HU224696B1 - Improved interferon polymer conjugates - Google Patents

Improved interferon polymer conjugates Download PDF

Info

Publication number
HU224696B1
HU224696B1 HU0101532A HUP0101532A HU224696B1 HU 224696 B1 HU224696 B1 HU 224696B1 HU 0101532 A HU0101532 A HU 0101532A HU P0101532 A HUP0101532 A HU P0101532A HU 224696 B1 HU224696 B1 HU 224696B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
interferon
alpha
polymer
positional isomers
interferon alpha
Prior art date
Application number
HU0101532A
Other languages
English (en)
Inventor
Carl W Gilbert
Myung-Ok Park-Cho
Original Assignee
Schering Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25540857&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU224696(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Schering Corp filed Critical Schering Corp
Publication of HUP0101532A2 publication Critical patent/HUP0101532A2/hu
Publication of HUP0101532A3 publication Critical patent/HUP0101532A3/hu
Publication of HU224696B1 publication Critical patent/HU224696B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány interferon-polimer konjugátumokra vonatkozik. A találmány tárgyát különösen új interferon-polimer kapcsolási profilú konjugátumok képezik.
Feltételezték, hogy biológiailag aktív fehérjék polimerekhez való kapcsolása egy vagy több tulajdonságot javít az alábbiak közül: keringésben megfigyelt életidő, vízoldhatóság vagy in vivő antigenitás. Például peptidek vagy polipeptidek polietilénglikolhoz (PEG) és hasonló vízben oldható polimerekhez való kapcsolásának néhány kezdeti koncepcióját leírták az USP 4,179,337 számú szabadalmi iratban, melynek tartalmát teljes egészében a kitanítás részének tekintjük.
Elsőként alkalmazott konjugált, terápiás hatású ágensek közé tartozik az inzulin és hemoglobin. Ezek a viszonylag nagyméretű polipeptidek számos kapcsolódási helyet tartalmaznak szabad lizin-c-aminocsoportoknál. Számos polimert lehet kapcsolni biológiai aktivitás szignifikáns vesztesége nélkül.
Sok biológiailag aktív anyag esetén azonban a konjugációs eljárás komplikációkkal jár. Figyelmet kell fordítani arra, hogy határt szabjunk a biológiai aktivitás veszteségének, melyet a konjugációs reakció okoz. Például ha túl sok aktivált polimer van kapcsolva a célfehérjéhez vagy polipeptidhez, a biológiai aktivitás jelentős mértékben csökkenhet vagy elveszhet. Továbbá ha rossz linker kapcsolja össze a polimert az alkalmazott fehérjével, vagy nem elegendő mennyiségű polimer van kapcsolva a célhoz, az eredményül kapott konjugátum terápiás értéke korlátozott. Az ilyen konjugátumok keringésben eltöltött ideje gyakran nem növekszik kellő mértékben ahhoz, hogy ellensúlyozza a biológiai aktivitásban bekövetkezett veszteséget. Az is eredményezhet problémákat, ha a terápiás hatású csoport aktív helye (azaz ahol a biológiai aktivitással asszociált csoportok találhatók) a polimer kapcsolódásának eredményeként blokkolás alá kerül. Ezt a problémát nehéz elkerülni, mivel a polimer és a fehérje tipikusan oldatban végbemenő reakciókban kapcsolódik. Javasolták az aktív helyek előzetes blokkolását bizonyos anyagokkal, például piridoxál-foszfáttal, de az eredmények ellentmondásosak voltak. A problémák különösen alacsony molekulatömegű fehérjékkel és peptidekkel voltak súlyosak. Ezek a biológiailag aktív anyagok gyakran kevés olyan kapcsolási hellyel rendelkeznek, amelyek nem asszociáltak biológiai aktivitással.
Az interferonok, melyeket a továbbiakban IFN-ként is jelölünk, olyan fehérjék, amelyek számára például különösen előnyösek lehetnek a javított polimerkonjugációs technikák. Lásd például USP 4.766.106 és 4.917.888 számú szabadalmi iratokat, amelyekben többek között leírnak aktivált polimerekkel, például mPEG-2,4,6-triklór-e-triazinnal, mPEG-N-szukcinimidil-glutaráttal vagy mPEG-N-szukcinimidil-szukcináttal konjugált béta-interferont. A szabadalmi iratokban leírják, hogy a fehérje kovalens módosítását 5 és 9 közötti pH-η végzik, ha viszont a fehérje lizincsoportjain keresztül reagál, akkor a fehérje kovalens módosítását 8 és 9 közötti pH-η végzik. Az aktivált polimert is viszonylag nagy (10-, 20- és 50-szeres) moláris feleslegben alkalmazzák.
Az EP 0 236 987 számú szabadalmi iratban leírtak szerint alfa- és gamma-interferonokat reagáltatnak nagy moláris feleslegű, alkil-imido-észterrel aktivált polietilénglikolokkal olyan körülmények között, amelyben előnyösen körülbelül 7 és 9 közötti pH-t alkalmaznak. Az EP 0 510 356 számú szabadalmi iratban leírtak szerint alfa-interferont konjugálnak piridil-karbonillal és tiokarbonillal aktivált PEG-gel, 7 és 9 közötti pH-n. Ezekben a leírásokban nem említik, hogy lizinen kívül más aminosavak is szerepet játszanak-e a konjugálásban, vagy azt, hogy ez előnyös lenne-e.
A fentebb leírt közlemények ellenére a legtöbb interferon-polimer konjugátum elfogadhatatlannak tartható egyik vagy másik okból.
A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki ezen hiányosságok megszüntetését.
A találmány tárgyát képezik egyik vonatkozásában monopolimer szálú alfa-interferon-konjugátumok keverékét tartalmazó gyógyászati készítmények. A keverékben egyedi monopolimer-IFN konjugátumok pozicionális izomerekként vannak meghatározva attól függően, melyik aminosav van kovalensen kapcsolva a polimerhez. Ebben a keverékben az egyik izomer egy polimerhez kovalensen kapcsolt alfa-interferon, az alfa-interferonon lévő hisztidinnél. A készítmények eltérnek a korábban előállított termékektől, részben amiatt, hogy a készítmény részét képező interferonkonjugátumok legalább 15%-a, és előnyösen legalább körülbelül 30%-a olyan polimert tartalmaz, amely az alfa-interferon hisztidinjénél kapcsolódik. Azonban a konjugátumok vagy pozicionális izomerek előnyösen körülbelül egy polimer szálat tartalmaznak egy alfa-interferonra vonatkoztatva, függetlenül attól, hogy a polimer hol kapcsolódik.
A találmány tárgyát képezik még további vonatkozásában eljárások alfa-interferon-konjugátumok előállítására, és az eljárások alkalmazásával előállított készítmények. Az IFN-polimer konjugátumokat úgy állítjuk elő, hogy alfa-interferont tartalmazó oldatot reagáltatunk elegendő mennyiségű oxi-karbonil-N-dikarboximid-aktivált polimerrel, például szukcinimidil-karbonát-aktivált PEG-gel olyan körülmények között, amely elegendő a polimer interferonhoz való kovalens kapcsolásához, legalább részben, az alfa-interferon hisztidinjéhez, például a His34-hez. Ezen körülmények részben olyan pH-tartományban végzett konjugációs reakciókat jelentenek, amely elősegíti a polimer szálak legalább egy részének kovalens kapcsolását az interferonmolekulák hisztidin-amino-csoportjaihoz.
Alkalmas alfa-interferonok lehetnek rekombináns és emlősökből izolált, nem rekombináns alfa-interferonok. A konjugátum polimerrésze előnyösen poli(alkilén-oxid) (PAO), például monometoxi-polietilénglikol (mPEG). A találmány egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint más, lényegében nem antigenikus polimereket is lehet alkalmazni. A polimerek előnyösen körülbelül 200 és körülbelül 35 000 közötti molekulatömeggel rendelkeznek.
A konjugáláshoz alkalmazott körülmények olyanok, amelynek során a kapcsolási reakcióban az aktivált polimert körülbelül ekvimoláris és körülbelül viszonylag
HU 224 696 Β1 kis moláris felesleg között alkalmazzuk az alfa-interferonhoz viszonyítva. A körülmények továbbá olyanok, amelyben a reakciót körülbelül 7-nél kisebb pH-η végezzük, és előnyösen körülbelül 4,5 és körülbelül 6,8 közötti pH-η végezzük.
A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti IFN-konjugátumok alkalmazása emlősökben alfa-interferonra érzékeny állapotok kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények előállítására. A kezelés során a találmány szerinti IFN-konjugátumokat tartalmazó készítmények hatásos mennyiségét adják be ilyen terápiára szoruló emlősöknek.
A találmány szerinti megoldás eredményeként váratlanul azt találtuk, hogy interferon-polimer konjugátumot tartalmazó készítmények további javítására van lehetőség. Például a konjugációs körülmények módosításával már olyan készítményeket is elő lehet állítani, amelyek viszonylag magas aktivitású monopolimer-IFN konjugátumokat tartalmaznak, amelyekben az alfa-interferon egy része egyedi helyeken kapcsolódik polimerekhez. Továbbá azt találtuk, hogy a konjugációs reakciót szukcinimidil-karbonáttal és néhány rokon szerkezetű oxi-karbonil-N-dikarboximid típusú aktivált polimerrel végezve, például SC-PEG-gel olyan pH-értékeken, amely savasabb a konjugációra tipikusan alkalmazott pH-értékeknél, a polimer nemcsak a várakozásnak megfelelő lizinhelyeken kapcsolódik az IFNmolekulához, hanem szelektíven hisztidineknél is, például előnyösen alfa-interferonokon található His34aminosavhoz.
A találmány szerinti megoldás alaposabb megértetése céljából az alábbi leírásra és ábrákra hivatkozunk.
Az 1. ábrán olyan kromatogramok sorozata látható, amelyekre a 11. példában utalunk.
A 2. ábrán olyan kromatogramok sorozata látható, amelyekre a 13. példában utalunk.
1. Interferonok
A polimerkonjugátum interferon- (IFN-) részét különböző forrásokból állíthatjuk elő vagy juthatunk hozzá, beleértve rekombinánstechnikák alkalmazását, például E. coliban expresszálva, szintetikus gének felhasználásával. Lásd még Pestka, „lnterferon-α” című fejezetet a „Humán Cytokines” című könyvben [Blackwell Scientific Publications 1-16. (1992)], melynek tartalmát teljes egészében a kitanítás részének tekintjük. Az IFN lehet továbbá emlősforrásból származó extraktum is, például humán, kérődző állatból származó vagy marhaeredetű α-IFN. IFN-ként különösen az IFNa-2b-t részesítjük előnyben, amely a Schering Corp. (Kenilworth, NJ) cég rekombinánsan termeltetett terméke.
Az „interferon” vagy „IFN” kifejezés a leírásban nagymértékben homológ, fajspecifikus fehérjék családját jelenti, amelyek vírusreplikációt és celluláris proliferációt képesek gátolni, és immunválaszt képesek modulálni. Humán interferonok három osztályba csoportosíthatók celluláris eredetük és antigenitásuk alapján: α-interferon (leukociták), β-interferon (fibroblasztok) és γ-interferon (B-sejtek). Az egyes csoportok rekombináns formáit is kifejlesztették, és a kereskedelemben rendelkezésre állnak. Az egyes csoportok antigenikus/strukturális tulajdonságok alapján oszthatók fel altípusokra. Legalább 24-féle (A-tól H-ig terjedő altípusokba csoportosítva), különböző aminosavszekvenciákkal rendelkező alfa-interferont azonosítottak ezen peptideket kódoló DNS izolálásával és szekvenálásával. Lásd még Viscomi, Biotherapy 10, 59-86 (1996), melynek tartalmát a kitanítás részének tekintjük. Az „a-interferon”, „alfa-interferon”, „interferon-alfa” és „humán leukocitainterferon” kifejezések a leírásban egymással felcserélhetők ezen csoport tagjainak leírása céljából. A találmány szerinti megoldásban egyaránt alkalmazható a természetesen előforduló, valamint a rekombináns α-interferon, beleértve a konszenzusinterferont, amelyet leírtak például az USP 4,897,471 számú szabadalmi iratban, melynek tartalmát a kitanítás részének tekintjük, és alkalmazhatjuk a találmány szerinti megoldásban.
Teljes vér álhártyás (buffy coat) frakciójából izolált, humán leukocitákból származó interferon-alfa tisztítását leírták az USP 4,503,035 számú szabadalmi iratban. Az így preparált humán leukocitainterferon különböző aminosavszekvenciákkal rendelkező, humán leukocitákból származó interferonkeveréket tartalmazott. Tisztított, természetes humán interferonokat és ezek keverékeit alkalmazhatjuk a találmány szerinti megoldásban, ilyenek például: Sumiferon® interferon-alfa-n1, amely a Sumitomo cégtől (Japán) származik, Wellferon® interferon-alfa-n1 (Ins), amely a Glaxo-Wellcome Ltd. cégtől (London, Nagy-Britannia) származik, és Alferon® interferon-alfa-n3, amely a Purdue Frederick Co. cégtől (Norwalk, CT) származik.
A rekombináns-DNS-technológia megjelenése és interferontermelésre való alkalmazása lehetővé tette számos humán interferon sikeres szintézisét, ezáltal megvalósíthatóvá vált különböző interferonok nagy mennyiségű fermentációja, termelése, izolálása és tisztítása homogenitásig. Rekombinánsan termeltetett interferonok megtartották in vitro és in vivő antivirális és immunmodulátor-aktivitásaikat. Az is nyilvánvaló, hogy a rekombinánstechnikák glikozilációs helyet is létrehozhatnak, ugyanis rekombináns eredetű polipeptidhez képesek szénhidrátcsoportot hozzáadni.
Humán leukocitából származó interferon legalább egy részletét kódoló szekvenciát tartalmazó rekombináns-DNS-plazmidok előállítását, és humán leukocitából származó interferon immunológiai és biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid E. coliban való expresszálását leírták az USP 4,530,901 és EP 0 032 134 számú szabadalmi iratokban. Különböző altípus-szekvenciák kombinációit tartalmazó, hibrid a-interferon-konstrukciókat (például A és D, A és B, A és F) leírtak az USP 4,414,150, 4,456,748 és 4,678,751 számú szabadalmi iratokban. A találmány szerinti megoldásban tipikusan alkalmas, rekombináns a-interferonok például interferon-alfa-2b, például lntron®A a Schering Corporation cégtől (Kenilworth, N. J.), interferon-alfaja, például Roferon®A a Hoffmann-La Roche cégtől (Nutley, N. J.) és Infergen™ az Amgen cégtől (Thousand Oaks, CA).
HU 224 696 Β1
A találmány egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint, kívánt esetben, idegen, nem teljesen autológ α-IFN-t is alkalmazhatunk. Azonban az fontos, hogy a nem autológ α-IFN rendelkezzen elegendő biológiai aktivitással vagy α-IFN-hatással, például antivirális aktivitással a célemlősben. Más anyagokat, például α-IFN-frakciókat vagy polipeptidek előalakjait is beépíthetjük a találmány szerinti konjugátumokba. A leírásban az „α-IFN-hatás emlősökben” kifejezés a-IFN-re megfigyelteknek megfelelő, in vivő aktivitást jelent. Ezeket az anyagokat szakember által ismert technikákkal lehet előállítani, például szövettenyészetek extrakciójával állati forrásból vagy rekombináns-DNS-módszerekkel. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott α-IFN és rokon szerkezetű anyagok származhatnak transzgenikus forrásokból. Ilyen anyagokhoz transzgenikus állatokból juthatunk, azaz olyan egerekből, sertésekből, tehenekből stb., amelyekben α-IFN-fehérje expresszálódik tejben, vérben vagy más szövetekben. A találmány szerinti konjugátumok előállítására alkalmazott α-IFN preparálására szolgáló eljárások nem korlátozódnak az itt leírtakra. A találmány szerinti célokra az α-IFN-eket részesítjük előnyben, biokémiai és szerológiai tulajdonságaik miatt. Főleg az α-IFN rendelkezik dokumentált antivirális tulajdonságokkal, és sokkal hatékonyabban diffundál a véráramba, mint a többi interferon.
