TWI739358B - 帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體 - Google Patents

帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體 Download PDF

Info

Publication number
TWI739358B
TWI739358B TW109110106A TW109110106A TWI739358B TW I739358 B TWI739358 B TW I739358B TW 109110106 A TW109110106 A TW 109110106A TW 109110106 A TW109110106 A TW 109110106A TW I739358 B TWI739358 B TW I739358B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
amino acid
mbm
residue
central core
scfv
Prior art date
Application number
TW109110106A
Other languages
English (en)
Other versions
TW202102521A (zh
Inventor
張子文
朱鑫懋
田偉廷
游約翔
Original Assignee
免疫功坊股份有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 免疫功坊股份有限公司 filed Critical 免疫功坊股份有限公司
Publication of TW202102521A publication Critical patent/TW202102521A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI739358B publication Critical patent/TWI739358B/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/547—Chelates, e.g. Gd-DOTA or Zinc-amino acid chelates; Chelate-forming compounds, e.g. DOTA or ethylenediamine being covalently linked or complexed to the pharmacologically- or therapeutically-active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6887—Antibody-chelate conjugates using chelates for therapeutic purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

在此揭示複合多肽。根據多種實施方式，所述複合多肽包含一親本多肽以及一金屬結合域，其能夠與金屬離子形成複合物。所述複合多肽可和帶有多個功能性元件的接合單元耦接，以形成多功分子構建體。或者是，可將多個複合多肽耦接至一接合單元，以形成一分子構建體，或稱胜肽束。亦揭示了適合與此種帶有金屬結合域之複合多肽耦接的接合單元。

Description

帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體
本發明是有關於一種帶有金屬結合域之複合多肽，且特別是有關於能和鋅離子形成複合物的短的寡肽。
生物耦合(Bioconjugation)技術可用於在生物分子與另一分子(可以是或不是生物分子)的之間形成共價鍵。生物分子通常是指存在於生物體中且對生物過程至關重要的分子。所述生物分子包括天然和合成的多肽或蛋白質、碳水化合物、脂質、核酸與代謝產物。
將抗體或抗體片段接上毒素(即抗體-毒素複合體(antibody-toxin conjugate，簡稱ATC))、細胞毒性藥物(即抗體-藥物複合體(antibody-drug conjugate，簡稱ADC))和放射性核素(即抗體-放射性核素複合體(antibody-radionuclide conjugate，簡稱ARC))的概念萌發於1970年代。此類生物耦合物的合成通常涉及耦合反應，例如與表面可接近的離胺酸、半胱胺酸或酪胺酸殘基的耦合，以及對表面可接近的離胺酸或色胺酸殘基或N-和C-端的修飾。然而，在親本抗體中可能有大量的上述胺基酸殘基，且耦合反應通常是隨機 發生。因此，這種耦合反應缺乏化學選擇性且效率不彰，並且經常導致異質產物。例如，對huN901-DM1(美登木素生物鹼類-單株抗體免疫複合物)的先前研究顯示，以離胺酸複合的ADC樣品之藥物-抗體比(drug-to-antibody ration，DAR)介於0到6之間，且可能包含超過450萬種獨特的分子。
有鑑於此，本領域亟需一種耦合技術，其能夠有效率地將功能性元件耦接到生物分子(特別是胜肽類分子)上的特定位置。本發明提供了此一需求的解方。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施方式的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。其唯一目的是以一種簡化的形式呈現本文所公開的一些概念，作為稍後呈現的實施方式的序言。
本發明之一態樣係有關於一種金屬結合域，其能夠在適當條件下雨鋅離子形成複合物。
根據本揭示內容一實施方式，所述金屬結合域包含以下胺基酸序列：CX1X2HA(序列編號：1)，由N-端至C-端或由C-端至N-端，其中X1為甘胺酸或脯胺酸、X2為甘胺酸或丙胺酸，且所述金屬結合域位於親本多肽的N-或C-端。所述金屬結合域的例示性實施例包括但不限於：CGGHA(序列編號：2)、CPGHA(序列編號：3)、CGAHA(序列編號：4)、CPAHA(序列編號：5)、GCGGHA (序列編號：6)、ACPGHA(序列編號：7)以及GCPGHA(序列編號：8)。
於另一種態樣中，本揭示內容是關於一種複合多肽，其包含如上述態樣/實施方式所述的金屬結合域。所述複合多肽因此能夠在適當的條件下，透過該金屬結合域和金屬離子形成複合物。如此一來，與金屬離子形成複合物之半胱胺酸殘基中的硫氫基比起沒有和金屬離子形成複合物之半胱胺酸殘基中的硫氫基有更強的反應性。當可理解，所述複合物可以和另外一個化學時匹或生物分子以位置專一性的方式進行化學耦合，以得到一生物耦合物。
根據本揭示內容一實施方式，所述複合多肽包含一親本多肽以及位於親本多肽N-或C-端的一金屬結合域。在某些可任選的實施例中，在親本多肽與金屬結合域間有1到10個作為中間序列的甘胺酸殘基，然而在其他實施例中，此處提出的金屬結合域是直接位於上述親本多肽之前或之後。
在又一種態樣中，可將一或多個功能性元件共價耦接至本揭示內容上述態樣/實施方式所提出的複合多肽，此一反應是透過所述複合多肽之金屬結合域中半胱胺酸殘基的硫氫基(SH)來進行，因而可得到一分子構建體(或生物耦合物)。
根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，所述SH-反應性基為順丁烯二醯亞胺基、碘乙醯基、溴乙醯基、乙烯碸基、單碸基、甲磺醯基苯并噻唑基或2-吡啶基二硫醇基。
在某些視需要而採用的實施方式中，所述複合多肽呈二聚體形式；舉例來說，所述複合多肽可包含Fc區域、F(ab’)2或抗體的疑部分。在這些情形中，每一複合多肽鏈可具有一個與其耦接的功能性元件。
根據本揭示內容多個實施方式，所述功能性元件為小分子實體，其能夠引致所欲的治療效果。舉例來說，所述小分子實體可以是細胞毒性藥物、類鐸受體(toll-like receptor，TLR)促效劑或與一放射性核種複合的螯合劑。或者是，所述功能性元件為能夠改變親本多肽或分子構建體整體之藥動學特性之脂肪酸鏈。
又或者是，所述功能性元件可以是接合單元(又稱為「分子束」)的形式。根據某些本揭示內容之實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個標的元件、效應元件或藥動學元件。
具體來說，所述中心核包含2至10個離胺酸(K)殘基。任兩個K殘基彼此相鄰或由一填充物所隔開。在某些例子中，有一SH-反應性基透過與其形成醯胺鍵而連接於中心核的第一個或最後一個K殘基。在其他例子中，上述中心核還包含一末端間隔物，且所述SH-反應性基透過與其形成醯胺鍵而連接到末端間隔物的末端胺基酸殘基。所述末端間隔物可以是連接到第一個K殘基N-端的N-端間隔物，或連接到最後一個K殘基C-端的C-端間隔物。上述填充物與末端間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核在與SH-反應性基連接的胺基酸殘基或其鄰近處帶有局部負電荷。舉例來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5至15個胺基酸殘基處。具體來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基中。可利用一或多個在pH=7帶有負電荷的胺基酸殘基(譬如天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)殘基)來形成所述局部負電荷。或者是，可將中心核和複數個帶負電的效應元件耦接。
在一些例子中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件透過與K殘基的ε-胺基形成醯胺鍵而連接到中心核的K殘基。在另一些例子中，所述分子構建體還包含2至10個連接臂，其中每一連接臂的一端透過與中心核的K殘基之ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件。舉例來說，所述連接臂可以是包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽、或是具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
根據本揭示內容的一些實施方式，上述複合多肽可作為一標的元件，其能夠將分子構建體導引至目標部位或提升分子構建體在目標部位的相對量。在這些情形中，所述接合單元(或分子束)可攜有複數個效應元件，譬如上文所述的小分子實體。
根據本揭示內容的一些實施方式，上文所述的複合多肽可作為一效應元件，其能夠在個體體內招致所欲的治療效果。在這些情形中，所述接合單元(或分子束)可攜有複數個藥動學元件，譬如 C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物，以改變或最佳化分子構建體或複合多肽於個體體內的藥動學行為。根據本揭示內容多種實施方式，K殘基的ε-胺基與C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物連接。上述脂肪酸分子能夠和血清白蛋白結合，因此能夠改善經修飾之親本多肽在活體內的動力學特性。
本揭示內容的範圍亦涵蓋上文所述的接合單元，其能夠與此處提出的複合多肽形成一分子構建體。
在又另一態樣中，本揭示內容是關於一種接合單元，其能夠攜帶複數個如本揭示內容上文態樣/實施方式所述之複合多肽。根據本揭示內容的實施方式，所述接合單元有共價連接到中心核的複數個複合多肽，且因此稱為胜肽束。
根據某些本揭示內容之實施方式，此處提出的接合單元包含一中心核及複數個連接臂。
具體來說，所述中心核包含2至10個離胺酸(K)殘基。任兩個K殘基彼此相鄰或由一填充物所隔開。在某些例子中，有一複合基基透過與其形成醯胺鍵而連接於中心核的第一個或最後一個K殘基。複合基的實例包括但不限於：疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基及環辛炔基。在其他例子中，上述中心核還包含一末端間隔物，且所述複合基透過與其形成醯胺鍵而連接到末端間隔物的末端胺基酸殘基。所述末端間隔物可以是連接到第一個K殘基N-端的N-端間隔物，或連接到最後一個K殘基C-端的C-端間隔物。上述填充物與末端 間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸。
根據一些實施方式，每一連接臂的一端透過與中心核的K殘基之ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件。舉例來說，所述連接臂可以是包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽、或是具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
根據本揭示內容的一些實施方式，所述接合單元更包含2至10個如上述態樣/實施方式所述的複合多肽以及一功能性元件。每一複合多肽透過SH-反應性交聯化學耦接至金屬結合域中半胱胺酸殘基的硫醇基。
根據本揭示內容某些視需要而採用的實施方式，每一連接臂在與SH-反應性基連接的胺基酸殘基或其鄰近處帶有局部負電荷。具體來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5至15個胺基酸殘基處。舉例來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基中。可利用一或多個在pH=7帶有負電荷的胺基酸殘基(譬如天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)殘基)來形成所述局部負電荷。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以 及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施方式能更明顯易懂，所附圖式之說明如下。
圖1為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽1中心核的MALDI-TOF分析結果；
圖2揭示根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽2-DOTA束的結構；
圖3A為Mal-胜肽2-DOTA束的反相分析級HPLC沖提圖譜；
圖3B為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽2-DOTA束的MALDI-TOF分析結果；
圖4A為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1的結構；
圖4B為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-1的還原SDS-PAGE分析結果；
圖5為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-2的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖6為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-3的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖7A為根據本揭示內容一實驗例，抗-CD19抗體-MBM-1或抗-CD19抗體-MBM-2的還原SDS-PAGE分析結果；
圖7B為根據本揭示內容一實驗例，抗-CD19抗體-MBM-1或抗-CD19抗體-MBM-2的還原SDS-PAGE分析結果；
圖8為根據本揭示內容一實驗例，四種(scFv α CD33)-Fc-MBM分子構建體的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖9為根據本揭示內容一實驗例，VL-VH及VH-VL兩種組態之重組(scFv α CD20)-Fc-MBM-1的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖10A為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-2的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖10B為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-3的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖11A為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖11B為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CA19-9)-Fc-MBM-2的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖12A為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CC38)-Fc-MBM-1的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖12B為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(VL-VH scFv α CC38)-Fc-MBM-2的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖13A為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的結構；
圖13B為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖14為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-2 X 2 DOTA束的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖15為重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-3 X 2 DOTA束的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖16為根據本揭示內容一實驗例，全長抗-CD19抗體-MBM-1 X 2 DOTA束的還原SDS-PAGE分析結果；
圖17為根據本揭示內容一實驗例，全長抗-CD19抗體-MBM-2 X 2 DOTA束的還原SDS-PAGE分析結果；
圖18為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD33)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖19為根據本揭示內容一實驗例，重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的非還原SDS-PAGE分析結果；
圖20為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的陰離子交換管柱FPLC沖提圖譜；
圖21為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以陰離子交換管柱處理收集之餾份的SDS-PAGE分析結果；
圖22為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以陰離子交換管柱處理收集之餾份的SDS-PAGE分析結果；
圖23為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的MALDI-TOF分析結果；
圖24為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2螯合89Y3+離子之DOTA束的MALDI-TOF分析結果；
圖25為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2螯合175Lu3+離子之DOTA束的MALDI-TOF分析結果；
圖26為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 111In標記之DOTA束之放射化學純度的TLC分析結果；
圖27為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 111In標記之DOTA束以西方墨點法進行之安定性分析結果；
圖28A至圖28D為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的染色分析結果；
圖29為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以SDS-PAGE進行之安定性分析結果；
圖30為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以TLC分析進行之安定性分析結果；
圖31為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的半衰期；
圖32為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束對表現CD1-的異種移植腫瘤的標的效果；
圖33為根據本揭示內容一實驗例，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在表現CD1-的異種移植腫瘤的生物分布分析結果；
圖34為根據本揭示內容一實驗例，Aib-GLP-1促效劑-Cys的概要結構式；
圖35為根據本揭示內容一實驗例，Cys-體抑素胜肽的概要結構式；
圖36為根據本揭示內容一實驗例，Cys-體抑素胜肽的MALDI-TOF/TOF分析結果；
圖37為根據本揭示內容一實驗例，Cys-PSMA配體的概要結構式；
圖38為根據本揭示內容一實驗例，Cys-PSMA配體的ESI-MS分析結果；
圖39為根據本揭示內容一實驗例，降鈣素-MBM-1的概要結構式；
圖40為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽3-來那度胺束的概要結構式；
圖41為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽3-來那度胺束的ESI-MS分析結果；
