HU223664B1 - Növekedési hormon felszabadulást elősegítő peptidek és eljárás előállításukra, valamint a peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények - Google Patents

Növekedési hormon felszabadulást elősegítő peptidek és eljárás előállításukra, valamint a peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények Download PDF

Info

Publication number
HU223664B1
HU223664B1 HU9400495A HU9400495A HU223664B1 HU 223664 B1 HU223664 B1 HU 223664B1 HU 9400495 A HU9400495 A HU 9400495A HU 9400495 A HU9400495 A HU 9400495A HU 223664 B1 HU223664 B1 HU 223664B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
phe
tyr
gly
dala
ala
Prior art date
Application number
HU9400495A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT69178A (en
HU9400495D0 (en
Inventor
David Coy
Cyril Y. Bowers
Original Assignee
Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Administrators Of The Tulane Educational Fund filed Critical Administrators Of The Tulane Educational Fund
Publication of HU9400495D0 publication Critical patent/HU9400495D0/hu
Publication of HUT69178A publication Critical patent/HUT69178A/hu
Publication of HU223664B1 publication Critical patent/HU223664B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

A találmány tárgya új, A1-A2-Ala-C2-C3-A5 (I) általános képletű peptid– ahol A1 jelentése Gly, Ala, DAla, ?-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar,Ava, Aib, N,N-bisz(kis szénatomszámú alkil)-amino-kar- bonsav, vagy(kis szénatomszámú alkil)-amino-karbonsav, ahol a kis szénatomszámúalkilcsoport 2 és 6 közötti szénatomot tartalmazó, egyenes láncúalkilcsoportot jelent; A2 jelentése DTrp, D?Nal vagy DPhe, A5jelentése A3-A5', vagy A5' általános képletű csoport, ahol A3jelentése Ala vagy DAla, A5' jelentése Lys(?-R1R2)-Z vagy Orn(?-R1R2)-Z, melynél R1 és R2 jelentése hidrogénatom vagy 1–6 szénatomszámú al-kilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha R1 jelentése hidrogénatom,akkor R2 jelentése alkilcsoport, és ha R2 jelentése hidrogénatom,akkor R1 jelentése alkilcsoport, Z jelentése –NH2 vagy –OH csoport,vagy A5' jelentése – ha A1 jelentése His-től eltérő – lehet még Lys-Z,Orn-Z vagy Arg-Z, ahol Z jelentése –NH2 vagy –OH, vagy A5' jelentése–NH(CH2)xNH2 csoport, ahol x értéke 2 és 9 közötti egész szám, C2jelentése Trp vagy Phe, C3 jelentése DPhe vagy DPal, – valamintszerves és szervetlen addíciós sói. A találmány szerinti vegyületeknövekedési hormonok felszabadulását elősegítő gyógyszerkészítményekbenhasználhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya új, (I) általános képletű polipeptidek - amelyek állatoknál és különösen embereknél elősegítik a növekedési hormonok felszabadulását - és eljárás a vegyületek előállítására. A találmány további tárgya növekedési hormon felszabadulásának elősegítésére és a növekedési hormonok szintjének emelésére alkalmas gyógyszerkészítmény, mely hatóanyagként az (I) általános képletű polipeptideket tartalmazza.
Ha állatoknak, például emlősöknek - beleértve az embert is - növekedési hormonokat (GH) felszabadító vegyületeket adunk be, és ezáltal ezek a hormonszintek kellőképpen magasra emelkednek, ez a testtömeg és a tejtermelés növekedését eredményezheti. Ismert továbbá, hogy állatokban és emberekben a növekedési hormonok szintjének emelése megoldható ismert, növekedési hormonokat felszabadító vegyületek, például a természetben előforduló, növekedési hormonokat felszabadító hormonok alkalmazásával.
Az emlősök növekedésihormon-szintjének emelése megoldható továbbá növekedési hormonokat felszabadító peptidek alkalmazásával, melyek közül egyeseket leírtak például a 4,223,019, a 4,223,020, a 4,223,021, a 4,224,316, a 4,226,857, a 4,228,155, a 4,228,156, a 4,228,157, a 4,228,158, a 4,410,512 és a 4,410,513 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírásában.
Ugyancsak használták a GH-szintek emelésére a növekedési hormonok felszabadításának endogén inhibitorával szembeni antitestet, a somatostsatint (SRIF). Ez utóbbi esetben a növekedési hormon szintjét oly módon növelik, hogy a növekedési hormonok felszabadításának endogén inhibitorát (SRIF) eltávolítják, mielőtt elérné a hipofízist, ahol a GH felszabadítását gátolja.
Mindezen - a növekedési hormonok felszabadítását elősegítő módszerekhez olyan anyagok szükségesek, melyeknek szintézise vagy izolálása olyan tisztasági fokban, hogy a kezelendő állatoknak beadhatók legyenek, igen költséges. Olyan rövid láncú, kis molekulatömegű, viszonylag egyszerű polipeptidek lennének megfelelők, amelyek viszonylag olcsón előállíthatok, és képesek a növekedési hormonok felszabadításának elősegítésére, mert ezek könnyen és olcsón előállíthatok, kémiai és/vagy fizikai úton könnyen módosíthatók, továbbá könnyen tisztíthatok és formulálhatók, ezenkívül kitűnő szállítási tulajdonságokat is kell mutatniuk.
Bár ismerünk néhány olyan rövid szénláncú polipeptidet, melyek képesek a növekedési hormon felszabadulásának elősegítésére és vérszintjének emelésére, fontos, hogy a polipeptideket különféle célok szerint szállítás, biológiai abszorbancia, megnövelt retenciós idő stb. - alakítani tudjuk. Viszont ha az aminosavakat bizonyos helyeken megváltoztatjuk, az rendkívüli mértékben csökkentheti a rövid szénláncú polipeptideknek a növekedési hormon felszabadulását elősegítő képességét.
Kívánatos lenne olyan rövid szénláncú polipeptidek előállítása, amelyek képesek a növekedési hormon felszabadulásának elősegítésére és szintjének emelésére állatok, és különösen az ember vérében.
Vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy az (I) általános képletű polipeptidek a fenti célra jól alkalmazhatók.
A találmány tárgya tehát polipeptidek, melyek az (I) általános képlettel írhatók le
A,-A2-Ala-C2-C3-A5 (I) ahol az általános képletben
A, jelentése Gly, Alá, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro,
Sár, Ava, Aib, N,N-bisz(kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, vagy (kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, ahol a kis szénatomszámú alkilcsoport 2 és 6 közötti szénatomot tartalmazó, egyenes láncú alkilcsoportot jelent;
A2 jelentése DTrp, DPNal vagy DPhe,
A5 jelentése A3-A5·, vagy A5· általános képletű csoport, ahol
A3 jelentése Alá vagy DAla,
A5-jelentése Lys(e-R|R2)-Z vagy Om(8-RtR2)-Z, melynél Rt és R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha R, jelentése hidrogénatom, akkor R2 jelentése alkilcsoport, és ha R2 jelentése hidrogénatom, akkor R, jelentése alkilcsoport, Z jelentése -NH2 vagy -OH csoport, vagy
A5· jelentése - ha A, jelentése His-től eltérő - lehet még Lys-Z, Om-Z vagy Arg-Z, ahol Z jelentése -NH2 vagy -OH, vagy
A5-jelentése —NH(CH2)XNH2 csoport, ahol x értéke 2 és 9 közötti egész szám,
C2 jelentése Trp vagy Phe,
C3 jelentése DPhe vagy DPal.
A találmány oltalmi körébe tartoznak továbbá a fenti polipetidek szerves és szervetlen addíciós sói, melyet a későbbiekben részletesen ismertetünk. A polipeptidek közül előnyösen alkalmazhatók az ArA2Ala-C2-DPhe-A5, még előnyösebben az ArA2-AlaTrp-DPhe-A5 általános képletnek.
A találmányt a továbbiakban a mellékelt rajzok felhasználásával ismertetjük, ahol az 1. ábra diagramsorozata a szérum növekedési hormon szintjét mutatja az idő függvényében.
Az aminosavmaradékokat a leírásban a szabványos peptidnómenklatura szerint a következőképpen jelöltük:
Gly = glicin
Tyr - L-tirozin
Ile = L-izoleucin
Glu = L-glutaminsav
Thr = L-treonin
Phe = L-fenil-alanin
Alá = L-alanin
Lys = L-lizin
Asp = L-aszparaginsav
Cys = L-cisztein
Arg = L-arginin
Ava = a-amino-valeriánsav
Aib = a-amino-izovajsav
Gin = L-glutamin
Pro = L-prolin
HU 223 664 Β1
Leu = L-leucin
Met = L-metionin
Ser = L-szerin
Asn = L-aszparagin
His = L-hisztidin
Trp = L-triptofán
Val = L-valin
DOPA = 3,4-dihidroxi-fenil-alanin
Met(O) = metionin-szulfoxid
Abu = O-amino-vajsav iLys = N'-izopropil-L-lizin
4-Abu = 4-amino-vajsav
Om = L-omitin
D^al = Ó-naftil-D-alanin
DPNal = β-naftil-D-alanin
Sár = szarkozin
LArg = homoarginin
Chx = ciklohexil
IMA = Νθ-imidazol-ecetsav
Tcc = l,2,3,4-tetrahidro-7-karbolin-3-karbonsav
Tic = l,2,3,4-tetrahidroizokinolin-3-karbonsav
Tip = 4,5,6,7-tetrahidro-lH-imidazo[4,5c]piridin-6-karbonsav a,yABU = α,γ-amino-vajsav
DPal = D-3-piridil-alanin
Az aminosavak nevének hárombetűs rövidítése előtt a „D” minden esetben azt jelenti, hogy az aminosavmaradék D-konfigurációjú, a glicin pedig „a természetben előforduló L-aminosavak” közé tartozik.
Ezekben a rövid szénláncú polipeptidekben bizonyos pozíciók toleránsabbak a változásokkal szemben, mint más részek, ami azt jelenti, hogy a változások nem hatnak károsan a pepiidnek azon képességére, hogy a növekedési hormon felszabadulását elősegíti, és a hormonszintet emeli az állatok vérében. Ilyen például az A5 pozíció. Más pozíciók kevésbé toleránsak a változtatásokkal szemben. Ilyenek például a közbenső aminosavak, mint Ala, Trp, Dphe a C,, C2, illetve C3 helyen. Korábban például azt hitték, hogy az A,-nek és az A2-nek L, illetve D formában kell jelen lennie, és a Trp-nek és a DPhe-nek ugyancsak L, illetve D formában kell jelen lennie, hogy ily módon egy LD LD szekvenciát képezzenek. Mi azonban azt tapasztaltuk, hogy az LD LD szekvencia helyett állhat DD LD szekvencia. Tehát arra a meglepő felismerésre jutottunk, hogy egy A,A2AlaC2C3A5 általános képletű polipeptid, amelyben At, A2 és A5 jelentése a fenti, C2 jelentése Trp vagy Phe, és C3 jelentése DPhe vagy DPal, elősegíti a növekedési hormon felszabadulását, és emeli a hormonszintet az állatok vérében.
C2 jelentése előnyösen Trp.
C3 jelentése előnyösen DPhe. Ha C3 jelentése DPal, akkor Z jelentése előnyösen hidroxilcsoport.
Az a megnövelt flexibilitás, ami abból következik, hogy az A,, A2, A3, A4, As, C2 és C3 aminosavak lehetnek bázisosak, semlegesek vagy savasak, és lehetnek L vagy D alakúak, a kívánt peptid fiziokémiai tulajdonságait nagymértékben szabályozhatóvá teszi.
Bár a DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2-nek és a DAla-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-NH2-nek hasonló a GH-felszabadító hatása, a Phe helyettesítése Trp-vel megnövelheti ennek a szekvenciának a kémiai stabilitását, mert a Trp érzékenyebb az oxidációra, mint a Phe. Továbbá ez a helyettesítés fokozhatja a peptid hidrofób jellegét, és ez a fizikai-kémai tulajdonság mint később látható lesz - előnyös lehet az orális, transzdermális és/vagy nazális felszívódás növelése, valamint a peptid formulálása szempontjából. Továbbá a DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2 és a DAla-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-NH2 azonos ED50értéket (30,5 ±0,5, illetve 30,8±0,3 pg/ml) adott egy patkánysejtes hisztaminvizsgálatban, és mindkettő javulásnak tekinthető az Ala-His-DpNal-Ala-TrpDphe-Lys-NH2 hisztaminaktivitásához képest, amely 11,0 ±1,0 pg/ml-nek bizonyult. Azok a peptidek, melyeknek kisebb a hisztaminfelszabadító hatása (nagyobb az ED50-értéke), klinikailag hatásosabbak lehetnek, mert a peptid beinjektálásának helyén várhatóan kisebb mértékű lokális reakciót váltanak ki, és/vagy kisebb valószínűséggel váltanak ki szervezeti antigén klinikai ellenhatásokat.
A flexibilitás nagyon előnyös a kívánt peptid képzése és szállítása szempontjából is egy adott faj esetén. Ezek a változtatások javíthatják továbbá az orális felszívódást, valamint a peptidek metabolizmusát és kiválasztását. Például az Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DpheLys-NH2 (GHRP-1) emberekben hatásosabban szabadítja fel a növekedési hormont, mint az Ala-His-DTrpAla-Trp-Dphe-Lys-NH2. Viszont orálisan beadva a DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2 (GHRP-2) hatásosabb a GHRP-l-nél. Az 1. ábrán fiatal férfiak szérumhormonszintje látható az idő függvényében 300 pg/kg GHRP-1 beadása után (40 személy, 1-1. ábra), 600 pg/kg GHRP-1 beadása után (39 személy, 1-2. ábra), illetve 100 pg/kg GHRP-2 beadása után (11 személy, 1-3. ábra). Ezen vizsgálatokban a GRPH-t 20 ml vízben adtuk be, majd 100 ml vizet adtunk be a fiatal, 25 év körüli férfiaknak. A vért a diagramon látható időpontokban vettük le. A GH-t radioimmunvizsgálattal mértük.
Az is várható, hogy miután aromás oldalláncok távolíthatók el ezen a peptidek bizonyos helyeiről, ahol eddig szükségesnek tartották a jelenlétükét, és minthogy a D-konfigurációjú aminosavmaradék biológiailag bizonyára jobban védett, mint az L-konfigurációjú, bizonyos peptideknél a nagyobb védelem és a kisebb tömeg felhasználható a polipeptid további alakítására olyan tulajdonságok támogatása érdekében, mint például a nazális, orális, transzdermális felszívódás, vagy az in vivő stabilitás.
Ugyancsak változtatható az R,, R2, R3, R4 és Z szubsztituens, és ezáltal a kívánt vegyület fiziokémiai tulajdonságai tovább szabályozhatók. Tehát egy bizonyos fajon belül megnövelhetjük egy pepiidnek egy adott receptorhoz történő szállítását.
