JP3179489B2

JP3179489B2 - 成長ホルモン放出活性を有するペプチド

Info

Publication number: JP3179489B2
Application number: JP50458593A
Authority: JP
Inventors: バウァーズ，シリル，ワイ．; コイ，デビッド
Original assignee: ツレーンメディカルスクール
Priority date: 1991-08-22
Filing date: 1992-08-20
Publication date: 2001-06-25
Anticipated expiration: 2016-06-25
Also published as: ES2124263T3; CN1035256C; RU2126014C1; SK20494A3; FI120095B; RO112507B1; CA2116120A1; ATE172742T1; MX9204861A; ZA926337B; IL102848A; CN1073684A; FI940807A0; HU223664B1; DE69227462D1; BG62655B1; CA2116120C; CZ293281B6; US5663146A; FI940807A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、動物特に人間に投与されたとき成長ホルモ
ンの放出を促進する新規なポリペプチド化合物に関す
る。他の態様において、本発明は動物に特定の成長ホル
モンを放出するポリペプチドを投与することにより動物
における成長ホルモンレベルの放出と上昇を促進する方
法に関する。

発明の背景成長ホルモン（GH）放出性化合物投与の際動物、例え
ば人間を含む哺乳動物、における成長ホルモン（GH）レ
ベルの上昇は、もし投与の結果十分にGHレベルの上昇が
起るならば、体重の増加および乳生産の増加へ導くこと
ができる。さらに、哺乳動物および人間における成長ホ
ルモンレベルの上昇は既知の成長ホルモン放出剤、例え
ば天然に発生する成長ホルモン放出性ホルモン、の適用
により達成され得ることが知られる。

哺乳動物における成長ホルモンレベルの上昇はまた成
長ホルモン放出性ペプチドの適用によっても達成される
ことができる。そのような若干のペプチドは以前に、例
えば米国特許第4,223,019号、同第4,223,020号、同第4,
223,021号、同第4,224,316号、同第4,226,857号、同第
4,228,155号、同第4,228,156号、同第4,228,157号、同
第4,228,158号、同第4,410,512号、同第4,410,513号各
明細書に記載されている。

内因性の成長ホルモン放出阻害物質に対する抗体、ソマ
トスタチンこの後者の例において、成長ホルモンレベルは、内因
性GH放出阻害物質（SRIF）が下垂体（そこでそれがGH放
出を阻害する）に達する以前にSRIFを除去することによ
り上昇する。

成長ホルモンレベルの上昇を促進するこれらの方法は
いずれも、合成するためおよび／または目的の動物に投
与するため十分な純度に単離ため高価につく物質を含
む。比較的安価に製造されかつ成長ホルモンの放出を促
進する能力を有する短鎖の、低分子量の、比較的簡単な
ポリペプチドは望ましいものであろう。なぜならそれら
は容易にかつ安価に製造され、化学的および／または物
理的に容易に変性され、同様に容易に精製されかつ配合
されるし、そしてそれらは優れた運搬性を有するはずで
あるからである。血液中の成長ホルモンレベルは放出お
よび上昇を促進することのできる若干の短鎖ポリペプチ
ドは知られている（例えば、米国特許第4,410,512号に
記載のHis−DTrp−ala−Trp−DPhe−Lys−NH₂）が、い
ろいろな理由、例えば配給、生物吸収、増加した滞留時
間など、のためにポリペプチドを適合するように造り得
ることは重要である。しかしある部位におけるアミノ酸
の変更は、成長ホルモンの放出を促進する短鎖ペプチド
の能力に劇的な効果を有することがあり得る。動物、特
に人間の血液中で成長ホルモンレベルの放出および上昇
を促進することのできるいろいろな短鎖ポリペプチドを
持つことは望ましいことであろう。またそのようなポリ
ペプチドを動物および人間の血液中で成長ホルモンレベ
ルの放出および／または上昇を促進するために使用でき
ることも有益なことであろう。

またそのような短鎖ポリペプチドを使用して動物の血
液中で成長ホルモンレベルの放出および／または上昇を
促進する方法を提供することも望ましいことであろう。

発明の要約本発明のポリペプチドは次の式により定義される。

上式中、 A₁は、Gly、DAla、β−Ala、His、Ser、Met、Pro、Sa
r、Ava、Aib、Ｎ−低級アルキルアミノカルボン酸、Ｎ
−Ｎ−ビス−低級アルキルアミノカルボン酸、アゾール
カルボン酸または低級アルキルアミノカルボン酸であ
り、前記低級アルキル基は２〜約10の直鎖炭素原子から
成る。

A₂はDTrp、ＤβNal、Ｄ−４−Ｙ−Phe−または５−Ｙ
−Ｄ−Trpであり、前式中はＹはOH、Cl、Br、Ｆまたは
Ｈである。さらに好ましくは、A₂はＤβNalである。

A₅はA₃−A₄−Ａ_５′、A₃−Ａ_５′、A₄−Ａ_５′、また
はＡ_５′である。好ましくはA₅はＡ_５′である。A₃はAl
a、Gly、DAla、ProまたはdesAlaである。A₄はAla、Gl
y、DAla、Pro、線状低級アルキルアミノカルボン酸また
はdesAlaであり、Ａ_５′はLys（ε−R₁,R₂）−Z,Orn
（δ−R₁、R₂）−Ｚ、NH（CH₂）_xN（R₃、R₄）である。A
₅はA₁がHisでない場合には、またLys−Ｚ、Orn−Ｚまた
はArg−Ｚであることもできる。R₁は線状低級アルキル
基またはＨ原子である。R₂は線状低級アルキル基または
Ｈ原子である。R₁がＨであるときはR₂はＨでなく、同様
にR₂がＨであるときはR₁はＨではない。R₃は線状低級ア
ルキル基またはＨ原子であり、R₄は線状低級アルキル基
またはＨ原子である。低級アルキル基は２〜約10の直鎖
炭素原子からなる。ＺはNH（線状低級アルキル基）、Ｎ
（線状低級アルキル基）_２、Ｏ−（線状低級アルキル
基）、NH₂またはOHであり、その場合に線状低級アルキ
ル基は前記に定義された通りである。ｘは２〜15であ
る。C₁はAlaである。C₂はTrp、PheまたはChxAlaであ
る。好ましくは、C₂はTrpまたはPheである。さらに好ま
しくはC₂はTrpである。C₃はDPhe、DPalまたはDChxAlaで
ある。好ましくはC₃はDPheである。

および前記ポリペプチドのすべての有機または無機の
付加塩。ポリペプチドは好ましくはA₁−A₂−Ala−C₂−D
Phe−A₅であり、さらに好ましくは、ポリペプチドはA₁
−A₂−Ala−Trp−DPhe−A₅である。

図面の簡単な説明図１は時間に関して人間の血清中成長ホルモンレベル
を示す一連のグラフである。

発明の詳細な説明発明者らは、動物の血液において成長ホルモンレベル
の放出と上昇を促進する数種の新規な短鎖ポリペプチド
を発見した。これらのポリペプチドは次の式により定義
される。

上式中、 A₁はGly、DAla、β−Ala、His、Ser、Met、Pro、Sa
r、Ava、Aib、イミダゾール酢酸、Ｎ−低級アルキルア
ミノカルボン酸、N,N−ビス−低級アルキルアミノカル
ボン酸、アゾールカルボン酸または低級アルキルアミノ
カルボン酸であり、前記低級アルキル基は２〜約10の直
鎖炭素原子から成る。好ましくは、低級アルキル基は２
〜６の直鎖炭素原子である。低級アルキル基は置換され
ているまたは置換されないものであることができる。好
ましい置換基はＯ、ＮまたはSiである。好ましくは、低
級アルキル基は非置換である。好ましいアゾールカルボ
ン酸はＮα−４−イミダゾール酢酸（IMA）である。好
ましくはＡはGly、DAlaまたはHisである。さらに好まし
くはＡはHisまたはDAlaである。A₁はDAlaであると最も
好ましい。

A₂はDTrp、ＤβNal、Ｄ−４−Ｙ−Phe−または５−Ｙ
−Ｄ−Trpであり、前記ＹはOH、Cl、Br、ＦまたはＨで
ある。好ましくは、A₂はＤβNal、Ｄ−４−Ｙ−Pheまた
は５−Ｙ−Ｄ−Trpである。さらに好ましくは、A₂はＤ
βNalである。Ｙは好ましくはOHまたはＨである。

