JP2016106074A - 血清アルブミン結合性分子 - Google Patents

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Abstract

【課題】さまざまな治療薬の血清中半減期を増加させる化合物、増加した血清中半減期を有する化合物、および治療薬の血清中半減期を増加させるための方法の提供。【解決手段】血清アルブミンに結合する第10フィブロネクチンIII型ドメイン（10Fn3）に基づく抗体様タンパク質。治療用蛋白質を上記抗体様タンパク質と結合することによる血清中半減期を増加させるための方法。増加した血清中半減期を有する抗体様タンパク質と結合した治療用蛋白質。【選択図】なし

Description

［関連出願］
本願は、米国特許出願第１３／０９８，８５１号（２０１１年５月２日出願）および米国仮特許出願第６１／３３０，６７２号（２０１０年５月３日出願）の利益を主張し、これらの出願は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
［序論］
多くの治療薬、特にペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの生物学的製剤の有用性は、不十分な血清中半減期によって損なわれる。このため、そのような治療薬は、治療効果にとって必要な血清中レベルを維持するために、より高頻度かつ／またはより高用量での投与、または徐放性製剤の使用が必要になる。薬物の頻繁な全身性投与は少なからぬ負の副作用を伴う。例えば頻繁な全身性注射は対象にとってかなり不快なものであり、投与関連感染のリスクを高め、特に治療薬が静脈内投与される場合には、入院または頻繁な通院が必要になることもある。そのうえ、長期処置では、日々の静脈内注射が、血管の反復的穿刺によって引き起こされる組織の瘢痕化および血管病変という、無視できない副作用につながりうる。例えば糖尿病者へのインスリンの投与、多発性硬化症を患う患者におけるインターフェロン薬の投与など、治療薬のどの頻繁な全身性投与についても、同様の課題が知られている。これらの要因はいずれも、患者のコンプライアンスの低下および医療制度のコスト増につながる。
本願は、さまざまな治療薬の血清中半減期を増加させる化合物、増加した血清中半減期を有する化合物、および治療薬の血清中半減期を増加させるための方法を提供する。治療薬の血清中半減期を増加させるためのそのような化合物および方法は、費用対効果の高い手法で製造することができ、望ましい生物物理学的性質（例えばＴｍ、実質的に単量体であること、またはよくフォールディングされていること）を有し、サイズは組織透過が可能なほど十分に小さい。
［発明の概要］
本発明は、血清アルブミン結合性フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメイン、およびそれらの使用に関する。本明細書には、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３を含む融合分子およびそれらの使用も開示する。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）のドメインＩまたはＩＩに１μＭ以下のＫＤで結合し、アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも５倍大きいポリペプチドを提供する。ある実施形態において、１０Ｆｎ３ドメインは、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの１つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含む。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲においてＨＳＡに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲において、２００ｎＭ以下のＫＤで、ＨＳＡに結合する。もう一つの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、２００ｎＭ以下のＫＤで、ＨＳＡに結合する。
いくつかの態様では、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、かつ１０Ｆｎ３ドメインが配列番号２と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドが、ここに提供される。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＦＧループの１つ以上を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ）の１つ以上にも結合する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡまたはＭｕＳＡの１つ以上と交差反応しない。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインは、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、少なくとも２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤでＨＳＡに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインは、ＨＳＡのドメインＩまたはＩＩに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのドメインＩとドメインＩＩの両方に結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲においてＨＳＡに結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、２００ｎＭ以下のＫＤで、ＨＳＡに結合する。もう一つの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤで、ＨＳＡに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤで、ＨＳＡに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも２倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、または３０倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、ＨＳＡ、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡ、またはＭｕＳＡのいずれか１つである。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、少なくとも２０時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１５０時間、１７０時間、または２００時間である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
ある態様において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、かつ１０Ｆｎ３ドメインが配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＦＧループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号６に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、配列番号７に示すアミノ酸配列を含むＦＧループの１つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、かつ１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むＦＧループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号９に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１１に示すアミノ酸配列を含むＦＧループの１つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、かつ１０Ｆｎ３ドメインが配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むＦＧループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１５に示すアミノ酸配列を含むＦＧループの１つ以上を含む。
ある態様において、本発明は、１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡに結合し、かつ１０Ｆｎ３ドメインが配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＦＧループを含むポリペプチドを提供する。もう一つの態様では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１７に示すアミノ酸配列を含むＢＣループ、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含むＤＥループ、および配列番号１９に示すアミノ酸配列を含むＦＧループの１つ以上を含む。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインは、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ）の１つ以上にも結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡまたはＭｕＳＡの１つ以上と交差反応しない。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、少なくとも１．５μＭ、１．２μＭ、１μＭ、７００ｎＭ、５００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤでＨＳＡに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインはＨＳＡのドメインＩまたはＩＩに結合する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインがＨＳＡのドメインＩとドメインＩＩの両方に結合する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲においてＨＳＡに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、２００ｎＭ以下のＫＤで、ＨＳＡに結合する。もう一つの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤでＨＳＡに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤで、ＨＳＡに結合する。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも２倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、または３０倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、ＨＳＡ、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡ、またはＭｕＳＡのいずれか１つである。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期は、少なくとも２０時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１５０時間、１７０時間、または２００時間である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインと異種タンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する融合ポリペプチドを提供する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号４と少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号７に示すアミノ酸配列を有するＦＧループを含む。もう一つの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＢＣループ、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＤＥループ、および配列番号７に示すアミノ酸配列を有するＦＧループの１つ以上を含む。
ある実施形態では、異種タンパク質が、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）、インスリン、インスリン受容体ペプチド、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、骨形成タンパク質９（ＢＭＰ−９）、アミリン、ペプチドＹＹ（ＰＹＹ３−３６）、膵ポリペプチド（ＰＰ）、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）、プレクタシン、プログラニュリン、オステオカルシン（ＯＣＮ）、アペリン、または１０Ｆｎ３ドメインを含むポリペプチドから選択される。別の実施形態では、異種タンパク質が、ＧＬＰ−１、エキセンディン４、アディポネクチン、ＩＬ−１Ｒａ（インターロイキン１受容体アンタゴニスト）、ＶＩＰ（血管作動性腸ペプチド）、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）、レプチン、ＩＮＧＡＰ（膵島新生関連タンパク質）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、およびオステオカルシン（ＯＣＮ）から選択される。ある実施形態では、異種タンパク質が、配列番号１１８に示す配列を含む。
一定の実施形態では、異種タンパク質が、血清アルブミン以外のターゲットタンパク質に結合する第２の１０Ｆｎ３ドメインを含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドが、さらに、ターゲットタンパク質に結合する第３の１０Ｆｎ３ドメインを含む。ある実施形態では、第３の１０Ｆｎ３ドメインが、第２の１０Ｆｎ３ドメインと同じターゲットに結合する。別の実施形態では、第３の１０Ｆｎ３ドメインが、第２の１０Ｆｎ３ドメインとは異なるターゲットに結合する。
ある実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）、またはマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ）の１つ以上にも結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡまたはＭｕＳＡの１つ以上と交差反応しない。
一定の実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５００ｎＭ以下のＫＤでＨＳＡに結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、少なくとも２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤでＨＳＡに結合する。
別の実施形態では、融合ポリペプチドの１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのドメインＩまたはＩＩに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ＨＳＡのドメインＩとドメインＩＩの両方に結合する。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲においてＨＳＡに結合する。別の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、２００ｎＭ以下のＫＤで、ＨＳＡに結合する。もう一つの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、５．５〜７．４のｐＨ範囲において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤで、ＨＳＡに結合する。ある実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、ｐＨ５．５において、少なくとも５００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、または５ｎＭのＫＤで、ＨＳＡに結合する。
いくつかの実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも５倍大きい。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも２倍、５倍、７倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、または３０倍大きい。いくつかの実施形態では、血清アルブミンが、ＨＳＡ、ＲｈＳＡ、ＣｙＳＡ、またはＭｕＳＡのいずれか１つである。
一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも２０時間である。一定の実施形態では、血清アルブミンの存在下における融合ポリペプチドの血清中半減期が、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１５０時間、１７０時間、または２００時間である。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドの半減期が、霊長類（例えばヒトまたはサル）またはマウスにおいて観察される。
前述の態様および実施形態のいずれかにおいて、１０Ｆｎ３ドメインは、配列番号８、１２、１６、２０、および２４〜４４から選択される配列を含む。
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループの１つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）野生型１０Ｆｎ３ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（ｉｉｉ）配列（ＥＤ）ｎを有するＣ末端テール（ここで、ｎは３〜７の整数である）を含む、ポリペプチドを提供する。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１の残基９〜９４に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、Ｃ末端テールが、そのＮ末端にＥ、ＩまたはＥＩを、さらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端テールが、ポリペプチドの溶解度を向上させ、かつ／またはポリペプチドの凝集を減少させる。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのそれぞれに修飾されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ポリペプチドが、１μＭ以下のＫＤでターゲットに結合する。
いくつかの態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかのポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。一定の実施形態では、医薬組成物が、コハク酸、グリシン、およびソルビトールを含む。例示的実施形態では、組成物が、ｐＨ６．０で、５ｎＭ〜３０ｍＭのコハク酸、５％〜１５％のソルビトール、および２．５％〜１０％のグリシンを含む。一定の実施形態では、組成物が、ｐＨ６．０で、１０ｍＭコハク酸、８％ソルビトール、および５％グリシンを含む。別の実施形態では、医薬組成物が、生理学上許容される担体をさらに含む。
マウスにおける生体内ＨＳＡ半減期。２０ｍ／ｋｇ（図１Ａ）または５０ｍｇ／ｋｇ（図１Ｂ）のＨＳＡをマウスに注射した。 マウスにおける生体内ＨＳＡ半減期。２０ｍ／ｋｇ（図１Ａ）または５０ｍｇ／ｋｇ（図１Ｂ）のＨＳＡをマウスに注射した。 マウスにおけるＳＡＢＡ１〜４の半減期決定。図２Ａ：ＳＡＢＡ１．１；図２Ｂ：ＳＡＢＡ２．１；図２Ｃ：ＳＡＢＡ３．１；および図２Ｄ：ＳＡＢＡ４．１。 マウスにおけるＳＡＢＡ１〜４の半減期決定。図２Ａ：ＳＡＢＡ１．１；図２Ｂ：ＳＡＢＡ２．１；図２Ｃ：ＳＡＢＡ３．１；および図２Ｄ：ＳＡＢＡ４．１。 マウスにおけるＳＡＢＡ１〜４の半減期決定。図２Ａ：ＳＡＢＡ１．１；図２Ｂ：ＳＡＢＡ２．１；図２Ｃ：ＳＡＢＡ３．１；および図２Ｄ：ＳＡＢＡ４．１。 マウスにおけるＳＡＢＡ１〜４の半減期決定。図２Ａ：ＳＡＢＡ１．１；図２Ｂ：ＳＡＢＡ２．１；図２Ｃ：ＳＡＢＡ３．１；および図２Ｄ：ＳＡＢＡ４．１。 ＨＳＡと同時注射した時のＳＡＢＡ１〜４のマウスにおける半減期向上の要約を表すグラフ。 カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１（図４Ａ）およびＳＡＢＡ５．１（図４Ｂ）に関する半減期決定。 カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１（図４Ａ）およびＳＡＢＡ５．１（図４Ｂ）に関する半減期決定。 直接結合ＥＬＩＳＡアッセイによるヒト、マウスおよびラット由来のアルブミンへのＳＡＢＡ１．２の結合。 ＳＡＢＡ１．１とＨＳＡの化学量論の決定。ＳＡＢＡ１．１とＨＳＡは１：１の化学量論で結合する。 ＨＳＡの組換えドメインフラグメントへのＳＡＢＡ１．２結合のＢｉａｃｏｒｅ分析。 １ｍｐｋおよび１０ｍｐｋの用量で投与されたサルにおけるＳＡＢＡ１．２の薬物動態プロファイル。 １ｍｐｋの用量で静脈内または皮下に投与されたサルにおけるＳＡＢＡ１．２の薬物動態プロファイル。 ＦＧＦ２１とＳＡＢＡの融合物の生産的発現に使用したｐＥＴ２９ｂベクターのプラスミドマップ。 ＰＢＳバッファー中、３７℃における、ＨＳＡによるＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１ｖ１融合物の代表的な等温滴定熱量測定。このアッセイにおいて決定された値は、Ｎ＝０．８７；ＫＤ＝３．８×１０−９Ｍ；ΔＨ＝−１５３６０カロリー／モルである。 ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１のＨＳＡ（Ａ）、ＣｙＳＡ（Ｂ）、およびＭｕＳＡ（Ｃ）への結合、またはＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３のＨＳＡ（Ｄ）、ＣｙＳＡ（Ｅ）、およびＭｕＳＡ（Ｆ）への結合に関するＳＰＲセンサーグラムデータ。 ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１のＨＳＡ（Ａ）、ＣｙＳＡ（Ｂ）、およびＭｕＳＡ（Ｃ）への結合、またはＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３のＨＳＡ（Ｄ）、ＣｙＳＡ（Ｅ）、およびＭｕＳＡ（Ｆ）への結合に関するＳＰＲセンサーグラムデータ。 ヒト血清アルブミンの存在下での、ＨＥＫβ−クロトー細胞中のｐＥＲＫ１／２レベルの刺激における、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１の活性とＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の活性の比較。 ＨＥＫ親細胞中およびＨＥＫβ−クロトー細胞中のｐＥＲＫ１／２レベルの刺激における、ＦＧＦ１、Ｈｉｓ６タグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の活性の比較。ＨＥＫ親細胞（図１４Ａ）およびＨＥＫβ−クロトー発現細胞（図１４Ｂ）におけるｐＥＲＫ１／２レベルの用量応答刺激の代表的グラフ。データを三重試料の平均±ｓｅｍとしてプロットする。 ＨＥＫ親細胞中およびＨＥＫβ−クロトー細胞中のｐＥＲＫ１／２レベルの刺激における、ＦＧＦ１、Ｈｉｓ６タグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の活性の比較。ＨＥＫ親細胞（図１４Ａ）およびＨＥＫβ−クロトー発現細胞（図１４Ｂ）におけるｐＥＲＫ１／２レベルの用量応答刺激の代表的グラフ。データを三重試料の平均±ｓｅｍとしてプロットする。 図１５ＡおよびＢは糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の生体内効力の調査及び食後血漿中グルコースレベルを示す。 図１５ＡおよびＢは糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の生体内効力の調査及び食後血漿中グルコースレベルを示す。 サルにおいて、ＳＡＢＡとＦＧＦ２１の融合物は、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１と比較して、ｔ１／２を約２７倍増加させた。 ＨｕＳＡ／ＳＡＢＡ１．２複合体を２方向から見た図を表し、２つめの図（図１７Ｂ）は１つめの図（図１７Ａ）から鉛直軸を中心に７０°回転させた図である。ＨｕＳＡを表面表示で示し、ＳＡＢＡ１．２をカートゥーンとして、すなわち、βストランドを矢印で、ループをひもで表している。ＳＡＢＡ１．２上の多様化されたループを黒色で示し、ＨｕＳＡ上の接触残基を、それより明るい灰色の陰で示す。ＨｕＳＡの３つの構造ドメインに印を付ける（すなわち、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ）。 用量漸増および処置コホートの図解（実施例Ａ９参照）。試験週数は試験の総継続時間を示す。各コホート内の週数（Ｗｋ）は、そのコホートにおける処置の開始時点からの継続時間を示す。（ａ）所与のコホートにおける処置は、ＰＫ分析が可能であるように、先のコホートにおける最後の被験者が２９日目の来院を完了した後、約４週間は開始されないであろう。（ｂ）各コホートにおける行１、２、または３は、１週間ずらして開始されるサブグループを示す（コホート１におけるサブグループ１と２の間は１５日の間隔）。グループ１は、１人のＳＡＢＡ１．２処置被験者と１人のプラセボ被験者を含み；グループ２は、４人のＳＡＢＡ１．２処置被験者と１人のプラセボ被験者を含み；グループ３は、５人（コホート１の場合）または４人（コホート２および３の場合）のＳＡＢＡ１．２処置被験者と１人（全てのコホート）のプラセボ被験者を含むであろう。矢印（↑）は処置を示し（各群について１日目と１５日目）；実線（−）は積極的観察期間を示し；点線（…）は安全性追跡調査を示す。 ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１による１４日間の処置後のｏｂ／ｏｂマウスにおけるＨｂＡ１ｃのレベル。 サルにおける時間に対する平均血漿中濃度のプロファイル（平均±ＳＤ）。 固相ペプチド合成において使用するためのオルソゴナルに保護されたアミノ酸の例（上）。固相合成に役立つ他のビルディングブロックも図解する（下）。 固相ペプチド合成において使用するためのオルソゴナルに保護されたアミノ酸の例（上）。固相合成に役立つ他のビルディングブロックも図解する（下）。 固相ペプチド合成において使用するためのオルソゴナルに保護されたアミノ酸の例（上）。固相合成に役立つ他のビルディングブロックも図解する（下）。
［発明の詳細な説明］
定義
本明細書において使用される次の用語および語句は、以下に示す意味を有する。本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、別段の定義がある場合を除いて、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
単数形「ある」および「その」（「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈上別段の必要がある場合を除いて、複数の指示対象を包含する。
「を含む」および「を含んでいる」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）という用語は、包括的、非限定的な意味で使用され、すなわち追加の要素が含まれていてもよい。
「を包含する」（「ｉｃｌｕｄｉｎｇ」）という用語は、「を包含するが、それに限定されるわけではない」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ」）を意味する。「を包含する」と「を包含するが、それに限定されるわけではない」とは可換的に使用される。
「抗体様タンパク質」という用語は、「免疫グロブリン様フォールド」を有する、すなわちβシートを形成する一組のβまたはβ様ストランドに構造的に組織化される約８０〜１５０個のアミノ酸残基を含み、そのβまたはβ様ストランドが介在するループ部分によってつながれている、非免疫グロブリンタンパク質を指す。βシートは抗体様タンパク質の安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループで構成された２つの「面」を作り出す。本明細書において説明するとおり、これらのループを変異させることで、カスタマイズされたリガンド結合部位を作り出すことができ、そのような変異はタンパク質の総合的安定性を破壊することなく生成させることができる。そのような抗体様タンパク質の一例は「フィブロネクチンベースのスキャフォールドタンパク質」であり、これは、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（Ｆｎ３）に基づくポリペプチドを意味する。ある態様では、抗体様タンパク質が第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（１０Ｆｎ３）に基づく。
「ポリペプチド」とは、長さ、翻訳後修飾、または機能を問わず、２つ以上のアミノ酸の任意の配列を意味する。「ポリペプチド」「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においては可換的に使用される。
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、本明細書においては、どの保存的置換も配列同一性の一部であるとは見なさずに、最大のパーセント配列同一性が得られるように、配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入した後に、第２配列中のアミノ酸残基と同一である、第１配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内にあるさまざまな手法で、例えば公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使って、達成することができる。当業者は、アラインメントをはかるための適当なパラメータを、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めて、決定することができる。ただし、ここでの目的には、％アミノ酸配列同一性値が、後述のように、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．によって作成され、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９）に利用者向け文書と共に登録申請されて、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されており、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）を通して公的に入手することができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはｄｉｇｉｔａｌ ＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄ上で使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータはＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変動しない。
ここでの目的には、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂへの、または所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する％アミノ酸配列同一性（これは、所与のアミノ酸配列Ｂに、または所与のアミノ酸配列Ｂと、または所与のアミノ酸配列Ｂに対して、一定の％アミノ酸配列同一性を有する、または含む、所与のアミノ酸配列Ａと、言い換えることもできる）は、以下のように算出される：１００×分率Ｘ／Ｙ（ここで、Ｘは、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２が、そのプログラムによるＡとＢのアラインメントにおいて、完全一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈ）とスコアリングしたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ中のアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合に、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくなくなることは、理解されるであろう。
「治療有効量」という用語は、哺乳動物における疾患または障害を処置し、かつ／またはその障害に関連する症状の１つ以上をある程度緩和するのに有効な、薬物の量を指す。
「ＳＡＢＡ」という用語は、血清アルブミン結合性（Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ）Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を指す。Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ， ａ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、すなわちＦｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に基づく、リガンド結合性スキャフォールドタンパク質である。
アミノ酸配列または化合物の半減期（ｔ１／２）は、一般に、ポリペプチドの血清中濃度が、例えばその配列もしくは化合物の分解および／または自然の機序によるその配列もしくは化合物の浄化もしくは隔離などにより、生体内で５０％減少するのに要する時間と定義することができる。半減期は、当技術分野において知られている任意の手法で、例えば薬物動態分析によって決定することができる。例えばＭ ＧｉｂａｌｄｉおよびＤ Ｐｅｒｒｏｎ著「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ刊、改訂第２版（１９８２）を参照されたい。半減期は、ｔ１／２−α、ｔ１／２−βおよび曲線下面積（ＡＵＣ）などのパラメータを使って表すことができる。「半減期の増加」とは、これらのパラメータの任意の１つ、これらのパラメータの任意の２つ、またはこれらのパラメータの３つ全ての増加を指す。一定の実施形態では、半減期の増加がｔ１／２−βの増加を指し、ｔ１／２−αもしくはＡＵＣの増加またはその両方の増加を伴っても、伴わなくてもよい。
「ＰＫ」という用語は「ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ（薬物動態の）」の頭文字であり、例えば吸収、分布、代謝、および対象による排除などといった化合物の性質を包含する。「ＰＫ調整タンパク質」または「ＰＫ部分」は、生物活性分子に融合するか生物活性分子と一緒に投与した場合にその生物活性分子の薬物動態的性質に影響を及ぼす任意のタンパク質、ペプチド、または部分を指す。
概略
Ｆｎ３とはフィブロネクチン由来のＩＩＩ型ドメインを指す。Ｆｎ３ドメインは小さく、単量体であり、可溶性であり、安定である。これはジスルフィド結合を欠き、それゆえに、還元条件下で安定である。Ｆｎ３の全体的構造は免疫グロブリンフォールドと類似している。Ｆｎ３ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、順に、βまたはβ様ストランドＡ；ループＡＢ；βまたはβ様ストランドＢ；ループＢＣ；βまたはβ様ストランドＣ；ループＣＤ；βまたはβ様ストランドＤ；ループＤＥ；βまたはβ様ストランドＥ；ループＥＦ；βまたはβ様ストランドＦ；ループＦＧ；およびβまたはβ様ストランドＧを含む。７本の逆平行βストランドは２つのβシートとして配置され、それらが安定なコアを形成すると同時に、βまたはβ様ストランドをつなぐループで構成された２つの「面」を作り出す。ループＡＢ、ＣＤ、およびＥＦは一方の面に位置し、ループＢＣ、ＤＥ、およびＦＧは反対面に位置する。ループＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧのいずれかまたは全てが、リガンド結合に関与しうる。Ｆｎ３のモジュールは少なくとも１５種類あり、モジュール間の配列相同性は低いが、三次構造は、全てが高い類似性を共有している。
Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（Ａｄｎｅｘｕｓ， ａ Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｒ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）は、第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、すなわちＦｎ３の第１０モジュール（１０Ｆｎ３）に基づく、リガンド結合性スキャフォールドタンパク質である。天然ヒト１０Ｆｎ３のアミノ酸配列を配列番号１に示す：
Figure 2016106074
 （配列番号１）（ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループに下線を付し、ＢＣ、ＦＧ、およびＤＥループを太字で強調している）。配列番号１では、ＡＢループが残基１５〜１６に対応し、ＢＣループが残基２１〜３０に対応し、ＣＤループが残基３９〜４５に対応し、ＤＥループが残基５１〜５６に対応し、ＥＦループが残基６０〜６６に対応し、ＦＧループが残基７６〜８７に対応する（Ｘｕら， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００２ ９：９３３−９４２）。ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループは、分子の一方の面に沿って並び、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループは分子の反対面に沿って並ぶ。配列番号１では、βストランドＡが残基９〜１４に対応し、βストランドＢが残基１７〜２０に対応し、βストランドＣが残基３１〜３８に対応し、βストランドＤが残基４６〜５０に対応し、βストランドＥが残基５７〜５９に対応し、βストランドＦが残基６７〜７５に対応し、βストランドＧが残基８８〜９４に対応する。ストランドは、例えばストランドＡとＢが、ループＡＢにより、ストランドＡ、ループＡＢ、ストランドＢの構成でつながれるというように、対応するループによって互いにつながれる。配列番号１の最初の８アミノ酸（上記の配列では斜体）は、分子の結合活性を保ったまま、欠失させることができる。疎水性コアの形成に関与する残基（「コアアミノ酸残基」）には、次に挙げる配列番号１のアミノ酸が包含される：Ｌ８、Ｖ１０、Ａ１３、Ｌ１８、Ｉ２０、Ｗ２２、Ｙ３２、Ｉ３４、Ｙ３６、Ｆ４８、Ｖ５０、Ａ５７、Ｉ５９、Ｌ６２、Ｙ６８、Ｉ７０、Ｖ７２、Ａ７４、Ｉ８８、Ｉ９０およびＹ９２（ここでは、コアアミノ酸残基を、１文字アミノ酸記号とそれに続く配列番号１内でのその位置によって表している）。
例えばＤｉｃｋｉｎｓｏｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３６：１０７９−１０９２ （１９９４）を参照されたい。
１０Ｆｎ３は、抗体に、具体的には抗体の可変領域に、構造的にも機能的にも類似している。１０Ｆｎ３ドメインは「抗体模倣物質」または「抗体様タンパク質」と記述することができるが、これらには従来の抗体より有利な点がいくつかある。特にこれらは、抗体と比べて、より良いフォールディング特性および熱安定性特性を示し、一定の条件下で適正なフォールディングを妨害または防止することが知られているジスルフィド結合を欠く。例示的な１０Ｆｎ３ベースの血清アルブミン結合物質は、主として、平均約６５℃のＴｍを有する単量体型である。
１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループは、免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似している。これらのループ領域中のアミノ酸配列の改変は、１０Ｆｎ３の結合特異性を変化させる。所望のターゲットに結合する分子を作製するために、ＡＢ、ＣＤおよびＥＦループ中に修飾を有する１０Ｆｎ３ドメインを作ることもできる。ループ外のタンパク質配列は、免疫グロブリンのフレームワーク領域に類似しており、１０Ｆｎ３の構造コンフォメーションにおいて役割を果たす。１０Ｆｎ３のフレームワーク様領域における改変は、リガンド結合が破壊されるほど構造コンフォメーションが改変されない限り、許容される。１０Ｆｎ３リガンド特異的結合物質を生成させるための方法は、高アフィニティＴＮＦα結合物質を開示するＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／０３４７８７、ＷＯ ０１／６４９４２、およびＷＯ ０２／０３２９２５、高アフィニティＶＥＧＦＲ２結合物質を開示するＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００８／０９７４９７、ならびに高アフィニティＩＧＦＩＲ結合物質を開示するＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００８／０６６７５２に記載されている。１０Ｆｎ３結合物質および結合物質の選択方法を議論しているさらなる参考文献には、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／０５６９１５、ＷＯ ０２／０８１４９７、およびＷＯ ２００８／０３１０９８、ならびに米国特許出願公開第２００３１８６３８５号が包含される。
上述のように、配列番号１の残基２１〜３０、５１〜５６、および７６〜８７に対応するアミノ酸残基は、それぞれＢＣ、ＤＥおよびＦＧループを規定する。しかし、ヒト血清アルブミンなどの所望のターゲットに対して強いアフィニティを有する１０Ｆｎ３結合物質を獲得するために、ループ領域内のあらゆる残基を修飾する必要があるわけではないことを、理解すべきである。例えば、本明細書に記載する実施例の多くでは、高アフィニティ１０Ｆｎ３結合物質を作製するために、ＢＣループのアミノ酸２３〜３０およびＤＥループのアミノ酸５２〜５５に対応する残基だけが修飾された。したがって、一定の実施形態では、ＢＣループを配列番号１の残基２３〜３０に対応するアミノ酸によって規定し、ＤＥループを、配列番号１の残基５２〜５５に対応するアミノ酸によって規定することができる。さらにまた、ループ領域中に挿入および欠失を加えてもなお、高アフィニティ１０Ｆｎ３結合物質を作製することができる。例えば配列番号４（ＳＡＢＡ１）は、ＦＧループが４つのアミノ酸欠失を含有する（すなわち配列番号１のアミノ酸２１〜２９に対応する１１残基が７つのアミノ酸で置き換えられている）ＨＳＡ結合物質の一例である。配列番号１１３は、ＦＧループがアミノ酸挿入を含有する（すなわち配列番号１のアミノ酸２１〜２９に対応する１１残基が１２個のアミノ酸で置き換えられている）ＨＳＡ結合物質の一例である。
したがって、いくつかの実施形態において、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧから選択される１つ以上のループは、野生型ヒト１０Ｆｎ３中の対応するループと比較して、長さが伸長または短縮されていてもよい。いくつかの実施形態において、ループの長さは、２〜２５アミノ酸分、伸長されていてもよい。いくつかの実施形態において、ループの長さは、１〜１１アミノ酸分、減少していてもよい。特に、１０Ｆｎ３のＦＧループが１２残基長であるのに対して、抗体重鎖中の対応するループは４〜２８残基の範囲にある。それゆえ、抗原結合を最適化するには、１０Ｆｎ３のＦＧループの長さを、抗原結合において最大限のフレキシビリティおよびアフィニティを得るために、長さも、配列も、４〜２８残基のＣＤＲ３範囲を網羅するように改変することができる。いくつかの実施形態では、インテグリン結合モチーフ「アルギニン−グリシン−アスパラギン酸」（ＲＧＤ）を、極性アミノ酸−中性アミノ酸−酸性アミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端に向かって）で置き換えることができる。
１０Ｆｎ３は一般に、配列番号１の１番目に対応するアミノ酸残基で始まる。しかし本発明にはアミノ酸欠失を有するドメインも包含される。いくつかの実施形態では、配列番号１の最初の８アミノ酸に対応するアミノ酸残基が欠失している。Ｎ末端またはＣ末端に追加の配列を付加することもできる。例えば、１０Ｆｎ３のＮ末端に、追加のＭＧ配列を置くことができる。通常、Ｍは切り離されて、Ｎ末端にＧが残るであろう。いくつかの実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインのＣ末端に伸長配列、例えばＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号５４）、ＥＩＥＫＰＳＱ（配列番号６０）、またはＥＩＤＫＰＳＱＬＥ（配列番号６１）を、置くことができる。そのようなＣ末端配列を、ここではテールまたは伸長部といい、本明細書においてさらに説明する。いくつかの実施形態では、Ｈｉｓ６タグをＮ末端またはＣ末端に置くことができる。
１０Ｆｎ３の非リガンド結合配列、すなわち「１０Ｆｎ３スキャフォールド」は、その１０Ｆｎ３がリガンド結合機能および／または構造安定性を保持するという条件の下で、改変することができる。いくつかの実施形態では、Ａｓｐ７、Ｇｌｕ９、およびＡｓｐ２３の１つ以上が、別のアミノ酸で、例えば非陰性荷電アミノ酸（例えばＡｓｎ、Ｌｙｓなど）で置き換えられる。これらの変異は、野生型と比べて中性ｐＨにおける変異型１０Ｆｎ３のより高い安定性を増進する効果を有すると報告されている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ０２／０４５２３参照）。１０Ｆｎ３スキャフォールドにおける追加の改変であって、有益または中立であるものは、種々開示されている。例えばＢａｔｏｒｉら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ２００２ １５（１２）：１０１５−２０；Ｋｏｉｄｅら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００１ ４０（３４）：１０３２６−３３を参照されたい。
１０Ｆｎ３スキャフォールドは、１つ以上の保存的置換によって修飾することができる。保存的置換により、リガンドに対する１０Ｆｎ３のアフィニティを実質的に改変することなく、１０Ｆｎ３スキャフォールド中のアミノ酸の５％、１０％、２０％、さらには３０％以上ものアミノ酸を改変することができる。例えば、スキャフォールドの修飾による、リガンドに対する１０Ｆｎ３結合物質の結合アフィニティの減少は、好ましくは、１００倍、５０倍、２５倍、１０倍、５倍、または２倍未満である。そのような変化は生体内での１０Ｆｎ３の免疫原性を改変するかもしれない。そして免疫原性が減少する場合、そのような変化は望ましいであろう。本明細書にいう「保存的置換」とは、対応する基準残基に物理的または機能的に類似する残基である。すなわち、保存的置換とその基準残基とは、類似するサイズ、形状、電荷、（共有結合または水素結合を形成する能力などといった）化学的性質などを有する。好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら， Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２（１９７８ ＆ Ｓｕｐｐ．）において許容される点突然変異に関して規定された基準を満たすものである。保存的置換の例は次のグループ内での置換である：（ａ）バリン、グリシン；（ｂ）グリシン、アラニン；（ｃ）バリン、イソロイシン、ロイシン；（ｄ）アスパラギン酸、グルタミン酸；（ｅ）アスパラギン、グルタミン；（ｆ）セリン、スレオニン；（ｇ）リジン、アルギニン、メチオニン；および（ｈ）フェニルアラニン、チロシン。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３スキャフォールドに基づく抗体様タンパク質を、次の配列：
ＥＶＶＡＡＴ（Ｘ）ａ ＳＬＬＩ（Ｘ）ｘ ＹＹＲＩＴＹＧＥ（Ｘ）ｂ ＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙ ＡＴＩ（Ｘ）ｃ ＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚ ＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号２）によって、広く定義することができる。配列番号２では、ＡＢループがＸａで表され、ＣＤループがＸｂで表され、ＥＦループがＸｃで表され、ＢＣループがＸｘで表され、ＤＥループがＸｙで表され、ＦＧループがＸｚで表される。Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸数の整数を表す。特に、ａは、１〜１５、２〜１５、１〜１０、２〜１０、１〜８、２〜８、１〜５、２〜５、１〜４、２〜４、１〜３、２〜３、または１〜２アミノ酸ぐらいであることができ、ｂ、ｃ、ｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７アミノ酸ぐらいであることができる。
好ましい実施形態では、ａが２アミノ酸、ｂが７アミノ酸、ｃが７アミノ酸、ｘが９アミノ酸、ｙが６アミノ酸、そしてｚが１２アミノ酸である。βストランドの配列は、配列番号１に示す対応するアミノ酸と比較して、７つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの置換、欠失または付加を有することができる。例示的一実施形態において、βストランドの配列は、配列番号１に示す対応するアミノ酸と比較して、７つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの保存的置換を有することができる。一定の実施形態では、コアアミノ酸残基が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、コアアミノ酸残基以外の残基に存在する。例示的実施形態では、それぞれ（Ｘ） ｘ 、（Ｘ） ｙ 、および（Ｘ） ｚ で表されるＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループが、下記の表２に示すＨＳＡ結合物質（すなわち、表２の配列番号４、８、１２、１６、２０、および２４〜４４）のいずれかに由来するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列を含むポリペプチドで置き換えられる。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３スキャフォールドに基づく抗体様タンパク質を、配列：
ＥＶＶＡＡＴＰＴＳＬＬＩ（Ｘ）ｘ ＹＹＲＩＴＹＧＥＴＧＧＮＳＰＶＱＥＦＴＶ（Ｘ）ｙ ＡＴＩＳＧＬＫＰＧＶＤＹＴＩＴＶＹＡＶ（Ｘ）ｚ ＩＳＩＮＹＲＴ（配列番号３）によって、広く定義することができる。配列番号３では、ＢＣループがＸｘで表され、ＤＥループがＸｙで表され、ＦＧループがＸｚで表される。Ｘは任意のアミノ酸を表し、Ｘに続く下付き文字はアミノ酸数の整数を表す。特にｘ、ｙおよびｚは、それぞれ独立して、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜８、５〜２０、５〜１５、５〜１０、５〜８、６〜２０、６〜１５、６〜１０、６〜８、２〜７、５〜７、または６〜７アミノ酸ぐらいであることができる。好ましい実施形態では、ｘが９アミノ酸、ｙが６アミノ酸、そしてｚが１２アミノ酸である。βストランドの配列は、配列番号１に示す対応するアミノ酸と比較して、７つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの置換、欠失または付加を有することができる。例示的一実施形態において、βストランドの配列は、配列番号１に示す対応するアミノ酸と比較して、７つ全てのスキャフォールド領域全体にわたって、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの保存的置換を有することができる。一定の実施形態では、コアアミノ酸残基が固定され、置換、保存的置換、欠失または付加はいずれも、コアアミノ酸残基以外の残基に存在する。例示的実施形態では、それぞれ（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙ、および（Ｘ）ｚで表されるＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループが、下記の表２に示すＨＳＡ結合物質（すなわち、表２の配列番号４、８、１２、１６、２０、および２４〜４４）のいずれかに由来するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列を含むポリペプチドで置き換えられる。
ＥＤテールを有する １０ Ｆｎ３ドメイン
ある態様において、本発明は、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（１０Ｆｎ３）ドメインを含むポリペプチドであって、１０Ｆｎ３ドメインが、（ｉ）野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して、ＡＢ、ＢＣ、ＣＤ、ＤＥ、ＥＦおよびＦＧループの１つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）野生型１０Ｆｎ３ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（ｉｉｉ）配列（ＥＤ）ｎを有するＣ末端テール（ここで、ｎは、２〜１０、２〜８、２〜５、３〜１０、３〜８、３〜７、３〜５、もしくは４〜７の整数であるか、またはｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０である）を含む、ポリペプチドを提供する。
一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１の残基９〜９４に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが配列番号１、２または３を含む。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、配列番号１のアミノ酸９〜９４を含む。
一定の実施形態では、ＥＤテールを有する１０Ｆｎ３ドメインが、Ｃ末端かつＥＤリピートの直前に、Ｅ、ＩまたはＥＩを含む。いくつかの実施形態では、ＥＤリピートが、１０Ｆｎ３ドメインの溶解度を向上させ、かつ／または１０Ｆｎ３ドメインの凝集を減少させる。
一定の実施形態では、ＥＤテールを有する１０Ｆｎ３ドメインが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのそれぞれに、修飾されたアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＥＤテールを有する１０Ｆｎ３ドメインが、１μＭ以下のＫＤで、所望のターゲットに結合する。
血清アルブミン結合物質
１０Ｆｎ３ドメインは、サイズが約１０ｋＤａと小さいため、腎臓濾過および分解によって、循環から迅速に浄化される（マウスにおいてｔ１／２＝１５〜４５分；サルにおいて３時間）。一定の態様において、本願は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合することで１０Ｆｎ３ドメインのｔ１／２を引き延ばす、１０Ｆｎ３ドメインを提供する。
ＨＳＡは、ヒトでは６００μＭの血清中濃度および１９日のｔ１／２を有する。ＨＳＡの長いｔ１／２は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によるそのリサイクリングが一因であると考えられている。ＨＳＡは、内皮細胞内へのエンドソーム取り込み後に、ｐＨ依存的にＦｃＲｎに結合する。この相互作用が再びＨＳＡを血流へとリサイクルさせることで、ＨＳＡをリソソーム分解から遠ざけている。ＦｃＲｎは、広く発現しており、このリサイクリング経路は構成的であると考えられる。大部分の細胞タイプでは、大半のＦｃＲｎが細胞内ソーティングエンドソーム中に存在する。ＨＳＡは、液相飲作用の非特異的機序によって容易にインターナライズされ、ＦｃＲｎにより、リソソームにおける分解からレスキューされる。エンドソームに見いだされる酸性ｐＨでは、ＦｃＲｎに対するＨＳＡのアフィニティが増加する（ｐＨ６．０において５μＭ）。ＦｃＲｎに結合すると、ＨＳＡは、リソソーム分解経路から遠ざけられ、ひとたび細胞表面へのトランスサイトーシスを受けて、細胞表面で放出される。
