NO314695B1 - Peptider med veksthormonfrigjörende aktivitet, farmasöytiske sammensetninger inneholdende disse, fremgangsmåter for fremstilling oganvendelse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye peptidforbindelser og farmasøytiske sammensetninger inneholdende disse som fremmer frigjøringen av veksthormon når de hlir administrert til dyr, fortrinnsvis mennesker. Videre vedrører foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for fremstilling av slike forbindelser og anvendelse av forbindelsene for fremstilling av medikamenter.

Forhøyning av veksthormon (GH)-nivåene i dyr, for eksempel pattedyr innbefattet mennesker ved administrering av GH-frigjørende forbindelser kan føre til økt kroppsvekt og økt melkeproduksjon dersom tilstrekkelig forhøyede GH-nivåer oppstår ved administrering. Det er videre kjent at forhøyning av veksthormonnivåene hos pattedyr og mennesker kan oppnås ved anvendelse av kjente veksthormonfrigjørende midler, så som naturlig forekommende veksthormonfrigjørende hormoner.

Forhøyning av veksthormonnivåene hos pattedyr kan også bli oppnådd ved å anvende veksthormonfrigjørende peptider og noen av disse er tidligere blitt beskrevet, for eksempel i US-PS 4.223.019, US-PS 4.223.020, US-PS 4.223.021, US-PS 4.224.316, US-PS 4.226.857, US-PS 4.228.155, US-PS 4.228.156, US-PS 4.228.157, US-PS 4.228.158, US-PS 4.410.512, US-PS 4.410.513. Peptider med veksthormonfrigjørende aktivitet er også blitt beskrevet i US 4.880.777, WO 8.910.933 og EP 0,434,675, men alle dise peptider skiller seg vesentlig fra peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Antistoffer mot endogen veksthormon frigjørende inhibitor, somatostatin (SEIF) er også blitt anvendt for å forårsake forhøyede GH nivåer. I sistnevnte eksempel blir veksthormon nivåene forhøyet ved å fjerne det endogene GH-frigjørings inhibitoren (SRIF) før den når hypofysen hvor den inhiberer frigjøringen av GH.

Hver av disse metodene for å fremme forhøyning av veksthormon nivåene involverer materialer som er kostbare å syntetisere og/eller isolere i tilstrekkelig renhet for administrering til et måldyr. Enkle polypeptider med kort kjede og lav molekylvekt som er relativt billige å fremstille og som har evnen til å fremme frigjøringen av veksthormon kan være ønskelig på grunn av at de lett og billig kan bli fremstilt og lett modifisert kjemisk og/eller fysisk samt lett renset og formulert. Disse har også gode transportegenskaper.

Til tross for at noen kortkjedede polypeptider som kan fremme frigjøringen og forhøyningen av veksthormonnivåene i blodet er kjent, så som His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NItø som beskrevet i US-PS 4.410.512, er det viktig å kunne skreddersy polypeptidene av forskjellige grunner, så som avlevering, bio-absorbansen, øket retensjonstid osv. Aminosyreforandringer ved visse posisjoner kan derimot ha dramatiske virkninger på evnen som kortkjedet peptid har når det gjelder å fremme frigjøringen av et veksthormon.

Det bør være ønskelig å ha forskjellige kortkjedede polypeptider som kan fremme frigjøringen og forhøyning av veksthormonnivåene i blodet til dyrene, spesielt i mennesker. Det bør også være nyttig å kunne anvende slike polypeptider for å fremme frigjøringen og/eller forhøyning av veksthormonnivåene i blodet til dyr og mennesker.

Det er også ønskelig å tilveiebringe fremgangsmåte for å fremme frigjøringen og/eller forhøyningen av veksthormonnivåene i blodet til dyr ved anvendelse av slike kortkjedede polypeptider.

Her i dokumentet anvendes betegnelsen kortkjedede polypeptider og peptider om hverandre.

Foreliggende oppfinnelse angår således et peptid, kjennetegnet ved at det har formelen

Al~^2~^la-C2"C3"A5' nvor

Aj er Gly, DAla, e-Ala, Sar, Ava, Aib, en N-C2-Ciq rettkjedet alkylamino-karboksylsyre, en N«N-bis-Cg-C^g rettkjedet aminokarboksylsyre, en azolkarboksylsyre eller en C2~ c10 rettkjedet amino-karbokylsyre, hvor

A2 er DTrp, D^Nal, D-4-Y-Phe- eller 5-Y-D-Trp, hvor Y er OH, Cl, Br, F eller H.

Ag er A3-A4-A5, A3-A5, <A>4-A5 eller A5,

hvor

(a) A3 er Ala, Gly, DAla, Pro eller desAla,

(b) A4 er Ala, Gly, DAla, Pro, en Cg-C^Q<r>ettkjedet

alkylamlno-karboksylsyre eller desAla, og

(c) A5 er Lys {c-RlfR2)-Z, Orn (5-E1(R2)-Z, NH(CH2)XN(R3,R4) Lys-Z, Orn-Z eller Arg-Z,

hvor R^ er en Cg-C^j rettkjedet alkylgruppe eller et H-atom, R2 er en C2-C^q rettkjedet alkylgruppe aller H-atom, men E^ og E2 er ikke samtidig H, R3 er en C2-C-^q rettkjedet akylgruppe eller et H-atom, E4 er en C2-Ciq rettkjedet alkylgruppe eller H-atom, Z er NH(C2-Cio rettkjedet alkylgruppe), N(2-<C>^q rettkjedet alkylgruppe)2, 0-(C2-Ciq rettkjedet alkylbruppe), NH2 eller OH, x er 2 til og med 15, C2'er Trp, Phe eller ChxAla,

C3 er DPhe, DPal eller DChxAla og

organiske eller uorganiske addisjonssalter av hvilke som helst av nevnte polypeptider. Polypeptidet er fortrinnsvis A^-A2-Ala-C2-DPhe-A4, mer foretrukket er det at polypeptidet er Aj-Ag-Ala-Trp-DPhe-Ag.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en farmasøytisk sammensetning for å fremme frigjøringen av veksthormonnivåene hos dyr, kjennetegnet ved at den omfatter en effektiv mengde av minst ett av peptidene Ifølge oppfinnelsen og en farma-søytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel og anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et medikament for forebyggelse av cachexi hos cancerpasienter. Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge oppfinnelen kjennetegnet ved å koble ovennevnte aminosyrer eller aminosyrederivater for å danne forbindelsen.

Foretrukne utførelsesformer er angitt i underkravene.

Figur 1 er en serie av grafer som viser humane veksthormonnivåer i serum over tid.

Aminosyreresidie forkortelsene som blir anvendt er i henhold til standardpeptid nomenklatur:

Gly - Glycin

Tyr = L-Tyrosin

Ile = L-isoleucin

Glu - L-glutaminsyre

Thr = L-Threonin

Phe = L-fenylalanin

Ala = L-Alanin

Lys = L-lysin

Asp = L-asparginsyre

Cys - L-cystein

Arg = L-arginin

Ava = aminovalerinsyre

Alb amlnolsosmøresyre

Gin = L-glutamin

Pro = L-prolin

Leu L-leucin

Met = L-methionin

Ser = L-serin

Asn = L-asparagin

His L-histidin

Trp - L-tryptophan

Val = L^valin

DOPA = 3,4-dihydroksyfenylalanin Met(O) = methionin sulfoksid

Abu = cx-aminosmørsyre

iLys = N<c->isopropyl-L-lysin 4-Abu - 4-aminosmørsyre Orn = L-ornithin

D<a>Nal = a-naftyl-D-alanin

D^<J>fal - 3-naftyl-D-alanin

Sar = Sarcosin

LArg = homoarginin

Chx = sykloheksyl

ChxAla - L-sykloheksylalanin

DChxAla = D-sykloheksylalanin

IMA = N^-imidazoleddiksyre

Tcc - 1 , 2 , 3 , 4 -1e t rahydro-7 - carol in-3-karboksylsyre

Tic = 1 , 2 , 3 , 4-tetrahydroisoquinolin-3-karboksylsyre

Tip 4,5,6,7-tetrahydro-lH-imidazo[e]-6-karboksylsyre

ot,-yABU = alfa, gammaaminosmørsyre DPal = D-3-pyridylalanin

Alle aminosyreforkortelsene med tre bokstaver med "D" forut indikerer D-konfigurasjonen til aminosyreresidiet og glycin blir betraktet å være innbefattet i betegnelsen "naturlig forekommende L-aminosyrer".