A találmány szerinti, növekedési hormont felszabadító vegyületek közül előnyösen alkalmazhatók az
ArA2-Ala-Trp-DPhe-A5
HU 223 664 Β1 általános képletűek, valamint szerves és szervetlen addíciós sóik.
Ezen csoporton belül előnyösen alkalmazhatók az alábbi vegyületek:
DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2,
DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-(e-iPr)-NH2,
DAla-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2,
DAla-DpNal-Ala-Trp-Dphe-NH-(CH2)5-NH2,
NH2-(CH2)5-CO-DpNal-Ala-Trp-Dphe-NH-(CH2)5NH2 valamint szerves és szervetlen addíciós sóik.
Jelenleg ezek a vegyületek a legelőnyösebbek, mert a rövidebb szénláncú polipeptidek szintézise olcsóbb, és a fenti vegyületekről bebizonyosodott, hogy nagyon hatásosan elősegítik a vér növekedési hormonszintjeinek emelését.
A növekedési hormon felszabadítására előnyösen alkalmazhatók továbbá az ArA2-Ala-Phe-DPhe-A5 általános képletű polipeptidek. Ezen csoporton belül előnyösen alkalmazhatók azok a vegyületek, melyekben A, jelentése N“IMA, a,rABU, DAla, His, Alá vagy His, A2 jelentése DpNal vagy Dphe, és A5 jelentése Lys-NH2, Arg-NH2, NH-Chx-NH2 (1,4-Chx-diamin) vagy Lys-EA. Ilyenek például az
N“IMA-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-NH2, a,rABU-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-NH2,
D Ala-Dphe-Ala-Phe-Dphe-Ly s-NH2,
Ala-His-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-NH2,
N“IMA-DpNal-Ala-Phe-Dphe-NH-Chx-NH2, ajABU-DpNal-Ala-Phe-Dphe-NH-Chx-NH2, DAla-DpNal-Ala-Phe-Dphe-Lys-EA, DAla-DpNal-Ala-Phe-Dphe-DArg-NH2, valamint szerves és szervetlen addíciós sóik.
A találmány egy további megvalósítását képezik az olyan A1A2AlaC2C3A5 általános képletű polipeptidek, amelyekben C2 jelentése Trp, Phe vagy ChxAla és C3 jelentése Dphe vagy DChxAla. A, jelentése előnyösen DAla, A2 jelentése előnyösen DpNal. Ilyen vegyület például a
DAla-DpNal-Ala-ChxAla-Dphe-Lys-NH2, a DAla-DpNal-Ala-Phe-DChxAla-Lys-NH2 és a DAla-DpNal-Ala-DChxAla-DChxAla-Lys-NH2, valamint szerves és szervetlen addíciós sóik.
Ezek a vegyületek könnyen szintetizálhatok, hatásosan elősegítik a vér növekedési hormonszintjének emelését, ipari méretű gyártásra és felhasználásra is megfelelőek. További előnyük, hogy a polipeptidek számos pozíciójában végrehajtható helyettesítésekből adódó flexibilitásnak köszönhetően olyan fiziokémiai tulajdonságokat mutatnak, melyeknek révén egy sor állatfajnak átadhatók. A poláris, neutrális vagy nempoláris C-terminális és közbenső pozíciók megválasztása révén érjük el, hogy a vegyület kompatibilis legyen a kívánt orális, nazális vagy folyamatos beadási móddal, melyekhez speciális kémiai/mechanikai átadási módszereket alkalmazunk.
Ezek a peptidek terápiásán felhasználhatók bármely olyan területen, ahol növekedési hormonok alkalmazhatók, így például a hipotalamikus hipofizeális törpenövés, csontritkulás, égések kezelésére, a veseelégtelenség akut kezelésére, csonttörés kezelésére az összeforrás hiánya esetén, továbbá sebek gyógyulásának elősegítésére. Továbbá felhasználhatók a műtét utáni, valamint az akut vagy krónikus legyengülést okozó belgyógyászati betegségekből történő gyógyulás elősegítésére. Ugyancsak használhatók ezek a peptidek rákbetegek kezelésére, például a betegek leromlásának megelőzésére és/vagy csökkentésére. Ezen terápiás felhasználások során a peptidből terápiásán hatásos mennyiséget alkalmazunk. Ez - mint mondottuk - az a mennyiség, amely szükséges ahhoz, hogy a szérumban a növekedési hormonok szintjét megemelje.
Ezenkívül a találmány szerinti vegyületek felhasználhatók állatokban a vér GH-szlntjeinek növelésére, tehenek tejtermelésének növelésére, állatok, például emlősök (mint ember, juh, szarvasmarha, sertés), valamint halak, szárnyasok, egyéb gerincesek és rákfélék testgyarapodásának növelésére, továbbá emlősök gyapjú- és/vagy szőrmetermelésének fokozására. A testgyarapodás mértéke függ többek között az állat nemétől és korától, a beadott - növekedésihormonfelszabadító - vegyület fajtájától és mennyiségétől, a beadás módjától. A találmány szerinti vegyületek az emberben is növelik a szérum GH-szintjét, kis termetű gyermekeknél elősegítik a testi növekedést, egyes gyermekeknél csökkentik a kövérséget és javítják a protein-anyagcserét, javítják a bőr, az izmok és a csontok protein-anyagcseréjét, miközben csökkentik az idősebbek elhízását, különösen akkor, ha a GH nem kielégítő.
Ezek a peptidek felhasználhatók továbbá az emberi szérum lipidmegoszlásának javítására azáltal, hogy a szérumban csökkentik a koleszterin és a kis sűrűségű lipoprotein mennyiségét, és növelik a nagy sűrűségű lipoprotein mennyiségét.
A találmány szerinti új polipeptidek az oldat- és szilárd fázisú peptidkémiában használatos, vagy a szakmában ismert hagyományos módszerekkel szintetizálhatok. A peptid-amidok esetén a szilárd fázisú szintézist előnyösen a peptid C-terminális végénél kezdjük. Az alkalmas kiindulási anyagot például úgy állíthatjuk elő, hogy a kívánt védett α-aminosavat egy klór-metilezett, hidroxi-metilezett, benzhidril-amin (BHA)vagy para-metil-benzil-hidril-amin (p-Me-BHA)gyantán megkötjük. Ilyen klór-metilezett gyanta BIOBEADS SX-1 kereskedelmi néven szerezhető be a Bio Rád Laboratoritories-tól (Richmond, Califomia). A hidroxi-metilezett gyanta előállítását Bodansky és munkatársai ismertetik [Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966)]. A BHA gyantát Pietta és Marshall írja le [Chem Comm. 650 (1970)], beszerezhető a Peninsula Laboratories Inc.-tói (Belmont, Califomia).
A kezdeti kapcsolás után az a-amino-védőcsoportot szerves oldószerben oldott savas reagenssel, például trifluor-ecetsavval (TFA) vagy sósavval (HCI) szobahőmérsékleten eltávolíthatjuk. Az a-amino-védőcsoport eltávolítása után a visszamaradt védett aminosavakat lépésről lépésre, a kívánt sorrendben kapcsolhatjuk. Általában mindegyik védett aminosavat a megfelelő reagensnek körülbelül háromszoros feleslegével reagáltatjuk egy alkalmas karboxilcsoport-aktivátor - például
HU 223 664 Bl metilén-kloridos (CH2C12) vagy dimetil-formamidos (DMF) vagy ezen oldószerek elegyével készített diciklohexil-karbodiimid (DCC)- vagy diizpropil-karbodiimid (DlC)-oldat - jelenlétében.
A kívánt aminosavszekvencia kialakítása után a kívánt peptidet a benzhidril-amin alapgyantáról például hidrogén-fluoridos (HF) kezeléssel hasíthatjuk le, amely nemcsak a peptidet hasítja le a gyantáról, hanem a legelterjedtebben használt oldalláncvédó csoportokat is. Ha klór-metilezett vagy hidroxi-metilezett gyantát használunk, a hidrogén-fluoridos kezeléssel szabad aminosavat kapunk. De ezekből a peptidgyantákból könnyen előállíthatunk peptid-alkil-amidokat és -észtereket is oly módon, hogy a lehasítást egy alkalmas alkil-aminnal, dialkil-aminnal vagy diamino-alkánnal végezzük, vagy egy alkohollal magas pH-jú közegben átészterezést hajtunk végre.
A fenti szilárd fázisú eljárás a szakmában jól ismert, leírása megtalálható Stewart és Young Solid Phase Peptide Synthesis című művében (Second Edn., Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984).
Bodansky és munkatársai (Peptide Synthesis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York, N. Y. 1976) leírnak néhány jól ismert oldószeres módszert, melyek alkalmasak a találmány szerinti peptidrészek szintetizálására.
Előnyösebbnek tartják az olyan oldószeres peptidszintézist, amelyben legalább két peptidfragmentum között kondenzációs reakció játszódik le.
Ebben az eljárásban egy Χ-Α,-Υ peptidfragmentum egy U-V-W peptidfragmentummal kondenzál, ahol az A, kivételével minden oldallánc semleges vagy védett, és X jelentése Prot, ahol Prot egy N-terminális védőcsoportot jelent; Y jelentése A2-Q, Ala-A2-Q, A2Ala-Q, Ala-A2-Ala-Q, A2-Ala-Trp-Q, Ala-A2-AlaTrp-Q, Ala-Q vagy -Q; ha Y jelentése Q, akkor U jelentése J-A2-Ala-Trp vagy J-Ala-A2-Ala-Trp; ha Y jelentése Ala-Q, akkor U jelentése J-A2-Ala-Trp; ha Y jelentése A2-Q, vagy Ala-A2-Q, akkor U jelentése JAla-Trp; ha Y jelentése A2-Ala-Q vagy Ala-A2-A3-Q, akkor U jelentése J-Trp; ha Y jelentése A2-Ala-Trp-Q vagy Ala-A2-Ala-Trp-Q, akkor U jelentése J; V jelentése A5 vagy Z; ha V jelentése A5, akkor W jelentése Z; ha V jelentése Z, akkor W nincs jelen; A,, A2, A5 és Z jelentése a fenti.
Q a peptidfragmentum karboxiterminálisa, jelentése -R3 vagy -M általános képletű csoport, ahol M egy nitrogéntartalmú nukleofillel helyettesíthető molekularész, R3 jelentése pedig hidrogénatom, 1 és körülbelül 10 közötti szénatomot tartalmazó alkilcsoport, 6 és körülbelül 12 közötti szénatomot tartalmazó arilcsoport, vagy 7 és körülbelül 12 közötti szénatomot tartalmazó aril-alkilcsoport; J a peptidfragmentum aminoterminálisa, jelentése hidrogénatom vagy egy, a kapcsolási reakciót nem zavaró védőcsoport, például benzilcsoport.
Ezután eltávolítjuk a védőcsoportokat, vagy pedig az így kapott védett peptidet további kondenzációs reakciókban felhasználjuk egy nagyobb peptid előállítására.
Ennek az előnyös módszernek a leírása megtalálható az 551,121 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (közzétételi száma: W09201709)
A találmány vonatkozik még gyógyszerkészítményre, melyek alkalmasak növekedési hormonok felszabadulásának elősegítésére és/vagy a növekedési hormonok szintjének emelésére állatok vérében.
A növekedési hormonok felszabadulásának elősegítésére és/vagy szintjeik emelésére szolgáló eljárás a fent felsorolt betegségek kezelésére is felhasználható. Az eljárás abból áll, hogy az állatnak vagy embernek a fenti peptideknek legalább egyikéből hatásos mennyiséget adunk be. Az eljárás egyik megvalósítása állatok kezelésére szolgál.
A találmány szerinti vegyületek beadhatók orálisan, parenterálisan (intramuszkuláris (im.), intraperitoneális (ip.), intravénás (iv.) vagy szubkután (se.) injekció alakjában), nazálisán, vaginálisan, rektálisan vagy szublinguálisan, intrapulmonáris belélegeztetéssel, és mindegyik beadási módhoz kialakítható a megfelelő dózisforma. Előnyösen alkalmazható a parenterális beadási mód.
Orális beadásra alkalmas szilárd dózisformák például a kapszulák, tabletták, pirulák, porok és granulátumok. Ezekben a szilárd dózis formákban a hatóanyag legalább egy inért hordozóanyaggal - mint szacharóz, laktóz vagy keményítő - van elkeverve. Az ilyen dózisformák általában tartalmaznak inért hordozóanyagokon kívül további anyagokat is, például lubrikánsokat (csúsztatószerek), mint magnézium-sztearát. Kapszulák, tabletták és pirulák esetén a dózisformák tartalmazhatnak pufferanyagokat is. A tabletták és pirulák készülhetnek enterális bevonattal.
Orális beadásra alkalmas folyékony dózisformák például az emulziók, oldatok, szuszpenziók, szirupok, elixírek, amelyek a szakmában ismert inért hígítóanyagokat, például vizet tartalmaznak. Az inért hígítóanyagokon kívül a készítmények tartalmazhatnak adalék anyagokat, például nedvesítő-, emulgeáló- és szuszpendálószereket, továbbá édesítő-, ízesítő- és illatosítóanyagokat.
A találmány szerinti, parenterális beadásra alkalmas készítmények közé tartoznak a steril vizes vagy nemvizes oldatok, szuszpenziók és emulziók. Nemvizes oldószerként vagy közegként használható például a propilénglikol, polietilénglikol, növényolajok, például olívavagy kukoricaolaj, zselatin és az injektálható szerves éterek, mint például az etil-oleát. Ezek a dózisformák tartalmazhatnak továbbá adalék anyagokat, például tartósító-, nedvesítő-, emulgeáló- és diszpergálószereket. A készítményeket sterilizálhatjuk például baktériumszűrőn történő átszűréssel, sterilizálószerek bevitelével, besugárzással vagy hőkezeléssel. Úgy is eljárhatunk, hogy a készítményt steril vízzel vagy más steril, injektálható közeggel közvetlenül a felhasználás előtt állítjuk össze.
A találmány szerinti vegyületeket beadhatjuk növekedési hormont felszabadító hormonnal (például a természetben előforduló, növekedési hormont felszabadító hormonnal, annak analógjaival vagy funkcionális megfelelőivel) együtt, valamint egyéb, a növekedési
HU 223 664 BI hormon felszabadulását elősegítő vegyületekkel, például növekedési hormont felszabadító peptidekkel együtt (lásd például a 4,880,778 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírásában), mint amilyenek például az acetokolin-észteráz-inhibitorok, a βadrenergiás blokkolószerek és az a-adrenergiás blokkolószerek. Ezek a kombinációk a találmány szerinti, növekedési hormont felszabadító peptidek beadásának egy különösen előnyös módját képezik, mert a kombináció sokkal nagyobb mértékben elősegíti a növekedési hormon felszabadulását, mint az az egyes komponensek egyedi hatásainak összegezése alapján várható lenne, vagyis a kombinációban szinergetikus hatás lép fel az egyedi komponensek hatásához képest. A fent idézett szabadalmi leírásban további részletek találhatók a növekedési hormont felszabadító peptidek beadásával kapcsolatban. Ezek a szinergetikus vegyületek előnyösen olyan vegyületek, amelyek a növekedési hormont felszabadító hormon receptoraival szemben agonistaként működnek vagy a szomatostatin hatását inhibiálják. A szinergizmus lehet bináris, tehát a találmány szerinti vegyület és egy szinergetikus vegyület közötti, de egynél több szinrgetikus vegyület is részt vehet benne.
