SK288175B6

SK288175B6 - Látková kompozícia viažuca polypeptid TALL-1, kódujúca DNA, expresný vektor a hostiteľská bunka

Info

Publication number: SK288175B6
Application number: SK1489-2003A
Authority: SK
Inventors: Min Hosung; Hsu Hailing; Fei Xiong
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 2001-05-11
Filing date: 2002-05-13
Publication date: 2014-04-02
Also published as: NO20034980D0; PL210546B1; CN1535281A; AU2002342669C1; BG66270B1; PT1385882E; BG108349A; CN100448891C; CA2446189A1; DK1385882T3; KR20040012815A; CN1970078A; HU229910B1; AU2002342669B2; YU95203A; SK14892003A3; EA200301241A1; US7259137B2; DE60222882D1; IL158719A0

Abstract

Látková kompozícia zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu Dz2Lz4, kde z2 je aminokyselinový zvyšok a z4 je T alebo I a viažuca polypeptid TALL-1, pričom táto kompozícia nezahŕňa fragment TACI, BCMA, alebo BAFFR. DNA kódujúca túto látkovú kompozíciu, expresný vektor zahŕňajúci túto DNA a hostiteľská bunka zahŕňajúca tento expresný vektor. Kompozícia definovaná vyššie na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami, lupusu, rakoviny sprostredkovanej B bunkami a B-bunkového lymfómu.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka látkovej kompozície zahŕňajúcej aminokyselinovú sekvenciu a viažucej polypeptid TALL-1, DNA kódujúcej túto látkovú kompozíciu, expresného vektoru zahŕňajúceho túto DNA a hostiteľskej bunky zahŕňajúcej tento expresný vektor. Kompozícia podľa vynálezu je najmä vhodná na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami, lupusu, rakoviny sprostredkovanej B bunkami a B-bunkového lymfómu.

Doterajší stav techniky

Po rokoch štúdií nekrózy nádorov boli konečne v roku 1984 klonované faktory nekrózy nádorov (tumor necrosis factors, TNFs) a a β. V nasledujúcich rokoch bola napríklad objavená superrodina cytokínov TNF, zahŕňajúca ligand fas (FasL), ligand CD27 (CD27L), ligand CD30 (CD30L), ligand CD40 (CD40L), ligand príbuzný TNF indukujúci apoptózu (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRA1L, rovnako označovaný ako AGP-1), väzbový protein pre osteoprotegrin (osteoprotegerin binding protein, OPG-BP, alebo tiež OPG ligand), ligand 4-1BB ligand, LIGHT, APRÍL a TALL-1. Smith et al. (1994), Celí 76: 959 - 962; Lacey et al. (1998), Celí 93: 165 - 176; Chichepotiche et al. (1997), J. Biol. Chem. 272: 32401 - 32410; Mauri et al. (1998), Immunity 8: 21 - 30; Hahne et al. (1998), J. Exp. Med. 188: 1185 - 90; Shu et al. (1999), J. Leukocyte Biology 65: 680 - 3. Táto rodina je jednotná v svojej štruktúre, najmä v C-konci. Okrem toho, väčšina doposiaľ známych členov tejto rodiny je exprimovaná v častiach imunitného systému, i keď niektoré z nich sú rovnako exprimované v iných tkanivách a orgánoch. Smith et al. (1994), Celí 76: 959 - 62. Všetky Ugandy, s výnimkou LT-α, sú transmembránovými proteínmi typu II, charakterizované konzervovanou oblasťou so 150 aminokyselinami vnútri C-koncovej extracelulámej domény. I pri obmedzení zhodnosti na 20 - 25 % zbaľuje sa konzervovaná doména so 150 aminokyselinami na charakteristickú štruktúru β-skladaného listu a trimerizuje. Uvedená konzervovaná oblasť môže byť proteolyticky uvoľnená, a tak môže poskytovať rozpustnú funkčnú formu. Banner et al. (1993), Celí 73: 431 -445.

Veľa členov v rámci tejto rodiny ligandov sú exprimované v tkanivách obohatených lymfoidmi a hrajú významné úlohy vo vývoji imunitného systému a jeho modulácii. Smith et al. (1994). Tak napríklad, TNFa je prevažne syntetizovaný makrofágmi a je významným mediátorom pre zápalové odpovede a imunitnú obranu. Tracey & Cerami, Ann. Rev. Med. 45; 491 - 503. Fas-L, prevažne exprimovaný v aktivovaných T-bunkách, moduluje apoptózu tymocytov sprostredkovávanú s TCR. Nagata, S. & Suda, T. (1995) Immunology Today 16: 39 - 43; Castrim et al. (1996), Immunity 5: 617 - 27. CD40L, rovnako exprimovaný aktivovanými T-bunkami, poskytuje základný signál pre prežívanie B buniek, proliferáciu a prepnutie (switching) imunoglobulínových izotypov. Noelle (1996), Immunity 4: 415 - 9.

Pre väčšinu členov rodiny ligandov TNF boli identifikované receptory. Uvedené receptory majú charakteristické početné opakujúce sa sekvencie bohaté na cysteín vnútri svojich extracelulárnych domén a nemajú katalytické motívy vnútri cytoplazmatických oblastí. Smith et al. (1994). Receptory signalizujú prostredníctvom priamej interakcie so smrtiacou doménou proteínov (death domain proteins) (napr. TRADD, FADD a RIP) alebo s proteínmi TRAF (napr. TRAF2, TRAF3, TRAF5 a TRAF6), spúšťajúcimi odlišné a vzájomne sa prekrývajúce signálne dráhy, napr. apoptózu, aktiváciu NF-κΒ, alebo aktiváciu JNK. Wallach et al. (1999), Annual Review of Immunology 17: 331 - 67. Uvedené signálne javy vedú k bunkovej smrti, proliferácii, aktivácii, alebo diferenciácii. Profil expresie pre každý z receptorových členov je rôzny. Tak napríklad, TNFR1 je exprimovaný v širokom spektre tkanív a buniek, zatiaľ čo bunkový povrchový receptor buniek OPGL je prevažne obmedzený na osteoklasty. Hsu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 3540 - 5.

Rad výskumných tímov nedávno identifikoval rodinu ligandov TNF so zhodnou alebo s v podstate podobnou sekvenciou. Ligand bol rôzne pomenovaný ako neutrokin a (prihláška WO 98/18921, publikovaná 7. mája 1998), 63954 (prihláška WO 98/27114, publikovaná 25. júna 1998), TL5 (prihláška EP 869 180, publikovaná 7. októbra 1998), NTN-2 (prihláška WO 98/55620 a prihláška WO 98/55621, publikované 10. decembra 1998), TNRLl-alfa (prihláška WO 9911791, publikovaná 11. marca 1999), „kay ligand“ (prihláška WO 99/12964, publikovaná 18. marca 1999) a AGP-3 (U. S. dočasná prihláška č. 60/119 906, podaná 12. februára 1999, a U. S. dočasná prihláška č. 60/166 271, podaná 18. novembra 1999, v uvedenom poradí); a TALL-1 (prihláška WO 00/68378, publikovaná 16. novembra 2000). Tu uvedené ligandy sú súhrnne nazývané ako TALL-1.

TALL-1 je člen superrodiny ligandu TNF, ktorý sa funkčne účastní v prežívaní a proliferácii B buniek. Transgénne myši nadmerne exprimujúce TALL-1 mali ťažkú hyperpláziu B buniek a autoimunitné ochorenie podobné lupus (lupus-like autoimmune disease). Khare et al. (2000) PNAS 97 (7): 3370 - 3375). Ako TACI, tak BCMA slúžia ako bunkové povrchové receptory pre TALL-1. Gross et al. (2000), Náture 404: 995 - 999; Ware (2000), J. Exp. Med. 192 (11): F35 - F37; Ware (2000), Náture 404: 949 - 950; Xia et al. (2000), J. Med. 192 (1): 137 - 143; Yu et al. (2000), Náture Immunology 1 (3): 252 - 256; Marsters et «/.(2000), Cur2 rent Biology 10: 785 - 788; Hatzoglou et al. (2000), J. of Immunology 165: 1322 - 1330; Shu et al. (2000) PNAS 97 (16): 9156 - 9161; Thompson et al. (2000) J. Exp. Med. 192 (1): 129 - 135; Mukhopadhyay et al.(l999) L Biol. Chem. 274 (23): 15978 - 81; Shu et al. (1999) J. Leukocyte Biol. 65: 680 - 683; Gruss et al. (1995) Blood 85 (12): 3378 - 3404; Smith et «/..(1994), Celí 76: 959 - 962; U. S. Patent č. 5 969 102, vydaný 19. októbra 1999; prihláška WO 00/67034, publikovaná 9. novembra 2000; prihláška WO 00/40716, publikovaná 13. júla 2000; prihláška WO 99/35170, publikovaná 15. júla 1999. Obidva receptory sú exprimované na B bunkách a signalizujú prostredníctvom interakcie s proteínmi TRAF. Okrem toho, tak TACI, ako BCMA sa rovnako viaže k inému členu rodiny ligandov TNF, a to k ligandu APRIL. Yu et «/.(2000), Náture Immunology 1 (3): 252 - 256. Bolo preukázané, že APRIL indukuje proliferáciu B buniek.

Až doposiaľ neboli opísané žiadne rekombinantné alebo modifikované proteiny využívajúce modulátory TALL-1. Rekombinantné a modifikované proteiny sú no vo vznikajúcou triedou terapeutických látok. Vhodné modifikácie proteínových terapeutických činidiel zahŕňajú kombinácie s doménou „Fc“ z protilátky a naviazanie na také polyméry, ako je napríklad polyetylénglykol (PEG) a dextrán. Uvedené modifikácie sú detailne diskutované v patentovej prihláške s názvom „Modified Peptides as Therapeutic Agents“, publikovanej ako WO 00/24782.

Celkom odlišným prístupom vo vývoji terapeutických látok je skríning peptidových knižníc. Interakcia proteínového ligandu s receptorom často prebieha na relatívne rozsiahlom rozhraní. Ale tak, ako bolo preukázané pre ľudský rastový hormón a jeho receptor, iba niekoľko kľúčových zvyškov na rozhraní prispieva k väčšine väzbovej energie. Clackson et al. (1995), Science 267: 383 - 6. Podstatná časť proteínových ligandov proste predstavuje väzbové epitopy v správnej topológii alebo má fúnkcie nezávislé od väzby. Z tohto dôvodu molekuly len s „peptidovou“ dĺžkou (2 až 40 aminokyselín) sa môžu viazať na receptorový protein uvedeného rozmerného proteínového ligandu. Také peptidy môžu napodobovať bioaktivitu objemných ligandov („peptidové agonisty“) alebo prostredníctvom kompetitívnej väzby inhibujú bioaktivitu objemných proteínových ligandov („peptidové antagonisty“).

Na identifikáciu takých peptidových agonistov a antagonistov bola vyvinutá účinná metóda knižníc fágového displeja peptidov (phage display peptide iibraries). Pozri napríklad Scott et al. (1990), Science 249: 386; Devlin et al. (1990), Science 249: 404; U. S. Pat č. 5 223 409, vydaný 29. 6. 1993; U. S. Pat. č. 5 733 731, vydaný 31. 3. 1998; U. S. Pat. č. 5 498 530, vydaný 12. 3. 1996; U. S. Pat č. 5 432 018, vydaný 11. 7. 1995; U. S. Pat č. 5 338 665, vydaný 16. 8. 1994; U. S. Pat. č. 5 922 545, vydaný 13. 7. 1999; prihláška WO 96/40987, zverejnená 19. 12, 1996; a prihláška WO 98/15833, zverejnená 16. 4. 1998.

V takých knižniciach sú náhodné peptidové sekvencie exponované (displejované) vo fúzii s obalovými proteínmi vláknitého fága. Typicky sú peptidmi exprimované fágy afinitne eluované proti imobilizovanému cieľovému proteínu. Zadržané fágy môžu byť obohatené nasledujúcou sériou afinitnej purifikácie a repropagácie. Peptidy, ktoré sa najlepšie viažu, môžu byť sekvenované tak, aby boli identifikované kľúčové zvyšky vnútri jednej alebo viacerých štruktúrne príbuzných rodín peptidov. Pozri napríklad Cwirla et al. (1997), Science 276: 1696 - 9, ktorí identifikovali dve odlišné rodiny peptidov. Z peptidových sekvencii je možné rovnako usúdiť, ktoré zvyšky môžu byť bezpečne nahradené alanínovým skanovaním alebo mutagenézou na úrovni DNA. Mutagenézou môžu byť vytvárané knižnice, ktoré sú testované na ďalšiu optimalizáciu sekvencie najlepších väzbových členov Lowman (1997), Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401 -24.

Štruktúrna analýza interakcie proteín-proteín môže byť rovnako použitá na navrhovanie peptidov, ktoré napodobujú väzbovú aktivitu objemných proteínových ligandov. Takou analýzou je možné z kryštalickej štruktúry stanoviť identitu a vzájomnú orientáciu kritických zvyškov v objemnom proteínovom ligande a navrhnúť štruktúru peptidu. Pozri napríklad Takasaki et al. (1997), Náture Biotech. 15: 1266 - 70. Uvedené analytické metódy môžu byť rovnako použité na skúmanie interakcií medzi receptorovým proteínom a peptidmi, ktoré sú fágovým displejom vyberané, čo môže viesť k ďalším modifikáciám peptidov s cieľom zvýšenia ich väzbovej afinity.

Vo výskume peptidov konkurujú metóde fágového displeja aj iné metódy. Peptidová knižnica môže byť fúzovaná ku karboxylovému koncu lac represoru a exprimovaná v E. coli. Iná metóda založená na E. coli umožňuje exponovanie na vonkajšej membráne buniek prostredníctvom fúzie s lipoproteínom asociovaným s peptidoglykánom (peptidoglycanassociated lipoprotein, PAL). Tieto metódy a metódy ďalej uvedené sú súhrnne nazývané ako „E. coli displej“. V inom postupe je zastavená translácia náhodilej RNA pred uvoľnením z ribozómov, čo vedie ku knižnici polypeptidov s ich asociovanou RNA, ktorá je dosiaľ pripojená. Tieto metódy a metódy ďalej uvedené sú súhrnne nazývané ako „ribozómový displej“. Iné metódy využívajú peptidy viazané k RNA; napríklad „PROfúsion technology“, Phylos, Inc. Pozri napríklad Roberts & Szostak (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297 - 303. Tieto metódy a metódy ďalej uvedené sú súhrnne nazývané ako „skríning RNA-peptidov“. Rovnako boli pripravené peptidové knižnice chemickými postupmi, v ktorých sú peptidy imobilizované na stabilných, nebiologických materiáloch, akými sú polyetylénové nosiče alebo rozpustné permeabilné živice. V inej chemicky pripravenej peptidovej knižnici je používaná fotolitografia na zobrazenie peptidov imobilizovaných na sklenených sklíčkach. Tieto metódy a metódy uvedené ďalej sú súhrnne nazývané ako chemický skríning peptidov (chemical-peptide skríning). Chemický skríning peptidov

SK 288175 Β6 môže byť výhodný preto, že umožňuje použitie D-aminokyselín a iných neprirodzených analógov rovnako ako nepeptidových prvkov. Tak biologické, ako chemické metódy sú súhrnne uvedené vo Wells & Lowman (1992), Curr. Opin. Biotechnol. 3: 355 - 62. Pri využití fágového displeja, RNA-skríningu peptidov a iných spomínaných metód je možné nájsť peptidové mimetiká akéhokoľvek proteínu.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa teda týka terapeutických látok, ktoré modulujú aktivitu TALL-1.

Prvým aspektom predmetu vynálezu v hlavnom uskutočnení

i) je látková kompozícia zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu Dz²Lz⁴, kde z² je aminokyselinový zvyšok a z⁴ je T alebo I a viažuca polypeptid TALL-1 so sekvenciou SEQ ID NO: 198, pričom táto kompozícia nezahŕňa fragment TACI, BCMA alebo BAFFR (SEQ ID NO: 195, 196 a 197).

Prednostné uskutočnenia tohto aspektu predmetu vynálezu zahŕňajú predovšetkým ii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia 1, kde z⁴ je T;

iii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i), kde z⁴ je I;

iv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a'°Ca¹²a¹³a¹⁴(SEQ IDNO: 100), v ktorom:

každý z a¹, a² a a³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; a⁶ je aminokyselinový zvyšok; a⁸ je T alebo I;

a⁹ je bázický alebo hydrofóbny zvyšok;

a¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

a¹² je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z a¹³ a a¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

v) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia iv), kde a⁸ je T a a⁹ je bázický zvyšok;

vi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia iv), kde a⁹ je K a a¹² je F;

vii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸(SEQ ID NO: 104), v ktorom:

každý z b¹ a b² je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b³ je kyslý alebo amidový zvyšok;

b⁵ aminokyselinový zvyšok;

b⁶ je aromatický zvyšok;

b⁸ je aminokyselinový zvyšok;

b¹⁰ je T alebo I;

b¹¹ je bázický zvyšok;

každý z b¹² a b¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

viii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia vii), kde:

b³ je D, Q, alebo E;

b⁶ je W alebo Y;

b¹⁰ je T;

b¹¹ je K alebo R; a b¹⁴ je V alebo L;

ix) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca c¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸(SEQ IDNO: 105), v ktorom:

každý z c¹, c² a c³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

SK 288175 Β6 c⁵ je aminokyselinový zvyšok;

c⁷ je aminokyselinový zvyšok;

c⁹ je T alebo I;

c¹⁰ je bázický zvyšok;

každý z c¹¹ a c¹² nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

c¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁶ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a c¹⁸ je aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný;

x) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia ix), kde:

C je T;

c¹⁰ je K alebo R;

c¹³ je I, L alebo V; a c¹⁷ je A alebo L;

xi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld^l2d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d¹⁸(SEQ IDNO: 106), v ktorom:

každý z d¹, d² a d³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; každý z d⁵, d⁶ a d⁷ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; d¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

d¹² je T alebo I;

d¹³ je aminokyselinový zvyšok;

d¹⁴ je aminokyselinový zvyšok; a každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

xii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca e¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le^1,Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸(SEQ IDNO: 107), v ktorom:

každý z e¹, e² a e³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; e¹¹ je T alebo I; a každý z e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

xiii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca f'ŕfK^Df’Lí⁹!¹^!⁴²!⁴³!¹⁴(SEQ IDNO: 109), v ktorom:

f¹, f² a í³ sú neprítomné alebo sú aminokyselinové zvyšky;

í® je W, Y alebo F;

f⁷ je aminokyselinový zvyšok;

í⁹ je T alebo I;

f¹⁰ je K, R alebo H;

f¹² je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo bázický zvyšok, prednostne W, C alebo R;

f¹³ je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo nie je prítomný; a f¹⁴ je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný;

za predpokladu, že iba jeden z f¹, í² a í³ môže byť C a iba jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ môže byť C;

xiv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde í® je W;

xv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde f⁷ je L;

xvi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde f⁹ je T;

xvii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde f¹⁰ je K;

xviii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde f¹² je C a jeden z f¹, f² a f³ je C;

xix) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii), kde f¹³ je V;

xx) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xiii) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca f¹f^zf³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f^l3f¹⁴(SEQ IDNO: 125);

xxi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xx) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147 - 150, 152 - 177, 179, 180 a 187;

xxii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xx) zahŕňajúcu aminokyselinovú sekvenciu vzorca

LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33);

xxiii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia i), ktorá má vzorec (X*)_a-V¹ - (X²)_b a jej multiméry, kde:

V¹ je Fc doména;

X¹ a X² sú nezávisle vybrané z -(L')_c - P¹,

- (L')_c - P¹ - (L²)d - P², - (L*)c - P¹ - (L²)d - P² - (L³)e - P³ a

- (L‘)_c - P¹ - (L²)d - P² - (L³)e - P³ - (L⁴)_f- P⁴;

jeden alebo viac z P¹, P², P³ a P⁴, každý nezávisle, zahŕňa Dz²Lz⁴;

L¹, L², L³ a L⁴ predstavuje každý nezávisle linker; a a, b, c, d, e a f je každý nezávisle 0 alebo 1, za podmienky, že aspoň jeden z a a b je 1;

xxiv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) vzorca

P¹ - (L¹),;-P²-(L²)_d-V¹;

xxv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) vzorca v'-oA-p'-ílVp²;

xxvi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii), kde V¹ je doména IgG Fc;

xxvii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii), kde V¹ je doména IgGl Fc;

xxviii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii), kde V¹ zahŕňa sekvenciu SEQ ID NO: 2;

xxix) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii), kde jeden alebo viac z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle zahŕňa sekvenciu vybranú z:

a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a‘°Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100) b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb*°b^llb^I2b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ ID NO: 104) c¹c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c^,0c¹¹c^I2c¹³c¹⁴Cc¹⁶c^I7c¹⁸ (SEQ IDNO: 105) d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd‘°Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d^l7d¹⁸ (SEQ ID NO: 106) e‘e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e^l7e¹⁸ (SEQ IDNO: 107)

ΤΓΓ’ΚΓΟΓΕίΎ'^ίΎΥ⁴ (SEQ ID NO: 109) g¹g²g³Cg⁵PFg⁸Wg¹⁰Cg¹²g¹³g¹⁴ (SEQ ID NO: 101), h¹h²h³CWh⁶h⁷WGh¹⁰Ch¹²h¹³h¹⁴ (SEQ ID NO: 102), a i¹i²i³Ci⁵i⁶i⁷i⁸i⁹i¹⁰Ci¹²i¹³i¹⁴(SEQ IDNO: 103), kde každý z a¹, a² a a³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

a⁶ je aminokyselinový zvyšok;

a⁹ je bázický alebo hydrofóbny zvyšok;

a⁸ je treonyl alebo izoleucyl;

a¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

b³ je kyslý alebo amidový zvyšok;

b⁵ aminokyselinový zvyšok;

b⁶ je aromatický zvyšok;

b⁸ je aminokyselinový zvyšok;

b¹⁰ je T alebo I;

SK 288175 Β6 b¹¹ je bázický zvyšok;

každý z b¹² a b¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; b¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; každý z c¹, c² a c³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; c⁵ j e aminokyselinový zvyšok;

c⁷ je aminokyselinový zvyšok;

c⁹ je T alebo I;

c¹⁰ je bázický zvyšok;

každý z c“ a c¹² nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

c¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁶ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁸ je aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný;

každý z d¹, d² a d³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z d⁵, d⁶ a d⁷ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

d¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

d¹² je T alebo I;

d¹³ je aminokyselinový zvyšok;

d¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z e¹, e² a e³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

e¹¹ je T alebo I;

každý z e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

f¹, f² a f³ sú neprítomné alebo sú aminokyselinové zvyšky;

f⁵ je W, Y alebo F;

f⁷ je aminokyselinový zvyšok;

f⁹ je T alebo I;

f¹⁰ je K, R alebo H;

f¹² je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo bázický zvyšok;

za predpokladu, že iba jeden z f¹, f² a f³ môže byť C a iba jeden z f⁴², f¹³ a f⁴⁴ môže byť C;

každý z g¹, g² a g³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

g⁵ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

g⁸ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

g¹⁰ je kyslý zvyšok;

každý z g¹² a g¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; a g¹⁴ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

každý z h¹, h² a h³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

h⁶ je hydrofóbny zvyšok;

h⁷ je hydrofóbny zvyšok;

h¹⁰ je kyslý alebo polárny hydrofóbny zvyšok;

každý z h¹², h¹³ a h¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

1¹ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

je aminokyselinový zvyšok;

každý z i⁵, i⁶, i⁷ a i⁸ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

i⁹ je kyslý zvyšok;

i¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

každý z i¹² a i¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; a i¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

xxx) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxix), kde:

a⁹ je bázický zvyšok;

b³ je D, Q alebo E;

b⁶ je W alebo Y;

b¹¹ je K alebo R;

b¹⁴ je V alebo L;

c¹⁰ je K alebo R;

c¹³ je a I, L alebo V;

c¹⁷ je A alebo L;

f⁵ je W;

f⁷ je L;

f*°jeK;a f¹³ je V;

xxxi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxix), kde jeden alebo viaceré z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle zahŕňa f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴(SEQIDNO: 125);

xxxii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi) vzorca

P¹ - (L‘)c-P²- (L²)d- V¹;

xxxiii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi) vzorca v'-oJvp'-oAj-p²;

xxxiv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), ktorá má aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQIDNO: 122, 123 a 124;

xxxv) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), v ktorej L² je väčší ako 5 aminokyselín; xxxvi) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxv), kde L² je vybrané z

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx*x2 (SEQIDNO: 193)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx‘x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴(SEQIDNO: 194), kde x¹ a x³ je každý nezávisle bázický alebo hydrofóbny zvyšok a x² a x⁴ je každý nezávisle hydrofóbny zvyšok;

xxxvii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), kde L² je vybrané z

GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 59),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ IDNO: 190),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ IDNO :191),a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQIDNO: 192);

xxxviii) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) zahŕňajúcu sekvencie vybrané z tabuľky 4 (SEQ ID NO: 44 - 55);

ixl) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), kde V¹ je doména Fc; xl) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), kde V¹ je doména IgG Fc; a xli) látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxxi), kde V¹ je doména IgGl Fc.

Iným aspektom predmetu vynálezu (uskutočnenie vynálezu xlii)) je DNA kódujúca látkovú kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii).

Ďalším aspektom predmetu vynálezu (uskutočnenie vynálezu xliii)) je expresný vektor zahŕňajúci DNA podľa uskutočnenia xlii).

Ešte ďalším aspektom predmetu vynálezu (uskutočnenie vynálezu xli v)) je hostiteľská bunka zahŕňajúca expresný vektor podľa uskutočnenia xliii).

Bunkou podľa uskutočnenia xliv) je prednostne bunka E. coli (uskutočnenie vynálezu xlv)).