圖42為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽4-來那度胺束的概要結構式；
圖43為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽5-脂肪酸束的概要結構式；
圖44為根據本揭示內容一實驗例，Mal-胜肽5-脂肪酸束的ESI-MS分析結果；
圖45為根據本揭示內容一實驗例，3-DOTA臂接合單元的概要結構式；
圖46為根據本揭示內容一實驗例，3-DOTA臂接合單元的ESI-MS分析結果；
圖47為根據本揭示內容一實驗例，MBM-1-IL-2的SDS-PAGE分析結果；
圖48為根據本揭示內容一實驗例，雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的SDS-PAGE分析結果；
圖49為根據本揭示內容一實驗例，體抑素胜肽X脂肪酸束的概要結構式；
圖50A為根據本揭示內容一實驗例，Aib-GLP-1促效劑X脂肪酸束的概要結構式；
圖50B為根據本揭示內容一實驗例，特立帕肽-MBM-1 X脂肪酸束；
圖51A為根據本揭示內容一實驗例，亮丙瑞林-MBM-3 X脂肪酸束的概要結構式；
圖51B為根據本揭示內容一實驗例，亮丙瑞林-MBM-3 X脂肪酸束的MALDI-TOF分析結果；
圖52A為根據本揭示內容一實驗例，3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體的概要結構式；
圖52B為根據本揭示內容一實驗例，3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體的ESI-MS分析結果；
圖53為根據本揭示內容一實驗例，純化雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的SDS-PAGE分析結果；
圖54為根據本揭示內容一實驗例，純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的SDS-PAGE分析結果；
圖55為根據本揭示內容一實驗例，純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的MALDI-TOF分析結果；
圖56A及圖56B為根據本揭示內容一實驗例，親本抗-CD38 hIgG1.Fc抗體以及雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的半衰期；
圖57A to圖57C為根據本揭示內容一實驗例，雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的標的效果；以及
圖58A及圖58B為根據本揭示內容一實驗例，雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的ADCC效果。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施方式提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施方式的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施方式的特徵以及用以建構與操作這些具體實施方式的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施方式來達成相同或均等的功能與步驟順序。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施方式中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料 用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。相似地，「至少二」一詞則代表包含了二、三、四或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值 的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指分子構建體能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明分子構建體遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述分子構建體導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標對象接合之後，標的元件可將本發明分子構建體內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明分子構建體標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明分子構建體能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦分子構建體到達目標部位後，所述分子構建體中能夠發揮生物活性(譬如，誘發或壓抑免疫活性、發揮細胞毒性、抑制酵素活性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募免疫細胞或其他治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
根據本發明，所述「藥動學元件」係指能夠改變分子構建體至少一種以下特徵的元件：溶解度、清除率、半衰期與生物可用性。舉例來說，所述藥動學元件可以是分子量介於約20,000至50,000道耳頓的長PEG鏈。或者是，所述藥動學元件可包含C8-28脂肪酸鏈或C8-28二元脂肪酸鏈。
本揭示內容所述的「生物耦合物」係指包含此處提出的複合多肽以及一或多個功能性元件的分子構建體。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。於本揭示內容中，認為以下胺基酸殘基分屬四種獨特的胺基酸類別：(1)離胺酸，其側鏈帶有胺基；(2)半胱胺酸，其側鏈帶有硫醇基；(3)絲胺酸與蘇胺酸，其側鏈帶有羥基；以及(4)天冬胺酸與麩胺酸，其側鏈帶有羧基。這四大類胺基 酸的側鏈各自帶有獨特的官能基，可以用來和不同的化學成分複合。也可使用帶有此類官能基的非天然胺基酸，以達到類似目的。應注意到，天冬胺酸或麩胺酸的羧基可和一元件的胺基反應而形成醯胺鍵。此反應化學類似離胺酸殘基的胺基和帶有羧基之元件間的醯胺鍵形成反應。因此，可利用天冬胺酸或麩胺酸殘基來取代中心核中的離胺酸殘基，而第一元件則同樣可透過形成醯胺鍵的相同反應化學而與中心核連接。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage(%)amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽 序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：
Figure 109110106-A0202-12-0021-1
 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
「複合部分(conjugating moiety)」一詞帶有有一或多個功能基的分子，所述功能基具有化學反應性，且能夠和其他化學單元共價連接。所述功能基的非限制性實施例包括：羧基、羰基、羥基、硫醇基、胺基、三級丁基二甲矽基(tert-Butyldimethylsilyl，TBDMS)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、SH-反應性基(如，順丁烯二醯亞胺基、鹵代乙醯基、碸基或吡啶基二硫基)、碘基(iodo)、碘乙醯胺基(iodoacetamide)、疊氮基、炔基、環辛炔基、四嗪基、環辛烯基與環辛炔基。根據本揭示內容的實施方式，此處提出之接合單元的複合部分具有兩個功能基，其中一個是羧基或胺基，此一功能基用以和間隔物的α-胺基或羧基形成醯胺鍵，而使複合部分接合到間隔物的N-端或C-端；而另一個則是SH-反應性基，用以透過SH-反應性交聯化學和第二元件接合。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-端或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「抗原(antigen或Ag)」一詞係指能夠導致免疫反應的分子。此種免疫反應可能涉及分泌性(secretory)、荷爾蒙性(humoral)和/或細胞級(cellular)的抗原專一反應。在本揭示內容中，「抗原」一詞係指蛋白質、多肽(包括其突變株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂質、核酸或上述之組合。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙單一性單鏈可變片段(bi-scFv)、奈米抗體(nanobodies；亦稱為單域抗體(single-domain antibodies，sdAb))、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。抗體片段可包含一對scFv，其連接於源自於人類γ4或γ1免疫求蛋白之成對CH2-CH3區段的N-或C-端。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(α)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)與μ(mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變區基因 (variable region genes)。輕鏈通常歸類為κ(kappa)或λ(lambda)。重鏈通常歸類為γ(gamma)、μ(mu)、α(α)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25kDa)與一「重」鏈(約50-70kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈(variable light chain，VL)與可變重鏈(variable heavy chain，VH)等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。在許多運用抗體片段的分子構型中，可使用擬抗體(antibody mimetics)來取代片段，此種擬抗體可結合至與抗體片段相同的抗原成分。擬抗體包含模擬抗體(anticalins)、預設計錨蛋白重複蛋白(DARPins)、親和體(affibodies)、fynomer結合蛋白、錨蛋白(ankyrins)、高親和力多聚體(avimers)及其他類似物。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M；或者是或額 外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明分子構建體或包含此分子構建體的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子構建體的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重若干毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」 等詞在此可交替使用，其係指將本發明之分子構建體或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之分子構建體、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
根據本揭示內容的數種實施方式，「金屬結合域」一詞係指一種段的寡肽，其能夠與金屬離子結合，如Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+或Cu2+。於某些實施方式中，能夠與鋅離子結合的金屬結合域亦稱為「鋅結合域」；然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可理解，此種結合域亦可能和其他和鋅離子具有相近物理和/或化學性質的金屬離子結合。
本揭示內容至少是基於多種新穎的金屬結合域，其可附接至親本多肽的N-或C-端。此處提出的金屬結合域在建構生物耦合物方面有以下數種優點。首先，此處提出的金屬結合域係源自人類的序列，因此其免疫源性低於既有非屬人類基因組的其他金屬結合域。其次，帶有此處提出的金屬結合域之複合多肽有理想的表現量，且所 表現出來的複合多肽在儲存、耦接與純化過程中相當穩定。第三，此處提出的金屬結合域可在親本多肽之半胱胺酸殘基大多不具反應性的狀況下，在金屬結合域之半胱胺酸殘基的SH基和功能性元件之SH-反應性基輕易地進行部位專一的耦接反應。因此，本揭示內容提出了能夠建構多功生物耦合物的方法。下文揭示本揭示內容的多種態樣與實施方式。
(I)金屬結合域
本揭示內容的第一種態樣是關於一種金屬結合域，其可在適當條件下，和一金屬離子形成複合物，上述金屬離子如Zn2+、Ni2+、Co2+、Fe2+、Mn2+或Cu2+。
根據本揭示內容一實施方式，所述金屬結合域包含以下胺基酸序列：CX1X2HA(序列編號：1)，由N-端至C-端或由C-端至N-端，其中X1為甘胺酸或脯胺酸、X2為甘胺酸或丙胺酸。例示性實施例金屬結合域包括但不限於：CGGHA(序列編號：2)、CPGHA(序列編號：3)、CGAHA(序列編號：4)、CPAHA(序列編號：5)、GCGGHA(序列編號：6)、ACPGHA(序列編號：7)以及GCPGHA(序列編號：8)。
(II)帶有金屬結合域之複合多肽
本揭示內容的另一種態樣是關於一複合多肽，其包含如上述態樣/實施方式所示之金屬結合域。因此，所述複合多肽可在適當條件下，透過金屬結合域和金屬離子形成複合物。
根據本揭示內容一實施方式，上述複合多肽包含親本多肽以及根據本揭示內容上述態樣/實施方式之金屬結合域。在多種 實施方式中，上述金屬結合域係接附接至親本多肽的N-或C-端，或透過一或多個中間胺基酸殘基而連接。在可任選的實施方式中，上述中間序列可以是2至10個甘胺酸殘基。
根據本揭示內容多個實施方式，當金屬結合域位於親本多肽的N-端時，金屬結合域的序列可以是CX1X2HA(序列編號：1)，由N-端至C-端或由C-端至N-端，其中X1為甘胺酸或脯胺酸且X2為甘胺酸或丙胺酸。相似地，當金屬結合域位於親本多肽的C-端時，金屬結合域的序列可以是CX1X2HA(序列編號：1)，由N-端至C-端或由C-端至N-端，其中X1為甘胺酸或脯胺酸且X2為甘胺酸或丙胺酸。
根據本揭示內容多個實施方式，所述親本多肽可以是一肽激素或其均等物。肽激素的均等物包含本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知的功能性片段、前驅物、類似物或衍生物。此處所述之肽激素的例示性實例包括：促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)、胰島澱粉樣多肽(amylin)、血管緊張素(angiotensin)、心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、C型利鈉肽(C-type natriuretic peptide，CNP)、降鈣素(calcitonin)、膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)、胃泌素(gastrin)、生長素釋放肽(ghrelin)、胰高血糖素(glucagon)、生長激素(growth hormone)、促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、胰島素(insulin)、瘦素(leptin)、促黑素細胞激素(melanocyte-stimulating hormone，MSH)、催產素(oxytocin)、副甲狀腺激素(parathyroid hormone，PTH)、催乳激素(prolactin)、腎素(renin)、體抑素(somatostatin)、促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)、促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin- releasing hormone，TRH)、血管加壓素(vasopressin)、及血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide)。舉例來說，胰島素的等價物包括但不限於賴脯胰島素(lispro)、天冬胰島素(aspart)、格林辛胰島素(glulisine)、地特米爾胰島素(detemir)、德谷胰島素(degludec)和甘精胰島素(glargine)。降鈣素的等效物包括但不限於降鈣素和腎上腺髓質素。體抑素的等效物包括但不限於奧曲肽(octreotide)和蘭瑞肽(lanreotide)。
於某些實施方式中，所述親本多肽可以是能夠和某些細胞表面受體結合的擬肽配體。擬肽是類蛋白的短鏈，經設計能夠模擬胜肽的功能。舉例來說，已設計出一系列以麩胺酸-尿素-離胺酸為基礎且具有PSMA結合力的擬肽分子。
在可任選的實施方式中，親本多肽可以是抗體，譬如單株抗體、免疫球蛋白A(IgA)、IgD、IgE、IgG或IgM。本揭示內容的範圍亦涵蓋完整抗體的功能性片段或衍生物，其例示包括但不限於：雙單一性抗體、嵌合抗體(chimeric antibodies)、人源抗體(human antibodies)、人源化抗體(humanized antibodies)、單鏈抗體(scAb)、單鏈可變片段(scFv)、串聯二-scFvs、串聯三-scFvs、雙抗體(diabodies)、三抗體(triabodies)、四抗體(tetrabodies)、Fab片段、F(ab')2片段、Fds、結構域抗體(domain antibodies)、以及微型抗體(minibodies)。
或者是，親本多肽可以是一細胞介素或其均等物。細胞介素的均等物包含本發明所屬技術領域中具有通常知識者所知的功能性片段、前驅物、類似物或衍生物。此處所述之。例示性實施例細胞介素包括但不限於：介白素-2(interleukin-2，IL-2)、IL-10、 IL-12、干擾素-α(interferon-α，IFN-α)、IFN-γ、轉型生長因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。
於某些實施方式中，親本多肽可以是一單鏈抗體片段、譬如單域抗體(single domain，sdAb)、單鏈抗體(scAb)、單鏈可變片段(scFv)、雙單一性t細胞銜接物(bi-specific T-cell engager，BiTE)、串聯二-scFv以及串聯三-scFv。在另一些實施方式中，親本多肽可以是源自免疫球蛋白之重鏈或輕鏈的抗體片段，且此處提出的複合多肽包含完整抗體的一部分、可結晶區片段(fragment crystallizable region，Fc區)、抗原結合片段(fragment antigen binding fragment，Fab)、Fab’、F(ab’)2、Fab’、Fv、(scFv)2、sc(Fv)2、雙抗體(diabody)、Fd、Fd’或迷你抗體。所述免疫球蛋白可源自免疫球蛋白D(IgD)、IgE或IgG。所述抗體可以是雙單一性抗體、嵌合抗體、人源抗體或人源化抗體。
於某些實施方式中，所述抗體(及其功能性片段)對對一細胞表面抗原專一，上述細胞表面抗原和液態腫瘤相關或在其上過度表現。此種細胞表面抗原的例示性實施例包括：CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD30、CD33、CD34、CD37、CD38、CD43、CD72a、CD78、CD79a、CD79b、CD86、CD134、CD137、CD138及CD319。可利用這些細胞表面抗原之抗體(或其片段或衍生物)作為標的元件，以將帶有標的元件之分子構建體帶到疾病部位。在其他視需要而採行的實施方式中，所述抗體(及其功能性片段或衍生物)可對其他細胞表面抗原專一，且此種抗體可在人體內發揮治療效果；此種細胞表面抗原的例示包括：CD3、CD16a、CD28、CD134、細胞毒 性T淋巴瘤細胞相關蛋白(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、程序性細胞死亡因子1(programmed cell death 1，PD-1)或程序性細胞死亡因子1配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)。又或者是，所述抗體(或其片段)可對腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA)專一，譬如人類上皮生長因子受體1(human epidermal growth factor receptor-1，HER1)、HER2、HER3、HER4、醣類抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA 19-9)、醣類抗原125(CA 125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、黏蛋白1(mucin 1，MUC 1)、神經節苷脂GD2(ganglioside GD2)、黑色素瘤相關抗原(melanoma-associated antigen，MAGE)、前列腺專一膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)、前列腺幹細胞抗原(prostate stem cell antigen，PSCA)、間皮素(mesothelin)、黏蛋白關聯Tn抗原、唾液酸Tn抗原(Sialyl Tn)、Globo H、階段專一性胚胎抗原(stage-specific embryonic antigen-4，SSEA-4)以及上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)。每一種TAA通常會在一或多種固態腫瘤的細胞表面上過度表現，此種TAA的抗體可作為一種標的元件，並用以製備此處所述的分子構建體。在另一些可任選的實施方式中，所述抗體(或其片段)對一生長因子具專一性，上述生長因子係選自以下物質所組成群組：上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、突變型EGF、表皮調節素(epiregulin)、肝素結合上皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)、鹼性纖維母細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)以及肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)。於某些實施方式中，所述抗體(或其片段)對上文所述之細胞介素具專一性。