I disse kortkjedede polypeptidene er visse posisjoner mer tolerante for forandringer enn andre uten negativt å påvirke peptidets evne til å fremme frigjøringen og/eller for-føyningen av veksthormonnivåene i blodet til dyrene. For eksempel A5 posisjonen. Andre posisjoner er mindre tolerante når det gjelder slike forandringer. For eksempel de midtre aminosyreresidiene Ala, Trp, DPhe betegnet henholdsvis C^, Cg og C3. Det var for eksempel tidligere antatt at Aj og Ag bør være henholdsvis L og D form og at Trp og DPhe også bør være i L og D form som utgjør en LD LD serie. Det er derimot oppdaget at LD LD sekvensen kan være en DD LD sekvens. Det ble derfor overraskende oppdaget at et polypeptid med formel Al-A2"t'l"^2-^3~A5 nvor Ai 1 A2» A5 er som beskrevet ovenfor og Ci er Ala, Cg er Trp, Phe og ChxAla og C3 er DPhe, Dpal eller DChxAla, vil fremme frigjøringen og/eller forhøyning av veksthormonnivåene i dyr.

Det er foretrukket at Cg er Trp eller Phe, mer foretrukket er det at C2 er Trp.

C3 er fortrinnsvis DPhe. Når Cg er ChxAla er C3 fortrinnsvis DPhe. Når C3 er DPal er Z fortrinnsvis OH.

Den økte fleksibiliteten assosiert med valg av basiske , nøytrale eller sure aminosyreresidier og L og D formene som kan bli anvendt for aminosyrene A^, Ag, A3, A4, Ag, Cg og C3 gir en stor grad av kontroll over de fysiokjemiske egenskapene til det ønskede peptidet.

Til tross for at DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 og DAla-DeNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHg har lignende GH frigjørende aktivitet kan Phe substitusjonen med Trp øke den kjemiske stabiliteten til DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHg på grunn av at Trp er mer følsom over oksidasjon enn Phe. Phe for Trp substitusjonen gir også mer hydrofobisitet til peptidet og denne fysiske-kjemiske egenskapen som beskrevet nedenfor kan være fordelaktig når det gjelder å forsterke oral, transdermal og/eller nasal absorpsjon samt formulering av peptidet. EF50 (5096 effektiv dose) i en rottecelle hista-minanalyse av DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHg og DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHg er like, dvs. 30,5 ± 0,5 og 30,8 ± 0,3 jig/ml og begge er en forbedring i forhold til histamin aktiviteten til Ala-His-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHg som var 11,0 ± 1,0 jig/ml. Peptider med mindre histaminf rigjørende aktivitet (høyere EDgø) kan være klinisk mer effektiv på grunn av at de kan produsere mindre negative lokale reaksjon ved peptidinjeksjonsstedet og/eller kan med mindre sann-synlighet produsere systemiske antigene negative kliniske virkninger.

Fleksibiliteten tilveiebringer også viktige fordeler for formuleringen og leveringen av det ønskede peptidet til en ny art. Disse forandringene kan også forbedre den orale absorpsjonen samt metabolismen og utskillelsen av peptidene. For eksempel er Ala-Hi s-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHg (GHRP-1) mer effektiv enn Ala-His-DTrp-Ala-Trp-Dhe-Lys-NHg når det gjelder veksthormon frigjøringsevnen i mennesker. Derimot er DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2) mer effektiv enn GHRP-1 når gitt oralt. Figur 1 utviser veksthormonnivåer i serum i normale yngre menn over tid etter administrering av 300 pg/kg GHRP-1 til 40 individer i den grafiske frem-stillingen til venstre (o), 600 pg/kg GHRP-1 til 39 individer i grafen i midten (a) og 100 pg/kg GHRP-2 til 11 individer i

(□) grafen til høyre (Q). I disse studiene ble GHRF administrert først i 20 ml H20 etterfulgt øyeblikkelig av 100 ml H20 til normale yngre menn med en gjennomsnittsalder på omtrent 25. Blodet ble tatt som registrert på skjemaet. GH ble målt ved radioimmunanalyse.

Det er også ventet at på grunn av at det i disse peptidene kan eliminere aromatiske sidekjeder ved visse posisjoner hvor de tidligere var antatt å være nødvendige, og at et D-aminosyreresidie bør være mer biologisk beskyttet enn re-formen, kan større beskyttelse og mindre vekter for noen av peptidene bli anvendt for å ytterligere skreddersy polypeptider for å muliggjøre egenskaper så som nasal, oral, transdermal absorpsjon, in vivo stabilitet osv.

Andeler av R^, R2, R3, R4 og Z kan også bli variert for derved å tilveiebringe ytterligere kontroll over de fysiokjemiske egenskapene til den ønskede forbindelsen. Man kan derfor oppnå forbedret levering av et peptid til en bestemt reseptor og i bestemte arter.

Foretrukne veksthormonfrigjørende forbindelser anvendt ved utførelse av foreliggende oppfinnelse er:

Aj-Ag-Ala-Trp-DPhe-Ag,

eller organiske eller uorganiske addisjonssalter av hvilke som helst av polypeptidene, hvor A^, A2 og Ag er som definert ovenfor.

I en foretrukket utførelsesform har det veksthormonfri-gjørende peptidet anvendt ved utførelse av foreliggende oppfinnelse formelen:

DAla-A2-Ala-Trp-DPhe-Ag,

og organiske eller uorganiske addisjonssalter derav. Foretrukne medlemmer av denne gruppen av forbindelser har formelen: DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2

Dala-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2

DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys(c-iPr)NH2

DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2

DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2,

N<H>2(C<H>2)5CO-DB<->Nal-Ala-Trp-D-Phe-NH(CH2)sNH2,

samt organiske eller uorganiske addisjonssalter derav.

Disse forbindelsene er for tiden de mest foretrukne på grunn av at disse kortkjedede polypeptidene er billigere å syntetisere og disse spesifikke forbindelsene er blitt vist å ha et høyere potensnivå når det gjelder å fremme økningen i serumveksthormon nivåene.

Andre foretrukne vekstfrigjørende peptider har formelen Aj-Ag-Ala-Phe-DPhe-Ag. Foretrukne medlemmer av denne gruppen av forbindelser innbefatter de hvor A^ er Na IMA, ocyABTJ, DAla, His, Ala, His eller oryABU, A2 er D^Nal, eller

DPhe og Ag er LysNH2, LysNH2, arg NH2, NH-Chx-NH2

(1,4 Chx diamin), eller Lys EA. For eksempel NocIMA-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2,

a,-YABU-D<e>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2,

Dala-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH2.

<p>Ala-His-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2,

NaIMA-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH2,

a,-yABTJ-D^Nal-Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH2 ,

DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-Lys EA,

DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-ArgNH2, samt organiske eller uorganiske addisjonssalter derav.

En annen utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen innbefatter polypeptider med formel Aj-A2-C^-C2-C3-A5 hvor C^ er Ala.

C2 er Trp, Phe eller ChxAla, C3 er DPhe eller DChxAla, Aj er fortrinnsvis DAla. A2 er fortrinnsvis D^Nal. For eksempel DAla-D<p>Nal-Ala-ChxAla-DPhe-LysNH2,

DAla,D<p>Bal-Ala-Phe-DChxAla-LysNH2, og

DAla-D<p>Nal-Ala-ChxAla-DChxAla-LysNH2 samt organiske eller uorganiske addisjonssalter derav.

Forbindelsene beskrevet heri er vanligvis lett å syntetisere, er effektive når det gjelder å fremme en økning i serum veksthormon nivåene og er -ønskelige for kommersiell skala produksjon og anvendelse. I tillegg kan disse forbindelsene være fordelaktige for de de har fysiologiske egenskaper som er ønskelige for effektiv levering av slike polypeptid-forblndelser til mange forskjellige dyrearter på grunn av fleksibiliteten som blir gjort mulig av de forskjellige substitusjonene ved de mange posisjonene til polypeptidforbindelsene ved valg av den polare, nøytrale eller ikke-polare naturen til C-terminalen og senterdelene til disse polypeptidforbindelsene slik at de er kompatible med den ønskede leveringsmetoden oralt, nasalt, kontinuerlig levering ved anvendelse av romlige-kjemiske/mekaniske leverings-metoder.

Disse peptidene kan bli anvendt terapeutisk for en hvilken som helst anvendelse hvor veksthormonet kan bli anvendt som ved behandling av hypothalamisk hypofyse dvergform, osteo-porose, brannsår og nyresvikt for akutt anvendelse, for ikke-union benfraktur og for å fremme leging av sår. De kan i tillegg bli anvendt for å fremme leging etter kirurgi og akutte/kroniske reduserende medisinske sykdommer. Fordelaktige anaboliske virkninger forekommer på hus, muskel og ben i relasjon til aldringsprosessen med en samtidig reduksjon i kroppsfett. Behandling av cancerpasienter med disse peptidene er også innbefattet for eksempel for forhindring og/eller reduksjon av cachexi i cancerpasienter. Disse terapeutiske anvendelsene blir oppnådd ved anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av peptidet. En slik mengde er det som er nødvendig for å fremme frigjøringen av serum vekst hormon nivåene som angitt nedenfor.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen kan også bli anvendt for å forsterke blod GH nivåene i dyr, forsterke melke-produksjonen i kuer, forsterke kroppsvekten i dyr/pattedyr (for eksempel mennesker, sauer, boviner og svin), samt fisk, fjærfe, andre virveldyr og krepsdyr, og øket ull og/eller pelsproduksjon i pattedyr. Mengden av kroppsvekt er avhengig av kjønn og alder til dyreartene, mengde og identiteten til den vekst hormon frigjørende forbindelsen som blir administrert, administrasjonsveien og lignende. Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen øker serum GH i mennesker, forsterker kroppsveksten i barn lav vekst, reduserer kroppsfett og forbedrer proteinmetabolismen i utvalgte dyr, forbedrer proteinmetabolismen 1 huden, musklene, ben og øker kroppsfettet til eldre personer, spesielt når GH mangel eksisterer.

