SK282895B6 - Peptidy s aktivitou uvoľňujúcou rastový hormón, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy - Google Patents

Peptidy s aktivitou uvoľňujúcou rastový hormón, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK282895B6
SK282895B6 SK204-94A SK20494A SK282895B6 SK 282895 B6 SK282895 B6 SK 282895B6 SK 20494 A SK20494 A SK 20494A SK 282895 B6 SK282895 B6 SK 282895B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
phe
tyr
ala
gly
trp
Prior art date
Application number
SK204-94A
Other languages
English (en)
Other versions
SK20494A3 (en
Inventor
Cyril Y. Bowers
David H. Coy
Original Assignee
Administrators Of The Tulane Educational Fund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Administrators Of The Tulane Educational Fund filed Critical Administrators Of The Tulane Educational Fund
Publication of SK20494A3 publication Critical patent/SK20494A3/sk
Publication of SK282895B6 publication Critical patent/SK282895B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Sú opísané peptidy všeobecného vzorca A1-A2-Ala-C2-C3-C5, ktoré podporujú uvoľňovanie rastového hormónu pri podávaní zvieratám, spôsob ich prípravy a ich použitie ako farmaceutickej kompozície.ŕ

Description

Oblasť techniky
Tento vynález sa týka nových polypeptidových zlúčenín, ktoré, keď sú podané živočíchom, hlavne ľuďom, podporujú uvoľnenie rastového hormónu. Z iného pohľadu sa tento vynález týka spôsobov podpory uvoľnenia a zvýšenia hladín rastového hormónu u živočíchov podaním špecifických polypeptidových zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón.
Doterajší stav techniky
Zvýšenie hladín rastového hormónu (GH) u živočíchov, napr. cicavcov včítane ľudí, po podaní zlúčenín uvoľňujúcich GH môže viesť k zvýšeniu telesnej hmotnosti a zvýšeniu produkcie mlieka, ak sa po podaní objavia dostatočne zvýšené hladiny GH. Ďalej je známe, že zvýšenie hladín rastového hormónu u cicavcov a ľudí môže byť dosiahnuté použitím známych látok uvoľňujúcich rastový hormón, ako sú prirodzene sa vyskytujúce hormóny uvoľňujúce rastový hormón.
Zvýšenie hladín rastového hormónu u cicavcov môže byť tiež dosiahnuté použitím peptidov uvoľňujúcich rastový hormón, niektoré z nich boli predtým opísané, napr. v U. S. 4 223 019, U. S. 4 223 020, U. S. 4 223 021, U. S. 4 224 316, U. S. 4 226 857, U. S. 4 228 155, U. S. 4 228 156, U. S. 4 228 157, U. S. 4 228 158, U. S. 4 410 512, U. S. 4 410 513.
Na zvýšenie hladín GH sa tiež použili protilátky proti endogénnemu inhibítoru uvoľnenia rastového hormónu, somatostatínu (SRIF). V tomto poslednom prípade sa hladiny rastového hormónu zvýšili odstránením endogénneho inhibítora uvoľnenia GH (SRIF) predtým, ako dosiahne hypofýzu, kde inhibuje uvoľnenie GH.
Každá z týchto metód na podporu zvýšenia hladín rastového hormónu vyžaduje materiály, ktorých syntéza a/alebo izolácia do čistoty, dostatočnej na podanie cieľovému živočíchovi, je nákladná. Žiaduce by boli relatívne jednoduché polypeptidy - krátky reťazec, nízka molekulová hmotnosť, ktorých príprava je relatívne nenákladná, sú schopné podporovať uvoľnenie rastového hormónu, pretože by sa mali dať ľahko a nenákladne pripraviť, ľahko chemicky a/alebo fyzikálne modifikovať a tiež ľahko purifíkovať a formulovať; a mali by mať výborné transportné vlastnosti.
Hoci sú niektoré krátke polypeptidové reťazce, ktoré môžu podporovať uvoľnenie a zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi, známe, dôležité je mať možnosť prispôsobiť polypeptidy škále požiadaviek, ako sú podanie, bioabsorbancia, zvýšený retenčný čas atď. Zámeny aminokyselín v určitých polohách môžu mať dramatický vplyv na schopnosť krátkych peptidových reťazcov podporovať uvoľnenie rastového hormónu.
Bolo by žiaduce mať rôzne krátke polypeptidové reťazce, ktoré môžu podporovať uvoľnenie a zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi živočíchov, zvlášť ľudí. Bolo by tiež užitočné môcť využiť takéto polypeptidy na podporu uvoľnenia a/alebo zvýšenia hladín rastového hormónu v krvi zvierat a ľudí.
Bolo by tiež žiaduce, použitím takýchto krátkych polypeptidových reťazcov, poskytnúť metódy na podporu uvoľnenia a/alebo zvýšenia hladín rastového hormónu v krvi živočíchov.
Podstata vynálezu
Polypeptidy sú definované nasledujúcim vzorcom: A|-A2-Ala-C2-C}-A5, kde
Ai je Gly, DAla, β-Ala, Ser, Met, Pro, Sár, Ava, Aib, kyselina N-alkylaminokarboxylová s dvomi až desiatimi atómami uhlíka v alkyle, kyselina azolkarboxylová alebo kyselina alkylaminokarboxylová, s dvomi až desiatimi atómami uhlíka v alkyle,
A2 je DTrp, DpNal, D-4-Y-Phe alebo 5-Y-D-Trp, kde
Y je OH, Cl, Br, F alebo H. A2 je prednostne DpNal.
A5 je A5-A4-A5., A3-A5’, A4-A5, alebo As·. A5 je prednostne A5·. A3 je Ala, Gly, DAla, Pro alebo desAla. A4 je Ala, Gly, DAla, Pro, kyselina alkylaminokarboxylová s jedným až desiatimi atómami uhlíka v alkyle alebo desAla.
Aj· je Lys(e-RbR2)-Z, Orn(ô-RbR2)-Z, NH(CH2)XN(R3,R4). Lys-Z, Orn-Z alebo Arg-Z, kde
Ri je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H, R2 je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H, ale ak Ak Rj je H, R2 nie je R3 je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H, R4 je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka, alebo atóm H. Z je NH (lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka), N (lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka)2, O-(lineáma alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka), NH2 alebo OH, kde lineárna alkylová skupina je taká istá, ako bola definovaná alkylová skupina, x je 2 až 15, C2je Trp, Phe alebo ChxAla. C2 je prednostne Trp alebo Phe. C2 je častejšie Trp. C3 je DPhe, DPal alebo DChxAla. C3 je prednostne DPhe a organické alebo anorganické adičné soli hociktorého zo spomenutých polypeptidov.
Polypeptid je prednostne A1-A2-Ala-C2-DPhe-A5, častejšie Aj-Aj-Ala-Trp-DPhe-Aj.
Objavili sme niekoľko nových krátkych polypeptidových reťazcov, ktoré podporujú uvoľnenie a zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi živočíchov. Polypeptidy sú definované nasledujúcim vzorcom:
A1-A2-Ala-Trp-DPhe-A5, kde
A, je Gly, DAla, beza-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kyselina imidazoloctová, kyselina N-nižší alkyl-aminokarboxylová, kyselina, Ν,Ν-bis-nižší alkyl-aminokarboxylová, kyselina azolkarboxylová alebo kyselina nižší alkyl-aminokarboxylová, kde nižšia alkylová skupina sa skladá z 2 až 10-členného priameho reťazca uhlíkových atómov. Nižšia alkylová skupina sa prednostne skladá z 2 až 6-členného priameho reťazca uhlíkových atómov. Nižšia alkylová skupina môže byť substituovaná alebo nesubstituovaná. Prednostné substituenty sú O, N alebo Si. Častejšie je nižšia alkylová skupina nesubstituovaná. Uprednostňovaná kyselina azolkarboxylová ja kyselina Na 4-imidazoloctová (IMA). A! je prednostne Gly, DAla alebo His. Častejšie, A! je His alebo DAla. Najčastejšie, A] je DAla.
A2je DTrp, ϋβΝαΙ, D-4-Y-Phe alebo 5-Y-D-Trp, kde
Y je OH, Cl, Br, F alebo H. A2 je prednostne DfiNal, D-4-Y-Phe alebo 5-Y-D-Trp. Častejšie, A2 je ϋβΝαΙ. Y je prednostne OH alebo H.
A5 je Λ3-Α4-Λ;., Α3-Α5·, A4.A5, alebo A5·. As je prednostne As·. A3 je Ala, Gly, DAla, Pro alebo desAla. A4 je Ala, Gly, DAla, Pro, kyselina nižší alkyl-aminokarboxylová alebo desAla. A5, je Lys(c-RbR2)-Z, Om(5-RbR2)-Z, LArg (g-R;-R6) NH(CH2)XN(R3,R4). A5. môže tiež byť Lys-Z, Om-Z alebo Arg-Z, ak A, nie je His. R] je lineárna nižšia alkylová skupina alebo atóm H. R2 je lineárna nižšia alkylová skupina alebo atóm H. Ak R] je H, R2 nie je H; podobne, ak R2 je H, Rj nie je H. R3 je lineárna nižšia alkylová skupina alebo atóm H. R4 je lineárna nižšia alkylová skupina alebo atóm II. R5 a R« sú lineárne nižšie alkylové skupiny. Lineárna nižšia alkylová skupina sa skladá z 2 až asi 10-členného priameho reťazca uhlíkových atómov. Nižšia alkylová skupina je prednostne 2 až 6-členným priamym reťazcom uhlíkových atómov. Nižšia alkylová skupina môže byť substituovaná alebo nesubstituovaná. Prednostným substituentom môžu byť O, N alebo Si. Nižšia alkylová skupina je prednostne nesubstituovaná, g je guanidino, Z je NH (lineárna nižšia alkylová skupina), N (lineárna nižšia alkylová skupina)2, O-(lineáma nižšia alkylová skupina), NH2 alebo OH, kde lineárna nižšia alkylová skupina je taká istá, ako bola definovaná skôr, x je 2 až 15, x je prednostne 2 až 6, A5, je prednostne Lys-NH2.
A organické alebo anorganické adičné soli hociktorého zo spomenutých polypeptidov.
Skratky aminokyselinových zvyškov sa zhodujú so štandardným názvoslovím peptidov:
Gly - Glycín Tyr - L-Tyrozín íle - L-Izoleucín
Glu - kyselina L-Glutámová
Thr - L-Treonín
Phe - L-Fenylalanín
Ala - L-Alanín
Lys - L-Lyzín
Asp - kyselina L-Asparágová
Cys - L-Cystein
Arg - L-Arginín
Ava - kyselina aminovalérová
Aib - kyselina aminoizomaslová
Gin - L-Glutamín
Pro - L-Prolín
Leu - L-Leucín
Met - L-Metionín
Ser - L-Serín
Asn - L-Asparagín His - L-Histidín Trp - L-Tryptofán Val - L-Valín
DOPA - 3,4-Dihydroxyfenylalanín
Met(O) - Metionínsulfoxid
Abu - kyselina a-aminomaslová iLys - Νε-Izopropyl-L-Lyzín 4-Abu - kyselina 4-aminomaslová Om - L-Ornitín
DaNal - a-Naftyl-D-Alanín
D0Nal - β-Naftyl-D-Alanín Sar - Sarkozín
LArg - homoArginín Chx - cyklohexyl ChxAla - L-Cyklohexylalanin DChxAla - D-Cyklohexylalanín IMA - kyselina Na-imidazoloctová
Tcc - kyselina l,2,3,4-tetrahydro-7-caroline-3-karboxylová
Tie - kyselina l,2,3,4-tetrahydroizochinolin-3-karboxylová
Tip - kyselina 4,5,6,7-tetrahydro-lH-imidazol(e) 6-karboxylová ct,rABU - kyselina alfa, gama-aminomaslová DPal - D-3-pyridylalanín
Písmeno „D“ pred trojpísmenovými skratkami aminokyselín označuje D-konfiguráciu aminokyselinových zvyškov a glycín je chápaný v zmysle „prirodzene sa vyskytujúca L-aminokyselina“.
V týchto krátkych polypeptidových vláknach sú určité polohy tolerantnejšie k zámenám ako iné bez toho, aby nepriaznivo ovplyvnili schopnosť peptidov podporovať uvoľnenie a/alebo zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi živočíchov. Napríklad poloha A5. Iné polohy sú menej tolerantné k takýmto zámenám. Napríklad stredové aminokyselinové zvyšky Ala, Trp, DPhe, označené Cb C2 a C3. Skôr sa napríklad verilo, že A] a A2 by mohli byť v L a D-forme a že Trp a DPhe by tiež mohli byť v L a D-forme, vytvárajúc rad LD LD. Zistili sme ale, že sekvencia LD LD môže byť DD LD sekvenciou. Prekvapujúci bol teda objav, že polypeptid so vzorcom A1-A2-Cl-C2-C3-A5, kde Ab A2, A5 sú také isté, ako bolo opísané skôr, a Ci je Ala, C2 je Trp, Phe a ChxAla a C3 je DPhe, DPal alebo DChxAla, podporuje uvoľnenie a/alebo zvýšenie hladín rastového hormónu u živočíchov.
C2 je prednostne Trp alebo Phe, častejšie je C2 Trp.
C3 je prednostne DPhe. Prednostne, ak C2 je ChxAla, C3 je DPhe. Ak C3 je DPal, Z je prednostne OH.
Zvýšená flexibilita, ohľadom výberu zásaditého, neutrálneho alebo kyslého aminokyselinového zvyšku, Da L-foriem, ktoré môžu byť použité pre aminokyseliny Ab A2, A3, A4, A5, C2 a C3, poskytuje výbornú kontrolu fyziochemických vlastností žiadaného peptidu.
Hoci DAIa-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 a DAla-DpNal-Ala-Phc-DPhe-Lys-NHj majú podobnú GH-uvoľňujúcu aktivitu, výmena Phe za Trp môže zvýšiť chemickú stabilitu DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NIl2, pretože Trp je citlivejší k oxidácii ako Phe. Výmena Phe za Trp sprostredkuje vyššiu hydrofobicitu peptidu a ako je opísané ďalej, táto fyzikálno-chemická vlastnosť môže byť výhodná z hľadiska zvýšenia orálnej, transdermálnej a/alebo nosovej absorpcie a tiež formulácie peptidu. Okrem toho, EDJ0 (50 % efektívnej dávky) v histamínovom teste potkaních buniek, sú DAla-DplNal-Ala-Trp-DPheLys-NH2 a DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2 podobné, t. j. 30,5 ±0,5 a 30,8 ±0,3 pg/ml a oba sú vo výhode nad histamínovou aktivitou Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, ktorá bola 11,0 ±1,0 pg/ml. Peptidy s nižšou histamínuvoľňujúcou aktivitou (vyššia ED50) by mohli byť klinicky efektívnejšie, pretože by mohli spôsobiť menšie nepriaznivé lokálne reakcie v mieste vstreknutia peptidu a/alebo by mohli s menšou pravdepodobnosťou spôsobiť systematické nežiaduce antigénne efekty.
Flexibilita tiež poskytuje významnú výhodu na navrhnutie vzorca a podanie žiadaného peptidu pre akýkoľvek daný druh. Tieto zmeny môžu tiež zlepšiť orálnu absorpciu aj metabolizmus a vylučovanie peptidov. Napríklad, Ala-His-D|iNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-1) má efektívnejšiu schopnosť uvoľniť rastový hormón u ľudí ako Ala-His-DTrp-Ala-Trp-Dhe-Lys-NH2. Ale, DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2), ak sa podá orálne, je efektívnejší ako GHRP-1. Pozri obrázok 1, ktorý ukazuje hladiny rastového hormónu v sére normálnych mladších mužov v závislosti od času, po podaní 300 pg/kg GHRP-1 40 subjektom v grafe naľavo (o), 600 pg/kg GHRP-1 39 subjektom v grafe v strede () a 100 pg/ml GHRP-2 11 subjektom v grafe napravo ( ). V týchto pokusoch bol GHRP podaný normálnym mladším mužom, najčastejšie asi 25 rokov starým, v 20 ml H2O, pričom hneď nasledovalo 100 ml H2O. Krv sa odoberala, ako je znázornené na diagrame. GH sa stanovil rádioimunotestom.