(III)功能性元件與帶有金屬結合域之複合多肽形成之分子構建體
在又另一種態樣中，可將一或多個功能性元件共價耦接於根據本揭示內容上述態樣/實施方式之複合多肽，其係藉由和所述複合多肽之金屬結合域中的半胱胺酸殘基之硫氫基(SH)反應，以形成本發明所示的分子構建體(或生物耦合物)。具體來說，複合多肽的金屬結合活性使得能夠進行位置專一的複合反應，故能得到均質的分子構建體。
根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，所述SH-反應性基為順丁烯二醯亞胺基、碘乙醯基、溴乙醯基、乙烯碸基、單碸基、甲磺醯基苯并噻唑基或2-吡啶基二硫醇基。
當可理解，所述功能性元件可以是能夠在個體體內產生所欲療效的效應元件。或者是，所述功能性元件可以是能夠將分子構建體導引至個體體內目標部位的標的元件。又或者是，所述功能性元件可以是能夠改變分子構建體在個體體內之藥動學表現的藥動學元件。又或者是，所述功能性元件是以接合單元(或分子束)的形式呈現。根據某些本揭示內容之實施方式，所述接合單元包含一中心核以及複數個標的元件、效應元件或藥動學元件；所述接合單元的結構如下文第(IV)節所述。
可用於本揭示內容的效應分子包括但不限於細胞毒性藥物、TLR促效劑或螯合劑(單獨或與放射性核種複合)。
當可理解，可對腫瘤細胞發揮細胞毒殺效果的細胞毒性藥物可以是：抗雌性素(anti-estrogen，如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)及甲地孕酮(megestrol))、黃體釋素促效劑(LHRH agonist，如戈舍瑞林(goscrclin)及亮丙瑞林(leuprolide))、抗雄性素(anti-androgen，如氟他胺(flutamide)及比卡魯胺(bicalutamide))、光動力治療劑(photodynamic therapies，如維替泊芬(vertoporfin)、酞菁(phthalocyanine)、光敏劑Pc4(photosensitizer Pc4)及去甲氧基竹紅菌素(demethoxy-hypocrellin A))、氮芥(nitrogen mustard，如環磷醯胺(cyclophosphamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)、氯乙環磷醯胺(trofosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、雌莫司汀(estramustine)及美法崙(melphalan))、亞硝基尿素(nitrosoureas，如卡莫司汀(carmustine)及洛莫司汀(lomustine))、烷基磺酸(alkylsulphonate，如白消安(busulfan)及蘇消安(treosulfan))、三氮烯(triazene，如達卡巴嗪(dacarbazine)及替莫唑胺(temozolomide))、含鉑化合物(如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin))、長春花生物鹼(vinca alkaloid，如長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞濱(vinorelbine))、類紫杉醇(taxoid，如紫杉醇(paclitaxel)及歐洲紫杉醇(docetaxeal))、表鬼臼毒素(epipodophyllin，如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)、托泊替康 (topotecan)、9-胺基喜樹鹹(9-aminocamptothecin)、康托替康(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、甲磺酸(crisnatol)及絲裂黴素C(mytomycin C))、抗代謝藥物(anti-metabolite)、二氫葉酸還原酶抑制劑(DHFR inhibitor，如胺甲喋呤(methotrexate)、二氯甲胺蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲蝶呤(trimetrexate)及依達曲沙(edatrexate))、肌苷-5'-單磷酸去氫酶抑制劑(IMP dehydrogenase inhibitor，如黴酚酸(mycophenolic acid)、噻唑呋林(tiazofurin)、利巴韋林(ribavirin)及EICAR))、核糖核苷酸還原酶抑制劑(ribonuclotide reductase inhibitor，如羥基尿素(hydroxyurea)及去鐵胺(deferoxamine))、尿嘧啶類似物(如5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟尿嘧啶(tegafur-uracil)及卡培他濱(capecitabine))、胞嘧啶類似物(如阿糖胞苷(cytarabine，又稱ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及氟達拉濱(fludarabine))、嘌呤類似物(如硫氫基嘌呤(mercaptopurine)及硫鳥嘌呤(Thioguanine))、維生素D3類似物(如EB 1089、CB 1093及KH 1060)、異戊二烯抑制劑(isoprenylation inhibitor，如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神經毒素(dopaminergic neurotoxin，如1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion))、細胞週期抑制劑(如星形孢菌素(staurosporine))、放線菌素(actinomycin，如放線菌素D)、博萊黴素(bleomycin，如博萊黴素A2、博萊黴素B2及培洛黴素 (peplomycin))、蒽環類藥物(anthracycline，如柔紅黴素(daunorubicin)、阿黴素(doxorubicin)、伊達比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)及米托蒽醌(mitoxantrone))、多重抗藥性抑制劑(MDR inhibitor，如維拉帕米(verapamil))、鈣離子三磷酸腺苷酶抑制劑(Ca2+ ATPase inhibitor，如毒胡蘿蔔素(thapsigargin))、伊馬替尼(imatinib)、沙利度胺(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、酪胺酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，如阿西替尼(axitinib)、波舒替尼(bosutinib)、西地尼布(cediranib)、達沙替尼(dasatinib)、厄羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊馬替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、來他替尼(lestaurtinib)、那替尼(neratinib)、尼洛替尼(nilotinib)、司馬沙尼(semaxanib)、舒尼替尼(sunitinib)、托賽拉尼(toceranib)、凡德他尼(vandetanib)、瓦他拉尼(vatalanib)、利妥昔單抗(rituximab)、索拉非尼(sorafenib)、依維莫司(everolimus)、西羅莫司(temsirolimus)、蛋白酶抑制劑(如硼替佐米(bortezomib))、哺乳類斥消靈標的蛋白抑制劑(mTOR inhibitor，例如雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、及雷帕黴素衍生物(ridaforolimus))、奧利默森(oblimersen)、吉西他濱(gemcitabine)、洋紅黴素(carminomycin)、亞葉酸鈣(leucovorin)、培美曲塞(pemetrexed)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、達卡巴嗪(dacarbazine)、甲基芐肼(procarbizine)、潑尼松龍(prednisolone)、地塞米松 (dexamethasone)、喜樹鹼(campathecin)、普卡黴素(plicamycin)、天門冬醯胺酶(asparaginase)、胺基蝶呤(aminopterin)、甲胺蝶呤(methopterin)、紫菜黴素(porfiromycin)、美法崙(melphalan)、異長春鹼(leurosidine)、環氧長春鹼(leurosine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、曲貝替定(trabectedin)、丙卡巴肼(procarbazine)、海綿內酯(discodermolide)、洋紅黴素(carminomycin)、胺基蝶呤(aminopterin)或六甲基三聚氰胺(hexamethyl melamine)。根據本揭示內容一具體實施方式，所述細胞毒性藥物為美登素(mertansine)、奧里斯他汀(auristatin)、美登木素(maytansine)、阿黴素(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)或喜樹鹼(camptothecin)。
TLR促效劑的非限制性例示包括：脂磷壁酸(lipoteichoic acid)、葡聚糖(glucan)、莫托立莫特(motolimod)、咪喹莫特(imiquimod)、瑞西喹莫特(resiquimod)、加德喹莫特(gardiquimod)、CpG寡聚去氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide，CpG DON)、脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)、單磷醯脂A(monophosphoryl lipid A)以及酵母聚糖(zymosan)。
在多種實施方式中，所述螯合劑可選自以下物質所組成的群組：1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid，DOTA)、N,N"-雙[2-羥基-5-(羧乙基)芐基]乙二胺-N，N"-二乙酸(N,N"-bis[2-hydroxy-5-(carboxyethyl)benzyl]ethylenediamine-N,N"-diacetic acid，HBED-CC)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙 酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid，NOTA)、2-(4,7-雙(羧甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)戊二酸(2-(4,7-bis(carboxymethyl)-1,4,7-triazonan-1-yl)pentanedioic acid，NODAGA)、2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1-基)戊二酸(2-(4,7,10-tris(carboxymethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1-yl)pentanedioic acid，DOTAGA)、1,4,7-三氮雜環壬烷次膦酸(1,4,7-triazacyclo-nonane phosphinic acid，TRAP)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1-[甲基(2-羧乙基)次膦酸]-4,7-雙[甲基(2-羥甲基)次膦酸](1,4,7-triazacyclononane-1-[methyl(2-carboxyethyl)phosphinic acid]-4,7-bis[methyl(2-hydroxymethyl)phosphinic acid]，NOPO)、3,6,9,15-四氮雜雙環[9.3.1.]十五-1(15)，11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1.]pentadeca-1(15),11,13-triene-3,6,9-triacetic acid，PCTA)、N'{5-[乙酰基(羥基)胺基]戊基}-N-[5-({4-[(5-胺基戊基)(羥基)胺基]-4-氧代丁酰基}胺基]戊基]-N-羥基琥珀酰胺(N’{5-[Acetyl(hydroxy)amino]pentyl}-N-[5-({4-[(5-aminopentyl)(hydroxy)amino]-4-oxobutanoyl}amino)pentyl]-N-hydroxysuccinamide，DFO)、二亞乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)、反式環己基-二亞乙基三胺五乙酸(trans-cyclohexyl-diethylenetriaminepenta-aceticacid，CHX-DTPA)、1-氧雜-4,7,10-三氮雜環十二烷-4,7,10-三乙酸(1-oxa-4,7,10-triazacyclododecane-4,7,10-triacetic acid，oxo-Do3A)、對-異硫氰酸根合芐基-DTPA(p- isothiocyanatobenzyl-DTPA，SCN-Bz-DTPA)、1-(對-異硫氰酸根合芐基)-3-甲基-DTPA(1-(p-isothiocyanatobenzyl)-3-methyl-DTPA，1B3M)、2-(對異硫氰酸根合芐基)-4-甲基-DTPA(2-(p-isothiocyanatobenzyl)-4-methyl-DTPA，1M3B)以及1-(2)-甲基-4-異氰酸根合芐基-DTPA(1-(2)-methyl-4-isocyanatobenzyl-DTPA，MX-DTPA)。於某些實施方式中，所述放射性核種為111In、131I或177Lu，在其他實施方式中，所述放射性核種可以是90Y、68Ga、99mTc、64Cu、153Gd、155Gd、157Gd、213Bi、225Ac或Fe。
在其他實施方式中，本發明分子構建體之效應元件的選擇亦涵蓋了多種多肽類分子，包括(1)對發炎性細胞介素(譬如TNF-α、IL-12/IL-23、IL-17、IL-1、IL-6、BAFF)專一的抗體片段、(2)對RANKL專一的抗體片段、(3)對表現於T細胞與NK細胞上之CD3及CD16a專一的抗體片段、(4)對PD-1、PD-L1、CTLA-4及其他免疫檢查點蛋白專一的抗體片段、以及(5)免疫強化細胞介素(IFN-α、IFN-γ、IL-2、TNF-α)。
可視欲治療的疾病來選擇適用於本揭示內容之實施方式的標的元件。舉例來說，用以治療各種疾病的標的元件包含(1)對關節、皮膚或骨骼中細胞外基質之成分專一的抗體片段，上述成分如第I型膠原蛋白、第II型膠原蛋白、第III型膠原蛋白、第V型膠原蛋白、第VII型膠原蛋白、第IX型膠原蛋白、第XI型膠原蛋白、α-蛋白聚糖以及骨結合素(osteonectin)；(2)對分化標記叢集專一之抗體片段，上述標記叢集如CD19、CD20、CD22、CD30、CD52、CD79a、CD79b；、CD38、CD56、CD74、CD78以及CD138；或CD319、 CD5、CD4、CD7、CD8、CD30；或CD13、CD14、CD15、CD33、CD34、CD36、CD37、CD41、CD61、CD64、CD65以及CD11c；以及淋巴樣細胞系、骨髓樣細胞系與漿細胞的其他細胞表面抗原，或(3)對在固態腫瘤細胞表面上過度表現的受體或抗原專一之抗體片段，上述受體或抗原如HER1、HER2/Neu、HER3、Tn、Globo H、GD-2、CA125、CA19-9、與CEA。
腫瘤細胞或其他患病細胞上會表現某些荷爾蒙、生長因子或細胞介素的受體，所以標的元件也可以是此類荷爾蒙、生長因子或細胞介素的抗體。在另一些可任選的實施方式中，此處提出之分子構建體的標的元件為生長因子。
根據本揭示內容某些實施方式，本揭示內容的親本多肽與功能性元件其中至少一者為對生長因子專一之抗體片段。於某些實施方式中，所述生長因子選自以下物質所組成的群組：：EGF、突變型EGF、表皮調節素、HB-EGF、VEGF-A、bFGF與HGF。與上文所述的概念相似，當標的元件為生長因子(如，EGF)時，此處提出的分子構建體能夠專一地標的到表現相關受體的細胞/組織/器官(如，其上表現有EGF受體的腫瘤細胞)。當效應元件是對生長因子(如，VEGF-A)專一的抗體片段時，其可捕捉並中和與該生長因子相關的信息傳導路徑(譬如VEGF-A-誘發的血管生成)。根據一實驗例，本發明分子構建體可用以治療固態腫瘤，其中效應元件是對VEGF-A專一的抗體片段。
藥動學元件的例示如C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物。每一藥動學元件透過K殘基的ε-胺基而連接至一K殘基。根據本揭示內容多個實施方式，所述功能性元件為一脂肪酸 衍生物，其係衍生自辛酸(octanoic acid)、壬酸(pelargonic acid)、癸酸(decanoic acid)、十一酸(undecanoic acid)、月桂酸(lauric acid)、十三酸(tridecanoic acid)、肉豆蔻酸(myristic acid)、十五酸(pentadecanoic acid)、棕櫚酸(palmitic acid)、十七酸(margaric acid)、硬脂酸(stearic acid)、十九酸(nonadecanoic acid)、花生酸(arachidic acid)、二十一酸(heneicosanoic acid)、二十二酸(behenic acid)、二十三酸(tricosanoic acid)、二十四酸(lignoceric acid)、棕櫚油酸(palmitoleic acid)、油酸(oleic acid)、亞麻油酸(lionleic acid)、蓖麻油酸(ricinoleic acid)、異檸檬酸(vaccenic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)或二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)。根據本揭示內容某些實施方式，所述功能性元件為二元脂肪酸衍生物，其係衍生自：1,8-辛二酸(suberic acid)、1,7-庚二甲酸(azelaic acid)、1,10-癸二酸(undecanedioic acid)、十一烷二酸(dodecanedioic acid)、十二烷二酸(brassylic acid)、十三烷二酸(sebacic acid)、十四烷二酸(tetradecanedioic acid)、十五烷二酸(pentadecanedioic acid)、十六烷二酸(thapsic acid)、十七烷二酸(heptadecanedioic acid)或十八烷二酸(octadecanedioic acid)。於某些實施方式中，此處提出的功能性元件係衍生自肉豆蔻酸或棕櫚酸。於其他實施方式中，此處提出的功能性元件係衍生自十四烷二酸或十六烷二酸。
(IV)用以與帶有金屬結合域之複合多肽耦接之接合單元
在某些視需要而採用的實施方式中，用以與上述複合多肽耦接的功能性元件是以分子束(或接合單元)形式呈現。根據某些 本揭示內容之實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個標的元件、效應元件或藥動學元件。當可理解，此種接合單元亦屬於本揭示內容保護的範圍。
根據某些本揭示內容之實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個如上述態樣/實施方式所述的元件、效應元件或藥動學元件。
具體來說，中心核是長度為3-120個胺基酸殘基的多肽，且至少包含兩個離胺酸(K)殘基，；舉例來說，此處提出的中心核可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個K殘基。根據某些實施方式，任兩個K殘基可彼此相鄰或由一填充物所隔開。在某些例子中，一SH-反應性基透過與其形成醯胺鍵而連接於中心核的第一個或最後一個K殘基。在其他例子中，上述中心核還包含一末端間隔物，且所述SH-反應性基透過與其形成醯胺鍵而連接到末端間隔物的末端胺基酸殘基。如此一來，能夠在親本多肽之半胱胺酸殘基大多不具反應性的適當的條件下，使此處提出之接合單元的末端SH-反應性基和複合多肽中金屬結合域之半胱胺酸殘基的SH基耦接，因而能夠實現位置專一的耦接，並得到均質的分子構建體。
所述末端間隔物可以是連接到第一個K殘基N-端的N-端間隔物，或連接到最後一個K殘基C-端的C-端間隔物。上述填充物與末端間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸。
在接合單元不具連接臂的情形中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件透過與K殘基的ε-胺基形成醯胺鍵而連接至中心核的K殘基。另一方面，當所述分子構建體的接合單元更包含2至 10個連接臂時，每一連接臂的一端透過與中心核的K殘基之ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件。舉例來說，所述連接臂可以是包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽、或是具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，在和標的元件、效應元件或藥動學元件耦接前，連接臂的自由端(即，未與中心核離胺酸殘基連接之該端)可帶有一連接基，其係選自以下物質所組成的群組：胺基、羧基、羥基、NHS、疊氮基、炔基、環辛炔、四嗪基或環辛烯基。隨著修飾離胺酸殘基之側鏈胺基的連接基(即，胺基、羧基、NHS、疊氮基、炔基、環辛炔、四嗪基或環辛烯基)不同(在無連接臂的情況下)，或隨著出現在連接臂自由端的連接基不同，能夠設計帶有相應官能基的功能性元件(譬如，標的元件、治療效應元件或能夠提升藥動學特性的元件)，而使得功能性元件可以透過以下任一種化學反應而連接到連接基：
