ES2898918T3 - Flagelina de roseburia e inmunomodulación - Google Patents

Flagelina de roseburia e inmunomodulación Download PDF

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Abstract

Una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para uso en medicina.

Description

DESCRIPCIÓN
Flagelina de roseburia e inmunomodulación
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a flagelinas de Roseburia, y/o secuencias de polinucleótidos que codifican dichas flagelinas de Roseburia, y/o vectores que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos, y/o células huésped, incluyendo las bacterias, que comprenden dichos vectores, y/o células huésped, incluyendo las bacterias, que comprenden dichas secuencias de polinucleótidos, para diversos usos terapéuticos y nutricionales.
ANTECEDENTES
Se cree que el intestino humano es estéril en el útero, pero se expone a una gran diversidad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. Posteriormente, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana que está influenciado por factores tales como el modo de suministro, el entorno, la dieta y el genotipo del huésped, todo lo cual afecta a la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se vuelve adulta (Spor, Koren y Ley 2011). La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos divisiones bacterianas principales, los Bacteroidetes y los Firmicutes (Eckburg et al. 2005). Las exitosas relaciones simbióticas que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia diversidad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Las actividades metabólicas mejoradas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietarios no digeribles se degraden con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. De forma similar, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal es bien conocida y se ilustra en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunitario deteriorado que se reconstituye funcionalmente después de la introducción de bacterias comensales (Macpherson et al. 2001, Macpherson, Martinic & Harris 2002, Mazmanian et al. 2005).
En fuerte contraste con la producción de IgA secretora intestinal, que se ve influenciada por la colonización microbiana, per se (Chung, Kasper 2010, Macpherson 2006), el desarrollo de linfocitos T y la diferenciación parecen requerir la colonización por microorganismos comensales específicos. Las especies de Clostridium, y en particular las bacterias filamentosas segmentadas formadoras de esporas (SFB, por sus siglas en inglés), parecen ser un potente estímulo para la diferenciación y la maduración de Th1, Th17 y Treg intestinales y colónicos (Gaboriau-Routhiau et al. 2009, Ivanov et al. 2009). Estudios recientes han demostrado ahora que otras bacterias intestinales, incluidas las de grupos de Clostridium IV y XIVa y la flora de Schaedler alterada (ASF, por sus siglas en inglés), pueden inducir la generación de novo de linfocitos T reguladoras mientras que la monocolonización con Bacteroides fragilis puede corregir el desequilibrio de Th1/Th2 en ratones libres de gérmenes promoviendo la expansión de Treg (Mazmanian et al. 2005, Geuking et al. 2011, Atarashi et al. 2011). Estos datos infieren importantes efectos inmunorreguladores de otras bacterias intestinales residentes. Claramente, los efectos de las bacterias comensales en las vías de diferenciación de los linfocitos T son variables y, como se ha postulado anteriormente, pueden estar influenciados por la serie de ligandos TLR que se encuentran asociados con bacterias específicas (Nutsch, Hsieh 2012). Por ejemplo, el mecanismo por el cual la SFB influye en las respuestas de los linfocitos T es actualmente desconocido, pero estudios genómicos recientes que confirman la presencia de genes de flagelina sugieren que las respuestas innatas mediadas a través de interacciones de TLR5-flagelina pueden ser importantes (Prakash et al.2011, Sczesnak et al. 2011). Además, los efectos potenciadores de Treg de B. fragilis se han relacionado con la PSA y la mediación por los eventos de señalización de TLR2 (Round et al. 2011).
Se han documentado cambios drásticos en la composición de la microbiota en los trastornos gastrointestinales tales como enfermedad inflamatoria del intestino (EII). Por ejemplo, los niveles de bacterias del grupo de Clostridium XIVa se reducen en pacientes con EII mientras que los números de E. coli aumentan, lo que sugiere un cambio en el equilibrio de simbiontes y patobiontes en el intestino (Frank etal. 2007, Scanlan et al. 2006, Kang et al. 2010, Machiels K. et al. 2013). Curiosamente, esta disbiosis microbiana también se asocia con desequilibrios en las poblaciones de linfocitos T efectores.
Roseburia pertenece al grupo filogenético XIVa del filo Firmicutes. Actualmente, dentro del género Roseburia, se han identificado y caracterizado cinco especies: Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans (Stanton y Savage 1983, Duncan et al 2006). Las bacterias son anaerobios comensales flagelados y también son grandes productores de butirato (Duncan et al. 2006). Aunque no se ha estimado con precisión el número preciso de estas bacterias que colonizan el intestino humano, las Roseburia spp. son dominantes en el intestino humano sano y están subrepresentadas en pacientes con EII (Machiels K. et al. 2013).
Se describen las funciones de los genes bacterianos, en particular la flagelina, que participan en la colonización y la adaptación al intestino murino, así como los genes inmunitarios del huésped que responden a la colonización por la bacteria Roseburia. Los inventores muestran que las estructuras de flagelina específicas de Roseburia, tales como R. hominis y R. intestinalis inducen respuestas de señalización distintas tanto en las células epiteliales como en las células dendríticas en relación con otras bacterias entéricas flageladas. Se demuestra la importancia de las interacciones de TLR5-Roseburia, tal como TLR5-R.hominis, en el direccionamiento de la respuesta adaptativa del huésped, en particular las respuestas de los Treg. La secuencia genómica completa y la anotación para R. hominis descritas en esta invención se muestran en GenBank con el número de acceso CP003040 (versión 1). Para R. intestinalis (número de acceso de GenBank para la cepa L1-82 del gen de ARNr 16S: AJ312385) descrita en esta invención se muestra la secuencia genómica de referencia en GenBank con el número de acceso ABYJ02000000 (versión 2) y consiste en las secuencias ABYJ02000001-ABYJ02000409.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones.
La presente invención proporciona una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para uso en medicina.
La presente invención proporciona el uso de una célula huésped, incluyendo las bacterias, que expresa una flagelina de Roseburia exógena o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de la misma y combinaciones de los mismos para estimular el apetito en un sujeto.
La presente invención proporciona además una composición farmacéutica y/o un complemento nutricional que comprende una célula huésped que expresa una flagelina de Roseburia exógena o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de la misma y combinaciones de los mismos, y un excipiente, portador y/o diluyente farmacéutica y/o nutricionalmente aceptable.
La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una composición farmacéutica y/o un complemento nutricional que comprende una célula huésped que expresa una flagelina de Roseburia exógena o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de la misma y combinaciones de los mismos, y un excipiente, portador o diluyente farmacéutica y/o nutricionalmente aceptable, comprendiendo dicho procedimiento mezclar la célula huésped que expresa una flagelina de Roseburia exógena o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de la misma y combinaciones de los mismos, con un excipiente, portador o diluyente farmacéutica y/o nutricionalmente aceptable.
DECLARACIONES DE LA INVENCIÓN
Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que las proteínas de flagelina de Roseburia son importantes en la modulación de la respuesta inmunitaria.
Además, los presentes inventores sorprendentemente encontraron que las proteínas de flagelina que se obtienen o pueden obtenerse a partir de Roseburia hominis o Roseburia intestinalis son importantes en la modulación de la respuesta inmunitaria.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la modulación de la inflamación de un tejido o un órgano (tal como el intestino) en un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la modulación de la producción de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T reguladores, tales como linfocitos T reguladores capaces de expresar TLR5) en un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la restauración de la tolerancia inmunológica.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación del sistema inmunitario de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en el tratamiento de un trastorno en un sujeto, donde dicho trastorno es un trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la modulación de las células dendríticas (tales como células dendríticas de médula ósea) y/o células epiteliales en un tejido o un órgano de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación de la producción de IL-10 y/o TGFp en una célula o células de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación de la producción de marcadores de superficie celular implicados en respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos tales como CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H y/o la especie equivalente en una célula o células de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación (por ejemplo, regulación negativa) de la expresión de uno o más genes de IFN de tipo I (tales como, pero sin limitación, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en IFN-p1, IFN-p3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 e Irf4) en una célula o células de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación (por ejemplo, regulación negativa) de la expresión de uno o más genes proinflamatorios (tales como uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación, IL1-p, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNy, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 y TNF-a) en una célula o células de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la mejora de la microbiota intestinal en un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación del apetito en un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la regulación (por ejemplo, regulación negativa) de la expresión del gen que codifica la colecistoquinina (Cck) y/o la expresión del gen que codifica el glucagón (Gcg) en una célula o células de un sujeto.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la mejora de la salud del tubo digestivo en un sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para modular la inflamación de un tejido o un órgano (tal como el intestino) en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto una flagelina de Roseburia, o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se modula la inflamación del tejido u órgano (tal como el intestino) en el sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para modular la producción de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T reguladores, tales como linfocitos T reguladores capaces de expresar TLR5) en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia
(tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se modula la producción de linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T reguladores, tales como linfocitos T reguladores capaces de expresar TLR5) en el sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular el sistema inmunitario de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia
(tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se regula el sistema inmunitario de un sujeto. En esta invención se describe un procedimiento para tratar un trastorno en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), donde dicho trastorno es un trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario.
