PL169562B1 - Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL

Info

Publication number
PL169562B1
PL169562B1 PL92302434A PL30243492A PL169562B1 PL 169562 B1 PL169562 B1 PL 169562B1 PL 92302434 A PL92302434 A PL 92302434A PL 30243492 A PL30243492 A PL 30243492A PL 169562 B1 PL169562 B1 PL 169562B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
dphe
trp
dala
phe
Prior art date
Application number
PL92302434A
Other languages
English (en)
Inventor
Cyril Y Bowers
David Coy
Original Assignee
Univ Tulane
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Tulane filed Critical Univ Tulane
Publication of PL169562B1 publication Critical patent/PL169562B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

1 Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogólnym wzorze A1-A2-C1-C2-C3-A5, w którym. A1 oznacza Gly, DAla, ß-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kwas N-nizszy alkilo-aminokarboksy- lowy, kwas N,N-dwu-nizszy alkilo-aminokarboksylowy, kwas azolokarboksylowy lub kwas nizszy alkilo- aminokarboksylowy, gdzie nizsza grupa alkilowa zawiera 2 do okolo 10 atomów wegla w lancuchu prostym; A2 oznacza DTrp, DßNal, D-4-Y-Phe- lub 5-Y-D-Trp, gdzie Y oznacza OH, Cl, Br, F lub H; A5 oznacza A3-A 4-A5', A3-A5', A4-A 5' lub A5', gdzie (a) A oznacza Ala, Gly, DAla, Pro lub desAla, (b) A4 oznacza Ala, Gly, DAla, Pro, kwas liniowy nizszy alkilo-aminokarboksylowy lub desAla; i (c) A 5' oznacza Lys( e-R1 , R 2)-Z, Orn(d-R1 , R2)-Z, NH(CH2)X N(R3, R4), a gdy A1 nie oznacza His, to wówczas A5' moze równiez oznaczac Lys-Z, Orn-Z lub Arg-Z, przy czym R1 oznacza liniowa nizsza grupe alkilowa lub atom H, R2 oznacza liniowa nizsza grupe alkilowa lub atom H; lecz gdy R1 oznacza H, to wówczas R2 nie oznacza H; a gdy R2 oznacza H, to wówczas R1 nie oznacza H; R3 oznacza liniowa nizsza grupe alkilowa lub atom H; R4 oznacza liniowa nizsza grupe alkilowa lub atom H; Z oznacza NH (liniowa nizsza grupe alkilowa), N (liniowa nizsza grupe alkilowa)2, O-(liniowa nizsza grupe alkilowa), NH2 lub OH, gdzie liniowa nizsza grupa alkilowa jest zdefiniowana jak nizsza grupa alkilowa; x oznacza 2 do 15; C1 oznacza Ala; C2 oznacza Trp, Phe lub ChxAla, C3 oznacza DPhe, DPal lub DChxAla oraz ich organicznych lub nieorganicznych soli addycyjnych, znamienny tym, ze sprzega tworzace ten zwiazek aminokwasy lub pochodne aminokwasów. (43) Zgloszenie ogloszono: 05.09.1994 BUP 18/94 PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów pobudzających uwalnianie hormonu wzrostu po podaniu ich istotom żywym, korzystnie ludziom.
Zwiększenie poziomu hormonu wzrostu (GH) u istot żywych, np. ssaków w tym ludzi, przez podawanie uwalniających GH związków może prowadzić do podwyższonej wagi ciała i zwiększonej produkcji mleka, gdy poziom GH po podaniu będzie dostatecznie podwyższony. Ponadto wiadome jest, że zwiększenie poziomu hormonu wzrostu u ssaków i ludzi można wywołać podaniem znanych środków uwalniających hormon wzrostu, takich jak naturalne hormony uwalniające hormon wzrostu.
Zwiększenie poziomu hormonu wzrostu u ssaków można także wywoływać podaniem peptydów uwalniających hormon wzrostu, przy czym niektóre z nich opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4223019, 4223020, 4223021, 4224316, 4226857, 4228155, 4228156, 4228157, 4228158, 4410512 i 4410513.
W celu zwiększenia poziomu GH stosowano również przeciwciała przeciw endogennemu inhibitorowi uwalniania hormonu wzrostu, somatostatynie (SRIF). W tym ostatnim przypadku poziom hormonu wzrostu zwiększa się przez usuwanie endogennego inhibitora uwalniania GH (SRIF) zanim dotrze on do przysadki mózgowej, gdzie inhibituje uwalnianie GH.
W każdej z tych metod pobudzania zwiększania poziomu hormonu wzrostu stosuje się substancje trudne do zsyntetyzowania i/lub wyodrębnienia z czystością wystarczającą na to, by można je było podać wybranej istocie żywej. Pożądane byłyby krótkołańcuchowe, stosunkowo proste polipeptydy o zdolności pobudzania uwalniania hormonu wzrostu, gdyż można by było łatwo i tanioje wytwarzać, łatwa byłaby ich modyfikacja chemiczna i/lub fizyczna, a także można by łatwo je oczyszczać i formułować i powinny mieć one doskonałą zdolność przenoszenia się.
Jakkolwiek znane są pewne krótkołańcuchowe peptydy, które mogą pobudzać uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększać jego poziom we krwi, takiejak His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 omówiony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4410512, to ważna jest możliwość tworzenia polipeptydów spełniających różne wymagania, np. odnośnie podawania, bioabsorpcji, czasu przebywania itp. Jednakże zmiany aminokwasów w pewnych pozycjach mogą mieć istotny wpływ na zdolność krótkołańcuchowych peptydów do pobudzania uwalniania hormonu wzrostu.
Pożądane byłoby posiadanie różnych krótkołańcuchowych polipeptydów pobudzających uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększanie jego poziomu we krwi istot żywych, zwłaszcza u ludzi Użyteczna byłaby także możliwość zastosowania takich polipeptydów do pobudzania uwalniania hormonu wzrostu i/lub zwiększania jego poziomu we krwi istot żywych i ludzi.
Pożądane byłoby również zapewnienie sposobów pobudzania uwalniania hormonu wzrostu i/lub zwiększania jego poziomu we krwi istot żywych, przy użyciu takich krótkołańcuchowych polipeptydów.
Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogólnym wzorze A1-A2-C1-C2-C3-A5, w którym:
A1 oznacza Gly, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kwas N-niższy alkiloaminokarboksylowy, kwas N,N-dwu-niższy alkilo-aminokarboksylowy, kwas azolokarboksylowy lub kwas niższy alkilo-aminokarboksylowy, gdzie niższa grupa alkilowa zawiera 2 do około 10 atomów węgla w łańcuchu prostym;
A2 oznacza DTrp, DβNal, D-4-Y-Phe- lub 5-Y-D-Trp, gdzie Y oznacza OH, Cl, Br, F lub H;
A5 oznacza A3-A4-A5', A3-A5', A4-A5' lub A5, gdzie (a) A3 oznacza Ala, Gly, DAla, Pro lub desAla;
(b) A4 oznacza Ala, Gly, DAla, Pro, kwas liniowy niższy alkilo-aminokarboksylowy lub desAla; i (c) Ay oznacza Lys(e-Rb R2)-Z, Orn(ÓTR, R2RZ, NH(CH2)XN(R3, R4), a gdy A1 nie oznacza His, to wówczas A5', może również oznaczać Lys-Z, Orn-Z lub Arg-Z, przy czym R1
169 562 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; R2 oznacza liniową nizszą grupę alkilową lub atom H; lecz gdy R1 oznacza H, to wówczas R2 nie oznacza H; a gdy R2 oznacza H, to wówczas R1 nie oznacza H; R3 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H, R4 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; Z oznacza NH(liniową niższą grupę alkilową), N(liniową niższą grupę alkilową)2, O-(liniową niższą grupę alkilową), NH2 lub OH, gdzie liniowa niższa grupa alkilowa jest zdefiniowana jak niższa grupa alkilowa; x oznacza 2 do 15;
C1 oznacza Ala;
C2 oznacza Trp, Phe lub ChxAla;
C3 oznacza DPhe, DPal lub DChxAla oraz ich organicznych lub nieorganicznych soli addycyjnych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że sprzęga się tworzące ten związek aminokwasy lub pochodne aminokwasów.
Korzystnym otrzymanym według wynalazku peptydem jest polipeptyd Ai-A2-Ala-C2DPhe-As, a zwłaszcza Ai-A2-Ala-Trp-DPhe-A5.
Figura 1 przedstawia szereg wykresów pokazujących poziom hormonu wzrostu u ludzi w zależności od czasu.
Sposób według wynalazku pozwala na wytworzenie nowych krótkołańcuchowych polipeptydów, które nieoczekiwanie pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi istot żywych. Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku są zdefiniowane następującym wzorem ogólnym:
AiwY-Ala-Trp-DPhe-As w którym Ai oznacza Gly, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kwas imidazolooctowy, kwas N-niższy alkilo-amino-karboksylowy, kwas N,N-dwu niższy alkiloaminokarboksylowy, kwas azolokarboksylowy lub kwas niższy alkilo-aminokarboksylowy, gdzie niższą grupa alkilowa zawiera 2 do około 10 atomów węgla w łańcuchu prostym. Korzystnie niższa grupa alkilowa stanowi łańcuch prosty o 2 do 6 atomach węgla. Niższa grupa alkilowa może być podstawiona lub niepodstawiona. Korzystnymi podstawnikami są O, N lub Si. Korzystnie niższa grupa alkilowa jest niepodstawiona. Korzystnym kwasem azolokarboksylowym jest kwas Ne--ńmidazolooctowy (IMA). Korzystnie Ai oznacza Gly, DAla lub His. Jeszcze korzystniej Ai oznacza His lub DAla. Ai najkorzystniej oznacza DAla.
A2 oznacza DTrp, DeNal, D-4-Y-Phe- lub 5-Y-D-Trp, gdzie Y oznacza OH, Cl, Br, F lub H. Korzystnie A2 oznacza T^Nal, D-4-Y-Phe- lub 5-Y-D-Trp. Korzystniej A2 oznacza T^Nal, Y korzystnie oznacza OH lub Η. A5 oznacza A3-A4-A5'. A3-A5'. A4-A5' lub A5'. Korzystnie A5 oznacza Ay. A3 oznacza Ala, Gly, DAla, Pro lub desAla. A- oznacza Ala, Gly, DAla, Pro, kwas liniowy niższy alkiloaminokarboksylowy lub desAla, Ay oznacza Lys(e-Ri, R2)-Z, Orn(5-Ri, R2)-Z, LArg(g-R5Ró), NH(CH2)XN(R-, R-). As· może również oznaczać Lys-Z, Orn-Z lub Arg-Z, gdy Ai nie oznacza His. Ri oznacza liniową niższą grupę alkilowąlub atomH. R2 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H. Gdy Ri oznacza H, to wówczas R2 nie oznacza H; podobnie gdy R2 oznacza H, to wówczas Ri nie oznacza H. R- oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H. R4 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H. R5 i R6 oznaczają niższe grupy alkilowe. Niższa grupa alkilowa zawiera 2 do około i0 atomów węgla w łańcuchu prostym. Korzystnie niższa grupa alkilowa stanowi łańcuch prosty o 2 do 6 atomach węgla. Niższa grupa alkilowa może być podstawiona lub niepodstawiona. Korzystnymi podstawnikami są O, N lub Si. Korzystnie niższa grupa alkilowa jest niepodstawiona, g oznacza grupę guanidynową. Z oznacza NH (liniową niższą grupę alkilową), N(liniową niższą grupę alkilową©, O-((iniową niższą grupę alkilową), NH2 lub OH, gdzie liniowa niższa grupa alkilowa jest zdefiniowana jak powyżej, x oznacza 2 do i5. x korzystnie oznacza 2 do 6. A5 korzystnie oznacza Lys-NH2.
Sposobem według wynalazku wytwarza się także organiczne i nieorganiczne sole addycyjne dowolnego z tych polipeptydów.
Stosowane skróty reszt aminokwasowych są zgodne z normą nomenklatury peptydów:
Gly = glicyna
Tyr = L-tyrozyna
Ile = L-izoleucyna
Glu = kwas L-glutaminowy
Thr = L-treonina
I69 562
Phe = L-fenyloalanina
Ala = L-alanina
Lys = L-lizyna
Asp = kwas L-asparaginowy
Cys = L-cysteina
Arg = L-arginina
Ava = kwas aminowalenanowy
Aib = kwas aminoizomasłowy
Gln = L-glutamina
Pro = L-prolina
Leu = L-leucyna
Met = L-metionina
Ser = L-seryna
Asn = L-asparagina
His = L-histydyna
Trp = L-tryptofan
Val = L-valina
DOPA = 3,4-dwuhydroksyfenyloalanina
Met(O) = sulfotlenek metioniny
Abu = kwas a-aminomasłowy iLys = N ε-izopropylo-L-lizyna 4--Abu = kwas 4-amnomasłowy Orn = L-ornityna
DaNal = α-naftylo-D-alanina
DpNal = β-naftylo-D-ałanina
Sar = sarkozyna
LArg = homoarginina
Chx = cykloheksyl
ChxAla = L-cykloheksyloalanma
DChxAla = D-cykloheksyk)alanina
IMA = kwas Na-imidazolooctowy
Tcc = kwas I,2,3,4-tetrahydrokarolino-7-karboksylowy-3
Tic = kwas i,2,3,4-LetrrOiycdoizochinolinokarboksylowy©
Tip = kwas 4,5,6,7-tetrahydro-IH-imidazo[e]karboksylowy-6 a,yABU = kwas α,γ-aminomasłowy DPal = D-3-pnrldyloalanina
Wszystkie trzyliterowe skróty aminokwasów poprzedzone D wskazują na konfigurację D reszty aminokwasowej, a glicyna jest objęta określeniem naturalny L-aminokwas.
W tych krótkołańcuchowych polipeptydach, zmiany w pewnych pozycjach są bardziej tolerowane niż w innych bez niekorzystnego wpływu na zdolność peptydu do uwalniania hormonu wzrostu i/lub zwiększania jego poziomu we krwi istot żywych. Przykładowo w pozycji A5. Takie zmiany w innych pozycjach są mniej tolerowane. Przykładowo dotyczy to środkowych reszt aminokwasowych Ala, Trp, DPhe, oznaczonych odpowiednio jako Ci, C2 i C3. Przykładowo poprzednio uważano, że Ai i A2 powinny mieć postać odpowiednio L i D, a Trp i DPhe powinny mieć również postać L i D, tworząc szereg LD LD. Stwierdziliśmy jednak, ze sekwencja LD LD może być sekwencją DD LD. Tak więc nieoczekiwanie odkryliśmy, że polipeptyd o wzorze AI-A2-CI-C2-C3-A5, w którym Ai, A2 i A5 mają wyżej podane znaczenie, Ci oznacza Ala, C2 oznacza Trp, Phe i ChxAla, a C3 oznacza DPhe, DPal lub DChxAla, będzie pobudzać uwalnianie hormonu wzrostu i/lub zwiększać jego poziom we krwi istot żywych.
Korzystnie C2 oznacza Trp lub Phe, a korzystniej C2 oznacza Trp.
C3 korzystnie oznacza Phe. Korzystnie, gdy C2 oznacza ChxAla, to wówczas C3 oznacza DPhe. Gdy C3 oznacza DPal, Z korzystnie oznacza OH.
169 562
Zwiększona elastyczność, związana z wyborem zasadowych, obojętnych i kwasowych reszt aminokwasów oraz postaci L i D, które można stosować do aminokwasów A, A2, A3, A4, As, C2 i C3, umożliwia szeroką kontrolę fizykochemicznych właściwości pożądanego peptydu.