Iné aspekty predmetu vynálezu zahŕňajú xlvi) kompozíciu podľa uskutočnenia i) na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami;

xlvii) kompozíciu podľa uskutočnenia xiii) na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami;

xlviii) kompozíciu podľa uskutočnenia i) na použitie na liečenie lupusu; il) kompozíciu podľa uskutočnenia xiii) na použitie na liečenie lupusu;

1) kompozíciu podľa uskutočnenia i) na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami; li) kompozíciu podľa uskutočnenia xiii) na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami;

Iii) kompozícia podľa uskutočnenia i) na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu;

liii) kompozíciu podľa uskutočnenia xiii) na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu;

liv) kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami;

lv) kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) na použitie na liečenie lupusu;

lvi) kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami; a lvii) kompozíciu podľa uskutočnenia xxiii) na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu;

Ďalším aspektom predmetu vynálezu (uskutočnenie vynálezu lviii)) je kompozícia podľa uskutočnenia xxiii), kde

P¹ zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 33

LPGCK.WDLLIK.QWVCDPL;

P² zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID

NO: 125 f'f t³KWDf⁷Lt⁹KQf²f¹³f^la;

f¹ nie je prítomný alebo predstavuje M;

f² je G;

í³ je C;

f⁷ je L;

f⁹ je I;

f¹² je W;

f¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

f¹⁴ je C;

L¹ zahŕňa peptidový linker so sekvenciou GGGGGV;

L² zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 59 GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM; a

V* je doména Fc;

pričom táto kompozícia prípadne obsahuje N-terminálny methionínový zvyšok.

Inými aspektmi predmetu vynálezu sú ilx) je kompozícia podľa uskutočnenia lviii) na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami;

lx) kompozícia podľa uskutočnenia lviii) na použitie na liečenie lupusu;

lxi) kompozícia podľa uskutočnenia lviii) na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami; a lxii) kompozícia podľa uskutočnenia lviii) na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu.

V ďalšom opise je vynález príležitostne objasňovaný v širšom kontexte ako zodpovedá rozsahu, ktorý je skutočne predmetom tohto vynálezu. Výslovne sa preto uvádza, že do rozsahu vynálezu patria len aspekty a ich uskutočnenia i) až lxii) explicitne uvedené vyššie, a iba tie sú tiež predmetom pripojených patentových nárokov. Nasledujúci opis má len ilustratívny význam.

Podľa predkladaného vynálezu môžu modulátory TALL-1 obsahovať aminokyselinovú sekvenciu Dz²Lz⁴(SEQ ID NO: 108), v ktorej z² je aminokyselinový zvyšok a z⁴ je treonyl alebo izoleucyl. Také modulátory TALL-1 zahŕňajú molekuly nasledujúceho vzorca:

I(a) a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ IDNO: 100), v ktorom:

každý z a¹, a², a³ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

a⁶ je aminokyselinový zvyšok;

a⁹ je bázický alebo hydrofóbny zvyšok;

a⁸ je treonyl alebo izoleucyl;

a¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

a¹² je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a

SK 288175 Β6 každý z a¹³ a a¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(b) b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b“b¹²b¹³b¹⁴Cb'⁶b¹⁷b¹⁸(SEQ IDNO: 104), v ktorom:

každý z b¹ a b² je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

b³ je kyslý alebo amidový zvyšok;

b⁵ aminokyselinový zvyšok;

b⁶ je aromatický zvyšok;

b⁸ je aminokyselinový zvyšok;

b¹⁰ je T alebo I;

b¹¹ je bázický zvyšok;

každý z b¹² a b¹³ je nezávisle aminokyselinový zvyšok;

b¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z b¹⁰, b¹⁷ a b¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(c)

v ktorom:

každý z c¹, c² a c³ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok; c⁵ je aminokyselinový zvyšok; c⁷ je aminokyselinový zvyšok; c⁹ je T alebo I;

c¹⁰ je bázický zvyšok;

každý z c¹¹ a c¹² je nezávisle aminokyselinový zvyšok;

c¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁶ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a c¹⁸ je aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný.

I(d) .16 .17 (d) d’d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁵d¹⁶d (SEQ IDNO: 106), v ktorom:

každý z d¹, d² a d³ je nezávisle neprítomný alebo sú aminokyselinový zvyšok; každý z d⁵, d⁶ a d⁷ je nezávisle aminokyselinový zvyšok;

d¹⁰ je aminokyselinový zvyšok; d¹² je T alebo I;

d¹³ je aminokyselinový zvyšok;

d¹⁴ je aminokyselinový zvyšok; a každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(e)

(SEQ IDNO: 107), v ktorom:

každý z e¹, e² a e³ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok; každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ je nezávisle aminokyselinový zvyšok; e¹¹ je T alebo I; a

ΙλπΤ/Ίι) «mríiilnlrt n1/-»l“kz-Y t λ ηινι ΐ m λΙλ, m r\l ΐ m Λ, r/. -τ,ιι,Χη každý z e , e a e je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(f) f¹f²f³Kf^íDf⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²fⁱ³f*⁴(SEQ IDNO: 109), v ktorom:

f¹, í² a Γ sú neprítomné alebo sú aminokyselinové zvyšky (s tým, že výhodne jeden z f¹, f² a f³ je C, keď jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ je C);

SK 288175 Β6 f⁶ je W, Y, alebo F (výhodne W);

f⁷ je aminokyselinový zvyšok (výhodne L);

f⁹ je T alebo 1 (výhodne T);

f¹⁰ je K, R alebo H (výhodne K);

f¹² je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo bázický zvyšok (výhodne W, C alebo R);

f¹³ je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo nie je prítomný (výhodne V); a f¹⁴ je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný;

za predpokladu, že iba jeden z f¹, í² a f³ môže byť C a iba jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ môže byť C.

Uvedené zlúčeniny vzorcov I(a) až I(f) obsahujú Dz²Lz⁴, rovnako ako SEQ ID NO: 63, uvedenú ďalej.

Sekvencia I(f) bola odvodená ako konsenzus sekvencie tak, ako je to opísané v príklade 1 uvedenom ďalej. Zo zlúčenín vzorca I(f) sú preferované zlúčeniny vzorca

I(f) f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ IDNO: 125).

Zlúčeniny patriace do vzorca l(f) zahŕňajú sekvencie SEQ ID NO: 32, 58, 60, 62, 63, 66, 67, 69, 70, 114, 115, 122, 123, 124, 147 - 150, 152 - 177, 179, 180, 187.

V súlade s predkladaným vynálezom sú rovnako zlúčeniny majúce konsenzus motív:

PFPWE (SEQ IDNO: 110), ktoré rovnako viažu TALL-1.

Ďalšími zlúčeninami podľa predkladaného vynálezu sú zlúčeniny vzorca:

I(g) g^lg²g³Cg⁵PFg⁸Wg¹⁰Cg¹g^,2g¹³ (SEQ IDNO: 101), v ktorom:

každý z g¹, g² a g³ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok; g⁵ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; g⁸ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; g¹⁰ je kyslý zvyšok;

každý z g¹² a g¹³ je nezávisle aminokyselinový zvyšok; a g¹⁴ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(h) h¹h²h³CWh⁶h⁷WGh'°Ch^I2h¹³h¹⁴ (SEQ ID NO: 102), v ktorom:

každý z h¹, h² a h³ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

h⁶ je hydrofóbny zvyšok;

h⁷ je hydrofóbny zvyšok;

h¹⁰ je kyslý alebo polárny hydrofóbny zvyšok; a každý z h¹¹, h¹³ a h¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

I(i) (i) i'^PCi⁵!⁶!⁷!⁸!⁹!¹^!¹²!¹³!¹⁴ (SEQ IDNO: 103), v ktorom:

1¹ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

1² je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

1³ je aminokyselinový zvyšok;

každý z i⁵, i⁶, i⁷ a i⁸ je nezávisle aminokyselinový zvyšok;

i⁹ je kyslý zvyšok;

i¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

každý z i¹² a i¹³ je nezávisle aminokyselinový zvyšok; a i¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok.

Zlúčeniny definované vzorcami I(g) až I(i) rovnako viažu TALL-1.

Ďalej podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú modulátory TALL-1:

SK 288175 Β6

a) TALL-1 modulujúcu doménu (napr. aminokyselinovú sekvenciu vzorca I(a) až I(i), výhodne aminokyselinovú sekvenciu Dz²Lz⁴, alebo sekvencie z nej odvodené pomocou fágového displeja, skríningu RNA-peptid alebo inými technikami uvedenými hore; a

b) vehikulum, ako napríklad polymér (napr. PEG alebo dextrán) alebo Fc doménu, ktorá je preferovaná; pričom vehikulum je kovalentne pripojené k doméne modulujúcej TALL-1. Vehikulum a doména modulujúca TALL-1 môžu byť spojené prostredníctvom N- alebo C-konca domény modulujúcej TALL-1 tak, ako je to opísané ďalej. Preferovaným vehikulom je doména Fc a preferovanou doménou Fc je doména IgG Fc. Takto Fc-spojené peptidy sú tu nazývané „peptilátky“ (peptilátky). Preferované domény modulujúce TALL-1 zahŕňajú aminokyselinové sekvencie opísané v tabuľkách 1 a 2. Ďalšie domény modulujúce TALL-1 môžu byť generované fágovým displejom, skríningom RNA-peptid a ďalšími uvedenými technikami.

Ďalším predmetom podľa predkladaného vynálezu je spôsob prípravy modulátorov TALL-1, ktorý zahŕňa:

a. selekciu aspoň jedného peptidu, ktorý sa viaže s TALL-1; a

b. kovalentné pripojenie uvedeného peptidu k vehikulu.

Výhodným vehikulom je doména Fc. Krok (a) je výhodne realizovaný selekciou z peptidových sekvencií uvedených v tabuľke, alebo fágovým displejom, skríningom RNA-peptid, alebo inými uvedenými technikami.

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť pripravené štandardnými metódami syntézy, technikami rekombinantnej DNA alebo akýmikoľvek inými metódami prípravy peptidov a fúznych proteínov. Zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré obsahujú nepeptidové podiely, môžu byť popri štandardných reakciách peptidovej chémie syntetizované reakciami štandardnej organickej chémie, pokiaľ je to vhodné.

Primárnym zamýšľaným použitím zlúčenín podľa vynálezu je ich použitie ako terapeutických a profylakčných agensov. Peptid spojený s vehikulom môže mať aktivitu porovnateľnú alebo dokonca väčšiu, ako má prirodzený ligand napodobovaný peptidom.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť použité na terapeutické alebo profylaktické účely tak, že sú upravené s vhodnými farmaceutickými nosičovými materiálmi a podávané v účinnom množstve potrebnému pacientovi, akým je napríklad človek (alebo iný cicavec). Ďalšie súvisiace aspekty sú rovnako zahrnuté v predmetnom vynáleze.

Početné ďalšie aspekty a prednosti predkladaného vynálezu sa stanú zrejmé z podrobného opisu vynálezu s prihliadnutím na obrázky.

Termíny použité v tomto opise majú nasledujúci význam, pokiaľ nie sú v špecifických prípadoch iným spôsobom obmedzené.

Všeobecné definície:

Výraz „zahŕňajúci“ znamená, že zlúčenina môže obsahovať ďalšie aminokyseliny tak na jednom, ako na obidvoch N- a C-koncoch danej sekvencie. Je zrejmé, že tieto ďalšie (dodatočné) aminokyseliny by nemali signifikantne interferovať s aktivitou zlúčeniny.

Okrem toho, sú tu zahrnuté fyziologicky prijateľné soli zlúčenín podľa vynálezu. Výraz „fyziologicky prijateľná soľ“ sa týka akýchkoľvek solí, ktoré sú známe, alebo budú neskoršie objavené, ktoré sú farmaceutický prijateľné. Niektorými zo špecifických príkladov sú: octan; trifluóroctan; hydrohalogenid, ako je napríklad hydrochlorid a hydrobromid; síran; citrát; tartarát; glykolát; a oxalát.

Aminokyseliny:

Výraz „kyslý zvyšok“ sa týka zvyšku aminokyselín v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce obsahujúce kyslé skupiny. Príkladné kyslé zvyšky zahŕňajú D a E.

Výraz „amidový zvyšok“ sa týka aminokyselín v D- a L-forme, ktoré majú bočné reťazce obsahujúce amidové deriváty kyslých skupín. Príkladné zvyšky zahŕňajú N a Q.

Výraz „aromatický zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce obsahujúce aromatické skupiny. Príkladné aromatické zvyšky zahŕňajú F, Y a W.

Výraz „bázický zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce obsahujúce bázické skupiny. Príkladné bázické zvyšky zahŕňajú H, K a R.

Výraz „hydrofilný zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce obsahujúce poláme skupiny. Príkladné hydrofílné zvyšky zahŕňajú C, S, T, N a Q.

Výraz „nefunkčný zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce, ktoré postrádajú kyslé, bázické alebo aromatické skupiny. Príkladné nefunkčné aminokyselinové zvyšky zahŕňajú M, G, A, V, I, La norleucín (Nie).

Výraz „neutrálny hydrofóbny zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce, ktoré postrádajú bázické, kyslé alebo polárne skupiny. Príkladné neutrálne hydrofóbne aminokyselinové zvyšky zahŕňajú A, V, L, I, P, W, M a F.

Výraz „polárny hydrofóbny zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú

SK 288175 Β6 bočné reťazce obsahujúce poláme skupiny. Príkladnými polárnymi hydrofóbnymi aminokyselinovými zvyškami sú T, G, S, Y, C, Q a N.

Výraz „hydrofóbny zvyšok“ sa týka aminokyselinových zvyškov v D- alebo L-forme, ktoré majú bočné reťazce, ktoré postrádajú bázické alebo kyslé skupiny. Príkladné hydrofóbne aminokyselinové zvyšky zahŕňajú A, V, L, I, P, W, M, F, T, G, S, Y, C, Q a N.

Peptidy:

Výraz „peptid“ sa týka molekúl z 1 až 40 aminokyselín, výhodne molekúl z 5 až 20 aminokyselín. Príkladné peptidy môžu zahŕňať doménu modulujúcu TALL-1 z prirodzene sa vyskytujúcej molekuly alebo zahŕňajú náhodné sekvencie.

Výraz „náhodné“ tak, ako je tu použitý vo vzťahu k peptidovým sekvenciám, sa týka celkom náhodných sekvencií (napríklad selektovaných pomocou metód fágového displeja alebo RNA-peptidového skríningu) a sekvencií, v ktorých jeden zvyšok alebo viac zvyškov v prirodzene sa vyskytujúcej molekule je zamenených aminokyselinovým zvyškom, ktorý sa v danej pozícii v prirodzenej molekule nevyskytuje. Príkladné spôsoby identifikácie peptidových sekvencií zahŕňajú fágový displej, E. coli displej, ribozómový displej, RNA-peptidový skríning, chemický skríning a podobne.

Výraz „doména modulujúca TALL-1“ sa týka akejkoľvek aminokyselinovej sekvencie, ktorá sa viaže k TALL-1 a obsahuje prirodzene sa vyskytujúce sekvencie alebo náhodné sekvencie. Príkladné domény modulujúce TALL-1 môžu byť identifikované alebo odvodené fágovým displejom alebo inými uvedenými metódami.

Výraz „antagonista TALL-1“ sa týka molekuly, ktorá sa viaže k TALL-1 a zvyšuje alebo znižuje jeden skúškový parameter alebo viac skúškových parametrov, na rozdiel od účinku prirodzeného TALL-1 s úplnou dĺžkou na tieto parametre. Takáto aktivita môže byť stanovená metódami, ktoré sú opísané v subsekcii nazvanej „Biological activity of AGP-3“ v časti Materials & Methods“ prihlášky vynálezu s názvom „TNF-RELATED PROTEINS“, WO 00/47740, publikovanej 17. augusta 2000.

Vehikulá a peptilátky:

Výraz „vehikulum“ sa týka molekuly, ktorá bráni degradácii a/alebo zvyšuje biologický polčas, znižuje toxickosť, znižuje imunogenickosť alebo zvyšuje biologickú aktivitu terapeutického proteínu. Príkladné vehikulá zahŕňajú doménu Fc (ktorá je preferovaná), rovnako ako lineárny polymér (napríklad polyetylénglykol (PEG), polylyzín, dextrán, a pod.); polymér s rozvetveným reťazcom (pozri, napríklad U. S. Patenty č. 4 289 872, pôvodcov Denkenwalter et al., vydaný 15. septembra 1981; 5 229 490, pôvodca Tam, vydaný 20. júla 1993; prihlášku WO 93/21259, pôvodcov Frechet et al., publikovanú 28. októbra 1993); lipid; cholesterolová skupina (ako je steroid); uhľovodan alebo oligosacharid (napríklad dextrán); akýkoľvek prirodzený alebo syntetický proteín, polypeptid alebo peptid, ktorý sa viaže k ochrannému (salvage) receptoru; albumín, zahŕňajúci ľudský sérový albumín (human sérum albumín, HSA), leucínovú zipovú (zipper) doménu, a ďalšie také proteíny a proteínové fragmenty. Vehikulá sú opísané ďalej.

Výraz „natívny Fc“ sa týka molekuly alebo sekvencie obsahujúcej sekvenciu neantigénneho väzbového fragmentu, ktorý vzniká štiepením úplnej protilátky, nech už v monomémej alebo multimémej forme. Pôvodný imunoglobulínový zdroj natívneho Fc je výhodne ľudského pôvodu a môže ním byť akýkoľvek z imunoglobulínov, hoci IgGl a IgG2 sú preferované. Natívne fragmenty Fc sú pripravované z monomémych peptidov, ktoré môžu byť spojené do dimérnych alebo multimémych foriem kovalentnou (napríklad disulfidovými mostíkmi) a nekovalentnou väzbou. Počet intermolekulárnych disulfidových mostíkov medzi monomémymi podjednotkami natívnych molekúl Fc sa pohybuje od 1 do 4 v závislosti od triedy (napríklad IgG, IgA, IgE) alebo podtriedy (napríklad IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Jedným príkladom natívneho Fc je dimér s disulfidovým mostíkom, ktorý vzniká štiepením IgG s papaínom (pozri Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071 - 9). Výraz „natívny Fc“ tak, ako je používaný, je generický pre monoméme, diméme a multiméme formy.

Výraz „variant Fc“ sa týka molekuly alebo sekvencie, ktorá je modifikovanou formou natívneho Fc, ale stále obsahuje väzbové miesto pre chránený (salvage) receptor, FcRn. Medzinárodná prihláška WO 97/34631 (zverejnená 25. septembra 1997) a prihláška WO 96/32478 opisujú príkladné varianty Fc rovnako ako interakcie s ochranným receptorom. Preto výraz „variant Fc“ zahŕňa molekulu alebo sekvenciu, ktorá je humanizovaná z natívneho Fc, ktorý nie je ľudského pôvodu. Okrem toho, natívny Fc obsahuje miesta, ktoré môžu byť odstránené, pretože poskytujú štruktúrne charakteristiky alebo biologickú aktivitu, ktoré nie sú pre fuziu molekúl podľa predkladaného vynálezu nevyhnutné. Z tohto dôvodu výraz „variant Fc“ zahŕňa aj molekulu alebo sekvenciu, ktorá postráda jedno alebo viac natívnych Fc miest alebo zvyškov, ktoré pôsobia alebo sú zúčastnené v (1) tvorbe disulfidového mostíka, (2) inkompatibilite s vybranou hostiteľskou bunkou, (3) N-terminálnej heterogenite po expresii vo vybranej hostiteľskej bunke, (4) glykozylácii, (5) interakcii s komplementom, (6) väzbe k receptoru Fc odlišnému od ochranného (salvage) receptoru alebo (7) protilátkovo dependentnej bunkovej cytotoxickosti (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Varianty Fc sú de13 tailne opísané ďalej.

Výraz „doména Fc“ zahŕňa molekuly a sekvencie natívneho Fc a varianty Fc už definované. Podobne ako v prípade variantov Fc a natívnych fragmentov Fc zahŕňa výraz „doména Fc“ molekuly v monomémej alebo multimémej forme, ktoré sú pripravované štiepením úplnej protilátky alebo inými spôsobmi.

Výraz „multimér“ tak, ako je použitý pre domény Fc alebo molekuly obsahujúce domény, sa týka molekúl majúcich dva polypeptidové reťazce alebo viac polypeptidových reťazcov spojených kovalentne, nekovalentne, alebo tak kovalentnými, ako nekovalentnými interakciami. Molekuly IgG typicky vytvárajú diméry; IgM, pentaméry; IgD, diméry; a IgA, monoméry, diméry, triméry alebo tetraméry. Multiméry sa môžu vytvárať pri využití sekvencie a rezultujúce aktivity natívneho zdroja Ig alebo Fc, alebo derivatizácie (tak, ako je definovaná ďalej) takých natívnych Fc.

Výraz „dimér“ tak, ako je použitý pre domény Fc alebo molekuly obsahujúce domény, sa týka molekúl majúcich dva alebo viac polypeptidových reťazcov spojených kovalentne alebo nekovalentne. Príkladnými dimérmi v rozsahu tohto vynálezu sú tie, ktoré sú zobrazené na obrázku 1.

Výrazy „derivatizujúci“ a „derivát“ a „odvodený“ zahŕňajú procesy a z nich rezultujúce zlúčeniny, kde (1) zlúčenina má cyklickú časť; napríklad priečne väzby medzi cysteinylovými zvyškami vnútri zlúčeniny;

(2) zlúčenina je priečne spojená alebo má miesto pre priečnu väzbu; napríklad zlúčenina má cysteinylový zvyšok a tvorí tak diméry s priečnymi väzbami v kultúre alebo in vivo’, (3) jedna alebo viac peptidových väzieb je nahradená nepeptidovou väzbou; (4) N-koniec je nahradený -NRR¹, NRC(O)R', -NRC(O)OR', -NRSÍO^R¹, -NHC(O)NHR, sukcinímidovou skupinou, alebo je substituovaný alebo nesubstituovaný benzyloxykarbonyl-ΝΗ-, kde R a R¹ a substituenty kruhov sú také, ako je definované ďalej; (5) C-koniec je nahradený -C(O)R² alebo -NR³R⁴, kde R² ,R³ a R⁴ sú také, ako je definované ďalej; a (6) zlúčeniny, v ktorých jednotlivé aminokyselinové časti sú modifikované pôsobením agens, ktoré sú schopné reagovať s vybraným bočným reťazcom alebo koncovými zvyškami. Deriváty sú tu opísané ďalej.

Výraz „peptilátka“ sa týka molekúl obsahujúcich doménu Fc a aspoň jeden peptid. Takými peptilátkami môžu byť multiméry alebo diméry alebo ich fragmenty, ktoré môžu byť derivatizované. Podľa predkladaného vynálezu ide o molekuly peptilátky vzorcov (II) až (VI), uvedené ďalej, v ktorých V¹ je doména Fc. Štruktúra zlúčenín:

Všeobecne: Pôvodcovia vynálezu identifikovali sekvencie schopné viazať sa a modulovať biologickú aktivitu TALL-1. Tieto sekvencie môžu byť modifikované uvedenými technikami, s ktorými jedna alebo viac aminokyselín môže byť pozmenená pri zachovaní alebo dokonca zlepšení väzbovej afinity peptidu.

V kompozíciách pripravených podľa tohto vynálezu môže byť peptid (peptidy) pripojený k vehikulu prostredníctvom peptidového N-konca alebo C-konca. Akýkoľvek z týchto peptidov môže byť spojený v tandeme (napríklad následne) pri použití linkerov alebo bez nich. Preto môžu byť molekuly vehikulum - peptid opísané nasledujúcim vzorcom:

(II) (X')_a-V¹ - (x²)_b, v ktorom:

V¹ je vehikulum (výhodne doména Fc);

X¹ a X² sú nezávisle vybrané z -(ĽX-P¹, -(L*)c - P¹ - (L²)d - P², -(Ľ)_c - P¹ - (L²)d - P² - (L³)e - P³ a -(Ľ)_c - P¹ - (L²)d- P²- (L³)e- P³- (Ľ)_f- P⁴;

P¹, P², P³ a P⁴ sú každý nezávisle sekvenciami domén modulujúcich TALL-1, ako sú napríklad domény vzorca (I(a)) až (I(i));

L¹, L², L³ a L⁴ sú každý nezávisle linkery; a a, b, c, d, e a f sú každý nezávisle 0 alebo 1, za podmienky, že aspoň jeden z a a b je L

Preto zlúčenina vzorca (II) zahŕňa výhodné zlúčeniny vzorca:

(III) X* - V¹ a ich multiméry, kde V¹ je doména Fc a je pripojená na C-konci A¹;

(IV) V¹-X² a ich multiméry, kde V¹ je doména Fc a je pripojená na N-konci A²;

(V) V'-ÍL^-P¹ a ich multiméry, kde V¹ je doména Fc a je pripojená na N-konci -(L'jc - P¹; a (VI) V¹-(L')c-P¹-(L²)d-P² a ich multiméry, kde V¹ je doména Fc aje pripojená na N-konci -Ľ - P¹ - L² - P².

Peptidy:

Peptidy podľa vynálezu sú vhodné ako peptidy modulujúce TALL-1 alebo ako domény modulujúce TALL-1 v molekulách vzorcov (II) až (VI). Molekuly podľa vynálezu, zahŕňajúce tieto sekvencie, môžu byť pripravené v odbore známymi metódami.

Výhodnými peptidovými sekvenciami sú sekvencie nasledujúceho vzorca (l(a)), ktoré majú substituenty 10 identifikované ďalej.

Tabuľka 1 — Výhodné peptidové substituenty

Vzorec I(a)	8 · +>- a je T; a⁹ je bázický zvyšok (najvýhodnejšie K; a a¹² je neutrálny hydrofóbny zvyšok (najvýhodnejšie F).
Vzorec I(b)	b³ je D, A alebo E; b⁶ je W alebo Y; b¹⁰ T; b¹¹ je K alebo R; a b¹⁴ je V alebo L.
Vzorec I(c)	C je T; c¹⁰ je K alebo R; c¹³ je I, L alebo V; a C¹⁷ je A alebo L.
Vzorec I(d)	d¹² je T.
Vzorec I(e)	e¹¹ je T.
Vzorec l(f)	fVň f¹⁰ je K; a f¹³ je V.
Vzorec I(g)	g⁵jeW; ^g’ je P; g je E; a g¹³je bázický zvyšok.
Vzorec I(h)	h¹ je G; h⁶ je A; h⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a h¹⁰ je kyslý zvyšok.
Vzorec I(i)	i²jeW; a i¹⁴ je W.