(1)於其間形成醯胺鍵：在此種情形中，連接基為胺基、羧基或NHS基，而功能性元件則帶有胺基或羧基；
(2)銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(Copper(I)-catalyzed alkyne-azide cycloaddition；CuAAC)反應：連接基與功能性元件其中之一帶有疊氮基或吡啶甲基疊氮(picolyl azide)基，而另一個則帶有炔基；
(3)逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels-Alder，iEDDA)反應：連接基與功能性元件其中之一帶有四嗪基，而另一個則帶有環辛烯基(如，TCO或降莰烯(norbornene)基)；或
(4)應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)：連接基與功能性元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有環辛炔基。
根據本揭示內容多個實施方式，所述四嗪基為1,2,3,4-四嗪基、1,2,3,5-四嗪基、1,2,4,5-四嗪基或其衍生物；環辛烯基為降莰烯基(norbornene)或反式-環辛烯基(trans-cyclooctene，TCO)基；且環辛炔基係選自以下所組成的群組：二苯并環辛炔基(dibenzocyclooctyne，DIBO)、二氟化環辛炔基(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔基(bicyclononyne，BCN)以及二苯并雜氮環辛炔基(dibenzoazacyclooctyne，DIBAC或DBCO)。根據本揭示內容一實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
根據本揭示內容某些視需要而採用的實施方式，中心核在與SH-反應性基連接的胺基酸殘基或其鄰近處帶有局部負電荷。舉例來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5至15個胺基酸殘基處。具體來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基中。可利用一或多個在pH=7帶有負電荷的胺基酸殘基(譬如天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)殘基)來形成所述局部負電荷。
或者是，可將中心核和複數個帶負電的效應元件耦接，以使中心核在與SH-反應性基或其鄰近處帶有局部負電荷。舉例來說，所述效應元件可以是一螯合劑(如，DOTA、DOTAGA及與其相似者)，其可增加接合單元整體的淨負電荷。
上文參照第(III)節所述的標的、效應及藥動學元件同樣適用於第(IV)節所述的實施方式，在此為求簡潔不再贅述。在多種實施方式中，攜有複數個效應元件的接合單元稱為「效應分子束」或「載藥束」；攜有複數個螯合劑的接合單元稱為「螯合劑束」；攜有複數個標的元件的接合單元稱為「標的分子束」；攜有複數個scFv的接合單元稱為「scFv束」；攜有複數個藥動學元件的接合單元稱為「藥動分子束」或「PK束」；且攜有複數個脂肪酸鏈及/或二元脂肪酸鏈的接合單元稱為「脂肪酸束」或「FA束」。
於某些實施方式中，脂肪酸(或二元脂肪酸)衍生物是一種經化學修是的脂肪酸(或二元脂肪酸)分子。舉例來說，脂肪酸分子的羧基(或二元脂肪酸分子的其中一個羧基)可和帶有兩個官能基的化學實體反應，其中一個官能基可和羧基反應，因而可和該(二元)脂肪酸分子形成共價鍵；而另一官能基則可和離胺酸殘基之側鏈胺基反應。根據本揭示內容視需要而採用的實施方式，修飾(二元)脂肪酸分子的化學實體為麩胺酸殘基、天冬胺酸殘基、胺基-EG2-酸、γ-胺基丁酸(gamma-aminobutyric acid)，或與其相似者；然本揭示內容不限於此。
當可理解，當親本多肽中不帶有半胱胺酸殘基或其他含硫氫基的胺基酸殘基時，可引入一末端半胱胺酸殘基來取代末端金屬結合域，以得到一複合多肽，且此處提出的接合單元能夠透過這種 末端半胱胺酸殘基和所述複合多肽形成偶聯物。
(V)接有複數個帶有金屬結合域之複合多肽的接合單元
本揭示內容又另一種態樣是關於一接合單元，其攜有複數個如本揭示內容上述態樣/實施方式所示之複合多肽。於某些實施方式中，此種接合單元亦稱為「胜肽束」。
根據某些本揭示內容之實施方式，接合單元包含一中心核、2至10個連接臂以及2至10個如上述態樣/實施方式所示之複合多肽。此種接合單元的連接臂自由端帶有一SH-反應性基，而由於每一複合多肽帶有此處提出的金屬結合域，所以能夠在親本多肽之半胱胺酸殘基大多不具反應性的適當的條件下，以位置專一的方式將複合多肽耦接至連接臂上。
具體來說，中心核是長度為3-120個胺基酸殘基的多肽，且至少包含兩個離胺酸(K)殘基，；舉例來說，此處提出的中心核可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10個K殘基。根據某些實施方式，任兩個K殘基可彼此相鄰或由一填充物所隔開。
在某些例子中，中心核更包含一複合基基，透過與其形成醯胺鍵而連接於中心核的第一個或最後一個K殘基。複合基的實例包括但不限於：疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基及環辛炔基。
在其他例子中，上述中心核還包含一末端間隔物，且所述複合基透過與其形成醯胺鍵而連接到末端間隔物的末端胺基酸殘基。所述末端間隔物可以是連接到第一個K殘基N-端的N-端間隔物，或連接到最後一個K殘基C-端的C-端間隔物。
上述填充物與末端間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸。一般來說，上述間隔物可以是，(1)由1-12個(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)K胺基酸殘基以外的胺基酸殘基所組成的多肽，或(2)具有1-12個(即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)EG單元的聚乙二醇化胺基酸。具體來說，當此處提出的中心核至少包含複數個K殘基時，間隔物可包含具有2-12個EG單元的聚乙二醇化胺基酸、或可包含1-12個非-K胺基酸殘基，其中每一個非-K胺基酸殘基分別且獨立地選自以下組成的群組：甘胺酸(G)、天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、絲胺酸(S)、精胺酸(R)、組胺酸(H)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q)、脯胺酸(P)、丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、苯基丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)與色胺酸(W)殘基；在較佳的情形中，每一個非-K胺基酸殘基分別且獨立地選自選自以下所組成的群組：G、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y與W殘基；在更佳的情形中，每一個非-K胺基酸殘基分別為G及/或S殘基。
根據一些實施方式，每一連接臂的一端透過與中心核的K殘基之ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端帶有硫氫基(SH)-反應性基。舉例來說，所述連接臂可以是包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽、或是具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
例示性的SH-反應性基包括順丁烯二醯亞胺基、鹵代乙醯基(如，碘乙醯基或溴乙醯基)、碸基(如，乙烯碸基、單碸基、甲磺醯基苯并噻唑基)、以及吡啶基二硫基(如，2-吡啶基二硫醇基)。
根據本揭示內容某些實施方式，所述連接臂為至少包含2-12個(即，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個)非-K胺基酸殘基(各自可為天然或非天然胺基酸殘基)的多肽。舉例來說，連接臂為至少包含2-12個非-K胺基酸殘基(即，獨立選自以下群組的胺基酸殘基：G、E、D、S、R、H、T、N、Q、P、A、V、I、L、M、F、Y及W殘基)的多肽。根據一實驗例，此處提出的連接臂為一多肽，其至少包含5-10個獨立選自G、S、E與R殘基之胺基酸殘基。或者是，連接臂可以是帶有2-24個(即、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24個)EG重複單元的PEG鏈；在較佳的情形中，為5-15個EG重複單元；在更佳的情形中，為6-12個EG重複單元。當可理解，可利用具有大致上相同長度的聚合物來取代此處所述的連接臂多肽或PEG鏈。可以使用如碳水化合物或其他親水性結構單元等聚合物來作為連接臂。
根據本揭示內容的一些實施方式，每一連接臂在與SH-反應性基連接的胺基酸殘基或其鄰近處帶有局部負電荷。具體來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5至15個胺基酸殘基處。舉例來說，所述局部負電荷出現在從與SH-反應性基連接之胺基酸殘基起算的前5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基中。可利用一或多個在pH=7帶有負電 荷的胺基酸殘基(譬如天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)殘基)來形成所述局部負電荷。
當可理解，當此處提出的中心核包含至少兩個末端間隔物或填充物時，每一末端間隔物或填充物可以相同或不同；亦即，每一末端間隔物或填充物可包含相同或不同的胺基酸序列及/或EG單元。根據本揭示內容一實施方式，此處提出的中心核包含三個填充物，其中第一個填充物為有8個EG單元的聚乙二醇化胺基酸，而另外兩個填充物分別為一個S殘基以及一個G殘基。根據本揭示內容另一種實施方式，此處提出的中心核包含一個末端間隔物及四個填充物，其中一個末端間隔物四個G殘基與兩個S殘基所組成，而其他四個填充物各由一個G殘基與一個S殘基組成。根據本揭示內容又一實施方式，此處提出的中心核包含兩個末端間隔物與三個填充物，各自為有四個EG單元的聚乙二醇化胺基酸。
根據本發明可任選的實施方式，可將包含複數個複合多肽的接合單元(或稱胜肽束)和一額外的接合單元耦接，譬如可透過與中心核的複合基反應，以形成分子構建體。舉例來說，所述額外的接合單元可以是一效應分子束、標的分子束或PK束。舉例來說，所述額外的接合單元的結構，類似申請人先前提出之申請案所記載的結構。簡言之，此額外的接合單元的結構可與上文第(III)節所述類似，不同之處在將末端SH-反應性基置換為能夠與多肽數之複合基反應之相對應複合基。
當所述額外接合單元所攜帶的標的或效應元件為多肽類元件時，所述多肽類元件亦可具有上文提出的鋅結合域，且此額 外的接合單元可採用此處提出之胜肽束的結構，因而可得到一種由兩個攜帶不同功能性元件之胜肽束所組成的分子構建體。
在某些可任選的實施方式中，複合基是一複合部分的一部分，所述複合部分有一官能基能夠和和末端胺基酸殘基(即，第一個連接胺基酸殘基或N-端間隔物的N-端胺基酸殘基)的α-胺基(-NH2)或是末端胺基酸殘基(即，最後一個連接胺基酸殘基或C-端間隔物的C-端胺基酸殘基)的羧基(-COOH)形成共價鍵，而將複合部位與其連接。於某些實施方式中，中心核可能只有N-端與C-端間隔物其中一種，且有第一與第二複合部分分別連接到兩個末端胺基酸殘基(可以是末端連接胺基酸殘基或末端間隔物的末端胺基酸殘基)。在某些實施方式中，中心核包含N-端與C-端間隔物兩者，且兩個複合部分分別連接到兩個末端間隔物的末端胺基酸殘基。在較佳的實施方式中，複合部分與末端胺基酸殘基間形成的共價鍵為醯胺鍵。當可理解，為了確保能夠得到均質的分子束，一個複合部分上的官能基僅能與α-胺基或羧基其中一種反應。
視需要地，所述複合部分可更包含有2-10個(即，2、3、4、5、6、7、8、9或10個)EG重複的PEG鏈，以將羧基或胺基和和複合基連接在一起；舉例來說，所述PEG鏈可能有4、6、7或8個EG單元。
根據本揭示內容多個實施方式，兩個複合部分可具有相同或不同的反應性。較佳地，當複合部分的第二個複合基是疊氮基、炔基或環辛炔基時，連接臂的連接基不能是疊氮基、炔基或環辛炔基，以避免第二複合基與連接基間的反應；此時，連接基可以是四嗪基、環辛烯基、胺基、羧基、或NHS基。或者是，當第二複合基是四嗪基 或環辛烯基時，連接基不能是四嗪基或環辛烯基；此時，連接基可以是疊氮基、炔基、環辛炔基、胺基、羧基或NHS基。
當可理解，連接到中心核之可任選的連接臂的數目取決於中心核中連接胺基酸殘基(即，K殘基)的數目。由於此處提出的中心核中有至少兩個連接胺基酸殘基，此處提出的標的或效應分子束可包含複數個連接臂。
當可理解，上文針對效應、標的或藥動學元件的相關敘述適用於所有涉及此類元件的態樣/實施方式，除非上下文另有相反的說明。
當可理解，在胜肽中心核的固態合成過程中，除了在合成中心核之後再接上功能性元件之外，也可將經過特定功能性元件修飾的K胺基酸殘基加入合成中的胜肽鏈。因此，根據多種實施方式，可在固態合成過程中依序加入經過不同功能性元件的K殘基，以製得均質的PK束，其中每一PK束可含有二或更多個不同的功能性元件連接於其上。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明。這些實驗例僅為例示，且不應將其視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。
實驗例1
Mal-胜肽1中心核的合成
於本實驗例中，本案發明人設計了帶有五個離胺酸殘基多肽，並委由KareBay Co.,Ltd.(Monmouth Junction,USA) 合成。此胜肽可作為一中心核，用以建構一接合單元或一功能分子束。利用標準Fmoc固態合成法來合成Mal-胜肽1(順丁烯二醯亞胺乙基GGSGGSKGSKGSKGSKGSK；序列編號：11)。Mal-胜肽1的純度為95.67%。
利用質譜MALDI-TOF分析來確認所合成的胜肽。此處的質譜分析都是由中央研究院分子生物學研究中心質譜核心設施(台北)進行分析，所用的設備為Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜儀(Bruker Daltonics,Bremen,Germany)。
圖1為MALDI-TOF質譜分析結果，由圖中可以看出Mal-胜肽1的分子量為1,790.916道耳頓。
實驗例2
Mal-胜肽2-DOTA束的合成
於本實驗例中，本案發明人設計的螯合劑束(參見圖2)是以帶有三個離胺酸殘基且含順丁烯二醯亞胺之多肽作為中心核，並有三個DOTA分子耦接至該中心核(Mal-胜肽2-DOTA束)，此螯合劑束委由KareBay Co.,Ltd.(Monmouth Junction,USA)合成。
利用標準Fmoc固態合成法來合成Mal-胜肽2(順丁烯二醯亞胺乙基GGSGGSGKGGSGGSGKGGSGGSGK，序列編號：12)，且之後利用液態合成將DOTA分子耦接到中心核上。
利用反相高效液態層析(HPLC)來分析所合成之螯合劑束的純化樣本，使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流動相使用乙腈及0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為1.0ml/min且管柱溫度為35℃。圖3A為實驗例2之 螯合劑束的反相HPLC圖譜，圖中顯示在滯留時間7.06分鐘可觀察到螯合劑束的峰值。
利用質譜MALDI-TOF分析來確認所合成的Mal-胜肽2-DOTA束。圖3B的MALDI-TOF質譜分析結果顯示此處提出的螯合劑束的分子量為3,093.454道耳頓。
實驗例3
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1的建構、表現與純化
對人類CD19專一之scFv的VL及VH來自單株抗體RB4v1.2。編碼scFv-CH2-CH3(人類γ1)重組鏈的基因序列的建構方式如下：將編碼對人類CD19專一之scFv的基因序列接到編碼IgG1.Fc之可撓性絞鏈區域與CH2域的上游位置，並將編碼金屬結合域(MBM)-1，即ACPGHA序列(序列編號：7)的基因序列接到編碼IgG1.Fc之CH3域以及一短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)的下游位置。
將scFv建構為兩種方向，即，VL-接合物-VH及VH-接合物-VL，其中VL及VH是透過一親水性接合物所連接，其序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(序列編號：10)。此處提出的(scFv α CD19)-Fc-MBM-1的VL-接合物-VH及VH-接合物-VL組態之重組鏈的胺基酸序列分別如序列編號：13及14所示，且圖4A揭示了該等雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1分子構建體的一般結構。
於利用哺乳類動物表現系統來製備重組蛋白時，採用以Expi293FTM細胞為基礎的過度表現系統。所用系統使用ExpiFectamineTM 293轉染套組(Life Technologies,Carlsbad, USA)，其包含Expi293FTM細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamineTM 293試劑、ExpiFectamineTM 293轉染強化劑1與2、以及培養基(Gibco,New York,USA)。
將編碼基因的序列置於pcDNA3表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0×106個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108個細胞的255ml培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamineTM 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37℃下以定軌搖動器(125rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamineTM 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白A親和力層析法純化培養基中的hIgG1.Fc融合重組蛋白。
將緩衝液置換為PBS，之後利用10% SDS-PAGE測定此處提出的(scFv α CD19)-Fc-MBM-1之濃度並進行分析。分析結果顯示，在非還原SDS-PAGE上，此處提出的(scFv α CD19)-Fc-MBM-1的分子量為約120kDa，比預期分子量110kDa大了一些。圖4B為雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-1的非還原SDS-PAGE分析結果，請見箭頭所指處的主要條帶。當可理解，SDS-PAGE結果僅係用來快速地確認所合成之分子構建體的大約分子量，且可利用質譜分析來測定更為精確的分子量。舉例來說，此處提出的分子構建體的MALDI-TOF分析結果如圖23所示。
實驗例4
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-2的建構、表現與純化
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方式來建構、表現與純化VL-接合物-VH組態的重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-2，差異之處在於此處使用了不同的金屬結合域，其序列為GCPGHA(序列編號：8，下稱MBM-2)。此處提出的(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-2之重組鏈的胺基酸序列如序列編號：15所示。
圖5的SDA-PAGE結果顯示此處提出的分子構建體的重組鏈大小為約120kDa(如箭頭所示)，略大於預期大小。
實驗例5
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-3的建構、表現與純化
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方式來建構、表現與純化VL-接合物-VH組態的重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-3，差異之處在於此處使用了不同的金屬結合域，其序列為GCGGHA(序列編號：6，下稱MBM-3)。此處提出的VL-接合物-VH組態之(scFv α CD19)-Fc-MBM-3重組鏈的胺基酸序列如序列編號：16所示。
利用SDS-PAGE來鑑定(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-3分子構建體。圖6的SDA-PAGE結果顯示此一新分子構建體的重組鏈大小為約110kDa(如箭頭所示)，與預期大小相符。
實驗例6
重組抗-CD19抗體-MBM的建構、表現與純化
將短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)及MBM序列(於本實驗例中，MBM-1或MBM-2)接到對C19專一之完整抗體的重鏈C-端，以建構出重組IgG(人類γ1)分子構建體。將上述基因序列 插入帶有多個選殖位點的pG1K表現匣中。利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組抗-CD19抗體-MBM。