Tiež sa očakáva, že aromatické postranné vlákna môžu byť v určitých polohách týchto peptidov, kde sú, ako sa predtým myslelo, nevyhnutné, eliminované a že D aminokyselinové zvyšky by mohli byť viac biologicky chránené ako L formy, väčšia ochrana a menšia hmotnosť niektorých peptidov môžu byť využité na ďalšie prispôsobenie polypeptidov z hľadiska zlepšenia vlastnosti, ako sú nosová, orálna a transdermálna absorpcia, stabilita in vivo atď.
Časti R|, R2, R3, R4 a Z sa môžu tiež meniť, čím sa poskytne ďalšia kontrola fyziochemických vlastností žiadaných zlúčenín. Následne sa môže dosiahnuť zosilnené dodanie peptidu určenému receptoru pri určených druhoch.
Zlúčeniny uvoľňujúce rastový hormón, prakticky využité v tomto vynáleze, sú prednostne:
A|-A2-Ala-Trp-DPhc-A5, alebo organické alebo anorganické adičné soli všetkých polypeptidov;
kde A), A2 a A5 sú také isté, ako boli definované skôr.
Presnejšie, peptid uvoľňujúci rastový hormón, prakticky využitý v tomto vynáleze, má vzorec: DAla-A2-Ala-Trp-DPhe-A5, a jeho organické alebo anorganické adičné soli. Uprednostňované členy tejto skupiny zlúčenín majú vzorec: DAla-DflNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2 DAla-D3Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2 DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys(c-iPr)NH2 DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2 DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, NH2(CH2)5CO-DpNal-Ala-Trp-D-Phe-NH(CH2)sNH2, ako aj ich organické alebo anorganické adičné soli.
Tieto zlúčeniny sú v súčasnosti najvýhodnejšie, pretože syntéza týchto kratších reťazcov polypeptidov je menej nákladná a ako sa ukázalo, tieto špecifické zlúčeniny majú veľkú schopnosť podporovať zvýšenie hladín rastového hormónu v sére.
Ďalšie uprednostňované peptidy uvoľňujúce rastový hormón majú vzorec A!-A2-Ala-Phe-DPhe-A5. Do tejto skupiny zlúčenín patria prednostne tie členy, kde Ab je ΝαΙΜΑ, ccrABU, DAla, His, Ala, His alebo arABU, A2 je DflNal alebo DPhe, a A5 je LysNH2, LysNH2, Arg NH2, NH-Chx-NH2 (14 Chx diamin) alebo Lys EA. Napríklad NaIMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, a, rABU-D[5Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, flAla-His-DflNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, NaIMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH2, a, tABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH2, DAla-DPNal-Ala-Phe-DPhe-Lys EA, DAla-D[lNal-Ala-Phe-DPhe-DArgNH2, ako aj ich organické alebo anorganické adičné soli.
Iné vyjadrenie tohto vynálezu zahŕňa polypeptidy so vzorcom A1-A2-C-1-C2-C3-A5, kde Cj je Ala, C2 je Trp, Phe alebo ChxAla, C3 je DPhe alebo DChxAla, A] je prednostne DAla. A2 je prednostne DflNal. Napríklad, DAla-DPNal-Ala-ChxAla-DPhe-LysNH2, DAla-DPNal-Ala-Phe-DChxAla-LysNH2 a DAla-DPNal-Ala-ChxAla-DChxAla-LysNH2, ako aj ich organické alebo anorganické adičné soli.
Pre tieto zlúčeniny tu opísané je typické, že sa ľahko syntetizujú, účinne podporujú zvýšenie hladín rastového hormónu v sére, a je žiadaná ich výroba a použitie v komerčnom rozsahu. Ďalej výhodou týchto zlúčenín je, že majú fyziochemické vlastnosti, ktoré sú žiaduce na účinné podávanie takýchto polypeptidových zlúčenín celej škále živočíšnych druhov, v dôsledku flexibility, ktorá umožňuje rôzne substitúcie v mnohých polohách polypeptidových zlúčenín výberom polárnej, neutrálnej alebo nepolámej podstaty C-koncovej a centrálnej časti týchto polypeptidových zlúčenín tak, aby boli v zhode so žiadanou metódou podania, ktoré je orálne, nosové, kontinuálne podávanie využívajúce špeciálne chemické/mechanické metódy podávania.
Tieto peptidy môžu byť terapeuticky použité v prípadoch, v ktorých sa môže využiť rastový hormón, ako sú liečenie hypotalamo-hypofyzámeho nanizmu, osteoporózy, popálenín, zlyhania obličiek, na akútne použitie pri zlomeninách kostí a na podporu hojenia rán.
Ďalej môžu byť použité na podporu rekonvalescencie po chirurgických zákrokoch a akútnych/chronických oslabujúcich ochoreniach. Blahodarný anabolický vplyv sa prejaví na koži, svaloch a kostiach vo vzťahu k procesu starnutia, s výrazným úbytkom telového tuku. Liečba týmito peptidmi zahrnuje aj pacientov chorých na rakovinu, napríklad prevencia a/alebo redukcia celkového vyčerpania u pacientov chorých na rakovinu. Tieto terapeutické použitia sú dosiahnuté použitím terapeuticky efektívneho množstva peptidu. Je to také množstvo, ktoré je potrebné na uvoľnenie hladín rastového hormónu v sére, ako je diskutované, infra.
Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť tiež použité na posilnenie krvných hladín GH u zvierat; zvýšenie produkcie mlieka u kráv, zrýchlenie rastu tela u živočíchov, ako sú cicavce (t. j. ľudia, ovce, hovädzí dobytok, ošípané), ako aj ryby, hydina, iné stavovce a ulitníky; zvýšenie produkcie vlny a/alebo kožušín u cicavcov. Množstvo telesného nárastu závisí od pohlavia a veku živočíšneho druhu, množstva a podstaty podanej zlúčeniny uvoľňujúcej rastový hormón, spôsobu podania a podobne. Zlúčeniny tohto vynálezu zvyšujú sérový GH u ľudí, posilňujú rast tela u deti s nízkym vzrastom, znižujú telesný tuk a posilňujú metabolizmus proteínov u vybraných detí, zlepšujú metabolizmus proteínov v koži, svaloch a kostiach znižujúc telesné tuky u starších, hlavne ak chýba GH.
Tieto peptidy sú tiež užitočné na zlepšenie zloženia sérových lipidov u ľudí tak, že sa v sére zníži množstvo sérového cholesterolu a lipoproteinov s nízkou hustotou a zvýši množstvo sérových lipoproteinov s vyššou hustotou.
Nové polypeptidové zlúčeniny tohto vynálezu sa môžu syntetizovať podľa zvyčajných metód peptidovej chémie v roztoku alebo pevnej fáze, alebo klasickými metódami, známymi v oblasti.
V prípade peptidových amidov sa syntéza na pevnej fáze prednostne začína z C-koncovej časti peptidu. Vhodný štartovací materiál sa môže pripraviť napríklad napojením požadovanej chránenej α-aminokyseliny na chlórmetylovanú živicu, hydroxymetylovanú živicu, benzhydrylamínovú (BHA) živicu alebo para-metylbenzhydryl amínovú (p-Me-BHA) živicu. Jednu takúto chlórmetylovú živicu predáva pod trhovým menom BIOBEADS SX-1 firma Bio Rad Laboratories, Richmond, California. Prípravu hydroxymetylových živíc opísal Bodansky et al., Chem. Ind.
(London) 38, 1597 (1966). BHA živicu opísali Pietta a Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) a komerčne je dostupná od firmy Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, California.
Po počiatočnom napojení môže byť skupina chrániaca a aminoskupinu odstránená vhodným kyslým činidlom, napr. roztokom kyseliny trifluóroctovej (TFA) alebo kyseliny chlorovodíkovej (HCI) v organickom rozpúšťadle pri laboratórnej teplote. Po odstránení skupiny chrániacej a aminoskupinu sa postupne napájajú ostávajúce chránené aminokyseliny v požadovanom poradí. Každá chránená aminokyselina môže zvyčajne reagovať asi v 3-násobnom nadbytku, pričom sa využíva vhodný aktivátor karboxylových skupín, ako sú dicyklohexylkarbodiimid (DCC) alebo diizopropyl karbodiimid (DIC) v roztoku, napr. metylénchloridu (CH2C12) alebo dimetylformamidu (DMF) alebo ich zmesí.
Keď sa ukončí požadovaná sekvencia aminokyselín, žiadaný peptid sa od benzhydrylamínového nosiča odštiepi opracovaním takým činidlom, ako je fluorovodík (HF), ktorý nielenže odštiepi peptid od živice, ale tiež odštiepi najčastejšie používané skupiny chrániace postranný reťazec. Keď sa použije chlórmetylovaná alebo hydroxymetylovaná živica, po opracovaní pomocou HF sa vytvorí voľná kyselina peptidu. Alkylamidy a estery peptidov sa z týchto peptidových živíc dajú ľahko pripraviť odštiepením vhodným alkylamínom, dialkylamínom alebo diaminoalkánom, alebo transesterifikaciou s alkoholom pri vysokom pH.
Uvedený postup na pevnej fáze je dobre známy a opísali ho Steward a Young, Solid Phase Peptide Svnthesis Second Edn. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984).
Niektoré dobre známe metódy v roztoku, ktoré sa dajú použiť na syntézu častí peptidov tohto vynálezu sú uverejnené v Bodansky et al., Peptide Svnthesis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York, N. Y. 1976.
Predpokladá sa, že peptidy budú častejšie syntetizované metódou kvapalnej fázy, ktorá zahrnuje kondenzačnú reakciu najmenej dvoch peptidových fragmentov.
Táto metóda obsahuje kondenzáciu peptidového fragmentu X-ArY s peptidovým fragmentom U-V-W, kde všetky aminokyseliny postranných reťazcov okrem A, sú neutrálne alebo chránené, a kde X je Prot, pričom Prot. je N-koncová chrániaca skupina; Y je A2-Q, Ala-A2-Q, A2-Ala-Q Ala-A2-Ala-Q, A2-Ala-Trp-Q, Ala-A2-Ala-Trp-Q, Ala-Q alebo -Q, kde ak Y je Q, U je J-A2-Ala-Trp alebo J-Ala-A2-Ala-Trp. Ak Y je Ala-Q, Uje J-A2-Ala-Trp. Ak Y je A2-Q alebo Ala-A2-Q, U je J-Ala-Trp. Ak Y je A2-Ala-Q alebo Ala-A2-A3-Q, U je J-Trp. Ak Y je A2-Ala-Trp-Q alebo Ala-A2-Ala-Trp-Q, U je J. V je A5 alebo Z. Ak V je A5, W je Z. Ak V je Z, W nie je prítomné. Ab A2, A5 a Z sú také isté ako tu definované.
Q je karboxy koniec peptidového fragmentu a je -OR3 alebo -M, kde M je časť, ktorá môže byť nahradená dusík obsahujúcim nukleofilom a R3 je H, alkylová skupina obsahujúca jeden až asi 10 atómov uhlíka, arylová skupina, ktorá má 6 až asi 12 atómov uhlíka alebo arylalkylová skupina, ktorá má 7 až asi 12 atómov uhlíka; J predstavuje amino koniec označeného fragmentu a je to H alebo chrániaca skupina, ktorá nebráni napájacínt reakciám, napríklad benzyl.
Potom sa odstráni chrániaca skupina. Alternatívne sa môže takto pripravený chránený peptid použiť v ďalšej kondenzácii na prípravu väčšieho peptidu.
Táto preferovaná metóda je detailnejšie opísaná v U. S. Patent Application Seriál Number 558 121, vyplnenom 24. júla 1990 Johnom C. Hubbsom a S. W. Parkerom pod názvom „Postup pre syntézu peptidov“, ktorá je tu použitá ako odkaz a publikovaná ako W09201709.
V zhode s iným obsahom tohto vynálezu je poskytnutá metóda na podporu uvoľnenia a/alebo zvýšenia hla dín rastového hormónu v krvi živočíchov. Táto metóda podpory uvoľnenia a/alebo zvýšenia hladín rastového hormónu môže tiež byť terapeuticky použitá na liečenie uvedených chorôb. Uvedené metódy obsahujú podanie efektívnej dávky aspoň jedného z opísaných polypeptidov živočíchovi. Z jednej strany jc táto metóda použitá u živočíchov iných, ako sú ľudia.
Zlúčeniny tohto vynálezu môžu byť podané orálne, parenterálne (intrasvalovou (i. m.), intraperitoneálnou (i. p.), intražilovou (i. v.) alebo podkožnou (s. c.) injekciou), nosovo, vaginálne, rektálne alebo podjazykovou cestou podania, ako aj intrapulmonárnou inhaláciou a môžu byť formulované v dávkach, vhodných pre každý spôsob podania. Uprednostňuje sa parenterálne podanie.
Pevná forma dávok na orálne podanie zahrnuje kapsuly, tablety, pilulky, prášky a granuly. Vo forme takýchto pevných dávok je aktívna zložka pomiešaná aspoň s jedným inertným nosičom, ako sú sacharóza, laktóza alebo škrob. Takéto formy dávok môžu tiež obsahovať, ako sa bežne používa, ďalšie látky, iné ako inertné rozrieďovadlá, t. j. lubrikačné činidlá, ako je stearan horečnatý. V prípade kapsúl, tabliet a piluliek, môžu formy dávok obsahovať tiež tlmiace činidlá. Tablety a pilulky môžu tiež byť pokryté vhodnou ochrannou vrstvou.
Formy kvapalných dávok na orálne podanie zahrnujú emulzie, roztoky, suspenzie, sirupy, elixíry obsahujúce inertné zrieďovadlá, bežne používané v oblasti, napr. voda. Okrem takýchto inertných zrieďovadiel, v zložení môžu tiež byť adjuvanty, ako sú zvlhčovadlá, emulgačné a suspenzačné činidlá, a činidlá dodávajúce sladkosť, chuť a vôňu.
Preparáty na parenterálne podanie podľa tohto vynálezu zahrnujú sterilné vodné a nevodné roztoky, suspenzie alebo emulzie. Príkladmi nevodných roztokov alebo prenášadiel sú propylénglykol, polyetylénglykol, rastlinné oleje, napr. olivový olej a kukuričný olej, želatína a injektovateľné organické estery, ako je etyloleát. Takéto formy dávok môžu tiež obsahovať adjuvanty, ako sú ochranné, zvlhčujúce, emulgačné a disperzačné činidlá. Môžu byť sterilizované napríklad filtráciou cez baktérie zadržujúce filtre, pridaním sterilizačných činidiel do zloženia, ožiarením alebo ohriatím zmesi. Môžu byť tiež pripravené v sterilnej vode alebo inom sterilnom injektovateľnom médiu tesne pred použitím.
