플의 총 세포 수로 나눈 다음 다시 단리 효율에 따른 나누기를 하여 세포당 TUMAP 복제 수를 계산했다. 선택된 펩티드의 복제 수는 표 22에 나와 있다.
[표 22]
절대 복제 수. 이 표는 NSCLC 종양 샘플에 대한 절대 펩티드 정량화 결과를 나열하고 있다. 각 펩티드에 대한 세포당 복제 수 중간값이 표시되어 있다: 100 미만 = +; 100 이상 = ++; 1,000 이상 +++; 10,000 이상 = ++++. 평가 가능한 고품질 MS 데이터를 사용할 수 있는 샘플 수가 표시되어 있다.
Figure pct00034
실시예 7
HLA 클래스 II T 세포 증식 측정
실험들은 선택된 MHC 클래스 II TUMAP의 T 세포 증식 측정에 따른 결과를 다음과 같이 요약한다. 시험한 펩티드 항원 10개 가운데 9개가 면역원성에 대해 양성이다. 평가가능한 21개 T 세포 샘플 가운데 11개가 적어도 하나의 펩티드에 대해 양성 반응을 보였다. 개별 펩티드 항원은 최대 6명의 공여자에서 CD4+ T 세포 증식을 자극시켰다. 이 숫자들은 동일한 측정 실행에서 시험한 5개 참조 펩티드의 결과와 유사하고 백신 임상 시험 환경에서 대다수의 환자에 대해 면역원성을 잘 보여주었다. 따라서 새로 시험한 펩티드 또한 백신 시험에서 T 세포 반응을 유도할 가능성이 높다고 결론을 내릴 수 있다.
선택된 펩티드에 대한 특히 백신 후보로서의 가능성을 특징짓기 위해, 프로이뮨(ProImmune) 회사의 상업용 T 세포 증식 측정법을 사용하여 T 세포 증식의 분석에 의해 그 시험관 내 면역원성을 결정했다.
건강한 공여자의 CD8-소실된 혈액 세포 샘플을 선택한 펩티드로써 검사했다. CD4+ 세포의 증식을 유도하는 펩티드는 보조 T 세포 의 면역 반응의 개발을 초래할 수 있으며 따라서 면역원성으로 간주된다. CD4+ T 세포의 증식을 카르복시플루오레세인 석시니미딜 에스테르(CFSE) 표지를 사용하여 결정했다. 증식하는 세포에서 CFSE는 분열하는 세포에 대해 균등하게 분배된다. 다음 증식은 분석하는 세포에서 CFSE 형광의 감소로서 측정할 수 있다.
[표 23]
선택된 HLA 클래스 II 펩티드
Figure pct00035
시험의 원리
건강한 증여자로부터의 말초 혈액 단세포(PBMC) 샘플을 HLA-DRB1 대립형질에 근거하여 프로이뮨 세포 은행을 통해 선택했다. CD8+ T 세포는 사용 전에 공여자 혈액 샘플로부터 제거하여 거짓 양성 반응을 피했다. 나머지 CD4+ T 세포는 CFSE로써 표지를 한 다음 선택된 펩티드를 5 ㎛씩 배양했다. 각 펩티드마다 6개의 복제 웰에서 시험했다. 5개의 지속하지 않은 대조 웰에서 각 플레이트마다 그 배경을 측정했다.
7일의 배양 이후 세포를 항-CD4 항체로써 공동 염색한 다음 유세포 측정으로 분석했다. 증식의 정도는 CFSE 강도의 감도를 측정하여 결정했다.
유세포 측정 데이터의 평가는 FlowJo 소프트웨어(트리 스타 인코포레이티드(Tree Star Inc.))를 사용하여 수행했다. 유세포 측정 분석의 결과는 CD4+ 모집단 대 총 CD4+ 모집단의 비율로서 표현했다. 증식의 정도는 배경을 초과하는 자극의 백분율, 즉, 항원 자극된 CD4+ CFSE dim 세포의 비율 빼기 비자극된 대조 웰에서 CD4+ CFSE dim 세포의 비율로서 표현했다. 각 샘플마다 6개 복제 샘플의 평균 및 상응하는 평균의 표준 오류(SEM)를 계산했다.