Disse peptidene er også nyttige for å forbedre serum lipid mønsterete i mennesker ved å redusere i serumet mengden av serumkolesterol og lav tetthet lipoprotein og øke i serumet i mengden av høy tetthet lipoprotein.

De nye polypeptidforbindelsene ifølge denne oppfinnelsen kan bli syntetisert ifølge de vanlige metodene for oppløsning og fast fase peptidkjemi eller ved klassiske metoder kjent innenfor fagområdet.

For peptidamider er fast-fase syntesen foretrukket påbegynt fra den C-terminale enden av peptidet. Et egnet utgangs-materiale kan blant annet bli fremstilt ved kobling av den nødvendig beskyttede alfa-amino syren til en klormetylert harpiks, en hydroksymetylharpiks, en benzhydrylamin (BHA) harpiks eller et para-metyl-benzhydrylamin (p-Me-BHA) harpiks. En slik klormetylharpiks blir solgt under varemerket BIOBEADS SX-1 av Bio Rad Laboratories, Richmond, California. Fremstilling av hydroksymetylharpiksen er beskrevet av Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966). BHA harpiksen er blitt beskrevet av Pietta og Marshall, Chem. Comm. 650 (1970) og er kommersielt tilgjengelig fra Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, California.

Etter den Innledende koblingen kan den alfa-amino beskyttende gruppen bli fjernet ved valg av sure reagenser. Inkludert trlfluoreddiksyre (TFA) eller saltsyre (HC1) oppløsninger i uorganiske oppløsningsmldler ved romtemperatur. Etter fjerning av den alfa-amino beskyttende gruppen kan de gjenværende beskyttende gruppen kan de gjenværende beskyttede aminosyrene bli koblet trinnvis i ønsket rekkefølge. Hver beskyttet aminosyre kan generelt bli omsatt i omtrent et 3-ganger overskudd ved anvendelse av en hensiktsmessig karboksylgruppe aktivator så som disykloheksylkarbodiimid (DCC) eller diisopropylkarbodiimid (DIC) i oppløsning, for eksempel i metylenklorid (CHgClg) eller dimetylformamid (DMF) og blandinger derav.

Etter at den ønskede aminosyresekvensen er blitt fullført kan det ønskede peptidet bli spaltet fra benzhydrylamin harpiksbæreren ved behandling med et reagens' så som hydrogenfluorid (HF) som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men også spalter de mest vanlige anvendte sidekjede beskyttende gruppene. Når en klormetylharpiks eller hydroksymetylharpiks blir anvendt resulterer HF behandling i dannelsen av den frie peptidsyren. Peptidalkylamider og estere kan derimot lett bli fremstilt fra disse peptidharpiksene ved spaltning med et egnet alkylamin, dialkylamin eller diaminoalkan eller transforestring med en alkohol ved høye pH nivåer.

Fast-fase prosedyren diskutert ovenfor er velkjent innenfor fagområdet og er blitt beskrevet av Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis: Second Edn. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984).

Noen av de velkjente oppløsningsmetodene som kan bli anvendt for å syntetisere peptiddelene ifølge foreliggende oppfinnelse er angitt i Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976.

Det antas at peptidene vil fortrinnsvis bli syntetisert ved en oppløsningsfase metode som innbefatter kondensasjonsreaksjon av minst to peptidfragmenter.

Denne metoden omfatter kondensering av et peptidfragment X-Aj-Y med peptidfragmentet U-V-W, hvor alle aminosyreside-kjedene unntatt Aj er nøytrale eller beskyttet, og hvor X er Prot. hvor Prot. er en N-terminal beskyttende gruppe, Y er A2-Q, Ala-A2-Q, A2-Ala-Q, Ala-A2-Ala-Q,

A2-Ala-Trp-Q, Ala-A2-Ala-Trp-Q, Ala-Q eller Q, hvor når Y er 0, er TJ J-A2-Ala-Trp, eller J-Ala-A2-Ala-Trp. Når Y er Ala-Q er U J-A2-Ala-Trp. Når Y er A2-Q eller Ala-A2-Q er U J-Ala-Trp. Når Y er A2-Ala-Q eller Ala-A2-A3-Q er U

J-Trp. Når Y er A2-Ala-Trp-Q eller Ala-A2-Ala-Trp-Q er U J. V er A5 eller Z. Når V er Ag er W Z. Når V er Z er W ikke til stede. Aj, A^ Ag og Z er som definert heri.

Q er karboksyterminalen til et peptidfragment og er -OR<3 >eller -M, hvor M er en del som kan bli erstattet med en nitrogen-inneholdende nukleofil og R<3> er H, en alkylgruppe inneholdende 1 til omtrent 10 karbonatomer, en arylgruppe med fra 6 til omtrent 12 karbonatomer eller en arylalkylgruppe med fra 7 til omtrent 12 karbonatomer, J representerer aminterminusen til det angitte fragmentet og er få eller en beskyttende gruppe, som ikke hindrer koblIngsreaksjon, for eksempel benzyl.

Deretter fjernes de beskyttende gruppene. Alternativt kan man anvende det beskyttede peptidet dannet på denne måten for ytterligere kondensasjoner for å danne et større peptid.

Denne foretrukne metoden er mer fullstendig beskrevet i US-patentsøknad serie nr. 558.121 Inngitt juli 24, 1990, av John C. Hubbs og S.W. Parker, "Process for Synthesizing Peptides", som er inkorporert heri som referanse og publisert som W09201709.

Peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i en fremgangsmåte for å fremme frigjøringen og/eller forhøyning av veksthormonnivåene i blodet til et dyr gitt. Denne metoden for å fremme frigjøringen og/eller økning av veksthormon nivåene kan også bli anvendt for teraeutisk behandling av ovennevnte sykdommer. Nevnte metoder omfatter administrering til et dyr en effektiv dose av minst av de ovennevnte polypeptidene. I en utførelsesform blir denne metoden anvendt i dyr som er forskjellige fra mennesker.

Forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen kan bli administrert ved oral, parenteral (intramuskulær (l.m.), intraperitoneal (i.p.), Intravenøs (i.v.) eller subkutan (s.c.) Injeksjon), nasalt, vaginalt, rektalt eller sublinguale administrasjons-måter samt intrapulmonær inhalasjon og kan bli formulert i doseformer hensiktsmessig for hver administrasjonscel. Parenteral administrasjons er foretrukket.

Faste doseformer for oral administrasjon Innebefatter kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. Slike faste doseformer blir den aktive forbindelsen blandet med minst en inert bærer så som sukrose, laktose eller stivelse. Slike doseformer kan også omfatte, som ved normal praksis, ytterligere forbindelser forskjellige fra inerte oppløsnings-midler, for eksempel smøremidler så som magneslumstearat. Når det gjelder kapsler, tabletter og piller kan doseformene også omfatte buffringsmidler. Tabletter og piller kan i tillegg bli fremstilt med spiselige belegg.

Væskedoseformer for oral administrasjon innbefatter emulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, siruper, elixirer Inneholdende inerte fortynningsmidler som vanligvis blir anvendt innenfor fagområdet, så som vann. Bortsett fra slike inerte fortynningsmidler kan sammensetningene også innbefatte adjuvants, så som fuktemidler, emulgerings- og suspenderings-midler og søtningsstoffer, smaksstoffer og luktestoffer. Preparater ifølge denne oppfinnelsen for parenteral administrering innbefatter sterile vandige eller ikke-vandige oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner. Eksempler på ikke-vandige oppløsningsmidler eller bærere er propylen-glykol, polyetylenglykol, vegetabilske oljer, så som olivenolje og maisolje, gelatin og injiserbare organiske estere så som etyloleat. Slike doseformer kan også inneholde adjuvants så som konserveringsmidler, fuktemidler, emul-geringsmldler og dispergeringsmidler. De kan for eksempel bli sterilisert ved filtrering gjennom et bakterle-tilbake-holdende filter, ved inkorporering av steriliserende midler inn i sammensetningene, ved bestrålnlng av sammensetningene eller ved oppvarming av sammensetningene. De kan også bli fremstilt i et medium av sterilt vann eller et annet sterilt injiserbart medium rett før bruk.