A₅はA₃−A₄−Ａ_５′、A₃−Ａ_５′、A₄−Ａ_５′、また
はＡ_５′である。好ましくはA₅はＡ_５′である。A₃はAl
a、Gly、DAla、ProまたはdesAlaである。A₄はAla、Gl
y、DAla、Pro、線状低級アルキルアミノカルボン酸、ま
たはdesAlaである。Ａ_５′はLys（ε−R₁,R₂）−Z,Orn
（δ−R₁、R₂）−Ｚ、LArg（ｇ−R₅−R₆）、NH（CH₂）_x
N（R₃、R₄）である。Ａ_５′はまたA₁がHisでないときLy
s−Ｚ、Orn−ＺまたはArg−Ｚであることができる。R₁
は線状低級アルキル基またはＨ原子である。R₂は、線状
低級アルキル基またはＨ原子である。R₁がＨであると
き、R₂はＨでなく、同様にR₂がＨであるとき、R₁はＨで
ない。R₃は線状低級アルキル基またはＨ原子である。R₄
は線状低級アルキル基またはＨ原子である。R₅とR₆は線
状低級アルキル基である。低級アルキル基は２〜約10の
直鎖炭素原子から成る。好ましくは、低級アルキル基は
２〜６の直鎖炭素原子である。低級アルキル基は置換さ
れているまたは非置換のものであることができる。好ま
しい置換基はＯ、ＮまたはSiであることができる。好ま
しくは低級アルキル基は非置換のものである。ｇはグア
ニジノである。ＺはNH（線状低級アルキル基）、Ｎ（線
状低級アルキル基）_２、Ｏ−（線状低級アルキル基）、
NH₂またはOHであり、その場合線状低級アルキル基は前
記の定義の通りである。ｘは２〜15である。ｘは好まし
くは２〜６である。Ａ_５′は好ましくはLys−NH₂であ
る。

および前記ポリペプチドのすべての有機または無機の
付加塩。

使用されるアミノ酸残基の略語は標準ペプチド命名法
に従っている。

“D"を前に付したすべての３文字のアミノ酸略号はア
ミノ酸残基のＤ−配置を示した。またグリシンは「天然
発生のＬ−アミノ酸」の用語の中に包含されると考えら
れている。

これらの短鎖ポリペプチドにおいて、ある位置は他の
位置よりも、動物の血液において成長ホルモンレベルの
放出および／または上昇を促進するペプチドの能力に逆
の効果を与えることなしに、変化の許容性がある。例え
ば、A₅位置。他の位置はそのような変化の許容性がより
少ない。例えば、中央のアミノ酸残基Ala、Trp、DPhe
（それぞれC₁、C₂およびC₃と名づけられている）。例え
ば、A₁とA₂はそれぞれＬとＤ形にあるべきことおよびTr
pとDPheもまたLDLD系列を構成するＬとＤ形にあるべき
ことが従来信じられていた。しかし、LDLD配列はDDLD配
列であり得ることを発明者らは発見した。かくして、意
外にも式A₁−A₂−C₁−C₂−C₃−A₅（式中、A₁、A₂、A₅は
前記の通りであり、C₁はAlaであり、C₂はTrp、PHe、お
よびChxAlaであり、そしてC₃はDPhe、DPalまたはDChxAl
aである）のポリペプチドは動物において成長ホルモン
レベルの放出および／または上昇を促進することが発見
された。

好ましくは、C₂はTrpまたはPheであり、そしてさらに
好ましくはC₂はTrpである。

C₃は好ましくはDPheである。好ましくは、C₂がChxAla
であるとき、C₃はDPheである。C₃がDPalであるとき、Ｚ
は好ましくはOHである。

アミノ酸A₁、A₂、A₃、A₄、A₅、C₂およびC₃のために用
いることのできる塩基性、中性または酸性のアミノ酸残
基およびＬとＤ形の選択に関連する増大した融通性は望
みのペプチドの物理化学的諸特性について多大の制御を
提供する。

DAla−ＤβNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH₂とDAla−
ＤβNal−Ala−Phe−DPhe−Lys−NH₂は同様のGH放出活
性を有するが、Trpに体するPheの置換は、TrpがPheより
も酸化に対してより敏感であるので、DAla−ＤβNal−A
la−Phe−DPhe−Lys−NH₂の化学的安定性を増すことが
できよう。また、Trpに対するPheの置換はペプチドによ
り多くの疎水性を与え、そしてこの物理−化学的特性は
後述のように経口、経皮および／または鼻の吸収並びに
ペプチドの配合を高めることにき有益であり得る。さら
にDAla−ＤβNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH₂とDAla−
ＤβNal−Ala−Phe−DPhe−Lys−NH₂のラット細胞ヒス
タミン検定におけるED₅₀（50％有効投与量）は同様、す
なわち30.5±0.5および30.8±0.3μg/mlであり、そして
両者はAla−His−ＤβNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH₂
のヒスタミン活性（それは11.0±1.0μg/ml）であっ
た）を越える改良である。ヒスタミン放出活性の少ない
（ED₅₀の高い）ペプチドは臨床上より有効であり得る。
なぜならばそれらはペプチド注射部位における逆の局所
反応を起す可能性が少なく、および／または全身系抗原
性の逆の臨床効果を生ずることはより少ないからであ
る。

この融通性はまたいかなる与えられた種類に対しても
望みのペプチドを配合しかつ配給するため重要な利益を
与える。これらの変化はまたペプチドの経口吸収並びに
代謝および排泄も改良することができよう。例えば、Al
a−His−ＤβNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH₂（GHRP−
１）は人間における成長ホルモン放出能力においてAla
−His−DTrp−Ala−Trp−Dhe−Lys−NH₂よりも有効であ
る。しかし、DAla−ＤβNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH
₂（GHRP−２）は経口投与の場合GHRP−１よりも有効で
ある。図１を見られたい。図１は正常な若い男の血清中
の成長ホルモンレベルを投与後の時間に対して示すが、
左側のグラフでは40人の被験者に300μg/kgのGHPR−１
投与（○）、中間のグラフでは39人の被験者に600μg/k
gのGHRP−１の投与（△）、および右側のグラフでは11
人の被験者に対し100μg/kgのGHRP−２の投与（□）の
結果を示す。これらの研究においてGHRPは平均年令約25
才の正常な若い男に初めに20mlの水の中で、次いで直ち
に100mlの水により投与された。血液は図に記録されて
いるように取られた。GHは放射標識免疫検定法により測
定された。

これらのペプチドにおいて芳香族側鎖は以前に必要と
考えられたある位置で除去されることができることおよ
びＤ−アミノ酸残基はＬ−形よりも生物学的に保護され
るべきなので、ある種のペプチドのためにより多大な保
護とより少ない重量を、例えば鼻、口、皮下の吸収、生
体内安定性などの特性を助長するようにポリペプチドを
さらに適合させるために用いることができるということ
もまた期待される。

R₁、R₂、R₃、R₄およびＺなどの部分は同様に変更でき
る。それにより望みの化合物の物理化学的特性に制御を
加えることができる。従って、あるペプチドをある受容
体へかつ特別の種類で多く配給することができる。

本発明の実施において使用される好ましい成長ホルモ
ン放出性化合物は、またはA₁、A₂およびＡ_５′が前記に定義された通りで
あるすべてのポリペプチドの有機または無機の付加塩で
ある。

好ましい実施態様において、本発明の実施において使
用される成長ホルモン放出性ペプチドは次式を有し、およびその有機または無機の付加塩である。こ
の化合物群の好ましいメンバーは次の式を有する。

並びにその有機または無機の付加塩である。

これらの化合物は、比較的短鎖のポリペプチドはより
安価に合成されるので、現在最も好ましいものであり、
またこれらの特定の化合物は血清中で成長ホルモンレベ
ルの増加を促進することにおいて高水準の効力を有する
ことを示された。

その他の好ましい成長放出ペプチドは式A₁−A₂−Ala
−Phe−DPhe−A₅を有する。この化合物群の好ましいメ
ンバーは、A₁がNaIMA、αγABU、DAla、His、Ala、His
またはαγABUであり、A₂はＤβNalまたはDPheであり、
そしてA₅はLysNH₂、LysNH₂、ArgNH₂、NH−Chx−NH₂（1,
4Chxジアミン）、またはLysEAであるものを含む。例え
ば、並びにその有機または無機の付加塩である。