Jakkolwiek DAl^j^^]DPNa]^-AJ^i^-Tr[>-D^^ei-L^sł-NH^2 i DAla-DSNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2 mają podobną aktywność uwalniającą GH, zastąpienie Trp przez Phe może prowadzić do zwiększenia chemicznej trwałości DAla-D[3Nal-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH.2, gdyż Trp jest bardziej wrażliwy na utlenianie niż Phe. Zastąpienie Trp przez Phe nadaje również peptydowi większą hydrofobowość i ta właściwość fizykochemiczna opisana poniżej może być korzystna ze względu na zwiększone wchłanianie po podaniu doustnym, poprzezskórnym i/lub donosowym oraz formułowanie peptydu. Ponadto wartości ED50 (dawka 50% skuteczna) w próbie histaminowej z użyciem komórki szczura są podobne w przypadku DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2 i DAla-DPNaPAla-Phe-DPhe-Lys-NH2, to jest wynoszą 30,5 ±0,5 i 30,8 + 0,3 pg/ml i obie te wartości wskazują na lepszą aktywność histaminową w porównaniu z Ala-His-DeNal-AlaTrp-DPhe-Lys-NH2, w przypadku której wspomniana wartość wynosi 11,0 ± 1,0 pg/ml. Peptydy o niższej aktywności uwalniającej histaminę (wyższa wartość ED50) mogą być klinicznie bardziej skuteczne, ponieważ mogłyby one wywoływać słabszą niekorzystną reakcję lokalną w miejscu iniekcji peptydu i/lub w ich przypadku zachodzi mniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia niekorzystnych efektów klinicznych związanych z antygenami układowymi.
Elastyczność to również ważna zaleta w przypadku formułowania i podawania pożądanego peptydu wybranemu gatunkowi. Te zmiany mogą także polepszać wchłanianie po podaniu doustnym oraz metabolizm i wydalanie peptydów. Przykładowo Ala^-HisHDeNal^-A.h-Ti-p^-DF^ł^^^Lys-NIH (GHRP-1) jest bardziej skuteczny niż Ala-His-DTrp-A]a-Trp-DPhe-Lys-NH2 pod względem zdolności uwalniania hormonu wzrostu u ludzi. Jednak DAla-DeNal-Aaa-Trp-DPheLys-NH2 (GHRP-2) jest bardziej skuteczny niż GHRP-1 po podaniu doustnym. Patrz figura 1, która pokazuje poziom hormonu wzrostu w surowicy normalnych młodych mężczyzn w zależności od czasu po podaniu 300 pg GHRP-1/kg 40 pacjentom na wykresie lewym (o), 600 pg GHRP-1/kg 39 pacjentom na wykresie środkowym (Δ) i 100 pg GHRP-2/kg 11 pacjentom na wykresie prawym (□). W tych badaniach GHRP podawano w 20 ml H2O i następnie natychmiast podawano 100 ml H2O normalnym młodym mężczyznom o średnim wieku około 25 lat. Krew pobierano w momentach zaznaczonych na wykresie. GH mierzono stosując test radioimmunologiczny.
Oczekuje się również, iż ze względu na to, że w tych peptydach można wyeliminować boczne łańcuchy aromatyczne w pewnych pozycjach, w których poprzednio uważano je za niezbędne, i że reszta D-aminokwasu powinna być bardziej biologicznie chroniona niż postać L, można uzyskać większą ochronę i stosować mniejsze ilości pewnych peptydów, aby następnie wytworzyć polipeptydy o lepszych właściwościach, takich jak wchłanianie po podaniu doustnym, donosowym lub poprzezskórnym, trwałość in vivo, itd.
Ugrupowania R1, R2, R3, R4 i Z także można zmieniać, co umożliwia dodatkową kontrolę fizykochemicznych właściwości pożądanego związku. Zatem można zapewnić zwiększone dostarczanie peptydu do określonego receptora i w określonych gatunkach.
Korzystnymi związkami wytworzonymi sposobem według wynalazku, uwalniającymi hormon wzrostu są także związki o wzorze
A1 -A2-Ala-Trp-DPhe-A5' albo organiczne lub nieorganiczne sole addycyjne dowolnego peptydu, gdzie A1, A2 i A5' mają wyżej podane znaczenie.
Korzystnym związkiem wytworzonym sposobem według wynalazku, uwalniającym hormon wzrostu jest peptyd o wzorze:
D Al a-A2-Ala-T rp-DPhe-As' oraz jego organiczne i nieorganiczne sole addycyjne. Korzystnymi peptydami z tej grupy związków są peptydy o wzorze:
DAla-DPNał-Ala-Trp-DPhe-LysNft
DAla-DPNal-Ała-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2
DAaa-DTip-Aaa-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2
DAła-DTip>-Aaa-Trp-DPhe-LysNH2
169 562
DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)5NH2
NH2(CH2)5CO-DP-Nal-Ala-Trp-D-Phe-iNI(CH2)5NH2 oraz ich organiczne i nieorganiczne sole addycyjne.
Te związki są najkorzystniejsze, ponieważ te krótkołańcuehowe polipeptydy taniej wytwarza się i te szczególne związki wykazały dużą siłę działania pobudzającego wzrost poziomu hormonu wzrostu w surowicy.
Inne wytworzone sposobem według wynalazku korzystne peptydy uwalniające hormon wzrostu mają wzór: Ai-A2-Ala-Phe-DPhe-A5. Korzystnymi peptydami z tej grupy związków są te, w których Ai oznacza NalMA, ayABU, DAla, Ala, His lub ayABU, A2 oznacza DPNal lub DPhe, a A5 oznacza LysNH2, ArgNH2, NH-Chx-NH2 (1,4-Chx-dwuaminę) lub Lys EA. Przykładowo
NttLMA-DpNal-'A.la-Phe-DPhe-LysNH2. ot,yABU-DPN ał-Ala-Phe-DPhe-Ly SNH2,
DAla-DPle-Ala-Phe-DPhe-LysN© pAla-His-DeNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2,
NaZMA-DpNal-Ala-Phc-DPhe-NH-Chx-NH2, ayABU-D|3Nal-Ala-Phe-DPhe-NH-Chx,NH2,
DAla-DpNal-Ala-Phe-DPhe-Lys EA,
DAla-DpN al-Al a-Phe-DPhe-D ArgNIE, oraz ich organiczne lub nieorganiczne sole addycyjne.
Sposobem według wynalazku otrzymuje się również polipeptydy o wzorze A1-A2-C1-C2C3-A5, w którym Ci oznacza Ala, C2 oznacza Trp, Phe lub ChxAla, C3 oznacza DPhe lub DChxAla, Ai oznacza korzystnie DAla. A2 oznacza korzystnie DPNal.
Przykładowo
DAla-DeNal-Ala-ChxAla-DPhe-LysNH2,
DAla-DpNal-Ala-Phe-DChxAla-LysNH2,
DAla-DeNal-Ala-ChxAla-DChxA]a-LysNH2, oraz ich organiczne i nieorganiczne sole addycyjne.
Opisane związki łatwo jest zazwyczaj zsyntetyzować sposobem według wynalazku, są one skuteczne jako środki zwiększające poziom hormonu wzrostu w surowicy krwi i korzystne z punktu widzenia produkcji i wykorzystania na skalę przemysłową. Ponadto związki te mogą być korzystne jako wykazujące właściwości fizykochemiczne pożądane dla skutecznego podawania takich związków polipeptydowych różnym gatunkom istot żywych, a to dzięki elastyczności osiągalnej poprzez różne podstawniki w licznych pozycjach związków polipeptydowych i dobór polarnych, obojętnych lub niepolarnych C-końcowych i środkowych części tych związków polipeptydowych, w wyniku której nadają się one do podawania wybraną metodą, drogą doustną, donosową, w sposób ciągły za pomocą specjalnych metod chemicznych/mechanicznych.
Peptydy wytworzone sposobem według wynalazku można stosować terapeutycznie w dowolnym przypadku, gdzie można stosować hormon wzrostu, takim jak leczenie karłowatości i podwzgórzowo-przysadkowej osteoporozy, oparzeń i niewydolności nerek w sposób uderzeniowy, brak zrostu złamanych kości oraz przyspieszanie gojenia się ran. Ponadto można je stosować w celu przyspieszania rekonwalescencji po oparzeniach i w przypadku ostrych/przewlekłych chorób wyniszczających. Wywierają one korzystne działanie anaboliczne na skórę, mięśnie i kości w przypadku procesu starzenia się, a przy tym zmniejszają poziom ciał tłuszczowych. Przy użyciu tych peptydów można też leczyć chorych na raka, przykładowo zapobiegać kacheksji lub ją zmniejszać. Takie zastosowanie terapeutyczne polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości peptydu. Jest to taka ilość, którajest potrzebna do pobudzenia uwalniania hormonu wzrostu i zwiększenia jego poziomu w surowicy, jak to opisano powyżej.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można również stosować w celu zwiększania poziomu GH we krwi istot żywych, zwiększania produkcji mleka przez krowy, zwiększania rozrostu ciała u takich istot żywych jak ssaki (np. ludzie, owce, bydło i świnie), a także ryby, drób, inne kręgowce i skorupiaki, a także produkcji wełny i/lub sierści u ssaków. Stopień rozrostu ciała zależy od płci i wieku gatunku istoty żywej, danego podawanego związku uwalniającego hormon wzrostu i jego ilości, drogi podawania, itp. Związki wytwarzane sposo8
169 562 bem według wynalazku zwiększają też poziom GH w surowicy ludzi, zwiększają rozrost ciała dzieci o niskim wzroście, zmniejszają poziom ciał tłuszczowych i polepszają metabolizm białek u wybranych dzieci, polepszają metabolizm białek skóry, mięśni i kości, zmniejszając poziom ciał tłuszczowych u starszych ludzi, zwłaszcza w przypadku niedoboru GH.
Peptydy wytwarzane sposobem według wynalazku są także przydatne do polepszania modelu lipidów w surowicy ludzi, gdyż zmniejszają w surowicy ilość cholesterolu i lipoprotein o niskiej gęstości i zwiększają w niej .ilość lipoprotein o wysokiej gęstości.
Nowe związki polipeptydowe wytworzone sposobem według wynalazku można syntetyzować metodami znanymi w chemii peptydów w roztworze lub w fazie stałej, względnie klasycznymi znanymi sposobami.
W przypadku peptydów amidowych synteza w fazie stałej rozpoczyna się od C-końca peptydu. Odpowiedni materiał wyjściowy można wytworzyć np. dołączywszy żądany zabezpieczony α-aminokwas do żywicy chlorometylowanej, żywicy hydroksymetylowanej, żywicy henzhydryloaminowej (BHA) lub żywicy p-metylobenzhydryloaminowej (p-Me-BHA). Jedna z takich żywic chlorometylowych jest sprzedawana pod nazwą handlową BIOBEADS SX-1 przez Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia. Wytwarzanie żywicy hydroksymetylowej opisali Bodansky i in. w Chem. Ind. (Londyn) 38, 1597 (1966). Żywicę bHa opisali Pietta i Marshall, Chem. Comm., 650 (1970), a jest ona dostępna w handlu jako produkt Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, Kalifornia.
Po wstępnym przyłączeniu grupę zabezpieczającą grupę α-aminową można usunąć przy użyciu różnych reagentów kwasowych, w tym roztworów kwasu trójfluorooctowego (TFA) lub kwasu solnego (HCl) w rozpuszczalnikach organicznych, w temperaturze pokojowej. Po usunięciu grupy zabezpieczającej grupę α-aminową pozostałe zabezpieczone aminokwasy można sprzęgać stopniowo w żądanej kolejności. Każdy zabezpieczony aminokwas można ogólnie poddawać reakcji w około trzykrotnym nadmiarze, z użyciem odpowiedniego aktywatora grupy karboksylowej, takiego jak dwucykloheksylokarbodwuimid (DCC) lub dwuizopropylokarbodwuimid (DIC) w chlorku metylenu (CH2Ch) lub dwumetyloformamidzie (DMF) i ich mieszaninach.
Po zakończeniu żądanej s^J^-we^^ji aminokwasów żądany peptyd można odszczepić z żywicy benzhydryloaminowej jako nośnika działaniem takiego reagenta jak fluorowodór (HF), który nie tylko odszczepia peptyd od żywicy, ale także odszczepia większość powszechnie stosowanych grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Gdy stosuje się żywicę chlorometylową lub hydroksymetylową, to w wyniku działania HF otrzymuje się peptyd w postaci wolnego kwasu. Z tych peptydów na żywicy można łatwo wytworzyć peptydy alkiloaminowe i estry przez odszczepienie przy użyciu odpowiedniej alkiloaminy, dwualkiloaminy lub dwuaminoalkanu, względnie drogą transestryfikacji alkoholem przy wysokiej wartości pH.
Opisany powyżej sposób syntezy w fazie stałej jest dobrze znany i został opisany przez Stewarda i Younga w Solid Phase Peptide Synthesis: Second Edn. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1098).
Niektóre powszechnie znane metody syntezy w roztworze, które można stosować w sposobie syntezy ugrupowań peptydowych według wynalazku przedstawiono w publikacji Bodansky i in., Peptide Synthesis, 2nd Edition, John Wiley and Sons, Nowy Jork, N.Y. 1976.
Uważa się, że korzystniejsza jest synteza peptydów w fazie roztworu, obejmująca reakcję kondensacji co najmniej dwóch fragmentów peptydowych.
Sposób ten polega na kondensacji fragmentu peptydowego X-Aj-Y z fragmentem peptydowym U-V-W, gdzie wszystkie aminokwasy, z wyjątkiem A1, są obojętne lub zabezpieczone, a X oznacza Prot., przy czym Prot. oznacza grupę zabezpieczającą N-koniec, Y oznacza A2-Q. Ala-A2-Q, A2-Ala-Q, Ala-A2-Ala-Q, A2-Ala-Trp-Q, Ala-A2-Ala-Trp-Q. Ala-Q lub -Q, przy czym gdy Y oznacza Q, to wówczas U oznacza J-A2-Ala-Trp lub J-Ala-A2-Ala-Trp. Gdy Y oznacza Ala-Q, to wówczas U oznacza J-A2-Ala-Trp. Gdy Y oznacza A2-Q lub Ala-A2-Q, to wówczas U oznacza J-Ala-Trp. Gdy Y oznacza A2-Ała-Q lub Ala-A2-A3-Q, to wówczas U oznacza J-Trp. Gdy Y oznacza A2-Ała-Trp-Q lub Ala-A2-Ała-Trp-Q, to wówczas U oznacza J. V oznacza A5 lub Z. Gdy V oznacza A5, to wówczas W oznacza Z. Gdy V oznacza Z, to wówczas nie ma W. A1, A2, A51 Z mają zdefiniowane tu znaczenie.
I69 562
Q jest końcem karboksylowym fragmentu peptydu i oznacza -OR3 lub -IM, gdzie M oznacza resztę zdolną do ulegania podstawieniu przez zawierający azot nukleofil, a R3 oznacza H, grupę alkilową o i do około I0 atomach węgla, grupę arylową o 6 do około I2 atomach węgla lub grupę aralkilową o 7 do około I2 atomach węgla J oznacza koniec aminowy wskazanego fragmentu i oznacza H lub grupę zabezpieczającą, która nie przeszkadza w reakcji sprzęgania, np. benzyl.
Następnie usuwa się grupy zabezpieczające.
Alternatywnie można zastosować tak wytworzony zabezpieczony peptyd w dalszych kondensacjach, w celu wytworzenia większego peptydu.
Tę korzystną metodę opisano bardziej szczegółowo w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr seryjny 558I2I, złożonym 24 lipca I990 r. przez Johna C. Hubbsa i S.W. Parkera, zatytułowanym Process for Synthesizing Peptides opublikowanym jako WO 920I709.
Związki wytwarzane według wynalazku pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i/lub zwiększają jego poziom we krwi istot żywych. Ten sposób pobudzania uwalniania hormonu wzrostu i/lub zwiększania jego poziomu można stosować w celu leczenia wyżej wspomnianych chorób. Polega on na podawaniu istocie żywej skutecznej dawki co najmniej jednego z wyżej opisanych polipeptydów. Związki wytworzone sposobem według wynalazku można także podawać istotom żywym innym niż ludzie.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo (drogą iniekcji domięśniowej (i.m.), dootrzewnowej (i.p.), dożylnej (i.v.) lub podskórnej (c.s.)), donosowo, dopochwowo, doodbytniczo lub podjęzykowo i można im nadawać formę postaci dawkowanych odpowiednich dla danej drogi podawania. Korzystne jest podawanie pozajelitowe.