A növekedési hormon felszabadulását és élőlények, például az ember vérében mért szintjének emelését eredményező kombinációk hatásos mennyiséget tartalmaznak a találmány szerinti polipeptidekből, és legalább egyet az alábbi csoportokból: az 1. csoportba tartozó polipeptidek vagy egy, a növekedési hormonok felszabadulását elősegítő vegyület, például egy, a 2. csoportba tartozó polipeptid. Az 1. csoportba tartozik bármely, a természetben előforduló, növekedési hormont felszabadító hormon és annak funkcionális megfelelői. A fenti polipeptidek az emlősök, szárnyasok, és rákfélék növekedési hormont felszabadító hormonreceptoraira agonistaként hatnak.
A 2. csoportba tartoznak az alábbi peptidek:
Tyr-DArg-Phe-NH2,
Tyr-DAla-Phe-NH2,
Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2,
Tyr-DMet(O)-Phe-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2,
Phe-DArg-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2,
Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2,
Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH2, (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Gly-ol,
Tyr-DArg-Gly-(NMe)-Phe-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Sar-ol,
Tyr-DAla-Phe-Sar-ol,
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2,
Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2,
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Gly-ol,
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol,
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2,
Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2,
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (szabad ditiol),
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (szabad ditiol),
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2 és szerves vagy szervetlen addíciós sóik. Ezen kombinációkat a növekedési hormon felszabadulását és az állati vérben mért szintjének emelését okozó szinergetikus hatás előidézéséhez szükséges mennyiségben adjuk be.
A szakmában jártasak más olyan vegyületeket is ismernek, amelyek a növekedési hormon felszabadulását idézik elő, ilyenek például az acetokolin-észterázinhibitorok, valamint a β-adrenergiás és az a2adrenergiás blokkolószerek.
A találmány egy előnyös megvalósításában a természetben előforduló, növekedési hormont felszabadító hormonokat és azok funkcionális megfelelőit használjuk a növekedési hormonok felszabadulását elősegítő vegyületekkel és a találmány szerinti peptidekkel együtt, például az 1. és a 2. csoportba tartozó vegyületeket a találmány szerinti peptidekkel, vagy egy másik példaként az 1. csoportba tartozó vegyületeket vagy βadrenergiás blokkolószereket a találmány szerinti peptidekkel együtt.
A találmány szerinti polipeptidből vagy polipeptidek kombinációjából beadandó mennyiség sokféle tényezőtől függ, így például a kezelendő állattól, annak életkorától és nemétől, az elérni kívánt terápiás hatástól, a beadási módtól, valamint attól hogy milyen polipeptidet vagy polipeptidkombinációt alkalmazunk, de minden esetben a növekedési hormon felszabadítása és a kezelt állat vérében mért szintjének emelése szempontjából hatásos dózist (terápiásán hatásos mennyiséget) alkalmazunk. Ez a dózisszint általában testtömegkilogrammonként körülbelül 0,1 pg-10 mg összes polipeptidet jelent. Az előnyös mennyiséget a szakmában jártasak a leírás alapján könnyen meghatározzák.
így például embereknél intravénás beadás esetén a dózisszint testtömeg-kilogrammonként előnyösen körülbelül 0,1 pg-10 pg, még előnyösebben körülbelül 0,5 pg-5 pg, a legelőnyösebben körülbelül 0,7 pg-körülbelül 3,0 pg összes polipeptid. A növekedési hormont felszabadító peptidek kombinációját is alkalmazhatjuk,
HU 223 664 Β1 mely esetben a találmány szerinti peptidekből értelemszerűen kisebb mennyiségek használhatók. Ha például a találmány szerinti pepiidet egy, a 4,880,778 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom leírásában szereplő és az 1. csoportba tartozó szinergetikus vegyülettel, például GHRH-val kombináljuk, akkor a találmány szerinti vegyület dózisszintje testtömeg-kilogrammonként előnyösen körülbelül 0,1 pg-körülbelül 5 pg, a másik vegyületé (például GHRH) körülbelül 0,5 pg-körülbelül 15,0 pg, még előnyösebben a találmány szerinti vegyület dózisszintje testtömeg-kilogrammonként körülbelül 0,1 pg-3 pg, a másik vegyületé pedig körülbelül 1,0 pg és körülbelül 3,0 pg közötti.
Orális beadási mód esetén általában nagyobb mennyiségek szükségesek. így például embereknél orális beadás esetén a dózisszint testtömeg-kilogrammonként előnyösen körülbelül 30 pg-körülbelül 1200 pg, még előnyösebben körülbelül 70 pg-körülbelül 600 pg, a legelőnyösebben körülbelül 200 pg-körülbelül 600 pg összes polipeptid. A szarvasmarhák és sertések általában az emberrel azonos, míg a patkányok általában magasabb dózisszintet igényelnek. A pontos dózisszint a leírás alapján kísérleti úton könnyen meghatározható.
A találmány tárgyát képezik olyan gyógyszerkészítmények, melyek hatóanyagként a fenti polipeptidek vagy kombinációik szerves vagy szervetlen addíciós sóit tartalmazzák, adott esetben egy hordozó-, hígító-, felszabadulást késleltető ágyazó- vagy bevonóanyaggal együtt.
A növekedési hormonokat felszabadító peptideknek és kombinációiknak a találmány oltalmi körébe tartozó szerves addíciós sói lehetnek például acetátok, mint trifluor-acetát, továbbá lehetnek oxalátok, valerátok, oleátok, laurátok, benzoátok, laktátok, tozilátok, citrátok, maleátok, fumarátok, szukcinátok, tartarátok, naftalátok; a szervetlen addíciós sók pedig tartalmazhatnak az I. oszlopba tartozó elemeket (ezek az alkálifémsók), a II. oszlopba tartozó elemeket (ezek az alkáliföldfémsók), lehetnek ammónium- és protaminsók, tartalmazhatnak továbbá cinket, vasat, ellenionként klorid-, bromid-, szulfát- és foszfátionokat, valamint a fenti szerves csoportokat.
Embereknek előnyösen adhatók be gyógyászatilag elfogadható sók. Ilyenek például a gyógyszeriparban általánosan használt nem toxikus alkálifém- és alkáliföldfém- és ammóniumsók, mint nátrium-, kálium-, lítium-, kalcium-, magnézium-, bárium-, ammónium- és protaminsók, amelyeket a szakmában ismert módszerekkel állítunk elő. Idetartoznak továbbá a nem toxikus savaddíciós sók, melyeket szintén ismert módon, általában úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti vegyületeket egy alkalmas szerves vagy szervetlen savval reagáltatjuk. Ilyen sók például a hidrokloridok, hidrobromidok, szulfátok, hidrogén-szulfátok, acetátok, oxalátok, valerátok, oleátok, laurátok, borátok, benzoátok, laktátok, foszfátok, tozilátok, citrátok, maleátok, fumarátok, szukcinátok, tartarátok, naftilátok.
Az alábbi példák a találmány további illusztrálására szolgálnak, annak oltalmi körét nem befolyásolják.
1. példa
A növekedési hormont felszabadító peptidek előállítása
Egy kereskedelmi forgalomban kapható automatikus peptidszintetizáló készülék reakcióedényébe parametil-benzhidril-amin-hidrokloridot (pMeBHA -HC1) töltünk. A gyantát körülbelül 5 mol/g töltésig szabad aminnal szubsztituáljuk. A vegyületeket az egyes aminosavak kapcsolásával állítjuk elő a peptidszekvencia karboxiterminálisából kiindulva, megfelelő aktiválószer, például N,N’-diciklohexil-karbodiimid (DCC) alkalmazásával. Az egyes aminosavak aaminocsoportját például t-butoxi-karbonil-csoporttal, az oldalláncok reakcióképes funkciós csoportjait pedig az alábbi 1. táblázatban megadott módon védjük.
1. táblázat
A szilárd fázisú peptidszintézisnél alkalmazható oldalláncvédő csoportok
Arginin Ns-tozil-
Aszpartámsav O-benzil-
Cisztein S-para-(metil-benzil)-
Glutaminsav O-benzil-
Hisztidin N'm-tozil-
Lizin Nc-2,4-diklór-benzil-oxi-karbonil-
Metionin S-szulfoxid-
Szerin O-benzil-
Treonin O-benzil-
Triptofán Nin-formil-
Tirozin 0-2,6-diklór-benzoil-
Az első aminosav beépítése előtt a gyantát annak 1 g-jára számítva körülbelül 10 ml diklór-metánnal háromszor körülbelül 1 percig keverjük, 1 g gyantára számítva körülbelül 10 ml 10:90 arányú diklór-metános Ν,Ν-diizopropil-etil-amin (DIEA)-oldattal háromszor - egyenként két percig - keverve semlegesítjük, majd 1 g gyantára számítva körülbelül 10 ml diklórmetánnal háromszor körülbelül 1 percig keverjük. Az első és minden egyes további aminosavat egy előre elkészített szimmetrikus anhidrid alkalmazásával kapcsolunk a gyantához oly módon, hogy a megfelelően védett aminosavból a gyanta reakciókapacitásának körülbelül 6-szorosát kitevő mennyiséget és a gyanta kötési kapacitásának 2,0-szeresét kitevő DIC-t használunk megfelelő mennyiségű diklór-metánban oldva. A diklór-metánban rosszul oldódó aminosavaknál az oldatot Ν,Ν-dimetil-formamid (DMF) hozzáadásával homogenizáljuk. A szimmetrikus anhidridet általában szobahőmérsékleten vagy alacsonyabb hőmérsékleten állítjuk elő, legfeljebb 30 perccel azelőtt, hogy a reakcióedénybe betöítenénk. A szimmetrikus anhidrid előállítása során képződő diciklohexil-karbamidot úgy távolítjuk el, hogy az oldatot gravitációs szűréssel a reakcióedénybe beleszűrjük. Az aminosavaknak a gyantához történő kapcsolódását általában színteszttel követjük, egy olyan reagens - például ninhidrin - al7
HU 223 664 Bl kalmazásával, amely a primer és szekunder aminokkal reagál. Miután a védett aminosav kapcsolódása a gyantához teljes mértékben (99%-ban) végbement, az α-aminocsoport védőcsoportját egy, vagy többsavas reagenssel eltávolítjuk. Erre a célra általában trifluorecetsav 33:66 arányú diklór-metános oldatát használjuk.
Miután a kívánt aminosavszekvencia kialakítását befejeztük, a kívánt peptidet a hordozógyantáról egy reagenssel, például hidrogén-fluoriddal végzett kezeléssel hasítjuk le, amely nemcsak a peptidet hasítja le a gyantáról, hanem a legáltalánosabban használt oldalláncvédő csoportokat is. Ha BHA- vagy p-MeBHA-gyantát használunk, a hidrogén-fluoridos kezelés eredményeként szabad peptid-amidokat kapunk. Ami5 nosav-Merrifield-gyanta használata esetén a szabad peptid-alkil-amidokat egy alkalmas aminnal, végzett kezeléssel hasítjuk le (ebben az esetben a Boc-NeFMOC-Lys alkalmazása az FMOC-csoport egyidejű eltávolítását is lehetővé teszi).
A 2. táblázaton látható az egyes aminosavak gyantára történő felvitelének teljes menete.
2. táblázat
Eljárás az egyes aminosavaknak a gyantára történő felvitelére
Reagens Keverések száma 1-1 keverés időtartama
1. Diklór-metán 3 1 perc
2. TFA-diklór-metán (33.66) 1 2 perc
3. Diklór-metán 1 20 perc
4. Diklór-metán 3 1 perc
5. DIEA, DMF (10:90) 2 2 perc
6. Diklór-metán 3 1 perc
7. Boc-aminosav/DIC 1 15-120 perc*
8. Diklór-metán 3 1 perc
10. A kapcsolási reakció előrehaladásának követése**
11. Az 1-12. lépés megismétlése minden egyes aminosavnál
* A kapcsolási reakcióidő a szóban forgó aminosavtól függ.
** Hogy a kapcsolás milyen mértékig ment végbe, az általában egy színteszttel követhető. Ha a kacsolás nem tökéletes, akkor ugyanazon aminosav kapcsolását más módon, például HOBt aktív észterrel megismételjük. Ha a kapcsolás tökéletesen végbement, akkor kapcsolhatjuk a következő aminosavat.
Ezzel az eljárással állítjuk elő a 3., 4., 5. és 6. táblázatban felsorolt vegyületeket.
2. példa
A GH in vivő felszabadítása patkányokban
A Charles River Laboratories-tól (Wilmington, MA) fejletlen nőstény patkányokat szereztünk be. Megérkezésük után 25 °C-on, 10:40 órás világos: sötét ciklusokban tartottuk őket. Vizet és Purina patkányeledelt szükség szerint kaptak. A kölykök 21 napos korukig maradtak anyjuk mellett.
Csoportonként 6 db 26 napos patkányt 20 perccel az intravénás peptides kezelés előtt 50 mg/kg intraperitoneálisan beadott pentobarbitallal érzéstelenítettünk. A peptidek intravénás (iv.) beadásához hordozóanyagként 0,1% zselatint tartalmazó normál nátriumklorid-oldatot használtunk. Az 55 65 g-os, érzéstelenített patkányoknak injekció alakjában beadtuk a növekedési hormont felszabadító vegyületeknek a 3. táblázatban látható mennyiségeit. A 0,1 ml-es injekciót a jugularis (nyaki) vénába adtuk be.
perccel az utolsó vizsgálati injekció (ld. 3. táblázat) beadása után minden állatot guillotinnal lefejeztünk, majd a vér GH-szintjeinek méréséhez a törzsből származó vért összegyűjtöttük. A vért hagytuk megalvadni, majd a vérrögöket a szérumtól centrifugálással elválasztottuk. A szérumot mindaddig fagyasztva tároltuk, míg a növekedési hormon-szintek meghatározására szolgáló, a National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIADDK) által kidolgozott és az alábbiakban leírt radioimmunvizsgálatához mintákat nem vettünk belőle.
A reagenseket általában a hűtőszekrény hőmérsékletén (körülbelül 4 °C), a következő sorrendben töltjük be a RíA-elemzés kémcsőibe:
(a) puffer (b) „hideg” (vagyis nem radioaktív) standard vagy meghatározandó ismeretlen szérumminta, (c) radiokatív jóddal megjelölt növekedésihormonantigén, és (d) növekedésihormon-antiszérum.
A reagenseket általában úgy adagoljuk, hogy a RIA kémcsőben elért végső hígítás körülbelül 1:30 000 legyen (az antiszérum és az összes folyadék térfogataránya).