Výhodné peptidové sekvencie sú uvedené v tabuľke 2.

Tabuľka 2 - Výhodné TALL-1 modulujúce domény

Sekvencie	SEQ ID NO:
PGTCFPFPWECTHA	29
WGACWPFPWECFKE	30
VPFCDLLTKHCFEA	31
GSRCKYKWDVLTKQCFHH	32
LPGCKWDLLIKQWVCDPL	33
SADCYFDILTKSDVCTSS	34
SDDCMYDQLTRMF1CSNL	35
DLNCKYDELTYKEWCQFN	36
FHDCKYDLLTRQMVCHGL	37
RNHCFWDHLLKQD1CPSP	38
ANQCWWDSLTKKNVCEFF	39
YKGRQMWD1LTRSWVVSL	126
QDVGLWWDILTRAWMPNI	127

SK 288175 Β6

Sekvencie	SEQ ID NO:
QNAQRVWDLLIRTWVYPQ	128
GWNEAWWDELTKIWVLEQ	129
R1TCDTWDSLXKKCVPQS	130
GA1MQFWDSLTKTWLRQS	131
WLHSGWWDPLTKHWLQKV	132
SEWFFWFDPLTRAQLKFR	133
GVWFWWFDPLTKQWTQAG	134
MQCKGYYDILTKWCVTNG	135
LWSKEWDILTKSWVSQA	136
KAAGWWFDWLTKVWVPAP	137
AYQTWFWDSLTRLWLSTT	138
SGQHFWWDLLTRSWTPST	139
LGVGQKWDPLTKQWVSRG	140
VGKMCQWDPL1KRTVCVG	141
CRQGAKFDLLTKQCLLGR	142
GQAIRHWDVLTKQWVDSQ	143
RGPCGSWDLLTKHCLDSQ	144
WQWXQQWDLLTKQMVWVG	145
PITICRKDLLTKQVVCLD	146
KTCNGKWDLLTKQCLQQA	147
KCLKGKWDLLTKQCVTEV	148
RCWNGKWDLLTKQCIHPW	149
NRDMRKWDPL1KQWIVRP	150
QAAAATWDLLTKQWLVPP	151
PEGGPKWDPLTKQFLPPV	152
QTPQKKWDLLTKQWFTRN	153
1GSPCKWDLLTKQMICQT	154
CTAAGKWDLLTKQCIQEK	155
VSQCMKWDLLTKQCLQGW	156
VWGTWKWDLLTKQYLPPQ	157
GWWEMKWDLLTKQWYRPQ	158
TAQVSKWDLLTKQWLPLA	159
QLWGTKWDLLTKQYIQ1M	160
WATSQKWDLLTKQWVQNM	161
QRQCAKWDLLTKQCVLFY	162
KTTDCKWDLLTKQRICQV	163
LLCQGKWDLLTKQCLKLR	164
LMWFWKWDLLTKQLVPTF	165
QTWAWKWDLLTKQWIGPM	166
NKELLKWDLLTKQCRGRS	167
GQKDLKWDLLTKQYVRQS	168
PKPCQKWDLLTKQCLGSV	169
GQIGWKWDLLTKQWIQTR	170
VWLDWKWDLLTKQWIHPQ	171
QEWEYKWDLLTKQWGWLR	172
HWDSWKWDLLTKQWWQA	173
TRPLQKWDLLTKQWLRVG	174
SDQWQKWDLLTKQWFWDV	175
QQTFMKWDLLTKQWIRRH	176
QGECRKWDLLTKQCFPGQ	177
GQMGWRWDPLIKMCLGPS	178
QLDGCKWDLLTKQKVCIP	179
HGYWQKWDLLTKQWVSSE	180
HQGQCGWDLLTRIYLPCH	181
LHKACKWDLLTKQCWPMQ	182
GPPGSVWDLLTKIWIQTG	183
ITQDWRFDTLTRLWLPLR	184

Sekvencie	SEQ ID NO:
QGGFAAWDVLTKMWITVP	185
GHGTPWWDALTRIWILGV	186
VWPWQKWDLLTKQFVFQD	187
WQWSWKWDLLTRQYISSS	188
NQTLWKWDLLTKQFITYM	60
PVYQGWWDTLTKLYIWDG	61
WLDGGWRDPLIKRSVQLG	62
GHQQFKWDLLTKQWQSN	63
QRVGQFWDVLTKMFITGS	64
QAQGWSYDALIKTWIRWP	65
GWMHWKWDPLTKQALPWM	66
GHPTYKWDLLTKQWILQM	67
WNN WSLWDPLTKL WLQQN	68
WQWGWKWDLLTKQWVQQQ	69
GQMGWRWDPLTKMWLGTS	70

Je potrebné uviesť, že známe receptory pre TALL-1 nesú určitú sekvenčnú homológiu s výhodnými peptidmi:

12-3 LPGCKWDLLIKOWVCDPL

BAFFR MRRGPRSLRGRDAPVPTPCVPTECYDLLVRKCVDCRLL

TACI TICNHQSQRTCAAFCRSLSCRKEQGKFYDHLLRDCISCASI

BCMA FVSPSQEIRGRFRRMLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRC (SEQ ID NO: 33, 195, 196 a 197, v uvedenom poradí).

Akýkoľvek peptid obsahujúci cysteinylový zvyšok sa môže priečne viazať s iným Cys-obsahujúcim peptidom, pričom buď jeden alebo obidva môžu byť viazané na vehikulum. Rovnako akýkoľvek peptid, ktorý má viac ako jeden zvyšok Cys, môže vytvárať intrapeptidový disulfidový mostík. Akýkoľvek z týchto peptidov môže byť derivatizovaný tak, ako je ďalej opísané.

Ďalšie užitočné peptidové sekvencie môžu vznikať na základe konzervatívnych a nekonzervatívnych modifikácií aminokyselinových sekvencii zo sekvencii uvedených v tabuľke 2.

Konzervatívne modifikácie poskytujú peptidy, ktoré majú fúnkčné a chemické charakteristiky podobné tým, ktoré má peptid, z ktorého sú také modifikácie pripravené. Naopak významné modifikácie fúnkčných a/alebo chemických charakteristík peptidov môžu byť vykonané selekciou substitúciou v aminokyselinovej sekvencii, ktoré sa signifikantne odlišujú v svojom účinku na zachovaní (a) štruktúry molekulárnej kostry v oblasti substitúcie, napríklad listovej alebo skrutkovicovej konformácie, (b) náboja alebo hydrofóbnosti molekuly v cieľovom mieste, alebo (c) veľkosti molekuly.

Tak napríklad, „konzervatívna aminokyselinová substitúcia“ môže zahŕňať substitúcie prirodzeného aminokyselinového zvyšku neprirodzeným zvyškom tak, že je v tejto pozícii malý alebo žiadny účinok na polaritu alebo na náboj aminokyselinového zvyšku. Okrem toho, akýkoľvek prirodzený zvyšok v polypeptide môže byť rovnako substituovaný za alanín tak, ako bolo opísané pre „alanine scanning mutagenesis“ (pozri napríklad MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643: 55 - 67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys. 35: 1 - 24, kde je mutagenéza alanínovým skanovaním diskutovaná).

Požadované aminokyselinové substitúcie (nech už konzervatívne alebo nekonzervatívne) môžu byť odborníkom v odbore stanovené v čase, kedy sú také substitúcie požadované. Tak napríklad, aminokyselinové substitúcie môžu byť použité na identifikáciu významných zvyškov v polypeptidovej sekvencii alebo na zvýšenie alebo zníženie afinity opísaných peptidových alebo vehikulum-peptidových molekúl (pozri uvedené vzorce). Príkladné aminokyselinové substitúcie sú uvedené v tabuľke 3.

Tabuľka 3 - Aminokyselinové substitúcie

Pôvodné zvyšky	Príkladné substitúcie	Výhodné substitúcie
Ala (A)	Val, Leu, íle	Val
Arg (R)	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn (N)	Gin	Gin
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser, Ala	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn

SK 288175 Β6

Pôvodné zvyšky	Príkladné substitúcie	Výhodné substitúcie
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro, Ala	Ala
His (H)	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
He (I)	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucín	Leu
Leu (L)	Norleucín, íle, Val, Met, Ala, Phe	íle
Lys (K)	Arg, kyselina 1,4-diaminomaslová, Gin, Asn	Arg
Met (M)	Leu, Phe, íle	Leu
Phe (F)	Leu, Val, íle, Ala, Tyr	Leu
Pro (P)	Ala	Gly
Ser (S)	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr, Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	íle, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucín	Leu

V určitých realizáciách zahŕňajú konzervatívne aminokyselinové substitúcie rovnako neprirodzene sa vyskytujúce aminokyselinové zvyšky, ktoré sú typicky začleňované pri chemickej syntéze peptidov skôr ako pri syntéze v biologických systémoch.

Ako bolo uvedené v časti „Definícia pojmov“, prirodzene sa vyskytujúce zvyšky môžu byť rozdelené do tried na základe všeobecných vlastností bočného reťazca, ktoré môžu byť vhodné na modifikácie sekvencie. Tak napríklad, nekonzervatívne substitúcie môžu zahŕňať zámenu člena jednej z týchto tried za člena z inej triedy. Takto zamenené zvyšky môžu byť zavedené do oblastí peptidu, ktoré sú homológne s nie-ľudskými ortológmi, alebo do nehomológnych oblastí molekuly. Okrem toho, je možné tiež pripraviť modifikácie pri použití P alebo G s cieľom ovplyvniť orientáciu reťazca.

Pri príprave takých modifikácií je potrebné vziať do úvahy hydropatický index aminokyselín. Každej z aminokyselín bol pridelený hydropatický index na základe ich hydrofóbnych a nábojových charakteristík, ktorý je pre: izoleucín (+4,5); valín (+4,2); leucín (+3,8); fenylalanín (+2,8); cysteín/cystín (+2,5); metionín (+1,9); alanín (+1,8); glycín (-0,4); treonín (-0,7); serín (-0,8); tryptofán (-0,9); tyrozín (-1,3); prolín (-1,6); histidín (-3,2); glutamát (-3,5); glutamín (3,5); aspartát (-3,5); asparagín (-3,5); lyzín (-3,9) a arginín (-4,5).

Význam hydropatického aminokyselinového indexu pre uvedené interaktívne biologické funkcie proteínu je v odbore známy. Kyte et al., í. Mol. Biol.. 157: 105 - 131 (1982). Je známe, že určité aminokyseliny môžu byť zamenené za iné aminokyseliny, ktoré majú podobný hydropatický index alebo skóre, a stále si uchovávajú podobnú biologickú aktivitu. Pri uskutočňovaní zámien na základe hydropatického indexu sú výhodné tie substitúcie aminokyselín, ktorých hydropatické indexy sú medzi ±2, výhodnejšie tie, ktorých hydropatické indexy sú medzi ±1, a najvýhodnejšie tie, ktorých hydropatické indexy sú medzi ±0,5.

Rovnako je v odbore známe, že substitúcia podobných aminokyselín môže byť účinne realizovaná na základe hydrofóbnosti. Najvyššia miestna priemerná hydrofóbnosť proteínu tak, ako je určovaná hydrofilitou susediacich aminokyselín, koreluje s jeho imunogenitou a antigenitou, tzn. s biologickou vlastnosťou proteínu.

Aminokyselinovým zvyškom boli pridelené nasledujúce hodnoty hydrofility: arginín (+3,0); lyzín (+3,0); aspartát (+3,0 ±1); glutát (+3,0 ±1); serín (+0,3); asparagín (+0,2); glutamín (+0,2); glycín (0); treonín (-0,4); prolín (-0,5 ±1); alanín (-0,5); histidín (-0,5); cysteín (1,0); metionín (-1,3); valín (-1,5); leucín (-1,8); izoleucín (-1,8); tyrozín (-2,3); fenylalanín (-2,5); tryptofán (-3,4). Pri realizácii zámen na základe podobných hodnôt hydrofility sú výhodné substitúcie aminokyselín, ktorých hodnoty hydrofility sú v rámci ±2, výhodnejšie tie, ktorých hodnoty hydrofility sú v rámci ±1, a najvýhodnejšie tie, ktorých hodnoty hydrofility sú v rámci ±0,5. Na základe hydrofility je možné rovnako identifikovať epitopy z primárnych aminokyselinových sekvencii. Tieto oblasti sú rovnako nazývané ako Jadrové oblasti epitopu“.

Odborník v odbore je schopný pri použití dobre známych techník stanoviť vhodné varianty polypeptidu tak, ako sú uvedené v nasledujúcich sekvenciách. Na identifikáciu vhodných oblastí molekuly, ktoré môžu byť menené bez narušenia aktivity, môže odborník v odbore vytypovať oblasti, o ktorých sa predpokladá, že nie sú významné pre aktivitu proteínu. Tak napríklad, keď sú známe polypeptidy s podobnými aktivitami z rovnakých druhov alebo z iných druhov, môže odborník v odbore porovnať aminokyselinovú sekvenciu peptidu s podobnými peptidmi. Na základe takého porovnania môžu byť identifikované zvyšky alebo časti molekúl, ktoré sú pri podobných polypeptidoch konzervované. Je potrebné zdôrazniť, že zmeny v oblastiach peptidu, ktoré nie sú konzervované vzhľadom na také podobné peptidy, by menej pravdepodobnejšie mali nepriaznivý účinok na biologickú aktivitu a/alebo štruktúru peptidu. Odborník v odbore by mal rovnako vedieť, že dokonca aj v relatívne konzervovaných oblastiach je možné substituovať chemicky podobné aminokyseliny za prirodzene sa vyskytujúce zvyšky pri zachovaní aktivity (konzervatívne aminokyselinové substitúcie). Preto dokonca aj oblastiach, ktoré môžu byť významné pre biologickú aktivitu alebo pre štruktúru, môžu byť podrobené konzervatívnym aminokyselinovým substitúciám bez narušenia biologickej aktivity alebo bez nepriaznivého pôsobenia na štruktúru peptidu.

Okrem toho, odborník v odbore môže vyhodnotiť štúdie o štruktúre - funkcii, ktoré identifikujú zvyšky v podobných peptidoch, ktoré sú významné pre aktivitu alebo štruktúru. S ohľadom na také porovnanie je možné predpovedať význam aminokyselinových zvyškov v peptide, ktoré korešpondujú s aminokyselinovými zvyškami, ktoré sú významné pre aktivitu alebo štruktúru pri podobných peptidoch. Odborník v odbore môže vybrať chemicky podobné aminokyselinové substitúcie pre takto predpovedané významné aminokyselinové zvyšky v peptidoch.

Odborník v odbore môže rovnako pri podobných peptidoch analyzovať trojrozmernú štruktúru a aminokyselinovú sekvenciu vo vzťahu k tejto štruktúre. Na základe tejto informácie môže odborník v odbore predpovedať zoradenie sekvencii (alignment) aminokyselinových zvyškov peptidu s ohľadom na trojrozmernú štruktúru. Odborník v odbore môže zvoliť postup, pri ktorom nie sú vykonávané radikálne zmeny v aminokyselinových zvyškoch, o ktorých sa predpokladá, že sú na povrchu proteínu, pretože tieto zvyšky môžu byť zúčastnené vo významných interakciách s inými molekulami. Navyše, odborník v odbore môže vytvoriť testovacie varianty obsahujúce jednoduché aminokyselinové substitúcie v každom z požadovaných aminokyselinových zvyškov. Varianty môžu byť skrinované pri použití skúšok aktivity, ktoré sú v odbore známe. Uvedené výsledky môžu byť použité na zhromaždenie informácií o vhodných variantoch. Tak napríklad, keď je zistené, že zmena v konkrétnom aminokyselinovom zvyšku viedla k deštruovanej, nežiaduco zníženej, alebo nevhodnej aktivite, sú varianty s takou zmenou vylúčené. Inak povedané, na základe informácií zhromaždených z takýchto rutinných pokusov môže odborník v odbore ľahko stanoviť aminokyseliny, kde ďalšie substitúcie by nemali byť vykonávané buď samostatne alebo v kombinácii s inými mutáciami.

Rad odborných publikácií bol venovaný predikcii sekundárnej štruktúry. Pozri Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7 (4): 422 - 427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222 - 245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211 - 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45 - 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem.. 47: 251 - 276 a Chou et al., Biophys. J., 26: 367 - 384 (1979). Okrem toho sú v súčasnosti dostupné počítačové programy, ktoré napomáhajú s predikciou sekundárnej štruktúry. Jedna z metód predikcie sekundárnej štruktúry je založená na homológnom modelovaní. Tak napríklad, dva polypeptidy alebo proteíny, ktoré majú sekvenčnú identitu vyššiu ako 30 % alebo podobnosť vyššiu ako 40 %, majú často podobné štrukturálne topológie. Súčasný nárast databáz údajov o proteínovej štruktúre (proteín structural data base, PDB) poskytuje zvýšenú predpovedateľnosť sekundárnej štruktúry, vrátane potenciálneho počtu zbalení vnútri polypeptidovej alebo proteínovej štruktúry. Pozri Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244 až 247 (1999). Bolo naznačené (Brenner et al. Curr. Og. Strúc. Biol.. 7 (3): 369 - 376 (1997)), že v danom polypeptide alebo proteíne existuje obmedzený počet zbalení, a keďže bol raz stanovený kritický počet štruktúr, dosiahne štrukturálna predpoveď významnú presnosť.

Ďalšie metódy predikcie sekundárnej štruktúry zahŕňajú „threading“ (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol.. 7 (3): 377 - 87 (1997); Sippl et al., Structure, 4 (1): 15-9 (1996)), „profile analysis“ (Bowie et al., Science, 253: 164 - 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzým.. 183: 146 - 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci.. 84 (13): 4355 - 8 (1987)), a „evolutionary linkage“ (Pozri Home, hore, a Brenner, hore).

Vehikulá:

Tento vynález vyžaduje prítomnosť aspoň jedného vehikulá (V¹) pripojeného k peptidu prostredníctvom N-konca, C-konca alebo bočného reťazca jedného z aminokyselinových zvyškov. Mnohonásobné vehikulá môžu byť rovnako použité, napríklad fragmenty Fc na každom konci, alebo Fc na konci a skupina PEG na inom konci alebo bočnom reťazci. Príkladné vehikulá zahŕňajú:

• doménu Fc;

• iné proteíny, polypeptidy alebo peptidy schopné väzby na ochranný (salvage) receptor;

• ľudský sérový albumín (human sérum albumín, HSA);

• doménu kukuričného leucínového zipperu (LZ);

• polyetylénglykol (PEG), zahŕňajúci 5 kD, 20 kD a 30 kD PEG, rovnako ako iné polyméry;

• dextrán a iné molekuly známe v odbore ako látky poskytujúce predĺženie biologického polčasu a/alebo ochranu pred proteolytickou degradáciou alebo odstránením (clearanciou).

Preferovaným vehikulom je doména Fc. Doména Fc môže byť fúzovaná na N- alebo C-konci peptidov, alebo na obidvoch N- a C-koncoch. Fúzia na N-konci je preferovaná.

Ako bolo uvedené, sú varianty Fc vhodnými vehikulmi patriacimi do rozsahu tohto vynálezu. Prirodzený Fc môže byť extenzívne modifikovaný za tvary variantu Fc v súlade s týmto vynálezom, za predpokladu že väzba k ochrannému (salvage) receptoru je zachovaná; pozri napríklad WO97/34631 a WO 96/32478. Pri takýchto variantoch Fc je možné odstrániť jedno miesto aíebo viac miest natívneho Fc, ktoré poskytujú štrukturálne znaky alebo funkčnú aktivitu, ktoré nie sú požadované na fúziu molekúl podľa vynálezu. Miesta je možné odstrániť napríklad substitúciou alebo deléciou zvyškov, inzerciou zvyškov do miesta, alebo skráte19

SK 288175 Β6 ním častí, ktoré miesto obsahujú. Inzerovanými alebo substituovanými zvyškami môžu rovnako byť pozmenené aminokyseliny, ako sú peptidomimetiká alebo D-aminokyseliny. Varianty Fc môžu byť žiaduce z radu dôvodov, z ktorých niektoré sú opísané ďalej. Príkladné varianty Fc zahŕňajú molekuly a sekvencie v ktorých:

1. Miesta zúčastnené v tvorbe disulfidových mostíkov sú odstránené. Také odstránenie môže zabrániť reakcii s inými proteínmi obsahujúcimi cysteín, ktoré sú prítomné v hostiteľskej bunke použitej na produkciu molekúl podľa vynálezu. Na tento účel môže byť segment obsahujúci cysteín na N-konci skrátený alebo môžu byť cysteínové zvyšky deletované alebo substituované inými aminokyselinami (napríklad alanylom, serylom). Konkrétne je možné odstrániť N-koncový 20-aminokyselinový segment zo sekvencie SEQ ID NO: 2, alebo odstrániť alebo substituovať cysteínové zvyšky v pozíciách 7 a 10 v sekvencií SEQ ID NO: 2. Napriek tomu, že sú cysteínové zvyšky odstránené, môžu jednoreťazcové domény Fc stále vytvárať diméme domény Fc, ktoré sú vzájomne spojené nekovalentnými väzbami.

2. Natívny Fc je modifikovaný tak, aby bol viac kompatibilný s vybranou hostiteľskou bunkou. Tak napríklad, je možné odstrániť sekvencie PA v blízkosti N-konca v typickom natívnom Fc, ktoré môžu byť rozpoznané štiepiacim enzýmom v E. coli, akým je prolín iminopeptidáza. Rovnako je možné na N-koniec pridať metionínový zvyšok, najmä vtedy, keď je molekula rekombinantne exprimovaná v bakteriálnej bunke, akou je E. coli. Doména Fc zo sekvencie SEQ ID NO: 2 je jedným z takých variantov Fc.

3. Časť N-konca natívneho Fc je odstránená na zabránenie N-koncovej heterogenickosti, keď je exprimovaný vo vybranej hostiteľskej bunke. Na tento účel je možné deletovať akýkoľvek z prvých 20-aminokyselinových zvyškov na N-konci, predovšetkým tých, ktoré sú v pozíciách 1, 2, 3, 4 a 5.

4. Jedno glykolyzačné miesto alebo viac glykozylačných miest je odstránené. Zvyšky, ktoré sú typicky glykozylované (napríklad asparagín), môžu poskytovať cytolytickú odpoveď. Také zvyšky môžu byť deletované alebo substituované s neglykozylovanými zvyškami (napríklad alanínom).

5. Miesta zúčastnené v reakcii s komplementom, ako je väzbové miesto Clq, sú odstránené. Tak napríklad je možné deletovať alebo substituovať sekvenciu EKK ľudského IgGl. Zapojenie komplementu nemusí byť pre molekuly podľa tohto vynálezu výhodné a s takýmto variantom Fc je možné ich vylúčiť.

6. Sú odstránené miesta, ktoré ovplyvňujú väzbu k receptorom Fc iným, ako je ochranný (salvage) receptor. Natívny Fc môže mať miesta pre interakciu s určitými bielymi krvnými bunkami, ktorá nie je požadovaná pre fúziu molekúl podľa predkladaného vynálezu, a preto môžu byť odstránené.

7. Je odstránené miesto ADCC. Miesta ADCC sú v odbore známe; pozri napríklad Molec. Immunol. 29 (5): 633 - 9 (1992) týkajúce sa miest ADCC v IgGl. Tieto miesta nie sú rovnako požadované pre fúziu molekúl podľa predkladaného vynálezu, a preto môžu byť odstránené.

8. Keď je natívny Fc odvodený z protilátky, ktorá nie je ľudská, môže byť natívny Fc humanizovaný.

Typicky sa na humanizáciu natívneho Fc substituujú vybrané zvyšky v nie ľudskom natívnom Fc za zvyšky, ktoré normálne nie sú v ľudskom natívnom Fc nachádzané. Techniky humanizácie protilátok sú v odbore veľmi dobre známe.

Výhodné varianty Fc zahŕňajú nasledujúce. V SEQ ID NO: 2 (obrázok 3) môže byť leucín v pozícii 15 substituovaný glutamátom; glutamát v pozícii 99 alanínom; a lyzíny v pozíciách 101 a 103 alanínmi. Okrem toho, jeden tyrozínový zvyšok alebo viac tyrozínových zvyškov môže byť zamenených zvyškami fenylalanínu.

Alternatívnym vehikulom môže byť proteín, polypeptid, peptid, protilátka, fragment protilátky alebo malá molekula (napríklad peptidomimetická zlúčenina), ktoré sú schopné väzby k ochrannému (salvage) receptoru. Tak napríklad, ako vehikulum je možné použiť polypeptid tak, ako je opísaný v U. S. Pat. č. 5 739 277, vydanom 14. apríla 1998 pôvodcom Presta et al. Peptidy môžu byť tiež selektované metódou fágového displeja alebo RNA-peptidovým skríningom na väzbu k FcRn ochrannému (salvage) receptoru. Také zlúčeniny, ktoré sa viažu k ochrannému (salvage) receptoru, sú rovnako zahrnuté do významu pojmu „vehikulum“ a patria do rozsahu tohto vynálezu. Vehikulá tohto typu by mali byť vybrané na zvýšenie polčasu (napríklad vylúčením sekvencií, ktoré sú rozpoznávané proteázami) a na zníženie imunogenity (napríklad uprednostnením neimunogénnych sekvencií, ako bolo objavené humanizáciou protilátok).

Ako bolo uvedené, ako V¹ môžu byť použité aj polyméme vehikulá. V súčasnosti sú dostupné rôzne prostriedky na pripojenie chemických zlúčenín vhodných ako vehikulá, pozri napríklad zverejnenú medzinárodnú prihlášku PCT WO 96/11953, s názvom „N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods“. Táto PCT publikácia, okrem iných, opisuje selektívne pripojenie vo vode rozpustných polymérov k N-koncu proteínov.