2. Nem antigenikus polimerek
Ha IFN-t polimerekhez, például poli(alkilén-oxid)okhoz kívánunk konjugálni, a polimer egyik hidroxilvégcsoportját reaktív funkciós csoporttá konvertáljuk, amely lehetővé teszi a konjugációt. Ezt az eljárást gyakran „aktiválás”-nak hívják, és a terméket „aktivált” polimernek vagy aktivált poli(alkilén-oxid)-nak. Más, lényegében nem antigenikus polimereket hasonlóan „aktiválunk” vagy funkcionalizálunk.
Az aktivált polimerek α-IFN-nel úgy reagálnak, hogy a kapcsolódás a lizinek ε-aminocsoportjainál, az N-terminális aminocsoportoknál, és a lentebb leírtak szerint hisztidinek aminocsoportjainál következik be. Kívánt esetben, ha jelen vannak, szabad karbonsavcsoportok, alkalmasan aktivált karbonilcsoportok, oxidált szénhidrátcsoportok és merkaptocsoportok is felhasználhatók további kapcsolódási helyként.
A találmány egy előnyös vonatkozásában uretán(karbamát-) kötések is kialakíthatók az α-IFN egyik aminosava (azaz lizin, hisztidin, N-terminális) és az aktivált polimer között. Az uretánkötést előnyösen terminális oxi-karbonil-oxi-N-dikarboximid-csoport, például szukcinimidil-karbonát-csoport alkalmazásával alakítjuk ki. Alternatív aktiválócsoport lehet például N-szukcinimid, N-ftálimid, N-glutárimid, N-tetrahidroftálimid és N-norborén-2,3-dikarboxid. Ezeket az uretánt kialakítani képes csoportokat leírtuk az USP 5.122.614 számú szabadalmi iratban, melynek tartalmát a kitanítás részének tekintjük. Ebben a leírásban ismertetjük polilakilén-oxidok N-szukcinimid-karbonát-származékainak előállítását is, amelyek szintén képesek uretánkötéseket kialakítani lizin-aminocsoport célpontokkal.
A lényegében nem antigenikus polimerek közül monoaktivált, alkoxiterminálissal rendelkező poli(alkilén-oxid)-okat (PAO-k), például monometoxiterminálissal rendelkező polietilénglikolokat (mPEG-eket) részesítünk előnyben; biszaktivált poli(etilén-oxid)-okat (glikolokat) is alkalmazhatunk IFN-ek keresztkötésére vagy lehetőséget biztosítva más csoportok, például célba juttató ágensek kapcsolására a polimer-a-IFN konjugátum egy adott területre, például májba való lokalizálása céljából.
Alkalmas polimerek lényegében tömeg szerint változhatnak. Rendszerint olyan molekulaszámmal rendelkező konjugátumokat választunk ki a találmány szerinti célokra, amelyek körülbelül 200 és körülbelül 35 000 közötti tartományba eső átlagos molekulatömegűek. Körülbelül 1000 és körülbelül 15 000 közötti molekulatömeg előnyös, és körülbelül 2000 és körülbelül 12 500 közötti molekulatömeg különösen előnyös.
A találmány szerinti megoldásban alkalmazott polimer anyagok előnyösen vízben is oldhatók szobahőmérsékleten. Ilyen polimerek például poli(alkilén-oxid)homopolimerek, például polietilénglikol (PEG) vagy polipropilénglikolok, polioxietilénezett poliolok, ezek kopolimerjei, valamint ezek blokk-kopolimerjei, feltéve, hogy a blokk-kopolimerek vízoldhatósága fenntartható. Az mPEG-en kívül 1-4 szénatomos, alkilterminált polimerek is alkalmazhatók.
A PAO-alapú polimerekkel párhuzamosan, hatásosan nem antigenikus anyagok, például dextrán, poli(vinil-pirrolidon)-ok, poliakrilamidok, például (hidroxi-propil)-metakril-amidok (HPMA), poli(vinil-alkohol)-ok, szénhidrátalapú polimerek, az előzőek kopolimerjei és hasonlók is alkalmazhatók. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentebb felsorolt lista szemléltetés célját szolgálja, és minden olyan polimer anyag szóba jöhet a találmány szerinti alkalmazásban, amely a fentebb leírtakkal azonos minőséggel rendelkezik. A leírásban „lényegében vagy hatásosan nem antigenikus” kifejezés szakember számára bármilyen olyan anyagot jelenthet, amely nem toxikus és nem kelt immunválaszt emlősökben.
3. Reakciókörülmények
A konjugációs reakciókat, melyeket néha PEGilálási reakcióknak is hívunk, oldatban végezzük, tekintet nélkül arra, hogy a polimer hol kapcsolódik a fehérjéhez. Ilyen technikákat rendszerint enyhén alkalikus pH-η, azaz pH 7,0 fölött körülbelül 9-ig végzünk α-IFN-ek konjugálására. Azonban a találmány szerinti megoldás kulcsa az, hogy az IFN biológiai aktivitásának megtartása úgy maximalizálható, ha a polimer hisztidinhez kapcsolódik, előnyösen az IFNa-2b-n lévő His34-hez. Szakember számára nyilvánvaló, hogy bár a különböző α-IFN-fajtákban lehet hisztidin a 34. helyzetben vagy nem, az interferonkonjugátumok előnyösen legalább néhány olyan pozicionális izomert tartalmaznak, amelyekben a polimer egy rendelkezésre álló hisztidinhez kapcsolódik.
A találmány szerinti eljárásban alfa-interferont tartalmazó oldatot reagáltatunk oxi-karbonil-N-dikarboxi4
HU 224 696 Β1 mid-aktivált polimerrel, például szukcinimidil-karbonátaktivált PEG-gel olyan pH-η, amely megfelelő ahhoz, hogy elősegítse a polimer szál legalább egy részének kovalens kapcsolódását az egyedi interferonmolekulák hisztidinjéhez, például IFNa-2b-n a His34-hez. A pH előnyösen kissé savas, azaz körülbelül 7,0-nél kevesebb; előnyösebben körülbelül 6,8-nél kevesebb, és legelőnyösebben körülbelül 4,5 és körülbelül 6,8 közötti tartományban van.
A konjugálást előidéző reakciókörülmények továbbá olyanok, hogy a kapcsolási reakcióban az aktivált polimert körülbelül ekvimoláristól körülbelül viszonylag kis moláris feleslegig alkalmazzuk az alfa-interferonhoz viszonyítva. Ebben a vonatkozásban, olyan eljárást végzünk, amelyben körülbelül 1-8-szoros moláris felesleget; előnyösen körülbelül 1,5-7-szeres moláris felesleget és legelőnyösebben körülbelül 1,75-5-szörös moláris felesleget alkalmazunk. A konjugációs reakciót körülbelül szobahőmérsékleten, 20-25 °C-on végezhetjük. Szintén előnyös, ha a kapcsolási reakciót inkább rövid ideig, azaz 1-2 óra hosszáig hagyjuk lefolyni a reakció megszakításáig (kvencselésig). A gyakorlatban ilyen körülmények között polimer-IFN pozicionális izomerek keverékéhez jutunk. Valamennyi izomer előnyösen egyetlen polimer szálat tartalmaz az interferonhoz kapcsolva aminosavon keresztül. A találmány egy alternatív előnyös megvalósítási módja szerint egynél több polimer szál is kapcsolódhat az eljárás eredményeként. Ilyen konjugátumokat tartalmazó oldatok, úgy, ahogy vannak, alkalmasak további feldolgozásra, a konjugátumok molekulatömeg alapján történő elválasztására.
Az előnyös egy polimer szál/IFN konjugátumok (izomerek) kationcserélő kromatográfiás jellemzése elkülönülő csúcsokba való szétválasztás esetén azt mutatta, hogy a polimer körülbelül nyolc különböző helyen kapcsolódhat az IFNa-2b-molekulához. Ezek a helyek egyedi pozicionális izomereknek felelnek meg: Cys1, Lys31, His34, Lys49, Lys83, Lys121, Lys131, Lys134. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint monopolimer-IFN konjugátumokat tartalmazó, egyesített reakciókeverékek viszonylag magasabb arányban tartalmaznak His34 pozicionális izomert, ami körülbelül 30-60%, Cys1 pozicionális izomer körülbelül 7-20% és Lys121 pozicionális izomer körülbelül 7-15%, a maradék rész tartalmazza a többi pozicionális izomert. Nyilvánvaló, hogy alternatív IFN-ek pozicionális izomerek alternatív megoszlását fogják adni, a kiindulási anyag aminosavszekvenciájától függően.
Az oldatban végzett konjugálás! reakciók természete következtében a készítmények termékfajták heterogén keverékéből állnak, amelyben a polimer szál(ak) különböző helyeken kapcsolódik(nak) az interferonmolekulához. A konjugátumokat tartalmazó bármilyen oldatban valószínű, hogy legalább körülbelül 3, előnyösen körülbelül 6 és előnyösebben körülbelül 8 pozicionális izomerből álló keverék van jelen. Például ha IFNa2b-t alkalmazunk, az oldat olyan konjugátumizomereket tartalmaz, amelyben a polimer egy vagy több Cys1-hez, Lys31-hez, His34-hez, Lys49-hez,
Lys83-hoz, Lys121-hez, Lys131-hez vagy Lys134-hez kapcsolódik az interferonon. IFNa2b és a leírás szerinti aktivált polimerek előnyös formái esetén, a 3 leggyakoribb kapcsolódási pont: His34 (55%), Cys1 (15%) és
Lys121 (15%).
A találmány szerinti előnyös készítmény IFN-polimer-izomerek keveréke, amely legalább körülbelül 15% His-nél szubsztituált polimer-IFN-ből áll. A konjugátumok legalább körülbelül 15%-a tartalmaz az alfa-interferonban lévő His és a lényegében nem antigenikus polimer közötti kovalens kapcsolatot. A találmány egy előnyösebb vonatkozásában a konjugátumok legalább körülbelül 30%-a, és a találmány legelőnyösebb vonatkozásában legalább körülbelül 40%-a tartalmaz His34-polimer kovalens kapcsolatot. Ha az IFNa2b-t vagy rokon szerkezetű IFN-eket alkalmazunk, a hisztidin kapcsolódási hely előnyösen His34.
4. A reakció pH-hatása PEG-IFN pozicionális izomerek megoszlására
A találmány szerinti eljárás annak a felismerésnek az előnyét hasznosítja, hogy a polimer kapcsolódási helye az interferonon nagymértékben befolyásolható a reakciórendszer pH-jával. Ahogyan a reakcióoldat pH-ját változtatjuk, a funkcionális csoportok, például alfa-aminok, imidazolok és epszilon-aminok reaktivitása az aktivált polimerek különböző speciális formái felé megváltozik. Polimerkonjugálási reakciókat tipikusan bázikus pH-η végzünk a lizin epszilon-aminocsoportjainál való kapcsolódás maximalizálása céljából. Például Zalipsky és munkatársai [Biotech. & App. Biochem. 15, 100-114 (1992)] elemezték az SC-PEG-reagenst PEGilálásra, és leírták, hogy az optimális reaktivitás körülbelül pH 9,3-nél van. A találmány szerinti eljárásban azonban alacsonyabb pH-kon végezzük a reakciót abból a célból, hogy lehetővé tegyük, hogy az aktivált polimer szálak hisztidin-aminocsoportokhoz kapcsolódjanak, és a lizinhelyeken való kapcsolódást kedvezőtlenebb helyzetbe hozzuk, de ne elimináljuk.
Továbbá azt találtuk, hogy a különböző polimerkonjugátumok pozicionális izomerjeinek biológiai aktivitása meglepő módon eltérő, még akkor is, ha minden egyes pozicionális izomer ugyanolyan mértékben van polimerszubsztituálva.
A leírás szerinti eljárás új polimerkapcsolási lehetőséget nyújt, például PEG kapcsolására IFN-molekulákban lévő, konkrét hisztidinekhez. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint a konjugálás! reakció számottevő mennyiségű, azaz legalább körülbelül 30% olyan konjugátumot eredményez, amelyben a kötődés IFN-hisztidineknél jön létre, például His34-nél az IFNa-2b-n.
Meghatároztuk, hogy meglepő módon a pozicionális izomerek relatív megoszlása nagymértékben függ attól a pH-tól, amelyen a konjugációs reakciót végezzük. Ha a pH bázikusról eltolódik enyhén savas pH felé (5,5-6,5), ez az IFNa-2b-n lévő His34-nél kapcsolódó konjugátumok keletkezését hozza kedvező helyzetbe, és kisebb mértékben az N-terminálisnál (Cys1) kapcsolódó konjugátumok keletkezését. Másrészt, pH
HU 224 696 Β1
8-10 alkalmazása a konjugálás! reakcióban lizinnél kialakuló kapcsolódási helyeknek kedvez, melyet kationcserélő kromatográfiával igazoltunk. Olyan helyzetekben, ahol IFNct-2b nem szerepel, a His34 természetesen nem mindig lehet jelen. A reakciókörülmények azonban lehetővé teszik az aktivált polimer kovalens kapcsolódását His-hez. Tehát kimutattuk, hogy a reakciórendszer pH-ja befolyásolja néhány aktíváit polimertípus kapcsolódási helyét a fehérje felszínén, különösen a különböző aminosavak vonatkozásában (azaz lizin, vagy N-terminális vagy hisztidin).
5. Konjugátumok frakcionálása
Bár a találmány szerinti eljárás alkalmazásával olyan konjugátumokat lehet előállítani, amelyek jelentős része egyetlen polimer szállal rendelkezik, de különböző mértékben poli(alkilén-oxid)-szubsztitúcióval rendelkező konjugátumok is keletkeznek. Maradék, nem konjugált PAO és α-IFN is jelen lehet. Ez a keverék tipikusan foszfát-, klorid- vagy bikarbonátanionok egyikét tartalmazó reakciópufferben van. A PAO-ot, α-IFN-t és konjugátumkeveréket előnyösen körülbelül 1-10 mg/ml ΡΑΟ-α-IFN konjugátumot tartalmazó pufferoldatban frakcionáljuk. Alkalmas frakcionálóoldatok pH-ja körülbelül 7,0 és körülbelül 9,0 között van, előnyösen körülbelül 7,5 és körülbelül 8,5 között van. Az oldatok előnyösen egy vagy több puffersót tartalmaznak az alábbiak közül: KCI, NaCI, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, (NH4)2CO3 vagy glicin-NaOH. Előnyösen foszfátpuffereket alkalmazunk.
A reakciópuffertől függően az oldatot tartalmazó α-IFN-polimer konjugátumot először puffercserének/ultraszűrésnek vetjük alá. Például az a-IFNkonjugátum-oldatokat alacsony molekulatömegnél kizáró membránon („cut-off”: 10 000-30 000) keresztül lehet ultraszűrni, amely eltávolítja a legtöbb felületaktív anyagot is, ha jelen van.
A konjugátumok kívánt fajtába való frakcionálását előnyösen anioncserélő közeg alkalmazásával végezzük. Ilyen közeg képes szelektíven kötni az 1^4 polimer szállal rendelkező IFN-konjugátumokat, a feleslegben maradt polimert és a módosítatlan IFN-t. Azért történik frakcionálódás, mert a különböző mértékben szubsztituált α-IFN-molekulák izoelektromos pontja valamennyire előre jelezhető módon változik. Például az α-IFN izoelektromos pontját a fehérje felszínén rendelkezésre álló aminocsoportok száma alapján lehet meghatározni. Ezek az aminocsoportok szolgálnak a poli(alkilén-oxid)-konjugátumok kapcsolódási pontjaiként is. Ennélfogva, mivel a poli(alkilén-oxid)-szubsztitúció mértéke növekszik, az izoelektromos pont csökken, és gyengül a konjugátum kötődési képessége az anioncserélő gyantához.