ある態様において、本開示は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３ドメインを含む抗体様タンパク質を提供する。例示的実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで、ＨＳＡに結合する。一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、５．５〜７．４のｐＨ範囲、２５℃または３７℃において、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで、ＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、７．４以上のｐＨでのＨＳＡに対する結合アフィニティと比べて、７．４未満のｐＨでは、ＨＳＡに、より強固に結合する。
一定の実施形態において、本明細書に記載するＨＳＡ結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、サル、ラット、またはマウスの１つ以上に由来する血清アルブミンにも結合しうる。一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭまたは１００ｐＭ未満のＫＤで、アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）またはカニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ）に結合する。
一定の実施形態において、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、ＨＳＡのドメインＩおよび／またはドメインＩＩに結合する。ある実施形態では、本明細書に記載する血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３タンパク質は、ＨＳＡのドメインＩＩＩに結合しない。
一定の実施形態では、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（ＳＡＢＡ）が、野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％または８５％の同一性を有する配列を含む。ある実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、またはＦＧループの少なくとも１つが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。もう一つの実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、またはＦＧループの少なくとも２つが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。もう一つの実施形態では、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの３つ全てが、野生型１０Ｆｎ３ドメインと比較して修飾されている。別の実施形態では、ＳＡＢＡが、表２に示す２６のコアＳＡＢＡ配列（すなわち配列番号４、８、１２、１６、２０、および２４〜４４）のいずれか１つまたは表２に示す伸長されたＳＡＢＡ配列（すなわち配列番号８９〜１１６、６×ＨＩＳタグを除く）のいずれか１つに対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本明細書に記載するＳＡＢＡは、それぞれ（Ｘ）ｘ、（Ｘ）ｙ、および（Ｘ）ｚで表されるＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループが、２６のコアＳＡＢＡ配列（すなわち、表２の配列番号４、８、１２、１６、２０、および２４〜４４）のいずれかに由来する明示されたＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループの各セットまたはそれら２６のコアＳＡＢＡ配列のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一な配列で置き換えられている、配列番号２または３に示す配列を含んでもよい。例示的実施形態において、本明細書に記載するＳＡＢＡは配列番号３によって規定され、２６のコアＳＡＢＡ配列（すなわち表２の配列番号４、８、１２、１６、２０、および２４〜４４）のいずれかに由来する一組のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループ配列を有する。そのようなＳＡＢＡのスキャフォールド領域は、配列番号１のスキャフォールドアミノ酸残基と比較して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの置換、保存的置換、欠失または付加を有しうる。例えばＳＡＢＡ１は配列番号４に示すコア配列を有し、それぞれ配列番号５〜７に示すＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを含む。それゆえに、ＳＡＢＡ１コアに基づくＳＡＢＡは、（Ｘ）ｘが配列番号５を含み、（Ｘ）ｙが配列番号６を含み、かつ（Ｘ）ｚが配列番号７を含む配列番号２または３を含みうる。他のＳＡＢＡコア配列に由来するＢＣ、ＤＥおよびＦＧループのセットを利用して、同様のコンストラクトが考えられる。そのようなＳＡＢＡのスキャフォールド領域は、配列番号１のスキャフォールドアミノ酸残基と比較して、０〜２０、０〜１５、０〜１０、０〜８、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、または０〜１個ぐらいの置換、保存的置換、欠失または付加を含みうる。そのＳＡＢＡが所望のＫＤで血清アルブミン、例えばＨＳＡに結合する能力を有する限り、そのようなスキャフォールド修飾を施すことができる。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ（例えば上述のＳＡＢＡコア配列またはそれに基づく配列）を修飾して、Ｎ末端伸長配列および／またはＣ末端伸長配列を含むようにすることができる。例示的な伸長配列を表２に示す。例えば、ＳＡＢＡ１．１と呼ばれる配列番号８９は、コアＳＡＢＡ１配列（配列番号４）を含み、Ｎ末端配列ＭＧＶＳＤＶＰＲＤＬＥ（配列番号４５、ＡｄＮＴ１と呼ばれる）とＣ末端配列ＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号５４、ＡｄＣＴ１と呼ばれる）とを伴う。ＳＡＢＡ１．１は、さらに、Ｃ末端にＨｉｓ６タグを含むが、Ｈｉｓ６タグは全く随意であって、Ｎ末端またはＣ末端伸長配列内のどこにおいてもよいと理解すべきである。さらに、表２に掲載する任意の所与のＳＡＢＡコア配列を修飾するために、表２に掲載する例示的Ｎ末端またはＣ末端伸長配列（配列番号４５〜６４および２１５）およびその変異体を、どれでも使用することができる。一定の実施形態では、表２に掲載するリンカー配列（配列番号６５〜８８、２１６〜２２１および３９７）を、Ｃ末端テール配列として、単独で、または配列番号５４〜６４または２１５の一つと組み合わせて、使用することができる。
一定の実施形態において、Ｃ末端伸長配列（「テール」とも呼ぶ）は、ＥおよびＤ残基を含み、８〜５０、１０〜３０、１０〜２０、５〜１０、および２〜４アミノ酸長であることができる。いくつかの実施形態では、テール配列は、配列がＥＤのタンデムリピートを含んでいるＥＤベースのリンカーを包含する。例示的実施形態において、テール配列は、２〜１０、２〜７、２〜５、３〜１０、３〜７、３〜５、３、４または５個のＥＤリピートを含む。一定の実施形態では、ＥＤベースのテール配列が、例えばＥＩ、ＥＩＤ、ＥＳ、ＥＣ、ＥＧＳ、およびＥＧＣなどといった追加のアミノ酸残基も包含する。そのような配列は、部分的に、既知のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）テール配列に基づき、例えば残基ＤおよびＫが除去されているＥＩＤＫＰＳＱ（配列番号５４）である。例示的実施形態において、ＥＤベースのテールは、ＥＤリピートの前にＥ、ＩまたはＥＩ残基を含む。
別の実施形態では、例えばＥＩＥＤＥＤＥＤＥＤＥＤがＧＳＧＳＧＳＧＳと接合されている配列番号１４７（ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１６）など、ＳＡＢＡ融合分子を設計する際に、テール配列を、必要に応じて他の既知リンカー配列（例えば表２の配列番号６５〜８８、２１６〜２２１および３９７）と組み合わせることができる。
血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（ＳＡＢＡ）の融合物
本発明の一態様は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（ＳＡＢＡ）と少なくとも１つの追加部分とを含むコンジュゲートを提供する。追加部分は、任意の診断、イメージング、または治療目的に役立ちうる。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡに融合される部分の血清中半減期が、ＳＡＢＡにコンジュゲートされていない当該部分の血清中半減期と比較して増加する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ融合物の血清中半減期が、ＳＡＢＡに融合されていない当該部分の血清中半減期と比較して、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１５００、１８００、１９００、２０００、２５００、または３０００％長い。別の実施形態では、ＳＡＢＡ融合物の血清中半減期が、ＳＡＢＡに融合されていない当該部分の血清中半減期より、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍大きい。いくつかの実施形態では、ＳＡＢＡ融合物の血清中半減期が、少なくとも２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ融合タンパク質が、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで、ＨＳＡに結合する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ融合タンパク質が、５．５〜７．４のｐＨ範囲、２５℃または３７℃において、３μＭ、２．５μＭ、２μＭ、１．５μＭ、１μＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭまたは１０ｐＭ未満のＫＤで、ＨＳＡに結合する。いくつかの実施形態では、ＳＡＢＡ融合タンパク質が、ｐＨ７．４における結合と比較して、７．４未満のｐＨでは、ＨＳＡに、より強固に結合する。
したがって本明細書に記載するＳＡＢＡ融合分子は、治療部分とＳＡＢＡとの融合物を作り出すことによって、治療部分（例えばＦＧＦ２１）の半減期を増加させるのに有用である。そのような融合分子は、その融合物に含有される治療部分の生物学的活性に応答する状態を処置するのに使用することができる。本発明では、次に挙げるタンパク質または分子のいずれかの調節不全によって引き起こされる疾患における、ＳＡＢＡ融合分子の使用が考えられる。
異種部分
いくつかの実施形態では、ＳＡＢＡが、小さな有機分子、核酸、またはタンパク質である第２の部分に融合される。いくつかの実施形態では、ＳＡＢＡが、受容体、受容体リガンド、ウイルスコートタンパク質、免疫系タンパク質、ホルモン、酵素、抗原、または細胞シグナリングタンパク質をターゲットとする治療部分に融合される。融合物は、第２部分をＳＡＢＡ分子のどちらか一方の端に、すなわちＳＡＢＡ−治療分子の配置または治療分子−ＳＡＢＡの配置で取り付けることによって、形成させることができる。
例示的実施形態では、治療部分が、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、Ｈｅｒ−１、Ｈｅｒ−２、Ｈｅｒ−３、ＥＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ−２、ＥＧＦ−３、α３、ｃＭｅｔ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＦＡ−Ｉ、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＣＯＳ、ＬＦＡ−Ｉ、ＩＬ−６、Ｂ７．１、Ｗｌ．２、ＯＸ４０、ＩＬ−Ｉｂ、ＴＡＣＩ、ＩｇＥ、ＢＡＦＦまたはＢＬｙｓ、ＴＰＯ−Ｒ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＩＬ−Ｉ−Ｒ１、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、補体受容体１、ＦＧＦａ、オステオポンチン、ビトロネクチン、エフリンＡ１−Ａ５、エフリンＢ１−Ｂ３、α−２−マクログロブリン、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦｂ、ＧＭＣＳＦ、ＳＣＦ、ｐ４０（ＩＬ１２／ＩＬ２３）、ＩＬＩｂ、ＩＬＩａ、ＩＬ１Ｒａ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２３、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、Ｆｌｔ３リガンド、４１ＢＢ、ＡＣＥ、ＡＣＥ−２、ＫＧＦ、ＦＧＦ−７、ＳＣＦ、ネトリン１，２、ＩＦＮａ，ｂ，ｇ、カスパーゼ２，３，７，８，１０、ＡＤＡＭ Ｓ１，Ｓ５，８，９，１５，ＴＳ１，ＴＳ５；アディポネクチン、ＡＬＣＡＭ、ＡＬＫ−Ｉ、ＡＰＲＩＬ、アネキシンＶ、アンギオゲニン、アンフィレギュリン、アンジオポエチン１，２，４、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂｃｌ−２、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＡＫ、ＢＣＡＭ、ＢＤＮＦ、ｂＮＧＦ、ｂＥＣＧＦ、ＢＭＰ２，３，４，５，６，７，８；ＣＲＰ、カドヘリン６，８，１１；カテプシンＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｌ，Ｓ，Ｖ，Ｘ；ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＧＰ２ｂ３ａ、ＧＨ受容体、ＲＳＶ Ｆタンパク質、ＩＬ−２３（ｐ４０、ｐ１９）、ＩＬ−１２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、α４−β１、α４−β７、ＴＮＦ／リンフォトキシン、ＩｇＥ、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＢＬＹＳ／ＢＡＦＦ、ＩＬ−２Ｒ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ジゴキシン、Ｒｈｏ（Ｄ）、水痘（Ｖａｒｉｃｅｌｌａ）、肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、ＣＭＶ、破傷風（Ｔｅｔａｎｕｓ）、ワクシニア（Ｖａｃｃｉｎｉａ）、抗毒素（Ａｎｔｉｖｅｎｏｍ）、ボツリヌス（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｔｒａｉｌ−Ｒ１、Ｔｒａｉｌ−Ｒ２、ｃＭｅｔ、ＴＮＦ−Ｒファミリー、例えばＬＡ ＮＧＦ−Ｒ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ９５、リンフォトキシンａ／ｂ受容体、ＷｓＩ−Ｉ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＢＡＦＦ、ＢＡＦＦ−Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６ ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＧＩＴＲ／［γ］ＮＦＲＳＦ１８、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１ ＩＢ、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫ Ｌ／ＴＮＦＳＦ１１、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦＳ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１ Ａ、Ｐｒｏ−ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ１Ａ、リンフォトキシンβ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ３、リンフォトキシンβ Ｒ（ＬＴｂＲ）／Ｆｃキメラ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＰＧＲＰ−Ｓ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＢ、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦＩＡ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡである。
特に興味深いのは、精製された形態で市販されているヒトターゲットタンパク質、ならびにこれらのターゲットタンパク質に結合するタンパク質である。以下はその例である：４ＥＢＰ１、１４−３−３ζ、５３ＢＰ１、２Ｂ４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、８Ｄ６Ａ、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、８−オキソ−ｄＧ、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド、Ａ２Ｂ５、アミノペプチダーゼＬＲＡＰ／ＥＲＡＰ２、Ａ３３、アミノペプチダーゼＮ／ＡＮＰＥＰ、Ａａｇ、アミノペプチダーゼＰ２／ＸＰＮＰＥＰ２、ＡＢＣＧ２、アミノペプチダーゼＰ１／ＸＰＮＰＥＰ１、ＡＣＥ、アミノペプチダーゼＰＩＬＳ／ＡＲＴＳ１、ＡＣＥ−２、アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ）、アクチン、アンフィレギュリン、β−アクチン、ＡＭＰＫα１／２、アクチビンＡ、ＡＭＰＫα１、アクチビンＡＢ、ＡＭＰＫα２、アクチビンＢ、ＡＭＰＫβ１、アクチビンＣ、ＡＭＰＫβ２、アクチビンＲＩＡ／ＡＬＫ−２、アンドロゲンＲ／ＮＲ３Ｃ４、アクチビンＲＩＢ／ＡＬＫ−４、アンギオゲニン、アクチビンＲＩＩＡ、アンジオポエチン−１、アクチビンＲＩＩＢ、アンジオポエチン−２、ＡＤＡＭ８、アンジオポエチン−３、ＡＤＡＭ９、アンジオポエチン−４、ＡＤＡＭ１０、アンジオポエチン様１、ＡＤＡＭ１２、アンジオポエチン様２、ＡＤＡＭ１５、アンジオポエチン様３、ＴＡＣＥ／ＡＤＡＭ１７、アンジオポエチン様４、ＡＤＡＭ１９、アンジオポエチン様７／ＣＤＴ６、ＡＤＡＭ３３、アンジオスタチン、ＡＤＡＭＴＳ４、アネキシンＡ１／アネキシンＩ、ＡＤＡＭＴＳ５、アネキシンＡ７、ＡＤＡＭＴＳ１、アネキシンＡ１０、ＡＤＡＭＴＳＬ−１／パンクチン（Ｐｕｎｃｔｉｎ）、アネキシンＶ、アディポネクチン／Ａｃｒｐ３０、ＡＮＰ、ＡＥＢＳＦ、ＡＰサイト（ＡＰ Ｓｉｔｅ）、アグリカン、ＡＰＡＦ−Ｉ、アグリン、ＡＰＣ、ＡｇＲＰ、ＡＰＥ、ＡＧＴＲ−２、ＡＰＪ、ＡＩＦ、ＡＰＬＰ−Ｉ、Ａｋｔ、ＡＰＬＰ−２、Ａｋｔｌ、アポリポタンパク質ＡＩ、Ａｋｔ２、アポリポタンパク質Ｂ、Ａｋｔ３、ＡＰＰ、血清アルブミン、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、ＡＬＣＡＭ、ＡＲＣ、ＡＬＫ−Ｉ、アルテミン、ＡＬＫ−７、アリールスルファターゼＡＪＡＲＳＡ、アルカリホスファターゼ、ＡＳＡＨ２／Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼ−２、α２ｕ−グロブリン、ＡＳＣ、α−１−酸性糖タンパク質、ＡＳＧＲ１、α−フェトプロテイン、ＡＳＫ１、ＡＬＳ、ＡＴＭ、エナメル芽細胞ＡＴＲＩＰ、ＡＭＩＣＡ／ＪＡＭＬ、オーロラ（Ａｕｒｏｒａ）Ａ、ＡＭＩＧＯ、オーロラＢ、ＡＭＩＧＯ２、アキシン（Ａｘｉｎ）−１、ＡＭＩＧＯ３、ＡｘＩ、アミノアシラーゼ／ＡＣＹ１、アズロシジン／ＣＡＰ３７／ＨＢＰ、アミノペプチダーゼＡ／ＥＮＰＥＰ、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＢＩＭ、Ｂ７−１／ＣＤ８０、６−ビオチン−１７−ＮＡＤ、Ｂ７−２／ＣＤ８６、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、Ｂ７−Ｈ２、ＢＬＩＭＰ１、Ｂ７−Ｈ３、ＢＩｋ、Ｂ７−Ｈ４、ＢＭＩ−Ｉ、ＢＡＣＥ−Ｉ、ＢＭＰ−１／ＰＣＰ、ＢＡＣＥ−２、ＢＭＰ−２、Ｂａｄ、ＢＭＰ−３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＭＰ−３ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ １３Ｃ、ＢＭＰ−４、Ｂａｇ−１、ＢＭＰ−５、ＢＡＫ、ＢＭＰ−６、ＢＡＭＢＩ／ＮＭＡ、ＢＭＰ−７、ＢＡＲＤ１、ＢＭＰ−８、Ｂａｘ、ＢＭＰ−９、ＢＣＡＭ、ＢＭＰ−１０、Ｂｃｌ−１０、ＢＭＰ−１５／ＧＤＦ−９Ｂ、Ｂｃｌ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、Ｂｃｌ−２関連タンパク質Ａ１、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、Ｂｃｌ−ｗ、ＢＭＰＲ−ＩＩ、Ｂｃｌ−ｘ、ＢＮＩＰ３Ｌ、Ｂｃｌ−ｘＬ、ＢＯＣ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＢＯＫ、ＢＤＮＦ、ＢＰＤＥ、ベンズアミド、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）、共通β鎖、Ｂ−Ｒａｆ、βＩＧ−Ｈ３、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ベータセルリン、ＢＲＣＡ１、β−ディフェンシン２、ＢＲＣＡ２、ＢＩＤ、ＢＴＬＡ、バイグリカン、Ｂｕｂ−１、Ｂｉｋ様キラータンパク質、ｃ−ｊｕｎ、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ｃ−Ｒｅｌ、ＣＤ９４、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＤ９７、ＣＩｑ Ｒ１／ＣＤ９３、ＣＤ１５１、ＣＩｑＴＮＦｌ、ＣＤ１６０、Ｃ１ｑＴＮＦ４、ＣＤ１６３、Ｃ１ｑＴＮＦ５、ＣＤ１６４、補体成分ＣＩｒ、ＣＤ２００、補体成分ＣＩｓ、ＣＤ２００ Ｒ１、補体成分Ｃ２、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、補体成分Ｃ３ａ、ＣＤ２３／ＦｃεＲＩＩ、補体成分Ｃ３ｄ、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、補体成分Ｃ５ａ、ＣＤ５Ｌ、カドヘリン−４／Ｒ−カドヘリン、ＣＤ６９、カドヘリン−６、ＣＤＣ２、カドヘリン−８、ＣＤＣ２５Ａ、カドヘリン−１１、ＣＤＣ２５Ｂ、カドヘリン−１２、ＣＤＣＰ１、カドヘリン−１３、ＣＤＯ、カドヘリン−１７、ＣＤＸ４、Ｅ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−１／ＣＤ６６ａ、Ｎ−カドヘリン、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｐ−カドヘリン、サーベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）１、ＶＥ−カドヘリン、ＣＦＴＲ、カルビンディンＤ、ｃＧＭＰ、カルシニューリンＡ、Ｃｈｅｍ Ｒ２３、カルシニューリンＢ、ケマリン、カルレティキュリン−２、ケモカインサンプラーパック、ＣａＭキナーゼＩＩ、キチナーゼ３様１、ｃＡＭＰ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、カンナビノイドＲ１、Ｃｈｋ１、カンナビノイドＲ２／ＣＢ２／ＣＮＲ２、Ｃｈｋ２、ＣＡＲ／ＮＲ１Ｉ３、ＣＨＬ−１／Ｌ１ＣＡＭ−２、炭酸脱水酵素Ｉ、コリンアセチルトランスフェラーゼ／ＣｂＡＴ、炭酸脱水酵素ＩＩ、コンドロレクチン、炭酸脱水酵素ＩＩＩ、コーディン、炭酸脱水酵素ＩＶ、コーディン様１、炭酸脱水酵素ＶＡ、コーディン様２、炭酸脱水酵素ＶＢ、ＣＩＮＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＶＩ、ＣＩＮＣ−２、炭酸脱水酵素ＶＩＩ、ＣＩＮＣ−３、炭酸脱水酵素ＶＩＩＩ、クラスピン、炭酸脱水酵素ＩＸ、クローディン−６、炭酸脱水酵素Ｘ、ＣＬＣ、炭酸脱水酵素ＸＩＩ、ＣＬＥＣ−Ｉ、炭酸脱水酵素ＸＩＩＩ、ＣＬＥＣ−２、炭酸脱水酵素ＸＩＶ、ＣＬＥＣＳＦ１３／ＣＬＥＣ４Ｆ、カルボキシメチルリジン、ＣＬＥＣＳＦ８、カルボキシペプチダーゼＡ１／ＣＰＡ１、ＣＬＦ−Ｉ、カルボキシペプチダーゼＡ２、ＣＬ−Ｐ１／ＣＯＬＥＣ１２、カルボキシペプチダーゼＡ４、クラスタリン、カルボキシペプチダーゼＢ１、クラスタリン様１、カルボキシペプチダーゼＥ／ＣＰＥ、ＣＭＧ−２、カルボキシペプチダーゼＸ１、ＣＭＶ ＵＬ１４６、カルジオトロフィン−１、ＣＭＶ ＵＬ１４７、カルノシンジペプチダーゼ１、ＣＮＰ、カロンテ（Ｃａｒｏｎｔｅ）、ＣＮＴＦ、ＣＡＲＴ、ＣＮＴＦ Ｒα、カスパーゼ、凝固第ＩＩ因子／トロンビン、カスパーゼ−１、凝固第ＩＩＩ因子／組織因子、カスパーゼ−２、凝固第ＶＩＩ因子、カスパーゼ−３、凝固第Ｘ因子、カスパーゼ−４、凝固第ＸＩ因子、カスパーゼ−６、凝固第ＸＩＶ因子／プロテインＣ、カスパーゼ−７、ＣＯＣＯ、カスパーゼ−８、コヒーシン、カスパーゼ−９、コラーゲンＩ、カスパーゼ−１０、コラーゲンＩＩ、カスパーゼ−１２、コラーゲンＩＶ、カスパーゼ−１３、共通γ鎖／ＩＬ−２ Ｒγ、カスパーゼペプチドインヒビター、ＣＯＭＰ／トロンボスポンジン−５、カタラーゼ、補体成分ＣＩｒＬＰ、β−カテニン、補体成分ＣＩｑＡ、カテプシン１、補体成分ＣＩｑＣ、カテプシン３、補体因子Ｄ、カテプシン６、補体因子Ｉ、カテプシンＡ、補体ＭＡＳＰ３、カテプシンＢ、コネキシン４３、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、コンタクチン−１、カテプシンＤ、コンタクチン−２／ＴＡＧ１、カテプシンＥ、コンタクチン−４、カテプシンＦ、コンタクチン−５、カテプシンＨ、コリン（Ｃｏｒｉｎ）、カテプシンＬ、コルヌリン（Ｃｏｒｎｕｌｉｎ）、カテプシンＯ、ＣＯＲＳ２６／Ｃ１ｑＴＮＦ，３、カテプシンＳ、ラット皮質幹細胞、カテプシンＶ、コルチゾール、カテプシンＸＩＴＪ？、ＣＯＵＰ−ＴＦ Ｉ／ＮＲ２Ｆ１、ＣＢＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ ＩＩ／ＮＲ２Ｆ２、ＣＣＩ、ＣＯＸ−Ｉ、ＣＣＫ−Ａ Ｒ、ＣＯＸ−２、ＣＣＬ２８、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＣＣＲ１、Ｃ反応性タンパク質、ＣＣＲ２、クレアチンキナーゼ筋型／ＣＫＭＭ、ＣＣＲ３、クレアチニン、ＣＣＲ４、ＣＲＥＢ、ＣＣＲ５、ＣＲＥＧ、ＣＣＲ６、ＣＲＥＬＤ１、ＣＣＲ７、ＣＲＥＬＤ２、ＣＣＲ８、ＣＲＨＢＰ、ＣＣＲ９、ＣＲＨＲ−Ｉ、ＣＣＲ１０、ＣＲＩＭ１、ＣＤ１５５／ＰＶＲ、クリプト（Ｃｒｉｐｔｏ）、ＣＤ２、ＣＲＩＳＰ−２、ＣＤ３、ＣＲＩＳＰ−３、ＣＤ４、クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）−２、ＣＤ４＋／４５ＲＡ−、ＣＲＴＡＭ、ＣＤ４＋／４５ＲＯ−、ＣＲＴＨ−２、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−／ＣＤ４４、ＣＲＹ１、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４、クリプティック（Ｃｒｙｐｔｉｃ）、ＣＤ５、ＣＳＢ／ＥＲＣＣ６、ＣＤ６、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＤ８、ＣＴＧＦ／ＣＣＮ２、ＣＤ８＋／４５ＲＡ−、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ８＋／４５ＲＯ−、キュビリン、ＣＤ９、ＣＸ３ＣＲ１、ＣＤ１４、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＸＣＬ１６、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＸＣＲ３、ＣＤ２８、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＸＣＲ５、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＸＣＲ６、ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１、シクロフィリンＡ、ＣＤ３４、Ｃｙｒ６１／ＣＣＮ１、ＣＤ３６／ＳＲ−Ｂ３、シスタチンＡ、ＣＤ３８、シスタチンＢ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、シスタチンＣ、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、シスタチンＤ、ＣＤ４３、シスタチンＥ／Ｍ、ＣＤ４４、シスタチンＦ、ＣＤ４５、シスタチンＨ、ＣＤ４６、シスタチンＨ２、ＣＤ４７、シスタチンＳ、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、シスタチンＳＡ、ＣＤ５５／ＤＡＦ、シスタチンＳＮ、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、シトクロムｃ、ＣＤ５９、アポシトクロムｃ、ＣＤ６８、ホロシトクロムｃ、ＣＤ７２、サイトケラチン８、ＣＤ７４、サイトケラチン１４、ＣＤ８３、サイトケラチン１９、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、サイトニン、Ｄ６、ＤＩＳＰ１、ＤＡＮ、Ｄｋｋ−１、ＤＡＮＣＥ、Ｄｋｋ−２、ＤＡＲＰＰ−３２、Ｄｋｋ−３、ＤＡＸ１／ＮＲ０Ｂ１、Ｄｋｋ−４、ＤＣＣ、ＤＬＥＣ、ＤＣＩＲ／ＣＬＥＣ４Ａ、ＤＬＬ１、ＤＣＡＲ、ＤＬＬ４、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ｄ−ルシフェリン、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＤＣ−ＳＩＧＮＲ／ＣＤ２９９、ＤＮＡポリメラーゼβ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＤＮＡＭ−Ｉ、ＤｃＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＤＤＲ１、ＤＮＥＲ、ＤＤＲ２、ドーパデカルボキシラーゼ／ＤＤＣ、ＤＥＣ−２０５、ＤＰＣＲ−Ｉ、デカペンタプレジック、ＤＰＰ６、デコリン、ＤＰＰ Ａ４、デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、デクチン−２／ＣＬＥＣ６Ａ、ＤＰＰＩＩ／ＱＰＰ／ＤＰＰ７、ＤＥＰ−１／ＣＤ１４８、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、デザートヘッジホッグ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、デスミン、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、デスモグレイン−１、ＤＳＣＡＭ、デスモグレイン−２、ＤＳＣＡＭ−Ｌ１、デスモグレイン−３、ＤＳＰＧ３、ディシェベルド−１、Ｄｔｋ、ディシェベルド−３、ダイナミン、ＥＡＲ２／ＮＲ２Ｆ６、ＥｐｈＡ５、ＥＣＥ−Ｉ、ＥｐｈＡ６、ＥＣＥ−２、ＥｐｈＡ７、ＥＣＦ−Ｌ／ＣＨＩ３Ｌ３、ＥｐｈＡ８、ＥＣＭ−Ｉ、ＥｐｈＢ１、エコチン、ＥｐｈＢ２、ＥＤＡ、ＥｐｈＢ３、ＥＤＡ−Ａ２、ＥｐｈＢ４、ＥＤＡＲ、ＥｐｈＢ６、ＥＤＧ−Ｉ、エフリン、ＥＤＧ−５、エフリン−Ａ１、ＥＤＧ−８、エフリン−Ａ２、ｅＥＦ−２、エフリン−Ａ３、ＥＧＦ、エフリン−Ａ４、ＥＧＦ Ｒ、エフリン−Ａ５、ＥＧＲ１、エフリン−Ｂ、ＥＧ−ＶＥＧＦ／ＰＫ１、エフリン−Ｂ１、ｅＩＦ２α、エフリン−Ｂ２、ｅＩＦ４Ｅ、エフリン−Ｂ３、ＥＩｋ−Ｉ、エピジェン（Ｅｐｉｇｅｎ）、ＥＭＡＰ−ＩＩ、エピモルフィン／シンタキシン２、ＥＭＭＰＲＩＮ／ＣＤ１４７、エピレギュリン、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ、ＥＰＲ−１／Ｘａ受容体、エンドカン（Ｅｎｄｏｃａｎ）、ＥｒｂＢ２、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＥｒｂＢ３、エンドグリカン（Ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎ）、Ｅ
ｒｂＢ４、エンドヌクレアーゼＩＩＩ、ＥＲＣＣ１、エンドヌクレアーゼＩＶ、ＥＲＣＣ３、エンドヌクレアーゼＶ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ＥＲＫ１、エンドレペリン（Ｅｎｄｏｒｅｐｅｌｌｉｎ）／パーレカン、ＥＲＫ２、エンドスタチン、ＥＲＫ３、エンドセリン−１、ＥＲＫ５／ＢＭＫ１、エングレイルド（Ｅｎｇｒａｉｌｅｄ）−２、ＥＲＲα／ＮＲ３Ｂ１、ＥＮ−ＲＡＧＥ、ＥＲＲβ／ＮＲ３Ｂ２、エンテロペプチダーゼ／エンテロキナーゼ、ＥＲＲγ／ＮＲ３Ｂ３、ＣＣＬ１１／エオタキシン、エリスロポエチン、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、エリスロポエチンＲ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＥＳＡＭ、ＥｐＣＡＭ／ＴＲＯＰ−１、ＥＲα／ＮＲ３Ａ１、ＥＰＣＲ、ＥＲβ／ＮＲ３Ａ２、Ｅｐｈ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、ＥｐｈＡ１、エキソストシン（Ｅｘｏｓｔｏｓｉｎ）様２／ＥＸＴＬ２、ＥｐｈＡ２、エキソストシン様３／ＥＸＴＬ３、ＥｐｈＡ３、ＦＡＢＰ１、ＦＧＦ−ＢＰ、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ Ｒ１−４、ＦＡＢＰ３、ＦＧＦ Ｒ１、ＦＡＢＰ４、ＦＧＦ Ｒ２、ＦＡＢＰ５、ＦＧＦ Ｒ３、ＦＡＢＰ７、ＦＧＦ Ｒ４、ＦＡＢＰ９、ＦＧＦ Ｒ５、補体因子Ｂ、Ｆｇｒ、ＦＡＤＤ、ＦＨＲ５、ＦＡＭ３Ａ、フィブロネクチン、ＦＡＭ３Ｂ、フィコリン−２、ＦＡＭ３Ｃ、フィコリン−３、ＦＡＭ３Ｄ、ＦＩＴＣ、線維芽細胞活性化タンパク質α／ＦＡＰ、ＦＫＢＰ３８、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、Ｆｌａｐ、Ｆａｓリガンド／ＴＮＦＳＦ６、ＦＬＩＰ、ＦＡＴＰ１、ＦＬＲＧ、ＦＡＴＰ４、ＦＬＲＴ１、ＦＡＴＰ５、ＦＬＲＴ２、ＦｃγＲＩ／ＣＤ６４、ＦＬＲＴ３、ＦｃγＲＩＩＢ／ＣＤ３２ｂ、Ｆｌｔ−３、ＦｃγＲＩＩＣ／ＣＤ３２ｃ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＦｃγＲＩＩＡ／ＣＤ３２ａ、フォリスタチン、ＦｃγＲＩＩＩ／ＣＤ１６、フォリスタチン様１、ＦｃＲＨ１／ＩＲＴＡ５、ＦｏｓＢ／Ｇ０Ｓ３、ＦｃＲＨ２／ＩＲＴＡ４、ＦｏｘＤ３、ＦｃＲＨ４／ＩＲＴＡ１、ＦｏｘＪ１、ＦｃＲＨ５／ＩＲＴＡ２、ＦｏｘＰ３、Ｆｃ受容体様３／ＣＤ１６−２、Ｆｐｇ、ＦＥＮ−Ｉ、ＦＰＲ１、フェチュインＡ、ＦＰＲＬ１、フェチュインＢ、ＦＰＲＬ２、酸性ＦＧＦ、ＣＸ３ＣＬ１／フラクタルカイン、塩基性ＦＧＦ、フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ）−１、ＦＧＦ−３、フリズルド−２、ＦＧＦ−４、フリズルド−３、ＦＧＦ−５、フリズルド−４、ＦＧＦ−６、フリズルド−５、ＦＧＦ−８、フリズルド−６、ＦＧＦ−９、フリズルド−７、ＦＧＦ−１０、フリズルド−８、ＦＧＦ−１１、フリズルド−９、ＦＧＦ−１２、Ｆｒｋ、ＦＧＦ−１３、ｓＦＲＰ−１、ＦＧＦ−１６、ｓＦＲＰ−２、ＦＧＦ−１７、ｓＦＲＰ−３、ＦＧＦ−１９、ｓＦＲＰ−４、ＦＧＦ−２０、フューリン、ＦＧＦ−２１、ＦＸＲ／ＮＲ１Ｈ４、ＦＧＦ−２２、Ｆｙｎ、ＦＧＦ−２３、Ｇ９ａ／ＥＨＭＴ２、ＧＦＲα−３／ＧＤＮＦ Ｒα−３、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα１、ＧＦＲα−４／ＧＤＮＦ Ｒα−４、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα２、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα４、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα５、ＧＬＩ−Ｉ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒα６、ＧＬＩ−２、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ１、ＧＬＰ／ＥＨＭＴ１、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ２、ＧＬＰ−Ｉ Ｒ、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒβ３、グルカゴン、ＧＡＢＡ−Ａ−Ｒγ２、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、ＧＡＢＡ−Ｂ−Ｒ２、ＧｌｕＲ１、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、ＧｌｕＲ２／３、ＧＡＤ２／ＧＡＤ６５、ＧｌｕＲ２、ＧＡＤＤ４５α、ＧｌｕＲ３、ＧＡＤＤ４５β、Ｇｌｕｔ１、ＧＡＤＤ４５γ、Ｇｌｕｔ２、ガレクチン−１、Ｇｌｕｔ３、ガレクチン−２、Ｇｌｕｔ４、ガレクチン−３、Ｇｌｕｔ５、ガレクチン−３ＢＰ、グルタレドキシン１、ガレクチン−４、グリシンＲ、ガレクチン−７、グリコホリンＡ、ガレクチン−８、グリピカン２、ガレクチン−９、グリピカン３、ＧａｌＮＡｃ４Ｓ−６ＳＴ、グリピカン５、ＧＡＰ−４３、グリピカン６、ＧＡＰＤＨ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇａｓ１、ＧＭ−ＣＳＦ Ｒα、Ｇａｓ６、ＧＭＦ−β、ＧＡＳＰ−１／ＷＦＩＫＫＮＲＰ、ｇｐ１３０、ＧＡＳＰ−２／ＷＦＩＫＫＮ、グリコーゲンホスホリラーゼＢＢ／ＧＰＢＢ、ＧＡＴＡ−Ｉ、ＧＰＲ１５、ＧＡＴＡ−２、ＧＰＲ３９、ＧＡＴＡ−３、ＧＰＶＩ、ＧＡＴＡ−４、ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１、ＧＡＴＡ−５、Ｇｒ−１／Ｌｙ−６Ｇ、ＧＡＴＡ−６、グラニュライシン、ＧＢＬ、グランザイムＡ、ＧＣＮＦ／ＮＲ６Ａ１、グランザイムＢ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、グランザイムＤ、Ｇ−ＣＳＦ、グランザイムＧ、Ｇ−ＣＳＦ Ｒ、グランザイムＨ、ＧＤＦ−Ｉ、ＧＲＡＳＰ、ＧＤＦ−３ ＧＲＢ２、ＧＤＦ−５、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）、ＧＤＦ−６、ＧＲＯ、ＧＤＦ−７、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯα、ＧＤＦ−８、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯβ、ＧＤＦ−９、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯγ、ＧＤＦ−１１、成長ホルモン、ＧＤＦ−１５、成長ホルモンＲ、ＧＤＮＦ、ＧＲＰ７５／ＨＳＰＡ９Ｂ、ＧＦＡＰ、ＧＳＫ−３α
／β、ＧＦＩ−Ｉ、ＧＳＫ−３α、ＧＦＲα−１／ＧＤＮＦ Ｒα−１、ＧＳＫ−３β、ＧＦＲα−２／ＧＤＮＦ Ｒα−２、ＥＺＦＩＴ、Ｈ２ＡＸ、ヒスチジン、Ｈ６０、ＨＭ７４Ａ、ＨＡＩ−Ｉ、ＨＭＧＡ２、ＨＡＩ−２、ＨＭＧＢ１、ＨＡＩ−２Ａ、ＴＣＦ−２／ＨＮＦ−１β、ＨＡＩ−２Ｂ、ＨＮＦ−３β／ＦｏｘＡ２、ＨＡＮＤ１、ＨＮＦ−４α／ＮＲ２ Ａ１、ＨＡＰＬＮ１、ＨＮＦ−４γ／ＮＲ２Ａ２、気道トリプシン様プロテアーゼ／ＨＡＴ、ＨＯ−１／ＨＭＯＸ１／ＨＳＰ３２、ＨＢ−ＥＧＦ、ＨＯ−２／ＨＭＯＸ２、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＨＰＲＧ、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、Ｈｒｋ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＨＲＰ−Ｉ、αＨＣＧ、ＨＳ６ＳＴ２、Ｈｃｋ、ＨＳＤ−Ｉ、ＨＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／Ｂ、ＨＳＤ−２、ＨＤＧＦ、ＨＳＰ１０／ＥＰＦ、ヘモグロビン、ＨＳＰ２７、ヘパソシン（Ｈｅｐａｓｓｏｃｉｎ）、ＨＳＰ６０、ＨＥＳ−１、ＨＳＰ７０、ＨＥＳ−４、ＨＳＰ９０、ＨＧＦ、ＨＴＲＡ／プロテアーゼＤｏ、ＨＧＦ活性化因子、ＨＴＲＡ１／ＰＲＳＳ１１、ＨＧＦ Ｒ、ＨＴＲＡ２／Ｏｍｉ、ＨＩＦ−Ｉα、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＨＩＦ−２α、ヒアルロナン、ＨＩＮ−１／セクレトグロブリン（Ｓｅｃｒｅｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）３Ａ１、４−ヒドロキシノネナール、Ｈｉｐ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＩＬ−１０、ｃＩＡＰ（汎（ｐａｎ））、ＩＬ−１０ Ｒα、ｃＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２、ＩＬ−１０ Ｒβ、ｃＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１、ＩＬ−１１、ＩＢＳＰ／シアロタンパク質ＩＩ、ＥＬ−１１ Ｒα、ＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４、ＩＬ−１２、ＩＣＡＭ−２／ＣＤ１０２、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３ ｐ４０、ＩＣＡＭ−３／ＣＤ５０、ＩＬ−１２ Ｒβ１、ＩＣＡＭ−５、ＩＬ−１２ Ｒβ２、ＩＣＡＴ、ＩＬ−１３、ＩＣＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα１、イズロン酸２−スルファターゼ／ＥＯＳ、ＩＬ−１３ Ｒα２、ＥＦＮ、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１５ Ｒα、ＩＦＮ−α１、ＩＬ−１６、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−α４ｂ、ＩＬ−１７ Ｒ、ＩＦＮ−αＡ、ＩＬ−１７ ＲＣ、ＩＦＮ−α Ｂ２、ＩＬ−１７ ＲＤ、ＩＦＮ−α Ｃ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＦＮ−α Ｄ、ＩＬ−１７Ｂ Ｒ、ＩＦＮ−α Ｆ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＦＮ−α Ｇ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＦＮ−α Ｈ２、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＦＮ−α 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Ｒ、ジャギド（Ｊａｇｇｅｄ）１、ＪＡＭ−４／ＩＧＳＦ５、ジャギド２、ＪＮＫ、ＪＡＭ−Ａ、ＪＮＫ１／ＪＮＫ２、ＪＡＭ−Ｂ／ＶＥ−ＪＡＭ、ＪＮＫ１、ＪＡＭ−Ｃ、ＪＮＫ２、キニノーゲン、カリクレイン３／ＰＳＡ、キニノスタチン（Ｋｉｎｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、カリクレイン４、ＫＥＲ／ＣＤ１５８、カリクレイン５、ＫＥＲ２ＤＬ１、カリクレイン６／ニューロシン、ＫＩＲ２ＤＬ３、カリクレイン７、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＣＤ１５８ｄ、カリクレイン８／ニューロプシン、ＫＩＲ２ＤＳ４、カリクレイン９、ＫＩＲ３ＤＬ１、血漿カリクレイン／ＫＬＫＢ１、ＫＥＲ３ＤＬ２、カリクレイン１０、Ｋｉｒｒｅｌ２、カリクレイン１１、ＫＬＦ４、カリクレイン１２、ＫＬＦ５、カリクレイン１３、ＫＬＦ６、カリクレイン１４、クロトー（クロトー）、カリクレイン１５、クロトーβ、ＫＣ、ＫＯＲ、Ｋｅａｐ１、クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）−１、ＫｅＩＩ、クレメン−２、ＫＧＦ／ＦＧＦ−７、ＬＡＧ−３、ＬＩＮＧＯ−２、ＬＡＩＲ１、リピン２、ＬＡＩＲ２、リポカリン−１、ラミニンα４、リポカリン−２／ＮＧＡＬ、ラミニンγ１、５−リポキシゲナーゼ、ラミニンＩ、ＬＸＲα／ＮＲ１Ｈ３、ラミニンＳ、ＬＸＲβ／ＮＲ１Ｈ２、ラミニン−１、リビン（Ｌｉｖｉｎ）、ラミニン−５、ＬＥＸ、ＬＡＭＰ、ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ、ランゲリン、ＬＭＩＲ２／ＣＤ３００ｃ、ＬＡＲ、ＬＭＩＲ３／ＣＤ３００ＬＦ、ラテキシン（Ｌａｔｅｘｉｎ）、ＬＭＩＲ５／ＣＤ３００ＬＢ、レーイリン（Ｌａｙｉｌｉｎ）、ＬＭＩＲ６／ＣＤ３００ＬＥ、ＬＢＰ、ＬＭＯ２、ＬＤＬ Ｒ、ＬＯＸ−１／ＳＲ−ＥＩ、ＬＥＣＴ２、ＬＲＨ−１／ＮＲ５Ａ２、ＬＥＤＧＦ、ＬＲＩＧ１、レフティー（Ｌｅｆｔｙ）、ＬＲＩＧ３、レフティー−１、ＬＲＰ−Ｉ、レフティー−Ａ、ＬＲＰ−６、レグマイン（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）、ＬＳＥＣｔｉｎ／ＣＬＥＣ４Ｇ、レプチン、ルミカン、レプチンＲ、ＣＸＣＬ１５／ラングカイン（Ｌｕｎｇｋｉｎｅ）、ロイコトリエンＢ４、ＸＣＬｌ／リンフォタクチン、ロイコトリエンＢ４ Ｒ１、リンフォトキシン、ＬＥＦ、リンフォトキシンβ／ＴＮＦＳＦ３、ＬＩＦ Ｒα、リンフォトキシンβＲ／ＴＮＦＲＳＦ３、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、Ｌｙｎ、リミチン（Ｌｉｍｉｔｉｎ）、Ｌｙｐ、ＬＩＭＰＩＩ／ＳＲ−Ｂ２、リジルオキシダーゼホモログ２、ＬＩＮ−２８、ＬＹＶＥ−Ｉ、ＬＩＮＧＯ−Ｉ、α２−マクログロブリン、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＭＡＤ２Ｌ１、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ミンディン、ＭａｆＢ、鉱質コルチコイドＲ／ＮＲ３Ｃ２、ＭａｆＦ、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１αアイソフォームＬＤ７８β、ＭａｆＧ、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＭａｆＫ、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＭＡＧ／シグレック−４ａ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＭＡＮＦ、ＣＣＬ１５／ＭＥＰ−１δ、ＭＡＰ２、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１γ、ＭＡＰＫ、ＭＩＰ−２、マラプシン（Ｍａｒａｐｓｉｎ）／パンクレアシン（Ｐａｎｃｒｅａｓｉｎ）、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＭＡＲＣＫＳ、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＭＡＲＣＯ、ＭＩＰ−Ｉ、Ｍａｓｈ１、ＭＩＰ−ＩＩ、マトリリン−２、ＭＩＰ−ＩＩＩ、マトリリン−３、ＭＩＳ／ＡＭＨ、マトリリン−４、ＭＩＳ ＲＩＩ、マトリプターゼ／ＳＴ１４、ＭＩＸＬ１、ＭＢＬ、ＭＫＫ３／ＭＫＫ６、ＭＢＬ−２、ＭＫＫ３、メラノコルチン３Ｒ／ＭＣ３Ｒ、ＭＫＫ４、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６、ＭＫＫ６、ＭＣＫ−２、ＭＫＫ７、Ｍｃｌ−１、ＭＫＰ−３、ＭＣＰ−６、ＭＬＨ−Ｉ、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＭＬＫ４α、ＭＣＰ−１１、ＭＭＰ、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＭＭＰ−１、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＭＭＰ−２、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＭＭＰ−３、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＭＭＰ−７、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＭＰ−８、Ｍ−ＣＳＦ Ｒ、ＭＭＰ−９、ＭＣＶ−ＩＩ型、ＭＭＰ−１０、ＭＤ−Ｉ、ＭＭＰ−１１、ＭＤ−２、ＭＭＰ−１２、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＭＭＰ−１３、ＭＤＬ−１／ＣＬＥＣ５Ａ、ＭＭＰ−１４、ＭＤＭ２、ＭＭＰ−１５、ＭＥＡ−Ｉ、ＭＭＰ−１６／ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２４／ＭＴ５−ＭＭＰ、ＭＥＫ１、ＭＭＰ−２５／ＭＴ６−ＭＭＰ、ＭＥＫ２、ＭＭＰ−２６、メルシン（Ｍｅｌｕｓｉｎ）、ＭＭＲ、ＭＥＰＥ、ＭＯＧ、メプリンα、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、メプリンβ、Ｍ−Ｒａｓ／Ｒ−Ｒａｓ３、Ｍｅｒ、Ｍｒｅ１１、メソテリン、ＭＲＰ１ メテオリン（Ｍｅｔｅｏｒｉｎ）、ＭＳＫ１／ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ１、ＭＳＫ１、メチオニンアミノペプチダーゼ、ＭＳＫ２、メチオニンアミノペプチダーゼ２、ＭＳＰ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＭＳＰ Ｒ／Ｒｏｎ、ＭＦＲＰ、Ｍｕｇ、ＭｇｃＲａｃＧＡＰ、ＭＵＬＴ−Ｉ、ＭＧＬ２、ムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）−１、ＭＧＭＴ、ムサシ−２、ＭＩＡ、ＭｕＳＫ、ＭＩＣＡ、ＭｕｔＹ ＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＩＣＢ、ＭｙＤ８８、ＭＩＣＬ／ＣＬＥＣ１２Ａ、ミエロペルオキシダーゼ、β２ミクログロブリン、ミオカルディン、ミッドカイン、ミオシリン、ＭＩＦ、ミオグロビン、ＮＡＩＰ ＮＧＦＩ−Ｂγ／ＮＲ４Ａ３、ナノグ（Ｎａｎｏｇ）、ＮｇＲ２／ＮｇＲＨ１、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＮｇＲ３／ＮｇＲＨ２、Ｎｂｓ１、ナイドジェン−１／エンタクチン、ＮＣＡＭ−１／ＣＤ５６、ナイドジェン−２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、一酸化窒素、ネクチン−１、ニトロチロシン、ネクチン−２／ＣＤ１１２、ＮＫＧ２Ａ、ネクチン−３、ＮＫＧ２Ｃ、ネクチン−４、ＮＫＧ２Ｄ、ネオゲニン、ＮＫｐ３０、ネプリライシン／ＣＤ１０、ＮＫｐ４４、ネプリライシン−２／ＭＭＥＬ１／ＭＭＥＬ２、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１、ネスチン、ＮＫｐ８０／ＫＬＲＦ１、ＮＥＴＯ２、ＮＫＸ２．５、ネトリン−１、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ１サブユニット、ネトリン−２、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ａサブユニット、ネトリン−４、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｂサブユニット、ネトリン−Ｇ１ａ、ＮＭＤＡ Ｒ、ＮＲ２Ｃサブユニット、ネトリン−Ｇ２ａ、Ｎ−Ｍｅ−６，７−ｄｉＯＨ−ＴＩＱ、ニューレグリン−１／ＮＲＧ１、ノーダル（Ｎｏｄａｌ）、ニューレグリン−３／ＮＲＧ３、ノギン、ニューリチン（Ｎｅｕｒｉｔｉｎ）、Ｎｏｇｏ受容体、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｏｇｏ−Ａ、ニューロファシン、ＮＯＭＯ、ニューロゲニン−１、ノープ（Ｎｏｐｅ）、ニューロゲニン−２、ノリン（Ｎｏｒｒｉｎ）、ニューロゲニン−３、ｅＮＯＳ、ニューロリシン、ｉＮＯＳ、ニューロフィジンＩＩ、ｎＮＯＳ、ニューロピリン−１、ノッチ−１、ニューロピリン−２、ノッチ−２、ニュ
ーロポエチン（Ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ノッチ−３、ニューロトリミン（Ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ）、ノッチ−４、ニュールツリン、ＮＯＶ／ＣＣＮ３、ＮＦＡＭ１、ＮＲＡＧＥ、ＮＦ−Ｈ、ＮｒＣＡＭ、ＮＦｋＢ１、ＮＲＬ、ＮＦｋＢ２、ＮＴ−３、ＮＦ−Ｌ、ＮＴ−４、ＮＦ−Ｍ、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＮＧ２／ＭＣＳＰ、ＮＴＨ１、ＮＧＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１６、ヌクレオステミン（Ｎｕｃｌｅｏｓｔｅｍｉｎ）、β−ＮＧＦ、Ｎｕｒｒ−１／ＮＲ４Ａ２、ＮＧＦＩ−Ｂα／ＮＲ４Ａ１、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン（Ｏｓｔｅｏａｄｈｅｒｉｎ）、Ｏｌｉｇ１，２，３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン（Ｏｓｔｅｏｃｒｉｎ）、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、乏突起膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、乏突起膠細胞マーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン（Ｏｐｔｉｃｉｎ）、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＯＡＳ２、オレキシンＢ、ＯＢＣＡＭ、ＯＳＣＡＲ、ＯＣＡＭ、ＯＳＦ−２／ペリオスチン、ＯＣＩＬ／ＣＬＥＣ２ｄ、オンコスタチンＭ／ＯＳＭ、ＯＣＩＬＲＰ２／ＣＬＥＣ２ｉ、ＯＳＭ Ｒβ、Ｏｃｔ−３／４、オステオアクチビン／ＧＰＮＭＢ、ＯＧＧ１、オステオアドヘリン、Ｏｌｉｇ１，２，３、オステオカルシン、Ｏｌｉｇ１、オステオクリン、Ｏｌｉｇ２、オステオポンチン、Ｏｌｉｇ３、オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、乏突起膠細胞マーカーＯ１、Ｏｔｘ２、乏突起膠細胞マーカーＯ４、ＯＶ−６、ＯＭｇｐ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、オプチシン、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、オレキシンＡ、ＲＡＣＫ１、Ｒｅｔ、Ｒａｄ１、ＲＥＶ−ＥＲＢα／ＮＲ１Ｄ１、Ｒａｄ１７、ＲＥＶ−ＥＲＢβ／ＮＲ１Ｄ２、Ｒａｄ５１、Ｒｅｘ−１、Ｒａｅ−１、ＲＧＭ−Ａ、Ｒａｅ−１α、ＲＧＭ−Ｂ、Ｒａｅ−１β、ＲＧＭ−Ｃ、Ｒａｅ−１δ、Ｒｈｅｂ、Ｒａｅ−１ε、リボソームタンパク質Ｓ６、Ｒａｅ−１γ、ＲＩＰ１、Ｒａｆ−１、ＲＯＢＯ１、ＲＡＧＥ、ＲＯＢＯ２、ＲａｌＡ／ＲａｌＢ、ＲＯＢＯ３、ＲａｌＡ、ＲＯＢＯ４、ＲａｌＢ、ＲＯＲ／ＮＲ１Ｆ１−３（汎）、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＲＯＲα／ＮＲ１Ｆ１、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＲＯＲγ／ＮＲ１Ｆ３、Ｒａｐ１Ａ／Ｂ、ＲＴＫ様オーファン受容体１／ＲＯＲ１、ＲＡＲα／ＮＲ１Ｂ１、ＲＴＫ様オーファン受容体２／ＲＯＲ２、ＲＡＲβ／ＮＲ１Ｂ２、ＲＰ１０５、ＲＡＲγ／ＮＲ１Ｂ３、ＲＰ Ａ２、Ｒａｓ、ＲＳＫ（汎）、ＲＢＰ４、ＲＳＫ１／ＲＳＫ２、ＲＥＣＫ、ＲＳＫ１、Ｒｅｇ２／ＰＡＰ、ＲＳＫ２、Ｒｅｇ Ｉ、ＲＳＫ３、Ｒｅｇ ＩＩ、ＲＳＫ４、Ｒｅｇ ＩＩＩ、Ｒ−スポンジン１、Ｒｅｇ ＩＩＩａ、Ｒ−スポンジン２、Ｒｅｇ ＩＶ、Ｒ−スポンジン３、リラキシン−１、ＲＵＮＸ１／ＣＢＦＡ２、リラキシン−２、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１、リラキシン−３、ＲＵＮＸ３／ＣＢＦＡ３、ＲＥＬＭα、ＲＸＲα／ＮＲ２Ｂ１、ＲＥＬＭβ、ＲＸＲβ／ＮＲ２Ｂ２、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＲＸＲγ／ＮＲ２Ｂ３、レジスチン、Ｓ１００Ａ１０、ＳＬＩＴＲＫ５、Ｓ１００Ａ８、ＳＬＰＩ、Ｓ１００Ａ９、ＳＭＡＣ／ディアブロ（Ｄｉａｂｌｏ）、Ｓ１００Ｂ、Ｓｍａｄ１、Ｓ１００Ｐ、Ｓｍａｄ２、ＳＡＬＬ１、Ｓｍａｄ３、δ−サルコグリカン、Ｓｍａｄ４、Ｓｃａ−１／Ｌｙ６、Ｓｍａｄ５、ＳＣＤ−Ｉ、Ｓｍａｄ７、ＳＣＦ、Ｓｍａｄ８、ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＭＣ１、ＳＣＧＦ、α−平滑筋アクチン、ＳＣＬ／Ｔａｌｌ、ＳＭＵＧ１、ＳＣＰ３／ＳＹＣＰ３、Ｓｎａｉｌ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ナトリウム・カルシウム交換輸送体１、ＳＤＮＳＦ／ＭＣＦＤ２、Ｓｏｇｇｙ−１、α−セクレターゼ、ソニックヘッジホッグ、γ−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ１、β−セクレターゼ、ＳｏｒＣＳ３、Ｅ−セレクチン、ソルチリン、Ｌ−セレクチン、ＳＯＳＴ、Ｐ−セレクチン、ＳＯＸ１、セマフォリン３Ａ、ＳＯＸ２、セマフォリン３Ｃ、ＳＯＸ３、セマフォリン３Ｅ、ＳＯＸ７、セマフォリン３Ｆ、ＳＯＸ９、セマフォリン６Ａ、ＳＯＸ１０、セマフォリン６Ｂ、ＳＯＸ１７、セマフォリン６Ｃ、ＳＯＸ２１ セマフォリン６Ｄ、ＳＰＡＲＣ、セマフォリン７Ａ、ＳＰＡＲＣ様１、セパラーゼ、ＳＰ−Ｄ、セリン／スレオニンホスファターゼ基質Ｉ、スピネシン（Ｓｐｉｎｅｓｉｎ）、セルピンＡ１、Ｆ−スポンジン、セルピンＡ３、ＳＲ−ＡＩ／ＭＳＲ、セルピンＡ４／カリスタチン、Ｓｒｃ、セルピンＡ５／プロテインＣインヒビター、ＳＲＥＣ−Ｉ／ＳＲ−Ｆ１、セルピンＡ８／アンジオテンシノゲン、ＳＲＥＣ−ＩＩ、セルピンＢ５、ＳＳＥＡ−Ｉ、セルピンＣ１／アンチトロンビン−ＩＩＩ、ＳＳＥＡ−３、セルピンＤ１／ヘパリン補因子ＩＩ、ＳＳＥＡ−４、セルピンＥ１／ＰＡＩ−１、ＳＴ７／ＬＲＰ１２、セルピンＥ２、スタビリン（Ｓｔａｂｉｌｉｎ）−１、セルピンＦ１、スタビリン−２、セルピンＦ２、スタニオカルシン１、セルピンＧ１／Ｃ１インヒビター、スタニオカルシン２、セルピン１２、ＳＴＡＴ１、血清アミロイドＡ１、ＳＴＡＴ２、ＳＦ−１／ＮＲ５Ａ１、ＳＴＡＴ３、ＳＧＫ、ＳＴＡＴ４、ＳＨＢＧ、ＳＴＡＴ５ａ／ｂ、ＳＨＩＰ、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＨＰ／ＮＲ０Ｂ２、ＳＴＡＴ５ｂ、ＳＨＰ−Ｉ、ＳＴＡＴ６、ＳＨＰ−２、ＶＥ−スタチン、ＳＩＧＩＲＲ、ステラ（Ｓｔｅｌｌａ）／Ｄｐｐａ３、シ