De nye forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er også nyttige når de blir administrert i kombinasjon med veksthormon frigjørende hormon (dvs. naturlig forekommende veksthormon frigjørende hormon, analoger og funksjonelle ekvivalenter derav), samt i kombinasjon med andre forbindelser som fremmer frigjøringen av veksthormon, for eksempel veksthormon frigjørende peptider (se US-PS 4.880.778 som er inkorporert heri som referanse), for eksempel acetylcholinesterase inhibitorer, p<->adrenergiske blokkeringsmidler, a-<2>adrenerglske blokkeringsmidler osv. Slike kombinasjoner representerer en spesielt foretrukket metode for å administrere de veksthormon frigjørende peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse på grunn av at kombinasjonen fremmer frigjøringen av mye mer veksthormon enn det som fremkommer ved summering av de Individuelle responsene for hver komponent av kombinasjonen, dvs. kombinasjonen gir en synergistisk respons relativt til den Individuelle komponenten. Ytterligere detaljer på administrering av kombinasjonene av veksthormon frigjørende peptider er beskrevet i ovennevnte patent. Slike synergistiske forbindelser er fortrinnsvis forbindelser som virker som en agonist på veksthormon frigjørende hormonreseptor eller som inhiberer virkningen av somatostatin. Synergismen kan være binær, dvs. foreliggende forbindelse ' og en av de synergistiske forbindelsene eller Involverer mer enn en synergistisk forbindelse .

Komblansjoner som effektivt forårsaker frigjøring og forhøying av nivået av veksthormon i blodet til et dyr så som mennesker omfatter en effektiv mengde polypeptider valgt fra de krevde polypeptidene og minst en av følgende grupper: gruppe 1 polypeptider eller en forbindelse som fremmer frigjøringen av veksthormoner for eksempel gruppe 2 polypeptider, hvor gruppe 1 polypeptider blir valgt fra hvilke som helst av de naturlig forekommende veksthormon frigjørende hormoner og funksjonelle ekvivalenter derav, hvori nevnte polypeptider virker på veksthormon frigjørende hormonreseptoren til pattedyr og andre virveldyr og krepsdyr. Gruppe 2 polypeptider blir valgt fra hvilke som helst av polypeptidene med struktur:

Tyr-DArg-Phe-NH2»

Tyr-DAla-Phe-NH2 ,

Tyr-DArg (N02) - Phe-NH2,

Tyr-DMet (0)-Phe-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Gly-NE2,

Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2,

Phe-DArg-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DAla-Gly-Phe-NH2,

Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2,

Tyr-DArg(N02 )-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DMet (0)-Phe-Gly-NH2,

(NlWe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Gly-ol,

Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Sar-ol

Tyr-DAla-Phe-Sar-ol

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH2,

Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(0)-ol,

Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(0)-ol,

Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2,

Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Gly-ol,

Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol,

Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH2,

Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2,

Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (syklisk disulfid), Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (fri dithiol),

Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (syklisk disulfid), Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (fri dithiol),

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,

Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2,

Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2, og

organiske eller uorganiske addisjonssalter av nevnte polypeptider fra gruppe 2 hvor nevnte kombinasjon blir administrert i et forhold slik at nevnte kombinasjon effektivt forårsaker den synergistiske frigjøringen og forhøyning av veksthormonet i blodet til slike dyr.

Andre forbindelser som fremmer frigjøringen av veksthormonene er kjent for fagfolk og Innbefatter acetylcholinesterase inhibitorer, p<->adrenegeniske blokkeringsmidler og a<2->adrenergiske agonister.

I en foretrukket utførelsesform anvendes naturlig forekommende veksthormonfrigjørende hormoner og funksjons ekvivalenter derav sammen med forbindelser som fremmer frigjøringer av veksthormoner sammen med peptider ifølge foreliggende oppfinnelse.

For eksempel gruppe 1 og gruppe 2 forbindelser sammen med peptider ifølge foreliggende oppfinnelse og et annet eksempel er gruppe 1 forbindelser eller p<->adrenergiske blokkeringsmidler sammen med foreliggende peptider.

Mengden av polypeptid eller kombinasjon av polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse som blir administrert vil variere avhengig av mange faktorer, for eksempel det bestemte dyret som blir behandlet, alderen og kjønnet, ønsket terapeutisk effekt, administrasjonsvei og hvilket polypeptid eller kombinasjon eller kombinasjon av polypeptider som blir anvendt. I alle tilfeller blir det derimot anvendt en dose som effektivt (terapeutisk effektiv mengde) fremmer fri-gjøringen og forhøyningen av veksthormonnivået i blodet til mottakerdyr. Dette dosenivået faller vanligvis inn under området på mellom omtrent 0,1 ug til 10 ug av det totale polypeptidet pr. kg kroppsvekt. Den foretrukne mengden kan lett bli bestemt empirisk av fagfolk Innenfor området basert på foreliggende beskrivelse.

For eksempel i mennesker når administrasjonsmåten er I.v. faller det foretrukne dosenivået i området på omtrent 0,1 ug til 10 ug av totalt polypeptid pr. kg kroppsvekt, mer foretrukket er omtrent 0,5 ug til 5 ug av totalt polypeptid pr. kg kroppsvekt, ytterligere mer foretrukket er omtrent .7 ug omtrent 3,0 ug pr. kg kroppsvekt. Når kombinasjoner av veksthormon frigjørende peptider blir anvendt kan lavere mengder av de for tiden beskrevne peptidene bli anvendt. For eksempel kombinering av det beskrevne peptidet med for eksempel en synergistisk forbindelse i gruppe I ifølge US-PS 4.880.778 så som GHRH, et foretrukket område er omtrent 0,1 ug til otmrent 5 ug av den beskrevne forbindelsen pr. kr kroppsvekt og omtrent .5 ug til omtrent 15.0 ug av den synergistiske forbindelsen (for eksempel GHRH) og mer foretrukket er omtrent 0,1 ug til omtrent 3 ug av foreliggende forbindelse med omtrent 1,0 ug til omtrent 3,0 mg av den synergistiske forbindelsen pr. kg kroppsvekt.

Når administråsjonsmåten er oral er større mengder vanligvis nødvendig. For eksempel i mennesker for oral administrasjon er dosenivået vanligvis omtrent 30 ug til omtrent 1200 ug av polypeptidet pr. kg kroppsvekt, mer foretrukket er omtrent 70 ug til omtrent 600 ug av polypeptidet pr. kg kroppsvekt, ytterligere mer foretrukket er omtrent 200 ug til omtrent 600 ug av totalt polypeptid pr. kg kroppsvekt. Kuer og griser trenger omtrent samme dosenivå som mennesker, mens rotter trenger vanligvis høyere dosenivåer. Det nøyaktige nivået kan lett bli bestemt empirisk basert på foreliggende beskrivelse.

Generelt vil administrering av kombinasjonene av veksthormon frigjørende peptider muliggjøre at lavere doser av de individuelle veksthormon frigjørende forbindelsene blir anvendt i forhold til dosenivåene som er nødvendig for individuelle veksthromon frigjørende forbindelser for å oppnå en lignende respons på grunn av den synergistiske virkningen av kombinasjonen.

Også innbefattet innefor rammen av foreliggende oppfinnelse er sammensetninger som omfatter som et aktivt ingrediens de organiske og uorganiske addisjonssaltene ifølge ovennevnte polypeptider og kombinasjoner derav, eventuelt sammen med en bærer, fortynningsmiddel, sakte frigjørende matrise eller belegg.

Organiske eller uorganiske addisjonssalter av veksthormon frigjørende forbindelser og kombinasjoner derav betraktet å være innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse innbefatter salter av slike organiske deler som acetat, trifluoracetat, oxalat, valerat, oleat, laurat, benzoat, lactat, tosylat, sitrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, naftalat og lignende og slike uorganiske deler som gruppe I (dvs. alkalimetallsalter), gruppe II (dvs. alakaliske jordart salter) ammonium og protaminsalter, sink, jern og lignende med motioner så som klorid, bromid, sulfat, fosfat og lignende, samt organiske deler referert til ovenfor. Farmasøytiske akseptable salter er foretrukket når administrering til humane individer betraktes. Slike salter innbefatter ikke-toksiske alkalimetaller, jordalkaliemetaller alkaliske metall og ammoniumsalter som vanligvis blir anvendt innen den farmasøytiske industrien Inkludert natrium, kalium, litium, kalsium, magnesium, barium, ammonium og protaminsalter som blir fremstilt ved hjelp av velkjente fremgangsmåter innenfor fagområdet. Betegnelsen innbefatter også ikke-tokslske syreaddisjonssalter som generelt blir fremstilt ved omsetning av forbindelsene ifølge denne oppfinnelsen med en egnet organiske eller uorganisk syre. Representative salter Innbefatter hydroklorld, hydrobromid, sulfat, bisulfat, acetat, oxalat, valerat, oleat, laurat, borat, benzoat, lactat, fosfat, tosylat, citrat, maleat, fumarat, succinat, tartrat, naftylat og lignende.

Oppfinnelsen vil bli ytterligere illustrert i følgende eksempler.