Nové zlúčeniny tohto vynálezu sú tiež užitočné, ak sa podajú spolu s hormónom uvoľňujúcim rastový hormón (t, j. prirodzene sa vyskytujúci hormón uvoľňujúci rastový hormón, jeho analógy a funkčné ekvivalenty), ako aj v kombinácii s inými zlúčeninami, ktoré podporujú uvoľnenie rastového hormónu, t. j. peptidmi uvoľňujúcimi rastový hormón (pozri U. S. Patent No. 4 880 778, ktorý je tu zahrnutý ako odkaz), napríklad inhibítory acetylcholínesterázy, (β-adrenergické blokujúce činidlá, a-2adrenergické blokujúce činidlá atď. Takéto kombinácie predstavujú mimoriadne vhodné prostriedky na podávanie peptidov uvoľňujúcich rastový hormón z tohto vynálezu, pretože kombinácia podporuje uvoľnenie oveľa väčšieho množstva rastového hormónu, ako sa predpokladalo zrátaním individuálnych odpovedí jednotlivých zložiek kombinácie, t. j. kombinácia poskytuje synergistickú odpoveď vzhľadom na individuálne zložky. Ďalšie detaily o podávaní kombinácií peptidov uvoľňujúcich rastový hormón sú opísané v citovanom patente. Takéto synergistické zložky sú hlavne zložky, ktoré reagujú ako agonisty na receptoroch hormónov uvoľňujúcich rastový hormón alebo inhibujú vplyv somatostatínu. Synergizmus môže byt binárny, t. j. jedna uvádzaná zložka a jedna zo synergistických zložiek, alebo môže zahrnúť viac ako jednu synergistickú zložku. Kombinácie, efektívne zapríčiňujúce uvoľnenie a zvýšenie hladiny rastového hormónu v krvi živočíchov, napr. ľudí, sa skladajú z efektívneho množstva polypeptidov, vybraných z tu uvádzaných polypeptidov a aspoň jednej z nasledujúcich skupín: polypeptidy skupiny 1 alebo zložka, ktorá podporuje uvoľnenie rastových hormónov e. g., kde polypeptidy skupiny 1 sú vybrané spomedzi prirodzene sa vyskytujúcich hormónov uvoľňujúcich rastový hormón a ich funkčných ekvivalentov, kde spomenuté polypeptidy pôsobia na receptor hormónu uvoľňujúceho rastový hormón u cicavcov a iných stavovcov, a mäkkýšov;
Polypeptidy skupiny 2 sú vybrané z ktorýchkoľvek polypeptidov, ktoré majú štruktúru: Tyr-DArg-Phe-NH2;
Tyr-DAla-Phe-NH2; Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2; Tyr-DMet(O)-Phe-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2; Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2; Phe-DArg-Phe-Gly-NH2;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2; Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2; Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2; Tyr-DMet (O)-Phe-Gly-NH2; (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Sar-ol; Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2; Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol; Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol; Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2; Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2; Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2;
Tyr-D Ala-Phe-Gly-ol; Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol; Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
Tyr-D Ala-Phe-Sar-NH2; Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2; Sar-TyT-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (voľný ditiol);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (voľný ditiol); Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2;
Tyr-D Arg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2; a organické a anorganické adičné soli spomenutých polypeptidov skupiny 2; kde spomínaná kombinácia je podávaná v takom pomere, že spomínaná kombinácia je efektívna na spôsobenie synergistického uvoľnenia a zvýšenia rastového hormónu v krvi takéhoto živočícha.
Zruční pracovníci poznajú ďalšie zlúčeniny, ktoré podporujú uvoľnenie rastových hormónov a patria sem inhibítory acetylcholínesterázy, β-adrenergické blokujúce činidlá a a2-adrenergické agonisty.
V preferovanom vyjadrení sa môžu použiť prirodzene sa vyskytujúce hormóny uvoľňujúce rastový hormón a ich funkčné ekvivalenty spolu so zlúčeninami, ktoré podporujú uvoľnenie rastového hormónu spolu s tu prítomnými peptidmi. Napríklad, zlúčeniny skupiny 1 a skupiny 2 spolu s tu prítomnými peptidmi, iným príkladom sú zlúčeniny skupiny 1 alebo β-adrenergické blokujúce činidlá spolu s tu prítomnými peptidmi.
Množstvo podaných polypeptidov alebo kombinácie polypeptidov tohto vynálezu sa bude meniť v závislosti od mnohých faktorov, t. j. ako je daný liečený živočích, jeho vek a pohlavie, požadovaný terapeutický efekt, spôsob podania a ktorý polypeptid alebo kombinácia polypeptidov sa použije. Vo všetkých prípadoch sa ale použije efektívna dávka (terapeuticky efektívne množstvo) na podporu uvoľnenia a zvýšenie hladiny rastového hormónu v krvi prijímajúceho živočícha. Táto hladina dávky zvyčajne patrí do rozsahu medzi 0,1 pg až 10 mg celkového polypeptidu na kg telesnej hmotnosti. Zručný pracovník môže na základe tu uvedeného odhalenia ľahko empiricky určiť odporúčané množstvo.
Napríklad u ľudí, keď spôsob podania je i. v., odporúčaná dávka patrí do rozsahu asi 0,1 pg až 10 pg celkového polypeptidu na kg telesnej hmotnosti, častejšie asi 0,5 pg až 5 pg celkového polypeptidu na kg telesnej hmotnosti, ešte častejšie asi ,7 pg až asi 3,0 pg na kg telesnej hmotnosti. Ak sa použijú kombinácie peptidov uvoľňujúcich rastový hormón, môžu sa použiť menšie množstvá tu opísaných peptidov. Napríklad, ak sa tu opísaný peptid kombinuje napríklad so synergistickou zlúčeninou skupiny 1 z U. S. Patent No. 4 880 778 ako je GHRH, odporúčaný rozsah je asi 0,1 pg až asi 5 pg tu opísanej zlúčeniny na kg telesnej hmotnosti a asi ,5 pg až asi 15,0 pg synergistickej zložky (t. j. GHRH) a častejšie asi 0,1 pg až asi 3 pg tu prítomnej zlúčeniny s asi 1,0 pg až asi 3,0 pg synergistickej zlúčeniny na kg telesnej hmotnosti.
Ak je spôsob podania orálny, sú zvyčajne potrebné väčšie množstvá. Napríklad, na orálne podávanie u ľudí je hladina dávky zvyčajne asi 30 pg až asi 1200 pg polypeptidu na kg telesnej hmotnosti, častejšie asi 70 pg až Βει 600 pg polypeptidu na kg telesnej hmotnosti, najčastejšie asi 200 pg až asi 600 pg celkového polypeptidu na kg telesnej hmotnosti. Kravy a prasce vyžadujú asi také isté hladiny dávok ako ľudia, zatiaľ čo potkany zvyčajne vyžadujú vyššie hladiny dávok. Na základe tu uvedeného odhalenia sa môže presná hladina ľahko určiť empiricky.
Všeobecne, ako je uvedené, podanie kombinácie peptidov uvoľňujúcich rastový hormón dovoľuje použiť nižšie dávky jednotlivých zložiek uvoľňujúcich rastový hormón v porovnaní s hladinami dávok potrebných pre jednotlivé zložky uvoľňujúce rastový hormón potrebnými na dosiahnutie podobnej odpovede, čo je peptidov uvoľňujúcich rastový hormón dovoľuje použiť, nižšie dávky jednotlivých zložiek uvoľňujúcich rastový hormón v porovnaní s hladinami dávok potrebných pre jednotlivé zložky uvoľňujúce rastový hormón potrebnými na dosiahnutie podobnej odpovede, čo je spôsobené synergistickým efektom kombinácie.
V rozsahu tu uvádzaného vynálezu sú zahrnuté aj kompozície, ktoré obsahujú ako aktívnu súčasť, organické a anorganické adičné soli opísaných polypeptidov a ich kombinácií; voliteľne v spojení s nosičom, zrieďovadlom, pomaly uvoľňujúcim matrixom alebo pokrytím.
V rozsahu tu uvádzaného vynálezu, uvažované organické alebo anorganické adičné soli zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón a ich kombinácie zahrnujú soli takých organických zlúčenín, ako sú octan, trifluóracetát, oxalát, valerát, oleát, laurát, benzoát, laktát, tosylát, citrát, malát, fumarát, sukcinát, tartrát, naftalát a podobne; a takých anorganických látok, ako sú soli prvkov skupiny I (t. j. soli alkalických kovov), skupiny II (t. j. soli kovov alkalických zemín), amónne a protamínové soli, zinku, železa a podobne s iónmi takými, ako sú chlorid, bromid, síran, fosforečnan a podobne, ako aj organické zložky, uvedené.
Ak sa uvažuje o podávaní ľuďom, uprednostňujú sa farmaceutický akceptovateľné soli. Medzi takéto soli patria soli netoxických alkalických kovov, kovov alkalických zemín a amónne soli, bežne používané vo farmaceutickom priemysle, kam patria sodné, draselné, litne, vápenaté, horečnaté, bámaté, amónne a protamínové soli, ktoré sa dajú pripraviť dobre známymi metódami. Termín tiež zahrnuje netoxické kyslé adičné soli, ktoré sa všeobecne pripravujú reakciou zlúčenín tohto vynálezu s vhodnou organickou alebo anorganickou kyselinou. Predstaviteľmi solí sú hydrochlorid, hydrobromid, síran, dvojsíran, octan, oxalát, valerát, oleát, laurát, borát, benzoát, laktát, fosfát, tosylát, citrát, maleát, fumarát, sukcinát, tartrát, naftylát a podobne.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázky sú sériou grafov ukazujúcich závislosť hladín ľudského rastového hormónu od času.
Obr. 1 znázorňuje hladiny GH po orálnom podaní GHRP-1, alebo GHRP-2 u normálnych mladších mužov pri dávkovaní 300 pg/kg GHRP-1.
Obr. 2 znázorňuje hladiny GH po orálnom podaní GHRP-1, alebo GHRP-2 u normálnych mladších mužov pri dávkovaní 600 pg/kg GHRP-1.
Obr. 3 znázorňuje hladiny GH po orálnom podaní GHRP-1, alebo GHRP-2 u normálnych mladších mužov pri dávkovaní 100 pg/kg GHRP-2.
Vynález bude ďalej ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré vynález v žiadnom smere neobmedzujú.
Príklad 1
Syntéza peptidov uvoľňujúcich rastový hormón
Do reakčnej nádoby komerčne dostupného automatického syntetizátora peptidov sa umiestni parametyl benzhydrylamínhydrochloridová (pMe-BHA HC1) živica. Živica je substituovaná voľným amínom do nasýtenia asi 5 mmol na gram. Zlúčeniny sa pripravujú spájaním jednotlivých aminokyselín, začínajúc z karboxy konca peptidovej sekvencie, pričom sa používa vhodné aktivačné činidlo, ako je Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC). a amín jednotlivých aminokyselín je chránený, napr. ako t-butylkarbonylový derivát (t-Boc) a reaktívne funkčné časti bočných vláken sú chránené tak, ako je načrtnuté v tabuľke 1.
Tabuľka 1
Skupiny chrániace postranné vlákna, vhodné na syntézu peptidov na pevnej fáze
Arginín: N8-Tosyl
Kyselina asparágová: O-Benzyl
Cysteín: S-para-Metylbenzyl
Kyselina glutámová: O-Benzyl Histidin: N'm-Tosyl
Lyzín: N-2,4-Dichlórbenzyloxykarbonyl
Metionín: S-Sulfoxid
Serín: O-Benzyl
Treonín: O-Benzyl
Tryptofán: N'n-Formyl
Tyrozín: O-2,6-Dichlórbenzyl
Pred inkorporáciou počiatočnej aminokyseliny sa živica trikrát pretrepáva (asi jednu minútu každý raz) s dichlórmetánom (CH2C12; asi 10 mL/gm živice), neutralizuje tromi pretrepaniami (asi dve minúty každé) N,N-diizopropyletylamínom (DIEA) v dichlórmetáne (10 : : 90; asi 10 mL/gm živice) a pretrepáva trikrát (asi jednu minútu každý) s dichlórmetánom (asi 10 mL/gm živice). Počiatočná a každá z následných aminokyselín sa na živicu napájajú použijúc pripravený symetrický anhydrid, pričom sa použije asi 6,0-násobok celkovej reakčnej kapacity živice vhodne chránenej aminokyseliny a asi 2,0-násobok celkovej reakčnej kapacity živice DICu vo vhodnom množstve dichlórmetánu. V prípade aminokyselín, ktoré majú nízku rozpustnosť v dichlórmetáne, sa na dosiahnutie homogénneho roztoku pridá N,N-dimetylformamid. Obyčajne sa symetrický anhydrid pripraví do 30 minút pred vložením do reakčnej nádoby pri laboratórnej teplote alebo pod ňou. Dicyklohexylmočovina, ktorá vzniká pri príprave symetrického anhydridu, sa odstráni filtráciou roztoku do reakčnej nádoby. Postup napájania aminokyseliny na živicu sa zvyčajne monitoruje pomocou farebných testov, pričom sa používa také činidlo, ako je ninhydrín (ktorý reaguje s primárnymi a sekundárnymi amínmi). Po skončení naviazania chránenej aminokyseliny na živicu (> 99 %) sa a amín chrániaca skupina odstráni opracovaním kyslým(i) činidlom(ami). Bežne používané činidlo obsahuje roztok kyseliny trifluóroctovej (TFA) v dichlórmetáne (33 : 66).
Keď sa dokonči požadovaná sekvencia aminokyselín, žiadaný peptid sa môže od živice odštiepiť opracovaním takým činidlom, ako je fluorovodík (HF), ktorý nielenže odštiepi peptid od živice, ale odštiepi aj najčastejšie používané skupiny, chrániace postranné reťazce. Ak sa použije BHA alebo p-Me-BHA živica, produktom opracovania s HF sú priamo voľné amidy peptidov. Ak sa použije aminokyselina-Merrifield živica, voľné alkylamidy peptidov sa odštepujú opracovaním príslušným aminom (v tomto prípade použitie Boc-N -FMOC-Lys umožní súčasné odstránenie skupiny FMOC).
Úplný postup na napojenie každého jedného aminokysclinového zvyšku na živicu je načrtnutý v tabuľke 2.
Tabuľka 2 Postup na napojenie jednotlivých aminokyselín na živicu
Činidlo Pretrepávania Čas/pretrepávanie
L Dichlórmetán 3 1 min.
2. TFA-Dichlórmetán (33 : 66) 1 2 min.
3. TFA-Dichlórmetán (33 : 66) 1 20 min.
4. Dichlórmetán 3 1 min.
5. DIEA, DMF (10:90) 2 2 min.
6. Dichlórmetán 3 1 min.
7. Boe aminokyselina/DIC 1 15 - 120 min.*
8. Dichlórmetán 3 1 min.
10. Sleduj postup
napájacej reakcie**
11 Opakuj kroky 1 -12 pre každú
jednotlivú aminokyselinu
* Čas napojenia závisí od jednotlivej aminokyseliny. ** Miera napojenia sa môže bežne sledovať farebným testom. Ak nie je napojenie ukončené, tá istá aminokyselina sa môže napojiť odlišným postupom, t. j. HOBt aktívnym esterom. Ak je napojenie ukončené, môže sa napojiť ďalšia aminokyselina.
Pomocou tohto postupu boli pripravené zlúčeniny opísané v tabuľkách 3, 4, 5 a 6.
Príklad 2
Uvoľnenie GH in vivo u potkanov
Nedospelé samičky potkanov línie Sprague-Dawley boli získané z Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Po príchode boli umiestnené pri 25 °C s cyklom svetlo : tma v pomere 14:10 hodín. Voda a potkania potrava Purina boli dostupné ad libitum. Mláďatá boli držané so svojimi matkami do 21 dní veku.
Dvadsaťšesť dní starým potkanom, šesť potkanov na vyšetrovanú skupinu, sa dala interperitoneálna anestézia s 50 mg/kg pentobarbitalu 20 minút pred i. v. liečením peptidom. Prostriedkom na intravenózne (i. v.) vstreknutie peptidu bol normálny roztok soli s 0,1 % želatínou. Anestetizovaným potkanom, vážiacim 55 - 65 gramov, sa i. v. vstreklo množstvo zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón uvedené v tabuľke 3. Vstreklo sa im 0,1 mL roztoku do krčnej žily.
Všetky zvieratá boli usmrtené gilotínou 10 minút po poslednej testovacej injekcii (pozri tabuľku 3). Po dekapitácii sa telová krv odobrala na stanovenie krvných hladín GH. Krv sa nechala zraziť, potom sa scentrifugovala a sérum sa oddelilo od zrazeniny. Sérum sa uchovávalo zmrazené do dňa prípravy vzoriek na určenie hladín rastového hormónu rádioimunotestom (RIA) podľa nasledujúceho postupu, ktorý bol vyvinutý v National Inštitúte of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIADDK).