공여자의 선택
공여자는 HLA-DRB1 대립형질에 따라 선택되었다. 다른 2개의 HLA 클래스 II 자리(DQ 및 DP)는 분석에 포함시키지 않았다. 흥미로운 DRB1 대립형질은 SYFPEITHI 알고리즘에 근거하여 예측된 펩티드 결합의 빈도에 따라 선택했다(Rammensee et al., 1999). HLA-DR의 경우, 결합은 SYFPEITHI 결합 예측 점수가 18 이상으로 정의했다. 이 한계 점수는 알려져 있는 발표된 결합의 분명한 HLA-DR 리간드의 결합 점수의 분석에 근거하여 정의했다(표 24).
[표 24]
실험적으로 몇몇 HLA-DR 대립형질에 결합하는 것으로 보여진 바 있는 펩티드와 HLA-DR의 결합에 대한 SYFPEITHI 예측 점수. 표시된 DR 대립형질에 대한 결합이 실험적으로 보여진 경우에만 예측 점수가 나와 있다. DR 대립형질의 고분해능 정보가 없으면 *로 표시된다. 어떤 대립형질에 대한 결합이 실험적으로 나타났다면 26개 가운데 23개의(89%) SYFPEITHI 점수는 18 이상이었다.
Figure pct00036
프로이뮨에 의해 선택된 모든 펩티드에 걸쳐 결합 빈도가 20% 넘는 모든 DRB1 대립형질을 공여자 패널에 포함시키도록 요청되었다. 4개의 다른 드문 DRB1 대립형질들(DRB1*10:01, DRB1*16:01, DRB1*08:01 및 DRB1*13:03)을 추가로 요청했다. 조립된 공여자 패널은 표 26에 나와 있다.
[표 25]
다양한 결합 모티브를 가진 다양한 HLA-DRB1 대립형질에 대한 선택된 펩티드의 결합 능력: SYFPEITHI 점수가 17을 넘으면 결합 사건으로서 1점이 주어졌다. 마지막 열은 모든 선택된 펩티드에 대한 결합 사건의 백분율을 보여준다.
Figure pct00037
[표 26]
공여자 패널. 21개의 선택된 공여자에서 HLA-DRB1 대립형질 분포
Figure pct00038
시험관 내 면역원성의 결과
CD4+ T 세포의 항원-자극 증식은 시험관 내 면역원성의 지표로서 간주했으며 프로이뮨의 상업용 T 세포 증식 측정법으로 조사했다. 항원-자극 CD4+ T 세포 증식의 정도는 백분율을 초과하는 자극의 백분율로 표현했다. 배경보다 0.02%가 큰 자극 및 SEM = 2에 해당하는 반응(즉, 배경보다 2개의 표준 오류가 큰 값)은 양성으로 간주했다.
10개의 선택된 펩티드 항원에서 9개는(FN1-002는 예외) 양성으로 시험되었다. 21개의 평가가능한 T 세포 샘플 가운데 11개는 적어도 1개의 펩티드에 대해 양성 반응을 보였다(도 4). 개별 펩티드 항원은 최대 6명의 공여자에서 CD4+ T 세포 증식을 자극했다.
시험관 내 대비 생체 내 면역원성의 비교
T 세포 증식 분석에는 알려진 생체 내면역원성을 가진 5개 펩티드를 양성 대조로 포함시켰다. 이러한 펩티드의 생체 내 면역원성은, CD4 T 세포의 세포 내 사이토카인 염색(ICS)을 사용하는 임상 시험에서 이 펩티드로써 면역접종된 환자의 혈액 샘플에서 결정했다.
원칙적으로 ICS 검사에서는 특이적 T 세포의 질을 작용기 기능으로서 분석한다. 따라서 말초 단핵 세포(PBMC)를 시험관 내에서 관심 대상의 펩티드, 참고 펩티드 및 음성 대조(여기서는 MOCK)로 다시 자극했다. 다음 재자극된 세포를 IFN-감마, TNF-알파, IL-2 및 IL-10 생산 및 공동자극 분자 CD154의 발현을 위해 염색했다. 염색한 세포의 계측을 흐름 세포측정기에서 수행했다(도 5).