Do stałych postaci dawkowanych do podawania doustnego należą kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulaty. W takiej stałej postaci dawkowanej związek aktywny jest zmieszany z co najmniej jednym obojętnym nośnikiem, takim jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Takie postacie dawkowane mogą także zawierać, co jest powszechną praktyką, dodatkowe substancje inne niż obojętne rozcieńczalniki, np. środki poślizgowe, takie jak stearynian magnezu. W przypadku kapsułek, tabletek lub pigułek postacie dawkowane mogą także zawierać bufory. Tabletki i pigułki mogą dodatkowo mieć powłoczki jelitowe.
Ciekłe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry, zawierające powszechnie stosowane obojętne rozcieńczalniki, takie jak woda. Poza takimi obojętnymi rozcieńczalnikami kompozycje mogą zawierać także substancje pomocnicze, takie jak zwilżacze, emulgatory i środki suspendujące, a także środki słodzące, smakowe i zapachowe.
Do preparatów do podawania pozajelitowego należą jałowe, wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników lub nośników są glikol propylenowy, poliglikol etylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i olej kukurydziany, żelatyna i estry organiczne do iniekcji, takie jak oleinian etylu. Takie postacie dawkowane mogą także zawierać substancje pomocnicze, takie jak konserwanty, zwilżacze, emulgatory i dyspergatory. Można je wyjaławiać, np. drogą filtracji przez filtr zatrzymujący bakterie, przez wprowadzanie środków wyjaławiających do kompozycji, przez naświetlanie kompozycji lub przez ogrzewanie kompozycji. Można je także wytwarzać w środowisku jałowej wody lub innym jałowym środowisku do iniekcji bezpośrednio przed użyciem.
Nowe związki wytwarzane sposobem według wynalazku są także użyteczne, gdy podaje się je w połączeniu z hormonem uwalniającym hormon wzrostu (to jest naturalnym hormonem uwalniającym hormon wzrostu, jego analogami lub funkcyjnymi odpowiednikami), a także w połączeniu z innymi środkami pobudzającymi uwalnianie hormonu wzrostu, np. peptydami uwalniającymi hormon wzrostu (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778, przytoczony tu jako pozycja literaturowa, np. inhibitorami acetylocholinoesterazy, środkami blokującymi receptory adrenergiczne β, środkami blokującymi receptory adrenergiczne a.2, itd. Takie połączenia są szczególnie korzystnymi środkami do podawania uwalniających hormon wzrostu peptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku,
169 562 gdyż połączenie sprzyja uwalnianiu znacznie większej ilości hormonu wzrostu niż można by to było przewidzieć sumując poszczególne reakcje na poszczególne składniki połączenia, to znaczy połączenie wywołujące reakcję synergiczną w stosunku do indywidualnego składnika. Dalsze szczegóły dotyczące podawania połączeń uwalniających hormon wzrostu peptydów opisano w wyżej przytoczonym opisie patentowym. Takie związki synergiczne są korzystnie związkami działającymi jako agoniści receptorów hormonu uwalniającego hormon wzrostu lub inhibituje-cymi działanie somatostatyny. Synergizm może być dwoisty, to znaczy występować w przypadku związku wytwarzanego według wynalazku i jednego ze związków synergicznych, względnie występować w przypadku większej liczby związków synergicznych.
Połączenia, które skutecznie wywołują uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi takich istot żywych jak ludzie, zawierają skuteczną ilość polipeptydów wybranych spośród zastrzeżonych tu polipeptydów i co najmniej jeden związek z następujących grup: polipeptydów z Grupy 1, lub związek pobudzający uwalnianie hormonu wzrostu, np. spośród polipeptydów z Grupy 2, przy czym polipeptydy z Grupy 1 są wybrane spośród dowolnych naturalnych hormonów uwalniających hormon wzrostu oraz ich funkcyjnych odpowiedników, a wspomniane polipeptydy działają na receptory hormonu uwalniającego hormon wzrostu u ssaków i innych kręgowców oraz skorupiaków.
Polipeptydy z Grupy 2 są wybrane spośród dowolnych polipeptydów o wzorze:
Tyr-DArg-Phe-NH2;
Tyr-DAla-Phe-NH2;
Tyr-DArg(NO2)-Phe-NH2;
Tyr-DMet(O)-Phe-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2;
TymDArg-Phe-Gly-NH2;
Tyr-DThr-Phe-Gly-NH2;
Phe-DArg-Phe-Gly-NH2;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
Tyr-DAia-Gly-Phe-NH2;
Tyr-DArg-Gly-Trp-NH2;
Tyr-DArg(NO2)-Phe-Gly-NH2;
Tyr-DMet(O)-Phe-Gly-NH2;
(NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
T yr-DArg-Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH2;
Tyr-DArg-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Sar-ol;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NlT;
Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol;
Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol;
Gly-T yr-DArg-Phe-Gly-N^;
Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH2;
Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Gly-ol;
T yr-D Ala-Gly-(NM.e)Phe-Gly-ol;
Tyr-DArg-Phe-Sar-NH?;
Tyr-DAla-Phe-Sar-NH2;
Tyr-DAla-Gly-(NMe--Phe-NH2;
Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH2;
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (cykliczny dwusiarczek);
Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH2 (wolny dwutiol);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (cykliczny dwusiarczek);
Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH2 (wolny dwutiol);
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NPL·;
Tyr-DAl a-Phe-S ar-T y r-Pro-Ser-NH2;
I69 562 ii
Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH2;
Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2;
Tyr-DAla-Phe-S ar-Phe-Hyp-S er-NH;
T yr-DArg-Phe-Gly-T yr-Hyp-Ser-NH;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH2;
Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH2; i
Tyr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Pro-Ser-NH2; oraz organicznych i nieorganicznych soli addycyjnych tych peptydów z Grupy 2, przy czym to połączenie podaje się w takim stosunku, ze skutecznie wywołuje ono synergiczne uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększanie jego poziomu we krwi takich istot żywych.
Inne związki pobudzające uwalnianie hormonu wzrostu są znane fachowcom i należą do nich inhibitory acetylocholinoesterazy, środki blokujące receptory adrenergiczne β i agoniści receptorów adrenergicznych a2.
Korzystnie stosuje się naturalne hormony uwalniające hormon wzrostu i ich funkcyjne odpowiedniki wraz ze związkami pobudzającymi uwalniającymi hormon wzrostu i wytwarzanymi sposobem według wynalazku peptydami. Przykładowo stosuje się związki z Grupy i i Grupy 2 wraz z wytworzonymi sposobem według wynalazku peptydami, względnie związki z Grupy i lub środki blokujące receptory β adrenergiczne wraz z peptydami wytworzonymi sposobem według wynalazku.
Ilość podawanego polipeptydu lub kombinacji polipeptydów wytworzonych według wynalazku będzie się zmieniać w zależności od licznych czynników, np. danej leczonej istoty żywej, jej wieku i płci, żądanego efektu terapeutycznego, drogi podawania i tego jaki polipeptyd lub jaką kombinację polipeptydów zastosowano. We wszystkich jednak przypadkach stosuje się dawkę skutecznie pobudzającą uwalnianie i zwiększającą poziom hormonu we krwi przyjmującej istoty żywej (ilość terapeutycznie skuteczną). Na ogól ta dawka wynosi około 0,i pg do 10 pg polipeptydu ogółem na i kg wagi ciała. Korzystną ilość fachowiec łatwo określi empirycznie w oparciu o niniejsze ujawnienie.
Przykładowo w przypadku podawania i.v. ludziom korzystna dawka wynosi około 0,i pg do i0 pg polipeptydu ogółem na i kg wagi ciała, korzystnie od około 0,5 pg do 5 pg polipeptydu ogółem na i kg wagi ciała, a jeszcze korzystniej od około 0,7 pg do 3,0 pg polipeptydu ogółem na i kg wagi ciała. Gdy stosuje się kombinację peptydów uwalniających hormon wzrostu, można użyć mniejsze ilości opisywanego tu peptydu. Przykładowo przy połączeniu opisywanego ,tu peptydu z np. synergicznym związkiem z Grupy i z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778, takim jak GHRH, korzystny zakres wynosi od około 0,i pg do około 5 pg opisywanego tu związku na i kg wagi ciała i od około 0,5 pg do około i5,0 g związku synergicznego (np. GHRH), a korzystniej od około 0,i pg do około 3 pg niniejszego związku i od około i,0 pg do około 3,0 pg związku synergicznego na i kg wagi ciała.
W przypadku podawania doustnego trzeba na ogół stosować większe ilości. Przykładowo przy doustnym podawaniu ludziom dawka wynosi zwykle od około 30 pg do około 1200 pg polipeptydu na i kg wagi ciała, korzystniej od około 70 pg do około 600 pg polipeptydu na i kg wagi ciała, a jeszcze korzystniej od około 200 pg do około 600 pg na i kg wagi ciała. Krowom i świniom trzeba podawać w przybliżeniu takie same dawki jak ludziom, natomiast szczury wymagają zazwyczaj dawek większych. Konkretną dawkę łatwo jest ustalić empirycznie na podstawie niniejszego ujawnienia.
Jak wspomniano uprzednio, na ogół podawanie połączenia peptydów uwalniających hormon wzrostu pozwala na obniżenie dawki w stosunku do dawki potrzebnej dla uzyskania podobnej reakcji w przypadku oddzielnego podawania poszczególnych związków, uwalniających hormon wzrostu, a to ze względu na synergiczne działanie połączenia.
Związki wytworzone sposobem według wynalazku wchodzą w skład kompozycji zawierających jako substancję czynną organiczne lub nieorganiczne addycyjne sole wyżej opisanych polipeptydów i ich połączeń, ewentualnie wraz nośnikiem, rozcieńczalnikiem, matrycą zapewniającą powolne uwalnianie lub powłoką.
169 562
Do odpowiednich organicznych i nieorganicznych soli addycyjnych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku uwalniających hormon wzrostu i ich połączeń należą sole z takimi ugrupowaniami organicznymi jako ugrupowania octanu, trójfluorooctanu, szczawianu, walerianianu, oleinianu, laurynianu, benzoesanu, mleczanu, tosylanu, cytrynianu, maleinianu, fumaranu, bursztynianu, winianu, naftalanu, itp. oraz takimi ugrupowaniami nieorganicznymi jak ugrupowania soli metali z grupy I (to jest soli metali alkalicznych), z grupy II (to jest metali ziem alkalicznych), soli amonowych i soli protaminy, cynku, żelaza, itp., z takimi przeciwjonami jak chlorem, bromek, siarczan, fosforan, itp., a także ugrupowania organiczne podane powyżej.
W przypadku podawania pacjentom-hidziom korzystne są sole farmaceutycznie dopuszczalne. Do takich soli należą nietoksyczne sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i amonowe, powszechnie stosowane w przemyśle farmaceutycznym, takie jak sole sodowe, potasowe, litowe, wapniowe, magnezowe, barowe, amonowe i protaminy, które wytwarza się dobrze znanymi metodami. To określenie obejmuje także nietoksyczne addycyjne sole z kwasami, które na ogół wytwarza się drogą reakcji związków według wynalazku z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym. Do reprezentowanych soli należą chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, wodorosiarczan, octan, szczawian, walerianian, oleinian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, fumaran, bursztynian, winian, naftylan, itp.
Przeprowadzono szereg doświadczeń określających uwalnianie hormonu wzrostu.
Próba 1
Uwalnianie GH in vivo u szczura
Niedojrzałe samice szczurów Sprague-Dawley otrzymano z Charles Rivers Laboratories (Wilmington, MA). Po przybyciu zostały umieszczone w pomieszczeniu o temperaturze 25°C i cyklu światło : mrok 14 : 10 godzin. Woda i pokarm dla szczurów Purina były dostępne do woli. Małe szczury trzymano z matkami do wieku 21 dni.
Dwadzieścia sześć dorosłych szczurów, po 6 szczurów w grupie zabiegowej, uśpiono przez dootrzewnowe podanie 50 mg/kg pentobarbitalu na 20 minut przed dożylnym podaniem peptydu. Nośnikiem preparatu peptydu do iniekcji dożylnej (i.v.) był normalny roztwór solanki zawierający 0,1% żelatyny. Uśpionym szczurom o wadze 55 - 65 g wstrzyknięto i.v. związki uwalniające hormon wzrostu w ilościach podanych w tabeli 1. Wstrzykiwano 0,1 ml roztworu w żyłę szyjną.
Wszystkie zwierzęta uśmiercono przez zgilotynowanie w 10 minut po ostatniej iniekcji badanego związku (patrz tabela 1). Po dekapitacji zebrano krew z tułowia dla oznaczenia poziomu GH we krwi. Pozwolono, by krew skrzepła, po czym odwirowano ją i surowicę oddzielono od skrzepu. Surowicę przechowywano w stanie zamrożonym aż do dnia przeprowadzenia analizy radioimmunologicznej (RIA) dla określenia poziomu hormonu wzrostu według następującej procedury opracowanej w National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIADDK).
Reagenty dodaje się zwykle do probówek do RIA w pojedynczym uchwycie w temperaturze lodówki (około 4°C) w następującej kolejności:
(a) bufor (b) zimny (tojestnieradioaktywny) wzorzec lub próbka nieznanej surowicy przeznaczonej do analizy, (c) znaczony jodem radioaktywnym antygen hormonu wzrostu i (d) surowica przeciw hormonowi wzrostu.
Dodawanie reagentów prowadzi się zazwyczaj tak, by uzyskać końcowe rozcieńczenie w probówce do RIA około 1 : 30000 (stosunek objętości surowicy anty do całkowitej objętości cieczy).
Zmieszane reagenty na ogół inkubuje się następnie w temperaturze pokojowej (około 25°C) przez około 24 godziny przed dodaniem drugiego przeciwciała (np. surowica kozy łub królika wiążąca gamma-globułiny małpy), które wiąże się z surowicą przeciw hormonowi wzrostu i powoduje precypitację jego kompleksu. Zawartość probówek do RIA z osadem analizuje się następnie pod kątem liczby impulsów zliczonych w określonym okresie czasu w liczniku scyntylacyjnym gamma. Krzywą wzorcową otrzymuje się sporządziwszy wykres liczby
169 562 impulsów w funkcji poziomu hormonu wzrostu (GH). Następnie poziom GH w badanych próbkach określa się przez porównanie z krzywą wzorcową.
Pomiar dla surowicy GH metodą RIA prowadzono z użyciem reagentów dostarczonych przez the National Hormone and Pituitary Program.
Poziom w surowicy z tabeli 1 rejestrowano w ng/ml w odniesieniu do normy szczurzej wynoszącej 0,61 jednostki międzynarodowej/mg (IU/mg). Wyniki zarejestrowano jako średnią +/- błąd standardowy średniej (SEM). Analizę statyHycz-ną przeprowadzono przy użyciu testu t-Studenta. W tabeli 1 podane wyniki to wartości średnie z badań dla 6 szczurów.