Preferovaným polymérnym vehikulom je polyetylénglykol (PEG). Skupina PEG môže mať akúkoľvek vhodnú molekulovú hmotnosť a môže byť lineárna alebo vetvená. Priemerná molekulová hmotnosť PEG sa bude výhodne pohybovať v rozsahu od približne 2 kiloDaltonov („kD“) do približne 100 kD, výhodnejšie od približne 5 kD do približne 50 kD, najvýhodnejšie od približne 5 kD do približne 10 kD. Skupiny PEG budú všeobecne pripojené k zlúčeninám podľa vynálezu prostredníctvom acylácie alebo redukčnej alkylácie na reaktívnej skupine časti PEG (napríklad na aldehydovej, aminoskupine tiolovej, alebo esterovej skupine) k re20

SK 288175 Β6 aktívnej skupine zlúčeniny podľa vynálezu (napríklad aldehydovej, aminoskupine, alebo esterovej skupine).

Vhodná stratégia na pegyláciu syntetických peptidov spočíva v kombinácii prostredníctvom vytvárania konjugačných väzieb v roztoku, peptidovej časti a podiele PEG, z ktorých každý nesie špeciálnu funkčnú skupinu, ktoré sú navzájom reaktívne. Peptidy môžu byť ľahko pripravené bežnou syntézou na pevnej fáze. Peptidy sú „vopred aktivované“ s vhodnými funkčnými skupinami na špecifickom mieste. Prekurzory sú purifikované a plne charakterizované pred reakciou s podielom PEG.

Väzba peptidu s PEG sa zvyčajne vykonáva vo vodnej fáze a môže byť ľahko monitorovaná analýzou HPLC s reverznou fázou. Pegylované peptidy môžu byť ľahko purifikované preparatívnou HPLC a charakterizované analytickou HPLC, aminokyselinovou analýzou a laserovou desorpčnou hmotovou spektrometriou.

Polysacharidové polyméry sú ďalším typom vo vode rozpustného polyméru, ktorý môže byť použitý na modifikáciu proteínu. Dextrány sú polysacharidové polyméry skladajúce sa z jednotlivých podjednotiek glukózy, prednostne spojených väzbami 1 - 6. Dextrán samotný je dostupný v mnohých rozmedziach molekulovej hmotnosti a je ľahko dostupný v molekulových hmotnostiach od približne 1 kD do približne 70 kD. Dextrán je vhodným vo vode rozpustným polymérom na použitie podľa predkladaného vynálezu ako vehikulum samotný alebo v kombinácii s iným vehikulom (napríklad s Fc). Pozri napríklad WO 96/11953 a WO 96/05309. Použitie dextránu konjugovaného s terapeutickými alebo diagnostickými imunoglobulínmi bolo publikované; pozri napríklad zverejnenú európsku patentovú prihlášku EP-A-0315456. Keď je dextrán použitý ako vehikulum v súlade s predkladaným vynálezom, je preferovaný dextrán s molekulovou hmotnosťou približne 1 kD až približne 20 kD.

Linkery:

Prípadne je možné použiť akúkoľvek skupinu „linkeru“. Keď je linker prítomný, jeho chemická štruktúra nie je kritická, pretože slúži primáme ako spacer. Linker je prednostne pripravený z aminokyselín vzájomne spojených peptidovými väzbami. A tak je vo výhodných realizáciách linker tvorený z 1 až 30 aminokyselín spojených peptidovými väzbami, pričom aminokyseliny sú vybrané z 20 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín. Niektoré z týchto aminokyselín môžu byť glykozylované tak, ako je odborníkovi v odbore dobre známe. Vo výhodnejšom rozpracovaní je 1 až 20 aminokyselín vybraných z glycínu, alanínu, prolínu, asparagínu, glutamínu a lyzínu. Ešte výhodnejšie je linker tvorený z prevažujúceho množstva aminokyselín, ktoré nie sú stéricky bránené, tzn. takými, ako je glycín a alanín.

Z tohto dôvodu sú preferovanými linkermi polyglycíny (konkrétne (Gly)₄, (Gly)₅), poly(Gly-Ala) a polyalaníny.

Ďalšími špecifickými príkladmi linkerov sú:

(Gly)₃Lys(Gly) (SEQ ID NO: 40);

(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO: 41);

(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO: 42); a

GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 43).

Na objasnenie použitej nomenklatúry napríklad (Gly)₃Lys(Gly)₄ znamená Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 40). Kombinácie Gly a Ala sú rovnako preferované. Uvedené linkery sú príkladné; linkery, patriace do rozsahu tohto vynálezu, môžu byť oveľa dlhšie a môžu obsahovať aj iné zvyšky.

Výhodnými linkermi sú aminokyselinové linkery obsahujúce viac ako 5 aminokyselín, s vhodnými linkermi majúcimi až približne 500 aminokyselín vybraných z glycínu, alanínu, prolínu, asparagínu, glutamínu, lyzínu, treonínu, serínu alebo aspartátu. Linkery z približne 20 až 50 aminokyselín sú najvýhodnejšie. Jednou skupinou linkerov sú linkery vzorca

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx'x² (SEQ ID NO: 193) a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx'x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴(SEQIDNO: 194), kde x¹ a x³ je každý nezávisle bázický alebo hydrofóbny zvyšok a x² a x⁴ je každý nezávisle hydrofóbny zvyšok. Špecifickými výhodnými linkermi sú:

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ ID NO: 59)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ IDNO: 190)

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQIDNO: 191), a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ IDNO: 192).

Nepeptidové linkery sú rovnako možné. Napríklad môžu byť použité alkylové linkery, ako je -NH-(CH₂)s-C(O)-, kde s = 2 - 20. Tieto alkylové linkery môžu byť ďalej substituované akoukoľvek stéricky nebrániacou skupinou, akou je nižší alkyl (napríklad Ci-C₆), nižší acyl, halogén (napríklad Cl, Br), CN, NH₂, fenyl a podobne. Príkladným nepeptidovým linkerom je PEG linker vzorca (VII)

kde n je také, že linker má molekulovú hmotnosť od 100 do 5000 kD, výhodne 100 až 500 kD. Peptidové linkery môžu byť pozmenené tak, že tvoria deriváty rovnakým spôsobom, ako bolo opísané.

Deriváty:

Pôvodcovia rovnako zamýšľajú derivatizáciu peptidového podielu a/alebo podielu vehikula zlúčenín podľa vynálezu. Takéto deriváty môžu pri zlúčeninách zlepšovať rozpustnosť, absorpciu, biologický polčas a pod. Časti derivátov môžu alternatívne eliminovať alebo zmierňovať nežiaduce vedľajšie účinky zlúčenín a pod. Príkladné deriváty zahŕňajú zlúčeniny, v ktorých:

1. Zlúčenina alebo jej časť je cyklická. Napríklad peptidový podiel môže byť modifikovaný tak, že obsahuje dva zvyšky alebo viac zvyškov Cys (napríklad v linkeri), ktoré môžu cyklizovať tvorbou disulfidového mostíka.

2. Zlúčenina je priečne viazaná alebo je upravená tak, že je schopná priečnej väzby medzi molekulami. Napríklad peptidový podiel môže byť modifikovaný tak, že obsahuje zvyšok Cys, a je preto schopný vytvárať intermolekuláme disulfidové väzby s podobnou molekulou. Zlúčenina môže byť tiež priečne prepojená prostredníctvom C-konca, tak ako je znázornené v zobrazenej molekule.

Vzorec (VIII)

V’-tXhb-CO-N^^.

V'-(X')_b-CON^Y o

NH₂

NH

Vo vzorci (VIII) každý z V¹ môže typicky znamenať jeden reťazec domény Fc.

3. Jedna z peptidových [-C(O)NR-] väzieb (mostíkov) je nahradená nepeptidovou väzbou. Príkladnými nepeptidovými väzbami sú -CH₂-karbamát [-CH₂-OC(O)NR-], fosfonát,-CH₂-sulfonamid [-CH₂-S(O)₂NR-], močovina [-NHC(O)NH-], -CH₂-sekundámy amín a alkylovaný peptid [-C(O)NR⁶-, kde R⁶ je nižší alkyl],

4. N-koniec je derivatizovaný. Typicky môže byť N-koniec acylovaný alebo modifikovaný na substituovaný amín. Príkladné N-koncové skupiny derivátov zahŕňajú -NRR¹ (iné ako -NH₂), -NRC(O)R*, -NRC(O)OR*, -NRS(O)₂R*, -NHC(O)NHR‘, sukcínimid, alebo benzyloxykarbonyl-NH-(CBZ-NH-), kde R a R* je každý nezávisle vodík alebo nižší alkyl a kde kruh fenylu môže byť substituovaný 1 až 3 substituentmi vybranými zo skupiny skladajúcej sa z Ci-C₄ alkylu, C_rC₄ alkoxyskupiny, chlóru a brómu.

5. Voľný C-koniec je derivatizovaný. Typicky je C-koniec esterifikovaný alebo amidovaný. Príkladné C-koncové skupiny derivátov zahŕňajú napríklad -C(O)R², kde R² je nižší alkyloxy, alebo -NR³R⁴, kde R³ a R⁴sú nezávisle vodík alebo Cj-C₈ alkyl (výhodne Ci-C₄ alkyl).

6. Disulfidový mostík je nahradený inou, výhodne stabilnejšou priečne väzbovou skupinou (napríklad alkylénom). Pozri napríklad Bhatnagar et a/.(1996), J. Med. Chem. 39: 3814 - 9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp.. 357 - 9.

7. Jeden aminokyselinový zvyšok alebo viac aminokyselinových zvyškov je modifikovaných. Sú známe rôzne derivatizujúce agensy, ktoré špecificky reagujú s vybranými bočnými reťazcami terminálnych zvyškov tak, ako je detailne opísané ďalej.

Lyzinylové zvyšky a aminoterminálne zvyšky môžu reagovať s anhydridmi kyseliny jantárovej alebo inej karboxylovej kyseliny, ktoré menia náboj lyzinylových zvyškov. Iné vhodné reagencie na derivatizáciu zvyškov obsahujúcich alfa-aminoskupiny zahŕňajú imidoestery, ako je metylpikolinimidát; pyridoxal fosfát; pyridoxal; chlórbórhydrid; trinitrobenzénsulfónová kyselina; O-metylizomočovina; 2,4-pentándión; a transaminázou katalyzovaná reakcia s glyoxylátom.

Arginylové zvyšky môžu byť modifikované reakciou s akoukoľvek konvenčnou reagenciou alebo s kombináciou z radu konvenčných reagencií, zahŕňajúcich fenylglyoxal, 2,3-butándión, 1,2-cyklohexándión a ninhydrín. Derivatizácia arginylových zvyškov vyžaduje, aby reakcia bola vykonávaná za alkalických podmienok vzhľadom na vysokú hodnotu pKa guanidínovej funkčnej skupiny. Okrem toho môžu tieto reagencie reagovať so skupinami lyzínu, rovnako ako s arginínovými epsilon-aminoskupinami.

Špecifické modifikácie tyrozylových zvyškov boli intenzívne študované s osobitným záujmom na zavedenie spektrálnych značiek do tyrozylových zvyškov reakciou s aromatickými diazóniovými zlúčeninami alebo s tetranitrometánom. Najbežnejšie sú používané N-acetylimidizol a tetranitrometán na tvorbu O-acetyl tyrozylových typov derivátov a 3-nitroderivátov v uvedenom poradí.

Karboxylové skupiny bočných reťazcov (aspartylu alebo glutamylu) môžu byť selektívne modifikované reakciou s karbodiimidmi (R¹ - N = C = N - R'), ako je l-cyklohexyl-3-(2-morfolinyl-(4-etyl) karbodiimid, alebo l-etyl-3-(4-azonia-4,4-dimetylpentyl) karbodiimid. Okrem toho môžu byť aspartylové a glutamylové zvyšky konvertované na asparaginylové a glutaminylové zvyšky reakciou s amóniovými iónmi.

Glutaminylové a asparaginylové zvyšky môžu byť deamidované na zodpovedajúce glytamylové a aspartylové zvyšky. Inak povedané, tieto zvyšky sú deamidované za mierne kyslých podmienok. Každá z foriem týchto zvyškov patrí do rozsahu tohto vynálezu.

Cysteinylové zvyšky môžu byť nahradené aminokyselinovými zvyškami alebo inými zlúčeninami buď na elimináciu disulfidovej väzby, alebo naopak, na stabilizáciu priečnej väzby. Pozri napríklad Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814 - 9.

Derivatizácia s bifunkčnými činidlami je vhodná na priečne pripojenie peptidov alebo ich funkčných derivátov k vo vode nerozpustným nosičom, alebo iným makromolekulámym vehikulom. Všeobecne používané agensy vytvárajúce priečne väzby zahŕňajú napríklad l,l-bis-(diazoacetyl)-2-fenyletán, glutaraldehyd, N-hydroxysukcínimidové estery, napríklad estery s 4-azidosalicylovou kyselinou, homobifunkčné imidoestery, zahŕňajúce disukcínimidylové estery, ako je 3,3'ditiocis(sukcinimidylpropionát), a bifunkčné maleimidy, ako je bis-N-maleimido-l,8-oktán. Derivatizačné agensy, ako je metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidát, poskytujú fotoaktivovateľné medziprodukty, ktoré sú schopné tvoriť priečne väzby v prítomnosti svetla. Inak povedané, reaktívne vo vode nerozpustné materiály, ako sú kyanogénne bromidom-aktivované uhľovodany a reaktívne substráty opísané v U. S. patentoch, č. 3 969 287; 3 691 016; 4 195 128; 4 247642; 4 229 537 a 4 330 440, sú zavedené s cieľom imobilizácie proteinov.

Uhľovodanové (oligosacharidové) skupiny môžu byť vhodne pripojené k miestam, o ktorých je známe, že sú v proteínoch glykozylačnými miestami.

Všeobecne O-viazané oligosacharidy sú pripojené k serínovým (Ser) alebo treonínovým (Thr) zvyškom, zatiaľ čo N-viazané oligosacharidy sú pripojené k asparagínovým (Asn) zvyškom, keď sú súčasťou sekvencie Asn-X-Ser/Thr, kde X môže byť akákoľvek aminokyselina s výnimkou prolínu. X je výhodne jedna z 19 prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselín odlišných od prolínu. Štruktúry N-viazaných a O-viazaných oligosacharidov a zvyškov cukrov, ktoré je možné nájsť v každom type, sú odlišné. Jedným typom cukru, ktorý je bežne nachádzaný pri obidvoch, je N-acetylneuramínová kyselina (uvádzaná ako kyselina sialová). Kyselina sialová je zvyčajne terminálnym zvyškom N-viazaných a O-viazaných oligosacharidov a vďaka svojmu negatívnemu náboju môže prinášať glykozylovanej zlúčenine kyslé vlastnosti. Také miesto (miesta) môže (môžu) byť inkorporované do linkéru zlúčenín podľa tohto vynálezu a je výhodne glykozylované bunkou počas rekombinantnej produkcie polypeptidových zlúčenín (napríklad v cicavčích bunkách, ako sú bunky CHO, BHK, COS). Ale takéto miesta môžu byť ďalej glykozylované syntetickými alebo semi-syntetickými postupmi známymi v odbore.

Ďalšie možné modifikácie zahŕňajú hydroxyláciu prolínu a lyzínu, fosforyláciu hydroxylových skupín serylových alebo treonylových zvyškov, oxidáciu atómu síry v Cys, metyláciu alfa-aminoskupín lyzínových, arginínových a histidínových bočných reťazcov. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79 - 86 (1983).

Rovnako môžu byť zlúčeniny podľa vynálezu zmenené na úrovni DNA. Sekvencie DNA pre akúkoľvek časť zlúčeniny môžu byť zmenené na kodóny, ktoré sú s vybranou hostiteľskou bunkou kompatibilnej šie. Pre E. coli, ktorá je preferovanou hostiteľskou bunkou, sú optimalizované kodóny v odbore známe.

Kodóny môžu byť substituované s cieľom eliminácie reštrikčných miest alebo na zavedenie tichých reštrikčných miest, čo môže pozitívne pôsobiť v úprave (processing) DNA vo vybranej hostiteľskej bunke. Vehikulum, linker a DNA sekvencie pre peptidy môžu byť modifikované tak, aby zahŕňali akúkoľvek z uvedených sekvenčných zmien.

SK 288175 Β6

Spôsoby prípravy:

Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť vo veľkom pripravené v transformovaných hostiteľských bunkách pri použití techník rekombinantných DNA. S týmto cieľom je pripravená rekombinantná DNA molekula kódujúca peptid, ktorý je pripravovaný. Spôsoby prípravy takých molekúl DNA sú v odbore dobre známe. Napríklad sekvencie kódujúce peptidy môžu byť vyrezané z DNA s použitím vhodných reštrikčných enzýmov. V inej realizácii môže byť molekula DNA syntetizovaná s použitím techník chemickej syntézy, ako je napríklad fosforamidátová metóda. Rovnako môže byť použitá kombinácia obidvoch týchto techník.

Vynález rovnako zahŕňa vektor schopný expresie peptidov vo vhodnom hostiteľovi. Vektor obsahuje molekulu DNA, ktorá kóduje peptidy operabilne pripojené k vhodným riediacim sekvenciám na expresiu. Spôsoby pôsobenia tohto operabilného spojenia, buď pred, a/alebo za molekulu DNA inzerovanú do vektoru, sú dobre známe. Riadiace sekvencie na expresiu zahŕňajú promótory, aktivátory, zosilňovače (enhancery), operátory, ribozomálne väzbové miesta, štart signály, stop signály, čiapočkové signály (cap signals), polyadenylačné signály a iné signály zúčastnené v riadení transkripcie alebo translácie.

Výsledný vektor nesúci molekulu DNA je použitý na transformáciu vhodného hostiteľa. Táto transformácia môže byť uskutočnená pri použití metód v odbore dobre známych.

Na realizáciu tohto vynálezu môžu byť použité akékoľvek z veľkého počtu dostupných a dobre známych hostiteľských buniek. Výber konkrétneho hostiteľa je závislý od radu v odbore zistených faktorov. Tieto faktory zahŕňajú napríklad kompatibilitu s vybraným expresným vektorom, toxickosť peptidov kódovaných molekulou DNA, rýchlosť transformácie, ľahkosť získania peptidov, charakteristiky expresie, biologickú bezpečnosť a nákladnosť. Je potrebné dosiahnuť rovnováhu medzi týmito faktormi s tým, že je potrebné chápať, že nie všetci hostitelia môžu byť zhodne účinní pri expresii konkrétnej sekvencie DNA. V rámci týchto všeobecných pravidiel sú zahrnuté ako vhodní mikrobiálni hostitelia baktérie (ako napríklad E. coli sp.), kvasinky (napríklad Saccharomyces sp.) a iné huby, hmyzie, rastlinné, cicavčie bunky (vrátane ľudských) v kultúre, alebo iní hostitelia známi v odbore.

Ďalej je transformovaný hostiteľ kultivovaný a purifikovaný. Hostiteľské bunky môžu byť kultivované za konvenčných fermentačných podmienok tak, že požadované zlúčeniny sú exprimované. Také fermentačné podmienky sú v odbore dobre známe. Nakoniec sú peptidy purifikované z kultúry postupmi dobre v odbore známymi.

Zlúčeniny môžu byť rovnako pripravované syntetickými postupmi. Napríklad môžu byť použité techniky syntézy na pevnej fáze. Vhodné techniky sú v odbore dobre známe a zahŕňajú tie, ktoré sú opísané v Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp. 335 - 61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394 - 414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Svnthesis; U. S. Pat. č. 3 941 763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105 - 253; a Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257 - 527. Syntéza na pevnej fáze je preferovanou technikou pri príprave jednotlivých peptidov, pretože ide o najúčinnejšiu metódu z hľadiska nákladnosti pri príprave malých peptidov.

Zlúčeniny, ktoré obsahujú derivatizované peptidy alebo ktoré obsahujú nepeptidové skupiny, môžu byť syntetizované dobre známymi technikami organickej chémie.

Použitie zlúčenín:

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť konkrétne užitočné v liečbe autoimunitných ochorení sprostredkovaných B-bunkami. Konkrétne, zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť užitočné v liečbe, prevencii, zlepšení, diagnostike alebo prognóze lupus, vrátane lupus erythematosus (SLE) a ochorení a stavov spojených s lupus. Ďalšie výhodné indikácie zahŕňajú nádory sprostredkované B-bunkami, vrátane B-bunkového lymfómu.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu rovnako byť použité na liečbu zápalových stavov kĺbov. Zápalové stavy kĺbov sú chronické kĺbové ochorenia, ktoré postihujú a oslabujú v rôznom stupni milióny ľudí na celom svete. Reumatoidná artritída je ochorenie kĺbových spojení, v ktorých chrupka a kosť sú pomaly narušované prolifératívnym, invazívnym spojivovým tkanivom nazývaným pannus, ktoré je odvodené zo synoviálnej membrány. Ochorenie môže zahŕňať periartikuláme štruktúry, ako sú burzy, šľachové puzdrá, puzdrá, rovnako ako extraartikuláme tkanivá, ako je subkutis, kardiovaskulárny systém, pľúca, slezina, lymfatické uzliny, kostrové svaly, nervový systém, (centrálny a periférny) a oči (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), 11: 1828). Osteoartritída je bežné kĺbové ochorenie charakteristické degeneratívnymi zmenami v artikulámej chrupke a reaktívnou proliferáciou kosti a chrupky dookola kĺbu. Osteoartritída je bunkami sprostredkovaný aktívny proces, ktorý môže byť výsledkom nevhodnej odpovede chondrocytov na katabolické a anabolické stimuly. Zmeny v niektorých molekulách matrice artikulámej chrupky sa údajne objavujú pri časnej osteoartritíde (Thonar et al. (1993), Rheumatic disease clinics of North America, Moskowitz (ed.), 19: 635 - 657 a Shinmei et al. (1992), Arthritis Rheum.. 35: 1304 - 1308). Predpokladá sa, že TALL-1, TALL-1R a ich modulátory sú vhodné na liečbu týchto a súvisiacich stavov.

SK 288175 Β6

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť rovnako užitočné v liečbe radu ďalších ochorení a porúch zahŕňajúcich:

• akútnu pankreatitídu;

ALS;

Alzheimerovu chorobu; astmu;

aterosklerózu;

autoimunitnú hemolytickú anémiu;

rakovinu, najmä rakovinu týkajúcu sa B buniek;

kachexiu/anorexiu;

chronický únavový syndróm; cirhózu (napríklad primárnu biliámu cirhózu); diabetes (napríklad inzulínovú diabetes); horúčku;

glomerulonefŕitídu, vrátane IgA glomerulonefritídy a primárnej glomerulonefritídy;

Goodpasturov syndróm;

Guillainov-Barrého syndróm; transplantát verzus ochorenie príjemcu;

Hashimotovu tyreoiditídu; hemoragický šok;

hyperalgéziu; zápalové ochorenie čriev;

zápalové stavy kĺbu, vrátane osteoartritídy, psoriázovej artritídy a reumatoidnej artritídy;

zápalové stavy rezultujúce z námahy, vytknutie, poškodenie chrupky, traumu, ortopedické operácie, infekcie a priebeh iných chorôb;

inzulín-dependentnú diabetes mellitus;

ischemické poškodenie vrátane cerebrálnej ischémie (napríklad poškodenie mozgu ako výsledok traumy, pilepsie, hemoragie, mŕtvice, z ktorých každý môže viesť k neurodegenerácii);

poruchy učenia;

pľúcne choroby (napríklad ARDS); mnohopočetný myelom; roztrúsenú sklerózu; myasténiu gravis;

myelogénne (napríklad AML a CML) a iné leukémie;

myopatiu (napríklad svalový proteínový metabolizmus najmä pri sepse);

neurotoxickosť (napríklad takú, ako indukuje HIV);

osteoporózu;

bolesť;

Parkinsonovu chorobu;

Pemphigus;

polymyozitídu/dermatomyozitídu;

zápal pľúc, vrátane autoimunitného zápalu pľúc;

predčasný pôrod;

psoriázu;

Reiterovu chorobu; reperfuzne poškodenie; septický šok;

vedľajšie účinky radiačnej terapie;

Sjogrenov syndróm; poruchy spánku; ochorenie čeľusťového kĺbu;

trombocytopeniu, vrátane idiopatickej trombocytopénie a autoimunitnej neonatálnej trombocytopenie; nádorové metastázy; uveitídu; a vaskulitídu.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť podávané samotné alebo v kombinácii s terapeuticky účinným množstvom iných liečiv, zahŕňajúcich analgetiká, antireumatické liečivá modifikujúce ochorenia (diseasemodifying anti-rheumatic drugs, DMARDs), nesteroidné protizápalové liečivá (non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) a akékoľvek modulátory imunity a zápalov. Preto môžu zlúčeniny podľa tohto vynálezu byť podávané s:

• Modulátormi iných členov z rodiny TNF/TNF receptorov, vrátane antagonistov TNF, ako je etanercept (Enbrel™), sTNF-RI (rozpustný TNF-alfa receptor I), onercept (TNF väzbový proteín-1), D2E7 a Remicade™.

• Modulátormi faktoru nervového rastu (NGF modulators);

• IL-1 inhibítormi zahŕňajúcimi IL-lra molekuly (antagonista receptoru pre IL-1), ako je anakinra, a nedávno objavené „IL-lra-like“ molekuly, ako sú IL-lHyl a IL-lHy2; IL-1 „trap“ molekuly, ak sú opísané v U. S. pat. č. 5 84 4 099, vydanom 1. decembra 1998; IL-1 protilátky; rozpustný receptor IL-1 a podobne.

• 1L-6 inhibítormi (napríklad protilátky proti IL-6).

• IL-8 inhibítormi (napríklad protilátky proti IL-8).

• IL-18 inhibítormi (napríklad IL-18 väzbový protein, solubilizovaný IL-18 receptor, alebo IL-18 protilátky).

• Modulátormi interleukín-1-konvertujúceho enzýmu (ICE).