면역원성 분석의 결과에 따르면, IMA950 펩티드(BIR-002 및 MET-005)로 접종받은 16명의 환자(IMA950-101 연구)는 100% 면역 반응을 보였으며, IMA910 펩티드(CEA-006, TGFBI-004 및 MMP-001)로 접종받은 71명의 환자(IMA910-101 연구)는 44% 내지 86%의 면역 반응을 보였다(도 6).
알려진 생체 내 면역원성을 가진 펩티드의 시험관 내 면역원성의 결과를 선택된 펩티드와 비교했다(표 27). 그 분석에 의하면 21개의 조사한 공여자 샘플 가운데 7개에서 양성 대조 펩티드가 CD4+ T 세포 증식을 자극했다. 자극 반응의 강도 평균은 펩티드 당 최대 4개의 공여자 샘플에서 배경 초과 범위가 0.09 내지 0.31%였다. 예를 들어, BIR-002의 자극 강도는 0.24%였다. BIR-002는 여러 임상 시험에서 고도의 면역원성을 갖는 것으로 나타났다. 여러 HLA-DR 대립형질을 발현하는 19명의 평가가능 환자에 의한 임상 시험에서, BIR-002는 전립선암-특이적 펩티드 백신의 성분으로서 시험했다(Feyerabend et al., 2009). 16명(84%) 환자가 BIR-002에 대해 강력한 CD4+ T 세포 반응을 보였으며(Widenmeyer et al., 2008) 이에 따라 높은 면역원성의 가능성을 보여주었다. IMA950 시험에서, 환자의 100%(n=16)가 BIR-002에 대해 면역 반응을 보여주었다.
FN1-002를 제외하고 비교하면, 현재 분석을 위해 선택된 펩티드들은 11개의 조사된 공여자 샘플에서 CD4+ T 세포 증식을 자극했다. 이에 따라, 자극 반응의 강도 평균은 펩티드 당 최대 6명의 공여자에서 배경 초과 범위가 0.19 내지 0.48%였다. 이 값들은 고도의 면역원성을 가진 펩티드 BIR-002의 자극 반응 강도와 유사했다. 흥미롭게도, 모든 양성 대조 펩티드에 대해 시험관 내 면역원성 측정에서 양성 공여자 샘플의 비율은(범위: 4 내지 19%), 임상 시험에서 이 펩티드들에 대해 면역 반응을 보인 환자의 비율(범위: 44 내지 100%)보다 상당히 많았다. 이러한 관찰은 현재의 시험관 내 면역원성 측정 셋업이 꽤 보존적이어서 임상적 환경에서 펩티드의 면역원성을 과소평가하기 쉽다는 것을 나타낸다. 따라서 대부분 환자의 경우 조사한 펩티드 10개 가운데 9개 임상 시험에서 생체 내 면역 원성을 유도할 가능성이 크다고 기대할 수 있다.
[표 27]
알려진 생체 내 면역원성을 가진 선택된 펩티드 및 양성 대조 펩티드에 대한 T 세포 증식 측정의 결과
Figure pct00039
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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ile Tyr Thr Arg Val Thr Tyr Tyr Leu 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Arg Tyr Gly Gly Ser Phe Ala Glu Leu 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ala Tyr Leu Lys Glu Val Glu Gln Leu 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Lys Tyr Ile Glu Ala Ile Gln Trp Ile 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Phe Tyr Gln Gly Ile Val Gln Gln Phe 1 5 <210> 83 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Glu Tyr Ser Asp Val Leu Ala Lys Leu Ala Phe 1 5 10 <210> 84 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Thr Phe Asp Val Ala Pro Ser Arg Leu Asp Phe 1 5 10 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Pro Phe Leu Gln Ala Ser Pro His Phe 1 5 <210> 86 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Leu Ser Ala Asp Asp Ile Arg Gly Ile Gln Ser Leu Tyr Gly Asp Pro 1 5 10 15 Lys <210> 87 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Glu Gly Asp Ile Gln Gln Phe Leu Ile Thr Gly Asp Pro Lys Ala Ala 1 5 10 15 Tyr Asp Tyr <210> 88 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Asn Pro Val Ser Gln Val Glu Ile Leu Lys Asn Lys Pro Leu Ser Val 1 5 10 15 Gly <210> 89 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Lys Leu Tyr Ile Gly Asn Leu Ser Glu Asn Ala Ala Pro Ser 1 5 10 <210> 90 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Asp Ala Val Gln Met Val Ile Thr Glu Ala Gln Lys Val Asp Thr Arg 1 5 10 15 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Val Ala Arg Leu Pro Ile Ile Asp Leu Ala Pro Val Asp Val Gly Gly 1 5 10 15 Thr Asp <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Asn Lys Pro Ser Arg Leu Pro Phe Leu Asp Ile Ala Pro Leu Asp Ile 1 5 10 15 Gly Gly Ala Asp 20 <210> 93 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ser Arg Pro Gln Ala Pro Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Val Tyr Ser Pro 1 5 10 15 Ser Val <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ile Leu Val Asp Trp Leu Val Gln Val 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Lys Ile Ile Gly Ile Met Glu Glu Val 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Ala Met Gly Ile Ala Pro Pro Lys Val 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Thr Leu Phe Pro Val Arg Leu Leu Val 1 5 <210> 98 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Val Leu Tyr Pro His Glu Pro Thr Ala Val 1 5 10 <210> 99 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Ala Leu Phe Gln Arg Pro Pro Leu Ile 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Lys Ile Val Asp Phe Ser Tyr Ser Val 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Leu Leu Leu Glu Ile Leu His Glu Ile 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ser Leu Leu Ser Glu Leu Gln His Ala 1 5 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Lys Leu Leu Ser Asp Pro Asn Tyr Gly Val 1 5 10 <210> 104 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 Ser Leu Val Ala Val Glu Leu Glu Lys Val 1 5 10 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Ile Val Ala Glu Ser Leu Gln Gln Val 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Ser Ile Leu Glu His Gln Ile Gln Val 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Ala