對人類CD19專一抗體之重鏈-MBM-1或MBM-2的胺基酸序列分別如序列編號：17及18所示，而全長抗-CD19抗體輕鏈的胺基酸序列如序列編號：19所示。
利用SDS-PAGE來鑑定所述分子構建體。圖7A的還原SDA-PAGE結果顯示對照蛋白(電泳條1)、人類CD19抗體-MBM-1(電泳條2)以及人類CD19抗體-MBM-2(電泳條3)有一個較大的分子量條帶為約55kDa以及一個較小的分子量條帶為約25kDa，分別與本分子構建體之重鏈及輕鏈的預期大小相符。
抗-CD19抗體-MBM-1分子構建體的一般結構如圖7B所示。
實驗例7
重組雙鏈(scFv α CD33)-Fc-MBM的建構、表現與純化
對人類CD33專一之scFv的VL及VH來自單株抗體huMy9-6。編碼(scFv α CD33)-CH2-CH3(人類γ1)重組鏈的基因序列的建構方式如下：將編碼對人類CD33專一之scFv的基因序列接到編碼IgG1.Fc之可撓性絞鏈區域與CH2域的上游位置，並將編碼MBM-1或MBM-2的基因序列接到編碼IgG1.Fc之CH3域以及一短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)的下游位置。
將scFv建構為兩種方向，即，VL-接合物-VH及VH-接合物-VL，其中VL及VH是透過一親水性接合物所連接，其序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(序列編號：10)。此處提出的(scFv α CD33)-Fc-MBM-1的VL-接合物-VH及VH-接合物-VL組態之重組鏈的胺基酸序列分別如序列編號：20及21所示，而此處提出的(scFv α CD33)-Fc-MBM-2的VL-接合物-VH及VH-接合物-VL組態之重組鏈的胺基酸序列分別如序列編號：22及23所示。
利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組雙鏈(scFv α CD33)-Fc-MBM。
利用非還原SDS-PAGE來鑑定所述分子構建體。圖8的SDA-PAGE結果顯示(VL-VH scFv α CD33)-Fc-MBM-1(電泳條1)、(VH-VL scFv α CD33)-Fc-MBM-1(電泳條2)、(VL-VH scFv α CD33)-Fc-MBM-2(電泳條3)以及(VH-VL scFv α CD33)-Fc-MBM-2(電泳條4)各有一個約120kDa大小的條帶，略大於110kDa的預期大小。
實驗例8
重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM的建構、表現與純化
對人類CD20專一之scFv的VL及VH來自奧珠單抗(ocrelizumab)。將金屬結合域MBM-1、MBM-2或MBM-3分別過一短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)接到(scFv α CD20)-CH2-CH3(人類γ1)重組鏈CH3域的C-端。將scFv建構為兩種方向，即，VL-接合物-VH及VH-接合物-VL，其中VL及VH是透過一親水性接合物所連接，其序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(序列編號：10)。
利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1、-MBM-2或-MBM-3。此處提出的(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-1、(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-1、(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-2、(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-3以及(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-3重組鏈的序列分別如序列編號：24、25、26、27與28所示。
利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM。
利用非還原SDS-PAGE來鑑定所述分子構建體。圖9的SDA-PAGE結果顯示(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-1(電泳條1)以及(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-1(電泳條2)兩種分子構建體的大小為約120kDa，略大於110kDa的預期大小。圖10A及圖10B的SDA-PAGE結果分別顯示(VH-VL scFv α CD20)-Fc-MBM-2以及(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-3兩種分子構建體的大小為約120kDa，略大於110kDa的預期大小。
實驗例9
重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM的建構、表現與純化
生產抗CA19-9抗體的小鼠B細胞融合瘤細胞HB8059購自艾荷華大學的Developmental Studies Hybridoma Bank。利用SuperScript III RT-PCR系統(Invitrogen,Waltham,USA)將Poly(A)+RNA反轉錄，並合成第一股cDNA。HB8059之VH與VL的核苷酸與胺基酸序列先前未曾發表過。為了決定HB8059可變區域的序列，使用Ig-primer Sets(Novagen,Madison,USA)提供的引子並根據製造商的指引透過PCR來擴增VH與VL的cDNA。對人類CA19-9專一之HB8059單株抗體的VH及VL之胺基酸序列分別如序列編號：29及30所示。
將MBM-1或MBM-3分別過一短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)接到(scFv α CA19-9)-CH2-CH3(人類γ1)重組鏈CH3域的C-端。scFv的方向為VL-接合物-VH，其中VL及VH是透過一親水性接合物所連接，其序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(序列編號：10)。此處提出的(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1及(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-3之重組鏈的序列分別如序列編號：31及32所示。
利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM。
利用SDS-PAGE來鑑定所述分子構建體。圖11A及圖11B的SDA-PAGE結果顯示(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1以及(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-3兩種分子構建體之重組鏈的大小為約120kDa(電泳條1)，略大於110kDa的預期大小。
實驗例10
重組雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM的建構、表現與純化
對人類CD38專一之scFv的VL及VH來自達拉他單抗(daratumumab)。將金屬結合域MBM-1與MBM-2分別過一短的可撓性接合物GGGG(序列編號：9)接到(scFv α CD38)-CH2-CH3(人類γ1)重組鏈CH3域的C-端。將scFv建構為兩種方向，即，VL-接合物-VH及VH-接合物-VL，其中VL及VH是透過一親水性接合物所連接，其序列為GSTSGSGKPGSGEGSTKG(序列編號：10)。利用與上文實驗例相似的方式來表現與純化此處提出的重組雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1或-MBM-2。此處提出的(VL-VH scFv α CD38)- Fc-MBM-1、(VH-VL scFv α CD38)-Fc-MBM-1、(VL-VH scFv α CD38)-Fc-MBM-2以及(VH-VL scFv α CD38)-Fc-MBM-2之重組鏈的序列分別如序列編號：33、34、35與36所示。
利用SDS-PAGE來鑑定所述分子構建體。圖12A的SDA-PAGE結果指出(VL-VH scFv α CD38)-Fc-MBM-1(電泳條1)重組鏈的大小為約120kDa，略大於110kDa的預期大小。圖12B的SDA-PAGE結果指出，(VL-VH scFv α CD38)-Fc-MBM-2重組鏈的大小為約120kDa，略大於110kDa的預期大小。
實驗例11
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，製備一分子構建體，其帶有兩個DOTA束，分別耦接於雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1之金屬結合域的半胱胺酸殘基；圖13A繪示此分子構建體的概要結構。為了還原實驗例3之純化重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-1在C-端的半胱胺酸殘基，將琥珀酸鈉緩衝液(10mM琥珀酸鈉、pH6.0及30mM蔗糖)中的重組蛋白和45μM的三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，簡稱TCEP)在室溫下輕輕搖晃以培育30分鐘。在還原反應後，以10mM琥珀酸鈉緩衝液(pH 6.0含30mM蔗糖)含60μM Zn(II)離子進行透析，以移除多餘的TCEP。之後，以15μM實驗例2之Mal-胜肽2-DOTA束來處理還原蛋白樣本，接著在室溫下培育1小時。利用脫鹽柱移除未反應的DOTA束，並利用SDS-PAGE來分析產物。
圖13B為此處提出的分子構建體的SDS-PAGE分析 結果，圖中顯示此處提出的分子構建體的分子量為約120kDa(電泳條2，如箭頭所示)，略小於預期大小。電泳條1為未經耦接的融合蛋白樣本。如圖13B所示，DOTA束與重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1的耦接產率約為90%。利用Image J來定量SDS-PAGE上的蛋白條帶。
實驗例12
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-2 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例4的重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-2。
圖14為此處提出的分子構建體的SDS-PAGE分析結果，圖中顯示此處提出的分子構建體的分子量為約120kDa(電泳條2，如箭頭所示)，與預期大小相符或略小。電泳條1為未經耦接的融合蛋白樣本。如圖14所示，DOTA束與重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-2的耦接產率約為90%。
實驗例13
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-3 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例5的重組雙鏈(VL-VH scFv α CD19)-Fc-MBM-3。
圖15為此處提出的分子構建體的SDS-PAGE分析結果，圖中顯示此處提出的分子構建體的分子量為約120kDa(電泳 條2，如箭頭所示)，與預期大小相符或略小。電泳條1為未經耦接的融合蛋白樣本。如圖15所示，DOTA束與重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-3的耦接產率約為90%。
實驗例14
抗-CD19抗體-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例6的C端接有MBM-1之全長人類抗-CD19抗體。
圖16為此處提出的抗-CD19抗體-MBM-1 X 2 DOTA束分子構建體的SDS-PAGE分析結果。如圖16所示，重鏈的分子量約為54kDa(如電泳條2中箭頭#1所示)，與預期大小相符。電泳條2中箭頭#2為抗-CD19抗體-MBM-1的未經耦接之重鏈，及箭頭#3為抗-CD19抗體-MBM-1的輕鏈。
實驗例15
抗-CD19抗體-MBM-2 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例6的C端接有MBM-2之全長人類抗-CD19抗體。
圖17為此處提出的分子構建體的SDS-PAGE分析結果。如圖17所示，重鏈的分子量約為54kDa(如電泳條2中箭頭#1所示)，與預期大小相符。電泳條2中箭頭#2為抗-CD19抗體-MBM-1的未經耦接之重鏈，及箭頭#3為抗-CD19抗體-MBM-2的輕鏈。
實驗例16
重組雙鏈(scFv α CD33)-Fc-MBM X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例7的重組雙鏈(VL-VH scFv α CD33)-Fc-MBM-1或-MBM-2。
圖18為將DOTA束耦接至重組雙鏈(scFv α CD33)-Fc-MBM-1之SDS-PAGE分析結果。如圖18所示，本分子構建體的分子量為約120kDa(如電泳條2中箭頭#1所示)，與預期大小相符或略小。電泳條1中箭頭#2為未經耦接的融合蛋白。SDS-PAGE分析結果顯示DOTA束與重組雙鏈(scFv α CD33)-hIgG1.Fc-MBM-1的耦接產率約為65%。
實驗例17
重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例8的重組雙鏈(VL-VH scFv α CD20)-Fc-MBM-1。
圖19為將DOTA束耦接至重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1之SDS-PAGE分析結果。如圖19所示，本分子構建體的分子量為約120kDa(如電泳條2中箭頭#1所示)，與預期大小相符或略小。電泳條1中箭頭#2為未經耦接的融合蛋白。圖19的SDS-PAGE分析結果顯示DOTA束與重組雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1的耦接產率約為65%。
實驗例18
重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM X 2 DOTA的製備
於本實驗例中，利用上文實驗例所述的方法將兩個DOTA束耦接至實驗例9的重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1或-MBM-3。SDS-PAGE分析結果顯示，DOTA束與重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1及-MBM-3的耦接產率分別為約65%與70%(資料未示出)。
實驗例19
雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的穩定化
利用以下方法進行開環反應以使雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束更為穩定。
利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)以Tris緩衝液(100mM Tris、pH 9.0，100mML-精胺酸，以及100mM氯化鈉)來置換實驗例14製得之分子構建體反應產物的緩衝液。之後將所得溶液加熱至37℃並持續5小時。待溶液冷卻後，藉由離心將緩衝液置換為50mM Bis-Tris緩衝液、pH 5.5。將最終樣本離心以得到約1至3mg/mL蛋白。
純化時，調整經穩定之產物至pH 5.5，之後加入預平衡之(50mMBis-Tris緩衝液、pH 5.5)陰離子交換管柱Hi-TrapTM Q HP(GE Healthcare)。利用階梯式沖提法處理經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束，所用條件為：250mM NaCl、15分鐘，且線性梯度為250mM至324mM的NaCl、流速1.0ml/分、進行50分鐘。
之後使用陰離子交換管柱Q HP將經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束與未耦接之雙鏈融合蛋白、和三或四個DOTA束耦接之雙鏈融合蛋白以及團聚物分離開來。將純化產物，即雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束，濃縮並將緩衝液置換為Tris緩衝液(50mMTris緩衝液、pH 7.0及290mM NaCl)。
圖20為經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的陰離子交換管柱FPLC Q HP沖提圖譜。如圖20所示，在69.91分鐘可觀察到經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的沖提峰值。圖21顯示對收集自陰離子交換管柱Q HP不同餾份的SDS-PAGE分析結果。電泳條A、B、C、D分別對應於未耦接之分子構建體，耦接一個DOTA束之分子構建體、儲備溶液中的經穩定之耦接兩個DOTA束之分子構建體以及載入管柱前之儲備溶液中的經穩定之耦接兩個DOTA束之分子構建體。
由圖21的餾份#53、#54及#55收集純的產物，即，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。
實驗例20
雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的穩定化
經穩定之雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的純化
利用與上文實驗例19類似的方法來穩定化雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。
純化時，調整經穩定之產物至pH 5.1，之後加入預平 衡之(50mM醋酸、pH 5.1)陰離子交換管柱Hi-TrapTM Q HP(GE Healthcare)。利用階梯式沖提法處理經穩定之雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束，所用條件為：300mM NaCl、18分鐘，且線性梯度為300mM至1,000mM的NaCl、流速1.0ml/分、進行80分鐘。
之後使用陰離子交換管柱Q HP將經穩定之雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束與未耦接之雙鏈融合蛋白、和三或四個DOTA束耦接之雙鏈融合蛋白以及團聚物分離開來。
圖22顯示對收集自陰離子交換管柱Q HP不同餾份的SDS-PAGE分析結果。電泳條A、B、C分別對應於未耦接之分子構建體，耦接一個DOTA束之分子構建體以及載入管柱前的經穩定之耦接兩個DOTA束之分子構建體。
由圖22的餾份#40及#41收集純的產物，即，經穩定之雙鏈(scFv α CD20)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。
實驗例21
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的MALDI-TOF分析
利用MALDI-TOF質譜儀來分析實驗例19的經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。圖23的MALDI-TOF分析結果顯示經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束樣本之分子量是114,435及57,306道耳頓，分別對應於m/z(z=1)：[M+H]+及m/z(z=2)：[M+2H]2+。
實驗例22
89Y-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，將Y(NO3)3溶液加入含有來自實驗例19之經純化的穩定雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的溶液中，莫耳比為6：1[Y3+離子：蛋白]；在室溫下將反應混合物培育6小時。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱自溶液中移除游離的Y3+離子。利用MALDI-TOF質譜儀來分析經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2[89Y]3+螯合-DOTA束。圖24的MALDI-TOF分析結果顯示此處提出的分子構建體的分子量為114,391道耳頓。
實驗例23
175Lu-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於本實驗例中，將LuCl3溶液加入含有經純化的穩定雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的溶液中，莫耳比為60：1[Lu3+離子：蛋白]；接著在45℃將反應混合物培育1.5小時，以得到175Lu-DOTA-蛋白螯合物。利用旋轉過濾(Amicon離心過濾機，10kDa)，自溶液中移除游離的Lu3+離子。利用MALDI-TOF質譜儀來分析經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 175Lu螯合-DOTA束。圖25的MALDI-TOF分析結果顯示此處提出的分子構建體的分子量為114,928道耳頓。
實驗例24
111ln-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的製備