• Inzulínu podobnými rastovými faktormi (insulin-like growth factors IGF-1 a IGF-2) a ich modulátormi.

• Transformujúcim rastovým faktorom-β (TGF-β), Členmi rodiny TGF-β a modulátormi TGF-β.

• Fibroblastovými rastovými faktormi FGF-1 až FGF-10 a modulátormi FGF.

• Osteoprotegrinom (OPG), analógmi OPG, osteoprotektívnymi látkami a protilátkami proti OPG-ligandu (OPG-L).

• Kosťovými anabolikami, ako je paratyroidný hormón (PTH), fragmentmi PTH a molekulami inkorporujúcimi fragmenty PTH (napríklad PTH (1 - 34) Fc).

• Antagonistmi PAF.

• Keratinocytovým rastovým faktorom (KGF), molekulami príbuznými s KGF (napríklad KGF-2) a modulátormi KGF.

• Inhibítormi COX-2, ako je Celebrex™ a Vioxx™.

• Analógmi prostaglandinu (napríklad E radu prostaglandínov).

• Modulátormi matricových metaloproteináz (MMP).

• Modulátormi syntázy oxidov dusíka (nitric oxide synthase, NOS), vrátane modulátorov indukovateľnej NOS.

• Modulátormi glukokortikoidného receptoru.

• Modulátormi glutamátového receptoru.

• Modulátormi hladín lipopolysacharidov (LPS).

• Protirakovinovými látkami, zahŕňajúcimi inhibítory onkogénov (napríklad fos, jun) a interferónmi.

• Noradrenalínom a jeho modulátormi a mimetikami.

Farmaceutické kompozície:

Predkladaný vynález rovnako poskytuje spôsoby použitia farmaceutických kompozícií zlúčenín podľa vynálezu. Také farmaceutické kompozície môžu byť vo forme na injekčné, orálne, pulmonálne, nazálne, transdermálne podanie alebo inú formu podania. Všeobecne, vynález zahŕňa farmaceutické kompozície obsahujúce účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu spoločne s farmaceutický prijateľnými riedidlami, konzervačnými látkami, rozpúšťadlami, emulzifikátormi, adjuvans/alebo nosičmi. Také kompozície obsahujú riedidlá s rôznym obsahom tlmivého roztoku (napr. Tris-HCl, acetát, fosfát), pH a iónovou silou; aditíva, ako sú detergenty a rozpúšťadlá (napríklad Tween 80, Polysorbate 80), antioxidanty (napríklad kyselinu askorbovú, metabisulfit sodný), konzervačné látky (napríklad Thimersol, benzylalkohol) a plnidlá (napríklad laktózu, manitol); zapracovanie materiálu do osobitných prípravkov z polymémych zlúčenín, ako je kyselina polymliečna, kyselina polyglykolová, a pod., alebo do lipozómov. Rovnako môže byť použitá kyselina hyalurónová, čo môže mať účinok na podporu udržovaného pretrvávania v cirkulácii. Také kompozície môžu ovplyvňovať fyzikálny stav, stabilitu, rýchlosť uvoľňovania in vivo a rýchlosť in vivo clearance proteínov a derivátov podľa vynálezu. Pozri napríklad Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042) 1435 - 1712. Kompozície môžu byť pripravené v kvapalnej forme alebo môžu byť ako suchý prášok, ako je iyofilizovaná forma. Rovnako sa uvádzajú implantovateľné prípravky s postupným uvoľňovaním, ako sú transdermálne prípravky.

Formy na perorálne podanie:

Na použitie podľa vynálezu sa uvádzajú orálne pevné dávkovacie formy, ktoré sú opísané v kapitole 89 v publikácii Remington's Pharmaceutical Sciences (1990), 18th Ed., Mack Publishing Co. Easton PA18042. Pevné dávkovacie formy zahŕňajú tablety, kapsuly, pilulky, pastilky, tabletky, zdravotné bonbóny alebo pelety. Na prípravu kompozícií podľa vynálezu môže rovnako byť použitá lipozomálna alebo protenoidná enkapsulácia (ako napríklad protenoidné guľôčky opísané v U. S. patente č. 4 925 673). Môže byť použitá lipozomálna enkapsulácia a lipozómy môžu byť derivatizované s rôznymi polymérmi (napríklad U. S. patent č. 5 013 556). Opis možných pevných dávkovacích foriem pre terapeutiká je uvedený v kapitole 10 publikácie Marshall, K., Modem Pharmaceutics (1979), edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes. Všeobecne prostrie26 dok bude zahŕňať zlúčeninu podľa vynálezu, inertné ingrediencie, ktoré umožňujú ochranu pred prostredím žalúdka a uvoľnenie biologicky aktívneho materiálu v čreve.

Rovnako sú špecificky zamýšľané orálne dávkovacie formy uvedených zlúčenín podľa vynálezu. Keď je to nevyhnutné, zlúčeniny môžu byť chemicky modifikované tak, aby orálne podanie bolo účinné. Všeobecne uvažovanou chemickou modifikáciou je pripojenie aspoň jednej zlúčeniny k vlastnej molekule zlúčeniny podľa vynálezu, pričom táto zlúčenina dovoľuje (a) inhibíciu proteolýzy a (b) vstrebávanie do krvného prúdu zo žalúdka a čreva. Rovnako je žiaduce zvýšenie celkovej stability zlúčeniny a zvýšenie času cirkulácie v tele. Zlúčeniny vhodné ako kovalentne pripojené vehikulá podľa tohto vynálezu môžu rovnako byť použité na tento účel. Príklady takých zlúčenín zahŕňajú: PEG, kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulózu, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón a polyprolín. Pozri napríklad Abuchowski and Davis, Soluble Polvmer-Enzvme Adducts, Enzymes as Drugs (1981), Hocenberg and Roberts, eds., WileyInterscience, New York, NY, pp. 367 - 83; Newmark, et al. (1982), J. Appl. Biochem. 4: 185 - 9. Ďalšími polymérmi, ktoré môžu byť použité, sú poly-l,3-dioxolán a poly-l,3,6-tioxocan. Ako bolo uvedené, sú na farmaceutické použitie výhodné zlúčeniny PEG.

Na dávkovacie formy na orálne podanie je rovnako možné použiť soľ modifikovanej alifatickej aminokyseliny ako napríklad N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino)kaprylát sodný (SNAC) ako nosič na zvýšenie absorpcie terapeutických zlúčenín podľa tohto vynálezu. Klinická účinnosť heparínových prípravkov používajúcich SNAC bola preukázaná Emisphere Technologies v pokusoch označených „Phase II“. Pozri U. S. patent č. 5 792 451 „Oral drug delivery composition and methods“.

Zlúčeniny podľa tohto vynálezu môžu byť zapracované do prípravkov ako jemné multičastice vo forme granúl alebo peliet s veľkosťou častíc približne 1 mm. Úprava materiálu na podanie v kapsulách môže byť tiež vo forme prášku, mierne stlačených valčekov alebo dokonca tabliet. Lieková forma môže byť pripravená lisovaním.

Rovnako môžu byť zahrnuté farbivá a látky zlepšujúce chuť. Napríklad proteín (alebo derivát) môže byť upravený (ako zapuzdrenie mikroguľôčok v lipozóme) a ďalej môže byť uvedený do kontaktu s požívateľným produktom, ako je chladený nápoj obsahujúci farbivá a látky zlepšujúce chuť.

Je možné vykonávať riedenie alebo zväčšenie objemu zlúčeniny podľa vynálezu pomocou inertného materiálu. Tieto riedidlá môžu zahŕňať uhľovodany, konkrétne manitol, α-laktózu, bezvodú laktózu, celulózu, sacharózu, modifikované dextrány a škrob. Rovnako môžu byť ako plnidlá použité určité anorganické soli, ktoré zahŕňajú kalcium trifosfát, uhličitan horečnatý a chlorid sodný. Niektorými z komerčne dostupných riedidiel sú Fast-Flo, STA-Rx 1500, Emcompress a Avicell.

Do terapeutických prípravkov v pevnej dávkovacej forme môžu byť začlenené desintegranty. Materiály použité ako desintegranty zahŕňajú, bez obmedzenia, škrob obsahujúci komerčný desintegrant na báze škrobu, Explotab. Glykolát sodný škrobu, Amberlit, karboxymetylcelulóza sodná, ultramylopektín, alginát sodný, želatína, pomarančová kôra, kyslá karboxymetylcelulóza, prírodná huba a bentonit môžu byť všetky použité. Inou formou desintegrantov sú nerozpustné katióno-výmenné živice. Práškové gumy môžu byť použité ako desintegranty a spojivá a zahŕňajú práškové gumy, ako je agar, guma karaya alebo tragant. Kyselina algínová a jej sodná soľ sú rovnako vhodné ako desintegranty.

Spojivá môžu byť použité na spojenie terapeutickej látky na formu pevnej tablety a zahŕňajú materiály z prírodných produktov, ako je arabská guma, tragant, škrob a želatína. Iné spojivá zahŕňajú metylcelulózu (MC), etylcelulózu (EC) a karboxymetylcelulózu (CMC). Na granuláciu terapeutík je možné použiť tak polyvinylpyrolidón (PVP), ako hydroxypropylmetylcelulózu (HPMC) v alkoholových roztokoch.

Antifrikčné agens môže byť zahrnuté do prípravku na zabránenie lepenia počas postupu prípravy. Lubrikanty môžu byť použité ako vrstva medzi terapeutikami a stenou lisu a tieto môžu zahŕňať bez obmedzenia kyselinu stearovú vrátane jej horečnatých a vápenatých solí, polytetrafluóretylén (PTFE), tekutý parafín, rastlinné oleje a vosky. Môžu byť použité rozpustné lubrikanty, ako je laurylsulfát sodný, laurylsulfát horečnatý, polyetylénglykol s rôznymi molekulovými hmotnosťami, Carbowa 4000 a 6000.

Tiež môžu byť pridané klzné látky (glidanty), ktoré môžu zlepšovať tekutosť počas prípravy lieku na podporu preskupenia počas lisovania. Klzné látky môžu zahŕňať škrob, mastenec, pyrogénny oxid kremičitý (silica) a hydratovaný silikoaluminát.

Na podporu rozpúšťania zlúčeniny podľa vynálezu vo vodnom prostredí môže byť pridaná povrchovo aktívna látka ako namáčadlo. Povrchovo aktívne látky môžu zahŕňať aniónové detergenty, ako je laurylsulfát sodný, dioktylsulfosukcinát sodný a dioktylsulfonát sodný. Môžu byť použité katiónové detergenty, ktoré môžu zahŕňať benzalkónium chlorid alebo benzetónium chlorid. Zoznam potenciálnych neionogénnych detergentov, ktoré môžu byť použité v prípravkoch ako povrchovo aktívne látky, zahŕňa „lauromacrogol 400“, „polyoxyl 40 stearate“, „polyoxyethylene hydrogenated castor oil 10, 50 a 60“, glycerolmonostearát, polysorbát 40, 60, 65 a 80, sacharózové estery mastných kyselín, metylcelulózu a karboxymetylcelulózu. Tieto surfaktanty môžu byť prítomné v prípravku s proteínom buď samostatne, alebo ako zmes v rôznom pomere zložiek.

Do prípravku môžu byť rovnako pridané aditíva na zvýšenie príjmu zlúčeniny. Aditíva, ktoré majú túto

SK 288175 Β6 vlastnosť, sú napríklad mastné kyseliny, kyselina olejová, kyselina linolová a kyselina linolénová. Môžu byť žiaduce prípravky s riadeným uvoľňovaním. Zlúčenina podľa tohto vynálezu môže byť zapracovaná do inertnej matrice, ktorá dovoľuje uvoľňovanie buď difúziou alebo mechanizmom vylúhovania, napríklad do gumy. Pomaly sa degradujúce materiály môžu rovnako byť zahrnuté v prípravku, napríklad algináty, polysacharidy. Inou formu riadeného uvoľňovania podľa tohto vynálezu je spôsob založený na Orosovom terapeutickom systéme (Alza Corp.), kedy je napríklad liečivo uzatvorené v semipermeabilnej membráne, ktorá dovoľuje vode vstupovať a vytlačovať liečivo von cez malý otvor pôsobením osmotických účinkov. Niektoré z enterických poťahovacích látok majú rovnako účinok odloženého uvoľňovania.

Na prípravu môžu byť použité ďalšie poťahovacie látky. Tieto zahŕňajú rad cukrov, ktoré môžu byť aplikované v poťahovacom stroji. Terapeutická látka môže byť tiež daná do tabliet potiahnutých filmom a materiály použité v tomto prípade sú rozdelené do 2 skupín. Prvú skupinu tvoria neenterické materiály a táto skupina zahŕňa metylcelulózu, etylcelulózu, hydroxyetylcelulózu, metylhydroxyetylcelulózu, hydroxypropylcelulózu, hydroxypropylmetylcelulózu, sódium karboxymetylcelulózu, providón a polyetylénglykoly. Druhá skupina sa skladá z enterických materiálov, ktorými sú zvyčajne estery kyseliny fialovej.

Môže byť použitá zmes materiálov na poskytnutie optimálneho filmu na potiahnutie. Potiahnutie filmom môže byť realizované v poťahovacom zariadení alebo vo fluidizačnom zariadení alebo kompresným poťahovaním.

Formy na pulmonálne podanie;

Rovnako sa uvažuje o pulmonálnom podaní proteínu podľa vynálezu (alebo jeho derivátov). Protein (alebo jeho derivát) je podávaný pulmonálne do pľúc cicavca pri inhalácii a prestupuje cez pľúcnu epitelovú líniu do krvného obehu. (K tomu ďalšie správy zahŕňajú Adjei et al., Pharma. Res. (1990) 7: 565 - 9; Adjei et al. (1990), Intematl. J. Pharmaceutics 63: 135 - 44 (leuprolid acetát); Braquet et al. (1989), J. Cardiovasc. Pharmacol. 13 (suppl. 5): s. 143 - 146 (endothelin-1); Hubbard et «/.(1989), Annals Int. Med. 3: 206 - 12 (al-antitrypsin); Smith et «/.(1989), J. Clin. Invest. 84: 1145 - 6 (αΐ-proteínáza); Oswein et al. (March 1990), „Aerosolization of Proteins“, Proc. Svmp. Resp. Drug Delivery Π, Keystone, Colorado (rekombinantný ľudský rastový hormón); Debs et al. (1988), J. Immunol. 140: 3482 - 8 (interferon-γ a faktor nekrózy nádorov) a Platz et al., U. S. Patent č. 5 284 656 (faktor stimulujúci kolónie granulocytov).

Na praktické použitie tohto vynálezu sa uvažuje o veľkom množstve mechanických zariadení navrhnutých na pulmonálne podanie terapeutických produktov, ktoré zahŕňajú bez obmedzenia rozprašovače, odmerné dávkovacie inhalátory a práškové inhalátory, ktoré sú odborníkom v odbore dôverne známe. Niektorými z konkrétnych príkladov komerčne dostupných zariadení vhodných na realizáciu tohto vynálezu sú rozprašovač Ultravent, vyrábaný Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; rozprašovač Acom II, vyrábaný Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; odmemý dávkovací inhalátor Ventolin, vyrábaný Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; a práškový inhalátor Spinhaler, vyrábaný Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Všetky tieto zariadenia vyžadujú použitie prípravkov vhodných na rozprašovanie zlúčeniny podľa vynálezu. Každý prípravok je špecifický pre typ používaného zariadenia a môže obsahovať použitie vhodného hnacieho materiálu, okrem riedidiel, adjuvansu a/alebo nosičov vhodných na liečbu.

Zlúčenina podľa vynálezu by mala byť najvýhodnejšie pripravovaná vo forme častíc s priemernou veľkosťou častíc menšou ako 10 pm (alebo mikrónov), najvýhodnejšie 0,5 až 5 pm na najúčinnejšie podávanie distálne do pľúc.

Farmaceutický prijateľné nosiče zahŕňajú uhľovodany, ako je trehalóza, manitol, xylitol, sacharóza, laktóza a sorbitol. Ďalšie ingrediencie na použitie v prípravkoch môžu zahŕňať DPPC, DOPE, DSPC a DOPC. Môžu byť použité prírodné alebo syntetické povrchovo aktívne látky. Môže byť použitý PEG (bez ohľadu na jeho použitie pri derivatizácii proteínu alebo analógu). Môžu byť použité dextrány, ako je cyklodextrán. Môžu byť použité žlčové soli a iné podobné zosilňovače. Tiež môže byť použitá celulóza a deriváty celulózy. Môžu byť použité aminokyseliny také ako pri príprave tlmivého roztoku.

Rovnako sa uvažuje o použití lipozómov, mikrokapsúl alebo mikroguľôčok, inklúznych komplexov a iných typov nosičov.

Prípravky vhodné na použitie v rozprašovači, buď dýzovom, alebo ultrazvukovom, budú typicky obsahovať zlúčeninu podľa vynálezu rozpustenú vo vode v koncentrácii od približne 0,1 do 25 mg biologicky aktívneho proteínu na ml roztoku. Prípravok môže rovnako obsahovať tlmivý roztok a jednoduchý cukor (napríklad na stabilizáciu proteínu a na reguláciu osmotického tlaku). Prípravok na použitie v rozprašovači môže rovnako obsahovať povrchovo aktívnu látku na zníženie alebo na zabránenie povrchovo indukovaného zhrkovania proteínu, spôsobeného atomizáciou roztoku pri vytváraní aerosólu.

Prípravky na použitie v odmerovacom dávkovacom inhalačnom zariadení budú všeobecne obsahovať jemný prášok obsahujúci zlúčeninu podľa vynálezu suspendovanú v hnacej látke s pomocou povrchovo aktívnej zlúčeniny. Hnacou látkou môže byť bežný materiál používaný na tento účel, ako je chlórfluórovaný uhľovodík, hydrochlórfluórovaný uhľovodík, hydrofluórovaný uhľovodík, alebo uhľovodík zahŕňajúci trich28

SK 288175 Β6 lórfluórmetán, dichlórdifluórmetán, dichlórtetrafluóretanol a 1,1,1,2-tetrafluóretán, alebo ich kombinácie. Vhodné povrchovo aktívne látky zahŕňajú sorbitan trioleát a sójový lecitín. Kyselina olejová môže byť rovnako vhodná ako povrchovo aktívna látka.

Prípravky na dávkovanie z práškového inhalačného zariadenia budú obsahovať jemný suchý prášok obsahujúci zlúčeninu podľa vynálezu a môžu rovnako obsahovať plnidlo, ako je laktóza, sorbitol, sacharóza, manitol, trehalóza, alebo xylitol v množstvách, ktoré umožňujú rozptýlenie prášku zo zariadenia, napríklad v 50 až 90 % hmotnosti prípravku.

Formy na nazálne podanie:

Rovnako sa uvažuje o nazálnom podaní zlúčeniny podľa vynálezu. Nazálne podanie umožňuje prienik proteínu do krvného prúdu priamo po podaní terapeutického produktu do nosa, bez toho a bolo nevyhnutné ukladanie produktu v pľúcach. Prípravky na nazálne podanie zahŕňajú prípravky s dextránom alebo cyklodextránom. Rovnako sa uvažouje o podaní, pri ktorom dochádza k prenosu i cez iné mukózne membrány.

Dávkovanie:

Dávkovací režim použitý pri spôsobe liečby hore opísaných stavov bude stanovený ošetrujúcim lekárom, ktorý zváži rôzne faktory, ktoré modifikujú pôsobenie liečiv, napríklad vek, stav, hmotnosť tela, pohlavie a diétu pacienta, závažnosť akejkoľvek infekcie, čas podania a ďalšie klinické faktory. Všeobecne, denný režim by mal byť v rozsahu od 0,1 do 1000 mikrogramov zlúčeniny podľa vynálezu na kilogram hmotnosti tela, výhodne 0,1 až 150 mikrogramov na kilogram.

Špecifické výhodné uskutočnenia:

Pôvodcovia určili výhodné štruktúry preferovaných peptidov, ktoré sú uvedené v tabuľke 4. Symbol „A“ môže znamenať ktorýkoľvek z opísaných linkerov, alebo môže proste znamenať normálnu peptidovú väzbu (tzn., že nie je linker prítomný). Z dôvodu jasnosti sú tandemové opakovania a linkery znázornené oddelene pomocou pomlčiek.

Tabuľka 4 - Výhodné uskutočnenia

Sekvencia/štruktúra	SEQ ID NO:
LPGCKWDLLIKQWVCDPL-A-V¹	44
V'-A-LPGCKWDLLIKQWVCDPL	45
LPGCKWDLLIKQWVCDPL-A-LPGCKWDLLIKQWVCDPL-A-V¹	46
V'-A-LPGCKWDLLIKQWVCDPL-A-LPGCKWDLLIKQWVCDPL	47
SADCYFDILTKSDVCTSS-A-V¹	48
V'-A-SADCYFDILTKSDVCTSS	49
SADCYFDILTKSDVTSS-A-SADCYFD1LTKSDVTSS-A-V¹	50
V'-A-SADCYFDILTKSDVTSS-A-SADCYFDILTKSDVTSS	51
FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-V¹	52
V'-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL	53
FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-V¹	54
V'-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL-A-FHDCKWDLLTKQWVCHGL	55

„V¹“ je doména Fc, ako bola definovaná. Okrem štruktúr uvedených v tabuľke 4, pôvodcovia ďalej rozzmýšľajú o heterodiméroch, v ktorých každý z reťazcov diméru Fc je pripojený k odlišnej peptidovej sekvencii; napríklad ide o tie, v ktorých je Fc pripojený k odlišnej sekvencii vybranej z tabuľky 2.

Všetky zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť pripravené postupmi opísanými v PCT prihláške zverejnenej pod číslom WO 99/25044.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje príkladné diméry Fc, ktoré môžu byť odvodené z protilátky IgGl. „Fc“ na obrázku predstavuje akýkoľvek z variantov Fc v použitom význame „doména Fc“. „XI“ a „X2“ predstavujú peptidy alebo linker-peptidové kombinácie tak, ako sú definované ďalej. Špecifické diméry sú nasledujúce:

A, D: Diméry s jednoduchou disulfidovou väzbou. Protilátky IgGl majú bežne dva disulfidové mostíky v pantovej oblasti protilátky. Doména Fc na obrázkoch IA a ID môže byť vytvorená skrátením medzi miestami dvoch disulfidových mostíkov alebo substitúciou zvyšku cysteinylu za nereagujúci zvyšok, ktorý nevytvára disulfidový mostík (napríklad alanyl). Na obrázku IA, je doména Fc viazaná na aminokoniec peptidov; na obrázku ID potom na karboxykoniec.

B, E: Diméry s dvojitou disulfidovou väzbou. Táto doména Fc môže byť vytvorená skrátením rodičovskej protilátky so zachovaním obidvoch zvyškov cysteinylu v reťazcoch domény Fc alebo expresiou z konštruktu obsahujúceho sekvenciu kódujúcu takú doménu Fc. Na obrázku 1B je doména Fc viazaná na aminokoniec peptidov; na obrázku 1E potom na karboxykoniec.

C, F: Nekovalentné diméry. Táto doména Fc môže byť vytvorená elimináciou zvyškov cysteinylu buď skrátením, alebo substitúciou. Môže byť požadovaná eliminácia zvyškov cysteinylu tak, aby boli vylúčené nečistoty, ktoré sa vytvárajú reakciou zvyškov cysteinylu so zvyškami cysteinylu iných proteínov, ktoré sú prítomné v hostiteľskej bunke. Nekovalentná väzba domén Fc je pre súdržnosť diméru postačujúca.

Ďalšie diméry môžu byť vytvárané pri použití domén Fc získaných z odlišných typov protilátok (napríklad IgG2, IgM).

Obrázok 2 znázorňuje štruktúru výhodných zlúčenín podľa vynálezu, ktoré sú charakterizované tandemovým opakovaním farmakologicky aktívneho peptidu. Obrázok 2A znázorňuje jednoreťazcovú molekulu a môže rovnako predstavovať konštrukt DNA pre molekulu. Obrázok 2B znázorňuje dimér, v ktorom linkerpeptidový podiel je prítomný iba v jednom reťazci diméru. Obrázok 2C znázorňuje dimér, ktorý má peptidový podiel v obidvoch reťazcoch. Dimér podľa obrázka 2C sa spontánne vytvára v určitých hostiteľských bunkách po expresii konštruktu DNA kódujúceho jednotlivý reťazec znázornený na obrázku 3A. V prípade iných hostiteľských buniek môžu byť bunky pestované za podmienok, ktoré favorizujú tvorbu dimérov, alebo diméry môžu byť vytvárané in vitro.

Obrázok 3 znázorňuje príkladnú sekvenciu nukleovej kyseliny a sekvenciu aminokyselín (SEQ ID NO: 1 a 2 v uvedenom poradí) ľudského IgG 1 Fc, ktoré môžu byť použité podľa tohto vynálezu.

Obrázky 4A až 4F znázorňujú nukleotidové a aminokyselinové sekvencie (SEQ ID NO: 3 - 27) fragmentov Ndel až Sali, kódujúcich peptid a linker.

Obrázky 5A až 5M znázorňujú nukleotidovú sekvenciu (SEQ ID NO: 28) vektora pAMG21-RANK-Fc, ktorý bol použitý na konštruovanie Fc-spojených molekúl podľa predkladaného vynálezu. Tieto obrázky identifikujú rad znakov nukleovej kyseliny, vrátane:

• oblastí promótoru PcopB, PrepA, RNAI, APHII, luxPR a luxPL;

• mRNA pro APHII, luxR;

• kódujúcej sekvencie a proteínovej aminokyselinovej sekvencie pre proteín copB, copT, repAI, repA4, APHII, luxR, RANK, a Fc;

• väzbových miest proteínov copB, CRP;

• vlásenkových štruktúr TI, T2, T7 a „toop“;

• miesta operátora pre proteín lux;

• miesta pre reštrikčné enzýmy Pfll 1081. BglII. Seal, Bmnl. Prdli. DralII. BstBI. AcelII. AflII. PflMI. Balí. Sfil. BstEII. BspLullI. NspV. BplI. Eagl. Bcgl. Nsil. Bsal. Pspl406I. AatlI. Bsml. Nrul, Ndel. ApaLI. Acc65I. KpnI. Sali. Accl. BspEI. Ahdl. BspHI. EconI. BsrGI. Bmal. Smal. SexAI. BamHI a Blpl.