En esta invención se describe un procedimiento para modular las células dendríticas (tales como las células dendríticas de médula ósea) y/o las células epiteliales en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se modulan las células dendríticas (tales como las células dendríticas de médula ósea) y/o las células epiteliales en el sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular la producción de IL-10 y/o TGFp en una célula o células de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto una flagelina de Roseburia y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se regula la producción de IL-10 y/o TGFp en una célula o células del sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular la producción de marcadores de superficie celular implicados en las respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos tales como CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H y/o las especies equivalentes en una célula o células de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar al sujeto una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se regula la producción de marcadores de superficie celular implicados en las respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos tales como CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H y/o las especies equivalentes en una célula o células del sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular (por ejemplo, regular negativamente) la expresión de uno o más genes de IFN de tipo I (tales como uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación, IFN-pi, IFN-P3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 e Irf4) en una célula o células de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), donde se regula la expresión de uno o más genes de IFN de tipo I (tales como uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación, IFN-p1, IFN-p3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI,
MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 e Irf4) en una célula o células del sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular (por ejemplo, regular negativamente) la expresión de uno o más genes proinflamatorios (tales como uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación, IL1-P, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNy, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 y TNF-a en una célula o células de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia,
y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), donde se regula la expresión de uno o más genes proinflamatorios (tales como uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en, pero sin limitación, IL1-13, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNy, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 y TNF-a) en una célula o células del sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para mejorar la microbiota intestinal en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se mejora la microbiota intestinal en un sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular el apetito en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se regula el apetito en el sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para regular (por ejemplo, regular negativamente) la expresión del gen que codifica la colecistoquinina (Cck) y/o la expresión del gen que codifica el glucagón (Gcg) en una célula o células de un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se regula la expresión del gen que codifica la colecistoquinina (Cck) y/o la expresión del gen que codifica el glucagón (Gcg) en una célula o células del sujeto.
En esta invención se describe un procedimiento para mejorar la salud del tubo digestivo en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se mejora la salud del tubo digestivo en un sujeto.
La presente invención se refiere al uso de una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para su uso en medicina.
En determinadas realizaciones, una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en la restauración de la tolerancia inmunológica.
En esta invención se describe un procedimiento para restaurar la tolerancia inmunológica en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento administrar una flagelina de Roseburia y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped que comprende dicho vector, y/o una célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis), y donde se restaura la tolerancia inmunológica en un sujeto.
FIGURAS
Figura 1. Secuencia y anotación del genoma de R. hominis. Se produjo la secuencia genómica completa de A2-183 de R. hominis. Se representa por un único cromosoma 3.592.125 pb con cuatro operones ribosómicos, 66 ARN y 3.273 proteínas predichas. (A) Mapa del genoma circular de R. hominis con la ubicación de los experimentos de PCR (Tabla S1) indicado en las regiones dirigidas por los cebadores. Las pistas del mapa del genoma, a partir de la pista exterior 0, son: pista 0 (azul) - experimentos de PCR en tiempo real indicados por marcas de verificación numeradas; pista 1 (azul claro) - CDS directo; pista 2 (azul pálido) - CDS inverso; pista 3 (gris) - ARNr; pista 4 (verde) - ARNt; pista 5 (rojo) - regiones marcadoras de STS dirigidas por PCR en tiempo real de marcado; gráfico 1 - contenido de GC; gráfico 2 - sesgo de GC. (B) La anotación funcional del genoma de R. hominis muestra que el mayor número de genes pertenecen a los carbohidratos, el metabolismo de proteínas y aminoácidos y derivados.
Figura 2. R. hom inis responde al entorno intestinal al regular positivamente los genes de motilidad, movilización y quimiotaxis. A ratones macho C3H/HeN libres de gérmenes GF se les dio cultivo de R. hominis mediante sonda nasogástrica durante 28d, y se compararon con los animales de control libres de gérmenes. En 14d y 28d, los animales tratados con R. hominis (N = 5) y los animales de control (N = 4) se sacrificaron y se extirparon el íleon, el colon y el ciego. (A) Validación por PCR en tiempo real de los genes implicados en la transferencia de conjugación/movilización. (B) Validación por PCR en tiempo real de los genes implicados en la motilidad y la quimiotaxis. (C) Transferencia de Western del crecimiento de R. hominis in vitro en presencia de comida murina estándar irradiada con UV inmunoteñida con el anticuerpo Fla1 purificado por afinidad, anticuerpo específico de Fla2 y el anticuerpo anti-ADN girasa A (carril 1: sin dieta, carril 2: 0,01 g de dieta/10 ml de cultivo de R. hominis, carril 3: 0,02 g de dieta/10 ml, carril 4: 0,05 g de dieta/10 ml, carril 5: 0,1 g de dieta/10 ml, carril 6: 0,2 g de dieta/10 ml, carril 7: 0,5 g de dieta/10 ml, carril 8: 1 g de dieta/10 ml). Imagen de microscopía electrónica (EM) de R. hominis que muestra flagelos (flechas de color negro) Se realizó la inmunocitoquímica en bacterias de contenidos luminales de ratones colonizados y de R. hominis cultivados in vitro usando antisuero específico de FlaA1 y FlaA2. Aumento original x1000. (D) Validación por PCR en tiempo real de genes implicados en el metabolismo del butirato. (E) Análisis de PCR en tiempo real de los transcritos de R. hominis durante la exposición in vitro a células epiteliales intestinales humanas. Los resultados de la PCR en tiempo real se presentan como factor de cambio, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Figura 3. Identificación de transcritos expresados diferencialmente en el intestino murino después de la monoasociación con R. hominis. (A) Análisis de micromatrices Affymetrix de genes expresados diferencialmente en ratones colonizados con R. hominis (N = 5) con respecto a GF (N = 4). Los gráficos de barras representan el mayor y el menor número de genes expresado después de 14 y 28 días. (B) Mapa de calor generado a partir de genes expresados diferencialmente con significación funcional entre ratones GF y colonizados con R. hominis en 14d y 28d. (C) Validación por PCR en tiempo real de genes que han demostrado ser significativamente diferentes entre ratones colonizados con R. hominis y Gf . Los resultados de la PCR en tiempo real se presentan como factor de cambio, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.
Figura 4. Inducción de linfocitos Treg FoxP3+ por Roseburia hominis. Análisis de citometría de flujo de linfocitos Treg FoxP3+ en la lámina propia (P = 0,0425 entre el control y el tratamiento con R. hominis) R. hominis) y los ganglios linfáticos mesentéricos (P = 0,0683) de C3H/HeN convencional tratados durante 14 días con R. hominis.
Figura 5. Los marcadores de linfocitos T colónicos se inducen significativamente por la monocolonización de R. hominis. (A) Análisis de inmunofluorescencia de células de la lámina propia del colon ascendente con anti-CD3 y anti-FoxP3 en ratones C3H/HeN libres de gérmenes y monocolonizados con R. hominis (N = 8) y ratones C57BI/6 (N = 3). (B) Análisis de inmunofluorescencia de células de la lámina propia marcadas con (i) anti-Ly6G, (ii) anti-CD11b, (iii) anti-CD3 y (iv) anti-CD3 y anti-FoxP3 en el colon ascendente de ratones C3H/HeN g F y tratados con R. hominis. Datos expresados como número de células positivas por campo de visión en ratones GF (N = 7-8) y ratones tratados con R. hominis (N = 8-10). *P<0,05. Aumento original x630.
Figura 6. La flagelina de R. hom inis RH1 tiene efectos específicos sobre las células epiteliales intestinales y las células dendríticas derivadas de la médula ósea murinas. (A) Mapa de calor generado a partir de genes expresados diferencialmente en células epiteliales intestinales Caco-2 (N = 1) tratadas con diferentes flagelinas bacterianas de Salmonella enteritidis (SE), E. coli K12 (EC), RH1 y RH2. (B) Expresión de (i) CD40; (ii) I-A/I-E y (iii) CD103 por células dendríticas obtenidas de CD11c+B220+CD317+Flt3L de C3H/HeN convencionales, control (azul) y después de 24 h de incubación con flagelina recombinante (SE, K12, RH1, RH2; verde) determinada por citometría de flujo. El histograma representa datos de tres experimentos. (C) Frecuencias de poblaciones de células dendríticas obtenidas de Flt3L y Gm Cs F tratadas con flagelina recombinante (SE, K12, RH1, Rh 2) de C3H/HeN convencionales abiertos en células CD11c+B220+CD317+ y CD11c+CD11b+B220-, respectivamente. Los datos se presentan como porcentaje de células totales, vivas y de singlete, media ± SEM de tres experimentos. (D) La expresión de proteínas de las citocinas IL-10 e IL-12 se midió mediante CBA en sobrenadantes de DC de control (DC no estimuladas; N = 3) y DC tratadas con RH1 (N = 3) obtenidas de C3H/HeN y C57BI/6. Los datos se presentan como media ± D.E. ***P<0,001. (E) Análisis cuantitativo del marcaje inmunofluorescente de células de la lámina propia del colon ascendente con anti-CD3 y anti-FoxP3 en ratones TLR5KO monocolonizados con R. hominis y libres de gérmenes (N = 2 ).