Eksempel 1

Syntese av veksthormon frigjørende peptider

Parametylbenzhydrylaminhydroklorid (pMe-BHA • HC1) harpiks blir plassert i en reaksjonsbeholder på en kommersiell tilgjengelig automatisert peptidsyntesemaskin. Harpiksen blir erstattet med fri amin opp til en belastning på omtrent 5 mmol pr. gram. Forbindelsene blir fremstilt ved kobling av individuelle aminosyrer begynnende ved karboksyterminusen av peptidsekvensen ved anvendelse av et hensiktsmessig akti-veringsmiddel, så som N,N'-disykloheksylkarbodlimid (DCC). Alfa aminet til de individuelle aminosyrene blir beskyttet, for eksempel, som t-butyloksykarbonylderivatet (t-Boc) og de reaktive sidekjedefunksjonalitetene blir beskyttet som beskrevet i tabell 1.

Før inkorporering av den første aminosyren blir harpiksen agitert tre ganger (omtrent ett minutt hver) ed diklormetan (CHgClg. omtrent 10 ml/g harpiks), nøytralisert med tre agiteringer (omtrent 2 minutter hver) av N.N-dlisopropyletyl-amin (DIEA) I diklormetan (10:90, omtrent 10 ml/g harpiks) og agitert tre ganger (omtrent ett minutt hver) med diklormetan (omtrent 10 ml/g harpiks). Den første og hver av de påfølg-ende aminosyrene blir koblet til harpiksen ved anvendelse av et fordannet symmetrisk anhydrid ved anvendelse av omtrent 6,0 ganger den totale mengden av reaksjonskapaslteten til harpiksen og en på egnet måte beskyttet aminosyre og omtrent 2,0 ganger den totale mengden av bindingskapasiteten til harpiksen for DIC i en hensiktsmessig mengde diklormetan. For aminosyrer med lav diklormetanoppløsellghet blir N,N-dimetylformamid (DMF) tilsatt for å oppnå en homogen oppløsning. Generelt blir det symmetriske anhydridet dannet opp til 30 minutter før innføring inn I reaksjonsbeholderen ved romtemperatur eller under. Disykloheksylurea som blir dannet ved preparering av det symmetriske anhydridet blir fjernet via tyngdefIltrering av oppløsningen inn i reaksjonsbeholderen. Progressjonen av koblingen av aminosyren til harpiksen blir vanligvis registrert via en farvetest ved anvendelse av et reagens så som ninhydrin (som reagerer med primære og sekundære aminer). Ved fullstendig kobling av den beskyttede aminosyren til harpiksen (>99#). blir den alfaamin beslyttende gruppen fjernet ved behandling med sure reagenser. Et vanlig anvendt reagens består av en oppløsning av trifluoreddiksyre (TFA) i diklormetan (33:66).

Etter at den ønskede aminosyresekvensen er blitt fullført kan det ønskede peptidet bli spaltet fra harpiksbæreren ved behandling med et reagens så som hydrogenfluorid (HF) som ikke bare spalter peptidet fra harpiksen, men som også spalter de mest anvendte side-kjede beskyttende gruppene. Når BHA eller p-Me-BHA harpisken blir anvendt resulterer HF behandling direkte i fri peptidamider. Når en aminosyre-Merrifield harpiks blir anvendt blir frie peptidalkylamider spaltet ved behandling med et hensiktsmessig amin (i dette tilfellet anvendelse av Boc-N<c->FMOC-Lys som muliggjør samtidig fjerning av FMOC gruppem).

Den fullstendige prosedyren for inkorporering av hvert individuelle aminosyreresidie på harpiksen er beskrevet I tabell 2.

Ved anvendelse av denne prosedyren ble forbindelsene beskrevet i tabellene 3, 4, 5 og 6 dannet.

Eksempel 2

In in vivo GH frigjøring i rotter

Umodene hunn Sprague-Dawley rotter ble oppnådd fra Charles River laboratories (Wilmington, MA). Etter ankomst ble de huset ved 25 "C med en 14:10 timer lang lys:mørke syklus. Water og Purina rat chow var tilgjengelig etter behov. Ungene ble oppbevart med mødrene helt til de var 21 dager gamle. 26 dager gamle rotter, 6 rotter pr. behandlingsgruppe ble bedøvt interperltonealt med 50 mg/kg pentobarbltal 20 minutter før I.v. behandling med peptidet. Normalt saltvann med 0,156 gelatin var bæreren for intravenøse (i.v.) In-jeksjoner av peptidene. De bedøvde rottene med vekt 55-65 gram ble injisert i.v. med mengden av veksthormon frigjørende forbindelser angitt i tabell 3. Injeksjonen ble utført som en 0,1 ml oppløsning inn i Jugular venen.

Alle dyrene ble ofret 10 minutter etter den endelige testinjeksjonen (se tabell 3). Kroppsblodet for bestemmelse av blod GH nivået ble samlet etter avlivningen. Etter at blodet er blitt koagulert ble det sentrifugert og serumet ble separert fra koagelen. Serumet ble oppbevart i frossen tilstand helt til prøvedagen for radioimmunoanalyse (RIA) bestemmelse av veksthormon nivåene ifølge følgende prosedyre,

som utviklet av National Dlseases (NIADDK).

Reagenser blir generelt tilsatt til RIA analyserørene ved et enkelt oppsett, ved kjøleskapstemperatur (omtrent 4'C) i følgende rekkefølge:

(a) buffer,

(b) "kald" (dvs. ikke-radioaktiv) standard eller ukjent

serumprøve som skal bli analysert,

(c) radio-iodinert veksthormon antigen og

(d) veksthormonantiserum.

Reagenstilsetningen blir generelt utført slik at det blir oppnådd en endelig RIA rørfortynning på omtrent 1:30000 (antiserum til totalt væskevolum, vol:vol).

De blandede reagensene blir deretter vanligvis inkubert ved romtemperatur (omtrent 25<*>C) i omtrent 24 timer før tilsetning av et sekundært antistoff (for eksempel geite- eller kanin anti-ape gammaglobullnserum) som blir bunder til og som forårsaker presipltering av det kompieksdannede veksthormon antiserumet. Presipiterte innhold av RIA rørene blir deretter analysert for antall tellinger i en spesifisert tidsperiode I en gamma scintillasjonsteller. En standardkurve blir dannet ved å oppføre antall radioaktive tellinger mot veksthormon (GH) nivået. GH nivåene til de ukjente blir deretter bestemt med referanse til standardkurven.

Serum GH ble målt ved RIA med reagenser fra NAtional Hormone and Pituitary Program.

Serumnivåene i tabell 3 blir registrert i ng/ml med hensyn på rotte GH standard Ifølge 0,61 International Units/mg (IU/mg). Dataene blir registrert som gjennomsnittlig +/- standardfeil til gjennomsnittet (SEM). Statistiske analyser ble utført med Studenfs t-test. I tabell 3 er de viste resultatene gjennomsnittet av studier med 6 rotter.

I tabell 3 blir forbindelsene ifølge oppfinnelsen sammen-lignet med forbindelsene som går ut over foreliggende generiske formel og fremmer frigjøringen og økningen av veksthormon nivåene i blodet til rotter som har mottatt slike forbindelser på en bra måte. Den overraskende veksthormon frigjørende aktiviteten til de foretrukne forbindelsene er meget verdifull på grunn av at et kort-kjedet, lavere molekyl vekt polypeptid med det relativt stabile og billige aminosyre D-alaninet med amino-terminusen og pentandiamin I stedenfor Lys ved C-terminusen har vist seg å være en billig metode for å forsterke veksthormon nivåene i dyr og mennesker.

Eksempel 3

In vivo GH frigjøring 1 rotter etter

oral administrering

Prosedyren ifølge eksempel 2 ble gjentatt med unntagelse av at rottene mottok de angitte dosene av forbindelsene fra Intragastriske rør. Forbindelsene som blir administrert, dosenivåene som blir anvendt og resultatene er angitt i tabell 4.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse har beholdt nyttige nivåer av GH frigjørende aktivitet etter oral administrering til rotter. Dette er verdifullt på grunn av at terapeutisk nyttighet av peptidene blir forsterket ved hjelp av denne administreringsmåten.

Eksempel 4 - In vivo GH frigøring i rotter Fremgangsmåte ifølge eksempel 2 ble gjentatt. Forbindelsene administrert, dosenivåene anvendt og resultatene er angitt i

tabellene 5 og 6.

Tabellene 5 og 6 viser at forbindelsene innenfor foreliggende formel fremmer frigjøringen og økningen av veksthormon nivåene i blodet I større grad enn forbindelsene som faller utenfor formelen.

Eksempel 5

In vivo GH frigjøring 1 mennesker

I normale humane individer ble hannkjønn med en gjennomsnittsalder på omtrent 25 administrert oralt med peptidet Ala-His-D<e>Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHBP-1) eller peptidet DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (GHRP-2). 40 individer mottok 300 ug 1 kg GHRP-1 i 20 ml H20 etterfulgt av 100 ml H20 og 39 Individer mottok 600 ug 1 kg GHRP-1 i 20 ml vann etterfulgt av 100 ml H20 og 11 individer mottok 100 ug/kg GHRP-2 i 20 ml H20, etterfulgt av 100 ml av H2G. Blod ble tappet ved periodevise intervaller som vist i figur 1 og prøver tatt ved radioimmunanalyse for veksthormon nivåene ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i eksempel 2. Resultatene er vist i figur 1. Oral administrering av 100 ug/kg GHRP-2 resulterte i høyere nivåer av veksthormon enn oral administrering av 300 ug/kg GHRP-1.