グレック（Ｓｉｇｌｅｃ）−２／ＣＤ２２、ＳＴＲＯ−Ｉ、シグレック−３／ＣＤ３３、サブスタンスＰ、シグレック−５、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、シグレック−６、スルファターゼ修飾因子１／ＳＵＭＦ１、シグレック−７、スルファターゼ修飾因子２／ＳＵＭＦ２、シグレック−９、ＳＵＭＯ１、シグレック−１０、ＳＵＭＯ２／３／４、シグレック−１１、ＳＵＭＯ３、シグレック−Ｆ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＳＩＧＮＲ１／ＣＤ２０９、スーパーオキシドジスムターゼ−１／Ｃｕ−Ｚｎ ＳＯＤ、ＳＩＧＮＲ４、スーパーオキシドジスムターゼ−２／Ｍｎ−ＳＯＤ、ＳＩＲＰβ１、スーパーオキシドジスムターゼ−３／ＥＣ−ＳＯＤ、ＳＫＩ、サバイビン、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、シナプシンＩ、スリーピング・ビューティ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ）トランスポザーゼ、シンデカン−Ｉ／ＣＤ１３８、Ｓｌｉｔ３、シンデカン−２、ＳＬＩＴＲＫ１、シンデカン−３、ＳＬＩＴＲＫ２、シンデカン−４、ＳＬＩＴＲＫ４、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＭＥＦＦ１／トモレギュリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）−１、ＴＡＯ２、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＰＰ１、ＴＮＦ−α／ＴＮＦＳＦ ＩＡ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＴＮＦ−β／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、タウ、ＴＮＦ ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦＩＡ、ＴＣ２１／Ｒ−Ｒａｓ２、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＣＡＭ−Ｉ、ＴＯＲ、ＴＣＣＲ／ＷＳＸ−１、ＴＰ−Ｉ、ＴＣ−ＰＴＰ、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、ＴＤＧ、ＴＲ、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＴＲα／ＮＲ１Ａ１、テネイシンＣ、ＴＲβ１／ＮＲ１Ａ２、テネイシンＲ、ＴＲ２／ＮＲ２Ｃ１、ＴＥＲ−１１９、ＴＲ４／ＮＲ２Ｃ２、ＴＥＲＴ、ＴＲＡ−１−８５、テスティカン（Ｔｅｓｔｉｃａｎ）１／ＳＰＯＣＫ１、ＴＲＡＤＤ、テスティカン２／ＳＰＯＣＫ２、ＴＲＡＦ−１、テスティカン３／ＳＰＯＣＫ３、ＴＲＡＦ−２、ＴＦＰＩ、ＴＲＡＦ−３、ＴＦＰＩ−２、ＴＲＡＦ−４、ＴＧＦ−α、ＴＲＡＦ−６、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＬＡＰ（ＴＧＦ−β１）、ＴＲＡＩＬ Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、潜在型ＴＧＦ−β１、ＴＲＡＩＬ Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、ＴＧＦ−β１．２、ＴＲＡＩＬ Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＴＧＦ−β２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、ＴＧＦ−β３、ＴｆＲ（トランスフェリンＲ）、ＴＧＦ−β５、アポ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｐ１、ホロ−トランスフェリン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｐ２、トラッピン（Ｔｒａｐｐｉｎ）−２／エラフィン、潜在型ＴＧＦ−β ｂｐ４、ＴＲＥＭ−１、ＴＧＦ−βＲＩ／ＡＬＫ−５、ＴＲＥＭ−２、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＴＲＥＭ−３、ＴＧＦ−βＲＩＩｂ、ＴＲＥＭＬ１／ＴＬＴ−１、ＴＧＦ−βＲＩＩＩ、ＴＲＦ−Ｉ、サーモライシン、ＴＲＦ−２、チオレドキシン−１、ＴＲＨ分解エクトエンザイム／ＴＲＨＤＥ、チオレドキシン−２、ＴＲＩＭ５、チオレドキシン−８０、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ、チオレドキシン様５／ＴＲＰ１４、ＴｒｋＡ、ＴＨＯＰ１、ＴｒｋＢ、トロンボモジュリン／ＣＤ１４１、ＴｒｋＣ、トロンボポエチン、ＴＲＯＰ−２、トロンボポエチンＲ、トロポニンＩペプチド３、トロンボスポンジン−１、トロポニンＴ、トロンボスポンジン−２、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、トロンボスポンジン−４、トリプシン１、サイモポエチン、トリプシン２／ＰＲＳＳ２、胸腺ケモカイン−１、トリプシン３／ＰＲＳＳ３、Ｔｉｅ−１、トリプターゼ−５／Ｐｒｓｓ３２、Ｔｉｅ−２、トリプターゼα／ＴＰＳ１、ＴＩＭ−Ｉ／ＫＩＭ−Ｉ／ＨＡＶＣＲ、トリプターゼβ−１／ＭＣＰＴ−７、ＴＩＭ−２、トリプターゼβ−２／ＴＰＳＢ２、ＴＩＭ−３、トリプターゼε／ＢＳＳＰ−４、ＴＩＭ−４、トリプターゼγ−１／ＴＰＳＧ１、ＴＩＭ−５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、ＴＩＭ−６、ＴＳＣ２２、ＴＩＭＰ−Ｉ、ＴＳＧ、ＴＩＭＰ−２、ＴＳＧ−６、ＴＩＭＰ−３、ＴＳＫ、ＴＩＭＰ−４、ＴＳＬＰ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＳＬＰ Ｒ、ＴＬＲ１、ＴＳＰ５０、ＴＬＲ２、β−ＩＩＩチューブリン、ＴＬＲ３、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２、ＴＬＲ４、ＴＷＥＡＫ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、ＴＬＲ５、Ｔｙｋ２、ＴＬＲ６、ホスホ−チロシン、ＴＬＲ９、チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＬＸ／ＮＲ２Ｅ１、チロシンホスファターゼ基質Ｉ、ユビキチン、ＵＮＣ５Ｈ３、Ｕｇｉ、ＵＮＣ５Ｈ４、ＵＧＲＰ１、ＵＮＧ、ＵＬＢＰ−Ｉ、ｕＰＡ、ＵＬＢＰ−２、ｕＰＡＲ、ＵＬＢＰ−３、ＵＲＢ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＶＤＥ、ＵＮＣ５Ｈ２、バニロイドＲ１、ＶＥＧＦ Ｒ、ＶＡＳＡ、ＶＥＧＦ Ｒ１／Ｆｌｔ−１、バソヒビン、ＶＥＧＦ Ｒ２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、バソリン（Ｖａｓｏｒｉｎ）、ＶＥＧＦ Ｒ３／ＦＵ−４、バソスタチン、バーシカン、Ｖａｖ−１、ＶＧ５Ｑ、ＶＣＡＭ−Ｉ、ＶＨＲ、ＶＤＲ／ＮＲ１Ｉ１、ビメンチン、ＶＥＧＦ、ビトロネクチン、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＬＤＬＲ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ｖＷＦ−Ａ２、ＶＥＧＦ−Ｄ、シヌクレイン−α、Ｋｕ７０、ＷＡＳＰ、Ｗｎｔ−７ｂ、ＷＩＦ−Ｉ、Ｗｎｔ−８ａ ＷＩＳＰ−１／ＣＣＮ４、Ｗｎｔ−８ｂ、ＷＮＫ１、Ｗｎｔ−９ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−９ｂ、Ｗｎｔ−３ａ、Ｗｎｔ−１０ａ、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−１０ｂ、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−１１、Ｗｎｔ−５ｂ、ｗｎｖＮＳ３、Ｗｎｔ７ａ、ＸＣＲ１、ＸＰＥ／ＤＤＢ１、ＸＥＤＡＲ、ＸＰＥ／ＤＤＢ２、Ｘｇ、ＸＰＦ、ＸＩＡＰ、ＸＰＧ、ＸＰＡ、ＸＰＶ、ＸＰＤ、ＸＲＣＣ１、Ｙｅｓ、ＹＹ１、ＥｐｈＡ４。
数多くのヒトイオンチャネルはとりわけ興味深いターゲットである。非限定的な例には、次に挙げるものが包含される：５−ヒドロキシトリプタミン３受容体Ｂサブユニット、５−ヒドロキシトリプタミン３受容体前駆体、５−ヒドロキシトリプタミン受容体３サブユニットＣ、ＡＡＤ１４タンパク質、アセチルコリン受容体タンパク質、αサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、βサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、δサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、εサブユニット前駆体、アセチルコリン受容体タンパク質、γサブユニット前駆体、酸感受性イオンチャネル３スプライス変異体ｂ、酸感受性イオンチャネル３スプライス変異体ｃ、酸感受性イオンチャネル４、ＡＤＰ−リボースピロホスファターゼ，ミトコンドリア前駆体、α１Ａ電位依存性カルシウムチャネル、アミロライド感受性カチオンチャネル１，神経性、アミロライド感受性カチオンチャネル２、神経性アミロライド感受性カチオンチャネル４アイソフォーム２、アミロライド感受性ナトリウムチャネル、アミロライド感受性ナトリウムチャネルαサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルβサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルδサブユニット、アミロライド感受性ナトリウムチャネルγ−サブユニット、アネキシンＡ７、アピカル（Ａｐｉｃａｌ）様タンパク質、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１０、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１１、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１４、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル１５、ＡＴＰ感受性内向き整流カリウムチャネル８、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１２．２サブユニット、カルシウムチャネルα１Ｅサブユニット・デルタ１９デルタ４０デルタ４６スプライス変異体、カルシウム活性化カリウムチャネルαサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット１、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット２、カルシウム活性化カリウムチャネルβサブユニット３、カルシウム依存性クロライドチャネル−１、カチオンチャネルＴＲＰＭ４Ｂ、ＣＤＮＡ ＦＬＪ９０４５３ ｆｉｓ，クローンＮＴ２ＲＰ３００１５４２，カリウムチャネル四量体化ドメイン含有６に高度に類似、ＣＤＮＡ ＦＬＪ９０６６３ ｆｉｓ，クローンＰＬＡＣＥ１００５０３１，細胞内クロライドチャネルタンパク質５に高度に類似、ＣＧＭＰ作動性カチオンチャネルβサブユニット、クロライドチャネルタンパク質、クロライドチャネルタンパク質２、クロライドチャネルタンパク質３、クロライドチャネルタンパク質４、クロライドチャネルタンパク質５、クロライドチャネルタンパク質６、クロライドチャネルタンパク質ＣｌＣ−Ｋａ、クロライドチャネルタンパク質ＣｌＣ−Ｋｂ、クロライドチャネルタンパク質、骨格筋、細胞内クロライドチャネル６、細胞内クロライドチャネルタンパク質３、細胞内クロライドチャネルタンパク質４、細胞内クロライドチャネルタンパク質５、ＣＨＲＮＡ３タンパク質、Ｃｌｃｎ３ｅタンパク質、ＣＬＣＮＫＢタンパク質、ＣＮＧＡ４タンパク質、カリン−５、サイクリックＧＭＰ作動性カリウムチャネル、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネル４、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルα３、環状ヌクレオチド作動性カチオンチャネルβ３、環状ヌクレオチド作動性嗅覚チャネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子、シトクロムＢ−２４５重鎖、ジヒドロピリジン感受性Ｌ型、カルシウムチャネルα−２／δサブユニット前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子３前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子５前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子６前駆体、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子７、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送調節因子８前駆体、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル１、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル２、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル３、Ｇタンパク質活性化内向き整流カリウムチャネル４、γ−アミノ酪酸受容体α−１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α４サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α５サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体α６サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体β３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体δサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体εサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体γ−１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体γ−３サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体πサブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体ρ１サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体ρ２サブユニット前駆体、γ−アミノ酪酸受容体θサブユニット前駆体、ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、グルタミン酸受容体１前駆体、グルタミン酸受容体２前駆体、グルタミン酸受容体３前駆体、グルタミン酸受容体４前駆体、グルタミン酸受容体７、グルタミン酸受容体Ｂ、グルタミン酸受容体δ１サブユニット前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型１前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型２前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型３前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型４前駆体、グルタミン酸受容体イオンチャネル型カイニン酸型５前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ａ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニット３Ｂ前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε１前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε２前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットε４前駆体、グルタミン酸［ＮＭＤＡ］受容体サブユニットζ１前駆体、グリシン受容体α１鎖前駆体、グリシン受容体α２鎖前駆体、グリシン受容体α３鎖前駆体、グリシン受容体β鎖前駆体、Ｈ／ＡＣＡリボ核タンパク質複合体サブユニット１、高親和性免疫グロブリンε受容体βサブユニット、仮想（Ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）タンパク質ＤＫＦＺｐ３１３１０３３４、仮想タンパク質ＤＫＦＺｐ７６１Ｍ１７２４、仮想タンパク質ＦＬＪ１２２４２、仮想タンパク質ＦＬＪ１４３８９、仮想タンパク質ＦＬＪ１４７９８、仮想タンパク質ＦＬＪ１４９９５、仮想タンパク質ＦＬＪ１６１８０、仮想タンパク質ＦＬＪ１６８０２、仮想タンパク質ＦＬＪ３２０６９、仮想タンパク質ＦＬＪ３７４０１、仮想タンパク質ＦＬＪ３８７５０、仮想タンパク質ＦＬＪ４０１６２、仮想タンパク質ＦＬＪ４１４１５、仮想タンパク質ＦＬＪ９０５７６、仮想タンパク質ＦＬＪ９０５９０、仮想タンパク質ＦＬＪ９０６２２、仮想タンパク質ＫＣＴＤ１５、仮想タンパク質ＭＧＣ１５６１９、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体１型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体２型、イノシトール１，４，５−三リン酸受容体３型、中間コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質４、内向き整流カリウムチャネル１３、内向き整流カリウムチャネル１６、内向き整流カリウムチャネル４、内向き整流Ｋ（＋）チャネル負調節因子Ｋｉｒ２．２ｖ、カイニン酸受容体サブユニットＫＡ２ａ、ＫＣＮＨ５タンパク質、ＫＣＴＤ１７タンパク質、ＫＣＴＤ２タンパク質、ケラチノサイト関連膜貫通タンパク質１、Ｋｖチャネル相互作用タンパク質４、メラスタチン１、膜タンパク質ＭＬＣ１、ＭＧＣ１５６１９タンパク質、ムコリピン（Ｍｕｃｏｌｉｐｉｎ）−１、ムコリピン−２、ムコリピン−３、多剤耐性関連タンパク質４、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体２Ｃサブユニット前駆体、ＮＡＤＰＨオキシダーゼホモログ１、Ｎａｖ１．５、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α１０サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α４サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α５サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α６サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α７サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質α９サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β２サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β３サブユニット前駆体、神経性アセチルコリン受容体タンパク質β４サブユニット前駆体、神経性電位依存性カルシウムチャネルα２Ｄサブユニット、Ｐ２Ｘプリン受容体１、Ｐ２Ｘプリン受容体２、Ｐ２Ｘプリン受容体３、Ｐ２Ｘプリン受容体４、Ｐ２Ｘプリン受容体５、Ｐ２Ｘプリン受容体６、Ｐ２Ｘプリン受容体７、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｂ、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｃ、膵カリウムチャネルＴＡＬＫ−Ｉｄ、ホスホレマン前駆体、プラスモリピン（Ｐｌａｓｍｏｌｉｐｉｎ）、多発性嚢胞腎２関連タンパク質、多発性嚢胞腎２様１タンパク質、多発性嚢胞腎２様２タンパク質、ＰＫＤＲＥＪ（Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｅｇｇ ｊｅｌｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）前駆体、ポリシスチン−２、カリウムチャネル調節因子、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１０、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー１７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー２、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー３、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー４、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー５、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー６、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー７、カリウムチャネルサブファミリーＫメンバー９、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質２、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質４、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質５、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１０、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有タンパク質１３、カリウムチャネル四量体化ドメイン含有１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＡメンバー６、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＢメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＢメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＣメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＤメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＥメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＦメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＧメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブ
ファミリーＧメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー６、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー７、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー８、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー４、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＫＱＴメンバー５、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳメンバー１、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＳ
メンバー３、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＶメンバー２、電位作動性カリウムチャネルサブファミリーＨメンバー７アイソフォーム２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル１、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル２、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル３、カリウム／ナトリウム過分極活性化環状ヌクレオチド作動性チャネル４、予想（Ｐｒｏｂａｂｌｅ）ミトコンドリア搬入受容体サブユニットＴＯＭ４０ホモログ、プリン作動性受容体Ｐ２Ｘ５アイソフォームＡ、推定（Ｐｕｔａｔｉｖｅ）４リピート電位作動性イオンチャネル、推定クロライドチャネルタンパク質７、推定ＧｌｕＲ６カイニン酸受容体、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体１、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体２、推定イオンチャネルタンパク質ＣＡＴＳＰＥＲ２変異体３、推定カリウムチャネル調節因子タンパク質変異体１、推定チロシン−プロテインホスファターゼＴＰＴＥ、リアノジン受容体１、リアノジン受容体２、リアノジン受容体３、ＳＨ３ＫＢＰ１結合タンパク質１、短型（Ｓｈｏｒｔ）一過性受容体電位チャネル１、短型一過性受容体電位チャネル４、短型一過性受容体電位チャネル５、短型一過性受容体電位チャネル６、短型一過性受容体電位チャネル７、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質１、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質２アイソフォームｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルタンパク質３アイソフォームｂ、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ２、小コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネルＳＫ３、ナトリウムチャネル、ナトリウムチャネルβ−１サブユニット前駆体、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＶ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＩＸ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｖ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＶＩＩＩ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質Ｘ型αサブユニット、ナトリウムチャネルタンパク質ＸＩ型αサブユニット、ナトリウム・クロライド活性化ＡＴＰ感受性カリウムチャネル、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼγ鎖、精子関連カチオンチャネル１、精子関連カチオンチャネル２アイソフォーム４、シンタキシン−１Ｂ１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＡメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー６、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＭメンバー７、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー１、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー２、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー３、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー４、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー５、一過性受容体電位カチオンチャネルサブファミリーＶメンバー６、一過性受容体電位チャネル４εスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル４ζスプライス変異体、一過性受容体電位チャネル７γスプライス変異体、腫瘍壊死因子α誘導タンパク質１内皮性、２ポアカルシウムチャネルタンパク質２、ＶＤＡＣ４タンパク質、電位作動性カリウムチャネルＫｖ３．２ｂ、電位作動性ナトリウムチャネルβ１Ｂサブユニット、電位依存性アニオンチャネル、電位依存性アニオンチャネル２、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質１、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質２、電位依存性アニオン選択的チャネルタンパク質３、電位依存性カルシウムチャネルγ１サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ２サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ３サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ４サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ５サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ６サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ７サブユニット、電位依存性カルシウムチャネルγ８サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα１Ｃサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルαＩＳサブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ１サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ２サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ３サブユニット、電位依存性Ｌ型カルシウムチャネルβ４サブユニット、電位依存性Ｎ型カルシウムチャネルα１Ｂサブユニット、電位依存性Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルα１Ａサブユニット、電位依存性Ｒ型カルシウムチャネルα１Ｅサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｇサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｈサブユニット、電位依存性Ｔ型カルシウムチャネルα１Ｉサブユニット、電位作動性Ｌ型カルシウムチャネルα１サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ１サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ２サブユニット、電位作動性カリウムチャネルβ３サブユニット、電位作動性カリウムチャネルＫＣＮＡ７。ヒト電位作動性ナトリウムチャネルのＮａｖｌ．ｘファミリーも特に有望なターゲットである。このファミリーには、例えばチャネルＮａｖｌ．６およびＮａｖｌ．８が包含される。
別の実施形態では、治療タンパク質がＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）であってもよい。例示的ＧＰＣＲには、次に挙げるものが包含されるが、これらに限定されるわけではない：クラスＡロドプシン様受容体、例えばムスカリン性（Ｍｕｓｅ．）アセチルコリン脊椎動物１型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物２型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物３型、ムスカリン性アセチルコリン脊椎動物４型；アドレノセプター（αアドレノセプター１型、αアドレノセプター２型、βアドレノセプター１型、βアドレノセプター２型、βアドレノセプター３型、ドーパミン脊椎動物１型、ドーパミン脊椎動物２型、ドーパミン脊椎動物３型、ドーパミン脊椎動物４型、ヒスタミン１型、ヒスタミン２型、ヒスタミン３型、ヒスタミン４型、セロトニン１型、セロトニン２型、セロトニン３型、セロトニン４型、セロトニン５型、セロトニン６型、セロトニン７型、セロトニン８型、セロトニンの他のタイプ、微量アミン、アンジオテンシン１型、アンジオテンシン２型、ボンベシン、ブラジキニン、Ｃ５ａアナフィラトキシン、Ｆｍｅｔ−ｌｅｕ−ｐｈｅ、ＡＰＪ様、インターロイキン８タイプＡ、インターロイキン８タイプＢ、インターロイキン８の他のタイプ、Ｃ−Ｃケモカイン１型〜１１型および他のタイプ、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（２型〜６型および他のタイプ）、Ｃ−Ｘ３−Ｃケモカイン、コレシストキニンＣＣＫ、ＣＣＫタイプＡ、ＣＣＫタイプＢ、他のＣＣＫ、エンドセリン、メラノコルチン（メラニン細胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、メラノコルチンホルモン）、ダッフィ抗原、プロラクチン放出ペプチド（ＧＰＲ１０）、神経ペプチドＹ（１型〜７型）、神経ペプチドＹ、他の神経ペプチドＹ、ニューロテンシン、オピオイド（Ｄ、Ｋ、Ｍ、Ｘ型）、ソマトスタチン（１型〜５型）、タキキニン（サブスタンスＰ（ＮＫ１）、サブスタンスＫ（ＮＫ２）、ニューロメジンＫ（ＮＫ３）、タキキニン様１、タキキニン様２、バソプレシン／バソトシン（１型〜２型）、バソトシン、オキシトシン／メソトシン、コノプレッシン、ガラニン様、プロテイナーゼ活性化様、オレキシンおよび神経ペプチドＦＦ、ＱＲＦＰ、ケモカイン受容体様、ニューロメジンＵ様（ニューロメジンＵ、ＰＲＸアミド）、ホルモンタンパク質（卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−絨毛性性腺刺激ホルモン、サイロトロピン、ゴナドトロピンＩ型、ゴナドトロピンＩＩ型）、オプシン（ロドプシン）、ロドプシン脊椎動物（１〜５型）、ロドプシン脊椎動物５型、ロドプシン節足動物、ロドプシン節足動物１型、ロドプシン節足動物２型、ロドプシン節足動物３型、ロドプシン軟体動物、ロドプシン，嗅覚（嗅覚ＩＩファミリー１〜１３）、プロスタグランジン（プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ１、プロスタグランジンＥ２／Ｄ２サブタイプＥＰ２、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ３、プロスタグランジンＥ２サブタイプＥＰ４、プロスタグランジンＦ２−α、プロスタサイクリン、トロンボキサン、アデノシン１型〜３型、プリン受容体、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１−４，６，１１ ＧＰＲ９１、プリン受容体Ｐ２ＲＹ５，８，９，１０ ＧＰＲ３５，９２，１７４、プリン受容体Ｐ２ＲＹ１２−１４ ＧＰＲ８７（ＵＤＰ−グルコース）、カンナビノイド、血小板活性化因子、性腺刺激ホルモン放出ホルモン、性腺刺激ホルモン放出ホルモンＩ型、性腺刺激ホルモン放出ホルモンＩＩ型、脂質動員ホルモン様、コラゾニン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンおよび分泌促進物質、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、成長ホルモン分泌促進物質様、脱皮トリガリングホルモン（ＥＴＨＲ）、メラトニン、リゾスフィンゴリピドおよびＬＰＡ（ＥＤＧ）、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−１、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−２、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−３、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−４、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−５、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−６、リゾホスファチジン酸Ｅｄｇ−７、スフィンゴシン１−リン酸Ｅｄｇ−８、他のＥｄｇ、ロイコトリエンＢ４受容体、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ１、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴ２、クラスＡオーファン／その他、推定神経伝達物質、ＳＲＥＢ、Ｍａｓがん原遺伝子およびＭａｓ関連（ＭＲＧ）、ＧＰＲ４５様、システイニルロイコトリエン、Ｇタンパク質共役胆汁酸受容体、遊離脂肪酸受容体（ＧＰ４０、ＧＰ４１、ＧＰ４３）、クラスＢセクレチン様、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、胃抑制ペプチド、グルカゴン、成長ホルモン放出ホルモン、副甲状腺ホルモン、ＰＡＣＡＰ、セクレチン、血管作用性腸管ポリペプチド、ラトロフィリン、ラトロフィリン１型、ラトロフィリン２型、ラトロフィリン３型、ＥＴＬ受容体、脳特異的血管新生インヒビター（ＢＡＩ）、メトセラ（Ｍｅｔｈｕｓｅｌａｈ）様タンパク質（ＭＴＨ）、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ（ＣＥＬＳＲ）、超高分子（Ｖｅｒｙ ｌａｒｇｅ）Ｇタンパク質共役受容体、クラスＣ代謝型グルタミン酸／フェロモン、代謝型グルタミン酸グループＩ〜ＩＩＩ、カルシウム感知様、細胞外カルシウム感知、フェロモン、他のカルシウム感知様、推定フェロモン受容体、ＧＡＢＡ−Ｂ、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ１、ＧＡＢＡ−Ｂサブタイプ２、ＧＡＢＡ−Ｂ様、オーファンＧＰＲＣ５、オーファンＧＰＣＲ６、ブライド・オブ・セブンレス（Ｂｒｉｄｅ ｏｆ ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ）タンパク質（ＢＯＳＳ）、味覚受容体（ＴｌＲ）、クラスＤ真菌フェロモン、真菌フェロモンＡ因子様（ＳＴＥ２、ＳＴＥ３）、真菌フェロモンＢ様（ＢＡＲ、ＢＢＲ、ＲＣＢ、ＰＲＡ）、クラスＥ ｃＡＭＰ受容体、眼白子症タンパク質、フリズルド／スムースンド（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ）ファミリー、フリズルドグループＡ（Ｆｚ１および２および４および５および７〜９）、フリズルドグループＢ（Ｆｚ３および６）、フリズルドグループＣ（その他）、鋤鼻受容体、線虫化学受容体、昆虫匂い受容体、およびクラスＺ古細菌／細菌／真菌オプシン。
別の実施形態において、本明細書に記載するＳＡＢＡ融合物は、次に挙げる活性ポリペプチドをどれでも含むことができる：ボトックス（ＢＯＴＯＸ）、マイオブロック（Ｍｙｏｂｌｏｃ）、ニューロブロック（Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ）、ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ）（または他の血清型のボツリヌス神経毒）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射剤）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（Ｓｕｎｔｏｒｙ）（ガンマ−Ｉａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、エプトテルミンアルファ、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射用（骨疾患）、カルシトニン（点鼻用、骨粗鬆症）、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｌｕｔａｍｅｒ）２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所外用ゲル、創傷治癒）、ＤＷＰ−４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノニン（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ）、エプタコグアルファ（活性型）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ）、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、アルファネート（Ａｌｐｈａｎａｔｅ）、オクトコグアルファ、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インディキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ（ｎａｔｅｐｌａｓｅ）、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム、酢酸トリプトレリン、ヒストレリン（皮下インプラント、ハイドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド徐放性デポー（アトリゲル（ＡＴＲＩＧＥＬ））、ロイプロリドインプラント（デュロス（ＤＵＲＯＳ））、ゴセレリン、ソマトロピン、ユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ＫＰ−１０２プログラム（ｐｒｏｇｒａｍ）、ソマトロピン、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入薬）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリン（バッカル剤、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファベート（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ ｒｉｎｆａｂａｔｅ）、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド（ａｐｃｉｔｉｄｅ）注射剤、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、ベータセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、酢酸グラチラマー、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン、ロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Ｚｅｍａｉｒａ）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、ＮＯＶ−００２、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所外用ゲル）、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン（Ｔｒｉｃｏｍｉｎ）、組換えヒョウヒダニアレルギー脱感作注射剤、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４（皮下、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ（経口口中錠）、ＧＥＭ−２ ＩＳ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラート、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴール、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼインヒビター（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド（無針注射剤、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ ２０００）、ＶＧＶ−Ｉ、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入型、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン（ｏｍｉｇａｎａｎ）、オーログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、酢酸ペキシガナン、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキン・ベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｋｉｎ ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、ＦａｖＩｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、チファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＡＡ−４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ−４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）、ディアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（徐放性注射剤）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入型、ＡＩＲ）、インスリン（吸入型、テクノスフェア（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ））、インスリン（吸入型、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンベータ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンアルファ−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリン貼付薬、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン、エイズバックス（ＡＩＤＳＶＡＸ）、ＧＶ−１００１、リンフォスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド、ＭＰ５２（β−リン酸三カルシウム運搬体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプロイセルＴ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテスペン、ヒトトロンビン（凍結物、手術による出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン（静脈内、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ（注射用、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（ｄｕｒａｍｙｃｉｎ）（吸入型、嚢胞性線維症）、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボウマン・バーク・インヒビター・コンセントレート、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラライドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリクス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）（持続放出）、オザレリクス（ｏｚａｒｅｌｉｘ）、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０−４７９８、インターロイキン−４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン（ｉｂｏｃｔａｄｅｋｉｎ）、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジチド（ｃｉｌｅｎｇｉｔｉｄｅ）、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド（ｐａｓｉｒｅｏｔｉｄｅ）、ｈｕＮ９０１−ＤＭ１、卵巣がん免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入型）、ｒＡＡＴ（皮膚科用）、ＣＧＲＰ（吸入型、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンβ−４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−Ｉ、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（経口、エリジェン（ｅｌｉｇｅｎ））、カルシトニン（経口、骨粗鬆症）、エクサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、ＴＰ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）（局所外用）、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼ変異体、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、島細胞新生療法、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エクセナチド（放出制御剤、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＯＤ−９６０４、酢酸リナクロチオド、ＣＥＴｉ−Ｉ、ヘモスパン（Ｈｅｍｏｓｐａｎ）、ＶＡＬ（注射用）、速効性インスリン（注射用、Ｖｉａｄｅｌ）、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入型）、インスリン（経口、エリジェン（ｅｌｉｇｅｎ））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注射剤、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）（局所外用）、ｒＥＶ−１３１（眼科用）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７ ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンアルファ−ｎ３（局所外用）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン（Ｔａｕｆｅｒｏｎ）、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ）、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−Ｉ、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（ビロゾーム、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨアナログ（局所外用、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５ Ａワクチン（結核）、ＦＡＲ−４０４、ＢＡ−２１０、組換えペストＦ１Ｖワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶｌ、Ｄｅｒ−ｐｌ／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲンターゲティングワクチン（チリダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（がん）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１
、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚科、糖尿病性足病変潰瘍）、ルピントリビル、レティキュロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、Ｐ１Ａ、α−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療用ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的イムノトキシン（抗がん）、ＤＴ３８８ＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（局所外用）、Ｌ−１９に基づく放射免疫治療薬（がん）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／Ｉ５４０／ＫＬＨワクチン（がん）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（パルス抗原治療薬）、前立腺がんワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ２（注射用）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻腔内）、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（点鼻用、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１００１（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン（眼科用、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化（ＧｌｙｃｏＰＥＧｙｌａｔｅｄ）エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノキャンディン（Ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリクス（即放性）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（放出制御剤、バイオスフェア（Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ））、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ−４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣＩＯ、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少性障害）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（疼痛）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経