Erősen poláros anioncserélő gyanták alkalmazása különösen előnyös a találmány szerinti eljárásban. Erre a célra kvaterner aminnal burkolt anioncserélő gyantákat alkalmaznak. A kvaterner amingyanta burkolva lehet polimer vagy szilikagél mátrixra; azonban polimer mátrixokat részesítünk előnyben. Számos tetrametil-amin vagy kvaterner metil-amin, anioncserélő gyanta áll rendelkezésre a kereskedelemben, hordozómátrixra burkolva. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható, kereskedelemben rendelkezésre álló, kvaterner anioncserélő gyanta például Q-HD a Bio-Sepra cégtől; QA TRISACRYL® és QMA-SPHEROSIL®, kvaterner amingyanták polimer mátrixra burkolva, melyet az IBF cég (Garenne, Franciaország) gyárt a Sepracor, Inc. cég részére (Marlborough, Massachusetts); TMAE650M®, amely tetrametil-amino-etil-gyanta polimer mátrixra burkolva, melyet az EM-Separators cég (Gibbstown, New Jersey) gyárt; QAE550C® és SUPERQC®, mindegyik kvaterner amingyanta polimer mátrixra burkolva, és gyártja a TosoHaas cég (Montgomeryville, PA). Szintén alkalmazható: QMA Accell, melyet a Millipore cég (Millford, MA) gyárt, PEl-gyanták, melyeket a JT Baker (Phillipsburg, NJ) gyárt.
Az anioncserélő gyantát oszlopba töltjük, és szokásos eszközökkel ekvilibráljuk. A konjugált a-IFN-oldattal megegyező pH-jú és ozmolalitású puffért alkalmazunk. Azután a konjugátumot tartalmazó oldatot adszorbeáljuk az oszlopra. A felvitel befejezése után az elúciós pufferben kialakított gradiensáramlást viszünk az oszlopra növekvő sókoncentrációval, a-IFN-poli(alkilén-oxid) konjugátumot tartalmazó, kívánt frakciók eluálása céljából. A frakciók lényegében azonos molekulatömeggel és szubsztitúciós fokkal rendelkeznek.
Az IFN-konjugátumot tartalmazó frakciók előnyösen 1-4 polimer szálat tartalmaznak a-IFN-molekulánként. Előnyösebben a frakció körülbelül 1 -2, és legelőnyösebben körülbelül 1 polimer szálat tartalmaz α-IFN-molekulánként. Az elúciós puffer előnyösen egy vagy több puffersót tartalmaz az alábbiak közül: KCI, NaCI, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 vagy (NH4)2CO3. Ezek a frakciók lényegében mentesek más konjugátumoktól. Azután bármilyen nem konjugált anyagot lemosunk az oszlopról, szokásos technikák alkalmazásával.
Több izokratikus lépésből álló, növekvő koncentrációt is alkalmazhatunk. Több izokratikus lépésből álló, növekvő koncentráció alkalmazása α-IFN-polimer konjugátumok fokozatos, egymás utáni elúcióját eredményezi. A polimer konjugációs foka az egyes frakciókban lényegében azonos. Viszont a polimer konjugációs foka az egyes frakciókban csökken az elúciós idővel. A konjugátumok ioncserés tisztítását el lehet végezni például a Sepracor, Inc. cégtől származó Q-HD-oszloppal, híg nátrium-foszfát-oldattal (10 mM NaPO4-ion). A mintát NaPO4-tal mossuk, bármilyen nem reagált PAO eltávolítása céljából, és azután egylépéses NaCIgradiens-elúciót alkalmazunk. A 10 mM NaCI-os elúcióval olyan frakciókhoz jutunk, amelyekben a konjugátumok 3 PAO-polimer szálnál többet tartalmaznak egy IFN-re vonatkoztatva; 50 mM NaCI-os elúcióval 1-2 szálat tartalmazó konjugátumokhoz jutunk; 150 mM NaCI-os elúcióval módosítatlan IFN-hez jutunk.
Az elúciót körülbelül 4 °C és körülbelül 25 °C közötti hőmérséklet-tartományban végezzük. Az elúciót előnyösen körülbelül 6 °C és körülbelül 22 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A ΡΑΟ-α-IFN frakció elúcióját
HU 224 696 Β1
UV-abszorbanciával detektáljuk 254 nm-en. A frakciókat egyszerű időprofilok alapján gyüjthetjük. Az előnyös frakciókat az elúciós pufferben egyesíthetjük.
6. Felületaktív anyagok
A találmány szerinti megoldás egy másik vonatkozásában olyan reakciókörülményeket alkalmazunk, amelyben felületaktív anyag van jelen. A találmány szerinti megoldásban alkalmazott felületaktív anyagok ionos típusú ágensek. Különösen előnyös ágens a nátrium-dodecil-szulfát (SDS). Más ionos felületaktív anyagokat is alkalmazhatunk, például lítium-dodecil-szulfátot, kvaterner ammóniumvegyületeket, taurokólsavat, kaprilsavat, dekánszulfonsavat stb. Nemionos felületaktív anyagokat is alkalmazhatunk. Például polioxi-etilén-szorbitánokat (Tween), polioxi-etilén-étereket (Triton) alkalmazhatunk. Lásd még Neugebauer, ,A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry” (1992), Calbiochem Corp. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott felületaktív anyag típusának csak az szab határt, hogy ne okozza az IFN lényegi denaturációját, és ne gátolja teljesen a polimerkonjugálást. A reakciókeverékben jelen lévő felületaktív anyagok mennyisége körülbelül 0,01-0,5%; előnyösen 0,05-0,5%; és legelőnyösebben körülbelül 0,075-0,25%. Felületaktív anyagok keverékét is alkalmazhatjuk.
7. Farmakokinetikai paraméterek
A fentebb tárgyaltak szerint a találmány szerinti készítmények polimer-IFN-fajták heterogén keverékét tartalmazzák, amelyben a polimer szál(ak) az interferonmolekula különböző helyeihez van(nak) kapcsolva. A konjugátumok heterogén természete ellenére a készítmények előre látható in vivő farmakokinetikai profillal rendelkeznek, amely maximalizálja az interferon terápiás hatását.
A találmány szerinti, IFNa-t tartalmazó készítmények legalább körülbelül 15% polimer-His konjugátumot tartalmaznak, előnyösebben legalább körülbelül 30%, és legelőnyösebben legalább körülbelül 40% polimer-His konjugátumot tartalmaznak. Anélkül, hogy bármilyen elmélethez ragaszkodnánk, feltételezzük, hogy a találmány szerinti készítményekben lévő His-pozicionális izomerek kötése viszonylag labilis a Lys-pozicionális izomerekkel szemben. Ennek eredményeként, fiziológiás pH-η a készítmények beadás után viszonylag zökkenőmentesen válnak aktívvá, valamint a hatás időtartama meghosszabbodik. Ez a profil lehetővé teszi szakember számára, hogy a készítményt ritkább dózisokban adagolja, mint a módosítatlan IFN-eket.
8. Kezelési eljárások
A találmány szerinti IFN-konjugátumokat hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények különböző orvosi állapotok kezelésére alkalmazhatók emlősökben, előnyösen emberekben. Az ilyen kezelésre szoruló emlősnek olyan α-IFN-polimer konjugátum hatásos mennyiségét tartalmazó készítményt adunk be, amelyet a leírás szerint állítottunk elő. A konjugátumok alkalmasak, többek között, interferonra érzékeny állapotok vagy olyan állapotok kezelésére, amelyek pozitívan vagy kedvezően (orvosi területen jártas szakember által használt fogalmakkal kifejezve) válaszolnak interferonra alapuló terápiára.
A találmány szerinti készítményekkel kezelhető állapotok általában olyanok, amelyek interferon-alfával való kezelésre érzékenyek. Érzékeny állapotok például olyan állapotok, amelyek pozitívan vagy kedvezően (orvosi területen jártas szakember által használt fogalmakkal kifejezve) válaszolnak interferon-alfára alapuló terápiára. A találmány szerinti célokból interferon-alfa-terápiával kezelhető állapotok olyanok, amelyekben interferon-alfa-kezelés bizonyos hatékonyságot mutat, de amely nem kezelhető interferon-alfával, mert a negatív mellékhatások felülmúlják a kezelés jótékony hatásait. Például alfa-terápiát kísérő mellékhatások lényegében kizárják Epstein-Barr-vírus kezelését interferon-alfával. A találmány szerinti gyakorlati megoldás lényegileg csökkenti vagy eliminálja a mellékhatásokat, ha szokásos interferon-alfa-kezeléshez hasonlítjuk.
Interferonnal kezelhető állapotok például sejtproliferációs rendellenességek, különösen rák (például hajas sejtes leukémia, Kaposi-szarkóma, krónikus mielogén leukémia, myeloma multiplex, bazálsejtes karcinóma és malignus melanoma, petefészekrák, kután T-sejt-limfóma) és vírusfertőzések. Interferont lehet alkalmazni például olyan állapotok kezelésére, amelyekben interferonszenzitív vírusok replikációjának gátlása jótékony hatást fejt ki. A találmány szerint kezelhető vírusfertőzés például hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, más nonA/non-B hepatitis, herpeszvírus, Epstein-Barr-vírus (EBV), citomegalovírus (CMV), herpes simplex, 6. típusú humán herpeszvírus (HHV-6), papilloma, himlővírus, Picoma-vírus, adenovírus, rhinovírus, 1. és 2. típusú humán T-limfotropikus vírus (HTLV-1/-2), humán rotavírus, veszettség, retrovírusok, például humán immunhiányos tünetegyüttes vírusa (HÍV), encephalitis és respirációs vírusfertőzések. A találmány szerinti eljárást különböző immunválaszok módosítására is lehet alkalmazni.
Az alábbi interferon-alfa-variánsokat hagyták jelenleg jóvá az USA-ban és számos országban hajas sejtes leukémia, venereás szemölcsök, Kaposi-szarkóma és krónikus non-A/non-B hepatitis kezelésére: interferon-alfa-2b, melyet INTRON®A név alatt forgalmaznak (Schering Corporation, Kenilworth, N. J.), és interferon-alfa-2a, melyet Roferon®A név alatt forgalmaznak (Hoffmann-La Roche, Nutley, N. J ), és konszenzusinterferon, melyet Infergen™ (Amgen, Thousand Oaks, CA) név alatt forgalmaznak. Mivel valamennyi interferon közül krónikus hepatitis C-fertözés kezelésére az interferon-alfa-2b rendelkezik a leginkább széles körű jóváhagyással világszerte, a találmány szerinti megoldást legelőnyösebben krónikus hepatitis C kezelésére alkalmazzuk.
A leírt dózisok beadása történhet minden második nap, de előnyösen hetente egyszer vagy kétszer. A dózisokat rendszerint legalább 24 hétig adjuk, injekció formájában.
A dózis beadása történhet intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan vagy bármilyen más, elfogadható
HU 224 696 Β1 szisztémás módszerrel. A kezelőorvos megítélése szerint a beadott drog mennyisége, valamint az alkalmazott kezelési rend természetesen függ a kortól, nemtől és a páciens orvosi előéletétől, a neutrofil leukociták számától (például a neutropenia súlyosságától), a konkrét betegállapot súlyosságától és a páciens kezeléssel szembeni toleranciájától, melyet lokális toxicitás és szisztémás mellékhatások tesznek nyilvánvalóvá. A dózis mennyiségét és beadási gyakoriságát a neutrofil. leukociták számának kezdeti szűrésével lehet meghatározni.
Szokásos gyógyszerformákat is preparálhatunk a találmány szerinti konjugátumot tartalmazó készítmények felhasználásával. A formák az interferon-polimer konjugátum alkotórész terápiásán hatásos mennyiségét tartalmazzák gyógyászatilag elfogadható hordozókkal. Például adjuvánsokat, hígítószereket, tartósítószereket és/vagy szolubilizálószereket alkalmazhatunk szükséges esetben a találmány szerinti megoldásban. A találmány szerinti, interferont tartalmazó gyógyszerkészítmények tartalmazhatnak különböző hígított, adott pH-tartományt és ionerősséget biztosító puffereket (például Tris-HCI-ot, acetátot, foszfátot), hordozókat (például humán szérumalbumint), szolubilizálókat (például Tweent, poliszorbátot) és tartósítószereket (például timerozolt, benzil-alkoholt). Lásd például az USP 4.496.537 számú szabadalmi iratot.
A fentebb leírt állapotok kezelésére szolgáló, α-IFN-polimer konjugátum mennyisége a polimerkonjugátum IFN-aktivitására alapul. Ez akkora mennyiség, amely elegendő ahhoz, hogy szignifikánsan befolyásoljon egy pozitív klinikai választ. Bár a klinikai mennyiség okozhat bizonyos mértékű mellékhatásokat néhány páciensben, emlősszervezeteknek, például embereknek beadható maximális dózis az a legmagasabb dózis, amely nem okoz kezelhetetlen, klinikailag jelentős mellékhatásokat. A találmány szerinti alkalmazásokban, ilyen klinikailag jelentős mellékhatások olyanok, amelyek miatt félbe kell szakítani a terápiát súlyos influenzaszerű tünetek, központi idegrendszer depressziója, súlyos gasztrointesztinális rendellenességek, kopaszodás, súlyos bőrviszketés vagy bőrkiütés miatt. Lényegi abnormalitások fehérvérsejtekkel és/vagy vörösvértestekkel és/vagy májenzimekkel kapcsolatban, vagy anémiaszerű állapotok szintén korlátozzák a dózist.
Természetesen a különböző a-IFN-készítmények dózisai változhatnak az α-IFN-rész és a kiválasztott polimer rész arányától függően. Azonban általában a konjugátumot körülbelül 100 000 és körülbelül néhány millió IU/m2 közötti napi mennyiségben adjuk be, az emlősszervezet állapotától függően. A fentebb leírt tartomány szemléltetés célját szolgálja, és szakember képes meghatározni a kiválasztott konjugátum optimális dózisait, klinikai tapasztalat és kezelési indikációk alapján.
A gyógyszerkészítmények lehetnek oldat, szuszpenzió, tabletta, kapszula, liofilizált por vagy hasonlók formájában, melyeket szakember által jól ismert módszerek szerint lehet előállítani. A találmány szerint ilyen készítmények beadása főleg parenterális úton történik, bár orálisan vagy inhalálás útján is alkalmazhatjuk azokat, szakember igényeitől függően.
Példák
Az alábbi példák a találmány szerinti megoldás további megismertetését szolgálják, amelyekkel viszont semmilyen módon nem kívánjuk korlátozni a találmány által igényelt oltalmi kört.
1. példa ra-IFN-PEG5000 előállítása SDS (0,1%) jelenlétében
Ebben a példában rekombináns a-IFN-2b-t (Schering-Plough Corporation terméke, Kenilworth, New Jersey) konjugáltunk aktivált polietilénglikol-N-szukcinimid-karbonáttal (SC-PEG), az USP 5,122,614 számú szabadalmi iratban leírtak szerint. A polimer molekulatömege körülbelül 5000.
mg r IFN-t átdializáltunk 0,1 M nátrium-foszfátba (pH 7,5) Centricon-10 (Amicon Corporation terméke, Beverly, Mass.) alkalmazásával. Az r IFN végkoncentrációja körülbelül 3 mg/ml volt. Az r IFN-hez hozzáadtunk 0,1 ml, 10%-os SDS-t, és szobahőmérsékleten inkubáltuk 10 percig. Azután hozzáadtunk 42 mg SC-PEG5000-et a fehérje-SDS-oldathoz, és szobahőmérsékleten kevertettük két óra hosszáig, és azután glicinnel kvencseltük. Ezt követően a reakciókeveréket 10 mM nátrium-foszfátba (pH 8) dializáltuk, hogy a PEGilált IFN-t frakcionáljuk Centricon-30 alkalmazásával.
2. példa ra-IFN-PEG-,2 000 előállítása SDS (0,1%) jelenlétében
Ebben a példában megismételjük az 1. példában leírt lépéseket, kivéve azt, hogy körülbelül 12 000 molekulatömegű polietilénglikolt alkalmazunk. A reakciólépések pontosan ugyanazok voltak a PEG12000-konjugátum előállítására is.
3. példa
2-PEG5000ra-IFN frakcionálása
Ebben a példában az 1. példában leírtak szerint előállított konjugátumokat frakcionáltuk a kívánt 2-PEG5000-frakció előállítása céljából. A PEG-a-IFN-t nátrium-foszfát-pufferben felvittük QHD anioncserélő oszlopra. A 2-PEG-frakciót 10 mM foszfátpufferben (pH 8,0) futtatott, 0-400 mM nátrium-klorid-gradienssel eluáltuk. A 2-PEG-frakciót méretkizáráson alapuló kromatográfia és SDS-PAGE alkalmazásával igazoltuk.