本発明の他の一つの実施態様は式A₁−A₂−C₁−C₂−C₃
−A₅のポリペプチドを含み、前式中C₁はAlaであり、C₂
はTrp、PheまたはDChxAla、C₃はDPheまたはDChxAlaであ
り、A₁は好ましくはDAlaであり、A₂は好ましくはＤβNa
lである。例えば、並びにその有機または無機の付加塩である。

ここに述べられたこれらの化合物は通例として合成し
易く、血清中の成長ホルモンレベルの増加を促進する効
力を有し、そして商業規模の製造および使用に望まし
い。その上、これらの化合物は、広範な種類の動物にそ
のようなポリペプチドを効率良く供給するため望ましい
物理化学的特性を有することにおいて有益であり得る。
それはポリペプチド化合物の多数の位置のいろいろな置
換法により、これらのペプチド化合物のＣ−末端および
中央部の極性、中性または非極性を、特別の化学的／機
械的供給方法を使用する経口、経鼻の連続供給である望
みの供給方法と相容性あるように選択することにより可
能になる融通性の故である。

これらのポリペプチドは治療上成長ホルモンが用いら
れ得るすべての用途に、例えば視床下部下垂体矮小発育
症、骨石化症、火傷、および腎臓不全の処置に、急性の
用途のため、偏関節骨折のため、および創傷の癒合を促
進するために使用されることができる。その上、それは
手術からの回復、急性／慢性の衰弱させる病気からの回
復を促進するために使用されることができる。有益な同
化作用の効果が体脂肪の付随的な減少を伴う老化過程に
関して皮膚、筋肉および骨にもたらされる。ガン疾患の
これらのペプチドによる処置もまた含まれる。例えば、
ガン患者における悪液質を防ぐまたは減少させる処置で
ある。これらの治療上の使用は治療上有効な量のペプチ
ドを使用することにより達成される。そのような量は以
下に論じられる如く血清成長ホルモンレベルの放出を促
進するため必要な量である。

本発明の化合物はまた動物の血液GHレベルを高めるた
め、牝牛の乳生産を増すため、哺乳類（例えば、人間、
羊、牛類および豚）のような動物、並びに魚、家畜、そ
の他の脊椎動物および甲殻類の体成長を増進させるた
め、および哺乳動物におけるむく毛および／または毛皮
の増加するためにも使用できよう。体成長の結果は動物
種の性と年令、投与される成長ホルモン放出性化合物の
量と何であるか、投与の経路などに関係する。また、本
発明の化合物は人間の血清GHを増加させ、背の低い子供
の体成長を高め、選ばれた子供において体脂肪を減じか
つたん白代謝を改善し、初老の、特にGH不足があると
き、皮膚、筋肉、骨のたん白代謝を改善し、その一方で
体脂肪を減少させる。

これらのペプチドはまた人間において血清のコレステ
ロールおよび低密度リポたん白質の量を血清中で減少さ
せかつ高密度リポたん白質の量を血清中に増加させるこ
とにより血清脂質パターンを改善するためにも役立つ。

本発明の新規なポリペプチド化合物は普通の溶液およ
び固相ペプチド化学の方法または当業界に既知の古典的
方法に従って合成することができる。

ペプチドアミドのためには、固相合成が特に好まれ
て、ペプチドのＣ−末端から始められる。適当な出発原
料は、例えば、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル
樹脂、ベンズヒドリルアミン（BHA）樹脂、またはパラ
−メチル−ベンジルヒドリルアミン（ｐ−Me−BHA）樹
脂に、要求される保護されたアルファ−アミノ酸を付加
させることにより製造することができる。そのようなク
ロロメチル樹脂は一つのビオ・ラ・ド・ラボラトリース
（Bio Rad Laboratories,Richmond,Calipormia）により
商品名ビオビース（BIOBEADS）SX−１で販売されてい
る。ヒドロキシメチル樹脂の製造はBodansky et al.,Ch
em.Ind.（London）38,1597（1966）に記載されている。
BHA樹脂はPietta ＆ Marshall,Chem.Comm.,650（1970）
に記載されており、ペニンスラ・ラボラトリース社（Pe
ninsula Laboratories,Inc.,Belmont,California）から
市販されている。

初めの付加の後、アルファ−アミノ保護基は、トリフ
ルオロ酢酸（TFA）または塩酸（HCl）を含む酸性試薬の
有機溶媒中溶液の選ばれた一つにより室温で除かれるこ
とができる。アルファ−アミノ保護基を、除いた後、残
りの保護されたアミノ酸は段階的に望みの順序にカップ
リングされることができる。各保護されたアミノ酸は一
般に適当なカルボキシル基活性化剤、例えばジシクロヘ
キシルカルボジイミド（DCC）またはジイソプロピルカ
ルボジイミド（DIC）を使用して、溶液中、例えばメチ
レンクロリド（CH₂Cl₂）またはジメチルホルムアミド
（DMF）およびそれらの混合物、の中で約３倍過剰で反
応させることができる。

望みのアミノ酸配列が完成された後、望みのペプチド
をベンズヒドリルアミン樹脂担体からフッ化水素（HF）
のような試薬による処理で分割することができる。前記
試薬はペプチドを樹脂から分割するばかりでなく、最も
普通に使用される側鎖保護基をも分割する。クロロメチ
ル樹脂またはヒドロキシメチル樹脂が使用される場合
に、HF処理は結果として遊離のペプチド酸の生成をもた
らす。しかし、ペプチドのアルキルアミドおよびエステ
ルはこれらのペプチド樹脂から適当なアルキルアミン、
ジアルキルアミンまたはジアミノアルカンによる分割ま
たは高いpHレベルにおいてアルコールとのエステル交換
により容易に製造することができる。

上記に論じられた固相法は当業界に周知であり、Stew
art ＆ young,Solid Phase Peptitle Synthesis,第２
版、（Pierce Chemical Co.,Rockford,IL 1984）により
記載されている。

本発明のペプチド部分を合成するために用いることの
できる若干の周知の溶液法はBodansky et al.,Peptide
Synthesis,第２版、John Wiley ＆ Sons,New York,N.Y.
1976に記載されている。

ペプチドは、少なくとも二つのペプチドフラグメント
の縮合反応を含む溶液相法により合成されるのがより好
ましいと信じられている。

この方法はペプチドフラグメントＸ−A₁−Ｙをペプチ
ドフラグメントＵ−Ｖ−Ｗと縮合させることから成る。
その際A₁を除くすべてのアミノ酸側鎖は中性かまたは保
護されており、そしてその際ＸはProt.であり、そこでP
rot.はＮ末端保護基である。Ｙは、A₂−Q,Ala−A₂−Q,A
₂−Ala−Q,Ala−A₂−Ala−Q,A₂−Ala−Trp−Q,Ala−A₂
−Trp−Q,Ala−Ｑまたは−Q,であり、そこでＹがＱであ
るとき、ＵはＪ−A₂−Al−Trp、またはＪ−Ala−A₂−Al
a−Trpである。ＹがAla−Ｑであるとき、ＵはＪ−A₂−A
la−Trpである。ＹがA₂−ＱまたはAla−A₂−Ｑであると
き、ＵはＪ−Ala−Trpである。ＹがA₂−Ala−ＱまたはA
la−A₂−A₃−Ｑであるとき、ＵはＪ−Trpである。ＹがA
₂−Ala−Trp−ＱまたはAla−A₂−Ala−Trp−Ｑであると
き、ＵはＪである。ＶはA₅またはＺである。ＶがA₅であ
るとき、ＷはＺである。ＶがＺであるとき、Ｗは存在し
ない。A₁、A₂、A₅およびＺは前記に定義された通りであ
る。

Ｑはペプチドフラグメントのカルボキシ末端であり、
また−OR³または−Ｍである。そこでＭは窒素を含む求
核試薬によって置換されることのできる部分であり、そ
してR³はＨ、１〜約10の炭素原子を含むアルキル基、６
〜約12の炭素原子を有するアリール基または７〜約12の
炭素原子を有するアリールアルキル基である。Ｊは指定
されたフラグメントのアミン末端であり、およびＨまた
はカップリング反応を妨害しない保護基、例えばベンジ
ル、である。