Figura 7. R. hom inis atenúa la inflamación en un modelo experimental de colitis. Se usaron veintidós ratones hembra C57BL/6 para evaluar el efecto terapéutico de R. hominis durante la colitis inducida por DSS. A los ratones tratados se les administró una dosis diaria de 109 UFC de R. hominis durante 14 días. A partir del día 8, se administró DSS a los ratones en el agua de bebida durante 6 días. Los animales se sacrificaron el día 14 y se realizó un muestreo de tejido intestinal. (A) Los ratones DSS no tratados (N = 8) tuvieron una fuerte elevación de todos los genes en comparación con los ratones de control (N = 4), mientras que la expresión génica diferencial fue menor en los animales tratados con R. hominis (N = 10). Los resultados de la PCR en tiempo real se presentan como factor de cambio, ***P<0,001. (B) Puntuación de tejidos de histopatología presentada como porcentaje medio de campos de visión en un grado dado. El tratamiento con DSS alteró significativamente todos los campos de visión en los grados 0, 2, 3 y 4. R. hominis redujo significativamente el % de campos de visión para patología de grado 4 (p = 0.02) y aumentó el % de campos de visión para el grado 0. Los datos se presentan como media ± D.E. (C) Colon ascendente (teñido con hematoxilina/eosina) de animales IL-10KO de control, tratados con DSS y tratados con DSS/R hominis. Las imágenes mostradas son campos de visión representativos de cada grupo de tratamiento. Aumento original x100.
Figuras complementarias
Figura S1. R. hom inis coloniza preferentemente el colon ascendente de ratones monocolonizados. (A) R. hominis colonizó el colon ascendente del intestino del ratón con una asociación cercana de bacterias al epitelio del huésped, detectada por FISH usando A2-183 (sonda específica de R. hominis; FITC), Eub338 (sonda 16S universal; Cy3) y DAPI (núcleos; azul). También se muestran superposiciones de A2-183 Eub338 y Eub338 DAPI. La gamma del canal rojo se aumentó en la superposición de Eub338 DAPI para ilustrar las bacterias etiquetadas. Aumento original x630. (B) El análisis por PCR usando cebadores específicos de R. hominis mostró una fuerte señal positiva en la postcolonización del ADN fecal, mientras que las heces de los animales GF fueron negativas para la presencia de cualquier bacteria. (C) Análisis de PCR en tiempo real que muestra los niveles de colonización de R. hominis/g de heces. El ADN bacteriano aislado de las heces se comparó con concentraciones estándar conocidas de R. hominis cultivadas en cultivo. Se detectaron niveles bacterianos similares en todos los ratones monocolonizados, aproximados a 1x101° bacterias/g de heces. Las heces de animales GF resultaron negativas para la presencia de cualquier bacteria.
Figura S2. Análisis de ontología génica realizado en genes regulados positivamente a los 28 días en el colon ascendente. La interpretación funcional de los datos basada en la ontología génica (GO, por sus siglas en inglés) se realizó usando DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov). Se asignaron transcritos significativamente diferentes (P <0,05) en la categoría de GO "Proceso biológico" para encontrar términos de GO significativamente enriquecidos. Los procesos biológicos de GO para la "polimerización de actina" (GO: 0030041) y la "regulación negativa de la cascada de I-kappaB cinasa/NF-kappaB" (GO: 0043124) se vieron afectados.
Figura S3. Identificación de transcritos expresados diferencialmente en el intestino murino después de la monoasociación con E. coli. (A) Análisis de micromatrices Affymetrix de genes expresados diferencialmente en ratones colonizados con E. coli y R. hominis en el tiempo. Los gráficos de barras representan el mayor y el menor número de genes expresados después de 22 y 28 días, respectivamente. (B) Mapa de calor generado a partir de genes expresados diferencialmente con significación funcional en ratones colonizados con E. coli a los 22d frente a 10d.
Figura S4. Identificación de transcritos expresados diferencialmente en el intestino de ratón TLR5KO después de la monoasociación con R. hom inis. (A) Mapa de calor generado a partir de genes expresados diferencialmente en el colon ascendente de ratones TLR5KO colonizados con R. hominis (N = 3) y de tipo silvestre (N = 3) a los 28d. (B) Mapa de calor generado a partir de genes inmunoasociados expresados diferencialmente en el colon ascendente de ratones TLR5KO colonizados con R. hominis y de tipo silvestre a los 28d. (C) Mapa de calor generado a partir de genes expresados diferencialmente en el íleon de ratones TLR5KO colonizados con R. hominis y de tipo silvestre a los 28d. (D) Mapa de calor generado a partir de genes inmunoasociados expresados diferencialmente en el íleon de ratones TLR5KO colonizados con R. hominis y de tipo silvestre a los 28d.
Figura S5. Análisis de gene ontología génica realizado en genes regulados negativamente a los 28 días en el colon ascendente. Los procesos biológicos de GO implicados en la regulación del apetito, tales como la "regulación negativa de la respuesta a los alimentos" (GO: 0032096), la "regulación negativa del apetito" (GO: 0032099) y la "regulación de la secreción de catecolaminas" (GO: 0050433) fueron los más afectados.
Figura S6. La colonización por R. hom inis influye en los genes de saciedad y el peso corporal. Se realizó un análisis del peso corporal seco y de la canal lipídica. (A) El peso de la canal seca de los ratones asociados con R. hominis fue significativamente mayor en comparación con los animales GF. (B) El análisis de la canal lipídica mostró que la adiposidad total también fue significativamente mayor en los animales tratados con R. hominis a los 14d. Los datos se presentan como media ± D.E.
Figura 1A Representación del vector de clonación pCR-Blunt II-TOPO usado para clonar flagelinas recombinantes insolubles después de la lisis celular. Permite la clonación de ADN de alta eficiencia de productos de PCR de extremos romos. Codifica genes de resistencia a kanamicina y zeocin para la selección en E. coli, y el inserto está flanqueado por múltiples sitios de restricción para la escisión.
Figura 2A Representación del vector de expresión T7-MAT-Tag-FLAG- usado para clonar flagelinas recombinantes insolubles después de la lisis celular. El sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) está flanqueado por la secuencia MAT (etiqueta de afinidad por metales) y la secuencia del péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), lo que da como resultado la producción de flagelina de doble etiqueta, que puede purificarse adicionalmente mediante columnas de afinidad. Este vector de expresión también codifica un promotor pT7/lac (operón lac del fago T7) para la expresión de alto nivel inducible por IPTG de flagelinas recombinantes MAT-ORF-FLAG, un gen lacl interno que reprime la transcripción en el estado inicial en cualquier huésped de E. coli, y un gen AmpR para la selección de ampicilina.
Figura 3A Visualización en una SDS-PAGE de flagelina recombinante clonada con el vector de clonación pCR-Blunt II-TOPO y expresada a través del vector de expresión pT7-MAT-Tag-FLAG-2. Descripción de carriles: 1, estándar de proteína (kDa); 2, RH1.
Las figuras B1A y B1B muestran un análisis SDS de flagelinas recombinantes.
(A) K12 (Escherichia coli K12); ER (Eubacterium rectale 33656); RI1 (Roseburia intestinalis Fla 1);
RI2 (Roseburia intestinalis Fla 2);
(B) RH1 (Roseburia hominis Fla 1); RH2 (Roseburia hominis Fla 2); RI3 (Roseburia intestinalis Fla 3);
RI4 (Roseburia intestinalis Fla 4).
Figura C1-C4. Alineamiento de múltiples secuencias que confirma la secuencia de nucleótidos de flagelina y el número de acceso.
Figura D.2 Análisis comparativo de la inducción del gen CCL20 por diferentes flagelinas. Las células HT-29 y Caco-2 se estimularon durante 2 horas con una sola flagelina recombinante a una concentración de 100 ng/ml. El ARN total se extrajo y se sometió a análisis de PCR cuantitativo en tiempo real para los genes CCL20 y p-actina. Los experimentos se realizaron por triplicado en tres ocasiones distintas. La Tabla D2 indica diferencias significativas entre cada tratamiento calculado con la prueba de la t para datos emparejados en HT-29.
Figura D.3 Secreción de quimiocinas mediada por flagelina en células HT-29 y Caco-2. Las Tablas D3a, D3b, D3c y D3d indican diferencias significativas entre cada tratamiento calculadas con la prueba de la t para datos emparejados. Figura D4, neutralización de TLR5 con un anticuerpo específico anti-TLR5.
Figura D5A: Frecuencias de células dendríticas obtenidas de GM-CSF/IL-4 estimuladas con flagelinas recombinantes, datos mostrados como factor de cambio en comparación con células dendríticas obtenidas de GM-CSF/IL-4 sin estimular.