Obrázky 6A a 6B znázoriiujú sekvencie DNA (SEQ ID NO: 97) inzerované do pCFM1656 medzi jedinečné reštrikčné miesto AatlI (pozícia číslo 4364 v pCFM1656) a reštrikčné miesto SacII (pozícia číslo 4585 v pCFM1656) na vytvorenie expresného plazmidu pAMG21 (prírastkové číslo ATCC 98113).

Obrázok 7 znázorňuje, že „TALL-1 peptilátka“ (SEQ ID NO: 70) inhibuje proliferáciu B buniek sprostredkovanú TALL-1. Purifikované B bunky (10⁵) z myší B6 boli triplicitne kultivované na platniach s 96 jamkami s určitým množstvom TALL-1 konsenzus peptilátky v prítomnosti 10 ng/ml TALL-1 plus 2 pg/ml protilátky anti-IgM. Proliferácia bola meraná príjmom rádioaktívneho [³H]tymidínu v posledných 18 hodinách značenia. Uvedené výsledky reprezentujú priemer ±SD z troch jamiek.

Obrázok 8 uvádza, že TALL-1 N-terminálne tandemové diméme peptidy (peptilátky) (SEQ ID NO: 123, 124 v ďalej uvedenej tabuľke 5B) sú výhodné pre inhibíciu proliferácie B buniek sprostredkované TALL-1. Purifikované B bunky (10⁵) z myší B6 boli triplicitne kultivované v 96-jamkových platniach s určitým množstvom TALL-1 12-3 peptilátky a TALL-1 konsenzus peptilátky (SEQ ID NO: 115 a 122 z tabuľky 5B) alebo s príbuznými dimérovými peptidmi (peptilátky) (SEQ ID NO: 123, 124) v prítomnosti 10 ng/ml TALL-1 plus 2 pg/ml anti-IgM protilátky. Proliferácia bola meraná príjmom rádioaktívneho [³H]tymidínu v posledných 18 hodinách značenia. Uvedené výsledky reprezentujú priemer ±SD z troch jamiek.

Obrázok 9. Peptilátka AGP3 sa viaže k AGP3 s vysokou afinitou. Disociačná rovnovážna konštanta (K_D) bola získaná z nelineárnej regresie kompetičných kriviek pri použití „dual-eurve one-site homogeneous binding model“ (KinEx™ Software). K_D je približne 4 pM pre väzbu peptilátky AGP3 s ľudským AGP3 (SEQ IDNO: 123).

Obrázky 10A a 10B. Peptilátka AGP3 blokuje ľudský a myší AGP3 v kompetičnej skúške Biacore (Biacore competition assay). Rozpustný ľudský proteín TACI bol imobilizovaný k čipu B1. 1 nM rekombinantného ľudského proteínu AGP3 (horný panel) alebo 5 nM rekombinantného myšieho proteínu AGP3 (dolný panel) bolo inkubovaných s určitým množstvom peptilátky AGP3 pred nastrieknutím na povrch receptora. Bola stanovená relatívna väzbová odpoveď ľudského AGP3 a myšieho AGP3 (SEQ ID NO: 123).

Obrázky 1 IA a 11B. Peptilátka AGP3 blokovala väzbu AGP3 k všetkým trom receptorom TACI, BCMA a BAFFR v kompetičnej skúške Biacore (obr. 11A). Rekombinantné rozpustné receptorové proteíny TACI, BCMA a BAFFR boli imobilizované k čipu CM5. 1 nM rekombinantného ľudského AGP3 (horný panel) bol inkubovaný s určitým množstvom peptilátky AGP3 pred nastrieknutím na každý z povrchov receptoru. Bola stanovená relatívna väzbová odpoveď AGP3. Podobne 1 nM rekombinantného proteínu APRÍL bol inkubovaný s určitým množstvom peptilátky AGP3 pred nastrieknutím na každý z povrchov receptora. Peptilátka AGP3 neinhibovala väzbu APRÍL k všetkým trom receptorom (SEQ ID NO: 123) (obr. 11B).

Obrázky 12A a 12B. Peptilátka AGP3 inhibuje zvýšenie hladiny imunoglobulínu v sére myší indukované imunizáciou s ľudským AGP3. Myši Balb/c dostávali denne počas 7 dní intraperitoneálne injekcie 1 mg/kg ľudského proteínu AGP3 súčasne s fyziologickým roztokom, ľudským Fc alebo peptilátkou AGP3 v uvedených dávkach a boli v 8. dni usmrtené. Celkové hladiny IgM a IgA v sére boli merané metódou ELISA (SEQ IDNO: 123).

Obrázok 13. Ošetrenie peptilátkou AGP3 znižovalo intenzitu artritídy v myšom modeli CIA. Samčeky myší DBA/1, staré osem až dvanásť týždňov, boli intradermálne imunizované pri koreni chvosta hovädzím kolagénom typu II (bCII), emulzifikovanom v kompletnom Freundovom adjuvanse a 3 týždne po primárnej imunizácii boli opakovane imunizované s bCII (boost) emulzifikovanom v nekompletnom Freundovom adjuvanse. Ošetrenie stanovenými dávkami peptilátky AGP3 bolo začaté v deň opakovanej imunizácie počas 4 týždňov. Opísaným spôsobom (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653 - 9, 1995) boli všetky štyri labky z hľadiska postihnutia artritídou jednotlivo skórované bodmi 0-3 (SEQ ID NO: 123).

Obrázok 14. Ošetrenie peptilátkou AGP3 inhibovalo v myšom modeli CIA tvorbu anti-kolagénovej protilátky IgG2b. Vzorky séra boli odoberané jeden týždeň po konečnom ošetrení (deň 35) tak, ako bolo opísané hore. Hladina protilátky proti kolagénu II bola v sére stanovená metódou ELISA (SEQ ID NO: 123). Graf je reprezentatívny aj pre izotypy IgGl, IgG3 a IgG2.

Obrázky 15A a 15B. Ošetrenie peptilátkou AGP3 oddialilo počiatok proteinúrie (obr. 15A) a zlepšilo prežívanie myší „NZB/NZW lupus“ (obr. 15B). Päť mesiacov staré myši NZBxNZBWFl náchylné k lupus boli ošetrené i. p. 3x/týždeň počas 8 týždňov PBS, alebo stanovenými dávkami peptilátky AGP3 (SEQ ID NO: 123), alebo ľudskými proteínmi Fc. Počas pokusu bol proteín v moči stanovovaný každý mesiac počas trvania pokusu, a to pri použití prúžkov „Albustix reagent strips“ (Bayer AG). Incidencia proteinúrie (Pb) vyjadrená ako P-hodnota na základe testu „Fishers Exact“ bola proti PBS 0,0108 a proti Fc 0,0573. Čas do úhynu (Pb) vyjadrený ako P-hodnota na základe testu „log-rank“ bol proti PBS 0,3685 a proti Fc 0,0159.

Obrázky 16A a 16B uvádzajú nukleokyselinové a aminokyselinové sekvencie výhodného TALL-1 -väzbové peptilátky (SEQ ID NO: 189 a 123).

Vynález bude ďalej opísaný príkladmi uskutočnenia, ktoré sú však ilustratívne, a nie limitujúce.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Prílad 1

Peptidy

Fágový displej peptidov

1. Príprava magnetických guľôčok

A. Imobilizácia Fc-TALL-1 na magnetických guľôčkach

Rekombinantný proteín Fc-TALL-1 bol imobilizovaný na guľôčkach Protein A Dynabeads (Dynal) v koncentrácii 8 pg Fc-TALL-1 na 100 pl rezervných guľôčok od výrobcu. Guľôčky boli pritiahnuté k jednej strane skúmavky pri použití magnetu a odpipetovaním kvapaliny, potom boli premyté dvakrát fosfátom tlmeným fyziologickým roztokom (phosphate buffer saline, PBS) a resuspendované v PBS. Proteín Fc-TALL-1 bol pridaný k premytým guľôčkam v uvedených koncentráciách a inkubovaný za rotácie počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Guľôčky potiahnuté Fc-TALL-1 boli potom blokované pridaním hovädzieho sérového albumínu (bovine sérum albumín, BSA) na konečnú 1 % koncentráciu a inkubované cez noc pri 4 °C za rotácie. Výsledné guľôčky potiahnuté Fc-TALL-1 boli potom dvakrát premyté PBST (PBS s 0,05 % Tween-20) predtým, ako boli podrobené selekčným postupom.

B. Príprava guľôčok na negatívnu selekciu

Ďalšie guľôčky boli rovnako pripravené na negatívne selekcie. Pre každú z podmienok panningu (triedenie) bolo 250 pl rezervných guľôčok od výrobcu podrobených uvedeným postupom (podľa časti Al) s tou výnimkou, že inkubačný krok s Fc-TALL-1 bol vynechaný. V poslednom stupni premývania boli guľôčky rozdelené do piatich 50 μΐ alikvótov.

SK 288175 Β6

2. Selekcia fágov viažucich sa k TALL-1

A. Celková stratégia

Knižnice vláknitých fágov TN8-IX (5 x 10⁹ nezávislých transformantov) a TN12-I (1,4 x 10⁹ nezávislých transformantov) (Dyax Corp.) boli použité na selekciu fágov viažucich sa k TALL-1. Každá z knižníc bola podrobená buď elúcii pri pH 2 alebo „guľôčkovej elúcii“ (časť 2E). V pokusoch s TALL-1 bolo takto vykonané usporiadanie štyroch odlišných podmienok panningu (TN8-IX pri použití elučnej metódy s pH 2, TN8IX pri použití metódy elúcie guľôčok, TN12-I pri použití elučnej metódy s pH 2 a TN12-I pri použití metódy elúcie guľôčok). V každej z realizácií boli uskutočnené tri cykly selekcie.

B. Negatívna selekcia

Pre každú z realizácií podmienok panningu bolo pripravených približne 100 ekvivalentov náhodnej knižnice (5 x 10¹¹ pfú pre TN8-IX a 1,4 x 10¹¹ pfú pre TN12-I) z rezervného kmeňa knižnice, ktoré boli zriedené na 300 μΐ s PBST. Po poslednom premytí bola odstránená kvapalina z prvého 50 μΐ alikvótu guľôčok pripravených na negatívnu selekciu (podľa časti 1B) a ku guľôčkam bolo pridaných 300 μΐ zriedeného rezervného kmeňa knižnice. Výsledná zmes bola inkubovaná počas 10 minút pri teplote miestnosti za rotácie. Fágový supernatant bol odstránený pri použití magnetu a bol pridaný k druhému 50 μΐ alikvótu pre ďalší krok negatívnej selekcie. Týmto spôsobom bolo uskutočnených päť stupňov negatívnej selekcie.

C. Selekcia pri použití guľôčok potiahnutých proteínom Fc-TALL-1

Fágový supernatant po poslednom kroku negatívnej selekcie (podľa časti 1B) bol pridaný ku guľôčkam potiahnutým Fc-TALL-1 po poslednom premývacom kroku (podľa časti 1A). Táto zmes bola inkubovaná za rotácie počas dvoch hodín pri teplote miestnosti, čo umožňovalo špecifické naviazanie fágov k cieľovému proteínu. Po odstránení supernatantu boli guľôčky sedemkrát premyté s PBST.

D. Elúcia naviazaných fágov elúciou pri pH 2.

Po poslednom kroku premytí (podľa časti 2C) boli naviazané fágy eluované z magnetických guľôčok pridaním 200 μΐ CBST (50 mM citrát sodný, 150 mM chlorid sodný, 0,05 % Tween-20, pH 2). Po inkubácii počas 5 minút pri teplote miestnosti bola kvapalina obsahujúca eluované fágy odstránená a prenesená do inej skúmavky. Elučný krok bol opäť zopakovaný pridaním 200 μΐ CBST a inkubáciou počas 5 minút. Kvapaliny z dvoch elučných krokov boli spojené a bolo pridaných 100 μΐ 2M roztoku Tris (pH 8) na neutralizáciu pH. Ďalej bolo pridaných 500 μΐ roztoku „Min A Salts“ (60 mM K₂HPO₄, 33 mM KH₂PO₄, 7,6 mM (NH₄)SO₄a 1,7 mM citrát sodný) na konečný objem 1 ml.

E. „Guľôčková elúcia“

Po konečnom premytí bola kvapalina odstránená (podľa časti 2C), a potom bol ku guľôčkam pridaný 1 ml roztoku „Min A salts“. Táto zmes guľôčok bola pridaná priamo ku koncentrovanej vzorke baktérií na infekciu (podľa častí 3 A a 3 B).

3. Amplifikácia

A. Príprava buniek k výsevu

Čerstvá kultúra buniek E. coli (XL-1 Blue MRF') bola pestovaná k OD₆₀₀ = 0,5 v médiu LB obsahujúcom 12,5 pg/ml tetracyklínu. Pre každú z podmienok panningu bolo 20 ml tejto kultúry schladených na ľade a centrifúgovaných. Bakteriálna peleta bola respuspendovaná v 1 ml roztoku „Min A Salts“.

B. Transdukcia

Každá zo zmesí z rôznych elučných postupov (podľa časti 2D a 2E) bola pridaná ku koncentrovanej bakteriálnej vzorke (podľa časti 3A) a inkubovaná pri 37 °C počas 15 minút. 2 ml média NZCYM (2XNZCYM, 50 pg/ml ampicilín) boli pridané do každej zmesi a nasledovala inkubácia pri teplote miestnosti počas 15 minút. Výsledný 4 ml roztok bol vysiaty na veľké platne s agarom NZCYM obsahujúcim 50 pg/ml ampicilínu a platne boli inkubované cez noc pri 37 °C.

C. Zber fágov

Každá zo zmesí baktérie/fág, ktorá bola pestovaná cez noc na veľkých platniach s agarom NZCYM (podľa časti 3 B), bola zoškrabnutá do 35 ml média LB a agarová platňa bola ďalej premytá s ďalšími 35 ml média LB. Výsledná zmes baktérie/fág v médiu LB bola centrifugovaná na odstránenie baktérií v pelete. 50 ml fágového supematnatu bolo prenesených do ďalšej skúmavky, bolo pridaných 12,5 ml roztoku PEG (20 % PEG 8000, 3,5 M acetát amónny) a nasledovala inkubácia na ľade počas 2 hodín s cieľom precipitácie fágov. Precipitované fágy boli odstredené centrifúgáciou a respuspendované v 6 ml fágového resuspenzného tlmivého roztoku (250 mM NaCl, 100 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA). Tento fágový roztok bol ďalej purifikovaný odstreďovaním centrifúgáciou na odstránenie zostávajúcich baktérií a druhou precipitáciou fága pridaním

1,5 ml roztoku PEG. Po kroku centrifugácie bola fágová peleta resuspendovaná v 400 μΐ PBS. Tento roztok bol podrobený konečnej centrifugácii na odstránenie zvyškového bakteriálneho debris. Výsledný fágový preparát bol titrovaný štandardnou skúškou tvorby povlakov (Molecular Cloning, Maniatis et al., 3^rd Edition).

4. Ďalšie dva cykly selekcie a amplifikácie

V druhom cykle bol amplifikovaný fág (10¹⁰ pfu) z prvého cyklu (podľa časti 3C) použitý ako vstupný fág na vykonanie selekčných a amplifikačných krokov (podľa častí 2 a 3). Amplifikovaný fág (10¹⁰ pfú) z druhého cyklu bol striedavo použitý ako vstupný fág na vykonanie tretieho cyklu selekcie a amplifikácie (podľa častí 2 a 3). Po elučných krokoch (podľa častí 2D a 2E) tretieho cyklu bola malá frakcia eluovaných fágov vysiata tak, ako v skúške tvorby povlakov (podľa časti 3C). Jednotlivé povlaky boli odpichnuté a nanesené do 96-jamkových mikrotitračných doštičiek obsahujúcich v každej jamke 100 μΐ tlmivého roztoku TE. Tieto základné platne boli inkubované pri 37 °C v inkubátore počas 1 hodiny tak, aby bola umožnená elúcia fágov do tlmivého roztoku TE.

5. Analýza klonov (ELISA fágov a sekvenovanie)

Klony fágov boli analyzované skúškou ELISA fágov a sekvenovacími postupmi. Sekvencie boli klasifikované na základe kombinovaných výsledkov z týchto dvoch skúšok.

ELISA fágov

Kultúra XL-1 Blue MRF' bola pestovaná na dosiahnutie OD₆₀₀ 0,5. Alikvót 30 μΐ tejto kultúry bol prenesený do každej jamky 96-jamkovej mikrotitračnej doštičky. 10 μΐ eluovaných fágov (podľa časti 4) bolo pridaných do každej jamky a ponechaných na infekciu baktérií počas 15 minút pri teplote miestnosti. 130 μΐ média LB obsahujúceho 12,5 pg/ml tetracyklínu a 50 pg/ml ampicilínu bolo pridaných do každej jamky. Mikrotitračná doštička bola potom inkubovaná cez noc pri 37 °C. Rekombinantný proteín TALL-1 (1 pg/ml v PBS) bol ponechaný na potiahnutie 96-jamkových doštičiek Maxisorp (NUNC) cez noc pri 4 °C. Ako kontrola bol na potiahnutie použitý rekombinantný proteín Fc-Trail na oddelenej doštičke Maxisorp v rovnakej molámej koncentrácii, ako proteín TALL-1.

Nasledujúci deň boli z doštičiek Maxisorp potiahnutých proteínom odstránené kvapaliny a každá z jamiek bola blokovaná s 300 μΐ 2 % roztoku BSA pri 37° počas 1 hodiny. Roztok BSA bol odstránený a jamky boli trikrát premyté roztokom PBST. Po poslednom premývacom kroku bolo 50 μΐ PBST pridaných do každej jamky doštičky Maxisorp potiahnutej proteínom. Každá z 50 μΐ kultúr pestovaných cez noc v 96-jamkovéj mikrotitračnej doštičke bola prenesená do zodpovedajúcich jamiek doštičiek potiahnutých TALL-1 rovnako ako do kontrolných doštičiek potiahnutých Fc-Trail. 100 μΐ zmesí v dvoch typoch doštičiek bolo inkubovaných počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Kvapalina bola z doštičiek Maxisorp odstránená a jamky boli päťkrát premyté PBST. Protilátka anti-M13 konjugovaná s HRP (HRP-conjugated anti-M13 antibody, Pharmacia) bola riedená 1 : 7500 a 100 μΐ zriedeného roztoku bolo pridaných do každej jamky doštičiek Maxisorp na 1-hodinovú inkubáciu pri teplote miestnosti. Kvapalina bola odstránená a jamky boli premyté sedemkrát PBST. Do každej jamky bolo pridaných 100 μΐ tetrametylbenzidínového (TMB) substrátu (Sigma) na vyvinutie farebnej reakcie a reakcia bola zastavená 50 μΐ 5N roztoku NH₂SO₄. OD₄₅₀ bola odčítaná na počítačke platní (Molecular Devices).

B. Sekvenovanie fágových klonov

Pre každý fágový kloň bol pripravený sekvenačný templát metódou PCR. Nasledujúci oligonukleotidový pár bol použitý na amplifikáciu približne 500-nukleotidového fragmentu: prajmer #1(5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3')(SEQ ID NO: 56) a prajmer #2(5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3')(SEQ ID NO: 57)

Pre každý kloň bola pripravená nasledujúca zmes:

Reagencie	objem (pl)/skúmavka
dH₂O	26,25
50 % giycerol	10
10B PCR tlmivý roztok (w/o MgCl₂)	5
25 mM MgCl₂	4
10 mM zmes dNTP	1
100 μΜ prajmer 1	0,25
100 μΜ prajmer 2	0,25
Taq polymeráza	0,25
Fág v TE (podľa časti 4)	3
Celkový reakčný objem	50

Bol použitý termocykler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) na uskutočnenie nasledujúceho programu: 94° C počas 5 min; [94 °C počas 30 s, 55 °C počas 30 s, 72 °C počas 45 s] x 30 cyklov; 72 °C počas 7 min.; ochladenie na 4 °C. Produkt PCR bol kontrolovaný nanesením 5 μΐ každej PCR reakcie na 1 % agarózový gél. Produkt PCR v zostávajúcich 45 μΐ z každej reakcie bol prečistený pri použití súpravy QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen), podľa odporúčania výrobcu. Výsledný produkt bol potom sekvenovaný pri použití ABI 377 sekvenátora (Perkin-Elmer) podľa výrobcom odporúčaného protokolu.

6. Klasifikácia sekvencií a stanovenie konsenzus sekvencie

A. Klasifikácia sekvencií (Sequence ranking)

Peptidové sekvencie, ktoré boli translatované z rôznych nukleotidových sekvencií (podľa časti 5B), boli korelované s údajmi ELISA. Klony, ktoré vykazovali vysoké OD₄₅o na jamkách potiahnutých TALL-1 a nízke OD₄₅₀ na jamkách potiahnutých Fc-Trail, boli považované za významnejšie. Sekvencie, ktoré sa objavujú mnohonásobne, boli rovnako považované za dôležité. Kandidátske sekvencie boli vybrané na základe týchto kritérií na ďalšiu analýzu peptidov alebo peptilátky. Päť a deväť kandidátskych peptidových sekvencií bolo vybraných z knižníc TN8-IX a TN 12-1 v uvedenom poradí.

B. Stanovenie konsenzus sekvencie

Väčšina sekvencií selektovaných z knižnice TN12-I obsahovala úplne konzervatívny motív DBL. Rovnako bol tento motív pozorovaný v sekvenciách selektovaných z knižnice TN8-IB. Iný motív, PFPWE (SEQ ID NO: 110) bol rovnako pozorovaný v sekvenciách získaných z knižnice TN8-IB.

Konsenzus peptid, FHDCKWDLLTKQWVCHGL (SEQ ID NO: 58), bol navrhnutý na základe motívu DBL. Vzhľadom na to, že peptidy odvodené z knižnice TN12-I boli najaktívnejšie, boli sekvencie najlepších 26 peptidových sekvencií zoradené (alignment) na základe uvedených klasifikačných kritérií (podľa časti 5A) s motívom DBL 26. Podčiarknutá Jadrová aminokyselinová sekvencia“ bola získaná stanovením aminokyselín, ktoré sa najčastejšie vyskytujú v každej pozícii. Dva cysteíny priliehajúce k jadrovým sekvenciám boli v knižnici TN 12-1 fixovanými aminokyselinami. Zvyšok aminokyselinovej sekvencie v konsenzus peptide je odvodený z jedného z kandidátskych peptidov, TALL-1-12-10 (tabuľka 2, SEQ ID NO: 37). Peptid a peptilátka, ktoré boli odvodené z tejto konsenzus sekvencie, boli najúčinnejšie v skúške proliferácie B buniek.

Príklad 2

Peptilátky

Bola skonštruovaná sada dvanástich TALL-1 inhibítomých peptilátok (tabuľka 5), v ktorých monomér každého z peptidov bol fúzovaný v čítacom rámci s Fc oblasťou ľudského IgGl. Každá TALL-1 inhibítomá peptilátka bola skonštruovaná teplotnou hybridizáciou párov oligonukleotidov zobrazených v tabuľke 6 na generovanie duplexu kódujúceho peptid a linker zložený z 5 glycínových zvyškov a jedného valínového zvyšku ako fragment Ndel až Sali. Tieto duplexné molekuly boli ligované do vektora (pAMG21-RANK-Fc, tu opísaného) obsahujúceho ľudský gén Fc rovnako rozštiepeného s Ndel a Sali. Výsledné ligačné zmesi boli transformované elektroporáciou do buniek kmeňa E. coli 2596 (GM221 tu opísaný). Klony boli skrínované na schopnosť produkovať rekombinantný proteínový produkt a na to, či majú génovú fuziu so správnou nukleotidovou sekvenciou. Pre každý z peptilátky bol vyselektovaný jeden taký kloň. Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie fuznych proteínov sú uvedené na obrázkoch 4A až 4F.