4. példa
2-PEG120QQra-IFN frakcionálása
A 2. példában leírtak szerint előállított polimerkonjugátumot a 3. példában leírtak szerint frakcionáltuk, és ugyanúgy igazoltuk.
5-8. példák
Ezekben a példákban további PEG12 000ra-IFN-preparátumokat állítottunk elő a fentebb leírtak szerint, kivéve, hogy felületaktív anyagot nem alkalmaztunk. A konjugálás! reakciók után mintákat teszteltünk a megmaradt aktivitásra és a PEG-számra vonatkozóan. Az eredményeket bemutatjuk az alábbi 1. táblázatban.
HU 224 696 Β1
1. táblázat
IFN-PEG12000- preparátumok Aktivitás (CPE) a kontroll %-ában PEG#
6. példa 26 1,2
7. példa 26 1,3
8. példa 24 1,0
9. példa
Összehasonlító adatok
Ebben a példában a 3. példában leírtak szerinti (SDS-2-PEG5000ra-IFN), felületaktív anyag alkalmazása nélkül előállított terméket (2-PEG5000ra-IFN) és nem konjugált ra-IFN-t teszteltünk. Az aktivitást CPE vizsgálati eljárás alkalmazásával határoztuk meg úgy, hogy A549 jelű humán tüdőkarcinóma-sejteket fertőztünk EMV-vírussal. A keringésben töltött időt úgy határoztuk meg, hogy 1 millió egységet kapott, csoportonként 3 patkány véréből származó átlagértéket vettünk, 7 napos időszakba eső időpontokban.
2. táblázat
Aktivitás (%) Vírusvédelmi vizsg. eljárás IC50 (pg/ml) Keringési féléletidő a-fázis (órák)
A) IFN-SDS 2-PEG500o 69 2,2 5,8
B) IFN-PEG5000 30 4,0 6,8
C) IFN 100 1,5 0,17
Ezek az adatok világosan mutatják a találmány szerinti eljárás előnyeit. A megmaradt aktivitás kétszer nagyobb, mint abban az esetben, amelyben standardtechnikákat alkalmaztunk.
10. példa
Ebben a példában a különböző farmakokinetikai adatokhoz a fentebb leírt eljárások szerint előállított 2PEG-ra-IFN-konjugátumok alkalmazásával jutottunk. 5 Ezeket a mintákat módosítatlan IFN-hez hasonlítottuk, a 4. táblázatban bemutatott módszer szerint. A B mintát SDS-sel preparáltuk.
3. táblázat
Minta PEG mol.tömeg CPE-aktivitás (kontroll %-a)
A 5 000 35
B 5 000 69
C 12 000 26
D 12 000 26
Például:
4. táblázat
Farmakokinetikai eljárás
Állatok: Sprague Dawley (3 patkány/időpont)
Dózis: 10x106 UN IFN/patkány
Beadási mód: szubkután (SC.)
Drog: 2-PEG-IFNa, 5000 és 12 000 mol.tömegű PEG
Időpontok: 0 perc, 5 perc, 15 perc, 30 perc, óra, 2 óra, 4 óra, 8 óra, 24 óra, 48 óra, 5 nap és 7 nap, a drog beadását követően
Vizsg. élj.: CPE vizsgálati eljárás szérumminták alkalmazásával EMC-vírusban és A549 jelű humán tüdőkarcinómában
AUC= görbe alatti terület, Cmax, Τ1/2α, Τ1/2β jelentésük általában megegyezik a szakember által ismert jelentéssel.
5. és 6. táblázat
PEG-interferonokra kapott farmakokinetikai adatok összegzése
5. táblázat
Minta IC50 (pg/ml) %-os aktivitás AUC Cmax (lU/ml)
Natív IFNa 1,52 pg/ml(N=6) 100% 145 720 60 000
A 4,0 pg/ml (N=3) 35% 348 920 24 433
B 2,2±0,5 pg/ml (N=3) 69% 351 037 -
C 5,8±2,2 pg/ml (N=3) 26% 1 574 682 62 750
6. táblázat
Minta Tmax. (0^) T1/2 a-fázis (óra) T1/2 β-fázis (óra)
Natív IFNa 1 0,17 -
A 4 6,8 48
B 2-3 5,8 -
C 8 12,1 33
A fenti adatok alapján az alábbi következtetéseket vonjuk le:
2-PEG-ra-IFN-konjugátumok, az 5000 és 12 000 molekulatömegű PEG-gel preparáltak egyaránt jól érzékelhető előnnyel rendelkeznek a módosítatlan interferonnal szemben, emlősökben alkalmazva azokat. Abban az esetben, amikor a készítményeket szubkután adtuk be, a Tmax lényegi módon növekedett, ha a fehérjét körülbelül 2 PEG-gel konjugáltuk. Krónikus állapotokban, hosszabb Tmax -ok kívánatosak és lehetővé teszik
HU 224 696 Β1 az orvosok számára a klinikai gyakorlatban jelenleg alkalmazott beadási gyakorlat mellőzését a hatás meghosszabbodása és tartóssága következtében. Sőt, várakozáson felül kiderült, hogy 2-PEG12000-konjugátumok 10-szeresére képesek növelni az AUC-ot. A görbe alatti terület drámai növekedése nem volt arányos a hozzáadott polimer tömegével. Nyilvánvaló, hogy terápiás előnyöket lehet a gyakorlatban realizálni ezzel a váratlan növekedéssel.
11. példa pH hatása a PEGilálásra
Ezen hatás vizsgálata céljából megismételtük az 5-8. példák szerinti polimerkonjugálási reakciókat (PEGilálásokat) mPEG-|2 000 alkalmazásával (felületaktív anyag nélkül) 4 különböző pH-η: 5,4-en, 6,5-en, 8,0-en és 10,0-en. 2,6 gramm SC-PEG12Ooo θδ 1 gramm IFN arányt (3,9:1 moláris arányt) alkalmaztunk az 5,4, 6,5 és 8,0 pH-kon végzett reakciókban, míg 2,1 gramm SC-PEG-|2000 és 1 gramm IFN arányt (3,2:1 moláris arányt) alkalmaztunk a pH 10-en végzett reakciókban. A reakció végén hozzáadtunk glicint, a maradék PEGiláló reagens kvencselése céljából. Azután az egyes reakciókból származó termékeket tisztítottuk „Q-hyper D-gyanta alkalmazásával, pH 8,0-en, amelyben sótartalmú elúcióval távolítottuk el a nem reagált szennyeződéseket.
A különböző pH-kon kapott, tisztított konjugátumokat elemeztük biológiai aktivitásuk, hidroxil-amin-érzékenységük és a pozicionális izomerek megoszlása szerint. A biológiai aktivitást specifikus aktivitás (MTT-CPE vizsgálati eljárás) vizsgálatával határoztuk meg.
A hidroxil-amin-érzékenység annak meghatározására szolgált, hogy a konjugátumok hány százaléka volt PEGilálva hisztidineken, beleértve az IFN-His34-et. A hidroxil-amin egy ismert reagens, amelyről azt találták, hogy szelektíven képes PEG-et hasítani I FN-hisztidinekről. Az egyes mintákból vett aliquotokat (50 μΙ) hígítottuk 0,45 ml, 10 mM nátrium-foszfáttal (pH 7,0). Ebből a fehérjeoldatból vett aliquotot (150 μΙ) 150 μΙ 0,5 Μ hidroxil-aminnal elegyítettünk, és szobahőmérsékleten inkubáltunk 60 percig. Ezután 75 μΙ-t felvittünk Mini-S oszlopra (Pharmacia Biotech), kationcserélő kromatográfia céljából. Az ,A” mozgófázis 10 mM nátrium-acetát-puffert (pH 5,3) és 25% 2-propanolt tartalmazott. A „B” mozgófázis 500 mM nátrium-kloridot tartalmazott az „A” mozgófázisban feloldva. Az áramlási sebesség 0,5 ml/percre volt állítva, és az eluált fehérjét 214 nm-en detektáltuk. Az egyedi PEG-IFN-oldatokat 5% izopropil-alkoholt tartalmazó, 10 mM nátrium-acetáttal (pH 5,3) hígítottuk 1 mg/ml fehérjekoncentrációra. Az injektált térfogat 10-30 μΙ volt, a fehérjekoncentrációtól függően. Lineáris gradienst alkalmaztunk. Az eredményeket bemutatjuk lentebb, a 7. táblázatban és az 1. ábrán.
Az 1. ábrán egymásra helyeztük a Mono-S kationcserélő kromatográfiás oszlopról eluált, különböző pH-kon végzett reakciókból származó termékeknek megfelelő kromatogramokat. Az egyes pozicionális izomerek polimerkonjugációs helyét úgy határoztuk meg, hogy a kationcserélő kromatográfiából származó egyedi csúcsokat proteolitikus enzimek (tripszin, V8-proteáz, kimotripszin vagy szubtilizin) alkalmazásával emésztettük, izoláltuk a PEGilált fragmentumokat, és N-terminális szekvenálással és tömegspektrometriával analizáltuk azokat.
Az ábrán látható, hogy a pozicionális izomerek megoszlása szignifikánsan változik, ahogyan a reakció pH-ja változik. Minél magasabb a pH, annál kevesebb a His34-kapcsolt PEG-IFN, és kevésbé drámai módon, de kevesebb Cys-1-kapcsolt PEG-IFN keletkezett.
A 7. táblázatban összefoglaljuk a specifikus biológiai aktivitás eredményeit, amelyet MTT-CPE biológiai vizsgálati eljárással határoztunk meg IFN-re, valamint meghatároztuk a felszabadult IFN mennyiségét 0,5 M-os hidroxil-aminnal, 2 óra hosszáig, 25 °C-on végzett kezelés esetén, a különböző konjugátumtermékekre. Az eredmények megerősítik, hogy az 1. ábrán látható különbségek a termékek különböző biológiai jellemzőinek tulajdoníthatóak. Ha a konjugációt magasabb pH-η (azaz 8 vagy 10) végezzük, a keletkezett termékek kisebb mértékben bioaktívak és nagyobb mértékben rezisztensek hidroxil-aminra, amely ennélfogva azt jelenti, hogy magasabb pH-kon kevesebb polimer van His34-en.
7. táblázat
Különböző pH-kon előállított PEG-IFN-ek biológiai aktivitása és hidroxil-amin-érzékenysége
Reakció pH-ja Specifikus aktivitás (CPE vizsgálati élj.) MlU/mg Konjugátum %-a IFN-né konvertálva hidroxil-aminnal
5,4 81,8 56%
6,5 74,5 47%
8,0 33,3 8%
10,0 27,8 <1%
A fenti eredmények azt mutatják, hogy a pH kulcsfontosságú változó a konjugációs reakcióban, valamint azt, hogy a pozicionális izomerek relatív megoszlása drámaian változik a pH-val. Várakozáson felül, az eredményül kapott PEG-IFN pozicionális izomerkeverék biológiai aktivitása szintén befolyásolva van.
12. példa
Uretánkötést kialakító aktivált polimerek összehasonlítása
Ebben a példában összehasonlítottuk a pH hatását a reakciókörülményekre, különböző típusú uretánkötés képződése esetén annak vizsgálata céljából, hogy van-e az aktiválócsoportnak bármilyen szerepe a polimer kapcsolódási helyének meghatározásában és a biológiai aktivitásban. Aktivált polimerreagensként elsősorban a korábbi kísérletekben alkalmazott, metoxi-polietilénglikol-szukcinimidil-karbonátot (MW 12 000; SC-PEG12000) hasonlítottuk össze az USP 5.382.657 számú szabadalmi iratban leírt metoxi-polietilénglikol-2-piridil-karbonáttal
HU 224 696 Β1 (MW 12 000; PC-PEG12Ooo) interferon-alfa-2b (IFN) esetén. Konjugálás! reakciókat végeztünk mindkét reagenssel, SC-PEG12OOo-rel és PC-PEG12 ooo-rel pH 6,5-en és 10,0-en. A 4-monopegilált IFN-minták előállítására szolgáló körülmények az alábbiak voltak: 1. 5
SC-PEG-|2ooo és pH 6,5; 2. PC-PEG-|2ooo és pH 6,5; 3. SC-PEG12000 és pH 10,0; 4. PC-PEG^2qqo és pH 10,0. Azokban az esetekben, ahol a pH 6,5 volt, 3,9:1 PEGJFN moláris arányt alkalmaztunk. Ezeket a körülményeket választottuk mindkét reakció pH és linker esetén, a végtermék összetételére kifejtett hatás elemzéséhez.
Az egyes reakciókörülmények alkalmazásával kapott, konjugált anyagot kinyertük és teszteltük biológiai aktivitásra (CPE vizsgálati eljárás) és a pozicionális izomerek eloszlására Mini-S kromatográfiás vizsgálati eljárással.
IFN és PC-PEG12OOo pH 6,5-en való reagáltatásával előállított PEG-IFN alacsonyabb biológiai aktivitással rendelkezett, mint ugyanezt SC-PEG 12 000-rel végezve, annak ellenére, hogy mindkét reagens uretánkötéseket képes kialakítani. Tehát kimutattuk, hogy a kötések hasonlósága ellenére az SC-PEG (amely egy oxi-karbonil-oxi-N-dikarboximid-aktivált polimer) elő10 nyösebben képes His34-hez kapcsolódni. Azonban érdekes módon ha a reakciót PC-PEG12 οοο'ΓθΙ és SC-PEG12 ooo_r®' együtt végezzük pH 10-en, a keletkezett PEG-IFN-termékek hasonló aktivitással rendelkeznek. Azonban mindkét esetben az aktivitások alacsonyabbak voltak, mint SC-PEG12 000 alkalmazásával pH 6,5-en.
Mini-S kromatográfiás vizsgálati eljárásokkal kimutattuk, hogy a hisztidin-34-nél kapcsolt PEG-IGN a legjelentősebb jelen lévő pozicionális izomer, ha a reakciót pH 6,5-en végeztük PC-PEG12000-rel. pH 10-en a fő termék a lizin-121-nél kapcsolt PEG-IFN, bármelyik reagenst alkalmazva. Lásd a 8. táblázatot.
Tehát savas pH-t és oxi-karboníl-oxi-N-dikarboximid-aktivált polimert (azaz SC-PEG-et) alkalmazva olyan konjugátumokat lehet előállítani, amelyek egyedi termékek, és nem lehet azokat reprodukálni más uretánkötést kialakítani képes, aktivált polimer helyettesítésével, például PC-PEG-|2 ooo-rel az SC-PEG12Ooo helyett.
A fenti anyagok összesen 5%-nál kevesebb di-PEG- és multi-PEG-IFN-t tartalmaztak, méretkizáráson alapuló HPLC vizsgálati eljárás alkalmazásával kimutatva.
8. táblázat
Mini-S vizsgálati eljárás eredményeinek összegzése
Csúcsszám (terület%)
Minta 1 2 3 4 5 6 7 8
SC-PEG; pH 6,5 2,1 63 ND 0,7 11,8 5,6 3,4 13,3
PC-PEG; pH 6,5 ND 4,8 9 9,6 33,8 13 3,8 25,9
SC-PEG;pH 10 ND ND 14,8 11,2 57,6 9,5 3,1 3,8
PC-PEG;pH 10 ND ND 9,6 13,8 51,7 13,7 3,5 7,8
ND: nem detektált
Csúcsok jelölése: 2. csúcs: His34-kapcsolt PEG-IFN; 4. csúcs: Lys31-kapcsolt PEG-IFN; 5. csúcs: Lys121-kapcsolt PEG-IFN; 6. csúcs: Lys49-kapcsolt PEG-IFN; 7. csúcs: Lys83-kapcsolt PEG-IFN; 8. csúcs: N-terminális- (cisztein-) kapcsolt PEG-IFN.
13. példa
Jellemzés kationcserélő kromatográfiával Ebben a példában a 11. példában alkalmazott eljárással (pH 6,5) előállított PEG-IFN-termék néhány sarzsát analitikailag elválasztottuk kationcserélő kromatográfia alkalmazásával, a polimer kapcsolódási helyeinek meghatározása és az egyedi pozicionális izomerek azonosítása céljából. A kationcserélő Mini-S oszlop volt (Pharmacia Biotech). Az ,A” mozgófázis 10 mM nátrium-acetát-puffert (pH 5,3) és 25% 2-propanolt tartalmazott. A „B mozgófázis 500 mM nátrium-kloridot tartalmazott az „A” mozgófázisban feloldva. Az áramlási sebesség 0,5 ml/percre volt állítva, és az eluált fehérjét 214 nm-en detektáltuk. Az egyedi PEG-IFN-oldatokat 5% 2-propanolt tartalmazó, 10 mM nátrium-acetáttal (pH 5,3) hígítottuk 1 mg/ml fehérjekoncentrációra. Az injektált térfogat 10-30 μΙ volt, a fehérjekoncentrációtól függően. Az alábbi lineáris gradienst 45 alkalmaztuk:
I Idő (perc) A(%) B (%)
0 100 0
5 93 7
50 83 17
60 0 100
65 0 100
66 100 0
75 100 °
Az eredményeket bemutatjuk az alábbi 9. táblázat60 bán, és grafikusan a 2. ábrán szemléltetjük.
HU 224 696 Β1
9. táblázat
PEG-IFN-reakciókhoz tartozó, csúcs alatti terület meghatározása kationcserélő kromatográfiával
Sarzs száma 2. csúcs 3-4.csúcsok 5. csúcs 6. csúcs 7.a csúcs 7.b csúcs 8. csúcs
1 2,6 53,2 5,3 14,2 6,5 3,4 17,2
2 1,5 54,7 3,3 12,6 6,1 3,2 18,6
3 1,6 55,3 2,4 11,9 5,5 3,2 20,1
4 1,7 55,1 2,6 11,6 5,3 3,1 20,5
5 1,7 54,3 2,7 11,8 5,6 3,2 20,7
6 1,7 54,5 2,6 11,8 5,3 2,9 21,1
7 1,9 54,2 2,3 11,6 5,2 3,2 21,5
Főbb csúcsok jelölése: 2. csúcs: Lys134-kapcsolt PEG-IFN; 3/4. csúcs: His34-kapcsolt PEG-IFN; 6. csúcs: Lys121-kapcsolt PEG-IFN és Lys131-kapcsolt PEG-IFN; 8. csúcs: Cys1-kapcsolt PEG-IFN.
Az eredmények szemléltetik azokat az eredményeket, amelyek szerint a 3. és 4. csúcsban His34-kapcsolt PEG-IFN konjugátumokat találtunk. Az eredmények azt is mutatják, hogy a várakozással ellentétben, a konjugátumok többsége inkább a polimer és a hisztidin kapcsolódásával alakult ki, nem a lizin-aminocsoportok egyikével.
Szakember számára nyilvánvalóak a találmány más előnyös megvalósítási módjai a találmányi leírás vagy gyakorlati megvalósítása alapján. A találmányi leírással és a példákkal csak szemléltetni szándékozzuk az alábbi szabadalmi igénypontokban rögzített, pontosan igényelt oltalmi kört és találmányi gondolatot.