口テリパラチド（エリジェン（ｅｌｉｇｅｎ））、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（セラポア（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ））、ＥＰ−１０４３、肺炎レンサ球菌小児用ワクチン、マラリアワクチン、Ｂ群髄膜炎菌ワクチン、新生児Ｂ群連鎖球菌ワクチン、炭疽ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥｌ＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、がんワクチン、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的ＴＮＦ（固形腫瘍）、デスモプレシン（口腔粘膜放出制御剤）、オネルセプト、ＴＰ−９２０１。
他の例示的実施形態では、ＳＡＢＡが、次に挙げるもの（ただしこれらに限るわけではない）から選択される部分に融合される：ＦＧＦ２１（線維芽細胞成長因子２１）、ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）、エキセンディン４、インスリン、インスリン受容体ペプチド、ＧＩＰ（グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド）、アディポネクチン、ＩＬ−１Ｒａ（インターロイキン１受容体アンタゴニスト）、ＶＩＰ（血管作動性腸ペプチド）、ＰＡＣＡＰ（下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド）、レプチン、ＩＮＧＡＰ（膵島新生関連タンパク質）、ＢＭＰ−９（骨形成タンパク質−９）、アミリン、ＰＹＹ３−３６（ペプチドＹＹ３−３６）、ＰＰ（膵ポリペプチド）、ＩＬ−２１（インターロイキン２１）、プレクタシン、ＰＲＧＮ（プログラニュリン）、アトストリン（Ａｔｓｔｒｒｉｎ）、ＩＦＮ（インターフェロン）、アペリンおよびオステオカルシン（ＯＣＮ）。
他の例示的実施形態では、ＳＡＢＡが、１つ以上の追加１０Ｆｎ３ドメインに融合される。例えばＳＡＢＡは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上の追加１０Ｆｎ３ドメインに融合することができる。追加１０Ｆｎ３ドメインは、血清アルブミン以外の同じまたは異なるターゲットに結合することができる。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＹまたはＹ−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１ はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７の任意の１つが包含される）であり、Ｙは本明細書に記載する治療部分である］によって表すことができるＳＡＢＡ−Ｙ融合物を提供する。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＹまたはＹ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７の任意の１つが包含される）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表１に示す）であり、Ｙは本明細書に記載する治療部分である］によって表すことができるＳＡＢＡ−Ｙ融合物を提供する。例示的実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーがマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、治療部分をＳＡＢＡポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートするか、またはＳＡＢＡポリペプチドを治療部分のＣ末端にコンジュゲートすることができる。
別の態様では、ＳＡＢＡを２つ以上の治療部分に結合してもよい。例えば２つの部分を、例えば融合物配列のＮ末端からＣ末端に向かって次に挙げるようなさまざまな配置で、ＳＡＢＡに結合することができる：Ｘ−Ｙ−ＳＡＢＡ、Ｘ−ＳＡＢＡ−Ｙ、またはＳＡＢＡ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは２つの異なる治療部分を表す）。２つの異なる治療部分は、本明細書に開示する部分のどれからでも選択することができる。
１．ＦＧＦ２１
線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ２１）は、シグナリングタンパク質のＦＧＦファミリーのメンバーである。これらのタンパク質は、細胞表面チロシンキナーゼファミリーのメンバーであるＦＧＦ受容体に結合し、それを活性化することによって機能する。ＦＧＦ２１は、ヘパリンには結合しないが、活性には補助受容体として、１回膜貫通タンパク質であるβ−クロトー（ｋｌｏｔｈｏ）を必要とするので、このファミリーの非定型的メンバーである。これらの受容体は幅広い組織分布を有するが、β−クロトー発現は一定の組織（肝臓、脂肪および膵臓）に限られ、ＦＧＦ２１に対するターゲット特異性を付与するのはβ−クロトーの組織選択的発現である。白色脂肪組織および肝臓では、それぞれＦＧＦＲ１ｃ（ＦＧＦＲ１のアイソフォーム）およびＦＧＦＲ４が好ましい受容体であることが、インビトロ研究によって示される。
ＦＧＦ２１は代謝調整物質として機能し、ＦＧＦ２１の調節不全はさまざまな代謝障害につながりうる。ＦＧＦ２１は、ＥＲＫリン酸化およびＧＬＵＴ１発現を誘導することによって、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞および初代ヒト脂肪細胞培養物におけるグルコース取り込みを増加させる。ＩＮＳ−１Ｅ細胞および単離された島では、ＦＧＦ２１がＥＲＫおよびＡＫＴリン酸化を誘導する。肝臓細胞株では、ＦＧＦ２１が、典型的ＦＧＦシグナリング（ＥＲＫリン酸化）を刺激し、グルコース生産を減少させた。
以下にさらに説明するとおり、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、さまざまな代謝性疾患および代謝性障害を処置または防止するために使用することができる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＦＧＦ２１、および本明細書においてＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１などといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＦＧＦ２１には、ＦＧＦ２１の機能的活性を保持しているＦＧＦ２１の変異体、切断型（ｔｒａｎｃａｔｅ）、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＦＧＦ−２１には、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＦＧＦ２１の生物学的活性を保持している限り包含される。
例えば、野生型完全長ＦＧＦ２１を配列番号１１７に示す。表２に掲載するＦＧＦ２１変異体は全て、配列番号１１８に示すコアＦＧＦ２１配列を含有している。さまざまなＮ末端配列、例えば配列番号１１９〜１２４のいずれか１つに示すものを、コアＦＧＦ２１配列（配列番号１１８）のＮ末端に付加し、機能的活性を保持することができる。加えて、Ｈｉｓ６タグをＮ末端に付加してもよい（例えば配列番号１２８〜１３１）。コアＦＧＦ２１配列はＣ末端セリンを欠き、このＣ末端セリンはコア配列のＣ末端に付加しても付加しなくてもよく、その活性には影響しない。さらにまた、ＦＧＦ２１とＳＡＢＡの融合分子は、ＦＧＦ２１の機能的活性には影響を及ぼすことなく、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡまたはＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１（本明細書に記載する、および当技術分野において知られている、任意の、随意の末端伸長部およびリンカー配列を包含する）の順序で、接合することができる（例えば実施例Ｂ６を参照されたい）。
例示的実施形態において、本願は、ＦＧＦ２１部分が配列番号１１７〜１１８もしくは１２５〜１３１の配列、または配列番号１１７〜１１８もしくは１２５〜１３１のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、配列番号１３２〜１７４のいずれか１つの配列、または配列番号１３２〜１７４のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２１−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＦＧＦ２１は本明細書に記載するＦＧＦ２１ペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を提供する。
２．インスリン
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとインスリンとの融合分子を記載する。インスリンは、身体におけるエネルギー代謝およびグルコース代謝を調節するホルモンである。このポリペプチドは膵β島細胞によって血中に分泌され、血中では、肝臓、筋および脂肪細胞による血液からのグルコース取り込みを刺激し、グリコーゲン生成および脂質生成を促進する。インスリンの分泌および／または作用のいずれかのステップの機能不全は、酸素利用、脂肪生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコース取り込み、タンパク質合成、熱産生、および基礎代謝率の維持の調節不全などといった、多くの障害につながりうる。この機能不全は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高血糖、高脂質血症、高ケトン血、真性糖尿病、および糖尿病性腎症などといった（ただしこれらに限るわけではない）疾患および／または障害をもたらす。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−インスリン融合ポリペプチドは、そのような疾患および／または障害を有する対象を処置するのに役立ちうる。
例示的実施形態において、本発明に応用することができるインスリン部分には、天然インスリン、生合成インスリン、インスリン誘導体およびインスリンアナログが包含される。インスリンアナログは、ヒトインスリンまたは動物型インスリンなどの天然インスリンタンパク質のアナログであって、少なくとも１つのアミノ酸残基が置換、付加および／または除去されているものである。そのようなアミノ酸は合成または修飾アミノ酸であることができる。インスリン誘導体は、例えば１つ以上のアミノ酸への１つ以上の特別な化学基の付加などによって化学修飾されている、天然インスリンまたはインスリンアナログのどちらかの誘導体である。例示的インスリンアナログは、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第７，４７６，６５２号に記載されている。
３．インスリン受容体ペプチド
ある態様において、本発明は、ＳＡＢＡとインスリン受容体ペプチドとの融合分子を記載する。一定の実施形態では、インスリン受容体ペプチドが、インスリン受容体のアミノ酸６８７〜７１０（ＫＴＤＳＱＩＬＫＥＬＥＥＳＳＦＲＫＴＦＥＤＹＬＨ；配列番号１７５）を含む。インスリン受容体は、ホルモンであるインスリンによって活性化される膜貫通受容体チロシンキナーゼである。インスリン受容体の活性化は、最終的には細胞表面へのグルコース輸送体の輸送をもたらして細胞が血液からグルコースを取り込むことができるようにするシグナリングカスケードの引き金を引く。グルコースの取り込みは、主として脂肪細胞および筋細胞で起こる。インスリン受容体の機能障害は、細胞がグルコースを取り込むことができなくなった時に起こる２型真性糖尿病および他の合併症にしばしばつながるインスリン非感受性またはインスリン抵抗性と関連する。インスリン受容体遺伝子中の変異と関連する他の障害には、ドナヒュー症候群およびラブソン−メンデンホール症候群が包含される。それゆえに、本明細書に記載するＳＡＢＡ−インスリン受容体ペプチド融合物の例示的使用には、２型真性糖尿病または不十分な細胞グルコース取り込みに関連する他の障害、ドナヒュー症候群およびラブソン−メンデンホール症候群のような障害を有する対象の処置が包含されうる。
４．ＢＭＰ−９
一定の態様において、本発明は、ＳＡＢＡとＢＭＰ−９との融合分子を記載する。さまざまなＢＭＰ−９組成物が、引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第５，６６１，００７号および同第６，２８７，８１６号に記述されている。骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長因子およびサイトカインのＴＧＦ−βファミリーに属する。ＢＭＰは骨および軟骨の形成を誘導し、他の多くの組織における形態形成変化を媒介する。ＢＭＰシグナリングは、胚発生ならびに出生後組織の成長および維持には不可欠である。シグナリング経路は、脊椎障害から、がん、逆流性食道炎等まで、多岐にわたる疾患にも関連付けられている。
２０を越えるＢＭＰが発見されている。これらの分子のうち、ＢＭＰ−９は、主として非実質性肝臓細胞において発現しており、肝細胞の増殖と機能、特に肝グルコース生産に関係づけられている。ＢＭＰ−９は、がん細胞のアポトーシス、内皮細胞におけるシグナリング、骨形成、軟骨形成、認知等において、他の役割も果たすようである。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＢＭＰ−９融合ポリペプチドは、さまざまな疾患および障害、例えばさまざまなタイプの創傷および肝臓の変性を示す疾患などを処置するのに役立つと共に、骨および／または軟骨欠損、歯周病ならびにさまざまながんを包含する他の疾患および／または障害の処置にも役立つ。
５．アミリン
いくつかの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとアミリンとの融合分子を記載する。アミリン（または島アミロイドポリペプチド、ＩＡＰＰ）は、膵β細胞によって分泌される３７アミノ酸の小さいペプチドホルモンである。アミリンはインスリンと同時に分泌され、インスリン分泌、グルコースホメオスタシス、胃内容排出、および満腹シグナルの脳への伝達を制御する役割を果たすと考えられている。アミリンは、膵β細胞のアポトーシス細胞死に関係づけられているフィブリルを形成する。この知見と合致して、２型真性糖尿病を患っている患者または神経内分泌腫瘍であるインスリノーマを抱える患者の膵島には、アミリンがよく見いだされる。
アミリンは、真性糖尿病を有する患者のための治療薬として使用することができる。アミリンペプチドの調製は、引用により本明細書にそのまま組み込まれる米国特許第５，３６７，０５２号に記載されている。同様に、米国特許第６，６１０，８２４号および同第７，２７１，２３８号（これらは引用により本明細書にそのまま組み込まれる）には、低血糖状態を処置または防止するために使用することができる、Ａｓｎ、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒ残基のグリコシル化によって形成されたアミリンのアゴニストアナログが記載されている。したがって本明細書において記載するＳＡＢＡ−アミリン融合ポリペプチドは、例えば、低血糖、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患を有する対象の処置に役立ちうる。ＳＡＢＡ−アミリン融合物の調製については実施例で説明する。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたアミリン、および本明細書においてＳＡＢＡ−アミリン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−アミリン融合物は、例えばアミリンおよびアミリン−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−アミリン融合物が、アミリンペプチドのＣ末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。一定の例示的ＳＡＢＡ−アミリン融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するアミリンには、アミリンの機能的活性を保持しているアミリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するアミリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がアミリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的アミリン配列を、表２に配列番号２９６〜３０３として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、アミリン部分が配列番号２９６〜３０３のいずれか１つの配列、または配列番号２９６〜３０３のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−アミリン融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−アミリン融合物が、配列番号３０４〜３２８のいずれか１つの配列、または配列番号３０４〜３２８のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−アミリン［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、アミリンは本明細書に記載するアミリンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−アミリン融合物を提供する。好ましくはアミリンペプチドはＣ末端がアミド化されている。アミリンペプチドは、Ｃｙｓ１，７またはＣｙｓ２，７ジスルフィド結合を、さらに含んでもよい。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−アミリン［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１５〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表１に示す）であり、アミリンは本明細書に記載するアミリンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−アミリン融合物を提供する。好ましくは、アミリンペプチドはＣ末端がアミド化されている。
アミリンペプチドは、Ｃｙｓ１，７またはＣｙｓ２，７ジスルフィド結合を、さらに含んでもよい。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、アミリンペプチドをＳＡＢＡポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートすることができる。
６．ＰＹＹ ３−３６
別の態様において、本発明はＳＡＢＡとＰＹＹとの融合分子を記載する。ペプチドＹＹ（ＰＹＹ、ペプチドチロシンチロシン、または膵ペプチドＹＹとも呼ばれている）は、摂食に呼応して回腸および大腸中の細胞によって放出される３６アミノ酸タンパク質である。ＰＹＹは膵臓において分泌されて、例えばインスリンなどの膵分泌を阻害することで血中グルコースレベルの増加をもたらし、摂食量を減らす必要を知らせることによって、エネルギーホメオスタシスの制御を助ける。ＰＹＹには２つの主要形態、完全長型（１−３６）と切断型（３−３６）がある。循環ＰＹＹ免疫反応性の最も一般的な形態はＰＹＹ３−３６である。ＰＹＹ３−３６はＹ２受容体に対してＰＹＹ１−３６より高いアフィニティを有する。加えて、ＰＹＹ１３−３６もＹ２受容体において同様の高い力価を有することから、残基４〜１２は、この受容体では重要でないことが示唆される（Ｋ．ＭｃＣｒｅａら「２−３６［Ｋ４，ＲＹＹＳＡ（１９−２３）］ＰＰ ａ ｎｏｖｅｌ Ｙ５−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｅｆｅｒｒｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｗｉｔｈ ｓｔｒｏｎｇ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ」Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ ８７ １−３ （２０００）， ｐｐ．４７−５８）。さらにまた、他のＮＰＹ受容体（Ｙ１、Ｙ４およびＹ５）との比較でＹ２選択性を示す、ＰＹＹ（２２−３６）および（２５−３６）の構造に基づくさらに短いＰＹＹフラグメントアナログも記載されている。例えば、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６０４，２０３号および同第６，０４６，１６７号を参照されたい。反応性基にカップリングされたＰＹＹペプチドおよび機能的誘導体は、引用により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６０１，６９１号に記載されている。
ＰＹＹは、栄養の取り込み、細胞増殖、リポリーシス、および血管収縮などといった、いくつかの生理学的活動に関係づけられている。特にＰＹＹ３−３６は、ヒトにおいて食欲および食物摂取を減少させることが示されている（例えばＢａｔｔｅｒｈａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ４１８：６５６−６５４， ２００２を参照されたい）。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合ポリペプチドの例示的使用には、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患の処置が包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＰＹＹ、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＰＹＹおよびＰＹＹ−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物が、ＰＹＹペプチドのＣ末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。
一定の例示的ＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に記載するＰＹＹには、ＰＹＹの機能的活性を保持しているＰＹＹの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＰＹＹには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＰＹＹの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＰＹＹ配列を表２に配列番号３２９〜３３７および４０８〜４１８として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＰＹＹ部分が、配列番号３２９〜３３７もしくは４０８〜４１８のいずれか１つの配列；配列番号３２９〜３３７もしくは４０８〜４１８のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；配列番号３２９〜３３３もしくは３３５〜３３７のいずれか１つの残基３〜３６、１３〜３６、２１〜３６、２２〜３６、２４〜３６、または２５〜３６を有する配列；配列番号３２９〜３３３もしくは３３５〜３３７のいずれか１つの残基３〜３６、１３〜３６、２１〜３６、２２〜３６、２４〜３６、または２５〜３６を有する配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；またはＶ３１Ｌ置換を有する前述の配列のいずれか１つを含む、ＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物を提供する。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物が、配列番号３３８〜３４４のいずれか１つの配列、または配列番号３３８〜３４４のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＰＹＹ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＰＹＹは本明細書に記載するＰＹＹペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物を提供する。好ましくは、ＰＹＹペプチドはＣ末端がアミド化されている。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＰＹＹ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１５〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表１に示す）であり、ＰＹＹは本明細書に記載するＰＹＹペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＰＹＹ融合物を提供する。好ましくは、ＰＹＹペプチドはＣ末端がアミド化されている。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、ＰＹＹペプチドをＳＡＢＡポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートすることができる。
７．膵ポリペプチド
いくつかの態様において、本発明は、ＳＡＢＡと膵ポリペプチドとの融合分子を記載する。
膵ポリペプチド（ＰＰ）は膵ポリペプチドホルモンファミリーのメンバーであり、このファミリーには、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）およびペプチドＹＹ（ＰＹＹ）も包含される。ＰＰは、食事、運動、および絶食に呼応して膵ポリペプチド細胞によって放出される３６アミノ酸タンパク質である。ＰＰは、膵臓、消化管、およびＣＮＳに見いだされ、そこでは、胆嚢収縮、膵分泌、腸の運動性、ならびにグリコーゲン分解および脂質レベルの低下などといった代謝機能に影響を及ぼす。ＰＰは、食物摂取、エネルギー代謝、ならびに視床下部ペプチドおよび胃グレリンの発現にも関係づけられている。加えて、ＰＰは、食物摂取量の増加を伴う状態では減少する。ＰＰは、膵ペプチド細胞のまれな悪性腫瘍などの腫瘍形成にも関与しうる。
ＰＰは、例えば肝グルコース生産を減少させるために、患者に投与することができる（米国特許第５，８３０，４３４号）。本明細書に開示するＳＡＢＡ−ＰＰ融合ポリペプチドの例示的使用には、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、および心血管疾患の処置が包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＰＰ、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＰＰ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＰＰおよびＰＰ−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物が、ＰＰペプチドのＣ末端が遊離であるような配置をとり、これにより、カルボキシ末端のアミド化が可能になる。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＰＰには、ＰＰの機能的活性を保持しているＰＰの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＰＰには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＰＰの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＰＰ配列を、表２に配列番号３４５〜３５７として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＰＰ部分が、配列番号３４５〜３５７のいずれか１つの配列、または配列番号３４５〜３５７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物を提供する。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物が、配列番号３５８〜３６４のいずれか１つの配列、または配列番号３５８〜３６４のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＰＰ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＰＰは本明細書に記載するＰＰペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＰＰ融合物を提供する。好ましくは、ＰＰペプチドはＣ末端がアミド化されている。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＰＰ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１５〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表１に示す）であり、ＰＰは本明細書に記載するＰＰペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＰＰ融合物を提供する。
好ましくは、ＰＰペプチドはＣ末端がアミド化されている。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、ＰＰペプチドをＳＡＢＡポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートすることができる。
８．インターロイキン２１（ＩＬ−２１）
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとＩＬ−２１との融合分子を記載する。ＩＬ−２１は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９、およびＩＬ−１５と共通する受容体γ鎖を有するＩ型サイトカインである。ＩＬ−２１は、活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞において発現し、Ｔヘルパー細胞のＴｈ２およびＴｈ１７サブセット、濾胞性Ｔ細胞およびＮＫ Ｔ細胞においてアップレギュレートされる。このサイトカインは、これら全ての細胞タイプの機能を調節する役割を有する。Ｂ細胞もＩＬ−２１によって調節される。ＩＬ−２１は、共刺激シグナルとの相互関係およびＢ細胞の発生段階に依存して、マウスでもヒトでも、増殖、Ｉｇ生産形質細胞への分化、またはアポトーシスを誘導することができる。ＩＬ−２１は、単独で、またはＴｈ細胞由来サイトカインとの組合せで、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチ組換えを調節することができ、これは、ＩＬ−２１が、Ｂ細胞のエフェクター機能を形作る上で重要な役割を持つことを示している。このように、ＩＬ−２１は、免疫細胞に対するその複数の効果により、正常な免疫応答の多くの側面において役割を果たす。
免疫系の調節物質として、免疫系のアップレギュレーションが望まれる状況における数ある使用法の中でもとりわけ、がん治療用の免疫刺激物質としての（単独での、または他の治療法との組合せでの）ＩＬ−２１の使用、免疫療法の補助としての使用、およびウイルス治療としての使用が研究されている。臨床的にも前臨床的にも処置されたことがある具体的がんは、転移性黒色腫、腎細胞癌、大腸癌、膵癌、乳癌、胸腺腫（ｔｈｙｏｍａ）、頭頸部扁平上皮細胞癌、および神経膠腫である（総説としてＳｏｎｄｅｒｇａａｒｄ ａｎｄ Ｓｋａｋ， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ， ７４（６）：４６７−４７９， ２００９を参照されたい）。加えて、ＩＬ−２１のアップレギュレーションは、例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎、主要な形態の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）関連胃炎、セリアック病、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｔｈｙｅｍａｔｏｓｕｓ）、関節リウマチ、および乾癬などといった、Ｔ細胞が媒介するまたはＴ細胞と連関するさまざまなヒト炎症性病変とも結びつけられている（総説としてＭｏｎｔｅｌｅｏｎｅら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ， ３０（８）， ４４１−７， ２００９を参照されたい）。例示的ＩＬ−２１タンパク質は、米国特許第６，３０７，０２４号および同第７，４７３，７６５号に記載されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合ポリペプチドの例示的使用には、一定のタイプのがん、ウイルス関連疾患、ならびにＴ細胞が媒介するまたはＴ細胞と連関するさまざまな炎症性障害、例えばクローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎、主要な形態の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ヘリコバクター・ピロリ関連胃炎、セリアック病、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｔｈｙｅｍａｔｏｓｕｓ）、関節リウマチ、および乾癬の処置などが包含される。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＩＬ−２１、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＩＬ−２１およびＩＬ２１−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＩＬ−２１には、ＩＬ−２１の機能的活性を保持しているＩＬ−２１の変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＩＬ−２１には、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＩＬ−２１の生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＩＬ−２１配列を、表２に配列番号２８６〜２８７として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＩＬ−２１部分が、配列番号２８６〜２８７のいずれか１つの配列、または配列番号２８６〜２８７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物が、配列番号２９０〜２９５のいずれか１つの配列、または配列番号２９０〜２９５のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＩＬ２１またはＩＬ２１−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＩＬ２１は本明細書に記載するＩＬ−２１ペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＩＬ２１融合物を提供する。
９．グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）／エキセンディン−４
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとＧＬＰ−１との融合分子を記載する。グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）は、栄養摂取に呼応して腸内分泌Ｌ細胞から放出される３０アミノ酸または３１アミノ酸のペプチド（配列番号２２６および２２７）である。このホルモンは、複数の機序で作用して、グルコースホメオスタシスを調整し、抗糖尿病効果を発揮する。ＧＬＰ−１シグナリングは、動物モデルにおいて、グルコース依存的インスリン分泌を高め、グルカゴン分泌をグルコース依存的に阻害し、胃内容排出を遅らせ、食物摂取と体重の減少をもたらし、β細胞塊の増加を引き起こす。
ネイティブＧＬＰ−１の治療的有用性は、それが遍在性プロテアーゼであるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって迅速に分解されるせいで半減期が２分未満であることから、限定されている。ＤＰＰ−ＩＶは、２番目の位置にアラニンまたはプロリンを有するアミノ末端ジペプチドを優先的に切断するので、半減期を増加させるための戦略の一つは、活性ＧＬＰ−１における２番目のアミノ酸（位置８）を、ペプチドがもはやＤＰＰ−ＩＶ基質ではなくなるように改変することである。位置８におけるアラニンを、例えばグリシン、セリン、スレオニン、またはバリンなどといった、多種多様な天然（または非天然アミノ酸で置き換えることで、ＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１アナログを作製することができる。しかし、ＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１アナログは、腎クリアランスによって排除されるので、依然として比較的短い薬物動態半減期を有する。例えば、強力なＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１受容体アゴニストである合成エキセンディン−４（配列番号２２８；バイエッタ（Ｂｙｅｔｔａ）の活性医薬成分）は、腎臓によって迅速に浄化されるので、ヒト糖尿病患者では、依然として毎日２回投与しなければならない。
持効性ＧＬＰ−１受容体アゴニストを作製するためのもう一つのアプローチは、ＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１アナログを、アルブミンまたはトランスフェリンなどの長命タンパク質と同じオープンリーディングフレームで発現させることであった。そのような融合タンパク質の一つ、ヒト血清アルブミンに融合されたＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１アナログであるアルビグルチドは、現在、第ＩＩＩ相臨床治験において評価されているところである。報告された症例のすべてにおいて、活性な融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端にＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１受容体アゴニストを有しており、ｃ末端融合物は力価が著しく低い。
例示的実施形態において、ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＤＰＰ−ＩＶ耐性ＧＬＰ−１受容体アゴニスト（ＧＬＰ−１またはエキセンディン−４に基づく配列を潜在的に包含する）、リンカー、およびＳＡＢＡを含む。
ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１およびＳＡＢＡ−エキセンディン融合ポリペプチドの例示的使用には、糖尿病、肥満、過敏性腸症候群（ｉｎｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の処置、ならびに血漿中グルコースを低下させること、胃および／または腸の運動を阻害すること、ならびに胃および／または腸排出を阻害すること、または食物摂取を阻害することによって利益が得られるであろう他の状態の処置が包含される。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＧＬＰ−１またはエキセンディン、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１またはＳＡＢＡ−エキセンディン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１またはＳＡＢＡ−エキセンディン融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１−ＳＡＢＡ、ＳＡＢＡ−エキセンディンおよびエキセンディン−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１およびＳＡＢＡ−エキセンディン融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＧＬＰ−１およびエキセンディンには、ＧＬＰ−１またはエキセンディンの機能的活性を保持しているＧＬＰ−１およびエキセンディンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＧＬＰ−１およびエキセンディンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＧＬＰ−１またはエキセンディンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＧＬＰ−１配列を表２に配列番号２２６〜２２７として掲載し、例示的エキセンディン配列を表２に配列番号２２８として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＧＬＰ−１部分が、配列番号２２６〜２２７のいずれか１つの配列、または配列番号２２６〜２２７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１融合物が、配列番号２２９〜２３２のいずれか１つの配列、または配列番号２２９〜２３２のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＧＬＰ−１は本明細書に記載するＧＬＰ−１ペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＧＬＰ−１融合物を提供する。
例示的実施形態において、本願は、エキセンディン部分が、配列番号２２８、または配列番号２２８に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−エキセンディン融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−エキセンディン融合物が、配列番号２３３〜２３６のいずれか１つの配列、または配列番号２３３〜２３６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−エキセンディンまたはエキセンディン−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、エキセンディンは本明細書に記載するエキセンディンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−エキセンディン融合物を提供する。
１０．プレクタシン
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとプレクタシンとの融合分子を記載する。プレクタシンは、真菌である腐性子嚢菌クロチャワンタケ（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ ｎｉｇｒｅｌｌａ）から単離された新規殺細菌性抗微生物ペプチドである。インビトロで、プレクタシンは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）および肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を、通常の抗生物質に対して耐性である数多くの株を含めて、バンコマイシンにもペニシリンにも匹敵する速度で迅速に殺すことができるが、哺乳動物細胞に対する細胞傷害効果は伴わない。生体内でも、プレクタシンは、マウスにおいて極めて低い毒性を示し、肺炎レンサ球菌が引き起こす腹膜炎および肺炎をバンコマイシンおよびペニシリンと同じぐらい有効に治癒させることができる。例えばＭｙｇｉｎｄ ＰＨら「Ｐｌａｅｃｔａｓｉｎ ｉｓ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｒｏｍ ａ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｕｓ」Ｎａｔｕｒｅ ４３７：９７５−９８０ （２００５）；Ｂｒｉｎｃｈ ＫＳら「Ｐｌｅｃｔａｓｉｎ ｓｈｏｗｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＴＨＰ−１ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ ｍｏｄｅｌ」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５３：４８０１−４８０８ （２００９）；３． Ｈａｒａ Ｓら「Ｐｌｅｃｔａｓｉｎ ｈａｓ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｏ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｒ ＩＬ−８ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３７４：７０９−７１３ （２００８）；およびＯｓｔｅｒｇａａｒｄ Ｃら「Ｈｉｇｈ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ （ＣＳＦ） ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ＣＳＦ ｏｆ ＮＺ２１１４， ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌｅｃｔａｓｉｎ ｖａｒｉａｎｔ， ｄｕｒｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ」Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５３：１５８１−１５８５ （２００９）を参照されたい。これらの特徴を考えると、プレクタシンは、有望な抗生物質製品として役立つ魅力的な候補である。例えばＸｉａｏ−Ｌａｎ Ｊら「Ｈｉｇｈ−Ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｌｅｃｔａｓｉｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：１９７−２０２ （２０１０）を参照されたい。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−プレクタシン融合ポリペプチドは、抗細菌剤として使用することができる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたプレクタシン、および本明細書においてＳＡＢＡ−プレクタシン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−プレクタシン融合物は、例えばＳＡＢＡ−プレクタシンおよびプレクタシン−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−プレクタシン融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するプレクタシンには、プレクタシンの機能的活性を保持しているプレクタシンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するプレクタシンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がプレクタシンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的プレクタシン配列を表２に配列番号２３７として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、プレクタシン部分が、配列番号２３７、または配列番号２３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−プレクタシン融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−プレクタシン融合物が、配列番号２３８〜２３９のいずれか１つの配列、または配列番号２３８〜２３９のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−プレクタシンまたはプレクタシン−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、プレクタシンは本明細書に記載するプレクタシンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−プレクタシン融合物を提供する。
１１．プログラニュリン（ＰＲＧＮ）およびアトストリン
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとプログラニュリンまたはＳＡＢＡとアトストリンの融合分子を記載する。プログラニュリンと、プログラニュリン由来の３フラグメントを含む改変タンパク質であるアトストリンは、ＴＮＦシグナリングを拮抗する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体結合物質である。プログラニュリンおよびアトストリンは、関節炎のマウスモデルにおいて、炎症を防止する。例えばＴａｎｇ， Ｗ．ら「Ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ Ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＴＮＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇａｉｎｓｔ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｍｉｃｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＳｃｉｅｎｃｅＥｘｐｒｅｓｓ，Ｍａｒｃｈ １０， ２０１１， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌを参照されたい。どちらのタンパク質のＳＡＢＡ融合物も、ＴＮＦαが媒介する疾患のための潜在的治療薬でありうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたプログラニュリンまたはアトストリン、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＰＲＧＮまたはＳＡＢＡ−アトストリン融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＰＲＧＮまたはＳＡＢＡ−アトストリン融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＰＲＧＮ、ＰＲＧＮ−ＳＡＢＡ、ＳＡＢＡ−アトストリンおよびアトストリン−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＰＲＧＮおよびＳＡＢＡ−アトストリン融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するプログラニュリンおよびアトストリンには、プログラニュリンまたはアトストリンの機能的活性を保持しているプログラニュリンおよびアトストリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するプログラニュリンおよびアトストリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がプログラニュリンまたはアトストリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的プログラニュリン配列を、表２に配列番号２４０〜２４１として掲載し、例示的アトストリン配列を表２に配列番号２４２として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＰＲＧＮ部分が、配列番号２４０〜２４１のいずれか１つの配列、または配列番号２４０〜２４１のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＰＲＧＮ融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＰＲＧＮ融合物が、配列番号２４３〜２４６のいずれか１つの配列、または配列番号２４３〜２４６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＰＲＧＮまたはＰＲＧＮ−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＰＲＧＮは本明細書に記載するプログラニュリンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＰＲＧＮ融合物を提供する。
例示的実施形態において、本願は、アトストリン部分が、配列番号２４２、または配列番号２４２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−アトストリン融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−アトストリン融合物が、配列番号２４７〜２５０のいずれか１つの配列、または配列番号２４７〜２５０のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−アトストリンまたはアトストリン−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、アトストリンは本明細書に記載するアトストリンペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−アトストリン融合物を提供する。
１２．オステオカルシン（ＯＣＮ）
一定の態様において、本発明は、ＳＡＢＡとオステオカルシンとの融合分子を記載する。オステオカルシン（ＯＣＮ；骨Ｇｌａタンパク質、またはＢＧＰとも呼ばれている）は、骨芽細胞によって生産される４９アミノ酸タンパク質であり、血流および骨基質中に分泌される。血漿中ＯＣＮレベルは、概日周期、季節、性別、年齢および月経周期などといった生物学的変動の影響を受ける。ＯＣＮは、カルボキシル化型、非カルボキシル化型および低カルボキシル化型として存在し、非カルボキシル化型と低カルボキシル化型は、インスリン分泌、膵β細胞増殖を刺激し、インスリン感受性を高める（これは部分的にアディポネクチンによって媒介される）ことによって、エネルギー代謝の調節に関与している。インスリンは骨リモデリングを促進し、骨芽細胞におけるそのシグナリングは、循環への非カルボキシル化および／または低カルボキシル化ＯＣＮの放出を増加させ、ひいてはそれが、グルコースの取扱いを改善する。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合ポリペプチドは、酸素利用、脂肪生成、グリコーゲン生成、脂質生成、グルコース取り込み、タンパク質合成、熱産生、および基礎代謝率の維持の調節不全などといった、インスリン関連障害の処置に使用することができる。この機能不全は、高インスリン血症、インスリン抵抗性、インスリン欠乏、高血糖、高脂質血症、高ケトン血、真性糖尿病、および糖尿病性腎症などといった（ただしこれらに限るわけではない）疾患および／または障害をもたらす。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＯＣＮ、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＯＣＮおよびＯＣＮ−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＯＣＮには、ＯＣＮの機能的活性を保持しているＯＣＮの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＯＣＮには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＯＣＮの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＯＣＮ配列を、表２に配列番号３６５〜３７８として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＯＣＮ部分が、配列番号３６５〜３７８のいずれか１つの配列、または配列番号３６５〜３７８のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物が、配列番号３７９〜３９６のいずれか１つの配列、または配列番号３７９〜３９６のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＯＣＮまたはＯＣＮ−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＯＣＮは本明細書に記載するＯＣＮペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物を提供する。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＯＣＮまたはＯＣＮ−Ｘ１−Ｃｙｓ−Ｘ２−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１は随意のポリペプチドリンカー（適切なリンカーには、例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７の任意の１つが包含される）であり、Ｃｙｓはシステイン残基であり、Ｘ２は化学的に誘導されたスペーサー（適切なスペーサーの例を表１に示す）であり、ＯＣＮは本明細書に記載するＯＣＮペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＯＣＮ融合物を提供する。例示的実施形態において、化学的に誘導されたスペーサーはマレイミド部分を含有し、これを使って、本明細書においてさらに説明するマイケル付加反応により、ＯＣＮペプチドをＳＡＢＡポリペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートするか、またはＳＡＢＡポリペプチドをＯＣＮペプチドのＣ末端Ｃｙｓにコンジュゲートする事ができる。