Leu Ser Glu Arg Ala Val Ala Val 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Thr Leu Leu Asp Phe Ile Asn Ala Val 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Asn Leu Ile Glu Val Asn Glu Glu Val 1 5 <210> 110 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ile Gln Leu Ile Val Gln Asp Lys Glu Ser Val Phe Ser Pro Arg 1 5 10 15 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Ser Leu Tyr Lys Gly Leu Leu Ser Val 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Val Leu Ala Pro Leu Phe Val Tyr Leu 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ala Asn Val 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Ala Met Ser Ser Lys Phe Phe Leu Val 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Lys Ile Gln Glu Met Gln His Phe Leu 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Ile Leu Ile Asp Trp Leu Val Gln Val 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ser Leu His Phe Leu Ile Leu Tyr Val 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Ile Val Asp Asp Ile Thr Tyr Asn Val 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Lys Ile Gln Glu Ile Leu Thr Gln Val 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Arg Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Leu 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 122 Lys Leu Ser Trp Asp Leu Ile Tyr Leu 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Gly Leu Thr Asp Asn Ile His Leu Val 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Asn Leu Leu Asp Leu Asp Tyr Glu Leu 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Arg Leu Asp Asp Leu Lys Met Thr Val 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Lys Leu Leu Thr Glu Val His Ala Ala 1 5 <210> 127 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Ile Leu Phe Pro Asp Ile Ile Ala Arg Ala 1 5 10 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Thr Leu Ser Ser Ile Lys Val Glu Val 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Gly Leu Ile Glu Ile Ile Ser Asn Ala 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Lys Ile Leu Glu Asp Val Val Gly Val 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Ala Leu Val Gln Asp Leu Ala Lys Ala 1 5 <210> 132 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 132 Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp Lys Val 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 134 Thr Leu Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Val 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Ala Ile Asp Gly Asn Asn His Glu Val 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ala Leu Val Asp His Thr Pro Tyr Leu 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Phe Leu Val Asp Gly Ser Trp Ser Val 1 5 <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Ala Leu Asn Glu Glu Ala Gly Arg Leu Leu Leu 1 5 10 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ser Leu Ile Glu Asp Leu Ile Leu Leu 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Thr Leu Tyr Pro His Thr Ser Gln Val 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Asn Leu Ile Glu Lys Ser Ile Tyr Leu 1 5 <210> 142 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Val Leu Leu Pro Val Glu Val Ala Thr His Tyr Leu 1 5 10 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 143 Ala Ile Val Asp Lys Val Pro Ser Val 1 5 <210> 144 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Lys Ile Phe Asp Glu Ile Leu Val Asn Ala 1 5 10 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Phe Gln Tyr Asp His Glu Ala Phe Leu 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Val Leu Phe Pro Asn Leu Lys Thr Val 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Ala Leu Phe Gly Ala Leu Phe Leu Ala 1 5 <210> 149 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Lys Leu Val Glu Phe Asp Phe Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Gly Val Leu Glu Asn Ile Phe Gly Val 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ala Val Val Glu Phe Leu Thr Ser Val 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 152 Ile Leu Gln Asp Arg Leu Asn Gln Val 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 153 Ala Leu Tyr Asp Ser Val Ile Leu Leu 1 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 154 Ile Leu Phe Glu Ile Asn Pro Lys Leu 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 155 Ala Leu Asp Glu Asn Leu His Gln Leu 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 156 Thr Val Ala Glu Val Ile Gln Ser Val 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 157 Lys Leu Phe Gly Glu Lys Thr Tyr Leu 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Lys