Claims (33)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Gyógyszerkészítmény, amely alfa-interferon és egy alkoxiterminális poli(alkilén-oxid) konjugátumai pozicionális izomereinek keverékét tartalmazza, amelyben a pozicionális izomerek legalább 15%-a olyan alfa-interferon, amely az alfa-interferon egy hisztidinmaradékánál alkoxiterminális poli(alkilén-oxid)-dal kovalensen konjugált.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az alfa-interferon interferon-alfa-2b.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a hisztidinmaradék a His34.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az alfa-interferon pozicionális izomereinek keveréke legalább 3 pozicionális izomert tartalmaz.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az alfa-interferon pozicionális izomereinek keveréke legalább 6 pozicionális izomert tartalmaz.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az alfa-interferon pozicionális izomereinek keveréke legalább 8 pozicionális izomert tartalmaz.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben az alfa-interferon alfa-interferon-2b, és a pozicionális izomerek a Cys1-et, Lys31-et, His34-et, Lys49-et, Lys83-at, Lys121-et, Lys131-et és Lys134-et tartalmazó csoportból kiválasztottak.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a poli(alkilén-oxid) egy polietilénglikol.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a poli(alkilén-oxid) egy monometoxi-polietilénglikol (mPEG).
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a polimer molekulatömege 200-tól 35 000-ig terjedő.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a polimer molekulatömege 1000-től 15 000-ig terjedő.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a polimer molekulatömege 2000-től 12 500-ig terjedő.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a polimer a polipropilénglikolt, dextránt, poli(vinil-pirrolidon)-okat, poliakrilamidokat, poli(vinil-alkohol)-okat és szénhidrátalapú polimereket tartalmazó csoportból kiválasztott.
  14. 14. Alfa-interferont tartalmazó készítmény, amely alfa-interferon és egy alkoxiterminális poli(alkilén-oxid) konjugátumai pozicionális izomereinek keverékét tartalmazza, amelyben a pozicionális izomerek legalább 15%-a olyan alfa-interferon, amely az alfa-interferon egy hisztidinmaradékánál alkoxiterminális poli(alkilénoxid)-dal kovalensen konjugált.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti készítmény, amelyben a készítmény alfa-interferon-része alfa-interferon-2b, a hisztidin pedig a His34.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti készítmény, amelyben a konjugátumok legalább 30%-a a polimer kovalens kötését az alfa-interferonban lévő hisztidin-34-nél tartalmazza.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti készítmény, amelyben a konjugátumok legalább 40%-a a polimer kovalens kötését az alfa-interferonban lévő hisztidin-34-nél tartalmazza.
  18. 18. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti gyógyszerkészítmény, amely alfa-interferon-2b-polimer pozicionális izomerek keverékét tartalmazza, amelyben a pozicionális izomerek 30-60%-a az alfa-interferonban lévő His34-hez konjugált polimer, a pozicionális izomerek 7-20%-a az alfa-interferonban
    HU 224 696 Β1 lévő Cys1-hez konjugált polimer, és a pozicionális izomerek 7-15%-a az alfa-interferonban lévő Lys121-hez konjugált polimer.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, amelyben a pozicionális izomerek körülbelül 55%-a az alfa-interferonban lévő His34-hez konjugált polimer, a pozicionális izomerek körülbelül 15%-a az alfa-interferonban lévő Cys1-hez konjugált polimer, és a pozicionális izomerek körülbelül 15%-a az alfa-interferonban lévő Lys121-hez konjugált polimer.
  20. 20. Eljárás alfa-interferon-konjugátumok előállítására, azzal jellemezve, hogy alfa-interferont egy moláris feleslegben levő oxi-karbonil-oxi-N-dikarboximiddel aktivált alkoxiterminális poli(alkilén-oxid)-dal reagáltatunk 7,0-nél alacsonyabb pH-nál alfa-interferon és alkoxiterminális poli(alkilén-oxid) konjugátumai pozicionális izomerei olyan keverékévé, amelyben a pozicionális izomerek legalább 15%-a olyan alfa-interferon, amely az alfa-interferon egy hisztidinmaradékánál alkoxiterminális poli(alkilén-oxid)-dal kovalensen konjugált.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oxi-karbonil-oxi-N-dikarboximidként szukcinimidil-karbonátot alkalmazunk.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 6,8-nél alacsonyabb pH-nál hajtjuk végre.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reakciót 4,5-től 6,8-ig terjedő pH-tartományban hajtjuk végre.
  24. 24. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1-től 8-szorosig terjedő moláris felesleget alkalmazunk.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1,5-től 7-szeresig terjedő moláris felesleget alkalmazunk.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 1,75-tól 5-szörösig terjedő moláris felesleget alkalmazunk.
  27. 27. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy poli(alkilén-oxid)-reagensként egy polietilénglikolt alkalmazunk.
  28. 28. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 200-tól 35 000-ig terjedő molekulatömegű poli(alkilén-oxid)-ot alkalmazunk.
  29. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10OO-től 15 000-ig terjedő molekulatömegű poli(alkilén-oxid)-ot alkalmazunk.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2000-től 12 500-ig terjedő molekulatömegű poli(alkilén-oxid)-ot alkalmazunk.
  31. 31. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy alfa-interferonként interferon-alfa-2b-t alkalmazunk.
  32. 32. Alfa-interferon és egy alkoxiterminális poli(alkilén-oxid) konjugátumai pozicionális izomerei olyan keverékének alkalmazása emlősökben alfa-interferonra érzékeny állapot kezelésére szolgáló, alfa-interferont tartalmazó gyógyszerkészítmény gyártására, amelyben a pozicionális izomerek legalább 15%-a olyan alfa-interferon, amely az alfa-interferon egy hisztidinmaradékánál egy alkoxiterminális poli(alkilén-oxid)-dal kovalensen konjugált.
  33. 33. A 20. igénypont szerinti eljárással előállítható polimer-interferon-konjugátum.
HU0101532A 1997-12-19 1998-12-16 Improved interferon polymer conjugates HU224696B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/994,622 US5951974A (en) 1993-11-10 1997-12-19 Interferon polymer conjugates
PCT/US1998/026677 WO1999032139A1 (en) 1997-12-19 1998-12-16 Improved interferon polymer conjugates