於製備111In-標記融合蛋白時，將不含載體的111In 於50mM HCI中之等分試樣轉移到試管中，並加入20倍體積的不含金屬之0.1M HEPES緩衝液，以將溶液的pH值調整至4.5。之後，加入雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束(30-50μg)的0.1M HEPES緩衝液(pH 4.5)溶液，蛋白最終濃度為0.3-0.6mg/mL。將所得到的溶液輕輕混合，並在40-45℃下培育60分鐘。加入蛋白質1,000倍量的二乙烯三胺五乙酸(Diethylenetriaminepentaacetic acid，簡稱DTPA)以捕捉游離的111In3+離子並使反應淬滅。在37℃下培育30分鐘後，自111In-標記產物移除111In-DTPA螯合物，並以旋轉過濾(Amicon離心過濾機，10kDa)將溶劑置換為0.9%食鹽水。
利用一γ-計數器測量適量等分試樣樣本之放射活度，以決定收集到之111In-標記產物的比活度。
實驗例25
111In-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的放射摻入分析
以即時薄層色層分析法(instant thin-layer chromatography，iTLC)來進行放射化學純度分析。利用原始溶劑將實驗例24之放射標記產物溶液以1：10或1：20稀釋；之後，將1μL的樣本點在1×10cm之TLC SG試紙條的一端。利用生色譜法以0.5M檸檬酸鈉(pH 4.5)使試紙顯影。利用放射-TLC掃描儀來測定放射活度。與蛋白質相關的放射活度表示為總放射活度的百分比。如圖26所示，111In標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的放射化學純度高於98%。
實驗例26
111In-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在血清中的安定性測試
以小鼠血清在37℃下將111In-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束處理96小時也測定其活體外安定性。將實驗例24之111In-標記之分子構建體懸浮於0.2M醋酸銨(pH 5)中。利用小鼠血清以1：10的比例稀釋111In-標記之分子構建體，之後再培育於37℃下96小時。在選定的時間點(0、12、24、48及96小時)，移除111In-標記分子並以實驗例25所述的放射-TLC法分析。
如圖27所示，將111In-標記雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在小鼠血清中於37℃下培育96小時後能可展現理想的放射活性。
實驗例27
重組雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的位置專一耦接
為了確認雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1中與DOTA束耦接的半胱胺酸殘基，將樣本分解後利用LC-MS進行分析。簡言之，將來自實驗例11的5μl樣本(0.4μg/mL)以含15μl的25mM四乙硼酸四乙銨(tetraethylammonium tetrahydroborate，TEAB)以及2μl的200mM TCEP之溶液稀釋，並於55℃下培育1小時。之後，向反應混合物加入2μl的375mM醋酸碘(IAA)並在室溫下培育30分鐘。在經過IAA烷基化之後，將酵素(胰蛋白酶與Glu-C)加入溶液中，並於37℃下反應一夜以使酵素分解樣本。
質譜分析資料(資料未示出)顯示MS光譜中片段的m/z值對應於4,530.99道耳頓，與含有SLSLSPGGGGACPGHA(序列編號：13之第468-483個胺基酸殘基)胺基酸序列之分子構建體以及一個DOTA束的判斷之分子量相符。
實驗例28
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束對人類B淋巴瘤細胞株的結合活性
分析兩種經穩定之分子構建體，即(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以及(scFv α CD19)-Fc-MBM-3 X 2 DOTA束，對人類B淋巴瘤細胞株Raji上之人類CD19的結合能力。將1x106個表現CD19的Raji細胞和0.001μg/ml的分子構建體PBS溶液一起在1% BSA中於冰上一起培育30分鐘，抗-CD19抗體(RB4v1.2)、(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以及(scFv α CD19)-Fc-MBM-3 X 2 DOTA束作為正對照組。抗-HER2抗體(曲妥珠單抗)作為負對照組。利用FACS(FACSCanto II,BD Biosciences)來分析細胞染色情形，以FITC-複合之山羊抗人類IgG.Fc(於PBS/BSA以1：200稀釋)(Caltag,Buckingham,UK)在4℃下於黑暗中處理20分鐘。圖27A及27B顯示含MBM-1及MBM-3的兩種分子構建體在表現CD19的Raji細胞上的細胞染色結果，結果指出這兩種分子構建體都能夠實質地和Raji細胞結合。
分析上述分子構建體對人類B淋巴瘤細胞株Ramos上之人類CD19的結合能力。利用與上文針對Raji細胞進行細胞結合分析類似之方法來進行此處的分析。以FITC-複合之山羊抗人類IgG.Fc利用FACS(FACSCanto II,BD Biosciences)來分析 Ramos細胞染色情形，其中抗-CD19 IgG作為正對照組。抗-HER2抗體(曲妥珠單抗)作為負對照組。圖27C及27D顯示含MBM-1及MBM-3的兩種分子構建體在表現CD19的Ramos細胞上的細胞染色結果。這兩種分子構建體都能夠實質地和Ramos細胞結合。
實驗例29
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的安定性
為了平經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的安定性，將分子構建體置於含穀胱甘肽或人類血清白蛋白(HSA)之Tris緩衝液(100mMTris緩衝液、pH 7.3，50mM Bis-Tris緩衝液以及290mM NaCl)中，並於37℃下培育30天。
如圖28所示，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在和穀胱甘肽或人類血清白蛋白一起在37℃下培育30天後仍可展現理想的安定性。如圖28所示，在穀胱甘肽和人類血清白蛋白處理的兩個組別中，溶液中仍保有約90%的全長分子構建體而無逆向邁克爾加成(Michael addition)產物。電泳條U及C分別對應於未耦接之分子構建體及儲存於4℃下之經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束，以作為對照。
實驗例30
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束之逆向邁克爾加成產物之檢視
為了進一步確認雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的安定性，將經穩定之分子構建體和穀胱甘肽或HAS一起培育，之後再利用西方墨點法分析。
簡單來說，在對經穩定之樣本進行西方墨點法時，先以8% SDS-PAGE凝膠分離樣本，並轉移至及聚偏二氟乙烯(poly(vinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore)上。以含5% BSA與0.05% Tween 20的PBS在室溫下處理1小時，以阻斷膜上的墨點。在以含PBS與0.05% Tween-20的磷酸鹽緩衝液-Tween 20(PBST)沖洗3次後，接著再將墨點和與山葵過氧化酶(HRP)複合之山羊抗人類IgG.Fc抗體(Millipore)一起培育。之後，以PBST清洗膜3次，利用ECLTM西方墨點偵測試劑(Millipore)來偵測免疫反應條帶並曝光於Fujifilm(Tokyo,Japan)上。
圖30為經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的西方墨點分析結果。如圖29所示，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在和穀胱甘肽或人類血清白蛋白一起在37℃下培育30天後仍可展現理想的安定性，相較於儲存於4℃下經穩定之分子構建體(電泳條C)。電泳條U為作為對照之未耦接之分子構建體。
實驗例31
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的半衰期
對小鼠體以靜脈內注射經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束後，測定其半衰期。利用ELISA來分析血清中的(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。8至10週齡的BALB/c小鼠購自BioLasco(臺北，臺灣)。將小鼠分為每組6隻，並靜脈內注射約200μL的3.33μM蛋白。
圖31示出抗-CD19抗體(RB4v1.2)與雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1融合蛋白的藥動學圖譜，由圖中可以看出抗-CD19抗體(RB4v1.2)、實驗例3之(scFv α CD19)-Fc-MBM-1融合蛋白、實驗例18之分子構建體(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以及實驗例19之經穩定之分子構建體(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束From實驗例19的半衰期分別為約129、179.6、153.6以及193.5小時。總結來說，穩定化處理可以延長經穩定之分子構建體的半衰期。
實驗例32
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束對表現CD19之異種移植腫瘤的標的效果
於本實驗例中，利用活體內顯影系統(in vivo imaging system，IVIS)來測定經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束對小鼠異種移植模型中表現CD19之腫瘤的標的效果。在IVIS顯影前，根據製造商的指示，以Dylight 680抗體標記套組(Thermo Scientific)來標記實驗例19的經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以及抗-CD19抗體(RB4v1.2)。
8至10週齡的NOD-SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/JNarl)係購自中研院細胞與個體生物學研究所的動物實驗設施(臺北，臺灣)。在處理前兩週，將1×107個B細胞淋巴瘤Raji細胞以腹膜內注射至每隻小鼠體內。將小鼠分為每組三隻小鼠，並靜脈內注射約200μL的6.65μM標記分子。在不同的時間點，在氧氣中以異氟烷麻醉小鼠並以仰臥姿放置於IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)中。利用Living Image Software V3.2在ex/em=675/720條件下擷取螢光影像。在指定時間IVIS Spectrum imager獲取影像後，利用Living Image軟體分析。
在注射Dylight 680-複合蛋白後的第0、24、48及72小時擷取NOD-SCID小鼠螢光影像並進行分析。圖32顯示螢光標記分子在小鼠模型中的分布。NOD-SCID小鼠經靜脈內注射抗-CD19抗體(RB4v1.2)(1及2)以及經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束(3及4)。
如圖32所示，在靜脈內注射後第24、48與72小時後，經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束及抗-CD19抗體(RB4v1.2)進入位於右方之腫瘤內的量遠高於進入左方正常器官的量。因此，經穩定之分子構建體對小鼠異種移植模型中表現CD19之腫瘤展現了理想的標的效果。
實驗例33
經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在表現CD19的異種移植腫瘤小鼠內的生體分布
利用實驗例32所述方法並稍加改變，以評估經穩定之(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束在異種移植小鼠模型體內的生體分布。
簡言之，在處理前2至3週，對每隻小鼠皮下注射1×107個B細胞淋巴瘤Raji細胞。小將小鼠分為每組三隻小鼠，並靜脈內注射約200μL的6.65μM標記分子。
在注射經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束以及抗-CD19抗體之後7天進行組織ELISA以分析NOD-SCID小鼠的生體分布。簡言之，在注射後第7天將動物犧牲。 將心臟血液放血，並收集11個器官的組織樣本。以均質機將組織樣本均質化，並以ELISA進一步分析其中的注射分子濃度。
圖33為小鼠模型中經穩定之雙鏈(scFv α CD19)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束(TE-1122)的分布。生物分布圖中Y軸代表組織對血液的比例。此處的結果亦顯示經穩定之分子構建體能夠標的到小鼠異種移植模型中表現CD19之腫瘤。
實驗例34
帶有末端半胱胺酸殘基之Aib-GLP-1促效劑的合成
於本實驗例中，製備C-端含自由半胱胺酸且帶有一個ε-異丁胺酸(ε-aminoisobutyric acid，Aib)取代基的似升糖素胜肽1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)促效劑(序列編號：37)。圖34為本分子構建體的概要結構。與索馬魯肽(semaglutide)類似，其第二個胺基酸殘基經Aib(或U)殘基取代，使其較能抵抗二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP 4)引發的降解；然而，於本分子構建體中，在索馬魯肽的最後一個甘胺酸殘基(即，序列編號：37的第46個胺基酸殘基之前加入了長度為15個胺基酸殘基的可撓性接合物(即，序列編號：37的第31至45個胺基酸殘基)，並在C-端加入一末端半胱胺酸殘基。
本案發明人設計了Aib-GLP-1促效劑-Cys的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。
利用反相分析級在HPLC在Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)上分析Aib-GLP-1促效劑-Cys的純化樣本，流動相使用乙腈及0.1%三氟乙酸，乙腈線性梯度為0%至100%、30分鐘，流速為1.0ml/min且管柱溫度為25℃。
利用ESI-MS質譜分析來鑑定Aib-GLP-1促效劑-Cys產物。Aib-GLP-1促效劑-Cys產物樣本在1,483.4處顯現出強的分子離子，對應於[M+H]+，這代表此處提出的Aib-GLP-1促效劑-Cys促效劑的真實分子量為1,482.4道耳頓。
實驗例35
帶有末端半胱胺酸殘基之體抑素類似物的合成
於本實驗例中，製備N-端帶有自由半胱胺酸的體抑素類似物；此一Cys-體抑素胜肽分子構建體的胺基酸序列如序列編號：38所示。圖35為本分子構建體的概要結構。本分子構建體有14個胺基酸殘基，其中加入一N-末端半胱胺酸殘基，之後接著5個胺基酸殘基的可撓性接合物以及體抑素胜肽序列。與原始的體抑素胜肽相似，此處提出的Cys-體抑素胜肽分子構建體的第七個胺基酸殘基(Phe)以及第十個胺基酸殘基(Trp)為D型，且在第8與第13個半胱胺酸殘基間形成一雙硫橋，且C-端的蘇胺酸殘基為蘇胺醇。此外，Cys-體抑素胜肽分子構建體的N-端經乙醯基修飾。
本案發明人設計了此處提出的Cys-體抑素胜肽分子構建體的結構，並委由Ontores Biotechnologies Co.,Ltd.(杭州，中國)以標準固態合成法合成。Cys-體抑素胜肽產物的純度高於95%。
利用MALDI-TOF質譜儀來分析Cys-體抑素胜肽產物。此處的質譜分析都是由中央研究院分子生物學研究中心(IMB)質譜核心設施(臺北，臺灣)進行分析，所用的設備為Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜(購自Bruker Daltonics，Bremen，德國)。圖36的MALDI-TOF質譜分析結果顯示，此處提出的分子構建體的分子量為1,493.587道耳頓。
實驗例36
帶有半胱胺酸殘基之PSMA配體的合成
於本實驗例中，製備帶有自由半胱胺酸殘基之的PSMA配體，此分子構建體的結構如圖37所示。
本案發明人設計了此處提出的Cys-PSMA配體分子構建體的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。Cys-PSMA配體產物的純度高於95.0%。
利用ESI-MS質譜分析來鑑定Cys-PSMA配體。圖38的ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的分子構建體在522.4處顯現出強的分子離子，對應於[M+H]+，這代表Cys-PSMA配體的真實分子量為521.4道耳頓。
實驗例37
降鈣素-MBM-1的合成
於本實驗例中，製備C-端帶有金屬結合域之降鈣素的分子構建體；此降鈣素-MBM-1分子構建體的胺基酸序列如序列編號：39所示。圖39為本分子構建體的概要結構。與降鈣素相似，在與第七個半胱胺酸殘基間形成一雙硫橋；然而，在本分子構建體中，於降鈣素的最後一個脯胺酸殘基(即，序列編號：39的第32個胺基酸殘基)之後引入長度為8個胺基酸殘基(序列編號：39的第33-40個胺基酸殘基)的可撓性接合物，並將MBM-1域(ACPGHA，序列編號：7)加入至可撓性接合物的C-端。
本案發明人設計了此處提出的降鈣素-MBM-1分子構建體的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。Cys-PSMA配體產物的純度高於95.0%。
實驗例38
特立帕肽-MBM-1的合成
於本實驗例中，製備C-端帶有金屬結合域之特立帕肽的分子構建體；此特立帕肽-MBM-1分子構建體的胺基酸序列如序列編號：40所示。特立帕肽是一種副甲狀腺(PTH)激素，其係由該激素的前34個胺基酸之活性部位所組成。其可用以至郎某些型式的骨質酥鬆症。在特立帕肽-MBM-1分子構建體中，於特立帕肽的最後一個苯丙胺酸殘基殘基(即，序列編號：40的第34個胺基酸殘基)之後引入長度為15個胺基酸殘基(序列編號：40的第35-49個胺基酸殘基)的可撓性接合物，並將MBM-1域(ACPGHA，序列編號：7)加入至可撓性接合物的C-端。
本案發明人設計了此處提出的特立帕肽-MBM-1分子構建體的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。Cys-PSMA配體產物的純度高於95.0%。
實驗例39
亮丙瑞林-MBM-3的合成
於本實驗例中，製備C-端帶有金屬結合域之亮丙瑞林的分子構建體；此亮丙瑞林-MBM-3分子構建體的胺基酸序列如序列編號：41所示。亮丙瑞林(亦稱為柳菩林)是一種促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)類似物，可作為多種GnRH受體的促效劑，並可用於治療前列腺癌與乳癌。可商業購得之亮丙瑞林是有9個胺基酸殘基的寡肽。在此處提出的亮丙瑞林-MBM-3分子構建體中，於亮丙瑞林的最後一個脯胺酸殘基(即，序列編號：41的第9個胺基酸殘基)之後引入長度為8個胺基酸殘基(序列編號： 41的第10-17個胺基酸殘基)的可撓性接合物，並將MBM-3域(GCGGHA，序列編號：6)加入至可撓性接合物的C-端。
本案發明人設計了此處提出的亮丙瑞林-MBM-3分子構建體的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。利用ESI-MS質譜分析來鑑定此處提出的亮丙瑞林-MBM-3分子構建體。ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的分子構建體在1,091.97處顯現出強的分子離子，對應於[M+2H]2，這代表亮丙瑞林-MBM-3分子構建體的真實分子量為2,181.35道耳頓。
實驗例40
來那度胺束的合成
於本實驗例中，本案發明任設計了兩種載藥束，其以帶有三個離胺酸殘基的含順丁烯二醯亞胺多肽作為中心核，並有三個來那度胺分子耦接至中心核上。利用綜合的方法來合成此處提出的來那度胺束，其中使用Fmoc標準固態合成法來合成中心核，之後再進行液態合成以將經過連接臂修飾的來那度胺分子連接到中心核離胺酸殘基的側鏈。本分子構建體委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。
圖40繪示Mal-胜肽3-來那度胺束，其中心核的序列為EGEGEAGGKGAGKGAGKG(序列編號：42)，其中第一個胺基酸殘基經順丁烯二醯亞胺乙烯基修飾。另一方面，在將其耦接至中心核之前，利用對胺基芐基氨基甲酸酯(para-amino benzyl carbamate，PABC)-丙胺酸-纈胺酸-PEG連接臂來修飾來那度胺分子。來那度胺分子透過連接臂的自由端連接至中心核之離胺酸殘基的ε-胺基。
利用ESI-MS質譜分析來鑑定Mal-胜肽3-來那度胺束。圖41的ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的載藥束在1,321.9處顯現出強的分子離子，對應於[M+3H]3+，這代表Mal-胜肽3-來那度胺束的真實分子量為3,962.02道耳頓。
圖42繪示Mal-胜肽4-來那度胺束，其中心核的序列為EDEDEAGGKGAGKGAGKG(序列編號：43)，其中第一個胺基酸殘基經順丁烯二醯亞胺乙烯基修飾。另一方面，在將其耦接至中心核之前，利用上述連接臂來修飾來那度胺分子，並透過連接臂的自由端連接至中心核之離胺酸殘基的ε-胺基。
利用ESI-MS質譜分析來鑑定Mal-胜肽4-來那度胺束。ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的載藥束在1,379.2處顯現出強的分子離子，對應於[M+3H]3+，這代表Mal-胜肽4-來那度胺束的真實分子量為4,135.15道耳頓。
實驗例41
Mal-脂肪酸束的合成