Činidlá sa zvyčajne pridávajú do skúmavok pre RIA analýzu, na jedno zasadnutie, pri chladničkovej teplote (asi 4 °C) v nasledujúcom poradí:
a) tlmivý roztok,
b) „chladný“ (t. j. nerádioaktívny) štandard alebo neznáma vzorka séra, ktorá má byť analyzovaná,
c) rádioaktívnym jódom značený antigén rastového hormónu, a
d) antisérum rastového hormónu.
Pridávanie reakčných zložiek sa zvyčajne robí tak, že sa v RIA skúmavke dosiahne konečné zriedenie asi 1 : 30,000 (antisérum k celkovému objemu kvapaliny; vol: vol).
Pred pridaním druhej protilátky (napr. antiopičie γ-globulínové sérum z kozy alebo králika), ktorá sa naviaže a spôsobí precipitáciu komplexu antiséra rastového hormónu, sa pomiešané reakčné zložky zvyčajne inkubujú asi 24 hodín pri laboratórnej teplote (asi 25 °C). V gama-scintilačnom počítači sa potom analyzuje počet impulzov za špecifickú časovú jednotku vyzrážaného obsahu RIA skúmavok. Kalibračná krivka sa zostrojí tak, že sa znázorní počet rádioaktívnych impulzov v závislosti od hladiny rastového hormónu (GH). Hladina GH neznámych vzoriek sa potom určí porovnaním s kalibračnou krivkou.
Sérový GH sa meral RIA metódou s chemikáliami, poskytnutými z National Hormon and Pituitary Program.
Hladiny séra v tabuľke 3 sú znázornené v ng/mL v zmysle potkanieho GH štandardu 0,61 medzinárodných jednotiek/mg (IU/mg). Údaje sú znázornené ako priemerná +/- štandardná chyba priemeru (SEM). Štatistická analýza sa robila pomocou Študentovho t-testu. Výsledky, znázornené v tabuľke 3, sú priemermi štúdií so šiestimi potkanmi.
Tabuľka 3
Uvoľňovanie GH vyvolané zlúčeninami uvoľňujúcimi rastový hormón in vivo u pentobarbitalom anestetizovaných potkanov (Zvieratá boli usmrtené 10 minút po poslednej injekcii)
Stĺpec A GH uvoľňujúci peptid Celková dávka“ (pg/iv) Kontrolné sérum GH ng/mL + SEM (N=6) Sérum s uvoľneným GH, GH ng/mL + SEM (N=6)
Ala-His-DPNal-Ala- ,1 337 ±51 610 ±90
-Trp-DPhe-Lys-NH2 b ,3 337 ±51 1140±187
1,0 337 ±51 2909 ±257
,0 337 ±51 3686 ±436
His-DTrp-Ala-Trp- ,1 131 ±43 540 ±148
-DPhe-Lys-NH2 b ,3 131 ±43 751 ±88
1,0 131 ±43 1790 ±252
3,0 131 ±43 2481 ±209
DAla-DPNal-Ala- ,1 337 ±51 1381±222
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 337 ±51 2831 ±304
1,0 337 ±51 2886±179
3,0 337 ±51 3678 ±287
Ala-DpNal-Ala-Trp- 0,3 167 ±46 363 ±73
-DPhe-Lys-NH2 1,0 167 ±46 1450±294
3,0 167 ±46 2072 ±208
10,0 167 ±46 2698 ±369
DAla-LpNal-Ala- ,1 160±151 263 ±45
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 160 ±151 315 ±85
1,0 426 ±41
DAla-DTrp-Ala-Trp ,1 111 ±24 526 ±86
-DPhe-Lys-NH2 ,3 111 ±24 1608 ±204
1,0 111 ±24 2820 ±346
3,0 111 ±24 2437 ±214
Ala-DpNal-Ala-Nme ,1 167 ±46 144 ±20
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 167 ±46 258 ±28
1,0 167 ±46 261 ±24
3,0 167 ±46 277 ±85
D-Leu-DpNal-Ala- ,1 160 ±51 256 ±94
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 160 ±51 452 ±49
1,0 160 ±51 355 ±94
D-Trp-DpNal-Ala- ,1 160 ±51 226 ±61
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 160 ±51 245 ±27
1,0 160 ±51 437 ±62
Ala-His-DPNal-Ala- ,3 160 ±51 1418 ±302
-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 1,0 160 ±51 2201 ±269
His-DTrp-Ala-Trp ,1 140 ±10 200 ±40
DPhe-Lys-NH2 b ,3 140 ±10 505 ±50
1,0 140 ±10 1640 ±215
DAsn-DpNal-Ala- ,1 228 ±23 122 ±38
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 228 ±23 195 ±21
1,0 228 ±23 197 ±47
DHis-DpNal-Ala- ,1 228 ±23 386 ±81
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 228 ±23 605 ±82
1,0 228 ±23 930 ±96
DLys-DpNal-Ala- ,1 228 ±23 262 ±31
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 228 ±23 340 ±86
1,0 228 ±23 335 ±56
DSer-DPNal-Ala- ,1 228 ±23 226 ±11
-Trp-DPhe-Lys-NH2 ,3 228 ±23 171 ±48
1,0 228 ±23 212 ±43
Ala-His-D[!Nal-Ala- ,3 228 ±23 1746 ±318
-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 1,0 228 ±23 2610 ±176
Gly-DPNal-Ala-Trp- ,3 160 ±36 1237 ±249
-Phe-Lys-NH2 1,0 160 ±36 2325 ±46
3,0 160 ±36 2694 ±370
10,0 160 ±36 3454±159
Ser-DPNal-Ala- ,3 160 ±36 227 ±39
-Trp-DPhe-Lys-NH2 1,0 160 ±36 595 ±112
3,0 160 ±36 1303 ±281
10,0 160 ±36 2919 ±320
Met-DPNal-Ala- ,3 160 ±36 181 ±48
-Trp-DPhe-Lys-NH2 1,0 160 ±36 226 ±58
3,0 160 ±36 316 ±66
10,0 160 ±36 1010 ±236
Ala-His-DpNal-Ala- 0,1 160 ±36 822 ±243
-Trp-DPhe-Lys-NH2 b 0,3 160 ±36 1594±292
1,0 160 ±36 2180 ±284
Gln-DpNal-Ala-Trp- 0,3 131 ±43 124±15
-DPhe-Lys-NH2 1,0 131 ±43 340 ±66
3,0 131 ±43 476 ±109
10,0 131 ±43 673 ±228
Pro-DpNal-Ala-Trp- 0,3 135 ±32 264 ±31
-DPhe-Lys-NH, 1,0 135 ±32 513 ±12
3, 135 ±32 1690±103
Gly-DpNal-Ala-Trp- 0,3 215 ±33 1301±260
-DPhe-Lys-NH, 1,0 215 ±33 2211 ±146
3,0 215 ±33 2364 ±365
NaAcecyl-Gly- 0,3 262 ±53* 268±21*
-DpNal-Ala-Trp- 1,0 262 ±53* 599 ±219*
-DPhe-Lys-NH2 3,0 262 ±53* 626 ±210*
Sar-DpNal-Ala-Trp- 0,3 262 ±53* 908±264*
-DPhe-Lys-NH2 1,0 262 ±53 1681 ±262*
3,0 262±53* 2600 ±316*
DPNal-Ala-Trp- 0,3 215 ±33 436 ±98
-DPhe-Lys-NH2 1,0 215 ±33 660 ±151
3,0 215 ±33 776 ±274
NaAcetyl-DpNal-Ala- 0,3 262 ±53* 339 ±17*
-Trp-DPhe-Lys-N H2 1,0 262 ±53* 430±136*
3,0 262±53* 634 ±118*
Nalsopropyl-DpNal- 0,3 262 ±53* 541 ±179*
-Ala-T rp-DPhe-Lys- 1,0 262±53* 972 ±247*
-NH2 3,0 262±53* 1636 ±371*
Nadiethyl-DPNal- 0,3 127 ±32* 462±132*
-Ala-Trp-DPhe-Lys- 1,0 127 ±32* 899 ±160*
-NH2 3,0 127 ±32* 1786 ±373*
Naethyl-DPNal-Ala- 0,3 135 ±32 531 ±80
-Trp-DPhe-Lys-NH2 1,0 135 ±32 1156 ±250
3,0 135 ±32 2664 ±225
Gly-DpNal-Ala-Trp- 0,3 135 ±32 1387 ±352
-DPhe-Lys-NH2 1,0 135 ±32 1958 ±353
3,0 135 ±32 2605 ±97
PAla-DpNal-Ala-Trp- 0,3 135 ±32 1937 ±343
-DPhe-Lys-NH2 1,0 135 ±32 3603 ±645
3,0 135 ±32 4000 ±500
Ava**-DPNal-Ala- 0,3 135 ±32 2469 ±185
-Trp-DPhe-Lys-NH2 1,0 135 ±32 4034 ±680
3,0 135 ±32 3142 ±392
Ala-DpNal-Ala-Trp- 0,3 208 ±148* 211 ±27*
-DPhe-NHCH2CH2NH2 1,0 208=tl48* 468±127*
3,0 208 ±148* 877 ±325*
30,0 208 ±148* 2325 ±477*
Ala-DPNal-Ala-Tip-DPhe- 0,3 208 ±148* 284 ±132*
NHCH2CH2CH2CH2CH2NH2 1,0 208 ±148* 527 ±166*
3,0 208 ±148* 816 ±289*
30,0 208 ±148* 3650 ±772*
D-Ala-DpNal-AU-Tip-DPhe- 0,3 111 ±24 180 ±37
NHCHjCH/ľHjCHjCHíNHí 1,0 111 ±24 686 ±135
3,0 111 ±24 1490 ±179
10,0 111 ±24 2248 ±70
Ala-DpNal-Ala-Trp- 0,3 208 ±148* 211 ±48*
-DPhe-OMe 1,0 208 ±148* 157 ±35*
3,0 208 ±148* 492±147*
30,0 208 ±148* 554 ±127*
D-Ala-DTrp-Ala-Trp- 0,1 111 ±24 526 ±86
-DPhc-Lys-NH2 0,3 111 ±24 1608 ±204
1,0 111 ±24 2820 ±346
3,0 111 ±24 2437 ±214
Aib-DpNal-Ala-Trp 0,1 208 ±148* 269 ±58*
-DPhe-Lys-NH2 0,3 208 ±148* 331 ±108*
1,0 208 ±148* 368 ±133*
3,0 208 ±148* 1090±176*
D-Ala-DpNal-Ala- 0,1 215 ±49 608±115
-Trp-DPhe-Lys(iPr)- 0,3 215 ±49 1753 ±419
-NH2 1,0 215 ±49 1817 ±297
3,0 215 ±49 2336 ±196
* Rozpustené v DMSO, **Rozpustené v kyseline aminovalérovej (Ava) “Takto označené dávky boli podané 29 dní starým samičkám potkanov, kontrolné GHRP
V tabuľke 3 sú zlúčeniny z vynálezu porovnané so zlúčeninami mimo tu uvádzaného druhového vzorca a ukazuje sa, že podporujú uvoľnenie a zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi potkanov, ktorým boli takéto zlúčeniny podané, lepším spôsobom, Prekvapujúca rastový hormón uvoľňujúca aktivita prednesených zlúčenín je celkom užitočná, pretože polypeptíd nízkej molekulovej hmotnosti, s kratším vláknom, relatívne stabilnou a nenákladnou aminokyselinou D-alanínom na aminokonci a pentándiamínom namiesto Lys na C-konci by sa mal potvrdiť ako lacný prostriedok na posilnenie hladín rastového hormónu u zvierat a ľudí.
Príklad 3
Uvoľnenie GH in vivo u potkanov po orálnom podaní
Zopakoval sa postup z príkladu 2 okrem toho, že naznačené dávky zlúčenín sa potkanom dali intragastrálnymi trubicami. Podané zlúčeniny, použité dávky a výsledky sú znázornené v tabuľke 4.
Tabuľka 4
Uvoľnenie GH in vivo, podporované zlúčeninami uvoľňujúcimi rastový hormón u pentobarbitalom anestetizovaných potkanov (Potkany boli usmrtené v rôznych časoch po intragastrálnom podaní peptidu)
Stĺpec A GH uvoľňujúci peptid Celková dávka (mg/kg) Sérový GH ng/ml ±SEM (N=6) Sérový GH ng/ml ±SEM (N=6 za:) 15' (20') (30')
Ala-His-DpNal-Ala- 10 247 ±32 786 ±244
-Trp-DPhe-Lys-NH2 a 30 267 ±32 1914 ±294
DAla-DpNal-Ala- 10* 247 ±32 116 ±298
-Trp-DPhe-Lys-NH2 30** 247 ±32 2038 ±444
Ava-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 30 322 ±145* 2135 ±586*
Gly-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 30 247 ±32 1072 ±137
His-DTrp-Ala- -Trp-DPhe-Lys-NH2 a 30 247 ±32 1810 ±437
Ala-His-DpNal-Ala- Trp-DPhe-Lys-NHj“ 10 196 ±49(15') 147 ±30(20) 133 ±18(30') 1421 ±363 1605 ±621 (20') 752 ±81(30')
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 10 196 ±49(15’) 147 ±30(20') 706 ±133 (15') 1062 ±254 (20')
Gly-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 10 196 ±49(15') 147 ±30(20') 957 ±188 (15') 1685 ±524 (20’)
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lysa 10 196 ±49(15') 147 ±30(20') 1131 ±189(15') 686 ±149 (20')
PAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHj 10 196 ±49(15') 147 ±30(20') 1202 ±429 (15’) 1217 ±239 (20')
Ava-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 10 196 ±49(15’) 147 ±30(20’) 1407 ±204(15’) 1251 ±351 (20‘)
*Suspenzia (ľahká* alebo ťažká* *)-pridaná kyselina octová “Kontrolné peptidy
Po orálnom podaní potkanom si zlúčeniny tu uvádzaného vynálezu udržujú užitočné hladiny GH-uvoľňujúcej aktivity. Toto je cenné, pretože sa touto metódou podania zvyšuje terapeutická užitočnosť peptidov.
Príklad 4
Uvoľnenie GH in vivo u potkanov
Zopakoval sa postup z príkladu 2. Podané zlúčeniny, použité dávky a výsledky sú znázornené v tabuľkách 5 a 6.