Tabela 1
Uwalnianie GH m vivo pobudzane przez związki uwalniające hormon wzrostu u szczura znieczulonego pentobarbitalem (Zwierzęta uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A Peptyd uwalniający GH Całkowita dawkaa (Pg/iv) GH w surowicy w próbie kontrolnej ng/ml ±SEM (N=6) Uwolniony GH w surowicy ng/ml ±SEM (N=6)
1 2 3 4
Ala-His-DeNal-A.ai^-Trii- 0,1 337 ±51 610 ± 90
DPhe-Lys-NH2b 0,3 337 ±51 1140 ± 187
1,0 337 ±51 2909 ± 257
3,0 337 ±51 3686 ± 436
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- 0,1 131±43 540± 148
Lys-NH2 0,3 131±43 751± 88
1,0 131 ±43 1790 ±252
3,0 131 ±43 2481 ±209
DAJa-DeNal-Ala-Trp-DPhe- 0,1 337 ±51 1381 ±222
Lys-NH2 0,3 337 ±51 2831 ±304
1,0 337 ±51 2886± 179
3,0 337 ±51 3678 ± 287
Ala-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 167 ± 46 363 ± 73
1,0 167 ±46 1450 ±294
3,0 167 ±46 2072 ±208
10,0 167 ±46 2698 ± 369
DAla-LeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,1 263 ± 45
0,3 160± 151 315 ±85
1,0 160± 151 426 ± 41
DAla-DTη--Ala-Trp-DPheLys-INH2 0,1 111 ± 24 526 ± 86
0,3 111 ± 24 1608 ±204
1,0 111 ±24 2820 ± 346
3,0 111 ±24 2437 ±214
Ala-DeNal-AIa-NMeTri- ' -
DPhe-Lys-NH2 0,1 167 ±46 144 ±20
0,3 167 ±46 258 ± 28
1,0 167 ± 46 261 ±24
3,0 167 ±46 277 ± 85
i4 i69 562 ciąg dalszy tabeli i
i 2 3 4
D-Leu-DeNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,i i60 ±5i 256 ± 94
0,3 i60 ±5i 452 ± 49
i,0 i60 ±5i 355 ±94
D-Trp^^eNal-^i^-Tri^- DPhe-Lys-NH2 0,i i60 ±5i 226 ± 6i
0,3 i60 ±5i 245 ± 27
i,0 i60 ±5i 437 ± 62
Ala-Hls-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 i60 ±5i i4i8 ±302
i,0 i60 ±5i 220i ±269
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2b 0,i i40 ± i0 200 ± 40
0,3 i 40 ±i0 505± 50
i,0 i 40 ±i0 i640 ±2i5
DAsn-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,i 228 ± 23 i22 ± 38
0,3 228 ± 23 i95 ± 2i
i,0 228 ± 23 i97 ± 47
DHis-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,i 228 ±23 386 ±8i
0,3 228 ±23 605 ± 82
i,0 228 ±23 930 ± 96
DLys-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,i 228 ±23 262 ±3i
0,3 228 ±23 340 ± 86
i,0 228 ±23 335 ± 56
DSer-ieNa-Aa-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,i 228 ± 23 226 ± ii
0,3 228 ± 23 i7i ±48
i,0 228 ± 23 2i2 ±43
Ala-His-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 228 ± 23 i746 ±3i8
i,0 228 ± 23 26i0± i76
GIy-DβNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 i60 ±36 i 237 ± 249
i,0 160 ±36 2325± 46
3,0 i 60 ± 36 2694 ±370
i0,0 i 60 ±36 3454± i59
Ser-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 i60 ±36 227± 39
i,0 i60 ±36 595 ± i i2
3,0 i60 ±36 i303 ±28i
i0,0 i60 ±36 29i9 ± 320
169 562 i5 ciąg dalszy tabeli i
i 2 3 4
Meι-DβNal-“Ma-Trp-DPlieLys-NH2 0,3 160 ±36 181± 48
1,0 i60 ±36 226± 58
3,0 160 ±36 316± 66
10,0 160 ±36 1010 ±236
Ala-HiS-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-Nl^b 0,1 160 ±36 822 ±243
0,3 160 ±36 1594 ±292
1,0 i60 ±36 2180 ±284
Gln-l^N al-Ala-Trp-DPheLys-NH2 0,3 i3i ±43 124 ± 15
1,0 131 ±43 340 ± 66
3,0 131 ±43 476 ±i09
10,0 131 ±43 673 ±228
Pro-DβNal-Ala-Trp-DPht- Lys-“NH2 0,3 i35 ±32 26-4 + 31
1,0 135 ±32 513 ±123
3,0 135 ±32 i690± 103
Gly-DβNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 215 ±33 1301 ±260
1,0 215 ±33 2211 ±146
3,0 215 ± 33 2364 ±365
NαAceryl-Gly-DβNal-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 262 ± 53* 268± 21*
1,0 262 ±53* 599 ±219*
3,0 262 ±53* 626 ±210*
Sar-DβNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 262 ±53* * 908 ± 264
1,0 262 ±53* 1681 ±262*
3,0 262 ± 53 2600 ±316*
DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- NH2 0,3 2i5 ± 33 436± 98
1,0 215 ±33 660± 151
3,0 215 ±33 776 ± 274
NαAceryl-DβNal-Ala-Trρ- DPhe-Lys-NH2 0,3 262 ± 53* 339± i7*
1,0 262 ±53* 430± 136*
3,0 262 ±53* 634± 118*
NαIzopropyl-DβNal-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 262 ± 53* 54i± 179*
1,0 262 ±53* 982 ± 247*
3,0 262 ± 53* 1636 ±371*
169 562 ciąg dalszy tabeli 1
1 2 3 4
Nadwuetylo-DBNal-Ala- Trp-DPhc-Lys-NH2 0,3 127 ±32* 462 ± 132*
1,0 127 ±32* 889± 160*
3,0 127 ±32* 1786 ±373*
Nctetyl-DeNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 135 ±32 531± 80
1,0 135 ±32 1156 ±250
3,0 135 ±32 2664 ± 225
Gly-DeNal-Aaa-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,3 135 ±32 1387 ±352
1,0 135 ±32 1958 ±353
3,0 135 ±32 2605 ± 97
βAla-DβNal-Ala-Trp-DPh-- Lys-NH2 0,3 135 ±32 1937 ±343
1,0 135 ±32 3603 ± 645
3,0 135 ±32 4000 ±500
** ~ Ava -DβNal-Ala-Trp-DPh-Lys-NH2 0,3 135 ±32 2469± 185
1,0 135 ±32 4034 ±680
3,0 135 ±32 3142 ±392
Ala-DeNal-Ala-Trp-DPhe-
NHCH2CH2NH2 0,3 208 ±148* 211± 27*
1,0 208± 148* 468 ±127*
3,0 208 ± 148* 877 ± 325*
30,0 208 ±148* 2325 ±477*
Ala-DeNal-Ala-Trp-DPhe- NHCH2CH2CH2CH2CH2NH2 0,3 208 ± 148* 284 ±132*
1,0 208 ±148* 527± 166*
3,0 208 ±148* 816 ±289*
30,0 208 ±148* 3650 ±772*
D-Ala-DeNal-Aaa-Trp- DPhe- 0,3 111 ±24 !80± 37
NHCH2CH2CH2CH2CH2NH2 1,0 111 ±24 686 ±135
3,0 111 ±24 1490 ±179
10,0 111 ±24 2248 ± 70
Ala-DeNal-Ala-Trp-DPhe- OMe 0,3 208 ±148* 211 ±48*
1,0 208 ±148* 157 ±35*
3,0 208 ±148* 492 ±147*
30,0 208 ±148* 554 ±127*
D-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,1 111 ± 24 526 ± 86
0,3 111 ±24 1608 ±204
1,0 111 ± 24 2820 ± 346
3,0 111 ±24 2437 ±214
169 562 ciąg dalszy tabeli 1
1 2 3 4
Alb-DpNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,1 208 ±148* 269± 58*
0,3 208 ±148* 331±108*
1,0 208 ±148* 368± 133*
3,0 208± 148* * 1090± 176
D-Ala-DPNal-Ala-Trp-
DPhe-Lys(iPr)-NH2 0,1 215 ±49 608 ±115
0,3 215 ±49 1753 ±419
1,0 215 ± 49 1817 ±297
3,0 215 ±49 2336± 196
Rozpuszczony w DMSO. ** Rozpuszczony w kwasie aminowalerianowym (Ava) a Dawki podawano samicom szczurów mającym 29 dni b Próba kontrolna z użyciem GHRP
W tabeli 1 związki wytworzone według wynalazku porównano ze związkami nie objętymi wzorem ogólnym tych związków i wykazano, że pobudzają one uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi szczurów, którym takie związki podano. Nieoczekiwana uwalniająca hormon wzrostu aktywność korzystnych związków jest bardzo cenna, gdyż krótkołańcuchowe polipeptydy o niskiej masie cząsteczkowej, zawierające stosunkowo trwały i tani aminokwas D-alaninę na amino-końcu i pentanodwuaminę zamiast Lys na C-końcu, okazały się tanimi środkami do zwiększania poziomu hormonu wzrostu u istot żywych i ludzi.
Próba 2 - Uwalnianie GH in vivo u szczura po podaniu doustnym
Powtórzono procedurę z próby 1, lecz szczurom podano wskazane dawki związków przez zgłębnik żołądkowy. Podawane związki, stosowane dawki i wyniki podano w tabeli 2.
Tabela 2
Uwalnianie GH in vivo pobudzane przez związki uwalniające hormon wzrostu u szczura znieczulonego pentobarbitalem (szczury uśmiercono w różnym czasie po dożołądkowym podaniu peptydu)
Kolumna A Peptyd uwalniający GH Całkowita dawka (mg/kg) GH w surowicy ng/ml ±SEM (N=6) GH w surowicy ng/ml ±SIeM (N=6) po (15’)(20’)(30’)
1 2 3 4
Ala-His-DpNal-Aaa-Trp- DPhe-Lys-NH2a 10 247 ± 32 786 ±244
30 247 ± 32 1914 ±294
DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 10* 247 ± 32 116±298
30** 247 ± 32 2038 ± 444
Ava-D3Nal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH.2 30 322 ±145* 2135 ±586*
Gly-DPNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 30 247 ± 32 1072± 137
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 30 247 ± 32 1810± 437
169 562 ciąg dalszy tabeli 2
1 2 3 4
Ala-Hts-DpNal-Ala-TrpDPhe-Lys-NH2 a 10 196 ± 49(15') 1421± 363
147 ±30(20') 1605 ±621(20')
133 ± 18(20') 752 ±81(30')
DAla-DpNal-Aaa-Trp-DPhe- Lys-NH2 10 196 ±49(15') 706 ± 133(15')
147 ±30(20') 1062 ± 254(20')
Gly-DpNal-Aaa-Trp-DPhe- Lys-NH2 10 196 ±49(15') 957 ± 188(15)
147 ±30(20') 1685 ± 524(20')
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe- Lysa 10 196 ±49(15') 1131± 189(15)
147 ± 30(20') 686 ± 149(20)
βAla-DβNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 10 196 + 49(15') 1202 ± 429(15')
147 ± 30(20') 1217 ±239(20')
Ava-DβNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 10 196 ±49(15') 1407 ± 204(15')
147 ± 30(20') 1251 ±351(20')
* Zawiesina (rzadka* lub gęsta**) - dodano do kwasu octowego a Peptydy kontrolne
Związki wytwarzane sposobem według mniejszego wynalazku zachowują użyteczną aktywność uwalniaj ącą GH po doustnym podaniu szczurom. Jest to bardzo cenne, gdyż ta metoda podawania umożliwa zwiększenie terapeutycznej użyteczości peptydów.
Próba 3. Uwalnianie GH m vivo u szczura
Powtórzono procedurę z próby 1. Podawane związki, stosowane dawki i wyniki podano w tabelach 3 i 4.
Tabela 3
Uwalnianie GH in vivo pobudzane przez syntetyczne peptydy uwalniające hormon wzrostu u szczurów znieczulonych pentobarbitalem (Zwierzęta uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A Peptyd uwalniający GH Całkowita dawka (mg/iv) GH w surowicy w próbie kontrolnej ng/ml±SEM (N=6) Uwolniony GH w surowicy ng/ml ±SEM (N=6)
1 2 3 4
DAJa^^eNal-Aih^-Trp- DPhe-NH2 0,30 216 ±27 340 ± 38
1,00 216 ±27 1205 ± 335
3,00 216 ±27 1703 ±182
10,00 216 ±27 2741± 484
DAla-DeNal-Aaa-Trp-DPhe- Ala-NH2 0,30 216 ±27 611± 68
1,00 216 ±27 929 ± 209
3,00 216 ±27 1765 ± 320
10,00 216 ± 27 2644 ±358
169 562 ciąg dalszy tabeli 3
i 2 3 4
Lys-DAla-DβNal-Ala-
Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 216 ± 27 216± 40
0,30 216 ± 27 269± 31
1,00 216 ± 27 432 ± 143
3,00 216 ±27 771±134
DAla-DβNal-Ala-Trp-
DPhe-NH-Chx-NH2 0,03 216 ±27 517± 135
0,10 216 ± 27 1078± 174
0,30 216 ±27 1831 ±436
1,00 216 ±27 3120 ±761
DAla-DβNal-Ala-Trp-
DAla-Lys-NH2 0,10 187 ±36 220± 34
0,30 187 ±36 167± 48
1,00 187 ±36 339± 61
3,00 187 ±36 778 ±174
10,00 187 ±36 1676 ±470
30,00 187 ±36 1791 ±384
DAla-DβNal-Ala-Trp-
DPhe-LysNHa 0,03 153 + 27 409 ± 97
0,10 153 ±27 1469± 152
0,30 153 ±27 2322 ± 265
1,00 153 ±27 2765 ± 352
DAlaTDβNa!-Ala-Trp-
DPhe-Ala-“NH(CH2)5NH2 0,03 177 ±45 542± 98
0,10 177 ±45 932± 84
0,30 177 ±45 1121 ±212
1,00 177 ±45 2599 ±144
NαIMA-DβNał-Ala-Trp-
DPhe-LysNH2 0,03 192 ±41 ±108
0,10 192 ±41 1049± 198
0,30 192 ±41 2567 ±419
1,00 192 ±41 2001 ±341
DAla-DβNal-Ala-TΓp~
DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 192 ±41 846 ±105
0,30 192 ±41 1886 ±493
1,00 192 ±41 2209± 187
3,00 192 ±41 3359 ±433
DAla-Tcc-Ala-Trp-DPhe-
Lys-NH2 0,30 93 ±22 149 ± 20
3,00 93 ± 22 142 ±35
DAla-Gly-Gly-Trp-DPhe-
Lys-NH2 0 30 u,ju 93 ± 22 107 ± 14
3,00 93 ±22 89 ± 15
169 562 ciąg dalszy tabeli 3
1 2 3 4
dai- r\Qxa~- r— jL>rtła-LZpiScH-rtia- i ip- DPhe-Lys-NH2 0,03 93 ± 22 230± 23
0,10 93 ±22 1006 ±204
0,30 93 ±22 2110± 260
1,00 93 ±22 1825 ±328
I,)A]a-DeNal-Ak--Trp- DTic-Lys-NH2 0,03 93 ±22 141 ±26
0,10 93 ±22 156 ±62
0,30 93 ±22 124 ±31
1,00 93 ±22 151 ±24
DAla^^eNal-Adi^-Trp- DPhe-Lys-OH 0,10 93 ±22 558 ±162
0,30 93 ±22 1730 ±306
DAla-DeNal-Ala-Tcc- DPhe-Lys-NH2 3,00 145 ± 17 537 ± 43
10,00 145 ±17 746 ± 92
DeNal-dy-Gly-Trp- DPhe-Lys-JNfe 3,00 145 ±17 417 ± 37
10,00 145 ±17 397 ±114
DAla-DeNal-Ala-Trp- DPal-Lys-NIfe 0,10 145 ± 17 365± 42
0,30 145 ±17 584± 148
DAla-DeNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-OH 0,10 145 ± 17 928 ±184
0,30 145 ±17 1782 ±241
3Me-His-DeNri-Ala-Trp- DPal-Lys-NH2 0,03 87 ±11 122 ± 11
0,10 87 ±11 185 ±27
0,30 87 ±11 101 ± 12
0,10 87+11 112 ± 13
3Me-His-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,03 87 ± 11 134 ±28
0,10 87 ± 11 159 ±30
0,30 87 ± 11 78 ± 19
1,00 87 ± 11 134 ±27
Tip-Ala-DeNal-A]a--Tri> DPhe-Lys-NH2 0,10 87 ± 11 168 ± 27
0,30 87 ± 11 167 ± 28
1,00 87 ± 11 152 ±74
3,00 87 ± 11 272 ± 63
169 562 ciąg dalszy tabeli 3
1 2 3 4
DAla-DeNal-AJa-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,3 247 ±53 870± 136
0,10 247 ± 53 1440 ±267
0,30 247 ± 53 2420 ±456
1,00 247 ± 53 2855 ± 347
3,00 247 ± 53 3421± 377
DAla-DTcc-Ala-TΓp- DPhe-Lys-NH2 0,10 247 ± 53 165 ± 26
0,30 247 ± 53 183 ± 9
1,00 247 ± 53 207 ± 38
3,00 247 ± 53 153 ±22
10,00 247 ± 53 269 ± 47
Ava-Trp-DTrp-Lys-NH2 0,10 247 ± 53 153 ±30
0,30 247 ±53 144 ± 14
1,00 247 ±53 117 ± 9
3,00 247 ±53 205 ± 59
10,00 247 ±53 214 ±48
DAla-LDeNal-Aa-Trp- DPal-Lys-NH2 0,03 228 ±48 203± 20
0,10 228 ± 48 772 ± 142
0,30 228 ± 48 979± 182
1,00 228 ± 48 1691±139
3,00 228 ± 48 3249 ± 526
Tyr-DAla-DeNai-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 228 ± 48 164± 52
0,10 228 ± 48 247± 51
0,30 228 ± 48 196± 39
1,00 228 ± 48 329± 57
3,00 228 ± 48 878 ±170
Ala-His-IDeNal-Aia-TrpDPhe-Lys-NH2 0,10 228 ± 48 894± 112
0,30 228 ± 48 1128 ±274
1,00 228 ± 48 1362± 198
DAla-DeNal-Aa--Trp- DPhe-Lys-OH 0,03 228 ± 48 300± 82
0,10 228 ± 48 585 ±141
0,30 228 ± 48 1202 ±236
1,00 228 ± 48 2610 ±355
DAla-DeNal-Aa-Trp- NMe-DPhe-Lys-NH2 0,03 167 ±29 123 ± 17
0,10 167 ±29 132 ±30
0,30 167 ±29 232 ± 49
1,00 167 ±29 233 ±41
169 562 ciąg dalszy tabeli 3
1 2 3 4
His-Trp-Ala-Trp-Phe- Lys-NH2 1,00 167 ±29 125 ± 24
3,00 167 ±29 201 ± 19
10,00 167 ±29 130 ±25
30,00 167 ±29 182 ±36
Ava-DAla-D3Nal-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 167 ±29 209 ± 33
0,10 167 ± 29 144 ± 42
0,30 167 ± 29 185 ± 47
1,00 167 ±29 499± 110
PAla-DeNal-Ała-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,03 167 ±29 489 ± 71
0,10 167 ±29 1112±194
0,30 167 ±29 1993 ±259
1,00 167 ± 29 3061 ±238
DAla-DpNal-Gly-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,10 / 121 ± 14 226 ± 26
0,30 121 ± 14 170± 31
1,00 121 ± 14 414 ±101
3,00 121 ± 14 713± 126
DAla-DPNal-Gly-Gly- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 121 ± 14 95 ±15
0,30 121 ± 14 82 ± 16
1,00 121 ±14 177 ±43
3,00 121 ± 14 223 ± 58
Asp-DAla-DpNal-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,03 121 ±14 210± 53
0,10 121 ±14 322 ± 48
0,30 121 ±14 557± 181
1,00 121 ± 14 821±173
DAla-DpNal-Ała-Trp- DPhe-NH-Chx-NH2 0,03 121 ± 14 335 ±106
0,10 121 ± 14 652± 129
0,30 121 ± 14 1528 ± 252
1,00 121 ± 14 2410 ±370
DAla-DpNal-DAla-Trp- DPhe-Lys-NH2 0,10 200 ±45 166 ± 36
0,30 200 ±45 197 ± 33
1,00 200 ±45 343 ± 73
3,00 200 ±45 531±121
DAla-DPNal-Ala-Ala- Trp-DPhe-Lys-NH2 0,10 200 ±45 147 ±21
0,30 200 ±45 184 ±45
1,00 200 ±45 206 ±66
3,00 200 ± 45 143 ± 9
169 562 ciąg dalszy tabeli 3
1 2 3 4
DAla-DβNa1-Ala-Tlrp- DPhe-NH-Chx-NH2 0,10 200 ± 45 1246 ±189
0,30 200 ±45 1616 ±250
1,00 200 ±45 2574 ± 467
3,00 200 ±45 2789± 130
DAla-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-“NH2 0,03 200 ±45 608 ±140
0,30 200 ±45 920 ±225
1,00 200 ±45 1755 ±291
3,00 200 ±45 2527± 196
DAla-DβNal-Ala-Trp- Pro-Lys-NH2 0,03 157 ±40 113 ± 14
1,00 157 ±40 136 ±40
3,00 157 ± 40 195 ± 35
10,00 157 ±40 226 ± 42
DAla-DβNal-Ala-Trp- DPro-Lys-NH2 0,30 157 ±40 234 ± 36
1,00 157± 40 358 ± 48
3,00 157 ±40 576 ± 77
10,00 157 ± 40 1624 ±241
DAla-DβNal-Ala-Trp- DLeu-Lys-NH2 0,30 157 ± 40 202 ± 27
1,00 157 ±40 165 ± 12
3,00 157 ±40 307± 51
10,00 157 ± 40 1591 ±568
Ava-DβNal-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH? 0,03 157 ± 40 768 ±191
0,10 157 ±40 1277± 61
0,30 157 ±40 1733 ±254
1,00 157 ±40 2418 ±162
Tabela 4
Uwalnianie GH m vivo pobudzane przez syntetyczne peptydy uwalniające hormon wzrostu u szczurów znieczulonych pentobarbitalem (Zwierzęta uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A Peptyd uwalniający GH Całkowita dawka (pg/iv) GH w surowicy w próbie kontrolnej ng/ml ±SEM (N=6) Uwolniony GH w surowicy ng/ml ±SE'M (N=6)
1 2 3 4
DAla-DβNal-Ala-2rp-DPhe- iLysNH2 0,03 186 ±34 412± 84
0,10 186 ±34 630± 124
0,30 186 ±34 1877 ±195
1,00 186 ±34 3008 ±417
169 562 ciąg dalszy tabeli 4
1 2 3 4
DAla-DβNal-Ala-homo-Ph-- DPhe-LysNH2 0,03 93 ±13 214 ± 71
0,10 93 ±13 214 ± 58
0,30 93 ± 13 406± 121
1,00 93 ± 13 1189± 120
DAlaIDβNaIAkrΊr-p-DPhcI Ala-1,3-dwu-aminopropan 0,03 93 ±13 444± 60
0,10 93 ±13 517± 109
0,30 93 ±13 2341 ±479
1,00 93 ±13 2468 ± 276
DAla-DPNal-Ala-Trp-DPhe- Lys-NH2 0,03 93 ±13 362± 64
0,10 93 ±13 800 ± 192
0,30 93 ±13 2674 ±486
1,00 93 ± 13 3658 ±610
DAla-DPNal-Ala-Trp-DPheAla-heki^ć^i^i^ilwuamina-1,6 0,03 85 ±16 395± 91
0,10 85 ±16 905± 113
0,30 85 ±16 735± 166
1,00 85 ±16 2708 ±310
ΪMAIDβ^laIAl;I-Trp-DPlleAla-1,3-dwuaminopropan 0,03 85 ±16 566± 157
0,10 85 ± 16 645 ±167
0,30 85 ±16 1428 ±271
1,00 85 ±16 2972 ± 365
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe- ArgNH2 0,03 125 ± 12 252 ± 29
0,10 125 ± 12 645 ± 90
0,30 125 ± 12 1180 ±318
1,00 125 ± 12 2197 ±285
Arg-DAla-DeNal-Ała-Tri> DPhe-ArgNH2 0,10 125 ± 12 155 ±43
0,30 125 ± 12 247 ±70
1,00 125 ± 12 276 ± 16
IMA-DpNaPAla-Trp-DPhe-AlaheksanodwuaminaI 1,6 0,03 125 ± 12 332 ± 59
0,10 125 ± 12 609 ± 165
0,30 125 ±12 1139 ±232
1,00 125 ± 12 1996 ±372
DAla-DPNal-Ala-Trp-LysNH2 0,30 160 ±33 187 ±44
1,00 160 ±33 257 ± 18
3,00 160 ±33 198 ±31
10,00 160 ±33 193 ±33
30,00 160 ±33 236 ± 23
169 562 ciąg dalszy tabeli 4
i 2 3 4
DAla-DeNal-Ala-TrpNH2 0.30 160 ±33 115 ± 22
1,00 160 ±33 107 ±23
3,00 i 60 ± 33 101 ±13
10,00 160 ±33 199 ±40
30,00 160 ± 33 232 ± 69
DAla-DeNal-Ala-Trp-DPhe- Ala-NH(CH2)5NH2 0,03 160 ±33 517± 89
0,i0 160 ±33 1164 ±255
0,30 160 ±33 2023 ± 242
i,00 i 60 ±33 3441 ±435
DAla-DeNal-AJa-Trp-Pro- LysNH2 0,30 157 ±40 113 ± 14
i,00 157 ±40 136 ±40
3,00 157 ±40 195 ±35
i0,00 157 ±40 226 ± 42
DAla-IDiNal-Ala-Trp-DPro- LysNH2 0,30 157 ±40 234 ± 36
i,00 157 ±40 353 ± 48
3,00 157 ±40 576 ± 77
10,00 157 ±40 1624 ±241
DAla-DeNal-Ala-Trp-DLeu- LysNH2 0,30 157 ± 40 202 ± 27
i,00 157 ± 40 165 ± 12
3,00 157 ±40 307 ± 51
10,00 157 ±40 1591 ±568
Ava-DeNal-Ala-Trp-DPhe- LysNH2 0,03 157 ±40 768± 191
0,10 157 ±40 1277 ± 61
0,30 157 ±40 1733 ± 254
i,00 157 ±40 2418± 162
α, yABU-DeNal-Ala-Trp-DPheLysNH2 0,03 108 ± 20 621± 85
0,10 108 ±20 1230 ±317
0,30 108 ± 20 2385 ±182
i,00 108 ± 20 3011 ±380
DAJa-DeNal-Ala-Trp-DPhe- HisNH2 0,03 108 ±20 246± 22
0,10 108 ± 20 199 ± 34
0,30 108 ± 20 370± 67
i,00 108 ± 20 1419 ±230
DAla-DeNal-Ala-Phe-DPhe- LysNH2 0,03 108 ± 20 366 ± 81
0,10 108 ± 20 1011 ±175
0,30 108 ±20 2361 ±233
i,00 108 ± 20 3057 ± 472
169 562 ciąg dalszy tabeli 4
1 2 3 4
DAla-DPNal-A!a-Trp-NH-Chx- NH2 0,10 108 ± 20 151 ±35
0,30 108 ± 20 251 ± 43
1,00 108 ± 20 227 ± 55
3,00 108 ± 20 349 ± 72
DAla-DpNal-Ala-Trp-DPhe- OrnNH2 0,03 200 ±33 515± 92
0,10 200 ±33 787 ± 71
0,30 200 ±33 1288 ±365
1,00 200 ±33 1888 ±615
DAla-DeNal-Ala-Trp-DHis- LysNH2 0,03 200 ±33 287± 48
0,10 200 ±33 131± 37
0,30 200 ±33 337± 78
100 200 ±33 457 ± 124
Tabele 3 i 4 ukazują, że związki objęte niniejszym wzorem pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi w znacznie większym stopniu niż związki nie objęte wzorem.
Próba 4. Uwalnianie GH in vivo u człowieka
Normalnym pacjentom, mężczyznom o średnim wieku około 25 lat, podano doustnie peptyd Ala-lisTDeNal-Ak-Trp-DPhe-Lys-NIT (GHRP-1) lub peptyd DAla-DβNal-Ala-TrpDPhe-Lys-NH (GHRP-2). Czterdziestu pacjentom podano 300 μg GHRP-1/kg w 20 ml H2O i następnie 100 ml samej H2O, 39 pacjentom podano 600 μg GHRP- 1/kg w 20 ml H2O i następnie 100 ml H2O, a 11 pacjentom podano 100 μg GHRP-2/kg w 20 ml H2O i następnie 100 ml H2O. Krew pobierano okresowo jak wskazano na figurze 1 i poddawano analizie radioimmunologicznej dla określenia poziomu hormonu wzrostu według procedury opisanej w Próbie 1. Wyniki przedstawiono na figurze 1. Po doustnym podaniu 100 μg GHRP-2/kg uzyskano wyższy poziom hormonu wzrostu niż po doustnym podaniu 300 μg GHRP-1/kg.
Próba 5. Uwalnianie GH in vivo u szczura
Powtórzono ogólną procedurę z Próby 1, lecz peptydy wstrzyknięto podskórnie a me dożylnie, zaś zwierzęta uśmiercono po 15 minutach, a nie po 10 minutach. Podawane związki, stosowane dawki i wyniki podano w tabeli 5.
Tabela 5
Kolumna A Peptyd uwalniający GH Całkowita dawka (pg/sc) GH w surowicy w próbie kontrolnej ng/ml ±SEM (N=6) Uwolniony GH w surowicy ng/ml ±SEM (N=6)
1 2 3 4
IMA-DeNal-Ala-Phe-DPhe- 0,03 147 ± 21 181± 36
Lys-NH2 0,10 147 ±21 399 ± 40
0,30 147 ±21 8O8± 187
1,00 147 ±21 2394 ± 475
α, y.ABU-DeNal-AH-Phe-DIhieLys-NH2 0,03 147 ±21 192 ± 29
0,10 147 ±21 288± 62
0,30 147 ±21 461 ± 90
1,00 147 ± 21 1441± 203
169 562 ciąg dalszy tabeli 5
i •2 3 4
IMA-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Alapentanodwuamina-1,5 0,03 147 ±21 475 ± 96
0,10 147 ± 21 916± 169
0,30 147 ±21 1118 ±243
1,00 147 ±21 2660 ±599
Hls-DβNal-Ala-Phe-DPhe-Lys- NH2 0,03 217 ± 33 317 ± 55
0,10 217 ±33 348 ± 65
0,30 217 ±33 1283 ±258
1,00 217 ± 33 1374 ±107
Ala-His-DβNal-Ala-Pht-E>Phe- Lys-NH2 0,03 217 ±33 341± 35
0,10 217 ±33 516±118
0,30 217 ±33 1060 ±151
1,00 217 ± 33 1467 ±208
γABU-DβNal-A]a-Phe-DPhe- Lys-NH2 0,03 217 ±33 197± 31
0,10 217 ±33 182 ± 20
0,30 217 ±33 524± 116
1,00 217 ±33 1127 ±110
DAla-DβNal-Ala-Phe-DPhe- Lys-NH2 0,03 217 ±33 287± 62
0,10 217 ±33 1084± 162
0,30 217 ±33 1982 ±345
1,00 217 ±33 2887 ± 275
DAla-Pht-Ala-Phe-DPht-Lys- NH2 0,03 132 ± 18 167 ± 29
0,10 132 ± 18 499 ± 62
0,30 132 ± 18 1132 ±145
1,00 132 ±18 2147 ±268
DAla-DβNal-Ala-Pht-DPhe- Lys-NH2 0,03 132 ± 18 356± 77
0,10 132 ± 18 795± 132
0,30 132 ± 18 1564 ±224
1,00 132 ± 18 2272 ±406
Wynalazek bliżej zilustrowano następującymi, nie ograniczającymi go przykładami. Przykład I. Synteza peptydów uwalniających hormon wzrostu.
Chlorowodorek żywicy p-metylobenzhydryloaminowej (pMe-BHA.HCl) umieszczono w naczyniu reakcyjnym dostępnego w handlu zautomatyzowanego urządzenia do syntezy peptydów. Żywicę podstawiono wolną aminą do uzyskania obciążenia 5 mmoli/g. Związki wytwarzano drogą sprzęgania poszczególnych aminokwasów, zaczynając od końca karboksylowego sekwencji peptydów, z użyciem odpowiedniego środka aktywującego, takiego jak N,N“-dwucykloheksylok.arbodwuimid (DDC). Grupy a-aminowe poszczególnych aminokwasów zabezpieczano jako np. pochodne t-butoksykarbonylowe (t-Boc), a reaktywne grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych zabezpieczano jako to podano w tabeli 6.
169 562
Tabela 6
Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne odpowiednie do stosowania w syntezie peptydów w fazie stałej
Arginina Ng--osyl
Kwas asparaginowy O-benzyl
Cysteina S-f^^-^m^tt/ylolbenzyl
Kwas glutaminowy: O-benzyl
Histydyna. Nim--oksyl
Lizyna. Ne-2,4-dwuchlorobenzyloksykarbonyl
Metionina S-sulfotlcnek
Seryna O-benzyl
Treonina· O-benzyl
Tryptofan Nm-dormyl
Tyrozyna O-2,6-dwuchlorobenzyl
Przed wprowadzeniem początkowego aminokwasu żywicę trzykrotnie mieszano (każdorazowo przez 1 minutę) z dwuchlorometanem (CH2Cl2, około 10 ml/mg żywicy), zobojętniono ją przez trzykrotne mieszanie (każdorazowo około 2 minuty) z N,N-dwuizopropyloetyloaminą (DIEA) w dwuchlorom^etanie (10 : 90, około 10 ml/h żywicy) i trzykrotnie mieszano (każdorazowo przez 1 minutę) z dwuchlorometanem (około 10 ml/mg żywicy). Początkowy 1 każde następne aminokwasy sprzęgano z żywicą z użyciem wstępnie wytworzonego symetrycznego bezwodnika, stosując około sześciokrotną ilość odpowiednio zabezpieczonego aminokwasu i około dwukrotną ilość DIC w przeliczeniu na całkowitą siłę wiążącą żywicy w odpowiedniej ilości dwuchlorometanu. W przypadku aminokwasów o słabej rozpuszczalności w dwuchlorometanie, dla uzyskania jednorodnego roztworu, dodawano N,N-dwuπletyloformamld (DMF). Na ogół symetryczny bezwodnik wytwarza się na do 30 minut przed wprowadzeniem do naczynia reakcyjnego w temperaturze pokojowej lub niższej. Dwucykloheksylomocznik powstały przy wytwarzaniu symetrycznego bezwodnika usuwano przez filtrowanie grawitacyjne roztworu do naczynia reakcyjnego. Postęp sprzęgania aminokwasu do żywicy na ogół śledzono z użyciem testu barwnego, stosując taki odczynnik jak ninhydryna (która reaguje z I- i Πrzędowymi aminami). Po pełnym sprzęgnięciu zabezpieczonego aminokwasu z żywicą (> 99%) grupę zabezpieczającą grupę α-aminową usuwano działaniem reagenta(ów) kwasowego(ych). Powszechnie stosowanym reagentem jest roztwór kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dwuchlorometanie (33 : 66).
Po zakończeniu żądanej sekwencji aminokwasów żądany peptyd można odszczepić z nośnika żywicznego działaniem takiego reagentajak fluorowodór (HF), który nie tylko odsz.czepia peptyd od żywicy, ale także odszczepia większość powszechnie stosowanych grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Gdy stosuje się żywicę BHA lub p-Me-BHA, to w wyniku działania HF otrzymuje się bezpośrednio wolne peptydy amidowe. Gdy stosuje się aminokwaszywicę Merrifielda, wolne peptydy alkiloamidowe odszczepia się działaniem odpowiedniej aminy (w tym przypadku użycie Boc-N£-FMOC-Lys- pozwoliłoby równocześnie usunąć grupę FMOC).
Pełną procedurę wprowadzania poszczególnych aminokwasów na żywicę przedstawiono w tabeli 7.
169 562
Tabela Ί
Procedura wprowadzania poszczególnych aminokwasów na żywicę
Reagent Mieszanina Czas mieszania
1 Dwuchlorometan 3 1 min.
2 TFA - 0Huchlonom2tag (33 : 66) 1 2 min
3. TFA - 0Huchlorom2tan (33 : 66) 1 20 min
4. Dwuchlonom2tag 3 1 min
5 DIEA,DMF (10 90) 3 2 min.
6. Dwuchlorometan 3 1 min
7 Boc - aminokwas/DIC i 15-120 min *
8. Dwuchlonom2rag 10. Śledzenie postępu reakcji sprzęgania** 1 i Powtórzenie etapów 1-12 dla poszczególnych aminokwasów 3 i min.
* Czas sprzęgania zależy od danego aminokwasu.
** Stopień sprzęgania można ogólnie śledzić przy użyciu testu barwnego. Gdy sprzężenie nie jest pełne, ten sam aminokwas można poddać ponownemu sprzęganiu inną metodą, np z użyciem aktywnego estru HoBt. Gdy sprzężenie jest pełne, można sprzęgać następny aminokwas.
Stosując tę procedurę wytworzono związki opisane w tabelach 1, 2, 3 i 4.
Przykład II. Reakcja kondensacji fragmentów peptydowych z wytworzeniem peptydu.
Procedury ogólne
Wartości temperatury topnienia można wyznaczyć· z użyciem kapilarnego urządzenia do pomiaru temperatury topnienia Thomas Hoover. Widma w podczerwieni (IR) można rejestrować w spektrofotometrze Perkin-Elmer Model 137 lub Nicolet Model 5DX i podawać jako liczby falowe (cm“). Widma masowe (MS) można otrzymać z użyciem spektrometru masowego VG Analytical Ltd. Model ZAB-1F w trabie EI (uderzenia elektronowego), FD (jonizacji polem) lub FAB (szybkiego bombardowania elektronami). GCMS można otrzymać z użyciem Finnigan 4023 GCMS wyposażonego w kolumnę kapilarną 30 m DB5 (J and W Scientific), stosując gazowy hel jako nośnik. Skręcalność optyczną można mierzyć polarymetrem Autopol HI produkcji Rudolph Research.
Widma 1 H NMR można otrzymać z użyciem urządzenia JEOL GX-400 NMR, pracującym przy 400 MHz lub JEOL GX-270, pracującym przy 270 MHz. Te urządzenia mają cyfrową zdolność rozdzielczą poniżej 0,7 Hz. Przesunięcia chemiczne są wyrażone w częściach na milion względem wzorca wewnętrznego, 3-“ttójmetylosiiilo)czterodwureropropionianu sodowego (TSP).
Wysokosprawną chromatorafię cieczową (HPLC) można realizować z użyciem układu Hitachi złożonego z kontrolera gradientu L-5000 i pompy 655A, przyłączonych do półprepaaatywnej kolumny Vydac 201TP1010 lub 218TP1010. Jako rozpuszczalnik eluujący można zastosować połączenia wody zawierającej 0,2% kwasu trójfluorooctowego i metanolu. Na ogół związki, o które chodzi, będą ulegały elucji przy prędkości przepływu 6 ml/minutę i gradiencie składnika organicznego rosnącym z prędkością około 1 - 2%/minutę. Związki wykrywa się następnie przy odpowiednich długościach fali z użyciem detektora UV z diodą LKB 2140. Całkowanie można następnie przeprowadzić z użyciem programu Nelson Analytical (Version 3, 6).
O ile nie podano inaczej, reakcje prowadzono w obojętnej atmosferze azotu lub argonu. Bezwodny tetrahydrofuran (THF. gatunku UV) i dwumetyloformamid (DMF) można nabyć w Burdick and Jackson i używać bezpośrednio z butli.
A. Wytw^nnefragmenag mentuptydowego -H2N-Trp-DPhe-Lys-(Boc)-N'H2, amidu loksykarbonylo-(N'-r-butoksyk;α'bonylo)lizcgy (związek nr 4)
Do roztworu karbogclodwuimiOazolu (CDI, związek nr 2, 88,24 g, 0,544 mola) o temperaturze 10°C i bezwodnego retrahydroeuragu (THF, 1500 ml) dodano powoli mC-benzy]oksykarbonylo-(mε-“-Bbtekkykaabonylo)lizygc (związek nr 1), 180 g, 0,474 mola). Podczas dodawania obserwowano wydzielanie się gazu. Podczas powstawania związku pośredniego,
169 562 imidazohdu Nα-benzyloksykardonyJo-(Nβ--tbbto0ssksrbdnyloC1izyny, (związek nr 3), sporządzano nasycony roztwór amoniaku i THF (2000 ml) (bezwodny gazowy NH3 przepuszczano przez THF w temperaturze 5 - 10°C). Pęuznaniu, że powstawanie związku pośredniego (związek nr 3) dobiegło końca (gdy ustało wydzielanie się gazu, około 2 godziny) do roztworu amoniaku dodano połowę roztworu THF zawierającego związek nr 3. Resztę roztworu zawierającego związek nr 3 dodano w 30 minut później. Podczas dodawania i przez następnych 45 minut utrzymywano stały przepływ gazowego amoniaku. Po dodaniu dwóch roztworów zawierających związek nr 3 wytrąca się biały osad. Pozwolono na ogrzanie się mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej i mieszano ją przez 15 godzin. Rozpuszczalnik usuwano z zawiesiny pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozprowadzono w wodzie, a powstałą substancję stałą odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Amid N E-ttbbtoosskaabdnylohzyny (związek nr 5).
Roztwór amidu lizyny (związek nr 4) (181,48 g, 0,479 mola) w metanolu (MeOH, 1000 ml) dodano w atmosferze argonu do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (5 g) w metanolu (250 ml). Przez mieszaninę reakcyjną przepuszczano pęcherzykami wodór (około 15 minut), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano w atmosferze wodoru do chwili, gdy analiza HPLC wykaże, że reakcja zaszła do końca (36 godzin). Atmosferę wodoru zastąpiono wówczas atmosferą argonu. Roztwór reakcyjny klarowano przesączywszy go przez warstwę CelituR i po usunięciu rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano substancję stałą.
Amid Nα-benzklokskaabdonylo-D-fenkloaJanyio-(NE---bbtokssksabonylo)llZknk (związek nr 8).
Nα-Benzyloksykarbonyio-D-fenyloalanmę (związek nr 6, 126,39 g, 0,432 mola) dodawano powoli do roztworu CDI (związek nr 2, 66,03 g, 0,409 mola) w THF (500 ml) o temperaturze 10°C. Podczas dodawania obserwowano wydzielanie się gazu. Gdy wydzielanie się gazu ustało, dodano roztwór amidu lizyny (związek nr 5) (110,75 g, 0,452 mola) w THF (500 ml). Po około 48 godzinach mieszaninę sączono w celu usunięcia substancji stałych. Przesącz zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem.
Powstałą substancję stałą rozprowadzono w octanie etylu (EtOAc, 500 ml) i przemywano jak następuje we wkraplaczu:
1. Wodnym roztworem HCl (1n, 3 x 500 ml), pH cieczy 1 z przemywania około 8, pH następnej cieczy z przemywania 1. '
2. Wodą (500 ml).
3. Wodnym roztworem Na2CO3 (1/2 nasycony, 2 x 500 ml) sączenie dla zebrania powstałych krkstałicznkch substancji stałych (8).
4. Wodą (3 x 500 ml).
Warstwę organiczną suszono nad MgSCU. Po sklarowaniu rozpuszczalnik usuwano pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość można poddać rekrystalizacji z gorącego EtOAc i otrzymać drugą próbkę związku nr 8.
Amid D-fenylcalanyio-(NE-ttbbtokssksa·bonylo)lizyny (związek nr 9).
Metanolowy roztwór (1500 ml) amidu (związek nr 8, 120, 53 g, 0,229 mola) dodano do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (50 g) w MeOH (200 ml). Atmosferę argonu zastąpiono atmosferą wodom. Gdy analiza HPLC wykazała, że reakcja zaszła do końca (około 4 godzin) atmosferę wodom zastąpioo atmosferą argonu. Roztwór reakcyjny klarowano przez warstwę CelituR, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem do pozostałości. Ten produkt dwupeptydowy można zastosować bezpośrednio do wytwarzania trójpeptydu (związku nr 12).
Amid N“-tany taksy karbonyta-ttyptoί'ita-Db'enytaalankta-(NE--tbdtoCsyksabbny/1 izyny (związek nr 12).
W temperaturze 10oC roztwór Nα-ben27lloksykarbonylo-tryptofanu (związek nr 10, 67,60 g, 0,200 mola), THF (500 ml) i CDI (2, 33,05 g, 0,204 mola) mieszano do ustania wydzielania się gazu. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór związku nr 9 (40,8 g, 0,103 mola) w THF (około 200 ml). Powstały roztwór poddano reakcji przez 15 godzin, ogrzewając go do temperatury pokojowej. Powstałe substancje stałe odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem. Z przesączu otrzymano pozostałość przez zatężenie pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość i substancję stałą połączono ponownie 1 roztworzono w EtOAc (4000 ml), stosując
169 562 lekkie ogrzewanie. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej tworzy się substancja stała. Tę substancję stałą odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem. Substancję stałą poddano rełkr-^.st^i^H^^i^a^.ji z gorącego MeOH i otrzymano oczyszczony trójpeptyd (związek nr 12). Przesącz EtOAc (z pierwszej ρΗη'ν'ΕΐηΗζη'Εί) przemyto jak następuje we wkraplaczu:
1. Wodnym roztworem HCl (1n, 2 x 500 ml).
2. Wodą (1 x 500 ml).
3. Wodnym roztworem Na2CC3 (1/2 nasycony, 2 x 50 ml).
4. Wodnym roztworem NaCl (1 x 500 ml).
Warstwę organiczną suszono nad MgSO.·, i klarowano przez sączenie pod zmniejszonym ciśnieniem. Rozpuszczalnik usunięto z przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość ponownie roztwarzano w EtOAc i otrzymano suchą substancję stałą. Tę substancję stałą można poddać rekrystanzacji z gorącego MeOH i otrzymać drugi rzut związku nr 12, w postaci białej substancji stałej.
Aπ^kłtτyptot'ilo-D-fenyloalanylo-(Nt'--tbbloksyk.aabonylo))lzyny (związek nr 13).
Metanolowy roztwór (1500 ml) trójpeptydu (związek nr 12) (64,59 g, 0,091 mola) dodano do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (5 g) w metanolu (250 ml) w atmosferze argonu. Dodano ponadto MeOH (2250 ml). Atmosferę argonu zastąpiono atmosferą wodoru i pozwolono na przebieg reakcji (około 24 godzin). Po zakończeniu reakcji atmosferę wodoru zastąpiono atmosferą argonu. Roztwór klarowano przez warstwę CelituR, a przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano trójpeptyd (związek nr 13), w postaci białej substancji stałej.
B. Wytwarzanir frai^mran^i trójper>tydowego- K-D-K-a-Dp.Nal-Ala-OMe. estru νησί! lowego Nα-benzyloksykarboaylo-D-alanylo-D-β-naftyroalaainy (związek nr 25).
Roztwór EtOAc (400 ml) i chlorowodorku estru metylowego D-e-naftyloalamny (22,0,62 mola) przemyto nasyconym roztworem węglanu sodowego (400 ml) i 10,8n wodnym roztworem wodorotlenku sodowego (około 500 ml). Powstałą fazę wodną usunięto (pH 8,5), a fazę organiczną przemyto kolejno półnasyconym wodnym roztworem Na2CO3 (150 ml), a potem wodą (50 ml). Po zatężeniu pod zmniejszony ciśnieniem warstwy w octanie etylu wyodrębniono związek nr 22 w postaci wolnej zasady.
W temperaturze -5°C (łaźnia lodowo-etanolowa) do roztworu NαDb^mz.yloksykarbonykD D-alaniny (związek nr 19, 143,5 g, 0,50 mola), N-hydroksysukcynimidy (HONSu, związek nr 23,0,62 mola) i świeżo wytworzonego związku nr 22 w postaci wolnej zasady (około 0,52 mola) w DMF (około 3 litrów) dodano dwycykloheksylokkrbodwuimidy (DDC, około 95 g, 0,46 mola). Powstały roztwór reakcyjny mieszano przez 24 godziny ogrzewając go do temperatury pokojowej. Należy stosować analizę HPLC, by stwierdzić, czy reakcja zaszła do końca. Jeśli nie, roztwór reakcyjny chłodzono do temperatury około -5UC i dodano jeszcze dwucykloheksylokarbodwpimidy (około 0,17 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano następnie jeszcze przez 24 godziny, ogrzewając ją do temperatury pokojowej. Następnie mieszaninę sączono dla usunięcia dwucykloheksylomoczaika (DCU). Do przesączu dodano wody (1 litr) i powstały roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość roztwarza się w 1n wodnym roztworze HCl (około 1 litra, do chwili, gdy pH wodnej fazy osiągnie 1). Warstwę wodną ekstrahowano dwiema porcjami octanu etylu (po 1 litrze każda). Warstwy w octanie etylu odrzucono. Wartość pH fazy wodnej regulowano następnie przez dodanie zimnego 2n wodorotlenku sodowego (500 ml) i pastylek wodorotlenku sodowego. Podczas zobojętniania roztwór utrzymywano w chłodzie przez dodawanie zimnego octanu etylu (1 litr). Gdy pH fazy wodnej osiągnie około 7, zwykle wydzielają się obficie biała substancja stała lub olej. Tę wytrąconą substancję zbierano przez odsączenie pod zmniejszonym ciśnieniem lub dekantację i przemywano kolejno półna^syconym wodnym roztworem węglanu sodowego (2 x 1500 ml), wodą (6 x 1500 ml) i octanem etylu (3 x 1500 ml). Otrzymany materiał suszono pod wysoką próżnią do stałej wagi. Ten materiał można poddać bezpośredniej hydrolizie bez dalszego oczyszczania.
Nα-Benzyloksykarbonylo-D-alanylo-β-naftylo-D-aianiaa, (związek nr 26).
Wodny roztwór wodorotlenku sodowego (192 ml, 0,08 g/ml roztworu, 0,38 mola) dodano do roztworu dwyprptydy (związek nr 25, około 0,38 mola), wody (360 ml) i MeOH (około 6 litrów). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej do zakończenia hydrolizy (około 24 godziny).
169 562
Zanik wyjściowego peptydu potwierdza analiza HPLC. Roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszczono w wodzie (około 1 litra). Warstwę wodną (pH około 10) ekstrahowano następnie EtOAc (2 x 500 ml) we wkraplaczu. Warstwy w octanie etylu odrzucono. Powstałą fazę wodną doprowadzono do pH około 5 za pomocą stężonego HCl, a wówczas z reguły wytrącaj ą się biała substancja stała lub olej. Produkt zbierano i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Ester metylowy Nα-benzyloksykarbonylo-D-alanylo-D-β-naktyloalanylo-alaniny (związek nr 20).
Dwupeptyd Nα-benzyloksykkrbonylo-Ddalknylo-D-β-naftyloalanlnę (związek nr 26, 0,253 mola) dodano do roztworu HONSu (23, 0,505 mola) w DMF (800 ml) w atmosferze argonu. Do tego roztworu dodano mieszaninę chlorowodorku estru metylowego alaniany (związek nr 15, 0,303 mola), N-metylomorfolίny (16, 0,303 mola) i DMF (200 ml) Powstały roztwór chłodzono do temperatury 10°C i w tym czasie dodano dwucykloheksyłokarbodwuimidu (związek nr 24, 0,265 mola) w chlorku metylenu (273 ml). Przebieg reakcji śledzono metodą HPLC i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze 10°C do zakończenia reakcji. Gdy po kilku dniach (około 4) reakcja nie dobiegła końca, dodano jeszcze 24 (0,080 mola) i mieszaninę reakcyjną mieszano jeszcze przez 1 dzień w temperaturze 10°C. Przebieg reakcji śledzono znowu metodą HPLC do zakończenia reakcji (na ogół około 5 dni). Wytrącone w trakcie reakcji substancje stałe odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymano pozostałość. Tę pozostałość roztworzono w octanie etylu i ekstrahowano półnasyconym wodnym roztworem Na2CO3 (2 x 500 ml). Fazę w octanie etylu suszono nad MgSO4. Powstały roztwór klarowano i zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem do pozostałości.
Do roztworu metanolu (500 ml) i wody (200 ml) zawierającego Na-benzyloksykarbony]o-D-Ala-Dβ-NalΛła-OMe (13,7 mmola) dodano 2n wodny roztwór wodorotlenku sodowego (7,5 ml, 15 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym drogą analizy HPLC stwierdzono, ile materiału wyjściowego pozostało. Gdy reakcja zaszła zasadniczo do końca (w przybliżeniu w ciągu nocy), powstały roztwór zatężano pod zmniejszonym ciśnieniem do objętości około 200 ml. Dodano wodę (100 ml) i pH doprowadzono do około 12 przez dodanie 2n wodorotlenku sodowego (1 ml). Powstały roztwór ekstrahowano octanem etylu (2 x 500 ml). Warstwy w octanie etylu odrzucono. Wartość pH fazy wodnej doprowadzono do około 5 przez dodanie wodnego roztworu HCl, co zwykle prowadzi do wytrącenia produktu. Ważne jest to, by objętość fazy wodnej zmniejszyć do minimum, dla ułatwienia tego wytrącenia. Warstwę wodną dekantowano znad produktu i produkt przepłukano wodą (2 x 50 ml). Wyodrębniony produkt suszono do stałej wagi pod próżnią.
C. Reakcja kondensacji fragmentów peptydowych z wytworzeniem sześciopeptydu.
Dwapeptydy, D-Ala-De-Nal-Ala-oH (związek nr 33,2,6 mmola) i Trp-D-Phe-Lys(Boc)NH2 (związek nr 13,2,8 mmola) rozpuszczono w bezwodnym DMF i powstały roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. To wstępne zatężenie prowadzi się jako próbę usunięcia wszelkich obecnych śladów metanolu. Powstałą mieszaninę peptydów rozpuszczono ponownie w DMF i dodano N-hydroksysukcynimidu (5,1 mmola). Powstały roztwór chłodzono do temperatury -2°C i do roztworu dodano następnie dwucykloheksylokarbodwuimidu (3,4 mmola) jako roztwór w chlorku metylenu (3,5 ml). Powstałą mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze -2°C przez 3 dni. W celu stwierdzenia, czy reakcja zaszła do końca stosowano analizę HPLC. Jeśli po tym okresie czasu reakcja jeszcze nie zaszła, można dodać jeszcze dwucykloheksylokarbodwuimidu i powstałą mieszaninę reakcyjną mieszać jeszcze przez dzień w temperaturze -2°C. Jeśli następnego dnia (ogółem po 4 dniach) analiza HPLC ponownie wskaże, że reakcja nie zaszła do końca, chłodzenie mieszaniny reakcyjnej należy przerwać. Można pozwolić, by temperatura roztworu wzrosła powoli do temperatury pokojowej (25°C) w ciągu kilku godzin (około 8). Powstałą mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Procedurę powtarzano do zakończenia reakcji. Następnie dodano wody (50 ml) i powstałą mieszaninę mieszano przez jeszcze 1 dzień. Roztwór reakcyjny przesączono następnie dla uscnlęcla,dwucykloheksylomocznikk i powstały przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do postaci lepkiego oleju. Do pozostałości dodano octanu etylu i półnasyconego wodnego
169 562 roztworu węglanu sodowego (200 ml). Dwufazową mieszaninę mieszano intensywnie w wyparce obrotowej przez około 1 godzinę. Wszelkie wytrącone substancje stałe odsączono przez sączek ze s^kla spiekanego i otrzymano produkt. Warstwę organiczną przemyto wodą, a potem suszono do stałej wagi pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując produkt. D-Ala-DP-Nal-AlaTrp-D-Phe-Lys-NH2, związek nr 35.
Sześciopeptyd. benz.yloksykarbonylo-D-Ala-DP-Nal -Ala-Trp-D-Phe-Lys-(B ocj-NTb (związek nr 34, 1,102 mmola) dodano w temperaturze pokojowej do roztworu kwasu trójfluorooctowego (30 ml), dwumetylosulfotlenku (14 ml), etanodwutiolu 1,2 (7 ml) i anizolu (2,2 ml) w chlorku metylenu (15 ml). Jednorodną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Po tym okresie czasu dodano bezwodnego eteru (450 ml), aby wytrącić biologicznie czynny surowy produkt peptydowy (związek nr 35). Ten produkt wyodrębniono przez odsączenie na sączku ze szkła spiekanego lub przez dekantację. Otrzymany produkt rozpuszczono w wodzie i liofb^iz^^c^w^^^^no. Zliofilizowany produkt można dalej oczyszczać drogą chromatografii średnicciśnienlowtj w kolumnie szklanej 26 x 460 mm, zawierającej materiał do kolumn LichroprepTM RP-18 (C-18, 25 - 40 nm, nieregularne ziarno). Po wstrzyknięciu peptydu w roztworze w wodzie kolumnę -Iuowi^ z prędkością przepływu 9 ml/minutę płytkim gradientem 0-25% metanolu przez 5 20 godzin, a potem gradientem 25 - 55% metanolu przez około 48 godzin. Stężenie metanolu w gradiencie podnoszono następnie z prędkością 2%/godzinę. Podczas elucji resztę kompozycji rozpuszczalnikowej uzupełniano wodą zawierającą 0,2% kwasu trójfluorcoctcwegc. Produkt (związek nr 35) identyfikowano za pomocą HPLC i wyodrębniono przez zatężenie odpowiedniej objętości eluatu.
Wynalazek opisano szczegółowo w odniesieniu do korzystnych jego postaci. Trzeba jednak wziąć pod uwagę, że fachowcy po zapoznaniu się z niniejszym ujawnieniem mogą dokonać zmian i modyfikacji zgodnych z duchem i zakresem wynalazku.
169 562
169 562
Poziom GH u normalnych młodszych mężczyzn po doustnym podaniu GHRP-1 lub GHRP-2
GH /«g / ± SEM
3OO^g /kg GHRP-I
Czas /minuty/
FIG. 4-1
169 562
Poziom GH u normalnych młodszych mężczyzn po doustnym podaniu GHRP-1 lub GHRP-2
GH //*g / ± SEM
Czas /minuty/'
FIG.1-2
169 562
Poziom GH u normalnych młodszych mężczyzn po doustnym podaniu GHRP-1 lub GHRP-2
GH /w / ± SEM
Czas /minuty/
FIG. 1- 3
169 562
Pozlcm GH u normalnych młodszych mężczyzn po doustnym podaniu GHRP-1 lub GHRP-2
ę vb +i
7» <s x
i o
£
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz Cena 6,00 zł

Claims (4)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogólnym wzorze A1-A2-C1-C2-C3-A5, w którym:
    Ai oznacza Gly, DAla, β-Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, kwas N-niższy alkiloaminokarboksylowy, kwas N,N-dwu-niższy alkilo-aminokarboksylowy, kwas azolokarboksylowy lub kwas niższy alkilo-aminokarboksylowy, gdzie niższa grupa alkilowa zawiera 2 do około 10 atomów węgla w łańcuchu prostym;
    A2 oznacza DTrp, DPNal, D-4-Y-Phe- lub 5-Y-D-Trp, gdzie Y oznacza OH, Cl, Br, F lub H;
    A5 oznacza A3-A4-A5', A3-A5; A4-A5' lub A5, gdzie (a) A oznacza Ala, Gly, DAla, Pro lub des Ala;
    (b) A4 oznacza Ala, Gly, DAla, Pro, kwas liniowy niższy alkilo-aminokarboksylowy lub desAla; i (c) Ay oznacza Lys(e-Ri, R2)-Z, Orn(5-Ri, R2)-Z, NH(CH2)XN(R3, R4), a gdy Ai nie oznacza His, to wówczas A5 może również oznaczać Lys-Z, Orn-Z lub Arg-Z, przy czym Ri oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; R2 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; lecz gdy Ri oznacza H, to wówczas R2 nie oznacza H; a gdy R2 oznacza H, to wówczas Ri nie oznacza H; R3 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; R4 oznacza liniową niższą grupę alkilową lub atom H; Z oznacza NH (liniową niższą grupę alkilową), N (liniową niższą grupę alkilową^, O-(liniową niższą grupę alkilową), NH2 lub OH, gdzie liniowa niższa grupa alkilowa jest zdefiniowana jak niższa grupa alkilowa; x oznacza 2 do 15;
    C1 oznacza Ala;
    C2 oznacza Trp, Phe lub ChxAla;
    C3 oznacza DPhe; DPal lub DChxAla oraz ich organicznych lub nieorganicznych soli addycyjnych, znamienny tym, że sprzęga tworzące ten związek aminokwasy lub pochodne aminokwasów.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poddaje się reakcji kondensacji fragmenty peptydowe tworzące związek końcowy.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że syntetyzuje się w fazie stałej wspomniane aminokwasy lub pochodne aminokwasów.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związków o wzorach:
    DAla-DeNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2,
    DAla-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2,
    DAla-DT rp-Ala-Trp-DPhe-Lys(e-iPr)NH2,
    DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-LysNH2,
    DAla-DeNal-Ala-Trp-DPhe-NH(CH2)NH2,
    N^CC^sCO-DP-Nal-Ala-Trp-DPhe -NH(CH2)5NH2,
    NaIMA-DeNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, ayABU-DeNal-Ala-Phe-DPhe-LysNH2,
    DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH2, eAla-His-DeNal-Ala-Phe-DPhe-LysNHz,
    NaIMA-DeNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHx-NH2, ayABU-DeNal-Ala-Phe-DPhe-NH-CHx, NH2,
    DAJa-DeNal-Ala-Phe-DPhe-Lys NIT,
    DAla-DeNal-Ala-Tip-DPhe-ArgNHa,
    DAla-Dp3Nal-A!a-Phe-DPhe-ArgNH2,
    DAla-DPNal-Ala-CHxAla-DPhe-LysNH2,
    DAla-DeNal-Ala-Phe-CHxAla-DPhe-LysNH2lub
    DAla-DpNal-Ala-CHxAla-DCHxAla-LysNH2,
    169 562 oraz ich organicznych lub nieorganicznych soli addycyjnych, sprzęga się tworzące je aminokwasy lub pochodne aminokwasów.
PL92302434A 1991-08-22 1992-08-20 Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL PL169562B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/748,350 US5663146A (en) 1991-08-22 1991-08-22 Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
PCT/US1992/007026 WO1993004081A1 (en) 1991-08-22 1992-08-20 Peptides having growth hormone releasing activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL169562B1 true PL169562B1 (pl) 1996-08-30

Family

ID=25009088

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL92302434A PL169562B1 (pl) 1991-08-22 1992-08-20 Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL

Country Status (26)

Country Link
US (2) US5663146A (pl)
EP (1) EP0605484B1 (pl)
JP (1) JP3179489B2 (pl)
KR (1) KR100247212B1 (pl)
CN (1) CN1035256C (pl)
AT (1) ATE172742T1 (pl)
AU (1) AU666673B2 (pl)
BG (1) BG62655B1 (pl)
BR (2) BR9206398A (pl)
CA (1) CA2116120C (pl)
CZ (1) CZ293281B6 (pl)
DE (1) DE69227462T2 (pl)
DK (1) DK0605484T3 (pl)
ES (1) ES2124263T3 (pl)
FI (2) FI120095B (pl)
HU (1) HU223664B1 (pl)
IL (1) IL102848A (pl)
MX (1) MX9204861A (pl)
NO (1) NO314695B1 (pl)
NZ (1) NZ244034A (pl)
PL (1) PL169562B1 (pl)
RO (1) RO112507B1 (pl)
RU (1) RU2126014C1 (pl)
SK (1) SK282895B6 (pl)
WO (1) WO1993004081A1 (pl)
ZA (1) ZA926337B (pl)

Families Citing this family (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843941A (en) 1993-05-14 1998-12-01 Genentech, Inc. Ras farnesyl transferase inhibitors
SK281963B6 (sk) * 1993-12-23 2001-09-11 Novo Nordisk A/S Zlúčeniny ovplyvňujúce uvoľňovanie rastového hormónu, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie
PL181286B1 (pl) * 1993-12-23 2001-07-31 Novo Nordisk As Zwiazki o wlasciwosciach uwalniania hormonu wzrostu i zawierajace je kompozycje farmaceutyczne PL PL PL PL PL PL PL PL
US5798337A (en) * 1994-11-16 1998-08-25 Genentech, Inc. Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
US20020111461A1 (en) * 1999-05-21 2002-08-15 Todd C. Somers Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
WO1997000894A1 (en) * 1995-06-22 1997-01-09 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
CA2252761A1 (en) * 1996-04-24 1997-10-30 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
JP4116097B2 (ja) 1997-06-20 2008-07-09 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 成長ホルモン放出特性をもつ化合物
US6127341A (en) * 1997-06-20 2000-10-03 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
ZA987383B (en) * 1997-08-19 2000-02-17 Lilly Co Eli Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues.