於本實驗例中，製備由Mal-胜肽5中心核以及一個硬脂醯二酸鏈與一個棕櫚酸鏈所組成的分子構建體。
圖43繪示本Mal-胜肽5-脂肪酸束的結構，其中心核的序列為順丁烯二醯亞胺乙基EGEGE-X1-K-X2-K-OMe(序列編號：44)，其中第一個胺基酸殘基經順丁烯二醯亞胺乙烯基基修飾，最後一個離胺酸殘基則經甲氧基(-OMe)修飾，且X1與X2皆為有4個EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸。一條硬脂醯二酸鏈與一條棕櫚酸鏈分別透過與脂肪酸的CO2H基和K殘基的胺基間所形成的醯胺鍵而連接到多肽中心核的K殘基。本案發明人設計了此處提出的Mal-胜肽5-脂肪 酸束的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。Mal-胜肽5-脂肪酸束產物的純度高於97.0%。
利用ESI-MS質譜分析來鑑定所合成的脂肪酸束。圖44的ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的載藥束在1,143.6處顯現出強的分子離子，對應於[M+2H]2+，這代表Mal-胜肽5-脂肪酸束的真實分子量為2,285.66道耳頓。
實驗例42
3-DOTA臂接合單元的合成
於本實驗例中，製備用以攜帶三個胜肽的3-DOTA臂接合單元。圖45為此種3-臂接合物的結構。具體來說，所述接合單元包含一中心核，其序列為乙醯-KGAGGKGAGGKG(序列編號：45，胜肽核6)，其中第一個離胺酸殘基經乙醯基修飾。所述接合單元亦包含三個連接臂，其序列為順丁烯二醯亞胺乙基EGEGEAGKGAG(SEQ ID NO：46)，其中第一個麩胺酸殘基經順丁烯二醯亞胺乙烯基修飾，且離胺酸殘基經DOTA分子修飾。
本案發明人設計了此處提出的3-DOTA臂接合單元的結構，並委由Shanghai WuXi AppTech Co.,Ltd.(上海，中國)合成。利用ESI-MS質譜分析來鑑定所合成的3-DOTA臂接合單元。圖46的ESI-MS質譜分析結果顯示，此處提出的載藥束在1,357.8處顯現出強的分子離子，對應於[M+4H]4+，這代表3-DOTA臂接合單元的真實分子量為5,427.2道耳頓。
實驗例43
重組MBM-1-IL-2的建構、表現與純化
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，建構、 表現與純化如序列編號：47所示的複合蛋白。具體來說，此處提出的MBM-1-IL-2分子構建體帶有MBM-1域，其後接著一個短的可撓性接合物(序列編號：9)以及IL-2序列。
收集培養物上清液，並純化利用陰離子交換管柱純化培養基中表現之重組融合蛋白。在純化前，將重組MBM-1-IL-2融合蛋白調整至pH 8.5。之後，將蛋白加入預平衡之(50mMBis-Tris緩衝液、pH 8.5)Q sepharose陰離子交換管柱(GE Healthcare)。利用3-階沖提法處理MBM-1-IL-2融合蛋白，分別是200mM、500mM及1M NaCl的4M尿素溶液、pH 8.5。
利用10% SDS-PAGE分析沖提產物，結果如圖47所示。MBM-1-IL-2融合蛋白的主要條帶位於約16kDa，與預期大小相符(如箭頭所示)。
實驗例44
雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的合成
於本實驗例中，將實驗例10的(scFv α CD38)-Fc-MBM-1融合蛋白和實驗例40的Mal-胜肽4-來那度胺束耦接，所得到的分子構建體帶有雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1融合蛋白以及兩個來那度胺束分別耦接至融合蛋白之個別金屬結合域的半胱胺酸殘基。簡言之，將純化的(scFv α CD38)-Fc-MBM-1融合蛋白置於琥珀酸鈉緩衝液(30mM琥珀酸鈉、pH5.3，0.02% Tween 20以及100mM蔗糖)並和45μM TCEP在室溫下輕輕搖晃以培育30分鐘，以將其還原。在還原反應後，以10mM琥珀酸鈉緩衝液(pH 5.3含0.02% Tween 20以及100mM蔗糖)含60μM Zn(II)離子進行 透析，以移除多餘的TCEP。之後，以15μM的Mal-胜肽4-來那度胺束來處理還原蛋白樣本，接著在室溫下培育1小時。利用脫鹽柱移除未反應的來那度胺束，並利用SDS-PAGE來分析產物。
圖48為此處提出的分子構建體的SDS-PAGE分析結果，圖中顯示本分子構建體的分子量為約120kDa(如電泳條2中箭頭#1所示)，略小於預期大小。電泳條3為未經耦接的融合蛋白樣本(如箭頭#2所示)。如圖48所示，雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1與來那度胺束的耦接產率約為85%。
實驗例45
體抑素胜肽X脂肪酸束的合成
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，將實驗例41的Mal-胜肽5-脂肪酸束和實驗例35的Cys-體抑素胜肽進行耦接，以使得Mal-胜肽5-脂肪酸束的順丁烯二醯亞胺乙基和Cys-體抑素胜肽之末端半胱胺酸殘基的SH基耦接，因而得到體抑素胜肽X脂肪酸束之分子構建體(參見，圖49)。
實驗例46
Aib-GLP-1促效劑X脂肪酸束的合成
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，將實驗例41的Mal-胜肽5-脂肪酸束和實驗例34的Aib-GLP-1促效劑-Cys進行耦接，以使得Mal-胜肽5-脂肪酸束的順丁烯二醯亞胺乙基和Aib-GLP-1促效劑-Cys之末端半胱胺酸殘基的SH基耦接，因而得到Aib-GLP-1促效劑X脂肪酸束之分子構建體(參見，圖50A)。
實驗例47
特立帕肽-MBM-1 X脂肪酸束的合成
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，將實驗例41的Mal-胜肽5-脂肪酸束和實驗例38的特立帕肽-MBM-1進行耦接，以得到特立帕肽-MBM-1 X脂肪酸束之分子構建體(參見，圖50B)。
實驗例48
亮丙瑞林-MBM-3 X脂肪酸束的合成
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，將實驗例41的Mal-胜肽5-脂肪酸束和實驗例39的亮丙瑞林-MBM-3進行耦接，以得到亮丙瑞林-MBM-3 X脂肪酸束之分子構建體(參見，圖51A)。利用MALDI-TOF質譜分析來鑑定所合成的亮丙瑞林-MBM-3 X脂肪酸束，其結果如圖51B所示，本分子構建體的分子量為4,466.019道耳頓。分子量2,181.038道耳頓顯示本反應在[亮丙瑞林-MBM-3：Mal-胜肽5-脂肪酸]莫耳比1.5：1的條件下，亮丙瑞林-MBM-3為過量的。
實驗例49
3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體的合成
於本實驗例中，利用與上文實驗例相似的方法，將實驗例42的3-DOTA臂接合單元和三個來自實驗例36的Cys-PSMA配體進行耦接，以得到3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體之分子構建體(參見，圖52A)。利用ESI-MS質譜分析來鑑定所合成的3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體，其結果如圖52B所示，此處提出的分子構建體在1,79處顯現出強的分子離子，對應於[M+4H]4+，這代表3-DOTA臂接合單元X 3 PSMA配體的真實分子量為6,992.18道耳頓。
實驗例50
經穩定之雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束的純化
利用如上文實驗例所述的方式使重組雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束穩定。
將上述實驗例之與兩個DOTA束耦接之雙鏈融合調整至pH 5.0，之後加入預平衡之(0.1m MEDTA、50mM Bis-Tris、pH 5.0)陰離子交換管柱Q sepharose(GE Healthcare)。利用3-階沖提法處理樣本；第一次沖提使用320mM NaCl、70分鐘，之後第二次沖提使用330mM、100分鐘，且最後一次沖提使用1,000mM NaCl、50分鐘，流速為1.0ml/分。
之後使用陰離子交換管柱Q sepharose將雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束與未耦接之雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1融合蛋白、和三或四個DOTA束耦接之雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1融合蛋白以及團聚物分離開來。
收集純化產物，即雙鏈(scFv α CA19-9)-Fc-MBM-1 X 2 DOTA束。圖53所示之電泳條1及電泳條2分別對應至未耦接之分子構建體以及耦接兩個DOTA束之分子構建體。
實驗例51
經穩定之雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的純化
利用如上文實驗例所述的方式使實驗例44的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束分子建構體穩定。
將經穩定之雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來 那度胺束分子建構體調整至pH 7.0，之後加入預平衡之(50mM Na2HPO4、pH 7.0、1M NaCl)疏水互動管柱(HIP)Phenyl HP(GE Healthcare)。利用線性梯度沖提經穩定之分子構建體，條件如下：1,000mM至0mM NaCl，流速1.0ml/分，進行80分鐘。
將從前述HIC純化管柱收集到的樣本加入尺寸排阻層析管柱ENrichTM SEC650(Bio-Rad)，以將經穩定之分子構建體和團聚物分離開來。收集純化產物。圖54為10%非還原SDS-PAGE分析結果，其中電泳條1與電泳條2分別對應至未耦接之分子構建體以及耦接兩個來那度胺束之分子構建體。
進一步利用MALDI-TOF質譜儀來分析純化後之經穩定雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束分子構建體。圖55下方所示的質譜分析結果顯示樣本的分子量為58,382與116,705道耳頓，分別對應於m/z(z=1)：[M+H]+及m/z(z=2)：[M+2H]2+。
圖55上方為作為對照之雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1的質譜分析結果，其分子量為54,300及108,537道耳頓，分別對應於m/z(z=1)：[M+H]+及m/z(z=2)：[M+2H]2+。
實驗例52
經穩定之雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束於NOD-SCID小鼠中之半衰期
對小鼠體以靜脈內注射經穩定之雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束後，測定其半衰期。利用ELISA來分析血清中的分子構建體。8至10週齡的NOD-SCID小鼠購自 BioLasco(臺北，臺灣)。將小鼠分為每組3隻，並靜脈內注射約100μL的7.6μM蛋白。
分析結果顯示親本抗-CD38 hIgG1.Fc抗體(圖56A)以及雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(圖56B)的半衰期分別是約13.1及23.9小時。利用非分室藥動學模型計算的結果顯示，此處提出的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束的半衰期比傳統抗-CD38抗體來得長。
實驗例53
純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束對H929與CD38-陽性U266細胞的細胞毒性
將H929細胞(5x103/孔)加入96孔盤的孔中，所用培養基為RPMI1640，含10%胎牛血清。2小時後，將20μM的純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1(不含來那度胺束)或雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束以2倍序列稀釋後，加入各孔中。培育2小時後，以400g離心5分鐘，以移除培養基並置換新鮮培養基，其後將細胞再培育120小時(5天)與168小時(7天)。接著利用alamarBlue細胞存活率試劑套組(Invitrogen)根據製造傷的指示，分析細胞存活率。
利用與上文針對H929細胞類似的方式，來決定帶有或不帶有兩個來那度胺束之純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1對CD38-陽性之U266細胞的細胞毒性。
圖57A顯示四個處理組別中，H929細胞的存活率。以20μM的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(標記為scFv-Fc-len)處理5天後，約有80%的H929細胞發生細胞溶解。 作為負對照的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1(標記為scFv-Fc)則沒有細胞毒殺效果。
圖57B顯示四個處理組別中，CD38-陽性之U266細胞的存活率。以20μM的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(標記為scFv-Fc-len)處理5天後，約有80%的CD38-陽性之U266細胞發生細胞溶解。
圖57C顯示四個處理組別中，CD38-陰性之U266細胞的存活率。不論是何種莫耳濃度的雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(標記為scFv-Fc-len)都不能引致CD38-陰性之U266細胞發生細胞溶解。
總結來說，圖57A至57C的結果顯示雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束有很強的標的效果。
實驗例54
純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束對表現CD38之H929與U266細胞的抗體介導細胞毒性(ADCC)
於本實驗例中，進行活體外分析以探討雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束之抗體介導細胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)對表現CD38之H929細胞以及CD38-陽性之U266細胞的細胞溶解有何影響。
自捐贈者取得人類全周邊血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)以分析ADCC功能。將H929細胞或CD38-陽性之U266細胞和雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束一起培育，最終濃度為200、40、8、1.6、0.32或0.064nM，且之後和人類PBMC以E：T比25的比例混合，並於37℃下 培育5小時。以親本抗-CD38 mAb作為正對照。利用LDH細胞毒性分析套組(Enzo Life Sciences)來分析細胞溶解。
此處所示的資料指出，純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(標記為scFv-Fc-len)可運用和親本抗-CD38單珠抗體類似的方式招募效應細胞，以引發細胞溶解活性(圖58A)。以親本抗-CD38抗體(標記為IgG)作為正對照，且亦使用了同型對照抗體(標記為對照IgG)。
如圖58B所述，純化雙鏈(scFv α CD38)-Fc-MBM-1 X 2來那度胺束(標記為scFv-Fc-len)在CD38-陽性U266細胞中可展現與親本物相近的溶胞活性。
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾。
<110> 免疫功坊股份有限公司
<120> 帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體
<130> P3187-TW
<150> US62/823,626
<151> 2019-03-25
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 變異體
<222> 2
<223> Xaa是甘胺酸或脯胺酸
<220>
<221> 變異體
<222> 3
<223> Xaa是甘胺酸或丙胺酸
<400> 1
Figure 109110106-A0202-12-0088-2
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
Figure 109110106-A0202-12-0088-3
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
Figure 109110106-A0202-12-0089-4
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
Figure 109110106-A0202-12-0089-5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
Figure 109110106-A0202-12-0089-6
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 6
Figure 109110106-A0202-12-0089-7
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
Figure 109110106-A0202-12-0089-8
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
Figure 109110106-A0202-12-0090-9
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
Figure 109110106-A0202-12-0090-10
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
Figure 109110106-A0202-12-0090-11
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
Figure 109110106-A0202-12-0090-12
<210> 12
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
Figure 109110106-A0202-12-0091-13
<210> 13
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
Figure 109110106-A0202-12-0091-14
Figure 109110106-A0202-12-0092-15
<210> 14
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
Figure 109110106-A0202-12-0092-16
Figure 109110106-A0202-12-0093-17
<210> 15
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
Figure 109110106-A0202-12-0093-18
Figure 109110106-A0202-12-0094-19
<210> 16
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
Figure 109110106-A0202-12-0095-20
Figure 109110106-A0202-12-0096-21
<210> 17
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
Figure 109110106-A0202-12-0096-22
Figure 109110106-A0202-12-0097-23
<210> 18
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
Figure 109110106-A0202-12-0097-24
Figure 109110106-A0202-12-0098-25
<210> 19
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
Figure 109110106-A0202-12-0098-26
Figure 109110106-A0202-12-0099-27
<210> 20
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
Figure 109110106-A0202-12-0099-28
Figure 109110106-A0202-12-0100-29
<210> 21
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
Figure 109110106-A0202-12-0100-30
Figure 109110106-A0202-12-0101-31
<210> 22
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
Figure 109110106-A0202-12-0102-32
Figure 109110106-A0202-12-0103-33
<210> 23
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
Figure 109110106-A0202-12-0103-34
