JP2014504299A - ポリペプチド−ポリヌクレオチド複合体、およびエフェクター成分の標的化された送達におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
本明細書においては、治療剤としてのポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を報告し、かつエフェクター成分の標的化された送達のためのツールとしてのその使用を報告する。複合体のポリヌクレオチド部分は、インビボでのタンパク質分解および酵素分解に対して本質的に耐性である。さらに、ポリペプチド部分は、化合物または組織もしくは器官などの構造に、つまりプロセスまたは疾患に応じて、特異的に結合する。したがって、本明細書において報告される1つの局面は、a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、ならびにc) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を含む、ポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体である。
Description
新規の治療剤およびインビボイメージング剤としてのポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体が本明細書において報告される。エフェクター成分の標的化された送達のためのツールとしての複合体の使用も報告される。複合体のポリヌクレオチド部分は、インビボでのタンパク質分解および酵素分解に対して本質的に耐性であり、同時に最大限の分子柔軟性を支持する。さらに、ポリペプチド部分は化合物または組織もしくは器官などの構造に特異的に結合する。
発明の背景
ここ数年間で、抗体、抗体断片、および細胞表面受容体に対するリガンドを含めて、多種多様の腫瘍特異的な標的指向性タンパク質が開発され、臨床的に試験されている。これらの標的指向性分子は、患者への特異的送達に向けた小分子薬、酵素、放射性同位体、タンパク質毒素、および他の毒素のような、いくつかのクラスの治療的毒素にコンジュゲートされてきた。これらの努力は、がんを処置するために意味のある進出をとげているが、より効果的な毒素を開発するためには、より強固かつ特異的な送達システムを作製するためには、ならびにヒトでの有害な免疫反応を回避する治療用タンパク質およびタンパク質ベクターを設計するためには、かなりの難関が立ちはだかっている。
ここ数年間で、抗体、抗体断片、および細胞表面受容体に対するリガンドを含めて、多種多様の腫瘍特異的な標的指向性タンパク質が開発され、臨床的に試験されている。これらの標的指向性分子は、患者への特異的送達に向けた小分子薬、酵素、放射性同位体、タンパク質毒素、および他の毒素のような、いくつかのクラスの治療的毒素にコンジュゲートされてきた。これらの努力は、がんを処置するために意味のある進出をとげているが、より効果的な毒素を開発するためには、より強固かつ特異的な送達システムを作製するためには、ならびにヒトでの有害な免疫反応を回避する治療用タンパク質およびタンパク質ベクターを設計するためには、かなりの難関が立ちはだかっている。
疾患の部位への効果的な送達は、任意の原薬の高い有効性および低い毒性のための必須条件である。一世紀以上前にEhrlichによって提唱されているように、抗体は、体内での薬物カーゴの輸送を促進し、それによって、しばしば引用される「魔法の弾丸」という概念を行使することによって、このような状況に加担しうることが明らかである。抗体への薬物のコンジュゲーションによって、ヒト体内の所望の部位での薬物の良好な局在化を達成することが可能になる。これは、この標的領域内での有効な薬物濃度を増大し、それによって、薬剤の治療効果を最適化する。さらに、標的化された送達により、臨床医は、治療剤の用量を低下させることができる可能性がある(これは、薬物ペイロードが毒性と関係している場合に、または慢性状態の処置において用いられる場合に、特に関連することである)(例えばMcCarron, P. A., et al., Mol. Interventions 5 (2005) 368-380を参照のこと)。
二重特異性抗体の作製が、例えば、WO 2004/081051に報告されている。広範囲の二重特異性抗体の型式が設計され、開発されている(例えばFischer, N. and Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14を参照のこと)。キレート組換え抗体(CRAb)がNeri, D.ら(Neri, D., et al., J. Mol. Biol. 246 (1995) 367-373)によって当初報告されている。Wright, M.J.およびDeonarain, M.P. (Molecular Immunology 44 (2007) 2860-2869)は、キレート組換え抗体の作製用のファージディスプレイライブラリーについて報告している。
理想的には、ペイロードと抗体とを接続するリンカーは、良好な血漿中安定性を示さなければならないが、しかし、腫瘍細胞内での酵素的または化学的分解(すなわち酸加水分解)に委ねられるはずである。多数の犠牲的(immolate)リンカー分子が文献に記述されており、市販されている(例えば、Amsberry, K.L. and Borchardt, R.T., J. Org. Chem. 55 (1990) 5867-5877; Dubowchik, G.M., et al., Tet. Lett. 38 (1997) 5261-5264; Rodrigues, M.L., et al., Chem. Biol. 2 (1995) 223-227; Shabat, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 6925-6930; Shabat, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001) 7528-7533を参照のこと。
さらに、内在化している腫瘍エピトープを標的とする抗体を活用して、化学療法薬および/または他の腫瘍調節剤の効果的かつ特異的な細胞内送達を達成することが可能とされている(例えばLiu, B., et al., Cancer Res. 64 (2004) 704-710; Nielsen, U.B., et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (2002) 109-118; Pirollo, K.F., et al., Hum. Gene Ther. 17 (2006) 117-124; Song, E., et al., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 709-717; Liu, B., et al., J. Mol. Biol. 315 (2002) 1063-1073を参照のこと)。
機能的に選択された内在化ヒト一本鎖抗体を用いた中皮腫細胞への標的化された薬物送達がFeng, A., et al., Mol. Cancer Ther. 7 (2008) 569-578によって報告されている。前立腺細胞がんに対する一本鎖Fv抗体ライブラリーの直接的な選択により腫瘍エピトープの空間をマッピングすることがLiu, B., et al., Cancer Res. 64 (2004) 704-710によって報告されている。Poul, M.A.らは、ファージライブラリーからの腫瘍特異的な内在化ヒト抗体の選択について報告している(J. Mol. Biol. 301 (2000) 1149-1161)。Nielsen, U.B.らは、細胞の飲食作用について選択されたファージ抗体により標的とされる抗ErbB2免疫リポソームの治療効果について報告している(Biochim. Biophys. Acta 1591 (2002) 109-118)。Heitner, T.らは、ファージディスプレイライブラリーからの細胞結合および内在化型の上皮成長因子受容体抗体の選択について報告している(J. Immunol. Meth. 248 (2001) 17-30)。
標的化された薬物送達のための分子媒体がBacker, M.V., et al., Bioconjugate Chem. 13 (2002) 462-467によって報告されている。WO 2010/118169は、制御された血清中薬物動態を有するヒトタンパク質足場について報告している。C末端エレメントを有するペプチドおよびタンパク質に関連した方法および組成物の関連出願の相互参照がWO 2009/105671において報告されている。WO 2007/038658においては、抗体-薬物コンジュゲートおよび使用の方法が報告されている。分子担体の標的化された生物学的送達のための組成物および方法がWO 2004/062602において報告されている。WO 2002/072141においては、標的化リガンドが報告されている。
WO 2009/037659においては、小さな実体の磁気的検出が報告されている。均質なアナライトの検出がWO 2006/137932において報告されている。US 2008/0044834においては、巨大分子および他のアナライトを検出するための3構成成分バイオセンサが報告されている。二重特異性試薬の設計および合成がWO 95/05399において報告されている。
エフェクター成分の標的化された送達のためには、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド構成成分を含む複合体がとりわけ有用であることが分かった。複合体のエフェクター成分、ポリペプチド構成成分およびポリヌクレオチド構成成分は、互いに非共有結合的に結合している。これにより、複合体の個々の構成成分のモジュール生成が可能になる。複合体のモジュール構造によって、複合体の他の構成成分を変化させる必要なしに個々の構成成分を変化させることができる。これにより、例えばライブラリーの提供のための、数多くの複合体変種の簡単かつ効率的なアセンブリが可能になる。
したがって、本明細書において報告される1つの局面は、
a) i) 第1の標的に特異的に結合する、および
ii) 第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第1のポリペプチド、
b) i) 第2の標的に特異的に結合する、および
ii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第2のポリペプチド、ならびに
c) i) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および
ii) 第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている
ポリヌクレオチドリンカー
を含む複合体である。
a) i) 第1の標的に特異的に結合する、および
ii) 第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第1のポリペプチド、
b) i) 第2の標的に特異的に結合する、および
ii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第2のポリペプチド、ならびに
c) i) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および
ii) 第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている
ポリヌクレオチドリンカー
を含む複合体である。
本明細書において報告される別の局面は、上記の複合体の生成中の中間体である複合体である。この複合体は
a) i) 標的に特異的に結合する、および
ii) 結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
ポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を含む。
a) i) 標的に特異的に結合する、および
ii) 結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
ポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を含む。
以下は、本明細書において報告される全ての局面の態様である。
1つの態様において、複合体は非共有結合複合体である。
1つの態様において、複合体は、ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含む。
1つの態様において、複合体は、
i) 第2の標的に特異的に結合する、およびii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているさらなるポリペプチド
をさらに含み、ポリヌクレオチドリンカーは第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている。
i) 第2の標的に特異的に結合する、およびii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているさらなるポリペプチド
をさらに含み、ポリヌクレオチドリンカーは第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている。
1つの態様において、複合体は、
i) 第1のエフェクター成分とコンジュゲートしているポリヌクレオチドの少なくとも一部と相補的であり、かつii) ポリヌクレオチドリンカーと相補的ではないポリヌクレオチド
とコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含む。
i) 第1のエフェクター成分とコンジュゲートしているポリヌクレオチドの少なくとも一部と相補的であり、かつii) ポリヌクレオチドリンカーと相補的ではないポリヌクレオチド
とコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含む。
1つの態様において、第1の標的および/または第2の標的は、細胞表面タンパク質である。
1つの態様において、ポリペプチドは一価結合ポリペプチドである。1つの態様において、一価結合ポリペプチドは抗体または抗体断片である。
1つの態様において、第1および第2のポリペプチドは、同じ標的に結合し、かつその標的上の重複しないエピトープに結合する。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは8〜1000ヌクレオチドから構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは10〜500ヌクレオチドから構成される。
1つの態様において、結合対のメンバーは、ロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイジング核酸配列からなる群より選択される。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは鏡像異性DNAである。1つの態様において、鏡像異性DNAはL-DNAである。1つの態様において、L-DNAは一本鎖L-DNA (ss-L-DNA)である。
1つの態様において、エフェクター成分は、結合成分、標識成分、および生物学的に活性な成分からなる群より選択される。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは自身の第1または第2の末端で結合対のメンバーとコンジュゲートしている。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは2つの結合対の2つの第2のメンバーとコンジュゲートしており、それによって、第1の結合対の第2のメンバーがポリヌクレオチドリンカーの第1の末端とコンジュゲートし、かつ第2の結合対の第2のメンバーがポリヌクレオチドリンカーの第2の末端とコンジュゲートしている。
本明細書において報告される1つの局面は、第1のポリペプチドが抗HER2抗体2C4のFAB'断片であり、第2のポリペプチドが抗HER2抗体4D5のFAB'断片であり、結合対のメンバーが各々、ハイブリダイジング核酸であり、かつポリヌクレオチドリンカーが60〜100個のL-DNAヌクレオチドを含む、本明細書において報告される複合体である。
1つの態様において、抗HER2抗体2C4のFAB'断片は、(a) SEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、(b) SEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、(c) SEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含み、かつ抗HER2抗体4D5のFAB'断片は、(a) SEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を含むHVR-H1と、(b) SEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を含むHVR-H2と、(c) SEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を含むHVR-H3とを含む。
1つの態様において、第1の結合対の第1および第2のメンバーは、それぞれ、SEQ ID NO: 05およびSEQ ID NO: 08の核酸配列を含む。
1つの態様において、第2の結合対の第1および第2のメンバーは、それぞれ、SEQ ID NO: 06およびSEQ ID NO: 07の核酸配列を含む。
1つの態様において、抗HER2抗体2C4のFAB'断片は、(a) SEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、(b) SEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、(c) SEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含み、かつ抗HER2抗体4D5のFAB'断片は、(a) SEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を含むHVR-L1と、(b) SEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を含むHVR-L2と、(c) SEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を含むHVR-L3とを含む。
1つの態様において、抗HER2抗体4D5のFAB'断片は、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
1つの態様において、抗HER2抗体2C4のFAB'断片は、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび/またはSEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む。
1つの態様において、複合体の第1および/または第2のポリペプチドは、互いに独立して、ヒトIgG1クラスの、またはヒトIgG2クラスの、またはヒトIgG3クラスの、またはヒトIgG4クラスのCH1ドメインの1つまたは複数、およびヒトκクラスの、またはヒトλクラスの軽鎖定常ドメインをさらに含む。
本明細書において報告される別の局面は、以下の構成成分
a) i) 第1の標的に特異的に結合する、および
ii) 第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第1のポリペプチド、
b) i) 第2の標的に特異的に結合する、および
ii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第2のポリペプチド、ならびに
c) i) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および
ii) 第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている
ポリヌクレオチドリンカー
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチドを合成する段階、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチドを合成する段階、
c) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびに
d) 合成された構成成分を組み合わせることによって複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
a) i) 第1の標的に特異的に結合する、および
ii) 第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第1のポリペプチド、
b) i) 第2の標的に特異的に結合する、および
ii) 第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
第2のポリペプチド、ならびに
c) i) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および
ii) 第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている
ポリヌクレオチドリンカー
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチドを合成する段階、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチドを合成する段階、
c) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびに
d) 合成された構成成分を組み合わせることによって複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
同様に、本明細書において報告される1つの局面は、以下の構成成分
a) i) 標的に特異的に結合する、および
ii) 結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
ポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、ならびに
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドを合成する段階、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を合成する段階、ならびに
d) 合成された構成成分を組み合わせることによって複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
a) i) 標的に特異的に結合する、および
ii) 結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている
ポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、ならびに
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドを合成する段階、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分を合成する段階、ならびに
d) 合成された構成成分を組み合わせることによって複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
本明細書において報告される別の局面は、本明細書において報告される複合体と、任意で薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤である。
本明細書において報告されるさらなる局面は、医薬として用いるための本明細書において報告される複合体である。
同様に、本明細書において報告される1つの局面は、がんの処置において用いるための本明細書において報告される複合体である。
本明細書において報告されるさらなる局面は、HER2陽性がん細胞の増殖の阻害において用いるための本明細書において報告される複合体である。
本明細書において報告される別の局面は、本明細書において報告される複合体の、医薬の製造における使用である。
1つの態様において、医薬はがんの処置用である。1つの態様において、医薬はHER2陽性がん細胞の増殖の阻害用である。
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法である。
本明細書において報告される1つの局面は、HER2陽性がん細胞の増殖を阻害するために、本明細書において報告される複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるHER2陽性がん細胞の増殖を阻害するための方法である。
本明細書において報告される1つの局面は、ヒトErbB2に結合し、かつErbB受容体のリガンド活性化をブロックする少なくとも1つの抗体断片を含む複合体、および該複合体と薬学的に許容される担体とを含む組成物、および細胞毒性剤をさらに含む本明細書において報告される複合体である。
ErbB2に結合する抗体または抗体断片を含む本明細書において報告される複合体の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんを処置する方法であって、該がんがErbB2受容体の過剰発現によって特徴付けられる、前記方法が本明細書において報告される。
同様に、ErbB2に結合し、かつErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体または抗体断片を含む本明細書において報告される複合体の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんを処置する方法であって、該がんがErbB2受容体の過剰発現によって特徴付けられない、前記方法が本明細書において報告される。
さらに、ErbB2に結合し、かつErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体または抗体断片を含む本明細書において報告される複合体の治療的有効量をヒトに投与する段階を含む、ヒトにおけるホルモン非依存性のがんを処置する方法が本明細書において報告される。
(a) ErbB2に結合し、かつErbB2を過剰発現するがん細胞の増殖を阻害する抗体または抗体断片を含む第1の複合体、および(b) ErbB2に結合し、かつErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体または抗体断片を含む第2の複合体の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんを処置する方法が本明細書においてさらに報告される。
同様に、ErbB2に結合し、かつErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体または抗体断片を含む本明細書において報告される複合体の治療的有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんを処置する方法であって、該がんが、結腸がん、直腸がん、および結腸直腸がんからなる群より選択される、前記方法が本明細書において報告される。
発明の詳細な説明
一般式
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
の複合体が本明細書において報告され、
式中、AおよびBは各々、標的に特異的に結合するポリペプチドを表し、ここでAはBの結合に干渉せず、
式中、a' : aおよびb : b'は各々、第1のメンバー(それぞれ、aおよびb)および第2のメンバー(それぞれ、a'およびb')からなる結合対を表し、ここでa'およびaは、bとb'の結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、
式中、Sは長さが少なくとも1 nmのポリヌクレオチドリンカーであり、
式中、Xは、a'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合しているエフェクター成分を示し、
式中、nは、複合体中のエフェクター成分の数を示す整数であり、
式中、- は共有結合を表し、
式中、: は非共有結合を表し、かつ
式中、a - S - bは6 nm〜100 nmの長さを有する。
一般式
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
の複合体が本明細書において報告され、
式中、AおよびBは各々、標的に特異的に結合するポリペプチドを表し、ここでAはBの結合に干渉せず、
式中、a' : aおよびb : b'は各々、第1のメンバー(それぞれ、aおよびb)および第2のメンバー(それぞれ、a'およびb')からなる結合対を表し、ここでa'およびaは、bとb'の結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、
式中、Sは長さが少なくとも1 nmのポリヌクレオチドリンカーであり、
式中、Xは、a'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合しているエフェクター成分を示し、
式中、nは、複合体中のエフェクター成分の数を示す整数であり、
式中、- は共有結合を表し、
式中、: は非共有結合を表し、かつ
式中、a - S - bは6 nm〜100 nmの長さを有する。
本明細書において用いられる用語および表現
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、該冠詞の文法的対象の1つをまたは2つ以上を(すなわち、少なくとも1つを)いうように本明細書において用いられる。例として、「1つの抗体(an antibody)」は1種の抗体または2種以上の抗体を意味する。
「1つの(a)」および「1つの(an)」という冠詞は、該冠詞の文法的対象の1つをまたは2つ以上を(すなわち、少なくとも1つを)いうように本明細書において用いられる。例として、「1つの抗体(an antibody)」は1種の抗体または2種以上の抗体を意味する。
「アクセプタヒトフレームワーク」は、以下に定義される、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワークまたは重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプタヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含んでもよく、またはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変化の数は10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、4個もしくはそれ未満、3個もしくはそれ未満、または2個もしくはそれ未満である。いくつかの態様において、VLアクセプタヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「親和性」という用語は、分子(例えばポリペプチドまたは抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば標的または抗原)との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を意味する。別段の指示がない限り、本明細書において用いられる場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー間の(例えばポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体中の、またはポリペプチドとその標的との間の、または抗体とその抗原との間の) 1 : 1の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。分子XのそのパートナーYに対する親和性は一般に、解離定数(kD)によって表すことができる。親和性は、表面プラズモン共鳴のような、および同様に本明細書において報告されるものを含めた、当技術分野において公知の共通の方法によって測定することができる。
「親和性成熟」抗体は、1つまたは複数の超可変領域(HVR)における1つまたは複数の改変であって、そのような改変を保有していない親抗体と比べて、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらすそのような改変を有する抗体をいう。
「ケージ化」という用語は、血清および体液中で制御された半減期を有する保護基によってエフェクターが保護されることを意味する。保護基は内因性酵素によって酵素的に切断することができる。保護基は、アスコルビン酸のような、注入によって外部から投与されまたは経口的に与えられる第2のエフェクターによって除去され、切断され、分解され、酵素的に消化されまたは代謝されうる。ケージ化エフェクター分子は、体液中で天然に存在している酵素によって活性化されうる。ケージ化エフェクター分子は、アスコルビン酸のような、体液中に同様に存在している還元剤によって活性化されうる。
「エフェクター成分」という用語は、活性が細胞(内)に送達されおよび/または細胞に局在することが望まれる任意の分子または分子の組み合わせを意味する。エフェクター成分は、標識、細胞毒素(例えば緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など)、酵素、成長因子、転写因子、薬物、放射性核種、リガンド、抗体、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどを含むが、これらに限定されることはない。
「HER2」という用語は、別段の指示がない限り、霊長類(例えばヒト)およびげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)のような哺乳類を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然HER2 (ErbB2またはp185neu)をいう。この用語は、「全長」の、プロセッシングされていないHER2、および細胞中でのプロセッシングから生じる任意のHER2形態を包含する。この用語はまた、天然に存在するHER2バリアント、例えば、スプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントを包含する。ヒトHER2タンパク質は、例えば、Semba, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 6497-6501およびYamamoto, T., et al., Nature 319 (1986) 230-234ならびにGenBankアクセッション番号X03363に報告されている。例示的なHER2のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 20に示されている。
「抗HER2抗体」および「HER2に結合する抗体」という用語は、HER2を標的とするうえでの診断剤および/または治療剤として有用であるような十分な親和性でHER2 (ErbB2またはp185neu)と結合することができる抗体をいう。1つの態様において、関係のない非HER2タンパク質との抗HER2抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ(RIA)法によって測定した場合にHER2と抗体との結合の約10%未満である。特定の態様において、HER2に結合する抗体は、10-8 Mまたはそれ未満の(1つの態様において10-8 M〜10-13 Mの、1つの態様において10-9 M〜10-13 Mの)解離定数(kD)を有する。
Hudziak, R.M.ら(Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172)は、ヒト乳房腫瘍細胞株SK-BR-3を用いて特徴付けられた抗HER2抗体のパネルの作製について記述している。この抗体への曝露後のSK-BR-3細胞の相対的な細胞増殖が、72時間後の単層のクリスタルバイオレット染色によって判定された。このアッセイ法を用いて、細胞増殖を56%阻害した4D5と呼ばれる抗体により最大阻害が得られた。パネルにおける他の抗体は、このアッセイ法においてそれほどではないにせよ細胞増殖を低減した。抗体4D5は、TNF-αの細胞傷害効果に対する、HER2を過剰発現している乳房腫瘍細胞株の感受性を増加させることがさらに分かった(同様にUS 5,677,171を参照のこと)。Hudziak, R.M.らに論じられている抗HER2抗体は、Fendly, B.M.ら(Cancer Research 50 (1990) 1550-1558)、Kotts, C.E.ら(In Vitro 26 (1990) 59A)、Sarup, J.C.ら(Growth Reg. 1 (1991) 72-82)、Shepard, H.M.ら(J. Clin. Immunol. 11 (1991) 117-127)、Kumar, R.ら(Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 979-986)、Lewis, G.D.ら(Cancer Immunol. Immunother. 37 (1993) 255-263)、Pietras, R.J.ら(Oncogene 9 (1994) 1829-1838)、Vitetta, E.S.ら(Cancer Res. 54 (1994) 5301-5309)、Sliwkowski, M.X.ら(J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665)、Scott, G.K.ら(J. Biol. Chem. 266 (1991) 14300-14305)、D'souza, B.ら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 7202-7206)、Lewis, G.D.ら(Cancer Res. 56 (1996) 1457-1465)、およびSchaefer, G.ら(Oncogene 15 (1997) 1385-1394)においてさらに特徴付けられている。
マウス抗HER2抗体4D5の組換えヒト化型(huMAb4D5-8、rhuMab HER2、トラスツズマブまたはHERCEPTIN(登録商標)、US 5,821,337参照)は、広範な事前の抗がん療法を受けたHER2過剰発現性の転移性乳がんを有する患者において臨床的に有効である(Baselga, J., et al., J. Clin. Oncol. 14 (1996) 737-744)。ヒト化抗HER2抗体には、参照により本明細書に明示的に組み入れられるUS 5,821,337の表3に記述のhuMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7およびhuMAb4D5-8 (HERCEPTIN(登録商標)); 参照により本明細書に明示的に組み入れられる、WO 93/21319に記述のヒト化520C9およびWO 01/000245に記述のヒト化2C4抗体が含まれる。
抗HER2抗体4D5は、SEQ ID NO: 26のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVH-CDR1はSEQ ID NO: 27のアミノ酸配列を有し、VH-CDR2はSEQ ID NO: 28のアミノ酸配列を有し、かつVH-CDR3はSEQ ID NO: 29のアミノ酸配列を有する。抗HER2抗体4D5は、SEQ ID NO: 30のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVL-CDR1はSEQ ID NO: 31のアミノ酸配列を有し、VL-CDR2はSEQ ID NO: 32のアミノ酸配列を有し、かつVL-CDR3はSEQ ID NO: 33のアミノ酸配列を有する。
さまざまな特性を有する他の抗HER2抗体がTagliabue, E.ら(Int. J. Cancer 47 (1991) 933-937)、McKenzie, S.J.ら(Oncogene 4 (1989) 543-548)、Maier, L.A.ら(Cancer Res. 51 (1991) 5361-5369)、Bacus, S.S.ら(Mol. Carcinogen. 3 (1990) 350-362)、Stancovskiら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 8691-8695)、Bacus, S.S.ら(Cancer Res. 52 (1992) 2580-2589)、Xu, F.ら(Int. J. Cancer 53 (1993) 401-408、WO 94/00136、Kasprzyk, P.G.ら(Cancer Res. 52 (1992) 2771-2776)、Handcock, M.C.ら(Cancer Res. 51 (1991) 4575-4580)、Shawver, L.K.ら(Cancer Res. 54 (1994) 1367-1373)、Arteaga, C.L.ら(Cancer Res. 54 (1994) 3758-3765)、Harwerth, I.M.ら(J. Biol. Chem. 267 (1992) 15160-15167)、US 5,783,186、およびKlapper, L.N.ら(Oncogene 14 (1997) 2099-2109)に記述されている。
相同性スクリーニングの結果、2つの他のHERファミリーのメンバーであるHER3 (US 5,183,884、US 5,480,968、Kraus, M.H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 9193-9197)およびHER4 (EP 0 599 274、Plowman, G.D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 1746-1750、Plowman, G.D., et al., Nature 366 (1993) 473-475)が特定された。これらの受容体の両方が、少なくとも一部の乳がん細胞株において発現の増大を見せる。HER受容体は一般に、細胞においてさまざまな組み合わせで見出され、ヘテロ二量体化が種々のHERリガンドに対する細胞反応の多様性を高めるものと考えられる(Earp, H.S., et al., Breast Cancer Res. Treat. 35 (1995) 115-132)。
上皮成長因子受容体(EGFR)は、6種の異なるリガンドである、上皮成長因子(EGF)、形質転換成長因子α(TGF-α)、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子(HB-EGF)、β-セルリン、およびエピレグリンによって結合される(Groenen, L.C., et al., Growth Factors 11 (1994) 235-257)。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーは、HER3およびHER4に対するリガンドである。ヘレグリンファミリーには、α、βおよびγヘレグリン(Holmes, W.E., et al., Science 256 (1992) 1205-1210、US 5,641,869、Schaefer, G., et al., Oncogene 15 (1997) 1385-1394)、neu分化因子(NDF)、グリア成長因子(GGF)、アセチルコリン受容体誘導因子(acetylcholine receptor inducing activity)(ARIA)、ならびに感覚運動神経由来因子(SMDF)が含まれる(Groenen, L.C., et al., Growth Factors 11 (1994) 235-257、Lemke, G, Mol. Cell. Neurosci. 7 (1996) 247-262、Lee, D.C., et al., Pharm. Rev. 47 (1995) 51-85を参照のこと)。最近になって、3種のさらなるHERリガンドである、HER3またはHER4のいずれかと結合するとされているニューレグリン-2 (NRG-2) (Chang, H., et al., Nature 387 (1997) 509-512、Carraway, K.L., et al., Nature 387 (1997) 512-516)、HER4と結合するニューレグリン-3 (Zhang, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 9562-9567)、およびHER4と結合するニューレグリン-4 (Harari, D., et al., Oncogene 18 (1999) 2681-2689)が特定された。HB-EGF、β-セルリン、およびエピレグリンもHER4に結合する。
EGFおよびTGFαはHER2と結合しないが、EGFはEGFRを刺激して、HER2とヘテロ二量体を形成し、これによってヘテロ二量体においてEGFRによるHER2のトランスリン酸化およびその逆も引き起こされる(Earp, H.S., et al., 前記を参照のこと)。同様に、HER3がHER2と共発現される場合、活性なシグナル伝達複合体が形成されるが、HER2に対する抗体は、この複合体を破壊することができる(Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665)。さらに、ヘレグリン(HRG)に対するHER3の親和性は、HER2と共発現される場合に、いっそう高い親和性状態に増大される(HER2-HER3タンパク質複合体に関しては、同様に、Levi, A.D., et al., J. Neurosci. 15 (1995) 1329-1340、Morrissey, T.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 1431-1435、Lewis, G.D., et al., Cancer Res. 56 (1996) 1457-1465を参照のこと)。HER4は、HER3のように、HER2と活性なシグナル伝達複合体を形成する(Carraway, K.L. and Cantley, L.C., Cell 78 (1994) 5-8)。
HER抗体に関連する特許公報は、