Tabuľka 5
Uvoľnenie GH in vivo, podporované syntetickými peptidmi uvoľňujúcimi rastový hormón u pentobarbitalom anestetizovaných potkanov (Zvieratá usmrtené 10 minút po poslednej injekcii)
Stĺpec A GH uvoľňujúci peptid Celková dávka (pg/iv) Kontrolné sérum GH ng/mL + SEM (N=6) Sérum s uvoľneným GH, GH ng/ml + SEM (N=6)
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,30 216=:27 611 ±68
DPhe-Ala-NH2 1,00 216 ±27 929 ±209
3,00 216 ±27 1765 ±320
10,00 216 ±27 2644 ±358
Lys-DAla-DpNal- 0,10 216 ±27 216 ±40
-Ala-T rp-DPhe-Lys- 0,30 216 ±27 269 ±31
-nh2 1,00 216 ±27 432±143
3,00 216 ±27 771 ±134
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 216 ±27 517 ±135
-DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 216 ±27 1078 ±174
0,30 216 ±27 1831 ±436
1,00 216 ±27 3120 ±761
DAla-DPNal-Ala- 0,10 187 ±36 220 ±34
-Trp-DAla-Lys-NH2 0,30 187 ±36 167 ±48
1,00 187 ±36 339 ±61
3,00 187 ±36 778±174
10,00 187 ±36 1676 ±470
30,00 187 ±36 1791 ±384
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 153 ±27 409 ±97
-DPhe-LysNH2 0,10 153 ±27 1469±152
0,30 153 ±27 2322 ±265
1,00 153 ±27 2765 ±352
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 177 =45 542 ±98
-DPhe-Ala-NH(CH2)5NH2 0,10 177 ±45 932 ±84
0,30 177 ±45 1121 ±212
1,00 177 ±45 2599 ±144
NalMA-DpNal-Ala- 0,03 192 ±41 696 ±108
-Trp-DPhe-LysNH2 0,10 192 ±41 1049 ±198
0,30 192 ±41 2567 ±419
1,00 192 ±41 2001 ±341
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,10 192 ±41 846 ±105
-DPhe-NH-Chx-NH2 0,30 192 ±41 1886 ±493
1,00 192 ±41 2209±187
3,00 192 ±41 3359 ±433
DAla-T cc-Ala-Trp- 0,30 93 ±22 149 ±20
-DPhe-Lys-NH2 3,00 93 ±22 142 ±35
DAla-Gly-Gly-Trp- 0,30 93 ±22 107 ±14
-DPhe-Lys-NH2 3,00 93 ±22 89 ±15
DAla-DPNal-Ala- 0,03 93 ±22 230 ±23
-Trp-DPhe-Lys-NH, 0,10 93 ±22 1006 ±204
0,30 93 ±22 2110 ±260
1,00 93 ±22 1825 ±328
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,03 93 ±22 141 ±26
-DTic-Lys-NH2 0,10 93 ±22 156 ±62
0,30 93 ±22 124 ±31
1,00 93 ±22 151 ±24
DAla-DPNal-Ala- 0,10 93 ±22 558±162
-Trp-DPhe-Lys-OH 0,30 93 ±22 1730 ±306
DAla-DPNal-Ala- 3,00 145 ±17 537 ±43
-Tcc-DPhe-Lys-NH2 10,00 145 ±17 746 ±92
DpNal-Gly-Gly-Trp- 3,00 145 ±17 417 ±37
-DPhc-Lys-NH2 10,00 145 ±17 397±U4
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,10 145 ±17 365 ±42
-DPal-Lys-NH2 0,30 45 ±17 1584 ±148
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,10 145 ±17 928±184
-DPal-Lys-OH 0,30 145 ±17 1782 ±241
3Me-His-DPNal-Ala- 0,03 87 ±11 122 ±11
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 87 ±11 185 ±27
0,30 87 ±11 101 ±12
0,10 87 ±11 112 ±13
3Me-His-DPNal-Ala- 0,03 87 ±11 134 ±28
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 87 ±11 159 ±30
0,30 87 ±11 78 ±19
1,00 87 ±11 134 ±27
Tip-Ala-DPNal-Ala- 0,10 87 ±11 168 ±27
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,30 87 ±11 167 ±28
1,00 87 ±11 152 ±74
3,00 87 ±11 272 ±63
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,03 247 ±53 870±136
-DPhe-Lys-NH2 0,10 247 ±53 1440 ±267
0,30 247 ±53 2420 ±456
1,00 247 ±53 2855 ±347
3,00 247 ±53 3421 ±377
DAla-DT cc-Ala-Trp- 0,10 247 ±53 165 ±26
-DPhe-Lys-NH2 0,30 247 ±53 183 ±9
1,00 247 ±53 207 ±38
3,00 247 ±53 153 ±22
10,00 247 ±53 269 ±47
Ava-Trp-DTrp-Lys-NH2 0,10 247 ±53 153 ±30
0,30 247 ±53 144 ±14
1,00 247 ±53 117 ±9
3,00 247 ±53 205 ±59
10,00 247 ±53 214 ±48
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 228 ±48 203 ±20
-DPal-Lys-NH2 0,10 228 ±48 772 ±142
0,30 228 ±48 979 ±182
1,00 228 ±48 1691 ±139
3,00 228 ±48 3249 ±526
Tyr-DAla-DpNal-Ala- 0,03 228 ±48 164 ±52
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 228 ±48 247 ±51
0,30 228 ±48 196 ±39
1,00 3,00 228 ±48 228 ±48 329 ±57 878 ±170 -DLeu-Lys-NH2 1,00 3,00 157 ±40 157 ±40 165 ±12 307 ±51
Ala-His-DPNal-Ala- 0,10 228 ±48 894±112 10,00 157 ±40 1591 ±568
-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,30 228 ±48 1128 ±274 Ava-DpNal-Ala-Trp- 0,03 157 ±40 768±191
1,00 228 ±48 1362±198 -DPhc-Lys-NH2 0,10 157 ±40 1277 ±61
DAla-DpNal-Ala- 0,03 228 ±48 300 =82 0,30 157 ±40 1733 ±254
-Trp-DPhe-Lys-OH 0,10 228 ±48 585 ±141 1,00 157 ±40 2418 ±162
0,30 228 ±48 1202 ±236
1,00 228 ±48 2610 ±355 Tabuľka 6
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 167 ±29 123 ±17 Uvoľnenie GH in vivo, podporované syntetickými pep-
-NMc-DPhe-Lys-NH; 0,10 167 ±29 132 ±30 tidmi uvoľňujúcimi rastový hormón u pentobarbitalom a-
0,30 167 ±29 232 ±49 nestetizovaných potkanov (Zvieratá usmrtené 10 minút
1,00 167 ±29 233 ±41 po poslednej injekcii)
His-Trp-Ala-Trp-Phe- 1,00 167 ±29 125 ±24 Kontrolné Sérum
-Lys-NH2 3,00 167 ±29 201 ±19 Stĺpec A Celková sérum GH s uvoľneným
10,00 167 ±29 130 ±25 GH uvoľňujúci dávka ng/mL + GH, GH
30,00 167 ±29 182 ±36 peptid (pg/iv) SEM ng/ml + SEM
Ava-DAla-DpNal-Ala- 0,03 167 ±29 209 ±33 (N=6) (N=6)
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 167 ±29 144 ±42 DAla-DPNal-Ala-2rp- 0,03 186 ±34 412 ±84
0,30 167 ±29 185 ±47 -DPhe-iLysNH2 0,10 186 ±34 630 ±124
1,00 167 ±29 499 ±110 0,30 186 ±34 1877 ±195
PAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 167 ±29 489 ±71 1,00 186 ±34 3008 ±417
-DPhe-Lys-NH2 0,10 167 ±29 1112 ±194 DAIa-D[5.\al-Ala-homo 0,03 93 ±13 214 ±71
0,30 167 ±29 1993 ±259 Phe-DPhe-LysNHj 0,10 93 ±13 214 ±58
1,00 167 ±29 3061 ±238 0,30 93 ±13 406 ±121
DAla-DpNal-Gly-Trp- 0,10 121 ±14 226 ±26 1,00 93 ±13 1189 ±120
-DPhe-Lys-NH2 0,30 121 ±14 170 ±31 DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 93 ±13 444 ±60
1,00 121 ±14 414±101 -DPhe-Ala-1,3-diami- 0,10 93 ±13 517 ±109
3,00 121 ±14 713±126 nopropane 0,30 93 ±13 2341±479
DAla-DpNal-Gly-Gly- 0,10 121 ±14 95 ±15 1,00 93 ±13 2468 ±276
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,30 121 ±14 82 ±16 DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 93 ±13 362 ±64
1,00 121 ±14 177 ±43 -DPhe-LysNH2 0,10 93 ±13 800 ±192
3,00 121 ±14 223 ±58 0,30 93 ±13 2674 ±486
Asp-DAla-DpNal-Ala- 0,03 121 ±14 210 ±53 1,00 93 ±13 3658±610
-Trp-DPhe-Lys-NHj 0,10 121 ±14 322 ±48 DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,03 85 ±16 395 ±91
0,30 121 ±14 557 ±181 DPhe-Ala-1,6, hexyl- 0,10 85 ±16 905 ±113
1,00 121 ±14 821±173 diamine 0,30 85 ±16 735±166
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 121 ±14 335±106 1,00 85 ±16 2708 ±310
-DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 121 ±14 652 ±129 IMA-DPNal-Ala-Trp- 0,03 85 ±16 566 ±157
0,30 121 ±14 1528 ±252 -DPhe-Ala-1,3, diami- 0,10 85 ±16 645 ±167
1,00 121 ±14 2410 ±370 nopropane 0,30 85 ±16 1428 ±271
DAla-DpNal-DAla- 0,10 200 ±45 166 ±36 1,00 85 ±16 2972 ±365
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,30 200 ±45 197 ±33 DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 125 ±12 252 ±29
1,00 200 ±45 343 ±73 -DPhe-ArgNH2 0,10 125 ±12 645 ±90
3,00 200 ±45 531 ±121 0,30 125 ±12 1180 ±318
DAla-DPNal-Ala-Ala- 0,10 200 ±45 147 ±21 1,00 125 ±12 2197 ±285
-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,30 200 ±45 184 ±45 Arg-DAla-DPNal-Ala- 0,10 125 ±12 155 ±43
1,00 200 ±45 206 ±66 -Trp-DPhe-ArgN H2 0,30 125 ±12 247 ±70
3,00 200 ±45 143 ±9 1,00 125 ±12 276±16
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,10 200 ±45 1246 ±189 IMA-DPNal-Ala-Trp- 0,03 125 ±12 332 ±59
-DPhe-NH-Chx-NHj 0,30 200 ±45 1616 ±250 -DPhe-Ala-1,6 hexyl- 0,10 125 ±12 609 ±165
1,00 200 ±45 2574 ±467 diamine 0,30 125 ±12 1139 ±232
3,00 200 ±45 2789 ±130 1,00 125 ±12 1996 ±372
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,03 200 ±45 608±140 DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,30 160 ±33 187 ±44
-DPhe-Lys-NH2 0,30 200 ±45 920 ±225 -LysNH2 1,00 160 ±33 257 ±18
1,00 200 ±45 1755 ±291 3,00 160 ±33 198 ±31
3,00 200 ±45 2527 ±196 10,00 160 ±33 193 ±33
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 157 ±40 113 ±14 30,00 160 ±33 236 ±23
-Pro-Lys-NH2 1,00 157 ±40 136 ±40 DAla-DpNal-Ala- 0,30 160 ±33 115 ±22
3,00 157 ±40 195 ±35 -TrpNH2 1,00 160 ±33 107 ±23
10,00 157 ±40 226 ±42 3,00 160 ±33 101 ±13
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,30 157 ±40 234 ±36 10,00 160 ±33 199 ±40
-DPro-Lys-NH2 1,00 157 ±40 358 ±48 30,00 160 ±33 232 ±69
3,00 157 ±40 576 ±77 DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,03 160 ±33 517 ±89
10,00 157 ±40 1624 ±241 DPhe-Ala-NH(CH2)5NH2 0,10 160 ±33 1164 ±255
DAla-DPNal-Ala-Trp- 0,30 157 ±40 202 ±27 0,30 160 ±33 2023 ±242
Príklad 6
Uvoľnenie GH in vivo u potkanov
Pracovalo sa podľa všeobecného postupu opísaného v príklade 2, s tou výnimkou, že peptidy boli injikované podkožné, namiesto intravenózne, a čas usmrtenia bol ±15 minút, namiesto ±10 minút. Podané zlúčeniny, použité dávky a výsledky sú znázornené v tabuľke 7.
1,00 160 ±33 3441 ±435
DAla-DpNal-Ala-Trp- 0,30 157 ±40 113 ±14
-Pro-LysNH2 1,00 157 ±40 136 ±40
3,00 157 ±40 195 ±35
10,00 157 ±40 226 ±42
DAla-DPNal-Ala- 0,30 157 ±40 234 ±36
-Trp-DPro-LysNH2 1,00 157 ±40 333 ±48
3,00 157 ±40 576 ±77
10,00 157 ±40 1624 ±241
DAIa-D3Nal-Ala-Trp- 0,30 157 ±40 202 ±27
-DLeu-LysNH2 1,00 157 ±40 165 ±12
3,00 157 ±40 307 ±51
10,00 157 ±40 1591±568
Ava^lNal-Ala-Trp- 0,03 157 ±40 768 ±191
-DPhe-LysNH2 0,10 157 ±40 1277 ±61
0,30 157 ±40 1733 ±254
1,00 157 ±40 2418±162
α,γΑΒυ-ϋβΝ31-Α13- 0,03 108 ±20 621 ±85
-Trp-DPhe-LysNH2 0,10 108 ±20 1230 ±317
0,30 108 ±20 2385±182
1,00 108 ±20 3011 ±380
ΟΑΐΗ-ΟβΝηΙ-ΑΙη-Τφ- 0,03 108 ±20 246 ±22
-DPhe-HisNH2 0,10 108 ±20 199 ±34
0,30 108 ±20 370 ±67
1,00 108 ±20 1419 ±230
ΟΑ13-ϋβΝ31-Α/-Ρ1ΐ6- 0,03 108 ±20 366 ±81
-DPhe-LysNH2 0,10 108 ±20 1011 ±175
0,30 108 ±20 2361 ±233
1,00 108 ±20 3057 ±472
DAla^Nal-Ala-Trp- 0,10 108 ±20 151 ±35
-NH-Chx-NH2 0,30 108 ±20 251 ±43
1,00 108 ±20 227 ±55
3,00 108 ±20 349 ±72
ΟΑΙο-ϋβ^Ι-Αυ-Τφ- 0,03 200 ±33 515 ±92
-DPhe-OmNH2 0,10 200 ±33 787 ±71
0,30 200 ±33 1288 ±365
1,00 200 ±33 1888 ±615
ΟΑ13-ϋβΝ31-Α13-ΤΓρ- 0,03 200 ±33 287 ±48
-DHis-LysNH2 0,10 200 ±33 131 ±37
0,30 200 ±33 337 ±78
1,00 200 ±33 457 ±124
Tabuľky 5 a 6 ukazujú, že zlúčeniny s tu uvedeným vzorcom podporujú uvoľnenie a zvýšenie hladín rastového hormónu v krvi vo väčšom rozsahu ako zlúčeniny mimo tohto vzorca.
Príklad 5 Uvoľnenie GH in vivo u ľudí
Peptid Ala-His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH-(GHRP-1) alebo peptid DAla-D3Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2) bol orálne podaný ľudským subjektom, mužom s hlavným vekom asi 25 rokov. Štyridsať subjektov dostalo 300 pg 1 kg GHRP-1 v 20 ml H2O, potom nasledovalo 100 ml iba H2O, 39 subjektov dostalo 600 pg 1 kg GHRP-1 v 20 ml vody, potom nasledovalo 100 ml H20, a 11 subjektov dostalo 100 pg/kg GHRP-2 v 20 ml H2O, potom nasledovalo 100 ml H2O. V periodických intervaloch, naznačených v obrázku 1, sa odoberala krv a vzorky boli spracované rádioimunotestom na stanovenie hladín rastového hormónu postupom, opísaným v príklade 2. Výsledky sú znázornené na obrázku 1. Orálne podanie 100 pg/kg GHRP-2 spôsobilo vyššie hladiny rastového hormónu ako orálne podanie 300 pg/kg GHRP-1.