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0101532A2 HUP0101532A2 (hu) 2001-08-28
HUP0101532A3 HUP0101532A3 (en) 2004-08-30
HU224696B1 true HU224696B1 (en) 2006-01-30

Family

ID=25540857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0101532A HU224696B1 (en) 1997-12-19 1998-12-16 Improved interferon polymer conjugates

Country Status (23)

Country Link
US (2) US5951974A (hu)
EP (1) EP1039922B1 (hu)
JP (2) JP3747070B2 (hu)
KR (1) KR100607388B1 (hu)
AR (1) AR017435A1 (hu)
AT (1) ATE218883T1 (hu)
AU (1) AU739359B2 (hu)
CA (1) CA2268433C (hu)
CO (1) CO4870741A1 (hu)
DE (1) DE69806055T2 (hu)
DK (1) DK1039922T3 (hu)
ES (1) ES2178297T3 (hu)
HU (1) HU224696B1 (hu)
IL (2) IL136290A0 (hu)
MY (1) MY119581A (hu)
NZ (1) NZ504735A (hu)
PE (1) PE20000003A1 (hu)
PT (1) PT1039922E (hu)
SG (1) SG71179A1 (hu)
SI (1) SI1039922T1 (hu)
TW (1) TW570802B (hu)
WO (1) WO1999032139A1 (hu)
ZA (1) ZA9811590B (hu)