Figura D5B: Frecuencias de células dendríticas obtenidas de Flt3L estimuladas con flagelinas recombinantes, datos mostrados como factor de cambio en comparación con células dendríticas obtenidas de Flt3L sin estimular.
Figura D 6 Análisis de citometría de flujo A y B de los Treg FoxP3+ en la lámina propia de ratones BOY/J WT y TLR5KO tratados con R. hominis.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Flagelina
La flagelina es el sustituyente principal del flagelo bacteriano, y está presente en grandes cantidades en bacterias casi completamente flageladas. Típicamente, flagelinas son proteínas globulares que se disponen en un cilindro hueco para formar el filamento en flagelo bacteriano.
La diversidad de proteínas estructurales y secuencias génicas de flagelina es bien reconocida y varía según la especie bacteriana, los orígenes geográficos, clínicos y ambientales. Hay miles de flagelinas y genes de flagelina relacionados. Algunas de las importantes en las bacterias intestinales incluyen las flagelinas FLA, FliC, FlgC, FLiE, FlaB, MoA y FliG.
Existen varios tipos de polipéptidos FLA (Fla). FlaA1, FlaA2, FlaA3, FlaA4 y FlaB son ejemplos de polipéptidos FLA.
Polipéptido FlaA1
El término "polipéptido FlaA1", como se usa en esta invención, se refiere a la proteína flagelina FlaA1. Los ejemplos de dichos polipéptidos incluyen el polipéptido FlaA1 de Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans; la secuencia de polipéptidos mostrada como la SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6; y polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID No 6 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos.
La SEQ ID NO 2 tiene la siguiente secuencia: La
MVVQHNLTAMNANRQLGITTGAQAKSSEKLSSGYKINRAADDAAGLTISEKMRSQV
RGLNKASDNAQDGVSLIQVAEGALSETHSILQRMNELATQAANDTNTTSDRTAVQQ
EINQLASEITRIASTTQFNTMNLIDGNFTSKKLQVGSLCGQAITIDISDMSATGLGVSG
LVVSSFSAAGKAMSAAQDAISYVSSMRSKLGALQNRLEHTISHLDNISEHTSSAESRI
RDTDMAEEMVEYSKNNILAQAGQSMLAQANQSTQGVLSLLQ
SEQ ID NO 2 se deposita en el NCBI con el número de acceso ABI48297.1.
Los términos "polipéptido FlaA1" y "polipéptido FlaA1" se usan indistintamente en esta invención.
Los términos "FlaA1", "Fla1" y "RH1" pueden usarse indistintamente en esta invención.
En una realización, el polipéptido FlaA1 tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 2 o con variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos. En una realización, los aminoácidos en las posiciones 79 a 117 y las posiciones 408 a 439, así como 411,412, 420 de la SEQ ID NO 2 (o equivalentes de las mismas) se consideran importantes. En una realización, los aminoácidos en las posiciones 411, 412, 420 de la SEQ ID No 2 (o equivalentes de las mismas) son alanina (A), glutamina (Q) y serina (S), respectivamente.
En una realización, el polipéptido FlaA1 es el polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6.
Los polipéptidos FlaA1 se pueden obtener de determinados microorganismos. En una realización, el polipéptido FlaA1 se obtiene a partir de una bacteria tal como Firmicute. En una realización adicional, el polipéptido FlaA1 se obtiene de una Roseburia spp tal como una Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis o Roseburia inulinivorans.
Roseburia hominis y Roseburia intestinalis son anaerobios intestinales comensales descritos recientemente del grupo filogenético XIVa dentro del filo Firmicutes, que pertenecen a un grupo dominante de bacterias en el intestino humano y también son productores importantes de butirato. Un ejemplo de Roseburia hominis es la cepa depositada bajo los términos del Tratado de Budapest en las National Collections of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB) en NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Reino Unido, AB21 9YA, el 21 de octubre de 2004 por el Rowett Research Institute con el número de acceso NCIMB 14029T A2-183T (DSM = 16839T) de Roseburia hominis. Otro ejemplo es la especie bacteriana Roseburia hominis como se describe en Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B. y Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441. Un ejemplo de Roseburia intestinalis es la cepa depositada con el número de acceso NCIMB 13810 L1-82T (DSM = 14610 T) de Rosburia intestinalis Otro ejemplo es la especie bacteriana Roseburia hominis como se describe en Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B. y Flint, H. J. (2006) Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 56: 2437-2441.
La expresión "secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido FlaA1", como se usa en esta invención, se refiere a una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína flagelina FlaA1. Los ejemplos de dichas secuencias de polinucleótidos incluyen el gen FlaA1 de R. hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis o Roseburia inulinivorans; la secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 o SEQ ID No 5; secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6; secuencias de polinucleótidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 1 o SEQ ID No 5 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de las mismas; y secuencias de polinucleótidos que codifican el polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6 o que codifican un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con el polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados del mismo.
La SEQ ID NO 1 tiene la siguiente secuencia: La
AT GGT AGT ACAGCACAAT CTT ACAGCAAT G AACGCT AACAG ACAGTT AGGT AT CA
CAACAGGCGCACAGGCT AAGT CTT CT G AG AAGTT AT CTT CT GGTT ACAAG AT CAA
CCGCGCAGCAG AT G ACGCAGCAGGT CTT ACG ATTT CCG AG AAG AT G AG AAGCC
AGGTT AG AGGCTT AAAT AAAGCTT CT G ACAACGCACAGG AT GGT GT AT CCCTT AT
T CAGGT AGCT GAGGGT GC ATT AAGT G AG ACACACT CCAT CTT ACAGCGT AT G AA
T G AGTT AGCAACT CAGGCAGCAAACG AT ACCAAT ACAACCT CAG ACAG AACT GC
AGTT CAGCAGG AG AT CAACCAGTT AGCAT CT G AG AT CACCAG AAT CGCTT CT AC
AACT CAGTT CAACACAAT G AACCT G AT CG AT GGT AACTT CACAAGT AAG AAGCTT
CAGGT AGGTT CCCTTT GCGG ACAGGCT AT CACAAT CG AT AT CT CT G AT AT GT CT G
CT ACAGGT CTT GGCGTT AGCGG ATT AGT AGT AT CTT CCTT CT CT GC AGCT GGT AA
GGCAAT GT CT GCAGCT CAGG AT GCT AT CAGCT ACGT AT CTT CT AT GCGTT CT AAG
CT GGGT GCATT ACAGAACAG ACTT G AGCACACAAT CT CCCACCT GGACAACATT
T CT GAGCACACAT CTT CT GCAG AGT CT CGT AT CCGT G AT ACAG AT ATGGCT G AA
G AG AT GGTT G AGT ACAGCAAG AACAACAT CCTT GCT CAGGCAGGACAGT CT AT G
CTT GCT CAGGCT AACCAGT CT ACT CAGGGT GT ATT AT CCTT ATT ACAGT AA
SEQ ID NO 1 se deposita en el NCBI con el número de acceso DQ789140.1.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido FlaA1 tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con la secuencia de polinucleótidos mostrada en la SEQ ID NO 1 o SEQ ID No 5 o con variantes, homólogos, fragmentos o derivados del mismo.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido FlaA1 codifica un polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6 o un polipéptido que tiene al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con el polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6 o con variantes, homólogos, fragmentos o derivados del mismo.
En una realización, el polipéptido FlaA1 es un polipéptido FlaA1 truncado. Por ejemplo, el polipéptido truncado comprende al menos 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 aminoácidos del polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2 o SEQ ID No 6.
Sin desear quedar ligado a la teoría, dos regiones esenciales de la proteína flagelina implicadas en el reconocimiento y la activación de TLR5 son los aminoácidos 79-117 de SEQ ID NO 2 (dominio N-D1) y los aminoácidos 408-439 de SEQ ID NO 2 (dominio C-D1). Sin desear quedar ligado a la teoría, los aminoácidos: A411, Q412, S420 son aminoácidos importantes.
Los ejemplos de polipéptidos FlaA1 truncados incluyen: polipéptidos que comprenden los aminoácidos 79-117 y los aminoácidos 408-439 de SEQ ID NO 2; polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con los aminoácidos 79-117 y los aminoácidos 408-439 de SEQ ID NO 2; polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con los aminoácidos 79­ 117 y los aminoácidos 408-439 de SEQ ID NO 2, donde el aminoácido en la posición 411 (o equivalente a la misma) es alanina (A) y/o el aminoácido en la posición 214 es glutamina (Q) y/o el aminoácido en la posición 420 es serina (S); polipéptidos que comprenden los aminoácidos 79-439 de SEQ ID NO 2; polipéptidos que comprenden los aminoácidos 79-439 de SEQ ID NO 2 donde el aminoácido en la posición 411 (o equivalente a la misma) es alanina (A); polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con los aminoácidos 79-439 de SEQ ID NO 2; y polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con los aminoácidos 79-439 de SEQ ID NO 2 donde el aminoácido en la posición 411 (o equivalente a la misma) es alanina (A) y/o el aminoácido en la posición 214 es glutamina (Q) y/o el aminoácido en la posición 420 es serina (S).