Tabuľka 5 - Peptidové sekvencie a oligonukleotidy použité na generovanie TALL-1 inhibítomých peptilátok

Peptilátka	Peptilátka SEQ ID NO	Sekvencia peptidu	Sense oligonukleotid	Antisense oligonukleotid
TALL-1-8-1-a	29	PGTCFPFPWECTHA	2517-24	2517-25
TALL-l-8-2-a	30	WGACWPFPWECFKE	2517-26	2517-27
TALL-l-8-4-a	31	VPFCDLLTKHCFEA	2517-28	2517-29
TALL-l-12-4-a	32	GSRCKYKWDVLTKQCFHH	2517-30	2517-31
TALL-l-12-3-a	33	LPGCKWDLLIKQWVCDPL	2517-32	2517-33
TALL-1-12-5-3	34	SADCYFDILTKSDVCTSS	2517-34	2517-35
TALL-l-12-8-a	35	SDDCMYDQLTRMFICSNL	2517-36	2517-37
TALL-1-12-9-3	36	DLNCKYDELTYKEWCQFN	2521 -92	2521 -93
TALL-l-12-10-a	37	FHDCKYDLLTRQMVCHGL	2521 -94	2521 -95
TALL-1-12-11-a	38	RNHCFWDHLLKQDICPSP	2521 -96	2521 -97
TALL-l-12-14-a	39	ANQCWWDSLTKKNVCEFF	2521 -98	2521 -99
TALL-1 -konsenzus	58	FHDCKWDLLTKQWVCHGL	2551 -48	2551 -49

SK 288175 Β6

Tabuľka 5B - TALL-1 inhibitorné peptilátky

Peptibody	Peptibody SEQID NO	Peptidová sekvencia
TALL-1-8-1-a	111	MPGTCFPFPW ECTHAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-1 -8-2-a	112	MWGACWPFPW ECFKEGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-1-8-4-a	113	MVPFCDLLTK HCFEAGGGGG VDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
TALL-1-12-4-a	114	MGSRCKYKWD VLTKQCFHHG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l-12-3-a	115	KLPGCKWDLL IKQWVCDPLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12-5-a	116	MSADCYFDIL TKSDVCTSSG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12-8-a	117	MSDDCMYDQL TRMFICSNLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12-9-a	118	MDLNCKYDEL TYKEWCQFNG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYXTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK

SK 288175 Β6

Peptibody	Peptibody SEQID NO	Peptidová sekvencia
TALL-l-12-10-a	119	MFHDCKYDLL TRQMVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12-11-a	120	MRNHCFWDHL LKQDICPSPG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-l-12-14-a	121	MANQCWWDSL TKKNVCEFFG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1 -konsenzus	122	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG GGGGVDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK
TALL-1-12-3 tandemový dimér	123	KLPGCKWDLL IKQWVCDPLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT HMLPGCKWDL LIKQWVCDPL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TALL-1 konsenzus tandemový dimér	124	MFHDCKWDLL TKQWVCHGLG SGSATGGSGS TASSGSGSAT KMFHDCKWDL LTKQWVCHGL GGGGGVDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

Tabuľka 6 - Sekvencie oligonukleotidov použité pri konštrukcii peptilátky

Oligonukleotid ID číslo	SEQ ID NO	Sekvencie
2517-24	71	TAT GCC GGG TAC TTG TTT CCC GTT CCC GTG GGA ATG CAC TCA CGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-25	72	TCG ACC CCA CCG CCT CCT GGA GCG TGA GTG CAT TCC CAC GGG AAG CCG AAA CAA GTA CCC GGC A
2517-26	73	TAT GTG GGG TGC TTG TTG GCC GTT CCC GTG GGA ATG TTT CAA AGA AGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-27	74	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCT TCT TTG AAA CAT TCC CAC GGG AAC GGC CAA CAA GCA CCC CAC A

Oligonukleotid ID číslo	SEQ ID NO	Sekvencie
2517-28	75	TAT GGT TCC GTT CTG TGA CCT GCT GAC TAA ACA CTG TTT CGA AGC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-29	76	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GCT TCG AAA CAG TGT TTA GTC AGC AGG TCA CAG AAC GGA ACC A
2517-30	77	TAT GGG TTC TCG TTG TAA ATA CAA ATG GGA CGT TCT GAC TAA ACA GTG TTT CCA CCA CGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-31	78	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TGG TGG AAA CAC TGT TTA GTC AGA ACG TCC CAT TTG TAT TTA CAA CGA GAA CCC A
2517-32	79	TAT GCT GCC GGG TTG TAA ATG GGA CCT GCT GAT CAA ACA GTG GGT TTG TGA CCC GCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-33	80	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGC GGG TCA CAA ACC CAC TGT TTG ATC AGC AGG TCC CAT TTA CAA CCC GGC AGC A
2517-34	81	TAT GTC TGC TGA CTG TTA CTT CGA CAT CCT GAC TAA ATC TGA CGT TTG TAC TTC TTC TGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-35	82	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCA GAA GAA GTA CAA ACG TCA GAT TTA GTC AGG ATG TCG AAG TAA CAG TCA GCA GAC A
2517-36	83	TAT GTC TGA CGA CTG TAT GTA CGA CCA GCT GAC TCG TAT GTT CAT CTG TTC TAA CCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2517-37	84	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGG TTA GAA CAG ATG AAC ATA CGA GTC AGC TGG TCG TAC ATA CAG TCG TCA GAC A
2521-92	85	TAT GGA CCT GAA CTG TAA ATA CGA CGA ACT GAC TTA CAA AGA ATG GTG TCA GTT CAA CGG TGG AGG CGG TGG GG
25221-93	86	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG TTG AAC TGA CAC CAT TCT TTG TAA GTC AGT TCG TCG TAT TTA CAG TTC AGG TCC A
2521 -94	87	TAT GTT CCA CGA CTG TAA ATA CGA CCT GCT GAC TCG TCA GAT GGT TTG TCA CGG TCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2521 -95	88	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGA CAA ACC ATC TGA CGA GTC AGC AGG TCG TAT TTA CAG TCG TGG AAC A
2521 -96	89	TAT GCG TAA CCA CTG TTT CTG GGA CCA CCT GCT GAA ACA GGA CAT CTG TCC GTC TCC GGG TGG AGG CGG TGG GG
2521 -97	90	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC GGA GAC GGA CAG ATG TCC TGT TTC AGC AGG TGG TCC CAG AAA CAG TGG TTA CGC A
2521-98	91	TAT GGC TAA CCA GTG TTG GTG GGA CTC TCT GCT GAA AAA AAA CGT TTG TGA ATT CTT CGG TGG AGG CGG TGG GG
2521-99	92	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCG AAG AAT TCA CAA ACG TTT TTT TTC AGC AGA GAG TCC CAC CAA CAC TGG TTA GCC A
2551-48	93	TAT GTT CCA CGA CTG CAA ATG GGA CCT GCT GAC CAA ACA GTG GGT TTG CCA CGG TCT GGG TGG AGG CGG TGG GG
2551-49	94	TCG ACC CCA CCG CCT CCA CCC AGA CCG TGG CAA ACC CAC TGT TTG GTC AGC AGG TCC CAT TTG CAG TCG TGG AAC A

Vektor PAMG21-RANK-Fc;

pAMG21. Expresný plazmid pAMG21 (ATCC prístupové číslo 98113) môže byť odvodený z expresného vektora (firmy Amgen) pCFM1656 (ATCC prístupové číslo 69576), ktorý bol postupne odvodený z expres5 ného vektorového systému (firmy Amgen), opísaného v U. S. patente č. 4 710 473. Plazmid pCFM1656 môže byť odvodený z plazmidu pCFM836 (opísaného v U. S. patente č. 4 710 473) takto:

• deštrukciou dvoch endogénnych reštrikčných miest Ndel koncovým zaplnením s enzýmom T4 polymerázou a následnou ligáciou zarovnaných koncov;

• zámenou sekvencie DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami AatlI a Clal obsahujúcej syntetický 10 promótor P_L, podobným fragmentom získaným z pCFM636 (U. S. patent č. 4 710 473) obsahujúcim promótor P_L (pozri SEQ ID NO: 95 ďalej); a • substituovaním malej sekvencie DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami Clal a KpnI za oligonukleotid, ktorý má sekvenciu SEQ ID NO: 96.

SK 288175 Β6

SEQ m NO: 95:

AatlI

5' CTAATTCCGCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAAAAATAAATTCATAT3’ TGCAGATTAAGGCGAGAGTGGATGGTTTGTTACGGGGGGACGTTTTTTATTTAAGTATA-AAAAAACATACAGATAACCATCTGCGGTGATAAATTATCTCTGGCGGTGTTGACATAAA-TTTTTTGTATGTCTATTGGTAGACGCCACTATTTAATAGAGACCGCCACAACTGTATTT-TACCACTGGCGGTGATACTGAGCACAT 3’

-ATGGTGACCGCCACTATGACTCGTGTAGC 5 ’

Clal

SEQ ID NO: 96:

5' CGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC 3'

3' TAAACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC 5'

Clal KpnI

Expresný plazmid pAMG21 môže potom byť odvodený z pCFM1656 vykonaní radu miestne riadených zámien báz s PCR mutagenézou prekrývajúcich sa oligonukleotidov („PCR overlapping oligonucleotide mutagenesis“) a so sekvenčnými substitúciami DNA. Počínajúc od miesta BglII (plazmid bp #180) bezprostredne popri 5' k plazmidovému replikačnému promótora P_CopB a pokračujúc k plazmidovým replikačným génom, sú zámeny párov báz také, ako sú uvedené v tabuľke 7.

Tabuľka 7 - Zámeny párov báz vedúce k pAMG21

PAMG21 bo#	bp VPCFM1656	bp zamenený na v pAMG21
#204	T/A	C/G
#428	A/T	G/C
#509	G/C	A/T
#617	—	inzert dvoch G/C bp
#679	G/C	T/A
#980	T/A	C/G
#994	G/C	A/T
#1004	A/T	C/G
#1007	C/G	T/A
#1028	A/T	T/A
#1047	C/G	T/A
#1178	G/C	T/A
#1466	G/C	T/A
#2028	G/C	delécia bp
#2187	C/G	T/A
#2480	A/T	T/A
#2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
#2642	TCCGAGC AGGCTCG	delécia 7 bp
#3435	G/C	A/T
#3446	G/C	A/T
#3643	A/T	T/A

Sekvencia DNA medzi jedinečnými reštrikčnými miestami AatlI (pozícia # 4364 v pCFM1656) a SacII (pozícia #4585 v pCFM1656) je substituovaná sekvenciou DNA uvedenou ďalej (SEQ ID NO: 97):

AatlI kohézny koniec] 5' GCGTAACGTATGCATGGTCTCC[pozícia # 4358 vpAMG21] 3' TGCACGCATTGCATACGTACCAGAGG-CCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACT-GGTACGCTCTCATCCCTTGACGGTCCGTAGTTTATTTTGCTTTCCGAGTCAGCTTTCTGA38

-GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGC-CCCGGAAAGCAAAATAGACAACAAACAGCCACTTGCGAGAGGACTCATCCTGTTTAGGCG-CGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGC-GCCCTCGCCTAAACTTGCAACGCTTCGTTGCCGGGCCTCCCACCGCCCGTCCTGCGGGCG-CATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGT-GTATTTGACGGTCCGTAGTTTAATTCGTCTTCCGGTAGGACTGCCTACCGGAAAAACGCAAatlI

-TTCTACAAACCCTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGGACGTCGTACTTAAC-AAGATGTTTGAGAAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACCTGCAGCATGAATTG-TTTTAAAGTATGGGCAATCAATTGCTCCTGTTAAAATTGCTTTAGAAATACTTTGGCAGC-AAAATTTCATACCCGTTAGTTAACGAGGACAATTTTAACGAAATCTTTATGAAACCGTCG-GGTTTGTTGTATTGAGTTTCATTTGCGCATTGGTTAAATGGAAAGTGACCGTGCGCTTAC-CCAAACAACATAACTCAAAGTAAACGCGTAACCAATTTACCTTTCACTGGCACGCGAATG-TACAGCCTAATATTTTTGAAATATCCCAAGAGCTTTTTCCTTCGCATGCCCACGCTAAAC-ATGTCGGATTATAAAAACTTTATAGGGTTCTCGAAAAAGGAAGCGTACGGGTGCGATTTG-ATTCTTTTTCTCTTTTGGTTAAATCGTTGTTTGATTTATTATTTGCTATATTTATTTTTC-TAAGAAAAAGAGAAAACCAATTTAGCAACAAACTAAATAATAAACGATATAAATAAAAAG-GATAATTATCAACTAGAGAAGGAACAATTAATGGTATGTTCATACACGCATGTAAAAATA-CTATTAATAGTTGATCTCTTCCTTGTTAATTACCATACAAGTATGTGCGTACATTTTTAT-AACTATCTATATAGTTGTCTTTCTCTGAATGTGCAAAACTAAGCATTCCGAAGCCATTAT-TTGÁTAGATATATCAACAGAAAGAGACTTAČACGTTTTGATTCGTAAGGCTTCGGTAATA-TAGCAGTATGAATAGGGAAACTAAACCCAGTGATAAGACCTGATGATTTCGCTTCTTTAA-ATCGTCATACTTATCCCTTTGATTTGGGTCACTATTCTGGACTACTAAAGCGAAGAAATT-TTACATTTGGAGATTTTTTATTTACAGCATTGTTTTCAAATATATTCCAATTAATCGGTG-AATGTAAACCTCTAAAAAATAAATGTCGTAACAAAAGTTTATATAAGGTTAATTAGCCAC-AATGATTGGAGTTAGAATAATCTACTATAGGATCATATTTTATTAAATTAGCGTCATCAT-TTACTAACCTCAATCTTATTAGATGATATCCTAGTATAAAATAATTTAATCGCAGTAGTA-AATATTGCCTCCATTTTTTAGGGTAATTATCCAGAATTGAAATATCAGATTTAACCATAG-TTATAACGGAGGTAAAAAATCCCATTAATAGGTCTTAACTTTATAGTCTAAATTGGTATC- AAT GAGGAT AAAT GAT C GC GAG T AAAT AAT AT T CAC AAT G T ACC AT T T TAGT CATAT CAG-TTACTCCTATTTACTAGCGCTCATTTATTATAAGTGTTACATGGTAAAATCAGTATAGTC-ATAAGCATTGATTAATATCATTATTGCTTCTACAGGCTTTAATTTTATTAATTATTCTGT-TATTCGTAACTAATTATAGTAATAACGAAGATGTCCGAAATTAAAATAATTAATAAGACA-AAGTGTCGTCGGCATTTATGTCTTTCATACCCATCTCTTTATCCTTACCTATTGTTTGTC-TTCACAGCAGCCGTAAATACAGAAAGTATGGGTAGAGAAATAGGAATGGATAACAAACAG-GCAAGTTTTGCGTGTTATATATCATTAAAACGGTAATAGATTGACATTTGATTCTAATAA-CGTTCAAAACGCACAATATATAGTAATTTTGCCATTATCTAACTGTAAACTAAGATTATT-ATTGGATTTTTGTCACACTATTATATCGCTTGAAATACAATTGTTTAACATAAGTACCTG-TAACCTAAAAACAGTGTGATAATATAGCGAACTTTATGTTAACAAATTGTATTCATGGAC-TAGGATCGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGGTTTGTTATAGTCGATTAATCGATTTGATT-ATCCTAGCATGTCCAAATGCGTTCTTTTACCAAACAATATCAGCTAATTAGCTAAACTAA39

-CTAGATTTGTTTTAACTAATTAAAGGAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGA-GATCTAAACAAAATTGATTAATTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCTSacII

-GCTCACTAGTGTCGACCTGCAGGGTACCATGGAAGCTTACTCGAGGATCCGCGGAAAGAA-CGAGTGATCACAGCTGGACGTCCCATGGTACCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTTTCTT-GAAGAAGAAGAAGAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATA-CTTCTTCTTCTTCTTTCGGGCTTTCCTTCGACTCAACCGACGACGGTGGCGACTCGTTAT-ACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGG-TGATCGTATTGGGGAACCCCGGAGATTTGCCCAGAACTCCCCAAAAAACGACTTTCCTCC-AACCGCTCTTCACGCTCTTCACGC 3 ' f SacII kohézny koniec]

-TTGGCGAGAAGTGCGAGAAGTG 5' [pozícia # 5904 v pAMG21]

Počas ligácie kohéznych koncov tejto substitúcie sekvencie DNA sú vonkajšie miesta AatlI a SacII deštruované. V substituovanej DNA existujú jedinečné miesta AatlI a SacII.

Gén kódujúci ľudský RANK fuzovaný k N-koncu Fc bol ligovaný do pAMG21 ako fragment Ndel až BamHI na vytvorenie kmeňa (firmy Amgen) #4125. Uvedený konštrukt bol modifikovaný inzerciou kodónu pre valín v spojení RANK a Fc. Susediace kodóny pre valín a aspartát vytvárajú jedinečné miesto Sali. Toto umožňuje fúziu peptidov na N-konci Fc3 medzi jedinečnými miestami Ndel a Sali. RANK sekvencia je deletovaná po inzercii nového fragmentu Ndel-Sall. Sekvencia vektora je uvedená na obrázku 5A až 5M.

GM221 (Amgen #2596) Hostiteľským kmeňom #2596 (firmy Amgen) je kmeň E. coli K-12 odvodený od kmeňa #393 (firmy Amgen), ktorý je derivátom z E. coli W1485, získaným od E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Connecticut (CGSC kmeň 6159). Kmeň bol modifikovaný tak, že obsahuje obidva teplotné senzitívne lambda represory cI857s7 v ranej oblasti ebg a represor lacI^Q v neskorej oblasti ebg (68 minút). Prítomnosť týchto dvoch represorových génov umožňuje použitie tohto hostiteľa v rade systémov expresie, ale obidva z týchto represorov sú irelevantné vzhľadom na expresiu luxP_R. Netransformovaný hostiteľ nemá rezistenciu na antibiotiká.

Ribozómové väzbové miesto génu cI857s7 bolo modifikované tak, aby obsahovalo zosilnený RBS. Bolo inzerované do perónu ebg medzi nukleotidovú pozíciu 1170 a 1411 tak, ako je číslované v Genbank accession number M644 41Gb_Ba s deléciou intervenujúcej sekvencie ebg. Sekvencia inzertu je znázornená ďalej s tým, že malé písmená reprezentujú sekvencie ebg lemujúce inzert uvedený ďalej (SEQ ID NO: 98):

ttattttcgtGCGGCCGCACCATTATCACCGCCAGAGGTAAACTAGTCAACACGCACGGTGTTAGATAT

TTATCCCTTGCGGTGATAGATTGAGCACATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGGATAATATATGAG

CACAAAAAAGAAACCATTAACACAAGAGCAGCTTGAGGACGCACGTCGCCTTAAAGCAATTTA

TGAAAAAAAGAAAAATGAACTTGGCTTATCCCAGGAATCTGTCGCAGACAAGATGGGGATGGG

GCAGTCAGGCGTTGGTGCTTTATTTAATGGCATCAATGCATTAAATGCTTATAACGCCGCATTGC

TTACAAAAATTCTCAAAGTTAGCGTTGAAGAATTTAGCCCTTCAATCGCCAGAGAATCTACGAG

ATGTATGAAGCGGTTAGTATGCAGCCGTCACTTAGAAGTGAGTATGAGTACCCTGTTTTTTCTCA

TGTTCAGGCAGGGATGTTCTCACCTAAGCTTAGAACCTTTACCAAAGGTGATGCGGAGAGATGG

GTAAGCACAACCAAAAAAGCCAGTGATTCTGCATTCTGGCTTGAGGTTGAAGGTAATTCCATGA

CCGCACCAACAGGCTCCAAGCCAAGCTTTCCTGACGGAATGTTAATTCTCGTTGACCCTGAGCA

GGCTGTTGAGCCAGGTGATTTCTGCATAGCCAGACTTGGGGGTGATGAGTTTACCtTCAAGAAA

CTGATCAGGGATAGCGGTCAGGTGTTTTTACAACCACTAAACCCACAGTACCCAATGATCCCAT

GCAATGAGAGTTGTTCCGTľGTGGGGAAAGTTATCGCTAGTCAGTGGCCTGAAGAGACGTTTGG

CTGATAGACTAGTGGATCCACTAGTgttttctgccc

Konštrukt bol vnesený do chromozómu pri použití rekombinantného fága nazvaného „MMebg-cI857s7enhancedRBS #4“ do F'tet/393. Po rekombinácii a štiepení zostáva v bunke len opísaný chromozomálny inzert. Bol pomenovaný F'tet/GMIOl. F'tet/GMIOl bol potom modifikovaný vnesením lacI^Q konštruktu do operónu ebg medzi nukleotidovú pozíciu 2493 a 2937 tak, ako je číslované v Genbank accession number M64441Gb_Ba s deléciou intervenujúcou sekvencie ebg. Sekvencia inzertu je znázornená ďalej s tým, že malé písmená reprezentujú sekvencie ebg lemujúce inzert uvedený ďalej (SEQ ID NO: 99):

ggcggaaaccGACGTCCATCGAATGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGA

GAGTCAATTCAGGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGT

GTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGG

AAAAAGTCGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACÄACAACTGO

CGGGCAAACAGTCGCTCCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCA

AATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTA

GAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTG

GGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAA

TGTTCCGGCOTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGA

AGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTA

GCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTCACTGG

CAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAA

ACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGG

CGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGCTGCGCOTTGGTGCGGATATCTCGGTAGT

GCXjATACGACGATACCGAAGACAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGAT

TITCOCCTGCTGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTXjCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGA

AGGGCAATCAGCTGTTGCCCGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCA

AACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGG

AAAGCGGACAGTAAGGTACCATAGGATCCaggcacagga

Konštrukt bol vnesený do chromozómu pri použití rekombinantného fága nazvaného „AGebg-LacIQ#5“ do F'tet/GMIOl. Po rekombinácii a štiepení zostáva v bunke len opísaný chromozomálny inzert hore. Bol pomenovaný F'tet/GMIOl. Konštrukt bol pomenovaný F'tet/GM221. Epizóm F'tet bol z kmeňa odstránený použitím akridínovej oranžovej v koncentrácii 25 pg/ml v LB. Získaný kmeň bol identifikovaný ako citlivý na tetracyklín a bol uložený ako GM221.

Expresia v E. coli:

Kultúry každého z pAMG21-Fc-fúznych konštruktov v E. coli GM221 boli pestované pri 37 °C v médiu Luria Broth. Indukcia expresie génového produktu z promótoru luxPR bola dosiahnutá po pridaní syntetického autoinduktoru N-(3-oxohexanoyl)-DL-homoserín laktónu ku kultivačnému médiu na konečnú koncentráciu 20 ng/ml. Kultúry boli inkubované pri 37 °C počas ďalších 3 hodín. Po 3 hodinách boli bakteriálne kultúry mikroskopicky vyšetrené na prítomnosť inklúznych teliesok a boli zhromaždené centrifugáciou. Refrakčné inklúzne telieska boli pozorované v indukovaných kultúrach, čo naznačuje, že Fc-íúzie boli najpravdepodobnejšie produkované v nerozpustnej frakcii v E. coli. Bunkové pelety boli priamo lyzované resuspendovaním vo vzorkovom tlmivom roztoku podľa Laemmliho, obsahujúcom 10 % β-merkaptoetanol, a boli analyzované s SDS-PAGE. V každom prípade bol na géli SDS-PAGE pozorovaný Coomassie-farbený pruh so zodpovedajúcou molekulovou hmotnosťou.

Príklad 3

TALL-1 peptilátka inhibuje proliferáciu B buniek sprostredkovanú TALL-1

Myšie B lymfocyty boli izolované zo slezín myší C57BL/6 negatívnou selekciou (MACS CD43 (Ly-48)

Microbeads, Miltenyi Biotech, Aubum, CA). Purifikované (10⁵) B bunky boli kultivované v MEM, 10 % tepelne inaktivovaný FCS, 5 x 10‘⁵ M 2-merkaptoetanol, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycín) triplicitne v 96-jamkových tkanivových kultivačných platniach s plochým dnom s 10 ng/ml proteínu TALL-1 a 2 mg/ml kozích F(ab')₂ z anti myšieho IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) so stanoveným množstvom TALL-1 peptilátky počas 4 dní pri 37 °C, 5 % CO₂. Proliferácia bola meraná príjmom rádioaktívneho ³[H]tymidínu po 18-hodinovom inkubačnom čase.

Príklad 4

TALL-1 peptilátka blokuje väzbu TALL-1 k jeho receptorom

Reacti-Gel 6x (Pierce) bol vopred potiahnutý ľudským AGP3 (rovnako známym ako TALL-1, Khare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 3370 - 3375, 2000) a blokovaný BSA. 100 pM a 40 pM vzoriek AGP3 peptilátky bolo inkubovaných stanovenými rôznymi koncentráciami ľudského AGP3 pri teplote miestnosti počas 8 hodín pred nanesením na guľôčky potiahnuté ľudským AGP3. Množstvo peptilátky naviazanej na guľôčky bolo kvantifikované fluorescenčné (Cy5) značenou kozou antiľudskou-Fc protilátkou (goat anti-human-Fc antibody, Jackon Immuno Research). Väzbový signál je úmerný koncentrácii voľnej peptilátky pri väzbovej rovnováhe. Disociačná rovnovážna konštanta (K_D) bola získaná z nelineárnej regresie kompetitívnych kriviek pri použití „dual-curve one-side homogeneous binding model“ (KinEx™ Software). K_D je približne 4 pM pre peptilátku AGP3 (SEQ ID NO 123), viažuci sa s ľudským AGP3 (obrázok 9).

Na stanovenie, či táto AGP3 peptilátka môže neutralizovať väzbu myšieho AGP3 rovnako ako ľudského AGP3, bola použitá neutralizačná skúška BIAcore. Všetky pokusy boli realizované na BIAcore 3000 pri teplote miestnosti. Ľudský proteín TACI-Fc (Xia et al., J. Exp. Med. 192, 137 - 144, 2000) bol imobilizovaný k čipu BI pri použití 10 mM acetátu pH 4,0 na úroveň 2900 RU. Ako kontrola pozadia bola použitá slepá vzorka prúdu buniek. Pri použití pracovného tlmivého roztoku PBS (bez vápnika alebo horčíka) obsahujúceho 0,005 % P20 bol 1 nM rekombinantného ľudského AGP3 (v pracovnom tlmivom roztoku plus, 0,1 mg/ml BSA) inkubovaný bez určeného množstva peptilátky a s určeným množstvom peptilátky AGP3 (osa x) pred jeho nanesením na povrch receptora. Regenerácia bola vykonávaná pri použití 8 mM glycínu pH 1,5 počas 1 minúty, 25 mM 3-[cyklohexylamino]-l-propánsulfónová kyselina (CAPS) pH 10,5, 1 M NaCl počas 1 minúty. Na stanovenie väzby myšieho AGP3 bol ľudský TACI značený his (human his-tagged TACI) imobilizovaný na 1000 RU v uvedenom tlmivom roztoku. 5 nM rekombinantného myšieho AGP3 (v pracovnom tlmivom roztoku plus, 0,1 mg/ml BSA) bolo inkubovaných bez peptilátky a s rôznymi množstvami peptilátky AGP3, ako je uvedené na obrázku 11 (osa x) pred nanesením na povrch receptora. Regenerácia bola vykonaná s 10 mM HC1 pH 2, dvakrát počas 30 sekúnd. Bola stanovená relatívna väzba tak ľudského, ako myšieho AGP3 v prítomnosti oproti (vs) neprítomnosti peptilátky AGP3 (SEQ ID NO: 123) (os y). Relatívna väzbová odpoveď bola stanovená ako (RU-RU slepej vzorky/RU₀-RU slepej vzorky). Peptilátka AGP3 (SEQ ID NO: 123) inhibovala väzbu tak ľudského, ako myšieho AGP3 k jeho receptoru TACI (obrázky 10A a 10B).