Figure 109110106-A0202-12-0104-35
<210> 24
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
Figure 109110106-A0202-12-0104-36
Figure 109110106-A0202-12-0105-37
<210> 25
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 25
Figure 109110106-A0202-12-0105-39
Figure 109110106-A0202-12-0106-40
<210> 26
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 26
Figure 109110106-A0202-12-0107-41
Figure 109110106-A0202-12-0108-42
<210> 27
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
Figure 109110106-A0202-12-0108-43
Figure 109110106-A0202-12-0109-44
<210> 28
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
Figure 109110106-A0202-12-0109-45
Figure 109110106-A0202-12-0110-46
<210> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
Figure 109110106-A0202-12-0110-47
Figure 109110106-A0202-12-0111-48
<210> 30
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
Figure 109110106-A0202-12-0111-49
<210> 31
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
Figure 109110106-A0202-12-0111-50
Figure 109110106-A0202-12-0112-51
<210> 32
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
Figure 109110106-A0202-12-0112-52
Figure 109110106-A0202-12-0113-53
Figure 109110106-A0202-12-0114-55
<210> 33
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
Figure 109110106-A0202-12-0114-54
Figure 109110106-A0202-12-0115-56
<210> 34
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
Figure 109110106-A0202-12-0115-57
Figure 109110106-A0202-12-0116-58
<210> 35
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
Figure 109110106-A0202-12-0116-60
Figure 109110106-A0202-12-0117-61
<210> 36
<211> 487
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
Figure 109110106-A0202-12-0118-62
Figure 109110106-A0202-12-0119-63
<210> 37
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 變異體
<222> 2
<223> Xaa是2-異丁胺酸
<400> 37
Figure 109110106-A0202-12-0119-64
<210> 38
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 變異體
<222> 7
<223> D-form
<220>
<221> 變異體
<222> 10
<223> D-form
<400> 38
Figure 109110106-A0202-12-0119-65
<210> 39
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
Figure 109110106-A0202-12-0120-67
<210> 40
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
Figure 109110106-A0202-12-0120-68
<210> 41
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 變異體
<222> 1
<223> Xaa是焦麩胺酸
<220>
<221> 變異體
<222> 6
<223> D-form
<400> 41
Figure 109110106-A0202-12-0120-66
<210> 42
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
Figure 109110106-A0202-12-0121-69
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
Figure 109110106-A0202-12-0121-70
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 變異體
<222> 6,8
<223> Xaa是具有四個EG單元的聚乙二醇化胺基酸
<400> 44
Figure 109110106-A0202-12-0121-71
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
Figure 109110106-A0202-12-0121-72
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
Figure 109110106-A0202-12-0122-74
<210> 47
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
Figure 109110106-A0202-12-0122-73

Claims (15)

  1. 一種複合多肽，包含一親本多肽以及一金屬結合域，其中該金屬結合域包含，由N-端至C-端或由C-端至N-端，如序列編號：1(CX1X2HA)所示的胺基酸序列，其中X1為甘胺酸或脯胺酸，且X2為甘胺酸或丙胺酸，且該金屬結合域位於該親本多肽的N-或C-端。
  2. 如請求項1所示的複合多肽，其中該金屬結合域的胺基酸序列為CGGHA(序列編號：2)、CPGHA(序列編號：3)、CGAHA(序列編號：4)、CPAHA(序列編號：5)、GCGGHA(序列編號：6)、ACPGHA(序列編號：7)或GCPGHA(序列編號：8)。
  3. 如請求項1所示的複合多肽，其中該親本多肽為一肽激素、受體結合擬肽配體、抗體片段或細胞介素，或其均等物。
  4. 一種分子構建體，包含一如請求項1所述的複合多肽以及一功能性元件，其中該功能性元件有一硫氫基(SH)-反應性基，其可與該金屬結合域中之該半胱胺酸殘基的硫醇基耦接。
  5. 如請求項4所述的分子構建體，其中該SH-反應性基為順丁烯二醯亞胺基、碘乙醯基、溴乙醯基、乙烯碸基、單碸基、甲磺醯基苯并噻唑基或2-吡啶基二硫醇基。
  6. 如請求項4所述的分子構建體，其中該複合多肽為二聚體形式，各帶有一個與之耦接的功能性元件。
  7. 如請求項4所述的分子構建體，其中該功能性元件包含：一中心核，其中該中心核包含：2至10個離胺酸(K)殘基，一或多個填充物，其中任兩個所述K殘基是由該填充物隔開，且該填充物至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，以及該SH-反應性基，藉由與該第一個或最後一個K殘基形成醯胺鍵而連接至該中心核；以及2至10個標的元件、效應元件或藥動學元件，其中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件連接至該中心核的該K殘基，或當該分子構建體更包含2至10個連接臂，每一連接臂的一端透過與該中心核的K殘基之該ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件，其中該連接臂為包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽；或具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
  8. 如請求項4所述的分子構建體，其中該功能性元件包含：一中心核，其中該中心核包含：2至10個離胺酸(K)殘基，一或多個填充物，其中任兩個所述K殘基是由該填充物隔開，一末端間隔物，其中該末端間隔物為連接至該第一個K殘基之N-端的一N-端間隔物或連接至該最後一個K殘基之C-端的一C-端間隔物，且該填充物與該末端間隔物彼此獨立地至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，以及該SH-反應性基，藉由與該末端間隔物的末端胺基酸殘基形成醯胺鍵而連接至該中心核；以及2至10個標的元件、效應元件或藥動學元件，其中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件連接至該中心核的該K殘基，或當該分子構建體更包含2至10個連接臂，每一連接臂的一端透過與該中心核的K殘基之該ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件，其中該連接臂為包含2-12 個非K胺基酸殘基的一胜肽；或具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
  9. 如請求項4所述的分子構建體，其中該功能性元件包含：一中心核，其中該中心核包含：2至10個離胺酸(K)殘基，其中任兩個所述K殘基彼此相鄰，以及該SH-反應性基，藉由與該第一個或最後一個K殘基形成醯胺鍵而連接至該中心核；以及2至10個標的元件、效應元件或藥動學元件，其中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件連接至該中心核的該K殘基，或當該分子構建體更包含2至10個連接臂，每一連接臂的一端透過與該中心核的K殘基之該ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件，其中該連接臂為包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽；或具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
  10. 如請求項4所述的分子構建體，其中該功能性元件包含： 一中心核，其中該中心核包含：2至10個離胺酸(K)殘基，其中任兩個所述K殘基彼此相鄰，一末端間隔物，其中該末端間隔物為連接至該第一個K殘基之N-端的一N-端間隔物或連接至該最後一個K殘基之C-端的一C-端間隔物，且該末端間隔物至少包含：(1)1至12個非K胺基酸殘基，或(2)具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，以及該SH-反應性基，藉由與該末端間隔物的末端胺基酸殘基形成醯胺鍵而連接至該中心核；以及2至10個標的元件、效應元件或藥動學元件，其中，每一標的元件、效應元件或藥動學元件連接至該中心核的該K殘基，或當該分子構建體更包含2至10個連接臂，每一連接臂的一端透過與該中心核的K殘基之該ε-胺基形成醯胺鍵而連接至該中心核的K殘基，且每一連接臂的另一端連接至每一標的元件、效應元件或藥動學元件，其中該連接臂為包含2-12個非K胺基酸殘基的一胜肽；或具有2至24個EG重複單元的一聚乙二醇化胺基酸鏈。
  11. 如請求項7到10任一項所述的分子構建體，其中該中心核在與該SH-反應性基連接之該胺基酸殘基或其鄰近處帶有一局部負電荷。
  12. 如請求項11所述的分子構建體，其中該中心核在與該SH-反應性基連接之該胺基酸殘基或其鄰近處有至少一麩胺酸(E)殘基或天冬胺酸(D)殘基。
  13. 如請求項11所述的分子構建體，其中該局部負電荷出現在自與該SH-反應性基連接之該胺基酸殘基起的前5至15個胺基酸殘基處。
  14. 如請求項11所述的分子構建體，其中該效應元件為帶負電的化學實體。
  15. 如請求項11所述的分子構建體，其中該藥動學元件為一C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物，其中該K殘基的ε-胺基與該C8-28脂肪酸衍生物或C8-28二元脂肪酸衍生物連接。
TW109110106A 2019-03-25 2020-03-25 帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體 TWI739358B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962823626P 2019-03-25 2019-03-25
US62/823,626 2019-03-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW202102521A TW202102521A (zh) 2021-01-16
TWI739358B true TWI739358B (zh) 2021-09-11

Family

ID=72607264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109110106A TWI739358B (zh) 2019-03-25 2020-03-25 帶有金屬結合區的複合多肽及其分子構建體

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11203614B2 (zh)
EP (1) EP3947474A4 (zh)
JP (2) JP7395200B2 (zh)
CN (1) CN113784989A (zh)
AU (2) AU2020246504B2 (zh)
CA (1) CA3129882A1 (zh)
TW (1) TWI739358B (zh)
WO (1) WO2020192701A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108395482B (zh) 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
US20240043561A1 (en) * 2020-11-24 2024-02-08 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Humanized antibodies and fragments thereof binding to carbohydrate antigens and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018166529A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Chang Tse Wen Linker units and molecular constructs comprising same

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100293669A2 (en) * 1999-05-06 2010-11-18 Jingdong Liu Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US20040146516A1 (en) * 1999-06-17 2004-07-29 Utah Ventures Ii L.P. Lumen-exposed molecules and methods for targeted delivery
US20110131679A2 (en) * 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
US7320793B2 (en) * 2001-01-19 2008-01-22 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20040142325A1 (en) * 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
JP2006223188A (ja) * 2005-02-17 2006-08-31 Toyobo Co Ltd プロテインキナーゼ活性のプロファイリング方法
EP2381920A4 (en) * 2008-12-05 2013-04-17 Univ California METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING P.ACNES
US20100150958A1 (en) * 2008-12-15 2010-06-17 Vectogen Pty Ltd. Methods and Compositions for Use of a Coccidiosis Vaccine
CN102272304B (zh) * 2009-01-07 2013-10-23 三菱化学株式会社 切断固醇侧链的酶蛋白质及其应用
JP6067754B2 (ja) * 2012-02-24 2017-01-25 アルテオジェン インコーポレイテッドＡｌｔｅｏｇｅｎ Ｉｎｃ． システイン残基を含むモチーフが結合した修飾抗体、前記修飾抗体を含む修飾抗体−薬物複合体及びその製造方法
IN2014KN02769A (zh) * 2012-06-06 2015-05-08 Bionor Immuno As
KR20150122280A (ko) * 2014-04-22 2015-11-02 한림대학교 산학협력단 세포투과성 ｎｏｌ３ 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
CN107106683B (zh) * 2015-01-16 2021-07-20 中央研究院 含靶向与效应组件的分子构建体
WO2017176007A1 (ko) * 2016-04-06 2017-10-12 (주)알테오젠 변형항체를 포함하는 항체-약물 접합체
US20180055946A1 (en) * 2016-09-01 2018-03-01 Immunwork Inc. Versatile peptide-based multi-arm linkers for constructing pharmaceutical molecules
EP3592775A1 (en) * 2017-03-09 2020-01-15 CytomX Therapeutics, Inc. Cd147 antibodies, activatable cd147 antibodies, and methods of making and use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018166529A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Chang Tse Wen Linker units and molecular constructs comprising same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Carl Branden & John Tooze, "Introduction to Protein Structure", Garland, 1998, Second Edition. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022528318A (ja) 2022-06-10
CN113784989A (zh) 2021-12-10
WO2020192701A1 (en) 2020-10-01
AU2024201892A1 (en) 2024-04-11
AU2020246504B2 (en) 2024-02-15
TW202102521A (zh) 2021-01-16
AU2020246504A1 (en) 2021-09-30
US20220064215A1 (en) 2022-03-03
US11203614B2 (en) 2021-12-21
JP7395200B2 (ja) 2023-12-11
US11926678B2 (en) 2024-03-12
JP2024023357A (ja) 2024-02-21
US20200308223A1 (en) 2020-10-01
EP3947474A4 (en) 2023-07-05
EP3947474A1 (en) 2022-02-09
CA3129882A1 (en) 2020-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI632160B (zh) 具有標的部分及效應部分的分子構建體
TWI738987B (zh) 接合單元及包含接合單元之分子構建體
AU2024201892A1 (en) Composite polypeptide having a metal binding motif and molecular construct comprising the same
RU2814475C2 (ru) Составной полипептид, имеющий металлсвязывающий мотив, и содержащая их молекулярная конструкция