１３．インターフェロンラムダ（ＩＦＮλ）
もう一つの態様において、本発明は、ＳＡＢＡとインターフェロン−ラムダ（ＩＦＮ−λ）との融合分子を記載する。ヒトインターフェロン（ＩＦＮ）は、３つの主要タイプ、すなわちＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型に分類される。Ｉ型ＩＦＮは、ウイルス感染に対する防御の最前線として発現する。Ｉ型ＩＦＮの主な役割は、ウイルス感染の最初の数日間におけるウイルスの蔓延を制限することで、その感染に対する強力な適応免疫応答が生成するための十分な時間を確保することである。ＩＩ型およびＩＩＩ型ＩＦＮは、Ｉ型ＩＦＮの抗ウイルス特性の一部を示す。
ＩＦＮ−λはＩＩＩ型ＩＦＮである。ヒトは、３つのＩＦＮ−λ分子、すなわちＩＦＮ−λ１（ＩＬ−２９）、ＩＦＮ−λ２（ＩＬ−２８Ａ）およびＩＦＮ−λ３（ＩＬ−２８Ｂ）をコードしている。ＵＳ７，１３５，１７０に記載されているように、ＩＬ−２８およびＩＬ−２９は、肝炎ウイルス感染の処置に有用であることが示されている。重要なことに、ＩＬ−２８およびＩＬ−２９は、既知のＩＦＮ治療法の使用に付随する毒性の一部を伴わずにこれらの抗ウイルス活性を有することが示された。Ｉ型ＩＦＮ治療に関係する毒性の一つは骨髄抑制である。これはＩ型ＩＦＮによる骨髄前駆細胞の抑制に起因している。ＩＬ−２９は、Ｉ型ＩＦＮ処置で見られるように骨髄細胞の拡充またはＢ細胞の増殖を有意に抑制することがないので、ＩＬ−２９には、処置に関連する毒性が少ないだろう。同様の結果が、ＩＬ−２８ＡおよびＩＬ−２８Ｂでも予期されるだろう。
したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＩＦＮ−λ融合ポリペプチドの例示的使用には、例えばＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびＤ型肝炎などのウイルス感染を含むウイルス感染を有する対象の処置が包含される。本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＩＦＮ−λ融合ポリペプチドは、呼吸器合胞体ウイルス、ヘルペスウイルス、エプシュタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ワクシニアウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ピチンデウイルスおよびポリオウイルスに関連するウイルス感染を処置するための抗ウイルス剤として使用することもできる。本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＩＦＮ−λ融合ポリペプチドは、慢性または急性ウイルス感染のどちらかを有する対象を処置するために使用することができる。
一定の実施形態において、本明細書に記載するＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物は、他の薬物動態部分、例えばＰＥＧなどに融合されたＩＦＮλポリペプチドより有益でありうる。特に、ここに提供するＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物は、ＰＥＧ−ＩＦＮλコンジュゲートと比べて、ＩＦＮλ分子の血清中半減期の有意な改善をもたらしうる。そのような半減期の増加により、頻度を下げた投与レジメンが可能になり、例えばＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物は、ＰＥＧ−ＩＦＮλコンジュゲートのような他のＩＦＮλ治療薬での、より頻繁な投薬、例えば週に１回の投薬と比べて、月に１回の投薬を可能にしうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたＩＦＮλ、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＩＦＮλおよびＩＦＮλ−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するＩＦＮλには、ＩＦＮλの機能的活性を保持しているＩＦＮλの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するＩＦＮλには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がＩＦＮλの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的ＩＦＮλ配列を、表２に配列番号２５１〜２５７として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、ＩＦＮλ部分が、配列番号２５１〜２５７のいずれか１つの配列、または配列番号２５１〜２５７のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物が、配列番号２５８〜２８５のいずれか１つの配列、または配列番号２５８〜２８５のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＩＦＮλまたはＩＦＮλ−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＩＦＮλは本明細書に記載するＩＦＮλペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＩＦＮλ融合物を提供する。
１４．アペリン
もう一つの態様において、本願は、ＳＡＢＡとアペリンとの融合分子を提供する。アペリンは、Ｇタンパク質共役受容体ＡＰＪの内在性リガンドである。アペリン遺伝子は、より短い活性フラグメントに切断される７７アミノ酸のプレプロタンパク質をコードしている。完全長成熟ペプチドはアペリン−３６であるが、アペリン−１７およびアペリン−１３も活性である（Ｍ Ｋｌｅｉｎｚら， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １０７：１９８−２１１ （２００５））。アペリンは、中枢神経系および末梢組織において広く発現しており、細胞発現には内皮細胞および脂肪細胞が包含される（前掲）。アペリンは、血管拡張をもたらし、心不全を有する患者の血行力学および心臓プロファイルを改善すると共に、前臨床モデルにおいてアテローム性動脈硬化を防止することが示されている（ＡＧ Ｊａｐｐら， Ｃｉｒｃ． １２１：１８１８−１８２７ （２０１０）；およびＨＹ Ｃｈｕｎら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１８： ３３４３−３３５４ （２００８））。加えて、アペリン投与は、糖尿病の前臨床モデルにおけるインスリン感受性の改善と関連する（Ｃ Ｄｒａｙら， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８：４３７−４４５ （２００８））。したがって、本明細書に記載するＳＡＢＡ−アペリン融合ポリペプチドの例示的使用には、糖尿病、肥満、摂食障害、インスリン抵抗性症候群および心血管疾患（例えば心不全、アテローム性動脈硬化、および高血圧）の処置がが包含されうる。
ある態様において、本願は、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３（すなわちＳＡＢＡ）に融合されたアペリン、および本明細書においてＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物と総称するそのような融合物の使用を提供する。ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物は、例えばＳＡＢＡ−ＡＰＬＮおよびＡＰＬＮ−ＳＡＢＡなどといった、さまざまな配置を有する融合物を指す。一定の例示的ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物コンストラクトを表２に示す。ただし、本明細書に開示するアペリンには、アペリンの機能的活性を保持しているアペリンの変異体、切断型、および任意の修飾型が包含されると理解すべきである。すなわち、本明細書に記載するアペリンには、一定のアミノ酸が欠失または置換されている修飾型（フラグメントを包含する）ならびに変異体、および１つ以上のアミノ酸が修飾アミノ酸または非天然アミノ酸に変えられている修飾、およびグリコシル化などの修飾も、その修飾型がアペリンの生物学的活性を保持している限り包含される。例示的アペリン配列を、表２に配列番号４１９〜４２３として掲載する。
例示的実施形態において、本願は、アペリン部分が、配列番号４１９〜４２３のいずれか１つの配列、または配列番号４１９〜４２３のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物を提供する。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物が、配列番号４２４〜４３０のいずれか１つの配列、または配列番号４２４〜４３０のいずれか１つと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
一定の実施形態において、本願は、式：ＳＡＢＡ−Ｘ１−ＡＰＬＮまたはＡＰＬＮ−Ｘ１−ＳＡＢＡ［式中、ＳＡＢＡは本明細書に記載するＳＡＢＡポリペプチド（任意のＮ末端および／またはＣ末端伸長部を包含する）であり、Ｘ１はポリペプチドリンカー（適切なリンカーには例えば配列番号６５〜８８、２１６〜２２１または３９７のいずれか１つが包含される）であり、ＡＰＬＮは本明細書に記載するＡＰＬＮペプチドである］によって表すことができるＳＡＢＡ−ＡＰＬＮ融合物を提供する。
１５．他のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）
一定の態様において、本願は、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）以外のターゲット分子に結合する１０Ｆｎ３ドメインに融合されて、ＳＡＢＡ−１０Ｆｎ３または１０Ｆｎ３−ＳＡＢＡ構成のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）二量体融合分子をもたらしている、ＳＡＢＡを提供する。別の態様において、本願は、２つ以上の１０Ｆｎ３ドメインに融合されて多量体を形成しているＳＡＢＡを提供する。例えば、ある実施形態において、本願は、２つの１０Ｆｎ３ドメイン、すなわち１０Ｆｎ３ａと１０Ｆｎ３ｂとに融合されたＳＡＢＡであって、各１０Ｆｎ３ａおよび１０Ｆｎ３ｂが異なるターゲット分子に結合し、どちらも血清アルブミン（例えばＨＳＡ）には結合しないものを提供する。その結果生じるＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）三量体の構成は、ＳＡＢＡ−１０Ｆｎ３ａ−１０Ｆｎ３ｂ、１０Ｆｎ３ａ−ＳＡＢＡ−１０Ｆｎ３ｂ、または１０Ｆｎ３ａ−１０Ｆｎ３ｂ−ＳＡＢＡであることができる。
例示的実施形態では、ＳＡＢＡが、配列番号１〜３のいずれか１つ、または配列番号１〜３のいずれか１つと少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む１０Ｆｎ３ドメインに融合され、ここで、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループはそれぞれ野生型ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループの配列と比較して修飾されており、かつ１０Ｆｎ３ドメインは５００μＭ未満のＫＤで（インテグリン以外の）ターゲットに結合する。１０Ｆｎ３ドメインは、本明細書に記載するＮ末端および／またはＣ末端伸長部を、さらに含むことができる。一定の実施形態では、１０Ｆｎ３ドメインが、本明細書に記載する治療部分であるターゲットに結合する。例示的実施形態では、追加の１０Ｆｎ３ドメインを１つ含む融合物において、１０Ｆｎ３ドメインがＶＥＧＦＲ２、ＴＮＦα、ＩＧＦ１Ｒ、またはＥＧＦＲに結合する。例示的実施形態では、追加の１０Ｆｎ３ドメインを２つ含む融合物において、１０Ｆｎ３ドメインがＶＥＧＦＲ２およびＩＧＦ１ＲまたはＥＧＦＲおよびＩＧＦ１Ｒに結合する。
コンジュゲーション／リンカー
ＳＡＢＡ融合物は共有結合で連結するか、非共有結合で連結することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーを介して、血清アルブミン結合性１０Ｆｎ３を、異種分子に直接または間接的に連結することができる。ＳＡＢＡを目的のタンパク質に接合するための適切なリンカーは、別々のドメインが、互いに独立にフォールディングして、融合タンパク質のどちらのメンバーの機能も破壊しない三次元構造を形成することを可能にするものである。例示的リンカーを表２に配列番号６５〜８８、２１６〜２２１および３９７として掲載する。
この開示は、グリシン−セリンベースのリンカー、グリシン−プロリンベースのリンカー、ならびにアミノ酸配列ＰＳＴＳＴＳＴ（配列番号８５）を有するリンカーなどといった、いくつかの適切なリンカーを提供する。いくつかの実施形態では、リンカーがグリシン−セリンベースのリンカーである。これらのリンカーはグリシン残基とセリン残基を含み、８〜５０、１０〜３０、および１０〜２０アミノ酸長であることができる。例には、アミノ酸配列（ＧＳ）７（配列番号７２）、Ｇ（ＧＳ）６（配列番号６７）、およびＧ（ＧＳ）７Ｇ（配列番号６９）を有するリンカーが包含される。別のリンカーはグルタミン酸を含有し、これには例えば、（ＧＳＥ）５（配列番号７４）およびＧＧＳＥ ＧＧＳＥ（配列番号７８）が包含される。別の例示的グリシン−セリンリンカーには、（ＧＳ）４（配列番号７１）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号８０）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号８１）、および（ＧＧＧＧＳ）３Ｇ（配列番号８２）が包含される。いくつかの実施形態では、リンカーがグリシン−プロリンベースのリンカーである。これらのリンカーは、グリシン残基とプロリン残基を含み、３〜３０、１０〜３０、および３〜２０アミノ酸長であることができる。例には、アミノ酸配列（ＧＰ）３Ｇ（配列番号８３）、（ＧＰ）５Ｇ（配列番号８４）、およびＧＰＧを有するリンカーが包含される。別の実施形態において、リンカーは、３〜３０、１０〜３０、および３〜２０アミノ酸の長さを有するプロリン−アラニンベースのリンカーであることができる。プロリンアラニンベースのリンカーの例には、例えば（ＰＡ）３（配列番号８６）、（ＰＡ）６（配列番号８７）および（ＰＡ）９（配列番号８８）が包含される。最適なリンカーの長さとアミノ酸組成は、当技術分野において周知の方法による日常的な実験で決定することができると考えられる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する融合物が、血中またはターゲット組織中のプロテアーゼによって切断されうるプロテアーゼ部位を有するポリペプチドリンカーを介してＳＡＢＡに連結される。より良い送達特性もしくは治療特性のために、またはより効率的な生産のために、そのような実施形態を使って治療タンパク質を放出させることができる。
さらなるリンカーまたはスペーサーを、Ｆｎ３ドメインのＣ末端、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入してもよい。さらなるリンカーまたはスペーサーを、Ｆｎ３ドメインのＮ末端、Ｆｎ３ドメインとポリペプチドリンカーの間に導入してもよい。
いくつかの実施形態では、ポリマーリンカーを介して、治療部分をＳＡＢＡに直接または間接的に連結することができる。ポリマーリンカーは、融合物の各構成要素間の距離を最適に変化させることで次に挙げる特徴の１つ以上を有するタンパク質融合物を作り出すために使用することができる：１）目的のタンパク質に結合するときの、１つ以上のタンパク質ドメインの結合の、減少または増加した立体障害、２）増加したタンパク質安定性または溶解度、３）減少したタンパク質凝集、および４）タンパク質の増加した総アビディティまたはアフィニティ。
いくつかの実施形態では、治療部分が、ポリマー糖などの生体適合性ポリマーを介してＳＡＢＡに連結される。ポリマー糖は、血中またはターゲット組織中の酵素によって切断されうる酵素的切断部位を包含することができる。より良い送達特性もしくは治療特性のために、またはより効率的な生産のために、そのような実施形態を使って治療タンパク質を放出させることができる。
ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物
一定の実施形態において、本願は、ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物を提供する。例示的神経ペプチドには、例えばアミリン、ＰＹＹおよびＰＰが包含される。ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物は、ポリペプチド融合物として構築するか、化学的に誘導されたスペーサーを介して連結されたコンジュゲートとして構築することができる。ある実施形態では、ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物が、ＳＡＢＡ、アミノ酸リンカー、および神経ペプチドを含むポリペプチド融合物である。多くの神経ペプチドはＣ末端がアミド化されているので、融合タンパク質の例示的配置は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＳＡＢＡ、アミノ酸リンカー、および神経ペプチドである。もう一つの実施形態では、ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物が、ＳＡＢＡを神経ペプチドに連結する化学的に誘導されたスペーサーを含有する。ＳＡＢＡ−神経ペプチドコンジュゲートの例示的配置は、次のとおりである：（１）ＳＡＢＡ−Ｃｙｓ−化学的に誘導されたスペーサー−神経ペプチド、または（２）ＳＡＢＡ−アミノ酸リンカー−Ｃｙｓ−化学的に誘導されたスペーサー−神経ペプチド。本明細書においてさらに説明するように、ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物は、微生物または哺乳動物細胞などの宿主細胞内で生産することができる。化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物のペプチド構成要素は、宿主細胞によって、もしくは化学合成によって、またはそれらの組合せによって、生産することができる。例示的実施形態では、化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物が、宿主細胞（例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））中で生産されたＳＡＢＡと、化学合成によって生産された神経ペプチドとから組み立てられる。ＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物の生産に関するさらなる詳細を以下に記載すると共に、実施例にも記載する。
多くの神経ペプチドは、その生物学的活性にとって重要なＣ末端α−アミド基を含有する。例えばアミリン、ＰＹＹおよびＰＰペプチドは全て、Ｃ末端アミド化されている。哺乳動物細胞では、αアミド化が、ペプチジルグリシン基質のα−アミド化生成物への転化を触媒する二機能性酵素であるペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によってプロセシングされうる。
Ｃ末端アミド化ペプチドを生産するための技法は種々存在する。例えば、ペプチド前駆体（Ｃ末端−グリシンもしくは−グリシン−リジン−アルギニンまたは他の伸長部を伴うもの）を、精製ＰＡＭ酵素により、インビトロでプロセシングすることができる。ＰＡＭと、ＰＡＭを使ってＣ末端アミド化ペプチドを生産するための方法は、当業者には知られている。例えばＵＳ４，７０８，９３４、ＵＳ５，７８９，２３４およびＵＳ６，３１９，６８５を参照されたい。Ｃ末端アミド化は、内在性ＰＡＭを発現する哺乳類発現系でも達成することができる。融合タンパク質は、−グリシンまたは−グリシン−リジン−アルギニン配列によって伸長された前駆体分子として発現させることができる。真核細胞（例えばＣＨＯ、ＮＩＨ ３Ｔ３およびＢＨＫ）において分泌タンパク質として発現させた場合、そのタンパク質は内在性ＰＡＭ酵素によって切断されて、Ｃ末端カルボキシアミドをもたらしうる。例えばＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ （１９９１） Ｖ１２９：５５３−５５５ （１９９１）；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９１：１３５−１４１ （１９９３）を参照されたい。Ｃ末端アミド化は、ヒトＰＡＭが同時発現する哺乳類発現系において達成することもできる。例えばＣｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （２００２） ｖ１８：２０−２４ （２００２）を参照されたい。
インビトロでのＰＡＭ酵素によるＣＯＯＨのＣＯＮＨ２への転化の他に、目的のタンパク質上のカルボキサミド末端は、メリフィールド合成を使って作り出すこともできる。メリフィールド合成では、メリフィールド合成プロセス中に、ペプチドのＮ末端にマレイミド部分を取り付けることが可能である。このマレイミド部分は、２つのポリペプチドドメインの間に置かれたスペーサーとして役立ちうるさまざまな非アミノ酸部分を使って、（例えばＳＡＢＡとカルボキシアミド化神経ペプチドなどといった）２つのアミノ酸配列間でのコンジュゲートを作り出すことを可能にする。スペーサーとして使用することができる適切な非アミノ酸部分の例を下記の表１に示す。マレイミドコンジュゲーション反応の利点は、タンパク質上で容易に行うことができ、タンパク質分子にとって好ましい穏やかな条件下で高い収率を与え、高度に特異的で、副生成物をほとんど伴わないことである。
［表１］Ｎ末端にマレイミド部分を有するペプチドにＳＡＢＡ分子をコンジュゲートするためのリンカー／スペーサーの実例
Figure 2016106074
いくつかの実施形態では、ペプチドのマレイミド誘導体（典型的にはペプチドのＮ末端にマレイミド基を持つもの）への、ＳＡＢＡのＣ末端Ｃｙｓのスルフヒドリル基のマイケル付加反応で、安定なチオエーテル結合を得ることにより、本明細書に記載するＣ末端アミド化合成ペプチドを、Ｃ末端Ｃｙｓ残基を含有するＳＡＢＡと、溶液中でコンジュゲートすることができる。同じコンジュゲーションを、ペプチドのハロアルキル誘導体（例えばブロモ酢酸またはヨード酢酸を使ったアシル化によってペプチド上に導入されたブロモメチル基またはヨードメチル基）による、ＳＡＢＡのＣｙｓスルフヒドリルのアルキル化によって達成することもできる。このタイプのペプチド−タンパク質コンジュゲーションは、例えばＧ．Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（カリフォルニア州サンディエゴ， １９９６）に記載されているようなバイオコンジュゲーション法など、いくつかの異なる方法を使って達成できることは、当業者であればわかるであろう。
もう一つの実施形態では、中性リンカーまたはスペーサーを、ペプチド上のチオール反応性基と、ネイティブまたは変性ペプチド配列との間に置く。リンカーまたはスペーサーは、立体障害の低下をもたらし、ペプチドの、そのコグネイト受容体またはタンパク質パートナーへの結合を容易にしうる。適切なリンカーには、表１に記載するリンカーが包含されるが、これらに限るわけではない。チオール反応性マレイミドまたはヨードアセチル基を有するリンカー８〜１１が示されており、これらは、当技術分野において記載されている対応Ｎ−スクシンイミジル活性エステルを使って、ペプチドにカップリングすることができる。
本明細書に記載するペプチドおよびペプチドアナログは、化学合成により、さまざまな固相技法、例えばＧ． ＢａｒａｎｙおよびＲ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ」；Ｖｏｌｕｍｅ ２「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐａｒｔ Ａ」ｐｐ．３−２８４（Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク， １９８０）；またはＷ．Ｃ．ＣｈａｎおよびＰ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ「Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， 英国オックスフォード， ２０００に記載されているものなどを使って作製することができる。ペプチド合成のための例示的戦略は、α−アミノ基を一時的に保護するためのＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルメチルオキシカルボニル）基と、アミノ酸側鎖を一時的に保護するためのｔｅｒｔ−ブチル基との組合せに基づく（例えば「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ」中のＥ．ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ「Ｔｈｅ Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ」；Ｖｏｌｕｍｅ ９「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐａｒｔ Ｃ」ｐｐ．１−３８（Ｓ．ＵｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， サンディエゴ， １９８７）を参照されたい）。
ペプチドは、不溶性ポリマー支持体（「レジン」ともいう）上で、ペプチドのカルボキシ末端から出発して段階的に合成することができる。合成は、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミドまたはエステル結合の形成を介してレジンに添加することによって開始される。
これにより、結果として生じたペプチドを最終的にそれぞれＣ末端アミドまたはカルボン酸として放出させることが可能になる。
Ｃ末端アミノ酸および合成に使用される他のアミノ酸は全て、好ましくは、合成中にα−アミノ保護基を選択的に除去することができるように、差異的に保護されたα−アミノ基と側鎖官能基（存在する場合）とを有する。アミノ酸のカップリングは、そのカルボキシル基を活性エステルとして活性化し、それを、レジンに添加されたＮ末端アミノ酸の、ブロックされていないα−アミノ基と反応させることによって行われる。α−アミノ基脱保護およびカップリングのサイクルを、ペプチド配列全体が組み立てられるまで繰り返す。次に、副反応を制限するために通常は適当なスカベンジャーの存在下で、ペプチドをレジンから切り離すと同時に、側鎖官能基を脱保護する。その結果得られたペプチドは、逆相分取用ＨＰＬＣで精製することができる。
最終ペプチドへの前駆体として使用されるペプチジル−レジンの合成には、市販の架橋ポリスチレンポリマーレジン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州サンディエゴ）またはＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ ＰＥＧポリマーレジン（ＰＣＡＳ ＢｉｏＭａｔｒｉｘ、カナダ・ケベックシティー）を利用することができる。好ましい固形支持体には、例えば次に挙げるものが包含される：Ｃ末端カルボキサミド用の、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセチル−ｐ−メチルベンズヒドリルアミンレジン（ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡレジン）；９−Ｆｍｏｃ−アミノ−キサンテン−３−イルオキシ−メリフィールドレジン（Ｓｉｅｂｅｒアミドレジン）；４−（９−Ｆｍｏｃ）アミノメチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）バレリル−アミノメチル−メリフィールドレジン（ＰＡＬレジン）、および対応するＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ ＰＥＧベースレジン。第１アミノ酸およびそれ以降のアミノ酸のカップリングは、ＤＩＣ／ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、またはＤＩＣ／６−Ｃｌ−ＨＯＢｔもしくはＨＣＴＵ／６−Ｃｌ−ＨＯＢｔからそれぞれ作製されるＨＯＢｔまたは６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ活性エステルを使って達成することができる。
本明細書に記載するペプチドおよびペプチドアナログは、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロウェーブペプチドシンセサイザー（ＣＥＭ Ｃｏｒｐ．、ノースカロライナ州マシューズ）などの自動ペプチド合成装置を使って行うことができる。実施例で述べるＦｍｏｃ／ｔ−ブチル保護戦略を使って、段階的固相ペプチド合成を行うことができる。いくつかの実施形態では、図２１に示すＦｍｏｃアミノ酸誘導体を使用することができる。
アミリン誘導体の場合、Ａｃｍ保護Ｃｙｓ残基間のジスルフィド結合（例えばＣｙｓ２，７またはＣｙｓ１，７）は、レジン上でのヨウ素媒介参加によって形成させることができる（ＣｈａｎおよびＷｈｉｔｅ， ２０００）。各ペプチドのペプチジル−レジン前駆体は、任意の標準的手法を使って、切断し、脱保護することができる（例えばＤ．Ｓ．Ｋｉｎｇら， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３６：２５５−２６６ （１９９０））。いくつかの実施形態では、スカベンジャーとしての水、ＴＩＳおよびフェノールの存在下で、ＴＦＡを使用する。典型的には、ペプチジル−レジンを、ＴＦＡ／水／ＴＩＳ（９４：３：３，ｖ：ｖ：ｖ；１ｍＬ／１００ｍｇ−ペプチジルレジン）またはＴＦＡ／水／フェノール（９０：５：５；ｖ：ｖ：ｗ）中、室温で、２〜３時間撹拌する。次に、使用済みのレジンを濾去し、ＴＦＡ溶液を減圧下で濃縮または乾燥する。その結果得られた粗ペプチドは、Ｅｔ２Ｏで沈殿させ洗浄するか、あるいは分取用ＨＰＬＣによる精製のためにＤＭＳＯ、ＤＭＦまたは５０％水性ＡｃＣＮに直接再溶解することができる。
望ましい純度を有するペプチドは、例えば島津モデルＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフでの分取用ＨＰＬＣを使った精製によって得ることができる。例えば、粗ペプチドの溶液をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８（５μｍ， ２１．２×２５０ｍｍ）カラムに注入し、どちらも０．１％ＴＦＡで緩衝化した水中のＭｅＣＮの直線的勾配で、１４〜２０ｍＬ／分の流速を使って、２２０ｎｍにおけるＵＶ吸光度で流出液のモニタリングを行いながら溶出させることができる。精製されたペプチドの構造は、エレクトロスプレーＬＣＭＳ分析によって確認することができる。例えば、ペプチド試料は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高速液体クロマトグラフ（ＵＰＬＣ）に接続されたＷａｔｅｒｓ ＺＱ ２０００シングル四重極質量分析計（マサチューセッツ州ミルフォード）でのＬＣ／ＭＳによって分析することができる。クロマトグラフィー分離は、２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ、３００Å、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ３００ Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）を使用して、０．８ｍＬ／分の勾配溶出で達成することができる。カラム温度は５０℃にすることができる。移動相Ａは、０．０５％ＴＦＡを含む９８：２ 水：アセトニトリルにすることができ、移動相Ｂは、０．０４％ＴＦＡを含むアセトニトリルにすることができる。直線的勾配は、１、２、または５分かけて２％の移動相Ｂから８０％の移動相Ｂまで形成させることができる。２μＬの注入を使用して、ｍ／ｚ ５００からｍ／ｚ １５００まで、またはｍ／ｚ １０００からｍ／ｚ ２０００までのＥＳＩ ＭＳデータを取得することができる。機器はユニット分解能で稼働させることができる。
結合ポリペプチドの脱免疫化
血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物のアミノ酸配列は、１つ以上のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを排除するために改変してもよい。本明細書に記載するＳＡＢＡ融合物などのタンパク質は、それを、所与の種に対して非免疫原性にするか、免疫原性を低下させるために、脱免疫化することができる。脱免疫化はタンパク質の構造改変によって達成することができる。当業者に知られている脱免疫化技法はどれでも使用することができる。例えばＷＯ ００／３４３１７（この文献の開示は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ある実施形態では、血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物の配列を、ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフの存在について分析することができる。例えば、ＭＨＣ結合モチーフのデータベースとの比較を、例えばワールドワイドウェブサイトｗｅｈｉｌ．ｗｅｈｉ．ｅｄｕ．ａｕ上の「モチーフ」データベースを検索することなどによって行うことができる。あるいは、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを、コンピュータスレッディング（ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）法、例えばポリペプチド由来の連続するオーバーラッピングペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質への結合エネルギーについて調べる、Ａｌｔｕｖｉａらが考案したものなど（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４９ ２４４−２５０ （１９９５））を使って、同定することができる。コンピュータ結合予測アルゴリズムには、ｉＴｏｐｅ（商標）、Ｔｅｐｉｔｏｐｅ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（ＥｐｉＶａｘ）、およびＭＨＣｐｒｅｄが包含される。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの同定を支援するために、うまく提示されるペプチドに関係する関連配列特徴、例えば両親媒性およびＲｏｔｈｂａｒｄモチーフ、ならびにカテプシンＢおよび他のプロセシング酵素の切断部位などを検索することができる。
潜在的（例えばヒト）Ｔ細胞エピトープが同定されたら、次に、Ｔ細胞エピトープを排除するのに必要な１つ以上のアミノ酸の改変を行うことによって、これらのエピトープを排除する。通常、これは、Ｔ細胞エピトープそのものの中の１つ以上のアミノ酸の改変を伴うであろう。これは、タンパク質の一次構造から見てエピトープに近接するアミノ酸、または一次構造では近接していないが、その分子の二次構造では近接しているものを改変することを伴いうる。考えられる通常の改変はアミノ酸置換であるだろうが、一定の状況では、アミノ酸の付加または欠失が適当である場合もありうる。全ての改変は、組換えＤＮＡ技術によって達成することができるので、最終的な分子は、組換え宿主からの発現により、例えば確立された方法によって調製することができるが、タンパク質化学または他の任意の分子改変手段も使用することができる。
同定されたＴ細胞エピトープを除去したら、新しいＴ細胞エピトープが作り出されていないことを保証し、新しいエピトープが作り出されている場合には、そのエピトープを欠失させることができるように、脱免疫化された配列を再び分析することができる。
計算上同定されたＴ細胞エピトープの全てを除去する必要はない。特定のエピトープの「強さ」、もっと正確に言えば潜在的免疫原性の重要性は、当業者には理解されるであろう。さまざまな計算方法によって潜在的エピトープに関するスコアが生成される。高スコアのエピトープだけを除去すればよい場合がありうることは、当業者にはわかるであろう。また、潜在的エピトープの除去とそのタンパク質の結合アフィニティまたは他の生物学的活性の維持との間にバランスがあることも、当業者にはわかるであろう。それゆえに、一つの戦略は、ＳＡＢＡまたはＳＡＢＡ融合タンパク質中に置換を逐次的に導入し、次に、ターゲット結合性または他の生物学的活性および免疫原性について調べることである。
ある態様において、脱免疫化されたＳＡＢＡまたはＳＡＢＡ融合タンパク質は、ヒト対象において、元のタンパク質よりも免疫原性が低い（もっと正確に言えば、誘発されるＨＡＭＡ応答が弱くなる）。免疫原性を決定するためのアッセイは、当業者にはよく知られている。当技術分野において認識されている、免疫応答を決定するための方法を実施することで、特定の対象における、または臨床試験中の、ＨＡＭＡ応答をモニタリングすることができる。脱免疫化されたタンパク質を投与した対象には、当該治療の施行の開始時および施行中のあらゆる時点で、免疫原性評価を加えることができる。ＨＡＭＡ応答は、例えば、対象から採取した血清試料中の、脱免疫化タンパク質に対する抗体を、表面プラズモン共鳴技術（ＢＩＡｃｏｒｅ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析などといった当業者に知られている方法を使って検出することによって測定される。あるいは、Ｔ細胞活性化イベントを測定するために設計されたインビトロアッセイも、免疫原性を示す。
さらなる修飾
一定の実施形態において、血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、さらに翻訳後修飾を含みうる。例示的翻訳後タンパク質修飾には、リン酸化、アセチル化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、ユビキチン化、グリコシル化、カルボニル化、ＳＵＭＯ化、ビオチン化、またはポリペプチド側鎖もしくは疎水性基の付加が包含される。結果として、修飾された血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物は、脂質、多糖または単糖、およびリン酸基などの非アミノ酸要素を含有しうる。好ましい形態のグリコシル化は、１つ以上のシアル酸部分がポリペプチドにコンジュゲートするシアリル化である。シアル酸部分は溶解性および血清中半減期を改善すると同時に、タンパク質の考えうる免疫原性も減少させる。例えばＲａｊｕら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２００１ Ｊｕｌ ３１；４０（３０）：８８６８−７６を参照されたい。そのような非アミノ酸要素が血清アルブミン結合物質またはそれらの融合物の機能性に及ぼす効果を、特定の血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＲｈＳＡ）に結合するそれらの能力に関して、および／または融合物の場合には具体的な非１０Ｆｎ３部分によって付与される機能的役割（例えばＦＧＦ２１がグルコース取り込みに及ぼす効果）に関して、調べることができる。
ベクターおよびポリヌクレオチドの実施形態
この開示には、本明細書に記載するタンパク質のいずれかをコードする核酸配列も包含される。当業者には理解されるように、第３塩基の縮重ゆえに、ほとんどすべてのアミノ酸は、コードしているヌクレオチド配列中で、２つ以上のトリプレットコドンによって表されうる。加えて、軽微な塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列における保存的置換をもたらす場合もあるが、遺伝子産物の生物学的活性は実質的に改変させないと予想される。それゆえに、本明細書に記載するタンパク質をコードする核酸配列は、配列をわずかに修飾してもなお、それぞれの遺伝子産物をコードすることができる。血清アルブミン結合物質およびそれらの融合物をコードする一定の例示的核酸には、表３に示す配列を有する核酸が包含される。
本明細書に開示するさまざまなタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸は、化学的に合成することができる。細胞内での発現が改善されるようにコドン使用頻度を選択することができる。そのようなコドン使用頻度は選択した細胞タイプに依存するであろう。大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞に、それぞれ特化したコドン使用頻度パターンが開発されている。例えばＭａｙｆｉｅｌｄら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００３ １００（２）：４３８−４２；Ｓｉｎｃｌａｉｒら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ． ２００２ （１）：９６−１０５；Ｃｏｎｎｅｌｌ ＮＤ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００１ （５）：４４６−９；Ｍａｋｒｉｄｅｓら， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ． １９９６ ６０（３）：５１２−３８；およびＳｈａｒｐら， Ｙｅａｓｔ． １９９１ ７（７）：６５７−７８を参照されたい。
核酸操作のための一般技法は当業者の知るところであり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第１〜３巻（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， 第２版， １９８９）またはＦ． Ａｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：ニューヨーク、１９８）とその定期改訂版にも記載されており、これらは引用により本明細書に組み込まれる。タンパク質をコードするＤＮＡは、哺乳動物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写または翻訳調節要素に作動的に連結される。そのような調節要素には、転写プロモーター、転写を制御するための随意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を制御する配列が包含される。宿主中で複製する能力（通常は複製起点によって付与される）および形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が、さらに組み込まれる。適切な調節要素は当技術分野ではよく知られている。
本明細書に記載するタンパク質および融合タンパク質は、異種ポリペプチド（好ましくはシグナル配列であるか、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであるもの）との融合タンパク質として作製することができる。好ましく選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。ネイティブシグナル配列を認識しプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群などから選択される原核生物シグナル配列で、シグナル配列を置換する。酵母分泌のためには、ネイティブシグナル配列を、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）のα因子リーダーを包含する）、または酸性ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー、またはＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１３６４６に記載のシグナルで置換することができる。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを利用することができる。そのような前駆体領域のＤＮＡは、タンパク質をコードするＤＮＡに読み枠を合わせてライゲートすることができる。
真核宿主細胞（例えば酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。そのような配列は、一般に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’非翻訳領域、また時には３’非翻訳領域から、入手することができる。これらの領域は、多価抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成要素の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９４／１１０２６とそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。
組換えＤＮＡは、タンパク質の生成に役立ちうる任意のタイプのタンパク質タグ配列も包含することができる。タンパク質タグの例には、ヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＧＳＴタグが包含されるが、これらに限るわけではない。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクターおよび発現ベクターは、「Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ニューヨーク， １９８５）に見いだすことができ、この文献の関連する開示は引用により本明細書に組み込まれる。
発現コンストラクトは、当業者には明白であるだろうように、その宿主細胞に適した方法を使って、宿主細胞に導入される。エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；および感染（この場合、ベクターは感染性因子である）など（ただしこれらに限るわけではない）、宿主細胞中に核酸を導入するためのさまざまな方法が、当技術分野では知られている。
適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、哺乳動物細胞、または細菌細胞が包含される。
適切な細菌には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば大腸菌またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）が包含される。酵母、好ましくは、サッカロミセス属の酵母、例えばサッカロミセス・セレビシア（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）なども、ポリペプチドの生産に使用することができる。さまざまな哺乳動物細胞培養系または昆虫細胞培養系も、組換えタンパク質を発現させるために使用することができる。昆虫細胞中で異種タンパク質を生産するためのバキュロウイルス系については、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓによる総説（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：４７， １９８８）がある。いくつかの例では、例えばグリコシル化のために、脊椎動物細胞においてタンパク質を生産することが望ましいであろうが、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、既に日常的な手法になっている。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、内皮細胞、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞、ＣＶ−１、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎臓細胞、ＨｅＬａ、２９３、２９３Ｔ、およびＢＨＫ細胞株が包含される。多くの応用では、本明細書に記載するタンパク質多量体のサイズが小さいことから、大腸菌が好ましい発現方法になるであろう。
タンパク質生産
宿主細胞は、タンパク質生産のために、本明細書に記載する発現ベクターまたはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択肢、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、適宜、変更が加えられた従来の栄養培地において培養される。
本発明のタンパク質を生産するために使用される宿主細胞は、さまざまな培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販培地は、宿主細胞を培養するのに適している。加えて、Ｈａｍら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． ５８：４４ （１９７９）、 Ｂａｒｎｅｓら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５ （１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；または同第５，１２２，４６９号；ＷＯ ９０／０３４３０；ＷＯ ８７／００１９５；または米国再発行特許発明第３０，９８５号に記載された培地はどれでも、宿主細胞用の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬など）、微量元素（通常はマイクロモル濃度域の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補足することができる。他の必要な補足物も、当業者には知られているであろう適当な濃度で含めることができる。例えば温度、ｐＨその他の培養条件は、発現用に選択した宿主細胞で以前使用されたものであり、当業者には明白であるだろう。
本明細書に開示するタンパク質は、細胞翻訳系を使って生産することもできる。そのような目的には、インビトロ転写によるｍＲＮＡの生産が可能になるように、そしてまた、利用するその無細胞系におけるｍＲＮＡの無細胞翻訳が可能になるように、タンパク質をコードする核酸を修飾しなければならない。例示的真核生物無細胞翻訳系には、例えば哺乳動物または酵母無細胞翻訳系が包含され、例示的原核生物無細胞翻訳系には、例えば細菌無細胞翻訳系が包含される。
本明細書に開示するタンパク質は、化学合成によって（例えば「Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（第２版，１９８４，Ｔｈｅ Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，イリノイ州ロックフォード）に記載の方法によって）生産することもできる。タンパク質への修飾も化学合成によって加えることができる。
本明細書に開示するタンパク質は、タンパク質化学の分野において広く知られているタンパク質の単離／精製法によって精製することができる。非限定的な例には、抽出、再結晶、塩析（例えば硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウム）、遠心分離、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、向流分配法またはこれらの任意の組合せが包含される。精製後に、濾過および透析などといった（ただしこれらに限るわけではない）当技術分野において知られているさまざまな方法のいずれかによって、タンパク質を異なるバッファーへと交換し、かつ／または濃縮することができる。
精製されたタンパク質は、好ましくは、少なくとも８５％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度、最も好ましくは少なくとも９８％の純度を有する。純度の正確な数値がどうであれ、タンパク質は、医薬製品としての使用にとっては、十分に純粋である。
イメージング、診断および他の応用
ここに提供するＳＡＢＡ融合物は、ＳＡＢＡに融合された異種分子の実体に基づいて、さまざまな疾患および障害を処置するために使用することができる。当業者は、当技術分野における知識および本明細書に記載する情報に基づいて、ＳＡＢＡ融合物の応用を決定することができる。さまざまなＳＡＢＡ融合タンパク質の使用を本明細書において詳述する。ＳＡＢＡ融合物は、ヒトとヒト以外の生物の両方を包含する任意の哺乳動物対象または患者に投与することができる。
本明細書に記載する血清アルブミン結合物質および融合分子は、検出可能に標識することができ、イメージング応用または診断応用のために、例えばその融合分子によって結合されるタンパク質を発現する細胞と接触させる目的で使用することができる。タンパク質を検出可能部分にコンジュゲートするための当技術分野において知られる方法は、Ｈｕｎｔｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ １４４：９４５ （１９６２）；Ｄａｖｉｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：１０１４ （１９７４）；Ｐａｉｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ４０：２１９ （１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ３０：４０７ （１９８２）に記載されている方法を含めて、どれでも使用することができる。
一定の実施形態では、本明細書に記載する血清アルブミン結合物質および融合分子を、さらに、検出することができるラベルに取り付ける（例えば、ラベルは、放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であることができる）。ラベルは、放射性物質、例えば鉄キレート化合物などの放射性重金属、ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート化合物、酸素、窒素、鉄、炭素、またはガリウムの陽電子放出体、４３Ｋ、５２Ｆｅ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３２Ｉ、または９９Ｔｃであることができる。そのような部分に付加された血清アルブミン結合物質または融合分子は、イメージング剤として使用することができ、ヒトなどの哺乳動物における診断的使用のために有効量で投与された後、イメージング剤の局在化および蓄積が検出される。イメージング剤の局在化および蓄積は、ラジオシンチグラフィ、核磁気共鳴イメージング、コンピュータ断層撮影法または陽電子放射断層撮影法によって検出することができる。当業者には明らかであるだろうように、投与すべき放射性同位体の量は放射性同位体に依存する。当業者であれば、投与すべきイメージング剤の量を、放射能部分として使用される所与の放射性核種の比放射能およびエネルギーに基づいて、容易に処方することができる。
血清アルブミン結合物質および融合分子は、アフィニティ精製剤としても有用である。
このプロセスでは、当技術分野において周知の方法を使って、Ｓｅｐｈａｄｅｘ樹脂または濾紙などの適切な支持体上にタンパク質が固定化される。タンパク質は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどといった、任意の既知アッセイ法で使用することができる（Ｚｏｌａ「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７））。
ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物の例示的使用