その後、保護基が除去される。あるいは、かくして形
成された保護ペプチドをさらに縮合において使用してよ
り大きなペプチドを製造してもよい。

この好ましい方法は「ペプチドの合成方法」（“Proc
ess for Synthesizing Peptides"）と題してJohn C.Hub
bsとS.W.Parkerにより1990年７月24日に提出された米国
特許出願第558,121号にさらに詳細に記載されている。
この特許文献は引用によりここに組み込まれかつWO9201
709として公告される。

本発明の他の一つの実施態様に従って、動物の血液に
おいて成長ホルホンレベルの放出および／または上昇を
促進するために一つの方法が提供される。この成長ホル
モンレベルの放出および／または上昇を促進する方法は
また前記の病気を治療上処置するために使用されること
もできる。前記の方法は動物に前記の少なくとも一種の
有効量を投与することから成る。一つの実施態様におい
この方法は人間以外の動物において使用される。

本発明の化合物は経口、非経口〔筋肉内（i.m.）、腹
膜腔内（i.p.）静脈内（i.v.）または皮下（s.c.）注
射〕、鼻、腔、直腸または舌下の投与経路並びに胸膜内
吸入により投与されることができ、また各投与経路に適
する薬剤形に配合されることができる。非経口的投与が
特に好まれる。

経口投与のための固体剤形はカプセル、錠剤、丸剤、
粉末および顆粒を含む。そのような固体剤形において、
有効化合物は少なくとも１種の不活性担体、例えばスク
ロース、ラクトース、またはデンプン、と混合される。
そのような薬剤形は、慣用の如く、不活性希釈剤の他の
添加物、例えばステアリン酸マグネシウムのような滑沢
剤、もまた含むことができる。カプセル、錠剤および丸
剤の場合に、薬剤形はまた緩衝剤を含むことがある。錠
剤と丸剤はさらに腸溶コーチングによって調製されるこ
ともできる。

経口投与用液体剤形は乳剤、溶液、懸濁液、シロッ
プ、当業界において慣用の不活性希釈剤、例えば水、を
含むエリキシル剤を含む。そのような不活性希釈剤のほ
かに、配合物は補助剤、例えば湿潤剤、乳化および懸濁
剤、および甘味剤、着香剤、および芳香剤、を含むこと
もできる。

非経口的投与のための本発明に従う製剤は無菌の水性
または非水性の溶液、懸濁液、または乳液を含む。非水
性溶媒または媒体の例はプロピレングリコール、ポリエ
チレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油および
トウモロコシ油）、ゼラチン、および注射可能な有機エ
ステル（例えば、エチルオレアート）である。そのよう
な薬剤形はまた保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤の
ような補助剤を含むこともある。それらは、例えば、細
菌保留フィルターを通す濾過により、配合物中に殺菌剤
を組み入れることにより、配合物を放射線照射すること
により、または配合物を加熱することにより滅菌される
こともある。それらはまた無菌水の媒体、またはなにか
他の無菌の注射可能な媒体の中で使用の直前に製造され
ることもできる。

本発明の新規化合物はまた成長ホルモン放出性ホルモ
ン（すなわち、天然に発生する成長ホルモン放出性ホル
モン、その類似物および機能的同等物）と組み合わせ
て、並びに成長ホルモンの放出を促進する他の化合物、
例えば、成長ホルモン放出性ペプチド（米国特許第4,88
0,778号参照、同特許文献は引用によりここに組み込ま
れる）、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、
β−アドレナリン産生の遮断剤、α^２−アドレナリン産
生の遮断剤など、と組み合わせて投与される時にも有効
である。そのような組合わせは本発明の成長ホルモン放
出性ペプチドを投与するため特に好ましい手段を表わ
す。なぜならばその組合わせは、その組合わせの各成分
についての個々の応答の加算により予測されるよりもは
るかに多くの成長ホルモンの放出を促進するからであ
る。すなわち、この組合わせは個々の成分について相乗
的応答を与える。成長ホルモン放出性ペプチドの組合わ
せの投与についてのさらに詳細なことは前記に引用した
特許に記載されている。そのような相乗性化合物は、成
長ホルモン放出性ホルモン受容体における作動薬として
作用するか、またはソマトスタチンの効果を阻害する化
合物であることが好ましい。その相乗作用は二元的、す
なわち本発明の化合物と一つの相乗性化合物であるか、
または一つより多くの相乗性化合物を含むことができ
る。

人間のような動物の血液において成長ホルモンレベル
の放出と上昇を生ぜしめるため有効な組合わせは本発明
において請求されているポリペプチドから選択される有
効量のポリペプチドと少なくとも一つの次のグループ、
グループ１、または成長ホルモンの放出を促進する化合
物、例えば、グループ２ポリペプチド、から成る。上記
においてグループ１ポリペプチドは天然に発生する成長
ホルモン放出性ホルモンおよびその機能上の同等物のい
ずれかから選択される。その際前記ポリペプチドは哺乳
類および他の脊椎動物、および甲殻類の成長ホルモン放
出性ホルモン受容体として作用する。

グループ２ポリペプチドは次の構造を有するポリペプ
チドのいずれかから選択される。

および前記グループ２のポリペプチドの有機または無
機の付加塩。ここで前記の組合わせは、そのような動物
の血液中で成長ホルモンの同乗作用的放出と上昇を起す
ために前記組合せが有効であるよう比率で投与される。

成長ホルモンの放出を促進するその他の化合物は当業
者に知られており、そしてアセチルコリンエステラーゼ
阻害剤、β−アドレナリン産生の遮断剤およびα^２−ア
ドレナリン産生の作動薬を包含する。

ある好ましい実施態様において天然に発生する成長ホ
ルモン放出性ホルモンおよびその機能上の同等物並びに
成長ホルモンの放出を促進する化合物を本発明のペプチ
ドと共に使用する。例えば、グループ１とグループ２の
化合物を本発明のペプチドと共に、他の一つの例はグル
ープ１化合物またはβ−アドレナリン産生の遮断剤を本
発明のペプチドと共にである。

投与される本発明のポリペプチドまたはポリペプチド
の組合わせの量は多数の因子、例えば、処置される特定
の動物、その年令および性別、望みの治療効果、投与の
経路およびどのポリペプチドまたはポリペプチドの組合
わせが使用されるか、に関係して変るであろう。しか
し、すべての場合に受け入れる動物の血液中で成長ホル
モンレベルの放出および上昇を促進するために有効な投
与量（治療上有効な量）が用いられる。通常、この投与
量レベルは体重kg当り約0.1μｇから10mgまでの全ポリ
ペプチド量の範囲内にある。この好ましい量は本開示に
基づいて当業者により経験的に決定されることができ
る。

例えば、人間において投与方法が静脈内であるとき、
好ましい投与量レベルは体重kg当り約0.1〜10μｇの全
ポリペプチド量の範囲内にあり、より好ましくは体重kg
当り約0.5μｇ〜５μｇ、さらに好ましくは体重kg当り
約0.7μｇ〜約3.0μｇの範囲内である。成長ホルモン放
出性ペプチドの組合わせが使用される場合には、より低
い量の前記ペプチドを使用することができる。例えば、
前記ペプチドを、GHRHのような米国特許第4,880,778号
のグループ１の相乗作用化合物と組合せるとき、好まし
い範囲は体重kg当り0.1μｇ〜約５μｇの前記化合物と
約0.5μｇ〜約15.0μｇの相乗作用化合物（例えば、GHR
H）、そしてより好ましくは体重当り約0.1〜約３μｇの
本発明の化合物と約1.0〜約3.0μｇの相乗作用化合物、
そしてさらに好ましくは体重当り約0.1μｇ〜約３μｇ
の本発明の化合物と約1.0μｇ〜約3.0μｇの相乗作用化
合物である。

投与方法が経口である場合には、さらに多量が一般に
必要である。例えば、人間において経口投与のために
は、投与量レベルは一般に体重当り約30μｇ〜約1200μ
ｇのポリペプチド、より好ましくは約70μｇ〜約600μ
ｇのポリペプチド、さらにより好ましくは約200μｇ〜
約600μｇの全ポリペプチド量である。牛と豚は人間と
ほぼ同じ投与量レベルを必要とするが、ラットは一般に
より高い投与量レベルを必要とする。正確なレベルは本
開示に基いて経験的に容易に決定することができる。