Families Citing this family (216)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
ES2297889T3 (es) * 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
US7270809B2 (en) * 1997-07-14 2007-09-18 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine variants of alpha interferon-2
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
IL142282A0 (en) 1998-10-16 2002-03-10 Biogen Inc Compositions containing polymer conjugates of interferon-beta-1a
ATE327254T1 (de) 1998-10-16 2006-06-15 Biogen Idec Inc Interferon-beta fusionsproteine und deren verwendungen
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
WO2000051631A2 (en) * 1999-03-02 2000-09-08 Schering Corporation Pegylated alpha interferon for hiv therapy
US6923966B2 (en) 1999-04-08 2005-08-02 Schering Corporation Melanoma therapy
US6362162B1 (en) 1999-04-08 2002-03-26 Schering Corporation CML Therapy
US6605273B2 (en) 1999-04-08 2003-08-12 Schering Corporation Renal cell carcinoma treatment
US6849254B1 (en) 1999-04-19 2005-02-01 Schering Corporation HCV combination therapy
EP1224939A4 (en) 1999-10-12 2005-01-12 Santen Pharmaceutical Co Ltd INTERFERON-BASED COMPLEX AND ITS USE IN MEDICINE
CN1309423C (zh) 1999-11-12 2007-04-11 马克西根控股公司 干扰素γ偶联物
HUP0203409A3 (en) 1999-11-12 2005-06-28 Maxygen Holdings Ltd Redwood C Interferon gamma conjugates
AU782580B2 (en) 2000-01-10 2005-08-11 Maxygen, Inc. G-CSF conjugates
DK1257295T3 (da) 2000-02-11 2009-08-10 Bayer Healthcare Llc Faktor VII eller VIIA-lignende molekyler
EP1263457A2 (en) * 2000-03-09 2002-12-11 Schering Corporation Hiv immune adjuvant therapy
KR100353392B1 (ko) * 2000-03-13 2002-09-18 선바이오(주) 높은 생체 활성도를 갖는 생체 활성 단백질과 ｐｅｇ의결합체 제조방법
US6476062B2 (en) 2000-03-30 2002-11-05 Schering Corporation Chemokine receptor antagonists
EP1335931B1 (en) * 2000-05-16 2005-12-21 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
AU2001280035A1 (en) * 2000-07-26 2002-02-05 Ramot University Authority For Applied Research And Industrial Development Ltd. Intracellular delivery system for protein phosphatases and other polypeptides
US7208167B2 (en) * 2000-08-07 2007-04-24 Sciclone Pharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis C with thymosin and peptide combination therapy
JP2004508338A (ja) * 2000-09-08 2004-03-18 グリフォン　セラピューティクス，インコーポレーテッド ポリマー修飾合成タンパク質
US7118737B2 (en) 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US7052686B2 (en) 2000-09-29 2006-05-30 Schering Corporation Pegylated interleukin-10
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
WO2002074806A2 (en) 2001-02-27 2002-09-26 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
US6958388B2 (en) 2001-04-06 2005-10-25 Maxygen, Aps Interferon gamma polypeptide variants
US7038015B2 (en) * 2001-04-06 2006-05-02 Maxygen Holdings, Ltd. Interferon gamma polypeptide variants
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
WO2003037915A1 (en) * 2001-10-31 2003-05-08 Biopolymed Inc. Biocompatible polymers including peptide spacer
KR100480429B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 인터페론-알파와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
KR100480430B1 (ko) * 2001-12-04 2005-04-06 선바이오(주) 인터페론-베타와 폴리에틸렌글리콜 유도체의 배합체
US20050095224A1 (en) * 2001-12-07 2005-05-05 Ramachandran Radhakrishnan Compositions and method for treating hepatitis virus infection
DK3025726T3 (da) 2002-01-18 2019-12-09 Biogen Ma Inc Polyalkylenpolymerforbindelser og anvendelser deraf
AU2003210052A1 (en) * 2002-03-20 2003-09-29 Biopolymed Inc. Preparation of g-csf stoichiometrically conjugated with biocompatible polymers at cystein residue
WO2003103475A2 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Dyax Corp. Prevention and reduction of blood loss
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
DK1517710T3 (da) 2002-06-21 2011-07-18 Novo Nordisk Healthcare Ag Pegylerede faktor VII-glycoformer
CN100348607C (zh) 2002-06-28 2007-11-14 埃迪尼克斯(开曼)有限公司 用于治疗黄病毒科病毒感染的2’和3’－核苷前药
EP1539814A2 (en) * 2002-07-03 2005-06-15 Maxygen Holdings Ltd. c/o Close Brothers (Cayman) Limited Full-length interferon gamma polypeptide variants
SI2386310T1 (sl) * 2002-08-28 2019-03-29 Dyax Corp. Metode za ohranjanje organov in tkiv
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) * 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
DE60307881T2 (de) * 2002-11-15 2007-03-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Positionelle isomeren von pegyliertem interferon alpha 2a
EP1628618A4 (en) * 2002-12-26 2009-09-09 Mountain View Pharmaceuticals POLYMER CONJUGATES OF CYTOKINES, CHEMOKINS, GROWTH FACTORS, POLYPEPTIDE HORMONES AND ANTAGONISTS THEREOF WITH PRESERVED RECEPTOR BINDING ACTIVITY
RS20050502A (en) 2002-12-26 2007-08-03 Mountain View Pharmaceuticals Inc., Polymer conjugates of interferon- beta with enhanced biological potency
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
US20050281778A1 (en) * 2003-03-28 2005-12-22 Myung-Ok Park Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
CA2530725A1 (en) * 2003-03-28 2004-10-07 Biopolymed Inc. Biologically active material conjugated with biocompatible polymer with 1:1 complex, preparation method thereof and pharmaceutical composition comprising the same
US20060134736A1 (en) * 2003-03-28 2006-06-22 Jacobs John W Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
ES2340494T3 (es) 2003-04-15 2010-06-04 Glaxosmithkline Llc Mutantes de sustitucion de il-18 humana y sus conjugados.
US20070172446A1 (en) 2003-05-16 2007-07-26 Intermune, Inc. Synthetic chemokine receptor ligands and methods of use thereof
PT1633766T (pt) 2003-05-30 2019-06-04 Gilead Pharmasset Llc Análogos de nucleósido fluorado modificado
EP1664326A2 (en) * 2003-07-31 2006-06-07 Anticancer, Inc. The use of plp with peg-rmetase in vivo for enhanced efficacy
EP1673387B1 (en) 2003-10-10 2010-09-15 Novo Nordisk A/S Il-21 derivatives
AP2287A (en) 2003-10-14 2011-10-31 Intermune Inc Macrocyclic carboxylic acids and acylsulfonamides as inhibitors of HCV replication.
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
US20050089952A1 (en) * 2003-10-22 2005-04-28 Akzo Nobel N.V. Apparatuses and processes for increasing protein PEGylation reaction yields
WO2005040758A2 (en) * 2003-10-24 2005-05-06 Intermune, Inc. Use of pirfenidone in therapeutic regimens
US20070258946A1 (en) * 2003-12-23 2007-11-08 Blatt Lawrence M Combination Therapy for Treating Hepatitis C Virus Infection
ES2720078T3 (es) * 2004-01-21 2019-07-17 Nektar Therapeutics Método para preparar polímeros terminados en ácido propiónico
CA2553040A1 (en) 2004-02-02 2005-08-18 Ambrx, Inc. Modified human four helical bundle polypeptides and their uses
WO2005084303A2 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Interferon-beta polymer conjugates
CN1984924B (zh) * 2004-03-17 2011-08-10 抗癌公司 提高蛋白质与聚乙二醇（peg）结合度的方法
EP1586334A1 (en) * 2004-04-15 2005-10-19 TRASTEC scpa G-CSF conjugates with peg
US20060018875A1 (en) * 2004-06-14 2006-01-26 Blatt Lawrence M Interferon compositions and methods of use thereof
US20050281872A1 (en) * 2004-06-16 2005-12-22 Peter Summerville Enhanced compliance antiviral medicaments and methods of manufacture and use
CN102603895B (zh) 2004-06-18 2016-09-28 Ambrx公司 新颖抗原结合多肽和其用途
UA103758C2 (ru) 2004-07-19 2013-11-25 Биокон Лимитед Конъюгаты олигомеров инсулина, их композиции и применение
EP1807451A2 (en) 2004-08-03 2007-07-18 Dyax Corporation Hk1-binding proteins
US7632491B2 (en) * 2004-08-12 2009-12-15 Schering Corporation Stable pegylated interferon formulation
WO2006031725A2 (en) 2004-09-14 2006-03-23 Pharmasset, Inc. Preparation of 2'­fluoro-2'- alkyl- substituted or other optionally substituted ribofuranosyl pyrimidines and purines and their derivatives
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2006073846A2 (en) 2004-12-22 2006-07-13 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
KR20070090023A (ko) 2004-12-22 2007-09-04 암브룩스, 인코포레이티드 변형 인간 성장 호르몬
NZ555386A (en) 2004-12-22 2011-01-28 Ambrx Inc Formulations of human growth hormone comprising a non-naturally encoded amino acid
KR101252835B1 (ko) 2004-12-22 2013-04-10 암브룩스, 인코포레이티드 아미노아실-ｔＲＮＡ 합성효소의 조성물 및 그것의 용도
US7365127B2 (en) * 2005-02-04 2008-04-29 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Process for the preparation of polymer conjugates
EP1863519B1 (en) 2005-03-31 2013-09-25 The General Hospital Corporation Modulating hgf/hgfr activity for treating lymphodema
CN101247821B (zh) 2005-06-03 2013-01-23 Ambrx公司 经改良人类干扰素分子和其用途
EP1893632B1 (en) 2005-06-17 2015-08-12 Novo Nordisk Health Care AG Selective reduction and derivatization of engineered factor vii proteins comprising at least one non-native cysteine
JP2009503111A (ja) * 2005-08-04 2009-01-29 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション Ｇ−ｃｓｆ部分および重合体の複合体
JP5415071B2 (ja) 2005-08-19 2014-02-12 ワイス・エルエルシー Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用
KR20080079643A (ko) 2005-11-16 2008-09-01 암브룩스, 인코포레이티드 비-천연 아미노산을 포함하는 방법 및 조성물
CU23556A1 (es) * 2005-11-30 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Estructura polimérica semejante a dendrímero para la obtención de conjugados de interés farmacéutico
US8992905B2 (en) 2006-01-12 2015-03-31 Hokusan Co. Ltd. Oral composition containing interferon-α
ITMI20060612A1 (it) * 2006-03-30 2007-09-30 Keryos Spa New activaded poly-ethylene glycols-and related polymers and their applications
CA2648077A1 (en) * 2006-03-31 2007-11-08 Schering Corporation Parenteral low dose type 1 interferons for bladder cancer
EP2581450B1 (en) 2006-05-02 2018-08-15 MedImmune Limited Non-natural amino acid substituted polypeptides
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
JP2009537609A (ja) 2006-05-24 2009-10-29 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 延長されたｆｉｘアナログ及び誘導体
US20070282170A1 (en) * 2006-05-30 2007-12-06 Sundaram Ravikumar Rake Retractor and Needle Assembly for Minimally Invasive Surgical Applications
US8008948B2 (en) * 2006-07-06 2011-08-30 Denso Corporation Peak voltage detector circuit and binarizing circuit including the same circuit
EP1886685A1 (en) 2006-08-11 2008-02-13 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods, uses and compositions for modulating replication of hcv through the farnesoid x receptor (fxr) activation or inhibition
JP2010510171A (ja) * 2006-08-21 2010-04-02 ユナイテッド セラピューティクス コーポレーション ウイルス感染症の治療のための併用療法
EP2069396B1 (en) 2006-09-08 2015-10-21 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and their uses
PT2064333E (pt) 2006-09-08 2014-06-09 Ambrx Inc Supressor híbrido arnt para células de vertebrados
WO2008060356A2 (en) * 2006-09-29 2008-05-22 Canji, Inc. Methods and compositions for gene therapy
US8679472B1 (en) 2006-10-05 2014-03-25 Merck, Sharp & Dohme Corp. Crystal of human interferon alpha 2B in complex with zinc
KR101079993B1 (ko) * 2006-11-17 2011-11-04 동아제약주식회사 폴리에틸렌글리콜 과립구 콜로니 자극인자 접합체
EP2097068B1 (en) 2006-11-24 2013-09-04 Cadila Healthcare Limited Formulations of peg-interferon alpha conjugates
CN104163864B (zh) 2007-03-30 2017-08-01 Ambrx公司 经修饰fgf‑21多肽和其用途
US7964580B2 (en) 2007-03-30 2011-06-21 Pharmasset, Inc. Nucleoside phosphoramidate prodrugs
AU2008247815B2 (en) 2007-05-02 2012-09-06 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CN101361968B (zh) 2007-08-06 2011-08-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗脂肪肝中的应用
CL2008002399A1 (es) * 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
CA2707840A1 (en) * 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
ES2386575T3 (es) * 2007-09-04 2012-08-23 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferón alfa 2a modificado por polietilenglicol, su proceso de síntesis y su aplicación
PL2186830T3 (pl) * 2007-09-04 2012-09-28 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferon alfa 2b zmodyfikowany glikolem polietylenowym, jego wytwarzanie i zastosowanie
BRPI0818004B8 (pt) * 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
MX338336B (es) 2007-11-20 2016-04-07 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
CN101939443B (zh) 2008-02-08 2014-01-29 Ambrx公司 经修饰瘦素多肽和其用途
TW200946541A (en) 2008-03-27 2009-11-16 Idenix Pharmaceuticals Inc Solid forms of an anti-HIV phosphoindole compound
KR20110033922A (ko) 2008-07-08 2011-04-01 더 보드 오브 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템 전사의 신호 변환자 및 활성제（ｓｔａｔｓ）의 증식 및 활성화의 신규한 억제제
PT2318029T (pt) 2008-07-23 2018-01-10 Ambrx Inc Polipéptidos de g-csf bovino modificados e suas utilizações
AR072850A1 (es) * 2008-07-31 2010-09-22 Pharmaessentia Corp Conjugados peptido-polimero
JP2012502906A (ja) * 2008-09-17 2012-02-02 ネクター セラピューティックス オリゴマー−プロテアーゼ阻害剤コンジュゲート
ES2660000T3 (es) 2008-09-26 2018-03-20 Ambrx, Inc. Vacunas y microorganismos dependientes de la replicación de aminoácidos no naturales
EP2342223B1 (en) 2008-09-26 2017-04-26 Ambrx, Inc. Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
WO2010039801A2 (en) 2008-10-02 2010-04-08 The J. David Gladstone Institutes Methods of treating hepatitis c virus infection
DK2379115T3 (da) 2008-12-17 2018-01-29 Merck Sharp & Dohme Fremstilling og anvendelse af mono- og di-PEG-IL-10
EP2376088B1 (en) 2008-12-23 2017-02-22 Gilead Pharmasset LLC 6-O-Substituted-2-amino-purine nucleoside phosphoramidates
TW201031675A (en) 2008-12-23 2010-09-01 Pharmasset Inc Synthesis of purine nucleosides
EP2376514A2 (en) 2008-12-23 2011-10-19 Pharmasset, Inc. Nucleoside analogs
EP2408449A4 (en) 2009-03-18 2012-08-08 Univ Leland Stanford Junior METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING INFECTION WITH A FLAVIVIRIDAE FAMILY VIRUS
TWI598358B (zh) 2009-05-20 2017-09-11 基利法瑪席特有限責任公司 核苷磷醯胺
US8618076B2 (en) 2009-05-20 2013-12-31 Gilead Pharmasset Llc Nucleoside phosphoramidates
US20120283171A1 (en) 2009-12-21 2012-11-08 Ambrx, Inc. Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
SG181769A1 (en) 2009-12-21 2012-07-30 Ambrx Inc Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
HUE039605T2 (hu) 2010-01-06 2019-01-28 Dyax Corp Plazma kallikreint kötõ proteinek
WO2011107591A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Rigshospitalet Chimeric inhibitor molecules of complement activation
UY33311A (es) 2010-03-31 2011-10-31 Pharmasset Inc Fosforamidatos de nucleosidos
JP2013528374A (ja) 2010-05-10 2013-07-11 パーシード セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー Ｖｌａ４のポリペプチド阻害剤
RU2447083C1 (ru) * 2010-07-20 2012-04-10 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
PL2605789T3 (pl) 2010-08-17 2019-11-29 Ambrx Inc Zmodyfikowane polipeptydy relaksyny i ich zastosowania
CN102380091A (zh) 2010-08-31 2012-03-21 健能隆医药技术（上海）有限公司 白介素-22在治疗病毒性肝炎中的应用
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
US8841275B2 (en) 2010-11-30 2014-09-23 Gilead Pharmasset Llc 2′-spiro-nucleosides and derivatives thereof useful for treating hepatitis C virus and dengue virus infections
KR102320178B1 (ko) 2011-01-06 2021-11-02 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 결합 단백질
WO2012107589A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment and prevention of hcv infections
KR20140054009A (ko) 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
EP2734640A1 (en) 2011-07-20 2014-05-28 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for determining treatment response in patients infected with hcv genotype 4
WO2013024156A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of anti-hcv-entry factor antibodies and interferons for the treatment and the prevention of hcv infection
WO2013024158A1 (en) 2011-08-17 2013-02-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Combinations of protein kinase inhibitors and interferons or of protein kinase inhibitors and direct acting antivirals for the treatment and the prevention of hcv infection
US8889159B2 (en) 2011-11-29 2014-11-18 Gilead Pharmasset Llc Compositions and methods for treating hepatitis C virus
AU2012347785B2 (en) 2011-12-06 2017-03-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for treating viral diseases
WO2013174988A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for predicting and monitoring treatment response in hcv- and hcv/hiv-infected subjects
SI2859017T1 (sl) 2012-06-08 2019-05-31 Sutro Biopharma, Inc. Protitelesa, ki vsebujejo specifične nenaravne aminokislinske ostanke, postopki njihove priprave in postopki njihove uporabe
EP2861617A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
WO2014004639A1 (en) 2012-06-26 2014-01-03 Sutro Biopharma, Inc. Modified fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014033266A1 (en) 2012-08-31 2014-03-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-sr-bi antibodies for the inhibition of hepatitis c virus infection
ES2907763T3 (es) 2012-08-31 2022-04-26 Sutro Biopharma Inc Aminoácidos modificados que comprenden un grupo azido
EA021610B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Жидкое противовирусное лекарственное средство
EA021643B1 (ru) * 2013-03-28 2015-07-30 Илья Александрович МАРКОВ Монопегилированный интерферон-альфа линейной структуры и фармацевтическая композиция для приготовления лекарственного средства, обладающего активностью интерферона-альфа
EA023360B1 (ru) * 2013-03-28 2016-05-31 Илья Александрович МАРКОВ Линейный ацилазидный пегилирующий агент, способ его получения и способ получения пегилированного интерферона
BR112015026122A8 (pt) 2013-04-18 2020-01-21 Armo Biosciences Inc agente de polietileno glicol-il-10 (peg-il-10), seu uso, composição farmacêutica, contentor estéril e kit
US9823255B2 (en) 2013-06-17 2017-11-21 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
EP3019522B1 (en) 2013-07-10 2017-12-13 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
MX2016002185A (es) 2013-08-27 2016-06-06 Gilead Pharmasset Llc Formulacion combinada de dos compuestos antivirales.
US10010588B2 (en) 2013-08-30 2018-07-03 Armo Biosciences, Inc. Methods of using pegylated interleukin-10 for treating hyperlipidemia
WO2015054658A1 (en) 2013-10-11 2015-04-16 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
CN104623637A (zh) 2013-11-07 2015-05-20 健能隆医药技术（上海）有限公司 Il-22二聚体在制备静脉注射药物中的应用
US11413332B2 (en) 2013-11-11 2022-08-16 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
WO2015148790A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Dyax Corp. Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema
US10076512B2 (en) 2014-05-01 2018-09-18 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis delta virus infection
US11311519B2 (en) 2014-05-01 2022-04-26 Eiger Biopharmaceuticals, Inc. Treatment of hepatitis delta virus infection
HUE044606T2 (hu) 2014-05-01 2019-11-28 Eiger Biopharmaceuticals Inc A hepatitis delta vírusfertõzés kezelése
RU2554761C1 (ru) * 2014-05-13 2015-06-27 Закрытое акционерное общество "Сибирский центр фармакологии и биотехнологии" Противоэнтеровирусное и иммуностимулирующее средство
US10293043B2 (en) 2014-06-02 2019-05-21 Armo Biosciences, Inc. Methods of lowering serum cholesterol
KR101736870B1 (ko) * 2014-08-20 2017-05-18 한국코러스 주식회사 인터페론 접합체를 포함하는 복합체 및 이의 제조방법
WO2016060996A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Armo Biosciences, Inc. Interleukin-15 compositions and uses thereof
WO2016064817A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Armo Biosciences, Inc. Methods of using interleukin-10 for treating diseases and disorders
KR20240024362A (ko) 2014-10-24 2024-02-23 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 변형된 fgf-21 폴리펩티드 및 그의 용도
KR102540109B1 (ko) 2014-11-06 2023-06-02 파마에센시아 코퍼레이션 Peg화된 인터페론의 투약 요법
US10618970B2 (en) 2015-02-03 2020-04-14 Armo Biosciences, Inc. Method of treating cancer with IL-10 and antibodies that induce ADCC
DK3285768T3 (da) 2015-04-21 2021-01-25 Eiger Biopharmaceuticals Inc Farmaceutiske sammensætninger omfattende lonafarnib og ritonavir
AU2016268403A1 (en) 2015-05-28 2017-12-07 Armo Biosciences, Inc. Pegylated interleukin-10 for use in treating cancer
EP3341012A4 (en) 2015-08-25 2019-03-20 Armo Biosciences, Inc. METHOD FOR USE OF INTERLEUKIN-10 FOR THE TREATMENT OF ILLNESSES AND SUFFERING
CN108367001A (zh) 2015-11-04 2018-08-03 艾格尔峰生物制药有限公司 治疗丁型肝炎病毒感染
NZ744233A (en) 2015-12-11 2023-11-24 Takeda Pharmaceuticals Co Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack
EP3442562B1 (en) 2016-04-15 2022-09-21 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd An il-22 dimer for use in treating necrotizing enterocolitis
CN106539557A (zh) * 2016-10-08 2017-03-29 西安交通大学 一种基于恒速静脉输入的药代动力学参数的测定方法
WO2018087345A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 F. Hoffmann-La Roche Ag COMBINATION THERAPY OF AN HBsAg INHIBITOR, A NUCLEOS(T)IDE ANALOGUE AND AN INTERFERON
US20210308277A1 (en) 2016-11-14 2021-10-07 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Conjugation linkers, cell binding molecule-drug conjugates containing the linkers, methods of making and uses such conjugates with the linkers
WO2018134260A1 (en) 2017-01-18 2018-07-26 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment patients suffering from myeloproliferative disorders
SG10201912034UA (en) 2017-02-08 2020-02-27 Bristol Myers Squibb Co Modified relaxin polypeptides comprising a pharmacokinetic enhancer and uses thereof
EP3658173A1 (en) 2017-07-25 2020-06-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for modulating monocytopoiesis
RU2678332C1 (ru) 2017-09-08 2019-01-28 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения
CA3111576A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and their uses
AU2019361206A1 (en) 2018-10-19 2021-06-03 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
KR20210136014A (ko) 2019-02-12 2021-11-16 암브룩스, 인코포레이티드 항체-tlr 작용제 콘쥬게이트를 함유하는 조성물, 방법 및 이의 용도
MX2022000742A (es) 2019-07-18 2022-02-14 Enyo Pharma Metodo para disminuir los efectos adversos del interferon.
WO2021178612A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection
AU2021233909A1 (en) 2020-03-11 2022-09-29 Ambrx, Inc. Interleukin-2 polypeptide conjugates and methods of use thereof
WO2021228983A1 (en) 2020-05-13 2021-11-18 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A pharmaceutical composition comprising an arsenic compound, an inductor of type-1 ifn and a protein kinase inhibitor for treating cancer
ES2929379T3 (es) 2020-05-20 2022-11-28 Inst Nat Sante Rech Med Métodos para el tratamiento de infecciones por coronavirus
WO2021263271A1 (en) 2020-06-22 2021-12-30 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis d virus infection
EP3954393A1 (en) 2020-08-13 2022-02-16 Bioasis Technologies Inc. Combination therapies for delivery across the blood brain barrier
JP2023538071A (ja) 2020-08-20 2023-09-06 アンブルックス，インコーポレイテッド 抗体－ｔｌｒアゴニストコンジュゲート、その方法及び使用
WO2022043496A2 (en) 2020-08-28 2022-03-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of mait cells as biomarkers and biotargets in covid-19
WO2022079205A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Use of ifn-alpha polypeptides for the treatment of coronavirus infections
EP4313163A1 (en) 2021-04-03 2024-02-07 Ambrx, Inc. Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4275000A (en) * 1977-08-22 1981-06-23 National Research Development Corporation Peptide macromolecular complexes
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
DE3380726D1 (en) * 1982-06-24 1989-11-23 Japan Chem Res Long-acting composition
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4680338A (en) * 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4810638A (en) * 1986-07-24 1989-03-07 Miles Inc. Enzyme-labeled antibody reagent with polyalkyleneglycol linking group
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5080891A (en) * 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5004605A (en) * 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2085297T3 (es) * 1989-05-27 1996-06-01 Sumitomo Pharma Procedimiento para preparar derivados de poli(etilenglicol) y proteina modificada.
JP2662311B2 (ja) * 1989-08-07 1997-10-08 デビオファルム ソシエテ アノニム 生物学的に活性な新規薬剤・ポリマー誘導体およびその製造方法
JPH06506217A (ja) * 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
US5595732A (en) * 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US5281698A (en) * 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5676942A (en) * 1992-02-10 1997-10-14 Interferon Sciences, Inc. Composition containing human alpha interferon species proteins and method for use thereof
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
CA2101361A1 (en) * 1992-08-27 1994-02-28 Robert A. Snow Low diol polyalkylene oxide biologically active proteinaceous substances
US5605976A (en) * 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
AU691225B2 (en) * 1993-11-10 1998-05-14 Schering Corporation Improved interferon polymer conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
US5650234A (en) * 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5824784A (en) * 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) * 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5646242A (en) * 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
TW517067B (en) * 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) * 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same