を含む。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体は、HER二量体化阻害剤であり、EGFR、またはHER3、またはHER4とHER2とのヘテロ二量体化を阻害する。1つの態様において、複合体は、HER二量体化阻害剤であり、抗HER2抗体4D5および/または抗HER2抗体2C4の断片を含む。本明細書において抗体2C4および特にそのヒト化変種(WO 01/00245参照; ATCC HB-12697の下でアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection), Manassass, VA, USAに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生される)は、HER2の細胞外ドメイン中の領域(例えば、HER2のおよそ残基番号22からおよそ残基番号584まで(残基番号22および584を含めて)の領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基)に結合する、抗体である。ヒト化2C4抗体の例は、WO 01/00245 (その全体が参照により本明細書に組み入れられる)の実施例3に提供されている。ヒト化抗HER2抗体2C4はペルツズマブとも呼ばれる。
ペルツズマブ(以前は2C4)は、HER二量体化阻害剤(HDI)として公知の新しいクラスの薬剤の最初のものである。ペルツズマブはその二量体化ドメインでHER2に結合し、それによって、活性な二量体受容体複合体を形成するその能力を阻害し、かくして細胞増殖および分裂を最終的には引き起こす下流のシグナルカスケードをブロックする(Franklin, M.C., Cancer Cell 5 (2004) 317-328を参照のこと)。ペルツズマブは、HER2の細胞外ドメインに対する完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ヒト上皮細胞上のHER2へのペルツズマブの結合によって、HER2がHERファミリーの他のメンバー(EGFR、HER3、HER4を含む)と複合体を形成することが、おそらくはHER2ホモ二量体化も、阻止される。複合体形成をブロックすることにより、ペルツズマブはHER1、HER3およびHER4のリガンド(例えばEGF、TGFα、アンフィレグリン、およびヘレグリン)により活性化された増殖刺激作用および細胞生存シグナルを阻止する。ペルツズマブはヒトIgG1(K)フレームワーク配列に基づいた完全ヒト化組換えモノクローナル抗体である。ペルツズマブの構造は2本の重鎖(449残基)および2本の軽鎖(214残基)からなる。トラスツズマブ(Herceptin(登録商標))と比べて、ペルツズマブは軽鎖において12アミノ酸の相違、およびIgG1重鎖において29アミノ酸の相違を有する。
抗HER2抗体2C4は、SEQ ID NO: 34のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVH-CDR1はSEQ ID NO: 35のアミノ酸配列を有し、VH-CDR2はSEQ ID NO: 36のアミノ酸配列を有し、かつVH-CDR3はSEQ ID NO: 37のアミノ酸配列を有する。抗HER2抗体2C4は、SEQ ID NO: 38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含み、これは次に、Kabatにしたがって決定される3つのCDRを含み、ここでVL-CDR1はSEQ ID NO: 39のアミノ酸配列を有し、VL-CDR2はSEQ ID NO: 40のアミノ酸配列を有し、かつVL-CDR3はSEQ ID NO: 41のアミノ酸配列を有する。
トラスツズマブは、腫瘍がHER2を過剰発現する、またはHER2遺伝子増幅を有する転移性乳がんを有する患者の処置のために
- その転移性疾患に対する少なくとも2つの化学療法レジメンを受けた患者の処置のための単剤療法として; 以前の化学療法は、少なくともアントラサイクリンおよびタキサンを含んでいたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くが; ホルモン受容体陽性の患者はまた、ホルモン療法を受けたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くが、
- その転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けて、およびアントラサイクリンが適していない者に向けてパクリタキセルとの組み合わせで、ならびに
- その転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けてドセタキセルとの組み合わせで
適応される。
- その転移性疾患に対する少なくとも2つの化学療法レジメンを受けた患者の処置のための単剤療法として; 以前の化学療法は、少なくともアントラサイクリンおよびタキサンを含んでいたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くが; ホルモン受容体陽性の患者はまた、ホルモン療法を受けたに違いない、ただし患者がこれらの処置に適さない場合を除くが、
- その転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けて、およびアントラサイクリンが適していない者に向けてパクリタキセルとの組み合わせで、ならびに
- その転移性疾患に対する化学療法を受けていない患者の処置に向けてドセタキセルとの組み合わせで
適応される。
当技術分野において、Herceptin/トラスツズマブによる乳がん患者の処置は、例えば、HER2陽性疾患を有する患者に対して推奨され慣用されている。HER2陽性疾患は、免疫組織化学法によって検出される高いHER2 (タンパク質)発現レベル(例えばHER2 (+++))もしくはHER2遺伝子増幅(例えば腫瘍細胞あたりHER2遺伝子が4コピーより高いHER2遺伝子コピー数)またはその両方が、乳房組織生検もしくは乳房組織の切除などの、患者から得られるサンプルにおいて、または転移部位に由来する組織において見出されるなら、存在する。
「エピトープ2C4」は、抗HER2抗体2C4が結合するErbB2の細胞外ドメイン中の領域である。2C4エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記述されているものなどの、慣用的な交差ブロッキングアッセイ法を行うことができる。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がErbB2の2C4エピトープ(例えば、ErbB2のおよそ残基番号22からおよそ残基番号584まで(残基番号22および584を含めて)の領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基)に結合するかどうかを評価することもできる。
「エピトープ4D5」は、抗HER2抗体4D5 (ATCC CRL 10463)が結合するErbB2の細胞外ドメイン中の領域である。このエピトープはErbB2の膜貫通ドメインに近接している。4D5エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記述されているものなどの、慣用的な交差ブロッキングアッセイ法を行うことができる。あるいは、エピトープマッピングを行って、抗体がErbB2の4D5エピトープ(例えば、およそ残基番号529からおよそ残基番号625まで(残基番号529および625を含めて)の領域におけるいずれか1つまたはそれ以上の残基)に結合するかどうかを評価することもできる。
ErbB受容体のリガンド活性化を「ブロックする」抗体は、そのような活性化を低減または阻止するものであり、ここで該抗体はモノクローナル抗体4D5よりもかなり効果的に、例えば、モノクローナル抗体7F3もしくは2C4またはそのFAB断片とほぼ同じくらい効果的に、およびとりわけ、モノクローナル抗体2C4またはそのFAB断片とほぼ同じくらい効果的にErbB受容体のリガンド活性化をブロックすることができる。例えば、ErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体は、ErbBヘテロオリゴマーの形成のブロッキングで4D5よりも約50〜100%効果的であるものでありうる。ErbB受容体のリガンド活性化のブロッキングは任意の手段によって、例えば、ErbB受容体へのリガンドの結合に干渉する、ErbB複合体形成に干渉する、ErbB複合体におけるErbB受容体のチロシンキナーゼ活性に干渉する、および/またはErbB受容体におけるもしくはErbB受容体によるチロシンキナーゼ残基のリン酸化に干渉することによって、行うことができる。ErbB受容体のリガンド活性化をブロックする抗体の例としては、モノクローナル抗体2C4および7F3 (これらはHRGによるErbB2/ErbB3およびErbB2/ErbB4ヘテロオリゴマーの活性化、ならびにEGF、TGF-α、アンフィレグリン、HB-EGFおよび/またはエピレグリンによるEGFR/ErbB2ヘテロオリゴマーの活性化をブロックする)、ならびにL26、L96およびL288抗体(Klapper, L.N., et al., Oncogene 14 (1997) 2099-2109)(これらは、EGFR、ErbB2、ErbB3およびErbB4を発現するT47D細胞へのEGFおよびNDFの結合をブロックする)が挙げられる。
「ErbBヘテロオリゴマー」は、少なくとも2種の異なるErbB受容体を含む非共有結合したオリゴマーを意味する。そのような複合体は、2種またはそれ以上のErbB受容体を発現している細胞がErbBリガンドに曝露される場合に生じ得、例えば、Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665に記述されているように免疫沈降により単離され、SDS-PAGEにより分析されうる。そのようなErbBヘテロオリゴマーの例としては、EGFR-ErbB2、ErbB2-ErbB3およびErbB3-ErbB4複合体が挙げられる。さらに、ErbBヘテロオリゴマーはErbB3、ErbB4またはEGFRのような、異なるErbB受容体と組み合わせた、2つまたはそれ以上のErbB2受容体を含みうる。サイトカイン受容体サブユニット(例えばgp130)のような、他のタンパク質がヘテロオリゴマーに含まれることもある。
「ErbB受容体のリガンド活性化」とは、関心対象のErbB受容体を含むErbBヘテロオリゴマーへのErbBリガンドの結合によって媒介されるシグナル伝達(例えば、ErbB受容体または基質ポリペプチドにおけるチロシン残基をリン酸化するErbB受容体の細胞内キナーゼドメインによって引き起こされる)を意味する。一般的に、これにはErbBヘテロオリゴマーへのErbBリガンドの結合が含まれ、これによってヘテロオリゴマーにおけるErbB受容体の1つまたは複数のキナーゼドメインが活性化され、その結果、ErbB受容体の1つもしくは複数におけるチロシン残基のリン酸化、および/またはさらなる基質ポリペプチドにおけるチロシン残基のリン酸化が引き起こされる。ErbB受容体活性化は、さまざまなチロシンリン酸化アッセイ法を用いて定量することができる。
本明細書において「抗体」という用語は、その最も広い意味で用いられ、所望とされる抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体および抗体断片を含むがこれらに限定されない、さまざまな抗体構造を包含する。
「抗体断片」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する完全抗体または全長抗体の断片を意味する。抗体断片の例としてはFv、FAB、FAB'、FAB'-SH、F(ab')2; ダイアボディ; 直鎖状抗体; 一本鎖抗体分子(例えばscFv)が挙げられるが、これらに限定されることはない。特定の抗体断片の概説については、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。さらに詳細には、「抗体断片」という用語のなかに包含されるのは、(i) FAB断片、すなわち、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価抗体断片(エピトープ残基と結合しかつ増大したインビボ半減期を有するサルベージ受容体を含んだFABおよびF(ab')2断片の考察については、US 5,869,046を参照のこと)、(ii) F(ab')2断片、すなわち、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された2つのFAB断片を含む二価断片、(iii) VHおよびCH1ドメインからなるFd断片、(iv) 抗体の単腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片(例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), (Springer-Verlag, New York), (1994) pp. 269-315、WO 93/16185、US 5,571,894、US 5,587,458を参照のこと)、(v) VHドメインからなるdAb断片(例えばWard, E.S., et al., Nature 341 (1989) 544-546を参照のこと)、ならびに(vi) 単離された相補性決定領域(CDR)である。さらに、Fv断片の2つのドメインVLおよびVHは別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、組換え法を用い、VLおよびVH領域が対合して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、つなぎ合わせることができる(一本鎖Fv (scFv)として公知、例えば、Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; Huston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883を参照のこと)。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を用いて得ることができ、インタクトな抗体と同じようにその結合特性についてスクリーニングすることができる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイ法において、50%またはそれ以上で、参照抗体とその抗原との結合をブロックする抗体をいい、逆に、参照抗体は、競合アッセイ法において、50%またはそれ以上で、上記抗体とその抗原との結合をブロックする。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が、特定の供給源または種に由来するが、重鎖および/または軽鎖の残部が、異なる供給源または種に由来する抗体をいう。
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプをいう。5つの主要なクラスの抗体である、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMが存在しており、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分類されうる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。
「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド(CYTOXAN(商標)); スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン; アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ; アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチルアミルアミン; ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード; ニトロ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン; 抗生物質、例えばアクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン; 代謝拮抗剤、例えばメトトレキサートおよび5-フルオロウラシル(5-FU); 葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキサート; プリン類似体、例えばフルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン; ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU; アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン; 抗副腎剤(anti-adrenal)、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン; 葉酸補充薬、例えばフロリン酸(frolinic acid); アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトラキサート; デフォファミン(defofamine); デメコルシン; ジアジコン; エルフォルニチン(elfornithine); エリプチニウムアセテート; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシウレア; レンチナン; ロニダミン; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダモール; ニトラクリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ポドフィリン酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; PSK(登録商標); ラゾキサン; シゾフィラン; スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジコン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン; ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポブロマン; ガシトシン(gacytosine); アラビノシド(「Ara-C」); シクロホスファミド; チオテパ; タキサン、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)およびドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France); クロラムブシル; ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキサート; 白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン; ビンブラスチン; 白金; エトポシド(VP-16); イホスファミド; マイトマイシンC; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ビノレルビン; ナベルビン; ノバントロン; テニポシド; ダウノマイシン; アミノプテリン; ゼローダ(xeloda); イバンドロネート(ibandronate); CPT-II; 35トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸; エスペラマイシン; カペシタビン; ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。また、この定義に含まれるのは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストンおよびトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン; ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン; ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの、腫瘍に及ぼすホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤である。
「抗血管新生剤」は、血管の発生をある程度までブロックする、または妨害する化合物をいう。抗血管新生剤は、例えば、血管新生の促進に関わる成長因子または成長因子受容体に結合する小分子または抗体でありうる。抗血管新生因子は1つの態様において、血管内皮成長因子(VEGF)に結合する抗体である。
「サイトカイン」という用語は、ある細胞集団によって放出され、細胞間メディエータとして別の細胞に作用するタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカインおよび従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインのなかに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン; 副甲状腺ホルモン; チロキシン; インスリン; プロインスリン; リラキシン; プロリラキシン; 糖タンパク質ホルモン、例えば卵胞刺激ホルモン(FSH)、甲状腺刺激ホルモン(TSH)および黄体形成ホルモン(LH); 肝成長因子; 線維芽細胞成長因子; プロラクチン; 胎盤ラクトゲン; 腫瘍壊死因子-aおよび腫瘍壊死因子-P; ミュラー阻害物質; マウスゴナドトロピン関連ペプチド; インヒビン; アクチビン; 血管内皮成長因子; インテグリン; トロンボポエチン(TPO); 神経成長因子、例えばNGF-p; 血小板成長因子; 形質転換成長因子(TGF)、例えばTGF-aおよびTGF-p; インスリン様成長因子-Iおよびインスリン様成長因子-II; エリスロポエチン(EPO); 骨誘導因子; インターフェロン、例えばインターフェロン-a、インターフェロン-Pおよびインターフェロン-y; コロニー刺激因子(CSF)、例えばマクロファージ-CSF (M-CSF); 顆粒球-マクロファージ-CSF (GM-CSF); および顆粒球-CSF (GCSF); インターロイキン(IL)、例えばIL-I、IL-la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-II、IL-12; 腫瘍壊死因子、例えばTNF-αまたはTNF-P; ならびにLIFおよびkitリガンド(KL)を含む他のポリペプチド因子である。本明細書において用いられる場合、サイトカインという用語は、天然供給源由来のタンパク質または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な同等物を含む。
「fMLP」という用語は、N-ホルミルメチオニン、ロイシンおよびフェニルアラニンからなるトリペプチドを意味する。1つの態様において、エフェクター成分はfMLPまたはその誘導体である。
「プロドラッグ」という用語は、親薬物と比べて腫瘍細胞に対する細胞毒性が低く、かつ酵素的に活性化されうるかまたはさらに活性な親形態へと変換されうる、薬学的に活性な物質の前駆体または誘導体の形態をいう。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」 Biochemical Society Transactions, Vol. 14, 615th Meeting Belfast (1986) pp. 375-382およびStella, et al., 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」, Directed Drug Delivery, Borchardt, et al., (eds.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照されたい。エフェクター成分として使用されうるプロドラッグは、さらに活性な、細胞毒性のない薬物へ変換されうる、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、b-ラクタム含有プロドラッグ、置換されてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換されてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、5-フルオロシトシンおよび他の5-フルオロウリジンプロドラッグを含むが、これらに限定されることはない。本発明において用いるためのプロドラッグ形態へ誘導体化されうる細胞毒性薬物の例としては、本明細書において記述される化学療法剤が挙げられるが、これらに限定されることはない。
「細胞毒性成分」という用語は、細胞の機能を阻害もしくは阻止する、および/または細胞の死もしくは破壊を引き起こす物質をいう。細胞毒性剤は、放射性同位体(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体); 化学療法剤または化学療法薬(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤); 成長阻害剤; 酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素; 抗生物質; 細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素的に活性な毒素のような、その断片および/または変種を含めた、毒素; ならびに本明細書において開示されるさまざまな抗腫瘍剤または抗がん剤を含むが、これらに限定されることはない。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために、必要な投与量および期間単位での、有効な量をいう。
「Fc領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含んだ免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために本明細書において用いられる。この用語は天然配列Fc領域および変種Fc領域を含む。1つの態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在してもまたは存在していなくてもよい。本明細書において特別の定めのない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の付番は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)に記述されているように、EU指数とも呼ばれる、EU付番システムにしたがう。
「フレームワーク」または「FR」という用語は、超可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基をいう。可変ドメインのFRは一般に、4つのFRドメインである、FR1、FR2、FR3およびFR4からなる。したがって、HVRおよびFR配列は一般に、VH (またはVL)中に以下の配列で見られる: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、および「完全抗体」という用語は、天然抗体の構造に実質的に類似の構造を有する、または本明細書において定義されるFc領域を含んだ重鎖を有する抗体をいうように本明細書において互換的に用いられる。そのような抗体は一般に、2本の重鎖および2本の軽鎖を含む。
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用した、非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義では、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVR由来のアミノ酸残基およびヒトFR由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。特定の態様において、ヒト化抗体は、HVR (例えばCDR)の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、かつFRの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも1つ、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を任意で含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体をいう。
本明細書において用いられる「超可変領域」または「HVR」という用語は、配列が超可変である、および/または構造的に規定されたループ(「超可変ループ」)を形成する抗体可変ドメインの領域の各々をいう。一般に、天然の4本鎖抗体は6つのHVR; VH中の3つ(H1、H2、H3)およびVL中の3つ(L1、L2、L3)を含む。HVRは一般に、超可変ループ由来のアミノ酸残基および/または「相補性決定領域」(CDR)由来のアミノ酸残基を含み、後者は配列多様性が最も高く、および/または抗原認識に関与する。例示的な超可変ループはアミノ酸残基番号26〜32 (L1)、50〜52 (L2)、91〜96 (L3)、26〜32 (H1)、53〜55 (H2)および96〜101 (H3)の位置に存在する(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917を参照のこと)。例示的なCDR (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2およびCDR-H3)は、L1のアミノ酸残基番号24〜34、L2のアミノ酸残基番号50〜56、L3のアミノ酸残基番号89〜97、H1のアミノ酸残基番号31〜35B、H2のアミノ酸残基番号50〜65およびH3のアミノ酸残基番号95〜102の位置に存在する(Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)を参照のこと)。VH中のCDR1を除いて、CDRは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。CDRはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」または「SDR」を含む。SDRは、短縮型-CDRまたはa-CDRと呼ばれるCDRの領域の中に含まれる。例示的なa-CDR (a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2およびa-CDR-H3)は、L1のアミノ酸残基番号31〜34、L2のアミノ酸残基番号50〜55、L3のアミノ酸残基番号89〜96、H1のアミノ酸残基番号31〜35B、H2のアミノ酸残基番号50〜58およびH3のアミノ酸残基番号95〜102の位置に存在する(Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照のこと)。別段の指示がない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基(例えば、FR残基)は、本明細書においてKabatら、前記にしたがい付番される。
「イムノコンジュゲート」は、結合対のメンバー、核酸またはエフェクター分子を含むがこれらに限定されない、1つまたは複数の非抗体由来分子とコンジュゲートされた抗体または抗体断片である。
「個体」または「対象」は哺乳類である。哺乳類は、家畜化した動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ)、霊長類(例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばサル)、ウサギ、ならびにげっ歯類(例えば、マウスおよびラット)を含むが、これらに限定されることはない。特定の態様において、個体または対象はヒトである。
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、例えば、天然に存在する変異を含むまたはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、一般的には少量存在している、生じ得る変種抗体を除いて、同一であり、および/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を通例含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、1つの抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られている抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の産生を要すると解釈されるべきではない。例えば、本明細書において報告される複合体において用いられるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体断片は、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだ形質転換動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、種々の技法によって作製されてもよく、そのような方法およびモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法が本明細書に記述されている。
「一価結合ポリペプチド」または「一価結合抗体断片」という用語は、その標的または抗原への結合のための部位または領域を1つしか持たない分子を意味する。一価結合ポリペプチドの例は、ペプチド、ペプチド模倣体、アプタマー、有機小分子(標的ポリペプチドへの特異的結合の能力がある阻害剤)、ダルピン、アンキリン反復タンパク質、Kunitz型ドメイン、単一ドメイン抗体(Hey, T., et al., Trends Biotechnol. 23 (2005) 514-522を参照のこと)、細胞表面受容体の(天然)リガンド、全長抗体の一価断片などである。例えば、全長抗体はその標的に対する結合部位を2つ持ち、したがって、二価である一方で、scFvまたはFAB'抗体断片はその標的に対する結合部位を1つしか持たず、したがって、一価である。一価抗体または抗体断片がポリペプチドとして用いられる場合、この部位はパラトープと呼ばれる。
「裸の抗体」または「裸の抗体断片」は、非抗体成分(例えば核酸、または細胞毒性成分、または放射性標識)とコンジュゲートされていない抗体または抗体断片をいう。
「天然の抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子をいう。例えば、天然のIgG抗体は、ジスルフィド結合している2本の同一の軽鎖および2本の同一の重鎖から構成された、約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端へと、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる、可変領域(VH)と、それに続く3つの定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3)を有する。同様に、N末端からC末端へと、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる、可変領域(VL)と、それに続く定常軽鎖(CL)ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる、2つのタイプのうちの1つに割り当てることができる。
「薬学的製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にさせるような形態にある調製物であって、その製剤が投与されるであろう対象に許容されず有毒である追加の構成成分を含有しない調製物をいう。
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって毒性のない、活性成分以外の、薬学的製剤中の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝液、賦形剤、安定剤または保存剤を含むが、これらに限定されることはない。
「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」という用語は、少なくとも8ヌクレオチドおよび多くても約1000ヌクレオチドを含む短い、一般的には一本鎖の、ポリヌクレオチドを意味する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも15、または少なくとも18、または少なくとも21、または少なくとも24、または少なくとも27、または少なくとも30ヌクレオチドの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドは200ヌクレオチド以下、または150ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下、または90ヌクレオチド以下、または80ヌクレオチド以下、または70ヌクレオチド以下、または60ヌクレオチド以下、または50ヌクレオチド以下、または45ヌクレオチド以下、または40ヌクレオチド以下、または35ヌクレオチド以下、または30ヌクレオチド以下の長さを有する。さらなる態様において、ポリヌクレオチドは少なくとも9、または少なくとも10、または少なくとも11、または少なくとも12、または少なくとも15、または少なくとも18、または少なくとも21、または少なくとも24、または少なくとも27、または少なくとも30ヌクレオチドの長さで、かつ200ヌクレオチド以下、または150ヌクレオチド以下、または100ヌクレオチド以下、または90ヌクレオチド以下、または80ヌクレオチド以下、または70ヌクレオチド以下、または60ヌクレオチド以下、または50ヌクレオチド以下、または45ヌクレオチド以下、または40ヌクレオチド以下、または35ヌクレオチド以下、または30ヌクレオチド以下の長さを有する。
「L-ポリヌクレオチド」という用語は、L-DNAのような、単量体構成要素として50%超のL-ヌクレオチドを含む核酸を意味する。1つの態様において、L-ポリヌクレオチドはL-ヌクレオチドだけを含む。そのようなL-ポリヌクレオチドのヌクレオチドの数は、1つのL-ヌクレオチドから任意の数にまで及ぶことが理解されるべきである。しかしながら、1つの態様において、L-ヌクレオチドの数は少なくとも10、または少なくとも15、または少なくとも20、または少なくとも25、または少なくとも30、または少なくとも35、または少なくとも40、または少なくとも45、または少なくとも50、または少なくとも55、または少なくとも60、または少なくとも70、または少なくとも80、または少なくとも90、または少なくとも100ヌクレオチドである。L-ポリヌクレオチドはL-A、L-G、L-C、L-U、L-Tおよびその組み合わせから作製され、ここでL-AはL-リボース-アデニンを意味する、などである。L-ポリデオキシヌクレオチドはL-dA、L-dG、L-dC、L-dU、L-dTおよびその組み合わせから作製され、ここでL-dAはL-デオキシリボース-アデニンを意味する、などである。
「ポリヌクレオチドリンカー」という用語は、2つのヌクレオチド配列をともに連結している成分を意味する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーはポリヌクレオチドである。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも1つのポリヌクレオチドおよび少なくとも1つの非ポリヌクレオチドを含む。非ポリヌクレオチドは、ポリペプチド、重合体、または多糖でありうる。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、長さが10〜30ヌクレオチドのポリヌクレオチドおよび直鎖状ポリ(エチレングリコール)を含む。
「ポリペプチド」は、天然に産生されたか合成的に産生されたかを問わず、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなる重合体である。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」といわれてもよいが、2つもしくはそれ以上のポリペプチドからなる、または100アミノ酸残基超の1つのポリペプチドを含む分子は、「タンパク質」といわれてもよい。ポリペプチドは、炭水化物群、金属イオンまたはカルボン酸エステルのような、非アミノ酸構成成分を含んでもよい。非アミノ酸構成成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって付加されてもよく、細胞のタイプによって変化してもよい。ポリペプチドは、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸という点で本明細書において定義される。炭水化物群などの付加は一般的に特定されていないが、それでもなお存在することがある。
「ポリペプチドエピトープ」は、対応する一価結合ポリペプチドによって結合されるポリペプチド標的上の結合部位を意味する。これは一般的にはアミノ酸から構成される。結合ポリペプチドは直鎖状エピトープ、すなわち、5〜12個の連続アミノ酸のストレッチからなるエピトープに結合するか、または結合ポリペプチドは、ポリペプチド標的のいくつかの短いストレッチの空間的配置によって形成される三次元構造に結合するかのどちらかである。結合ポリペプチドにより、例えば、抗体または抗体断片の抗原認識部位またはパラトープにより認識される三次元エピトープは、抗原分子の三次元表面の特徴と考えることができる。これらの特徴は、結合ポリペプチドの、対応する結合部位(中)にぴったり適合し、その結果、結合ポリペプチドとその標的との間の結合が促進される。
「特異的に結合する」という用語は、ポリペプチドまたは抗体もしくは抗体断片が10-8 Mまたはそれ未満の、1つの態様において10-8 M〜10-13 Mの、1つの態様において10-9 M〜10-13 Mの解離定数(KD)でその標的に結合することを意味する。この用語は、ポリペプチドが、存在する他の生体分子に特異的に結合しない、すなわち、ポリペプチドが10-6 M以上の、1つの態様において10-6 M〜1 Mの解離定数(KD)で他の生体分子に結合することを示すためにさらに用いられる。
本明細書において用いられる場合、「処置」(および「処置する」または「処置すること」のようなその文法的変形)は、処置されている個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入をいい、予防のためにまたは臨床病理の過程中に行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患進行の速度の減少、病状の改善または緩和、および寛解または改善された予後予測を含むが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、本明細書において報告される複合体は、疾患の発生を遅延させるため、または疾患の進行を遅らせるために用いられる。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体をその抗原に結合させる際に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインをいう。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれ、VHおよびVL)は一般に、類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)および3つの超可変領域(HVR)を含む(例えば、Kindt, et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと)。単一のVHまたはVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、該抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用い、それぞれ、相補性VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングして単離されうる(例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887、Clarckson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照のこと)。
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、連結している別の核酸を増やすことができる核酸分子をいう。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクターの他に、導入を受けた宿主細胞のゲノムに組み入れられているベクターも含む。特定のベクターは、機能的に連結している核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」といわれる。
ポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体
標的への1つまたは複数のエフェクター成分の送達のための複合体が本明細書において報告され、これにより、複合体は、非共有結合性相互作用によって接続されている少なくとも2つの構成成分を含み、構成成分は、単離されたRNAまたはDNAよりも、とりわけD-DNAよりもインビボでのタンパク質分解および酵素分解に対して耐性である。複合体はその標的に対して高い親和性を有し、良好な溶解性を有する。
標的への1つまたは複数のエフェクター成分の送達のための複合体が本明細書において報告され、これにより、複合体は、非共有結合性相互作用によって接続されている少なくとも2つの構成成分を含み、構成成分は、単離されたRNAまたはDNAよりも、とりわけD-DNAよりもインビボでのタンパク質分解および酵素分解に対して耐性である。複合体はその標的に対して高い親和性を有し、良好な溶解性を有する。
ポリペプチド部分およびポリヌクレオチド部分、とりわけL-ポリヌクレオチド部分の混合物を含む複合体は、これらの要件を満たし、インビボでのエフェクター成分の送達にとりわけ適していることが分かった。