Az összekevert reagenseket ezután rendszerint 24 órán át szobahőmérsékleten (körülbelül 25 °C-on) inkubáljuk, majd hozzáadunk egy második antitestet (például a majom gamma-globulinjával szembeni
HU 223 664 Bl kecske- vagy nyúlszérumot), amely a komplexbe vitt növekedésihormon-antiszérumhoz kötődik, és kicsapja azt. Ezután a RIA kémcsövekben lévő csapadékokból egy gamma-szcintillációsszámlálóval meghatározzuk az adott idő alatt jelentkező becsapódások számát. 5 A becsapódások számát a növekedési hormon (GH) szintjének függvényében ábrázolva felveszünk egy összehasonlító görbét. Az ismeretlen minták GHszintjét azután ehhez az összehasonlító görbéhez viszonyítva határozzuk meg.
A szérum GH-t RIA-módszerrel mértük, a National Hormoné and Pituitary Programtól kapott reagensek alkalmazásával.
A 3. táblázatban a szérumszinteket ng/ml-ben adjuk meg a patkány GH standard értékében (0,61 nemzetközi egység/mg, IU/mg) kifejezve. Az adatok mellett feltüntettük a középértéktől való ± eltérést (standard hiba, SEM). A statisztikai elemzést Student-t-vizsgálattal végeztük. A 3. táblázatban a 6-6 patkánnyal kapott ered10 mények átlagértékei láthatók.
3. táblázat
Növekedési hormont felszabadító vegyületekkel elért in vivő GH-felszabadulás pentobarbitallal érzéstelenített patkányokban (az utolsó injekció beadása után 10 perccel az állatokat lefejeztük)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis3 (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,1 337±51 610±90
0,3 337±51 1140± 187
1,0 337±51 2909±257
3,0 337±51 3686±436
* His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,1 131 ±43 540± 148
0,3 131 ±43 751 ±88
1,0 131 ±43 1790±252
3,0 131 ±43 2481±209
DAIa-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,1 337±51 1381±222
0,3 337±51 2831 ±304
1,0 337±51 2886± 179
3,0 337±51 3678±287
* Ala-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 167 ±46 363±73
1,0 167±46 1450±294
3,0 167±46 2072±208
10,0 167 ±46 2698±369
* DAIa-pNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 160±151 263±45
0,3 1,0 160±151 315±85 426±41 1
*-gal a találmány oltalmi körén kívüli vegyületeket jelöljük
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis3 (pg/iv) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 111±24 526±86
0,3 111±24 1608 ±204
1,0 111±24 2820±346
3,0 111±24 2437±214
* Ala-DpNal-Ala-NMeTrp-DPhe-Lys-NH2 0,1 167 ±46 144±20
0,3 167 ±46 258±28
1,0 167±46 261 ±24
3,0 167±46 277±85
* D-Leu-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 160±51 256±94
0,3 160±51 452±49
1,0 160±51 355±94
* D-Trp-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 160±51 226±61
0,3 160±51 245±27
1,0 160±51 437±62
HU 223 664 Bl
3. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis3 (pg/iv) Kontrol lszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH,b 0,3 160±51 1418±302
1,0 160±51 2201±269
* His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,1 140±10 200±40
0,3 140±10 505±50
1,0 140±10 1640±215
* DAsn-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 228±23 122±38
0,3 228±23 195±21
1,0 228±23 197±47
* DHis-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 228±23 386±81
0,3 228±23 605 ±82
1,0 228±23 930±96
* DLys-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 228±23 262±31
0,3 228±23 340±86
1,0 228±23 335±56
* DSer-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,1 228±23 226± 11
0,3 228±23 171 ±48
1,0 228±23 212±43
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,3 228±23 1746±318
1,0 228±23 2610± 176
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,3 160±36 1237±249
1,0 160±36 2325±46
3,0 160±36 2694±370
10,0 160±36 3454± 159
Ser-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 160±36 227±39
1,0 160±36 595± 112
3,0 160±36 1303±281
10,0 160±36 2919±320
Met-DpN al-Ala-T rp-DPhe-Lys-NH2 0,3 160±36 181±48
1,0 160±36 226±58
3,0 160±36 316±66
10,0 160±36 1010±236
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,1 160±36 822±243
0,3 160±36 1594±292
1,0 160±36 2180±284
* Gln-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NI f2 0,3 131 ±43 124±15
1,0 131 ±43 340±66
3,0 131 ±43 476±109
10,0 131 ±43 673±228
Pro-D [INal - A1 a-Trp-D Phe-Ly s-N H2 0,3 135±32 264±31
1,0 135±32 513±123
3,0 135±32 1690±103
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,3 215±33 1301 ±260
1,0 215±33 2211±146
3,0 215±33 2364±365
NaAcetil-Gly-D[jNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 262±53* 268±21*
1,0 262±53* 599±219*
3,0 262 ±53* 626±210*
Sar-DfSNal-Ala-Trp-DPhc-Lys-NH2 0,3 262±53* 908±264*
1,0 262 ±53* 1681 ±262*
3,0 262 ±53* 2600±316*
* DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 215±33 436±98
1,0 215±33 660±151
3,0 215±33 776±274
HU 223 664 Β1
3. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis11 (pg/iv) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
* NaAcetil-DflNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,3 262 ±53* 339±17*
1,0 262 ±53* 430±136*
3,0 262±53* 634±118*
Ncdzopropil-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,3 262±53* 541 ±179*
1,0 262 ±53* 972±247*
3,0 262 ±53* 1636±371*
NaDietil-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 127±32* 462±132*
1,0 127±32* 899±160*
3,0 127±32* 1786±373*
NaEtil-DpNaL-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 135±32 531±80
1,0 135±32 1156±250
3,0 135±32 2666±225
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhc-Lys-NH2 0,3 135±32 1387±352
1,0 135±32 1958±353
3,0 135±32 2605±97
PAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 135±32 1937±343
1,0 135±32 3603±645
3,0 135±32 4000±500
Ava* *-DpNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 135±32 2469± 185
1,0 135±32 4034±680
3,0 135±32 3142±392
* Ala-DPNal-Ala-Trp-DPhe-NHCH2CH2NH2 0,3 208±148* 211±27*
1,0 208±168* 468±127*
3,0 208±148* 877±325*
30,0 208±148* 2325±477*
* Ala-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NHCH2CH2CH2CH2CH2NH2 0,3 208±148* 284±132*
1,0 208±148* 527±166*
3,0 208±148* 816±289*
30,0 208±148* 3650±772*
D-Ala-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NHCH2CH2CH2CH2CH2NH2 0,3 111±24 180±37
1,0 111±24 686±135
3,0 111±24 1490±179
10,0 111±24 2248±70
* Ala-DpNal-Ala-Trp-DPhe-OMe 0,3 208±148* 211±48*
1,0 208±148* 157±35*
3,0 208±148* 492 ±147*
30,0 208±148* 554±127*
D-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 111±24 526±86
0,3 111±24 1608±204
1,0 111 ±24 2820±346
3,0 111 ±24 2437±214
Aib-DpNal-ALa-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 208±148* 269±58*
0,3 208±148* 331 ±108*
1,0 208±148* 368±133*
3,0 208±148* 1090±176*
D-Ala-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys(iPr)-NH2 0,1 215±49 608± 115
0,3 215±49 1753±419
1,0 215±49 1817±297
3,0 215±49 2336± 196
* DMSO-ban oldva ** amino-valcriánsavban (Ava) oldva a az így jelölt dózisokat 29 napos nőstény patkányoknak adtuk be b kontrollként használt GH-felszabadító peptidek
HU 223 664 Bl
3. táblázat
Növekedési hormont felszabadító vegyületekkel elért in vivő GH-felszabadulás pentobarbitallal érzéstelenített patkányokban
A 3. táblázatban a találmány szerinti vegyületeket hasonlítottuk össze az ilyen vegyületek általános képletén kívül eső vegyületekkel, és kimutattuk, hogy az előbbiek patkányoknak beadva rendkívüli mértékben elősegítik a növekedési hormon felszabadulását és szintjének emelését az állatok vérében. Különösen értékelendő az előnyös vegyületek meglepő hatása a növekedési hormon felszabadítására, mert egy rövid szénláncú, kis molekulatömegű polipeptid, melynek aminoterminális végén D-alanin, C-terminális végén pedig a Lys helyén pentán-diamin van, minden bizonnyal olcsó eszközt jelent majd az állatok és emberek növekedésihormon-szintjeinek emelésére.
3. példa
A GH in vivő felszabadítása patkányokban orális beadás után
A 2. példában leírt eljárást ismételtük, azzal az eltéréssel, hogy a vegyületek ott feltüntetett dózisait intragasztrikus (gyomorba vezetett) csövön át adtuk be a patkányoknak. A beadott vegyületek, az alkalmazott dózisok és az eredmények a 4. táblázaton láthatók.
4. táblázat
Növekedési hormont felszabadító vegyületekkel elért in vivő GH-felszabadulás pentobarbitallal érzéstelenített patkányokban (az állatokat a peptidek intragasztrikus beadását követően különböző időpontokban lefejeztük)
A oszlop GH-fclszabaditó peptid Összes dózis3 (mg/kg) Szérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Szérum GH ng/ml ± SEM (N-6) 15’, (20’), (30’) múlva
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHq 10 30 247+32 247+32 786+244 1914+294
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 10* 30** 247+32 247+32 116+298 2038+444
Ava-DpNaL-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 30 322+145* 2135+586*
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhc-Lys-NH2 30 247+32 1072+137
* His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH/ 30 247+32 1810+437
* Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 a 10 196+49(15’) 147+30(20’) 133 + 18 (30’) 1421+363 1605+621 (20’) 752 + 81 (30’)
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 10 196+49 (15’) 147+30(20’) 706+133 (15’) 1062+254 (20’)
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 10 196+49(15’) 147+30(20’) 957+188(15’) 1685+524 (20’)
* His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lysa 10 196+49(15’) 147+30(20’) 1131 + 189(15’) 686+149 (20’)
PAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-I.ys-NIL 10 196+49 (15’) 147+30(20’) 1202+429(15’) 1217+239(20’)
Ava-DpNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH2 10 196±49(15’) 147+30(20’) 1407+204(15’) 1251+351 (20’)
* szuszpenzió (nehéz* vagy könnyű**) ecetsav hozzáadásával a kontrollpcptidck
A találmány szerinti vegyületek patkányoknak orálisan beadva GH-felszabadító hatásukat megtartják. Ez értékes tulajdonság, mert ez a beadási mód növeli a peptidek terápiás használhatóságát.
4. példa
A GH in vivő felszabadítása patkányokban A 2. példában leírt eljárást ismételtük. A beadott vegyületek, az alkalmazott dózisok és az eredmények θθ az 5. és 6. táblázatban láthatók.
