FI117388B - Selektionsmarkörgenfria jäststammar, förfarande för deras framställning och användning av dessa stammar - Google Patents

Claims (25)

1. Jästvektor, kännetecknad därav, att den innehäller en dominerande, dubbelriktad och kontraselektiv 5 selektionsmarkörgen, som är flankerad av DNA- upprepningssekvenser, som möjliggör inre rekombination i genomet av en jäst.

2. Vektor enligt patentkrav 1, kännetecknad därav, att DNA-10 upprepningssekvenserna väljs frän 5'- eller 3'-ändan av DNA- sekvensen som ska avslägnas.

3. Vektor enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknad därav, att selektionsmarkörgenen är en acetamidasgen. 15

4. Vektor enligt patentkrav 3, kännetecknad därav, att acetamidasgenen härstammar frän en svamp.

5. Vektor enligt patentkrav 4, kännetecknad därav, att 20 acetamidasgenen är frän arten Aspergillus.

6. Vektor enligt nägot av patentkraven 1-5, kännetecknad därav, att vektorn innehäller ocksä ett önskat DNA-fragment. • e· ♦ · V*: 25

7. Vektor enligt patentkrav 6, kännetecknad därav, att det '**** önskade DNA-fragment et innehäller nägot av följande genetiska ·:*·: element eller deras kombinationer: en gen, en cDNA, en ··· promotor, en terminator, ett regleringselement, en intron, en MM ·*··· igenkänningssekvens för ett DNA-bindande protein, ett 30 translationsinitieringsställe eller ett restriktionsställe. m • e · « « <

8. Vektor enligt patentkrav 7, kännetecknad därav, att det • * ’** önskade DNA-fragmentet innehäller en sekvens som kodar för • : kymosin, fytas, xylanas, lipas, amylas, proteas eller β- ·«* 35 galaktosidas. • « • m ·

9. Rekombinant jäst som är transformerad med en vektor enligt » · nägot av patentkraven 1-8. 117388

10. Jäst enligt patentkrav 9, kännetecknad därav, att den omfattar minst tvä olika vektorer enligt nägot av patentkraven 1-8. 5

11. Jäst enligt patentkrav 9 eller 10, kännetecknad därav, att vektorn har integrerats i genomet av nämnda jäst via positionsspecifik homologisk rekombination. 10

12. Jäst enligt nägot av patentkraven 9 - 11, kännetecknad därav, att jästen är Kluyveromyces- eller Saccharomyces-art, företrädesvis Kluyveromyces laetis eller Saccharomyces cerevisiae. 15

13. Förfarande för att erhälla en selektionsmarkörgenfri rekombinant jäst, kännetecknat därav, att det omfattar följande steg: a) ett önskat DNA-fragment och en dominerande och 20 dubbelriktad selektionsmarkörgen integreras i genomet av en jäst, b) transformanter selekteras, c) selektionsmarkörgenen avslägnas med rekombination mellan ··!:* selektionsmarkörgenens flankerande DNA-upprepningssekvenser, * « 5Λ: 25 d) kontraselekteras, sora är baserad pä avsaknad av en ·;·*: selektionsmarkörgen.

• « .*· 14. Förfarande enligt patentkravet 13, kännetecknat därav, *· φ » .·*·. att en sekvens klonas tili 5'- eller 3'-sidan av 30 selektionsmarkörgenen, vilken sekvens bildar en . upprepningssekvens med en sekvens, som ligger pä 3'- eller • i * 5'-sidan av sekvensen, som avslägnas frän genomet. ft · « · jj*:

15. Förfarande enligt patentkravet 13 eller 14, kännetecknat :***· 35 därav, att det önskade DNA-fragmentet omfattar nägot av ··· . \ följande genetiska element eller deras kombinationer: en gen, ”· ’ en cDNA, en promotor, en terminator, ett regleringselement, en intron, en igenkänningssekvens för ett DNA-bindande 117388 protein, ett translationsinitieringsställe eller ett restriktionsställe.

16. Förfarande enligt patentkravet 13 eller 14, kännetecknat 5 därav, att stegen a)-d) repeteras med den erhallna jästen med användning av antingen detsamma eller olika önskade DNA-fragment.

17. Förfarande enligt· nägot av patentkraven 13 - 16, 10 kännetecknat därav, att selektionsmarkörgenen är en acetamidasgen.

18. Förfarande enligt patentkravet 17, kännetecknat därav, att selektionsmarkörgenen är acetamidasgenen härstammande 15 frän en svamp.

19. Förfarande enligt patentkravet 18, kännetecknat därav, att selektionsmarkörgenen är acetamidasgenen, som är frän arten Aspergillus. 20

20. Förfarande för att framställa en bioaktiv produkt, kännetecknat därav, att förfarandet omfattar odling av en jäst producerads med ett förfarande enligt nägot av patentkraven 13-19. a · • i · n tr \ ·: 25

21. Förfarande enligt patentkravet 20, kännetecknat därav, *:**: att den bioaktiva föreningen är ett protein. » • »· Φ

22. Förfarande enligt patentkravet 20, kännetecknat därav, ··· 30 att den bioaktiva föreningen är ett antibiotikum. • · · • « · lii

23. Användning av en trädformig svamp, som har producerats ·;* med ett förfarande enligt nägot av patentkraven 13 - 19, för * 9 •J · produktion av en bioaktiv förening. ··· ., ; : 35 • a* .

24. Användning enligt patentkravet 23, kännetecknad därav, • · · I att den bioaktiva föreningen är ett protein. • « 117388

25. Användning enligt patentkravet 23, kännetecknad. därav, att den bioaktiva föreningen är ett antibiotikum. »*** • 1 * 1 · • 1 • # « * 1 *·« « ··«« • « «A 1 « « · a · 1 «a1 • « • ♦ *·» * • · * « a * a · • aa a »a» * i a a • • a # · · a a 1 *·« 1 ·