本明細書において報告される複合体は、例えば、免疫アッセイ法においてアナライトとの結合に用いることができる。例えば、アナライトが少なくとも2つの重複しないエピトープを有する場合、本明細書において報告される複合体は、リンカーポリヌクレオチドと、重複しないエピトープに特異的に結合する2つのポリペプチドとを含み、リンカーポリヌクレオチドは、これらのエピトープに特異的に結合するポリペプチドの相乗的結合に最適な長さを有するように構築される。これは、例えば、そのような複合体を利用するアナライトの検出のための方法において大変有用でありうる。
したがって、本明細書において報告される1つの局面は、サンプル中の関心対象のアナライトの検出における本明細書において報告される複合体の使用である。特定の態様において、用いられる検出方法は、酵素免疫アッセイ(ELISA)法、任意の適切なシグナル検出の方法、例えば、電気化学発光、または免疫組織化学において用いられる複合体を利用する直接的、間接的、競合的またはサンドイッチ免疫アッセイ法である。
本明細書において報告される1つの局面は、式
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
のポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体であり、
式中、AおよびBは、標的に特異的に結合するポリペプチドであり、
式中、a' : aおよびb : b'は結合対であり、ここでa'およびaは、bとb'の結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、
式中、Sはリンカーポリヌクレオチドであり、
式中、(: X)は、共有結合的にまたは結合対によってa'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合されたエフェクター成分を意味し、
式中、(n)は整数であり、
式中、- は共有結合を表し、かつ
式中、: は非共有結合を表す。
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
のポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体であり、
式中、AおよびBは、標的に特異的に結合するポリペプチドであり、
式中、a' : aおよびb : b'は結合対であり、ここでa'およびaは、bとb'の結合に干渉せず、その逆の場合も同じであり、
式中、Sはリンカーポリヌクレオチドであり、
式中、(: X)は、共有結合的にまたは結合対によってa'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合されたエフェクター成分を意味し、
式中、(n)は整数であり、
式中、- は共有結合を表し、かつ
式中、: は非共有結合を表す。
同様に、1つの局面として本明細書において報告されるのは、上で概説した式
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
のポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成するための、以下の段階を含む方法である:
a) A-a'およびb'-Bをそれぞれ合成する段階、
b) リンカー a - S - bを合成する段階、ならびに
c) 前記式の複合体を形成させる段階、
ここで、エフェクター成分Xは、段階a)、b)またはc)においてa'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合している。
(A - a' : a - S - b: b' - B) - X(n)または(A - a' : a - S- b: b' - B):X(n)
のポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成するための、以下の段階を含む方法である:
a) A-a'およびb'-Bをそれぞれ合成する段階、
b) リンカー a - S - bを合成する段階、ならびに
c) 前記式の複合体を形成させる段階、
ここで、エフェクター成分Xは、段階a)、b)またはc)においてa'、a、b、b'、またはSのうちの少なくとも1つに結合している。
本明細書において報告される複合体は、その個々の構成成分に基づき、複合体の個々の構成成分とコンジュゲートされた結合対のメンバー間のハイブリダイゼーションによる標準的な手順によって得ることができる。
1 : 1 : 1の化学量論を有する複合体を得るために、複合体を他のコンジュゲーション副生成物からクロマトグラフィーによって分離することができる。この手順は、色素標識された結合対のメンバーおよび/または荷電リンカーを用いることによって容易にすることができる。この種の標識されたおよび強く負に荷電された結合対のメンバーを用いることにより、モノコンジュゲートポリペプチドは、電荷および分子量の差異を分離のために用いることができるので、2つ以上のリンカーを保有するポリペプチドおよび非標識ポリペプチドから容易に分離される。蛍光色素は、標識された一価結合剤と同様、非結合構成成分から複合体を精製するのに有用でありうる。
本明細書において報告される1つの局面では、以下の構成成分
a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含むポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) i) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドと、
ii) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分と
をそれぞれ合成する段階、
b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法が報告される。
a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含むポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階
a) i) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドと、
ii) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分と
をそれぞれ合成する段階、
b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法が報告される。
本明細書において報告される別の局面は、以下の構成成分
a)第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチド、
b)第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチド、ならびに
c) 第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を含むポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階
a)第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチドと、
第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチドと
をそれぞれ合成する段階、ならびに
b) 第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
a)第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチド、
b)第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチド、ならびに
c) 第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を含むポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を生成する方法であって、以下の段階
a)第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチドと、
第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチドと
をそれぞれ合成する段階、ならびに
b) 第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法である。
複合体は、電荷を均等化するために1つまたはいくつかの対イオンYをさらに含むことができる。適当な、負に荷電した対イオンの例は、ハロゲン化物、OH-、カーボネート、アルキルカルボキシレート、例えばトリフルオロアセテート、スルフェート、ヘキサフルオロホスフェートおよびテトラフルオロボレート基である。ヘキサフルオロホスフェート、トリフルオロアセテートおよびテトラフルオロボレート基がとりわけ適している。他の適した、正に荷電した対イオンは、アルカリ金属イオンおよび/またはアンモニウムイオンのような一価陽イオンである。
本明細書において報告される複合体の完全ライブラリーを容易に提供することができ、分析することができ、そのようなライブラリーのなかから適当な結合剤を必要に応じて、大規模で生成することができる。
ライブラリーは、本明細書において報告される複合体のセットをいい、ここで各々のポリペプチドおよび結合対のメンバーは同一であり、かつここでポリヌクレオチドリンカーの長さは、結合剤について提示された要件に最も適合するように調整される。1 nm〜100 nmの全範囲に及ぶ、かつ約10 nm間隔のステップを有するポリヌクレオチドリンカーラダーを最初に用いることが容易に可能である。その後、第1ラウンドにおいて特定された最も適切な長さの前後で、リンカーの長さは再度、容易に、さらに精緻化される。
本明細書において、異なるポリヌクレオチドリンカー長を有する多数の複合体を含んだライブラリーからのポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体の選択のための方法も報告される。この方法の1つの態様において、さまざまな長さのポリヌクレオチドリンカーを有するいくつかのリンカー分子を合成し、これを、さまざまな長さのポリヌクレオチドリンカーを含んだ本明細書において報告される複合体の形成において用い、2つの一価ポリペプチド結合剤のより良い方と比べて少なくとも5倍のKdissの改善を有する複合体を選択する。1つの態様において所望のKdissを有する二価結合剤の選択は、実施例において開示のBIAcore分析によって行われる。
本明細書において報告される1つの局面は、
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、および第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含むリンカー
を含む複合体である。
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、および第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含むリンカー
を含む複合体である。
本明細書において報告される1つの局面は、
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、および第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含むリンカー
を含む複合体である。
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしている抗体FAB断片またはscFv、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、および第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含むリンカー
を含む複合体である。
第1の一本鎖L-DNA成分は、第2の一本鎖L-DNA成分とハイブリダイズせず、かつ第2の一本鎖L-DNAリンカー成分とハイブリダイズしない。一方、第2の一本鎖L-DNA成分は、第1の一本鎖L-DNA成分とハイブリダイズせず、かつ第1の一本鎖L-DNAリンカー成分とハイブリダイズしない。
本明細書において提示される全ての局面の以下の態様においては、以下が与えられる。
1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、抗体または抗体断片である。1つの態様において、抗体断片はFABである。
1つの態様において、第1および/または第2の一本鎖L-DNA成分は、10〜50ヌクレオチドの長さを有する。1つの態様において、長さは15〜35ヌクレオチドのものである。1つの態様において、長さは20〜30ヌクレオチドのものである。
1つの態様において、リンカーは第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、第2の一本鎖L-DNAリンカー成分、および一本鎖ドッキング成分を含む。1つの態様において、リンカーは直鎖状の非ヌクレオチド成分をさらに含む。1つの態様において、直鎖状の非ヌクレオチド成分はポリペプチドまたは非イオン性重合体である。1つの態様において、非イオン性重合体は直鎖状ポリ(エチレングリコール)である。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜100個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜50個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜25個のエチレングリコール単位を含む。
1つの態様において、複合体は、
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含む、および第1の一本鎖L-DNA成分と第2の一本鎖L-DNA成分との間に第3の一本鎖L-DNAリンカー成分を含むリンカー
を含む。
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の一本鎖L-DNA成分とコンジュゲートしているポリペプチド、ならびに
c)第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分を第1の(または3')末端に含む、第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分を第2の(または5')末端に含む、および第1の一本鎖L-DNA成分と第2の一本鎖L-DNA成分との間に第3の一本鎖L-DNAリンカー成分を含むリンカー
を含む。
1つの態様において、リンカーは3'から5'の方向に
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
ドッキング一本鎖L-DNA成分は第1の一本鎖L-DNA成分またはその相補的な第1の一本鎖リンカー成分とハイブリダイズせず、かつ第2の一本鎖L-DNA成分またはその相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分とハイブリダイズしない。
1つの態様において、リンカーは3'から5'の方向に
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 直鎖状の非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 直鎖状の非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
1つの態様において、リンカーは3'から5'の方向に
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、
- 非ヌクレオチド成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、
- 非ヌクレオチド成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
1つの態様において、リンカーは3'から5'の方向に
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、および
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
1つの態様において、リンカーは3'から5'の方向に
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 第1の非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、
- 第2の非ヌクレオチド成分、
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
- 第1の一本鎖L-DNA成分と相補的な第1の一本鎖L-DNAリンカー成分、
- 第1の非ヌクレオチド成分、
- ドッキング一本鎖L-DNA成分、
- 第2の非ヌクレオチド成分、
- 第2の一本鎖L-DNA成分と相補的な第2の一本鎖L-DNAリンカー成分
を含む。
1つの態様において、第1の非ヌクレオチド成分および第2の非ヌクレオチド成分は同じものまたは異なるものである。1つの態様において、直鎖状の非ヌクレオチド成分はポリペプチドまたは非イオン性重合体である。1つの態様において、非イオン性重合体は直鎖状ポリ(エチレングリコール)である。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜100個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜50個のエチレングリコール単位を含む。1つの態様において、直鎖状ポリ(エチレングリコール)は1〜25個のエチレングリコール単位を含む。
ポリペプチド構成成分
モノクローナル抗体法は、特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片の形態で特異的に結合する作用物質の産生を可能にする。モノクローナル抗体またはその断片を作製するために、マウス、ウサギ、ハムスターまたは任意の他の哺乳類をポリペプチド、すなわち抗体の標的、または/およびポリペプチドをコードする核酸で免疫するような技法を用いることができる。あるいは、モノクローナル抗体またはその断片をscFv (一本鎖可変領域)、具体的にはヒトscFvのファージライブラリーの使用によって得ることができる(例えばUS 5,885,793、WO 92/01047、WO 99/06587を参照のこと)。
モノクローナル抗体法は、特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片の形態で特異的に結合する作用物質の産生を可能にする。モノクローナル抗体またはその断片を作製するために、マウス、ウサギ、ハムスターまたは任意の他の哺乳類をポリペプチド、すなわち抗体の標的、または/およびポリペプチドをコードする核酸で免疫するような技法を用いることができる。あるいは、モノクローナル抗体またはその断片をscFv (一本鎖可変領域)、具体的にはヒトscFvのファージライブラリーの使用によって得ることができる(例えばUS 5,885,793、WO 92/01047、WO 99/06587を参照のこと)。
1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、一価抗体断片である。1つの態様において、一価抗体断片はモノクローナル抗体に由来する。
一価抗体断片はFAB、FAB'-SH、単一ドメイン抗体、F(ab')2、FvおよびscFv断片を含むが、これらに限定されることはない。したがって、1つの態様において、一価抗体断片は、FAB、FAB'-SH、単一ドメイン抗体、F(ab')2、FvおよびscFv断片を含む群より選択される。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの少なくとも1つが、モノクローナル抗体のFAB'断片または、FAB断片または、単一ドメイン抗体である。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの両方が、お互いに独立してモノクローナル抗体のFAB'断片または、FAB断片または、単一ドメイン抗体である。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの両方が、単一ドメイン抗体、またはFAB断片、またはFAB'断片である。
1つの態様において、ポリペプチドまたは一価結合ポリペプチドによって特異的に結合される標的またはエピトープは、重複しない。
ダイアボディは、二価または二重特異性でありうる2つの抗原結合部位を有する抗体断片である(例えば、EP 0 404 097、WO 93/01161、Hudson, P.J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134、およびHolliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照のこと)。トリアボディおよびテトラボディもHudson, P. J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134に記述されている。
単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体断片である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体(Domantis, Inc., Waltham, MA; US 6,248,516)である。
Fvは最小の抗体断片であり、これは完全な抗原結合部位を含み、かつ定常領域を欠く。scFvの概説については、例えば、Plueckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315、WO 93/16185、US 5,571,894、US 5,587,458を参照されたい。一般に、6つの超可変領域(HVR)が、抗体に対して抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(または1つの抗原に対して特異的な3つのHVRしか含まないFvの半分)でさえ、その抗原を認識して結合する能力を有する。
1つの態様において、一価抗体断片は、強力な非共有結合状態にある1本の重鎖および1本の軽鎖の可変ドメインの二量体からなる2本鎖Fv種である。
1つの態様において、一価抗体断片は、柔軟性ペプチドリンカーによって共有結合的に連結された1本の重鎖および1本の軽鎖の可変ドメインからなる一本鎖Fv (scFv)種である。
抗体のFAB断片は、重鎖および軽鎖の可変ドメイン、ならびに軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含む。
FAB'断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含めて重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりFAB断片とは異なる。
FAB'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持ったFAB'を意味する。
抗体断片の産生のために、さまざまな技法が開発されている。伝統的には、全長抗体のタンパク質消化によって抗体断片を得ることができる(例えば、Morimoto, K., et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24 (1992) 107-117、Brennan, M., et al., Science 229 (1985) 81-83を参照のこと)。例えば、全長抗体のパパイン消化は、「FAB」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力をその名が反映している、残りの「Fc」断片とを生ずる。特定の抗体断片の概説については、Hudson, P. J., et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。
抗体断片は組換え手段によって直接産生することもできる。FAB、FvおよびscFv抗体断片は全て、例えば大腸菌(E. coli)中で発現させ、大腸菌から分泌させ、かくして、これらの断片の大量の簡易産生を可能にすることができる。抗体断片は標準的な手順にしたがって抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、FAB'-SH断片は大腸菌から直接回収することもできる(Carter, P., et al., Bio/Technology 10 (1992) 163-167)。哺乳類細胞システムを用いて、抗体断片を発現させ、必要なら、分泌させることもできる。
1つの態様において、抗原に特異的に結合するポリペプチドは、単一ドメイン抗体である。特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である(例えば、US 6,248,516参照)。1つの態様において、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部または一部からなる。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部または軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む単一のポリペプチド鎖である。
特定の態様において、ポリペプチドは、≦ 10 nM、≦ 1 nM、≦ 0.1 nM、≦ 0.01 nM、または≦ 0.001 nM (例えば10-8 Mまたはそれ未満、例えば10-8 M〜10-13 M、例えば、10-9 M〜10-13 M)の解離定数(KD)でその標的に結合する。
ポリペプチドが抗体または抗体断片である1つの態様において、解離定数は、以下のアッセイ法によって記述されるように、抗体のFAB断片およびその抗原で行われる放射性標識抗原結合アッセイ(RIA)法によって決定される。
抗原に対するFABの溶液中結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下において最小濃度の(125I)標識抗原でFABを平衡化し、その後、結合した抗原を、抗FAB抗体でコーティングしたプレートで捕捉することにより測定される(例えば、Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと)。アッセイの条件を確立するために、MICROTITER(登録商標)マルチウェルプレート(Thermo Scientific)を50 mM炭酸ナトリウム(pH 9.6)中5 μg/mlの捕捉用抗FAB抗体(Cappel Labs)で終夜コーティングし、その後、PBS中2% (w/v)のウシ血清アルブミンにより室温(およそ23℃)によって2〜5時間ブロッキングする。非吸着プレート(Nunc #269620)では、100 pMまたは26 pMの[125I]抗原を、関心対象のFABの連続希釈液と混合する(例えば、Presta, L.G., et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599における抗VEGF抗体FAB-12の評価と一致している)。その後、関心対象のFABを終夜インキュベートする; しかしながら、平衡に達することを確実とするために、さらに長い時間(例えば、約65時間)、インキュベーションを続けてもよい。その後、混合物を室温での(例えば、1時間の)インキュベーションのために捕捉プレートに移す。その後、溶液を除去し、プレートをPBS中0.1%のポリソルベート20 (TWEEN-20(登録商標))で8回洗浄する。プレートが乾いた時点で、150 μl/ウェルのシンチレーション剤(MICROSCINT-20(商標); Packard)を加え、プレートをTOPCOUNT(商標)ガンマカウンタ(Packard)にて10分間カウントする。最大結合の20%以下を与える各FABの濃度を、競合的結合アッセイ法で用いるために選択する。
別の態様によれば、およそ10反応単位(RU)の固定化抗原CM5チップを備えた25℃のBIACORE(登録商標)-2000またはBIACORE(登録商標)-3000またはBIACORE(登録商標)A-100 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)により表面プラズモン共鳴アッセイ法を用いて解離定数を決定する。
手短に言えば、カルボキシメチル化したデキストランバイオセンサチップ(CM5, BIACORE, Inc.)を、供給元の使用説明書にしたがってN-エチル-N'-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化する。抗原を、5 μl/分の流速での注入の前に10 mM酢酸ナトリウム, pH 4.8で5 μg/ml (およそ0.2 μM)まで希釈して、およそ10反応単位(RU)の、カップリングされたタンパク質を達成する。抗原の注入後、1 Mのエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。動力学の測定のために、FABの2倍連続希釈液(0.78 nM〜500 nM)を、25℃の、0.05%ポリソルベート20 (TWEEN-20(商標))界面活性剤(PBST)を含むPBS中にておよそ25 μl/分の流速で注入する。単純な1対1ラングミュアー結合モデル(BIACORE(登録商標)評価ソフトウェアバージョン3.2)を用いて会合および解離のセンサグラムを同時に当てはめることによって、会合速度(kon)および解離速度(koff)を計算する。平衡解離定数(KD)をkoff/konの比として計算する(例えばChen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照のこと)。上記の表面プラズモン共鳴アッセイ法による会合速度が106 M-1s-1を超えるなら、分光計、例えば流動停止を備えた分光光度計(Aviv Instruments)または撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AMINCO (商標)分光光度計(ThermoSpectronic)にて測定される、漸増濃度の抗原の存在下、PBS, pH 7.2中20 nMの抗抗原抗体(FAB型)の25℃での蛍光放出強度(励起 = 295 nm; 放出 = 340 nm、帯域通過16 nm)の増加または減少を測定する蛍光消光技法を用いることによって会合速度を決定することができる。
2つの結合分子が2つの独立した結合部位を認識する場合、協調的結合事象が生み出されうるが、これはポリヌクレオチドリンカーの長さとは無関係でありうる。
協調的結合効果は、自由ギブズ結合エネルギーΔG°1およびΔG°2がΔG°coop : ΔG°1 + ΔG°2 =ΔG°coopにまとめられるという点で物理学的に特徴付けられる。
ギブズ方程式ΔG°coop = -RTlnKDcoopによれば、ΔG°coopは親和性KD1およびKD2から生成物を形成する。
自由ギブズ結合エネルギーの増強は、結合親和性(KDcoop)および結合特異性を協調的、劇的に増大する。
結合特異性は、応じる結合部位が、例えば腫瘍細胞の表面上に共局在化されうる2つの異なる標的分子上に独立して位置している場合に、さらに増大する。
標的に特異的に結合するポリペプチドは、特定のカップリング試薬と潜在的に反応しうる、1つまたは複数の遊離OH、COOH、NH2および/またはSH基を保有する可能性が高い。コンジュゲーション反応の間の(副)反応を回避するために、以下の表1に与えたカップリング化学反応の1つを選択することができる。
表1は、ポリペプチドを結合対の各メンバーに共有結合させるための、ならびにリンカーを結合対の各メンバーに共有結合させるための反応基の概要を示す。
（表１）
上記の双直交(bi-orthogonal)カップリング化学反応は、一価結合ポリペプチドのコンジュゲーションにとりわけ適している。2つの結合パートナーが特定の反応性官能基を保有していないなら、例えば2つのアプタマーの組み合わせの場合なら、反応部位の選択の自由度はさらに高い。それゆえ、上記表に与えた対応する反応部位の対に加えてまたはそれと組み合わせて、アミノ/活性エステル(例えばNHSエステル)およびSH/SHまたはSH/マレインイミドを直交カップリングのために用いることができる。
一価結合ポリペプチドは合成ペプチドまたはペプチド模倣体であってもよい。ポリペプチドが化学的に合成される場合、直交化学反応性を有するアミノ酸を、そのような合成中に組み入れることができる(例えば、de Graaf, A.J., et al., Bioconjug. Chem. 20 (2009) 1281-1295を参照のこと)。多種多様の直交官能基にかかわる問題であり、これらの官能基は合成ペプチドに導入することができるため、リンカーへのそのようなペプチドのコンジュゲーションは標準的な化学反応である。
ポリヌクレオチド構成成分
本明細書において報告される複合体は、(ポリヌクレオチド)リンカーを含む。リンカーがポリペプチドと共有結合していてもよく、または(ポリヌクレオチド)リンカーおよびポリペプチドが特異的な結合対によって互いに結合していてもよい。
本明細書において報告される複合体は、(ポリヌクレオチド)リンカーを含む。リンカーがポリペプチドと共有結合していてもよく、または(ポリヌクレオチド)リンカーおよびポリペプチドが特異的な結合対によって互いに結合していてもよい。
異なる長さの(ポリヌクレオチド)リンカーが用いられる場合には、その結果として、標的に特異的に結合する第1のポリペプチドと第2のポリペプチドとの間の距離の異なる複合体の構築体を得ることができる。これによって最適な距離および/または柔軟性が可能になる。
ポリヌクレオチドという用語は、広義に理解されるべきであり、DNAおよびRNAならびにその類似体および修飾を含む。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、20%超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、30%超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、40%超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、50%超の単量体がヌクレオシドである限り、異なるタイプの単量体の混合物から構成される。
例えば、リンカーはヌクレオシドから排他的に構成されてもよく、またはリンカーはヌクレオシドおよびアミノ酸、および/もしくは糖残基、および/もしくはジオール、および/もしくはホスホ-糖単位、および/もしくは非イオン性重合体構成要素の混合物であってもよい。
オリゴヌクレオチドは、例えば、標準塩基デオキシアデノシン(dA)、デオキシグアノシン(dG)、デオキシシトシン(dC)、デオキシチミジン(dT)、デオキシウラシル(dU)の位置に置換基を保有する置換ヌクレオチドを含んでもよい。そのような置換核酸塩基の例は、5-置換ピリミジン(5-メチル-dC、アミノアリル-dUまたは-dC、5-(アミノエチル-3-アクリルイミド)-dU、5-プロピニル-dUまたは-dCのような)、5-ハロゲン化-dUまたは-dC、N-置換ピリミジン(N4-エチル-dCのような)、N-置換プリン(N6-エチル-dA、N2-エチル-dGのような)、8-置換プリン(8-[6-アミノ)-ヘキサ-1-イル]-8-アミノ-dGまたは-dAのような)、8-ハロゲン化-dAまたは-dG、8-アルキル-dGまたは-dA、および2-置換-dA (2-アミノ-dAのような)である。
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含んでもよい。すなわち、天然に存在する核酸塩基は、5-ニトロインドール-D-リボシド、3-ニトロ-ピロール-D-リボシド、デオキシイノシン(dI)、デオキシアントシン(dX)、7-デアザ-dG、-dA、-dIもしくは-dX、7-デアザ-8-アザ-dG、-dA、-dIもしくは-dX、8-アザ-dA、-dG、-dIもしくは-dX、D-ホルマイシン、プソイド-dU、プソイド-イソ-dC、4-チオ-dT、6-チオ-dG、2-チオ-dT、イソ-dG、5-メチル-イソ-dC、N8-連結-8-アザ-7-デアザ-dA、5,6-ジヒドロ-5-アザ-dC、エテノ-dA、またはピロロ-dCのような核酸塩基類似体を用いることにより交換することができる。当業者には明らかなように、相補鎖中の核酸塩基は、二重鎖形成が特異的であるように選択されなければならない。例えば、5-メチル-イソ-dCが片鎖(例えば(a))において用いられるなら、イソ-dGが相補鎖(例えば(a'))中になければならない。
1つの態様において、リンカーのオリゴヌクレオチド骨格は、置換糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間リン酸成分の修飾を含むように修飾され、および/またはPNA(ホスフェートおよびd-リボースのない骨格を有する)である。
オリゴヌクレオチドは、例えば、2'-メトキシ-、2'-フルオロ-、2'-メチルセレノ-、2'-アリルオキシ-、4'-メチル-dN (ここでNは核酸塩基、例えば、A、G、C、TまたはUである)のような置換デオキシリボースを有するヌクレオチドを含みうる。
糖類似体は、例えば、キシロース、(2'-O, 4'-Cメチレン) (LNAとして公知のオリゴマー)または(2'-O, 4'-Cエチレン) (ENAとして公知のオリゴマー)のような2',4'-架橋リボース、L-リボース、L-D-リボース、ヘキシトール(HNAとして公知のオリゴマー)、シクロヘキセニル(CeNAとして公知のオリゴマー)、アルトリトール(ANAとして公知のオリゴマー)、C3'およびC5'原子が、シクロプロパン環に縮合しているエチレン架橋によって接続されている三環式リボース類似体(トリシクロDNAとして公知のオリゴマー)、グリセリン(GNAとして公知のオリゴマー)、グルコピラノース(ホモDNAとして公知のオリゴマー)、カルバリボース(テトラヒドロフランサブユニットの代わりにシクロペンタンを有する)、ヒドロキシメチル-モルホリン(モルホリノDNAとして公知のオリゴマー)である。
ヌクレオシド間リン酸成分の多くの修飾は、ハイブリダイゼーション特性に干渉しないことも知られており、このような骨格修飾を置換ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例としては、ホスホロチオエート(phosphorthioate)、ホスホロジチオエート(phosphordithioate)、ホスホロアミデート(phosphoramidate)およびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
上記の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびポリヌクレオチド骨格修飾を、本明細書において報告される複合体中に含まれるポリヌクレオチドにおいて必要に応じて組み合わせることができる。
(ポリヌクレオチド)リンカーは1 nm〜100 nmの長さを有する。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは4 nm〜80 nmの長さを有する。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは5 nm〜50 nmの、または6 nm〜40 nmの長さを有する。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは10 nmもしくはそれを上回る、または15 nmもしくはそれを上回る長さを有する。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは10 nm〜50 nmの長さを有する。
1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーとコンジュゲートされた結合対のメンバーは、少なくとも各2.5 nmの長さを有する。
(ポリヌクレオチド)リンカーの長さは、実体と化学的に類似している構成成分の既知の結合距離および結合角度を用いることにより計算することができる。そのような結合距離は、標準的なテキストブック中に一部の分子についてまとめられている(例えばCRC Handbook of Chemistry and Physics 91st edition 2010-2011 section 9を参照のこと)。
スペーサーまたはリンカーの長さの計算では、以下の近似を当てはめる: a) 非ヌクレオシドの実体の長さを計算するために、連結される原子の性質とは関係なく、結合角度180°とともに平均の結合の長さ130 pmを用いる、b) 一本鎖における1つのヌクレオチドは500 pmで計算する、およびc) 二本鎖における1つのヌクレオチドは330 pmで計算する。
130 pmの値は、125 pmの2つのC(Sp3)間の結合距離および推定結合角度180°で換算した、およそ250 pmである2つのC(sp3)間の距離153 pmおよび結合角度109°28'でのC(sp3)-C(sp3)-C(sp3)鎖の2つの末端炭素原子の距離の計算に基づく。PおよびSのようなヘテロ原子ならびにsp2およびsp1 C原子もリンカーの一部でありうることを考慮すると、130 pmの値がとられる。リンカーがシクロアルキルまたはアリールのような環状構造を含むなら、その距離は、距離を規定している原子の鎖全体の一部である環状構造の結合の数をカウントすることによって同じように計算される。
本明細書において報告される複合体中の(ポリヌクレオチド)リンカーの長さは、必要に応じて変化させることができる。可変長のリンカー、すなわち、ライブラリーを容易に利用可能とするために、そのようなライブラリーの異なるリンカーへ合成によって簡単に到達できることが適当である。リンカーのコンビナトリアル固相合成が適している。リンカーは最大およそ100 nmの長さで合成されなければならないので、合成戦略は、単量体の合成構成要素が高い効率で固相合成中にアセンブルされるように選択される。単量体の合成構成要素としてのホスホラミダイトのアセンブリに基づくデオキシオリゴヌクレオチドの合成がこの要件を満たす。そのようなリンカーにおいて、リンカー内の単量体単位はいずれの場合にも、ホスフェートまたはホスフェート類似体成分を介して連結される。
(ポリヌクレオチド)リンカーは1つの態様などで、多官能性アミノ-カルボン酸の遊離正電荷基または/および負電荷基、例えばアミノ、カルボキシレートまたはホスフェートを含むことができる。例えば、電荷担体は、a) アミノ基および2つのカルボキシレート基、またはb) 2つのアミノ基および1つのカルボキシレート基を含む三官能性アミノカルボン酸に由来することができる。そのような三官能性アミノカルボン酸の例は、リジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、α,β-ジアミノプロピオン酸、アルギニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸、カルボキシグルタミン酸ならびにEP 0 618 192またはUS 5,519,142に記述されているものなどの対称三官能性カルボン酸である。あるいは、a)の三官能性アミノカルボン酸におけるカルボキシレート基の1つは、ホスフェート、スルホネートまたはスルフェート基によって置換されうる。そのような三官能性アミノ酸の例はホスホセリンである。
(ポリヌクレオチド)リンカーはまた、1つの態様などで、非荷電親水性基を含むことができる。非荷電親水性基の適した例は、エチレンオキシド基、またはとりわけ、エチレンオキシド基などの、少なくとも3つの構成要素を含むポリ(エチレンオキシド)基、スルホキシド基、スルホン基、カルボン酸アミド基、カルボン酸エステル基、ホスホン酸アミド基、ホスホン酸エステル基、リン酸アミド基、リン酸エステル基、スルホン酸アミド基、スルホン酸エステル基、硫酸アミド基および硫酸エステル基である。アミド基は1つの態様において、第一級アミド基であり、とりわけ、例えばアミノ酸アスパラギンおよびグルタミンの、アミノ酸側鎖基のカルボン酸アミド残基である。エステルは、とりわけ、親水性アルコール、具体的にはC1〜C3アルコールまたはジオールまたはトリオールに由来する。
鏡像異性L-DNAは、その直交ハイブリダイゼーション挙動、そのヌクレアーゼ耐性で知られており、可変長のポリヌクレオチドの合成の容易さで知られている。
1つの態様において、複合体中の全てのポリヌクレオチドは鏡像異性L-DNAまたはL-RNAである。1つの態様において、複合体中の全てのポリヌクレオチドは鏡像異性L-DNAである。
鏡像異性の一本鎖L-DNA (ss-L-DNA)は、高い分子柔軟性および体液中での安定性を兼ね備える。一本鎖L-DNAが2つまたはそれ以上の独立した結合分子間のリンカーとして用いられる場合、これらの結合分子は、ss-L-DNAリンカーの長さに依るにすぎない、実質的にあらゆる結合角度および結合距離に適応しうる。
1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは、互いにハイブリダイズしうるセグメントとして合成される。
この場合、リンカーは、セグメント相互のハイブリダイゼーションによって形成されうる。結果として生じるリンカー構築体は、オリゴヌクレオチドの二重鎖部分を含む。リンカーがそのように構築される場合、二重鎖を形成するハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドの実体の配列は、結合対の核酸とのハイブリダイゼーションまたは干渉が起こりえないように選択される。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、互いにハイブリダイズしうるss-L-DNAセグメント、例えばAおよびBとして合成される。
この場合、ポリヌクレオチドリンカーは、セグメント相互のハイブリダイゼーションによって構築されうる。それゆえ、リンカーの長さは、鎖状体を形成する構成要素、すなわち例証される通りのAおよびBの順次適用によって単純に、2つの結合部位の間の距離に自己調整されうる。リンカーは、樹立されたリンカーの核酸末端が、鎖状体間の融点温度(すなわちTM2)よりも低い融点温度(すなわちTM1)で(TM2 > TM1)、ss-L-DNA標識結合分子とハイブリダイズするという点で特徴付けられる。全長リンカーの最終の長さを分析するために、得られた複合体を、第1の融点温度を上回るが、しかし第2の融点温度を下回る第3の温度(すなわちTM3)でインキュベートする(すなわちTM3 > TM1およびTM3 < TM2)。その温度により溶出されたリンカーを標準的な方法により、例えば、エチジウムブロミド染色アガロースゲルを用いて分析することができる。リンカーの長さは、各鎖状体の長さが分かっているので、計算することもできる。個々の鎖状体を1つの態様において標識することができる。