En una realización, los aminoácidos en las posiciones 411,412, 420 de SEQ ID NO 2 (o equivalentes de las mismas) en un polipéptido FlaA1 truncado son alanina (A), glutamina (Q) y serina (S), respectivamente.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido FlaA1 codifica un polipéptido FlaA1 truncado.
En una realización, el polipéptido FlaA1 es un polipéptido de fusión. Por ejemplo, el polipéptido se fusiona con la glutatión S-transferasa (GST).
Género Roseburia
Las bacterias Roseburia son células en forma de bastón ligeramente curvadas que son estrictamente anaerobias y originarias del intestino de los mamíferos. Las bacterias son productoras de butirato y se mueven activamente a través de múltiples flagelos presentes a lo largo del lado cóncavo y en un grupo en un extremo (Stanton y Savage 1983). Actualmente, dentro del género Roseburia, se han identificado y caracterizado cinco especies: Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia hominis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans (Stanton y Savage 1983, Duncan et al 2006).
Stanton y Savage (1983 - Roseburia cecicola gen. nov., sp. nov., a motile, obligately anaerobic bacterium from a mouse cecum. Int. J. Syst. Bacteriol., 1983, 33, 618-627.) describen Roseburia cecicola.
Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) describen Roseburia faecis.
Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) describen Roseburia hominis.
Duncan et al. (2002 - Roseburia intestinalis sp. nov., a novel saccharolytic, butyrate-producing bacterium from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52, 1615-1620) describen Roseburia intestinalis.
Duncan et al. (2006 - Proposal of Roseburia faecis sp. nov., Roseburia hominis sp. nov. and Roseburia inulinivorans sp. nov., based on isolates from human faeces. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2006, 56, 2437-2441) describen Roseburia inulinivorans.
Flagelina de Roseburia
La expresión "flagelina de Roseburia", como se usa en esta invención, se refiere una proteína flagelina obtenida o que puede obtenerse a partir de una bacteria Roseburia, tal como Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans.
La flagelina de Roseburia puede ser flaA1, flaA2, flaA3, flaA4 o combinaciones de las mismas.
Los términos "FlaA1", "Fla1", "flaA1" y "fla1" se usan indistintamente en esta invención.
Los términos "FlaA2", "Fla2", "flaA2" y "fla2" se usan indistintamente en esta invención.
El término Fla se usa en esta invención para abarcar los polipéptidos que pueden ser flaA1, flaA2, flaA3 flaA4 o fliC. En una realización, la presente invención abarca el uso de al menos una flagelina de Roseburia. Por ejemplo, la presente invención abarca el uso de una combinación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco flagelinas de Roseburia.
En algunas realizaciones, la combinación de flagelinas de Roseburia comprende flagelinas que se obtienen o pueden obtenerse a partir de al menos dos, tres, cuatro o cinco especies diferentes de Roseburia.
Los ejemplos de flagelinas de Roseburia incluyen flagelinas obtenidas o que pueden obtenerse a partir de la bacteria Roseburia, tal como Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans. En una realización, la flagelina se obtiene o puede obtenerse a partir de Roseburia hominis. En otra realización, la flagelina se obtiene o puede obtenerse a partir de Roseburia intestinalis.
Los ejemplos de flagelinas de Roseburia incluyen secuencias de polipéptidos que tienen al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos.
En una realización, la flagelina de Roseburia tiene la secuencia de polipéptidos mostrada como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12.
Los ejemplos de flagelinas de Roseburia hominis son Fla1 y Fla2 de Roseburia hominis.
Un ejemplo de Fla1 de Roseburia hominis se muestra como la SEQ ID NO 2. Fla1 de Roseburia hominis también se denomina en esta invención RhFlaA1, RHFlaA1, RhFla1, RHFla1, RH1 o Rh1.
SEQ ID NO 2 tiene la siguiente secuencia:
MVVQHNLTAMNANRQLGITTGAQAKSSEKLSSGYKINRAADDAAGLTISEKMRSQVRGLNK
ASDNAQDGVSLIQVAEGALSETHSILQRMNELATQAANDTNTTSDRTAVQQEINQLASEITRI
ASTTQFNTMNLIDGNFTSKKLQVGSLCGQAITIDISDMSATGLGVSGLVVSSFSAAGKAMSA
AQDAISYVSSMRSKLGALQNRLEHTISHLDNISEHTSSAESRIRDTDMAEEMVEYSKNNILAQ
AGQSMLAQANQSTQGVLSLLQ SEQ ID NO 2 se deposita en el NCBI con el número de acceso ABl48297.1.
Un ejemplo de Fla2 de Roseburia hominis se muestra como la SEQ ID NO 4. Fla2 de Roseburia hominis también se denomina en esta invención RhFlaA2, RHFlaA2, RhFla2, RHFla2, Rh2 o RH2.
SEQ ID NO 4 tiene la siguiente secuencia:
MVVNHNMAAICESRQLRYNVKKMEKSSKKLATGYKLNTANDDAAGLQISETMRHHVKGLNK
ASRNSQDGISMLQTADAALQETQDVLDRMVELTTQAANDINTDSDRRAIQDELDQLNKEVD
RIAYTTHFNQQYMLAEGTPQAAPGYYRIQSGALNGQAIDIHFVNASKESLGTDKVNVSSHAK
ASESITMVQDAIEQAALWRDEFGSQQERLEHAVRNTDNTSQNTQSAESGIRDTNMNMEMV
LYSTNRILVHASQSILAQYNDDAKSVLEILK
Los ejemplos de flagelinas de Roseburia intestinalis incluyen Fla1, Fla2, Fla3 y Fla4 de Roseburia intestinalis. Un ejemplo de Fla1 de Roseburia intestinalis se muestra como SEQ ID No 6. Roseburia intestinalis también se denomina en esta invención RiFlaA1, RIFlaA1, RiFla1, RIFla1, Ri1 o RI1.
SEQ ID NO 6 tiene la siguiente secuencia:
MRINYNVSAAIANKHLLGIEDNLSASMERLSSGLKINHSKDNPAGMAISNKMKAQIDGLNRAS
QNASDGISVIQIADGALSETTSILQRMRELSVQAASDATMTPADKEAIQKEITSLKDEVDRIST
DTEYNSKTLLDGSLDTRVYTKNATRVDISDHVKAGQYQLSIDTAATQAGPVTANQNYNSTAP
VGASGTMSINGSKVEIEAADTYAEAFEKIRNAAETGETTVKIEKNGALSFTAEQYGMSSILEIA
FDDKQLANALGFTADGGNSVVEDPENKGSYVYGQIQNGKVIVPSGTDAEVTLTKPSDGTGF
GDTATVKTDGNKITVTDRAGFEMSFLADAGYTGKLDFDVTDIGTMALHIGANEDQETRVRIP
EVSCKSLYIDDADVTTVNGAGRGITQFDDAISKVSEVRSRLGAYQNRLESTVSSLDTFEENM
TGAQSRLTDADMASEMTDYTHQNVLNQAAISVLTQANDLPQ
Un ejemplo de Fla2 de Roseburia intestinalis se muestra como SEQ ID No 8. Fla2 de Roseburia intestinalis también se denomina en esta invención RiFlaA2 o RIFlaA2 o Ri2 o RI2.
SEQ ID NO 8 tiene la siguiente secuencia:
MVVNHNMALICESRQLRCNVKNMEKSSKKLATGYKLLGANDDAAGLQISETMRHQTRGLN
KASRNSQDGISMLQTADAALQETQEVLDRMTDLTTQAANDINTDADRRAIQDEIDQLNQEVD
RIAYTTNFNQQYILADGTPQARPGYYMIQTGSLAGQGIEIKFVNASKESLGVDKVDVSSHAK
ATESIAVVQNAIEKAASFRDTFGAQQERLEHALRGTDNTSESTQRAESSRRDTNMNMEMV
QYSTNRILVQASQSILAQYNDDAKYVLEMLKQVLQILQ
Un ejemplo de Fla3 de Roseburia intestinalis se muestra como SEQ ID No 10. Fla3 de Roseburia intestinalis también se denomina en esta invención RiFla3 o RIFla3 o Ri3 o RI3.
SEQ ID NO 10 tiene la siguiente secuencia:
MVVQHNMTAMNANRMLGVTTSAQAKSSEKLSSGYRINRAGDDAAGLTISEKMRSQIRGLN
KASDNAQDGISLIQVAEGALSETHSILQRMNELATQAANDTNTTADRGAIQDEINQLTSEINRI
SSTTQFNTQNLIDGTFANKNLQVGSICGQRITVSIDSMSAGSLNVSANLVKVNTFSAAGEAM
SNIQGAISAISTQRSYLGALQNRLEHTISNLDNISENTQSAESRIRDTDMAEEMVTYSKNNILA
QAGQSMLAQANQSTQGVLSLLQ
Un ejemplo de Fla4 de Roseburia intestinalis se muestra como SEQ ID No 12. Fla4 de Roseburia intestinalis también se denomina en esta invención RiFla4 o RIFla4 o Ri4 o RI4.