一般に、前記の如く、成長ホルモン放出性ペプチドの
組合わせの投与は、組合せの相乗効果により、同様の応
答を得るために個々の成長ホルモン放出性化合物に要求
される投与量レベルよりも低い使用される個々の成長ホ
ルモン放出性化合物の投与量を見込むであろう。

また有効成分として前記のポリペプチドおよびその組
合わせの有機および無機の付加塩を、任意に、担体、希
釈剤、低速放出マトリックス、またはコーティングと共
に含む配合物も本発明の範囲内に包含される。

本発明の範囲内にあると意図されている成長ホルモン
放出性化合物およびその組合せの有機または無機の付加
塩は酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、吉相酸
塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、ｐ−トルエン
スルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸
塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフタル酸塩などのような
有機部分を有する塩、および第Ｉ族（すなわち、アルカ
リ金属塩）、第II族（すなわち、アルカリ土類金属）、
アンモニウムおよびプロタミン塩、亜鉛、鉄などの無機
部分とクロリド、ブロミド、スルファート、ホスファー
トなどのような対イオン並びに前記の有機部分の塩を包
含する。

人間に対して投与することが意図されている場合に
は、医薬品として許容される塩類が特に好ましい。その
ような塩類に含まれるものは医薬品産業において一般に
使用されている非毒性のアルカリ金属、アルカリ土類金
属およびアンモニウムの塩であり、当業界において周知
の方法により製造されるナトリウム、カリウム、リチウ
ム、カルシウム、マグネシウム、ハリウム、アンモニウ
ムおよびプロタミンの塩を含む。前記用語はまた本発明
の化合物と適当な有機または無機の酸を反応させること
により一般に製造される非毒性付加塩を含む。代表的な
塩に含まれるものは塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、重硫酸
塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉相酸塩、オレイン酸塩、ラ
ウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸
塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、マレイン
酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸
塩などである。

本発明は次の非限定的な例によりさらに説明される。

例１成長ホルモン放出ペプチドの合成市販の自動ペプチド合成装置上の反応器の中にパラメ
チルベンズヒドリルアミン塩酸塩（pMe・BHA・HCl）樹
脂を入れる。前記樹脂を遊離のアミンによりグラム当り
約５ミリモルの充填度まで置換する。前記化合物は個々
のアミノ酸をペプチド配列のカルボキシ末端で出発して
適当な活性化剤、例えばN,N′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド（DCC）、を使用してカップリングすること
により製造される。個々のアミノ酸のアルファアミン
は、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル誘導体（ｔ−
BOC）として保護され、そして反応側の連鎖官能基は表
１に要約されているように保護される。

最初のアミノ酸の取組みの前に、前記樹脂を３回（毎
回約１分間）ジクロメタン（CH₂Cl₂:約10mL/gm樹脂）と
共に撹拌し、N,N−ジイソプロピルエチルアミン（DIE
A）のジクロロメタン溶液（10:90;約10mL/gm樹脂）と３
回（毎回２分間）の撹拌により中和し、そしてジクロロ
メタン（約10mL/gm樹脂）と３回（毎回約１分間）撹拌
する。最初のおよびそれに続く各アミノ酸は、適当な量
のジクロロメタン中で樹脂の全反応容量の約６倍の適当
に保護されたアミノ酸と、樹脂の全結合容量の約２倍の
DICを使用して予備形成された対称無水物を用いてカッ
プリングされる。低いジクロロメタン溶解度を有するア
ミノ酸のためには、N,N−ジメチルホルムアミド（DMF）
を加えて均一溶液を達成する。一般に、対称無水物は室
温またはそれ以下で反応器に導入する30分前までに調製
されている。対称無水物の製造の際に生成するジシクロ
ヘキシルウレアは反応器中への前記溶液の重力濾過で除
去される。アミノ酸の樹脂へのカップリングの進行は通
例として、ニンヒドリン（これは第一級および第二級ア
ミンと反応する）のような試薬を使用する比色試験によ
り監視する。保護されたアミノ酸の樹脂へのカップリン
グが完了すると（＞99％）、アルファアミン保護基は酸
性試薬（一種または数種）による処理で除去される。一
般に使用される試薬はトリフルオロ酢酸（TFA）のジク
ロロメタン溶液（33:66）から成る。

望みのアミノ酸配列が完成した後、望みのペプチドを
フッ化水素のような試薬で処理することにより樹脂担体
から切断することができる。前記試薬はペプチドを樹脂
から切断するばかりでなく、最も一般に使用される側鎖
保護基をも切断する。BHAまたはｐ−Me−BHA樹脂が使用
される場合には、HF処理は結果として直接に遊離のペプ
チドアミドを生ずる。アミノ酸−メリフィールド（Merr
ifield）樹脂が使用される場合には、遊離のペプチドア
ルキルアミドが適当なアミンによる処理で切断される
（この場合に、Boc−N^E−FMOC−Lysの使用はFMOC基の同
時除去を可能にするであろう）。

各個別のアミノ酸残基を樹脂上へ取込むのための完全
な手順を表２に要約して示す。

例２ラットにおける生体内GH放出未成熟の雌のスプラグゥードウレイ（Spragve−Dawlc
y）をチャールス・リバー・ラボラトリース（Charles R
iver Laboratories,Wilmington,MA）から入手した。到
着後それらを25℃で14:10時間明暗サイクルにより飼育
した。水とプリナ（Purina）ラット食餌は随意に（ad l
ibitum）得られた。子ラットたちは生後21日まで彼らの
母親と一緒に居らせた。

生後26日のラットは、６匹づつの処置群に分け、ペプ
チドによる生体内処置の20分前に50mg/kgのペントバル
ビタール20により腹膜間麻酔をかけられた。0.1％ゼラ
チンを含む正常食塩水をペプチドの静脈（i.v.）注射用
の容器に入れてあった。麻酔を受けたラット（体重55−
65g）に表３に示された量の成長ホルモン放出化合物を
静脈注射した。注射は頚静脈に0.1mL溶液として行われ
た。

すべての動物を最終のテスト注射（表３参照）の10分
後にギロチンにより殺した。血液GHレベルの測定のため
動脈幹血液を断頭の後に採取した。血液を凝固させた
後、遠心分離してから血清を凝固物から分離した。形成
は、国立関節炎、糖尿病および消化器・腎臓病研究所
（NIADDK）により開発されたような次の手順に従って成
長ホルモンレベルの放射標識免疫検定法（RIA）測定用
の試料採取の日まで凍結保存された。

試薬は一般に複数のRIA分析管に一度に冷蔵庫温度
（約４℃）で次の順序に加えられる。

（ａ）緩衝液、（ｂ）「冷たい」（“cold"）（すなわち、非放射性）
標準または未知の被験血清試料、（ｃ）放射性ヨウ素化成長ホルモン抗原、および（ｄ）成長ホルモン抗血清。

試薬の添加は一般に最終のRIA管の希釈度が1:30,000
（抗血清対全液容積:vol:vol）になるように行われる。

上記の試薬混合物は次に通例として室温（約25℃）に
24時間保温された後に、錯体化された成長ホルモン抗血
清に結合してその沈澱を生じさせる第２の抗体（例え
ば、ヤギまたはウサギの抗モンキーガンマグロブリン血
清）の添加が行われる。RIA管の沈殿物はそれからガン
マ−シンチレーション計数管における一定時間内の計数
値について分析される。標準曲線が放射性カウント数を
成長ホルモン（GH）レベルに対してプロットすることに
より作られる。未知物のGHレベルはそれから前記標準曲
線を参照して決定される。

血清GHは国立ホルモンおよび下垂体プログラム（Nati
onal Hormone and Pituitary Program）により提供され
る試薬でRIAにより測定される。

表３における血清レベルは0.61国際単位/mg（IU/mg）
のラットGH標準によってng/mLで記録されている。デー
タは平均値の平均＋／−標準誤差（SEM）として記録さ
れている。統計的分析は学生のｔ−試験（Student's t
−test）と共に行われた。表３において示された結果は
６匹のラットによる研究の平均値である。