二重鎖部分はオリゴヌクレオチドリンカーを強固にしうる。これを用いて、リンカーの可動性および柔軟性を低減することができる。
1つの態様において、1つまたは複数のL-DNAオリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドL-DNAリンカーとハイブリダイズされる。
この態様において、オリゴヌクレオチドリンカーがL-DNA二重鎖形成によって強固にされる。
1つの態様において、L-DNA/ポリ(エチレングリコール)ハイブリッドが(オリゴヌクレオチド)リンカーとして用いられる。
1つの態様において、L-DNA/D-DNA/ポリ(エチレングリコール)ハイブリッドが(オリゴヌクレオチド)リンカーとして用いられる。
1つの態様において、L-DNA/D-DNA/ポリ(エチレングリコール)/ポリペプチドハイブリッドが(オリゴヌクレオチド)リンカーとして用いられる。
1つの態様において、1つまたは複数のL-DNAオリゴヌクレオチドがL-DNA/ポリ(エチレングリコール)ハイブリッド(オリゴヌクレオチド)リンカーとハイブリダイズされる。
1つの態様において、さまざまな長さのポリ(エチレングリコール)分子に共有結合的にカップリングされている1つまたは複数のL-DNAオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドL-DNAポリ(エチレングリコール)ハイブリッド(オリゴヌクレオチド)リンカーとハイブリダイズされる。
1つの態様において、L-DNA/D-DNAハイブリッドが(オリゴヌクレオチド)リンカーとして用いられる。
1つの態様において、L-DNA/D-DNAハイブリッドが(オリゴヌクレオチド)リンカーとして用いられ、ここで1つまたは複数のD-DNAオリゴヌクレオチドが(オリゴヌクレオチド)リンカーのオリゴヌクレオチドD-DNA部分とハイブリダイズされて、二本鎖D-DNAを形成する。
1つの態様において、L-DNA/D-DNAハイブリッドがリンカーとして用いられ、ここで1つまたは複数のL-DNAオリゴヌクレオチドが(オリゴヌクレオチド)リンカーのオリゴヌクレオチドL-DNA部分とハイブリダイズされて、二本鎖L-DNAを形成する。
二本鎖の、すなわちらせん状の、DNA二重鎖の形成を用いて、複合体のインビボでの半減期を改変または調整し、ヌクレアーゼの酵素作用に応じうるようにすることができる。
(ポリヌクレオチド)リンカーを構築する簡単な方法は、標準的なDまたはLヌクレオシドホスホラミダイト構成要素を用いることである。
1つの態様において、dTの一本鎖ストレッチが用いられる。
これは有利である。というのは、dTが、塩基保護基を保有する必要がないからである。
二本鎖の長さは一本鎖と比べて低減され、かつ二本鎖は一本鎖よりも強固であるので、(ポリヌクレオチド)リンカーの長さ(ポリヌクレオチドリンカーの末端にある結合対のメンバー間の距離)およびスペーサーの柔軟性を変化させるために、ハイブリダイゼーションを用いることができる。
ハイブリダイゼーションのために、1つの態様において、官能成分で修飾されたオリゴヌクレオチドが用いられる。
ハイブリダイゼーションのために用いられるオリゴヌクレオチドは、リンカーとハイブリダイズしない1つもしくは2つの末端延長部を有することができ、および/または内向きに分岐される。リンカーとハイブリダイズしていない(および結合対のメンバーに干渉していない)そのような末端延長部は、さらなるハイブリダイゼーション事象のために用いることができる。
1つの態様において、末端延長部とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドは、エフェクター成分を含むオリゴヌクレオチドである。
この標識されたオリゴヌクレオチドは、かさねて、さらなるハイブリダイゼーションを可能とするために末端延長部を含んでもよく、または分岐されていてもよく、それによりポリヌクレオチド凝集体またはデンドリマーを得ることができる。ポリ標識を作製するために、またはエフェクター成分の高い局所濃度を得るために、とりわけ、ポリオリゴ核酸デンドリマーが用いられる。
ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに干渉しない修飾ヌクレオチドを、それらのポリヌクレオチドに組み入れることができる。適した修飾ヌクレオチドは、C5置換ピリミジンまたはC7置換7-デアザプリンである。ポリヌクレオチドを、エフェクター成分の導入のために用いられる非ヌクレオチド実体を用いて内側でまたは5'もしくは3'末端で修飾することができる。
1つの態様において、そのような非ヌクレオチド実体は、2つの結合対のメンバー間の(ポリヌクレオチド)リンカー(その末端と前記メンバーとがコンジュゲートしている)内に位置する。
ポリヌクレオチドの構築のための多くの異なる非ヌクレオチド構成要素は、文献において公知であり、多種多様のものが市販されている。エフェクター成分の導入のために、非ヌクレオシド二官能性構成要素または非ヌクレオシド三官能性構成要素のどちらかを、末端標識のためのCPGとして、または内部標識のためのホスホラミダイトとして用いることができる(例えばWojczewski, C, et al., Synlett 10 (1999) 1667-1678を参照のこと)。
二官能性スペーサー構成要素は1つの態様において、非ヌクレオシド構成成分である。例えば、そのようなリンカーはC2〜C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖である一方で、アルキル、アルケニル、アルキニル鎖は、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよび/もしくはアミド成分または四級化陽イオン性アミン成分によって中断されてもよい。1つまたは2つのC1〜C6アルキル基で置換されてもよい、C5〜C6-シクロアルキル、C4N-、C5N-、C4O-、C5O-ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状成分を非ヌクレオシド二官能性リンカーとして用いることもできる。適した二官能性構成要素はC3〜C6アルキル成分およびトリ〜ヘキサ-エチレングリコール鎖を含む。表2aおよび2bは、異なる親水性、異なる剛性および異なる電荷を有するヌクレオチド二官能性スペーサー構成要素のいくつかの例を示す。一方の酸素原子は、酸に不安定な保護基、好ましくはジメトキシトリチルに接続され、他方のものはホスホラミダイトの一部である。
（表２ａ）
（表２ｂ）
それゆえ、三官能性構成要素はポリヌクレオチド内の任意の位置への官能成分の位置付けを可能にする。三官能性構成要素はまた、ポリヌクレオチドの3'末端標識のために用いられる、固体支持体、例えば制御多孔質ガラス(CPG)を用いた合成のための必要条件である。この場合、三官能性リンカーはC2〜C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖を介して官能成分または、必要なら、保護官能成分に接続されるが、アルキル、アルケニル、アルキニル鎖は、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよび/またはアミド成分によって中断されてもよく、固相に切断可能なスペーサーを介して付着しているヒドロキシル基および酸に不安定な保護基で保護されているヒドロキシル基を含む。この保護基の除去後、ヒドロキシル基は遊離され、これがその後、ホスホラミダイトと反応しうる。
三官能性構成要素は非ヌクレオシドまたはヌクレオシドであってもよい。
非ヌクレオシド三官能性構成要素はC2〜C18アルキル、アルケニル、アルキニル炭素鎖である一方で、アルキル、アルケニル、アルキニルは、リンカーの親水性を増大するためにさらなるエチレンオキシおよび/またはアミド成分によって任意で中断されてもよい。他の三官能性構成要素は、1つまたは2つのC1〜C6アルキル基で置換されてもよい、C5〜C6-シクロアルキル、C4N-、C5N-、C4O-、C5O-ヘテロシクロアルキル、フェニルのような環状基である。環状基および非環状基は1つの(C1〜C18)アルキル-O-PG基で置換されうる一方で、C1〜C18アルキルは(エチレンオキシ)n、(アミド)m成分を含み、nおよびmは互いに独立して0〜6であり、PGは酸に不安定な保護基である。好ましい三官能性構成要素は、任意で1つのアミド結合を含んでよい、かつC1〜C6アルキルO-PG基で置換されてもよいC3〜C6アルキル、シクロアルキル、C5O-ヘテロシクロアルキル成分であり、ここでPGは酸に不安定な保護基、好ましくはモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、最も好ましくはジメトキシトリチルである。
非ヌクレオシド三官能性構成要素の非限定的な、しかし適した例は、例えば、表3にまとめられている。
（表３）
非修飾ポリヌクレオチドと比べてポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性に影響を与えないことが必要である場合は常に、内部標識のためにヌクレオシド三官能性構成要素が用いられる。それゆえ、ヌクレオシド構成要素は、相補的塩基とそれでもなおハイブリダイズできる塩基または塩基類似体を含む。本明細書において報告される複合体中に含まれるa、a'、b、b'、またはSの1つまたは複数の核酸配列を標識するための標識化合物の一般式を式IIに示す。
式II:
式中、PGは酸に不安定な保護基、とりわけモノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル、キサンチル、とりわけジメトキシトリチルであり、式中、YはC2〜C18アルキル、アルケニル、アルキニルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニルはエチレンオキシおよび/またはアミド成分を含んでよく、式中、Yは好ましくは、C4〜C18アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、かつ1つのアミド成分を含み、ならびに式中、Xは官能成分である。
式II:
そのような置換がハイブリダイゼーション特性に及ぼす影響を最小限に抑えるために、塩基の特定の位置が選択されてもよい。それゆえ、以下の位置は置換にとりわけ適している: a) 天然塩基による置換: C5位でのウラシル置換、C5位またはN4位でのシトシン置換、C8位またはN6位でのアデニン置換、およびC8位またはN2位でのグアニン置換、ならびにb) 塩基類似体による置換: C7位での7-デアザ-A置換および7-デアザ-G置換、C7位での7-デアザ-8-アザ-A置換および7-デアザ-8-アザ-G置換、C7位での7-デアザ-アザ-2-アミノ-A置換、N1位でのプソイドウリジン置換およびN2位でのホルマイシン置換。
（表４）
表4において、二官能性成分の末端酸素原子または三官能性成分の末端酸素原子の1つは、詳細には示されていないが、しかし当業者には明らかなホスホラミダイトの一部である。三官能性構成要素のもう1つの末端酸素原子は、上記式IIについて定義のように、酸に不安定な保護基PGで保護される。
合成後修飾は、共有結合している官能成分をリンカーに導入するための別の戦略である。このアプローチにおいて、固相合成の間に二官能性または三官能性構成要素を用いることにより、アミノ基が導入される。支持体からの切断およびアミノ修飾リンカーの精製後、リンカーを官能成分の活性化エステルと反応させるか、または二官能性試薬と反応させる。ここで1つの官能基は活性エステルである。とりわけ適した活性エステルはNHSエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルである。
合成後修飾は、固相合成および脱保護の間に安定ではない官能成分を導入するためにとりわけ有用である。例としては、Staudingerライゲーションのためのトリフェニルホスフィンカルボキシメチルエステルによる置換(Wang, Charles C.-Y., et al., Bioconjugate Chemistry 14 (2003) 697-701)、市販のスルホSMCCを用いてマレイニミド基を導入するためのジゴキシゲニンによる修飾である。
結合対の構成成分
1つの態様において、結合対の各メンバーは、10 kDaまたはそれ未満の分子量である／分子量を有する。1つの態様において、結合対の各メンバーの分子量は8 kDa、もしくは7 kDa、もしくは6 kDa、もしくは5 kDa、もしくは4 kDaまたはそれ未満である。
1つの態様において、結合対の各メンバーは、10 kDaまたはそれ未満の分子量である／分子量を有する。1つの態様において、結合対の各メンバーの分子量は8 kDa、もしくは7 kDa、もしくは6 kDa、もしくは5 kDa、もしくは4 kDaまたはそれ未満である。
結合対に対する(結合対内の)解離定数、すなわち結合親和性は、少なくとも10-8 M (=10-8 mol/l = 108 l/mol)である。本明細書において報告される複合体中の両結合対のメンバーは、異なる。結合対a:a'とb:b'との間の差異は、例えば、相反性結合、例えば、bまたはb'へのaおよびa'の結合の解離定数が対a:a'の解離定数の10倍またはそれ以上であるなら、認められる。
1つの態様において、相反性結合、すなわちbまたはb'それぞれへの、aおよびa'の結合の解離定数は、対a:a'の解離定数の20倍またはそれ以上である。1つの態様において、解離定数は対a:a'内での解離定数の50倍またはそれ以上である。1つの態様において、相反性(交差反応性)結合の解離定数は結合対内での解離定数の100倍またはそれ以上である。
1つの態様において、結合対のメンバーは、ロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイジング核酸配列からなる群より選択される。1つの態様において、両方の結合対がロイシンジッパードメイン二量体である。
1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジング核酸配列である。1つの態様において、全ての結合対のメンバーがL-DNA配列である。1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジングL-DNAである。
1つの態様において、結合対の両メンバーがロイシンジッパードメインに相当する。
「ロイシンジッパードメイン」という用語は、およそ35残基のストレッチにおける7残基ごとのロイシン残基の存在によって特徴付けられる二量体化ドメインを意味する。ロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは当初、いくつかのDNA結合タンパク質において特定された(Landschulz, W.H., et al., Science 240 (1988) 1759-1764)。既知のロイシンジッパーのなかには、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびその誘導体がある。可溶性多量体タンパク質を産生するのに適したロイシンジッパードメインの例は、WO 94/10308に報告されているもの、およびHoppe, H.J., et al., FEBS Lett. 344 (1994) 191-195に報告されている肺サーファクタントタンパク質D (SPD)に由来するロイシンジッパーである。
ロイシンジッパードメインは、α-ヘリックスコイルドコイルによって結び付けられた二量体(結合対)を形成する。コイルドコイルは1回転あたり3.5残基を有し、これは、7残基ごとにヘリックス軸に対して等価な位置を占めることを意味する。コイルドコイル内部のロイシンの規則的配列構造が、疎水性相互作用およびファンデルワールス相互作用により構造を安定化する。
ロイシンジッパードメインが第1の結合対および第2の結合対を形成するなら、両方のロイシンジッパー配列は異なり、すなわち第1の結合対のメンバーは第2の結合対のメンバーに結合しない。ロイシンジッパードメインは、転写因子などの、そのようなドメインを含むことが知られている天然タンパク質から単離されうる。1つのロイシンジッパードメインは、例えば、転写因子fosに由来し、2つ目のものは転写因子junに由来しうる。ロイシンジッパードメインは、当技術分野において公知の合成および設計のための標準的な技法を用いて、設計され、人工的に合成されてもよい。
1つの態様において、両方の結合対がハイブリダイジング核酸配列である。
したがって、各結合対のメンバー、すなわちaとa'ならびにbとb'は、それぞれ、互いにハイブリダイズする。一方の第1の結合対に含まれる核酸配列と、他方の第2の結合対に含まれる核酸配列とは異なり、すなわち互いにハイブリダイズしない。
1つの態様において、結合対は両方ともにハイブリダイジング核酸対であり、ここで異なる結合対のハイブリダイジング核酸配列は互いにハイブリダイズしない。
他の言い方をすると、第1の結合対の核酸同士は互いにハイブリダイズするが、しかし第2の結合対の核酸のいずれにも結合せず、または第2の結合対の核酸同士のハイブリダイゼーションに干渉せず、逆の場合も同じである。ハイブリダイゼーション動態およびハイブリダイゼーション特異性は融点分析によって容易にモニタリングすることができる。当該結合対に対する融解温度が、任意の可能な他の結合対との組み合わせまたは他の結合対メンバー同士の組み合わせと比べて少なくとも20℃高ければ、当該結合対の特異的ハイブリダイゼーションおよび干渉のないことが認められる。
結合対を形成する核酸配列は、原理上は、任意の天然に存在する核酸塩基またはそれに対する類似体を含んでよく、原理上は、上記のように修飾骨格または非修飾骨格を有してよいが、ただし複数の塩基対合によって安定な二重鎖を形成できることを条件とする。安定なとは、二重鎖の融解温度が30℃よりも高い、とりわけ37℃よりも高いことを意味する。
二本鎖は1つの態様において、2つの完全に相補的な一本鎖ポリヌクレオチドからなる。
しかしながら、37℃での安定性が与えられる限り、ミスマッチまたは挿入が可能である。
核酸二重鎖は鎖間架橋結合によってさらに安定化することができる。いくつかの適切な架橋結合法、例えばソラレンによるまたはチオヌクレオシドに基づく方法が知られている。
結合対のメンバーに相当する核酸配列は1つの態様において、12〜50ヌクレオチドからなる。1つの態様において、そのような核酸配列は15〜35ヌクレオチドからなる。
RNAseは遍在しているので、RNAに基づく結合対および/またはリンカー配列の望ましくない消化を回避するためには、特別な注意を払わなければならない。RNAに基づく結合対および/またはリンカーを使用できるが、DNAに基づく結合対および/またはリンカーがとりわけ適している。
適切なハイブリダイジング核酸配列は、3対以上の相反性の相補ポリヌクレオチドを提供するように容易に設計することができ、3つ以上の結合対の簡易な作製および使用を可能にすることができる。本明細書において報告される複合体においてハイブリダイジング核酸配列を用いることの別の利点は、修飾を容易に導入できるということである。例えば官能成分を含むポリヌクレオチドの簡易合成を可能にする、修飾された構成要素が市販されている。そのような官能成分は任意の所望の位置に、かつ第1および/もしくは第2の結合対のメンバーならびに/またはポリヌクレオチドリンカーのいずれかに容易に導入することができるが、ただしそれらは全て、ポリヌクレオチドに相当するということを条件とする。
末端に結合対のメンバーを含む(ポリヌクレオチド)リンカーを、提供することができ、単一のポリヌクレオチドとして合成することができる。標的に特異的に結合するポリペプチドを、ハイブリダイジング核酸配列、すなわち結合対のメンバーと、各々、カップリングさせることができる。(ポリヌクレオチド)リンカーの長さは、任意の所望の方法で容易に変化させることができる。
標的に特異的に結合するポリペプチドの生化学的性質に依り、結合対のメンバーへのコンジュゲーションのための異なる戦略がいつでも使える。ポリペプチドが天然に存在し、または組換えにより産生され、50〜500アミノ酸残基長である場合、当業者は、テキストブックに報告されている標準的な手順に容易にしたがうことができる(例えばHackenberger, C.P.R.、およびSchwarzer, D., Angew. Chem. Int. Ed. 47 (2008) 10030-10074を参照のこと)。
コンジュゲーションのための1つの態様において、ポリペプチド内のシステイン残基とのマレイニミド(maleinimido)成分の反応が用いられる。
これは、例えば抗体のFABまたはFAB'断片が一価結合ポリペプチドとして用いられる場合には、とりわけ適したカップリング化学反応である。
1つの態様において、ポリペプチドのC末端と結合対のメンバーとのカップリングが行われる。
タンパク質の、例えばFAB断片のC末端修飾を、例えば、記述(Sunbul, M. and Yin, J., Org. Biomol. Chem. 7 (2009) 3361-3371)のように行うことができる。
一般に、部位特異的な反応および一価結合ポリペプチドと結合対のメンバーとの共有結合的なカップリングは、ポリペプチドに存在する他の官能基の反応性と直交性である反応性を有するアミノ酸へと天然アミノ酸を変換することに基づく。
例えば、稀有な配列コンテクスト内の特定のシステインを、アルデヒドにて酵素的に変換することができる(例えばFrese, M-A. and Dierks, T., ChemBioChem 10 (2009) 425-427を参照のこと)。所与の配列コンテクストにおける天然アミノ酸を用いた特定の酵素の特異的な酵素反応性を利用することにより、所望のアミノ酸修飾を得ることも可能である(例えば: Taki, M., et al., Prot. Eng. Des. Sel. 17 (2004) 119-126、Gautier, A., et al., Chem. Biol. 15 (2008) 128-136; Bordusa, F., in Highlights in Bioorganic Chemistry (2004), Schmuck, C. and Wennemers, H., (eds.), Wiley VCH, Weinheim, pp. 389-403を参照のこと)。
部位特異的な反応および一価結合ポリペプチドと結合対のメンバーとの共有結合的なカップリングは、適切な修飾試薬との末端アミノ酸の選択的反応によって達成することもできる。
ベンゾニトリルとN末端システインとの反応性(Ren, H., et al., Angew. Chem. Int. Ed. 48 (2009) 9658-9662を参照のこと)を用いて、部位特異的な共有結合的カップリングを達成することができる。
天然型化学的ライゲーション法もC末端システイン残基に依存しうる(Taylor, E., et al., Nucl. Acids Mol. Biol. 22 (2009) 65-96)。
EP 1 074 563は、正電荷アミノ酸のストレッチに位置するシステインとの負電荷アミノ酸のストレッチ内のシステインの高速反応に基づくコンジュゲーション法について報告している。
エフェクター構成成分
エフェクター成分は、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、および反応性成分からなる群より選択することができる。2つ以上のエフェクター成分が複合体に存在するなら、各々のそのようなエフェクター成分はいずれの場合にも、独立して、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、または反応性成分でありうる。結合成分は、各結合対との干渉がないように選択される。
エフェクター成分は、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、および反応性成分からなる群より選択することができる。2つ以上のエフェクター成分が複合体に存在するなら、各々のそのようなエフェクター成分はいずれの場合にも、独立して、結合成分、標識成分、生物学的に活性な成分、または反応性成分でありうる。結合成分は、各結合対との干渉がないように選択される。
1つの態様において、エフェクター成分は、結合成分、標識成分、および生物学的に活性な成分からなる群より選択される。
1つの態様において、エフェクター成分は結合成分である。
結合成分の例は、互いに特異的に相互作用しうるバイオアフィン(bioaffine)結合対のメンバーである。適当なバイオアフィン結合対は、ハプテンまたは抗原と抗体; アミノビオチン、イミノビオチン、またはデスチオビオチンなどのビオチンまたはビオチン類似体とアビジンまたはストレプトアビジン; 糖とレクチン、ポリヌクレオチドと相補ポリヌクレオチド、受容体とリガンド、例えば、ステロイドホルモン受容体とステロイドホルモン; およびウシリボヌクレアーゼAの104個のアミノ酸(aa)の断片(S-タンパク質として公知)とウシリボヌクレアーゼAの15個のアミノ酸(aa)の断片(S-ペプチドとして公知)の対である。
1つの態様において、エフェクター成分は結合成分であり、複合体の構成成分の少なくとも1つに共有結合されている。
1つの態様において、バイオアフィン結合対のより小さいパートナー、例えばビオチンもしくはそれに対する類似体、受容体リガンド、ハプテンまたはポリヌクレオチドは、本明細書において報告される複合体に含まれるポリヌクレオチドの少なくとも1つに共有結合されている。
1つの態様において、エフェクター成分は、ハプテン、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチンまたはビオチン類似体; ポリヌクレオチドおよびステロイドホルモンから選択される結合成分である。
1つの態様において、エフェクター成分は標識基である。
標識基は任意の公知の検出可能な基から選択することができる。
1つの態様において、標識基は、化学発光基などの発光標識基のような色素、例えばアクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびその誘導体、ルテニウム錯体もしくはユーロピウム錯体などの発光金属錯体、CEDIA (クローン化酵素ドナー免疫アッセイ法(Cloned Enzyme Donor Immunoassay)、例えばEP 0 061 888)に用いられるような酵素、ミクロ粒子もしくはナノ粒子、例えばラテックス粒子または金属ゾル、ならびに放射性同位体から選択される。
1つの態様において、標識基は発光金属錯体であり、該化合物は一般式(I)の構造を有する:
[M(L1L2L3)]n - Y - XmA (I)
式中、Mは、希土類金属イオンまたは遷移金属イオンから選択される二価または三価の金属陽イオンであり、L1、L2およびL3は、同じまたは異なるものであり、かつ窒素原子を介してL1、L2およびL3が金属陽イオンと結合している少なくとも2つの窒素含有複素環を有する配位子を意味し、Xは、リンカーYを介して配位子L1、L2およびL3の少なくとも1つに共有結合された反応性官能基であり、nは1〜10、とりわけ1〜4の整数であり、mは1または2、とりわけ1であり、Aは電荷を一様にするために必要とされうる対イオンを意味する。
[M(L1L2L3)]n - Y - XmA (I)
式中、Mは、希土類金属イオンまたは遷移金属イオンから選択される二価または三価の金属陽イオンであり、L1、L2およびL3は、同じまたは異なるものであり、かつ窒素原子を介してL1、L2およびL3が金属陽イオンと結合している少なくとも2つの窒素含有複素環を有する配位子を意味し、Xは、リンカーYを介して配位子L1、L2およびL3の少なくとも1つに共有結合された反応性官能基であり、nは1〜10、とりわけ1〜4の整数であり、mは1または2、とりわけ1であり、Aは電荷を一様にするために必要とされうる対イオンを意味する。
金属錯体は1つの態様において、発光金属錯体、すなわち適切な励起後に検出可能な発光反応を起こす金属錯体である。
発光反応は、例えば、蛍光測定により、または電気化学発光測定により検出することができる。この錯体における金属陽イオンは、例えば、遷移金属または希土類金属である。
金属は1つの態様において、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウム、イリジウム、レニウム、クロムおよびオスミウムがとりわけ適している。ルテニウムが最も適している。
本明細書において報告される複合体中の標識成分として金ナノロッド(GNR)を用いることもできる。ナノロッドは、10 nm〜100 nmの、 10 nmと100 nmを含めた、およびその間の全ての整数を含めた長さを有することができる。
1つの態様において、GNRは70〜75 nmの平均長を有する。
GNRは、5 nm〜45 nm の、5 nmと45 nmを含めた、およびその間の全ての整数を含めた直径を有することができる。
1つの態様において、GNRは25〜30 nmの平均直径を有する。GNRは純金であり得、または90%〜99%の、90%と99%を含み、その間の全ての整数を含めた、純金でありうる。
さまざまな態様において、GNRはその表面に最大で1%の銀を含んでよく、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)を含んでよい。
この関連で、GNRは任意の適当な方法によって作製することができる。例えば、溶液中での電気化学合成、膜テンプレート法、光化学的合成、マイクロ波合成、および種結晶媒介成長は全て、GNRを作製する方法の適当かつ非限定的な例である。
1つの態様において、金ナノロッドは、臭化セチルトリメチルアンモニウム(CTAB)中での種結晶媒介成長法を用いて作製される。
金ナノロッドおよびRNAポリヌクレオチドの複合体を形成するために、GNRをDNAまたはRNAポリヌクレオチドと静電的に複合体形成させるのに適した正のゼータ電位を与えるよう金ナノロッドの表面を官能化することができる。金ナノロッドに対して正のゼータ電位を生み出す任意の適当な方法が用いられてもよい。例えば、金ナノロッドの表面をチオール化-PEG-NH2またはチオール化-PEG-COOHのような、二官能性分子で官能化することができる。
1つの態様において、表面官能化は、CTABによりコーティングされた金ナノロッドを、最初に陰イオン性ポリ電解質のポリ(3,4-エチレンジオキシチ-6-フェン(3,4-ethylenedioxythi-6-phene))/ポリ(スチレンスルフェート) (PEDT/PSS)でコーティングし、その次に陽イオン性ポリ電解質のポリ(ジアリルジメチルアンモニウムクロリド) (PDDAC)でコーティングすることにより達成される。
この結果、陽イオン性の表面電荷(正のゼータ電位)を有する金ナノロッドを生じ、また、CTAB層をマスクする(例えば、Ding, H., et al., J. Phys. Chem. C 111 (2007) 12552-12557を参照のこと)。
正電荷を持つ金ナノロッドは、静電相互作用を用いてDNAポリヌクレオチドと静電的に複合体形成される。
ナノ粒子複合体(nanoplexes)の形成は、金ナノロッドの、局在化した縦プラズモン共鳴ピークの赤方偏移の観測から、およびゲル電気泳動を用いたナノ粒子複合体の、制限された電気泳動移動度から確認することができる。
1つの態様において、エフェクター成分Xは治療的に活性な物質である。
治療的に活性な物質は、例えばがんの阻害、アルキル化による、架橋結合による、またはDNAの二本鎖切断によるDNA鋳型の損傷において有効な、様々な方法を有する。他の治療的に活性な物質はインターカレーションによりRNA合成をブロックすることができる。作用物質のなかには、ビンカアルカロイドのような、紡錘体毒、または酵素活性を阻害する代謝拮抗物質、またはホルモン剤および抗ホルモン剤がある。エフェクター成分は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、ニトロソ尿素、ホルモン剤および抗ホルモン剤、ならびに毒素から選択されうる。
適したアルキル化剤はシクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、またはナイトロジェンマスタードである。
適した代謝拮抗物質はメトトレキサート、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、6-チオグアニン、6-メルカプトプリンである。
適した抗腫瘍抗生物質はドキソルビシン、ダウノルビシン、イドルビシン(idorubicin)、ニミトキサントロン(nimitoxantron)、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、およびプリカマイシンである。
適した紡錘体毒はメイタンシンおよびメイタンシノイドであり、ビンカアルカロイドおよびエピポドフィロトキシンはビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデスチン、エトポシド、テニポシドによって例示されうる。
さらに、適したタキサン剤はパクリタキセル、ドセタキセル、SB-T-1214によって例示されうる。
適したニトロソ尿素はカルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシンである。
適したホルモン剤および抗ホルモン剤は、アドレノコルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン、抗アンドロゲンである。
適したランダム合成薬剤はデカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ミトタン、プロカルバジド、シスプラチン、カルボプラチンである。
適した単球走化因子はf-Met-Leu-Phe (fMLP)、f-Met-Leu-Phe-o-メチルエステル、ホルミル-ノルロイシル-フェニルアラニン、ホルミル-メチオニル-フェニルアラニンである。
適したNK細胞誘引因子はIL-12、IL-15、IL-18、IL-2、およびCCL5、抗体のFC部分である。
エフェクター成分は、複合体の構成成分の少なくとも1つに共有結合的にまたはさらなる結合対を介して結合されうる。エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体中に1倍から数(n)倍含まれ得、ここで(n)は整数であり、0または1もしくは2以上である。1つの態様において、(n)は1〜1,000,000である。1つの態様において、(n)は1,000〜300,000である。1つの態様において、(n)は1〜50である。1つの態様において、(n)は1〜10、または1〜5である。1つの態様において、(n)は1または2である。
複合体中の構成成分の少なくとも1つへのエフェクター成分の共有結合のために、任意の適切なカップリング化学反応を用いることができる。第1および/もしくは第2の結合対のメンバーならびに/または(ポリヌクレオチド)リンカーを合成するときに、とりわけポリペプチドまたは(ポリヌクレオチド)リンカーとコンジュゲートされる結合対のメンバーに、適切な構成要素の使用によって官能成分を組み入れることも可能である。
実質的に(またはほとんど)非免疫原性である連結をもたらすコンジュゲーション方法が、とりわけ適している。それゆえ、ペプチド- (すなわちアミド-)、スルフィド-、(立体的に障害された)、ジスルフィド-、ヒドラゾン-、または他の連結がとりわけ適している。これらの連結は、ほとんど非免疫原性であり、血清内で妥当な安定性を示す(例えば、Senter, P.D., Curr. Opin. Chem. Biol. 13 (2009) 235-244; WO 2009/059278; WO 95/17886を参照のこと)。
1つの態様において、エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体の(ポリヌクレオチド)リンカーに結合される。
1つの態様において、エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体のポリペプチドまたは(ポリヌクレオチド)リンカーとコンジュゲートされた結合対のメンバーに共有結合される。
エフェクター成分が、ハイブリダイジングポリヌクレオチド内に位置するなら、それを修飾ヌクレオチドに結合させることがとりわけ適しており、またはヌクレオシド間P原子に付着される(例えばWO 2007/059816を参照のこと)。
二官能性構成要素(上記の)を用いて、伸長中のポリヌクレオチド鎖の末端ヒドロキシル基へと構成要素を5'末端で(正規合成)または3'末端で(反転合成)付着させるためのホスホラミダイト基に、エフェクター成分または、必要なら、保護されたエフェクター成分を接続することができる。
三官能性構成要素(上記の)を用いて、
(i) エフェクター成分または、必要なら、保護されたエフェクター成分、
(ii) 伸長中のポリヌクレオチド鎖の末端ヒドロキシル基へとポリヌクレオチド合成中にレポーターまたはエフェクター成分もしくは、必要なら、保護されたエフェクター成分をカップリングさせるためのホスホラミダイト基、および
(iii) 酸に不安定な保護基で、とりわけジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基
を接続することができる。この酸に不安定な保護基の除去後、ヒドロキシル基が遊離し、これはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。
(i) エフェクター成分または、必要なら、保護されたエフェクター成分、
(ii) 伸長中のポリヌクレオチド鎖の末端ヒドロキシル基へとポリヌクレオチド合成中にレポーターまたはエフェクター成分もしくは、必要なら、保護されたエフェクター成分をカップリングさせるためのホスホラミダイト基、および
(iii) 酸に不安定な保護基で、とりわけジメトキシトリチル保護基で保護されているヒドロキシル基
を接続することができる。この酸に不安定な保護基の除去後、ヒドロキシル基が遊離し、これはさらなるホスホラミダイトと反応することができる。
エフェクター成分は1つの態様において、第1および/もしくは第2の結合対のメンバーの少なくとも1つに、またはポリヌクレオチドリンカーに、さらなる第3の結合対を介して結合される。1つの態様において、第3の結合対は、ハイブリダイジング核酸配列の対である。第3の結合対のメンバーは、他の結合対のメンバーが互いに行う結合に干渉しない。
エフェクター成分が結合されうるさらなる結合対は、とりわけロイシンジッパードメインまたはハイブリダイジング核酸である。エフェクター成分が、第1および/もしくは第2の結合対のメンバーの少なくとも1つに、または(ポリヌクレオチド)リンカーに、さらなる結合対メンバーを介して結合される場合には、エフェクター成分が結合している結合対メンバー、ならびに第1および第2の結合対のメンバーは、それぞれ、全てが異なる特異性を有するように選択される。第1および第2の結合対ならびにエフェクター成分が結合している結合対のメンバーは各々、他の結合対のいずれの結合にも干渉せずに、その各パートナーに結合する(例えばハイブリダイズする)。
1つの態様において、結合対および/または(ポリヌクレオチド)リンカーの相補的核酸は、少なくとも部分的に、L-DNA、もしくはL-RNA、もしくはLNA、もしくはイソ-C核酸、もしくはイソ-G核酸、またはその任意の組み合わせで作製される。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーは少なくとも50%のL-DNA、もしくはL-RNA、もしくはLNA、もしくはイソ-C核酸、もしくはイソ-G核酸、またはその任意の組み合わせで作製される。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーはL-ポリヌクレオチド(シュピーゲルマー)である。1つの態様において、L-ポリヌクレオチドはL-DNAである。
1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーはDNAである。1つの態様において、(ポリヌクレオチド)リンカーはβ-L-DNAもしくはL-DNAとしても公知のDNAのL-立体異性体または鏡像DNAである。
この立体異性DNAは、L-DNAの2つの相補的一本鎖の間でのみ二重鎖が形成されるが、しかしL-DNAの一本鎖と相補的D-DNA鎖との間では二重鎖が形成されないことを意味する、直交ハイブリダイゼーション挙動、ヌクレアーゼ耐性および長いリンカーの合成さえも容易なことなどの利点を特徴とする。合成の容易さおよびスペーサーの長さの可変性は、リンカーライブラリーを提供するために重要である。可変長の(ポリヌクレオチド)リンカーは、最適な長さのポリヌクレオチドリンカーを有した本明細書において報告される複合体を特定するうえで有用であり、したがって、標的に特異的に結合する2つのポリペプチド間の最適な距離を提供する。
1つの態様において、複合体は非共有結合複合体である。1つの態様において、非共有結合複合体は結合対によって形成される。
いくつかの態様において、エフェクター成分は治療薬である。
例えば、エフェクター成分は治療用放射性核種、ホルモン、サイトカイン、インターフェロン、抗体もしくは抗体断片、核酸アプタマー、酵素、ポリペプチド、毒素、細胞毒素、化学療法剤、または放射線増感剤でありうる。
本明細書において報告される1つの局面は、本明細書において報告される複合体を用いる方法である。
例えば、本明細書において報告される複合体が、細胞を殺処理するのに十分な量で細胞に投与される、細胞を殺処理する方法が本明細書において報告される。
1つの態様において、細胞はがん細胞である。
本明細書において報告される複合体が、がん細胞の成長を遅延または停止させるのに十分な量で哺乳類に投与される、哺乳類においてがん細胞の成長を遅延または停止させる方法も本明細書において報告される。
1つの態様において、本方法は、がん細胞の成長または増殖を阻害するための方法である。
1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチドは、細胞の細胞表面分子に特異的に結合する。1つの態様において、細胞表面分子はがん細胞上に特異的に存在する。
1つの態様において、標的に特異的に結合する第1および第2のポリペプチドは互いに独立して、抗体、抗体断片、一本鎖可変領域抗体、小ペプチド分子、環状ポリペプチド、ペプチド模倣体、およびアプタマーからなる群より選択される。
1つの態様において、標的に特異的に結合する第1および第2のポリペプチドは、一価結合ポリペプチドである。
1つの態様において、ポリペプチドが特異的に結合する細胞表面分子は、plgR、plgR stalk、アポリポタンパク質(例えば、アポリポタンパク質A1、A2、A3、A4、A5、B、C1、C2、C3、C4、D、および/またはE)、サイトカイン受容体、Toll受容体またはToll様受容体、受容体チロシンキナーゼ、スカベンジャー受容体、GPI連結タンパク質、糖脂質、スフィンゴ糖脂質、セラミド、セレブロシド、トランスフェリン受容体、トランスフェリン受容体に結合したトランスフェリン、トランスフェリン受容体に結合したアポトランスフェリン、ビタミンB12受容体、FcRn、PGDFおよびVEGF受容体ファミリーのメンバー(例えば、Fit-1、Flk-1、Flt-4)、アクアポリン、高密度リポタンパク質結合タンパク質(例えば、ATP結合カセットタンパク質-1、スカベンジャー受容体-BI)、カドヘリン(例えば、E-カドヘリン、N-カドヘリン、P-カドヘリン、R-カドヘリン、K-カドヘリン、および/またはOB-カドヘリン)、ならびに低密度リポタンパク質受容体からなる群より選択される。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの標的は、白血球マーカーCD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD11a、b、c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD44、CD45およびアイソフォーム、CDw52 (Campath抗原)、CD56、CD58、CD69、CD72、CTLA-4、LFA-1、TCR、her2-neu、ムチン、CEAおよびエンドシアリンCMV糖タンパク質B、H、およびgCIII、HIV-1外被糖タンパク質、RSV外被糖タンパク質、HSV外被糖タンパク質、HPV外被糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原を含む群より選択される。細胞へのエフェクター成分の効率的な、標的化された送達を達成するために、直接、細胞の表面上の標的に特異的に結合するポリペプチドを用いることができる。
1つの態様において、ポリペプチドは抗体断片である。1つの態様において、抗体断片は、細胞表面分子に特異的に結合する内在化抗体に由来する。
本明細書において報告される複合体とエフェクター成分とのコンジュゲーションは、細胞上の所望の部位でのエフェクター成分の特異的な局在化を可能にする。局在化は標的細胞上のエフェクター成分の有効濃度を増大し、それによってエフェクター成分の効果を最適化する。さらに、複合体は非標的化エフェクター成分と比べて低い用量で投与することができる。これは、エフェクター成分が付随した毒性を有する場合、または慢性疾患の処置において用いられる場合、特に関連しうる。
L-DNAは、本明細書において報告される複合体の形成において有用なヌクレオチドである。L-DNAは、それ自体、天然に存在する形態のDNA (D-DNA)またはRNAとハイブリダイズしない。L-DNAは多くの酵素の天然基質ではないため、インビボでのL-DNAの安定性はD-DNA安定性よりも高くなりうる。L-DNA二重鎖はD-DNAと溶解性、二重鎖安定性および選択性という点で同じ物理的特性を有するが、しかし左らせん状の二重らせんを形成する。本明細書において用いられるL-ポリヌクレオチドは、若干のD-ポリヌクレオチドを含んでもよいものと理解されるべきである。
L-ポリヌクレオチドの化学的性質のために、L-ポリヌクレオチドの使用の根底にある薬物動態が、DNA特異的な分解過程の影響を受ける程度にまではならず、または少なくともその影響を受ける程度にまではならず、その程度にまでL-ポリヌクレオチドが代謝されることはない。L-ポリヌクレオチドの安定性の増大を考えると、哺乳類での本明細書において報告される複合体のインビボ半減期は、かくして、事実上、無制限である。特に重要なのは、L-ポリヌクレオチドが腎毒性ではないという事実である。
1つの態様において、哺乳類はヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、またはマウスから選択される。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーはD-DNAおよびL-DNAヌクレオチドを含み、すなわちポリヌクレオチドリンカーはD-DNAおよびL-DNAの混合物である。