HU 223 664 Bl
5. táblázat
Növekedési hormont felszabadító szintetikus peptidekkel elért in vivő GH-felszabadulás pentobarbitallal érzéstelenített patkányokban (az utolsó injekció beadása után 10 perccel az állatokat lefejeztük)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH2 0,30 216±27 340±38
1,00 216±27 1205±335
3,00 216±27 1703±182
10,00 216±27 2741 ±484
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH, 0,30 216±27 611 ±68
1,00 216±27 929 ±209
3,00 216±27 1765±320
10,00 216±27 2644±358
* Lys-DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,10 216±27 216±40
0,30 216±27 269±31
1,00 216±27 432± 143
3,00 216±27 771± 134
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH-Chx-NHj 0,03 216±27 517±135
0,10 216±27 1078± 174
0,30 216±27 1831 ±436
1,00 216±27 3120±761
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DAla-Lys-NH, 0,10 187±36 220±34
0,30 187±36 167±48
1,00 187±36 339±61
3,00 187±36 778 ±174
10,00 187±36 1676±470
30,00 187±36 1791±384
DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,03 153±27 409±97
0,10 153±27 1469± 152
0,30 153±27 2322±265
1,00 153±27 2765±352
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH(CH2)5NH2 0,03 177±45 542±98
0,10 177±45 932±84
0,30 177±45 1121 ±212
1,00 177 ±45 2599 ±144
NalMA-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NlL 0,03 192±41 696± 108
0,10 192±41 1049± 198
0,30 192±41 2567±419
1,00 192±41 2001 ±341
DAIa-DpNal-Ala-Trp-DPhc-NH-Chx-NH, 0,10 192±41 846± 105
0,30 192±41 1886±493
1,00 192±41 2209±187
3,00 192±41 3359±433
DAla-Tcc-Ala-Trp-DPhc-Lys-NHj 0,30 93 ±22 149±20
3,00 93 ±22 142±35
* DAla-Gly-Gly-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,30 93±22 107±14
3,00 93±22 89± 15
DAIa-DfíNal-AIa-Trp-DPhe-I.ys-NH, 0,03 93±22 230±23
0,10 93±22 1006±204
0,30 93 ±22 2110±260
1,00 93 ±22 1825±328
DAla-DpNal-Ala-Trp-DTic-Lys-NH2 0,03 93 ±22 141±26
0,10 93 ±22 156±62
0,30 93 ±22 124±31
1,00 93±22 151 ±24
HU 223 664 Bl
5. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM(N-6)
DAIa-DfiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-OH 0,10 93±22 558±162
0,30 93±22 1730±306
DAla-DfiNal-Ala-Tcc-DPIre-Lys-NH, 3,00 145±17 537±43
10,00 145±17 746±92
* DpNal-Cily-Gly-Trp-DPhc-Lys-NH, 3,00 145±17 417±37
10,00 145±17 397±114
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPal-Lys-NH2 0,10 145±17 365±42
0,30 145±17 584±148
DAla-DfiNal-Ala-Trp-DPal-Lys-OH 0,10 145±17 928±184
0,30 145±17 1782±241
* 3Me-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 87± 11 122± 11
0,10 87±11 185±27
0,30 87± 11 101 ±12
0,10 87±11 112±13
* 3Me-His-D3Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 87±11 134±28
0,10 87±11 159±30
0,30 87± 11 78±19
1,00 87±11 134±27
* Tip-Ala-DfiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,10 87±11 168±27
0,30 87±11 167±28
1,00 87±11 152±74
3,00 87±11 272±63
DAla-DfiNal-Ala-Trp-DPhc-Lys-NH, 0,03 247±53 870± 136
0,10 247 ±53 1440±267
0,30 247 ±53 2420±456
1,00 247±53 2855±347
3,00 247 ±53 3421±377
* DAla-DTcc-Ala-Trp-DPh-Lys-NH2 0,10 247±53 165±26
0,30 247±53 183±9
1,00 247±53 207±38
3,00 247 ±53 153±22
10,00 247 ±53 269±47
* Ava-Trp-DTrp-Lys-NH2 0,10 247±53 153±3O
0,30 247±53 144± 14
1,00 247±53 117±9
3,00 247±53 205±59
10,00 247±53 214±48
DAla-DfiNal-Ala-Tip-DPal-Lys-NHj 0,03 228±48 203±20
0,10 228±48 772±142
0,30 228±48 979±182
1,00 228±48 1691±139
3,00 228±48 3249±526
* Tyr-DAla-DfiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,03 228±48 164±52
0,10 228±48 247±51
0,30 228±48 196±39
1,00 228±48 329±57
3,00 228±48 878±170
* Ala-His-DfiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 228±48 894± 112
0,30 228±48 1128±274
1,00 228±48 1362± 198
HU 223 664 Bl
5. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
DAla-DfiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-OH 0,03 228±48 300±82
0,10 228±48 585±141
0,30 228±48 1202±236
1,00 228±48 2610±355
* DAla-DpNal-Ala-Trp-NMe-DPhe-Lys-NH2 0,03 167±29 123±17
0,10 167±29 132±30
0,30 167±29 232±49
1,00 167±29 233±41
* His-Trp-Ala-Trp-Phe-Lys-NH2 1,00 167±29 125±24
3,00 167±29 201±19
10,00 167±29 130±25
30,00 167±29 182±36
* Ava-DAla-DpNal-Ala-Trp-UPhe-Lys-NH, 0,03 167±29 209±33
0,10 167±29 144±42
0,30 167±29 185±47
1,00 167±29 499±110
QAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,03 167±29 489±71
0,10 167±29 1112±194
0,30 167±29 1993±259
1,00 167±29 3061±238
* DAla-DpNal-Gly-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 121 ± 14 226±26
0,30 121±14 170±31
1,00 121± 14 414±101
3,00 121± 14 713±126
* DAla-DpNal-Gly-Gly-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 121±14 95±15
0,30 121 ± 14 82±16
1,00 121± 14 177±43
3,00 121± 14 223±58
* Asp-DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 121 ± 14 210±53
0,10 121± 14 322±48
0,30 121 ± 14 557± 181
1,00 121 ±14 821± 173
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH-Chx-NH2 0,03 121±14 335±106
0,10 121 ±14 652± 129
0,30 121±14 1528±252
1,00 121±14 2410±370
* DAla-DpNal-DAla-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 200±45 166±36
0,30 200±45 197±33
1,00 200±45 343±73
3,00 200±45 531 ±121
* DAla-DpNal-Ala-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 200±45 147±21
0,30 200±45 184±45
1,00 200±45 206±66
3,00 200±45 143±9
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 200±45 1246±189
0,30 200±45 1616±250
1,00 200±45 2574±467
3,00 200±45 2789±130
* DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,03 200±45 608 ±140
0,30 200±45 920±225
1,00 200±45 1755±291
3,00 200±45 2527±196
HU 223 664 Bl
5. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-fclszabaditó peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
* DAla-DpNal-Ala-Trp-Pro-Lys-NH2 0,03 157+40 113+14
1,00 157+40 136+40
3,00 157+40 195+35
10,00 157+40 226+42
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DPro-Lys-NHj 0,30 157+40 234+36
1,00 157+40 358+48
3,00 157+40 576+77
10,00 157+40 1624+241
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DLcu-Lys-NH2 0,30 157+40 202+27
1,00 157+40 165+12
3,00 157+40 307+51
10,00 157+40 1591+568
Ava-DfNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,03 157+40 768+191
0,10 157+40 1277+61
0,30 157+40 1733+254
1,00 157+40 2418+162
6. táblázat
Növekedési hormont felszabadító szintetikus peptidekkel elért in vivő GH-felszabadulás pentobarbitallal érzéstelenített patkányokban (az utolsó injekció beadása után 10 perccel az állatokat lefejeztük)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml +SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml +SEM (N-6)
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-iLys-NHj 0,03 186+34 412+84
0,10 186+34 630+124
0,30 186+34 1877+195
1,00 186+34 3008+417
* DAla-DpNal-Ala-homo-Phe-DPhe-Lys-NHj 0,03 93+13 214+71
0,10 93+13 214+58
0,30 93+13 406+121
1,00 93+13 1189+120
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-l,3-diamino-propán 0,03 93 + 13 444+60
0,10 93 + 13 517+109
0,30 93 + 13 2341+479
1,00 93 + 13 2468+276
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 93 + 13 362+64
0,10 93+13 800+192
0,30 93 + 13 2674+486
1,00 93+13 3658+610
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-1,6-hexil-diamin 0,03 85+16 395+91
0,10 85+16 905 + 113
0,30 85+16 735+166
1,00 85+16 2708+310
IMA-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-1,3-diamino-propán 0,03 85+16 566+157
0,10 85+16 645 + 167
0,30 85+16 1428+271
1,00 85+16 2972+365
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Arg-NHj 0,03 125+12 252+29
0,10 125+12 645+90
0,30 125+12 1180+318
1,00 125+12 2197+285
HU 223 664 Β1
6. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM(N-6)
* Arg-DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Arg-NHj 0,10 125+12 155+43
0,30 125+12 247 ±70
1,00 125+12 276+ 16
IMA-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-1,6-hexil-diamin 0,03 125+12 332+59
0,10 125+12 609+165
0,30 125+12 1139+232
1,00 125+12 1996+372
* DAla-DpNal-Ala-Trp-Lys-NH2 0,30 160+33 187+44
1,00 160+33 257+18
3,00 160+33 198+31
10,00 160+33 193+33
30,00 160+33 236+23 1
* DAla-DpNal-Ala-Trp-NH, 0,30 160+33 115+22
1,00 160+33 107+23
3,00 160+33 101 + 13
10,00 160+33 199+40
30,00 160+33 232+69
DAla-D(5Nal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH(CH2)5NH2 0,03 160+33 517+89
0,10 160+33 1164+255
0,30 160+33 2023+242
1,00 160+33 3441+435
* DAla-DpNal-Ala-Trp-Pro-Lys-NH2 0,30 157+40 113+14
1,00 157+40 136+40
3,00 157+40 195+35
10,00 157+40 226+42
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DPro-Lys-NH2 0,30 157+40 234+36
1,00 157+40 358+48
3,00 157+40 576+77
10,00 157+40 1624+241
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DLeu-Lys-NH2 0,30 157+40 202+27
1,00 157+40 165+12
3,00 157+40 307+51
10,00 157+40 1591+568
Ava-DpNal-Ala-Trp-DPhc-Lys-NH2 0,03 157+40 768+191
0,10 157+40 1277+61
0,30 157+40 1733+254
1,00 157+40 2418+162
a,yABU-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 108+20 621+85
0,10 108+20 1230+317
0,30 108+20 2385+182
1,00 108+20 3011+380
* DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-His-NH2 0,03 108+20 246+22
0,10 108+20 199+34
0,30 108+20 370+67
1,00 108+20 1419+230
DAla-DfiNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHj 0,03 108+20 366+81
0,10 108+20 1011 + 175
0,30 108+20 2361+233
1,00 108+20 3057+472
* DAla-DpNal-Ala-Trp-NH-Chx-NH2 0,10 108+20 151+35
0,30 108+20 251+43
1,00 108+20 227+55
3,00 108+20 349+72
HU 223 664 Bl
6. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-fclszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Om-NH2 0,03 200±33 515±92
0,10 200±33 787±71
0,30 200±33 1288±365
1,00 200±33 1888±615
* DAla-DPNAl-Ala-Trp-DHis-Lys-NH2 0,03 200±33 287±48
0,10 200±33 131 ±37
0,30 200±33 337±78
1,00 200±33 457±124
Az 5. és 6. táblázat azt mutatja, hogy a találmány szerinti vegyűletek nagyobb mértékben segítik elő a növekedési hormon felszabadulását és vérszintjének emelését, mint az egyéb vegyűletek.
5. példa
A GH in vivő felszabadítása emberekben
Normális, 25 éves átlagos életkorú férfiaknak orálisan beadtuk az Ala-His-DpNal-Ala-Trp-Dphe-LysNH2 (GHRP-1) vagy a DAla-DpNal-Ala-Trp-DpheLys-NH2 (GHRP-2) peptidet. 40 személy 300 pg/kg 25 GHRP-l-et kapott 20 ml vízben, majd 100 ml vizet tisztán, 39 személy 600 pg/kg GHRP-l-et kapott 20 ml vízben, majd 100 ml vizet, 11 személy pedig 100 pg/kg GHRP-2-t kapott 20 ml vízben, majd 100 ml vizet. Rendszeres időközökben - amint az az 30
1. ábrán látható - vért vettünk, és a mintából a 2. példa szerinti módon, radioimmunvizsgálattal meghatároztuk a növekedésihormon-szinteket. Az eredmények az 1. ábrán láthatók. 100 pg/kg GHRP-2 orális beadásával magasabb növekedésihormon-szinteket értünk el, mint 300 pg/kg GHRP-1 orális beadásával.
6. példa
A GH in vivő felszabadítása patkányokban A 2. példában leírt általános eljárást ismételtük, azzal az eltéréssel, hogy a peptideket nem intravénásán, hanem szubkután injektáltuk, és a lefejezést nem 10, hanem 15 perc elteltével végeztük. A beadott vegyületek, az alkalmazott dózisok és az eredmények a 7. táblázatban láthatók.
7. táblázat
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszérum GH ng/ml ±SEM(N-6) =-Ί Kezelt szérum GH ng/ml ±SEM (N-6)
IMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHj 0,03 147±21 181±36
0,10 147±21 399±40
0,30 147±21 808± 187
1,00 147±21 2394±475
a,yABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 0,03 147±21 192±29
0,10 147±21 288±62
0,30 147±21 461 ±90
1,00 147±21 1441 ±203
IMA-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Alá-1,5-pentadiamin 0,03 147±21 475±96
0,10 147±21 916±169
0,30 147±21 1118±243
1,00 147±21 2660±599
His-DpNal-ALa-Phe-DPhe-Lys-NH, 0,03 217±33 317±55
0,10 217±33 348±65
0,30 217±33 1283±258
1,00 217±33 1374±107
Ala-His-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH, 0,03 2I7±33 341 ±35
0,10 217±33 516±118
0,30 217±33 1060± 151
1,00 217±33 1467 ±208
rABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-I.ys-NHi 0,03 217±33 197±31
0,10 217±33 182±20
0,30 217±33 524±116
1,00 217±33 1127±110
HU 223 664 Β1
7. táblázat (folytatás)
A oszlop GH-felszabadító peptid Összes dózis (pg/iv.) Kontrollszcnim GH ng/ml ± SEM (N-6) Kezelt szérum GH ng/ml +SEM (N-6)
DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 0,03 217+33 287+62
0,10 217+33 1084+162
0,30 217+33 1982+345
1,00 217+33 2887+275
DAla-Phe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 0,03 132+18 167+29
0,10 132+18 499+62
0,30 132+18 1132+145
1,00 132+18 2147+268
DAla-D(lNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 0,03 132+18 356+77
0,10 132+18 756+132
0,30 132+18 1564+224
1,00 132+18 2272+406
7. példa
Peptidfragmentumok kondenzációs reakciója a peptid előállításához Általános eljárások
Az olvadáspontok meghatározásához egy Thomas Hoover kapilláris olvadáspontmérő berendezést használhatunk. Az infravörös spektrum (IR) felvételéhez egy Perkin-Elmer Model 137 vagy egy Nicolet Model 5DX spektrofotométert használunk, a mért értékeket hullámszámban (cm1) adjuk meg. A tömegspektrumot (MS) VG Analytical Ltd. Model ZAB-1F tömegspektrométerrel vehetjük fel El (elektronütköztetéses), FD (meződeszorpciós) vagy FAB (gyors atombombázási) módban. A GCMS-vizsgálatot végezhetjük egy 30 m DB5 kapillárisoszloppal (J & W Scientific) felszerelt Finnigan 4023 GCMS gázkromatográffal, hélium vivőgáz alkalmazásával. Az optikai forgatóképességet a Rudolph Research által gyártott Autopol III polariméterrel mérhetjük.
Az 'H-NMR-spektrumot egy 400 M Hz-en működő JEOL GX-400 NMR vagy egy 270 M Hz-en működő JEOL GX-270 NMR-készülékkel mérjük. Ezek a készülékek 0,7 Hz-nél kisebb rutinszerű digitális feloldásra képesek. A kémiai eltolódásokat ppm-ben (egymilliomod rész) fejezzük ki a nemzetközileg elfogadott 3-(trimetil-szilil)-tetradeutro-nátrium-propionáthoz (TSP) viszonyítva.
A nagy teljesítményű folyadékkromatográfiát (HPLC) egy L-5000 gradiensszabályozóból és egy Vydac 201TP1010 vagy 218TP1010 félpreparatív oszlophoz kapcsolt 655A szivattyúból álló Hitachi rendszerrel végezhetjük. Eluensként 0,2%-os trifluor-ecetsav-oldat és metanol különböző elegyeit alkalmazhatjuk. A szóban forgó vegyületeket általában 6 ml/perc sebességgel eluáljuk, miközben a szerves oldószer aránya fokozatosan, percenként 1-2%-kal növekszik. A vegyületeket azután a megfelelő hullámhosszaknál egy LKB 2140 dióda elrendezésű UV-detektorral mutatjuk ki. Az integrálást Nelson Analytical szoftverrel (3.6 verzió) végezhetjük.
A reakciókat - hacsak nincs másképp megadva inért nitrogén- vagy argonatmoszférában hajtjuk végre.
A vízmentes tetrahidroíuránt (THF, UV-minőség) és dimetil-formamidot (DMF) a Burdick és Jackson cégtől szerezhetjük be, és közvetlenül a palackból használhatjuk. Szárításra vízmentes MgSO4-ot alkalmazunk.
A) Az NH2-Trp-Dphe-Lys(Boc)-NH2 tripeptidfragmentum előállítása
Nv-Benzil-oxi-karbonil-fN^-t-butoxi-karbonilj-lizin-amid, 4
88,24 g (0,544 mól) karbonil-diimidazolt (CDI, 2) 1500 ml vízmentes tetrahidrofuránban (THF) oldunk, és 10 °C-ra hűtve lassan hozzáadunk 180 g (0,474 mól) Ne-t-butoxi-karbonil)-lizint (1). Az adagolás során gázfejlődés tapasztalható. Az N' -benzil-oxi-karbonil(Ne-t-butoxi-karbonil)-lizin-imidazolid (3 közbenső termék) képződése közben 2000 ml THF-t ammóniával telítünk (a THF-on 5-10 °C-on vízmentes ammóniagázt vezetünk át). Mikor úgy látjuk, hogy a 3 közbenső termék képződése befejeződött (vagyis a gázfejlődés már körülbelül 2 órája megszűnt), a 3 közbenső terméket tartalmazó THF-os oldat felét hozzáadjuk az ammóniaoldathoz. A 3 közbenső terméket tartalmazó oldat visszamaradt részét 30 perc múlva adjuk az oldathoz. Az adagolások ideje alatt és még további 45 percen át folyamatos ammóniagáz-áramot tartunk fenn. A 3 közbenső terméket tartalmazó oldat hozzáadása után fehér csapadék válik ki. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd 15 órán át keverjük. Ezután a szuszpenzióból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A maradékot vízben szuszpendáljuk, a kapott szilárd anyagot vákuumszűréssel leszűrjük.