表３において、本発明の化合物は本明細書記載の一般
式以外の化合物に比較され、そして上記のようにして本
発明の化合物がそれに投与されたラットの血液中の成長
ホルモンレベルの放出と上昇を促進することを示されて
いる。特に好まれる化合物の驚くべき成長ホルモン放出
活性は全く価値が高い。なぜならば比較的安定でかつ安
価なアミノ酸、Ｄ−アラニンをアミノ末端にかつペンタ
ンジアミンをLysの代りにＣ−末端に有するより短い連
鎖の、より低い分子量のポリペプチドは動物および人間
における成長ホルモンレベルを高める低コストの手段で
あることを証明するにちがいないからである。

例３−経口投与後のラットにおける生体内GH放出例２の操作手順を繰返して行ったが、但しラットは胃
内管により指示された投与量の化合物を与えられた。投
与された化合物、用いられた投与量レベルおよび試験結
果が表４に記載されている。

本発明の化合物は、ラットへの経口投与の後にGH放出
活性の有用なレベルを維持する。これは、ペプチドの治
療上の有用性がこの投与方法により増加されるので価値
が高い。

例４−ラットにおける生体内GH放出例２の操作手順が繰返された。投与された化合物、採
用された投与量レベルおよび試験結果が表５および６に
記載されている。

表５および表６は、本発明の一般式の範囲内の化合物
が前記一般式の範囲外の化合物よりも高い程度に血液中
の成長ホルモンレベルの放出と上昇を促進することを示
す。

例５人間における生体内GH放出正常な人間被験者、約25才の平均年令の男、において
ペプチドAla−His−Ｄ^βNal−Ala−Trp−DPhe−Lys−NH
₂（GHRP−１）またはペプチドDAla−Ｄ^βNal−Ala−Trp
−DPhe−Lys−NH₂（GHRP−２）が経口投与された。40人
の被験者は20mlの水の中の300μg/kg GHRP−１を、それ
に続いて100mlの水のみを投与され、39人の被験者は20m
lの水の中の600μg/kg GHRP−１を、それに続いて100ml
の水を投与され、そして11人の被験者は20mlの水の中の
100μg/kgのGHRP−２を、それに続いて100mlの水を投与
された。血液を図１に示すような時間の間隔で採取し
て、例２に述べた手順により成長ホルモンについて放射
標識免疫検定法により検定した。その結果が図１に示さ
れている。100μg/kgのGHRP−２の経口投与は、300μg/
kgのGHRP−１の経口投与よりも高いレベルの成長ホルモ
ンを結果として与えた。

例６ラットにおける生体内GH放出例２の一般手順に従ったが、但しペプチドは静脈より
むしろ皮下に注射され、また殺す時間は＋10分よりもむ
しろ＋15分であった。投与された化合物、採用された投
与量レベルおよび試験結果が表７に記載されている。

例７ペプチドを形成するためのペプチド断片の縮合反応一般
的手順融点はトーマス・フーバー（Thomas Hoover）毛細管
融点測定装置を使用して測定することができる。赤外ス
ペクトル（IR）はパーキン・エルマー（Perkin−Elme
r）モデル137またはニコレット（Nicolet）モデル5DX分
光光度計で記録されかつ波数（cm^-1）で報告されること
ができる。質量スペクトル（MS）はVGアナリチカル社
（VG Analytical Ltd.）モデルZAB−1F質量分析計を使
用してEI（電子衝撃）、FD（電界脱離）またはFAB（高
速原子衝撃）などのモードで得ることができる。GCMS
は、ヘリウムキャリヤーガスを使用する30mDB5毛細管カ
ラム（J ＆ W Scientific）を装備したフィニガン（Fin
nigan）4023GCMSを使用して得ることができる。旋光度
はルドルフ・リサーチ（Rudolph Research）製のオート
ポール（Autopol）III旋光計を使用して測定することが
できる。

¹HNMRスペクトルは400MHzで操作するJEOL GX−400
NMR測定機たは270MHzで操作するJEOL GX−270 NMR測
定機で得ることができる。これらの機器は0.7Hz以下の
日常ディジタル分解が可能である。化学シフトは内部の
３−（トリメチルシリル）−テトラデューテロナトリウ
ムプロピオナート（TSP）に関してppmで表わされる。

高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）は、Ｌ−5000
勾配調節機およびVgdac201TP1010または218TP1010半分
取カラムに付設された655Aポンプから成る日立システム
を使用して達成することができる。0.2％トリフルオロ
酢酸を含む水とメタノールの組合せが溶離溶媒として使
用できる。通例として、問題の化合物は、毎分約１−２
％の割合で有機成分を増す勾配で毎分6mLの流速で溶離
されることになる。化合物はその際LKB2140ダイオード
配列U.V検出器を使用して適当な波長で検出される。積
分はそれからネルソン・アナリチカル（Nelson Analyti
cal）ソフトウェア（Version 3.6型）を使用して達成す
ることができる。

反応は、特に指定されなければ窒素またはアルゴンの
不活性雰囲気の下で行われることになる。無水テトラヒ
ドロフラン（THF、U.V.グレード）およびジメチルホル
ムアミド（DMF）はバーディック・アンド・ジャクソン
（Burdick and Jackson）から購入されそして瓶から直
接に使用することができる。

A.トリペプチドフラグメント−₂NH−Trp−DPhe−Lys（B
oc）−NH₂の製造Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−（Ｎξ−ｔ−ブトキ
シカルボニル）リシンアミド、４カルボニルジイミダゾール（CDI,2.88.24g、0.544モ
ル）と乾燥テトラヒドロフラン（THF、1500mL）の10℃
溶液にＮα−ベンジルオキシカルボニル−（Ｎξ−ｔ−
ブトキシカルボニル）リシン（１、180g、0.474モル）
をゆっくり加える。ガスの発生がこの添加の間に見られ
る。Ｎξ−ベンジルオキシカルボニル（Ｎξ−ｔ−ブト
キシカルボニル）リシンイミダゾリド中間体、３、が生
成する間に、アンモニアとTHF（2000mL）の飽和溶液を
調製する（無水NH₃ガスを５−10℃でTHFを通す）。中間
体３の形成が完了したと判断された後（ガス発生が止ん
だとき、約２時間後）、３を含むTHF溶液の半分を前記
アンモニア溶液に加える。３を含む溶液の残りを30分後
に加える。アンモニアガスの連続の流れを添加の間を通
じておよびその後さらに45分間維持する。３を含む前記
二つの溶液の添加の際白い沈殿を生じる。反応系を室温
まで温まらせかつ15時間撹拌する。溶媒を真空でスラリ
ーから除去する。残渣を水中にスラリー化して、その結
果生じる固体を真空濾過により採集する。

Ｎξ−ｔ−ブトキシカルボニル−リシン−アミド、５リシンアミド４（181.48g、0.479モル）のメタノール
（MeOH、1000mL）中溶液をメタノール（250mL）中５％P
d/C（5g）の触媒スラリーにアルゴン下に加える。水素
を反応混合物に泡立てて通気し（約15分間）、それから
反応系を水素雰囲気の下で撹拌し、HPLC分析が反応の完
結を示すまで続ける（36時間）。次に水素雰囲気をアル
ゴンで置換する。反応溶液をセライト（Celite）パッ
ドを通して透明にしてから、溶媒を真空で除去して固体
を得る。

Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−フェニルアラニ
ル−（Ｎξ−ｔ−ブトキシカルボニル）リシン−アミ
ド、８Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−フェニルアラ
ニン（６、126.39g、0.423モル）をCDI（２、66.03g、
0.409モル）のTHF（500mL）中の10℃溶液にゆっくり加
える。添加の間にガス発生が見られる。ガス発生が止む
と、リシンアミド５（10.75g、0.452モル）をTHF（500m
L）中の溶液として加える。約48時間後その混合物を濾
過して固体を除く。濾液を真空濃縮する。

その結果生じる残渣をエチルアセタート（EtOAc、500
mL）中に溶解し、それから分液漏斗中で次のように洗
う。

1.aqHCl（1N、３×500mL）洗浄１のpH、約8;その後の洗
浄pH、１、 2.水（500mL） 3.aqNa₂CO₃（1/2飽和、２×500mL）、濾過して生成した
結晶性固体（８）を採集する。