このリンカーを用いて、ポリヌクレオチドリンカーの半減期を操作することが可能であり、すなわち、オリゴヌクレオチドリンカーのインビボ半減期を複合体の対象用途に対して個別化かつ調整することができる。
本明細書において報告される複合体に存在するポリヌクレオチドの各々が、1つまたは複数のエフェクター成分を含むことができる。エフェクター成分は疾患の処置での本明細書において報告される複合体の使用を可能にする。エフェクター成分は、例えば担体の目的のために、すなわちエフェクター機能の送達のために、および/または薬物動態的挙動の調節のために、および/または物理化学的特性の調節のために用いることができる。
1つの態様において、エフェクター成分は親油性成分、ペプチド、タンパク質、炭水化物およびリポソームから選択される。
1つの態様において、ポリヌクレオチドはL-ポリヌクレオチドである。
L-ポリ(デオキシ)ヌクレオチドは、一本鎖ポリヌクレオチドとしてまたは二本鎖ポリヌクレオチドとして存在することができる。典型的には、L-ポリ(デオキシ)ヌクレオチドは、(規定された)二次構造、およびまた、三次構造を形成しうる一本鎖核酸として存在する。そのような二次構造には、また、二本鎖ストレッチが存在することもある。しかしながら、L-ポリ(デオキシ)ヌクレオチドは、互いに相補的である2つの鎖がハイブリダイズされるという意味で少なくとも部分的に二本鎖分子として存在することもできる。L-ポリヌクレオチドは修飾されてもよい。修飾はポリヌクレオチドの個々のヌクレオチドに関連しうる。
二次構造の形成を回避するために、1つの態様において核酸塩基として2,4-ジヒドロキシ-5-メチルピリミジン(T)を用いることができる。
本明細書において報告される複合体中のL-ポリヌクレオチドは1つの態様において、「自己ハイブリダイゼーション」を起こしやすい。
したがって、L-ポリヌクレオチドは相補的L-ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることがさらに容易に可能であるが、しかし天然DNAまたはRNAとは安定な二重鎖を形成しない。
1つの態様において、L-DNAセグメントにおけるヌクレオチドは1'S、3'R、および4'Sの高次構造を有する。
1つの態様において、L-DNAポリヌクレオチドリンカーは、その末端の結合対のメンバーと複合体のポリペプチドとのハイブリダイゼーションによって、コンジュゲートされる。
1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも1 nmの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、6 nm〜100 nmの長さを有する。1つの態様において、ポリヌクレオチドリンカーは、少なくとも70ヌクレオチドの長さを有する。
ポリヌクレオチドリンカーはタグ配列を含んでもよい。タグ配列は
のような一般的に用いられるタンパク質認識タグから選択されうる。
かくして、本明細書において報告される方法の1つの態様において、エフェクター成分を含まない本明細書において報告される複合体を最初に投与し、その標的に結合させ、その後、(ポリヌクレオチド)リンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートされたエフェクター成分を投与する。それによって、エフェクター成分はインサイチューで、本明細書において報告される複合体とハイブリダイズすることによりその標的に結合された複合体と共に位置付けられる。
本明細書において報告される複合体が、いずれかの特定の核酸配列に、もしくは標的に特異的に結合するいずれかのポリペプチドに、または特定の細胞種に、もしくは特定の条件に、もしくは特定の方法などに限定されず、したがって変わることもあり、その中の多数の修飾および変形が当業者には明らかなことが理解されるべきである。
本明細書において報告される方法の1つの態様において、複合体は腫瘍細胞の細胞表面に結合し、高い密度または高い局所濃度のエフェクター成分にまで局所的に濃縮する。
1つの態様において、エフェクター成分は標識されたss-L-DNAであり、これは複合体の初期標的会合と同時にまたは複合体の初期標的結合に続いて投与される。
標識されたss-L-DNAエフェクター成分は、複合体のss-L-DNA (オリゴヌクレオチド)リンカーとハイブリダイズする。
標的結合複合体を用いて、先天性免疫反応を活性化する、すなわち、ナチュラルキラー細胞(NK細胞)とも呼ばれる、細胞傷害性リンパ球を誘引する。NK細胞は腫瘍およびウイルスに感染した細胞の拒絶において主要な役割を果たす。それらは、アポトーシスによって標的細胞を死滅させるグランザイムおよびパーフォリンと呼ばれるタンパク質の細胞質小顆粒を放出させることにより細胞を殺処理する。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体を用いて、結合した複合体のすぐ近くにNK細胞を誘引する。1つの態様において、サイトカインとコンジュゲートされたss-L-DNAをエフェクター成分として用いる。
このサイトカイン標識エフェクター成分を用いて、NK細胞を誘引することができる。NK活性化に関わるサイトカインには、IL-12、IL-15、IL-18、IL-2、およびCCL5が含まれる。
1つの態様において、抗体のFc部分とコンジュゲートされたss-L-DNAをエフェクター成分として用いる。
NK細胞は、マクロファージおよびいくつかの他の細胞種とともに、Fc受容体(FcR)分子(FC-γ-RIII = CD16)、つまり抗体のFc部分に結合する活性化生化学的受容体を発現する。これは、NK細胞を、液性反応が動員された細胞に標的指向させ、NK細胞に、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を通じて細胞を溶解させる。
1つの態様において、1つもしくは複数のFc部分とコンジュゲートされたss-L-DNAの1つもしくは複数または組み合わせをエフェクター成分として用いる。
この態様において、複合体を用いて、ADCCおよび/または補体活性化(CDC)を調節することができる。
1つの態様において、遺伝子操作されたFc区画を、ADCCおよびCDCに関与するその効力についてスクリーニングする方法において、この複合体を用いる。
1つの態様において、複合体を用いて、精液ホスファターゼを阻害する。
この態様において、複合体を用いて、NK細胞不活化を回避することができる。
1つの態様において、細胞表面分子に特異的に結合する抗体または抗体断片のような、標的に特異的に結合するポリペプチドは、標的受容体のリガンドまたは標的を提示している細胞への複合体の取り込みを増大するために細胞のエンドサイトーシス機構によっていっそう容易に取り込まれる大分子とコンジュゲートされる。
標的に結合した複合体はその後、エンドサイトーシスにより内在化され、エフェクター成分が細胞の内部で放出されうる。
標的に特異的に結合するポリペプチドは1つの態様において、抗体断片である。
「一本鎖可変領域断片」または「scFv」という用語は、軽鎖および重鎖の部分が抗原結合部位を形成することを可能とするのに十分な長さを有する共有結合によってともに連結された単一の抗体軽鎖および単一の抗体重鎖の可変の、抗原結合領域を意味する。そのようなリンカーは共有結合と同じくらい短くてもよい。とりわけ適したリンカーは、2〜50アミノ酸残基、およびとりわけ5〜25アミノ酸残基を含む。
他の抗体断片はHolliger, P.ら(PNAS (USA) 90 (1993) 6444-6448))によって最初に記述されたダイアボディである。これらは、抗体の重鎖および軽鎖を用いて、ならびに抗体の個々のCDR領域を用いることによって構築されうる。典型的には、ダイアボディは、短すぎて同じ鎖上の2つのドメイン間での対合を可能としえないリンカーによって軽鎖可変ドメイン(VL)に接続された重鎖可変ドメイン(VH)を含む。したがって、1つの断片のVHおよびVLドメインを別の断片の相補的VHおよびVLドメインと対合させ、それにより2つの抗原結合部位を形成させる。トリアボディを3つの抗原結合部位で同様に構築することができる。
Fv抗体断片は、非共有結合性相互作用によって結び付けられたVLドメインおよびVHドメインを含んだ完全な抗原結合部位を含む。Fv断片はまた、VHおよびVLドメインがグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド結合、または他のリンカーを通じて架橋されている構築体を含む。重鎖および軽鎖の可変ドメインをともに融合させて、親抗体のもともとの特異性を保持している一本鎖可変断片(scFv)を形成させることができる。Gruber, M., et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374によって最初に記述された一本鎖Fv (scFv)二量体は、抗体の重鎖および軽鎖を用いて、ならびに抗体の個々のCDR領域を用いることによって構築されうる。当技術分野において公知の多くの技法を用いて、本明細書において報告される複合体において適した特異的な結合性構築体を調製することができる(例えば、US 2007/0196274、US 2005/0163782を参照のこと)。
二重特異性抗体は、化学的架橋結合によりまたはハイブリッドハイブリドーマ技術により作製することができる。あるいは、二重特異性抗体分子は、組換え技法によって産生することもできる。二量体化は、VHおよびVLドメインをつなぎ合わせるリンカーの長さを、scFv断片の産生のために日常的に用いられる約15アミノ酸から、約5アミノ酸にまで減らすことによって促進されうる。これらのリンカーはVHおよびVLドメインの鎖内アセンブリに有利に働く。適当な短いリンカーはSGGGS (SEQ ID NO: 66)であるが、しかし他のリンカーを用いることができる。かくして、2つの断片が二量体分子へアセンブルする。リンカーの長さを0〜2アミノ酸残基にまでさらに減らすことにより、三量体(トリアボディ)または四量体(テトラボディ)分子を作製することができる。
1つの態様において、標的に特異的に結合するポリペプチド、例えば細胞表面受容体に特異的に結合する抗体を、標的受容体のリガンドまたは細胞のエンドサイトーシス機構によっていっそう容易に取り込まれる大分子に連結させることができる。
この態様において、複合体を用いて、標的を提示している細胞への複合体の取り込みを増大させることができる。標的に結合した複合体はその後、エンドサイトーシスにより内在化され、エンドサイトーシス小胞がリソソームと融合する際に、エフェクター成分が酸加水分解または酵素活性により放出されうる。
本明細書において報告される複合体を用いて、エフェクター成分を細胞内におよび細胞外に送達することができる。複合体を用いて、がん細胞をインサイチューで認識し、それらを、標的化治療用物質の開発に向けた魅力的な候補にすることができる。
構成成分と別の構成成分との(または粒子もしくはカプセルとの)非共有結合が望ましい場合、利用されうる適切な結合性相互作用は、抗体-抗原、受容体-ホルモン、アビジン-ビオチン対、ストレプトアビジン-ビオチン、金属-キレート、小分子/ポリヌクレオチド(例えば、Dervan, P.B., Bioorg. Med. Chem. 9 (2001) 2215-2235; Zahn, Z.Y. and Dervan, P.B., Bioorg. Med. Chem. 8 (2000) 2467-2474を参照のこと); ポリヌクレオチド/相補的ポリヌクレオチド(例えば、二量体および三量体ヘリックス)、アプタマー/小分子、アプタマー/ポリペプチド、コイルドコイル、ならびにポリヌクレオチド/ポリペプチド(例えばDNA配列に結合する亜鉛フィンガー、ヘリックスターン(tum)ヘリックス、ロイシンジッパーおよびヘリックスループヘリックスモチーフ)を含むが、これらに限定されることはない。
本明細書において報告される複合体を用いて、治療薬、放射線を放出する構成成分、植物、真菌または細菌由来の分子、生体タンパク質、およびその混合物を含む細胞毒性薬のような種々のエフェクター成分を細胞に送達することができる。例えば、細胞毒性薬は、例えば、短距離、高エネルギーのα放射体を含め、短距離の放射線放射体のような、細胞内で作用する細胞毒性薬でありうる。
1つの態様において、エフェクター成分は、薬物(例えば、アブラキサン、ドキソルビシン、パミドロン酸二ナトリウム、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール タモキシフェン、パクリタキセル、デセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、ゾレドロン酸、ビンブラスチンなどのような抗がん薬)を封入しているリポソーム、免疫系の構成成分による結合細胞の認識を刺激する抗原、免疫系の構成成分に特異的に結合し、かつそれらを細胞へ向かわせる抗体などである。
1つの態様において、エフェクター成分は、細胞に及ぼす電離放射線(例えば60CoまたはX線源によって生み出されうるような)の細胞傷害効果を増強する放射線増感剤を含むことができる。
1つの態様において、エフェクター成分は単球走化因子、もしくはf-Met-Leu-Phe (fMLP)、もしくはf-Met-Leu-Phe-o-メチルエステル、もしくはホルミル-ノルロイシル-フェニルアラニン、もしくはホルミル-メチオニル-フェニルアラニン、またはその誘導体から選択される。
1つの態様において、エフェクター成分は反応基である。
反応基はアミノ、スルフヒドリル、カルボキシレート、ヒドロキシル、アジド、アルキニルまたはアルケニルのような、任意の公知の反応基から選択することができる。
1つの態様において、反応基はマレイニミド、スクシンイミジル、ジチオピリジル、ニトロフェニルエステル、ヘキサフルオロフェニルエステルから選択される。
作用機序がエフェクター成分としてのfMLPの場合のようなエフェクターの高い局所濃度を標的に対して作ることに依るなら、リンカー実体のL-DNAの性質は、同じまたは異なるエフェクター成分で修飾された第2のL-DNAオリゴヌクレオチドとの特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。
第2のL-DNAに結合されるエフェクター成分の数は、単一のエフェクター修飾L-DNAによって誘導される反応がないため、限定される必要がある。望ましいなら、第2のL-DNAは、同じまたは異なるエフェクター成分で修飾された第3のL-DNAオリゴヌクレオチドと特異的にハイブリダイズできるさらなる部位を含む。ある二重鎖を他の二重鎖の存在下において特異的に形成する多くの異なる配列を選択することは容易であるので、多量体複合体は容易に構築されうる。
多量体複合体は、重複配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて直鎖状の多量体複合体を形成させることにより、または分岐したオリゴヌクレオチドを用いることにより構築することができ、ここで分岐は、樹枝状の多量体複合体の形成をもたらす第3のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能である。
1つの態様において、エフェクター成分はα放射体、すなわち、α粒子を放射する放射性同位体である。適当なα放射体はBi、213Bi、211Atなどを含むが、これらに限定されることはない。
エフェクター成分はリガンド、エピトープタグ、または抗体を含むこともできる。
酵素的に活性な毒素およびその断片は、ジフテリア毒素A断片、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A (緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サクリン(sacrin)、特定のシナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、特定のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca americana)タンパク質(PAP、PAPIIおよびPAP-S)、ニガウリ(Morodica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(Saponaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、ならびにエノマイシンから選択することができる。
1つの態様において、高密度のケージ化エフェクター成分で修飾された1つまたは複数のL-DNAオリゴヌクレオチドが、L-DNAリンカーとハイブリダイズされる。
がん細胞はさまざまな形で正常細胞とは異なり、そのうちの1つが細胞表面の分子組成である。表面の化学的性質の変化により、がん細胞は、成長および生存の外部シグナルに効率的に反応することが可能になり、種々の宿主組織要素と直接相互作用して、移動し、血液循環に侵入し、浸出し、遠隔部位に定着することが可能になる。悪性細胞のマーカーとして働くことに加えて、腫瘍細胞表面分子は、血流または細胞外空間に投与された標的指向分子に対するその相対的に容易な接近可能性のため、治療に有益な標的である(Feng, A., et al., Mol. Cancer Ther. 7 (2008) 569-578)。
企図される腫瘍特異抗原は、CEA、CD20、HER1、HER2/neu、HER3、HER4、PSCA、PSMA、CA-125、CA-19-9、c-Met、MUC1、RCAS1、Ep-CAM、Melan-A/MART1、RHA-MM、VEGF、EGFR、インテグリン、フィブロネクチンのED-B、ChL6、Lym-1、CD1b、CD3、CD5、CD14、CD20、CD22、CD33、CD52、CD56、TAO-72、インターロイキン-2受容体(IL-2R)、フェリチン、神経細胞接着分子(NCAM)、黒色腫関連抗原、ガングリオシドGm、EOF受容体、テネイシン、c-Met (HGFR)を含むが、これらに限定されることはない。
1つの態様において、抗体は、細胞表面受容体上の翻訳後修飾された標的に特異的に結合する。1つの態様において、翻訳後の標的はリン酸化またはグリコシル化により修飾される。
1つの態様において、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、同じまたは重複するエピトープに結合する。
ポリヌクレオチドリンカーにより互いに連結されている、標的に特異的に結合する2つの一価ポリペプチドからなる複合体であって、第1のポリペプチドが標的のポリペプチドエピトープに結合し、第2のポリペプチドが翻訳後ポリペプチド修飾に結合し、各一価結合剤が10-2/秒〜10-3/秒の範囲のKdissを有する、10-4/秒以下のKdissを有する該複合体によって、翻訳後修飾された標的ポリペプチドが検出できることが分かった。
異なるタイプの共有結合性のアミノ酸修飾が知られている。例えば、Mann and Jensen (2003)によりおよびSeo and Lee (2004)により報告された翻訳後修飾は、参照(Mann, M. and Jensen, O.N., Biochemistry 21 (2003) 255-261; Seo, J. and Lee, K.-J., Biochemistry and Molecular Biology 37/1 (2004) 35-44)により本明細書に含まれる。
1つの態様において、翻訳後修飾は、アセチル化、リン酸化、アシル化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化、SUMO化、硫酸化およびニトロ化からなる群より選択される。
アセチル化(+42 Daの分子量変化)は、かなり安定な二次修飾である。例としては、多くのタンパク質のN末端に見出されるアセチル化またはリジンもしくはセリン残基上のアセチル化がある。通常、リジン残基のアセチル化はポリペプチド鎖内の1つまたは複数の明確に規定された位置に見出されるが、他のリジン残基はそれほど頻繁にはまたは全くアセチル化されない。
タンパク質のリン酸化および脱リン酸化(その正味残量をリン酸化状態ということができる)は、タンパク質の生物活性の調節において重要な要素の1つであることが知られている。低い割合のリン酸化アミノ酸残基が、特定の生物活性を誘発するのに既に十分なこともある。リン酸化は80 Daの質量増加(分子量増加)をもたらす。アミノ酸のチロシン(Y)、セリン(S)、トレオニン(T)、ヒスチジン(H)、およびアスパラギン酸(D)がリン酸化されうる。ポリペプチドの生物学的機能が複雑であるほど、それに対応する、リン酸化の可能性がある部位のパターンも複雑になる。これは膜結合受容体、とりわけ、いわゆる受容体チロシンキナーゼ(RTK)についてとりわけ知られ、当てはまる。その命名から既に示唆されるように、RTKの細胞内シグナル伝達の少なくとも一部は、そのようなRTKの細胞内ドメインの特定のチロシンのリン酸化状態によって媒介される。
ポリペプチドはファルネシル基、ミリストイル基またはパルミトイル基によってアシル化されてもよい。アシル化は、通常、システイン残基の側鎖上で起こる。
二次修飾としてのメチル化は、リジン残基の側鎖を介して起こる。核酸に結合できる調節タンパク質の結合特性は、例えば、メチル化を介して調節されうることが示されている。
グリコシル化は一般的な二次修飾である。これはタンパク質-タンパク質相互作用に、タンパク質の可溶化に、その安定性にも大きな影響を及ぼす。2つの異なるタイプのグリコシル化が知られている: N結合型(アミノ酸N (アスパラギン)を介した)側鎖およびO結合型側鎖(セリン(S)またはトレオニン(T)を介した)。O-Glc-NAcのような糖誘導体を含むものもある、多くの異なる多糖(直鎖状のまたは分岐側鎖を有する)が特定されている。
ユビキチン化およびSUMO化は、それぞれ、血液循環中でのタンパク質の半減期に影響を及ぼすことが知られている。ユビキチン化は破壊シグナルとして働き、ユビキチン化ポリペプチドの切断および/または除去をもたらしうる。
チロシン残基(Y)を介した硫黄化(sulfatation)は、タンパク質-タンパク質(細胞-細胞)相互作用の調節において、ならびにリガンド-相互作用において重要であるものと考えられる。
チロシン残基(Y)のニトロ化は、例えば炎症過程などでの、酸化的損傷の特徴であるものと考えられる。
L-デオキシヌクレオシドホスホラミダイト単位L-dT、L-dC、L-dAおよびL-dGは、文献にしたがって調製することができる(例えばUrata, H., et al., Nucl. Acids Res. 20 (1992) 3325-3332; Shi, Z.D., et al., Tetrahed. 58 (2002) 3287-3296を参照のこと)。L-デオキシリボース誘導体は、8段階を通じてL-アラビノースから合成することができる。L-デオキシヌクレオシドはL-デオキシリボース誘導体での適切な核酸塩基誘導体のグリコシル化によって得ることができる。ヌクレオシドホスホラミダイトへの誘導体化の後、それらを固相DNA合成法によってオリゴデオキシヌクレオシドに組み入れることができる。逆相HPLCおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によってオリゴマーを精製することができる。
L-DNAは、標準的な合成プロトコルを用いることによってDNAのように大規模合成することができる。
scFv抗体断片の発現および精製の場合、scFvをコードする核酸を、scFvのC末端の位置にc-mycエピトープタグおよびヘキサヒスチジンタグの付加をもたらしうる、pUC119mycHisのような、発現および/または分泌ベクターにクローニングすることができる。免疫組織化学用の(scFv')2二量体(Adams, G.P., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4026-4034)を作製するため、c-mycエピトープタグをpUC119mycHisから遺伝学的に除去することができ、遊離システインをヘキサヒスチジンタグに先行するscFvのC末端の位置に導入することができる。scFvまたは(scFv')2二量体タンパク質を細菌ペリプラズムから収集し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過によって精製することができる(Nielsen, U.B., et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (2002) 109-118)。
あるいは、scFvは、scFvをコードする構造遺伝子を、C末端の位置にc-mycおよびヘキサヒスチジンタグを付与する発現ベクターに導入することによって産生することもできる(Liu, B., et al., Cancer Res. 64 (2004) 704-710)。可溶性(scFv)2を産生するため、第2のベクターを用いて、C末端の位置にシステインおよびヘキサヒスチジンタグを付与することができる。IPTG誘導の後、抗体断片を細菌細胞膜周辺腔からニトリロ三酢酸-ニッケルビーズ上に精製することができる。FACSおよび免疫組織化学研究の場合、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)を製造元の使用説明書にしたがって用い、scFvをビオチン化することができる。
解離定数(KD)の決定の場合、10% FCSを補充したRPMI 1640などの適当な培地中で、各標的表面分子を発現している細胞株を90%の集密度まで増殖させることができる。細胞を2 mmol/l EDTA/PBS中のトリプシン(0.2%)での短時間の消化によって収集することができる。ビオチン化scFvをPBS/0.25%ウシ血清アルブミン中にて4℃で4時間105個の細胞とともにインキュベートすることができる。結合したscFvをストレプトアビジン-フィコエリトリンによって検出することができ、FACSによって分析することができる。データを曲線適合させることができ、GraphPad Prism (Graph-Pad Software)を用いてKD値を計算することができる。
免疫組織化学の場合、凍結および/またはパラフィン包埋ブロック由来の組織切片を用いることができる。免疫組織化学分析の場合、組織切片を4時間4℃で精製二量体scFv (例えば2%ミルク/PBS中50 μg/ml)とともにインキュベートし、PBSで洗浄し、400分の1に希釈した抗(His)6抗体(Santa Cruz Biotechnology)、引き続き400分の1に希釈したビオチン化抗抗(His)6抗体(Vector Lab)および400分の1に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン(Sigma)とともにインキュベートすることができる。基質としてジアミノベンジジン(Sigma)を用いて、結合を検出することができる。
あるいは、試験組織および対照組織の凍結切片を1時間室温でビオチン化scFv (250 nmol/l)で染色することができる。FACSによって試験細胞株に結合しないscFvを、全ての実験の対照として用いることができる。結合したscFvは、3,3'-ジアミノベンジジン基質を用いてストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼにより検出することができる。染色された組織をヘマトキシリンで対比染料し、70%、95%および100%エタノール中で乾燥し、マウントし、分析することができる。
HER2過剰発現および増幅を検出するための免疫組織化学(IHC)および蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)に関しては、特にUS 2003/0152987 (参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。
内在化の判定の場合、以下の手順を用いることができる。蛍光顕微鏡検査実験の場合、細胞を24ウェルプレート中で約80%の集密度まで増殖させ、37℃で4時間1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸で標識された非標的化または標的化複合体とともに同時にインキュベートすることができる。細胞をPBSで洗浄し、Nikon Eclipse TE300蛍光顕微鏡で調べることができる。FACS分析の場合、細胞を2時間37℃で1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン-5,5'-ジスルホン酸標識複合体とともにインキュベートし、表面に結合したリポソームを除去するために5分間室温でグリシン緩衝液(pH 2.8; 150 mmol/l NaCl)に曝露し、FACS (LSRII; BD Biosciences)によって分析することができる。平均蛍光強度値を用い、全細胞会合リポソーム(グリシン処理前)と比べて内在化リポソーム(グリシン処理に耐性)の割合を計算することができる。
増殖阻害および内在化アッセイの場合、約30%〜80%の集密度のがん細胞を、1% FCSを含有する培地中にて72時間37℃で、さまざまな濃度のアフィニティー精製複合体とともにインキュベートすることができる。テトラゾリウム塩3-(4,5-ジメチルチアゾール(dimethylthizaol)-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミドアッセイ(Promega)を用いて増殖状態を評価することができ、KaleidaGraph 3.5 (Synergy Software)を用いてIC50を計算することができる。内在化アッセイの場合、複合体をスルホ-NHS-LC-ビオチン(Pierce)でビオチン化し、さまざまな時間37℃で標的細胞とともにインキュベートすることができる。細胞を100 mMグリシン緩衝液(pH 2.8)で洗浄し、2%ホルムアルデヒドで固定し、氷冷100%メタノールで透過処理し、ストレプトアビジン-FITCとともにインキュベートすることができる。染色された細胞を最初に、Axiophot蛍光顕微鏡(Zeiss)で調べ、Leica TCS NT共焦点レーザー蛍光顕微鏡(Leica)でさらに観察することができる。
毒性の判定の場合、細胞を96ウェルプレート中に1ウェルあたり6,000個でプレーティングし、37℃で2時間さまざまな濃度(0〜10 μg/ml)の本明細書において報告される複合体とともにインキュベートすることができる。複合体の除去後、細胞を、10% FCSを補充したRPMI 1640で1回洗浄し、37℃でさらに70時間インキュベートすることができる。Cell Counting Kit-8 (Dojindo)を製造元の使用説明書にしたがって用い、細胞生存をアッセイすることができる。データは、非処理対照細胞のものと比べた生存細胞の割合として表すことができる。
インビトロでの細胞毒性の判定の場合、がん細胞を96ウェルプレート中に播種し(例えばPC3およびDu-145細胞の場合には1ウェルあたり6,000個の細胞または例えばLNCaP細胞の場合には1ウェルあたり10,000個の細胞)、37℃で4時間、本明細書において報告される複合体(0 〜10 μg/ml)とともにインキュベートすることができる。細胞を、補充RPMI 1640で2回洗浄して薬物を除去し、37℃でさらに72時間、新鮮培地とともにインキュベートすることができる。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド染色を用いて細胞生存をアッセイすることができ(Carmichael, J., et al., Cancer Res. 47 (1987) 936-942)、マイクロタイタープレートリーダー(SpectraMax 190, Molecular Devices)を用いて570 nmで結果を読み取ることができる。Cell counting kit-8 (Dojindo)を製造元の使用説明書にしたがって用い、細胞生存を判定することができる。
細胞内送達のアッセイの場合、以下の方法を用いることができる。細胞内複合体送達を評価するために、複合体を1 μg/mlの精製(His)6タグ付scFvとともに細胞に加え、30分間37℃でインキュベートし、1 mM EDTAを含有する生理食塩水で3回洗浄して、内在化することができなかった細胞表面結合複合体を除去することができる。複合体の取り込みを、Gemini顕微蛍光光度計(Molecular Devices)を用いた顕微蛍光測光により、および倒立蛍光顕微鏡(Nikon)により判定することができる。
組換え方法および組成物
一般に、抗体断片または結合対のメンバーのようなポリペプチドは、例えば、US 4,816,567に記述されているように、組換え方法および組成物を用いて産生されうる。
一般に、抗体断片または結合対のメンバーのようなポリペプチドは、例えば、US 4,816,567に記述されているように、組換え方法および組成物を用いて産生されうる。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体の各ポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。
そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/もしくはVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖および/もしくは重鎖)ならびに/または結合対のメンバーのアミノ酸配列をコードしうる。
1つの態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。1つの態様において、以下を含む(例えば、以下で形質転換された)宿主細胞が提供される: (1) 抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだベクター、または(2) 抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだ第1のベクターおよび抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含んだ第2のベクター。1つの態様において、宿主細胞は真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞またはリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現の場合、例えば、US 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248, B.K.C. Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, (2004) pp. 245-254を参照されたい。発現後、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離することができ、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような有用真核微生物は、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である(Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2003) 1409-1414)、およびLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと)。
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる(例えば、US 5,959,177、US 6,040,498、US 6,420,548、US 7,125,978、およびUS 6,417,429を参照のこと)。
脊椎動物細胞が宿主細胞として用いられてもよい。例えば、浮遊状態で増殖するように適合された哺乳類細胞株が有用でありうる。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS-7)、ヒト胚腎臓株(HEK 293)、ベビーハムスター腎細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記述されているTM4細胞)、サル腎細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76)、ヒト子宮頸がん細胞(HELA)、イヌ腎細胞(MDCK)、バッファローラット肝細胞(BRL 3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝細胞(Hep G2)、マウス乳腺腫瘍細胞(MMT 060562)、例えば、Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記述されているTRI細胞、MRC 5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、DHFR- CHO細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220)、ならびにY0、NSOおよびSp2/0のような骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)を参照されたい。
本明細書において報告される複合体のポリペプチドを産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。ハムF10 (Sigma)、最小必須培地((MEM), (Sigma)、RPMI-I640 (Sigma)、およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM), Sigma)のような、市販されている培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ham, R.G., et al., Meth. Enzymol. 58 (1979) 44-93、Barnes, D., et al., Anal. Biochem. 102 (1980) 255-270、US 4,767,704、US 4,657,866、US 4,927,762、US 4,560,655、US 5,122,469、WO 90/03430、WO 87/00195、およびUS Re 30,985に記述されている培地のいずれかが宿主細胞に対する培地として用いられてもよい。これらの培地のいずれにも必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子(インスリン、トランスフェリンまたは表皮成長因子など)、塩(塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェートなど)、緩衝液(HEPESなど)、ヌクレオチド(アデノシンおよびチミジンなど)、抗生物質(GENTAMYCIN(商標)薬など)、微量元素(マイクロモル範囲の終濃度で通常存在する無機構成成分として定義される)、ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源が補充されてもよい。任意の他の必要な補充物質が、当業者に知られている適切な濃度で含まれてもよい。温度、pHなどのような、培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技法を用いる場合、ポリペプチドは細胞内で、細胞膜周辺腔中で産生され、または培地中に直接分泌されうる。ポリペプチドが細胞内で産生されるなら、最初の段階として、宿主細胞または溶解断片のどちらかの、微粒子状残屑を、例えば、遠心分離または限外ろ過によって除去する。例えば、Carter, P., et al., Bio/Technology 10 (1992) 163-167は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順について記述している。手短に言えば、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH 3.5), EDTA、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で約30分間かけて融解する。細胞残屑を遠心分離によって除去することができる。ポリペプチドが培地中に分泌される場合、そのような発現系由来の上清を一般に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外ろ過ユニットを用いて最初に濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにPMSFのようなプロテアーゼ阻害剤を前記の段階のいずれかに含めてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するために抗生物質を含めてもよい。細胞から調製されたポリペプチド組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができるが、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい抗体精製技法である。親和性リガンドとしてのプロテインAの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンFcドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインAを用いて、ヒトγ1、γ2またはγ4重鎖に基づく抗体を精製することができる(Lindmark, R., et al., J. Immunol. Meth. 62 (1983) 1-13)。プロテインGは、全てのマウスアイソタイプの場合におよびヒトγ3の場合に推奨される(Guss, B., et al., EMBO J. 5 (1986) 1567-1575)。親和性リガンドが付着しているマトリックスは、ほとんどの場合はアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ(スチレンジビニル)ベンゼンのような機械的に安定したマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。抗体がCH3ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)が精製に有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相HPLC、シリカ上のクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE(商標)上のクロマトグラフィー、(ポリアスパラギン酸カラムのような)陰イオンまたは陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマト分画、SDS-PAGE、および硫安沈殿のような、他のタンパク質精製技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。
任意の予備的な精製段階の後、関心対象のポリペプチドおよび夾雑物を含む混合物は、約2.5〜4.5のpHの溶出緩衝液を用いた、とりわけ、低い塩濃度(例えば、約0〜0.25 Mの塩)で行われる低pH疎水性相互作用クロマトグラフィーに供されうる。
本明細書において報告される複合体およびその個々の構成成分は、所望のように単離および精製されうる。複合体が形成される反応混合物の不要な構成成分は、例えば、所望とされる複合体に行き着かなかったものの、その構成要素を構成するポリペプチドおよびポリヌクレオチドである。1つの態様において、複合体は分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって判定した場合に80%超の純度まで精製される。いくつかの態様において、複合体は分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって判定した場合に、それぞれ、90重量%、95重量%、98重量%、または99重量%超の純度まで精製される。純度は、あるいは、例えば、還元または非還元条件下のSDS-PAGEにより、例えば、タンパク質検出時にクマシーブルー染色または銀染色を用いて容易に判定されうる。純度が複合体レベルで評価される場合、サイズ排除クロマトグラフィーを適用して、複合体を副生成物から分離することができ、260 nmのODをモニターして、その純度を評価する。
イムノコンジュゲート
本明細書において、標的に特異的に結合するポリペプチドまたはリンカーの少なくとも1つが1つまたは複数のエフェクター成分、例えば化学療法剤もしくは化学療法薬のような、細胞毒性剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはその断片)、あるいは放射性同位体とコンジュゲートしている複合体も提供される。
本明細書において、標的に特異的に結合するポリペプチドまたはリンカーの少なくとも1つが1つまたは複数のエフェクター成分、例えば化学療法剤もしくは化学療法薬のような、細胞毒性剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素的に活性な毒素、またはその断片)、あるいは放射性同位体とコンジュゲートしている複合体も提供される。
1つの態様において、エフェクター成分は、メイタンシノイド(US 5,208,020、US 5,416,064、EP 0 425 235を参照のこと)、モノメチルアウリスタチン薬成分DEおよびDFのようなアウリスタチン(MMAEおよびMMAF、US 5,635,483、US 5,780,588、US 7,498,298を参照のこと)、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはその誘導体(US 5,712,374、US 5,714,586、US 5,739,116、US 5,767,285、US 5,770,701、US 5,770,710、US 5,773,001、US 5,877,296、Hinman, L.M., et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342、Lode, H.N., et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928を参照のこと)、ダウノマイシンまたはドキソルビシンのようなアントラサイクリン(Kratz, F., et al., Current Med. Chem. 13 (2006) 477-523、Jeffrey, S.C., et al., Bioorg. Med. Chem. Letters 16 (2006) 358-362、Torgov, M.Y., et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721、Nagy, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834、Dubowchik, G.M., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12 (2002) 1529-1532、King, H.D., et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343、およびUS 6,630,579を参照のこと)、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン、例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセルおよびオルタタキセル、トリコテセン、ならびにCC1065を含むが、これらに限定されない、薬物である。