N^-t-Butoxi-karbonil-lizin-amid, 5 g 5%-os Pd/C (szénen megkötött palládium) katalizátort 250 ml metanolban szuszpendálunk, és argonatmoszférában hozzáadunk 181,48 g (0,479 mól) 4 lizin-amidot 1000 ml metanolban oldva. Körülbelül 15 percig hidrogént buborékoltatunk át a reakcióelegyen, majd addig keverjük hidrogénatmoszférában, míg a HPLC-elemzés azt nem mutatja, hogy a reakció teljes mértékben végbement (36 óra). Ezután a hidrogénatmoszférát argonnal váltjuk fel. A reakcióoldatot Celite betéten leszűrve derítjük, majd az oldószert vákuumban eltávolítva szilárd anyagot kapunk.
HU 223 664 Β1
Na-Benzil-oxi-karbonil-D-fenil-alanil-(Ne-t-butoxi-karbonil)-lizin-amid, 8
66,03 g (0,409 mól) CDI-t (2) 500 ml THF-ban oldunk, és 10 °C-ra hűtve lassan hozzáadunk 126,39 g (0,423 mól) Na-benzil-oxi-karbonil-D-fenil-alanint (6). Az adagolás során gázfejlődés tapasztalható. Ennek megszűnte után 110,75 g (0,452 mól) 5 lizin-amidot adunk az oldathoz 500 ml THF-ban oldva. Körülbelül 48 óra múlva a keverékből a szilárd anyagokat szűréssel eltávolítjuk, majd a szűrletet vákuumban bepároljuk.
Az így kapott maradékot 500 ml etil-acetáttal (EtOAc) felvesszük, és választótölcsérben a következőképpen mossuk:
1. háromszor 500 ml 1 N vizes sósavoldattal; az első mosás utáni mosóoldat pH-ja körülbelül 8, a következőké 1,
2. 500 ml vízzel,
3. kétszer 500 ml félig telített vizes nátriumkarbonát-oldattal, azután a képződött kristályos szilárd anyagot (8) szűréssel eltávolítjuk,
4. háromszor 500 ml vízzel.
A szerves réteget magnézium-szulfáton szárítjuk. Derítés után az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Az így kapott maradékot forró EtOAc-ból átkristályosítva egy második adagot kapunk a 8 közbenső termékből.
D-Fenil-alanil-(Nc-t-butoxi-karbonil)-lizin-amid, 9 g 5%-os Pd/C katalizátort 200 ml metanolban szuszpendálunk, és argonatmoszférában hozzáadunk 120,53 g (0,229 mól) 8 amidot 1500 ml metanolban oldva, majd az argonatmoszférát hidrogénre cseréljük. Mikor a HPLC-elemzés azt mutatja, hogy a reakció teljes mértékben végbement (körülbelül 4 óra), a hidrogénatmoszférát argonnal váltjuk fel. Ezután a reakcióoldatot Celite betéten leszűrve derítjük, majd az oldószert vákuumban bepároljuk. A maradékként kapott dipeptidet a /2 tripeptid szintéziséhez közvetlenül felhasználhatjuk.
Na-Benzil-oxi-karbon iltriptofil-D-fenil-alanil-(NQ-t-butoxi-karbonil)-lizin-amid, 12
67,60 g (0,209 mól) N“-benzil-oxi-karbonil-triptofánt (10) és 33,05 g (0,204 mól) CDI-t (2) 500 ml THF-ban oldunk, és az oldatot 10 °C-ra hűtve addig keverjük, míg a gázfejlődés megszűnik. Ezután körülbelül 200 ml THF-ban oldva 40,8 g (0,103 mól) 9 közbenső terméket adunk a reakcióelegyhez. A kapott oldatot 15 órán át állni hagyjuk, miközben melegítéssel szobahőmérsékleten tartjuk. A képződött szilárd anyagot vákuumszűréssel eltávolítjuk, majd a szűrletet vákuumban bepároljuk. Az így kapott maradékot 4000 ml EtOAc-tal enyhe melegítés közben feloldjuk. Az oldatot szobahőmérsékletre lehűtve szilárd anyag válik ki. Ezt vákuumban leszűrjük, és forró metanolból átkristályosítjuk, így megkapjuk a tisztított 12 tripeptidet. Az első kristályosításból kapott EtOAc-os szűrletet választótölcsérben a következőképpen mossuk:
1. kétszer 500 ml 1 N vizes sósavoldattal,
2. 500 ml vízzel,
3. kétszer 500 ml félig vizes telített nátriumkarbonát-oldattal,
4. egyszer 500 ml vizes nátrium-klorid-oldattal.
A szerves réteget magnézium-szulfáton szárítjuk, majd vákuumszűréssel derítjük. A szűrletből az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Az így kapott maradékot forró EtOAc-tal ismét felvesszük. Az így kapott szilárd anyagból forró metanolból történő átkristályosítással a 12 tripeptid egy újabb adagját nyerhetjük ki fehér szilárd anyag alakjában.
Triptofil-D-fenil-alanil-(N--t-butoxi-karbonil)-lizin-amid, 13 g 5%-os Pd/C katalizátort 250 ml metanolban szuszpendálunk, és argonatmoszférában hozzáadunk 64,59 g (0,091 mól) 12 tripeptidet 1500 ml metanolban oldva, majd az oldathoz további 2250 ml metanolt adunk. Ezután az argonatmoszférát hidrogénre cseréljük, és a reakcióelegyet 24 órán át állni hagyjuk. Mikor a reakció teljes mértékben végbement, a hidrogénatmoszférát argonnal váltjuk fel. Ezután a reakcióoldatot Celite betéten leszűrve derítjük, majd az oldószert vákuumban bepároljuk, így fehér, szilárd anyag alakjában megkapjuk a 13 tripeptidet.
B) A K-DAla-DVNal-Ala-OMe tripeptidfragmentum előállítása
Na-Benzil-oxi-karbonil-D-alanil-D-$-naftil-alanin-metil-észter, 25
0,62 mól D-P-naftll-alanin-metil-észter-hidroklorid (22) 400 ml EtOAc-tal készített oldatát 400 ml telített nátrium-karbonát-oldattal és körülbelül 500 ml 0,8 N vizes nátrium-hidroxid-oldattal mossuk. A vizes fázist, melynek pH-ja 8,5, eltávolítjuk, a szerves fázist 150 ml félig telített vizes nátrium-karbonát-oldattal, majd 50 ml vízzel mossuk. A 22 szabad bázisformát az EtOAc-os réteg vákuumbepárlásával izoláljuk.
A körülbelül 0,52 mól frissen előállított 22 szabad bázisformát, továbbá 143,5 g (0,50 mól) Na-benziloxi-karbonil-D-alanint és (19), 0,62 mól N-hidroxiszukcinimidet (HONSu, 23) körülbelül 3 liter DMF-ben oldunk, és jeges etanolos fürdőben -5 °C-ra hűtve 95 g (0,46 mól) diciklohexil-karbodiimidet (DCC) adunk hozzá. A kapott reakcióelegyet 24 órán át keverjük, eközben szobahőmérsékletre melegszik. HPLC-elemzéssel állapítjuk meg, hogy a reakció teljesen végbement-e. Ha nem, akkor a reakcióelegyet -5 °C-ra hűtjük, és további körülbelül 0,17 mól diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. Ezután újabb 24 órán át keverjük, miközben ismét szobahőmérsékletre melegszik. Ekkor a reakcióelegyet a diciklohexilkarbamid (DCU) eltávolítására leszűrjük, a szűrlethez 1 liter vizet adunk, és az így kapott oldatot vákuumban bepároljuk. A maradékot 1 N vizes sósavoldattal felvesszük (addig adjuk hozzá a sósavoldatot, míg a pH-ja eléri az 1-et, ez körülbelül 1 liter). A vizes fázist kétszer 1 liter etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos rétegeket elöntjük. A vizes fázis pH-ját 500 ml hideg 2 N nátrium-hidroxid-oldat és szemcsés nátrium-hidroxid hozzáadásával állítjuk be. A semlegesítés folyamán az oldatot 1 liter hideg etil-acetát hozzáadásával tartjuk hi20
HU 223 664 BI degen. Mikor a vizes fázis pH-ja eléri a körülbelül 7-et, rendszerint bőséges fehér csapadék vagy olaj válik ki. Ezt vákuumszűréssel vagy dekantálással elválasztjuk, és rendre kétszer 1500 ml félig vizes telített nátriumkarbonát-oldattal, hatszor 1500 ml vízzel és háromszor 1500 ml etil-acetáttal mossuk. A kapott anyagot nagyvákuumban tömegállandóságig szárítjuk. Ezt az anyagot további tisztítás nélkül közvetlenül hidrolizálhatjuk.
Na-Benzil-oxi-karbonil-D-alanil-$-naftil-D-alanin,
Körülbelül 0,38 mól 25 dipeptidet 360 ml vízben és körülbelül 6 liter metanolban oldunk, és 192 ml 0,08 g/ml koncentrációjú (0,38 mól) vizes vizes nátrium-hidroxid-oldatot adunk hozzá. Az oldatot szobahőmérsékleten addig keverjük, míg teljes mértékben elhidrolizál (körülbelül 24 óra). HPLC-elemzéssel győződünk meg arról, hogy a kiindulási peptid már nincs jelen. Az oldatot vákuumban bepároljuk, a maradékot körülbelül 1 liter vízben oldjuk. A vizes réteget (pH-ja körülbelül 10), választótölcsérben kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos rétegeket elöntjük. A vizes fázis pH-ját koncentrált sósavoldattal körülbelül 5-re állítjuk, ekkor rendszerint fehér csapadék vagy olaj válik ki. A terméket leszűrjük és vákuumban szárítjuk.
Na-Benzil-oxi-karbonil-D-alanil-D-$-naftil-alanil-alanin-metil-észter, 20 0,505 mól HONSu-t (23) 800 ml DMF-ben oldunk, és argonatmoszférában hozzáadjuk a 0,253 mól Na-benzil-oxi-karbonil-D-alanil-p-naftil-D-alanint (26). Ehhez az oldathoz hozzáadjuk 0,303 mól alaninmetil-észter-hidroklorid (15), 0,303 mól N-metil-morfolin (16) és 200 ml DMF keverékét. Az így kapott oldatot 10 °C-ra hűtjük, és 0,265 mól diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá 273 ml metilén-kloridban oldva. A reakció előrehaladását HPLC-vel követjük, miközben a reakcióelegy hőmérsékletét a reakció befejeződéséig 10 °C-on tartjuk. Ha néhány (körülbelül 4) nap múlva a reakció nem fejeződött be, további 0,080 mól 24 vegyületet adunk hozzá, és még egy napig 10 °C-on keverjük. A reakció előrehaladását továbbra is HPLCvel követjük, egészen a befejeződéséig (körülbelül 5 nap). A reakció során képződött szilárd anyagot vákuumban leszűrjük, a szűrletet vákuumban bepároljuk. A maradékot etil-acetáttal felvesszük, és kétszer 500 ml félig telített vizes nátrium-karbonát-oldattal extraháljuk. Az etil-acetátos fázist magnézium-szulfáton szárítjuk. A kapott oldatot derítjük, majd vákuumban szárazra pároljuk.
500 ml metanol és 200 ml víz elegyéhez, amely 13,7 mól N“-benzil-oxi-karbonil-DAla-DPNal-AlaOME-t tartalmaz, 7,5 ml (15 mmol) 2 N vizes nátrium-hidroxid-oldatot adunk. A reakcióelegyet egy éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd HPLCvel megvizsgáljuk, hogy mennyi maradt a kiindulási anyagból. Ha a reakció lényegében befejeződött (körülbelül egy éjszaka), az oldatot vákuumban körülbelül 200 ml-re bepároljuk. Ezután 100 ml vizet adunk hozzá, és pH-ját 1 ml 2 N nátrium-hidroxid-oldat hozzáadásával körülbelül 12-re állítjuk. A kapott oldatot kétszer 500 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos rétegeket elöntjük. A vizes fázis pH-ját vizes sósavoldattal körülbelül 5-re állítjuk, ekkor a termék rendszerint kicsapódik. Ennek elősegítésére fontos, hogy a vizes fázis térfogatát minimalizáljuk. A vizes fázist a termékről ledekantáljuk, a terméket kétszer 50 ml vízzel leöblítjük. Az elválasztott terméket vákuumban tömegállandóságig szárítjuk.
C) A peptidfragmentumok kondenzálása hexapeptid előállítására
2,6 mmol Dala-DPNal-Ala-OH-t (33) és 2,8 mmol Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH2 (13) peptidet vízmentes DMF-ben oldunk, és a kapott oldatot vákuumban bepároljuk. Ezt az előzetes bepárlást azért végezzük, hogy megkíséreljük a nyomokban esetleg jelen lévő metanol eltávolítását. A kapott peptidkeveréket ismét feloldjuk, és 5,1 mmol N-hidroxi-szukcinimidet adunk hozzá. Az így kapott oldatot -2 °C-ra hűtjük, és
3.4 mmol diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá
3.5 ml metilén-kloridban oldva. A reakcióelegyet -2 °C-on három napig keverjük, majd HPLC-vel megvizsgáljuk, hogy a reakció lényegében befejeződött-e. Ha nem, akkor további diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá, és a kapott reakcióelegyet még egy napon át -2 °C-on keverjük. Ha ekkor (összesen 4 nap múltán) a HPLC azt mutatja, hogy a reakció még mindig nem ment végbe tökéletesen, akkor a reakcióelegy hűtését megszüntetjük, és hagyjuk, hogy az oldat lassan, több (körülbelül 8) óra alatt szobahőmérsékletre melegedjék. Ezt az eljárást addig ismételjük, míg a reakció teljesen végbe nem megy. Ezután 50 ml vizet hozzáadva a reakcióelegyet még egy napig keverjük, majd a diciklohexil-karbamid eltávolítására leszűrjük, és a szűrletet vákuumban viszkózus olajjá bepároljuk. A maradékhoz etil-acetátot és 200 ml félig telített vizes nátrium-karbonát-oldatot adunk. A kétfázisú keveréket rotary bepárlóban körülbelül 1 órán át erőteljesen forgatjuk. Az esetleg kivált szilárd anyagot zsugorított üvegszűrőn leszűrjük. A szerves fázist vízzel mossuk, majd tömegállandóságig szárítjuk, így megkapjuk a kívánt terméket.