4.水（３×500mL）。

有機相をMgSO₄上で乾燥させる。清澄の後、溶媒を真
空で除去する。その結果生じる残渣を熱EtOAから再結晶
させて８の第２の試料を得ることができる。

Ｄ−フェニルアラニル（Ｎξ−ｔ−ブトキシカルボニ
ル）リシン−アミド、９アミド８（120.53g、0.229モル）のメタノール溶液
（1500mL）をMeOH（200mL）中５％Pd/C（50g）の触媒ス
ラリーに加える。アルゴン雰囲気を水素に置換する。HP
LC分析が反応の終結を示すとき（約４時間）、水素雰囲
気をアルゴンに置換する。反応溶液を次にセライト（Ce
lite）パッドを通して清澄化し、そして濾液を真空蒸
発させて残渣を取る。そのジペプチド生成物は直接にト
リペプチド12の製造において使用することができる。

Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−トリプトフィル−Ｄ
−フェニルアラニル−（Ｎξ−ｔ−ブトキシ−カルボニ
ル）リシン−アミド、12 Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−トリプトファン
（10、67.60g、0.200モル）、THF（300mL）、およびCDI
（２、33.05g、0.204モル）の10℃溶液を撹拌してガス
の発生が止むまで続ける。９（40.8g、0.103モル）のTH
F（約200mL）中の溶液を次に前記反応混合物に加える。
その結果生じる溶液を室温まで温めながら15時間反応さ
せる。生成する固体を次に真空濾過により採集する。濾
液を真空濃縮することにより残渣を得る。その結果の残
渣と固体を再び一緒にして、EtOAc（4000mL）中で少し
温めながら溶解する。その溶液を室温に冷すと、固体が
生成する。その固体を真空濾過で採取する。この固体を
熱MeOHから再結晶させると精製されたトリペプチド12を
得る。前記EtOAC濾液（初めの結晶化からの）を分液漏
斗中で次のように洗う。

1.aqHCl（1N、２×500mL）、 2.水（１×500mL） 3.aqNa₂CO₃（1/2飽和、２×500mL）、 4.aqNaCl（１×500mL）。

有機相をMgSO₄上で乾燥させてから、真空濾過により
清澄化する。濾液の溶媒を真空で除去する。その結果生
じる残渣を再びEtOAcに溶解させて乾燥固体を得る。そ
の固体は熱MeOH再結晶を受けると白い固体として12の第
２の収穫物を与える。

トリプトフィル−Ｄ−フェニルアラニル−（Ｎξ−ｔ−
ブチルオキシカルボニル）リシン−アミド13 トリペプチド12（64.59g、0.091モル）のメタノール
溶液（1500mL）を５％Pd/C（5g）とMeOH（250mL）の触
媒スラリーにアルゴン雰囲気下で加える。MeOHの追加量
（2250mL）を加える。アルゴン雰囲気を水素に置換して
から、反応させる（約24時間）。反応が終結すると、水
素雰囲気をアルゴンに置換する。溶液をセライト（Celi
te）パッドを通して清澄化し、そして濾液を真空で濃
縮すると白色固体としてトリペプチド13を得る。

B.トリペプチドフラグメント−Ｋ−DAla−ＤβNal−Ala
−OMe Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アラニル−Ｄ−
ベータ−ナフチルアラニンメチルエステル、25 EtOAc（400mL）とＤ−ベータナフチルアラニンメチル
エステル塩酸塩（22、0.62モル）の溶液を飽和炭酸ナト
リウム液（400mL）および0.8N水酸化ナトリウム水溶液
（約500mL）で洗う。その結果生じる水相応を除き（pH
8.5）、そして有機相を連続して半飽和Na₂CO₃水溶液（1
50mL）で、および次に水（50mL）で洗う。遊離塩基形の
22が、エチルアセテート相を真空で濃縮すると単離され
る。

ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、約95g、0.46
モル）を、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アラ
ニン（19、143.5g、0.50モル）、Ｎ−ヒドロキシスクシ
ンイミド（HONSu、23、0.62モル）および新しく製造さ
れた遊離塩基形の22（約0.52モル）のDMF（約3L）中−
５℃（氷−エタノール浴）溶液に加える。その結果有生
じる反応溶液を室温まで温めながら24時間撹拌する。HP
LC分析を、反応が完了したかどうかを見るために使用す
べきである。もし反応が完了していないならば、そのと
きは反応溶液を約−５℃に冷却してから、追加分のジシ
クロヘキシルカルボジイミド（約0.17モル）を反応系に
加える。その反応混合物をさらに24時間撹拌し、その間
に室温まで温めさせる。その混合物を次に濾過してジシ
クロヘキシルウレア（DCU）を除く。水（1L）を濾液に
加えてから、その結果生じる溶液を真空で濃縮する。そ
の結果生じる残渣を1N HCl溶液中に溶解させる（約1
L、水相のpHがpH1に達するまで）。その水相を次に２回
分のエチルアセタート（毎回1L）で抽出する。エチルア
セタート層を捨てる。次に水相のpHを冷い2N水酸化ナト
リウム（500mL）と水酸化ナトリウムペレットにより調
整する。この中和の間に、溶液を冷いエチルアセタート
（1L）を加えることにより低温に保つ。水相のpHがほぼ
７に到達すると、通常多量の白色固体または油状の沈殿
が生じる。この沈殿物を真空濾過またはデカンテーショ
ンにより採取してから、連続して半飽和炭酸ナトリウム
液（２×1500mL）、水（６×1500mL）およびエチルアセ
タート（３×1500mL）で洗う。かくして生成する物質を
高真空の下で一定重量になるまで乾燥させる。この物質
はさらに精製せず直接に加水分解させることができる。

Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アラニル−β−
ナフチル−Ｄ−アラニン、26 水酸化ナトリウム水溶液（192mL、0.08g/mL溶液、0.3
8モル）をジペプチド25（約0.38モル）の溶液に加え
る。その溶液を室温で撹拌し、加水分解が完了するまで
（約24時間）続ける。出発当初のペプチドの消失をHPLC
分析により確認する。溶液を真空で濃縮して残渣を得
て、これを水（約1L）中に溶解させる。その水層（pH約
10）を次に分液漏斗中でEtOAc（２×500mL）により抽出
する。エチルアセタート層を捨てる。かくして生成する
水相を濃HClによりほぼpH5に調整すると、その時点で通
常白色固体または油状の沈殿を生じる。この生成物を採
集してから真空で乾燥させる。

Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−アラニル−Ｄ−
ベータ−ナフチルアラニル−アラニンメチルエステル、
20 ジペプチド、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−
アラニル−−Ｄ−ベータ−ナフチルアラニン（26、0.25
3モル）をHONSu（23、0.505モル）のDMF（800mL）中溶
液にアルゴン雰囲気下で加える。この溶液にアラニンメ
チルエステル塩酸塩（15、0.303モル）、Ｎ−メチルモ
ルホリン（16、0.303モル）およびDMF（200mL）の混合
物を加える。その結果生じる溶液を10℃に冷却させ、そ
の時点でジシクロヘキシルカルボジイミド（24、0.265
モル）のメチレンクロリド（273mL）中溶液を加える。
反応をHPLCで監視し、その間反応温度を反応が完了する
まで10℃に保つ。もし数日（約４日）後に反応が完了ま
で進んでいないならば、追加投入量の24（0.080モル）
を加えてから、反応混合物をさらに１日間10℃で撹拌さ
せる。その反応を再びHPLC分析により反応終結まで（通
例約５日）監視する。反応の間に生成する固体を真空濾
過により採集する。濾液を次に真空で濃縮して残渣を得
る。かくして生じる残渣をエチルアセタートに溶解させ
てから、半飽和Na₂CO₃水溶液（２×500mL）で抽出す
る。エチルアセタート相をMgSO₄上で乾燥させる。その
結果生ずる溶液を清澄化してから、真空で濃縮して残渣
を得る。