Leu Asp Glu Thr Asn Asn Thr Leu 1 5 <210> 159 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Thr Tyr Lys Tyr Val Asp Ile Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Ser Tyr Leu Gln Ala Ala Asn Ala Leu 1 5 <210> 161 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Leu Tyr Gln Ile Leu Gln Gly Ile Val Phe 1 5 10 <210> 162 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Thr Asn Gly Val Ile His Val Val Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp 1 5 10 15 Thr <210> 163 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Tyr Leu Leu Pro Ala Ile Val His Ile 1 5 <210> 165 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn 1 5 10 15 <210> 166 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 Thr Phe Ser Tyr Val Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr 1 5 10 15 Gly <210> 167 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 167 Ser Gln Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Tyr Gly Lys Arg Ser 1 5 10 15 <210> 168 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 168 Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr 1 5 10 15 <210> 169 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 169 Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His 1 5 10 15 <210> 170 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Lys Ile Phe Tyr Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr 1 5 10 15 <210> 171 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 172 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 1 5 10 15 <210> 173 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val 1 5 10 15 <210> 174 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly 1 5 10 15 <210> 175 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg 1 5 10 15 Leu Thr <210> 176 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg 1 5 10 15 Phe <210> 177 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Ala Lys Ala Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala 1 5 10

Claims (39)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열 및 서열번호 1 내지 서열번호번호 110에 대해 88% 이상 상동성인 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드로서,
    상기 변이체가 주조직적합 복합체(MHC)의 분자에 결합하고/하거나 상기 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도하고, 전장 폴리펩티드가 아닌, 펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드가 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 결합하는 능력을 보유하고, 상기 MHC와 결합 시 CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    펩티드 또는 이의 변이체의 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 110 중 어느 하나에 따른 아미노산의 연속적인 신장을 포함하는 펩티드 또는 변이체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드 또는 이의 변이체가 갖는 전체 길이가 8 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 8 내지 30개, 더욱 바람직하게는 8 내지 16개의 아미노산이고, 가장 바람직하게는 펩티드가 서열번호 1 내지 서열번호 110에 따른 임의의 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는 펩티드 또는 변이체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드가 변형되고/되거나 비펩티드 결합을 포함하는 펩티드 또는 변이체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩티드가 융합 단백질의 일부이고, 특히 HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 변이체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 암호화하고 임의적으로 이종 자극자 서열에 연계된 핵산.
  8. 제7항에 따른 핵산을 발현시키는 발현 벡터.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산 또는 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포가 바람직하게는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포인 재조합 숙주 세포.
  10. 의학에서의 사용을 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 또는 제9항에 따른 숙주 세포.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체의 생산 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 제시하거나 제7항에 따른 핵산을 발현시키거나 제8항에 따른 발현 벡터를 포함하는 제9항에 따른 숙주 세포의 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 그 배양 배지로부터의 펩티드 또는 이의 변이체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 활성화 T 림프구를 생산하는 시험관 내 방법으로서,
    T 세포를 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 항원-로딩된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자 또는 항원-제시 세포를 모방하는 인공 구축물과 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 항원이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드인, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항 내지 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 제12항에 따른 방법에 의해 생산되는 활성화 T 세포.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 주어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 세포를 표적으로 환자의 몸에서 표적 세포를 괴사시키는 방법으로서,
    제13항에 정의된 효과적인 수의 활성화 T 세포를 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 MHC 분자에 결합된 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하는 항체, 특히 용해성 또는 막 결합된 항체.