US6329342B1 (en) 1997-08-19 2001-12-11 Eli Lilly And Company Treatment of congestive heart failure with growth hormone secretagogues
WO1999036431A1 (en) 1998-01-16 1999-07-22 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
WO1999039730A1 (fr) * 1998-02-09 1999-08-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation a administration orale contenant des peptides favorisant la secretion d'hormone de croissance
US6919315B1 (en) 1998-06-30 2005-07-19 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
US6682908B1 (en) 1998-07-10 2004-01-27 Merck & Co., Inc. Mouse growth hormone secretagogue receptor
CA2333857A1 (en) 1998-07-13 2000-01-20 Merck & Co., Inc. Growth hormone secretagogue related receptors and nucleic acids
EP1112282A4 (en) 1998-08-10 2002-10-31 Merck & Co Inc RECEPTOR OF THE GROWTH HORMONE SECRETION PROMOTER FROM THE DOG
WO2000009537A2 (en) * 1998-08-14 2000-02-24 Administrators Of The Tulane Educational Fund Compounds having growth hormone releasing activity
US6639076B1 (en) 1998-08-18 2003-10-28 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US6696063B1 (en) * 1998-12-30 2004-02-24 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Treatment of HIV-associated dysmorphia/dysmetabolic syndrome (HADDS) with or without lipodystrophy
US7022677B1 (en) 1999-02-18 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Amide derivatives as growth hormone secretagogues
CA2362290A1 (en) * 1999-02-18 2000-08-24 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Novel amide derivatives as growth hormone secretagogues
US6828331B1 (en) * 1999-02-19 2004-12-07 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
MXPA02000938A (es) * 1999-07-26 2004-03-19 Baylor College Medicine Analogo super-activo de la hormona que libera la hormona de crecimiento porcina.
US20040192593A1 (en) * 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
US7022311B1 (en) * 1999-10-12 2006-04-04 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Powdery inhalational preparations and process for producing the same
UA73530C2 (uk) 1999-11-10 2005-08-15 Ново Нордіск А/С Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту
JP3498041B2 (ja) * 2000-05-29 2004-02-16 科研製薬株式会社 プラルモレリン含有点鼻用製剤
ES2333097T3 (es) 2000-05-31 2010-02-17 Raqualia Pharma Inc Uso de secretagogos de la hormona de crecimiento para estimular la motilidad gastrointestinal.
US7919647B2 (en) 2000-08-24 2011-04-05 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7645898B2 (en) 2000-08-24 2010-01-12 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and method of use thereof
US7622503B2 (en) 2000-08-24 2009-11-24 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
US7855229B2 (en) 2000-08-24 2010-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Treating wasting disorders with selective androgen receptor modulators
EP1355941A2 (en) 2001-02-02 2003-10-29 ConjuChem, Inc. Long lasting growth hormone releasing factor derivatives
US7125840B2 (en) * 2001-10-09 2006-10-24 Eli Lilly And Company Substituted dipeptides as growth hormone secretagogues
CN100417419C (zh) 2001-10-26 2008-09-10 贝勒医学院 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
US8853266B2 (en) 2001-12-06 2014-10-07 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulators for treating diabetes
US6831102B2 (en) 2001-12-07 2004-12-14 Bristol-Myers Squibb Company Phenyl naphthol ligands for thyroid hormone receptor
BR0214869A (pt) 2001-12-11 2005-03-08 Advisys Inc Suplementação mediada por plasmìdeo para tratamento de indivìduos cronicamente doentes
US7015219B2 (en) 2001-12-19 2006-03-21 Bristol-Myers Squibb Company 3-aryl-hydroxybenzoxazines and 3, 4-dihydro-3-aryl-hydroxybenzoxazines as selective estrogen receptor beta modulators
ATE510919T1 (de) * 2002-02-07 2011-06-15 Baylor College Medicine Veränderte hirnanhangsdrüsenentwicklung in nachkommen von mit einer therapie mit wachstumshormon freisetzendem hormon behandelten trächtigen muttertieren
US7772433B2 (en) 2002-02-28 2010-08-10 University Of Tennessee Research Foundation SARMS and method of use thereof
US7381730B2 (en) 2002-03-15 2008-06-03 Bristol-Myers Squibb Company 3-arylquinazoline derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
AU2003218337A1 (en) * 2002-04-09 2003-10-27 Eli Lilly And Company Growth hormone secretagogues
US20060167268A1 (en) * 2002-04-09 2006-07-27 Eli Lilly And Company, Patent Division, Growth hormone secretagogues
WO2003094845A2 (en) 2002-05-08 2003-11-20 Bristol-Myers Squibb Company Pyridine-based thyroid receptor ligands
US7405234B2 (en) 2002-05-17 2008-07-29 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
EP1536817A1 (en) 2002-08-23 2005-06-08 Gestion Univalor Société en Commandite Growth hormone-releasing peptides in the treatment of prevention of atherosclerosis and hypercholesterolemia
WO2004045518A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Open chain prolyl urea-related modulators of androgen receptor function
US8309603B2 (en) 2004-06-07 2012-11-13 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
TW200504021A (en) 2003-01-24 2005-02-01 Bristol Myers Squibb Co Substituted anilide ligands for the thyroid receptor
WO2004067719A2 (en) * 2003-01-28 2004-08-12 Advisys, Inc. Growth hormone releasing hormone (ghrh) for use in reducing culling in herd animals
WO2004069793A2 (en) 2003-01-28 2004-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Novel 2-substituted cyclic amines as calcium sensing receptor modulators
US7205322B2 (en) 2003-02-12 2007-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Thiazolidine compounds as calcium sensing receptor modulators
US7557143B2 (en) 2003-04-18 2009-07-07 Bristol-Myers Squibb Company Thyroid receptor ligands
TW200424214A (en) * 2003-04-21 2004-11-16 Advisys Inc Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
US7459460B2 (en) 2003-05-28 2008-12-02 Bristol-Myers Squibb Company Trisubstituted heteroaromatic compounds as calcium sensing receptor modulators
US7265145B2 (en) 2003-05-28 2007-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Substituted piperidines and pyrrolidines as calcium sensing receptor modulators and method
US7476653B2 (en) 2003-06-18 2009-01-13 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic modulators of the ghrelin receptor
US7361642B2 (en) * 2003-08-04 2008-04-22 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Canine specific growth hormone releasing hormone
AU2003272814A1 (en) 2003-10-02 2005-05-19 Ibrahim Al-Habdan Peptide for promoting healing of fractures
DE602004027165D1 (de) * 2003-12-31 2010-06-24 VGX Pharmaceuticals LLC Reduzierung von arthritis und lahmheit bei personen unter supllement von wachstumshormon freisetzendem hormon (ghrh)
US7517863B2 (en) * 2004-01-20 2009-04-14 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Enhanced secretion/retention of growth hormone releasing hormone (GHRH) from muscle cells by species-specific signal peptide
US20050164952A1 (en) * 2004-01-23 2005-07-28 Vital Pharmaceuticals, Inc. Delivery system for growth hormone releasing peptides
US7820702B2 (en) 2004-02-04 2010-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Sulfonylpyrrolidine modulators of androgen receptor function and method
US7378426B2 (en) 2004-03-01 2008-05-27 Bristol-Myers Squibb Company Fused heterotricyclic compounds as inhibitors of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3
US7696241B2 (en) 2004-03-04 2010-04-13 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic compounds as modulators of androgen receptor function and method
US7625923B2 (en) 2004-03-04 2009-12-01 Bristol-Myers Squibb Company Bicyclic modulators of androgen receptor function
US9889110B2 (en) 2004-06-07 2018-02-13 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator for treating hormone-related conditions
US9884038B2 (en) 2004-06-07 2018-02-06 University Of Tennessee Research Foundation Selective androgen receptor modulator and methods of use thereof
MX2007000893A (es) * 2004-07-23 2007-04-18 Advisys Inc La hormona liberadora de hormona de crecimiento mejora la respuesta inmune inducida por la vacunacion.
WO2006023608A2 (en) 2004-08-18 2006-03-02 Elixir Pharmaceuticals, Inc. Growth-hormone secretagogues
US7456188B1 (en) 2005-04-28 2008-11-25 Bristol-Myers Squibb Company C-5 substituted quinazolinone derivatives as selective estrogen receptor beta modulators
ES2453981T3 (es) 2005-08-31 2014-04-09 University Of Tennessee Research Foundation Tratamiento de síntomas de enfermedad renal con moduladores selectivos de receptor de andrógenos (SARM)
CU23558A1 (es) 2006-02-28 2010-07-20 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos análogos a los secretagogos peptidicos de la hormona de crecimiento
WO2008006019A2 (en) * 2006-07-06 2008-01-10 Advisys Inc. Growth hormone releasing hormone treatment to decrease cholesterol levels
EP2038252B1 (en) 2006-07-12 2016-11-02 University of Tennessee Research Foundation Substituted acylanilides and methods of use thereof
EP2995619B1 (en) 2006-08-02 2019-09-25 Cytokinetics, Inc. Certain chemical entities comprising imidazopyrimidines, compositions and methods
US8299248B2 (en) 2006-08-02 2012-10-30 Cytokinetics, Incorporated Certain 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2(3H)-ones and 1H-imidazo[4,5-b]pyrazin-2-ols and methods for their use
US10010521B2 (en) 2006-08-24 2018-07-03 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
CN103251579B (zh) 2006-08-24 2016-12-28 田纳西大学研究基金会 取代的n-酰基苯胺及其使用方法
US9730908B2 (en) 2006-08-24 2017-08-15 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
US9844528B2 (en) 2006-08-24 2017-12-19 University Of Tennessee Research Foundation SARMs and method of use thereof
AU2008241532A1 (en) 2007-02-09 2008-10-30 Tranzyme Pharma, Inc. Macrocyclic ghrelin receptor modulators and methods of using the same
US20100099640A1 (en) 2007-05-04 2010-04-22 Joannes Geuns Tissue degeneration protection
US7968603B2 (en) 2007-09-11 2011-06-28 University Of Tennessee Research Foundation Solid forms of selective androgen receptor modulators
US8003689B2 (en) 2008-06-20 2011-08-23 Gtx, Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators and methods of use thereof
AR081331A1 (es) 2010-04-23 2012-08-08 Cytokinetics Inc Amino- pirimidinas composiciones de las mismas y metodos para el uso de los mismos
US9133123B2 (en) 2010-04-23 2015-09-15 Cytokinetics, Inc. Certain amino-pyridines and amino-triazines, compositions thereof, and methods for their use
AR081626A1 (es) 2010-04-23 2012-10-10 Cytokinetics Inc Compuestos amino-piridazinicos, composiciones farmaceuticas que los contienen y uso de los mismos para tratar trastornos musculares cardiacos y esqueleticos
WO2013190520A2 (en) 2012-06-22 2013-12-27 The General Hospital Corporation Gh-releasing agents in the treatment of vascular stenosis and associated conditions
US10314807B2 (en) 2012-07-13 2019-06-11 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
PT2872482T (pt) 2012-07-13 2020-09-22 Oncternal Therapeutics Inc Método de tratamento de cancro de mama com modulador seletivo do recetor de andrógeno (sarm)
US10987334B2 (en) 2012-07-13 2021-04-27 University Of Tennessee Research Foundation Method of treating ER mutant expressing breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMs)
US10258596B2 (en) 2012-07-13 2019-04-16 Gtx, Inc. Method of treating HER2-positive breast cancers with selective androgen receptor modulators (SARMS)
US9744149B2 (en) 2012-07-13 2017-08-29 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
US9969683B2 (en) 2012-07-13 2018-05-15 Gtx, Inc. Method of treating estrogen receptor (ER)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMS)
US9622992B2 (en) 2012-07-13 2017-04-18 Gtx, Inc. Method of treating androgen receptor (AR)-positive breast cancers with selective androgen receptor modulator (SARMs)
IN2015DN04172A (pl) 2012-10-24 2015-10-16 Daiichi Sankyo Companyltd
US10092627B2 (en) 2013-04-08 2018-10-09 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for rejuvenating skeletal muscle stem cells
US9119832B2 (en) 2014-02-05 2015-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of treating mild brain injury
SG11201609050UA (en) 2014-05-30 2016-12-29 Pfizer Carbonitrile derivatives as selective androgen receptor modulators
US20170121385A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurodegenerative conditions
CA3142514A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 Cytokinetics, Inc. Polymorphs of 1-(2-((((trans)-3-fluoro-1-(3-fluoropyridin-2-yl)cyclobutyl)methyl)amino)pyrimidin-5-yl)-1h-pyrrole-3-carboxamide
WO2023275715A1 (en) 2021-06-30 2023-01-05 Pfizer Inc. Metabolites of selective androgen receptor modulators

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4228157A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
CA1175810A (en) * 1979-03-30 1984-10-09 Frank A. Momany Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223021A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223019A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228156A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228155A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4224316A (en) * 1979-03-30 1980-09-23 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228158A (en) * 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223020A (en) * 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4226857A (en) * 1979-03-30 1980-10-07 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410513A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410512A (en) * 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Combinations having synergistic pituitary growth hormone releasing activity
WO1983002272A1 (en) * 1981-12-28 1983-07-07 Beckman Instruments Inc Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4880778A (en) * 1986-05-12 1989-11-14 Eastman Kodak Company Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof
US4839344A (en) * 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US4880777A (en) * 1987-09-01 1989-11-14 Eastman Kodak Company Synthetic peptides having growth hormone releasing activity
DE68919213T2 (de) * 1988-01-28 1995-05-11 Polygen Holding Corp Polypeptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.
EP0400051B1 (en) * 1988-01-28 1995-05-10 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
AU633003B2 (en) * 1988-05-11 1993-01-21 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
IL98910A0 (en) * 1990-07-24 1992-07-15 Polygen Holding Corp Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity and pharmaceutical compositions containing them
JPH05508859A (ja) 1990-07-24 1993-12-09 イーストマン コダック カンパニー ペプチド合成方法
US5486505A (en) * 1990-07-24 1996-01-23 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity

Also Published As

Publication number Publication date
ES2124263T3 (es) 1999-02-01
CN1035256C (zh) 1997-06-25
RU2126014C1 (ru) 1999-02-10
SK20494A3 (en) 1994-10-05
FI120095B (fi) 2009-06-30
RO112507B1 (ro) 1997-10-30
CA2116120A1 (en) 1993-02-23
ATE172742T1 (de) 1998-11-15
MX9204861A (es) 1994-06-30
ZA926337B (en) 1993-04-22
IL102848A (en) 1998-04-05
CN1073684A (zh) 1993-06-30
FI940807A0 (fi) 1994-02-21
HU223664B1 (hu) 2004-11-29
DE69227462D1 (de) 1998-12-03
BG62655B1 (bg) 2000-04-28
CA2116120C (en) 2002-12-03
CZ293281B6 (cs) 2004-03-17
US5663146A (en) 1997-09-02
FI940807A (fi) 1994-02-21
KR100247212B1 (ko) 2000-03-15
FI120691B (fi) 2010-01-29
HUT69178A (en) 1995-08-28
BG98489A (bg) 1995-02-28
NO940592L (no) 1994-04-14
NZ244034A (en) 1995-08-28
NO940592D0 (no) 1994-02-21
HU9400495D0 (en) 1994-05-30
NO314695B1 (no) 2003-05-05
DE69227462T2 (de) 1999-04-08
EP0605484B1 (en) 1998-10-28
JP3179489B2 (ja) 2001-06-25
SK282895B6 (sk) 2003-01-09
IL102848A0 (en) 1993-01-31
CZ40094A3 (en) 1994-11-16
FI20050467A (fi) 2005-05-02
WO1993004081A1 (en) 1993-03-04
AU666673B2 (en) 1996-02-22
BR9206398A (pt) 1994-12-27
AU2541692A (en) 1993-03-16
DK0605484T3 (da) 1999-07-05
BR1100309A (pt) 2000-08-01
US5776901A (en) 1998-07-07
EP0605484A1 (en) 1994-07-13
JPH07507039A (ja) 1995-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL169562B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL PL
EP0398961B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0400051A1 (en) POLYPEPTIDES WITH A HORMONE GROWTH RELEASING EFFECT.
US5486505A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0417165B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
PL167804B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych peptydów PL
US7250399B2 (en) Compounds having growth hormone releasing activity

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20110820