ここに提供するＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、下記の１つ以上の処置または防止に使用することができる：糖尿病、高血糖、耐糖能異常、妊娠糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、網膜症、ニューロパシー、ネフロパシー、創傷治癒、アテローム性動脈硬化およびその続発症（急性冠症候群、心筋梗塞、狭心症、末梢血管疾患、間欠性跛行、心筋虚血、脳卒中、心不全）、メタボリック症候群、高血圧、肥満、異常脂質血症、高脂質血症、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、低ＨＤＬ、高ＬＤＬ、血管再狭窄、末梢動脈疾患、脂質障害、骨疾患（骨粗鬆症を包含する）、ＰＣＯＳ、ＨＩＶプロテアーゼ関連リポジストロフィー、緑内障および炎症性疾患、例えば乾癬、関節リウマチおよび変形性関節症、ならびに糖尿病、リポジストロフィーおよび骨粗鬆症に関係するコルチコステロイド処置による副作用の処置。一定の実施形態において、ここに提供するＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、対象において、肥満を処置または防止するため、体重を減少させるため、または体重増加を防止するために使用することができる。例示的一実施形態では、２５〜２９．９のＢＭＩを有する対象において、体重を減少させるためまたは体重増加を防止するために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。もう一つの例示的実施形態では、≧３０のＢＭＩを有する対象において、体重を減少させるためまたは体重増加を防止するために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。もう一つの実施形態では、≧２００ｍｇ／ｄＬの総コレステロールレベルおよび／または≧１５０ｍｇ／ｄＬのトリグリセリドレベルを有する対象を処置するために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。別の実施形態では、インスリン抵抗性を処置または低下させ、かつ／または脂肪組織におけるグルコース取り込みを増加させるために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。別の実施形態では、前糖尿病対象における糖尿病の進行を遅らせるために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。別の実施形態では、対象における血中グルコースレベルを低下させ、トリグリセリドレベルを低下させ、コレステロールレベルを低下させ、エネルギー消費を増加させ、脂肪利用を増加させ、かつ／または脂質排出を増加させるために、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を使用することができる。
本明細書にいう疾患または障害を「防止する」とは、無処置対照サンプルと比較して、統計サンプルにおける疾患状態の発生の確率を低下させること、または無処置対照サンプルと比較して、その疾患または障害の１つ以上の症状の発生を遅延させるか、前記症状の重篤度を低減することを指す。患者は、一般集団と比べて臨床的疾患状態を患うリスクを増加させることが知られている要因に基づいて、予防的治療のために選択することができる。本明細書において使用する「処置する」という用語は、（ａ）疾患状態を阻害すること、すなわちその発達を阻むこと；および／または（ｂ）疾患状態を緩和すること、すなわち疾患状態が樹立された時にその退縮を引き起こすことを包含する。
一定の実施形態において、本願は、活性成分として治療有効量のＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を、単独で、または医薬担体と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。場合により、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、単独で使用するか、本明細書に記載する他の融合物と組み合わせて、または１つ以上の他の治療剤、例えば抗糖尿病剤もしくは他の医薬活性物質と組み合わせて使用することができる。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物を、単独で、または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。「組み合わせて投与」または「併用療法」とは、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物と１つ以上のさらなる治療剤とが、処置される哺乳動物に並行して投与されることを意味する。組み合わせて投与される場合、各構成要素は同時に投与されてもよいし、異なる時点において任意の順序で逐次的に投与されてもよい。したがって各構成要素は、別々に、ただし所望の治療効果が得られるように十分に近い時間間隔で、投与することができる。
ここに提供するＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、抗糖尿病剤、抗高血糖剤、抗高インスリン血症剤、抗網膜症剤、抗ニューロパシー剤、抗ネフロパシー剤、抗アテローム性動脈硬化剤、抗虚血剤、抗高血圧剤、抗肥満剤、抗異常脂質血症剤、抗異常脂質血症剤、抗高脂血症剤、抗高トリグリセリド血症剤、抗高コレステロール血症剤、抗再狭窄剤、抗膵臓剤（ａｎｔｉ−ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａｇｅｎｔ）、脂質低下剤、食欲抑制剤、記憶増強剤、抗認知症剤、または認知促進剤、食欲抑制剤、心不全のための処置、末梢動脈疾患のための処置、および抗炎症剤と組み合わせて使用することができる。
ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物と組み合わせて使用される抗糖尿病剤には、インスリン分泌促進物質またはインスリン抵抗性改善薬、ＧＰＲ４０受容体調整物質、または他の抗糖尿病剤が包含されるが、これらに限るわけではない。これらの薬剤には、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ４）阻害剤（例えばシタグリプチン、サクサグリプチン、アログリプチン、ビルダグリプチンなど）、ビグアニド剤（例えばメトホルミン、フェンホルミンなど）、スルホニル尿素剤（例えばグリブリド（ｇｌｉｂｕｒｉｄｅ）、グリメピリド、グリピジドなど）、グルコシダーゼ阻害剤（例えばアカルボース、ミグリトール、など）、チアゾリジンジオン類などのＰＰＡＲγアゴニスト（例えばロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）、ＰＰＡＲα／γ二重アゴニスト（例えばムラグリタザル、テサグリタザル、アレグリタザルなど）、グルコキナーゼ活性化因子（引用により本明細書に組み込まれるＦｙｆｅ，Ｍ．Ｃ．Ｔ．ら， Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ， ３４（８）：６４１−６５３ （２００９）に記載されているもの）、ＧＰＲ１１９受容体調整物質（ＭＢＸ−２９５２、ＰＳＮ８２１、ＡＰＤ５９７など）、ＳＧＬＴ２阻害剤（ダパグリフロジン、カナグリフロジン、レマグリフロジン（ｒｅｍａｇｌｉｆｌｏｚｉｎ）など）、プラムリンチドなどのアミリンアナログ、および／またはインスリンが包含されるが、これらに限るわけではない。糖尿病を処置するための現在の治療法および注目を集めつつある治療法に関する総説は、Ｍｏｈｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら， Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ２９（１）：１２５−１９５ （２００９）、およびＭｉｚｕｎｏ，Ｃ．Ｓ．ら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １５：６１−７４ （２００８）に見いだすことができる。
ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、場合により、１つ以上の食欲減退剤、例えばジエチルプロピオン、フェンジメトラジン、フェンテルミン、オルリスタット、シブトラミン、ロルカセリン、プラムリンチド、トピラマート、ＭＣＨＲ１受容体アンタゴニスト、オキシントモジュリン、ナルトレキソン、アミリンペプチド、ＮＰＹ Ｙ５受容体調整物質、ＮＰＹ Ｙ２受容体調整物質、ＮＰＹ Ｙ４受容体調整物質、セチリスタット、５ＨＴ２ｃ受容体調整物質などと組み合わせて使用することもできる。ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は、注射によって投与するか、鼻腔内に投与するか、経皮デバイスまたはバッカルデバイスによって投与することができるグルカゴン様ペプチド−１受容体（ＧＬＰ−１ Ｒ）のアゴニスト、例えばエクセナチド、リラグルチド、ＧＰＲ−１（１−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、ＧＬＰ−１（７−３７）（Ｈａｂｅｎｅｒの米国特許第５，６１４，４９２号に開示されているもの；この特許文献の開示は引用により本明細書に組み込まれる）などと組み合わせて使用することもできる。肥満を処置するための現在の治療法および注目を集めつつある治療法に関する総説は、Ｍｅｌｎｉｋｏｖａ， Ｉ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ５：３６９−３７０ （２００６）；Ｊｏｎｅｓ， Ｄ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， ８：８３３−８３４ （２００９）；Ｏｂｉｃｉ， Ｓ．， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ， １５０（６）：２５１２−２５１７ （２００９）；およびＥｌａｎｇｂａｍ， Ｃ．Ｓ．， Ｖｅｔ． Ｐａｔｈｏｌ．， ４６（１）：１０−２４ （２００９）に見いだすことができる。
一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、約１０ｎｇ〜２０ｍｇ、１０ｎｇ〜５ｍｇ、１０ｎｇ〜２ｍｇ、１０ｎｇ〜１ｍｇ、１００ｎｇ〜２０ｍｇ、１００ｎｇ〜５ｍｇ、１００ｎｇ〜２ｍｇ、１００ｎｇ〜１ｍｇ、１μｇ〜２０ｍｇ、１μｇ〜５ｍｇ、１μｇ〜２ｍｇ、１μｇ〜１ｍｇ、１０μｇ〜２０ｍｇ、１０μｇ〜５ｍｇ、１０μｇ〜２ｍｇ、１０μｇ〜１ｍｇ、０．０１〜２０ｍｇ、０．０１〜１０ｍｇ、０．１〜２０ｍｇ、０．１〜１０ｍｇ、０．０１〜５ｍｇ、０．１〜５ｍｇ、もしくは０．７〜５ｍｇ、または約１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、または約１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇの用量で投与される。一定の実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、約１００ｐｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、１００ｐｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇ、０．１〜２００μｇ／ｋｇ、０．１〜１００μｇ／ｋｇ、１〜２００μｇ／ｋｇ、１〜１００μｇ／ｋｇ、０．１〜５０μｇ／ｋｇ、１〜５０μｇ／ｋｇ、もしくは７〜５０μｇ／ｋｇ、または約１００ｐｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、または１、２、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、２００もしくは２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される。ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物は毎日（例えば毎日１回、２回、３回、または４回）与えてもよいし、それより低い頻度で（例えば２日に１回、週または月に１回または２回）与えてもよい。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、１週間あたり約０．０１〜２０ｍｇ、約０．０１〜１０ｍｇ、約０．１〜２０ｍｇ、約０．１〜１０ｍｇ、約０．０１〜５ｍｇ、約０．１〜５ｍｇ、もしくは約０．７〜５ｍｇ、または約１、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｇの用量で投与される。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、１週間あたり約０．１〜２００μｇ／ｋｇ、約０．１〜１００μｇ／ｋｇ、約１〜２００μｇ／ｋｇ、約１〜１００μｇ／ｋｇ、約０．１〜５０μｇ／ｋｇ、約１〜５０μｇ／ｋｇ、もしくは約７〜５０μｇ／ｋｇ、または約１、２、５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、２００もしくは２５０μｇ／ｋｇの用量で投与される。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、１日あたり約１０ｎｇ〜２０ｍｇ、約１０ｎｇ〜５ｍｇ、約１０ｎｇ〜２ｍｇ、約１０ｎｇ〜１ｍｇ、約１０ｎｇ〜５００μｇ、約１０ｎｇ〜２００μｇ、約１００ｎｇ〜２０ｍｇ、約１００ｎｇ〜５ｍｇ、約１００ｎｇ〜２ｍｇ、約１００ｎｇ〜１ｍｇ、約１００ｎｇ〜５００μｇ、約１００ｎｇ〜２００μｇ、約１μｇ〜２０ｍｇ、約１μｇ〜５ｍｇ、約１μｇ〜２ｍｇ、約１μｇ〜１ｍｇ、約１μｇ〜５００μｇ、約１μｇ〜２００μｇ、約１０μｇ〜２０ｍｇ、約１０μｇ〜５ｍｇ、約１０μｇ〜２ｍｇ、約１０μｇ〜１ｍｇ、約１０μｇ〜５００μｇ、約１０μｇ〜２００μｇ、または約１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、５００μｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、もしくは５ｍｇの用量で投与される。例示的実施形態では、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物が、１日あたり約１００ｐｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ、約１００ｐｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ、約１ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ、約１００ｎｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜２００μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇ、もしくは約１０μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ、または約１００ｐｇ／ｋｇ、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇもしくは２００μｇ／ｋｇの用量で投与される。加えて、当技術分野では知られているとおり、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に合わせた調節が必要であるだろうが、当業者は、それらを日常的な実験で確かめることができるであろう。
治療用製剤および投与様式
本願は、ＳＡＢＡに融合された治療部分を投与するための方法であって、ＳＡＢＡに融合されると治療部分の半減期が延長される方法を提供する。融合コンストラクトを投与するための技法および投薬量は、ＳＡＢＡに融合される治療部分のタイプおよび処置される具体的状態に依存して変動するであろうが、当業者であればすぐに決定することができる。一般に、規制当局は、治療薬として使用されるタンパク質試薬については、含まれる発熱性物質のレベルが許容される程度に低くなるように製剤化されることを要求する。したがって、治療用製剤は一般に、それらが実質的に発熱性物質を含まないという点で、または少なくとも、適当な規制当局（例えばＦＤＡ）によって決定される許容されるレベルを超える発熱性物質を含有しないという点で、他の製剤とは区別されるであろう。一定の実施形態では、ＳＡＢＡおよびそれらの融合分子の医薬製剤が、例えばｐＨ４．０〜７．０で、１〜２０ｍＭコハク酸、２〜１０％ソルビトール、および１〜１０％グリシンを含む。例示的一実施形態では、ＳＡＢＡおよびそれらの融合分子の医薬製剤が、例えばｐＨ６．０で、１０ｍＭコハク酸、８％ソルビトール、および５％グリシンを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＡＢＡおよびその融合物が、哺乳動物、特にヒトにとって、医薬上許容される。「医薬上許容される」ポリペプチドとは、動物に投与しても際立った有害な医学的結果を伴わないポリペプチドを指す。医薬上許容されるＳＡＢＡおよびその融合物の例には、本質的にエンドトキシンを含まないか、極めて低いエンドトキシンレベルしか持たない、インテグリン結合ドメイン（ＲＧＤ）を欠く１０Ｆｎ３ドメイン、およびＳＡＢＡまたはＳＡＢＡ融合物の組成物が包含される。
治療用組成物は、医薬上許容される希釈剤、担体、または賦形剤と共に、単位剤形で投与することができる。投与は、非限定的な例として、非経口（例えば静脈内、皮下）投与、経口投与、または局所外用投与であることができる。組成物は、経口投与用の丸剤、錠剤、カプセル剤、液剤、または徐放性錠剤；静脈内、皮下または非経口投与用の液剤；または局所外用投与のためのゲル剤、ローション剤、軟膏、クリーム剤、またはポリマーもしくは他の徐放性媒体の形態をとることができる。
製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」（第２０版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ．編、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィア）に見いだされる。非経口投与用の製剤は、例えば賦形剤、滅菌水、食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレン（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓ）を含有しうる。化合物の放出を制御するために、生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを使用することができる。化合物の体内分布を制御するためにナノ粒子状製剤（例えば生分解性ナノ粒子、固形脂質ナノ粒子、リポソーム）を使用することができる。他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、植え込み型注入システム、およびリポソームが包含される。製剤中の化合物の濃度は、投与すべき薬物の投薬量や投与経路などといった、いくつかの要因に依存して変動する。
ポリペプチドは、場合により、医薬上許容される塩、例えば無毒性酸付加塩として、または医薬品業界においてよく使用される金属錯体として投与することができる。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；および塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が包含される。金属錯体には、亜鉛、鉄などが包含される。ある例では、ポリペプチドが、熱安定性を増加させるために酢酸ナトリウムの存在下で製剤化される。
経口使用のための製剤には、無毒性の医薬上許容される賦形剤と混合された活性成分を含有する錠剤が包含される。これらの賦形剤は、例えば不活性希釈剤または充填剤（例えばスクロースおよびソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、および粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、またはタルク）であることができる。
経口使用のための製剤は、咀嚼錠として、または活性成分が不活性固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水または油性媒質と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として提供することもできる。
治療有効量とは、その投与の目的である治療効果をもたらす用量を指す。正確な用量は処置される障害に依存するであろうが、当業者であれば、既知の技法を使って確かめることができる。一般に、ＳＡＢＡまたはＳＡＢＡ融合物は、１日あたり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１日あたり０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。ポリペプチドは、毎日（例えば毎日１回、２回、３回、または４回）与えてもよいし、それより低い頻度で（例えば２日に１回、週または月に１回または２回）与えてもよい。加えて、当技術分野では知られているとおり、年齢ならびに体重、全身の健康状態、性別、食餌、投与の時間、薬物相互作用、および疾患の重症度に合わせた調節が必要になりうるが、当業者は、それらを日常的な実験で確かめることができるであろう。
例示
ここに概説した発明は、以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろうが、これらは、本発明の一定の態様および実施形態を例証するために記載するに過ぎず、決して本発明の限定を意図するものではない。
配列の要約
本願において言及する配列の多くを以下の表２に要約する。別段の指定がある場合を除き、全てのＮ末端伸長部を一重下線で示し、全てのＣ末端テール／伸長部を二重下線で示し、リンカー配列を四角い枠で囲む。各コアＳＡＢＡ配列についてはループ領域ＢＣ、ＤＥおよびＦＧに影を付ける。
［表２］例示的配列の要約
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［表３］一定の例示的核酸配列（配列番号１７６〜２１４および３９７〜４０７）
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Ａ．血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（ＳＡＢＡ）
実施例Ａ１．候補血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）のスクリーニングと選択
概略
ＰＲＯｆｕｓｉｏｎと呼ばれる選択技法（例えばＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９４（２３）：１２２９７−３０２， １９９７ならびにＷＯ ２００８／０６６７５２を参照されたい）を、１０Ｆｎ３のＢＣ、ＤＥおよびＦＧループにデザインされた可変領域を有するＤＮＡライブラリーに応用した。１０１３を越える分子のランダムライブラリーをこのデザインから作り出し、ビオチン化型のＨＳＡに対して選択圧をかけることで、所望の結合特性を有する候補血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（ＳＡＢＡ）を単離した。
高スループットタンパク質生産（ＨＴＴＰ）プロセス
高スループットタンパク質生産プロセス（ＨＴＰＰ）を使ってさまざまなＨＳＡ結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（商標）を精製した。選ばれた結合物質を、ＨＩＳ６タグを含有するｐＥＴ９ｄベクター中にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。形質転換された細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地５ｍｌに、２４ウェルフォーマットで接種し、３７℃で終夜成長させた。終夜培養物から２００μｌを吸引し、それを適当なウェルに吐出することによって、誘導発現用に、新鮮な５ｍＬ ＬＢ培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）培養を調製した。培養をＡ６０００．６〜０．９まで３７℃で成長させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導後に、培養を３０℃でさらに４時間成長させ、４℃、３２２０×ｇで１０分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
４５０μｌの溶解バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、３０μｇ／ｍｌ ＤＮＡｓｅ、２μｇ／ｍｌアプロトニン（ａｐｒｏｔｏｎｉｎ）、ｐＨ８．０）に再懸濁することによって細胞ペレット（２４ウェルフォーマット）を溶解し、室温で１時間振とうした。９６ウェルの６５０μｌキャッチプレートに装着した９６ウェルＷｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｄユニフィルターに移すことによって、溶解物を清澄化すると共に９６ウェルフォーマットに装填し直し、２００×ｇで５分間遠心分離した。清澄化した溶解物を、平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化させておいた９６ウェルＮｉキレートプレートに移し、５分間インキュベートした。結合していない物質を除去した。樹脂を、０．３ｍｌ／ウェル×２の洗浄バッファー＃１（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣＨＡＰＳ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄した。次に、樹脂を０．３ｍｌ／ウェル×３のＰＢＳで洗浄した。溶出に先だって、各ウェルを５０μｌの溶出バッファー（ＰＢＳ＋２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、５分間インキュベートし、この洗浄液を減圧によって捨てた。さらに１００μｌの溶出バッファーを各ウェルに適用することによってタンパク質を溶出させた。室温で３０分間のインキュベーション後に、プレートを２００×ｇで５分間遠心分離し、溶出したタンパク質を、Ｎｉプレートの底に固定された５μｌの０．５Ｍ ＭｇＣｌ２が入っている９６ウェルキャッチプレートに集めた。溶出したタンパク質は、ＳＧＥ（対照Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））をタンパク質標準にして、ＢＣＡプロテインアッセイを使って定量した。ＳＧＥ Ａｄｎｅｃｔｉｎは、インテグリン結合ドメイン（位置７８〜８０のアミノ酸ＲＧＤ）がＳＧＥで置き換えられている野生型１０Ｆｎ３ドメイン（配列番号１）である。
ＨＳＡ、ＲｈＳＡおよびＭｕＳＡ直接結合ＥＬＩＳＡ
ＨＳＡへの直接結合物質をアッセイするために、Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ニューヨーク州ロチェスター）を、４℃において、ＰＢＳ中の１０μｇ／ｍＬ ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）で、終夜コーティングした後、カゼインブロックバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、イリノイ州ロックフォード）中、室温で１〜３時間ブロッキングした。１点スクリーニングアッセイのために、精製ＨＴＰＰ Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）をカゼインブロックバッファーに１：２０希釈し、室温で１時間、各ウェル中のＨＳＡに結合させた。用量応答アッセイには、０．１ｎＭから１μＭまでの範囲にわたる濃度を使用した。未結合のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を除去するためにＰＢＳＴ中で洗浄した後、カゼインブロックバッファーに１：２５００希釈した抗Ｈｉｓ ｍＡｂ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を、結合しているＨｉｓタグ付きＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）に、室温で１時間加えた。ＰＢＳＴで洗浄することによって過剰のコンジュゲートを除去し、ＴＭＢ検出試薬（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造者の指示に従って使用することにより、結合しているＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を検出した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集測定
ＨＴＰＰで得られたＳＡＢＡに対してサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。ＨＴＰＰ由来物質のＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ５／１５０またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ５／１５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００または１２００ ＨＰＬＣシステムにより、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍにおけるＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎｍ、蛍光＝３５０ｎｍ）で行った。１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーを、ＳＥＣカラムに適した流速で使用した。分子量キャリブレーションにはゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用した。
ＨＴＰＰ精製ＳＡＢＡに関するＳＥＣの結果は、主として単量体であること、および球状ゲル濾過標準（ＢｉｏＲａｄ）との対比で１０ｋＤａの概略範囲に溶出することを示した。
５．候補血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（ＳＡＢＡ）の同定
ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ結合および生物物理学的基準に関するスクリーニングの結果として、マウスにおいてその半減期を評価するために、４つのユニークな血清アルブミン結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）（ＳＡＢＡ）が同定され、選択された。インビトロおよびインビボでの特徴づけを行うために、これらの４つのＳＡＢＡについて中規模生産を行った。表２に、ＰＲＯｆｕｓｉｏｎによって同定された２６のユニークなＳＡＢＡコア配列（ＳＡＢＡ１〜２６と名付けた）の配列を掲載する。ＳＡＢＡ４は、中規模生産の前に固定されたスキャフォールド変異を有していた。ＳＡＢＡ４のスキャフォールド完全版はＳＡＢＡ５である。ＳＡＢＡ４とＳＡＢＡ５は、ＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループでは同一の配列を有する。
実施例Ａ２．候補ＳＡＢＡの生産と製剤化
ＳＡＢＡの中規模タンパク質生産
実施例Ａ１に記載の選ばれたＳＡＢＡ（Ｈｉｓ６タグが後続しているもの）をｐＥＴ９ｄベクターにクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現させた（ＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、およびＳＡＢＡ５．１と名付けられた各Ｈｉｓタグ付きＳＡＢＡ配列については表２を参照されたい）。２０ｍｌの種菌培養（単一平板培養コロニーから生成させたもの）を使って、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１リットルのＬＢ培地に接種した。培養をＡ６０００．６〜１．０まで３７℃で成長させた。１ｍＭイソプロピル−β−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）による誘導後に、培養を３０℃でさらに４時間成長させ、４℃、≧１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって収穫した。細胞ペレットを−８０℃で凍結した。細胞ペレットを、２５ｍＬの溶解バッファー（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼインヒビターカクテル−ＥＤＴＡフリー（Ｒｏｃｈｅ）、ｐＨ７．４）に、氷上でＵｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘホモジナイザー（ＩＫＡ ｗｏｒｋｓ）を使って再懸濁した。細胞溶解は、モデルＭ−１１０Ｓマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使った高圧ホモジナイゼーション（≧１８，０００ｐｓｉ）によって達成した。可溶性画分を、４℃、２３，３００×ｇで３０分間の遠心分離によって分離した。上清を０．４５μｍフィルターで清澄化した。清澄化した溶解物を、２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で前平衡化したＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ）にローディングした。次にカラムを２５カラム体積の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で洗浄した後、２０カラム体積の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄し、次に３５カラム体積の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、４０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を１５カラム体積の２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出させ、Ａ２８０における吸光度に基づいてフラクションをプールし、１×ＰＢＳ、５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５または５０ｍＭ ＮａＯＡｃ；１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ４．５に対して透析した。０．２２μｍで濾過することにより、沈殿物をすべて除去した。
中規模での発現および精製により、可溶型で発現され、細菌細胞質ゾルの可溶性画分から精製された、高度に純粋で活性なＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を得た。１００ｍＭ ＮａＰＯ４、１００ｍＭ ＮａＳＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８の移動相におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３０ＧＬでのＳＥＣ分析（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、主として単量体型であるＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）が実証された。
ＳＡＢＡ１．２の製剤
予備的製剤化スクリーンには、一つの具体的ＳＡＢＡ、ＳＡＢＡ１．２（配列番号８０）を選んだ。ＳＡＢＡ１．２は、１０Ｆｎ３の「コア１」配列上に（ＥＤ）５伸長部を含んでいる。ＳＡＢＡ１．２については、１０ｍＭコハク酸、８％ソルビトール、５％グリシン、ｐＨ６．０で、製品濃度５ｍｇ／ｍＬの安定な製剤が同定された。この製剤では、タンパク質融解温度は、１．２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を使った示差走査熱量測定（ＤＳＣ）による決定で、７５℃であった。この製剤は４℃および２５℃で良好な物理的および化学的安定性をもたらし、初期凝集物レベルは１．２％だった。１ヶ月間安定性を保った後も、凝集のレベルは極めて低かった（４℃で１．６％、２５℃で３．８％）。タンパク質は、この製剤では、−８０℃および−２０℃から周囲温度まで推移する５サイクルの凍結融解後も安定であった。加えて、この製剤では、ＳＡＢＡ１．２は、４℃および周囲温度において、少なくとも２０ｍｇ／ｍＬタンパク質濃度まで可溶であり、沈殿も凝集の増加も起こらなかった。
実施例Ａ３．候補ＳＡＢＡの生物物理学的特徴づけ
サイズ排除クロマトグラフィー
中規模プロセスによって得られた候補ＳＡＢＡに対して標準的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。中規模生産材料のＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３０またはＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００または１２００ ＨＰＬＣシステムにより、Ａ２１４ｎｍおよびＡ２８０ｎｍにおけるＵＶ検出ならびに蛍光検出（励起＝２８０ｎｍ、蛍光＝３５０ｎｍ）で行った。１００ｍＭ硫酸ナトリウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８のバッファーを、ＳＥＣカラムに適した流速で使用した。分子量キャリブレーションにはゲル濾過標準（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用した。
中規模生産精製ＳＡＢＡでのＳＥＣの結果は、主として単量体型であるＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）と、球状ゲル濾過標準（ＢｉｏＲａｄ）との対比で１０ｋＤａの概略範囲における溶出とを示した。
熱安定性
中規模生産ＳＡＢＡの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）分析を行うことで、それぞれのＴｍを決定した。１ｍｇ／ｍｌ溶液を、Ｎ−ＤＳＣ ＩＩ熱量計（Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ）において、３気圧下で、温度を５℃から９５℃まで毎分１度の速度で昇温させることによって走査した。データは、Ｏｒｇｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＯｒｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐ）を使用し、ベストフィットを使って、適当なバッファーの対照ランと対比して分析した。ＳＥＣ分析およびＤＳＣ分析の結果を表４に要約する。
［表４］候補ＳＡＢＡに関するＳＥＣ分析およびＤＳＣ分析の要約
Figure 2016106074
実施例Ａ４．血清アルブミンへの候補ＳＡＢＡ１結合の特徴づけ
各血清アルブミン（ＨＳＡ／ＲｈＳＡ／ＭｕＳＡ）をＢｉａｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップの表面に固定化し、参照セルと固定化したアルブミンの両方に一連の濃度のＳＡＢＡを流すことにより、実施例Ａ１およびＡ２で述べたＨＴＰＰ材料および中規模生産材料から精製した選ばれたＳＡＢＡクローンのキネティクスを決定した。加えて、アルブミンへの結合を、ｐＨ５．５からｐＨ７．４までの範囲にあるさまざまなｐＨ条件下で行った。ＨＳＡ結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、ＳＡＢＡ４．１（ＳＡＢＡ５．１）およびＳＡＢＡ１．１は、ＲｈＳＡと交差反応したが、ＭｕＳＡとは交差反応しなかった。ＳＡＢＡ２およびＳＡＢＡ４の結合がｐＨ感受性であるのに対し、クローンＳＡＢＡ３は、下はｐＨ６．０まで、ＨＳＡに対してｐＨ耐性の結合を示した。ＳＡＢＡ１．１は、下はｐＨ５．５まで、ｐＨ耐性およびアフィニティ／キネティクスの生化学的基準を満たす。
Ｂｉａｃｏｒｅによってドメインマッピングを行った。ＨＳＡ、またはＨＳＡドメインＩおよびＩＩだけもしくはＨＳＡドメインＩＩＩだけからなるコンストラクトをＢｉａｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５チップの表面に固定化し、参照フローセルと固定化したアルブミンとの両方に一連の濃度のＳＡＢＡを流すことにより、ＨＴＰＰ材料および／または中規模生産材料から精製した選ばれたＳＡＢＡクローンについて決定した。クローンＳＡＢＡ２およびＳＡＢＡ１はＨＳＡおよびＨＳＡドメインＩ−ＩＩコンストラクトに結合したが、ＨＳＡドメインＩＩＩコンストラクトには結合しなかった。クローンＳＡＢＡ３およびＳＡＢＡ４はＨＳＡには結合したが、ＨＳＡドメインＩ−ＩＩコンストラクトにもＨＳＡドメインＩＩＩコンストラクトにも結合しなかった。これらの結果を表５に要約する。
［表５］候補ＳＡＢＡ（ＳＡＢＡ１．１、２．１、３．１および４．１）の結合アフィニティおよびキネティクス
Figure 2016106074
実施例Ａ５．候補ＳＡＢＡの生体内ｔ １／２ の調査
ＨＳＡ結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）はＭｕＳＡと交差反応しないので、マウスにおいてＨＳＡ結合性Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を評価することが可能になるように、マウスにおけるＨＳＡの半減期を決定した。ＨＳＡを、約６週齢のＮｃｒヌード雌マウスの尾静脈に、２０ｍｇ／ｋｇ（図１Ａ）および５０ｍｇ／ｋｇ（図１Ｂ）の用量で注射し、注射後に間隔をおいて採取した血液試料中のＨＳＡの濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアおよび非コンパートメントモデリングを使って、２０ｍｇ／ｋｇおよび５０ｍｇ／ｋｇの量でマウスに注射されたＨＳＡのｔ１／２は、それぞれ約２４時間および約２０時間であると決定された。
マウスにおけるＳＡＢＡ１〜４の半減期決定
ＨＳＡ結合性クローンＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、およびＳＡＢＡ４．１の１リットル大腸菌培養物を調製し、精製し、エンドトキシンを除去した。各ＳＡＢＡ変異体をＨＳＡと共にまたはＨＳＡを伴わずにマウスの尾静脈に注射し、注射後に間隔をおいて採取した血液試料中の濃度を、血漿試料中のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を検出するために開発された定量的ＥＬＩＳＡベースアッセイを使って決定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアによる非コンパートメントモデリングを使って、各Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）の薬物動態パラメータを決定した。
各ＳＡＢＡの薬物動態プロファイルを、約６週齢のＮｃｒヌード雌マウスにおいて、ＨＳＡの存在下または非存在下で比較した。結合性クローンはＨＳＡおよびＲｈＳＡに対して選択的であり、マウス血清アルブミンには結合しなかったので、ＨＳＡとの同時注射を行ったマウスには、各ＳＡＢＡと予め混合されたＨＳＡ（３〜４モル過剰のＨＳＡ）を与えた。マウス血漿におけるＳＡＢＡ１．１の半減期が０．５６時間であったのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ１．１の半減期は５．６時間と、半減期が約１０倍増加した（図２Ａ）。マウス血漿におけるＳＡＢＡ２．１の半減期が０．２４時間であったのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ２．１の半減期は２．８時間と、半減期が約１２倍増加した（図２Ｂ）。マウス血漿におけるＳＡＢＡ３．１の半減期が０．２８時間であったのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ３．１の半減期は０．５３時間と、半減期が約２倍増加した（図２Ｃ）。マウス血漿におけるＳＡＢＡ４．１の半減期が０．６６時間であったのに対し、ＨＳＡと同時注射されたＳＡＢＡ４の半減期は４．６時間と、半減期が約７倍増加した（図２Ｄ）。この実施例の要約を図３に示す。表６に、ＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、ＳＡＢＡ４．１およびＳＡＢＡ５．１について、類似するデータを要約する；利用できる場合はカニクイザル（ｃｙｎｏ）における半減期と比較する。
［表６］マウスおよびサルにおけるＳＡＢＡ１．１、ＳＡＢＡ２．１、ＳＡＢＡ３．１、ＳＡＢＡ４．１およびＳＡＢＡ５．１に関するデータ
Figure 2016106074
カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１．１およびＳＡＢＡ５．１の半減期決定
ＳＡＢＡ１．１（図４Ａ）およびＳＡＢＡ５．１（図４Ｂ）の３週間単回投与概念証明研究をカニクイザルで行うことで、２匹のカニクイザルにおいて１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）用量でのＩＶ投与時の薬物動態を評価した。薬物動態は、血漿試料中のＡｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を検出するために開発された定量的ＥＬＩＳＡベースアッセイを使って評価した。ＳＡＢＡ１．１は、９６〜１３７時間の範囲にある半減期を有する（図４Ａおよび表７）。ＳＡＢＡ５．１は、約１２時間の半減期を有し、ＥＬＩＳＡでは１２０時間までしか測定できなかった（図４Ｂおよび表８）。ＳＡＢＡ１．１に関するデータを表７に要約し、ＳＡＢＡ５．１に関するデータを表８に要約する。
［表７］ＳＡＢＡ１．１に関するデータ
Figure 2016106074
 ［表８］ＳＡＢＡ５．１に関するデータ
Figure 2016106074
実施例Ａ６．血清アルブミンへのＳＡＢＡ１結合の特徴づけ
ＳＡＢＡ１．１および１．２はＨＳＡおよびＲｈＳＡに結合する
（ＥＤ）５伸長部（配列番号９０）を含む「コア１」１０Ｆｎ３であるＳＡＢＡ１．２は、中性ｐＨおよび２５℃において、８．２１Ｅ＋０３Ｍ−１ｓ−１の平均会合速度定数（ｋａ）および４．４３Ｅ−０４ｓ−１の平均解離速度定数（ｋｄ）でヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合し、平均ＫＤの計算値は５５．３ｎＭになる（表９）。アカゲザル血清アルブミン（ＲｈＳＡ）の場合、測定された平均会合速度定数は６．６Ｅ＋０３Ｍ−１ｓ−１であり、解離速度定数は３．７８Ｅ−０３ｓ−１であったことから、平均ＫＤの計算値は５８０ｎＭになった。ＳＡＢＡ１．２とマウスまたはラット血清アルブミンの間の測定可能な相互作用は１μＭまで観察されなかった（表９および図５）。３７℃ではｋａおよびｋｄが２〜５倍増加して、ＨＳＡに対するアフィニティーが約２倍増加し、ＲｈＳＡに対するアフィニティーが１／２になった（表９）。
［表９］ＨＢＳ−ＰバッファーにおけるアルブミンへのＳＡＢＡ１．２結合に関する速度論的パラメータ
Figure 2016106074
さらに、ＳＡＢＡ１とＨＳＡの間の化学量論を決定するために熱量滴定を行った。この研究には、Ｈｉｓ６伸長部を含む「コア１」１０Ｆｎ３であるＳＡＢＡ１．１（配列番号８９）を使用した。濃度８．１μＭのＳＡＢＡ１．１を含有している熱量測定用セルに、ＨＳＡ（注入１回につき１０μｌの１１５μＭタンパク質溶液）を注入した。実験は、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー中、３７℃で行った。図６は、ＳＡＢＡ１．１が１：１の化学量論でＨＳＡに結合することを示している。
ＳＡＢＡ１．２は低いｐＨでＨＳＡに強く結合する
アルブミンの長い半減期（例えばＨＳＡのｔ１／２は１９日である）は、エンドソームの内部に存在する低ｐＨ条件下でそれらが新生児型Ｆｃ受容体ＦｃＲｎに結合することによってエンドサイトーシス経路からリサイクルされるという事実に、かなりの部分、起因している。表１０に示すように、ＳＡＢＡ１．２は５．５のエンドソームｐＨにおいてＨＳＡに強く結合したことから、ひとたびＨＳＡに結合すれば、ＳＡＢＡ１のｔ１／２も、ＦｃＲｎリサイクリング機構の恩恵を受けるであろうことが示唆される。
［表１０］ＭＥＳバッファー中、ｐＨ７．４および５．５における、アルブミン結合キネティクスの比較
Figure 2016106074
ＳＡＢＡ１．２はＨＳＡのドメインＩおよびＩに結合するがドメインＩＩＩには結合しない
ＳＡＢＡ１．２に対するアルブミン上の結合部位は、組換えＨＳＡフラグメントを使って、Ｎ末端ドメインＩまたはＩＩにマッピングされ、ドメインＩＩＩへの検出可能な結合はなかった（図７）。ドメインＩＩＩは主としてＦｃＲｎと相互作用するＨＳＡのドメインであるから、ＳＡＢＡ１．２が、ＦｃＲｎへのＨＳＡ結合に関して競合する可能性は低く、ここでも、リサイクリング機構を活用して半減期を向上させる可能性が増加する。
実施例Ａ７．ＳＡＢＡ１．２の生体内薬理
ＳＡＢＡ１．２の４週間単回投与前毒性研究をカニクイザルで行うことで、２つの異なる用量レベルにおける薬物動態を評価した。薬物動態およびバイオアベイラビリティも、静脈内投与アームと皮下投与アームの両方を包含する３週間単回投与前毒性研究において評価した。これらの研究のそれぞれでは、血漿試料中のＳＡＢＡ１．２を検出するために開発された定量的ＥＬＩＳＡベースアッセイをＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアによる非コンパートメントモデリングと組み合わせて使用することによって、ＳＡＢＡ１．２の薬物動態を評価した。
ＳＡＢＡ１．２を１ｍｐｋおよび１０ｍｐｋ ＩＶでサルに投与した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを使った非コンパートメント分析を行うことで、薬物動態パラメータを評価した。図２０および後述のパラメータに示すように、濃度時間曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）評価によって決定したところ、この研究において、ＳＡＢＡ１．２は、用量依存的薬物動態を示した。１０ｍｐｋのＳＡＢＡ１．２については、クリアランス（ＣＬ）が０．１５ｍｌ／時間／ｋｇ、β相半減期（ｔ１／２）は１４３時間、分布容積（Ｖｚ）は３０ｍＬ／ｋｇ、そして総薬物曝露量（ＡＵＣａｌｌ）は５，６０９，４５７時間＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１１）。１ｍｐｋのＳＡＢＡ１．２については、クリアランス（ＣＬ）が０．４ｍｌ／時間／ｋｇ、半減期（ｔ１／２）が１２４時間、分布容積（Ｖｚ）が７２ｍＬ／ｋｇ、そして総薬物曝露量（ＡＵＣａｌｌ）が２１４，６３６時間＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１１）。
ＳＡＢＡ１．２のＳＣまたはＩＶ投与後はβ相薬物動態プロファイルが類似していた（図９）。１ｍｐｋ ＩＶのＳＡＢＡ１．２については、クリアランス（ＣＬ）が０．２２ｍｌ／時間／ｋｇ、β相半減期（ｔ１／２）が１２５時間、分布容積（Ｖｚ）が４０ｍＬ／ｋｇ、そして総薬物曝露量（ＡＵＣａｌｌ）が時間＊ｎｍｏｌ／Ｌだった（表１１）。１ｍｐｋ ＳＣのＳＡＢＡ１．２については、クリアランス（ＣＬ）が０．３２ｍｌ／時間／ｋｇ、β相半減期（ｔ１／２）が１３４時間、分布容積（Ｖｚ）が６２ｍＬ／ｋｇ、そして総薬物曝露量（ＡＵＣａｌｌ）が２５１，３３９時間＊ｎｍｏｌ／Ｌであった（表１１）。ＩＶと比較したＳＣの相対的バイオアベイラビリティ（Ｆ）は０．７だった。
［表１１］サルにおけるＳＡＢＡ１．２に関する薬物動態パラメータ
Figure 2016106074
実施例Ａ８．ＳＡＢＡ１．２との複合体におけるヒト血清アルブミンの構造
ヒト血清アルブミンとＳＡＢＡ１．２との複合体は、Ｐｒｏｔｅｒｏｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨによって、１００ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．７５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、および２８％ＰＥＧ２００から結晶化された。Ｆｒｅｅ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＦＭＳ）を使って結晶からの回折を最適化し、オイル下でフラッシュ冷却した。
データは、Ｐｒｏｔｅｒｏｓ Ｂｉｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨにより、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＰＸＩ／Ｘ０６ＳＡにおいて、１００Ｋに維持された結晶を使って収集された。波長は１．００１５Åであり、検出器はＰｉｌａｔｕｓ ６Ｍ（Ｄｅｃｔｒｉｓ）だった。データをＸＤＳおよびＸＳＣＡＬＥ（Ｗ． Ｋａｂｓｃｈ （２０１０）「ＸＤＳ」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ ６６， １２５−１３２；Ｗ． Ｋａｂｓｃｈ （２０１０）「Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ， ｓｃａｌｉｎｇ， ｓｐａｃｅ−ｇｒｏｕｐ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｏｓｔ−ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ ６６， １３３−１４４）で処理し、以下の統計量を得た：空間群：Ｐ２１２１２１；単位格子：ａ＝６１．６Å；ｂ＝１２４．１Å；ｃ＝１００．０Å。
［表１２］結晶データの要約
Figure 2016106074
分子置換のためのプログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ， Ａ．およびＴｅｐｌｙａｋｏｖ， Ａ． （１９９７）「ＭＯＬＲＥＰ： ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ」Ｊ． Ａｐｐ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．， ３０， １０２２−１０２５）と、検索モデルとしてＰＤＢエントリー１ＢＭ０とを使用して、ヒト血清アルブミンの構造を決定した。Ａｄｎｅｃｔｉｎ部分の構造は、ＰＤＢエントリー１ＦＮＦ残基１４２３〜１５０２に基づく検索モデルから、分子置換プログラムＰＨＡＳＥＲ（Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ， Ｒ．Ｗ． Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ， Ｐ．Ｄ． Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ． Ｗｉｎｎ， Ｌ．Ｃ． ＳｔｏｒｏｎｉおよびＲ．Ｊ． Ｒｅａｄ （２００７）「Ｐｈａｓｅｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ」Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． ４０， ６５８−６７４）を使って決定した。
モデルの精密化は、ＢＵＳＴＥＲ／ＴＮＴ（Ｂｌａｎｃ， Ｅ．， Ｒｏｖｅｒｓｉ， Ｐ．， Ｖｏｎｒｈｅｉｎ， Ｃ．， Ｆｌｅｎｓｂｕｒｇ， Ｃ．， Ｌｅａ， Ｓ．Ｍ．およびＢｒｉｃｏｇｎｅ， Ｇ． （２００４）「Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅｌｙ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｉｔｈ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｉｎ ＢＵＳＴＥＲ／ＴＮＴ」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ ６０， ２２１０−２２２１）を使って行い、モデル構築はＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．およびＣｏｗｔａｎ， Ｋ． （２００４）「Ｃｏｏｔ： ｍｏｄｅｌ−ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ． Ｄ ６０：２１２６−２１３２；Ｅｍｓｌｅｙ， Ｐ．， Ｌｏｋｈａｍｐ， Ｂ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｗ．Ｇ．およびＣｏｗｔａｎ， Ｋ． （２０１０）「Ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｏｏｔ」Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｓｅｃｔ． Ｄ ６６：４８６−５０１）で行った。表示用の図は、ＰｙＭｏｌ（ＤｅＬａｎｏ， Ｗ．Ｌ． （２００２）， Ｔｈｅ ＰｙＭｏｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ， ＤｅＬａｎｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国カリフォルニア州サンカルロス；ワールドワイドウェブのｐｙｍｏｌ．ｏｒｇにおいて入手可能）で作成した。
精密化の最終ラウンドによって表１３に示す統計量が得られた。
［表１３］精密化の最終ラウンドから得られた統計量
Figure 2016106074
構造の説明
ＳＡＢＡ１．２に対する結合部位は、厳密に、ヒト血清アルブミン（ＨｕＳＡ）のドメイン１上にある（図１７ＡおよびＢ）。次に挙げるＨｕＳＡの残基がＡｄｎｅｃｔｉｎと接触していた（シグナルおよびプロペプチド領域を欠く成熟ＨｕＳＡ配列に基づくナンバリング）：Ｐｒｏ３５、Ｐｈｅ３６、Ｇｌｕ３７、Ｐｒｏ１１３、Ａｒｇ１１４、Ｌｅｕ１１５、Ａｒｇ１１７、Ｐｒｏ１１８、Ｇｌｕ１１９、Ｖａｌ１２２、Ｍｅｔ１２３、Ｐｈｅ１３４、Ｌｙｓ１３７、Ｔｙｒ１４０、Ｇｌｕ１４１、Ａｒｇ１４４、Ａｒｇ１４５、およびＴｙｒ１６１（Ｓｈｅｒｉｆｆ， Ｓ．， Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ， Ｗ． Ａ．およびＳｍｉｔｈ， Ｊ．Ｌ． （１９８７）「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍｙｏｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ ｉｎ ｔｈｅ Ａｚｉｄｏｍｅｔ Ｓｔａｔｅ ａｔ １．７／１．３ Å Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７， ２７３−２９６；Ｓｈｅｒｉｆｆ， Ｓ． （１９９３）「Ｓｏｍｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｘａｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ３， １９１−１９６）。より広義の相互作用残基は、少なくとも部分的に埋没しているものであり、これには、接触している残基として上に列挙したものに加えて、次に挙げる残基が包含される：Ａｓｐ３８、Ｔｈｒ１２５、Ａｌａ１２６、Ａｓｐ１２９、Ｔｈｒ１３３、Ｔｙｒ１３８、およびＬｅｕ１８２。