Also Published As

Publication number Publication date
DK1039922T3 (da) 2002-10-14
KR100607388B1 (ko) 2006-08-02
DE69806055D1 (de) 2002-07-18
AR017435A1 (es) 2001-09-05
ATE218883T1 (de) 2002-06-15
EP1039922B1 (en) 2002-06-12
CO4870741A1 (es) 1999-12-27
PT1039922E (pt) 2002-10-31
PE20000003A1 (es) 2000-01-17
CA2268433A1 (en) 1999-06-19
SG71179A1 (en) 2000-03-21
HUP0101532A3 (en) 2004-08-30
CA2268433C (en) 2002-07-30
JP3747070B2 (ja) 2006-02-22
IL136290A0 (en) 2001-05-20
TW570802B (en) 2004-01-11
HUP0101532A2 (hu) 2001-08-28
ZA9811590B (en) 1999-06-18
AU739359B2 (en) 2001-10-11
ES2178297T3 (es) 2002-12-16
NZ504735A (en) 2002-10-25
EP1039922A4 (en) 2000-10-04
JP2005015464A (ja) 2005-01-20
MY119581A (en) 2005-06-30
US5951974A (en) 1999-09-14
JP2000508356A (ja) 2000-07-04
EP1039922A1 (en) 2000-10-04
IL136290A (en) 2008-03-20
US6042822A (en) 2000-03-28
WO1999032139A1 (en) 1999-07-01
KR20010024755A (ko) 2001-03-26
DE69806055T2 (de) 2003-01-23
SI1039922T1 (en) 2002-10-31
AU1916799A (en) 1999-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU224696B1 (en) Improved interferon polymer conjugates
US5985263A (en) Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
EP1037657B1 (en) Alpha-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
CA2176229C (en) Improved interferon polymer conjugates
KR100254097B1 (ko) 인터페론결합체
LV12275B (en) COMPOSITIONS AND METHODS FOR STIMULATION OF DEGREE AND DIFFERENTIATION OF MEGAKAROCYTE
KR100694994B1 (ko) 사람 과립구 콜로니 형성인자 동종체
KR20020007296A (ko) Ｇｃｓｆ 결합체
WO2011041376A1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
MXPA99011862A (es) Conjugados mejorados de polimero de interferon

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20051118

HC9A Change of name, address

Owner name: MERCK SHARP & DOHME CORP., US

Free format text: FORMER OWNER(S): SCHERING CORP.,, US