2N水酸化ナトリウム水溶液（7.5mL、15ミリモル）
を、Ｎα−ベンジルオキシカルボニル−デルタ−ＤβNa
l−Ala−OMe（13.7ミリモル）を含むメタノール（500m
L）と水溶液（200mL）に加える。反応系を室温で一晩中
撹拌させて後、HPLC分析は残っている出発原料の量を示
す。それが実質上完了しているときは（ほぼ一晩明け
て）、結果として生じた溶液は真空で約200mLの容積ま
で濃縮される。水（100mL）を加えてから、2N水酸化ナ
トリウム（1mL）の添加によりpHをほぼ12に調整する。
その結果得られる溶液をエチルアセタート（２×500m
L）で抽出する。そのエチルアセタート層を捨てる。水
相のpHを次にHCl水溶液の添加により約５に調整する
が、HCl水溶液は通常生成物の沈殿をもたらす。この沈
殿を促進するため水相の容積を最小にすることが重要で
ある。生成物から水相をデカンテーションにより除いて
から、生成物を水（２×50mL）ですすぎ洗いする。単離
された生成物を真空で一定重量になるまで乾燥させる。

C.ヘキスタペプチドを製造するためのペプチドフラグメ
ントの縮合反応２種のペプチドDAla−ＤβNal−Ala−OH（33、2.6ミ
リモル）およびTrp−Ｄ−Phe−Lys（BOC）−NH₂（13、
2.8ミリモル）を無水DMFに溶解させ、その結果得られた
溶液を真空で濃縮した。この予備濃縮は、存在するかも
知れないいかなる痕跡量のメタノールをも除去する試み
で行われる。その結果のペプチド混合物をDMF中に再び
溶解させ、それからＮ−ヒドロキシスクシンイミド（5.
1ミリモル）を加える。かくして生成した溶液を次に−
２℃の溶液温度に冷却させ、それからジシクロヘキシル
カルボジイミド（3.4ミリモル）をメチレンクロリド
（3.5mL）中の溶液として加える。その結果生じる反応
混合物を−２℃の溶液温度で３日間撹拌させる。HPLC分
析を、反応が実質上完了したかどうか判定するために使
用する。もしそれが完了していなければ、この期間の後
に追加のジシクロヘキシルカルボジイミドをそのとき加
えることができ、そしてかくして生じる反応混合物をさ
らにもう１日間−２℃で撹拌させることができる。もし
翌日に（合計４日間）HPLC分析が再び不完全反応を示す
ならば、反応混合物の冷却を止めなければならない。反
応系の溶液温度をある時間（約８時間）に亘って室温
（25℃）までゆっくりと上げさせることができる。その
結果得られる溶液を一晩中室温で撹拌させる。この操作
手順を反応が完了するまで繰返す。次に、水（50mL）を
加えて、その結果の混合物をさらにもう１日間撹拌させ
る。反応溶液を次に濾過してジシクロヘキシルウレアを
除き、そしてかくして生じる濾液を粘稠な油になるまで
真空で濃縮する。その結果生じる残渣にエチルアセター
トと半飽和炭酸ナトリウム水溶液（200mL）を加える。
その二相混合物を約１時間回転蒸発器上で激しく渦巻き
を起して流す。生成したすべての固体を半融ガラス漏斗
上で濾過することにより採集して生成物を提供する。有
機相を水で洗ってから、真空で一定重量になるまで乾燥
させて生成を得る。

DAla−Ｄ−β−Nal−Ala−Trp−Ｄ−Phe−Lys−NH₂、35 ヘキサペプチド、ベンジルオキシカルボニル−DAla−
Ｄ−βNal−Ala−Trp−Ｄ−Phe−Lys−（Boc）−NH₂（3
4、1.02ミリモル）を、トリフルオロ酢酸（30mL）、ジ
メチルスルフィド（14mL）、1,2−エタンジオール（7m
L）およびアニソール（2.2mL）のメチレンクロリド（15
mL）中の室温溶液に加える。その均一な反応混合物を15
分間撹拌させる。この時間の後、無水エーテル（450m
L）を加えて粗製生物活性ペプチド生成物35の沈殿を生
じさせる。この生成物を半融ガラス漏斗上の濾過または
デカンテーションにより単離する。その結果得られる生
成物を水に溶解させてから凍結乾燥する。凍結乾燥した
生成物はさらに中圧クロマトグラフィにより、リクロプ
レプ（Lichroprep）RP−18カラム充填剤（Ｃ−18、25
−40nm、不規則メッシュ）を含む26×460mmガラスカラ
ム上で精製することができる。ペプチドを水溶液として
注入した後、カラムは０〜25％メタノールの浅い勾配で
毎分9mLの流速において５−20時間、それから25〜55％
メタノールの勾配により約48時間に亘って溶離される。
その勾配のメタノール濃度は次に毎時２％の割合で増加
される。溶離の間、溶媒組成の残りは0.2％トリフルオ
ロ酢酸を含む水から成っている。生成物（35）はHPLCに
より同定され、そして適当な溶出容積の濃度により単離
される。

本発明はその特に好ましい実施態様に関して詳細に説
明された。しかし、当業者がこの開示を考察する際に本
発明の精神と範囲の内で変更および変形をなし得ること
は認識されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 7/06 A61K 38/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式、〔上式中、A₁は、Gly,DAla,β−Ala,His,Ser,Met,Pro,S
ar,Ava,Aib,N−低級アルキルアミノカルボン酸、N,N−
ビス−低級アルキルアミノカルボン酸、アゾールカルボ
ン酸または低級アルキルアミノカルボン酸であり（前記
低級アルキル基は２〜約10の直鎖炭素原子から成る）、
A₂はDTrp、Ｄ^βNal、Ｄ−４−Ｙ−Phe−または５−Ｙ−
Ｄ−Trpであり、（ＹはＯ、Cl、Br、ＦまたはＨであ
る）、 A₅はA₃−A₄−Ａ_５′、A₃−Ａ_５′、A₄−Ａ_５′、またＡ
_５′であり、上式中、（ａ）A₃はAla、Gly、DAla、ProまたはdesAlaであり、（ｂ）A₄はAla、Gly、DAla、Pro,線状低級アルキルアミ
ノカルボン酸またはdesAlaであり、および（ｃ）Ａ_５′はLys（ε−R₁,R₂）−Z,Orn（δ−R₁,R₂）
−Z,NH（CH₂）_xN（R₃,R₄）であり、A₁がHisでない場合
には、Ａ_５′またはLys−Ｚ、Orn−ＺまたはArg−Ｚで
あることができ；上式中R₁は線状低級アルキル基または
Ｈ原子であり、R₂は線状低級アルキル基またはＨ原子で
あるが、R₁がＨであるときはR₂はH₂でなく、またR₂がＨ
であるときはR₁はＨではなく;R₃は線状低級アルキル基
またはＨ原子であり、R₄は線状低級アルキル基またはＨ
原子であり;ZはNH（線状低級アルキル基）、Ｎ（線状低
級アルキル基）_２、Ｏ−（線状低級アルキル基）、NH₂
またはOHであり；その場合に線状低級アルキル基とは低
級アルキル基アルキルと定義され;xは２〜15であり； C₁はAlaであり、 C₂はTrp、PheまたはChxAlaであり、 C₃はDPhe、DPalまたはDChxAlaである〕のペプチドおよび前記ペプチドの有機または無機の付加
塩。
【請求項２】A₁はGly、DAlaまたはHisである請求項１に
記載のペプチド。
【請求項３】A₁はDAlaである請求項１に記載のペプチ
ド。
【請求項４】A₂はDTrpまたはＤ^βNalである請求項１に
記載のペプチド。
【請求項５】A₂はＤ^βNalである請求項１に記載のペプ
チド。
【請求項６】A₅はＡ_５′である請求項１、２、３、４ま
たは５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】C₂はTrpまたはPheである請求項１、２、
３、４または５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項８】C₃はDPheである請求項１、２、３、４、
５、６または７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項９】C₂はTrpである請求項７に記載のペプチ
ド。
【請求項１０】式を有する請求項１に記載のペプチドおよびその有機また
は無機の付加塩。
【請求項１１】請求項１、６、７、８、９または10のい
ずれか１項に記載のペプチドの少なくとも１種の有効量
および医薬として許容される担体または希釈剤から成
る、動物における成長ホルモンレベルの放出を促進する
ための医薬組成物。
【請求項１２】成長ホルモン放出ホルモン受容体におい
て作動薬として作用するかまたはソマトスタチンの効果
を抑制する第２の化合物をさらに含む請求項11に記載の
医薬組成物。
【請求項１３】一般式を有する請求項６に記載のペプチドおよびその有機また
は無機の付加塩。