SEQ ID NO 12 tiene la siguiente secuencia:
MAMVVQHNMSAMNANRNLGVTTGMQAKSSEKLSSGYKINRAADDAAGLSISEKMRSQIR
GLNKASDNAQDGISLIQTAEGALNESHSILQRMRELSVQAANGTETDDDREAVQNEVSQL
QEELTRISETTEFNTMKLLDGSQSGSTSSTGSGPKFGVVDATLDGALVTSNVKGIKVATAA
ATTTKAGQETAIWAADGKTLTLNLSKNKVYTQDEIDDLIANAKQEDSSATGAPAEVKVSLK
NGIFNADADTTAGTVTAGGVKAVSDEGTVTGFVGADTISFTANKYGAEFNDTVFKFKFDKA
AGKEEVETNTAIEIDGANAVTAGEYTIHLAAGKEYTAEDLEDVLKTAGFDFDVKLSGNTPDE
PNTLFATSGASTVTDITMGAGTAGAGLGSTDAMWGQAGYDSVSSGAGITLQIGANEGQT
MSFSIDDMSARALGVDGNKVDLSTQAGAQKATDTIDAAIKKVSAQRGRMGAIQNRLEHTIS
NLDTAAENTQTAESRIRDTDMAEEMVEYSKNNILAQAGQSMLAQANQSTQGVLSLLQ
Los términos "polipéptido FlaA1", "polipéptido FlaA1", "polipéptido Fla1" y "polipéptido Fla1" se usan indistintamente en esta invención. Los términos "polipéptido Fla2" y "polipéptido Fla2" se usan indistintamente en esta invención. Los términos "polipéptido Fla3" y "polipéptido Fla3" se usan indistintamente en esta invención. Los términos "polipéptido Fla4" y "polipéptido Fla4" se usan indistintamente en esta invención.
En una realización, la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en Fla1, Fla2, Fla3 y Fla4. En una realización, la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en Fla2, Fla1, Fla4 y combinaciones de las mismas. En una realización adicional, la flagelina de Roseburia es Fla2.
En una realización, la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en Fla1 de Roseburia hominis, Fla2 de Roseburia hominis, Fla1 de Roseburia intestinalis, Fla2 de Roseburia intestinalis, Fla3 de Roseburia intestinalis y Fla4 de Roseburia intestinalis. En una realización, la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en Fla2 de Roseburia hominis, Fla2 de Roseburia intestinalis, Fla1 de Roseburia intestinalis, Fla4 de Roseburia intestinalis y combinaciones de las mismas. En una realización adicional, la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en Fla2 de Roseburia hominis, Fla2 de Roseburia intestinalis y combinaciones de las mismas. En otra realización, la flagelina de Roseburia es Fla2 de Roseburia intestinalis.
En una realización, la presente invención abarca el uso de al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de Roseburia. Por ejemplo, la presente invención abarca el uso de una combinación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia. En una realización, la presente invención abarca el uso de una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una flagelina de Roseburia. Por ejemplo, la presente invención abarca el uso de una secuencia de polinucleótidos que codifica una combinación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia.
La secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de Roseburia puede codificar flaA1, flaA2, fla3, fla4 o combinaciones de las mismas.
En algunas realizaciones, la combinación de secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia comprende secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas que se obtienen o pueden obtenerse a partir de al menos dos, tres, cuatro o cinco especies diferentes de Roseburia.
En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos codifica una combinación de flagelinas de Roseburia que se obtienen o pueden obtenerse a partir de al menos dos, tres, cuatro o cinco especies diferentes de Roseburia. En otra realización, la presente invención abarca el uso de una combinación de al menos una flagelina de Roseburia y al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de Roseburia.
Los ejemplos de secuencia de polinucleótidos que codifica flagelinas de Roseburia incluyen flagelinas obtenidas o que pueden obtenerse a partir de la bacteria Roseburia, tal como Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans. En una realización, la secuencia de polinucleótidos codifica una flagelina de Roseburia obtenida o que puede obtenerse a partir de Roseburia hominis. En otra realización, la secuencia de polinucleótidos codifica una flagelina de Roseburia obtenida o que puede obtenerse a partir de Roseburia intestinalis.
Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican flagelina de Roseburia incluyen las secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SeQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de las mismas y secuencias de polinucleótidos que tienen al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID n O 9 o SEQ ID NO 11 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de las mismas.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia tiene la secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia mostrada como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia tiene la secuencia de polinucleótidos mostrada como SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 11.
Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia hominis son secuencias de polinucleótidos que codifican Fla1 y Fla2 de Roseburia hominis.
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla1 de Roseburia hominis se muestra como la SEQ ID NO 1.
La SEQ ID No 1 tiene la siguiente secuencia:
AT GGT AGT ACAGCACAAT CTT ACAGCAAT G AACGCT AACAG ACAGTT AGGT AT CACAAC
AGGCGCACAGGCT AAGT CTT CT G AG AAGTT AT CTT CT GGTT ACAAG AT CAACCGCGCAG
CAG AT G ACGCAGCAGGT CTT ACG ATTT CCG AG AAG AT G AGAAGCCAGGTT AG AGGCTT
AAAT AAAGCTT CT GACAACGCACAGG AT GGT GT AT CCCTT ATT CAGGT AGCT G AGGGT G
CATT AAGT GAG ACACACT CCAT CTT ACAGCGT AT G AAT G AGTT AGCAACT CAGGCAGCA
AACG AT ACCAAT ACAACCT CAG ACAG AACT GCAGTT CAGCAGG AG AT CAACCAGTT AGC
AT CT G AG AT CACCAG AAT CGCTT CT ACAACT CAGTT CAACACAAT GAACCT G AT CG AT GG
T AACTT CACAAGT AAGAAGCTT CAGGT AGGTT CCCTTT GCGG ACAGGCT AT CAC AAT CG
AT AT CT CT GAT AT GT CT GCT ACAGGT CTT GGCGTT AGCGG ATT AGT AGT AT CTT CCTT CT
CT GCAGCT GGT AAGGCAAT GT CT GCAGCT CAGG AT GCT AT CAGCT ACGT AT CTT CT AT G
CGTT CT AAGCT GGGT GC ATT ACAG AACAG ACTT G AGCACACAAT CT CCCACCT GG ACAA
CATTT CT G AGCACACAT CTT CT GCAG AGT CT CGT AT CCGT GAT ACAG AT ATGGCT GAAG
AG AT GGTT G AGT ACAGCAAG AACAACAT CCTT GCT CAGGCAGG ACAGT CT AT GCTT GCT
CAGGCT AACCAGT CT ACT CAGGGT GT ATT AT CCTT ATT ACAGT AA
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia hominis se muestra como la SEQ ID NO 3.
La SEQ ID No 3 tiene la siguiente secuencia:
AT GGT GGTT AAT CAT AAT AT GGCGGCAAT CT GT G AG AGCAGGCAGCT GCGCT AT AACGT
G AAG AAG AT GG AAAAAT CTT CCAAAAAGCTT GCG ACAGGGT ACAAGCT G AACACAGCAA
AT GAT G AT GCGGCAGGCTTGCAG AT AT CAG AG ACG AT GCGGCAT CAT GT G AAAGGGCT
G AACAAAGCCT CCCGG AATT CACAGG ACGGCAT CAGT ATGCT GCAGACGGCGG AT GCA
GCGCT CCAAG AG ACGCAGG AT GTT CT CG AT CGT AT GGT GG AGCT G ACG ACGCAGGCAG
CCAAT GACAT CAACACAG ACT CGG AT CGCAGGGCT ATT CAGG AT GAGTT GG AT CAGCT G
AACAAGG AAGT GG ACCGCAT CGCCT AT ACG ACGCACTT CAAT CAGCAGT AT AT GTT GGC
GG AGGGAACGCCGCAGGCGGCACCGGG AT ATT ACCGCAT ACAGT CCGGGGCACT G AA
CGG ACAGGCG AT AG AT AT CCATTTT GT AAAT GCG AGC AAGG AG AGCCTT GGCACAG AC
AAAGT GAAT GT AT CTT CGCAT GCG AAGGCGT CGG AAT CCAT CACG AT GGTT CAGGACGC
G ATT GAACAGGCGGCGCT CT GG AG AG ACG AGTT CGGCAGCCAGCAGG AGCGT CT GG A
ACAT GCCGT GCGCAAT ACGG ACAACACAT CACAAAAT ACGCAG AGT GCGG AGT CAGGG
AT CAG AGACACCAACAT GAAT AT GG AG AT GGT ATT AT ATT CG ACCAACCGG ATT CT GGT
GCAT GC AT CCCAG AGT ATT CT GGCACAGT AT AAT GAT GAT GCAAAAT CAGT GCTT GAGA
TTTTGAAATAG
Los ejemplos de secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia intestinalis son secuencias de polinucleótidos que codifican Fla1, Fla2, Fla3 y Fla4 de Roseburia intestinalis.
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla1 de Roseburia intestinalis se muestra como la SEQ ID NO 5.