1つの態様において、エフェクター成分は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAP-S)、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトギリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセンを含むが、これらに限定されない、酵素的に活性な毒素またはその断片である。
1つの態様において、エフェクター成分は、放射性原子である。種々の放射性同位体が放射性コンジュゲート(radioconjugate)の産生のために利用可能である。例としては、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212、およびLuの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出のために用いられる場合、それは、シンチグラフ検査用の放射性原子、例えばTc99mもしくはI123、または核磁気共鳴(NMR)画像法(磁気共鳴画像法、MRIとしても公知)のためのスピン標識、例えば、ここでもI123、I131、In111、F19、C13、N15、O17、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含んでもよい。
エフェクター成分は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(SMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミデートHCl)、活性エステル(例えばスベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド(例えばグルタルアルデヒド)、ビスアジド構成成分(例えばビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えばビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えばトルエン2,6-ジイソシアネート)、および二活性(bis-active)フッ素構成成分(例えば1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を用い本明細書において報告される複合体の任意の構成成分とコンジュゲートさせることができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104に記述されているように調製することができる。炭素-14標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、複合体との放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である(WO 94/11026を参照のこと)。本明細書において報告される複合体と毒性成分をコンジュゲートさせるためのリンカーは、細胞中での細胞毒性薬の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chari, R.V., et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131、US 5,208,020)を用いることができる。
エフェクター成分は、本明細書において報告される複合体の化合物とコンジュゲートされてもよいが、しかし(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから)市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCCおよびスルホ-SMPB、ならびにSVSB (スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート)を含むが、これらに限定されない、架橋試薬で調製されたそのようなコンジュゲートに限定されない。
複合体依存性酵素媒介プロドラッグ療法(CDEPT)
本明細書において報告される複合体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO 81/01145を参照のこと)を活性な抗がん薬に変換するプロドラッグ活性化酵素であるエフェクター成分を用いることによりCDEPTにおいて用いられてもよい(例えば、WO 88/07378およびUS 4,975,278も参照のこと)。
本明細書において報告される複合体は、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO 81/01145を参照のこと)を活性な抗がん薬に変換するプロドラッグ活性化酵素であるエフェクター成分を用いることによりCDEPTにおいて用いられてもよい(例えば、WO 88/07378およびUS 4,975,278も参照のこと)。
CDEPTに有用な複合体の酵素構成成分は、プロドラッグをそのさらに活性な細胞毒性形態に変換するようにプロドラッグに作用できる任意の酵素を含む。本発明の方法において有用である酵素は、ホスフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、スルフェート含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ、無毒性の5-フルオロシトシンを抗がん薬の5-フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ、ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用である、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン(カテプシンBおよびLなど)のような、プロテアーゼ、D-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なD-アラニルカルボキシペプチダーゼ、グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ-ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼなどの炭水化物切断酵素、β-ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ-ラクタマーゼ、ならびにアミン窒素の位置で、それぞれ、フェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基により誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンVアミダーゼまたはペニシリンGアミダーゼなどの、ペニシリンアミダーゼを含むが、これらに限定されることはない。あるいは、当技術分野において「アブザイム」としても公知の、酵素活性を有する抗体を用いて、本明細書において報告されるプロドラッグを遊離活性薬に変換することもできる(例えば、Massey, R.J., Nature 328 (1987) 457-458を参照のこと)。複合体-アブザイムコンジュゲートは、腫瘍細胞集団へのアブザイムの送達のために本明細書において記述されるように調製することができる。酵素は、上記のヘテロ二官能性架橋試薬の使用のような、当技術分野において周知の技法によって複合体に非共有結合的にまたは共有結合的に結合されうる。あるいは、酵素の少なくとも機能的に活性な部分と連結している抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質が、当技術分野において周知の組換えDNA技法を用いて構築されてもよい(例えば、Neuberger, M.S., et al., Nature 312 (1984) 604-608を参照のこと。
診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書において提供される複合体のいずれも、生物学的サンプル内での、複合体中のポリペプチドによって特異的に結合される標的の存在を検出するのに有用である。本明細書において用いられる「検出する」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。
特定の態様において、本明細書において提供される複合体のいずれも、生物学的サンプル内での、複合体中のポリペプチドによって特異的に結合される標的の存在を検出するのに有用である。本明細書において用いられる「検出する」という用語は、定量的または定性的検出を包含する。
1つの態様において、複合体は、診断または検出の方法で用いるために提供される。さらなる局面において、生物学的サンプル内での、本明細書において報告される複合体のポリペプチドの標的の存在を検出する方法が提供される。特定の態様において、本方法は、ポリペプチドのその標的への結合に許容的な条件の下で本明細書において報告される複合体と生物学的サンプルとを接触させる段階、および複合体と標的との間で複合体が形成されるかどうかを検出する段階を含む。そのような方法はインビトロまたはインビボの方法でありうる。
1つの態様において、本明細書において報告される複合体は、複合体に含まれる単離されたポリペプチドによる治療に適した対象を選択するために、例えば、標的が、患者の選択のためのバイオマーカーである場合に用いられる。
特定の態様において、標識された複合体、すなわちエフェクター成分が標識である複合体が提供される。標識は、(蛍光標識、発色標識、電子高密度標識、化学発光標識および放射性標識のような)直接的に検出される標識、ならびに例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて、間接的に検出される、酵素またはリガンドのような、標識を含むが、これらに限定されることはない。例示的な標識は、放射性同位体P32、C14、I125、H3、およびI131、フルオロフォア、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ(US 4,737,456)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体を酸化する過酸化水素を利用する酵素、例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはマイクロペルオキシダーゼとカップリングさせたもの、ビオチン/アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定な遊離基などを含むが、これらに限定されることはない。
薬学的製剤
本明細書において報告される複合体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような複合体と、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体(Osol, A. (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Mack Publishing Company (1980))とを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は一般に、利用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール)、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン、親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤、例えばEDTA、糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)、ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されることはない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20 (HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)をさらに含む。rHuPH20を含めて、特定の例示的なsHASEGPおよび使用の方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記述されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
本明細書において報告される複合体の薬学的製剤は、所望の純度を有するそのような複合体と、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体(Osol, A. (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Mack Publishing Company (1980))とを、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は一般に、利用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤; 保存剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール)、低分子量(約10残基未満)のポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン、親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物、キレート剤、例えばEDTA、糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体)、ならびに/または非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されることはない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、ヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrHuPH20 (HYLENEX(登録商標), Baxter International, Inc.)をさらに含む。rHuPH20を含めて、特定の例示的なsHASEGPおよび使用の方法は、US 2005/0260186およびUS 2006/0104968に記述されている。1つの局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼのような1つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、US 6,267,958に記述されている。水性の抗体製剤は、US 6,171,586およびWO 2006/044908に記述されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
本明細書における製剤は、処置されている特定の適応症のために必要な2つ以上の活性成分、とりわけ互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含んでもよい。そのような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によりまたは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはマクロエマルジョン中に、封入されてもよい。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.), (1980)に開示されている。
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の適当な例には、抗体を含有する固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、該マトリックスは成形物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。
インビボ投与に用いられる製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通してろ過することにより、容易に達成されうる。
治療方法および組成物
本明細書において報告される複合体のいずれも治療方法において使用されうる。
本明細書において報告される複合体のいずれも治療方法において使用されうる。
1つの局面において、医薬として用いるための本明細書において報告される複合体が提供される。さらなる局面において、がんの処置で用いるための複合体が提供される。特定の態様において、処置の方法で用いるための複合体が提供される。特定の態様において、本発明は、複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、がんを有する個体を処置する方法で用いるための複合体を提供する。1つのそのような態様において、本方法は、少なくとも1つのさらなる治療剤の有効量を個体に投与する段階をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、血管新生の阻害もしくは細胞増殖の阻害またはB細胞の枯渇で用いるための本明細書において報告される複合体を提供する。特定の態様において、本発明は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために複合体の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させる方法で用いるための複合体を提供する。上記の態様のいずれかによる「個体」は、とりわけヒトである。
さらなる局面において、本明細書において報告される複合体の、医薬の製造または調製における使用が本明細書において提供される。1つの態様において、医薬はがんの処置のためである。さらなる態様において、医薬は、がんを有する個体に医薬の有効量を投与する段階を含む、がんを処置する方法で用いるためである。さらなる態様において、医薬は血管新生の阻害もしくは細胞増殖の阻害またはB細胞の枯渇のためである。さらなる態様において、医薬は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために医薬の有効量を個体に投与する段階を含む、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させる方法で用いるためである。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトでありうる。
本明細書において報告されるさらなる局面において、がんを処置するための方法が提供される。1つの態様において、本方法は、本明細書において報告される複合体の有効量を、そのようながんを有する個体に投与する段階を含む。上記の態様のいずれかによる「個体」は、ヒトでありうる。
本明細書において報告されるさらなる局面において、個体において血管新生を阻害する、もしくは細胞増殖を阻害する、またはB細胞を枯渇させるための方法が提供される。1つの態様において、本方法は、血管新生を阻害するために、もしくは細胞増殖を阻害するために、またはB細胞を枯渇させるために、本明細書において報告される複合体の有効量を個体に投与する段階を含む。1つの態様において、「個体」はヒトである。
本明細書において報告されるさらなる局面において、例えば、上記の治療方法のいずれかで用いるための、本明細書において提供される複合体のいずれかを含む薬学的製剤が提供される。1つの態様において、薬学的製剤は、本明細書において提供される複合体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書において報告される複合体のいずれかと、少なくとも1つのさらなる治療剤とを含む。
本明細書において報告される複合体は、治療法において単独でまたは他の薬剤との組み合わせで用いることができる。例えば、本明細書において報告される複合体は、少なくとも1つのさらなる治療剤と同時投与されうる。
上記のそのような併用療法は併用投与(2つまたはそれ以上の治療剤が同一のまたは別個の製剤に含まれる場合)、および個別投与を包含し、その場合、本発明の抗体の投与は、さらなる治療剤および/または補助剤の投与の前に、同時に、および/または後に行うことができる。本明細書において報告される複合体は、放射線療法との組み合わせで用いることもできる。
本明細書において報告される複合体は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与、必要に応じて局所の処置のために、病巣内投与を含む、任意の適当な手段によって投与することができる。非経口注入は筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、または皮下投与を含む。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、任意の適当な経路により、例えば、静脈内注射または皮下注射のような、注射により投薬することができる。単回投与またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含むが、これらに限定されない、さまざまな投薬スケジュールが本明細書において企図される。
本明細書において報告される複合体は、適正な医療行為と一致する形で製剤化され、投薬され、および投与される。これに関連して考慮される要因には、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医師に知られる他の要因が含まれる。複合体は、問題になっている障害を予防または処置するために現在用いられている1つまたは複数の薬剤とともに製剤化される必要はないが、しかし任意で製剤化されてもよい。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する複合体の量、障害または処置のタイプ、および上記の他の要因に依存する。これらは一般的に、本明細書において記述されるのと同じ投与量および投与経路で、または本明細書において記述される投与量の約1%〜99%で、または適切であるものと経験的に/臨床的に決定されている任意の投与量および任意の経路で用いられる。
疾患の予防または処置のため、(単独でまたは1つもしくは複数の他のさらなる治療剤との組み合わせで用いる場合の)本明細書において報告される複合体の適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、複合体のタイプ、疾患の重症度および経過、複合体が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、過去の治療、患者の病歴および複合体に対する反応、ならびに主治医の裁量に依存する。複合体は一度にまたは一連の処置にわたり患者に適切に投与される。疾患のタイプおよび重症度に依り、約1 μg/kg〜15 mg/kg (例えば0.1 mg/kg〜10 mg/kg)の複合体は、例えば、1回もしくは複数回の個別投与によるか、または持続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期の候補投与量でありうる。1つの典型的な1日投与量は、上記の要因に依り、約1 μg/kg〜100 mg/kgまたはそれ以上に及びうる。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依り、疾患症状の所望の抑制が起きるまで、処置は一般的に持続される。複合体の1つの例示的な投与量は、約0.05 mg/kg〜約10 mg/kgの範囲内であると考えられる。したがって、約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kgまたは10 mg/kg (またはその任意の組み合わせ)の1回または複数回の用量が患者に投与されうる。そのような(例えば患者が約2回〜約20回、または例えば約6回の用量の複合体を受けるような)用量は断続的に、例えば毎週または3週ごとに投与されうる。初期の高負荷用量、その後、1回または複数回の低用量が投与されうる。この治療の進捗は従来の技法およびアッセイ法によって容易にモニターすることができる。
製造品
本明細書において報告される1つの局面において、上記の障害の処置、予防および/または診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は容器、および容器の表面のまたは容器に付随のラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV液バッグなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成されうる。容器は、状態を処置、予防および/または診断するのに有効な、単独でのまたは別の組成物との組み合わせでの、組成物を収容し、無菌アクセスポートを持ちうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパを持つバイアルまたは静脈液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本明細書において報告される複合体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択の状態を処置するために用いられることを示す。さらに、製造品は、(a) 本明細書において報告される複合体を含む組成物を含有した第1の容器; および(b) さらなる細胞毒性剤またはそれ以外の治療剤を含む組成物を含有した第2の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物を用いて特定の状態を処置できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。あるいは、またはさらに、製造品は、注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような、薬学的に許容される緩衝液を含む第2(または第3)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含めて、商業上および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
本明細書において報告される1つの局面において、上記の障害の処置、予防および/または診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は容器、および容器の表面のまたは容器に付随のラベルまたは添付文書を含む。適当な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV液バッグなどを含む。容器は、ガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成されうる。容器は、状態を処置、予防および/または診断するのに有効な、単独でのまたは別の組成物との組み合わせでの、組成物を収容し、無菌アクセスポートを持ちうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパを持つバイアルまたは静脈液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本明細書において報告される複合体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が選択の状態を処置するために用いられることを示す。さらに、製造品は、(a) 本明細書において報告される複合体を含む組成物を含有した第1の容器; および(b) さらなる細胞毒性剤またはそれ以外の治療剤を含む組成物を含有した第2の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製造品は、組成物を用いて特定の状態を処置できることを示す添付文書をさらに含んでもよい。あるいは、またはさらに、製造品は、注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液のような、薬学的に許容される緩衝液を含む第2(または第3)の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針およびシリンジを含めて、商業上および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
アッセイ法
上記のように、任意の細胞表面標的の発現レベルを免疫組織化学法によって検出することができる。
上記のように、任意の細胞表面標的の発現レベルを免疫組織化学法によって検出することができる。
例えば、HER2の検出のための方法が当技術分野において周知であり、対応する市販のキットが容易に入手可能である。使用されうる例示的なキットは、とりわけ、Dako社によって製造かつ流通されているHercepTest(商標)またはVentana Pathway(商標)と呼ばれる試験である。適当には、HER2タンパク質発現のレベルは、HercepTest(商標)に提供されている試薬を用いることにより、およびHercepTest(商標)のプロトコルにしたがうことにより評価される。当業者は、免疫組織化学法によってHER2の発現レベルを判定するためのさらなる手段および方法を承知している(例えばWO 2005/117553を参照のこと)。それゆえ、HER2の発現レベルは、過度の負担なく当業者によって容易にかつ再現性よく判定されうる。しかしながら、正確なかつ再現性のある結果を確実とするには、試験は専門研究所で行われなければならず、これによって試験手順の検証を確実とすることができる。
あるいは、HER2のタンパク質発現レベルの評価のためのさらなる方法、例えばウエスタンブロット、ELISAに基づく検出システムなどが用いられてもよい。HER2タンパク質の正常発現レベルは、これらの技法により、およびc-Myc遺伝子増幅についてさらに分析されたHER2タンパク質発現の正常レベルを有するものと分類された患者の組織サンプルにより判定されうる。
HER2の発現レベルはノザンブロット、リアルタイムPCR、RT PCTなどのような、対応する技法によるmRNA発現の評価によって判定されてもよい。これらの検出システムの全てが当技術分野において周知であり、Lottspeich, F. and Zorbas, H., (Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag (1998))またはSambrook and Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA (2001))などの、標準的なテキストブックから推測されうる。HER2 mRNAの正常発現レベルは、これらの技法により、およびc-Myc遺伝子増幅についてさらに分析されたHER2 mRNA発現の正常レベルを有するものと分類された患者の組織サンプルにより判定されうる。
一般的に、すなわち標的特異的にではなく、本明細書において報告される複合体の増殖阻害特性は、乳房腫瘍細胞株SK-BR-3を用いて評価することができる(Hudziak, R.M., et al., Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172を参照のこと)。手短に言えば、SK-BR-3細胞を、0.25% (vol/vol)のトリプシンの使用によってはがし、1 mlあたり細胞4×105個の密度で完全培地中に懸濁することができる。100 μl (細胞4×104個)のアリコットを96ウェル微量希釈プレートにプレーティングすることができ、細胞を接着させることができ、培地のみまたは複合体を含有する培地(終濃度およそ5 μg/ml) 100 μlをその後、加えることができる。72時間後、Sugaman, B.J., et al., Science 230 (1985) 943-945に記述されているようにプレートをPBS (pH 7.5)で2回洗浄し、クリスタルバイオレット(メタノール中0.5%)で染色し、相対的な細胞増殖について分析することができる。
モノクローナル抗体2C4および4D5は、SK-BR-3の相対的な細胞増殖を、それぞれ、約20%および約56%阻害した。
一般的に、すなわち標的特異的にではなく、本明細書において報告される複合体は、MCF7細胞の全細胞溶解物由来のMW 180,000の範囲にあるタンパク質のHRO刺激性のチロシンリン酸化を阻害するその能力について評価することができる(Lewis, G.D., et al., Cancer Research 56 (1996) 1457-1465)。MCF7細胞は、全ての既知ErbB受容体を発現するものの、比較的低いレベルで発現することが報告されている。ErbB2、ErbB3およびErbB4はほぼ同一の分子サイズを有するので、全細胞溶解物をウエスタンブロット分析によって評価する場合にどのタンパク質が、リン酸化されたチロシンになっているかを区別することは可能ではない。
しかしながら、これらの細胞は、用いられるアッセイ条件の下で、外因的に加えられたHRGがない場合に、MW 180,000の範囲にあるチロシンリン酸化タンパク質を低いレベル〜検出不能なレベルで示すので、HRGチロシンリン酸化アッセイ法に理想的である。
アッセイのため、MCF7細胞を24ウェルプレートにプレーティングすることができ、本明細書において報告される複合体を各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートすることができる; その後、rHRGβ1177-244を各ウェルに0.2 nMの終濃度まで加えることができ、インキュベーションを8分間続けることができる。培地を各ウェルから注意深く吸引することができ、SDSサンプル緩衝液(5% SDS、25 mM DTT、および25 mM Tris-HCl, pH 6.8) 100 μlの添加によって反応を停止させることができる。各サンプル(25 μl)を4〜12%の勾配ゲル(Novex)上で電気泳動することができ、その後、ポリビニリデンジフルオリド膜へ電気泳動的に転写することができる。抗ホスホチロシン(4G 10、UBIより、1 μg/mlで用いた)免疫ブロットを発色させることができ、Mr- 180,000の位置の主たる反応性バンドの強度を既述(Holmes, W.E., et al., Science 256 (1992) 1205-1210、Sliwkowski, M.X., et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 14661-14665)のように、反射率デンシトメトリによって定量することができる。
モノクローナル抗体2C4および4D5は、MW 180,000の位置でのHRG誘導性のチロシンリン酸化シグナルの生成を顕著に阻害した。HRGがない場合、これらの抗体のどちらもMW 180,000の範囲にあるタンパク質のチロシンリン酸化を刺激することができなかった。また、これらの抗体はEGFR (Fendly, B.M., et al., Cancer Research 50 (1990) 1550-1558)、ErbB3またはErbB4と交差反応しない。抗体2C4は対照の<25%にまでHRGによるp180チロシンリン酸化の刺激を顕著に阻害した。モノクローナル抗体4D5はHRGによるチロシンリン酸化の刺激を約50%ブロックすることができた。
本明細書において報告される複合体によるMCF7乳房腫瘍細胞株へのHRGの結合の阻害は、24ウェルプレートの形式で氷上の単層培養物を用いて行うことができる(Lewis, G.D., et al., Cancer Research 56 (1996) 1457-1465)。複合体を各ウェルに加えることができ、30分間インキュベートすることができる。I125標識rHRGβ1177-224 (25 pm)を加えることができ、インキュベーションを4〜16時間続けることができる。
データの分析から、チロシンリン酸化のデータに一致して2C4について2.4 ± 0.3 nMのIC50および2C4について-74%の最大阻害が得られた。
ErbB2と関連するErbB3の能力を共免疫沈降実験において試験することができる。1.0×106個のMCF7またはSK-BR-3を6ウェル組織培養プレート中、10%ウシ胎仔血清(FBS)および10 mM HEPES, pH 7.2 (増殖培地)を含有する50:50のDMEM/ハムF12培地に播種することができ、終夜付着させることができる。実験を始める前に細胞を無血清増殖培地中で2時間飢餓させることができる。
細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で手短く洗浄することができ、その後、0.2% w/vのウシ血清アルブミン(BSA), RPMI培地, 含10 mM HEPES, pH 7.2 (結合用緩衝液)中で希釈された100 nMの複合体とともに、または結合用緩衝液のみ(対照)とともにインキュベートすることができる。室温で1時間の後、HRGをウェルの半分に5 nMの終濃度まで加えることができる(+)。類似した容量の結合用緩衝液を他のウェルに加えることができる(-)。インキュベーションをおよそ10分間続けることができる。
上清を吸引によって除去することができ、細胞を、0.2 mM PMSF、10 μg/mlロイペプチンおよび10 TU/mlアプロチニンを含有するRPMI, 10 mM HEPES, pH 7.2, 1.0% (v/v) TRITON X-100(商標), 1.0% (w/v) CHAPS (溶解緩衝液)中で溶解することができる。遠心分離によって溶解物から不溶性物質を除去することができる。アフィニティーゲル(Affi-Prep, Bio-Rad)に共有結合的にカップリングされたモノクローナル抗体を用いてErbB2を免疫沈降させることができる。この抗体(Ab-3, Oncogene Sciences)は細胞質ドメインエピトープを認識する。固定化抗体およそ8.5 μgを含有するゲルスラリー10 μlを各溶解物に加えることによって免疫沈降を行うことができ、サンプルを2時間室温で混合させることができる。ゲルをその後、遠心分離によって回収することができる。ゲルを溶解緩衝液により3回バッチ洗浄して、未結合の物質を除去することができる。SDSサンプル緩衝液を次いで、加えることができ、サンプルを沸騰水浴中で手短に加熱することができる。
上清を4〜12%のポリアクリルアミドゲル上で泳動し、ニトロセルロース膜に電気ブロットすることができる。
ErbB3の存在は、その細胞質ドメインエピトープに対するポリクローナル抗体(c-17, Santa Cruz Biotech)でブロットをプローブすることによって評価することができる。ブロットは化学発光基質(ECL, Amersham)を用いて可視化することができる。
一般に、EGF、TGF-αまたはHRGによるMAPKの活性化を阻害する複合体の能力を以下の方法で評価することができる: MCF7細胞(細胞105個/ウェル)を12ウェル細胞培養プレート中にて、血清を含有する培地にプレーティングすることができる。翌日、細胞培地を除去することができ、0.1%の血清を含有する新鮮培地を各ウェルに加えることができる。この手順を翌日およびアッセイの前に繰り返すことができ、培地を無血清の結合用緩衝液と交換することができる(Jones, J.T., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 11667-11674、およびSchaefer, G, et al., J. Biol. Chem. 274 (1999) 859-866)。細胞を室温まで平衡化させることができ、その後、200 nMの複合体溶液0.5 mlとともに30分間インキュベートすることができる。細胞をその後、15分間1 nM EGF、1 nM TGF-αまたは0.2 nM HRGで処理することができる。細胞培地を吸引し、その後、1% DTTを含有するSDS-PAGEサンプル緩衝液0.2 mlを加えることにより、反応を停止することができる。既述(Jones, J.T., et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 11667-11674)のように抗活性型MAPK抗体(Promega)を用いたウエスタンブロッティングによってMAPK活性化を評価することができる。
一般に、肺腺がん細胞株Calu-3を用いた異種移植モデルを用い、本明細書において報告される複合体が腫瘍成長を抑制する効力を評価することができる。雌性NCRヌードマウスに0.1 ml中20×106個の細胞を皮下接種することができる。腫瘍測定を週2回行うことができ、腫瘍小結節(tumor modules)が100 mm3の容積に達した時点で、動物を処置群に無作為化することができる。処置群は以下とすることができる:
(a) 対照モノクローナル抗体、例えばmAb 1766;
(b) HERCEPTIN(登録商標)、10 mg/kg;
(c) モノクローナル抗体2C4、10 mg/kgおよび/またはモノクローナル抗体4D5、10 mg/kg;
(d) HERCEPTIN(登録商標)および2C4、それぞれ10 mg/kgで; ならびに
(e) 本明細書において報告される複合体、10 mg/kg。
(a) 対照モノクローナル抗体、例えばmAb 1766;
(b) HERCEPTIN(登録商標)、10 mg/kg;
(c) モノクローナル抗体2C4、10 mg/kgおよび/またはモノクローナル抗体4D5、10 mg/kg;
(d) HERCEPTIN(登録商標)および2C4、それぞれ10 mg/kgで; ならびに
(e) 本明細書において報告される複合体、10 mg/kg。
動物を24日目まで週2回処置することができる。腫瘍容積を38日目まで週2回測定することができる。
HCA-7、LS 174TまたはCaCo-2のようなヒト結腸直腸細胞株をSheng, H., et al., J. Clin. Invest. 99 (1997) 2254-2259に記述されているように無胸腺ヌードマウスに皮下移植することができる。腫瘍が容積で約100 mm3にまで確立されたら、腹腔内での注射により週2回、本明細書において報告される複合体10〜50 mg/kgを投与して動物の群を処置することができる。
ErbB2を過剰発現しないヒト乳がん細胞に及ぼす複合体の効果を3日間のAlamar Blueアッセイ法にて評価することができる(Ahmed, S.A., J. Immunol. Methods 170 (1994) 211-224、Tommasi, S., et al., Int. J. Oncol. 5 (1994) 473-477)。このアッセイ法において用いられる細胞は、1+レベルでErbB2を発現するMDA-175ヒト乳がん細胞でありうる。
一般に、エストロゲン受容体陽性(ER+)であり、かつ低レベルのErbB2を発現するMCF7異種移植片に対する複合体の効力は、次のように評価することができる: エストロゲンを補充した雌性マウスを用いることができる。複合体を毎週30 mg/kgの用量で投与することができる。
以下の実施例、図面および配列は、本発明の理解を補助するために提供されるが、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の趣旨から逸脱することなく、記載された手順において変形がなされうることが理解される。
配列
SEQ ID NO: 01 VH (mAb 1.4.168)
SEQ ID NO: 02 VL (mAb 1.4.168)
SEQ ID NO: 03 VH (mAb 8.1.2)
SEQ ID NO: 04 VL (mAb 8.1.2)
SEQ ID NO: 05 17merのss-DNA (5'末端で、それぞれ、抗トロポニンT MAB aのFAB'およびIGF-1Rに対するFAB' 1.4.168に共有結合される)
SEQ ID NO: 06 19merのss-DNA (3'末端で、それぞれ、抗トロポニンT MAB bのFAB'およびリン酸化IGF-1Rに対するFAB' 8.1.2に共有結合される)
SEQ ID NO: 07 相補的19merのss-DNA (リンカーの一部として用いられる)
SEQ ID NO: 08 相補的17merのss-DNA (リンカーの一部として用いられる)
SEQ ID NO: 09 抗トロポニン抗体aに対するエピトープ「A」
SEQ ID NO: 10 抗トロポニン抗体bに対するエピトープ「B」
SEQ ID NO: 11 IGF-1R (1340-1366)
SEQ ID NO: 12 hInsR (1355-1382)
SEQ ID NO: 13 35merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 14 75merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 15 95merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 16 4D5 FAB'重鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 17 4D5 FAB'軽鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 18 2C4 FAB'重鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 19 2C4 FAB'軽鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 20 ErbB2の細胞外ドメイン(ECD)内の残基番号22〜645
配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
SEQ ID NO: 26 抗HER2抗体4D5重鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 27 VH CDR1
SEQ ID NO: 28 VH CDR2
SEQ ID NO: 29 VH CDR3