Eksempel 6

In vivo GH frigjørin<g> i rotter

Den generelle prosedyren ifølge eksempel 2 ble fulgt med unntagelse av at peptidene ble injisert subkutant i stedenfor intravenøst og ofringstiden var +15 minutter i stedenfor +10 minutter. Forbindelsene som ble administrert, dosenivåene som blir anvendt og resultatene er angitt i tabell 7.

Eksempel 7

Kondensas. 1 onsreaksjon til peptidfragmenter for å danne peptid

Generelle prosedyrer

Smeltepunktene kan bli bestemt ved anvendelse av en Thomas Hoover capillær smeltepunkt apparatur. Infrarødt (IR) spektra kan bli registrert på en Perkin-Elmer Model 137 eller et NIcolet Model 5 DX spektrofotometer og rapportert I bølge-nummeret (cm~<l>). Massespekterene (MS) kan bli oppnådd ved anvendelse av et VG analytisk Ltd. Model ZAB-1F massespektro-meter i EI (elektrn lmpact), FD (felt desorpsjon) eller FAB (fast atom mombardement) metoder. GCMS kan bli oppnådd ved anvendelse av en Finnigan 4023 GCMS utstyrt med en 30 m DB5 kapillaerkolonne (J & W Scientific) ved anvendelse av helimbærergass. Optiske rotasjoner kan bli målt ved anvendelse av et Autopool III polarimeter fra Rudolph Research.

<!>h NMR spektra kan bli oppnådd på et JEOL GX-400 NMR instrument som blir drevet ved 400 MHz eller et JEOL GX-270 NMR instrument som blir drevet ved 270 MHz. Disse instru-mentene har evne til en rutinemessig digital resolusjon på mindre enn 0,7 Hz. Kjemiske skift er ventet i ppm relativt til indre 3-(trimetylsilyl)-tetradeuteronatriumpropionat

(TSP).

Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) kan bli oppnådd ved anvendelse av et Hitachi system bestående av en L-5000 gradient kontrollør og en 655A pumpe koblet til en Vydac 201TP1010 eller 218TP1010 semipreparativ kolonne. Kombinasjoner av vann inneholdende 0,2* trifluoreddiksyre og metanol kan bl ianvendt bli anvendt som eluerende opp-løsningsmiddel. Forbindelser av interesse vil vanligvis bli eluert ved en strømningsrate på 6 ml pr. minutt med en gradient som øker den organiske komponenten ved en rate på omtrent 1-2* pr. minutt. Forbindelsene blir deretter detektert ved hensiktsmessige bølgelengder ved anvendelse av en LKB 2140 diode område UV detektor. Integrasjoner kan deretter bli oppnådd ved anvendelse av Nelson Analytical software {versjon 3.6).

Reaksjonene vil bli utført under en inert atmosfære av nitrogen eller argon dersom ikke annet er angitt. Vannfri tetrahydrofuran (THF, U.V. kvalitet) og dimetylformamid (DMF) kan bli oppnådd fra Burdick og Jackson og anvendt direkte fra flasken.

A. Preparering av tripeptidfragmentet - 2 BN~ Trp- DPhe-Lvs( Boc)- NHg

N^- benzykoksykarbonvl- f N-^- t- butoksvkarbonvl ) lysinamid. 4

Til en ICC oppløsning av karbonyldiimidazol (CDI, 2, 88.24 g, 0,544 mol) og tørr tetrahydrofuran (THF, 1500 ml), N<01->benzyloksykarbonyl-(N<c->t-butoksykarbonyl)lysln (1, 180 g, 0,474 mol) blir sakte tilsatt. Gassutviklingen blir observert i løpet av denne tilsetningen. Mens N<c->benzyloksykarbonyl-(N<c->t-butoksykarbonyl)lysinimidazolid mellomproduktet, 3, blir dannet, blir en mettet oppløsning av ammoniakk og THF (2000 ml) dannet (vannfri NH3 gass blir sendt gjennom THF ved 5-10°C). Etter at dannelsen av mellomproduktet 3 blir vurdert som fullført (når gassutviklingen har opphørt, omtrent 2 timer), blir halvparten av THF oppløsningen inneholdende 3 tilsatt til ammoniumoppløsningen. Det gjenværende av oppløsningen inneholdende 3 blir tilsatt 30 minutter senere. En kontinuerlig strømning av ammoniakkgass blir opprettholdt i løpet av tilsetningene og i ytterligere 45 minutter deretter. Ved tilsetning av to oppløsninger inneholdende 3 dannes et hvitt preslpitat. Reaksjonen blir varmet til romtemperatur og omrørt i 15 timer. Oppløsningsmiddelet blir fjernet fra oppslemningen inn i vakuum. Resten blir opp-slemmet i vann og det resulterende faste stoffet blir samlet ved vakuumfiltrering.

N-£— t- butoksykarbonyl- lysln- amid. 5 .

En oppløsning av lysinamid 4 (181.48 g, 0,479 mol) i metanol (MeOH, 1000 ml) blir tilsatt til en katalysatoroppslemning av 5* pd/C (5g( I metanol (250 1 ) under argon. Hydrogen blir boblet gjennom reaksjonsblandingen (ca. 15 minutter) og reaksjonen blir deretter omrørt under en atmosfære av hydrogen helt til HPLC analysen indikerer at reaksjonen er fullført (36 timer). Hydrogenatmosfæren blir deretter erstattet med argon. Reaksjonsoppløsningen blir gjort klar gjennom et celit stykke og oppløsningsmiddelet blir fjernet i vakuum for å tilveiebringe et fast stoff.

N^- benzyloksvkarbonyl- D- fenylalanyl-( N-£— t- butoksykarbonvl )-lvsin amid. 8.

Na<->benzyloksykarbonyl-D-fenylalanin (6, 126.39 g, 0,423 mol) blir sakte tilsatt til en 10<*>C oppløsning bestående av CDI (2, 66.03 g, 0,409 mol) I THF (500 ml). Gass utviklingen blir observert i løpet av tilsetningen. Når gassutviklingen har opphørt blir lysinamid 5 (110.75 g, 0,452 mol) tilsatt som en oppløsning i THF (500 ml). Etter omtrent 48 timer blir blandingen filtrert for å fjerne de faste stoffene. Filtratet blir konsentrert i vakuum.

Den resulterende resten blir tatt opp i etylacetat (EtOAc, 500 ml) og blir deretter vasket som følger i en skylletrakt: 1. aq HC1 (IN. 3 X 500 ml) pH av vask 1, ca. 8; deretter vask av pH, 1,

2. vann (500 ml),

3. aq Na2C03(l/2 mettet, 2 X 500 ml), blir filtrert for å samle de dannede krystallinske faste stoffene (8).

4. Vann (3 X 500 ml).

Det organiske laget blir tørket over MgS04. Etter klargjøring blir oppløsningsmiddelet fjernet i vakuum. Den resulterende resten kan bli omkrystallisert fra varm EtOAc for å tilveiebringe en annen prøve av 8.

D- fenvlalanvl- f N-£— t- butoksykarbonyl llysin- amid. 9

En metanolisk oppløsning Na<->benzyloksykarbonyl-tryptophan (10, 67.60 g, 0,200 mol), THF (500 ml) og CDI (2, 33.05 g, 0,204 mol) blir tilsatt til en katalysatoroppslemning av 5* Pd/C (50 g) i MeOH (200 ml). Argonatmosfæren blir erstattet med hydrogen. Når HPLC analysen indikerer at reaksjonen er fullført (ca 4 timer) blir hydrogenatmosfæren erstattet med argon. Reaksjonsoppløsningen blir deretter gjort klar gjennom et celitstykke og filtratet blir satt til en rest i vakuum. Dette dipeptidproduktet kan bli anvendt direkte for fremstilling tripeptid 12.

N° i- benzy 1 oksvkarbonyl - 1 ryptophy 1 - D- f eny 1 al anyl - (N—-1 - butoksykarbonvl) lvsin- amid 12

En 10' C oppløsning av Na<->benzyloksykarbonyltryptophan (10, 67.60, 0,200 mol), THF (500 ml) og CDI (2, 33.05 g, 0,204 mol) blir omrørt helt til gassutviklingen opphører. En oppløsning av 9 (40,8g, 0.103 mol) i THF (ca. 200 ml) blir deretter tilsatt til reaksjonsblandingen. Den resulterende oppløsningen blir omsatt i 15 timer med oppvarming til romtemperatur. Det fast stoffet som blir dannet blir deretter samlet ved vakuumflltrering. Filtratet blir gjort til en rest ved konsentrering i vakuum. Den resulterende resten og det faste stoffet blir på ny kombinert og tatt opp i EtOAc (4000 ml) med kort oppvarming. Ved avkjøling av oppløsningen til romtemperatur blir det dannet et fast stoff. Det faste stoffet blir samlet ved vakuumflltrering. Dette fast stoffet blir omkrystallisert fra varm MeOH for å tilveiebringe renset tripeptid 12. EtOAc filtratet (fra den første krystalli-seringen) blir vasket som følger I en skilletrakt:

1. aq HC1 (IN, 2 X 500 ml),

2. vann (1 X 500 ml),

3. aq Na2C03 (1/2 mettet, 2 X 500 ml),

4. aq NaCl (1 X 500 ml).

Det organiske laget blir tørket over MgS04 og deretter gjort klart ved vakuumflltrering. Oppløsningsmiddelet til filtratet blir fjernet i vakuum. Den resulterende resten blir igjen tatt opp I EtOAc for å tilveiebringe et tørt fast stoff. Det faste stoffet kan bli utsatt for en varm MeOH omkrystalli-sering for å tilveiebringe en annen omgang 12 som et hvitt fast stoff.

Trvptophvl - D- f eny lal anyl -( N^-- t- but lyoksykarbonvl) lysinamid 13.

En metanolisk oppløsning (1500 ml) av tripeptid 12 (64.59 g, 0.091 mol) ble tilsatt til en katalysator oppslemnlng bestående av 5* Pd/C (5g) og meOH (250 ml) under en argonatmosfære. Et ytterligere volum av MeOH (2250 ml) blir tilsatt. Argonatmosfæren blir erstattet med hydrogen og omsatt (ca 24 timer). Etter endt reaksjon blir hydrogenatmosfæren erstattet med argon. Oppløsningen blir klargjort gjennom et celitstykke og filtratet blir konsentrert i vakuum for å tilveiebringe tripeptid 13 som et hvitt fast stoff.

B. Fremstilling av trlpeptidfragmentet- K- DAla- D& Nal- Ala- OMe-N°— benzyloksykarbonyl- D- alanyl- D- beta- naftvlalaninmetylester.

25

En oppløsning av EtOAc (400 ml) og D-beta-naftylalanin-metylesterhydroklorid 822, 0,62 mol) blir vasket med mettet natriumkarbonat (400 ml) og 0,8 N vandig natriumhyroksid (ca 500 ml). Den resulterende vandige fasen blir fjernet (pH 8,5) og den organiske fasen blir deretter vasket med halv-mettet vandig Na2C03 (150 ml) og deretter med vann (50 ml). Den frie baseformen av 22 blir isolert ved konsentrering av etyl-acetatlaget i vakuum.

Disykloheksylkarbodiimid (DCC, ca 95 g, 0,46 mol) blir tilsatt til -5°C (is-etanol bad) oppløsning bestående av N<01->benzyloksykarbonyl-D-alanln (19, 143.5 g, 0,50 mol), N-hydroksysuccinimid (HONSu, 23, 0.62 mol) og den friske dannede frie baseformen av 22 (ca 0,52 mol) i DMF (ca 31). Den resulterende reaksjonsoppløsningen blir omrørt i 24 timer med oppvarming til romtemperatur. HPLC analysen bør bli anvendt for å se om reaksjonen er fullført. Dersom den ikke er det blir reaksjonsoppløsningen deretter avkjølt til ca-5°C og en ytterligere del av disykloheksylkarbodiimid (ca 0.17 mol) blir tilsatt til reaksjonen. Reaksjonsblandingen blir deretter omrørt i ytterligere 24 timer med oppvarming til romtemperatur. Blandingen blir deretter filtrert for å fjerne disykloheksylura (DCU). Vann (1 1) blir tilsatt til filtratet og den resulterende oppløsningen blir konsentrert i vakuum. Den resulterende resten blir tatt opp i vandig IN HC1 (ca 1 1 helt til pH av den vandige fasen når en pH på 1). Den vandige fasen blir deretter ekstrahert med to porsjoner etylacetat (1 1 hver). Etylacetatlagene blir fjernet. pH til den vandige fasen blir deretter justert ved tilsetning av kald 2N natriumhydroksid (500 ml) og natrlumhydroksid-pelleter. I løpet av denne nøytraliseringen blir oppløsningen oppbevart kaldt ved tilsetning av kald etylacetat (1 1). Når pH til den vandige fasen når omtrent 7 resulterer dette ofte i rikelig presipitasjon av et hvitt fast stoff eller olje. Dette presipitatet blir samlet ved vakuumflltrering eller dekantering og deretter vasket med halvmettet natriumkarbonat (2 X 1500 ml), vann (6 X 1500 ml) og etylacetat (3 X 1500 ml). Det resulterende materialet blir tørket under høyt vakuum til konstant vekt. Dette materialet kan bli hydro-lysert direkte uten ytterligere rensning.

N°— benzyloksykarbonyl- D- alanyl- p- naftyl- D- alanin. 26.

vandig natriumhydroksid (192 ml, 0,08 g/ml oppløsning, 0,38 mol) blir tilsatt til en oppløsning av dipeptid 25 (ca 0,38 mol), vann (360 ml) og MeOH (ca 6 1). Oppløsningen blir omrørt ved romtemperatur helt til hydrolysen er fullført (ca 24 timer). Fjerning av utgangspeptidet blir oppnådd ved HPLC analyse. Oppløsningen blir konsentrert I vakuum til en rest som blir løst opp i vann (ca 1 19. Det vandige laget (pH ca 19) blir deretter ekstrahert med EtOAc (2 X 500 ml) i en separasjonstrakt. Etylacetatlagene blir fjernet. Den resulterende vandige fasen blir justert til en pH på omtrent 5 med konsentrert HC1 og deretter fører dette vanligvis til presipitering av et hvitt fast stoff eller olje. Produktet blir samlet og blir tørket i vakuum.

N°— benzyloksvkarbonyl - D- alanvl- D- beta- naf tyl- alanvl- alanin-metvlester. 20

Dipeptidet Na<->benzyloksykarbonyl-D-alanyl-D-beat-naftylalanin (26, 0.253 mol) ble tilsatt til en oppløsning av HONSu (23, 0,505 mol) i DMF (800 ml) under en argonatmosfære. Til denne oppløsningen blir en blanding av alaninmetylesterhydroklorid (15, 0,303 mol), N.metylmorfolin (16, 0,303 mol) og DMF (200 ml) tilsatt. Den resulterende oppløsningen blir avkjølt til 10°C og disykloheksylkarbodiimid (24, 0,265 mol) i metylenklorid (273 ml) blir tilsatt. Reaksjonen blir registrert ved HPLC mens reaksjonstemperaturen blir opprettholdt ved 10'C helt til reaksjonen er fullført. Dersom det etter flere dager (ca 4) ikke har ført til at reaksjonen er fullført blir en ytterligere tilførsel av 24 (0,080 mol) tilsatt og reaksjonsblandingen blir omrørt i en ytterligere dag ved 10"C. Reaksjonen blir på ny registrert ved HPLC analyse helt til den er fullført (vanligvis ca 5 dager). De faste stoffene som blir dannet 1 løpet av reaksjonen blir samlet ved vakuum filtrering. Filtratet blir deretter konsentrert til en rest i vakuum. Den resulterende resten blir tatt opp i etylacetat og ekstrahert med halv-mettet vandig NagC03 (2 X 500 ml). Etylacetat fasen blir tørket over MgSO^ Den resulterende oppløsningen blir gjort klar og konsentrert til en rest i vakuum.

En 2N vandig natriumhydroksidoppløsning (7,5 ml, 15 mmol) blir tilsatt til en metanol (500 ml) og vann oppløsning (200 ml) inneholdende Na<->benzyloksykarbonyl-DAla-D<p>Nal-Ala-OMe (13,7 mmol). Etter at reaksjonen blir omrørt over natt ved romtemperatur indikerer HPLC analysen mengden " av utgangs-materiale som er igjen. Når den er fullført (ca over natt) blir den resulterende oppløsningen konsentrert i vakuum til et volum på omtrent 200 ml. Vann (100 ml) blir tilsatt og pH blir justert til omtrent 12 ved tilsetning av 2N natriumhydroksid (1 ml). Den resulterende oppløsningen blir ekstrahert med etylacetat (2 X 500 ml). Etylacetatlagene blir fjernet. pH til den vandige fasen blir deretter justert til omtrent 5 ved tilsetning av vandig HC1 som vanligvis resulterer i presipitering av produktet. Det er viktig å minimalisere volumet av den vandige fasen for å fremme denne presipiteringen. Den vandige fasen blir dekantert bort fra produktet og produktet blir deretter skylt med vann (2 X 50 ml). Det isolerte produktet blir tørket til konstant vekt i vakuum.