  16. 암의 치료 또는 암에 대한 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제9항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체의 용도.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암이 폐암, 뇌암, 유방암, 결장직장암, 식도암, 신장암, 간암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 위암, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 백혈병(AML, CLL), 및 펩티드 서열번호 1 내지 서열번호 110이 유래된 단백질의 과발현을 보여주는 기타 종양들로 구성된 군으로부터 선택되는 용도.
  18. (a) 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제7항에 따른 핵산, 제8항에 따른 발현 벡터, 제10항에 따른 세포, 제13항에 따른 활성화 T 림프구 또는 제15항에 따른 항체를 용액이나 동결건조된 형태로 포함하는 약학 조성물을 포함하는 용기;
    (b) 임의적으로, 희석제 또는 동결건조된 제형을 위한 재구성 용액을 포함하는 제 2 용기;
    (c) 임의적으로, 서열번호 1 내지 서열번호 162로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 펩티드; 및
    (d) 임의적으로, (i) 용액의 사용 혹은 (ii) 동결건조된 제형의 재구성 및/또는 사용을 위한 설명서
    를 포함하는 키트.
  19. 제18항에 있어서,
    하나 이상의 (iii) 완충액, (iv) 희석제, (v) 필터, (vi) 주사바늘 또는 (v) 주사기를 추가로 포함하는 키트.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 펩티드가 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성되는 군에서 선택되는 키트.
  21. 개인화 항암 백신의 생산 방법으로서,
    a) 상기 개별 환자의 종양 샘플에 의해 제시된 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 동정하는 단계;
    b) 정상 조직과 비교하여 종양에서 면역원성 및/또는 과다 제시에 대해 사전선별된 펩티드의 창고를 단계 a)에서 동정된 펩티드와 비교하는 단계;
    c) 환자에서 동정된 TUMAP와 일치하는 하나 이상의 펩티드를 창고로부터 선택하는 단계; 및
    d) 단계 c)에 근거한 개인화 백신을 제조하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 TUMAP가
    (a1) 종양 샘플에서 과발현되거나 이상 발현된 단백질을 동정하기 위해 종양 샘플의 발현 데이터를 종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직의 샘플의 발현 데이터와 비교하는 단계; 및
    (a2) 종양에 의해 과발현되거나 이상 발현된 단백질로부터 유래한 MHC 리간드를 동정하기 위해, 종양 샘플에서 발현 데이터와 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자에 결합된 MHC 리간드의 서열과의 상관관계를 결정하는 단계
    에 의해 동정되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    종양 샘플로부터 단리된 MHC 분자로부터 결합된 펩티드를 용출시키고 용출된 리간드를 서열결정하여 MHC 리간드의 서열을 동정하는 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    종양 샘플의 조직 유형에 상응하는 정상 조직을 동일한 환자로부터 얻는 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    창고에 포함된 펩티드를 다음 단계들에 근거하여 동정하는 방법:
    aa. 정상 조직이나 조직들과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    ab. 단계 aa에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 암호화된 펩티드를 선택하는 단계, 및
    ac. 건강한 공여자나 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역 원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 결정하는 단계; 또는
    ba. 질량 분광분석 방법을 사용하여 상기 종양 샘플로부터 HLA 리간드를 동정하는 단계,
    bb. 정상 조직이나 조직들과 비교하여 악성 조직에서 과발현된 유전자의 동정을 포함하는, 마이크로어레이 또는 서열결정-기반의 발현 프로필과 같은 고도의 병렬 방법에 의한 게놈-전체 전령 리보핵산(mRNA) 발현 분석을 수행하는 단계,
    bc. 동정된 HLA 리간드와 상기 유전자 발현 데이터를 비교하는 단계,
    bd. 단계 bc에서 검출된 선택적으로 발현되거나 과발현된 유전자에 의해 암호화된 펩티드를 선택하는 단계,
    be. 종양 조직 상에서 단계 bd로부터 선택된 TUMAP 및 건강한 조직 상에서 결여되거나 덜 빈번한 검출을 재검출 mRNA 수준에서 과발현의 타당성을 확인하는 단계, 및