DAla-DWal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2 (35) ml trifluor-ecetsavat, 14 ml dimetil-szulfidot, 7 ml 1,2-etán-ditiolt és 2,2 ml anizolt 15 ml metilénkloridban oldunk, és hozzáadjuk az 1,02 mmol benziloxi-karbonil-Dala-DPNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys(Boc)NH2 (34) hexapeptidet. A homogén reakcióelegyet 15 percig keverjük. Ezen idő eltelte után 450 ml vízmentes étert adunk hozzá, ennek hatására kiválik a biológiailag aktív nyers 35 peptid. Ezt a terméket zsugorított üvegszűrőn leszűrve vagy dekantálással elválasztjuk. A kapott terméket vízben oldjuk, és liofilizáljuk. A liofilizált terméket tovább tisztíthatjuk közepes nyomású kromatográfiával, amit egy Lichrorpep™ RP-18 (C-18, 25-40 nm, szabálytalan szemcsés) töltőanyagot tartalmazó 26x460 mm-es üvegcsőben hajtunk végre. A peptid vizes oldatának beinjektálása után az oszlopot 9 ml/perc áramlási sebességgel, 5-20 órán át 0—>25% metanolgradienssel, majd körülbelül
HU 223 664 Bl órán át 25—>55% metanolgradienssel eluáljuk. Ezután a gradiens metanolkoncentrációját óránként 2%-os sebességgel növeljük. Az eluens másik része 0,2% trifluorecetsavat tartalmazó vízből áll. A 35 terméket HPLC-vel vizsgáljuk, és a megfelelő eluátumfrakciók bepárlásával izoláljuk.
A kapott termék szagtalan, sárgásfehér por, melynek aminosavszekvenciáját PSQ-1 típusú proteinszekvencia-mérő eszközzel (Shimadzu) mérve a kapott eredmény megfelel a számítottnak.
A szabad bázis molekulatömege: 817,99 (FAB tömegspektrummérés JMS-SX102 típusú spektrográffal).
'HNMR-spektrumot egy JNM-EX270 típusú (Nihon
Denshi) készülékben felvéve az alábbi értékeket kapjuk (N-H protonok és HCl-protonok nem mutathatók ki).
iH-NMR 8270 M Hz, D2O-ban δ 7,95-7,43 (m, 7H, naftil), 7,52-6,99) (m, 5H, indol), 7,32-7,17 (m, 5H, fenil), 4,62 (t, J=6,9 Hz, 1H, CH Nal), 4,44 (t, J=6,9 Hz, 1H, CH, Phe), 4,26 (t, J=6,9 Hz, 1H,
CH Trp), 4,15-4,02 (m, 3H, CH Alá, CH Alá, CH Lys), 3,35-3,07 (m, 2H, CH2 Nal), 3,24-3,07 (m, 2H, CH2 Phe), 2,86 (t, J = 7,9 Hz, 2H, CH2(e)Lys), 2,68-2,47 (m, 2H, CH2, Trp), 1,70-1,57 (m, 2H, CH2(P)Lys), 1,51 (d, J=6,9 Hz,
3H, CHjAla), 1,50-1,35 (m, 2H, CH2(ő)Lys),
0,99-0,88 (m, 2H, CH2(y)Lys), 0,82 (d, J=6,9 Hz, 3H, CH3 Alá).
A találmány részletes leírása során annak előnyös megvalósításait ismertettük. A szakmában jártasak szá15 mára nyilvánvaló, hogy a leírás alapján a találmány oltalmi körébe eső, annak szelleme szerinti módosítások és változtatások végrehajthatók.

Claims (20)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. (I) általános képletű peptid
    A j - A2-Ala-C2-C3-A5 ahol az általános képletben
    A[ jelentése Gly, Alá, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro,
    Sár, Ava, Aib, N,N-bisz(kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, vagy (kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, ahol a kis szénatomszámú alkilcsoport 2 és 6 közötti szénatomot tartalmazó, egyenes láncú alkilcsoportot jelent;
    A2 jelentése DTrp, DPNal vagy DPhe,
    A5 jelentése A3-A5·, vagy A5- általános képletű csoport, ahol
    A3 jelentése Alá vagy DAla,
    Aj. jelentése Lys(c-R|R2)-Z vagy Om(ő-RjR2)-Z, melynél Rj és R2 jelentése hidrogénatom vagy 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha R, jelentése hidrogénatom, akkor R2 jelentése alkilcsoport, és ha R2 jelentése hidrogénatom, akkor Rj jelentése alkilcsoport, Z jelentése —NH2 vagy -OH csoport, vagy
    Aj. jelentése - ha At jelentése His-től eltérő - lehet még Lys-Z, Om-Z vagy Arg-Z, ahol Z jelentése -NH2 vagy -OH, vagy
    A5. jelentése -NH(CH2)XNH2 csoport, ahol x értéke 2 és 9 közötti egész szám,
    C2 jelentése Trp vagy Phe,
    C3 jelentése DPhe vagy DPal, valamint az (I) általános képletű vegyületek szerves és szervetlen addíciós sói.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol Aj jelentése Gly, DAla vagy His, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol A, jelentése DAla, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol A2 jelentése DTrp vagy DPNal, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol A2 jelentése DPNal, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol A5 jelentése A3-A5. általános képletű csoport, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  7. 7. Az 1., 2., 3., 4. vagy 5. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol A5 jelentése A5· általános képletű csoport, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol C3 jelentése DPhe, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol C2 jelentése Trp, a többi szubsztituens jelentése az 1. igénypontban megadott.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti (I) általános képletű peptid, ahol C3 jelentése DPhe, a többi szubsztituens jelentése all. igénypontban megadott.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti, DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-(E-iPr)-NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-(e-iPr)-NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-NH-(CH2)5-NH2, NH2-(CH2)5-CO-DPNal-Ala-Trp-DPhe-NH-(CH2)5nh2,
    DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2, βΑΐ3-Ηί8-ΟβΝ3ΐ-Αΐ3-Ρ1ΐ6-ΟΡ1ΐ6-ΕΥ5-ΝΗ2,
    DAla-DPNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2,
    DAla-DPNal-Ala-Phe-DPhe-Arg-NH2,
    DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-DArg-NH2, képletű peptidek, valamint szerves és szervetlen addíciós sóik.
  12. 12. Gyógyszerkészítmény növekedési hormonok felszabadulásának elősegítésére és állatokban vagy emberben mért vérszintjének növelésére, mely valamely 1. igénypont szerinti peptidet, egy gyógyászatilag elfogadható hordozó- vagy hígítóanyagot, és kívánt eset22
    HU 223 664 Bl ben egy másik vegyületet, amely vegyület a növekedési hormont felszabadító hormon receptoraira agonistaként hat, vagy amely a szomatosztatin felszabadulását inhibiálja, valamint adott esetben más segédanyagot tartalmaz.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény növekedési hormonok felszabadulásának elősegítésére és vérszintjének növelésére, mely tartalmaz valamely 1. igénypont szerinti peptidet legalább egy, a természetben előforduló, növekedési hormont felszabadító hormonnal vagy annak funkcionális megfelelőivel, vagy egy, a növekedési hormonok felszabadulását elősegítő vegyülettel együtt.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény növekedési hormonok felszabadulásának elősegítésére és vérszintjének növelésére, mely tartalmaz valamely 1. igénypont szerinti peptidet legalább egy, az 1. csoportba tartozó polipeptiddel vagy a 2. csoportba tartozó polipeptiddel együtt, ahol az 1. csoport tartalmaz minden, a természetben előforduló, növekedési hormont felszabadító hormont és azok funkcionális megfelelőit, a 2. csoport pedig az alábbi polipeptideket
    Tyr-DArg-Phe-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-NH2,
    Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2,
    Tyr-DMet(O)-Phe-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2,
    Phe-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2,
    Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2,
    Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH2, (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-ol,
    Tyr-DArg-Gly-(NMe)-Phe-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-ol,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-ol,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2,
    Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
    Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
    Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2,
    Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-ol,
    Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2,
    Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
    Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (szabad ditiol),
    Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
    Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (szabad ditiol),
    Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    T yr-D Arg-Phe-Gly-T yr-Pro-Ser-NH2 valamint szerves és szervetlen addíciós sóikat tartalmazza.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, mely tartalmaz valamely 1. csoportba tartozó és valamely 2. csoportba tartozó polipeptidet.
  16. 16. A 13. igénypont szerinti gyógyszerkészítmény, mely a növekedési hormonok felszabadulását elősegítő vegyületként β-adrenergiás vagy a2-adrenergiás blokkolószert vagy egy acetokolin-észteráz-inhibitort, és az alábbi csoportból választható peptidet:
    Tyr-DArg-Phe-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-NH2,
    Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2,
    T yr-DMet(O)-Phe-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2,
    Phe-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    T yr-D Ala-Gly-Phe-NH2,
    Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2,
    Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH2, (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-ol,
    Tyr-DArg-Gly-(NMe)-Phe-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-ol,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-ol,
    T yr-D Ala-Phe-Gly-T yr-NH2,
    Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
    Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol,
    Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2,
    Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Gly-ol,
    Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2,
    Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2,
    S ar-Tyr-D Arg-Phe- Sar-NH2,
    Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
    Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (szabad ditiol),
    Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (ciklikus diszulfid),
    Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (szabad ditiol),
    Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    T yr-D Ala-Phe- Sar-Phe-Pro-Ser-NH2,
    T yr-D Ala-Phe-Gly-Tyr-Hyp- Ser-N H2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,
    Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2,
    HU 223 664 Bl vagy ezek szerves vagy szervetlen addíciós sóját tartalmazza.
  17. 17. A 7. igénypont szerinti DAla-DPNal-Ala-Trp-Dphe-Lys-NHj, DAla-DPNal-Ala-Trp-Dphe-Lys(c-iPr)-NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys(c-iPr)-NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys-N H2, DAla-DPNal-Ala-Trp-Dphe-NH-(CH2)5-NH2, NH2-(CH2)5-CO-DPNal-Ala-Trp-Dphe-NH-(CH2)5-NH2 képletű peptid és ezek szerves vagy szervetlen addíciós sói.
  18. 18. Eljárás (I) általános képletű
    Ai-A2-Ala-C2-C3-A5 (I) peptid - ahol a képletben
    A( jelentése Gly, Alá, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro,
    Sár, Ava, Aib, N,N-bisz(kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, vagy (kis szénatomszámú alkil)amino-karbonsav, ahol a kis szénatomszámú alkilcsoport 2 és 6 közötti szénatomot tartalmazó, egyenes láncú alkilcsoportot jelent;
    A2 jelentése DTrp, DPNal vagy DPhe,
    As jelentése A3-A5·, vagy As· általános képletű csoport, ahol
    A3 jelentése Alá vagy DAla,
    A5- jelentése Lys(e-R,R2)-Z vagy Om(ő-R,R2)-Z, melynél R, és R2 jelentése hidrogénatom vagy
    1 -6 szénatomszámú alkilcsoport, azzal a megkötéssel, hogy ha Rt jelentése hidrogénatom, akkor R2 jelentése alkilcsoport, és ha R2 jelentése hidrogénatom, akkor Rt jelentése alkilcsoport, Z jelentése -NH2 vagy -OH csoport, vagy
    A5-jelentése - ha A| jelentése His-től eltérő - lehet még Lys-Z, Om-Z vagy Arg-Z, ahol Z jelentése -NH2 vagy -OH, vagy
    Aj· jelentése -NH(CH2)XNH2 csoport, ahol x értéke 2 és 9 közötti egész szám,
    C2 jelentése Trp vagy Phe,
    C3 jelentése DPhe vagy DPal,
    - valamint szerves és szervetlen addíciós sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a fenti aminosavakat vagy aminosavszármazékokat szilárd fázisú peptidszintézis során ismert módon a kívánt sorrendben egymáshoz kapcsoljuk, vagy oldatfázisú kondenzációs reakció során ismert módon állítjuk elő a kívánt pepiidet.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vegyületet oldatfázisú reakció során a peptidffagmentumok kondenzálásával állítjuk elő.
  20. 20. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosavak vagy aminosavszármazékok összekapcsolását szilárd fázisú szintézissel állítjuk elő.
HU9400495A 1991-08-22 1992-08-20 Növekedési hormon felszabadulást elősegítő peptidek és eljárás előállításukra, valamint a peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények HU223664B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/748,350 US5663146A (en) 1991-08-22 1991-08-22 Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
PCT/US1992/007026 WO1993004081A1 (en) 1991-08-22 1992-08-20 Peptides having growth hormone releasing activity

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9400495D0 HU9400495D0 (en) 1994-05-30
HUT69178A HUT69178A (en) 1995-08-28
HU223664B1 true HU223664B1 (hu) 2004-11-29

Family

ID=25009088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9400495A HU223664B1 (hu) 1991-08-22 1992-08-20 Növekedési hormon felszabadulást elősegítő peptidek és eljárás előállításukra, valamint a peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5663146A (hu)
EP (1) EP0605484B1 (hu)
JP (1) JP3179489B2 (hu)
KR (1) KR100247212B1 (hu)
CN (1) CN1035256C (hu)
AT (1) ATE172742T1 (hu)
AU (1) AU666673B2 (hu)
BG (1) BG62655B1 (hu)
BR (2) BR9206398A (hu)
CA (1) CA2116120C (hu)
CZ (1) CZ293281B6 (hu)
DE (1) DE69227462T2 (hu)
DK (1) DK0605484T3 (hu)
ES (1) ES2124263T3 (hu)
FI (2) FI120095B (hu)
HU (1) HU223664B1 (hu)
IL (1) IL102848A (hu)
MX (1) MX9204861A (hu)
NO (1) NO314695B1 (hu)
NZ (1) NZ244034A (hu)
PL (1) PL169562B1 (hu)
RO (1) RO112507B1 (hu)
RU (1) RU2126014C1 (hu)
SK (1) SK282895B6 (hu)
WO (1) WO1993004081A1 (hu)
ZA (1) ZA926337B (hu)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843941A (en) 1993-05-14 1998-12-01 Genentech, Inc. Ras farnesyl transferase inhibitors
SG55069A1 (en) * 1993-12-23 1998-12-21 Novo Nordisk As Compounds with growth hormone releasing properties
AU683121B2 (en) * 1993-12-23 1997-10-30 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US5798337A (en) * 1994-11-16 1998-08-25 Genentech, Inc. Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
US20020111461A1 (en) * 1999-05-21 2002-08-15 Todd C. Somers Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
PL186520B1 (pl) * 1995-06-22 2004-01-30 Novo Nordisk As Związk o właściwościach uwalniania hormonu wzrostu, kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten związek i jego zastosowanie
PL329413A1 (en) * 1996-04-24 1999-03-29 Novo Nordisk As Chemical compounds exhibiting properties capable to cause growth hormone release
US6127341A (en) * 1997-06-20 2000-10-03 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
EP1005484A1 (en) 1997-06-20 2000-06-07 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
ZA987383B (en) * 1997-08-19 2000-02-17 Lilly Co Eli Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues.