SEQ ID NO: 30 抗HER2抗体4D5重鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 31 VL CDR1
SEQ ID NO: 32 VL CDR2
SEQ ID NO: 33 VL CDR3
SEQ ID NO: 34 抗HER2抗体2C4重鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 35 VH CDR1
SEQ ID NO: 36 VH CDR2
SEQ ID NO: 37 VH CDR3
SEQ ID NO: 38 抗HER2抗体2C4軽鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 39 VL CDR1
SEQ ID NO: 40 VL CDR2
SEQ ID NO: 41 VL CDR3
X = フルオレセイン、Y = C7アミノリンカー、Z = C3スペーサー
X = Cy5、Y = C7アミノリンカー、Z = C3スペーサー
X = アミノリンカー、Y = フルオレセイン、Z = C3スペーサー
X = フルオレセイン、Y = C7アミノリンカー、Z = C3スペーサー
X = アミノリンカー、Y = フルオレセイン、Z = C3スペーサー
SEQ ID NO: 67 f-Met-Leu-Phe (fMLP)
SEQ ID NO: 68 f-Met-Leu-Phe-o-メチルエステル
SEQ ID NO: 69 IgG1定常ドメイン
SEQ ID NO: 70 IgG2定常ドメイン
SEQ ID NO: 71 IgG4定常ドメイン
SEQ ID NO: 01 VH (mAb 1.4.168)
SEQ ID NO: 02 VL (mAb 1.4.168)
SEQ ID NO: 03 VH (mAb 8.1.2)
SEQ ID NO: 04 VL (mAb 8.1.2)
SEQ ID NO: 05 17merのss-DNA (5'末端で、それぞれ、抗トロポニンT MAB aのFAB'およびIGF-1Rに対するFAB' 1.4.168に共有結合される)
SEQ ID NO: 06 19merのss-DNA (3'末端で、それぞれ、抗トロポニンT MAB bのFAB'およびリン酸化IGF-1Rに対するFAB' 8.1.2に共有結合される)
SEQ ID NO: 07 相補的19merのss-DNA (リンカーの一部として用いられる)
SEQ ID NO: 08 相補的17merのss-DNA (リンカーの一部として用いられる)
SEQ ID NO: 09 抗トロポニン抗体aに対するエピトープ「A」
SEQ ID NO: 10 抗トロポニン抗体bに対するエピトープ「B」
SEQ ID NO: 11 IGF-1R (1340-1366)
SEQ ID NO: 12 hInsR (1355-1382)
SEQ ID NO: 13 35merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 14 75merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 15 95merのL-DNAポリヌクレオチドリンカー
SEQ ID NO: 16 4D5 FAB'重鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 17 4D5 FAB'軽鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 18 2C4 FAB'重鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 19 2C4 FAB'軽鎖アミノ酸配列
SEQ ID NO: 20 ErbB2の細胞外ドメイン(ECD)内の残基番号22〜645
SEQ ID NO: 27 VH CDR1
SEQ ID NO: 28 VH CDR2
SEQ ID NO: 29 VH CDR3
SEQ ID NO: 30 抗HER2抗体4D5重鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 31 VL CDR1
SEQ ID NO: 32 VL CDR2
SEQ ID NO: 33 VL CDR3
SEQ ID NO: 34 抗HER2抗体2C4重鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 35 VH CDR1
SEQ ID NO: 36 VH CDR2
SEQ ID NO: 37 VH CDR3
SEQ ID NO: 38 抗HER2抗体2C4軽鎖可変ドメイン
SEQ ID NO: 39 VL CDR1
SEQ ID NO: 40 VL CDR2
SEQ ID NO: 41 VL CDR3
SEQ ID NO: 68 f-Met-Leu-Phe-o-メチルエステル
SEQ ID NO: 69 IgG1定常ドメイン
SEQ ID NO: 70 IgG2定常ドメイン
SEQ ID NO: 71 IgG4定常ドメイン
実施例1
FAB-ss-DNAコンジュゲートの形成
それぞれ、重複しない異なるエピトープ、つまりエピトープaおよびエピトープbの位置で、ヒト心臓トロポニンTに結合する2つのモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体の両方を現行のRoche Elecsys(商標)トロポニンTアッセイ法において用い、ここでトロポニンTがサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。
FAB-ss-DNAコンジュゲートの形成
それぞれ、重複しない異なるエピトープ、つまりエピトープaおよびエピトープbの位置で、ヒト心臓トロポニンTに結合する2つのモノクローナル抗体を用いた。これらの抗体の両方を現行のRoche Elecsys(商標)トロポニンTアッセイ法において用い、ここでトロポニンTがサンドイッチ免疫アッセイの形式で検出される。
培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、タンパク質化学の最先端の方法を用いて行われた。
精製されたモノクローナル抗体を予め活性化された、パパインでプロテアーゼ消化して(抗エピトープa MAb)、またはペプシンでプロテアーゼ消化して(抗エピトープb MAb)、F(ab')2断片をもたらし、これらをその後、37℃で低濃度のシステアミンによりFAB'断片に還元する。ポリペプチドを含有するサンプル部分からSephadex G-25カラム(GE Healthcare)上にシステアミンを分離することによって、反応を停止させる。
FAB'断片を、下記の活性化ss-DNAaおよびss-DNAbオリゴヌクレオチドとコンジュゲートさせる。
a) 抗トロポニンT (エピトープA)抗体FAB-ss-DNAコンジュゲートA
抗トロポニンT <エピトープa>抗体FAB-ss-DNAaコンジュゲートAの調製の場合には、SEQ ID NO: 05の誘導体、すなわち
を用い、配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = 3'-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG (ChemGenes)を介して導入された3''-アミノ修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
抗トロポニンT <エピトープa>抗体FAB-ss-DNAaコンジュゲートAの調製の場合には、SEQ ID NO: 05の誘導体、すなわち
b) 抗トロポニンT (エピトープB)抗体FAB-ss-DNAコンジュゲートB
抗トロポニンT <エピトープb>抗体FAB-ss-DNAbコンジュゲートBの調製の場合には、SEQ ID NO: 06の誘導体、すなわち
を用い、配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
抗トロポニンT <エピトープb>抗体FAB-ss-DNAbコンジュゲートBの調製の場合には、SEQ ID NO: 06の誘導体、すなわち
それぞれ、SEQ ID NO: 05または06のオリゴヌクレオチドは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。マレイニミド基の導入は、固相オリゴヌクレオチド合成過程の間に組み入れられたZのスクシンイミジル基とのYのアミノ基の反応によって行われた。
上に示した一本鎖DNA構築体は、システアミン処理によって作製されたFAB'ヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB'断片を得るために、FAB'断片に対するss-DNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB'断片(ss-DNA:FAB' = 1 : 1)の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー(カラム: MonoQ, GE Healthcare)によって行う。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲルろ過クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEによって達成する。
実施例2
ビオチン化リンカー分子の形成
それぞれ、ss-DNAリンカーL1、L2およびL3において用いられるオリゴヌクレオチドは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法により、およびビオチン化のためのビオチン化ホスホラミダイト試薬の利用により合成された。
ビオチン化リンカー分子の形成
それぞれ、ss-DNAリンカーL1、L2およびL3において用いられるオリゴヌクレオチドは、最先端のオリゴヌクレオチド合成法により、およびビオチン化のためのビオチン化ホスホラミダイト試薬の利用により合成された。
リンカー1 (=L1)、つまりスペーサーを持たないビオチン化ss-DNAリンカー1は、以下の組成を有する。
これは、それぞれ、SEQ ID NO: 7および8のss-DNAオリゴヌクレオチドを含み、ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることによりビオチン化された。
リンカー2 (=L2)、つまり10merのスペーサーを持つビオチン化ss-DNAリンカー2は、以下の組成を有する。
これは、それぞれ、SEQ ID NO: 7および8のss-DNAオリゴヌクレオチド、2度の、各チミジン5個のオリゴヌクレオチドストレッチを含み、ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることによりビオチン化された。
リンカー3 (=L3)、つまり30merのスペーサーを持つビオチン化ss-DNAリンカー3は、以下の組成を有する。
これは、それぞれ、SEQ ID NO: 7および8のss-DNAオリゴヌクレオチド、2度の、各チミジン15個のオリゴヌクレオチドストレッチを含み、ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を用いることによりビオチン化された。
実施例3
一価トロポニンT結合剤aおよびbに対する各エピトープ
個々に、それぞれ、抗トロポニンT抗体aおよびbに由来する対応のFAB'断片に対する中等度の親和性しか持たない合成ペプチドを構築した。
一価トロポニンT結合剤aおよびbに対する各エピトープ
個々に、それぞれ、抗トロポニンT抗体aおよびbに由来する対応のFAB'断片に対する中等度の親和性しか持たない合成ペプチドを構築した。
a) 抗体aに対するエピトープ「A」は
に含まれ、配列中、Uはβ-アラニンを表す。
b) 抗体bに対するエピトープ「B」は
に含まれ、配列中、Oはアミノ-トリオキサ-オクタン酸を表す。
当業者には理解されるように、これらの2つのエピトープ含有ペプチドを2通りの方法で組み合わせることが可能であり、エピトープ「A」および「B」を直線的に組み合わせることによって両方の変種を設計し、調製した。両方の変種の配列、つまりエピトープ「A」-「B」(= TnT 1)および「B」-「A」(= TnT 2)の直鎖状配列は、それぞれ、最先端のペプチド合成法により調製した。
それぞれ、エピトープ「A」および「B」に対する配列は、それに対するFABの各々の結合親和性を減らすためにヒト心臓トロポニンT配列(P45379/UniProtKB)のオリジナルのエピトープと比べて改変された。このような状況の下、ヘテロ-二価結合の効果の動態は、例えばBIAcore技術で結合親和性を分析することにより、いっそう良好に視認できる。
実施例4
生体分子の相互作用分析
この実験のため、BIAcore 3000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分により行った。
生体分子の相互作用分析
この実験のため、BIAcore 3000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分により行った。
HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20をシステム緩衝液として用いた。サンプル緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。
BIAcore 3000システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で駆動された。フローセル1は7 RUのD-ビオチンで飽和させた。フローセル2には、1063 RUのビオチン化ss-DNAリンカーL1を固定化した。フローセル3には、879 RUのビオチン化ss-DNAリンカーL2を固定化した。フローセル4には、674 RUのビオチン化ss-DNAリンカーL3を捕捉した。
その後、FAB断片DNAコンジュゲートAを600 nMで注入した。FAB断片DNAコンジュゲートBはシステムへ900 nMで注入した。これらのコンジュゲートを2 μl/分の流速で3分間注入した。これらのコンジュゲートを継続的に注入して、各FAB断片DNAコンジュゲートの、その各リンカーに対しての各飽和シグナルをモニターした。FABの組み合わせは、各リンカーに存在する単一のFAB断片DNAコンジュゲートA、単一のFAB断片DNAコンジュゲートBならびにFAB断片DNAコンジュゲートAおよびBの両方で推進された。安定なベースラインは、リンカーがFAB断片DNAコンジュゲートによって飽和された後に作製されたが、これはさらなる動態測定のための必須条件であった。
ペプチドアナライトTnT1およびTnT2は、表面提示されたFAB断片と相互作用させるためにシステムへ溶液中のアナライトとして注入した。
TnT1は500 nMのアナライト濃度で注入し、TnT2は900 nMのアナライト濃度で注入した。両方のペプチドを4分の会合時間、50 μl/分で注入した。解離を5分間モニターした。再生は全てのフローセルで50 μl/分の50 mM NaOHでの1分の注入により行った。
動態データはBIAevaluationソフトウェア(V.4.1)を用いて決定した。表面提示された各FAB断片の組み合わせからのTnT1およびTnT2ペプチドの解離速度KD (s-1)は、線形Langmuir 1 : 1適合モデルにしたがって決定した。一次動態方程式ln(2)/(60＊kD)の解にしたがい分単位の複合体半減時間を計算した。
結果:
それぞれ、表5および6に示した実験データは、それぞれ、一価dsDNA FAB AまたはBコンジュゲートと比べて、それぞれ、アナライト(TnT1またはTnT2)と、さまざまなヘテロ二価FAB-FABコンジュゲートA-Bとの間の複合体安定性の増大を実証する。この効果は各表中、列2および列3と比べて列1において認められる。
それぞれ、表5および6に示した実験データは、それぞれ、一価dsDNA FAB AまたはBコンジュゲートと比べて、それぞれ、アナライト(TnT1またはTnT2)と、さまざまなヘテロ二価FAB-FABコンジュゲートA-Bとの間の複合体安定性の増大を実証する。この効果は各表中、列2および列3と比べて列1において認められる。
（表５）さまざまな長さのリンカーとともにTnT1を用いた分析データ
（表６）さまざまな長さのリンカーとともにTnT2を用いた分析データ
結合力の効果はさらに、リンカーの長さに依存する。表1下に示した副表において、30merのリンカーL3が最も低い解離速度または最も高い複合体安定性を示し、表2下に示した副表において、10merのL2リンカーが最も低い解離速度または最も高い複合体安定性を示す。これらのデータは総合すれば、本発明において示したアプローチに固有のリンカー長の柔軟性が大変有用であり、有利であることを実証している。
実施例5
FAB'-ss-DNAコンジュゲートの形成
重複しない異なるエピトープAおよびBの位置でヒトHER2 (ErbB2またはp185neu)に結合する2種のモノクローナル抗体を用いた。第1の抗体は抗HER2抗体4D5 (huMAb4D5-8、rhuMab HER2、トラスツズマブまたはHERCEPTIN(登録商標); 全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 5,821,337を参照のこと)である。第2の抗体は抗HER2抗体2C4 (ペルツズマブ)である。
FAB'-ss-DNAコンジュゲートの形成
重複しない異なるエピトープAおよびBの位置でヒトHER2 (ErbB2またはp185neu)に結合する2種のモノクローナル抗体を用いた。第1の抗体は抗HER2抗体4D5 (huMAb4D5-8、rhuMab HER2、トラスツズマブまたはHERCEPTIN(登録商標); 全体が参照により本明細書に組み入れられるUS 5,821,337を参照のこと)である。第2の抗体は抗HER2抗体2C4 (ペルツズマブ)である。
培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、タンパク質化学の最先端の方法を用いて行うことができる。
精製されたモノクローナル抗体を、予め活性化されたパパインまたはペプシンでプロテアーゼ消化して、F(ab')2断片をもたらす。これらをその後、37℃で低濃度のシステアミンによりFAB'断片に還元する。ポリペプチドを含有するサンプル部分からSephadex G-25カラム(GE Healthcare)上にシステアミンを分離することによって、反応を停止させる。
得られたFAB'断片を活性化ss-DNAポリヌクレオチドとコンジュゲートさせる。
a) 抗HER2抗体4D5 FAB'-ss-DNAコンジュゲート
抗HER2抗体4D5 FAB'-ss-DNAコンジュゲートの調製の場合には、SEQ ID NO: 05の誘導体、すなわち
を用い、配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
抗HER2抗体4D5 FAB'-ss-DNAコンジュゲートの調製の場合には、SEQ ID NO: 05の誘導体、すなわち
b) 抗HER2抗体2C4 FAB'-ss-DNAコンジュゲート
抗HER2抗体2C4 FAB'-ss-DNAコンジュゲートBの調製の場合には、SEQ ID NO: 06の誘導体、すなわち
を用い、配列中、X = ホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入されたプロピレン-ホスフェートであり、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつ配列中、Z = スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)を介して導入された4[N-マレイニミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシである。
抗HER2抗体2C4 FAB'-ss-DNAコンジュゲートBの調製の場合には、SEQ ID NO: 06の誘導体、すなわち
それぞれ、SEQ ID NO: 05またはSEQ ID NO: 06のポリヌクレオチドは、最先端のポリヌクレオチド合成法によって合成された。マレイニミド基の導入は、固相ポリヌクレオチド合成過程の間に組み入れられたYのアミノ基とスルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(ThermoFischer)との反応によって行われた。
一本鎖DNA構築体は、システアミン処理によって作製されたFAB'ヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB'断片を得るために、FAB'断片に対するss-DNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB'断片(ss-DNA:FAB' = 1 : 1)の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー(カラム: MonoQ, GE Healthcare)によって行う。効率的な標識および精製の検証は、分析的ゲルろ過クロマトグラフィーおよびSDS-PAGEによって達成する。
実施例6
生体分子の相互作用分析
この実験のため、BIAcore T100機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMの50 mM NaOH, pH 8.0中1 MのNaClの注入3×1分、引き続いて10 mMのHClの注入1分により行った。システム緩衝液はHBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% P 20)であった。サンプル緩衝液は、1 mg/mlのCMD (カルボキシメチルデキストラン)を補充したシステム緩衝液であった。
生体分子の相互作用分析
この実験のため、BIAcore T100機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMの50 mM NaOH, pH 8.0中1 MのNaClの注入3×1分、引き続いて10 mMのHClの注入1分により行った。システム緩衝液はHBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% P 20)であった。サンプル緩衝液は、1 mg/mlのCMD (カルボキシメチルデキストラン)を補充したシステム緩衝液であった。
ビオチン化ss-L-DNAリンカーを各フローセル中のSA表面に捕捉させた。フローセル1はアミノ-PEO-ビオチン(PIERCE)で飽和させた。
40 RUのビオチン化35merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル2に捕捉させた。55 RUのビオチン化75merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル3に捕捉させた。60 RUのビオチン化95merオリゴヌクレオチドリンカーを、フローセル4に捕捉させた。
250 nMの抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAをシステムへ3分間注入した。300 nMの抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAをシステムへ5分間2 μl/分で注入した。DNA標識FAB断片を単独でまたは組み合わせで注入した。
対照として、250 nMの抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-D-DNAおよび300 nMの抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-D-DNAしかシステムへ注入しなかった。さらなる対照として、DNA標識FAB断片の代わりに緩衝液を注入した。各ss-L-DNA二官能性リンカーに対してのss-L-DNA標識FAB断片のハイブリダイゼーションの後、溶液中のアナライトhHER2-ECDを3.5分の会合相の間、100 μl/分でシステムへ24 nM、8 nM、3 nM、1 nM、0.3 nM、0 nMの異なる濃度系列で注入した。解離相を15分間100 μl/分でモニターした。システムは20 μl/分の100 mMのグリシン緩衝液(Glycine pH 11, 150 mM NaCl)での30秒の注入、その後、30 μl/分での水の1分の二次注入によって再生させた。
シグナルをアナライトの濃度依存的な時間分解センサグラムとして測定した。BIAcore BIAevaluationソフトウェア4.1を用いてデータを評価した。適合モデルとして、標準的なLangmuirバイナリ結合モデルを用いた。
結果:
ss-D-DNA標識FAB断片は、センサ表面に提示されたシュピーゲルマーのss-L-DNAリンカーとハイブリダイズしなかったので、ss-D-DNA標識FAB断片をシステムに注入した場合にはHER2-ECDの相互作用を観測することができなかった(図2)。
ss-D-DNA標識FAB断片は、センサ表面に提示されたシュピーゲルマーのss-L-DNAリンカーとハイブリダイズしなかったので、ss-D-DNA標識FAB断片をシステムに注入した場合にはHER2-ECDの相互作用を観測することができなかった(図2)。
表7: 複合体形成実験の動態の結果。リンカー: 表面提示されたビオチン化ss-L-DNAポリヌクレオチドリンカー、リンカーの長さが異なるオリゴ_35mer-Bi、オリゴ_75mer-Biおよびオリゴ_95mer-Bi。ss-L-DNA-FAB: 2C4-ss-L-DNA: 19mer-フルオレセインで標識された抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA。4D5-ss-L-DNA: 17mer-フルオレセインで標識された抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA。4D5-+2C4-ss-L-DNA: 表面提示された両断片組み合わせ。LRU: センサ表面にハイブリダイズされる、反応単位質量。抗原: 溶液中のアナライトとして87 kDaのHER2-ECDを用いた。ka: (Ms-1)単位の会合速度。kD: (s-1)単位の解離速度。t1/2解離: 一次動態方程式の解ln(2)/kD＊3600にしたがい時間単位で計算された抗原複合体の半減時間。kD: モル単位の親和性。kD: ピコモル単位で計算された親和性。Rmax: 反応単位(RU)での飽和時の最大のアナライト反応シグナル。MR: 相互作用の化学量論を示す、モル比。Chi2, U-値: 測定の品質指標。
（表７）
BIAcoreセンサグラムは35mer複合体HER2-ECDの相互作用の濃度依存測定を示す(図3)。このリンカーは、もっぱらDNA標識のハイブリダイゼーションの原動力となる配列からなる。動態データから、完全に樹立された複合体が動態性能の改善のないことを示すものと示唆される。これは、35merの不十分なリンカー長および柔軟性の欠如によるものである。
BIAcoreセンサグラムは75mer複合体HER2-ECDの相互作用の濃度依存測定を示す(図4)。75merのリンカーは35merのリンカーと比べて、リンカーの長さを増すためにポリTを保有する。動態データから、完全に樹立された複合体がその動態性能の劇的な改善を示すものと示唆される。これは、75merの最適なリンカー長および柔軟性によるものである。
BIAcoreセンサグラムは95mer複合体HER2-ECDの相互作用の濃度依存測定を示す(図5)。95merのリンカーは35merのリンカーと比べて、リンカーの長さを増すためにポリTを保有する。動態データから、完全に樹立された複合体がその動態性能の劇的な改善を示すものと示唆される。これは、95merのリンカー長および柔軟性の増大によるものである。
BIAcoreアッセイのセットアップには以下が含まれた(同様に、図1を参照されたい): ss-L-DNA二官能性リンカーをBIAcore SAセンサ上に提示した。フローセル1は対照としての役割を果たした。溶液中のアナライトHer2-ECDを用いた。抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAおよび抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAを、表面提示されたリンカーとハイブリダイズさせた。
初めて、高度に柔軟なss-L-DNAリンカーによってともに連結されたHerceptin-FABとペルツズマブ-FABとの間の十分に機能的で協調的な結合事象をここに示す。表3中のデータは、協調的な結合事象の存在の証拠を提供する。完全に樹立された複合体のRmax値が一つずつのFAB腕の構築体のシグナルの高さのほぼ2倍であるにもかかわらず、モル比の値はちょうど1 (MR = 1)である。これは両FAB断片の同時に行われる、協調的な結合事象の存在の明らかな証拠である。複合体は1 : 1のLangmuir結合化学量論で単一分子と見なす。2つの個別結合性のHER2接触面を有するにもかかわらず、1つの複合体と2つのHER2ドメインとの間の分子間結合を検出することはできない。
モノクローナル抗体の相乗作用対の、または化学的に架橋された二重特異性F(ab')2の結合力定数は一般に、個々のモノクローナル抗体の親和性定数よりも最大で15倍高いだけであり、これは、反応物間の理想の組み合わせで予想される理論的な結合力よりも著しく低い(Cheong, H.S., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 173 (1990) 795-800)。この理論によって束縛されるわけではないが、この理由の1つは、相乗的結合(高い結合力をもたらす)に関与する個々のエピトープ/パラトープの相互作用が、最適な相乗作用を得るように互いに対して特定の方法で配向されなければならないということである可能性がある。
さらに、表7に提示されたデータは、ss-L-DNAハイブリダイゼーションの原動力だけからなる短い35merのリンカーが、協調的な結合効果を生み出すのに十分な柔軟性または/およびリンカー長を示さないという証拠を提供する。35merのリンカーは固い、二重らせんL-DNA構築体である。ハイブリダイゼーションが二重L-DNAらせんを生じ、これはss-L-DNA配列よりも短く、柔軟性が低い。らせんは自由度の低減を示し、固いリンカー構築体と見なすことができる。表7は、35merのリンカーが協調的な結合事象を生み出しえないことを示す。
リンカーの長さを高度に柔軟なポリ-T ss-L-DNAにより延長して、それぞれ、75merおよび95merを形成させることで、親和性の増大およびとりわけ抗原複合体安定性kD (s-1)の増大をもたらす。
chi2値は良質の測定結果を示す。全ての測定結果は極小の誤差を示す。データはLangmuir 1 : 1適合モデルの残差逸脱度(fitting model residuals deviate)に適合させることができ、データを得るためにわずか+/- 1のRU、小さいchi2値およびわずか10回の反復計算が必要であった。
協調的な結合効果は、自由結合エネルギーΔG1およびΔG2が集約するという点で、物理法則にしたがって作用する。親和性は倍加する: KDcoop = KD1×KD2。さらに、解離速度も倍加する: KDcoop = kd1×KD2。これは、75merおよび95merのリンカーの実験においてまさしく観測可能である。これは、それぞれ、4146時間(173日)および3942時間(164日)の非常に長い複合体半減時間をもたらす。親和性は100 fmol/lの範囲内である。協調的な結合事象が起こることが明らかである。
全ての完全に樹立された複合体の会合速度は、一つずつハイブリダイズされた構築体と比べて、いっそう速い。より高い分子量を示すにもかかわらず、会合速度は増大する。
ここで、本発明者らは、本明細書において報告される複合体においてともに連結されたトラスツズマブおよびペルツズマブがHER-2細胞外ドメイン(ECD)に同時に結合することを示すことができた。両方のFAB断片は、HER2-ECDの真のエピトープ(PDB 1S78およびPDB 1N82)に結合する。さらに、両方のFAB断片は、その結合角度がかなり異なる。最適な75mer (30 nm) ss-L-DNAのリンカー長ならびにその有益な柔軟性および長さ特性を用いることにより、協調的な結合事象を示すことができた。
シグナルをアナライトの濃度依存的な時間分解センサグラムとして測定した。BIAcore BIAevaluationソフトウェア4.1を用いてデータを評価した。適合モデルとして、標準的なLangmuirバイナリ結合モデルを用いた。
実施例7
さらなる生体分子の相互作用分析
BIAcore 3000機器にCM-5センサチップを取り付けた。センサは製造元(GE healthcare, Uppsala, Sweden)から推奨されているようにプレコンディショニングされた。システム緩衝液は(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20)であった。システム緩衝液はサンプル緩衝液としても使われた。システムは制御ソフトウェア4.1の下、25℃で操作された。
さらなる生体分子の相互作用分析
BIAcore 3000機器にCM-5センサチップを取り付けた。センサは製造元(GE healthcare, Uppsala, Sweden)から推奨されているようにプレコンディショニングされた。システム緩衝液は(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20)であった。システム緩衝液はサンプル緩衝液としても使われた。システムは制御ソフトウェア4.1の下、25℃で操作された。
10 mM酢酸緩衝液pH 4.5中30 μg/mlのポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-Fcγ抗体(Jackson Laboratories, USA)をフローセル1に13,952 RUでおよびフローセル2に15,047 RUで標準的なNHS/EDC化学により固定化した。10 mMグリシンpH 1.5緩衝液の20秒のパルス、10 mMグリシンpH 1.7緩衝液の1分のパルス、および10 mMグリシンpH 1.5緩衝液の30秒のパルスを用い20 μl/分でシステムを再生した。フローセル1に、5 nM huIgG (Bayer Healthcare)を参照として10 μl/分で1分間注入した。
フローセル2に、10 nMのヒトHER2細胞外受容体FCキメラ(hHER2-ECDpresSFc)を10 μl/分で1分間注入した。典型的には、100反応単位の予構築ホモ二量体hHER2-ECDpresSFcをヤギ抗ヒトIgG-Fcγ抗体によってフローセル2に、ヒトFC部分を介して捕捉した。典型的には、130反応単位のhuIgGをフローセル1に、ヒトFC部分を介して捕捉した。
フローセル2のシグナルをフローセル1に対して参照とした。
ss-L-DNA標識FAB断片の抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAおよび抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAを75merのss-L-DNAリンカーと、1 : 1 : 1のモル化学量論によりハイブリダイズさせた。完全に樹立された複合体2C4-75mer-4D5をシステムへ50 nMで3分間注入した。対照として、単一のFAB断片をシステムへ50 nMで注入した。
注入終了の直後に、250 nMのストレプトアビジンまたはシステム緩衝液を10 μl/分で3分間システムへ注入した。75merのリンカーはその配列の中央に単一のビオチン成分を含むので、SAはFAB断片の存在ではなく、リンカー内のビオチンを認識するためのプローブとして働くはずである。
別の実験では、完全に樹立された4D5-75mer-2C4複合体を異なる濃度段階0 nM、0.6 nM、1.9 nM、2×5.6 nM、16.7 nM、50 nMにて3分間10 μl/分でシステムへ注入した。hHER2-ECDpresSFcアナライトの濃度依存的な反応レベルをモニターした。反応レベルをhHER2-ECDpresSFcの濃度段階に対してプロットした。ソフトウェアOrigin 7を用いてデータを視覚化した。Origin 7ソフトウェアによって提供されているHill方程式y=Vmax ＊xn/(kn+xn)を用いてデータを適合した。
BIAcoreアッセイのセットアップには以下が含まれた(同様に、図6を参照されたい): ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG-Fcγ抗体をBIAcore CM5センサに固定化し、huFcキメラHER2 ECDの捕捉システムとして役立てた。抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA (2C4 FAB)、抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA (4D5 FAB)および完全に樹立された複合体を注入し、引き続いてストレプトアビジン(SA)の注入を行った。実験の目的は、75merのss-L-DNAリンカー内のビオチン成分の存在および接近可能性を実証することである。
実験の結果を図7に描く。BIAcoreセンサグラムは、抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNA (2C4)、抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNA (4D5)、および75merのss-L-DNAリンカーにより接続され完全に樹立された複合体(2C4-75mer-4D5)の50 nMの注入による相互作用シグナルの重ね合わせプロットを示す。重ね合わせプロットから、完全に樹立された複合体結合剤(2C4-75mer-4D5 + 緩衝液)は、137 kDaというさらに高いその質量によって、FAB断片の注入(2C4 + 緩衝液、4D5 + 緩衝液)と比べた場合に、さらに高いシグナル反応レベルを生ずることが示される。FAB断片は、それぞれ、57 kDaの計算上の分子量を有する。420秒での注入終了の直後に、250 nMのストレプトアビジンまたはシステム緩衝液を注入した。両矢印は、緩衝液の注入(2C4-75mer-4D5 + 緩衝液)と比べて250 nMのストレプトアビジンの注入(2C4-75mer-4D5 + SA)により誘導された14 RUのシグナルシフト(ΔRU)に印を付けている。FAB断片はSA注入によるシグナルシフトがないことを示し、緩衝液のシグナルレベルにとどまっている((2C4 + SA)、(2C4 + 緩衝液)、(4D5 + SA)、(4D5 + 緩衝液))。ストレプトアビジンはエフェクター成分である。ストレプトアビジンはss-L-DNAリンカーの接近可能性を示す。
表面提示されたhuFcキメラHER2 ECDと相互作用する、溶液中のアナライトとしての完全に樹立された75mer複合体の濃度依存的な測定結果の重ね合わせプロットを示すBIAcoreセンサグラムを図8に示す。黒線はデータに関する1 : 1 Langmuir適合を表す。動態データ、会合速度ka = 1.25＊105 Ms-1、解離速度KD = 3.39＊10-5 s-1、親和性定数0.3 nM。
図8の反応レベルは、完全に樹立された複合体のアナライト濃度に対してプロットされた(図9)。データをhill方程式にしたがって適合させ、hill因子を決定した(Origin 7)。方程式: y=Vmax ＊xn/(kn+xn)、Chi2/DoF = 0.6653、R2= 0.99973; n = 1.00201 +/- 0.06143。
表8には、図6に描いたBIAcoreアッセイ形式からの動態データを示す。協調的な結合効果は溶液中の複合体によって生み出すことができる。モル比は、正確に単一の複合体が単一のHER2-ECDキメラを認識することを示す。動態データ、会合速度ka Ms-1、解離速度kD s-1、親和性定数KD (M)および(nM)単位、最大結合反応シグナル(Rmax)、捕捉されたhuFcキメラHer2ECDリガンドの量(RU)、Langmuir t1/2解離にしたがう複合体半減時間。結合事象の化学量論を示す、モル比MR。誤差chi2。4D5-2C4-75merは、完全に樹立された複合体である。4D5-75merおよび2C4-75merはFAB断片であるが、ss-L-DNA 75merリンカーとハイブリダイズする。
（表８）
表8に提示したデータから、75mer ss-L-DNAリンカーによって接続され、完全に樹立された複合体は協調的な結合を示すことが実証される。単一のFAB断片は、完全に樹立された複合体と比べて、より低い親和性を示す。Rmaxでのシグナルレベルは、単一のFAB断片と比べて複合体の分子量の増大を示す。より高いシグナルレベルにもかかわらず、モル比はちょうど1.1である。これは、統計的に各複合体が単一のhuFcキメラHER2 ECD分子に結合することを示す。
協調性による増幅率は、複合体がセンサ表面にアセンブルされた先のアッセイ形式と比べた場合にそれほど高くない。KDcoopは最大6倍まで誘因される。理論によって束縛されるわけではないが、これは、ホモ二量体huFcキメラHER2 ECDの性質によるものでありえた。潜在的に、二重結合剤は、huFc HER2キメラにおける2つの分離したHER2 ECDを認識するが、協調性を完全には樹立することができない。
生細胞に対するフィコエリトリン標識ストレプトアビジンプローブを用いたFACS分析(次の実施例を参照のこと)により、色素形態のエフェクター成分の効率的な送達を示すことができた。ストレプトアビジン標識プローブは、75mer ss-L-DNAリンカー構築体におけるビオチン成分に容易に接近することができた。
上記の測定からのデータをHillプロットの作成に用いた(図9)。複合体のHill分析から、FAB断片の結合事象は相互に独立しており、相互に干渉しないことが示される。HER2分子の構造障害という点から協調的結合を検出できなかったが、Hill係数(n = 1.00201 +/- 0.06143)はちょうど1である。それゆえ、リンカーの化学的構造(linker chemistry)、ss-L-DNAリンカーの性質およびオリゴ標識FAB断片は、標的分子の認識にマイナスに干渉していない。
実施例8
さらなる複合体 - 合成および特徴付け
ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成
それぞれ、SEQ ID NO: 05および06に示した配列を含む以下のアミノ修飾前駆体は、標準的な方法にしたがって合成された。下記のオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく、蛍光色素も含む。当業者なら容易に理解するように、この蛍光色素は、したがってオリゴヌクレオチドの、およびそれらを含む構成成分の精製を容易にするのに非常に好都合である。
さらなる複合体 - 合成および特徴付け
ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの合成
それぞれ、SEQ ID NO: 05および06に示した配列を含む以下のアミノ修飾前駆体は、標準的な方法にしたがって合成された。下記のオリゴヌクレオチドは、いわゆるアミノリンカーだけでなく、蛍光色素も含む。当業者なら容易に理解するように、この蛍光色素は、したがってオリゴヌクレオチドの、およびそれらを含む構成成分の精製を容易にするのに非常に好都合である。
合成は市販のCPGを固体支持体として、ならびに標準的なdA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いトリチルオンモード(5'アミノ修飾の場合)またはトリチルオフモード(3'アミノ修飾の場合)にて10 μmolのスケールでABI 394合成機にて行った。
以下のアミダイト、アミノ修飾剤およびCPG支持体を用いて、オリゴヌクレオチド合成の間に、それぞれ、C3-スペーサー、色素およびアミノ成分を導入した:
- スペーサーホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- 5'アミノ修飾剤は5'-アミノ-修飾剤C6 (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によって導入される;
- 5'-フルオレセインホスホラミダイト6-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル-6-カルボキサミド)-ヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research);
- Cy5(商標)ホスホラミダイト1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピルホスホロアミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンクロリド(Glen Research);
- LightCycler Fluorescein CPG 500 A (Roche Applied Science); および
- 3'-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500 A (ChemGenes)。
- スペーサーホスホラミダイトC3 (3-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)プロピル-1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- 5'アミノ修飾剤は5'-アミノ-修飾剤C6 (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)の使用によって導入される;
- 5'-フルオレセインホスホラミダイト6-(3',6'-ジピバロイルフルオレセイニル-6-カルボキサミド)-ヘキシル-1-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research);
- Cy5(商標)ホスホラミダイト1-[3-(4-モノメトキシトリチルオキシ)プロピル]-1'-[3-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピルホスホロアミジチル]プロピル]-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニンクロリド(Glen Research);
- LightCycler Fluorescein CPG 500 A (Roche Applied Science); および
- 3'-アミノ修飾剤TFAアミノC-6 lcaa CPG 500 A (ChemGenes)。
Cy5標識オリゴヌクレオチドの場合、dA(tac)、dT、dG(tac)、dC(tac)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用い、33%アンモニアでの脱保護を室温で2時間行った。
L-DNAオリゴヌクレオチドはβ-L-dA(bz)、dT、dG (iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(ChemGenes)の使用によって合成された。
フルオレセイン修飾されたハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの精製は、2段階の手順によって行われた: 最初に、オリゴヌクレオチドを逆相HPLC (Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム; 勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]: 1.0 ml/分の流速で3分、A中20%のB、12分、A中20〜50%のBおよび25分、A中20%のB、260 nmで検出)にて精製した。所望の産物を含有する画分(分析的RP HPLCによってモニターされた)を混ぜ合わせ、蒸発乾固させた。(モノメトキシトリチル保護アルキルアミノ基により5'末端の位置で修飾されたオリゴヌクレオチドは、20分間20%酢酸とともにインキュベートすることによって脱トリチル化される)。標識としてフルオレセインを含んだオリゴマーは、HPLCでのIEXクロマトグラフィー[Mono Qカラム: 緩衝液A: 水酸化ナトリウム(10 mmol/l; pHおよそ12) 緩衝液B 水酸化ナトリウム(10 mmol/l; pHおよそ12)に溶解された1 Mの塩化ナトリウム 勾配: 1 ml/分の流速で100%緩衝液Aから100%緩衝液Bへ30分にて; 260 nmで検出]によって再度精製された。産物を透析によって脱塩した。
Cy5標識オリゴマーを逆相HPLC (Merck-Hitachi-HPLC; RP-18カラム; 勾配系[A: 0.1 M (Et3NH)OAc (pH 7.0)/MeCN 95:5; B: MeCN]: 1.0 ml/分の流速で3分、A中20%のB、12分、A中20〜50%のBおよび25分、A中20%のB、260 nmで検出)での最初の精製の後に用いた。オリゴマーを透析によって脱塩し、Speed-Vacエバポレータにて凍結乾燥し、固形物を得、これを-24℃で凍結させた。
ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの活性化
実施例2からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを0.1 Mのホウ酸ナトリウム緩衝液pH 8.5の緩衝液に溶解し(c= 600 μmol)、Thermo Scientificからの、DMFに溶解された18倍モル過剰のスルホSMCC (スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(c= 3 mg/100 μl)と反応させた。スルホ-SMCC 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートの加水分解産物を除去するために、反応産物を水に対して十分に透析した。
実施例2からのアミノ修飾されたオリゴヌクレオチドを0.1 Mのホウ酸ナトリウム緩衝液pH 8.5の緩衝液に溶解し(c= 600 μmol)、Thermo Scientificからの、DMFに溶解された18倍モル過剰のスルホSMCC (スルホスクシンイミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレート(c= 3 mg/100 μl)と反応させた。スルホ-SMCC 4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシレートの加水分解産物を除去するために、反応産物を水に対して十分に透析した。
透析物を蒸発によって濃縮し、チオール基を含む一価結合剤とのコンジュゲーションに直接用いた。
ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを両端に含むリンカーオリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、市販のdT-CPGを固体支持体として用い、ならびに標準的なdA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いトリチルオンモードにて10 μmolのスケールでABI 394合成機にて標準的な方法により合成された。
オリゴヌクレオチドは、市販のdT-CPGを固体支持体として用い、ならびに標準的なdA(bz)、dT、dG(iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(Sigma Aldrich)を用いトリチルオンモードにて10 μmolのスケールでABI 394合成機にて標準的な方法により合成された。
L-DNAオリゴヌクレオチドは市販のβL-dT-CPGを固体支持体として、ならびにβ-L-dA(bz)、dT、dG (iBu)およびdC(Bz)ホスホラミダイト(ChemGenes)を用いることによって合成された。
オリゴヌクレオチドの精製は、実施例3の下で記述したように逆相HPLCにて行われた。所望の産物を含有する画分(分析的RP HPLCによってモニターされた)を混ぜ合わせ、蒸発乾固させた。脱トリチル化は15分間80%酢酸とともにインキュベートすることによって行われた。酢酸は蒸発により除去した。残り(reminder)を水に溶解し、凍結乾燥した。
以下のアミダイトおよびCPG支持体を用いて、オリゴヌクレオチド合成の間にC18スペーサー、ジゴキシゲニンおよびビオチン基を導入した:
- スペーサーホスホラミダイト18 (18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール, 1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- ビオチンホスホラミダイト1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト; ならびに
- アミノ修飾およびジゴキシゲニン-N-ヒドロキシル-スクシンイミジルエステルでの後標識のための5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン, 3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
- スペーサーホスホラミダイト18 (18-O-ジメトキシトリチルヘキサエチレングリコール, 1-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- ビオチン-dT (5'-ジメトキシトリチルオキシ-5-[N-((4-t-ブチルベンゾイル)-ビオチニル)-アミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン-3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト(Glen Research);
- ビオチンホスホラミダイト1-ジメトキシトリチルオキシ-2-(N-ビオチニル-4-アミノブチル)-プロピル-3-O-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト; ならびに
- アミノ修飾およびジゴキシゲニン-N-ヒドロキシル-スクシンイミジルエステルでの後標識のための5'-ジメトキシトリチル-5-[N-(トリフルオロアセチルアミノヘキシル)-3-アクリルイミド]-2'-デオキシウリジン, 3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイト。
以下の架橋構築体またはリンカーを合成した。
上記の架橋構築体の例は少なくとも第1のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドおよび第2のハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドを含む。リンカー3〜18はハイブリダイズ可能な核酸ストレッチに加えて、それぞれ、中央のビオチン化チミジンもしくはジゴキシゲニン化チミジン、または上記の長さのチミジン単位からなるスペーサーを含む。
それぞれ、5'-ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 07に対応し、3'-ハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドはSEQ ID NO: 08に対応する。SEQ ID NO: 07のオリゴヌクレオチドはSED ID NO: 06のオリゴヌクレオチドと容易にハイブリダイズする。SEQ ID NO: 08のオリゴヌクレオチドはSED ID NO: 05のオリゴヌクレオチドと容易にハイブリダイズする。
上記の架橋構築体の例において、[B-L]は、L-DNAオリゴヌクレオチド配列が与えられていることを示し; スペーサーC18、ビオチンおよびビオチンdTはそれぞれ、上記の構成要素に由来のC18スペーサー、ビオチンおよびビオチン-dTをいい; かつ数字の付いたTは、示した位置でリンカーに組み入れられたチミジン残基の数を示す。
複合体のアセンブリ
A) IgGの切断およびss-DNAでのFAB'断片の標識化
精製されたモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けを借りて切断し、F(ab')2断片を得たが、これをその後、37℃で低濃度のシステアミンでの処理によりFAB'断片に還元する。PD 10カラムでのシステアミンの分離によって反応を停止させる。FAB'断片を、実施例3にしたがって生成された活性化オリゴヌクレオチドで標識する。この一本鎖DNA (=ss-DNA)は、FAB'ヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB'断片を得るために、FAB'断片に対するss-DNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB'断片(ss-DNA:FAB' = 1 : 1)の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー(カラム: Source 15 Q PE 4.6/100, Pharmacia/GE)によって行う。効率的な精製の検証は、分析的ゲルろ過およびSDS-PAGEによって達成する。
A) IgGの切断およびss-DNAでのFAB'断片の標識化
精製されたモノクローナル抗体をペプシンプロテアーゼの助けを借りて切断し、F(ab')2断片を得たが、これをその後、37℃で低濃度のシステアミンでの処理によりFAB'断片に還元する。PD 10カラムでのシステアミンの分離によって反応を停止させる。FAB'断片を、実施例3にしたがって生成された活性化オリゴヌクレオチドで標識する。この一本鎖DNA (=ss-DNA)は、FAB'ヒンジ領域のシステインと反応するチオール反応性マレイミド基を保持する。高い割合の単一標識FAB'断片を得るために、FAB'断片に対するss-DNAの相対モル比を低く維持する。単一標識FAB'断片(ss-DNA:FAB' = 1 : 1)の精製は、陰イオン交換クロマトグラフィー(カラム: Source 15 Q PE 4.6/100, Pharmacia/GE)によって行う。効率的な精製の検証は、分析的ゲルろ過およびSDS-PAGEによって達成する。
B) 標的に特異的に結合する2つのポリペプチドを含む複合体のアセンブリ
抗pIGF-1R複合体は、IGF-1Rの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする2つのFAB'断片に基づく: FAB' 8.1.2は標的タンパク質のリン酸化部位(pTyr 1346)を検出し、FAB' 1.4.168は非リン酸化部位を検出する。これらのFAB'断片が一本鎖DNA (ss-DNA)に共有結合的に連結された: FAB' 1.4.168は、SEQ ID NO: 05を含むかつ蛍光マーカーとしてフルオレセインを含有する17merのss-DNAに連結され、FAB' 8.1.2は、SEQ ID NO: 06を含むかつ蛍光マーカーとしてCy5を含有する19merのss-DNAに連結された。以下において、共有結合された17merまたは19merのss-DNAを有するこれらのFAB'を、それぞれ、ss-FAB' 1.4.168およびss-FAB' 8.1.2と名付ける。複合体のアセンブリは、ss-FAB'断片の対応するss-DNAとハイブリダイズするリンカー(すなわち、2つの相補的ss-DNAオリゴヌクレオチド(それぞれ、SEQ ID NO: 7および8)を含む架橋構築体)によって媒介される。複合体の2つのss-FAB'断片の距離は、それぞれ、スペーサー、例えばC18-スペーサーまたは異なる長さのDNAを用いることによって変化させることができる。
抗pIGF-1R複合体は、IGF-1Rの細胞内ドメインの異なるエピトープを標的とする2つのFAB'断片に基づく: FAB' 8.1.2は標的タンパク質のリン酸化部位(pTyr 1346)を検出し、FAB' 1.4.168は非リン酸化部位を検出する。これらのFAB'断片が一本鎖DNA (ss-DNA)に共有結合的に連結された: FAB' 1.4.168は、SEQ ID NO: 05を含むかつ蛍光マーカーとしてフルオレセインを含有する17merのss-DNAに連結され、FAB' 8.1.2は、SEQ ID NO: 06を含むかつ蛍光マーカーとしてCy5を含有する19merのss-DNAに連結された。以下において、共有結合された17merまたは19merのss-DNAを有するこれらのFAB'を、それぞれ、ss-FAB' 1.4.168およびss-FAB' 8.1.2と名付ける。複合体のアセンブリは、ss-FAB'断片の対応するss-DNAとハイブリダイズするリンカー(すなわち、2つの相補的ss-DNAオリゴヌクレオチド(それぞれ、SEQ ID NO: 7および8)を含む架橋構築体)によって媒介される。複合体の2つのss-FAB'断片の距離は、それぞれ、スペーサー、例えばC18-スペーサーまたは異なる長さのDNAを用いることによって変化させることができる。
アセンブリの評価のため、複合体の構成成分ss-FAB' 8.1.2、ss-FAB' 1.4.168およびリンカー構築体(1) (= 例2.4のリンカー17)
および(2) (= 例2.4のリンカー10)
を室温にて等モル量で混合した。1分のインキュベーション段階の後、反応混合物を分析的ゲルろ過カラム(Superdex(商標) 200, 10/300 GL, GE Healthcare)にて分析した。単一の複合体構成成分の溶出体積(VE)と反応混合物のVEとの比較から、複合体が成功裏に形成されたことが実証される(図10)。
固定化されたIGF-1RおよびIRペプチドへの抗pIGF-1R複合体の結合を評価するBIAcore実験
この実験のため、BIAcore 2000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分により行った。
この実験のため、BIAcore 2000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。プレコンディショニングは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分により行った。
HBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20をシステム緩衝液として用いた。サンプル緩衝液はシステム緩衝液と同一であった。BIAcore 2000システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で駆動された。
その後、ビオチン化ペプチドを各フローセル中のSA表面に捕捉させた。16 RUのIGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr; Glu(Bi-PEG-1340]アミド(すなわち、位置番号1340に対応するグルタミン酸を介して結合され、かつ他端の位置でビオチン化されているPEGリンカーを含む、SEQ ID NO: 11の、1346位のチロシンがリン酸化されたペプチド)をフローセル2に捕捉させた。18 RUのIGF-1R(1340-1366); Glu(Bi-PEG-1340]アミド(すなわち、位置番号1340に対応するグルタミン酸を介して結合され、かつ他端の位置でビオチン化されているPEGリンカーを含む、SEQ ID NO: 11の、1346位のチロシンがリン酸化されていないペプチド)をフローセル3に捕捉させた。20 RUのhInsR(1355-1382)[1361-pTyr; Glu(Bi-PEG-1355]アミド(すなわち、ヒトインスリン受容体の位置番号1355に対応するグルタミン酸を介して結合され、かつ他端の位置でビオチン化されているPEGリンカーを含む、SEQ ID NO: 12の、1361位のチロシンがリン酸化されたペプチド)をフローセル4に捕捉させた。最後に、全てのフローセルをd-ビオチンで飽和させた。
複合体形成のため、上記のアセンブリプロトコルを用いた。2つのss-FAB'のうちの1つだけでの個別操作を行った場合、リンカーDNAの有無は会合または解離曲線に影響を与えなかった。
溶液中100 nMのアナライト(すなわち、これらの実験においては、二価の二重結合剤)を240秒の会合時間にわたって50 μl/分で注入し、解離を500秒間にわたってモニターした。効率的な再生は80 mM NaOHによる50 μl/分での1分の注入段階を用いることにより達成された。フローセル1は参照としての役割を果たした。抗原の注入の代わりにブランク緩衝液の注入を用いて、緩衝液のシグナルの減算によりデータの二重参照とした。
各測定サイクルにおいて、溶液中の以下のアナライトのうちの1つを4つ全てのフローセルに注入した: それぞれ、100 nM ss-FAB' 8.1.2、100 nM ss-FAB' 1.4.168、100 nM ss-FAB' 8.1.2および100 nM ss-FAB'の混合物、リンカー(3)
上にハイブリダイズされたss-FAB' 8.1.2およびss-FAB' 1.4.168からなる100 nMの二価結合剤、ならびにリンカー(1)
上にハイブリダイズされたss-FAB' 8.1.2およびss-FAB' 1.4.168からなる100 nMの二価結合剤。
シグナルを時間依存性BIAcoreセンサグラムとしてモニターした。
報告点をアナライトの会合相の終わり(結合終点(Binding Late), BL)に、およびアナライトの解離相の終わり(安定相(Stability Late), SL)に設定して、各相互作用の反応単位のシグナルの高さをモニターした。BIAcore評価ソフトウェア4.1を用い線形1 : 1 Langmuirの適合にしたがって解離速度kD (s-1)を計算した。式ln(2)/(60＊kD)によって分単位の複合体半減時間を計算した。
センサグラム(図11〜図14)は、ss-FAB' 1.4.168およびss-FAB' 1.4.168が複合体(=二価結合剤)の形態で用いられる場合、おそらく、根底にある協調的な結合効果により、pIGF-1R結合の特異性と複合体安定性の両方の増加を示す。FAB' 1.4.168単独では、pIRペプチドに対する交差反応性のないことは示されるものの、IGF-1Rのリン酸化型と非リン酸化型とが識別されない(どちらの場合もT1/2解離 = 3分)。FAB' 8.1.2は、しかしながら、IGF1-Rペプチドのリン酸化型にのみ結合するが、リン酸化インスリン受容体といくらかの望ましくない交差反応性を示す。複合体はpIGF-1Rペプチドと他の両ペプチドとを十分に識別し(図13参照)、したがって、非特異的結合の問題を克服するのに役立つ。両方のFAB'がリンカーDNAなしで適用される場合には、特異性の増加が失われること(図14)に留意されたい。pIGF-1Rペプチドに対する複合体の親和性の増加は、個別のFAB'、およびリンカーDNAを除いたFAB'の混合物と比べて解離半減時間の増大で明らかである(図12および図14)。2つの異なるDNAリンカーを有する試験された複合体は、標的結合特異性および親和性に対し全体としてプラスの効果を共有するが、より長いリンカー(スペーサーとしてT40-Digを有する) (すなわちリンカー15)は両基準に関して有利であるように見える。
M-1.4.168-IgGおよびM-8.1.2のBIAcoreアッセイサンドイッチ
BIAcore T100機器(GE Healthcare)をシステムに取り付けられたBIAcore CM5センサとともに用いた。センサは100 μl/分の0.1% SDS、50 mM NaOH、10 mM HClおよび100 mM H3PO4での1分の注入によりプレコンディショニングされた。
BIAcore T100機器(GE Healthcare)をシステムに取り付けられたBIAcore CM5センサとともに用いた。センサは100 μl/分の0.1% SDS、50 mM NaOH、10 mM HClおよび100 mM H3PO4での1分の注入によりプレコンディショニングされた。
システム緩衝液はHBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20)であった。サンプル緩衝液がシステム緩衝液であった。
BIAcore T100システムは制御ソフトウェアV1.1.1の下で駆動された。10 mMの酢酸ナトリウム(Na-Acetate) pH 4.5中30 μg/mlでポリクローナルウサギIgG抗体<IgGFCγM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)を製造元の使用説明書にしたがってEDC/NHS化学により、それぞれ、フローセル1、2、3および4に10000 RUで固定化した。最後に、センサ表面を1 Mエタノールアミンでブロックした。完全な実験は13℃で駆動された。
500 nMの一次mAb M-1.004.168-IgGを<IgGFCγM>R表面に10 μl/分で1分間捕捉させた。ブロッキング溶液を含有する3 μMのIgG断片混合物(IgGクラスIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3の)を、5分間30 μl/分で注入した。ペプチドIGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr; Glu(Bi-PEG-1340]アミドを30 μl/分にて3分間300 nMで注入した。300 nMの二次抗体M-8.1.2-IgGを30 μl/分で注入した。3分間50 μl/分で10 mMのグリシン-HCl pH 1.7を用いてセンサを再生した。
図15には、アッセイのセットアップを提示する。図18には、測定結果を示す。この測定結果から、両方のモノクローナル抗体がその各標的ペプチドの2つの異なる、無関係のエピトープに同時に結合できることが明らかに示唆される。これは、協調的な結合事象を生み出すことを目的としたいずれかの後の実験に対する必要条件である。
センサ表面のBIAcoreアッセイ複合体
BIAcore 3000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。システムは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分によりプレコンディショニングされた。
BIAcore 3000機器(GE Healthcare)をT = 25℃で、システムに取り付けられたBIAcore SAセンサとともに用いた。システムは100 μl/分で、50 mMのNaOH中1 MのNaClの注入3×1分および10 mMのHCl 1分によりプレコンディショニングされた。
システム緩衝液はHBS-ET (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.05% Tween(登録商標) 20)であった。サンプル緩衝液がシステム緩衝液であった。
BIAcore 3000システムは制御ソフトウェアV4.1の下で駆動された。
124 RUのアミノ-PEO-ビオチンを参照フローセル1に捕捉させた。1595 RUのビオチン化された14.6 kDa T0-Bi 37mer ss-DNAリンカー(1)
(= 例2.4のリンカー17)および1042 RUのビオチン化された23.7 kDa T40-Bi 77mer ss-DNAリンカー(2)
を異なるフローセルに捕捉させた。
300 nMのss-FAB 8.1.2および300 nMのss-FAB 1.004.168を3分間50 μl/分でシステムに注入した。対照として、300 nMのss-FAB 8.1.2または300 nMのss-FAB 1.004.168のみを注入して、各ss-FABの動態寄与を調べた。対照として、ss-Fabの代わりに緩衝液を注入した。ペプチドIGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr]アミド、INR(1355-1382)[1361-pTyr]アミド、IGF-1R(1340-1366)アミドを溶液に遊離させ0 nM、4 nM、11 nM、33 nM (2回)、100 nMおよび300 nMの濃度段階で4分間50 μl/分でシステムに注入した。ペプチドIGF-1R(1340-1366)[1346-pTyr]アミドに対する親和性を測定するための別の態様では、0 nM、0.4 nM、1.1 nM、3.3 nM (2回)、10 nMおよび30 nMの濃度段階であった。
解離を5.3分間50 μl/分でモニターした。システムを各濃度段階の後、250 mM NaOHの12秒のパルスによって再生し、システムにss-FABリガンドを再負荷した。
図17は、BIAcore機器に関してのアッセイのセットアップを図式的に記述している。図18に示した表は、このアプローチからの定量の結果を示す。図19、図20および図21は、このアッセイのセットアップからの例示的なBIAcoreの結果について描いている。
図18の表は、複合体構想の利益を実証している。T40二重結合剤(例2.4のリンカー10を有する二重結合剤、すなわち、T20-ビオチン-dT-T20のスペーサーを有するリンカー)は、抗原複合体の半減時間の2倍の改善(414分)および親和性の3倍の改善(10 pM)を、それぞれが192分および30 pMのT0二重結合剤(すなわちリンカー16を有する二重結合剤)と比べて、もたらす。これは、協調的な至適結合効果を生ずるようにリンカーの長さを最適化する必要性を強調している。
T40二重結合剤(すなわちT40-Biリンカー(リンカー10)を含む二重結合剤)は、リン酸化IGF-1Rペプチドに対して10 pMの親和性を示す(図18の表、図19)。これは、リン酸化インスリン受容体ペプチドに対する2400倍の親和性の改善(24 nM)および非リン酸化IGF-1Rペプチドに対する100倍の改善である。
それゆえ、2つの異なったかつ分離した結合事象の組み合わせによって特異性および親和性を増大するという目標が達成される。
協調的な結合効果はとりわけ、リン酸化IGF-1Rペプチドに対する解離速度から明らかとなり、ここで複合体は、それぞれ、一価結合剤8.1.2単独での0.5分に対して、および一価結合剤1.4.168単独での3分に比べて、414分の抗原複合体の半減時間を示す。
さらに、完全にアセンブルされた構築体はその解離速度kD (s-1)を、一つずつFABがハイブリダイズされた構築体と比べた場合、ほぼ倍加する(図21、図20、図21および図18の表)。興味深いことに、また会合速度ka (Ms-1)は単一FABの相互作用事象と比べた場合にわずかに増大し、これは構築体の分子柔軟性の増大によるものでありうる。
実施例9
結合アッセイ法 - インビトロおよびエクスビボ
検出オリゴヌクレオチドプローブ-Cy5
ss-L-DNA検出オリゴヌクレオチドプローブ-Cy5
は、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。Cy5色素の導入はアミノ基とCy5モノ反応性NHSエステルとの反応により行われた。(GE Healthcare Lifescience, STADT, LAND)。ヌクレオチドには、L-DNAアミダイト(ChemGenes, STADT, LAND)を用いた。固相オリゴヌクレオチド合成過程の間に5'および3'アミノ基を導入し、配列中、Y = (6-(4-モノメトキシトリチルアミノ)ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト(Glen Research)を介して導入された5'-アミノ-修飾剤C6であり、かつZ = 3'アミノ修飾剤TFAアミノC6長鎖アミノアルキルControlled Pore Glass 1000 A (ChemGenes)を介して導入された3'-アミノ修飾剤C6である。
結合アッセイ法 - インビトロおよびエクスビボ
検出オリゴヌクレオチドプローブ-Cy5
ss-L-DNA検出オリゴヌクレオチドプローブ-Cy5
二重結合剤リンカーオリゴヌクレオチド
ss-L-DNAオリゴヌクレオチドリンカー
は、最先端のオリゴヌクレオチド合成法によって合成された。
ss-L-DNAオリゴヌクレオチドリンカー
複合体のアセンブリ
複合体は、SEQ ID NO: 73のss-L-DNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。
複合体は、SEQ ID NO: 73のss-L-DNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。
インビトロ結合アッセイ法
ヒト乳がんKPL-4細胞をμ-スライドVI (ibidi, Germany)へ30 μlの体積中にて細胞2×106個/mlの濃度で播種した。それから3時間後に、培地(RPMI 1640, 2 mM L-グルタミン, 10% FCS) 70 μlを加えて、細胞を接着させた。
ヒト乳がんKPL-4細胞をμ-スライドVI (ibidi, Germany)へ30 μlの体積中にて細胞2×106個/mlの濃度で播種した。それから3時間後に、培地(RPMI 1640, 2 mM L-グルタミン, 10% FCS) 70 μlを加えて、細胞を接着させた。
(以下の全てのインキュベーションに有効な)水飽和雰囲気中5% CO2および37℃で24時間のインキュベーションの後、上清を除去し、細胞をPBS 100 μlで1回洗浄して、残存培地を除去した。
連続適用のため、FITC溶液で標識された上記で調製の複合体4D5-2C4 (c = 2.5 μg/ml) 50 μlを加え、45分間インキュベートし、引き続いてPBS 100 μlでの1回の洗浄段階および等モル量(0.13 μg/ml)のDNAプローブ(SEQ ID NO: 72) 50 μlとのさらなるインキュベーションを行った。
予混合手順は、複合体および検出プローブを最初に混合することによって行われた。その後、それを細胞に加え(濃度は上記参照)、引き続き45分間のインキュベーションを行った。
Xolair(登録商標)、つまりヒトIgE免疫グロブリンを標的とするヒト化IgG1モノクローナル抗体を陰性対照として用い、ヒトHER-2受容体を標的とする、Cy5で標識されたHerceptin(登録商標)を陽性対照として用いた。両方の抗体を同じ濃度(2.5 μg/ml)で適用した。
その後、上清を除去し、細胞をPBS 100 μlで1回洗浄した。細胞核をその後、HOECHST33342溶液(c = 10 μg/ml) 50 μlの添加によりDAPIで染色し、15分間インキュベートした。細胞染色色素を除去するために、細胞を上清の除去後、PBS 100 μlで2回洗浄した。PBSさらに120 μlを加えて細胞の潤いを保ち、生存性を確実にした。全ての希釈は培地(L-グルタミンおよびFCSなしの)で行って、細胞の生存性を確実にし、細胞のはく離を回避した。この手順の後、NUANCEシステム(CRi, Cambridge, USA)を用いて多重スペクトル蛍光分析によりスライドを画像化した。蛍光強度の比較可能性のために画像を規準化した。
エクスビボ分析
(同所性に移植された)樹立KPL-4腫瘍を有する免疫不全SCIDベージュマウスにPBS 100 μl中50 μgの複合体を静脈内(i.v.)注射し、それから18時間後にCy5標識DNAプローブを等モル濃度(マウス1匹あたり2.63 μg)で注射した。腫瘍をそれから48時間後に外植し、MAESTROシステム(CRi, Cambridge, USA)を用いて多重スペクトル蛍光分析により調べた。
(同所性に移植された)樹立KPL-4腫瘍を有する免疫不全SCIDベージュマウスにPBS 100 μl中50 μgの複合体を静脈内(i.v.)注射し、それから18時間後にCy5標識DNAプローブを等モル濃度(マウス1匹あたり2.63 μg)で注射した。腫瘍をそれから48時間後に外植し、MAESTROシステム(CRi, Cambridge, USA)を用いて多重スペクトル蛍光分析により調べた。
結果
インビトロ結合アッセイ法
複合体はそのFAB'-ss-L-DNA構成成分の各々によって二重にFITC標識されている。検出プローブは二重にCy5標識されたss-L-DNAの20merのオリゴヌクレオチドプローブであり、これは複合体の95merのss-L-DNAリンカーとハイブリダイズされうる。
インビトロ結合アッセイ法
複合体はそのFAB'-ss-L-DNA構成成分の各々によって二重にFITC標識されている。検出プローブは二重にCy5標識されたss-L-DNAの20merのオリゴヌクレオチドプローブであり、これは複合体の95merのss-L-DNAリンカーとハイブリダイズされうる。
Xolair-Cy5 (蛍光シグナルなし、陰性対照)とは対照的に、Herceptin-Cy5は腫瘍細胞を特異的に染色した(図22)。FITC標識4D5-2C4-95mer複合体は、腫瘍細胞に対しての、複合体と共局在化される検出プローブ(Cy5蛍光チャネルにて測定される)との連続的インキュベーションによって分かるようにKPL-4腫瘍細胞に特異的に結合し、検出オリゴヌクレオチドプローブ-Cy5と複合体とのハイブリダイゼーションが示唆された。連続的インキュベーションモードにおいて、および予混合の設定において、Her-2抗原に対しての腫瘍細胞の特異的染色を実証することができた(図2)。
図22では、複合体および検出プローブとともにインキュベートされたがん細胞の近赤外像を示す(NIRF画像化)。図の右上では、Cy5標識検出オリゴヌクレオチドとハイブリダイズされた完全アセンブル4D5-2C4-95mer複合体のスケッチを示す。図の右中央では、Cy5標識Herceptinの絵図を示す。図の右下では、シグナル強度のバーを示す。
図22の左上では、がん細胞へのCy5標識Herceptin(登録商標)の結合を示す(陽性対照)。KPL-4細胞膜は、DAPIで染色された細胞核周囲の明るく輝く環のように見える。左下では、Cy5標識Xolair(登録商標)のインキュベーションを示す(陰性対照)。膜染色を検出することはできないが、細胞核のDAPI染色を検出することができる。図の下中央では、4D5-2C4-FITC複合体の結合を示す。膜結合複合体のフルオレセインシグナルは、DAPIで染色された細胞核周囲の輝く環のように見える。図の上中央では、4D5-2C4-FITC複合体およびCy5標識検出プローブの結合を示す。連続的にハイブリダイズされた、Cy5標識ss-L-DNA検出プローブによる複合体の検出を認めることができる。検出オリゴヌクレオチドのCy5シグナルは膜染色のように見え、DAPIで染色された細胞核周囲の明るく輝く環を示している。
図23では、KPL-4細胞の近赤外(NIRF)画像化を示す。図23Aでは、FITC標識4D5-2C4複合体およびCy5標識検出プローブの連続適用の結果を示す。図23Bでは、予混合されたFITC標識4D5-2C4複合体およびCy5標識検出プローブとのKPL-4細胞のインキュベーションの結果を示す。どちらの画像も膜に局在したシグナルを示す。対照として、細胞をDAPIで染色した。
実験から、HER-2陽性細胞を特異的に標的化するために、本明細書において報告される複合体をまず最初に適用できることが実証される。第2段階において、標的に結合した複合体とハイブリダイズさせるために、標識された検出プローブを適用することができる。蛍光標識された検出プローブはその結果、オリゴヌクレオチドに基づくエフェクター成分の時間遅延、連続適用および特異的標的指向化の構想の証明となる。この場合、ペイロードはインビトロでの細胞画像化の目的のための蛍光色素である。
エクスビボ結合アッセイ法
図24 (左画像)に描かれているように、サンプルを最初に複合体と、その後にCy5標識検出プローブとインキュベートさせた実験的設定では強い蛍光シグナルが検出可能である。対照的に(右画像)、Cy5標識検出プローブだけをKPL-4異種移植片に予め注入した腫瘍では蛍光シグナルを検出することができなかった。
図24 (左画像)に描かれているように、サンプルを最初に複合体と、その後にCy5標識検出プローブとインキュベートさせた実験的設定では強い蛍光シグナルが検出可能である。対照的に(右画像)、Cy5標識検出プローブだけをKPL-4異種移植片に予め注入した腫瘍では蛍光シグナルを検出することができなかった。
図24は、NIRF画像化に供した外植KPL-4腫瘍を示す。最初の画像では、最初に4D5-2C4複合体で、その後に検出プローブで連続的に処置したマウスより外植された3つのKPL-4腫瘍から得たCy5蛍光シグナルを示す。右画像では、4D5-2C4複合体を除いて検出プローブだけで3匹のマウスを処置した場合、3つのKPL-4腫瘍からは蛍光シグナルが得られなかったことが示されている。
実施例10
MDA-MB-175乳がん細胞株における細胞増殖の阻害
10%ウシ胎仔血清、2 mMグルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12培地中で培養されたMDA-MB-175乳がん細胞2×104個を96ウェルプレートに播種した。それぞれ、抗体および複合体を翌日に、表示濃度(40〜0.0063 μg/ml)で加えた。6日間のインキュベーション後、Alamar Blueを加え、プレートを組織培養インキュベータ中で3〜4時間インキュベートした。蛍光を測定し(励起530 nm/発光590 nm)、参照として未処理細胞を用い阻害率を計算した。
MDA-MB-175乳がん細胞株における細胞増殖の阻害
10%ウシ胎仔血清、2 mMグルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM/F12培地中で培養されたMDA-MB-175乳がん細胞2×104個を96ウェルプレートに播種した。それぞれ、抗体および複合体を翌日に、表示濃度(40〜0.0063 μg/ml)で加えた。6日間のインキュベーション後、Alamar Blueを加え、プレートを組織培養インキュベータ中で3〜4時間インキュベートした。蛍光を測定し(励起530 nm/発光590 nm)、参照として未処理細胞を用い阻害率を計算した。
結果
抗HER2抗体2C4 (ペルツズマブ)は44%の最大阻害を示した。抗HER2抗体Herceptinは9%の最大阻害を示した。ペルツズマブおよびHerceptin(登録商標)のFAB断片を含む本明細書において報告される複合体は、46%の最大阻害を示す。
抗HER2抗体2C4 (ペルツズマブ)は44%の最大阻害を示した。抗HER2抗体Herceptinは9%の最大阻害を示した。ペルツズマブおよびHerceptin(登録商標)のFAB断片を含む本明細書において報告される複合体は、46%の最大阻害を示す。
ペルツズマブは、2つのHER2結合部位を有する全長IgG抗体として試験されたが、複合体は、単一のHER2結合部位を有する単一のペルツズマブFab断片を含むことを指摘せねばならない。
実施例11
複合体の凍結融解安定性
複合体は、SEQ ID NO: 73のss-L-DNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。
複合体の凍結融解安定性
複合体は、SEQ ID NO: 73のss-L-DNAリンカーとともに等モル化学量論の、FITCで標識された抗HER2抗体2C4-FAB'-ss-L-DNAおよびFITCで標識された抗HER2抗体4D5-FAB'-ss-L-DNAをハイブリダイズさせることによりアセンブルされた。複合体の的確なアセンブリを検証するために、複合体をSECクロマトグラフィー段階に供し、滅菌フィルタを通してろ過した。
TSK3000カラム(GE)を用い分析的SECによって複合体(1.5 mg/ml) 50 μlを分析した。泳動用緩衝液は0.1 M KH2PO4 pH 6.8であった。流速は1 ml/分であった。クロマトグラムを図25に示す。
凍結融解の後、複合体を、再クロマトグラフィーによって分離した。TSK3000カラム(GE)を用い分析的SECによって複合体(1.5 mg/ml) 50 μlを分析した。泳動用緩衝液は0.1 M KH2PO4 pH 6.8であった。流速は1 ml/分であった。クロマトグラムを図26に示す。
Claims (17)
- a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびに
c) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているss-L-DNAリンカー
を含む複合体。 - a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているss-L-DNAリンカー、ならびに
c) ss-L-DNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含む複合体。 - ss-L-DNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- ss-L-DNAリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチド(L-DNA)とコンジュゲートしているエフェクター成分をさらに含むことを特徴とする、請求項1記載の複合体。
- ポリペプチドが一価抗体または一価抗体断片であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 第1および第2のポリペプチドが、同じ標的に結合し、かつ同じ標的上の重複しないエピトープに結合することを特徴とする、請求項5記載の複合体。
- 結合対のメンバーが、ロイシンジッパードメイン二量体およびハイブリダイジング核酸配列からなる群より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 非共有結合複合体であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- エフェクター成分が、結合成分、標識成分、および生物学的に活性な成分からなる群より選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 第1のポリペプチドが抗HER2抗体2C4のFAB'断片であり、第2のポリペプチドが抗HER2抗体4D5のFAB'断片であり、結合対のメンバーがハイブリダイジング核酸であり、かつss-L-DNAリンカーが60〜100個のL-DNAヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 第1の結合対の第1および第2のメンバーが、SEQ ID NO: 05およびSEQ ID NO: 08の核酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 第2の結合対の第1および第2のメンバーが、SEQ ID NO: 06およびSEQ ID NO: 07の核酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の複合体。
- 以下の構成成分
a) 標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチド、
b) 結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー、ならびに
c) ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a)標的に特異的に結合する、および結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしているポリペプチドと、
ポリヌクレオチドリンカーの少なくとも一部と相補的なポリヌクレオチドとコンジュゲートしているエフェクター成分と
をそれぞれ合成する段階、
b) 第1の末端で結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカーを合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法。 - 以下の構成成分
a) 第1の標的に特異的に結合する、および第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第1のポリペプチド、
b) 第2の標的に特異的に結合する、および第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている第2のポリペプチド、ならびに
c) 第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を含む複合体を生成する方法であって、以下の段階
a)第1の標的に特異的に結合する第1のポリペプチドであって、第1の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第1のポリペプチドと、
第2の標的に特異的に結合する第2のポリペプチドであって、第2の結合対の第1のメンバーとコンジュゲートしている該第2のポリペプチドと
をそれぞれ合成する段階、ならびに
b) 第1の末端で第1の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしている、および第2の末端で第2の結合対の第2のメンバーとコンジュゲートしているポリヌクレオチドリンカー
を合成する段階、ならびに
c) 合成された構成成分をハイブリダイズさせることによってポリペプチド-ポリヌクレオチド複合体を形成させる段階
を含む前記方法。 - 請求項1〜12のいずれか一項記載の複合体と、任意で薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
- 医薬として用いるための、請求項1〜12のいずれか一項記載の複合体。
- 請求項1〜12のいずれか一項記載の複合体の、医薬の製造における使用。
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