Tabuľka 7
Stĺpec A GH uvoľňujúci peptid Celková dávka (pg/iv) Kontrolné sérum GH ng/ml + SEM (N=6) Sérum s uvoľneným GH, ng/ml + ± SEM (N=6)
IMA^Nal-Ala-Phe- ,03 147 ±21 181 ±36
-DPhe-Lys-NH2 ,10 147 ±21 399 ±40
,30 147 ±21 808 ±187
1,00 147 ±21 2394 ±475
αγΑΒυ-ΟβΝ31-Α£- ,03 147 ±21 192 ±29
-Phe-DPhe-Lys-NH2 ,10 147 ±21 288 ±62
,30 147 ±21 461 ±90
1,00 147 ±21 1441 ±203
ΙΜΑ-ϋβΝηΙ-ΑΙα- ,03 147 ±21 475 ±96
-Trp-DPhe-Ala-1,5- ,10 147 ±21 916 ±169
-pentadiamine ,30 147 ±21 1118 ±243
1,00 147 ±21 2660 ±599
His^Nal-Ala-Phe ,03 217 ±33 317 ±55
DPhe-Lys-NH2 ,10 217±33 348 ±65
,30 217 ±33 1283 ±258
1,00 217±33 1374 ±107
Ala-His^Nal-Ala- ,03 217 ±33 341 ±35
-Phe-DPhe-Lys-NH2 ,10 217 ±33 516 ±118
,30 217 ±33 1060 ±151
1,00 217±33 1467 ±208
yABU^Nal-Ala- ,03 217 ±33 197 ±31
+Phe-DPhe-Lys-NH2 ,10 217±33 182 ±20
,30 217 ±33 524±116
1,00 217 ±33 1127±110
DAla-DPNal-Ala-Phe- ,03 217 ±33 287 ±62
-DPhe-Lys-NH2 ,10 217 ±33 1084 ±162
,30 217 ±33 1982 ±345
1,00 217 ±33 2887 ±275
DAla-DPhe-Ala-Phe- ,03 132 ±18 167 ±29
-DPhe-Lys-NH2 ,10 132 ±18 499 ±62
,30 132 ±18 1132 ±145
1,00 132±18 2147 ±268
DAla^Nal-Ala- ,03 132 ±18 356 ±77
-Phe-DPhe-Lys-NH2 ,10 132 ±18 795 ±132
,30 132 ±18 1564 ±224
1,00 132 ±18 2272 ±406
Príklad 7
Príprava peptidu kondenzaČnou reakciou peptidových fragmentov
Všeobecné postupy
Teplota topenia sa môže určiť s použitím kapilárnej aparatúry Thomasa Hoovera na stanovenie teploty topenia. Infračervené spektrá sa môžu zaznamenať na spektrofotometroch Perkin-Elmer Model 137 alebo Nicolet Model 5DX a môžu byť vyjadrené v hodnotách vlnových dĺžok (cm-1). Hmotnostné spektrá sa môžu získať na hmotnostnom spektrometri VG Analytical Ltd. Model ZAB-1F v modoch EI (eleetron impact), FD (field desorption) alebo FAB (fast atóm bombardement). GCMS sa môže získať pomocou Finnigan 4023 GCMS, vybaveným m DBS kapilárnou kolónou (J & W Scientific), ako nosičový plyn sa použije hélium. Optická rotácia sa môže merať pomocou polarimetra Autopol III, vyrobeného v Rudolph Research.
*H spektrum sa môže získať na prístroji JEOL GX400 NMR, pracujúcom pri 400 MHz alebo prístroji JEOL GX-270, pracujúcom pri 270 MHz. Tieto prístroje umožňujú rutinné digitálne rozlíšenie menej ako 0,7 Hz. Chemické posuny sú vyjadrené v časticiach na milión vzhľadom na vnútorný 3-(trimetylsilyl)-tetradeuteropropionát sodný (TSP).
Vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC) sa môže robiť na systéme Hitachi, ktorý obsahuje kontroler gradientu L-5000 a pumpu 655Λ, napojené na semipreparatívnu kolónu Vydac 201TP1010 alebo 218TP1010. Ako elučný roztok sa môže použiť voda, obsahujúca 0,2 % kyselinu trifluóroctovú a metanol. Zlúčeniny, o ktoré máme záujem, sa typicky eluujú pri nízkej prietokovej rýchlosti šesť mL za minútu pomocou gradientu, v ktorom sa organická zložka zvyšuje rýchlosťou asi 1 - 2 % za minútu. Zlúčeniny sa detegujú pri vhodnej vlnovej dĺžke pomocou diódovej rady U. V. detektora LKB 2140. Integrácia sa môže urobiť pomocou Nelson Analytical Software (Verzia 3.6).
Ak nie je inak upresnené, reakcie prebiehajú v inertnej atmosfére dusíka alebo argónu. Anhydrický tetrahydrofurán (THF, stupeň U. V.) a dimetylformamid (DMF) sa môžu kúpiť od Burdick and Jackson a môžu sa použiť priamo z fľaše.
A. Príprava tripeptidového fragmentu - 2HN-Trp-DPhe-Lys(Boc)-NH2
Na-Benzyloxykarbonyl-(Ne-t-butoxykarbonyl)lyzínamid. 4.
Do 10 °C teplého roztoku karbonyldiimidazolu (CDI, 2, 88,24 g, 0,544 mol) a suchého tetrahydrofuránu (THF, 1500 mL), sa pomaly pridáva Na-benzyloxykarbonyl(Nc-t-butoxykarbonyl)lyzín (1, 180 g, 0,474 mol). Počas pridávania sa pozoruje uvoľňovanie plynu. Počas tvorby Na-benzyloxykarbonyl-(Ne-t-butoxykarbonyl)lyzínimidazolidového intermediátu, 3, sa pripraví nasýtený roztok amoniaku a THF (2000 mL) (bezvodý plynný NH3 sa prebubláva cez THF pri 5 - 10°C). Po usúdení, že tvorba intermediátu 3 je ukončená (prestane uvoľňovanie plynu, približne 2 hodiny), sa do amoniakálneho roztoku pridá polovica roztoku THF obsahujúceho 3. Zvyšok roztoku, obsahujúceho 3, sa pridá po 30 minútach. Počas pridávania a 45 minút po ňom sa udržuje nepretržitý tok plynného amoniaku. Po pridaní dvoch roztokov, obsahujúcich 3, sa tvorí biela zrazenina. Reakcia sa nechá ohriať na laboratórnu teplotu a miešať 15 hodín. Rozpúšťadlo sa z kaše odstráni in vacuo. Zo zostatku sa vo vode urobí riedka kaša a výsledná tuhá látka sa získa vákuovou filtráciou.
Nc-t-Butoxykarbonyl-lyzínamid, 5.
Roztok lyzínamidu 4 (181,48 g, 0,479 mol) v metanole (MeOH, 1000 mL) sa pridá do kasičky katalyzátora 5 % Pd/C v metanole (250 mL) pod argónom. Reakčná zmes sa prebuble vodíkom (asi 15 minút) a nechá sa potom miešať pod vodíkovou atmosférou dovtedy, kým sa HPLC analýzou zistí, že reakcia ja ukončená (36 hodín). Vodíková atmosféra sa potom nahradí argónom. Reakčný roztok sa potom vyčíri cez vložku CeliteR a rozpúšťadlo sa odstráni in vacuo, čím sa získa tuhá látka.
Na-Benzyloxykarbonyl-D-fenylalanyl-(Nc-t-butoxykarbonyl) lyzínamid, 8.
Do 10 °C teplého roztoku CDI (2, 66,03 g, 0,409 mol) v THF (500 mL) sa pomaly pridá Na-Benzyloxykarbonyl-D-fenyl-alanín (6, 126,39 g, 0,423 mol). Počas pridávania sa pozoruje uvoľňovanie plynu. Keď sa uvoľňovanie plynu skončí, pridá sa lyzínamid 5 (110,75 g, 0,452 mol) ako roztok v THF (500 mL). Po asi 48 hodinách sa filtráciou zmesi odstráni pevné látky. Filtrát sa nakoncentruje in vacuo. Získaný zvyšok sa zoberie v octane etylnatom (EtOAc, 500 mL) a premýva sa v oddeľovacom lieviku nasledovným postupom:
1. aq HCI (1 N, 3 x 500 mL) pH premytia 1, asi 8; pH nasledujúcich premytí, 1,
2. voda (500 mL),
3. aq Na2CO3 (1/2 nasýtenia, 2 x 500 mL), filtruje sa, aby sa získali vytvorené kryštály (8),
4. voda (3 x 500 mL).
Organická vrstva sa vysuší nad MgSO4. Po vyčírení sa rozpúšťadlo odstráni in vacuo. Zostatok sa môže rekryštalizovať z horúceho EtOAc a získa sa druhá vzorka 8.
D-Fenylalanyl-(Ns-t-butoxvkarbonyl)lyzinamid, 9.
Do kasičky katalyzátora - 5 % Pd/C (50 g) v MeOH (200 mL) sa pridá metanolový roztok (1500 mL) amidu 8. (120,53 g, 0,229 mol). Argónová atmosféra sa nahradí vodíkom. Keď HPLC analýza indikuje, že reakcia je ukončená (asi 4 hodiny), vodíková atmosféra sa nahradí argónom. Reakčný roztok sa vyčíri cez vložku CeliteR a filtrát sa odparí in vacuo. Tento dipeptidový produkt sa môže použiť priamo na prípravu tripeptidu 12.
Na-Benzyloxykarbonyl-tryptofyl-D-fenylalanyl-(Ne-t-butoxykarbonyl)lyzínamid, 12.
°C teplý roztok Na-benzyloxykarbonyl-tryptofánu (10, 67,60 g, 0,200 mol), THF (500 mL) a CDI (2,33,05 g, 0,204 mol) sa mieša, dokiaľ neprestane uvoľňovanie plynu. Potom sa do reakčnej zmesi pridá roztok 9 (40,8 g, 0,103 mol) v THF (asi 200 mL). Výsledný roztok sa nechá reagovať 15 hodín súčasne zahrievajúc na laboratórnu teplotu. Pevná látka, ktorá sa tvorí, sa potom získa vákuovou filtráciou. Filtrát sa zakoncentruje in vacuo. Získaný odparok a pevná látka sa spoja a rozpustia v EtOAc (4000 mL), za mierneho ohriatia. Po ochladení roztoku na laboratórnu teplotu sa vytvorí pevná látka. Pevná látka sa zberá vákuovou filtráciou. Pevná látka sa rekryštalizuje z horúceho MeOH, čím sa získa purifikovaný tripeptid 12. EtOAc filtrát (z prvej kryštalizácie) sa premyje v oddeľovacom lieviku nasledovným postupom:
1. aq HCI (1 N, 2 x 500 mL),
2. voda (1 x 500 mL),
3. aq Na2CO3 (1/2 nasýtenia, 2 x 500 mL),
4. aq NaCl (1 x 500 mL).
Organická vrstva sa vysuší nad MgSO4 a potom vyčíri vákuovou filtráciou. Rozpúšťadlo z filtrátu sa odstráni in vacuo. Výsledný zostatok sa vezme v EtOAc, čím sa získa suchá pevná látka. Pevná látka sa môže podrobiť rekryštalizácii v horúcom MeOH, čím sa získa druhý výťažok 12 ako biela tuhá látka.
Tryptofyl-D-fenylalanyl-(Ne-t-butyloxykarbonyl)lyzínamid 13.
Metanolický roztok (1500 mL) tripeptidu 12 (64,59 g, 0,091 mol) sa pridá do kašičky katalyzátora - 5 % Pd/C (5 g) a meOH (250 mL) pod argónovou atmosférou. Pridá sa ďalší objem MeOH (2250 mL). Argónová atmosféra sa nahradí vodíkom a nechá sa bežať reakcia (asi 24 hodín). Po skončení reakcie sa vodíková atmosféra nahradí argónom. Roztok sa vyčíri cez vložku CeliteR a filtrát sa za koncentruje in vacuo, čím sa získa tripeptid 13 ako biela tuhá látka.
B. Príprava tripeptidového fragmentu-K-DAla-DpNal-AlaOMe Na-benzyloxykarbonyl-D-Alanyl-D-P-naftyl alanín metylesteru, 25.
Roztok EtOAc (400 mL) a D-p-naílvIalanín metylester hydrochloridu (22, 0,62 mol) sa premýva nasýteným roztokom uhličitanu sodného (400 mL) a 0,8 N vodným roztokom hydroxidu sodného (asi 500 mL). Získaná vodná fáza sa odstráni (pH 8,5) a organická fáza sa postupne premýva so spolovice nasýteným vodným roztokom Na2CO3 (150 mL) a potom vodou (50 mL). Voľná zásaditá forma 22 sa vyizoluje po nakoncentrovaní etylacetátovej vrstvy in vacuo. Do -5 “C teplého (kúpeľ ľadetanol) roztoku Να-benzyloxykarbonyl-D-alanínu (j_9, 143,5 g, 0,50 mol), N-hydroxysukcínimidu (HONSu, 23, 0,62 mol) a čerstvo pripravenej zásaditej formy 22 (asi 0,52 mol) v DMF (asi 3 L) sa pridá dicyklohexylkarbodiimid (DCC, asi 95 g, 0,46 mol). Výsledný reakčný roztok sa nechá miešať 24 hodín súčasne sa zahrievajúc na laboratórnu teplotu. Na posúdenie, či je reakcia ukončená, sa použije HPLC analýza. Ak reakcia nie je ukončená, reakčný roztok sa nechá ochladiť na asi -5 °C a do reakcie sa pridá ďalšia časť dicyklohexylkarbodiimidu (asi 0,17 mol). Reakčná zmes sa potom nechá miešať ďalších 24 hodín súčasne sa zahrievajúc na laboratórnu teplotu. Dicyklohexylmočovina (DCU) sa zo zmesi odstráni filtráciou. Do filtrátu sa pridá voda (1 L) a výsledný roztok sa zakoncentruje in vacuo. Výsledný zvyšok sa zoberie vodným roztokom 1 N HCI (asi 1 L, dokiaľ pH vodnej fázy dosiahne hodnotu 1). Vodná fáza sa potom extrahuje dvoma objemami octanu etylnatého (1 L každý). Etyloctanové vrstvy sa vyhodia. pH vodnej fázy sa potom nastaví pridaním studeného 2 N hydroxidu sodného (500 mL) a zrniek hydroxidu sodného. Počas tejto neutralizácie sa roztok udržuje chladným pridaním studeného octanu etylnatého (1 L). Keď pH vodnej fázy dosiahne asi hodnotu 7, výsledkom je hojná precipitácia bielej pevnej látky alebo oleja. Tento precipitát sa zberá vákuovou filtráciou alebo dekantáciou a postupne sa premyje so spolovice nasýteným roztokom uhličitanu sodného (2 x 1500 mL), vodou (6 x 1500 mL) a octanom etylnatým (3 x 1500 mL). Výsledný materiál sa vysuší do konštantnej hmotnosti pod vysokým vákuom. Tento materiál sa môže bez ďalšej purifíkácie priamo hydrolyzovať.
Na-Benzyloxykarbonyl-D-alanyl-P-naftyl-D-alanín, 26.
Vodný roztok hydroxidu sodného (192 mL, 0,08 g/mL, 0,38 mol) sa pridá do roztoku dipeptidu 25 (asi 0,38 mol), vody (360 mL) a MeOH (asi 6 L). Roztok sa mieša pri laboratórnej teplote do ukončenia hydrolýzy (asi 24 hodín). Miznutie pôvodného peptidu sa stanovuje HPLC analýzou. Roztok sa zakoncentruje in vacuo_a zostatok sa rozpustí vo vode (asi 1 L). Vodná vrstva sa potom extrahuje s EtOAc (2 x 500 mL) v oddeľovacom lieviku. Etylacetátové vrstvy sa vyhodia. pH výslednej vodnej fázy sa nastaví pomocou koncentrovanej HCI na hodnotu asi 5, zvyčajným výsledkom je bodová precipitácia bielej pevnej látky alebo oleja. Produkt sa zberá a vysuší in vacuo.
Na-Benzyloxykarbonyl-D-alanyl-D-P-naftylalanyl-alanín metylester, 20.
Dipeptid Na-benzyloxykarbonyl-D-alanyl-D-P-naftyl alanín (26, 0,253 mol) sa pridá do roztoku HONSu (23, 0,505 mol) v DMF (800 mL) pod argónovou atmosférou. Do tohto roztoku sa pridá zmes alaninmetylester hydro chloridu (15, 0,303 mol), N-metylmorfolínu (16. 0,303 mol) a DMF (200 mL). Výsledný roztok sa ochladí na 10 °C, súčasne sa pridá dicyklohexylkarbodiimid (24, 0,265 mol) v metylénchloride (273 mL). Udržiavajúc reakčnú teplotu na 10 °C sa reakcia, dokiaľ nie je ukončená, sleduje pomocou HPLC. Ak po niekoľkých dňoch (asi 4) nie je reakcia ukončená, pridá sa ďalšia várka 24 (0,080 mol) a reakčná zmes sa nechá miešať ďalší deň pri 10 °C. Reakcia sa do skončenia (typicky asi 5 dní) sleduje zase pomocou HPLC analýzy. Pevná látka, ktorá sa vytvára počas reakcie, sa zberá vákuovou filtráciou. Filtrát sa potom zakoncentruje in vacuo. Výsledný zostatok sa zoberie v octane etylnatom a extrahuje so spolovice nasýteným vodným roztokom Na2CO3 (2 x 500 mL). Etylacetátová fáza sa vysuší nad MgSO4. Výsledný roztok sa vyčíri a zakoncentruje in vacuo.