La SEQ ID No 5 tiene la siguiente secuencia:
AT GCGT GGCGG AGACAAT AG AAGG AGAAACAG AAT G AG AATT AATT ACAAT GT GT CAGC
AGCG ATTGCG AAT AAACATTT ACTT GG AATT GAGG AT AATTT AAGT GCAT CG AT GG AACG
GCTTT CAT CGGG ACTT AAG AT CAACCATT CCAAGG ACAAT CCGGCAGG AAT GGCT ATTT
CCAACAAG AT G AAAGCACAG ATT GAT GGTTT AAACCGGGCTT CCCAG AAT GCAT CGG AT
GGT ATTT CT GTT ATT CAG AT CGCAG AT GGT GCGCT GAGT G AAACG ACCAGT ATTTT ACA
GCGT AT G AGAGAACTTT CCGT GCAGGCAGCG AGT GAT GCAACAAT G ACACCGGCGG AT
AAAG AAGCAAT CCAG AAAG AAAT CACTT CATT AAAAG AT G AAGTT G ACCGT ATTT CT ACA
GAT ACAGAGT AT AACAGCAAAACACTTTT AG AT GGTT CATT AG AT ACCAGGGTTT ACACC
AAAAATGCAACAAGAGT GGACATTT CT GAT CAT GT GAAAGCAGGACAGT AT CAGCTTT C
CATT G AT ACT GC AGCT ACACAGGCCGG ACCGGT AACAGCAAAT CAG AATT AT AATT CCA
CAGCACCGGT CGGT GCGT CCGG AACAAT G AGT ATT AAT GGTT CT AAAGT AG AG AT AG AG
GCAGCCG ACACCT AT GCGG AGGCTTTT G AG AAG AT CAG AAAT GCAGCAG AG ACT GGT G
AAACAACCGTT AAG ATT G AAAAG AAT GG AGCACTTT CATTT ACCGCAG AACAGT ACGG A
AT GT CAAGCAT CTT AG AG AT CGCATTNNT GAT GAT AAGCAGCTTGCT AAT GCACTTGG AT
TT ACAGCAG ACGG AGG AAACAGT GTT GT AG AAG AT CCAG AG AAT AAAGGCAGCT AT GT A
T ACGG ACAGATT CAG AAT GGCAAAGT GAT CGT ACCTT CCGGT ACAG AT GCCG AAGT AAC
GCT CACAAAACCG AGT G ATGG AACCGG ATTT GGT GAT ACAGCT ACGGT AAAAACAG AT G
G AAAT AAGATT ACGGTT ACAG ACAG AGCCGGATTT G AG AT GT CATTT CTT GCT GAT GCA
GGTT AT ACGGGT AAGCT GG ATTTT GAT GT CACGG AT AT CGG AACG AT GGCACTT CAT AT
T GG AGCAAAT GAGG AT CAGG AAACAAG AGT GCGT ATT CCGG AGGTTT CCT GCAAG AGC
CTTT ACATT GAT GAT GCAG ACGT G ACG ACT GT AAAT GG AGCAGGCAG AGGT AT CACACA
GTTT G ACG AT GCCATTT CAAAGGT CAGT G AAGT GCGTT CAAG ACTT GGT GCAT ACCAG A
AT CGT CTT G AG AGT ACGGT AT CAAGCCT GG AT ACGTTT G AAG AAAAT AT G ACAGG AGCC
CAGT CACG ACT GACAG AT GCGG AT AT GGCAT CGG AAAT G ACAGATT AT ACACAT CAG AA
T GT ATT AAAT CAGGC AGCAAT CT CT GTTTT G ACACAGGCAAACG AT CT GCCACAGCAGG
T ATT GCAG ATT CT GC AGT AA
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia intestinalis se muestra como la SEQ ID NO 7.
La SEQ ID No 7 tiene la siguiente secuencia:
AT GGT AGTT AAT CAT AAT AT GGCATT GAT CT GT G AG AGT AG ACAGTT ACG AT GT AAT GT G
AAG AACAT GGAG AAGT CTT CAAAAAAGCT GGCAACAGGTT AT AAATT GCTTGG AGCAAA
T GAT GAT GC AGCAGGATT ACAG AT AT CAG AAACCAT GCGT CAT CAG ACCAG AGGT CTT A
ACAAAGCAT CCAG AAATT CGCAAG AT GG AATT AGT AT GCT GCAG ACAGCAGAT GC AGCA
TT ACAGG AGACACAGG AAGT GTT GG AT CG AAT G ACGG AT CT G ACAACACAGGCAGCT A
AT GAT AT CAAT ACGG AT GCGG AT CGT CGT GCAATT CAGG AT G AAAT CG AT CAGTT AAAT C
AGG AAGT GGAT CGT ATT GCAT AT ACG ACG AATTTT AAT CAGCAGT AT AT ATT AGCGG AT G
G AACT CCGCAGGCAAG ACCAGG AT ACT AT AT GAT ACAG ACAGG AAGT CTT GCGGG ACA
GGG AAT AG AG ATT AAGTTT GTT AAT GCG AGCAAAG AG AGCTT GGGT GT GG ACAAGGTT G
AT GT AT CAT CGCAT GCAAAAGCG ACAG AAT CT AT AGCAGT GGT ACAG AAT GCAATT G AA
AAGGCAGCTT CGTTT AG AG AT ACATTT GGGGCACAAC AGG AGCGGTT AG AACACGCATT
GCGT GG AACGG AT AAT ACAT CAG AAAGT ACACAG AGGGCAG AAT CAAGT AG ACGCG AT
ACCAACAT G AAT AT GG AG AT GGT ACAAT ATT CT ACAAACCGT ATTTT AGT ACAGGCAT CT
CAG AGT ATTTT AGCACAGT ACAAT GAT GAT GCAAAAT AT GT GTT GG AAAT GTT AAAAT AG
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla3 de Roseburia intestinalis se muestra como la SEQ ID NO 9.
La SEQ ID No 9 tiene la siguiente secuencia:
AT GGT AGT ACAGCACAAT AT G ACCGCAAT G AAT GCG AACAG AAT GTT AGGCGTT ACAAC
AAGCGCACAGGCAAAAT CTT CAG AG AAATT AT CTT CT GGTT ACAG AAT CAACCGT GCAG
GT G AT G ACGCT GCT GGTTT AACAATTT CT G AG AAG AT G AG AAGCCAG AT CCGT GG ATT A
AACAAAGCTT CT G ACAACGCACAGG AT GGT ATTT CCTT AAT CCAGGTT GCT G AGGGT GC
ATT AT CT G AG AC ACATT CT AT CTT ACAGCGT AT GAAT G AGTT AGCT ACT CAGGCT GCT AA
CG AT ACCAAT ACAACT GCT G AT AG AGG AGCT ATT CAGG AT G AG AT CAACCAGTT AACAT
CT G AGATT AACAG AAT CT CTT CT ACAACT CAGTT CAAT ACT CAG AACCT CAT CG AT GGT A
CATT CGCAAAT AAAAACCTT CAGGTT GGTT CT AT CT GT GG ACAG AG AATT ACT GTTT CT A
T CG ACAGT AT GT CT GCT GGT AGCTT AAAT GT AT CT GCT AACTT AGT AAAGGTT AACACTT
T CAGT GC AGCAGGT GAAGCAAT GT CCAAT ATT CAGGGT GCT ATTT CT GCAATTT CT ACAC
AGCGTT CTT ACTT AGGAGCT CTT CAG AAT CGT CT GG AGCAT ACAAT CT CCAACTT GG ACA
ACATTT CT GAG AAT ACT CAGT CT GCT GAAT CT CGT AT CCGT G AT ACAGAT AT GGCT GAAG
AG AT GGTT ACTT ACAGCAAG AACAAT ATT CTT GCT CAGGCAGG ACAGT CT AT GCTT GCTC
AGGCT AACCAGT CT ACT CAGGGT GT ACTTT CT CT GTT ACAGT AA
Un ejemplo de una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla4 de Roseburia intestinalis se muestra como la SEQ ID NO 11.