ＡｄｎｅｃｔｉｎはＢＣ、ＤＥ、およびＦＧループを介して相互作用し、次に挙げる残基がＨｕＳＡと接触している：（ＳＡＢＡ１．２、例えば配列番号９０の）Ｈｉｓ２５、Ｓｅｒ２６、Ｔｙｒ２７、Ｇｌｕ２９、Ｇｌｎ３０、Ａｓｎ３１、Ｐｒｏ５３、Ｔｙｒ５４、Ｓｅｒ５５、Ｔｈｒ５７、Ｔｙｒ７８、Ｔｙｒ８３、およびＴｙｒ８４）。先に列挙した残基に加えて、次に挙げる残基も、相互作用によって少なくとも部分的には埋没している：（ＳＡＢＡ１．２、例えば配列番号９０の）Ｔｒｐ２４、Ｓｅｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｇｌｎ５６、Ｇｌｙ７９、およびＬｙｓ８１。
実施例Ａ９．第Ｉ相ＳＡＢＡ安全性試験の計画
健常男性ボランティアにおいて、静脈内投与されたＳＡＢＡ１．２の第１相部分盲検プラセボ対照薬物動態試験が行われる。ボランティアは、処方せん薬または一般用医薬品による処置を現在受けていない、プロトコールに定められた健康状態および臓器機能に関する制限に合致する、１８〜６０歳の健常成人男性被験者とする。ＳＡＢＡ１．２は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する結合アフィニティを有する非治療用Ａｄｎｅｃｔｉｎである。これは、そのままでは迅速に排除されるであろう別個の治療用Ａｄｎｅｃｔｉｎまたは他のタンパク質と共に単一のポリペプチド鎖に組み込まれた時に、血清中半減期（Ｔ−ＨＡＬＦ）を延長させるためのアルブミン結合物質として役立つことを意図したものである。被験者のコホートは、０．１、０．３、または１．０ｍｇ／ｋｇのＳＡＢＡ１．２またはプラセボで、２週間に１回、合計２回の投薬で処置される。
試験計画．ボランティア被験者にはＳＡＢＡ１．２またはプラセボのどちらか一方がランダムに与えられ、それぞれのランダム化された処置の投与が、１４日の間隔を空けて２回、それぞれに１時間の注入として施行され、その後、２週間の試料収集および観察期間が設けられる。また、２回目の観察期間後、被験者はさらに４週間にわたって、安全性に関して追跡される。処置（ＳＡＢＡ１．２またはプラセボ）は１日目および１５日目に施行される。
ＳＡＢＡ１．２の用量レベルを漸増させて、３つの逐次的コホートがリクルートされる。個々の用量コホートはさらに、部分盲検的（被験者および治験スタッフは輸液剤の実体について盲検化され、薬剤師は盲検化されない）にＳＡＢＡ１．２またはプラセボに逐次的に曝露される３つのサブグループに分割される（図１８参照）。各コホートの第１サブグループは、リスクを最小限に抑えるために、活性薬処置被験者を１人だけ含む。
コホート１の全ての被験者がそれぞれの２９日目の来院を完了し、ＰＫ所見が評価された後（最大４週間と予想される）に、所定の最大無毒性量（ｎｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔ ｌｅｖｅｌ：ＮＯＡＥＬ）を上回る基準がコホート１では認められなかったと仮定して（下記参照）、コホート２が試験を開始する。同様に、ＮＯＡＥＬを上回らなかったと仮定して、コホート２の完了とＰＫ評価までは、コホート３を開始しない。
ＮＯＡＥＬは、ａ）２人以上の積極的処置（非プラセボ）被験者が何らかのグレード２国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＮＣＩ；米国）−有害事象共通用語基準（Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ：ＣＴＣＡＥ ｖ４．０３）ＳＡＢＡ１．２関連毒性を経験するか、ｂ）少なくとも１人の積極的処置被験者が、何らかのグレード≧３ ＳＡＢＡ１．２関連毒性を経験する最低用量レベルよりも、１レベル低い用量レベルと定義される。これらの基準のどちらも満たさない場合は、完了した最も高い用量レベルをＮＯＡＥＬとする。コホート２または３においてＮＯＡＥＬ基準を上回った場合は、その次に低いコホートがＮＯＡＥＬと宣言され、残りの被験者は全員がＮＯＡＥＬで処置され、この試験では合計３７人（ＳＡＢＡ１．２を投与される２８人とプラセボを投与される９人）が処置されることになる。これは、薬物動態（ＰＫ）および免疫原性評価を裏付けるために要求される統計精度を維持するため、および安全性観察を受ける被験者の数を十分な数に維持するためである。コホート１の用量レベルがＮＯＡＥＬを越えることが分かった場合は、さらなる被験者への投与は行わず、試験は終了されることになる。
試験評価および主要評価項目．試験の主要評価項目はＰＫであり、全ての用量にわたる平均Ｔ−ＨＡＬ、最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）、全身クリアランス（ＣＬ）、投薬から投薬間隔終了時点までの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣｔｌａｓｔ）、および定常状態における分布容積（ＶＳＳ）が包含されるであろう。ＰＫ分析用の連続試料は、試験１日目および１５日目の各注入の開始前と、開始後０．５（注入中）、１（注入終了時）、１．５、２、３、５、７、２４、４８、７２、９６または１２０、および１６８時間の時点で収集される。加えて、ＳＡＢＡ１．２血漿中濃度のための単一ランダム試料を２９日目（１５日目の投与の３３６時間後の標本）、３６日目、４３日目、５０日目、および５７日目に収集する。
安全性評価には、バイタルサイン、理学的検査、心電図、臨床検査室評価、および有害事象が包含される。加えて、抗薬物抗体（ＡＤＡ）、自己免疫の血清指標（抗核抗体［ＡＮＡ］、Ｃ３、およびＣ４）の測定、および臨床観察（例えば発疹、輸液反応、筋痛または関節痛など）によって、免疫原性が評価される。観察された何らかの免疫原性の機序を理解するための試みとして、ＨＬＡタイピングおよびＴ細胞刺激アッセイが行われるであろう。
統計的方法．被験者が２５人の場合、１３３．１５９時間以上のＴ−ＨＡＬＦ観測値については、片側９５％信頼区間（ＣＩ）の下限が１２０時間に及ぶことはないであろう。２５人の積極的処置完了者を得るために、積極的処置被験者が合計２８人になるように、１用量コホートあたり１人の追加被験者を含める。
血漿ＰＫパラメータについて、用量別に、および用量間で、要約統計量を製表する。ＰＫパラメータは、時間に対するＳＡＢＡ１．２血漿中濃度から、非コンパートメント法を使って導き出される。正当な理由があるなら、消長をさらに理解するために、コンパートメントアプローチを使用してもよい。平均Ｔ−ＨＡＬＦは９５％ＣＩによって推定される。Ｃｍａｘ、ＡＵＣｔｌａｓｔ、Ｒ、およびＣＬについては幾何平均およびＣＶが報告され、Ｔｍａｘについては中央値（最小、最大）が報告され、他のパラメータについては平均および標準偏差が報告される。ＳＡＢＡ１．２の用量比例性が評価される。線形混合効果モデリングを使って対数変換ＡＵＣおよびＣｍａｘが対数変換用量にフィッティングされる。関係の傾きに関して対称漸近９５％ＣＩが構築される。
９５％ＣＩが１．０の値を包含するのであれば、用量比例性が結論されることになる。逆に、９５％ＣＩが１．０の値を包含しないのであれば、非比例性が結論されることになる。
安全性結果は、用量レベル別に、および包括的に、記述的に要約されるであろう。
開始用量の理論的根拠．週に２回、５回にわたって投与した場合、カニクイザルにおけるＮＯＥＬ（Ｎｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｌｅｖｅｌ：無作用量）は、３０ｍｇ／ｋｇ ＩＶである。体表面積から見た用量によれば、このヒト臨床治験におけるＳＡＢＡ１．２の開始用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、サルにおけるＮＯＥＬより低く、１００倍の安全係数に相当し、この試験における最も高い計画用量（１ｍｇ／ｋｇ）は１０倍の安全係数に相当する。予測されるヒトＣｍａｘおよびＡＵＣによれば、この臨床試験における開始用量は、サルＮＯＥＬにおける１５日目のサルＣｍａｘおよびＡＵＣに対して、それぞれ約６００倍および２００倍の安全係数に相当し、一方、この試験における最も高い計画用量によれば、予測されるヒトＣｍａｘおよびＡＵＣは、１５日目のサル・パラメータに対して、それぞれおよそ５０倍および２０倍の安全係数に相当する。このように、この試験における用量レベルについては、十分な安全係数が考慮されている。
Ｂ．ＦＧＦ２１−ＳＡＢ融合物分子
実施例Ｂ１．ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合分子の調製
概略
本明細書において開示するＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ ＤＮＡ配列は全て、市販の発現ベクターｐＥＴ２９ｂ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に入れた。リボソーム結合部位のすぐ下流にあるプラスミドベクターのＮＤＥＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とＸＨＯＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間に、配列を適切に配置した（図１０）。
それらの発現ベクターを宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｎｅｃｅｓ）に形質転換したところ、封入体としてさまざまなレベルに発現した。あるいは、それらを大腸菌株の酸化性株、例えば「Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）」（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換することもできる。後者の宿主株は、チオレドキシンレダクターゼ（ｔｒｘＢ）遺伝子とグルタチオンレダクターゼ（ｇｏｒ）遺伝子の両方に変異を含有し、これらの変異は大腸菌細胞質におけるジスルフィド結合の形成を著しく強化する。適切な配慮を払って、さまざまなＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物、例えば表２に記載するものを発現させた。
精製したプラスミドＤＮＡ発現ベクターを、当業者に広く知られている標準的形質転換法により、上記の大腸菌に組み込んだ、すなわち「形質転換」した。簡単に述べると、市販のコンピテント細胞（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を氷上で融解し、細胞が均等に懸濁されていることを保証するために、静かに混合した。これらの細胞を、氷上で予冷しておいた１．５ｍｌポリプロピレン製微量遠心チューブに、２０μｌずつピペッティングした。約１μｌの精製プラスミドＤＮＡ（１〜１０ｎｇ／μｌプラスミド）を細胞に直接加え、混合するために静かに振とうした。チューブを氷上に５分間保った後、正確に３０秒間、４２℃の水浴で加熱した。加熱したチューブを直ちに氷上に置き、２分間休ませた。８０μｌの室温ＳＯＣまたはＬＢ培地を各チューブに加えた。形質転換体の選択は、ｐＥＴ２９ｂプラスミドがコードする薬物耐性用に、カナマイシンを含有する培地で平板培養することによって達成した。
形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることにより、Ｏｒｉｇａｍｉ２細胞株における可溶性ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合ポリペプチドの発現を開始した。細胞を、それぞれ１リットルのＬＢ培地（ルリアブロス）が入っている２リットル振とうフラスコの接種に使用し、２５０〜３００ＲＰＭで激しく振とうしながら、Ｏ．Ｄ．６００ｎｍが０．６〜０．８に達するまで、３７℃で成長させた。この時点で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ誘導を開始するために０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を加え、振とうインキュベータの温度を１８℃に低下させた。発酵を１２〜１６時間継続し、遠心分離によって細胞を収穫し、圧縮湿細胞ペーストとして−８０℃で凍結した。
ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞株における封入体（ＩＢ）としてのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合ポリペプチドの発現も、形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることから開始した。細胞を、それぞれ１リットルのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）培地（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２， ２３３−２３５， ２００５）が入っている２リットル振とうフラスコの接種に使用した。封入体形成のためには、発酵温度を低下させる必要がなく、その代わりに細胞を３７℃で１２〜１６時間成長させてから、遠心分離によって収穫した。収穫された細胞は、圧縮湿細胞ペーストとして−８０℃で凍結した。
記載したＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ変異体の精製は、使用したその配列変異体と、タンパク質をＯｒｉｇａｍｉ細胞株において細胞質ゾル可溶型として発現させるかどうか、またはＢＬ２１細胞株において封入体として発現させるかどうかとに依存して、さまざまである。方法は、配列が精製を助けるための６×ヒスチジンタグを含有するかどうかにも依存する。しかし一般に、精製法には、当業者にはよく知られる共通の技法が含まれる。以下は、精製法の詳細な説明である。
細胞溶解および封入体（ＩＢ）ペレットの調製
細胞を、圧縮細胞ペースト１部に対してバッファー８〜１０部の希釈度で、溶解バッファーに懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ−５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．、カナダ・オンタリオ州オタワ）を使って、２０００ＰＳＩで２回通すことにより、細胞を機械的に溶解した。溶解後に、溶解物を遠沈した（４，０００ＲＰＭで２０〜３０分間）。可溶性画分は捨てる。細胞片を除去するために封入体ペレットを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗浄し、その懸濁液を再び遠心分離した。このプロセスを、ペレットが均一な白色に見えるまで（典型的には２回または３回）繰り返した。次に、その結果得られた濃縮ＩＢ調製体ペレットをＰＢＳバッファーで洗浄することで、過剰の界面活性剤を除去した。
封入体の可溶化
次に、洗浄し界面活性剤を枯渇させたＩＢペレットを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と５００ｍＭ ＮａＣｌで緩衝化した６Ｍグアニジン−ＨＣｌに可溶化した。この方法で調製した材料の大半は、自由に溶液相に入るが、少量の細胞片が残るので、ＳＳ−３４ローター中、１６，０００ＲＰＭで１時間の遠心分離によって、これを除去した。リフォールディングおよび酸化ステップのために、上清をとっておいた。あるいは、この段階で、金属キレーションクロマトグラフィーステップ（ＩＭＡＣ）を使って、６×Ｈｉｓタグを含有するタンパク質融合物変異体を捕捉して、さらに精製することができる。カオトロープで変性させた材料をカラムに結合させ、夾雑物を洗浄してから、イミダゾールを補足した変性バッファーの存在下で溶出させることができる。
リフォールディングと酸化
グアニジン−ＨＣｌで可溶化した材料を約１ｍｇ／ｍＬタンパク質（２８０ｎＭの吸光度で推定）に希釈し、３．５ＭＷＣＯ透析チューブに入れた。次に、透析デバイス中の試料を、４Ｌのリフォールドバッファー（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）に、４℃で終夜、静かに撹拌しながら浮かせた。透析リフォールドバッファーは、翌朝に、新鮮なリフォールドバッファーと交換する。このプロセスの間に、融合タンパク質のＦＧＦ２１ドメイン中のジスルフィド橋が、容易に空気酸化される。この簡便な透析法は便利であり、必要であればいくつかの試料を一度に処理することができる。あるいは、グアニジン−ＨＣｌの代わりに尿素中でタンパク質を変性させることもできる。あるいは、高いカオトロピック塩濃度から低い塩濃度への分子の急速希釈を使って、リフォールディングと酸化を行うこともできる。あるいは、空気酸化の代わりに、還元型および酸化型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の所定の酸化還元混合物を使って、系をリフォールディングさせることもできる。
あるいは、上述のように透析または急速希釈によって自由拡散相でこれらのタンパク質をリフォールディングさせる代わりに、クロマトグラフィー樹脂に結合している間に、これらをリフォールディングさせてもよい。バルク凝集と収量損失につながりうるリフォールディング相中のタンパク質相互作用が最小限に抑えられるので、この方法には利点があり、収率が改善されることが多い。
沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）の除去
これらの条件下でのリフォールドおよび酸化ステップの終わりに、タンパク質の全てが可溶性のままであるわけではない。分子の一部は、凝集した状態で存在し、沈殿物（ｐｒｅｃｐｉｔａｔａｎｔ）として溶液から容易に降下する。これを、ＳＳ−３４ローターで１時間、１６，０００ＲＰＭで遠心分離することによって除去した。そして、典型的には、クロマトグラフィーに先だって、これを０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。
クロマトグラフィー分離
ＤＮＡおよび他の夾雑物を除去するために、リフォールディングされたＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物を、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑまたは類似のイオン交換媒体系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って精製することができる。４０ｍＬ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムをリフォールドバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス、ｐＨ９．０）中で平衡化し、清澄化したリフォールディングされた材料を、そのカラムに通す。これらの条件下で、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ変異体の大部分は、結合せずに樹脂ベッドを通過する。洗浄された封入体からのＤＮＡおよび他の細胞片は、カラム樹脂上に保持される。あるいは、６×Ｈｉｓタグを含有するフォールディングされたタンパク質融合物変異体を、この時点で、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ステップを使って捕捉し、イミダゾールまたはヒスチジンの勾配で溶出させることもできる。
濃縮
次に、第１クロマトグラフィーステップで富化されたタンパク質試料を、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬデバイスおよびＬａｂｓｃａｌｅ（商標）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ビルリカ）を使って、約４ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
サイズ排除クロマトグラフィー
次に、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中で前平衡化した２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００または２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物の約４ｍｇ／ｍＬ試料をさらに精製した。単量体型タンパク質融合物に対応する試料をプールし、必要であれば試料を１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈してから、−８０℃で凍結した。この方法を使って、封入体を生産した元の自己誘導培地１００ｍＬにつき、２０ｍｇまでのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物を精製することができる。
実施例Ｂ２．血清アルブミンへのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物結合の特徴づけ
Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＶＰ−ＩＴＣ機器（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．、米国マサチューセッツ州アマースト）での等温滴定熱量測定を使って、ヒト血清アルブミンへのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物変異体の結合能力および熱力学的特徴づけを行った。さらに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３７８２、米国ミズーリ州セントルイス）、カニクイザル血清アルブミン（ＣｙＳＡ、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ ＃ＣＭＳＡ、米国テキサス州カーヴィル）、およびマウス血清アルブミン（ＭｕＳＡ、Ｓｉｇｍａ＃Ａ３５５９）へのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ１融合物変異体の結合能力および速度論的特徴づけを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で行った。詳細な実験条件を以下に述べる。
熱量測定アッセイには、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ変異体ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１（配列番号１３２）を使用した。
３７℃における代表的滴定曲線を図１１に示す。ＫＤは３．８ｎＭと計算された。ＳＰＲ研究では、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３（配列番号１３４）を調べた。ヒト由来（ＨＳＡ）、カニクイザル由来（ＣｙＳＡ）およびマウス由来（ＭｕＳＡ）の血清アルブミンへの１０００、５００、２５０、１２５、および６２．５ｎＭ融合物の結合に関するＳＰＲセンサーグラムデータを、図１２に示す。ＨＳＡ、ＣｙＳＡ、およびＭｕＳＡへのこれらの融合物の結合に関する速度論的データを、表１４に要約する。
［表１４］ＨＳＡ、ＣｙＳＡ、およびＭｕＳＡへのＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３の結合に関するＳＰＲ速度論的データ
Figure 2016106074
詳細なプロトコール
等温滴定熱量測定
実験のための適正な溶媒マッチングを保証するために、精製ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１融合タンパク質および市販のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ ＃Ａ３７８２、米国ミズーリ州セントルイス）を、別々の３，５００ＭＷ透析バッグで、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．１）に対して透析した。ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合タンパク質＋バッファーを、０．４〜１．０ｍｇ／ｍＬタンパク質の濃度範囲で、機器試料セルに入れた。整合するバッファーを参照セルに入れた。純粋なタンパク質のタンパク質配列から算出された吸光係数を使って、濃度を決定した。機器反応セルを３７℃で平衡化した。反応セルへの各１０μｌの反復注入を注入シリンジから行い、ＨＳＡ１モルあたりの過剰の熱を監視した。得られたデータセットからベースラインを差し引き、セルに注入したＨＳＡの希釈熱について補正した。その結果得られたサーモグラムデータを、Ｏｒｉｇｉｎ（商標）評価ソフトウェアパッケージ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ Ｉｎｃ．）バージョン２．０．２を使ってフィッティングすることで、タンパク質−タンパク質結合反応の化学量論、エンタルピー、および平衡解離定数（ＫＤ）を推定した。
表面プラズモン共鳴
血清アルブミンをＰＢＳバッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．１）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解してから、固定化のために１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）に８〜１０μｇ／ｍｌまで希釈した。ＨＢＳ−ＥＰ＋ランニングバッファー中、２５℃で、標準的エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ケミストリーを使用し、製造者の一般的指針に従って、血清アルブミンを、Ｓｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ上に固定化した。フローセル１はＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し、エタノールアミンでブロッキングした。フローセル２、３および４は、それぞれＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した後、８〜１０μｇ／ｍｌ血清アルブミンの固定化を行い、エタノールアミンでブロッキングすることで、７００ＲＵ ＨＳＡ（フローセル２）、１１００ＲＵ ＣｙＳＡ（フローセル３）、および１０５０ＲＵ ＭｕＳＡ（フローセル４）の表面密度を得た。速度論的実験は、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳバッファー（ランニングバッファー）中、２５℃または３７℃で行った。ＰＢＳ ｐＨ７．２中のＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３（１５．３μＭ）またはＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１（４０．６μＭ）の原液をＰＢＳランニングバッファーで１μＭまで希釈してから、段階希釈（２：１）を行うことで、各タンパク質について１．０μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ、０．１２５μＭ、０．０６３μＭの濃度系列を作成した。物質輸送限界をチェックするために、これらの試料を、フローセル１〜４を横切るように、３０μｌ／分または６０μｌ／分の流速で３００秒間注入し、解離時間を４２０秒とした。全ての表面を、３０μｌ／分で３０秒間の１０ｍＭグリシン（ｐＨ２．０）のパルス２回で再生させた。フローセル１データをフローセル２、３または４のデータから差し引いた後、別個のバッファーサイクルを各センサーグラムから差し引くことにより、生センサーグラムを「二重準拠（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）」にした。この二重準拠センサーグラムデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０．２を使って１：１ラングミュアモデルにフィッティングすることで、会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。
実施例Ｂ３．ＨＥＫ−β−クロトー細胞におけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１融合物のインビトロ活性
ＦＧＦ２１はβ−クロトーの存在下でＥＲＫリン酸化を誘導する。そこで、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合物の機能的活性をインビトロで調べるために、本ＨＥＫ−β−クロトーアッセイ系を構築した。具体的に述べると、非融合Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１（「ＦＧＦｖ１」；配列番号１２５）をコンパレーターとして使用して、ＨＥＫβ−クロトー発現安定細胞ｐＥＲＫ１／２アッセイで測定されるインビトロ活性、力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）（ＥＣ５０）および効力（ｅｆｆｉｃａｃｙ）（ＳＡＢＡに融合されていないＦＧＦ２１分子で観察される最大活性に対するパーセンテージとして）を、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１（配列番号１３２）融合タンパク質について決定した。
図１３に示すように、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、ヒトβ−クロトーを安定に発現するＨＥＫ細胞におけるｐＥＲＫ１／２レベルを、用量依存的に刺激する。力価（ＥＣ５０）は、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１と比較して約１５倍右方シフトし、効力はＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１の６２％である（下記表１５参照）。したがってＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、ヒト血清アルブミンに結合している時でも、ＦＧＦ２１活性を保っている。
［表１５］対照ＦＧＦ２１と比べたＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物の力価
Figure 2016106074
 ＊ＨＥＫβ−クロトー発現安定細胞ｐＥＲＫ１／２アッセイにおいて測定される化合物の力価（ＥＣ５０）および効力（Ｈｉｓ６タグ付きＦＧＦ２１最大活性に対する％）。Ｎ≧４の独立したアッセイから平均±標準偏差として与えられる複数の実験から集計されたデータ。
βクロトーを内在的に発現しない親ＨＥＫ細胞における特異性アッセイでは、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１とＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はどちらもｐＥＲＫ１／２レベルを刺激しなかったが、陽性対照ＦＧＦ１は刺激した（図１４Ａ）。タンパク質希釈液は同じだが標準アッセイＨＥＫβ−クロトー安定細胞を使用する並行実験では、３つ全てのタンパク質が活性を示した（図１４Ｂ）。したがってＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、アルブミンに結合している時でも、ＦＧＦ２１の特異性を保っている。
この細胞ベースアッセイでは、ｐＥＲＫリン酸化経路を活性化するのに必要な薬物の濃度を、まず最初に決定する必要があった。この目的のために、細胞培地中、ＨＳＡの存在下および非存在下で、細胞に融合タンパク質を滴定した。ＨＳＡを加える場合には、血流中に見いだされる生理的濃度（３０〜４０ｍｇ／ｍＬ、約５００μＭのＨＳＡ）で加えた。この濃度は、全てのＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合タンパク質を飽和させるのに必要な濃度より数千倍高い。ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ−ＨＳＡ溶液結合定数は約４ｎＭである（図１１参照）。ＨＳＡの存在とは関わりなくアッセイ中のタンパク質融合物の活性に変化はなかったことから、融合タンパク質がＨＳＡと複合体を形成している時もＦＧＦ２１ドメインの活性は変化しないことが示された。
以下は実験方法の詳細な説明である。
ＨＥＫ−β−クロトー安定細胞株の構築
ヒトβ−クロトーを安定に発現するＨＥＫ細胞株を構築した。ヒトβ−クロトーコンストラクトは、ＣＭＶプロモーターの制御下にあって、Ｃ末端ＦＬＡＧタグを伴う、完全長タンパク質をコードしていた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１６６８０２７）を製造者のプロトコールに従って使用し、標準的技法を使って、ＨＥＫ２９３細胞を、線状化したｃＤＮＡでトランスフェクトした。Ｌ−グルタミン、Ｈｅｐｅｓを含有する高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２４３００５４）および１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅカタログ番号ＳＨ３００７１）中、６００μｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１０１３１）における１４日間の選択後に、陽性クローンが単離された。陽性安定クローンを、ウェスタンブロット分析およびＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＴＧＲＥＳ５０Ｋ）分析によるｐ−ＥＲＫ活性化によって、さらに特徴づけた。
ＨＥＫβ−クロトーｐＥＲＫ１／２アッセイ
ヒトβ−クロトーを安定に発現するＨＥＫ細胞を、９６ウェル組織培養プレートにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および６００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ）中、２０，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。翌日、培地を除去し、血清を含まないＤＭＥＭ高グルコース培地で置き換え、細胞を終夜インキュベートした。３日目の朝、無血清培地を除去し、細胞を、３％（ｗ／ｖ）脂肪酸フリーヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ中に作成したタンパク質の希釈液と共に、合計７分間インキュベートした。希釈液は、三つ一組にして、３つのプレートのそれぞれで１ウェルずつ試験した。７分間のインキュベーションの終了時に、タンパク質希釈液を除去し、１ウェルにつき１００μｌの１×ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ溶解バッファー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を加え、振とうしながら約１０〜１５分間インキュベートした。細胞溶解物が入っているプレートを、−８０℃で、少なくとも３０分間またはアッセイの準備ができるまで凍結した。融解した細胞溶解物の各ウェルからの４μｌを、３８４ウェル白色Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用し、Ｓｕｒｅｆｉｒｅ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ｐＥＲＫ１／２キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用することにより、ｐＥＲＫ１／２について分析した。プレートを暗所、室温で、２時間インキュベートしてから、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３マルチプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、非線形回帰分析を使って、データを分析した。
選択性アッセイは、β−クロトーを内在的に発現しない親ＨＥＫ細胞化を使って、上記のように行った。これらの実験ではＦＧＦ１を陽性対照として使用した。
実施例Ｂ４．３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１のインビトロ活性
３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＬ−１７３）は、マウス脂肪細胞に分化することができるマウス線維芽細胞である。β−クロトーは分化した３Ｔ３−Ｌ１細胞でしか発現しないので、実施例Ｂ３で述べたβ−クロトーｐＥＲＫ１／２アッセイを行う前に、それらをまず分化させる必要があった。ＨＥＫ系におけるその活性と同様に、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞でもＥＲＫをリン酸化する能力を保持しており、この活性はＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１に匹敵する。結果を表１６に示す。
［表１６］３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１活性はＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１に匹敵する
Figure 2016106074
以下は実験方法の詳細な説明である。
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞の分化
細胞を、１０％高品質（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃ＳＨ３００７１．０３）および１×抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ ＃１５２４０−０９６）を補足したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１２４３０−０５４）中で成長させた。細胞は、３７℃のインキュベーター中、５％ＣＯ２で培養した。トリプシン−ＥＤＴＡ溶液の代わりにＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ ＃１２６０５）を使用した点以外は、ＡＴＣＣの製品情報シートに記載されている継代培養の手法に従った。
分化の約６８時間前に、１ウェルあたり（培地１５０μｌ中）５５００個の細胞を９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ ＃３５３０７２）に播種した。細胞数は播種の時間とそれらの倍加時間に応じて調節できるであろうが、分化手法を開始した時点で細胞は１００％コンフルエントであった。分化を開始させるために、細胞上清を注意深く吸引し、２００μｌの新鮮な分化培地Ｉ（ＩＢＭＸ ５００μＭ、デキサメタゾン１００ｎＭ、インスリン２４０ｎＭを含有する成長培地；全てＳｉｇｍａ製）を各細胞ウェルに加えた。次に、細胞を４１〜４８時間インキュベートしてから、細胞上清を注意深く吸引し、２００μｌの分化培地ＩＩ（２４０ｎＭのインスリンを含有する成長培地）を各細胞ウェルに加えた。細胞を再び４８時間インキュベートした後、細胞上清を注意深く吸引し、２００μｌの通常成長培地を各ウェルに加えた。次に、細胞をさらに４８〜７２時間インキュベートした。この時点で、細胞は脂肪細胞へと十分に分化しているだろう。
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞におけるｐＥＲＫアッセイの確立
分化の９日目から１０日目に、成長培地を細胞から吸引除去し、細胞を、２％ウシ胎児血清を含む２００μｌのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１２３２０−０３２）で飢餓処理した。翌日、プレート中の９６ウェル全てへの同時添加が保証されるようにＴｏｍｔｅｃ Ｑｕａｄｒａを使って、飢餓細胞を、試験剤（ＦＧＦ２１またはその変異体の一つ）または対照としてのＰＢＳを含有する１００μｌのＤＭＥＭ＋０．１％脂肪酸フリーＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃Ａ６００３）で処理した。次に、プレートを、９５％空気／５％ＣＯ２の３７℃インキュベーター中で、７分間インキュベートした。７分後に、処置培地を細胞から除去し、１００μｌの溶解バッファーを各ウェルに加えた。溶解バッファー原液は、０．５ｍＭ ＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ９７７９）、５ｍＭピロリン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ６４２２）、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ｓ６５０８）およびＲｏｃｈｅのプロテアーゼインヒビタータブレット（＃０４６９３１５９００１）を補足したＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ＳｕｒｅＦｉｒｅ ｐ−ＥＲＫ１／２アッセイキット（カタログ番号ＴＧＲＥＳ１０Ｋ）であった。検出プロトコールはアッセイキットに基づいた。すなわち、溶解バッファーを含むプレートをプレート振とう器上で約１５分間撹拌し、−８０℃で３０分間凍結した。プレートを室温で融解し（約４０分）、完全な溶解を保証するために融解物を（ピペットで２０回上下させることにより）撹拌した。次に、各ウェルから４μｌの溶解物を３８４ウェルプレートに移し、７μｌの反応ミックス（キットのプロトコールに従って混合した活性化バッファーならびにＩｇＧ検出ドナーおよびアクセプタービーズ［ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＃６７６０６１７Ｍ］）を各ウェルに加えた。プレートを封止し、１〜２分間撹拌した後、遮光エリアにおいて２２℃で２時間インキュベートした。最後に、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒで、標準的Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ設定を使って、プレートを読み取った。
実施例Ｂ５．糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の生体内効力
ＦＧＦ２１は、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞および初代ヒト脂肪細胞培養におけるグルコース取り込みを増加させることが示されている。したがって、糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿中グルコースレベルを監視することは、ＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ融合タンパク質の機能的活性の評価を可能にする一方法になる。８週齢から始めて、７日間にわたって、糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスに毎日、皮下投与を行った（１群あたりｎ＝８）。プロトコールは全てＢＭＳ ＡＣＵＣ委員会によって承認された。午前８：００から始まる７日目の投与の２４時間後と３時間後の両方で、摂食時グルコースレベルを調べた。Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はＰＢＳ中に製剤化し、それぞれ０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。
ヒトアルブミンに結合しているＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の効力を評価するために、融合タンパク質（１ｍｇ／ｋｇ）をモル過剰のヒト血清アルブミン（６ｍｇ／ｋｇ）と共にインキュベートし、その混合物をもう一つの群に注射した（ｑ．ｄ．、ｓ．ｃ．、７日間）。もう一つの対照群としてヒト血清アルブミン（６ｍｇ／ｋｇ）を使用した。
図１５に示す結果は、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１が投与の３時間後にＰＢＳ媒体対照と比べてグルコースを２９％低下させ、この低下は７日目のＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１によるそれに匹敵することを示している（図１５Ａ）。これに対し、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１とヒトアルブミンの組合せは、ＨＳＡ対照と比べて血漿中グルコースレベルを４６％低下させた。
投与の２４時間後は、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１によるグルコース低下の強さが７％であるのに対し、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１とＨＳＡの組合せは４１％だったので、７日目の最後の投与後２４時間は持続したことになる（図１５Ｂ）。したがってＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、ヒト血清アルブミンに結合している時にも、ｏｂ／ｏｂマウスにおける血漿中グルコースレベルを低下させるのに、極めて有効であった。ヒトアルブミンを伴うおよびヒトアルブミンを伴わないＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の曝露を表１７および１８に示す。ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の曝露は、ヒト血清アルブミンの存在下の方が、その非存在下より大きい。
［表１７］投与の３時間後のＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の血漿中濃度
Figure 2016106074
 ＳＤ：標準偏差
［表１８］投与の２４時間後のＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の血漿中濃度
Figure 2016106074
 ＜ＬＬＯＱは定量下限未満である。
実施例Ｂ６．マウスおよびサルにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の血漿中ｔ １／２ の測定
Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の薬物動態を特徴づけるために、マウスおよびサルにおいて、さまざまな生体内研究を行った。ＥＬＩＳＡベースのリガンド結合アッセイを使って、全てのマウスおよびサル血漿試料中のＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１を測定した。
静脈内投与および皮下投与後のマウスにおけるＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の薬物動態
Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１
ＣＤ−１マウスにおける静脈内投与（１ｍｇ／ｋｇ）後、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１の定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は０．２７Ｌ／ｋｇだった。全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）値は１２ｍＬ／分／ｋｇだった。終末相半減期（Ｔ１／２）は０．５時間だった。皮下投与後、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは約１００％だった。見掛けの皮下終末相半減期（Ｔ１／２）は０．６時間だった。
ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１
ＣＤ−１マウスにおける静脈内投与（１．６ｍｇ／ｋｇ）後、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は０．１２Ｌ／ｋｇだった。全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）値は２．９ｍＬ／分／ｋｇだった。終末相半減期（Ｔ１／２）は１．９時間で、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１（０．５ｈ）より長かった。皮下投与後、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はよく吸収された。見掛けの皮下終末相半減期（Ｔ１／２）は１．９時間だった。
また、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１をヒト血清アルブミン（６ｍｇ／ｋｇ）との前混合後に１ｍｇ／ｋｇの用量でｏｂ／ｏｂマウスに皮下投与した。見掛けの皮下終末相半減期（Ｔ１／２）はさらに９時間に増加した。
静脈内投与および皮下投与後のサルにおけるＨｉｓタグ付きＦＧＦ２１およびＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の薬物動態
Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１
静脈内投与（０．５ｍｇ／ｋｇ）後、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１の定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は１Ｌ／ｋｇだった。全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）値は６．４ｍＬ／分／ｋｇだった。終末相半減期（Ｔ１／２）は１．９時間だった。皮下投与後、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは６５％だった。見掛けの皮下終末相半減期（Ｔ１／２）は４．３時間だった。
ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１
静脈内投与（０．０８ｍｇ／ｋｇ）後、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は０．０８Ｌ／ｋｇだった。全身血漿クリアランス（ＣＬＴｐ）値は０．０１２ｍＬ／分／ｋｇだった。終末相半減期（Ｔ１／２）は９７時間だった。皮膚投与後、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はよく吸収された。絶対皮下バイオアベイラビリティは６８％だった。見掛けの皮下終末相半減期（Ｔ１／２）は６７時間だった。
図１６は、例示的融合物であるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ３（配列番号１３４）と、ＳＡＢＡ部分がＦＧＦ２１のＣ末端にあるＦＧＦ２１−ＳＡＢＡ１ｖ１（配列番号１７１）の、サルにおけるｔ１／２を、Ｈｉｓタグ付きＦＧＦ２１と比較して示している。これらの結果は、ＦＧＦ２１のみと比較して、融合物がｔ１／２を約２７倍増加させたことを示している。データを下記表１９に要約する。
［表１９］ＳＡＢＡ−ＦＧＦ２１融合物に関する薬物動態データ
Figure 2016106074
実施例Ｂ７．ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はｏｂ／ｏｂマウスにおけるＨｂＡ１ｃを低下させる
ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１のさらなる急性および慢性効果を糖尿病ｏｂ／ｏｂマウスにおいて調べた。毎日の処置を３週間にわたって行った後の研究終了時に、血漿中グルコース、インスリン、および総コレステロールを観察した。血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼは低下し、β−ヒドロキシ酪酸レベルは上昇した。経口ブドウ糖負荷試験において、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１処置動物は、グルコース負荷を処理する能力の増加を示した。
もう一つの実験は、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の３つの異なる用量（０．０１または０．１または１ｍｇ／ｋｇ）のうちの１つをヒト血清アルブミン（６ｍｇ／ｋｇのＨＳＡ）と前もって混合し、それを１４日間にわたって注射（ｓ．ｃ．、ｑ．ｄ．）した糖尿病ｏｂ／ｏｂマウス（１群あたりｎ＝８）において行った。対照群にはＨＳＡ（ＰＢＳ中の６ｍｇ／ｋｇ）だけを与えた。最後の投与の２４時間後に、血漿試料中のＨｂＡ１ｃを測定した（図１９参照）。対照群（ＨＳＡのみを与えたもの）は、ベースライン値と比べてＨｂＡ１ｃレベルの低下を示さなかった。最も低い用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）は低下を示さず、中間用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）は統計的に有意でない０．３９％の低下を示した。最も高い用量である１ｍｇ／ｋｇ（すなわちｍｐｋ）は、ＨｂＡ１ｃに、ベースラインに対して０．９％、媒体との比較で０．９４％の低下を示し、これらは統計的に有意だった。したがって、ヒトアルブミンと同時注射したＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は、糖尿病マウスにおけるＨｂＡ１ｃレベルを低下させるのに有効であった。
０．０１、０．１および１ｍｇ／ｋｇ用量での血漿中ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１レベルは、最後の投与の２４時間後に、それぞれ３．８５、２．２８および２８．７３ｎｇ／ｍｌだった。
実施例Ｂ８．カニクイザルにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の薬物動態
静脈内（ＩＶ）投与後、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の定常状態分布容積（Ｖｓｓ）は０．０７６Ｌ／ｋｇだった。
この値は血漿体積より大きいが細胞外液の体積よりは小さかったことから、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１は主に細胞外間隙に存在することが示された。ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の全身血漿クリアランスは低く（０．７１ｍＬ／時間／ｋｇ）、サル血清アルブミンへの高アフィニティ結合と合致していた。
終末相半減期（Ｔ１／２）は９７時間だった（図２０および表２０参照）。さらにまた、ＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１はサルにおいて良好な皮下（ＳＣ）バイオアベイラビリティを示した（図２０および表２０参照）。絶対ＳＣバイオアベイラビリティは６８％だった。
［表２０］サルにおけるＳＡＢＡ１−ＦＧＦ２１ｖ１の単回投与薬物動態パラメータ（平均±ＳＤ）
Figure 2016106074
 ＊３匹のうちの１匹では投与の２４時間後の血漿試料が収集されなかった；サル：Ｎ＝２（ＩＶ）および３（ＳＣ）。
Ｃ．ＳＡＢＡ−合成ペプチド融合物分子
実施例Ｃ１．化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたＳＡＢＡ−合成ペプチド融合物分子に使用するためのＳＡＢＡポリペプチドの調製
合成的に誘導されたペプチドにコンジュゲートしてＳＡＢＡ融合タンパク質を形成させるためのＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓポリペプチドを、以下に述べる方法を使って作製した。このプロセスは、ポリペプチドリンカーによって共有結合されたＳＡＢＡ−ペプチド融合物を作製するためにも使用することができる。
（ＥＤ）５Ｇ Ｃ末端テール（配列番号３９７）とＣ末端Ｈｉｓ残基とを伴うＳＡＢＡ１．７（配列番号２２５）（ＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓ）をコードするＤＮＡ配列を、市販の発現ベクターｐＥＴ２９ｂ（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）に入れた。リボソーム結合部位のすぐ下流にあるプラスミドベクターのＮＤＥＩ制限エンドヌクレアーゼ部位とＸＨＯＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間に、配列を適切に配置した（図１０）。発現ベクターを宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に形質転換し、封入体として発現させた。