N vodný roztok hydroxidu sodného (7,5 mL, 15 mmol) sa pridá do roztoku metanolu (500 mL) a vody (200 mL), ktorý obsahuje Na-benzyloxykarbonyl-DAlaDPNal-Ala-OMe (13,7 mmol). Reakcia sa nechá miešať cez noc pri laboratórnej teplote, potom sa pomocou HPLC analýzy zistí množstvo zostávajúceho východiskového materiálu. Keď je reakcia v podstate ukončená jaší cez noc), výsledný roztok sa nakoncentruje na objem asi 200 mL in vacuo. Pridá sa voda (100 mL) a pH sa pridaním 2 N hydroxidu sodného (1 mL) nastaví na hodnotu asi 12. Výsledný roztok sa extrahuje s octanom etylnatým (2 x 500 mL). Etyloctanové vrstvy sa vyhodia. pH vodnej fázy sa potom pridaním vodného roztoku HCI nastaví na hodnotu asi 5, čo zvyčajne vyústi vo vyzrážaní produktu. Na podporu tejto precipitácie je dôležité minimalizovať objem vodnej fázy. Vodná fáza sa od produktu oddekantuje a produkt sa opláchne vodou (2 x 50 mL). Izolovaný produkt sa vysuší do konštantnej hmotnosti in vacuo.
C. Tvorba hexapeptidu kondenzačnou reakciou peptidových fragmentov
Dva peptidy DAla-DPNal-Ala-OH (33, 2,6 mmol) a Trp-DPhe-Lys(Boc)-NH2 (13, 2,8 mmol) sa rozpustia v bezvodom DMF a výsledný roztok sa zakoncentruje in vacuo. Toto predbežné zakoncentrovanie sa robí preto, aby sa odstránili zvyšky metanolu, ktoré by tu mohli byť. Výsledná zmes peptidov sa znovu rozpustí v DMF a potom sa pridá N-hydroxysukcinimid (5,1 mmol). Výsledný roztok sa potom ochladí na teplotu roztoku -2 °C a pridá sa dicyklohexylkarbodiimid (3,4 mmol) ako roztok v metylénchloride (3,5 mL). Výsledná reakčná zmes sa nechá miešať pri teplote roztoku -2 °C počas troch dní. Na určenie, či sa reakcia skončila, sa použije HPLC analýza. Ak nie je reakcia po tomto čase ukončená, môže sa pridať ďalší dicyklohexylkarbodiimid a reakcia sa nechá miešať ďalší deň pri -2 °C. Ak nasledujúci deň (celkovo štyri dni) HPLC analýza zase ukáže neukončenú reakciu, chladenie reakčnej zmesi by sa malo zastaviť. Reakčná teplota roztoku sa počas niekoľkých hodín (asi 8) nechá pomaly vystúpiť na laboratórnu teplotu (25 °C). Výsledná reakčná zmes sa nechá miešať cez noc pri laboratórnej teplote. Postup sa opakuje dovtedy, kým sa reakcia neskonči. Potom sa pridá voda (50 mL) a výsledná zmes sa nechá miešať ďalší deň. Dicyklohexylmočovina sa potom z reakčného roztoku odstráni filtráciou a výsledný filtrát sa zakoncentruje in vacuo na viskózny olej. Do výsledného zostatku sa pridá octan etylnatý a spolovice nasýtený vodný roztok uhličitanu sodného (200 mL). Dvojfázová zmes sa intenzívne zvíri na rotačnej odparke po dobu asi jednej hodiny. Vytvorené tuhé látky sa zberajú filtráciou cez lievik so sklenou fritou, čím sa získa produkt. Orga nická fáza sa premyje s vodou a potom vysuší na konštantnú hmotnosť in vacuo, čím sa získa produkt.
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, 35.
Do roztoku laboratórnej teploty kyseliny trifluóroctovej (30 mL), dimetylsulíidu (14 mL), 1,2-etánditiolu (7 mL) a anizolu (2,2 mL) v metylénchloride (15 mL) sa pridá hexapeptid bcnzyloxykarbonyl-DAIa-D[lNal-AlaTrp-DPhe-Lys-(Boc)-NH2 (34, 1,02 mmol). Homogénna reakčná zmes sa nechá miešať 15 minút. Po tomto čase sa pridá bezvodý éter (450 mL), čo zapríčiní vyzrážanie produktu - hrubého biologicky aktívneho peptidu 35. Tento produkt sa získa filtráciou cez lievik so sklenenou fritou alebo dekantáciou. Výsledný produkt sa rozpustí vo vode a zlyofilizuje. Lyofilizovaný produkt môže byť ďalej prečistený strednotlakovou chromatografiou na sklenej kolóne (26 x 460 mm), obsahujúcej náplň Lichroprep™ RP-18 (C-18, 25 - 40 nm, nepravidelné zosietenie). Po nanesení peptidu ako roztoku vo vode, sa kolóna eluuje pri prietokovej rýchlosti 9 mL za minútu jemným gradientom 1 až 25 % metanolu počas asi 5-20 hodín, a potom gradientom 25 až 55 % metanolu počas asi 48 hodín. Koncentrácia metanolu v gradiente sa potom zvyšuje rýchlosťou asi 2 % za hodinu. Počas elúcie je zvyšok zloženia roztoku tvorený vodou obsahujúcou 0,2 % kyselinu trifluóroctovú. Produkt (35) sa stanovuje pomocou HPLC a izoluje sa nakoncentrovaním príslušných elučných objemov.
Vynález bol podrobne opísaný so zvláštnym dôrazom na jeho uprednostnené zrealizovanie. Bude ale vítané, že ten, kto je zručný v oblasti, môže po posúdení tohto uvedenia urobiť variácie a modifikácie v rámci idey a podľa vynálezu.

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Peptid vzorca
    A1-A2-Ala-C2-C3-A5, kde A, je Gly, Dala, β -Ala, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kyselina N- alkylaminokarboxylová s dvomi až desiatimi atómami uhlíka v alkyle, kyselina N,N-bis-alkylaminokarboxylová s dvomi až desiatimi atómami uhlíka v alkyle, kyselina azolkarboxylová alebo kyselina alkylaminokarboxylová s dvomi až desiatimi atómami uhlíka v alkyle,
    A2 je DTrp, DPNal, D-4-Y-Phe alebo 5-Y-D-Trp, kde Y je OH, CI, Br, F alebo H;
    A5 je A3-A4-A5., A3-A5', A4-A5· alebo Ay, kde
    a) A3 je Ala, Gly, DAla, Pro alebo desAla;
    b) A4 je Ala, Gly, DAla, Pro, kyselina alkyl-aminokarboxylová s jedným až desiatimi atómami uhlíka v alkyle alebo desAla.
    c) A5 je Lys(e-R1,R2)-Z, Om(ó-R1,R2)-Z, NHÍCIDxNÍRi.Ki), a Lys-Z, Om-Z alebo Arg-Z; kde R! je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H; R2 je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H; ale ak r, je H, R2 nie je H; a ak R2 je H, R| nie je H; R3 je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H; IG je lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka alebo atóm H; Z je NH (lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka), N (lineárna alkylová skupina s jedným až desiatimi atómami uhlíka)2, O-(lineárna alkylová sku pina s jedným až desiatimi atómami uhlíka), NH2 alebo OH, kde lineárna alkylová skupina je taká istá, ako bola definovaná alkylová skupina; x je 2 až 15;
    C2 je Trp, Phe alebo ChxAla, C3 je DPhe, DPal alebo DChxAla a organické alebo anorganické adičné soli uvedených zlúčenín.
  2. 2. Peptid podľa nároku 1, kde Aj je Gly, DAla.
  3. 3. Peptid podľa nároku 1, kde A| je DAla.
  4. 4. Peptid podľa nároku 1, kde A2 je DTrp alebo DPNal.
  5. 5. Peptid podľa nároku 1, kde A2 je D3Xal.
  6. 6. Peptid podľa nároku 1, kde A5 je A3-A4-A5..
  7. 7. Peptid podľa nároku 1, kde A5je A3-A5·.
  8. 8. Peptid podľa nároku 1, kde A5je A4-A5.
  9. 9. Peptid podľa nárokov 1, 2, 3, 4 alebo 5, kde A5 je A5·.
  10. 10. Peptidy podľa nárokov 1, 2, 3, 4 alebo 5, kde C2 je Trp alebo Phe.
  11. 11. Peptidy podľa nárokov 1, 2, 3, 4, 5, 9 alebo 10, kde C3 je DPhe.
  12. 12. Peptidy podľa nároku 10, kde C2 je Trp.
  13. 13. Peptidy podľa nároku 12, kde C3 je DPhe.
  14. 14. Peptid podľa nároku 1, ktorý má vzorec DAla-D'3Nal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2 DAIa-D'1Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys('£-iPr)NH2, DAIa-DTrp-Ala-Trp-DPhc-Lys(s-iPr)NH:, DAIa-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, NH2(CH2)5CO^Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, NaIMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, ajABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, βΑυ -D^Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH,, NalMA-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHxNH2, a, TABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHxNH2, DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2 DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-ArgNH2 DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Arg-NH2, DAla-DpNal-Ala-ChxAla-DPhe-LysNH2, DAla-DpNal-Ala-Phe-DChxAla-LysNH2 alebo DAla-DpNal-Ala-ChxA! a-DChxAla-LysNH2 a ich organické alebo anorganické adičné soli.
  15. 15. Farmaceutická kompozícia na podporu uvoľnenia a zvýšenia hladín rastového hormónu v krvi obsahujúca peptid podľa nároku 1 v synergickom množstve s druhou zlúčeninou, kde druhou zlúčeninou je zlúčenina, ktorá pôsobí ako agonista na receptore hormónu uvoľňujúceho rastový hormón alebo inhibuje uvoľnenie somatostatínu.
  16. 16. Farmaceutická kompozícia na podporu uvoľnenia a zvýšenia hladín rastového hormónu v krvi obsahujúca peptid podľa nároku 1 a aspoň jeden prirodzene sa vyskytujúci hormón uvoľňujúci rastový hormón a jeho funkčný ekvivalent alebo zlúčeninu, ktorá podporuje uvoľnenie rastového hormónu.
  17. 17. Farmaceutická kompozícia na podporu uvoľnenia a zvýšenia hladín rastového hormónu v krvi obsahujúca peptid podľa nároku 1 v synergickom množstve s aspoň jedným polypeptidom skupiny 1 alebo polypeptidom skupiny 2, kde polypeptid skupiny 1 je vybraný z prirodzene sa vyskytujúcich hormónov uvoľňujúcich rastový hormón alebo ich funkčných ekvivalentov a polypeptid skupiny 2 je vybraný zo skupiny polypeptidov, ktorá obsahuje:
    Tyr-DArg-Phe-NH2; Tyr-DAla-Phe-NH2;
    Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2; Tyr-DMet(O)-Phe-NH2;
    Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2; Phe-DArg-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2;
    Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2; Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-DMet (O)-Phe-Gly-NH2; (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-ol; Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-ol;
    Tyr-DAla-Phe-Sar-ol; Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2; Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(0)-ol; Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol; Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2; Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2; Gly-Tyr-DAIa-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-DAla-Phe-Gly-ol; Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
    Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
    Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2; T yr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2; Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
    Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (voľný ditiol);
    Tyi-DCvs-Gly-Phe-DCys-NHi (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (voľný ditiol); Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2;
    Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2;
    Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2;
    a ich organické alebo anorganické adičné soli.
  18. 18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že zlúčenina, ktorá podporuje uvoľnenie rastového hormónu, je vybraná zo skupiny obsahujúcej β-adrenergické blokujúce činidlá, a2-adrcnergické blokujúce činidlá, inhibítory acetylcholínesterázy a peptidy obsahujúce;
    Tyr-D Arg-Phe-NH2;
    Tyr-DAla-Phe-NH2; Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2;
    Tyr-DMet(O)-Phe-NH2; Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2; Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2;
    Phe-DArg-Phc-Gly-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
    Tyr-DAIa-Gly-Phe-NH2; Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2;
    Tyr-D Arg(NO2)-Phe-Gly-NH2; Tyr-DMct (O)-Phe-Gly-NH2; (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-ol; Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2;
    Tyr-D Arg-Phe-Sar-ol;
    Tyr-D Ala-Phe-Sar-ol;
    Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2;
    Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol; Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(0)-ol; Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2; Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2; Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2;
    Tyr-D Ala-Phe-Gly-ol; Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol;
    T yr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2; Tyr-DAIa-Gly-(NMe)Phe-NH2; Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2; Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NHj (voľný ditiol); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (cyklický disulfid); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (voľný ditiol); Tyr-DAIa-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-D Ala-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2; Tyr-D Arg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; Tyr-D Arg-Phc-Gly-Tyr-Pro-Scr-NH2;
    a ich organické alebo anorganické adičné soli.
  19. 19. Peptid podľa nároku 9, ktorý má vzorec DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys(E-iPr)NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, alebo NH2(CH2)5CO-DpNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2 a jeho organické alebo anorganické adičné soli.
  20. 20. Spôsob prípravy zlúčenín všeobecného vzorca podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje spájanie opísaných aminokyselín alebo derivátov aminokyselín na vytvorenie zlúčeniny, pričom spájanie sa uskutočňuje syntézou peptidov v pevnej fáze, zahrnujúcou pripojenie karboxylovej koncovej skupiny aminokyseliny na živicu, odstránenie jej α-amino chrániacej skupiny a spájanie zvyšných chránených aminokyselín postupne v žiadanom poradí, alebo kondenzačnou reakciou v roztoku, zahrnujúcou rozpúšťanie peptidových fragmentov v organickom rozpúšťadle a potom zahusťovanie výsledného roztoku, čistenie fragmentu a opakovanie, ak je to potrebné.
  21. 21. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kondenzačné reakcie peptidových fragmentov na vytvorenie zlúčeniny.
  22. 22. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 20, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje syntézu vymenovaných aminokyselín alebo derivátov aminokyselín v pevnej fáze.
SK204-94A 1991-08-22 1992-08-20 Peptidy s aktivitou uvoľňujúcou rastový hormón, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy SK282895B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/748,350 US5663146A (en) 1991-08-22 1991-08-22 Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
PCT/US1992/007026 WO1993004081A1 (en) 1991-08-22 1992-08-20 Peptides having growth hormone releasing activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK20494A3 SK20494A3 (en) 1994-10-05
SK282895B6 true SK282895B6 (sk) 2003-01-09

Family

ID=25009088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK204-94A SK282895B6 (sk) 1991-08-22 1992-08-20 Peptidy s aktivitou uvoľňujúcou rastový hormón, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5663146A (sk)
EP (1) EP0605484B1 (sk)
JP (1) JP3179489B2 (sk)
KR (1) KR100247212B1 (sk)
CN (1) CN1035256C (sk)
AT (1) ATE172742T1 (sk)
AU (1) AU666673B2 (sk)
BG (1) BG62655B1 (sk)
BR (2) BR9206398A (sk)
CA (1) CA2116120C (sk)
CZ (1) CZ293281B6 (sk)
DE (1) DE69227462T2 (sk)
DK (1) DK0605484T3 (sk)
ES (1) ES2124263T3 (sk)
FI (2) FI120095B (sk)
HU (1) HU223664B1 (sk)
IL (1) IL102848A (sk)
MX (1) MX9204861A (sk)
NO (1) NO314695B1 (sk)
NZ (1) NZ244034A (sk)
PL (1) PL169562B1 (sk)
RO (1) RO112507B1 (sk)
RU (1) RU2126014C1 (sk)
SK (1) SK282895B6 (sk)
WO (1) WO1993004081A1 (sk)
ZA (1) ZA926337B (sk)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843941A (en) 1993-05-14 1998-12-01 Genentech, Inc. Ras farnesyl transferase inhibitors
SK281963B6 (sk) * 1993-12-23 2001-09-11 Novo Nordisk A/S Zlúčeniny ovplyvňujúce uvoľňovanie rastového hormónu, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie
PL181286B1 (pl) * 1993-12-23 2001-07-31 Novo Nordisk As Zwiazki o wlasciwosciach uwalniania hormonu wzrostu i zawierajace je kompozycje farmaceutyczne PL PL PL PL PL PL PL PL
US5798337A (en) * 1994-11-16 1998-08-25 Genentech, Inc. Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
US20020111461A1 (en) * 1999-05-21 2002-08-15 Todd C. Somers Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
WO1997000894A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
CA2252761A1 (en) * 1996-04-24 1997-10-30 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
JP4116097B2 (ja) 1997-06-20 2008-07-09 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 成長ホルモン放出特性をもつ化合物
US6127341A (en) * 1997-06-20 2000-10-03 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
ZA987383B (en) * 1997-08-19 2000-02-17 Lilly Co Eli Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues.