US6329342B1 (en) 1997-08-19 2001-12-11 Eli Lilly And Company Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues
DE69921611T2 (de) 1998-01-16 2005-11-03 Novo Nordisk A/S Verbindungen mit wachstumshormon-freisetzenden eigenschaften
WO1999039730A1 (fr) * 1998-02-09 1999-08-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation a administration orale contenant des peptides favorisant la secretion d'hormone de croissance
US6919315B1 (en) 1998-06-30 2005-07-19 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US6682908B1 (en) 1998-07-10 2004-01-27 Merck & Co., Inc. Mouse growth hormone secretagogue receptor
WO2000002919A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Merck & Co., Inc. Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids
CA2340095A1 (en) 1998-08-10 2000-02-24 Merck & Co., Inc. Canine growth hormone secretagogue receptor
EP1159292A2 (en) 1998-08-14 2001-12-05 Administrators of The Tulane Educational Fund Compounds having growth hormone releasing activity
US6639076B1 (en) 1998-08-18 2003-10-28 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US6696063B1 (en) * 1998-12-30 2004-02-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Treatment of HIV-associated dysmorphia/dysmetabolic syndrome (HADDS) with or without lipodystrophy
CA2362290A1 (en) * 1999-02-18 2000-08-24 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Novel amide derivatives as growth hormone secretagogues
US7022677B1 (en) 1999-02-18 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Amide derivatives as growth hormone secretagogues
US6828331B1 (en) * 1999-02-19 2004-12-07 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
KR20020047096A (ko) 1999-07-26 2002-06-21 크로커 사무엘 에스 초활성 돼지 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체
US20040192593A1 (en) 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
CA2387212A1 (en) * 1999-10-12 2001-04-19 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Dry powder inhalation and a method for the preparation thereof
UA73530C2 (uk) 1999-11-10 2005-08-15 Ново Нордіск А/С Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту
JP3498041B2 (ja) * 2000-05-29 2004-02-16 科研製薬株式会社 プラルモレリン含有点鼻用製剤
ES2333097T3 (es) 2000-05-31 2010-02-17 Raqualia Pharma Inc Uso de secretagogos de la hormona de crecimiento para estimular la motilidad gastrointestinal.
US7622503B2 (en) 2000-08-24 2009-11-24 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7919647B2 (en) 2000-08-24 2011-04-05 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7855229B2 (en) 2000-08-24 2010-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators
US7645898B2 (en) 2000-08-24 2010-01-12 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and method of use thereof
EP1355941A2 (en) 2001-02-02 2003-10-29 ConjuChem, Inc. Long lasting growth hormone releasing factor derivatives
US7125840B2 (en) * 2001-10-09 2006-10-24 Eli Lilly And Company Substituted dipeptides as growth hormone secretagogues
ATE536100T1 (de) * 2001-10-26 2011-12-15 Baylor College Medicine Zusammensetzung für die änderung der knocheneigenschaften bei einem probanden
US8853266B2 (en) 2001-12-06 2014-10-07 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators for treating diabetes
US6831102B2 (en) 2001-12-07 2004-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Phenyl naphthol ligands for thyroid hormone receptor
CA2469310C (en) * 2001-12-11 2013-01-29 Advisys, Inc. Plasmid mediated supplementation for treating chronically ill subjects
US7015219B2 (en) 2001-12-19 2006-03-21 Bristol-Myers Squibb Company 3-aryl-hydroxybenzoxazines and 3, 4-dihydro-3-aryl-hydroxybenzoxazines as selective estrogen receptor beta modulators
US7250405B2 (en) * 2002-02-07 2007-07-31 Baylor College Of Medicine Modified pituitary gland development in offspring from expectant mother animals treated with growth hormone releasing hormone therapy
US7772433B2 (en) 2002-02-28 2010-08-10 University Of Tennessee Research Foundation SARMS and method of use thereof
US7381730B2 (en) 2002-03-15 2008-06-03 Bristol-Myers Squibb Company 3-arylquinazoline derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
DE60306636T2 (de) * 2002-04-09 2007-07-05 Eli Lilly And Co., Indianapolis Wachstumhormonsekretionsförderer
US20060167268A1 (en) * 2002-04-09 2006-07-27 Eli Lilly And Company, Patent Division, Growth hormone secretagogues
AU2003225305A1 (en) 2002-05-08 2003-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Pyridine-based thyroid receptor ligands
US7405234B2 (en) 2002-05-17 2008-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
US7785567B2 (en) 2002-08-23 2010-08-31 Valorisation-Recherche, Société en Commandite Growth hormone-releasing peptides in the treatment or prevention of atherosclerosis and hypercholesterolemia
WO2004045518A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Open chain prolyl urea-related modulators of androgen receptor function
US8309603B2 (en) 2004-06-07 2012-11-13 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
TW200504021A (en) 2003-01-24 2005-02-01 Bristol Myers Squibb Co Substituted anilide ligands for the thyroid receptor
CA2513743C (en) * 2003-01-28 2013-06-25 Advisys, Inc. Reducing culling in herd animals growth hormone releasing hormone (ghrh)
WO2004069793A2 (en) 2003-01-28 2004-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Novel 2-substituted cyclic amines as calcium sensing receptor modulators
US7205322B2 (en) 2003-02-12 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Thiazolidine compounds as calcium sensing receptor modulators
US7557143B2 (en) 2003-04-18 2009-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Thyroid receptor ligands
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
US7459460B2 (en) 2003-05-28 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Trisubstituted heteroaromatic compounds as calcium sensing receptor modulators
US7265145B2 (en) 2003-05-28 2007-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Substituted piperidines and pyrrolidines as calcium sensing receptor modulators and method
US7476653B2 (en) 2003-06-18 2009-01-13 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic modulators of the ghrelin receptor
WO2005016964A2 (en) * 2003-08-04 2005-02-24 Advisys, Inc. Canine specific growth hormone releasing hormone
US7399826B1 (en) 2003-10-02 2008-07-15 Ali Sadat M Peptide for promoting healing of fractures
DE602004027165D1 (de) 2003-12-31 2010-06-24 VGX Pharmaceuticals LLC Reduzierung von arthritis und lahmheit bei personen unter supllement von wachstumshormon freisetzendem hormon (ghrh)
ATE507239T1 (de) * 2004-01-20 2011-05-15 VGX Pharmaceuticals LLC Erhöhte sekretion/retention von wachstumshormonfreisetzendem hormon (ghrh) aus muskelzellen durch speziesspezifisches signalpeptid
US20050164952A1 (en) * 2004-01-23 2005-07-28 Vital Pharmaceuticals, Inc. Delivery system for growth hormone releasing peptides
US7820702B2 (en) 2004-02-04 2010-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Sulfonylpyrrolidine modulators of androgen receptor function and method
US7378426B2 (en) 2004-03-01 2008-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Fused heterotricyclic compounds as inhibitors of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3
US7625923B2 (en) 2004-03-04 2009-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
US7696241B2 (en) 2004-03-04 2010-04-13 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic compounds as modulators of androgen receptor function and method
US9884038B2 (en) 2004-06-07 2018-02-06 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof
US9889110B2 (en) 2004-06-07 2018-02-13 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions
ATE413890T1 (de) * 2004-07-23 2008-11-15 Advisys Inc Wachstumshormon-freisetzendes hormon verstärkt die vakzin-induzierte immunantwort
AU2005277389A1 (en) 2004-08-18 2006-03-02 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Growth-hormone secretagogues
US7456188B1 (en) 2005-04-28 2008-11-25 Bristol-Myers Squibb Company C-5 substituted quinazolinone derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
EP2425715B1 (en) 2005-08-31 2014-03-05 University of Tennessee Research Foundation Treating symptoms of renal disease with selective androgen receptor modulators (SARM)
CU23558A1 (es) 2006-02-28 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos análogos a los secretagogos peptidicos de la hormona de crecimiento
US8058253B2 (en) * 2006-07-06 2011-11-15 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Growth hormone releasing hormone treatment to decrease cholesterol levels
MX2009000385A (es) 2006-07-12 2009-04-06 Univ Tennessee Res Foundation Acil-anilidas sustituidas y metodos de uso de las mismas.
CA2659336C (en) 2006-08-02 2015-03-24 Cytokinetics, Incorporated Certain 1h-imidazo[4,5-b]pyrazin-2(3h)-ones and 1h-imidazo[4,5-b]pyrazin-2-ols, compositions thereof and their use
US8299248B2 (en) 2006-08-02 2012-10-30 Cytokinetics, Incorporated Certain 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2(3H)-ones and 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2-ols and methods for their use
US10010521B2 (en) 2006-08-24 2018-07-03 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US9730908B2 (en) 2006-08-24 2017-08-15 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
ES2581765T3 (es) 2006-08-24 2016-09-07 University Of Tennessee Research Foundation Acilanilidas sustituidas y métodos de uso de las mismas
US9844528B2 (en) 2006-08-24 2017-12-19 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
EP2644618B1 (en) 2007-02-09 2016-08-17 Ocera Therapeutics, Inc. tether intermediates for the synthesis of macrocyclic ghrelin receptor modulators
WO2008134828A2 (en) 2007-05-04 2008-11-13 Katholieke Universiteit Leuven Tissue degeneration protection
US7968603B2 (en) 2007-09-11 2011-06-28 University Of Tennessee Research Foundation Solid forms of selective androgen receptor modulators
US8003689B2 (en) 2008-06-20 2011-08-23 Gtx, Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
AR081331A1 (es) 2010-04-23 2012-08-08 Cytokinetics Inc Amino- pirimidinas composiciones de las mismas y metodos para el uso de los mismos
AR081626A1 (es) 2010-04-23 2012-10-10 Cytokinetics Inc Compuestos amino-piridazinicos, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos para tratar trastornos musculares cardiacos y esqueleticos
EP2560488B1 (en) 2010-04-23 2015-10-28 Cytokinetics, Inc. Certain amino-pyridines and amino-triazines, compositions thereof, and methods for their use
WO2013190520A2 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The General Hospital Corporation Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions
US10314807B2 (en) 2012-07-13 2019-06-11 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
PT2872482T (pt) 2012-07-13 2020-09-22 Oncternal Therapeutics Inc Método de tratamento de cancro de mama com modulador seletivo do recetor de andrógeno (sarm)
US9969683B2 (en) 2012-07-13 2018-05-15 Gtx, Inc. Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS)
US10987334B2 (en) 2012-07-13 2021-04-27 University Of Tennessee Research Foundation Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs)
US9622992B2 (en) 2012-07-13 2017-04-18 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US9744149B2 (en) 2012-07-13 2017-08-29 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US10258596B2 (en) 2012-07-13 2019-04-16 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
JP6262661B2 (ja) 2012-10-24 2018-01-17 第一三共株式会社 筋萎縮性側索硬化症治療剤
JP2016518357A (ja) 2013-04-08 2016-06-23 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 骨格筋幹細胞を若返らせる方法および組成物
US9119832B2 (en) 2014-02-05 2015-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of treating mild brain injury
BR112016027778A2 (pt) 2014-05-30 2017-08-15 Pfizer Usos de derivados de carbonitrila, sua combinação e sua composição farmacêutica
WO2017075535A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurodegenerative conditions
JP2022538119A (ja) 2019-06-27 2022-08-31 サイトキネティックス， インコーポレイテッド １－（２－（（（（ｔｒａｎｓ）－３－フルオロ－１－（３－フルオロピリジン－２－イル）シクロブチル）メチル）アミノ）ピリミジン－５－イル）－１Ｈ－ピロール－３－カルボキサミドの多形
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228158A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228156A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223021A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4224316A (en) * 1979-03-30 1980-09-23 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
CA1175810A (en) * 1979-03-30 1984-10-09 Frank A. Momany Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228157A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228155A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223019A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4226857A (en) * 1979-03-30 1980-10-07 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223020A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410513A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410512A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Combinations having synergistic pituitary growth hormone releasing activity
WO1983002272A1 (en) * 1981-12-28 1983-07-07 Beckman Instruments Inc Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4880778A (en) * 1986-05-12 1989-11-14 Eastman Kodak Company Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof
US4839344A (en) * 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US4880777A (en) * 1987-09-01 1989-11-14 Eastman Kodak Company Synthetic peptides having growth hormone releasing activity
EP0398961B1 (en) * 1988-01-28 1994-11-02 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0400051B1 (en) * 1988-01-28 1995-05-10 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
DE68912775T2 (de) * 1988-05-11 1994-06-30 Polygen Holding Corp Polypeptid-verbindungen mit hormonwachstumsbefreiender wirkung.
US5486505A (en) * 1990-07-24 1996-01-23 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
JPH05508859A (ja) 1990-07-24 1993-12-09 イーストマン コダック カンパニー ペプチド合成方法
IL98910A0 (en) * 1990-07-24 1992-07-15 Polygen Holding Corp Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity and pharmaceutical compositions containing them

Also Published As

Publication number Publication date
US5776901A (en) 1998-07-07
NO314695B1 (no) 2003-05-05
CA2116120A1 (en) 1993-02-23
ZA926337B (en) 1993-04-22
DE69227462T2 (de) 1999-04-08
NZ244034A (en) 1995-08-28
HUT69178A (en) 1995-08-28
HU9400495D0 (en) 1994-05-30
WO1993004081A1 (en) 1993-03-04
CN1035256C (zh) 1997-06-25
RU2126014C1 (ru) 1999-02-10
NO940592D0 (no) 1994-02-21
IL102848A0 (en) 1993-01-31
EP0605484A1 (en) 1994-07-13
FI120095B (fi) 2009-06-30
CN1073684A (zh) 1993-06-30
CA2116120C (en) 2002-12-03
BG98489A (bg) 1995-02-28
FI120691B (fi) 2010-01-29
KR100247212B1 (ko) 2000-03-15
JPH07507039A (ja) 1995-08-03
BG62655B1 (bg) 2000-04-28
EP0605484B1 (en) 1998-10-28
AU666673B2 (en) 1996-02-22
ES2124263T3 (es) 1999-02-01
JP3179489B2 (ja) 2001-06-25
CZ293281B6 (cs) 2004-03-17
NO940592L (no) 1994-04-14
PL169562B1 (pl) 1996-08-30
IL102848A (en) 1998-04-05
SK282895B6 (sk) 2003-01-09
MX9204861A (es) 1994-06-30
FI20050467A (fi) 2005-05-02
FI940807A0 (fi) 1994-02-21
BR9206398A (pt) 1994-12-27
AU2541692A (en) 1993-03-16
RO112507B1 (ro) 1997-10-30
DE69227462D1 (de) 1998-12-03
DK0605484T3 (da) 1999-07-05
US5663146A (en) 1997-09-02
CZ40094A3 (en) 1994-11-16
ATE172742T1 (de) 1998-11-15
SK20494A3 (en) 1994-10-05
BR1100309A (pt) 2000-08-01
FI940807A (fi) 1994-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU223664B1 (hu) Növekedési hormon felszabadulást elősegítő peptidek és eljárás előállításukra, valamint a peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények
US5486505A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
JPH03502329A (ja) 成長ホルモン放出活性を有するポリペプチド化合物類
JPH03502326A (ja) 成長ホルモン放出活性を有するポリペプチド化合物類
EP0417165B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
CZ401392A3 (en) Polypeptide compounds exhibiting capability of releasing growth hormone
US7250399B2 (en) Compounds having growth hormone releasing activity
HU211694A9 (en) Hexapeptides with sulphate ester groups

Legal Events

Date Code Title Description
HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20041005

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees