FI120691B - Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä - Google Patents

Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä Download PDF

Info

Publication number
FI120691B
FI120691B FI20050467A FI20050467A FI120691B FI 120691 B FI120691 B FI 120691B FI 20050467 A FI20050467 A FI 20050467A FI 20050467 A FI20050467 A FI 20050467A FI 120691 B FI120691 B FI 120691B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ala
trp
dphe
lys
peptide
Prior art date
Application number
FI20050467A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20050467A (fi
Inventor
David H Coy
Cyril Y Bowers
Original Assignee
Univ Tulane
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Tulane filed Critical Univ Tulane
Publication of FI20050467A publication Critical patent/FI20050467A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI120691B publication Critical patent/FI120691B/fi

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/60Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06Antihyperlipidemics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä
Keksintö koskee ei-terapeuttisia menetelmiä, joilla 5 voidaan edistää kasvuhormonitäsojen vapautumista ja nousua eläimillä, siten että niille annetaan erityisiä kasvuhormonia vapauttavia polypeptidiyhdisteitä,
Keksinnön tausta
Kasvuhormonin (GHj tasojen nostaminen eläimissä, 10 esimerkiksi, nisäkkäissä ihmistä lukuun ottamatta, antamalla GH:ta vapauttavia yhdisteitä, voi johtaa painon nousuun ja maidontuotannon tehostumiseen, jos antamisen jälkeen ilmenee riittävän kohonneita Gk-tasoja. lisäksi tiedetään, että kasvuhormonitasojen nousu nisäkkäissä voidaan saada aikaan 15 käyttämällä tunnettuja kasvuhormonia vapauttavia aineita, kuten luonnossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia hormone j a.
Kasvuhormonitasojen nousu nisäkkäissä voidaan myös | saada aikaan käyttämällä kasvuhormonia vapauttavia peptide- j 20 jä, joista jotkin on kuvattu aikaisemmin, esimerkiksi patenteissa US 4 223: 019, US 4 223 020, US 4 223 021, US 4 224 316, US 4 226 857, US 4 228 155, US 4 228 156, US 4 228 157, US 4 228 158, US 4 410 512, US 4 410 513.
j
Kohonneiden GH-tasojen aikaansaamiseksi on myös j 25 käytetty vasta-aineita, jotka on suunnattu endogeenista j kasvuhormonin vapautumisen inhihlittoria, somatostatilnia | (SRIF) vastaan. Tässä jälkimmäisessä esimerkissä kasvuhormonit asoj a kohotetaan poistamalla endogeeninen GH:n vapau- | humisen inhibiittori (SRXF) ennen kuin se pääsee axvolisäk- | 30 keeseen, jossa se estää GH:n vapautumista. i
Kuhunkin näistä menetelmistä, joilla voidaan edis- ! | tää kasvuhormonitasojen kohoamista, sisältyy materiaaleja, j jotka ovat kalliita syntetisoida ja/tai eristää riittävän j j puhtaana kohde-eläimelle antamista varten. Lyhytketjuiset, | 35 molekyylipainoltäan pienet, suhteellisen yksinkertaiset po- j lypeptidit, jotka ovat suhteellisen halpoja valmistaa ja j 2 joilla on kyky edistää kasvuhormonin vapautumista, olisivat suotavia, koska niiden pitäisi olla helposti ja halvalla valmistettavissa, helposti modifioitavissa kemiallisesti ja/tai fysikaalisesti, samoin kuin helposti puhdistettavis-5 sa ja formuloitavissa, ja niillä pitäisi olla erinomaiset kuljetus omi naisuudet.
Vaikka tunnetaankin, joitakin lyhyt ket juisia polypeptide jä jotka voivat edistää kasvuhormonitasojen vapautumista ja nousua veressä, kuten tyis-DTrp-Ma-Trp-DPhe-Lys·-· 10 ΜΗχ, kuten pohditaan patentissa: US 4 410 512, on tärkeää kyetä tarkoin muuttamaan polypeptideja eri syistä, kuten vapautuminen, biologinen imeytyminen, lisääntynyt retentio-aika jne. Äminohappomuutoksilla tietyissä kohdissa voi kuitenkin olla dramaattisia vaikutuksia lyhyt ke tj ui sen pepti-15 din kykyyn edistää kasvuhormonin vapautumista. j
Olisi suotavaa, jos olisi olemassa erilaisia lyhyt- j
ketjuisia polypeptidejä, jotka voivat edistää kasvuhormo- I
nitasojen vapautumista ja nousua eläinten veressä. Olisi j myös edullista, jos sellaisia polypeptidejä voitaisiin käyt-20 tää edistämään kasvuhormonitasojen vapautumista ja/tai nou- j sua eläinten veressä;.
Olisi myös suotavaa tarjota menetelmiä, joilla voi- | •j täisiin edistää kasvuhormonitasojen vapautumista ja/tai nou- j
sua eläinten veressä sellaisia lyhytketjuisia polypeptidejä I
25 käyttämällä. ΐ
Keksinnön yhteenveto j
Keksintö koskee menetelmää kasvuhormonin vapautunut— j sen edistämiseksi eläimessä, ihmistä lukuun ottamatta, ja | lukuun ottamatta terapeuttista menetelmää, joka kohdiste- | 30 taan eläimeen, jolle on tunnusomaista, että eläimelle anne- 1 taan tehokas määrä ainakin yhtä seuraavalla menetelmällä j valmistettua peptidiä,: jolla on kaava j ^-Äi*“Äla-G2”C3-Ä5',. 1 ] i ] j 3 jossa Ai on Gly, DAla, β-Äla, Sar, Äva, Äib, ABU, NH2(GH2)5CO tai XMÄ, Ä2 on DTrp, D^Nal, Ag on A2—A4—Ag>, A3—Äg>, A4—Ag tai A51, jossa a) ä3 on Ala, Gly, DAla tai Pro, 5 b) A4 on Ala, Gly, DAla, Pro tai Ci-Cic-suoraket- juinen aikyytiaminokarboksyylihappo, ja c) As- on Lys (s-Ri, R2)-Z, Orn (5-Rt, R2)-Z, N H (CH2)XN-(R3, R4) , Lys-Z, Orn-Z tai Arg-Z, joissa Ri on suora ket j uinen C2~Cio~a 1 kyytiryhmä tai H-atorni, R2 on suoraketjuinen C2-Ci0-10 alkyyliryhmä tai H-atomi, mutta Rj ja ,R2 eivät samanaikaisesti ole H, R3 on suoraket j uinen C2-Cio-alkyyliryhmä tai Ί H-atomi, R4 on suoraketjuinen C2-Ci0-alkyyliryhmä tai H-ato- .] mi, Z on NH (suoraketjuinen Cg-Gio-alkyyliryhmä), N (suoraket- | juinen C2~Ciö~alkyyliryhmä) 2, O-{suoraketjuinen C2-Cio-alkyy- j 15 liryhmä), NHs tai OH, x on 2 - 15, | C2 on Trp, Phe tai ChxAla, C3 on DPhe, DPal tai DChxAla, j
jolloin (i) edellä kuvatut aminohapot tai aminohappojoh— I
dännaiset liitetään yhteen peptidin muodostamiseksi käyttä- ] 20 en kiinteän faasin menetelmää, tai (ii) suoritetaan edellä | kuvattujen aminohappojen tai aminohappojohdannaisten tai |
A
näiden peptidifragmanttien syntetisointi liuosvaihemenetel- | mällä, joka sisältää ainakin kahden fragmentin konden- j saatioreäktion, peptidin muodostamiseksi, j
25 Kuvioiden lyhyt kuvaus I
Kuvio 1 on sarja kuvaajia, joista käy ilmi ihmisen j kasvuhormonin tasot seerumissa ajan funktiona. j
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus j
Olemme keksineet menetelmän, jossa eläimille anne- J
30 taan useita uusia lyhytketjuisia polypeptidejä, jotka saa- j vat aikaan kasvuhormonitasojen vapautumisen ja nousun eläin- j ten veressä. Menetelmässä eläimelle annetaan ainakin yhtä ] seuraavalla menetelmällä valmistettua peptidiä, jolla on j kaava: j 35
Äl Co~C3 —Ä5y I
4 jossa Ai on Gly, DAla, β-Ala, Sar, Äva, Aib, ABU, NH2 (¢.¾). gCQ tai IMA, Ä2 on DTrp, DBNal, As on A3-A4--A5., A3-Ä51, ä4~A5· tai Ä5't jossa a) A3 on Ala, Gly, DAla tai Pro, 5 b} A4 on Ala, Gly, DAla, Pro tai C2~C10-suoraket“ juinen alkyyliaminokarboksyylihappo, ja c) A5. on Lvs { ε-Ri, R2} -Z, Orn (δ-Ri, R?) -Z, NH (CH2) XN (R3i Ra) , Lys-Z, Orn-Z tai Arg-Z, joissa Ri on suoraketj uinen C2-Cip-alkyyliryhinä tai H-atomi, R2 on suoraketjui-10 nen C2-Cio/-alkyyliryhmä tai H~atomi, mutta Ri ja R2 eivät samanaikaisesti ole H, R3 on suoraketj uinen C2-Cio-alkyyIiryh-mä tai H-atomi, R4 on suoraketjuinen Gs-Cio-alkyyliryhmä tai H-atomi, Z on NH (suoraketjuinen C2~Ci0-alkyyliryhmä), N (suoraketj uinen C2-Ci0-alkyyliryhmä) 2, O- (suoraket juinen C2-Giö-15 alkyyliryhmä), NH2 tai OH, x on 2 - 15, C2 on Trp, Phe tai ChxÄla, C3 on DPhe, DPal tai DChxAla, jolloin (i) edellä kuvatut aminohapot tai aminohappojohdan-naiset liitetään yhteen peptidin muodostamiseksi käyttäen 20 kiinteän faasin menetelmää, tai (ii) suoritetaan edellä kuvattujen aminohappojen tai aminohappojohdannaisten tai näiden peptidlfragmanttien syntetisointi liuosvaihemenetelmäl-lä, joka sisältää ainakin kahden fragmentin kondensaätiore-aktion, peptidin muodostamiseksi.
2.5 Käytetyt aminohappotähteiden lyhenteet ovat standard | dinomaisen peptidinimistön mukaisia: |
Gly = Glysiini |
Tyr = L-tyrosiini ]
Ile = L-isoleusiini | 30 Glu = L-glutamiinihappo ;]
Thr = L-treeniini :|
Phe = L-fenylaläniirii j
Ala = L-alaniini |
Lys = L-lysiini | 35 Asp = L-asparagiinihappo |
Cys = L-kysteiini | ! 5
Arg ~ L-arginiini
Ava = aminovaleriaanahappo
Aib = aminoisovoihappo
Gin = L-glutamiini 5 Pro = L-proliini
Leu = L-leusiini
Met = L-met ioniini
Ser = L-seriini
Asn - L-asparagiini 10 His - L~hiskidiini
Trp = L-t.ryptofaani
Val = L-valiini DOPA = 3, 4-dih.ydroksifenylalaniini ;
Met(O) = metioniinisulfoksidi | 15 Abu - of-amino voihappo iLys = NE-isopropyyli“L-lysiini 4-Abu = 4-aminovoihappo
Orn = L-ornitiini j D“Nal = cf-naftyyli-D-alaniini \ 20 D%al = β-naftyyli-D-alaniini \
Sar = sarkosiini j LArg = homoarginiini |
Chx = sykloheksyyli j
ChxAla = L-sykloheksyylialaniini | .25 DCHxAla = D-sykloheksyylialaniini f IMA = Na~imidatsolietikkahappo ?|
Tcc = 1,2,3,4-tetra.hydro-7“karoliini-3- j karboksyylihappo j
Tic = 1, 2,3,4-tetrahydrois.okinoliini-3- ] 30 karboksyylihappo ]
Tip = 4,5,6,7-tetrahydro-lH-imidatsQ[e]-6- | karboksyylihappo j a,gamma-ABU = alfa,gamma-aminovoihappo j DPal = D-3-pyridyylialaniini j 35 Kaikki kolmikirjaimiset aminohappolyhenteet, joita j edeltää "D", viittaavat aminohappotähteen D-konfiguraati- j 5 ] j 6 oon, ja glysiinin. ajatellaan sisältyvän termiin "luonnossa .ilmene vät L-amlnohapot", Näissä lyhyt ket jäisissä: polypeptideissä tietyt; 'kohdat sietävät enemmän muutoksia kuin toiset, ilman että ne 5 vaikuttaisivat haitallisesti peptidin kykyyn, edistää kasvu-* hormonitasojen vapautumista ja/tai nousua eläinten veressä.
Esimerkiksi A5-kohta, Toiset kohdat sietävät vähemmän sellaisia muutoksia:. Esimerkiksi keskellä sijäitseyat aminohappotähteet Ala, Trp, DPhe, jotka on esitetty vastaavasti 10 merkein G*, 'Cz ja G3. Aikaisemmin uskottiin esimerkiksi, että Ai ja As pitäisi olla L~ ja vastaavasti D-muodossa, ja että Trp ja DPhe pitäisi olla myös L- ja D-muodossa, mikä -f muodostaa Lp LD -sarjan. Havaitsimme kuitenkin, että LD LD -sarja voi olla DD LD -sarja. Täten havaittiin yllättäen, j j 15 että polypeptidi jolla on kaava Ai-As-Gi-Gj-Cs-As, jossa Ai, hz, A5 ovat edellä kuvatun kaltaisia ja Ci on Ala, Cz on
Trp, Phe ja ChxAla ja C3 on DPhe, DPal tai DChxAla, edistää kasvuhormonitasojen vapautumista ja/tai nousua eläimissä., f C2 on edullisesti Trp tai Phe, edullisemmin C? on i
20 Trp, I
C3 on edullisesti DPhe, Kun ¢2 on ChxAla, C3 on edullisesti DPhe. Kun C3 on DPal, Z on edullisesti OH.
Lisääntynyt taipuisuus, joka: liittyy siihen että valitaan emäksisiä, neutraaleja tai happamia aminohappotäh- 2!5 teitä ja L- ja D-muotoja, joita voidaan käyttää aminohappo- | jen Ai, A?, A3, A4, A5, C2 ja C3 tapauksessa, tarjoaa suuren j hallittavuuden halutun peptidin fysikaalis-kemiailisia omi- | naisuuksia silmälläpitäen:, |
Vaikka peptideillä DÄla-DpNal-Äla-Trp-DPhe-Lys-NHa j 30 ja DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NHj on samanlaista GH:ta va- j pauttavaa aktiivisuutta, Trp:n substituointi Phe:llä voi | lisätä peptidin DÄla-DPNal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NIb kemiallista | stabiiliutta, koska Trp hapettuu herkemmin kuin Phe. Samoin j
Trp:n substituointi Phe:llä antaa peptidille enemmän hydro- 1 35 fobisuutta ja tämä jäljempänä kuvattu fysikaalis-kemialli- j ή en ominaisuus voi olla edullinen ajateltaessa suun kautta, f \ ! 7 ihon läpi ja/tai nenän kautta imeytymisen tehostamista samoin kun peptidin formulointia. Lisäksi DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHs: n ja DAla-LpNal-Älä-Phe-DPhe-Lys-NH2 :n ED5Q (50-prosenttisesti tehokas annos) rotan solun histamiini-5 määrityksessä on samanlainen, se on: 30,5 ± 0,5 ja 30,8 + 0,3 pg/ml ja molemmat ovat parannus verrattuna Ala-His-D£Nal-Äla-Trp-DPhe-Lys-NH2tn histamiiniaktiivisuuteen, joka oli 11,0 ± 1,.:0. pg/ml, Peptidit, joilla on vähemmän histamiinia vapauttavaa aktiivisuutta (korkeampi ED50} voivat olla 10 kliinisesti tehokkaampia, koska ne voisivat tuottaa vähemmän haitallisen paikallisreaktion peptidin injektiokohtaan ja/tai voivat vähemmän todennäköisesti tuottaa systeemisiä antigeenisiä haitallisia kliinisiä vaikutuksia,
Taipuisuus tarjoaa myös tärkeitä etuja halutun pep- i 15 tidin formuloinnissa ja antamisessa mille tahansa lajille.
Nämä muutokset voivat myös parantaa suun kautta tapahtuvaa imeytymistä, samoin kuin peptidien metaboliaa. ja erittymistä. Äia-His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHs (GHRP-1) on esimerkiksi kasvuhormonia vapauttavalta kyvyltään ihmisessä te- \ 20 hokkaampi kuin Äla-His-DTrp-Ala-Trp-Dhe-Lys-NHa. DÄla-D^Nal-- | Äia-Trp-DP:he-Lys-NH2 (GHRP-2) on kuitenkin tehokkaampi kuin | GHRP-1 suun kautta annettuna. \
Odotetaan myös, että koska näissä peptideissä aro- j
maattiset sivuketjut voidaan poistaa tietyistä kohdista, I
,\ 25 joissa niiden aikaisemmin ajateltiin olevan välttämättömiä, \ ja että D-aminohappotähteen pitäisi olla biologisesti suo- 'j jatumpi kuin L-muodon, voidaan käyttää joillekin peptideil- | le suurempaa suojatista ja pienempiä painoja, jotta polypep- ]
tidiä saadaan edelleen tarkoin muuteltua jotta saadaan mah- I
\ 30 dölii.seksi sellaiset ominaisuudet kuten imeytyminen nenän | kautta, suun kautta:, ihon läpi, stabiilisuus in vivo jne. j
Ri:n, Ra:n, Rs:n, R4: n ja Z :n osia voidaan myös :j vaihdella, mikä: tarjoaa näin ollen lisäkontrollin halutun j yhdisteen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien suhteen. | 35 Vastaavasti voidaan saada aikaan peptidin tehostunut vapaa- j tuminen tiettyyn reseptoriin ja tietyssä lajissa. j 8
Edullisia kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä, joita käytetään tätä keksintöä harjoitettaessa, ovat: Äx-Ä2-Äla -Trp- DPhe-Ag, 5 tai minkä tahansa sellaisen polypeptidin orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat, joissa Αχ, A2 ja Ag ovat edellä olevan määritelmän mukaisia.
Edullisesti kasvuhormonia vapauttavalla, peptidillä, 10 jota käytetään tätä keksintöä harjoitettaessa, on kaava: DÄla-Aa-Ala-Trp-DPhe-Äg, ja sen orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat.
15 Tämän yhdisteryhmän edullisilla jäsenillä on kaava: DAla-D%ä 1 - AI a - T r p- DPhe - L:y's:NH2, DÄla-D%al-Ala-Trp-DPhe-Lys (ε-iPr} NH2, DAl a - DT f p - AI a - T r p - D Ph e-L y s (ε - i Pr)N H2, DAla-DTrp-Äla-Trp-DPhe-LysNHs, 20 DAla-DsNal-Ala-Trp-DPhe-NH (CH2) 5NH2, NH2 (CH2) 5CO-Dp-Nal-Ala-Trp-D-Phe-MH (CH2) 5NH2, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset ad- f ditiosuolat. j
Rämä yhdisteet ovat tällä hetkellä edullisimpia, I
25 koska nämä lyhytketjuisemmat poiypeptidit ovat halvempia j syntetisoida, ja näiden spesifisten yhdisteiden on osoitet- j tu edistävän hyvin tehokkaasti seerumin kasvuhormonitasojen ] nousua. |
Muilla edullisilla kasvua vapauttavilla peptideillä j 30 on kaava Äx-Ä^Ala-Phe-DPhe-Ag. Edullisiin jäseniin tässä j yhdisteryhmässä kuuluvat ne, joissa Αχ on Nai MA·,· a, gamma, ABU, 1 DÄla, Ris, Ala, Hi s tai a, gamma, ABU, A2 on D%al tai DPhe, | ja Ä5 on LysNH2, LysNH2, Arg NH2, NH-CI-Ix-NHz (1,4-Chx- | diamiini) tai Lys EÄ. Esimerkiksi NalMA-D^Nal-Ala-Phe-DFhe- | 35 LysNH2, a, gamma, ABU - DPN a 1 -AI a-Phe- DPhe-L y s NH2, DAla-DPhe-Ala- j
Phe-DPhe-LysNH2, pAla-His-D%al^Ala-Phe-DPhe-LysNH2, ΝαΙΜΑ- j i 9 D^al-Ala-Pfce-DPhe-NH-CHx--NH2, a, gamma, ABU-D^Nal-Ala- Phe-DPhe-KH-Ghx-NH2, DAI a - D% a 1 - A la - Phe-DPhe-Lys EA, DAla-DpNal-Ala~ Phe-DPhe-ArgKHa, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset a dditiosuolat.
5 Tähän keksintöön kuuluvat polypeptidit, joilla on kaava Ai-A2-Ci-C2-C3-A5, jossa C-. on Ala, C2 on Trp, Phe tai ChxAla, C3 on DPhe tai DChxAla, Ai on edullisesti DÄla. Ä2 on edullisesti D%al. Esimerkiksi DAla-D^Nal-Ala-ChxAia-DPhe-LysNH2, DAla-DpWal-Äla-Phe-DChxAla-LysNH2 ja DAla-Dpftal-10 Ala-GhxÄla-DChxAla-L>ysNH2, samoin kuin näiden orgaaniset tai epäorgaaniset additiosuolat. \ Tässä kuvatut yhdisteet ovat tyypillisesti helppoja j syntetisoida, ne edistävät tehokkaasti seerumin hormonita- \
sojen nousemista, ja ne ovat suotavia kaupallisen mittakaa- I
15 van tuotannossa ja hyötykäytössä. Lisäksi nämä yhdisteet I
voivat olla edullisia sikäli että niillä on fysikaalis-kerni- j ailisiä ominaisuuksia, jotka ovat suotavia silmälläpitäen f sellaisten polypeptidiyhdisteiden tehokasta antamista mo~ f
nille erilaisille eläinlajeille, mikä johtuu taipuisuudesta I
20 jonka ovat mahdollistaneet erilaiset substituutiot polypep- 1 tidiyhdisteiden monissa eri kohdissa, ja siitä että on va- | littu näiden polypeptidiyhdisteiden C-terminaalisen osan ja j keskiosan polaarinen, neutraali tai ei-polaarinen luonne, ] niin että se olisi yhteensopiva halutun antotavan kanssa, \ 25 on suun kautta, nenän kautta, jatkuva antaminen, jossa käy- j
; I
tetään erityisiä kemiallisiä/mefcaanisia antomenetelmiä:. :j Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavia yhdistei- ] tä voidaan myös käyttää kohottamaan veren GH-tasoja eläi- . \ missä, lisäämään maidon tuotantoa naudoissa, lisäämään ruu- ] 30 mlin kasvua sellaisissa eläimissä kuten nisäkkäät (esim. j lampaat, naudat ja siat) samoin kuin kaloissa, siipikarjas- | sa, muissa selkärankaisissa ja äyriäisissä, ja lisäämään j villan ja/tai turkin tuotantoa: nisäkkäissä, Puumiin kasvun j määrä riippuu eläinlajin sukupuolesta ja iästä, annettavan j 35 kasvuhormonia vapauttavan yhdisteen määrästä ja identitee- ] tistä, antoreitistä ja vastaavasta. \ :¾ i 10 Tämän keksinnön mukaisesti valmistettavat uudet po-lypeptidiyhdisteet voidaan syntetisoida tavanomaisten liu-osfaasin ja: kiinteän faasin peptidikemian menetelmien mukaisesti, tai sinänsä tunnetuilla tavoilla.
5 Peptidiami de j;a varten kiinteän faasin synteesi aloi tetaan edullisesti peptidin C-terminaalisesta päästä. Sovelias lähtömateriaali voidaan valmistaa esimerkiksi kiinnittämällä tarvittava suojattu alfa-aminohappo kloorimetyloi-tuun hartsiin,: hydroksimetyylihartsiin, bentshydryyliamiini 10 (BHA) -hartsiin tai parametyylihentsyylihydryyliamiini (p-Me- BHÄ) -hartsiin. Bio-Rad Laboratories {Richmond, California) myy yhtä sellaista kloorimetyylihartsia kauppanimellä BIO-BEADS SX-1. Hydroksimetyylihartsin valmistus kuvataan Bo-danskyn ym, artikkelissa:, Chem. Ind. (Lontoo) 38, i 597 j 15 ¢1966), BBA-hartsin ovat kuvanneet Piettä ja Marshall,
Chem. Comm,, 650 (1970) ja se on kaupallisesti saatavilla j
; J
(Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, California), f Älkukiinnityksen jälkeen älfa-aminon suojaryhmä voi- | da an... poistaa valikoimalla happamia reagensseja, mukaan lu- | 20 kien trifluorietikkahapon (TFA) tai suolahapon (HC1) iiuok- j set orgaanisissa liuottimissa huoneenlämmössä. Alfa-aminon | SUojaryhmän poistamisen jälkeen jäljellä olevat suojatut | aminohapot voidaan liittää vaiheittain halutussa järjestyksessä . Kukin suojattu aminohappo voidaan saattaa yleensä 25 reagoimaan, noin kolminkertaisena ylimääränä käyttämällä soveliasta karboksyyliryhmäaktivaattoria, kuten disyklpheksyy-likarbodi-imidi (DCC) tai di-isopropyylikarbodi-imidi (DIG) liuoksessa, esimerkiksi metyleenikloridissa {CH2C'1$) tai di-metyyliformamidissa (DMF) ja näiden seoksissa.
30 Sen jälkeen kun haluttu aminohappOsekvenssi on saa- | tu valmiiksi, haluttu peptidi voidaan lohkaista irti bents- j hybryyliamiinihartsikantajasta käsittelemällä sellaisella | reagenssilla kuten fluorivety (HF), joka ei pelkästään loh- j kaise peptidiä irti hartsista vaan lohkaisee irti yleisiin·-· j 35 min käytetyt sivuketjun suojaryhmät... Kun käytetään kloori- j metyylihartsia tai hydroksimetyylihartsia, HF-käsittely joh- j 11 taa vapaan peptidihapon muodostumiseen. Peptidialkyyliami-deja ja -estereitä voidaan kuitenkin valmistaa näistä pep-tidihartseista lohkaisemalla soveliaalla alkyyliamilnilla, dialkyyiiamiinilla: tai diaminoalkaanilla tai transesteröi-5 mällä alkoholilla korkeissa pH-arvoissa.
Edellä kuvattu kiinteän faasin menetelmä on sinänsä tunnettu ja sen ovat kuvanneet Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis;; toinen laitos (Pierce Chemical Co., .Rockford, IL 1984), 10 Bodänsky ym. esittävät teoksessa Peptide Synthesis, töinen laitos, John Wiley S Sons, New York, N.Y. 1976, joitakin. hyvin tunnettuja iiuosmenetelmiä, joita voidaan käyttää syfltetoitaessa: tämän keksinnön pept.idiosat,
Uskotaan, että peptidit on edullisempi syntetisoida 15 liuosvaihemenetelmällä, joka sisältää ainakin kahden peptidi fragment in kondensointireaktion.
Tämä menetelmä käsittää sen, että peptidifragmentti Χ-Αχ-Υ kondensoidaan peptidifragmentin u-V-W kanssa, jolloin kaikki aminohapposivuketjut paitsi Αχ: n sivuketjut 20 ovat neutraaleja tai suojattuja, ja jossa X on suoj. jossa | suoj. on N-pään suojaryhmä: Y on Aa~Q, Ala-A2-Q, .Ä2-&la-Q, !
Ala-Aa-Äla-Q, A2-Ala-Trp-Q, Ala-A2-Ala-Trp~Q, Ala-Q tai -Q, \ jossa kun Y on Q, U on J-Ä2-Äla-Trp tai J-Ala-A2-Ala-Trp. |
Kun Y on Ala-Q, U on J-A2-Äla-Trp. Kun Y on A2-Q tai Alä-Ä?- I
25 Q, U on J-Ala-Trp, Kun ¥ on Ä2-Ala-Q tai Ala-A2~A3-Q, U on J-Trp. Kun Y on Äs-Äla-irp-Q tai Ala-Aj-Ala-Trp-Q, U on J.
V on As tai Z. Kun V on A5, W on Z. Kun V on Z, W ei ole läsnä. Αχ, Ä2, A5 ja Z ovat kuten tässä on määritelty, Q on peptidifragmentin karbOksipää ja se on -OR3 j 30 tai -M, jossa M on osa jonka typpeä sisältävä nukleofiili j kykenee syrjäyttämään, ja R3 on H, älkyyliryhmä joka sisäl- j tää yksi - noin 10 hiiliatomia, aryyliryhmä jossa on 6 - noin j 12 hiiliatomia, tai aryylialkyyliryhmä jossa on 7 - noin 12 hiiliatomia, J edustaa osoitetun fragmentin amiinipäätä ja 35 on H tai suojaryhmä, joka ei estä kytkentäreaktlota, esimerkiksi bentsyyli.
12 Tämän jälkeen suojaryhmat poistetaan. Vaihtoehtoisesti näin muodostunutta suojattua peptidiä voidaan käyttää jatkökondensaatioissa isomman peptidin valmistamiseksi.
Tämä edullinen menetelmä kuvataan täydellisemmin 5: US-patenttihakemuksessa nro 558 121, jonka John C. Hubbs ja S.W. Parker ovat panneet vireille 24. heinäkuut3 1990: otsikolla "Process for Synthesizing Peptides”, joka liitetään tähän viitteenä ja julkaistaan numerolla ¢¢09201709, Tämän keksinnön suoritusmuodon mukaisesti tarjotaan 10 menetelmä, jolla voidaan edistää kasvuhormonitäsojen vapautumista ja/tai kohoamista eläimen veressä. Mainittuihin menetelmiin kuuluu se, että eläimelle annetaan tehokas annos ainakin yhtä edellä kuvattua polypeptidiä. Tätä menetelmää käytetään Muissa eläimissä kuin ihmisessä.
15 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistet tavaa polypeptidiä yoidäan antaa suun kautta, parenteraali-sesti (lihaksensisäinen (i.m.), vatsaontelon sisäinen (.1.p.), laskimonsisäinen (i.v,:} tai ihonalainen (s.c.) injektio), j nenän kautta, vaginan kautta, peräsuolen kautta tai kielen \
20'· alle, samoin kuin keuhkojen sisäisenä inhalaationa ja ne J
voidaan formuloida annosmuodoiksi, jotka soveltuvat kulle- ] kin antoreitille. Parenteraaiinen antaminen on edullista. j
Kiinteisiin annosmuotoihin suun kautta antamista j varten kuuluvat kapselit, tabletit, pillerit, jauheet ja | 25 rakeet. Sellaisissa kiinteissä annosmuodoi ssa vaikuttava | aine sekoitetaan ainakin yhden inertin kantajan kanssa, ku- j ten sakkaroosi, laktoosi tai tärkkelys. Sellaiset annosmuo- j dot voivat myös sisältää, normaalin käytännön mukaisesti, j muitakin lisäaineita kuin inerttejä laimennusaineita, esim. j 30 liukuaineita kuten magnesiumstearaatti. Kapseleiden, tab- | j lettien ja pillereiden tapauksessa annosinuodot voivat myös sisältää puskuroivia aineita. Tabletit ja pillerit voidaan lisäksi valmistaa enteröpääliysteillä.
Nestemäisiin annosmuotoihin suun kautta tapahtuvaa 35 antamista varten kuuluvat emulsiot, liuokset, suspensiot, siirapit, eliksiirit jotka sisältävät sinänsä tunnettuja m 13 inerttejä laimennusaineita, kuten vettä. Sellaisten inert-tien laimennusaineiden lisäksi koostumuksiin voi lisäksi sisältyä apuaineita, kuten kostutusaineita, eöitilgointi- ja suspensointiaineita ja makeutus-, maku- ja hajuaineita.
5 Tämän keksinnön mukaisiin valmisteisiin parenteraa- lista antamista varten kuuluvat steriilit vesipohjaiset tai ei-vesipohjäiset liuokset, suspensiot tai emulsiot. Esimerkkejä ei-vesipohjaisista liuottimista tai yehikkeleistä ovat propyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli, kasviöljyt, 10 kuten oliiviöljy ja maissiöljy, liivate ja injektoitavissa olevat orgaaniset esterit kuten etyylioleaatti. Sellaiset annosmuodot voivat myös sisältää apuaineita kuten säilytys-, .] kostutus-, emulgointi- ja dispergointiaineita. Ne voidaan | steriloida esimerkiksi suodattamalla bakteereja pidättävän } 1,5 suodattimen läpi, sisällyttämällä koösturnuksiin steriloivia ] aineita, säteriyttämällä koostumuksia tai kuumentamalla koostumuksia.·.. Ne voidaan myös valmistaa, steriiliin veslliu- 1 okseen, täi johonkin muuhun steriiliin injektoitavissa; ole- f
vaan liuokseen välittömästi ennen käyttöä. I
20 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistat- j tavat uudet koostumukset ovat myös hyödyllisinä annettuna j yhdessä kasvuhormonia vapauttavan hormonin kanssa (se on: j luonnossa ilmenevä kasvuhormonia vapauttava hormoni, sen j analogit ja funktionaaliset ekvivalentit) samoin kuin yh-25 distelmänä muiden sellaisten yhdisteiden kanssa, jotka edistävät kasvuhormonin vapautumista, esimerkiksi kasvuhor- ; monia vapauttavat peptidit (katso US-patentti nro 4 880 778, johon viitataan täten viitteenä), esimerkiksi asetyyliko-liiniesteraasin inhibiittorit, β-salpaajat, a-?-salpaajat 30 jne. Sellaiset yhdistelmät edustavat erityisen edullista keinoa antaa tämän keksinnön mukaisia kasvuhormonia vapauttavia peptidejä, koska yhdistelmä edistää paljon suuremman kasvuhormonimäärän vapautumista kuin yhdistelmän kunkin komponentin aiheuttajan vasteen summan perusteella ennuste-35 taan, se on: yhdistelmä tarjoaa synergistisen responssin yksilöllisen komponentin suhteen. Edellä siteeratussa pa- 14 tentissä kuvataan lisää yksityiskohtia kasvuhormonia vapauttavien peptidien, yhdistelmien antamisesta* Sellaiset sy-nergistiset yhdisteet ovat edullisesti yhdisteitä:, jotka toimivat agonistina kasvuhormonia vapauttavan hormonin re~ 5 septorissa: tai inhiboivat somatostatiinih vaikutusta. Sy-hergismi voi olla binääristä., se oh: tämä: yhdiste ja yksi synergistisistä yhdisteistä, tai sisältää useamman kuin yhden synergistisen yhdisteen.
Yhdistelmät, jotka aiheuttavat tehokkaasti kasvu-10 hormonitason vapautumisen ja nousun eläimen veressä, sisältävät tehokkaan määrän polypeptidejä, jotka on valittu tässä patenttivaatimukseen 1 kuuluvista polypeptideistä ja ainakin yhdestä seuraajista ryhmistä: ryhmän 1 polypeptidit, tai yhdiste joka edistää kasvuhormonien vapautumista esim., 15 ryhmän 2 polypeptidit, jossa ryhmän 1 polypeptidit voivat olla mitä tahansa luonnossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia hormoneja ja niiden funktionaalisia ekvivalentteja, missä mainitut polypeptidit vaikuttavat nisäkkäiden, ja muiden selkärankaisten ja äyriäisten kasvuhormonia vapauttavan | 20 hormonin reseptoriin, f ryhmän 2 polypeptidit voivat olla mitä tahansa po- j lypeptidejä, joilla on rakenne: j
Tyr-DArg-Phe-NHs, I
Tyr-DAla-Phe-NH?, 25 Tyr-DÄrg (N02) -Phe-NH2/ ί
Tyr-DMet (0}-Phe-NH2, |
Tyr-DAla-Phe-Gly-NHa,:
Tyr-DArg-Phe-Gly-NHs,
Tyr-DThr-Phe-Gly-NHs, 1
30 Phe-DArg-Phe-Gly-NHa, I
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2, j
Tyr-DÄla-Gly-Phe-NH2, |
Tyr-DÄrg-Gly-Trp-NH2, |
Tyr-DÄrg {N02) “Phe-Gly-NHa, j 35 Tyr-DMet (Öj-Phe-Gly~NH2, 1 (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar~NH2, | 15
Tyr-DAr g -Phe-Gly-oLi,
Tyr-DArg-GIy-(NMe)Phe-NH2,
Tyr - DAr g -Phe- S ar - o 11,
Tyr-DAIa-Phe - S a r - o 11, 5 Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH?.,
Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(0)-oli,
Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-oli, G1y-Tyr-DArg-Phe-G1y-NH2,
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2, ID Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NHs,
Tyr-DAla-Phe-Gly-Dli,
Tyr-DAla-Giy-{NMe}Phe-Gly-oli,
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH?, }
Tyr-DA Ia-Ph e- S a r -N H 2, | 15 Tyr-DAla-Gly- (NMe)Phe-NHy, j
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2, |
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NHs (syklinen disulfidi), j
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NHa (vapaa ditioli), }
Tyr-DCys-Giy-Phe-DCys-NH2 (syklinen disulfidi), | 20 Tyr-DCys-Gly-Phe~DCys-NH2 (vapaa ditioli), (
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NHL, f
Tyr-DAla-Phe-3ar-Tyr-Pro-Ser~NH2/ I
Tyr-DAIa-Phe-S a r -Phe-Pro-Ser-NH2, |
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NHaf | 25 Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NHs, j T y r - DAI a - Ph e - S ar-Phe-Hyp~S e r-NH2,
Tyr-DArg-Phe-Gly-Ty r-Hyp-Ser-NH2, j
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro“Ser-NH2, ]
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NHs, } 30 Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser~NH2, ja | mainittujen ryhmän 2 polypeptidien orgaaniset tai ( epäorgaaniset additiosuolat, jossa mainittu yhdistelmä an- j hetaan sellaisena suhteena että mainittu yhdistelmä aiheut- \ taa tehokkaasti kasvuhormonin synergistisen vapautumisen ja 1 i 35 kohoamisen sellaisen eläimen veressä.
Muut yhdisteet, jotka edistävät kasvuhormonien va- j j il 16 pautumista, ovat ammattimiehen tieolossa ja niihin kuuluvat asetyyliköliiniesterassin inhibiittorit, β-salpaajat ja a2-agonistit.
Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa käytetään luon-5 nossa ilmeneviä kasvuhormonia vapauttavia hormoneja ja näiden funktioekvivalentteja yhdessä yhdisteiden kanssa, jotka edistävät kasvuhormonien vapauttamista, yhdessä näiden peptidien kanssa. Esimerkiksi ryhmän 1 ja ryhmän 2 yhdisteitä näiden peptidien kanssa, toinen esimerkki on ryhmän 1 yh-10 disteet tai β-salpaajat näiden peptidien kanssa.
Tämän keksinnön mukaisen polypeptidin määrä tai po-lypeptidieh yhdistelmän määrä, joka annetaan, vaihtelee ] riippuen monista tekijöistä, esim. tietty eläin, sen ikä ja j
sukupuoli, haluttu vaikutus, antoreitti ja mitä polypepti- I
15 dia tai poTypeptidien yhdistelmää käytetään. Kaikissa tapa- j uksissa käytetään kuitenkin annosta, joka tehokkaasti edis- ] tää kasvuhorraonitason vapautumista ja nousua vastaanottavan j eläimen veressä. Tavallisesti tämä annostaso on välillä -| noin 0,1 ug - 10 mg polypeptidin kokonaismääränä painokiloa j 20 kohti. Ammattimies voi määrittää helposti kokeellisesti |
edullisen määrän tämän paljastuksen perusteella. J
Kun käytetään kasvuhormonia vapauttavien peptidien | yhdistelmiä, voidaan käyttää alhaisempia määriä tässä ku- j vattua peptidiä. j 25 Kun esimerkiksi yhdistetään tässä kuvattu peptidi j esimerkiksi US-patentin nro 4 880 788 ryhmän I synergisti- :]
sen yhdisteen kanssa, kuten GHRH, edullinen alue on noin I
0,1 pg - noin 5 pg tässä kuvattua yhdistettä painokiloa \ kohti ja noin 0,5 pg ·- noin 15,0 pg synergististä yhdistet- j
30 ta (esim. GHRH) ja edullisemmin noin 0,1 pg - noin 3 pg tätä yhdistettä noin 1,0 pg:n - noin 3 pg:n kanssa synergia- I
tistä yhdistettä painokiloa kohti. 1
Kun antotapa on suun kautta antaminen, tarvitaan j tyypillisesti suurempia määriä. Esimerkiksi ihmisillä suun j 35 kautta antamista varten annostaso on tyypillisesti noin j
30 pg - noin 1 200 pg polypeptidiä painokiloa kohti, edul- I
5 !
: I
17 lisemmin noin 70 pg - noin 600 pg polypeptidiä painokiloa kohti, vielä edullisemmin noin 200 μ g - noin 600 pg poly-peptidin kokonaismääränä painokiloa kohti. Lehmät ja siat tarvitsevat noin saman annostason kuin ihmiset, kun taas 5 rotat tarvitsevat tyypillisesti korkeampia annostasoja. Tarkka taso voidaan päätellä helposti kokeellisesti tämän pal-j astuksen nojalla.
Kuten edellä on sanottu, yleensä kasvuhormonia vapauttavien peptidien yhdistelmien antaminen mahdollistaa 10 sen, että käytetään alempia annoksia yksilöllisiä kasvuhor monia vapauttavia yhdisteitä suhteessa niihin annos-tasoihin, joita vaadittaisiin yksittäisten kasvuhormonia vapauttavien. yhdisteiden tapauksessa, jotta saataisiin aikaan samanlainen vaste, mikä johtuu yhdistelmän synergistisestä 15 vaikutuksesta.
Tässä keksinnössä kuvataan myös koostumukset, jotka sisältävät vaikuttavana aineenaan edellä kuvattujen poly-pepiidien ja niiden yhdistelmien Orgaanisia ja epäorgaanisia additiosuoloja, mahdollisesti liittyneenä kantajaan, lai-20 mennusaineeseen, ainetta hitaasti vapauttävaän matriisiin | täi päällysteeseen.
Kasvuhormonia vapauttavien yhdisteiden tai näiden | yhdistelmien, joiden ajatellaan kuuluvan tämän keksinnön | suojapiiriin, orgaanisiin tai epäorgaanisiin additiosuoloi- | 25 hin kuuluvat sellaisten orgaanisten osien suolat kuten ase- |
taatti, trifluoriasetäatti, oksalaatti, valeraatti, oleaat- I
ti, lauraatti, bentsoaatti, laktaatti, tosylaatti, sitraat- I
ti, maleaatti, fumaraatti, sukkinaatti, tartaraatti, nafta-laatti ja vastaavat, ja sellaisten epäorgaanisten osien 30 suolat kuten ryhmän I (se on: alkalimetailisuolat), ryhmän j
II (se on: maa-alkalimetallisuolat), ammonium- ja prota- I
miinisuolat, sinkki, rauta ja vastaavat sellaisten vastaio-· ] nien kanssa kuten kloridi, bromidi, sulfaatti, fosfaatti ja vastaavat, samoin kuin orgaanisten osien suolat joihin 35 edellä viitataan.
Keksintöä havainnollistavat lisäksi seuraavat, ei-
J
18 raj oittavat esimerkit.
Esimerkki 1
Kasvuhormonia vapauttavien peptidien synteesi
Parametyyliben t s hydryy1iamiin i hydrok1ori di f pMe-5 BHS*HC1) -hartsi sijoitetaan reaktioastiaan kaupallisesti saatavilla olevassa automatisoidussa peptidisyritetisaattoris-sa. Hartsi substituoidaan vapaalla amiinilla aina subs-tituutioasteeseen 5 mmol/g. Yhdisteet valmistetaan liittämällä yhteen yksittäisiä aminohappoja peptidisekvenssin kar-10 boksipäästä alkaen, siten että käytetään soveliasta akti voivaa ainetta, kuten N,Nr-disyklQheksyylikarbödi-imidi (DCC). Yksittäisten aminohappojen alfa-amiini suojataan esimerkiksi t-butyylioksikarbon.yylijohdannaisena (t-Boc) ja reaktiivisen puolen ketjun funktionaaliset ryhmät suojataan 15 kuten taulukossa 1 pääpiirteittäin esitetään. j
Taulukko 1
Sivuketjun suojaryhmät, jotka ovat soveliaita kiinteän faasin peptidisynteesissä i Ärginiini: N9-tosyyli 20 Äsparagiinihappo: O-bentsyyli
Kysteiini: S-para-metyylibentsyyli
Glutamiinihappo: O-bentsyyli f
Histidiini: Nim-to5yyli |
Lysiini: Me-2,4-diklooribentsyylioksikarbonyyli 25 Metioniini: S-sulfoksidi 1
Seriini: O-bentsyyli !
Treoniini: O-bentsyyli -j
Tryptofaani: Nln-formyyli
Tyrosiini: 0-2,6-diklöoribentsyyli | 30 Ennen ensimmäisen aminohapon inkorporastiota hart- | siä ravistellaan kolme kertaa (noin yksi minuutti kerral- j laa n) di kloorimetaanin kanssa (CH2CI2, noin 10 ml/'hartsi” \ gramma), neutraloidaan ravistelemalla kolmasti (noin kaksi j minuuttia kerrallaan) dlkioprimetaanissa olevan NfN-di-isö- : | 35 propyylietyyliamiinin (DIEÄ) kanssa (10:90, noin ID mi/hart- 1 sigrammaj ja ravistellaan kolmasti (noin yksi minuutti ker- 19 rallaan) dikloorimetaanin kanssa (noin 10 ml/ hartsigrämmä) . Ensimmäinen aminohappo ja kukin seuraavista aminohapoista liitetään hartsiin käyttäen esimupdostettua symmetristä anhydridiä, niin että käytetään soveliaalla tavalla 5 suojatun aminohapon hartsin reäktiokapasiteetin noin 6,0-ker-taista .kokonaismäärää ja DIC:n .hartsin sitomiskapäsiteetin noin 2,0-kertäista kokonaismäärää soveliaassa määrässä di-kloorimetaania. Sellaisille aminohapoille, jotka ovat huo-noliukoisia dikloorimetaanissa:, lisätään N, N-dimetyyliforma-10 midia (DMF) homogeenisen liuoksen aikaansaamiseksi. Yleensä symmetrinen anhydridi valmistetaan jopa 30 minuuttia ennen kuin se pannaan reaktioastiaan huoneehlämpötilassa tai sitä -j alemmassa lämpötilassa. Symmetrisen anhydridin valmistulcses- | sa muodostuva disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla j 15 liuos omalla painollaan reaktioastiaan. Aminohapon hartsiin \ liittämisen edistymistä seurataan yleensä väritestillä käyt- | tämällä sellaista reagenssia kuten ninhydriini (joka reagoi | \ primääristen ja sekundääristen amiinien kanssa). Sen jäi- | keen kun suojattu aminohappo on liitetty täydellisesti | 20 hartsiin (> 99 S')> alfa-aminon suojaryhmä poistetaan kasit- | telemällä happamalla reagenssilla (happamilla reagensseil- 1 la)« Yleisesti käytetty reagenssi koostuu trifluorietikka- 1 hapon (TFA) liuoksesta dikloorimetaanissa (33:66) . s s
Sen jälkeen kun haluttu aminohapposekvenssi on saa- \ 25 tu valmiiksi, haluttu peptidi voidaan lohkaista irti hart- j sikantajasta käsittelemällä sellaisella reagenssilla kuten f fluorivety (KF), joka ei pelkästään lohkaise peptidiä hart- j sista vaan lohkaisee irti useimmin käytetyt sivuketjun suo- j jarynmät. Kun käytetään BHA- tai p-Me-BHA-hartsia, HF-kä- j 30 sittely tuottaa suoraan vapaat peptidiamidit. Kun käytetään aminohappo-Merrifield-hartsia, vapaat peptidialkyyliamidit lohkaistaan irti käsittelemällä soveliaalla amiinilla (tässä tapauksessa Boc-Ne-FMÖG-Lys:n käyttö tekisi mahdolliseksi FMOC-.ryhmän sarnanaikaisen poistamisen) .
35 Täydellinen menetelmä, jolla kukin yksittäinen aminohappotähde voidaan inkorporoida hartsiin, esitetään pää- | 20 piirteittäin taulukossa 2,
Taulukko 2
Menetelmä, jolla yksittäiset aminohapot voidaan in-korporoida hartsiin 5 Reagenssi Ravistelut
Aika/Ravistelu 1. Dikloorimetaani 3 1 mill 2. TTA-dikloorimetaani 1 2 min (33:66} 10; 3. TFA-dikloorimetaani 1 20 min (33:66) 4. Dikloorimetaani 3 1 min 5. DIEA, DMF 2 2 min (10:90) 15 6. Dikloorimetaani 3 1 min 7. Boc-aminohappo/DIC 1 15-120 min* 8. Dikloorimetaani 3 1 min 10, Tarkkaile liittämis- reaktion edistymistä*’' 20 11. Toista vaiheet 1-12 kullekin yksittäiselle aminohapolle
Liittämisaika riippuu yksittäisestä aminohaposta. Liittymisastetta voidaan yleensä seurata väri-25 testillä. Jos liittyminen on epätäydellistä, sama aminohap- ] po voidaan liittää uudelleen eri menetelmäin, esim. HOBt- f aktiivisella esterillä. Jos liittyminen on mennyt loppuun, ;j voidaan sitten liittää seuraava aminohappo. :j
Tätä menetelmää käyttäen valmistettiin yhdisteet, J
30 jotka on kuvattu taulukoissa 3, 4, 5 ja 6. j
Esimerkki 2 j GH:n vapautuminen rotissa in vivo j
Hankittiin kypsymättömiä Sprague-Dawley-naarasrot- j tia (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Saapumi- j 35 sen jälkeen niitä pidettiin 25 °C:n lämpötilassa 14:10 tunnin valo:pimeys-jaksolla. Vettä ja Purina-rotanrehua oli 21 saatavilla mielin määrin. Poikaset pidettiin emojensa luona 21 päivän: vanhoiksi.
Käksikymmentäkuusi päivää vanhoja: rottia, kuusi rottaa per käsittelyryhmä, nukutettiin: vatsaontelon sisäi-5 sesti pentobarbitaalilla (50 mg/kg) 20 minuuttia ennen i.V.-käsittelyä peptidillä·. Normaali suolaliuos, joka oli 0:.,.1-prosenttinen liivatteen suhteen, oli vehikkeli peptidien laskimonsisäisille (i.v.) injektioille. Nukutetut rotat, jotka painoivat 55 - 65 grammaa, injektoitiin i.v. taulu-10 kossa 3 osoitetulla määrällä kasvuhormonia vapauttavia yhdisteitä. Injektio tehtiin 0,1 mi:n liuoksena kaulalaski- j moon, j
Kaikki eläimet uhrattiin giljotiinilla 10 minuuttia ! viimeisen testi-injektion jälkeen (katso taulukko 3). Pään 15 irrottamisen jälkeen kerättiin vartaiosta tulevaa verta veren GH-tasojen määrittämiseksi. Sen jälkeen kun veren oli annettu hyytyä, se sentrifugoitiin ja seerumi erotettiin hyytymästä. Seerumi pidettiin pakastettuna siihen päivään saakka, jolloin kerättiin näyte: radioimmunologiseen määri-20 tykseen :(RIA) kasvuhormonitasöjen määritystä varten: seuraa- | van menetelmän mukaisesti, jonka kehitti National Institute f of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases |
( N I A DDK ) , J
Reagenssit lisätään yleensä RIA-analyysiputkiin yh- | 25 della Istumalla jääkaappilämpötilassa ( + 4 °C) seuraavassa | järj es tykses s ä: | jij a) puskuri, ::] b) "kylmä" (se on: ei-radioaktiivinen) standardi :;| tai tuntematon analysoitava s:eeruminäyte:, ij 30 c) radiojodeerattu kasvuhormoniantigeeni, ja j d) kasvuhormonia vastaan suunnattu antiseerumi. j
Reagenssin lisäys suoritetaan yleensä niin, että saadaan aikaan lopullinen RIÄ-putken laimennos noin j 1:30 000 (antiseerumin suhde nesteen kokonaistilavuuteen, 35 tilavuus/tilavuus)
Sekoitettuja reagensseja inkuboidaan sitten tyypil- ! | s.
22 lisesti huoneenlämpötilassa (noin 25 °Cj noin 24 tuntia ennen toisen vasta-aineen lisäystä (esim. apinan gammaglobuliinia vastaan suunnattu vuohen tai kanin antiseerumi) joka sitoutuu kasvuhormonia vastaan suunnattuun, korripieksoitu-5 neeseen antiseerumiin ja aiheuttaa sen suostumisen, R.IA-putkien saostuneet sisällöt analysoidaan sitten silmälläpitäen laskentatapahtumien lukumääriä tietyssä aikajaksossa gammatuikelaskurissa.. Valmistetaan standardikäyrä piirtämällä kuvaajaan radioaktiivisten laskentatapahtumien luku-10 määrä kasvuhormoni (GM) -tason funktiona;. Tuntemattomien j GH-tasot määritetään sitten standardi käyrän referenssinä. j
Seerumin GH mitattiin BIAilla reagensseilla, jotka j saätiin National Hormone and Mtuitary Program, -ohjelmalta. \
Taulukossa 3: olevat seerumitasot mitataan yksikössä ( 15 ng/ml lähtien rotan GH:n standardiarvosta 0,61 kansainvä- j lista ykslfcköä/mg (lö/mg). Tulokset mitataan keskiarvona \ +7- keskiarvon keskivirhe (SEM). Tilastollinen analyysi \ suoritettiin Studentin t-testillä. Taulukossa 3 esitetyt tulokset ovat keskiarvoja kuudella rotalla tehdyistä tutki- { 20 muksista. j
Taulukko 3
In vivo GH-vapautuminen, jonka kasvuhormonia vapa- | uitavat yhdisteet saivat aikaan pentöbarbitaatilia nukute- j tuissa rotissa, ]
25 {Eläimet uhrattiin 10 minuuttia viimeisen injektion jäi- I
; |
keen) ; I
Sarake A Kokonais- Kontrolli- Vapautunut GH j GH:ta vapaat- annos9 seerumi Seerumin GH ng/ml j 30 tava peptidi (pg/iv) GH ng/ml + SEM (N=6) j + SEM (N=6) | ! | j 23
Ala-His-D/JNal~ o,L 337 + 51 610 ± 90
Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2b 0,3 337 + 51 1140 + 18? 1.0 337 + 51 2909 ± 257 3.0 337 + 51 3686 + 436
His DTrp-Ala-Trp- ο/ϊ 131 + A3 560 + 148 DPhe-Lys-NH2b 0,3 131 ± 43 751 ± 88 1.0 131 ± 43 1790 + 252 3.0 131 + 43 2481 + 209 DA la-D0Na1-Ala- ÖJl 337 + 51 1381 ±222 ~
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 33? ± 51 2831 + 304 1.0 337 + 51 2886 + 179 3.0 337 + 51 3678 + 287
Ala-DONal .-Ala» ;
Trp-DPhe*Lys-HHj 0,3 167 + 46 363 + 73 1.0 167+46 1450 + 294 3.0 167 + 46 2072 ± 208 10,0 167 ± 46 2698 + 369 DAla-LONal-Ala- \
Trp-DPhe-Lys-NH, 0,1 263 + 45 1 0,3 160 + 151 315 + 85 1.0 160+151 426+ 41 j ä ] 24 DAla-DTrp-Ala-Trp- DPhs-Lys-KHj 0,1 111 ± 24 526 + 86 0,3 111 ± 24 1608 + 204 1.0 111 £ 24 2820 + 346 3.0 111 + 24 2437 + 214
Ala-D0Nal-Aia-
RtieTrp-DPhe·Lys»'NHj 0,1 167 ± 46 144 + 20 0,3 167 ± 46 258 + 28 1.0 167 + 46 261 + 24 3.0 167 ± 46 277 ± 85 D-Leu-DjSNal- ” ™ " ~~
Ala-Trp-DPhe-Lys-RH2 0,1 160 + 51 256 + 94 0,3 160 + 51 452 + 49 L?0 160+51 355 + 94 D-Trp-D^Nal-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 160+51 226+ 61 0,3 160 + 51 245 + 27 1,0 160 + 51 437 + 62
Trp-DPhe-Lys-NH2b 0,3 160 + 51 1418 + 302 j 1.0 160 + 51 2201 + 269 j \
His-DTrp-Ala-Trp j DPhe-Lys-NH2b 0,1 140 + 10 200 + 40 | 0,3 140 + 10 505 + 50 | 1.0 140 + 10 1640 ± 215 f DAsn-DiJNal-Aia- |
Trp-DPhe-Lys-BH- 0,1 228 + 23 122 + 38 I
0,3 228 ± 23 195 + 21 \ lf0 228 + 23 197 + 47 j j DHls-D^Nai-Ala- ]
Trp-DPhe-Lys-NH-j 0,1 228 + 23 386 ± 81 1 0^3 228 ± 23 605 + 82 j 1.0 228 ± 23 930 ± 96 | j .] j 25 DLys-D/?Nal-Ala-
Trp-DPhe-Lvs-NH2 0,1 228 ± 23 262 + 31 0,3 228 + 23 360 + 86 1.0 228 + 23 335 ± 56 DSet-DjSNai-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH2 Or 1 228 + 23 226 + 11 0,3 228 + 23 171 ± 68 1.0 228 + 23 212 ± 63
Ala-His-D0Nal-Alg-
Trp-DPhe-Lys-NH2b 0,3 228 + 23 1766 + 318 1.0 228 + 23 2610 ± 176 G1 y - D/3N a 1 -Al a -Tr p- DPhe-Lys-NH2 A3 ISO + 36 1237 + 269 1.0 160 + 36 2325+ 66 j 3.0 160 + 36 2696 + 370
10 f0 160 + 36 3656 + 159 I
Ser-D0Nai-Ala" ~ )
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 160 + 36 227 + 39 ] 1.0 160 + 36 595 + 112 1 3.0 160 + 36 1303 + 281 \ 10.0 160 + 36 2919 ± 320 fiec-D^Nal-Ala- f
Trp-DPhe-Aye-BH, 0r3 160 + 36 181 + 68 1 1.0 160 + 36 226 ± 58 j 3.0 160+36 316+ 66 1 10.0 160 + 36 1010 + 236 \
Ala-His-D^Ral-Ala- :j
Trp-DPhe-Lys-HH2b 0,1 160 ± 36 822 ± 263 I
0,3 160+36 1596+292 | 1.0 160 ± 36 2180 + 286 |
J
......-.......... ....... ^
Gln-D^Nal-Ala-Trp- j DPhe-Lys-NH2 0,3 131 + 63 126 + 15 | 1.0 131 + 63 360 + 66 \ 3.0 131 + 63 676 + 109 1 10.0 131 + 63 673 + 228 | _ . _ .. . . --. , ...... \ "" “_r'r .......:: ' ' .........} \ ] j 2 6
Pro-D^Nal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 135 ± 32 264 ± 31 1.0 135 ± 32 513 ± 123 3.0 135 ± 32 1690 + 103 G ly - DjSNal - Al a- Trp - ' ” DPhe-Lys-NH2 0,3 215 ± 33 1301 + 260 1.0 215 ± 33 2211 ± 146 3.0 215 ± 33 2364 ± 365 N, alfa,asetyyli-Gly-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-
Lys-NH2 0,3 262 + S3* 268 ± 21* 1.0 262 ± 53 599 + 219* 3.0 262 ± 53 626 + 210*
Sar-D^Nal-Ala-Trp- DPhe*Lys-NH2 0,3 262 + 53* 908 + 264* 1(0 262 t 53* 1681 ± 262* 3.0 262 + 53 2600 ± 316* D/3tial -Ala * Trp-DPhe-
Lys-NK2 0,3 215 ± 33 436 ± 98 1.0 215 ± 33 660 + 151 ] 3.0 215 + 33 776 ± 274 | N~alfa-asetyyli“D-beta--Nal~AIa- |
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 262 ± 53* 339 ± 17* j 1.0 262 + 53 430 ± 136 ί
3.0 262 + 53* 634 + 118* I
N-alfa-isopiropyyli-D-beta-Mal-Ala- ;j
Irp-DPhe-Lys*NHfl 0,3 262 + 53* 541 + 179* 1 2 l[o 262 ± 53* 972 ± 247* ] 3.0 262 ± 53* 1636 + 371* j
J
N-alfa-<3ietyyli~D~beta-Nal-Ala- |
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 127 + 32t 462 + 132. j 1.0 127 + 32Λ B99 ± 160 j 3.0 127+32* 1786 ± 373* | ~—--——-— -———— 1 $ -¾ j j 27 N-alfa-etyyli-D-beta-Nal-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 133 ± 32 531 + 80 1.0 135 + 32 1156 + 250 3.0 135 + 32 2664 + 225
Gly-D^Nal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 135 ± 32 1387 ± 352 1.0 135 + 32 1958 ± 353 3.0 135 + 32 2605 ± 97 $Ala-D/3Nal-Aia-Trp- DPhe-Lys-KHj 0,3 135 + 32 1937 + 343 1.0 135 + 32 3603 + 645 3.0 135 + 32 4000 ± 500
Ava^" - D/9Nal - Ala -
Trp-DPhe-Lys*NH2 0,3 135 + 32 2469 + 185 1.0 135 + 32 4034 + 680 3.0 135 + 32 3142 ± 392
Ala-D0Nal-Ala-Trp- | DPhe-NHCH2CH2NH2 0,3 208+148' 211+ 27 ! 1.0 208 + 148* 468 + 127* j 3.0 208 ± 148* 877 + 325* 30.0 208 + 148* 2325 + 477* | $ 5
Ala - DjSNal -Ala~Trp-DPhe» " ~~~ ~~™ \ NHCH,CH,CH0CH,CHnNH, L ^ 1 0,3 208 + 148t 284 + 132 ] 1.0 208 ± 148* 527 ± 166* | 3.0 208 + 148* 816 + 289* 1 30jΟ 208 ± 148* 3650 + 772* | ;3 D-Ala - D0Nal-Ala-Trp - DPhe - | NHCHnCH?CH,CH?CH?NH? | 0,3 Hi + 24 180 ± 37 | 10 111 ± 24 686 ± 135 j 3.0 111 ± 24 1490 ± 179 \ 10.0 111 + 24 2248 + 70 j ........... ....... ...... - - .......—............ ............... ' .....-..... .......... ] } 3 \ 3 ] 28
Ala-D0Na1Ά L a - Trp· DPhe-GMe 0,3 208 + 1*8* 211 ± 68* 1.0 208 + 168* 157 ± 35* 3.0 208 + 168* 692 + 147 30t0 2QS + 148* 554 + 127* D-Ala-DTrp-Ala* T rp * D Phe- Ly s -ΝΉ 2 0,1 m + 26 526 + 86 0,3 lii + 26 1608 + 206 1.0 111+ 26 2820+366 3.0 111+26 2637+216
Aib-D0Nal - Ala - Tr;JJ:·''' ~ “ 1 DFhe-Lys~NH2 0;1 208 + 168* 26* + 58* 0,3 208 + 148* 331 + 108* [ 1.0 208 + 148* 368 + 133 j 3.0 208 + 168* 1090 + 176* | D -Ala- OjSN ai ^ A1 a · t rp - D Ph® * ~~ ' ~ 1
Lys(iPr)-NH2 0,1 215 + 49 608 + 115 0,3 215 + 49 1753 + 419 1.0 215 + 49 1817 + 297 3.0 215 + 49 2336 + 196 | *;) Liuotettu DMSO:hön, | **) Liuotettu aminovaleriaanatiappoori (Ava) j a} Näin merkityt annokset annettiin 29 päivää vanhoil- | 5 ie naaraspuolisille rotille
b) Kontrolli - GHRP:t I
Taulukossa 3 keksinnön mukaisia yhdisteitä verra- I
taan yhdisteisiin, jotka eivät ole tämän yleisen kaavani mu- 1 kaisia, ja niiden osoitetaan edistävän ylivertaisesti kas-10 vuhormonitasojen vapautumista ja nousua sellaisten rottien veressä, joille sellaisia yhdisteitä pn annettu. Edullisten j yhdisteiden yllättävät kasvuhormonia vapauttavat aktiivi- j
suudet ovat varsin arvokkaita, koska lyhyempiketjuisen, no- I
lekyyllpainoltaan pienemmän polypeptidin, jossa on sulit eel- | 15 linen stabiili ja halpa aminohappo D-alaniini aminopäässä j ja pentaanidiamiini Lys:n paikalla C—päässä·, pitäisi osoit- \ taut.ua olevan kustannuksiltaan alhainen keino lisätä kasvu- j .s j 29 hormonitasoja eläimissä.
Esimerkki 3 - GH: n vapautuminen rotissa in vivo suun kautta tapahtuvan antamisen jälkeen
Esimerkin 2 menettely toistettiin, paitsi että ro-5 tille annettiin ilmaistut yhdisteannokset mahansisäisillä putkilla. Annetut yhdisteet, käytetyt ännostäsot ja tulök-set esitetään taulukossa 4.
Taulukko 4
In vivo GH-vapaatominen, jota kasvuhormonia vapaut-10 tavat yhdisteet edistivät pentobarbitaatilla nukutetuissa rotissa.
{Rotat uhrattu eri aikoina peptidin mahansisäisen antamisen jälkeen)
Sarake A Kokonais- Seerumin Seerumin 15 GH:ta vapaut- annos GH ng/ml GH ng/mi tava peptidi (mg/kg) ± SEM (N=6) ± sEM (N=6) vikapisteessä (15') (20’) 20 (30 *) |
Alä-His«D0Nal-Ala- ]
Trp*DPhe*Lys-NH2a 10 247 ± 32 786 ± 244 1 30 247 + 32 1914 + 294 1 DAla-D^Näl-Ala- t
Trp-OPhe-Lys^Hj 10* 247 * 32 116 + 298 i| 30** 247 + 32 2038 + 446 ij | j 30
Ava-D/3Nal-Ala-
Trp-DPhe-tys-NH2 30 322+145* 2135+586*
Gly - DjSHa 1 * A l a -
Trp-DPhe-Lys-NHj 30 267 + 32 1072 + 137
His-DTrp-Ala-
Ttp-PPhs-Lys-NHg3 30 247 + 32 1810 + 437
Ala-His-D0Nal-Ala-
Trp-DPhe-Lys«NH2a 10 1?S + 49(15':) 1621 + 363 147+30(20} 1605+621(20') 133 + 18(30’) 752 + 81 (30') DAla - 0/@Nal - Ala *
Trp-DFhe-lys-t5H2 10 196 + 49(15') 706 + 133 (15') 147 + 30(20') 1062 ± 254 (20')
Gly-D0Nal-Ala- t rp - D Ph e - Ly s - NH 5 10 196 + 49(1.5;') 957 ± 188 (15·) 11 167 + 30(20') 1685 + 526 (20«) HIs-DTrp-Ala-
Trp-DPhe-Lysa 10 196 + 69(15') 1131 ± 189 (15'} 147 + 30(20') 686 + 169 (20') SAla - DjSNal - Ala
Trp-DPhe-Lys-NH-> 10 196 + 49(15') 1202 + 429 (15') * 147 + 30(20') 1217 + 239 (20-)
Ava-D#Na1-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH, 10 196 + 69(15' } 1407 + 204 (15' > 147 + 30(20') 1251 + 351 (20') *) Suspensio (kevyt* tai raskas**) etikkahappo lisätty a) Kontroliipeptidit GH:ta vapauttava aktiivisuus säilyy tämän keksinnön 5 mukaisilla yhdisteillä hyödyllisillä tasoilla sen jälkeen kun ne on annettu rotille suun kautta. Tämä on arvokasta, koska tämä antomenetelmä lisää peptidien terapeuttista hyödyllisyyttä. j
Esimerkki 4 - GH:n vapautuminen rotissa in vivo 10 Esimerkin 2 menettely toistettiin. Annetut yhdis- \ } teet, käytetyt annostasot ja tulokset esitetään taulukoissa 5 ja 6. j
Taulukko S I
|
In vivo GH-vapäutuitiio.en:, jota kasvuhormonia vapaut- j
15 tavat synteettiset peptidit edistivät pentobarbitaätilla I
nukutetuissa rotissa. j (Eläimet uhrattiin 10 minuuttia viimeisen injektion jälkeen) j 31
Kontrolli-
Sarake A Kokonais- seerumin Vapautunut GH
GH:ta vap.aut- annos GH ng/ml Seerumin GH ng/ml tava peptidi (pg/iv) ± SEM (N=6) ± SEM (K=6) 'DAla-D/SKal- 0,30 216 + 27 340 + 38
Ala«Trp-DPhe-NH2 1,00 216 + 27 1205 ± 335 3.00 216 + 27 1703 ± 182 10f00 216 ± 27 2741 + 484 DAla-D£Nal-Ala*Trp* DPhe-Äla-NH, 0,30 216 + 27 611 ± 68 1.00 216 + 27 929 ± 209 3.00 216 + 27 1765 + 320 10.00 216+27 2644+358 g ~ ~
Lys -DAla^D/SNal-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NHo 0,10 216 + 27 216 ± 40 0.30 216 ±27 269 + 31 1f 00 216 ± 27 432 ± 143 3.'00 216 + 27 771 + 134 f — DAla-Dj3Nal-Aia- "
Trp-DPhe-NH-Chx-NHj 0,03 216 + 27 517 ± 135 1 0,10 216 ± 27 1078 + 174 1 0,30 216 + 27 1831 + 436 | 1.00 216 ± 27 3120 + 761 j DAla-D/9Nal-Ala- :
Trp-DAla-Lys-NH, 0,10 187 ± 36 220 + 34 0,30 187 ± 36 167 + 48 j i 00 187 + 36 339 + 61 | 3.00 18? + 36 778 + 174 1 10.00 187 ± 36 1676 ± 470 f 30.00 187 + 36 1791 ± 384 j - ..... |
Ij | § \ li 32 DAla-D%al-Ala- 0,03 153 + 27 409 + 97
Tr ρ-DPhe- Lys.HH 2 0,10 153 + 27 1469 + 152 0,30 153 ± 27 2322 ± 265 1.00 153 + 27 2765 ± 352 DAla - DySNal - Ala -Trp*DPhe-Ala- NH(CH2)5NH2 0,03 177 ± 45 542 ± 98 0,10 177 ± 45 932 + 84 0,30 177 ± 45 1121 + 212 1.00 177 ± 45 2599 + 144 ΝαIMA- DjSNa 1 - Al a -
Trp-DPhe-LysNH2 0,03 192 ± 41 696 + 108 0.10 192 ± 41 1049 + 198 0,30 192 + 41 2567 ± 419 1.00 192 ± 41 2001 + 341 DAla - D/SNa 1 - Ala - Trp - ” —- DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 192 + 41 846 ± 105 0,30 192 + 41 1886 + 493 1.00 192 + 41 2209 + 187 3.00 192 ± 41 3359 ± 433 DAla-Tcc-Ala-Trp- DPhe -Lys-NH2 0,30 93 + 22 149 + 20 3.00 93 + 22 142 + 35 DAla-Gly-Gly-Trp-DPhe-
Lys-NH2 0,30 93 + 22 107 + 14 3.00 93 ± 22 89 + 15 DAla-D^Nal-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NHn 0,03 93 ± 22 230 ± 23 ! 0,10 93+22 1006 ± 204 0,30 93 + 22 2110 + 260 00 93 + 22 1825 ± 328 \ ::1 j 33 DAla-D/3Nal-Ala-Trp- DTic-Lys-NHj 0,03 93 + 22 141 + 26 0,10' 93 ± 22 156 ± 62 0,30 93 + 22 124 + 31 1,00 93 + 22 151 + 24 DAla-D/9Nal -Ala*
Trp-DPhe-Lys-OH 0,10 93 ± 22 558 + 162 0,30 93 ± 22 1730 + 306 DAla-DjSNal-Aia-
Tcc-DPhe-Lys-NH^ 3,00 145 + 17 537 + 43 10.00 145 + 17 746 + 92
DjSNal-Gly-Gly-Trp- DPhe-Lys-NH, 3,00 145 + 17 417 + 37 10.00 145 + 17 397 + 114 DAla-D/SNal-Ala-Trp- DPal - Lys -NH-, 0,.10 145 + 17 365 + 42 Ä 0,30 145 + 17 584 + 148 DA 1 a - D/9N a 1 - A1 a - Trp - " ~ ’ j DPal-lys-OH 0,10 145+17 928+184 0,30 145 + 17 1782 + 241 3Ma - His - DjSNal - Ala »Trp* ~~ DPhe-Lys-NH, 0,03 87 + 11 122 + 11 0,10 87 + 11 185 + 27 \ 0,30 87 + 11 101 + 12 0,10 87 ± 11 112 ± 13 | 3He-His-D0Nal-Ala-Trp* i
DPhe-Lvs-NH2 0,03 87 + 11 134 + 28 I
0,10 87 + 11 159 + 30 j 0,30 87 + 11 78+19 | 1.00 87 + 11 134 + 27 ) tip-Aia-DjONal-Ala-Trp- 1 DPhe-Lys-NH, 0,10 87 ± 11 168 ± 27 ] 0,30 87 + 11 167 + 28 ' j 1.00 87 + 11 152 + 74 j 3.00 87 ± 11 272 + 63 j ύ 34 DAla-D^Nal-Ala-Trp- DPhe*Lys-NH2 0,03 247 ± 53 870 + 136 0,10 247 ± 53 1440 + 267 0,30 247 + 53 2420 + 456 1.00 247 ± 53 2855 ± 347 3.00 247 ± 53 3421 + 377 DAla*DTcc-Ala Trp- "™ DPhe-Lys-NH2 0,10 247 ± 53 165 + 26 0,30 247 + 53 183 + 9 1.00 247 + 53 207 + 38 3.00 247 + 53 153 ± 22 10.00 247 + 53 269 ± 47
Ava-Trp-DTrp-Lys-NH2 0,10 247 + 53 153+ 3(Γ 0,30 247 + 53 144 +- 14 1.00 247 .+ 53 11.7 + 9 3.00 247 + 53 205 ± 59 10.00 247 + 53 214 + 48 DA'la-D#Nal-Ala-Trp * DPal-Lys-NH2 0,03 228 + 48 203 + 20 0,10 228 ± 48 772 + 142 0,30 228 + 48 979 ± 182 1.00 228+48 1691+139 3.00 228 + 48 3249 ± 526
Tyr- DAla-D^tial - Ala-Trp- DPhe-Lys-NH, 0,03 228 + 48 164 + 52 0,10 228 + 48 247 + 51 0,30 228 + 48 196 + 39 1.00 228 + 48 329 + 57 3.00 228 + 48 878 + 170
Ala-His-D/SNal-Ala-Trp - DPhe-Lys-NH2 0,10 228 + 48 894 + 112 | 0,30 228 + 48 1128 + 274 j
1..00 228 + 48 1362 + 198 I
* S
DAla-D^Nal-Ala-Trp- | OPhe-Lys-OH 0,03 228 + 48 300 + 82 \ 0,10 228 + 48 585 + 141 ] 0,30 228 + 48 1202 + 236 |
1.00 228 + 48 2610 + 355 I
ä j :¾ 35 DAla -DjSNal -Ala-Trp* NHe-DPhe-Lys-NH2 0,03 167 ± 29 123 + 17 0f10 167 + 29 132 + 30 0,30 167 + 29 232 + 49 l;0O 167 + 29 233 ± 41
His-Trp-Ala-Trp-Phe-
Lys-.NH* 1,00 167 ± 29 125 + 24 3.00 167 ± 29 201 ± 19 10.00 167 +.29 130 + 25 30.00 167 + 29 182+ 36
Ava-DAla-D^Nal*
Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 167 ±29 209 ± 33 0 10 167 + 29 144 + 42 0*30 167 + .29 185 + 47 1.00 167 + 29 499 ± 110 ^Ala-D^Nal-
Ala-Trp-DPhe-Ly$-NH2 0,03 L67 + 29 489 ± 71 0,10 167 + 29 1112 + 194 1
0,30 167 + 29 1993 ± 259 I
1/00 167 + 29 3061 ± 238
DA la * D/9Na 1 - G ly - Tr p - ~ " " ~ I
DPhe-Lys-NH2 0,10 121 + 14 226 + 26 I
0,30 121 ± 14 170 + 31 \
1.00 121 + 14 414 + 101 J
3.00 121 + 14 713 + 126 |
DA la - D0Nal - G1 y - G ly · ™ ~ I
Trp-DPhe-Lys-NHo 0,10 121 + 14 95 + 15 j 0,30 121 + 14 82+16 | 1.00 121 + 14 177 + 43 1 3.00 121 ± 14 223 + 58 )
Asp-DAla-D/?Nal-Ala- \
Trp-DPhe-Lys*NH2 0,03 121 ± 14 210 ± 53 | 0,10 121 ± 14 322 + 48 1 0,30 121 + 14 557 + 181 j 1.00 III ± 14 821 .+ 173 ' j j
........................····-·-·.·.·.·.·. v.;.J
36 DÄla - DjSNaT-AIa -Trp' - ~ “ ‘ DPhe-NH-Chx-NHj 0,03 121 + 14 335 + 106 0,10 121 ± 14 652 + 129 0,30 121 + 14 1528 + 252 1/00 121 + 14 2410 + 370 DAI a - D/SNa 1 * DA l a - T rp * DPhe-Lys-NHj 0,10 200 + 45 166 + 36 0,30 200 ± 45 19? + 33 1.00 200 + 45 343 + 73 3.00 200 ± 45 531 + 121 DAla-D^SNal-Ala-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 200 + 45 147+21 0,30 200 + 45 184 + 45 1.. 00 200 + 45 206 + 66 3.00 200 +.45 143 + 9 DAla-D8Nal-Ala-Trp- DPhe-NH * Chx- NH* 0.10 200 + 45 1246 + 189 0,30 200 + 45 1616 + 250 1.00 200 + 45 2574 + 467 3.00 200.+ 45 2789 + 130 DAla - aϊ Ά1 a - ” 0 ,03 200 + 45 608 + 140
Trp-DPhe-Lys-NHo 0,30 200 + 45 920 + 225 1 00 200 + 45 1755 ± 291 3.00 200 + 45 2527 + 196 DAia-D/SNal-Ala-Trp-
Pro-Lys-Ntto 0,03 157 + 40 113 + 14 1 00 157 + 40 136 + 40 | 3.00 157 + 40 195 + 35 | 10^00 157 ± 40 226 + 42 | Ί DAla-D$Nal-Ala-Trp- :j DPro-Lys-NH? 0,30 157+40 234 + 36 j 1 00 15? ± 40 358 ± 48 \ 3.00. 157 + 40 576 + 77 j 10,00 157 + 40 1624 + 241 j ξ 5 $ i ! 37 DAla-D#Nal-Ala-Trp- DLeu-Lys-NH2 0;30 157 + 40 202 + 27 1.00 157 ± 40 165:+. 12 3 .,00 157 + 40 307 + 51 10.00 157 ±40 1591 ±568
Ava-DjflNal-Ala-Trp" 0Pbe-Lys-NH2 0,03 15? ± 40 768 + 191 0,10 157 ± 40 1277 + 61 0,30 157 ± 40 1733 + 254 1.00 157 ± 40 2418 + 162
Taulukko 6
In vivo GH-vapautuminen, jota kasvuhormonia vapauttavat synteettiset peptidit edistivät pentobarhitaatilla nu-5 kutetuissa rotissa, (Eläimet uhrattiin. 10 minuuttia yiimeisen injektion jälkeen)
Sarake Ä Kokonais- Kontrolli-- Vapautunut GH
GH:ta vapaut- annos'" seerumi Seerumin GH n g/ml tava peptidi (pg/iv) GH ng/ml + SEM (N=6) 10 ± SEM (N-6) DAla-D^Nal-Ala * 0,03 186· + 34 612 + 84 2rp-DFhe-iLysHH2 0,10 186 ± 34 630 ± 124 0,30 186 + 34 1877 + 195 Ϊ 1.00 186 + 34 3008 ± 417 | DAla-D^Nal- Ala-homo 1
Phe-DPhe * LysKHo 0,03 93 ± 13 214 + 71 j 0,10 93+13 214+ 58 \ 0,30 93 + 13 406+121 \ 1.00 93+13 1189+120 j 38 DAla-D0Nal-Ala -Trp-DPhe-Ala- Ir 3 - diaminopropaqrii 0,03 93 + 13 444 + 60 0,10 93 ± 13 517 ± 109 0,30 93 + 13 2341 + 479 1.00 93 + 13 2468 + 276 DAla-D/?Nal-Ala* Trp- DPhe*LysNH2 0,03 93 ± 13 362 + 64 0,10 93 + 13 800 + 192 0,30 93 £ 13 2674 + 486 1.00 93 ± 13 3658 ± 610 DAla-D/8'Nal- Ala-Trp - DPhe-Ala-1,6, 0,03 85 + 16 395 ± 91 heksyylidiamiini 0,10 85 £ 16 905 + 113 0,30 85 £ 16 735 £ 166 1.00 85 £ 16 2708 + 310 m^DjSHal-Ala-Trp- DPhe-Ala-1.3, 0,03 85 ± 16 566 + 157 dlaminopropaini 0,10 85 £ 16 645 + 167 0,30 85 £ 16 1428 + 271 1.00 85 £ 16 2972 ± 365 DAla-D/JNal-Ala-Trp- DPhe-AxgHHp 0,03 125 ± 12 252 £ 29 0.,10 125 ± 12 645 ± 90 0 30 125 £ 12 1180 ± 318 1.00 125 + 12 2197 + 285
Arg-DAla-D#Nal-Ala-Trp- DPhe-ArgNH, 0,10 125 ± 12 155 ± 43
0. 30 125+12 247+ 70 I
1, QQ 125 £ 12 276 £ 16 | 3 IMA-Djfltlal-Ala.-Trp- 1 DPhe-Ala-1,6 0,03 125+12 332 ± 59 j heksyylidiamiini 0,10 125 + 12 609 + 165 |
0.30 125 ± 12 1139 + 232 I
1.00 125 + 12 1996 + 372 j :| 5 $ ] 39 DAla - D/?Na 1 * Ala - Trp -
LysNH2 0,30 160 + 33 187 ± 44 lf00 160 ± 33 237 ± 18 3.00 160 + 33 198 + 31 10.00 160 + 33 193 + 33 30.00 160 + 33 236 + 23 DAla* D/9Nal r Ala-
TrpNH2 0,30 160 ± 33 115 ± 22 1.00 160 ± 33 107 ± 23 3.00 160 + 33 101 + 13
10.00 160 + 33 199 + 6Q
30.00 160 + 33 232 + 69 DAla-DjSNal- Ala * Trp - DPhe-Ala-NH(CH2)5 ! NH2 0,03 160 ± 33 517 4 89 ! 0,10 160 ± 33 USA + 255 | 0,30 160 + 33 2023 ± 262 ! 1.00 160 ± 33 3661 + 635 DAla-DjSNal-Ala-lrp
Pro * LysNHn 0,30 157 ± 40 113 ±16 \ 1.00 157 + 60 136 + 60 f 3.00 157 + 60 195 + 35 10.00 157 ± 60 226 + 62 f DAla-D^Nal-Ala- =:
Trp-DPro-LysNH, 0,30 157 + 60 2*6 + 36 I
1 00 157 + 60 353 ± 48 1 3.00 157 ± 40 576 + 77 j 10.00 157 + 60 1626 ± 261 | DAla-D0Nal-Ala*Trp- ) DLeu-LysNH, 0,30 157 ± 60 202 ± 27 | 1.00 157 ± 60 16.5 ± 12 1 3.00 157 ± 40 307 ± 51 10.00 157-± 60 1591 + 568 1
" I
Ava-B^Nal-Ala-Trp \ DPhe-LysNHj 0,03 157 + 40- 768 ± 191 | 0,10 157 + 40 1277 ± 61 | 0,30 157 ± 40 1733 ± 254 j 1.00 157 + 40 2418 + 162 j 1 j ! 40 a.^ABU-OjflNal-Ala-
Trp-DPhe - LysfJHj O', 0,3 108 + 20 621 + 85 0,10 108 + 20 1230 + 317 0 f30 108 + 20 2385 + 182 1.00 108 ± 20 3011 ± 380 DAta-D^Nal -Ala-Trp- " ~~ “ DPhs-HisMH^ 0^03 108 + 20 246 + 22 0,10 108 + 20 199 + 34 0,30 108 + 20 370 + 67 1.00 108 + 20 1419 ± 230 pAla-D^Nal-Ala-Phe· DPhe-LysNHj 0,03 108 + 20 366 + 81 0,10 108 ± 20 1011 ± 175 0,30 108 + 20 2361 + 233 :1,0.0 108 + 20 3057 ± 472 DAla * D/SNa l - Ala-Trp * NH-Ghx-NHg 0,10 108 +20 151+35 0t3O 108 + 20 251 + 43 1.00 108 + 20 227 + 55 3.00 108+20 349+ 72 DAla - DiSNal -Ala- Trp- DPhe-OrnNH, 0,03 200 + 33 515 + 92 0,10 200 i 33 787 + 71 0,30 200 + 33 1288 + 365 1.00 200+33 1888+615 DA1a -D^Na1-A1a -T rp- DHis-LysNH, 0,03 200 + 33 287 ± 48 ? 0,10 200 + 33 131 + 37 | 0,30 200 + 33 337 + 78 j 1.00 200 + 33 457 + 124 |
Taulukoista 5 ja 6 käy ilmi, että tämän kaavan mu- | kaiset yhdisteet edistävät kasvuhormonitasojen vapautumista j ja nousua veressä suuremmassa määrin kuin yhdisteet, jotka ]
5 eivät ole kaavan mukaisia. I
J
:3 i 41
Esimerkki 5 GE:n vapautuminen rotissa in vivo
Noudatettiin esimerkin 2 mukaista yleistä menetelmää, paitsi että peptidit injektoitiin ihonalaisesti pikem-5 min kuin laskimonsisäisesti, ja uhrausäika oli +15 minuuttia pikemminkin kuin +10 minuuttia. Annetut yhdisteet, käytetyt annostasot ja tulokset esitetään taulukossa 7.
i i | '3
II
] 5 42
Taulukko 7
Kontrolli-
Sarake A Kokonais- seerumin Vapautunut GH
GH:.ta vapaut- annos GH ng/ml Seerumin GH ng/ml 5 tava peptidi (pg/iv) ± SEM (N=6) ± SEM (N=6) XMA- D/SNa l - Ala * ?he-DFhe-Lys-ttH2 0,03 147 + 21 181 ± 36 0,10 147 + 21 399 + - 40 q3Q 147 ± 21 808 + 187 1.00 147 + 21 2394+475 QTASU· D^Nal-Ala-Phe- DPhe-Lys-NH2 o,03 147 ± 21 192 ± 29 0,10 147 ± 21 288 + 62 0,30 147 + 21 461 + 90 1.00 147 + 21 1441 + 203 XHA-D^Nal-Ala-
Trp-DPhe-Ala-1,5- pencadlamine 0}03 147 +21 475 + 96 0,10 147 + 21 916 ± 169 0,30 147 + 21 1118 + 243 1.00 147 + 21 2660 + 599
His -D/JNal-Ala- Fhe DPhe-Lys-NH, 0,03 217 + 33 317 ± 55 0,10 21? ± 33 348 + 65 0?30 217 ± 33 1283 ± 258 1.00 217 + 33 1374 + 107
Ala-His*D$Nal-Ala-Fhe-DFhe-Lys- NH2 0,03 217 + 33 341 + 35 0,10 217 + 33 516 ± 118 O?30 217 ± 33 1060 ± 151 1.00 217+33 1467 + 208 3 :¾
7ABU- D/9Nal* I
Ala-Fhe-DFha-Lys- | ΝΗτ 0,-03 217 + 33 197 + 31 :| o 10 217 + 33 182 ± 20 ] 0,30 217 + 33- 524 + 116 .} 1'00 217 + 33 1127 + 110 j §
:J
43 DAla-D0Nal-Ala-
Fhe-DPhe-Lys- 0,03 217+33 287+ 62 m2 0,10 217 + 33 1084 + 162 0,30 217 + 33 1982 + 345 1.00 217+33 2887+275 DAia-DPhe-Ala-Phe-0,03 132 + 18 167 + 29 DPhe-Lys-NH, 0.10 132 + 18 499 + 62 oj30 132+18 1132+145 1.00 132 + 18 '2147 + 268 DAla * D/9Na 1 -Ala -
Fbe-OPhe-Lys-NH, 0 03 132 + 18 356 + 77
OfIO 132 + 18 798+132 0,30 112+18 156A + 224 1.00 132 + 18 2272 + 406
Esimerkki 6
Peptidifragroenttien kondensaatioreaktio peptidin muodostamiseksi 5 Yleiset menetelmät
Sulamispisteet voidaan määrittää käyttämällä Thomas Hoover “kapillaarisulami.splstei.aitetta.. Infrapuna (IR) spektrit voidaan, mitata .Perkin-Elmer Model 137 tai Nicolet Model 5DX -spektrofotometrillä ja raportoida aaltolukuina 10 -{piti"·1·) . Massaspaktrit (MS) voidaan hankkia käyttämällä VG
Analytical Ltd.:n Model 2ÄB-1F massaspektrometria EI (elektroni-impakti}, FD (kenttädesorptio) tai FAB (nopea-atomipommitus) -tiloissa. GCMS yöidäan hankkia käyttämällä Finnigan. 4023 GCMS-laitetta, joka on varustettu 30 m DB5-ka-15 pillaaripylväällä (J & W Scientific), käyttäen heliumia
kantajakaasuna. Optiset rotaatiot voidaan mitata käyttämällä Autopol III -polarimetria, jota valmistaa Rudolph Research, I
1H-NMR-spektri voidaan hankkia JEOL GX-400 -NMR- 1 j 20 instrumentilla, joka toimii 400 MHz:n taajuudella, tai JEOL | GX-270 -NMR-instrumentilla, joka toimii 270 MHz:n taajuu- ij della. Nämä instrumentit kykenevät rutiininomaisesti alle j 0,7 Hz: n digitaaliseen resoluutioon. Kemialliset siirtymät j ilmaistaan miljoonasosina suhteessa sisäiseen 3-(trimetyy-25 lisilyyli)-tetradeuteronatriumpropionaattiin (TSP). j 4 4
Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) voidaan saada aikaan käyttämällä Ritachi-järjestelmää, joka koostuu L-5000-gradientinsäätelijäätä ja 655Ä-pumpusta, joka on kiinnitetty Vydac 201TP1010 tai 218TP1010 semiprepa-5 ratiiviseen pylvääseen. Veden, joka on 0,2-prosenttinen trifiuorietikkahapon suhteen, ja metanolin yhdistelmiä voidaan käyttää eluointiliuottimena. Mielenkiintoiset yhdisteet eluoituvat tyypillisesti virtausnopeudella kuusi ml minuutissa, jolloin gradientti kasvattaa orgaanisen kom-10 ponentin osuutta nopeudella noin 1-2 % minuutissa. Sitten yhdisteet havaitaan soveliailla aallonpituuksilla käyttämällä LKB 2140 -UV~diodirividetektoria. Integroinnit voidaan sitten suorittaa käyttämällä Nelson ..analytical -ohjelmistoa (versio 3.6).
15 Reaktiot suoritetaan inertissä typpi- tai argon- kaasukehässä ellei toisin spesifioida- Vedetön tetrahydro- i furaani (THF, U.V. grade) ja dimetyyliformamidi (DMF) voidaan ostaa Burdick and Jackson -yhtiöitä ja käyttää suoraan pullosta.
20 A. Tr ipeptidif ragmen tin - 2HN-Trp-DPhe-Lys (Boc) -NH2 valmistus l^-bentsyylioksikarbonyyli-N-t-hutoksikarbonyyli}-lysiiniamidi, 4 10 DC:n lämpötilassa olevaan karbonyylidi-imidatso-25 Iin (GDI, 2, 88,24 g, 0,544 mol) ja kuivan tetrahydroFuraanin (THF, 1500 ml) muodostamaan liuokseen lisätään hitaasti Na-bentsyyliaksikarbonyyii-(N ^-t-butoksikarbonyyli)lysiini (1, 180 g, 0,474 mol). Kaasun kehittymistä tarkkaillaan tämän lisäyksen aikana, Samalla kun N 5-bentsyylioksikarbo-30 nyyli-(N ^-t-butoksikarbonyyli)lysiihi-imidätsöli-välituote 3_ on. muodostumassa, lisätään kyllästetty ammoniakin ja THF:n (2000 ml) liuos (vedetön ;NH3-kaasu viedään THF:n läpi ] 5 - 10 °C::n lämpötilassa) . Sen jälkeen kun välituotteen 3 | muodostumisen arvioidaan: olevan lopussa (kun kaasun kehit- | 35 tyminen on loppunut, noin 2 tuntia), puolet 3:n sisaltäväs- ;| tä THF-liuoksesta lisätään ammoniakkiliuokseen 3:n sisäl- jf | 45 tavan liuoksen loppuosa lisätään 30 minuuttia myöhemmin.
Jatkuva ammoniakkikaasun virtaus pidetään yllä koko additi-oiden ajan ja vielä 45 minuuttia sen jälkeen. Kun kaksi 3;n sisältävää liuosta on lisätty, muodostuu valkoinen sakka.
5 Reaktion annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan ja sekoittua 15 tuntia. Liuotin poistetaan lietteestä in vacuo. Jäännös lietetään veteen, ja tuloksena oleva kiinteä aine kerätään i mus u o d a t u ks.e 11a, N^-t-butoksikarbonyylilysiiniairtidi, 5 10 Lysliniamidin _4 {181,48 g, 0, 479 mol) liuos me- tanolissa (MeOH, 1000 ml) lisätään katalysaattoriliettee-seen (5-prosenttinen Pd/C (5 g) metanolissa (250 ml) ) argonissa. Vetyä kuplit et a an reaktio seoksen läpi. (noin 15 minuuttia) ja reaktiota sekoitetaan; sitten vetykaasukehän ai- \ 15 la, kunnes HPLC-analyysl osoittaa että reaktio on täydellinen (36 tuntia). Vetykaasukehä syrjäytetään sitten argonilla. Reaktioliuos selkeytetään CeiiteR -kerroksen läpi ja liuotin poistetaan in vacuo, jolloin saadaan kiinteä aine.
N^-benfcsyylioks ikarbonyyli-D-fany1aianyyli-(Nξ -1-2 0 butoksikarbonyyli)lysiiniamidi, 8 N^-bentsyyl io ks i karbonyyli-D-f enylalaniihi (_6, 126,39 g, 0,423 mol) lisätään hitaasti 10 °C:n lämpötilassa olevaan CDI-liuokseen (2, 66,03 g, 0,409 mol) THF:ssä (500 ml) , Kaasun kehittymistä tarkkaillaan addition aika-25 na. Kun kaasun kehittyminen lakkaa, lysiiniamidi _5 (110,75 g, 0,452 mol) lisätään THF-liuoksena (500 ml). Noin 48 tunnin kuluttua seos suodatetaan kiinteiden aineiden poistamiseksi. Suodos konsentroidaan in vacuo. |
Tuloksena oleva jäännös pannaan etyyliasetaattiin | 30 (EtQÄc, 500 ml) ja pestään sitten seuraavasti erotussuppi- | lossa: ]
1. HCl:n vesiliuos (1 N, 3 x 50:0 ml), pesun 1 pH I
noin 8, seuraavien pesujen pH:t 1, | 2. vesi (500 ml), : ] 35 3. Na2C03 (puolikyllästetty, 2 x 500 mi) suodate- j taan muodostuneiden kiteisten kiinteiden aineiden keräämi- ] ; | 46 seksi .(. _8 }, 4. vesi (3 x 500 ml).
Orgaaninen kerros: kuivataan MgSG^cllä. Selkeyttämisen jälkeen liuotin poistetaan in vacuo. Tuloksena oleva 5 jäännös voidaan jälleenkiteyttää kuumasta EtÖÄcistä, jolloin saadaan toinen 8_:n näyte.
D - f eny 1 alanyy 1 i - (N*-t-butoksikarbonyyli)lysiiniamidi, 9.
Ämidin _8 (120, 53 g, 0,229 mol) metanoliliuos 10 (1 500 ml) lisätään katalysaattorilietteeseen (50 g 5-pro senttista Pd/C:tä 200 ml:ssa MeQH:ta), Ärgonkaasukehä syrjäytetään vedyllä.. Kun HPLC-analyysi viittaa siihen, että reaktio on mennyt loppuun (noin 4 tuntia), vetykaasukehä syrjäytetään argonilla. Reaktioliuos selkeytetään sitten 15 Celiie**· -kerroksen läpi ja suodos saatetaan jäännökseksi in vacuo. Tämä dipeptidituote voidaan käyttää suoraan tx.ip.ep-tidin 12 valmistuksessa.
N“-foenfcsyylioksikarbon.yyli-t:ryptofyyli-D-fenyyl±ala-nyyli- {N^-t-butoksikarbonyyli} lysiiniamidi, 12 20 Na-bentsyylioksikarbonyylitryptofäänin (10, 67,60 g, 0,200 mol), THF:n (500 ml) ja CDI:n (2, 33,05 g, 0,204 mol) 10 °C:n lämpötilassa olevaa liuosta sekoitetaan kunnes kaasun kehittyminen lakkaa. j>:n liuos (40,8 g, 0,103 mol) THF*ssä (noin 200 ml) lisätään sitten reaktioseokseen. Tu-25 1oksana olevan liuoksen annetaan reagoida 15 tunnin ajan samalla kun se lämpenee huoneenlämpötilaan. Muodostuva kiinteä aine: kerätään sitten irausuodatuksella. Suodos saatetaan jäännökseksi konsentroimalla in vacuo. Tuloksena oleva jäännös ja kiinteä aine yhdistetään jälleen ja otetaan EtO-30 Ac:hen (4 000 ml) hiukan lämmittäen. Kun liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan, muodostuu kiinteä aine. Kiinteä aine kerätään imusuodatuksella. Tämä kiinteä aine jälleenkitey-tetään kuumasta MeOH: s.ta, jolloin saadaan puhdistettu tri-peptidi 12. EtOAc-suodos (ensimmäisestä kiteytyksestä) pes-35 tään seuraavasti erotussuppilossa: 1. HCl:n vesiliuos (i N, 2 x 500 ml), 47 2. vesi (1 x 500 ml), 3. Ha2CÖ3:n vesiliuos (puolikyllästetty, 2 x 500 ml), 4. MaCl:n vesiliuos {I χ 500 ml).
Orgaaninen kerros kuivataan MgSQ^llä ja selkeyte-5 tään sitten imusuodatuksella... Suodoksen liuotin poistetaan in vaeuo. Tuloksena oleva jäännös otetaan uudestaan EtO-Ac:hen, jolloin saadaan kuiva kiinteä aine. Kiinteä aine voidaan panna jälleenkiteytykseen kuumassa MeGH:ssa, jolloin saadaan toinen 12:n saanto valkoisena kiinteänä ainee-10 na.
Tryptofyyli-D-fenylalanyyli- {N^-t-foutyylioksikar-bonyyli)lysixniamidi, 13
Tripeptidin 12 (6:4,59 g, 0,091 mol) metanoliliuos (1 500 ml) lisätään ka t a lysaattPri lietteeseen- (5 g 5-pro-15 senttistä Bd/C:tä 250 ml:ssa MeOHita) argonkaasukehässä.
Lisätään vielä tilavuus MeÖHvta: (2250 ml) . Argonkaasukehä syrjäytetään vedyllä ja annetaan reagoida (noin 24 tuntia). |
Kun reaktio on mennyt loppuun, vetykaasukehä syrjäytetään argonilla. Liuos selkeytetään Celite* -kerroksen läpi ja 20 suodos konsentroidaan in vaouo, jolloin saadaan tripeptidi 13 valkoisena kiinteänä aineena.
B, Tripeptidifragmentin -K-DAla-DpHal-Ala-OMe val mistus N“-bentsyylioksikarbonyyli-D-alanyyli-D-beta-naf-25 tyylialaniinin metyyliästeri, 25
EtOAc:n (400 ml) ja D-beta-naftyylialaniinimetyy-liesterihydrokloridin {'22, 0, 62 mol) liuos pestään kyllästetyllä natriumkarbonaatilla (400 ml) ja 0,8 N natriumhyd-roksidin vesiliuoksella (noin 500 ml). Tuloksena oleva ve-30 sifaasi poistetaan (pH 8,5) ja orgaaninen faasi pestään perätysten puolikyllästetyllä Ka2C03-vesiliuoksella (150 ml) | ja sitten vedellä (50 ml). 22:n vapaa emäsmuoto eristetään | konsentroimalla etyyllasetaattikerros in vacuo. |
Disykloheksyylikarbodi-imidi (DCC, noin ,95 g, | 35 0,46 mol) lisätään -5 °C:n lämpötilassa olevaan (jää-etano- i| lihaude) Ma-bentsyylioksikarbonyyli-D-aIaniinin (19, 143,5 g, j 4 8 0,50 mol) , N-hydroksisukkinimidin (HONSu, 23, 0,62 mol) ja vasta valmistetun 2_2:n vapaan emäsmuodon (noin 0,52 mol) liuokseen DMF:ssä (noin 3 1). Tuloksena olevan reaktioliu-oksen annetaan .sekoittua 24 tunnin ajan samalla kun sitä 5 lämmitetään huoneenlämpötilaan, HPLC-analyysiä pitäisi käyttää; tarkkailemaan meneekö reaktio loppuun. Jos se ei ole mennyt, xeaktioseos jäähdytetään sitten noin -5 °C:n lämpötilaan ja reaktioon lisätään lisäosa disykloheksyylikarho-di-imidiä (noin 0,17 mol). Reakiloseoksen annetaan sitten 10 sekoittua vielä 24 tuntia: samalla kun se lämmitetään huoneenlämpötilaan.: Seos suodatetaan: sitten disykloheksyy- liurean (SCO) poistamiseksi. Vesi (1 1) lisätään suodokseen ja tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vacuo. Tuloksena oleva jäännös otetaan HCi:n 1-normaaliseen vesiliuokseen 15 (noin 1 X kunnes vesi f. aasin pH saavuttaa pH: n 1). Vesifaasi i uutetaan sitten kahdella annoksella etyyliasetaattia. (1 1 kumpikin), Etyyliasetaattikerrokset heitetään pois. Vesi-faasin pH säädetään sitten lisäämällä kylmää 2-normaalista, natriumhydroksidiä (500 ml) ja natriumhydroksidinappeja.
2Q Tämän neutraloinnin aikana liuos pidetään kylmänä lisäämällä kylmää etyyliasetaattia (1 1). Kun vesifaasin pH saavuttaa noin arvon 7, tuloksena on yleensä valkoisen sakan tai öljyn runsas saostuminen. Tämä sakka kerätään imusuodatuk-sella tai dekantoimalla ja pestään peräjälkeen puolikylläs-25 tetyllä natriumkarbonaatilla (2 x 1500 ml) , vedellä (6 x 1500 ml) ja etyyliasetaatilla (3 x 1500 ml), Tuloksena oleva materiaali kuivataan voimakkaassa alipaineessa vakiopai-noon. Tämä materiaali voidaan hydrolysoida suoraan ilman jät kopuhd i s tu s ta. i 30 N-benfcsyylioksikarbonyyli-D-alanyyli-^-naftyyli- 1 D-alaniini, 26 |
Natriumhydroksidin vesiliuos (192 ml, liuoksessa 0,08 g/ml, 0,38 mol) lisätään dipeptidin 25 (noin 0,38 mol), | veden (360 ml) ja MeOHrn (noin 6 1) liuokseen. Liuosta se- j 35 koitetaan huoneeniämpöt.liassa kunnes hydrolyysi on täydellinen (noin 24 tuntia}. Lähtöpeptidin katoaminen varmiste- 49 taan HPLC-analyysiliä, Liuos konsentroidaan in vacuo jäännökseksi,. joka liuotetaan veteen (noin 1 1). Vesikerros (pH noin 10) uutetaan sitten EtOÄc:lla (2 x 500 ml) ero-tussuppilossa. Etyyliasetaattikerrokset heitetään pois. Tu-5 loksena olevan vesifaasin pH säädetään noin 5: kai väkevällä HCl:Uä, jolloin tapahtuu yleensä valkoisen kiinteän aineen tai öljyn saastuminen. ‘Tuote kerätään ja kuivataan in vacuo.
N“-ben tsyy1ioksikarbonyyli-D~alanyy1i-D-beta-naf-10 tyylialanyyli-alaniinin metyyliesteri, 20
Qipeptidi N^-bentsyylioksikarbonyyli-D-älanyyli-D-beta-naftyyliä!aniini (26, 0,253 mol) lisätään HÖNSu-liu-okseen (23, 0,505 mol) DMFissä (800 ml) argonkaasukehässä.
Tähän liuokseen lisätään alaniinimetyyliesterihydroklofidin 15 (15, 0, 303 mol) , N-metyyl.imöTfoiiinin (16, 0,303 mol) ja DMF:n (200: ml) seos. Tuloksena oleva liuos jäähdytetään i 10 °C lämpötilaan, jossa vaiheessa lisätään disykloheksyy-likarbödi-imidi (24, 0,265 mol) metyleeniklaridissa (273 ml).
Reaktiota seurataan HPLC:lla samalla kun reaktiolämpötila 20 pidetään 10 °C:ssa kunnes reaktio on mennyt loppuun. Jos useiden päivienkään päästä (noin 4) reaktio ei ole edennyt loppuun, lisätään vielä annos 24_:ää (0,080 mol) ja reak- tioseoksen annetaan sekoittua vielä päivä 10 °C:n lämpötilassa, Reaktiota monitoroidaan taas HPLC-analyysillä kunnes 25 se on mennyt loppuun (tyypillisesti noin 5 päivää). Reaktion aikana muodostuvat kiinteät aineet kerätään Imusuodatuk- : sella. Suodos konsentroidaan sitten jäännökseksi in vacuo. |
Tuloksena oleva jäännös otetaan etyyliasetaattiin ja uute- I
taan puolikyllästetyllä NaaCQ^n vesiliuoksella (2 x 500 ml) . j :ä 30 Etyyliasetaatti f:a.ä:Si kuivataan MgSGdullä. Tuloksena oleva .] liuos selkeytetään ja konsentroidaan jäännökseksi in vacuo.
2-normaalinen natriumhydroksidin vesiliuos (7,5 ml, j 15 mmol) lisätään metanolln (500 ml) ja veden (200 ml) liu- j okseen, joka sisältää Na-be;ntsyylioksikarbonyyli-DÄla-DpNal- ] 35 Ala-Ome::a (13,7 mmol) . Sen jäikeen kun reaktion on annettu 1 sekoittua yli yön huoneenlämpötilassa, HPLC-analyysi osoit- ] $ 50 taa jäljellä olevan lähtömateriaalin määrän. Kun reaktio on oleellisesti mennyt loppuun (noin yli yön), tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vacuo noin 200 mi:n tilavuuteen.
Vesi (100 ml) lisätään ja pH säädetään noin 12;:ksi lisää-5 maila '2-normaalista natriumhydroksidia (1 ral) . Tuloksena oleva liuos uutetaan etyyliasetaatilla {2 x 500 ml) . Etyy-liasetaattikertökset heitetään pois. Vesifaasin pH säädetään sitten noin 5:ksi lisäämällä HC1 ·:n vesiliuosta:, mikä johtaa yleensä tuotteen saostumiseen. On tärkeää minimoida 10 vesifaasin tilavuus tämän sapstumisen edistämiseksi. Vesi- faasi dekantoidaan pois tuotteesta ja tuotetta huuhdellaan sitten vedellä (2 x 50 ml) . Eristetty tuote kuivataan va-kiopainoon in vaouo.
C. Peptidifragmanttien kondensaatioreaktiö hejcsa-15 peptidin tuottamiseksi
Kaksi peptidiä DAla-DpNal-Ala-GH (33, 2,6 mmol) ja i
Trp-D^Phe-Lys(Boc)-NH2 (13, 2,8 mmol) liuotetaan vedettö mään 'DMFiään ja tuloksena oleva liuos konsentroidaan in vaouo . Tämä alustava konsentrointi suoritetaan yrityksenä 20 poistaa mahdolliset läsnä; kenties olevat metanolijäännökset. Tuloksena oleva peptidiseos liuotetaan uudelleen DMF:ään ja sitten lisätään N-hydroksisukkinimidi (5,1 mmol) .
Tuloksena oleva liuos jäähdytetään sitten .-2 DC:n liuos-lämpötilaan ja sitten lisätään disykloheksyylikarbodi-lmidi 25 (3,4 mmol) liuoksena metyleenikloridissa (3,5 ml). Tulokse na olevan reaktioseoksen annetaan sekoittua -2 °C:n liuos-lämpötilassa kolmen päivän ajan. HPLC-analyysiä käytetään määrittämään, onko reaktio mennyt oleellisesti loppuun. Tämän ajanjakson jälkeen, jos se ei ole mennyt, voidaan sit-30 ten lisätä vielä disykloheksyylikardodi-iinidiä ja tuloksena |
olevan reaktioseoksen annetaan.. sekoittua vielä päivä I
-2 °C:n lämpötilassa..,. Jos seuraävana päivänä (neljä päivää 1 kaikkiaan) HPLC-analyysi viittaa jälleen epätäydelliseen | reaktioon, reaktiQsepksen jäähdytys pitäisi lopettaa, Reak- 1 35 tion liuoslämpötilan voidaan antaa kohota hitaasti huoneen- j lämpötilaan (25 °C) tuntien aikana (noin 8) , Tuloksena ole- j 5 i 51 van reaktioseoksen annetaan sekoittua yli yön huoneenlämpö-tilassa. Menettely toistetaan kunnes reaktio on mennyt loppuun. Sitten lisätään vettä f SO ml) ja tuloksena olevan seoksen annetaan sekoittua vielä päivän. Reaktioliuos suo-5 datetaan sitten disykloheksyyliurean poistamiseksi ja tuloksena oleva suodos konsentroidaan in vacuo viskoosiksi öljyksi. Tuloksena olevaan jäännökseen lisätään etyyliasetaatti ja puolikyllästetty natriumkarbonaatin vesiliuos (200 ml) . Kaksifaasista seosta pyöritetään voimakkaasti 10 pyörphaihduttimessa noin yhden tunnin ajan. Mitkä tahansa muodostuneet kiinteät aineet kerätään, jolloin tuote saadaan suodattairialla lasisintterisuppilossa. Orgaaninen kerros pestään vedellä ja kuivataan sitten vakiopainoon in va- } cuo, jolloin saadaan tuote. j 15 DA1 a-D-^Nal -Äla-Trp-D-Phe-Lys-NH2, 35 |
Heksapeptidi bentsyy1ioksikärbonyyli-DAla-D-%a 1 - Ala- |
Trp-D-Phe-Lys-(Boc)-NH2 .(34., 1, 02 mmolj lisätään trifluo- j
rietikkahapon (30 ml), dimetyylisulfidin {14 ml), J
1,2-etaaniditiolin {7 ml) ja anisolin (2,2 ml) huoneenläm- | 20 paiseen: liuokseen metyleeniklöridissa {15 ml). Homogeenisen | reaktioseoksen annetaan sekoittua 15 minuutin ajan. Tämän f ajanjakson jälkeen lisätään vedetön eetteri (450 ml}, jotta } saadaan aikaan epäpuhtaan, biologisesti aktiivisen peptidi- | tuotteen 3_5 saostuminen. Tämä tuote eristetään suodattamal- | 25 la lasisintterisuppilossa tai dekantöimaila. Tuloksena ole- j va tuote liuotetaan veteen ja lyöfilisoidaan. Lyofilisoitu | tuote voidaan edelleen puhdistaa keskipainekromatografiässä | 26 x 460 mm lasipylväässä, joka sisältää Lichroprep™ R-18 | -pylväspakkausmateriaalia {C-18, 25 - 40 nm, epäsäännöili- j 30 nen mesh). Sen jälkeen kun peptidi on injektoitu liuoksena vedessä, pylväs eluoidaan virtausnopeudella 9 ml minuutissa 0 - 25-prGsenttisen metanolin ioivalla gradientilla 5 - 20 ] tunnin ajan, ja sitten gradientilla 25 - 55-prosenttinen j metanoli noin 48 tunnin ajan. Gradientin metanolikönsent- \ 35 raatiota nostetaan sitten nopeudella 2 % tunnissa. Eluution 1
aikana jäljellä oleva liuötinkoostumus tehdään veteen, joka I
.¾ 52 on 0,2-prosenttinen trifluorietikkahapon suhteen. Tuote (35) tunnistetaan HPLC:llä ja eristetään konsentroimalla soveliaat eluutiotilavuudet.
Keksintöä on: kuvattu yksityiskohtaisesti viitaten 5 erityisesti sen edullisiin suoritusmuotoihin. Ymmärretään kuitenkin, että ammattimiehet voivat tätä paljastusta pohdittuaan tehdä variaatioita ja modifikaatioita keksinnön hengen ja suojapiirin sisällä.
: | : j : | | , :j il j % |

Claims (4)

1. Menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä, ihmistä lukuun ottamatta, ja lukuun otta-5 matta terapeuttista menetelmää, joka kohdistetaan eläimeen, t annettu siitä, että eläimelle annetaan tehokas määrä ainakin yhtä seuraavalla menetelmällä valmistettua peptidiä, jolla on kaava 10 Äi-Ä2-Äla-Ca-C3-Ä5, jossa on Glv, DAla, β-Ala, Sar, Ava, Aib, ABU, j NHa (GH2) 5CO' tai IMÄ, Ä2 P.ii DTrp, D%al:, Ä5 on A3-A4-&5'* Ä3- j Ä5., A4~Ä5< tai A5-, jossa j 15 a) A3 on Ala, Gly, DAla tai Pro, \ b) A4 on: Ala, Gly, 'DAla, Pro tai C2-C10- suoraketjuinen alkyyliaminokarboksyylihappo, ja c) Ä5< on. Lys ( ε-Ri, Ra) -2, Orn (δ-Ri, R?) -Z, NH (CH2) xN {RsyR,}) , Lys-Z, Örn-Z tai Ärg-Z, joissa Ri on suora- 20 ketjuinen Cs-Cio-alkyyliryhmä tai H-atomi, R2 on suoraketj uinen G2-Cio-alkyyliryhmä tai H-atomi, mutta Ri ja Rs eivät samanaikaisesti ole H, :R3 on suoraketj uinen C2-C10- al kyy li ryhmä tai H-atomi, R4 on suoraketj uinen C2-C10- alkyyliryhmä tai H-atomi, Z on NH(suoraketjuinen C2-C10-25 aikyyliryhmä), N (suoraketjuinen Cs-Cio-alkyyliryhmä)2, O- (suoraketjuinen C2-Gio-alkyylirylTmä), NH? tai OH, x on 2 - 15, I G.2 on Top, Puhe tai ChxAla, C3 on DPhe, DPal tai DChxAla, i 30 jolloin (i) edellä kuvatut aminohapot tai aminohappojohdan- ; naiset liitetään yhteen peptidin muodostamiseksi käyttäen kiinteän faasin menetelmää, tai (il) suoritetaan edellä kuvattujen aminohappojen tai aminohappojohdannaisten tai nai- i den peptidifragmanttien syntetisointi liuosvaihemenetel” 35 millä, joka sisältää ainakin kahden fragmentin kondensaa-tioreaktion, peptidin muodostamiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eläin on nisäkäs.
3. Menetelmä, eläimen lihaksiston kasvattamiseksi ja/tai sen ruumiin rasvapitoisuuden alentamiseksi, jolloin 5 ihminen ei ole eläin, tunnettu siitä, että annetaan tehokas määrä patenttivaatimuksen 1 mukaista peptidiä.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tehokas peptidin kokonaismäärä vaihtelee välillä noin 0,1 pg - 10' mg painokiloa kohti.
FI20050467A 1991-08-22 2005-05-02 Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä FI120691B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/748,350 US5663146A (en) 1991-08-22 1991-08-22 Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
US74835091 1991-08-22
PCT/US1992/007026 WO1993004081A1 (en) 1991-08-22 1992-08-20 Peptides having growth hormone releasing activity
US9207026 1992-08-20

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20050467A FI20050467A (fi) 2005-05-02
FI120691B true FI120691B (fi) 2010-01-29

Family

ID=25009088

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI940807A FI120095B (fi) 1991-08-22 1994-02-21 Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on kasvuhormonia vapauttavaa aktiivisuutta
FI20050467A FI120691B (fi) 1991-08-22 2005-05-02 Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI940807A FI120095B (fi) 1991-08-22 1994-02-21 Menetelmä peptidien valmistamiseksi, joilla on kasvuhormonia vapauttavaa aktiivisuutta

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5663146A (fi)
EP (1) EP0605484B1 (fi)
JP (1) JP3179489B2 (fi)
KR (1) KR100247212B1 (fi)
CN (1) CN1035256C (fi)
AT (1) ATE172742T1 (fi)
AU (1) AU666673B2 (fi)
BG (1) BG62655B1 (fi)
BR (2) BR9206398A (fi)
CA (1) CA2116120C (fi)
CZ (1) CZ293281B6 (fi)
DE (1) DE69227462T2 (fi)
DK (1) DK0605484T3 (fi)
ES (1) ES2124263T3 (fi)
FI (2) FI120095B (fi)
HU (1) HU223664B1 (fi)
IL (1) IL102848A (fi)
MX (1) MX9204861A (fi)
NO (1) NO314695B1 (fi)
NZ (1) NZ244034A (fi)
PL (1) PL169562B1 (fi)
RO (1) RO112507B1 (fi)
RU (1) RU2126014C1 (fi)
SK (1) SK282895B6 (fi)
WO (1) WO1993004081A1 (fi)
ZA (1) ZA926337B (fi)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2160786A1 (en) 1993-05-14 1994-11-24 James C. Marsters, Jr. Ras farnesyl transferase inhibitors
HU221092B1 (en) * 1993-12-23 2002-08-28 Novo Nordisk As Compounds with growth hormone releasing properties
HU224345B1 (hu) * 1993-12-23 2005-08-29 Novo Nordisk A/S. Növekedési hormont felszabadító tulajdonságú peptidek, ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk
US5798337A (en) * 1994-11-16 1998-08-25 Genentech, Inc. Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
US20020111461A1 (en) * 1999-05-21 2002-08-15 Todd C. Somers Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
BR9608909A (pt) * 1995-06-22 1999-03-02 Novo Nordisk As Composto composição farmacêutica processos para estimular a liberação do hormônio do crescimento da patuitária e aumentar a velocidade e extensão do crescimento dos animais para aumentar a produção de leite ou lã de animais ou para para doenças e uso do composto
ATE231131T1 (de) * 1996-04-24 2003-02-15 Novo Nordisk As Verbindungen mit wachtumshormon freisetzenden eigenschaften
EP1005484A1 (en) 1997-06-20 2000-06-07 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US6127341A (en) * 1997-06-20 2000-10-03 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
ZA987383B (en) * 1997-08-19 2000-02-17 Lilly Co Eli Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues.
US6329342B1 (en) 1997-08-19 2001-12-11 Eli Lilly And Company Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues
AU766305B2 (en) 1998-01-16 2003-10-16 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
WO1999039730A1 (fr) * 1998-02-09 1999-08-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation a administration orale contenant des peptides favorisant la secretion d'hormone de croissance
US6919315B1 (en) 1998-06-30 2005-07-19 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US6682908B1 (en) 1998-07-10 2004-01-27 Merck & Co., Inc. Mouse growth hormone secretagogue receptor
JP2002520011A (ja) 1998-07-13 2002-07-09 メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド 成長ホルモン分泌促進物質関連受容体および核酸
JP2002522058A (ja) 1998-08-10 2002-07-23 メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーテッド イヌ成長ホルモン分泌促進物質受容体
US6468974B1 (en) 1998-08-14 2002-10-22 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Compounds having growth hormone releasing activity
US6639076B1 (en) 1998-08-18 2003-10-28 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US6696063B1 (en) 1998-12-30 2004-02-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Treatment of HIV-associated dysmorphia/dysmetabolic syndrome (HADDS) with or without lipodystrophy
US7022677B1 (en) 1999-02-18 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Amide derivatives as growth hormone secretagogues
AU759022B2 (en) * 1999-02-18 2003-04-03 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Novel amide derivatives as growth hormone secretagogues
US6828331B1 (en) * 1999-02-19 2004-12-07 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US20040192593A1 (en) * 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
KR20020047096A (ko) * 1999-07-26 2002-06-21 크로커 사무엘 에스 초활성 돼지 성장 호르몬 분비 호르몬 유사체
JP4691298B2 (ja) * 1999-10-12 2011-06-01 科研製薬株式会社 粉末吸入用製剤及びその製造方法
UA73530C2 (uk) 1999-11-10 2005-08-15 Ново Нордіск А/С Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту
JP3498041B2 (ja) * 2000-05-29 2004-02-16 科研製薬株式会社 プラルモレリン含有点鼻用製剤
ATE446758T1 (de) 2000-05-31 2009-11-15 Pfizer Prod Inc Verwendung von wachstumshormonsekretagoga zur förderung der beweglichkeit des verdauungstrakts
US7622503B2 (en) 2000-08-24 2009-11-24 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7855229B2 (en) 2000-08-24 2010-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators
US7645898B2 (en) 2000-08-24 2010-01-12 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and method of use thereof
US7919647B2 (en) 2000-08-24 2011-04-05 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
EA006484B1 (ru) 2001-02-02 2005-12-29 Конджачем, Инк. Долгоживущие производные рилизинг-фактора гормона роста
US7125840B2 (en) * 2001-10-09 2006-10-24 Eli Lilly And Company Substituted dipeptides as growth hormone secretagogues
EP1450605B1 (en) * 2001-10-26 2011-12-07 Baylor College Of Medicine Composition to alter bone properties in a subject
US8853266B2 (en) 2001-12-06 2014-10-07 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators for treating diabetes
US6831102B2 (en) 2001-12-07 2004-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Phenyl naphthol ligands for thyroid hormone receptor
MY142457A (en) * 2001-12-11 2010-11-30 Advisys Inc Plasmid mediated supplementation for treating chronically ill subjects
US7015219B2 (en) 2001-12-19 2006-03-21 Bristol-Myers Squibb Company 3-aryl-hydroxybenzoxazines and 3, 4-dihydro-3-aryl-hydroxybenzoxazines as selective estrogen receptor beta modulators
TW200307749A (en) * 2002-02-07 2003-12-16 Baylor College Medicine Modified pituitary gland development in offspring from expectant mother animals treated with growth hormone releasing hormone therapy
US7772433B2 (en) 2002-02-28 2010-08-10 University Of Tennessee Research Foundation SARMS and method of use thereof
US7381730B2 (en) 2002-03-15 2008-06-03 Bristol-Myers Squibb Company 3-arylquinazoline derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
US20060167268A1 (en) * 2002-04-09 2006-07-27 Eli Lilly And Company, Patent Division, Growth hormone secretagogues
ES2271557T3 (es) * 2002-04-09 2007-04-16 Eli Lilly And Company Secretagogos dipeptidicos de la hormona del crecimiento.
AU2003225305A1 (en) 2002-05-08 2003-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Pyridine-based thyroid receptor ligands
US7405234B2 (en) 2002-05-17 2008-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
AU2003259340A1 (en) 2002-08-23 2004-03-11 Gestion Univalor Societe En Commandite Growth hormone-releasing peptides in the treatment of prevention of atherosclerosis and hypercholesterolemia
WO2004045518A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Open chain prolyl urea-related modulators of androgen receptor function
US8309603B2 (en) 2004-06-07 2012-11-13 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
TW200504021A (en) 2003-01-24 2005-02-01 Bristol Myers Squibb Co Substituted anilide ligands for the thyroid receptor
US7105537B2 (en) 2003-01-28 2006-09-12 Bristol-Myers Squibb Company 2-substituted cyclic amines as calcium sensing receptor modulators
WO2004067719A2 (en) * 2003-01-28 2004-08-12 Advisys, Inc. Growth hormone releasing hormone (ghrh) for use in reducing culling in herd animals
US7205322B2 (en) 2003-02-12 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Thiazolidine compounds as calcium sensing receptor modulators
US7557143B2 (en) 2003-04-18 2009-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Thyroid receptor ligands
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
US7459460B2 (en) 2003-05-28 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Trisubstituted heteroaromatic compounds as calcium sensing receptor modulators
US7265145B2 (en) 2003-05-28 2007-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Substituted piperidines and pyrrolidines as calcium sensing receptor modulators and method
US7476653B2 (en) 2003-06-18 2009-01-13 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic modulators of the ghrelin receptor
WO2005016964A2 (en) * 2003-08-04 2005-02-24 Advisys, Inc. Canine specific growth hormone releasing hormone
WO2005041998A1 (en) 2003-10-02 2005-05-12 Ali Sadat M Peptide for promoting healing of fractures
ATE467417T1 (de) * 2003-12-31 2010-05-15 VGX Pharmaceuticals LLC Reduzierung von arthritis und lahmheit bei personen unter supllement von wachstumshormon freisetzendem hormon (ghrh)
EP1713828B1 (en) * 2004-01-20 2011-04-27 VGX Pharmaceuticals, LLC Enhanced secretion/retention of growth hormone releasing hormone (ghrh) from muscle cells by species-specific signal peptide
US20050164952A1 (en) * 2004-01-23 2005-07-28 Vital Pharmaceuticals, Inc. Delivery system for growth hormone releasing peptides
US7820702B2 (en) 2004-02-04 2010-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Sulfonylpyrrolidine modulators of androgen receptor function and method
US7378426B2 (en) 2004-03-01 2008-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Fused heterotricyclic compounds as inhibitors of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3
US7696241B2 (en) 2004-03-04 2010-04-13 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic compounds as modulators of androgen receptor function and method
US7625923B2 (en) 2004-03-04 2009-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
US9884038B2 (en) 2004-06-07 2018-02-06 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof
US9889110B2 (en) 2004-06-07 2018-02-13 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions
ATE413890T1 (de) * 2004-07-23 2008-11-15 Advisys Inc Wachstumshormon-freisetzendes hormon verstärkt die vakzin-induzierte immunantwort
CA2576915A1 (en) 2004-08-18 2006-03-02 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Growth-hormone secretagogues
WO2006116401A1 (en) 2005-04-28 2006-11-02 Bristol-Myers Squibb Company C-5 substituted quinazolinone derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
KR101388087B1 (ko) 2005-08-31 2014-04-25 유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션 선택적 안드로겐 수용체 조절제를 이용한 신장 질환, 화상,부상 및 척수 손상의 치료 방법
CU23558A1 (es) 2006-02-28 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos análogos a los secretagogos peptidicos de la hormona de crecimiento
WO2008006019A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Advisys Inc. Growth hormone releasing hormone treatment to decrease cholesterol levels
WO2008008433A2 (en) 2006-07-12 2008-01-17 University Of Tennessee Research Foundation Substituted acylanilides and methods of use thereof
KR101410453B1 (ko) 2006-08-02 2014-06-27 싸이토키네틱스, 인코포레이티드 소정의 화학 물질, 조성물 및 방법
US8299248B2 (en) 2006-08-02 2012-10-30 Cytokinetics, Incorporated Certain 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2(3H)-ones and 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2-ols and methods for their use
US9730908B2 (en) 2006-08-24 2017-08-15 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US10010521B2 (en) 2006-08-24 2018-07-03 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US9844528B2 (en) 2006-08-24 2017-12-19 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
CN107007581A (zh) 2006-08-24 2017-08-04 田纳西大学研究基金会 取代的n‑酰基苯胺及其使用方法
ES2604943T3 (es) 2007-02-09 2017-03-10 Ocera Therapeutics, Inc. Moduladores macrocíclicos del receptor de la grelina y procedimientos de uso de los mismos
EP2155769B1 (en) 2007-05-04 2012-06-27 Katholieke Universiteit Leuven KU Leuven Research & Development Tissue degeneration protection
US7968603B2 (en) 2007-09-11 2011-06-28 University Of Tennessee Research Foundation Solid forms of selective androgen receptor modulators
US8003689B2 (en) 2008-06-20 2011-08-23 Gtx, Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
WO2011133920A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Cytokinetics, Inc. Certain amino-pyridines and amino-triazines, compositions thereof, and methods for their use
AR081626A1 (es) 2010-04-23 2012-10-10 Cytokinetics Inc Compuestos amino-piridazinicos, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos para tratar trastornos musculares cardiacos y esqueleticos
AR081331A1 (es) 2010-04-23 2012-08-08 Cytokinetics Inc Amino- pirimidinas composiciones de las mismas y metodos para el uso de los mismos
WO2013190520A2 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The General Hospital Corporation Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions
US9622992B2 (en) 2012-07-13 2017-04-18 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US10314807B2 (en) 2012-07-13 2019-06-11 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
US9744149B2 (en) 2012-07-13 2017-08-29 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US10987334B2 (en) 2012-07-13 2021-04-27 University Of Tennessee Research Foundation Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs)
AU2013203600C1 (en) 2012-07-13 2016-11-24 University Of Tennessee Research Foundation A method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS)
US10258596B2 (en) 2012-07-13 2019-04-16 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
US9969683B2 (en) 2012-07-13 2018-05-15 Gtx, Inc. Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS)
CA2889499C (en) 2012-10-24 2019-09-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Growth hormone secretagogue receptor agonists for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2014168973A2 (en) 2013-04-08 2014-10-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
US9119832B2 (en) 2014-02-05 2015-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of treating mild brain injury
EP3148587B1 (en) 2014-05-30 2021-02-24 Pfizer Inc Carbonitrile derivatives as selective androgen receptor modulators
US20170121385A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurodegenerative conditions
EP3990447A1 (en) 2019-06-27 2022-05-04 Cytokinetics, Inc. Polymorphs of 1-(2-((((trans)-3-fluoro-1-(3-fluoropyridin-2-yl)cyclobutyl)methyl)amino)pyrimidin-5-yl)-1h-pyrrole-3-carboxamide
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4223020A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228155A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228157A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228158A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4226857A (en) * 1979-03-30 1980-10-07 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228156A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
CA1175810A (en) * 1979-03-30 1984-10-09 Frank A. Momany Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4224316A (en) * 1979-03-30 1980-09-23 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223021A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223019A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
WO1983002272A1 (en) * 1981-12-28 1983-07-07 Beckman Instruments Inc Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410512A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Combinations having synergistic pituitary growth hormone releasing activity
US4410513A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4880778A (en) * 1986-05-12 1989-11-14 Eastman Kodak Company Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof
US4839344A (en) * 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US4880777A (en) * 1987-09-01 1989-11-14 Eastman Kodak Company Synthetic peptides having growth hormone releasing activity
ATE113607T1 (de) * 1988-01-28 1994-11-15 Polygen Holding Corp Polypeptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.
JPH03502329A (ja) * 1988-01-28 1991-05-30 ポリゲン ホールディング コーポレイション 成長ホルモン放出活性を有するポリペプチド化合物類
WO1989010933A1 (en) * 1988-05-11 1989-11-16 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
IL98910A0 (en) * 1990-07-24 1992-07-15 Polygen Holding Corp Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity and pharmaceutical compositions containing them
US5486505A (en) * 1990-07-24 1996-01-23 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
WO1992001709A1 (en) 1990-07-24 1992-02-06 Eastman Kodak Company Process for synthesizing peptides

Also Published As

Publication number Publication date
DK0605484T3 (da) 1999-07-05
US5776901A (en) 1998-07-07
AU666673B2 (en) 1996-02-22
WO1993004081A1 (en) 1993-03-04
BR9206398A (pt) 1994-12-27
AU2541692A (en) 1993-03-16
EP0605484A1 (en) 1994-07-13
DE69227462D1 (de) 1998-12-03
CN1073684A (zh) 1993-06-30
CA2116120C (en) 2002-12-03
IL102848A (en) 1998-04-05
NO940592L (no) 1994-04-14
BR1100309A (pt) 2000-08-01
CA2116120A1 (en) 1993-02-23
ATE172742T1 (de) 1998-11-15
JPH07507039A (ja) 1995-08-03
FI120095B (fi) 2009-06-30
NO314695B1 (no) 2003-05-05
NZ244034A (en) 1995-08-28
FI940807A (fi) 1994-02-21
BG62655B1 (bg) 2000-04-28
CN1035256C (zh) 1997-06-25
RO112507B1 (ro) 1997-10-30
ES2124263T3 (es) 1999-02-01
FI20050467A (fi) 2005-05-02
HUT69178A (en) 1995-08-28
HU9400495D0 (en) 1994-05-30
DE69227462T2 (de) 1999-04-08
EP0605484B1 (en) 1998-10-28
US5663146A (en) 1997-09-02
BG98489A (bg) 1995-02-28
JP3179489B2 (ja) 2001-06-25
CZ40094A3 (en) 1994-11-16
IL102848A0 (en) 1993-01-31
ZA926337B (en) 1993-04-22
RU2126014C1 (ru) 1999-02-10
KR100247212B1 (ko) 2000-03-15
PL169562B1 (pl) 1996-08-30
SK20494A3 (en) 1994-10-05
CZ293281B6 (cs) 2004-03-17
HU223664B1 (hu) 2004-11-29
MX9204861A (es) 1994-06-30
FI940807A0 (fi) 1994-02-21
NO940592D0 (no) 1994-02-21
SK282895B6 (sk) 2003-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI120691B (fi) Ei-terapeuttinen menetelmä kasvuhormonin vapautumisen edistämiseksi eläimessä
AU637316B2 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US5486505A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0647656B1 (en) Motilin-like polypeptides that inhibit gastrointestinal motor activity
EP0417165B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0540676B1 (en) Peptide compounds having growth hormone releasing activity
US6468974B1 (en) Compounds having growth hormone releasing activity
FI111462B (fi) Menetelmä motiliinityyppisten polypeptidien valmistamiseksi, joilla on ruoansulatuskanavan motiliteettia stimuloivaa aktiivisuutta

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 120691

Country of ref document: FI

MM Patent lapsed