Na zistenie, či táto peptilátka AGP3 blokuje väzbu k všetkým trom receptorom (TACI, BCMA a BAFFR), boli proteíny TACI, BCMA a BAFFR imobilizované k čipu CM5. Pri použití 10 mM acetátu, pH 4 bol ľudský TACI-Fc imobilizovaný na 6300 RU, ľudský BMCA-Fc na 5000 RU a BAFFR-Fc na 6000 RU. 1 nM rekombinantného AGP3 (v pracovnom tlmivom roztoku obsahujúcom 0,1 mg/ml BSA a 0,1 mg/ml Heparinu) alebo 1 nM rekombinantného proteínu APRÍL (Yu et al., Nat. Immunol., 1: 252 - 256, 2000) bol inkubovaný s určeným množstvom peptilátky AGP3 pred nanesením na každý z receptorových povrchov. Regenerácia v pokuse s AGP3 bola vykonaná s 8 mM glycínu, pH 1,5 počas 1 minúty a následne s 25 mM CAPS, pH 10,5, 1 M NaCl počas 1 minúty. Regenerácia v pokuse s APRÍL bola vykonaná s 8 mM glycínu, pH 2 počas 1 minúty a následne s 25 mM CAPS, pH 10,5, 1 M NaCl počas 1 minúty. Bola meraná relatívna väzba AGP3 a APRILu. Peptilátka AGP3 (SEQ ID NO: 123) blokovala väzbu AGP3 k všetkým trom receptorom (obrázok 11 A). Peptilátka AGP3 nemala účinok na väzbu APRILu k receptorom (obrázok 1 IB).

Príklad 5

Peptilátka AGP3 blokuje proliferáciu B buniek sprostredkovanú AGP3

Myšie B lymfocyty boli izolované negatívnou selekciou zo slezín myší C57BL/6. (MACS CD43 (Ly-48)

Microbeads, Miltenyi Biotech, Aubum, CA). Purifikované (10⁵) B bunky boli kultivované v minimálnom základnom médiu (minimal essential médium, MEM) 10 % tepelne inaktivované fetálne hovädzie sérum (fetal calf sérum, FCS), 5 x 10'⁵ M 2-merkaptoetanol, 100 U/ml penicilín, 100 pg/ml streptomycín) triplicitne v 96-jamkových tkanivových kultivačných platniach s plochým dnom s 10 ng/ml proteínu AGP3 (TALL-1) a 2 mg/ml kozích F(ab')₂ z anti myšieho IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratory, West Grove, Pennsylvania) so stanoveným množstvom rekombinantnej AGP3 peptilátky (SEQ ID NO: 123) počas 4 dní pri 37 °C, 5 % CO₂. Proliferácia bola meraná príjmom rádioaktívneho³ [H] tymidínu po 18-hodinovom inkubačnom čase.

Príklad 6

Peptilátka AGP3 a produkcia Ig pri myši stimulovanej AGP3

Myši (Balb/c samičky staré 9-14 týždňov s hmotnosťou 19 - 21 g) boli získané od Charles River Laboratories, Wilmington, MA. Myši (n = 10) boli intraperitoneálne ošetrené s 1 mg/kg ľudského AGP3 raz denne počas piatich nasledujúcich dní a následne s 5 mg/kg alebo 0,5 mg/kg peptilátky AGP3 (SEQ ID NO: 123), alebo s fyziologickým roztokom, alebo s 5 mg/kg ľudského Fc. Ďalšie myši boli ponechané bez ošetrenia. Myši boli usmrtené v šiestom dni a bol meraný sérový IgM a IgA, ktoré boli merané metódou ELISA. Stručne povedané, platne boli potiahnuté zachytávajúcimi protilátkami špecifickými pre IgM alebo IgA (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), blokované a boli pridané roztoky štandardných (IgM od Calbiochem, San Diego, CA a IgA od Southern Biotechnology Associates) alebo testovaných vzoriek. Zachytené Ig boli zisťované pri použití biotinylovaných protilátok špecifických proti IgM alebo IgA (Southern Biotechnology Associates), peroxidázou konjugovanou s neutravidinom (neutravidin-conjugated peroxidase, Pierce, Rockford, IL) a tetrametylbenzidínovým (TMB) peroxidázovým substrátom (KPL, Gaithersburg, MD) určeným pre mikrodoštičky. Hodnoty optickej hustoty boli kvantifikované na čítačke ELISA (Thermomax ELISA reader, Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Zvýšenie sérových hladín IgM a IgA stimulované ľudským AGP3 bolo blokované 5 mg/kg anti-AGP3 peptilátky (SEQ ID NO: 123) a nie 0,5 mg/kg (obrázky 12A a 12B).

Príklad 7

Peptilátka AGP3 znižovala počet slezinných buniek u myši

Myši (zhodné, ako je uvedené n = 7) boli ošetrené počas siedmich nasledujúcich dní 5 mg/kg, alebo

1,5 mg/kg, alebo 0,5 mg/kg peptilátky AGP3 (SEQ ID NO: 123), alebo fyziologickým roztokom, alebo 5 mg/kg ľudského Fc. Myši boli usmrtené v ôsmom dni na stanovenie počtu slezinných B buniek. Sleziny boli odoberané do fyziologického roztoku a jemne rozrušené manuálnou homogenizáciou za poskytnutia bunkovej suspenzie. Celkový počet buniek bol stanovený na H1E čítačke (H1E counter, Technicon, Tarrytown, N Y). Percento B buniek bolo odvodené z imunofluorescenčného dvojitého farbenia a z prietokovej cytometrie pri použití fluoresceín izotiokyanát(FITC)-konjugovanej a fykoerytrin (PE)-konjugovanej protilátky (Ab) proti CD3 a B220 v uvedenom poradí (PharMingen, San Diego, CA) a FACScan analyzátora (FACScan analyser Becton and Dickinson, Mountain View, CA). B bunky boli identifikované ako CD3-B220+. Vo všetkých dávkach znižoval AGP3 peptilátky (SEQ ID NO: 123) počet slezinných B buniek spôsobom závislým od dávky (obrázky 12A a 12B) (SEQ ID NO: 123).

Tabuľka 8 - AGP3 peptilátka znižuje pri normálnych myšiach počet B buniek

n = 7	Dávka (1/deň x7)	slezinné B bunky (1 x 10e6)	SD	t test
fyziologický roztok		51,3	9,6
Fc	5 mg/kg	45,5	7,1
Peptilátka	5 mg/kg	20,1	3,8	l,37856E-05
	1,5 mg/kg	22,6	6,9	5,10194E-05
	0,5 mg/kg	25,8	3,6	0,000111409

Príklad 8

Peptilátka AGP3 znižovala intenzitu artritídy na myšom modeli CIA

Osem 12-týždňov starých myší DBA/1 (získaných od Jackon Laboratories, Bar Harbor, ME) bolo imunizovaných s hovädzím kolagénom typu II (bCII)(poskytnutým z University of Utah), emulzifikovanom v kompletnom Freundovom adjuvanse (Difco) intradermálne ku koreňu chvosta. Každá injekcia bola 100 μϊ a obsahovala 100 pg bCll. Myši boli opakovane imunizované (boosted) 3 týždne po primárnej imunizácii s bCII emulzifikovanom v nekompletnom Freundovom adjuvanse. Liečba bola začatá od dňa opakovanej imunizácie počas 4 týždňov. Myši boli vyšetrené na vznik artritídy. Ako bolo opísané (Khare et al., J. Immunol. 155: 3653 - 9, 1995), všetky štyri labky boli jednotlivo skórované hodnotou 1 až 3. Preto sa intenzita artritídy môže pohybovať od 0 do 12 pre každé zviera. Liečba AGP3 (SEQ ID NO: 123) signifikantne znížila intenzitu skóre artritídy (obrázok 13).

Boli odoberané vzorky séra jeden týždeň po poslednej liečbe (deň 35) na analýzu hladiny antikolagénových protilátok. High binding ELISA platne (Immulon, Nunc) boli potiahnuté 50 μϊ roztoku 4 pg/ml hovädzieho Cll v uhličitanovom tlmivom roztoku a boli udržované v chlade cez noc v chladničke. Platne boli trikrát premyté ľadovou vodou. 75 μϊ blokujúceho roztoku pripraveného z PBS/0,05 % tween 20/1 % BSA bolo použité na blokovanie nešpecifickej väzby počas jednej hodiny. Vzorky boli zriedené (do blokujúceho tlmivého roztoku) v riediacich doštičkách 1 : 25, 1 : 100, 1 : 400 a 1 : 1600 a 25 μϊ týchto vzoriek bolo pridaných do každej jamky doštičky ELISA na konečné riedenie 100, 400, 1600 a 6400 s konečným objemom 100 μΙ/jamka. Po inkubácii pri teplote miestnosti počas 3 hodín boli doštičky opäť trikrát premyté. 100 μϊ druhotnej protilátky nariedenej v blokujúcom tlmivom roztoku (potkaní anti myší IgM, IgG2a, IgH2b, IgGl, IgG3-HRP) bolo pridaných do každej jamky a doštičky boli inkubované počas aspoň 2 hodín. Doštičky boli premyté štyrikrát. 100 μϊ roztoku TMB (Sigma) bolo pridaných do každej jamky a reakcia bola zastavená pri použití 50 μϊ 25 % kyseliny sírovej. Doštičky boli odčítané pri použití ELISA čítačky pri 450 nm. OD bola porovnaná so štandardnou vzorkou (poolom) predstavujúcou jednotky/ml. Liečba pri použití peptilátky AGP3 (SEQ ID NO: 123) znižovala hladiny sérových anti kolagén II IgGl, IgG3, IgG2a a IgG2b v porovnaní s PBS alebo Fc kontrolnými liečebnými skupinami (obrázok 14).

Príklad 9

Liečba lupus myší NZB/NZW pri použití peptilátky AGP3

Päť mesiacov staré myši NZBx NZB WF1 náchylné k lupus boli ošetrené intraperitoneálne 3x/týždeň počas 8 týždňov PBS, alebo určenými dávkami peptilátky AGP3 alebo ľudských proteinov Fc. Pred liečbou boli zvieratá vopred skrínované na protein v moči prúžkami Albustix reagents strips (Bayer AG). Myši, ktoré mali viac ako 100 mg/dl proteinu v moči, neboli do štúdie zahrnuté. Protein v moči bol hodnotený mesačne po celý čas pokusu. Liečba AGP3 peptilátkou (SEQ ID NO: 123) viedla k oddialeniu vypuknutia proteinúrie a zlepšila prežívanie (obrázky 15A a 15 B).

Liečba s AGP3 peptilátkou znižovala počet B buniek myší. Myši Balb/c dostali 7 denných intraperitoneálnych injekcií stanoveného množstva AGP3 peptilátky (SEQ ID NO: 123), alebo ľudského proteinu Fc. V ôsmom dni boli odoberané sleziny a tieto boli podrobené analýze FACS na B bunky B220+, ako je uvedené v tabuľke 8.

Vynález tu bol kompletne opísaný a je zrejmé, že odborník v odbore môže uskutočniť veľa zmien a modifikácií bez toho, aby došlo k odklonu od podstaty a rozsahu vynálezu tak, ako je tu uvedený.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Látková kompozícia zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu Dz²Lz⁴, kde z² je aminokyselinový zvyšok a z⁴ je T alebo I a viažuca polypeptid TALL-1 so sekvenciou SEQ ID NO: 198, pričom táto kompozícia nezahŕňa fragment TACI, BCMA, alebo BAFFR (SEQ ID NO: 195, 196 a 197).
2. Látková kompozícia podľa nároku 1, kde z⁴ je T.
3. Látková kompozícia podľa nároku 1, kde z⁴ je I.
4. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴(SEQ IDNO: 100), v ktorom:

každý z a¹, a² a a³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; a⁶ je aminokyselinový zvyšok; a⁸ je T alebo I;

a⁹ je bázický alebo hydrofóbny zvyšok;

a¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

a¹² je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z a¹³ a a¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok.
5. Látková kompozícia podľa nároku 4, kde a⁸ je Ta a⁹ je bázický zvyšok.
6. Látková kompozícia podľa nároku 4, kde a⁹ je K a a¹² je F.
7. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb^,0b¹¹b¹²b¹³b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸(SEQ IDNO: 104), v ktorom:

každý z b¹ a b² je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b³ je kyslý alebo amidový zvyšok;

b⁵ aminokyselinový zvyšok;

b⁶ j e aromatický zvyšok;

b⁸ j e aminokyselinový zvyšok;

b¹⁰ j e T alebo I;

b¹¹ je bázický zvyšok;

každý z b¹² a b¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok.
8. Látková kompozícia podľa nároku 7, kde: b³ je D, Q, alebo E;

b⁶ je W alebo Y;

b¹⁰ je T;

b¹¹ je K alebo R; a b¹⁴ je V alebo L.
9. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca c^,c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c¹¹c¹²c¹³c^,4Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸(SEQ IDNO: 105), v ktorom:

každý z c¹, c² a c³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; c⁵ je aminokyselinový zvyšok; c⁷ je aminokyselinový zvyšok; c⁹ je T alebo I;

c¹⁰ je bázický zvyšok;

každý z c¹¹ a c¹² nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

c¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁶ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a

120 c¹⁸ je aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný.
10. Látková kompozícia podľa nároku 9, kde:

C⁹ je T;

c¹⁰ je K alebo R;

5 c¹³ je I, L alebo V; a c¹⁷ je A alebo L.
11. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca d‘d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld^l2d¹³d¹⁴Cd^I6d¹⁷d¹⁸10 (SEQ IDNO: 106), v ktorom:

každý z d¹, d² a d³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; každý z d⁵, d⁶ a d⁷ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;
15 d¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

d¹² je T alebo I;

d¹³ je aminokyselinový zvyšok; d¹⁴ je aminokyselinový zvyšok; a každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok.

20 12. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca e¹e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le^1IKe¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸(SEQ IDNO: 107),

25 v ktorom:

každý z e¹, e² a e³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok; každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; e¹¹ je T alebo I; a každý z e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok.

30 13. Látková kompozícia podľa nároku 1 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lí⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴(SEQ IDNO: 109),

35 v ktorom:

f¹, f² a f³ sú neprítomné alebo sú aminokyselinové zvyšky; f⁵ je W, Y alebo F; f⁷ je aminokyselinový zvyšok; f⁹ je T alebo I;

40 f¹⁰ je K, R alebo H;

f¹² je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo bázický zvyšok, prednostne W, C alebo R; f¹³ je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo nie je prítomný; a f¹⁴ je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný; za predpokladu, že iba jeden z f¹, f² a f³ môže byť C a iba jeden z f¹², f¹³ a f¹⁴ môže byť C.

45 14. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f⁵ je W.

15. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f⁷ je L.
16. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f⁹ je T.
17. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f¹⁰ je K.
18. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f¹² je C a jeden z f¹, f² a f³ je C.

50
19. Látková kompozícia podľa nároku 13, kde f¹³ je V.
20. Látková kompozícia podľa nároku 13 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca f‘ťf³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴(SEQ ID NO: 125).
21. Látková kompozícia podľa nároku 20 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo skupiny skladajúcej sa z: SEQ ID NO: 32, 33, 58, 60, 63, 66, 67, 69, 114, 115, 122, 123, 124, 147 - 150, 152 - 177, 179, 180 a 187.
22. Látková kompozícia podľa nároku 20 zahŕňajúca aminokyselinovú sekvenciu vzorca

121

LPGCKWDLLIKQWVCDPL (SEQ ID NO: 33).
23. Látková kompozícia podľa nároku 1, ktorá má vzorec (X‘)_a-V¹ - (X²)_b a jej multiméry, kde:

V¹ je Fc doména;

X¹ a X² sú nezávisle vybrané z - (L¹^ - P¹,

- (L‘)_c - P* - (L²)d - P², - (L‘)c - P¹ - (L²)d - P² - (L³)e - P³ a

- (L*)_c - P¹ - (L²)d - P² - (L³)e - P³ - (L⁴)_f - P⁴;

jeden alebo viac z P¹, P², P³ a P⁴, každý nezávisle, zahŕňa Dz²Lz⁴;

L¹, L², L³ a L⁴ predstavuje každý nezávisle linker; a a, b, c, d, e a f je každý nezávisle 0 alebo 1, za podmienky, že aspoň jeden z a a b je 1.
24. Látková kompozícia podľa nároku 23 vzorca P¹ - (L‘)c- P²- (L²)d- V¹.
25. Látková kompozícia podľa nároku 23 vzorca V¹ - (L‘)c - P¹ - (L²)d - P².
26. Látková kompozícia podľa nároku 23, kde V¹ je doména IgG Fc.
27. Látková kompozícia podľa nároku 23, kde V¹ je doména IgG 1 Fc.
28. Látková kompozícia podľa nároku 23, kde V¹ zahŕňa sekvenciu SEQ ID NO: 2.
29. Látková kompozícia podľa nároku 23, kde jeden alebo viac z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle zahŕňa sekvenciu vybranú z:

a¹a²a³CDa⁶La⁸a⁹a¹⁰Ca¹²a¹³a¹⁴ (SEQ ID NO: 100), b¹b²b³Cb⁵b⁶Db⁸Lb¹⁰b¹¹b¹²b^I3b¹⁴Cb¹⁶b¹⁷b¹⁸ (SEQ ID NO: 104), c‘c²c³Cc⁵Dc⁷Lc⁹c¹⁰c^llc¹²c¹³c¹⁴Cc¹⁶c¹⁷c¹⁸ (SEQ ID NO: 105), d¹d²d³Cd⁵d⁶d⁷WDd¹⁰Ld¹²d¹³d¹⁴Cd¹⁶d¹⁷d¹⁸ (SEQ ID NO: 106), e'e²e³Ce⁵e⁶e⁷De⁹Le¹¹Ke¹³Ce¹⁵e¹⁶e¹⁷e¹⁸ (SEQ ID NO: 107), f¹f²f³Kf⁵Df⁷Lf⁹f¹⁰Qf¹²f¹³f¹⁴ (SEQ ID NO: 109), g¹g²g³Cg⁵PFg⁸Wg¹⁰Cg^,2g¹³g¹⁴ (SEQ IDNO: 101), h¹h²h³CWh⁶h⁷WGh^l0Ch¹²h¹³h¹⁴ (SEQ ID NO: 102), a i¹i²i³Ci⁵i⁶i⁷i⁸i⁹i¹⁰Ci¹²i¹³i¹⁴ (SEQ ID NO: 103), kde každý z a¹, a² a a³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

a⁶ j e aminokyselinový zvyšok;

a⁹ je bázický alebo hydrofóbny zvyšok;

a⁸ je treonyl alebo izoleucyl;

a¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

a¹² je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z a¹³ a a¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z b¹ a b² je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b³ je kyslý alebo amidový zvyšok;

b⁵ aminokyselinový zvyšok;

b⁶ je aromatický zvyšok;

b⁸ je aminokyselinový zvyšok;

b¹⁰ je T alebo I;

b¹¹ je bázický zvyšok;

každý z b¹² a b¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

b¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok; a každý z b¹⁶, b¹⁷ a b¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z c¹, c² a c³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

c⁵ je aminokyselinový zvyšok;

c⁷ je aminokyselinový zvyšok;

c⁹ je T alebo I;

c¹⁰ je bázický zvyšok;

každý z c¹¹ a c¹² nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

c¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

122

SK 288175 Β6 c¹⁶ je aminokyselinový zvyšok;

c¹⁷ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

c¹⁸ je aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný;

každý z d¹, d² a d³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z d⁵, d⁶ a d⁷ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

d¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

d¹² je T alebo I;

d¹³ je aminokyselinový zvyšok;

d¹⁴ je aminokyselinový zvyšok;

každý z d¹⁶, d¹⁷ a d¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z e¹, e² a e³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

každý z e⁵, e⁶, e⁷, e⁹ a e¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

e“ je T alebo I;

každý z e¹⁵, e¹⁶, e¹⁷ a e¹⁸ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

f¹, f² a f³ sú neprítomné alebo sú aminokyselinové zvyšky;

ť je W, Y alebo F;

f⁷ je aminokyselinový zvyšok;

f⁹ je T alebo I;

f¹⁰ je K, R alebo H;

f¹² je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo bázický zvyšok;

f¹³ je C, neutrálny hydrofóbny zvyšok alebo nie je prítomný; a f¹⁴ je akýkoľvek aminokyselinový zvyšok alebo nie je prítomný; za predpokladu, že iba jeden z f¹, f² a f³ môže byť C a iba jeden z f¹², f¹³ a f¹ môže byť C;

každý z g¹, g² a g³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

g⁵ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

g⁸ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

g¹⁰ je kyslý zvyšok;

každý z g¹² a g¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; a g¹⁴ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

každý z h¹, h² a h³ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

h⁶ j e hydrofóbny zvyšok; h⁷ je hydrofóbny zvyšok;

h¹⁰ je kyslý alebo polárny hydrofóbny zvyšok;

každý z h¹², h¹³ a h¹⁴ je nezávisle neprítomný alebo predstavuje aminokyselinový zvyšok;

1¹ je neprítomný alebo je aminokyselinový zvyšok;

1² je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

1³ je aminokyselinový zvyšok;

každý z i⁵, i⁶, i⁷ a i⁸ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok;

i⁹ je kyslý zvyšok;

i¹⁰ je aminokyselinový zvyšok;

každý z i¹² a i¹³ nezávisle predstavuje aminokyselinový zvyšok; a i¹⁴ je neutrálny hydrofóbny zvyšok.
30. Látková kompozícia podľa nároku 29, kde: a⁹ je bázický zvyšok;

b³ je D, Q alebo E;

b⁶ je W alebo Y;

b¹¹ je K alebo R;

b¹⁴ je V alebo L;

c¹⁰ je K alebo R;

c¹³ je a 1, L alebo V;

c¹⁷ ie A alebo L;

f⁵ je W;

f je L;

f¹⁰jeK;a f¹³ je V.
31. Látková kompozícia podľa nároku 29, kde jeden alebo viaceré z P¹, P², P³ a P⁴ každý nezávisle zahŕňa f¹f²f³KWDf⁷Lf⁹KQf¹²f¹³f¹⁴(SEQ ID NO: 125).

123

SK 288175 Β6
32. Látková kompozícia podľa nároku 31 vzorca

P¹- (L*)c- P²- (L²)d- V¹.
33. Látková kompozícia podľa nároku 31 vzorca v¹ - (l'x-p¹ - (L²)_d-p².
34. Látková kompozícia podľa nároku 31, ktorá má aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo SEQ ID NO: 122, 123 a 124.
35. Látková kompozícia podľa nároku 31, v ktorej L² je väčší ako 5 aminokyselín.
36. Látková kompozícia podľa nároku 35, kde L² je vybrané z

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx‘x²(SEQ ID NO: 193) a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATx‘x²GSGSATGGSGSTASSGSGSATx³x⁴(SEQ IDNO: 194), kde x*a x³ je každý nezávisle bázický alebo hydrofóbny zvyšk a x² a x⁴ je každý nezávisle hydrofóbny zvyšok.
37. Látková kompozícia podľa nároku 31, kde L² je vybrané z

GSGSATGGSGSTASSGSGSATH (SEQ ID NO: 59),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGM (SEQ IDNO: 190),

GSGSATGGSGSTASSGSGSATGS (SEQ ID NO :191), a

GSGSATGGSGSTASSGSGSATHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATHM (SEQ IDNO: 192).
38. Látková kompozícia podľa nároku 23 zahŕňajúca sekvencie vybrané z tabuľky 4 (SEQ ID NO: 44 55).
39. Látková kompozícia podľa nároku 31, kde V* je doména Fc.
40. Látková kompozícia podľa nároku 31, kde V¹ je doména IgG Fc.
41. Látková kompozícia podľa nároku 31, kde V¹ je doména IgGl Fc.
42. DNA kódujúca látkovú kompozíciu podľa nároku 23.
43. Expresný vektor zahŕňajúci DNA podľa nároku 42.
44. Hostiteľská bunka zahŕňajúca expresný vektor podľa nároku 43.
45 Bunka podľa nároku 44, kde bunkou je bunka E. coli.
46. Kompozícia podľa nároku 1 na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami.
47. Kompozícia podľa nároku 13 na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami.
48. Kompozícia podľa nároku 1 na použitie na liečenie lupusu.
49. Kompozícia podľa nároku 13 na použitie na liečenie lupusu.
50. Kompozícia podľa nároku 1 na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami.
51. Kompozícia podľa nároku 13 na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami.
52. Kompozícia podľa nároku 1 na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu.
53. Kompozícia podľa nároku 13 na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu.
54. Kompozícia podľa nároku 23 na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami.
55. Kompozícia podľa nároku 23 na použitie na liečenie lupusu.
56. Kompozícia podľa nároku 23 na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami.
57. Kompozícia podľa nároku 23 na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu.
58. Kompozícia podľa nároku 23, kde

P¹ zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:33

124

LPGCKWDLLIKQWVCDPL;

P² zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 125 f^xf f³KWDf⁷Lf⁹KQŕ²f¹³f^la;

f¹ nie je prítomný alebo predstavuje M;

5 f² je G;

f³ je C; f⁷ je L; í⁹ je I; f¹² je W;

10 f¹³ je neutrálny hydrofóbny zvyšok;

f¹⁴ je C;

L¹ zahŕňa peptidový linker so sekvenciou GGGGGV;

L² zahŕňa aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:59 GSGSATGGSGSTASSGSGSATHM; a

15 V¹ je doména Fc;

pričom táto kompozícia prípadne obsahuje N-terminálny methionínový zvyšok.
59. Kompozícia podľa nároku 58 na použitie na liečenie autoimunitných ochorení sprostredkovaných B bunkami.
60. Kompozícia podľa nároku 58 na použitie na liečenie lupusu.

20
61. Kompozícia podľa nároku 58 na použitie na liečenie rakoviny sprostredkovanej B bunkami.
62. Kompozícia podľa nároku 58 na použitie na liečenie B-bunkového lymfómu.