C. KondensasJonsreaksjonen til peptidfragmentene for å produsere heksapeptid

To peptider DAla-D<B>Nal-Ala-0H (33, 2,6 mmol) og Trp-D-Phe-Lys(BocJ-NHg (13, 2,8 mmol) blir løst opp vannfri DMF og den resulterende oppløsningen blir konsentrert i vakuum. Denne preliminære konsentrasjonen blir utført I et forsøk på å fjerne eventuelle spor av metanol som kan være til stede. Den resulterende peptidblandingen blir på ny løst opp i DMF og N-hydroksysuccinimid (5,1 mmol) blir deretter tilsatt. Den resulterende oppløsningen blir deretter avkjølt til en oppløsningstemperatur på -2°C og disuykloheksylkarbodiimid (3,4 mmol) blir deretter tilsatt som en oppløsning i metylenklorid (3,5 ml). Den resulterende reaksjonsblandingen blir omrørt ved -2'C oppløsningstemperatur i en periode på 3 dager. HPLC analyse blir anvendt for å bestemme om reaksjonen er fullført. Etter denne tidsperioden kan ytterligere disykloheksylkarbodiimid deretter bli tilsatt og den resulterende reaksjonsblandingen blir omrørt i en ytterligere dag ved -2'C. Dersom det på følgende dag (1 totalt 4 dager) HPLC analysen på ny Indikerer ufullstendig reaksjon bør avkjøling av reaksjonsblandingen bli avsluttet. Oppløsnlngs-temperaturen til reaksjonen kan bli sakte øket til romtemperatur (25° C) over en periode på timer (ca 8). Den resulterende reaksjonsblandingen blir omrørt over natt ved romtemperatur. Prosedyren blir gjentatt helt til reaksjonen er fullført. Deretter blir vann (50 ml) tilsatt og den resulterende blandingen blir omrørt i en ytterligere dag. Reaksjonsoppløsningen blir deretter filtrert for å fjerne disykloheksylurea og det resulterende filtratet blir konsentrert i vakuum til en viskøs olje. Etylacetat og halv-mettet vandig natriumkarbonat (200 ml) blir tilsatt til den resulterende resten. To-fase blandingen blir omfattende omrørt på en roterende avdamper i omtrent 1 time. Eventuelle faste stoffer som blir dannet blir samlet for å tilveiebringe produktet ved filtrering på en sintret glasstrakt. Den organiske fasen blir vasket med vann og deretter tørket til konstant vekt 1 vakuum for å tilveiebringe produktet.

DAla- D- £Nal- Ala- Trp- D- Phe- Lvs- NH2. 35

Heksapeptidet benzyloksykarbonyl-DAla-D<0>Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-(Boc )-NH2 (34, 1,02 mmol) blir tilsatt til en rom-temperaturoppløsning av trifluoreddiksyre (30 ml), dimetyl-sulfid (14 ml), 1,2 etandithiol (7 ml) og anisol (2,2 ml) i metylenklorid (15 ml). Den homogene reaksjonsblandingen blir omrørt i 15 minutter. Etter denne tidsperioden blir vannfri eter (450 ml) tilsatt for å forårsake presipitasjon av det rå biologisk aktive peptidproduktet 35. Dette produktet blir isolert ved filtrering på en sintret glasstrakt eller ved dekanterlng. Det resulterende produktet blir løst opp i vann og lyofilisert. Det lyofiliserte produktet kan bil ytterligere renset ved middel trykkroaratografi på en 26 X 460 mm glasskolonne Inneholdende Lichroprep™ RP-18 kolonne pakkemateriale (C-18, 25-40 nm, ujevn mesh). Etter injeksjon av peptidet som en oppløsning i vann blir kolonnen eluert ved en strømningsrate på 9 ml pr. minutt med en grunn gradient på 0 til 25* metanol i 5-20 timer og deretter ved en gradient på 25 til 55* metanol over ca 48 timer. Metanol konsentrasjonen til gradienten blir deretter øket med en rate på 2* pr. time. I løpet av elueringen blir det gjenværende av oppløsnings-middelsammensetningen dannet av vann inneholdende 0,2* trlfluoreddiksyre. Produktet (35) blir identifisert ved HPLC og blir isolert ved konsentrering av hensiktsmessige elueringsvolumer.

Claims (17)

1. Peptid, karakterisert ved at det har formelen Ai-A2-Ala-C2-C3-Ag, hvor Aj er Gly, DAla, p<->Ala, Sar, Ava, Aib, en N-C2_Cjq rettkjedet alkylamino-karboksylsyre, en N.N-bis-Cg-Cjo rettkjedet amino-karboksylsyre, en azolkarboksylsyre eller en C2-Cjq rettkjedet amino-karboksylsyre, hvor A2 er DTrp, D<e>Nal, D-4-Y-Phe- eller 5-Y-D-Trp, hvor Y er OH, Cl, Br, F eller H, A5 er A3-A4-A5, <A>3-<A>5, A4-Ag eller Ag, hvor (a) A3 er Ala, Gly, DAla, Pro eller desAla, (b) A4 er Ala, Gly, DAla, Pro, en C2-Cjq rettkjedet alkylamino-karboksylsyre eller desAla, og (c) Ag er Lys(c-Ej,R2)-Z, 0rn(S-Ej,E2)-Z, NH(C<H>2)XN(R3,R4) Lys-Z, Orn-Z eller Arg-Zf hvor Ej er en C2-Cjq rettkjedet alkylgruppe eller et H atom, E2 er en C2-Cjq rettkjedet alkylgruppe eller H-atom, men Ej og R2 er ikke samtidig H, R3 er en C2-Cjq rettkjedet alkylgruppe eller et H-atom, R4 er en C2-Cjq rettkjedet alkylgruppe eller H-atom, Z er NH(C2-Cjq rettkjedet alkylgruppe), N(<C>2-<C>10 rettkjedet alkylgruppe)2, 0-(C2-C10<r>ettkjedet alkylgruppe), NH2 eller OH, x er 2 til og med 15, Q2 er Trp, Phe eller ChxAla, C3 er DPhe, DPal eller DChxAla og organiske eller uorganiske addisjonssalter av ovennevnte.

2. Peptid ifølge krav 1,karakterisert ved at Aj er Gly eller DAla og fortrinnsivs DAla.

3. Peptid ifølge krav l,karakterisert ved at A2 er DTrp eller D<p>Nal, og fortrinnsvis D<p>Nal.

4. Peptid ifølge krav 1,karakterisert ved at Ag er A3-A4-A5, A3-Ag eller A4-Ag.

5. Peptid ifølge kravene 1 eller 2, karakterisert ved at Ag er Ag.

6. Peptid ifølge kravene 1 eller 2, karakterisert ved at C2 er Trp eller Phe.

7. Peptid ifølge kravene 1, 2, 3, 4, 5 eller 6, karakterisert ved at C3er DPhe.

8. Peptid ifølge krav 6,karakterisert ved at C2 er Trp.

9. Peptid ifølge krav 8,karakterisert ved at C3 er DPhe.

10. Peptid Ifølge krav 1,karakterisert ved at det har formelen DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys(c-IPr )NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys {c-iPr)NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-D<e>Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, NH2(CH2)5CO-D<p->Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)sNH2, NaIMA-D<e>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, a, 7ABU-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNB2, DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, pAla-Hls-D<P>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, NotIMA-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHxNE2, a ,-YABU-DpNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHx-NH2, DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-ArgNH2, DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DPhe-Arg-NH2, DAla-D<e>Nal-Ala-ChxAla-DPhe-LysNH2, DAla-D<p>Nal-Ala-Phe-DChxAla-LysNH2, eller DAla-D<e>Nal-Ala-ChxAla-DChxAla-LysNH2 og organiske eller uorganiske addisjonssalter derav.

11. Farmasøytisk sammensetning for å fremme frigjøringen av veksthormonnivåene hos dyr, karakter! sert ved at den omfatter en effektiv mengde av minst ett av peptidene Ifølge kravene 1, 5, 6, 7, 8 eller 10 og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel.

12. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 11,- karakterisert ved at den videre omfatter en annen forbindelse som virker som en agonist ved veksthormon frigjørende hormonreseptoren eller inhiberer virkningene av somatostatin.

13. Anvendelse av en terapeutisk effektiv mengde av peptidet ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for forebyggelse av cachexi hos cancerpasienter.

14. Peptid ifølge krav 9,karakterisert ved at har formelen DAla-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-LysNHg, DAla-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys (c-iPr)NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys (c-iPr)NH2, DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2, DAla-D<p>Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2, eller NH2(C<H>2)5C0-D<e>Nal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NB2 og organiske eller uorganiske addisjonssalter derav.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser ifølge krav 1, karakterisert ved å koble ovennenvte aminosyrer eller aminosyrederivater for å danne forbindelsen.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen Ifølge krav 15, karakterisert ved at den omfatter en kondensasjonsreaksjon av peptidfragmentene for å danne forbindelsen.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av forbindelsen ifølge krav 15, karakterisert ved at den omfatter en fast fase syntese av nevnte aminosyrer eller aminosyrederivater.