    bf. 건강한 공여자나 상기 환자의 인간 T 세포를 사용하여 시험관 내 면역 원성 검정을 포함하는 선택된 펩티드에 의한 생체 내 T 세포 반응의 유도를 측정하는 단계.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    창고에 포함된 펩티드의 면역원성을, 시험관 내 면역원성 측정, 개별 HLA 결합에 대한 환자 면역 모니터링, MHC 멀티머 염색, ELISPOT 측정 및/또는 세포내 시토카인 염색을 포함하는 방법으로 측정하는 방법.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 창고가 서열번호 1 내지 서열번호 162로 구성되는 군에서 선택된 복수의 펩티드를 포함하는 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    개별 환자로부터 상응하는 정상 조직에 대해 종양 샘플에 고유한 하나 이상의 돌연변이를 동정하는 단계, 및 그 돌연변이와 상관관계가 있는 펩티드를 백신에 포함시키거나 세포 요법의 생성을 위해 선택하는 단계을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 하나 이상의 돌연변이를 전체 유전체 서열 결정에 의해 동정하는 방법.
  30. HLA 리간드에 반응성인 T 세포 수용체, 바람직하게는 용해성 또는 막-결합된 T 세포 수용체로서,
    상기 리간드가 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성되는 군에서 선택된 아미노산 서열에 대해 75% 초과 동일성을 갖는 T 세포 수용체.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 아미노산 서열이 식별 번호 1 내지 서열번호 110에 대해 88% 이상 동일한 T 세포 수용체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서,
    상기 아미노산 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 110 중 어느 하나로 구성되는 T 세포 수용체.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 T 세포 수용체가 용해성 분자로 제공되고 임의적으로 면역 자극 도메인 혹은 독소와 같은 추가 효과기 기능을 보유하는 T 세포 수용체.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체를 암호화하고 임의적으로 이종 자극자 서열에 연계된 핵산.
  35. 제34항에 따른 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터.
  36. 제34항에 따른 핵산 또는 제15항에 따른 항체를 암호화하는 핵산 또는 제35항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포가 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포인 숙주 세포.
  37. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 수용체의 생산 방법으로서,
    제36항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포 및/또는 그 배양 배지로부터 상기 T 세포 수용체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 하기 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물:
    a) 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성된 군에서 선택되는 하나의 펩티드;
    b) a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체와 반응성인 T 세포 수용체;
    c) a)에 따른 펩티드 및 HLA-DR 항원-연관 불변쇄(Ii)의 N-말단 아미노산 1 내지 80개를 포함하는 융합 단백질;
    d) a) 내지 c) 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 또는 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터;
    e) d)의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포;
    f) T 세포를 적절한 항원-제시 세포의 표면에 발현된 a)에 따른 펩티드와 상기 T 세포를 항원 특이적 방식으로 활성화하는데 충분한 시간 동안 시험관 내에서 접촉시킴을 포함하는 방법, 및 이러한 활성화 T 세포를 자가 조직 혹은 다른 환자에게 이식하는 방법에 의해 얻어지는 활성화 T-림프구;
    g) a)에 따른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 복합체 및/또는 a)에 따른 펩티드를 제시하는 세포에 대해 반응성이고 예를 들어 면역-활성화 도메인 또는 독소와의 융합에 의해 잠재적으로 변형되는 항체 또는 용해성 T 세포 수용체;
    h) 서열번호 1 내지 서열번호 110으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드 및/또는 서열번호 1 내지 서열번호 162로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드와 MHC 분자의 복합체를 인식하는 압타머;
    i) a) 내지 h) 중 어느 하나에 따른 접합된 또는 라벨링된 펩티드 또는 골격 및 약학적으로 허용가능한 담체, 및 임의적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 안정화제.
  39. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 바람직하게는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 MHC 분자에 결합된 펩티드 또는 변이체를 특이적으로 인식하는 압타머.
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