US6329342B1 (en) 1997-08-19 2001-12-11 Eli Lilly And Company Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues
WO1999036431A1 (en) 1998-01-16 1999-07-22 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
WO1999039730A1 (fr) * 1998-02-09 1999-08-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation a administration orale contenant des peptides favorisant la secretion d'hormone de croissance
US6919315B1 (en) 1998-06-30 2005-07-19 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US6682908B1 (en) 1998-07-10 2004-01-27 Merck & Co., Inc. Mouse growth hormone secretagogue receptor
CA2333857A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Merck & Co., Inc. Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids
EP1112282A4 (en) 1998-08-10 2002-10-31 Merck & Co Inc RECEPTOR OF THE GROWTH HORMONE SECRETION PROMOTER FROM THE DOG
WO2000009537A2 (en) * 1998-08-14 2000-02-24 Administrators Of The Tulane Educational Fund Compounds having growth hormone releasing activity
US6639076B1 (en) 1998-08-18 2003-10-28 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US6696063B1 (en) * 1998-12-30 2004-02-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Treatment of HIV-associated dysmorphia/dysmetabolic syndrome (HADDS) with or without lipodystrophy
US7022677B1 (en) 1999-02-18 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Amide derivatives as growth hormone secretagogues
CA2362290A1 (en) * 1999-02-18 2000-08-24 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Novel amide derivatives as growth hormone secretagogues
US6828331B1 (en) * 1999-02-19 2004-12-07 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
MXPA02000938A (es) * 1999-07-26 2004-03-19 Baylor College Medicine Analogo super-activo de la hormona que libera la hormona de crecimiento porcina.
US20040192593A1 (en) * 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
US7022311B1 (en) * 1999-10-12 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Powdery inhalational preparations and process for producing the same
UA73530C2 (uk) 1999-11-10 2005-08-15 Ново Нордіск А/С Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту
JP3498041B2 (ja) * 2000-05-29 2004-02-16 科研製薬株式会社 プラルモレリン含有点鼻用製剤
ES2333097T3 (es) 2000-05-31 2010-02-17 Raqualia Pharma Inc Uso de secretagogos de la hormona de crecimiento para estimular la motilidad gastrointestinal.
US7919647B2 (en) 2000-08-24 2011-04-05 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7645898B2 (en) 2000-08-24 2010-01-12 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and method of use thereof
US7622503B2 (en) 2000-08-24 2009-11-24 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7855229B2 (en) 2000-08-24 2010-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators
EP1355941A2 (en) 2001-02-02 2003-10-29 ConjuChem, Inc. Long lasting growth hormone releasing factor derivatives
US7125840B2 (en) * 2001-10-09 2006-10-24 Eli Lilly And Company Substituted dipeptides as growth hormone secretagogues
CN100417419C (zh) 2001-10-26 2008-09-10 贝勒医学院 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
US8853266B2 (en) 2001-12-06 2014-10-07 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators for treating diabetes
US6831102B2 (en) 2001-12-07 2004-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Phenyl naphthol ligands for thyroid hormone receptor
BR0214869A (pt) 2001-12-11 2005-03-08 Advisys Inc Suplementação mediada por plasmìdeo para tratamento de indivìduos cronicamente doentes
US7015219B2 (en) 2001-12-19 2006-03-21 Bristol-Myers Squibb Company 3-aryl-hydroxybenzoxazines and 3, 4-dihydro-3-aryl-hydroxybenzoxazines as selective estrogen receptor beta modulators
ATE510919T1 (de) * 2002-02-07 2011-06-15 Baylor College Medicine Veränderte hirnanhangsdrüsenentwicklung in nachkommen von mit einer therapie mit wachstumshormon freisetzendem hormon behandelten trächtigen muttertieren
US7772433B2 (en) 2002-02-28 2010-08-10 University Of Tennessee Research Foundation SARMS and method of use thereof
US7381730B2 (en) 2002-03-15 2008-06-03 Bristol-Myers Squibb Company 3-arylquinazoline derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
AU2003218337A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US20060167268A1 (en) * 2002-04-09 2006-07-27 Eli Lilly And Company, Patent Division, Growth hormone secretagogues
WO2003094845A2 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Bristol-Myers Squibb Company Pyridine-based thyroid receptor ligands
US7405234B2 (en) 2002-05-17 2008-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
EP1536817A1 (en) 2002-08-23 2005-06-08 Gestion Univalor Société en Commandite Growth hormone-releasing peptides in the treatment of prevention of atherosclerosis and hypercholesterolemia
WO2004045518A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Open chain prolyl urea-related modulators of androgen receptor function
US8309603B2 (en) 2004-06-07 2012-11-13 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
TW200504021A (en) 2003-01-24 2005-02-01 Bristol Myers Squibb Co Substituted anilide ligands for the thyroid receptor
WO2004067719A2 (en) * 2003-01-28 2004-08-12 Advisys, Inc. Growth hormone releasing hormone (ghrh) for use in reducing culling in herd animals
WO2004069793A2 (en) 2003-01-28 2004-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Novel 2-substituted cyclic amines as calcium sensing receptor modulators
US7205322B2 (en) 2003-02-12 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Thiazolidine compounds as calcium sensing receptor modulators
US7557143B2 (en) 2003-04-18 2009-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Thyroid receptor ligands
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
US7459460B2 (en) 2003-05-28 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Trisubstituted heteroaromatic compounds as calcium sensing receptor modulators
US7265145B2 (en) 2003-05-28 2007-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Substituted piperidines and pyrrolidines as calcium sensing receptor modulators and method
US7476653B2 (en) 2003-06-18 2009-01-13 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic modulators of the ghrelin receptor
US7361642B2 (en) * 2003-08-04 2008-04-22 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Canine specific growth hormone releasing hormone
AU2003272814A1 (en) 2003-10-02 2005-05-19 Ibrahim Al-Habdan Peptide for promoting healing of fractures
DE602004027165D1 (de) * 2003-12-31 2010-06-24 VGX Pharmaceuticals LLC Reduzierung von arthritis und lahmheit bei personen unter supllement von wachstumshormon freisetzendem hormon (ghrh)
US7517863B2 (en) * 2004-01-20 2009-04-14 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Enhanced secretion/retention of growth hormone releasing hormone (GHRH) from muscle cells by species-specific signal peptide
US20050164952A1 (en) * 2004-01-23 2005-07-28 Vital Pharmaceuticals, Inc. Delivery system for growth hormone releasing peptides
US7820702B2 (en) 2004-02-04 2010-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Sulfonylpyrrolidine modulators of androgen receptor function and method
US7378426B2 (en) 2004-03-01 2008-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Fused heterotricyclic compounds as inhibitors of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3
US7696241B2 (en) 2004-03-04 2010-04-13 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic compounds as modulators of androgen receptor function and method
US7625923B2 (en) 2004-03-04 2009-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
US9889110B2 (en) 2004-06-07 2018-02-13 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions
US9884038B2 (en) 2004-06-07 2018-02-06 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof
MX2007000893A (es) * 2004-07-23 2007-04-18 Advisys Inc La hormona liberadora de hormona de crecimiento mejora la respuesta inmune inducida por la vacunacion.
WO2006023608A2 (en) 2004-08-18 2006-03-02 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Growth-hormone secretagogues
US7456188B1 (en) 2005-04-28 2008-11-25 Bristol-Myers Squibb Company C-5 substituted quinazolinone derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
ES2453981T3 (es) 2005-08-31 2014-04-09 University Of Tennessee Research Foundation Tratamiento de síntomas de enfermedad renal con moduladores selectivos de receptor de andrógenos (SARM)
CU23558A1 (es) 2006-02-28 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos análogos a los secretagogos peptidicos de la hormona de crecimiento
WO2008006019A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Advisys Inc. Growth hormone releasing hormone treatment to decrease cholesterol levels
EP2038252B1 (en) 2006-07-12 2016-11-02 University of Tennessee Research Foundation Substituted acylanilides and methods of use thereof
EP2995619B1 (en) 2006-08-02 2019-09-25 Cytokinetics, Inc. Certain chemical entities comprising imidazopyrimidines, compositions and methods
US8299248B2 (en) 2006-08-02 2012-10-30 Cytokinetics, Incorporated Certain 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2(3H)-ones and 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2-ols and methods for their use
US10010521B2 (en) 2006-08-24 2018-07-03 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
CN103251579B (zh) 2006-08-24 2016-12-28 田纳西大学研究基金会 取代的n-酰基苯胺及其使用方法
US9730908B2 (en) 2006-08-24 2017-08-15 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US9844528B2 (en) 2006-08-24 2017-12-19 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
AU2008241532A1 (en) 2007-02-09 2008-10-30 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic ghrelin receptor modulators and methods of using the same
US20100099640A1 (en) 2007-05-04 2010-04-22 Joannes Geuns Tissue degeneration protection
US7968603B2 (en) 2007-09-11 2011-06-28 University Of Tennessee Research Foundation Solid forms of selective androgen receptor modulators
US8003689B2 (en) 2008-06-20 2011-08-23 Gtx, Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
AR081331A1 (es) 2010-04-23 2012-08-08 Cytokinetics Inc Amino- pirimidinas composiciones de las mismas y metodos para el uso de los mismos
US9133123B2 (en) 2010-04-23 2015-09-15 Cytokinetics, Inc. Certain amino-pyridines and amino-triazines, compositions thereof, and methods for their use
AR081626A1 (es) 2010-04-23 2012-10-10 Cytokinetics Inc Compuestos amino-piridazinicos, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos para tratar trastornos musculares cardiacos y esqueleticos
WO2013190520A2 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The General Hospital Corporation Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions
US10314807B2 (en) 2012-07-13 2019-06-11 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
PT2872482T (pt) 2012-07-13 2020-09-22 Oncternal Therapeutics Inc Método de tratamento de cancro de mama com modulador seletivo do recetor de andrógeno (sarm)
US10987334B2 (en) 2012-07-13 2021-04-27 University Of Tennessee Research Foundation Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs)
US10258596B2 (en) 2012-07-13 2019-04-16 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
US9744149B2 (en) 2012-07-13 2017-08-29 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US9969683B2 (en) 2012-07-13 2018-05-15 Gtx, Inc. Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS)
US9622992B2 (en) 2012-07-13 2017-04-18 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
IN2015DN04172A (sk) 2012-10-24 2015-10-16 Daiichi Sankyo Companyltd
US10092627B2 (en) 2013-04-08 2018-10-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
US9119832B2 (en) 2014-02-05 2015-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of treating mild brain injury
SG11201609050UA (en) 2014-05-30 2016-12-29 Pfizer Carbonitrile derivatives as selective androgen receptor modulators
US20170121385A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurodegenerative conditions
CA3142514A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 Cytokinetics, Inc. Polymorphs of 1-(2-((((trans)-3-fluoro-1-(3-fluoropyridin-2-yl)cyclobutyl)methyl)amino)pyrimidin-5-yl)-1h-pyrrole-3-carboxamide
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228157A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
CA1175810A (en) * 1979-03-30 1984-10-09 Frank A. Momany Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223021A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223019A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228156A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228155A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4224316A (en) * 1979-03-30 1980-09-23 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228158A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223020A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4226857A (en) * 1979-03-30 1980-10-07 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410513A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410512A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Combinations having synergistic pituitary growth hormone releasing activity
WO1983002272A1 (en) * 1981-12-28 1983-07-07 Beckman Instruments Inc Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4880778A (en) * 1986-05-12 1989-11-14 Eastman Kodak Company Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof
US4839344A (en) * 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US4880777A (en) * 1987-09-01 1989-11-14 Eastman Kodak Company Synthetic peptides having growth hormone releasing activity
DE68919213T2 (de) * 1988-01-28 1995-05-11 Polygen Holding Corp Polypeptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.
EP0400051B1 (en) * 1988-01-28 1995-05-10 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
AU633003B2 (en) * 1988-05-11 1993-01-21 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
IL98910A0 (en) * 1990-07-24 1992-07-15 Polygen Holding Corp Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity and pharmaceutical compositions containing them
JPH05508859A (ja) 1990-07-24 1993-12-09 イーストマン コダック カンパニー ペプチド合成方法
US5486505A (en) * 1990-07-24 1996-01-23 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity

Also Published As

Publication number Publication date
ES2124263T3 (es) 1999-02-01
CN1035256C (zh) 1997-06-25
RU2126014C1 (ru) 1999-02-10
SK20494A3 (en) 1994-10-05
FI120095B (fi) 2009-06-30
RO112507B1 (ro) 1997-10-30
CA2116120A1 (en) 1993-02-23
ATE172742T1 (de) 1998-11-15
MX9204861A (es) 1994-06-30
ZA926337B (en) 1993-04-22
IL102848A (en) 1998-04-05
CN1073684A (zh) 1993-06-30
FI940807A0 (fi) 1994-02-21
HU223664B1 (hu) 2004-11-29
DE69227462D1 (de) 1998-12-03
BG62655B1 (bg) 2000-04-28
CA2116120C (en) 2002-12-03
CZ293281B6 (cs) 2004-03-17
US5663146A (en) 1997-09-02
FI940807A (fi) 1994-02-21
KR100247212B1 (ko) 2000-03-15
FI120691B (fi) 2010-01-29
HUT69178A (en) 1995-08-28
BG98489A (bg) 1995-02-28
NO940592L (no) 1994-04-14
NZ244034A (en) 1995-08-28
NO940592D0 (no) 1994-02-21
HU9400495D0 (en) 1994-05-30
NO314695B1 (no) 2003-05-05
DE69227462T2 (de) 1999-04-08
EP0605484B1 (en) 1998-10-28
JP3179489B2 (ja) 2001-06-25
PL169562B1 (pl) 1996-08-30
IL102848A0 (en) 1993-01-31
CZ40094A3 (en) 1994-11-16
FI20050467A (fi) 2005-05-02
WO1993004081A1 (en) 1993-03-04
AU666673B2 (en) 1996-02-22
BR9206398A (pt) 1994-12-27
AU2541692A (en) 1993-03-16
DK0605484T3 (da) 1999-07-05
BR1100309A (pt) 2000-08-01
US5776901A (en) 1998-07-07
EP0605484A1 (en) 1994-07-13
JPH07507039A (ja) 1995-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK282895B6 (sk) Peptidy s aktivitou uvoľňujúcou rastový hormón, farmaceutická kompozícia s ich obsahom a spôsob ich prípravy
EP0400051B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0398961B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US5486505A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0417165B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0540676B1 (en) Peptide compounds having growth hormone releasing activity
US7250399B2 (en) Compounds having growth hormone releasing activity

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20110820