精製したプラスミドＤＮＡ発現ベクターを、当業者に広く知られている標準的形質転換法により、上記の大腸菌に組み込んだ、すなわち「形質転換」した。簡単に述べると、市販のコンピテント細胞（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を氷上で融解し、細胞が均等に懸濁されていることを保証するために、静かに混合した。これらの細胞を、氷上で予冷しておいた１．５ｍｌポリプロピレン製微量遠心チューブに、２０μｌずつピペッティングした。約１μｌの精製プラスミドＤＮＡ（１〜１０ｎｇ／μｌプラスミド）を細胞に直接加え、混合するために静かに振とうした。チューブを氷上に５分間保った後、正確に３０秒間、４２℃の水浴で加熱した。加熱したチューブを直ちに氷上に置き、２分間休ませた。８０μｌの室温ＳＯＣまたはＬＢ培地を各チューブに加えた。形質転換体の選択は、ｐＥＴ２９ｂプラスミドがコードする薬物耐性用に、カナマイシンを含有する培地で平板培養することによって達成した。
形質転換された細胞の終夜スターター培養を成長させることにより、大腸菌における可溶性ＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓの発現を開始した。細胞を、それぞれ１リットルのＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）培地（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、およびＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２， ２３３−２３５， ２００５）が入っている２リットル振とうフラスコの接種に使用した。可溶物収量を改善するために、振とうインキュベータの温度を１８℃まで低下させることができる。発酵を１２〜１６時間継続させ、遠心分離によって細胞を収穫し、圧縮湿細胞ペーストとして−８０℃で凍結した。タンパク質封入体（ＩＢ）の形成は、それが保護と、宿主細胞プロテアーゼ切断を最小限に抑えることに役立つので、好ましいことがわかった。
細胞溶解および封入体（ＩＢ）ペレットの調製
細胞を融解し、圧縮細胞ペースト１部に対してバッファー８〜１０部の希釈度で、溶解バッファーに懸濁した。Ａｖｅｓｔｉｎ Ｃ−５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ Ｉｎｃ．、カナダ・オンタリオ州オタワ）を使って、２０００ＰＳＩで２回通すことにより、細胞を機械的に溶解した。溶解後に、溶解物を遠沈した（４，０００ＲＰＭで２０〜３０分間）。可溶性画分は捨てる。細胞片を除去するために封入体ペレットを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗浄し、その懸濁液を再び遠心分離した。このプロセスを（典型的には２回または３回）繰り返した後は、ペレットが均一な白色に見える。次に、その結果得られた濃縮ＩＢ調製体ペレットをＰＢＳバッファーで洗浄することで、過剰の界面活性剤を除去した。
封入体の可溶化
次に、洗浄し界面活性剤を枯渇させたＩＢペレットを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と５００ｍＭ ＮａＣｌで緩衝化した６Ｍグアニジン−ＨＣｌに可溶化した。この方法で調製した材料の大半は、自由に溶液相に入るが、少量の細胞片が残るので、ＳＳ−３４ローター中、１６，０００ＲＰＭで１時間の遠心分離によって、これを除去した。リフォールディングおよび酸化ステップのために、上清をとっておいた。あるいは、この段階で、金属キレーションクロマトグラフィーステップ（ＩＭＡＣ）を使って、６×Ｈｉｓタグを含有するタンパク質を捕捉して、さらに精製することができる。カオトロープで変性させた材料をカラムに結合させ、夾雑物を洗浄してから、イミダゾールを補足した変性バッファーの存在下で溶出させることができる。
リフォールディング（および酸化の制御）
グアニジン−ＨＣｌで可溶化した材料を約１ｍｇ／ｍＬタンパク質（２８０ｎＭの吸光度で推定）に希釈し、３．５ＭＷＣＯ透析チューブに入れた。次に、透析デバイス中の試料を、４Ｌのリフォールドバッファー（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）に、４℃で終夜、静かに撹拌しながら浮かせた。透析リフォールドバッファーは、翌朝に、新鮮なリフォールドバッファーと交換する。
このプロセスの間に、融合タンパク質のジスルフィド酸化および／または架橋形成の調整を、必要に応じて達成することができる。適正な最終形態に到達するには、ジスルフィド橋がそのポリペプチド配列中の２つのシステイン残基間に形成されることを必要とするアミリンなどのペプチドの場合は、透析プロセス中に系を空気酸化させる。後で目的のペプチドにマレイミドコンジュゲートすることができるように還元型でなければならない単一のシステイン残基を含有するＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓの場合は、リフォールドプロセスの最後に還元剤（例えばＴＣＥＰ、トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはジチオスレイトール（ＤＴＴ））を添加することによって、酸化を最小限に抑えることができる。酸化を極力伴わないリフォールディングは、Ｃｙｓアミノ酸のチオラートアニオンが生じてジスルフィド橋形成を開始することが容易ではないｐＨ４．５におけるリフォールディングによって達成することもできる。
この簡便な透析法は便利であり、必要であればいくつかの試料を一度に処理することができる。あるいは、グアニジン−ＨＣｌの代わりに尿素中でタンパク質を変性させることもできる。あるいは、高いカオトロピック塩濃度から低い塩濃度への分子の急速希釈を使って、リフォールディングと酸化を行うこともできる。あるいは、空気酸化の代わりに、還元型および酸化型グルタチオン（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）の所定の酸化還元混合物を使って、系をリフォールディングさせることもできる。あるいは、上述のように透析または急速希釈によって自由拡散相でこれらのタンパク質をリフォールディングさせる代わりに、クロマトグラフィー樹脂に結合している間に、これらをリフォールディングさせてもよい。バルク凝集と収量損失につながりうるリフォールディング相中のタンパク質相互作用が最小限に抑えられるので、この方法では収率が改善されることが多い。
沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔ）の除去
リフォールドステップ（および必要であれば酸化ステップ）の終わりに、タンパク質の全てが可溶性のままであるわけではない。分子の一部は、凝集した状態で存在し、沈殿物（ｐｒｅｃｐｉｔａｔａｎｔ）として溶液から容易に降下する。この物質を、ＳＳ−３４ローターで１時間、１６，０００ＲＰＭで遠心分離することによって除去した。そして、典型的には、クロマトグラフィーに先だって、これを０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。
クロマトグラフィー分離
ＤＮＡおよび他の夾雑物を除去するために、リフォールディングされたＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓを、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑまたは類似のイオン交換媒体系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って精製することができる。４０ｍＬ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムをリフォールドバッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス、ｐＨ９．０）中で平衡化し、清澄化したリフォールディングされた材料を、そのカラムに通す。これらの条件下で、ポリペプチドの大部分は、結合せずに樹脂ベッドを通過する。洗浄された封入体からのＤＮＡおよび他の細胞片は、カラム樹脂上に保持される。あるいは、６×Ｈｉｓタグを含有するフォールディングされたポリペプチドを、この時点で、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）ステップを使って捕捉し、イミダゾールまたはヒスチジンの勾配で溶出させることもできる。
サイズ排除クロマトグラフィー
次に、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．２）中で前平衡化した２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ１００または２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５サイズ排除カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使って、ＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓをさらに精製することができる。単量体型タンパク質に対応する試料をプールし、必要であれば試料を１〜２ｍｇ／ｍｌに希釈してから、−８０℃で凍結した。ここで発現し精製されるタンパク質の発現および精製収率はさまざまである。これらの方法を使って、封入体を生産した元の自己誘導培地１Ｌにつき、０．５〜１０ｍｇ以上の精製収量を得ることができる。
実施例Ｃ２．化学的に誘導されたスペーサーによって連結されたＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物分子に使用するための神経ペプチドの化学合成
実施例Ｃ２−１：３−マレイミドプロピオニル−ＰＥＧ ２０ −ラットアミリン：Ｍａｌ−（ＰＥＧ） ２０ −ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−ＮＨ ２ の合成
ペプチドは、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロウェーブペプチドシンセサイザー（ＣＥＭ Ｃｏｒｐ．、ノースカロライナ州マシューズ）を使って、固相合成によって調製した。Ｆｍｏｃ脱保護およびカップリングステップは、２０Ｗの電力パルス印加シーケンスによってもたらされるマイクロ波加熱を使って、７５℃で行った。反応容器中に挿入した光ファイバープローブで反応温度を監視した。合成は、５０ｍＬポリプロピレン容器に入れた０．２５ｍｍｏｌのＦｍｏｃ保護ＰＡＬ−ＰＥＧレジン（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）から開始した。製造者によって提供された０．２５ｍｍｏｌスケール法を使ってアミノ酸をカップリングした。各カップリングステップの最初に、０．１Ｍ ＨＯＢｔを含有するＤＭＦ中の５％ピペラジンによる５分間の処置を２回行うことによって、Ｆｍｏｃ基を除去した。２０ｍＬのＤＭＦによる洗浄を５回行った後、ＤＭＦ中の０．５Ｍ ＨＣＴＵ（４当量）とＮＭＰ中の２Ｍ ＤＩＥＡ（８当量）で活性化することによって、必要なＦｍｏｃ−アミノ酸を逐次的にカップリングした。各カップリングの最後に、レジンを２０ｍＬのＤＭＦ洗浄液で５回洗浄した。Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ２０のカップリングに先だって、ペプチジル−レジン（０．１２５ｍｍｏｌ）の半分を取り除き、Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ２０を上述のように合成装置でカップリングした。Ｆｍｏｃ脱保護ペプチジル−レジンを、フリット付きポリプロピレンリアクターに移し、ＨＯＡｔ／ＤＩＣ（５当量）による１６時間の活性化によって、３−マレイミドプロピオン酸を手作業でカップリングした。ペプチジル−レジンをＤＭＦ（５ｍＬ×４）およびＤＣＭ（５ｍＬ×４）で洗浄し、再びＤＭＦ（５ｍＬ×４）で洗浄した。Ｉ２（２０当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を加え、その混合物を１時間撹拌した。レジンをＤＭＦ（５ｍＬ×５）およびＤＣＭ（５ｍＬ×３）で洗浄することにより、所望のラットアミリンペプチド誘導体Ｍａｌ−（ＰＥＧ）２０−ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱ ＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−ＮＨ２（アミド）を、環状ジスルフィド生成物として得た。
ＴＦＡ／水／フェノール（９０：５：５；ｖ：ｖ：ｗ）（１５ｍＬ）を使って室温で９０分間処理することにより、ペプチドを脱保護し、リジンから遊離させた。使用済みのレジンを濾去し、追加の切断溶液（２．５ｍＬ×２）ですすいだ。合わせた濾液を約４ｍＬまでエバポレートし、Ｅｔ２Ｏ（３５ｍＬ）の添加によって生成物を沈殿させた。沈殿した生成物を遠心分離によって集め、追加のＥｔ２Ｏで洗浄し、乾燥することで、オフホワイトの固形物（理論値の５０％）を得た。
次に述べるように島津モデルＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフィーでの分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって、粗ペプチドを精製した。ペプチドを水／ＡｃＣＮ／ＴＦＡ（６０：４０：０．１）に溶解し、０．４５ミクロンフィルターで濾過し、一度に３０ｍｇをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（２１．２×１００ｍｍ；５μ）に注入した。４５分にわたるＡ中の２５−４５％Ｂの勾配を使って、１５ｍＬ／分で生成物を溶出させた（２２０ｎｍにおけるＵＶ検出）。溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ；溶媒Ｂ：ＡｃＣＮ中の０．１％ＴＦＡ。分析用ＨＰＬＣによる決定できれいな生成物を含有するフラクションを合わせて凍結乾燥することで、純度が少なくとも９５％の生成物を白色凍結乾燥物として得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１４６４．０および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１０９７．９は、分子量計算値４３８９．９Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−２：３−マレイミドプロピオニル−（ＧＳ） ５ −ラットアミリン：Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−ＮＨ ２ の合成
実施例Ｃ２−１に記載したものと同じ固相カップリングおよびジスルフィド環化法を使ってペプチドを調製することにより、所望のラットアミリンペプチド誘導体Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＫＣＮＴＡＴＣＡＴＱＲＬＡＮＦＬＶＲＳＳＮＮＬＧＰＶＬＰＰＴＮＶＧＳＮＴＹ−ＮＨ２（アミド）を環状ジスルフィド生成物として得た。脱保護とレジンからの遊離後に、４０分にわたるＡ中の１０−５５％Ｂの勾配を使ってペプチドを溶出した点以外は実施例Ｃ２−１で述べたとおりに、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも９８％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１５９８．３および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１１９９．３から導き出される４７９２．２Ｄという分子量は、分子量計算値４７９１．２Ｄの１ダルトン以内にある。
実施例Ｃ２−３：３−マレイミドプロピオニル−Ａｈｘ−マウスＰＹＹ（３−３６）：Ｍａｌ−Ａｈｘ−ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ ２ の合成
実施例Ｃ２−１に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスＰＹＹ（３−３６）ペプチド誘導体Ｍａｌ−Ａｈｘ−ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２を得た。Ａｌａ１２−Ｓｅｒ１３残基対とＡｌａ２２−Ｓｅｒ２３残基対は、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨシュードプロリンジペプチド（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）としてカップリングした。脱保護およびレジンからの遊離後に、４５分にわたるＡ中の５−５０％Ｂの勾配を使ってペプチドを溶出した点以外は実施例Ｃ２−１で述べたとおりに、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも９７％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１４１５．８および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１０６２．２は、分子量計算値４２４４．７Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−４：３−マレイミドプロピオニル−ＰＥＧ ２０ −マウスＰＹＹ（３−３６）：Ｍａｌ−ＰＥＧ ２０ −ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ ２ の合成
Ｆｍｏｃ−６−Ａｈｘ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＰＥＧ２０−ＯＨをカップリングした点以外は実施例Ｃ２−３に記載したものと同じ固相カップリング法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスＰＹＹ（３−３６）ペプチド誘導体Ｍａｌ−ＰＥＧ２０−ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ２を得た。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例Ｃ２−３に記載したように分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも８６％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１４８４．８および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１１１３．５は、分子量計算値４４４９．９Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−５：３−マレイミドプロピオニル−（ＧＳ） ５ −マウスＰＹＹ（３−３６）：Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ−ＮＨ ２ の合成
このペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例Ｃ２−３に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、所望のマウスＰＹＹ（３−３６）ペプチド誘導体Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＡＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＳＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱ ＲＹ−ＮＨ２を９５％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１６１８．５および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１２１４．１は、分子量計算値４８５２．２Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−６：３−マレイミドプロピオニル−Ａｈｘ−マウスＰＰ：Ｍａｌ−Ａｈｘ−ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲＰＲＹ−ＮＨ ２ の合成
実施例Ｃ２−３に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスＰＰペプチド誘導体Ｍａｌ−Ａｈｘ−ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲＰＲＹ−ＮＨ２（アミド）を得た。Ａｌａ１２−Ｔｈｒ１３残基対は、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（ΨＭｅ，Ｍｅｐｒｏ）−ＯＨシュードプロリンジペプチド（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）としてカップリングした。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例Ｃ２−３で述べたとおりに分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも９９％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１５３３．５および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１１５０．４から導き出される４５９７．５Ｄの分子量は、分子量計算値４５９８．２Ｄの１ダルトン以内にある。
実施例Ｃ２−７：３−マレイミドプロピオニル−ＰＥＧ ２０ −マウスＰＰ：Ｍａｌ−ＰＥＧ ２０ −ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲＰＲＹ−ＮＨ ２ の合成
Ｆｍｏｃ−６−Ａｈｘ−ＯＨの代わりにＦｍｏｃ−ＰＥＧ２０−ＯＨをカップリングした点以外は実施例Ｃ２−６に記載したものと同じ固相法を使ってこのペプチドを調製することにより、所望のマウスＰＰペプチド誘導体Ｍａｌ−ＰＥＧ２０−ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲＰＲＹ−ＮＨ２（アミド）を得た。脱保護およびレジンからの遊離後に、実施例Ｃ２−３で述べたとおりに分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで粗ペプチドを精製することにより、純度が少なくとも９１％の生成物を得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１６０１．９および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１２０１．７から導き出される４８０３．０Ｄの分子量は、分子量計算値４８０３．４Ｄの１ダルトン以内にある。
実施例Ｃ２−８：３−マレイミドプロピオニル−（ＧＳ） ５ −マウスＰＰ：Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲＰＲＹ−ＮＨ ２ の合成
このペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例Ｃ２−６に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、所望のマウスＰＰペプチド誘導体Ｍａｌ−ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ−ＡＰＬＥＰＭＹＰＧＤＹＡＴＰＥＱＭＡＱＹＥＴＱＬＲＲＹＩＮＴＬＴＲ ＰＲＹ−ＮＨ２（アミド）を、９０％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１３０２．５および（Ｍ＋５Ｈ）５＋／５＝１０４２．１は、分子量計算値５２０５．７Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−９：ヒトオステオカルシン：ＹＬＹＱＷＬＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲＲＥＶＣＥＬＮＰＤＣＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱＥＡＹＲＲＦＹＧＰＶ（Ｃｙｓ ２３ −Ｃｙｓ ２９ ジスルフィドによって環化したもの）の合成
線状ペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例Ｃ２−６に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、ヒトＯＣＮの所望の線状前駆体を８７％の純度で得た。ペプチドの酸化的ジスルフィド環化は、５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．１）、５ｍＭ還元型グルタチオンおよび０．５ｍＭ酸化型グルタチオン中の線状ペプチドの溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ；２０ｍＬ）を室温で４日間撹拌することによって達成した。その溶液をロータリーエバポレーションによって１０ｍＬまで濃縮し、４０分にわたるＡ中の２０−５０％Ｂの勾配を溶出に使用した点以外は実施例Ｃ２−１で述べたとおりに、分取用ＨＰＬＣでペプチドを精製した。これにより、所望の環状ヒトＯＣＮペプチドを９９％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１９３３．３および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１４４９．８は、分子量計算値５７９７．４Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−１０：マウスオステオカルシン：ＹＬＧＡＳＶＰＳＰＤＰＬＥＰＴ ＲＥＱＣＥＬＮＰＡＣＤＥＬＳＤＱＹＧＬＫＴＡＹＫＲＩＹＧＩＴＩ（Ｃｙｓ １９ −Ｃｙｓ ２５ ジスルフィドによって環化したもの）の合成
線状ペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例Ｃ２−９に記載したものと同様の固相法を使ってカスタム合成され、マウスＯＣＮの所望の線状前駆体を９０％の純度で得た。このペプチドを、実施例Ｃ２−９で述べたように環化し、分取用ＨＰＬＣで精製することにより、環状マウスＯＣＮペプチドを９８％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１７０５．３および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１２７９．５は、分子量計算値５１１４．７Ｄと合致している。
実施例Ｃ２−１１：ラットオステオカルシン：ＹＬＮＮＧＬＧＡＰＡＰＹＰＤＰＬＥＰＨ ＲＥＶＣＥＬＮＰＮＣＤＥＬＡＤＨＩＧＦＱＤＡＹＫＲＩＹＧＴＴＶ（Ｃｙｓ ２３ −Ｃｙｓ ２９ ジスルフィドによって環化したもの）の合成
このジスルフィド環状ペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ， Ｉｎｃ．（ニュージャージー州ピスカタウェイ）により、実施例Ｃ２−９に記載したものと同様の固相法および酸化的環化法を使ってカスタム合成され、所望の環状ラットＯＣＮを９６％の純度で得た。ペプチドの実体をエレクトロスプレーモードのＬＣ／ＭＳ分析によって確認した。実測されたｍ／ｚイオン（Ｍ＋３Ｈ）３＋／３＝１８６２．５および（Ｍ＋４Ｈ）４＋／４＝１３９７．５は、分子量計算値５５８６．１Ｄと合致している。
実施例Ｃ３．化学的に誘導されたスペーサーにより、マレイミドコンジュゲーション反応を使って連結された、ＳＡＢＡ−アミリン、ＳＡＢＡ−ＰＹＹおよびＳＡＢＡ−ＰＰ融合物分子の形成
Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で上に概説したように精製したＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓタンパク質を０．５ｍＭ ＴＣＥＰで還元した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．２中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、ＴＣＥＰを除去し、タンパク質をさらに精製した。溶出したＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓタンパク質を、このバッファー中で、モル比１：１のマレイミド−ＰＥＧ２０−アミリン−ＣＯＮＨ２、マレイミド−ＰＥＧ２０−ＰＹＹ−ＣＯＮＨ２またはマレイミド−ＰＥＧ２０−ＰＰ−ＣＯＮＨ２合成ペプチドと合わせ、静かに振とうしながら４℃で終夜インキュベートした。
インキュベーション後に、反応混合物を０．２μｍフィルターで濾過し、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ ＳＥＣカラムを使って、修飾タンパク質ＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２０−アミリン−ＣＯＮＨ２（配列番号３２８）、ＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２０−ＰＹＹ−ＣＯＮＨ２（配列番号３４４）またはＳＡＢＡ１．７−（ＥＤ）５Ｇ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ２０−ＰＰ−ＣＯＮＨ２（配列番号３６４）を、遊離の反応物から単離した。
実施例Ｃ４．ヒト血清アルブミンへのＳＡＢＡ−神経ペプチド（アミリン、ＰＹＹおよびＰＰ）融合物の結合効力
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、分子相互作用をリアルタイムに観察することができる直接結合技法である。これらの実験では、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使ってＳＰＲ結合研究を行った。ランニングバッファーであるリン酸緩衝食塩水０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０ ｐＨ７．４はＴｅｋｎｏｖａから購入し（カタログ番号Ｐ１１９２）、全ての実験を２５℃で行った。ヒト血清アルブミンは、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したアミンカップリング試薬を使用し、製造者の指針に従って、アミンカップリングにより、ＢｉｏＲａｄ ＧＬＣチップ上に直接固定化した。ヒト血清アルブミンはＮｏｖｏｚｙｍｅｓから購入した（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（商標））。約５０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のヒト血清アルブミンを、ＧＬＣチップ表面の別々の４レーン上に固定化した。各分析物について、１５．６ｎＭから２５０ｎＭまでの範囲にわたる５つの濃度を、３０μｌ／分で、２４０秒間、表面上に注入した。解離を６００秒間監視した。表面を１００ｍＭ ＨＣｌで再生した。その結果得られたデータを、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使って、ラングミュア１：１結合モデルにフィッティングした。異なる濃度範囲で実験を繰り返した。この第２の実験では、５００ｎＭから３２ｎＭまでの範囲にわたる５つの濃度を表面上に注入し、上記のようにデータを分析した。これらの実験の結果を平均し、表２１に示す。ＫＤは解離定数である。
小さい数字は血清アルブミンへの強固な結合を示す。血清アルブミンに結合するＳＡＢＡに共有結合された分子は、ＳＡＢＡ−ＦＧＦ−２１融合物に関して先に述べたように、より長い生体内薬物動態半減期を示す。
［表２１］ヒト血清アルブミンへの結合に関するＳＡＢＡ−神経ペプチド融合物のＫｏｎ、ＫｏｆｆおよびＫＤ値
Figure 2016106074
実施例Ｃ５．ＳＡＢＡ−合成ペプチド融合物のインビトロ活性
実施例Ｃ５−１：ＳＡＢＡ−アミリン融合物のインビトロ活性
アミリンは、Ｇｓ共役ＧＰＣＲであるアミリン受容体を活性化することによって細胞環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）生産を誘導する。したがって細胞ｃＡＭＰ生産は、アミリンアゴニストのインビトロでの機能的活性の読出しとして使用される。具体的には、力価（ＥＣ５０）および効力（アミリンペプチドで観察される最大活性に対するパーセンテージとして）などといったインビトロ活性を、ＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５（配列番号３２８）タンパク質について決定した。
下記表２２に示すように、ＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５は、アミリン受容体を安定に発現するＨＥＫ細胞におけるｃＡＭＰ生産を刺激する。ＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５の力価（ＥＣ５０）は１２．２ｎＭであり、効力はアミリンペプチドの約１１９％である。したがってＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５は、ＳＡＢＡに連結されていても、インビトロアッセイにおいて完全なアミリンの機能的活性を保っている。さらなる実験において、ラットアミリンとＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５はどちらもＨＥＫ親細胞におけるｃＡＭＰレベルに対して有意な効果を持たなかったことから、アミリン受容体に対するそれらの特異性が実証された。
アミリン受容体安定細胞株の構築
アミリン受容体は、カルシトニン受容体（ＣＴ）と受容体活性調節タンパク質（ＲＡＭＰ）の一つとのヘテロ二量体である。チンパンジーＣＴ（ａ）とヒト受容体活性調節タンパク質３（ＲＡＭＰ３）との両方をＨＥＫ−２９３細胞に安定にトランスフェクトすることにより、組換えアミリン受容体細胞株を作製した。ラットアミリン、サケカルシトニン、ヒトカルシトニンおよびヒトＣＧＲＰなどといったいくつかのアミリンアゴニストペプチドを使って、これらの組換え受容体細胞株を選択し、特徴づけた。安定細胞株は、３００μｇ／ｍｌネオマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含む完全ＤＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
ＳＡＢＡ１−ＡＭＹｖ２５活性を評価するためのインビトロ環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）機能アッセイ
Ｃｉｓｂｉｏ（マサチューセッツ州ベッドフォード）製のＨＴＲＦ（登録商標）ｃＡＭＰアッセイキットを使ってｃＡＭＰアッセイを行った。アミリン受容体安定細胞を、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）７５ｃｍ２フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）において、培地（１０％ＦＢＳ、３００μｇ／ｍｌネオマイシンおよび２５０μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＤＭＥＭ）中、３７℃および５％ＣＯ２で成長させた。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製の細胞解離バッファー（酵素フリー）を使って細胞をフラスコから収穫した。ＰＢＳバッファーで１回洗浄した後、細胞をアッセイバッファー（ＨＢＳＳバッファー、２．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００μＭ ＩＢＭＸ）に再懸濁し、９６ウェルアッセイプレートにローディングした（約２，０００細胞／ウェル）。次に細胞を、アミリンペプチドまたはＳＡＢＡ−アミリンと共に、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞中のｃＡＭＰ量を製造者のプロトコール（Ｃｉｓｂｉｏ）に従って決定した。
実施例Ｃ５−２：ＳＡＢＡ−ＰＹＹ ３−３６ およびＳＡＢＡ−ＰＰ融合物のインビトロ活性
ペプチドＹＹ（ＰＹＹ）および膵ポリペプチド（ＰＰ）は、摂食に呼応してそれぞれ腸および膵臓から分泌される天然の満腹因子であり、絶食すると減少する。ＰＹＹおよびＰＰは、どちらも、３６残基ペプチドアミドである完全長型で単離することができる。ＰＹＹは、酵素ＤＰＰＩＶによってさらに切断されて、より短い生物活性型ＰＹＹ（３−３６）にもなりうる。ＰＹＹ（３−３６）またはＰＰの末梢注射は、動物モデルおよびヒトにおいて、食物摂取量と体重の低下を引き起こす。病的肥満を有する患者では、基礎および食餌刺激時ＰＹＹ（３−３６）および／またはＰＰレベルが、どちらも低下している。対照的に、食欲不振またはバイパス手術後の体重減少を伴う患者では、血漿中ＰＹＹ（３−３６）および／またはＰＰが正常より高い。ＰＹＹ（３−３６）およびＰＰのアゴニズムは、肥満および代謝性疾患の処置に大きな治療的価値を有する。ＮＰＹ Ｙ２およびＹ４は、それぞれＰＹＹ（３−３６）およびＰＰに対して最も高いアフィニティを有する受容体である。ＮＰＹ受容体はＧ−タンパク質共役受容体ファミリーに属する。アゴニスト刺激を受けると、ＮＰＹ受容体は、下流のＧ−タンパク質を刺激して、その結合型ＧＤＰをＧＴＰと交換しうる。競合結合アッセイを使って、それぞれの受容体に対するＳＡＢＡ１−ＰＹＹｖ７（配列番号３４４）およびＳＡＢＡ１−ＰＰｖ７（配列番号３６４）の結合アフィニティを測定し、ＧＴＰγＳ結合アッセイを使って、最初期の受容体媒介イベントの一つにおける受容体占有の機能的結果を測定した。
表２２に示すように、記載のアッセイにおいて測定された力価（ＥＣ５０）は、ＰＹＹ３−３６については０．６ｎＭであり、ＳＡＢＡ１−ＰＹＹｖ７融合物については５２ｎＭである。記載のアッセイにおいて測定された力価（ＥＣ５０）は、ＰＰについては１．７ｎＭであり、ＳＡＢＡ１−ＰＰｖ７融合物については＞１μＭである。ＳＡＢＡ１−ＰＰｖ７融合物に関する力価の減少は、ＳＡＢＡとＰＰポリペプチドをコンジュゲートするために使用したＰＥＧ２０リンカーによるのかもしれない。ＰＥＧ２０リンカーはこのコンストラクトでは最適とは言えないかもしれないので、ＳＡＢＡ−ＰＰ融合物の力価を改善するには、代替リンカーを持つコンストラクトが使用されるであろう。
受容体膜調製：
ヒトＮＰＹ Ｙ２またはＹ４受容体を過剰発現する組換えＣＨＯ細胞のＴ１５０フラスコ１本を、０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＦ−１２培地（Ｌ−グルタミン酸を含むＨＡＭ）でコンフルエントになるまで成長させた。収穫前に細胞をＰＢＳ（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないもの）で洗浄し、次に、細胞解離溶液を使って剥離した。遠心分離後に、細胞ペレットを１ｍｌの溶解バッファー（２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡおよびプロテイナーゼインヒビター）に再懸濁し、ポリトロンホモジナイザーを使ってホモジナイズした（５に設定、１０秒×２）。ホモジナイズされた細胞を１，０００ｇで１０分間遠心分離した。上清を集め、ペレットを１ｍｌの溶解バッファーに再懸濁し、ホモジナイズし、再び１，０００ｇで１０分間、遠心分離した。両方の遠沈で得た上清をプールし、１００，０００ｇで６０分間遠心分離した。その結果得られた膜ペレットを２５０μｌのアッセイバッファー（ＴＢＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）に再懸濁した。タンパク質濃度を測定し、小分けしたものを使用時まで−８０℃で保存した。
競合結合アッセイ：
アッセイは、９６ウェルプレートにおいて、総体積２５０μｌのアッセイバッファー（ＴＢＳ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２）で行った。反応混合物は、アッセイ試料（ＳＡＢＡ１−ＰＹＹｖ７／ＳＡＢＡ１−ＰＰｖ７、対照ＰＰ／ＰＹＹ（３−３６）、対照培地）、膜、および０．０２５ｎＭの１２５Ｉ−ｈＰＹＹまたは１２５Ｉ−ｈＰＰ（２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）からなった。試薬添加の順序は、１５０μｌのアッセイ試料、５０μｌの１２５Ｉ−ＰＹＹまたは１２５Ｉ−ｈＰＰ、次に５０μｌの膜（アッセイバッファー中、１〜３μｇ／ウェル）であった。結合混合物を室温で１２０分間インキュベートした。Ｐａｃｋａｒｄセルハーベスターを使って反応をＧＦ／Ｃプレート（０．５％ポリエチレンイミンおよび０．１％ＢＳＡに予浸したもの）上に移すことにより、結合反応を停止させた。次に、フィルタープレートを、氷冷５０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．４）で、２００ｍｌ×４回洗浄した。洗浄後に、４０μｌのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ２０を各ウェルに加え、Ｐａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔシンチレーション計数器で、プレートをカウントした。
ＧＴＰγＳ結合アッセイ
アッセイは、９６ウェルプレート上、１００μｌの総体積で行った。まず最初に、１０μｌのユニバーサルバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０μＭ ＧＤＰ、０．１％ＢＳＡ）を各ウェルに加えた。次に、１０μｌの試験試料を加え、続いて４０μｌの膜（アッセイバッファー中、１〜３μｇ／ウェル）を加え、よく混合した。反応を２５℃で振とうしながら３０分間インキュベートした。次に、３５Ｓ−ＧＴＰ（０．２５μＣｉ／ｍｌ）を含む４０μｌのＳＰＡビーズ（０．５ｍｇ／ウェル）を加え、振とうしながら２５℃でさらに６０分間インキュベートした。１０００ｒｐｍで５分間の遠沈によって反応を停止させた。
［表２２］ＳＡＢＡ−アミリン、ＳＡＢＡ−ＰＹＹ３−３６およびＳＡＢＡ−ＰＰ融合物の機能的活性
Figure 2016106074
 ＊ネイティブペプチドリガンド最大活性に対する試験化合物の％として表したもの。結果を、１回の実験で得た三つ一組の測定の平均±ＳＥＭとして表す。
Ｄ．他のＳＡＢ融合物分子
実施例Ｄ１：ＳＡＢＡ−オステオカルシン融合物のインビトロ活性
オステオカルシン（ＯＣＮ）は膵β細胞におけるインスリン分泌を刺激するので、齧歯類動物の島からのインスリン生産が、インビトロでオステオカルシン（ＯＣＮ）の生物学的機能を評価するための読出しとして使用される。齧歯類動物の島を、ネイティブヒトＯＣＮ（ｈＯＣＮ）およびＡｄｎｅｃｔｉｎ ＳＡＢＡ融合ヒトＯＣＮ（ＳＡＢＡ−ｈＯＣＮ）で処理し、各コンストラクトに関連するインスリン分泌の強化の程度を決定する。
実施例Ｄ２：ＳＡＢＡ−アペリン融合物
ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮｖ２は、６×Ｈｉｓ タグおよび（ＧＳ）７リンカーを介してＡＰＬＮｖ４に融合されたＳＡＢＡ１．６の融合物である。麻酔したラットにおいて、ＡＰＬＮｖ４は、６０μｇ／ｋｇの静脈内送達で、ロバストな血圧降下作用を示した。ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮｖ２は１５，０００の分子量を示すので、ＡＰＬＮｖ４は融合タンパク質の質量の１０％に相当する。ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮｖ２を、麻酔したラットに６００μｇ／ｋｇの用量で静脈内送達しても、血圧には影響がなかった。ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮｖ２コンストラクトに活性がなかったことの考えうる説明には、生産的衝突頻度の減少、立体障害、またはペプチド−ＰＫＥアニーリングによる、力価の減損が包含されうる。ＳＡＢＡ−ＡＰＬＮｖ２がＨＳＡに結合するかどうかを決定するための試験は行わなかった。

Claims (65)

  1. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンのドメイン1または2に１μＭ以下のKDで結合し、アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きいポリペプチド。
  2. 10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
  3. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項1または2に記載のポリペプチド。
  4. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  5. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが配列番号2と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  6. 10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループの1つ以上を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
  7. 10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44から選択される配列を含む、請求項5に記載のポリペプチド。
  8. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項5〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項5〜7のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 10Fn3ドメインが１μＭ以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜9のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 10Fn3ドメインが500nM以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜10のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項5〜11のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項5〜12のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項5〜13のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  15. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きい、請求項5〜14のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  16. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項5〜15のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  17. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を含むBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を含むDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を含むFGループを含む、ポリペプチド。
  18. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項17に記載のポリペプチド。
  19. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項17に記載のポリペプチド。
  20. 10Fn3ドメインが１μＭ以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜19のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. 10Fn3ドメインが500nM以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜20のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項17〜21のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項17〜22のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  24. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項17〜23のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  25. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が、血清アルブミンの非存在下におけるポリペプチドの血清中半減期より少なくとも5倍大きい、請求項17〜24のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項17〜25のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  27. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインと異種タンパク質とを含む融合ポリペプチドであって、10Fn3ドメインが１μＭ以下のKDでヒト血清アルブミンに結合する、融合ポリペプチド。
  28. 10Fn3ドメインが、配列番号4と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、請求項27に記載の融合ポリペプチド。
  29. 10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項27または28に記載の融合ポリペプチド。
  30. 10Fn3ドメインが、配列番号5に示すアミノ酸配列を有するBCループ、配列番号6に示すアミノ酸配列を有するDEループ、および配列番号7に示すアミノ酸配列を有するFGループを含む、請求項27または28に記載の融合ポリペプチド。
  31. 異種タンパク質が、線維芽細胞成長因子21（FGF21）、インスリン、インスリン受容体ペプチド、骨形成タンパク質9（BMP-9）、アミリン、ペプチドYY（PYY3-36）、膵ポリペプチド（PP）、インターロイキン21（IL-21）、グルカゴン様ペプチド1（GLP-1）、プレクタシン、プログラニュリン、アトストリン、オステオカルシン（OCN）、アペリン、または10Fn3ドメインを含むポリペプチドから選択される、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  32. 異種タンパク質がFGF21である、請求項31に記載の融合ポリペプチド。
  33. 異種タンパク質が配列番号118に示す配列を含む、請求項32に記載の融合ポリペプチド。
  34. 異種タンパク質が、HSA以外のターゲットタンパク質に結合する第2の10Fn3ドメインを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  35. ターゲットタンパク質に結合する第3の10Fn3ドメインをさらに含む、請求項34に記載の融合ポリペプチド。
  36. 第3の10Fn3ドメインが、第2の10Fn3ドメインと同じターゲットに結合する、請求項35に記載の融合ポリペプチド。
  37. 第3の10Fn3ドメインが、第1および第2の10Fn3ドメインとは異なるターゲットに結合する、請求項35に記載の融合ポリペプチド。
  38. 10Fn3ドメインが、アカゲザル血清アルブミン（RhSA）、カニクイザル血清アルブミン（CySA）、またはマウス血清アルブミン（MuSA）の1つ以上にも結合する、請求項27〜37のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  39. 10Fn3ドメインが、RhSA、CySAまたはMuSAの1つ以上と交差反応しない、請求項27〜37のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  40. 10Fn3ドメインが１μＭ以下のKDでHSAに結合する、請求項27〜39のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  41. 10Fn3ドメインがHSAのドメインIまたはIIに結合する、請求項27〜40のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  42. 10Fn3ドメインが5.5〜7.4のpH範囲において血清アルブミンに結合する、請求項27〜41のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  43. 10Fn3ドメインがpH5.5において200nM以下のKDでHSAに結合する、請求項27〜42のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  44. 血清アルブミンの存在下における融合物の半減期が、異種タンパク質単独の半減期より少なくとも5倍大きい、請求項27〜43のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  45. 血清アルブミンの存在下におけるポリペプチドの血清中半減期が少なくとも2時間である、請求項27〜44のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
  46. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインが、（i）野生型10Fn3ドメインと比較して、AB、BC、CD、DE、EFおよびFGループの1つ以上に修飾されたアミノ酸配列を含み、（ii）野生型10Fn3ドメインによって結合されないターゲット分子に結合し、かつ（iii）配列(ED)nを有するC末端テール（ここで、nは3〜7の整数である）を含む、ポリペプチド。
  47. 10Fn3ドメインが、配列番号1の残基9〜94に示すアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項46に記載のポリペプチド。
  48. C末端テールがN末端にE、IまたはEIをさらに含む、請求項46または47に記載のポリペプチド。
  49. C末端テールが、ポリペプチドの溶解度を向上させるか、ポリペプチドの凝集を減少させるか、またはその両方である、請求項46〜48のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  50. 10Fn3ドメインが、野生型10Fn3ドメインと比較して、BC、DEおよびFGループのそれぞれに修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項46〜49のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  51. １μＭ以下のKDでターゲットに結合する、請求項46〜50のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  52. 配列番号132〜174から選択される配列を含む、請求項32に記載の融合ポリペプチド。
  53. 異種タンパク質がPYY3〜36、PPまたはアミリンである、請求項31に記載の融合ポリペプチド。
  54. フィブロネクチンIII型第10（10Fn3）ドメインを含むポリペプチドであって、10Fn3ドメインがヒト血清アルブミンに結合し、かつ10Fn3ドメインが、配列番号8、12、16、20、および24〜44と少なくとも70％同一なアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  55. 請求項1〜54のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
  56. 生理学上許容される担体をさらに含む、請求項55に記載の医薬組成物。
  57. 糖尿病を処置し、インスリン抵抗性を処置するか低下させ、肥満を処置し、体重を減少させるか体重増加を防止し、異常脂質血症を処置し、脂肪組織におけるグルコース取り込みを増加させ、または糖尿病の進行を遅らせるための方法であって、請求項32〜33または52のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  58. 低血糖、肥満、糖尿病、摂食障害、インスリン抵抗性症候群、または心血管疾患を処置するための方法であって、請求項53に記載の融合ポリペプチドの治療有効量を対象に投与することを含む方法。
  59. 請求項1〜26、45〜51または53のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項27〜45または52のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードする核酸。
  60. 表3に示す配列を含む、請求項58に記載の核酸。
  61. 請求項59または60の核酸を含むベクター。
  62. 発現ベクターである、請求項61のベクター。
  63. 請求項61または62のベクターを含む宿主細胞。
  64. 細菌細胞である、請求項63に記載の宿主細胞。
  65. 哺乳動物細胞である、請求項63に記載の宿主細胞。
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