La SEQ ID No 11 tiene la siguiente secuencia:
AT GGCAAT GGT AGT ACAGCACAACAT GT CCGCAAT GAAT GCG AACAG AAATTT AGGT GT
T ACAACAGG AAT GCAGGCAAAAT CAT CAG AG AAGTT AT CTT CCGGTT ACAAG AT CAACC
GT GCAGCAG AT GAT GCAGCAGG ACTTT CT ATTT CT GAG AAG AT GAG AAGCCAG AT CCGC
GGTTT AAAT AAAGCAT CT G ACAAT GCACAGG AT GGT AT CT CTTT AAT CCAG ACCGCT GAG
GG AGCATT AAAT G AGT CCCACT CT ATTTT ACAG AG AAT GAG AG AGTT AT CCGT ACAGGC
AGCCAACGGT ACAG AG ACAG AT G ACG ACCGCG AGGCAGT ACAG AACG AGGTTT CCCAG
TT ACAGG AAG AGCT G ACAAG AATTT CT G AG ACAACAG AGTT CAACACG AT G AAGCT GCT
GG AT GGTT CT CAG AGT GG AAGT ACAT CTT CAACCGGGT CAGGT CCGAAGTTT GGT GTT G
T AG AT GCAACATT AG ACGGT GCACTT GT AACAT CT AACGT G AAAGGT ATT AAAGT AGCAA
CAGCAGCT GCCACAACAACAAAGGCAGGT CAGG AG ACT GCT AT CT GGGCT GCT GAT GG
AAAG ACATT AACTTT AAAT CTTT CG AAAAAT AAGGT AT AT ACACAGG ACG AAATT GAT G AC
TT GAT CGCAAAT GCAAAACAGG AAG ACAGTT CT GCAACGGGT GCACCGGCT G AAGT GA
AAGT AT CTTT AAAG AAT GGT ATTTTT AAT GCAG AT GCAG ACACAACT GCCGG AACT GT AA
CAGCCGGT GGT GT G AAGGCAGT AT CT GAT G AAGG AACAGT AACT GGATTT GTT GGT GC
AG AT ACAATTT CATTT ACGGCAAAT AAGT AT GG AGCAG AGTT CAAT GAT ACT GT ATTT AAA
TT CAAATTT G AT AAGGCAGCAGGCAAAG AAG AAGT AG AG ACAAAT ACAGCAATT G AAATT
G AT GG AGCAAAT GCGGT AACAGCAGGT G AAT AT ACAATT CAT CTT GCAGCAGGCAAAG A
AT AT ACGGCAG AAG ATTT AG AAG AT GTT CTT AAAACGGCAGG ATT CG ACTTT G AT GTT AA
ATT AAGT GG AAAT ACACCAG AT G AGCCAAAT ACTTT ATTT GCAACCAGT GGCGCAT CAAC
T GT G ACT G AT ATT ACAAT GGGT GCTGGCACCGCCGG AGCT GGT CTT GG AAGT ACAG AT
GCT AT GT GGGGGCAAGCT GGTT AT G ACAGTT AT CTT CT GGT GCT GGCATT ACCTTGCAG
ATT GGT GCAAAT GAAGGT CAG ACCAT GAGTTT CT CT AT CG AT G ACAT GAGT GCAAG AGC
ACTT GGCGT AG AT GGCAACAAAGTT G ATTT AAGCACACAGGCT GGCGCACAG AAAGCAA
CT G AT ACCATT G ATGCAGCAAT CAAG AAAGT AT CT GCACAGCGT GGT AG AAT GGGT GCG
AT CCAGAACCGT CT GG AGCACACCAT CAGCAACCTT G AT ACAGCAGCAG AG AAT ACCCA
G ACT GC AG AGT CCCGT AT CCGT G AT ACAG AT AT GGCAG AAG AG AT GGTT GAGT ACT CCA
AG AACAACATT CTTGCACAGGCAGGT CAGT CT AT GCTT GCACAGGCG AACCAGT CT ACA
CAGGGT GT ACT CT CCTT ATT ACAGT AA
En una realización, la secuencia de polinucleótidos codifica una flagelina de Roseburia seleccionada del grupo que consiste en Fla1, Fla2, Fla3 y Fla4. En una realización, la secuencia de polinucleótidos codifica una flagelina de Roseburia seleccionada del grupo que consiste en Fla2, Fla1, Fla4 y combinaciones de las mismas. En una realización adicional, la secuencia de polinucleótidos codifica la flagelina Fla2 de Roseburia.
En un aspecto de la realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla1 de Roseburia hominis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia hominis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla1 de Roseburia intestinalis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia intestinalis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla3 de Roseburia intestinalis y una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla4 de Roseburia intestinalis. En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia hominis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia intestinalis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla1 de Roseburia intestinalis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla4 de Roseburia intestinalis y combinaciones de las mismas. En una realización adicional, la secuencia de polinucleótidos que codifica flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia hominis, una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia intestinalis y combinaciones de las mismas. En otra realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica flagelina de Roseburia es una secuencia de polinucleótidos que codifica Fla2 de Roseburia intestinalis.
Los inventores evaluaron el efecto terapéutico de las flagelinas mediante ensayos funcionales.
En una realización, la flagelina de Roseburia es una flagelina de Roseburia truncada. Por ejemplo, la flagelina de Roseburia truncada comprende al menos 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 aminoácidos del polipéptido mostrado como SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12.
En una realización, la flagelina de Roseburia truncada es una flagelina de Roseburia hominis truncada o una flagelina de Roseburia intestinalis truncada.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia codifica una FlaA1, Fla2, Fla3 o Fla4 truncada. Por ejemplo, la secuencia de polinucleótidos codifica una flagelina de Roseburia truncada que comprende al menos 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 o 200 aminoácidos del polipéptido mostrado como s Eq ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12.
En una realización, la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia codifica una FlaA1 o Fla3 truncada.
En una realización, la flagelina de Roseburia es un polipéptido de fusión. Por ejemplo, el polipéptido se fusiona con la glutatión S-transferasa (GST).
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Tabla B - Resumen del número de acceso para las fla elinas de Roseburia descritas en esta invención.
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Modulación/regulación
Los términos "modulación" y "regulación" pueden usarse indistintamente en esta invención.
En una realización, el término "modulación" se refiere a un aumento y/o inducción y/o promoción y/o activación. En una realización alternativa, el término "modulación" se refiere a una disminución y/o reducción y/o inhibición.
En una realización, el término "regulación" se refiere a una regulación positiva. En una realización alternativa, el término "regulación" se refiere a una regulación negativa.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, reduce la inflamación de un tejido u órgano.
Por ejemplo, se reduce la inflamación del tubo digestivo o parte del mismo (tal como el intestino).
El término "inflamación", como se usa en esta invención, se refiere a uno o más de los siguientes: enrojecimiento, hinchazón, dolor, sensibilidad, calor y función alterada de un tejido u órgano debido a un proceso inflamatorio desencadenado por una reacción excesiva del sistema inmunitario.
Se puede determinar una reducción de la inflamación en un sujeto determinando los niveles de citocinas proinflamatorias y quimiocinas en muestras de tejido, suero y/o heces en un sujeto antes y después de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se pueden controlar los niveles de uno o más de los siguientes: IL-1, IL-4, IL5, IL6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-17, IL-21, IL-22, IL23, TNFa, IFNy, CXCL1, CXCL10, CCL2, CCL20 calprotectina sérica y fecal, proteínas de unión al calcio SA1009/SA1008 e interferones de tipo 1, marcadores CD tales como CD163, CD14, factores de transcripción inflamatorios tales como NF-kB, STAT y MAPcinasas, proteína C reactiva (CRP, por sus siglas en inglés), velocidad de sedimentación globular (ESR, por sus siglas en inglés), proteínas del complemento, albúmina sérica, evaluación histológica de tejidos y órganos diana, índices de actividad de la enfermedad. Además, en estudios con seres humanos, se pueden realizar cuestionarios de calidad de vida (CdV) antes y después de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la cantidad de tejido u órgano que está inflamado en un sujeto es al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % menor en comparación con la cantidad de tejido u órgano que está inflamado en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, reduce la inflamación por las células epiteliales del tejido o el órgano.
Por ejemplo, las células epiteliales son células epiteliales del tubo digestivo o parte del mismo (tal como el intestino).
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, aumenta la producción de linfocitos T en un sujeto.
En una realización, los linfocitos T son linfocitos T reguladores (también denominados Treg) tales como linfocitos T reguladores capaces de expresar TLR5 (receptor 5 tipo Toll).
Sin desear quedar ligado a la teoría, un aumento en la cantidad de Treg combatirá los efectos de otros linfocitos T efectores (también denominados Teff), tales como Th1, Th17 y Th2, que impulsan la inflamación, la autoinmunidad y las afecciones alérgicas/atópicas. Por lo tanto, esta propiedad de la Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, puede aprovecharse para abordar muchas enfermedades donde se pierde el equilibrio de los linfocitos Teff/Treg, por ejemplo, Crohn y colitis ulcerosa.
En una realización, la producción de linfocitos T en un sujeto aumenta de manera que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de linfocitos T, o más de un 100 % más de linfocitos T, en comparación con el número de linfocitos T en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "sistema inmunitario", como se usa en esta invención, puede referirse al sistema inmunitario adaptativo y/o al sistema inmunitario innato.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa para regular el sistema inmunitario adaptativo de un sujeto.
Como se usa en esta invención, la expresión "sistema inmunitario adaptativo", también conocido como el "sistema inmunitario específico" se refiere a células y procesos sistémicos altamente especializados que eliminan o previenen el crecimiento patógeno. La respuesta inmunitaria adaptativa proporciona al sistema inmunitario de los vertebrados la capacidad de reconocer y recordar patógenos específicos (para generar inmunidad) y de organizar ataques más fuertes cada vez que se encuentra el patógeno.
Como se usa en esta invención, la expresión "regular el sistema inmunitario adaptativo" significa inducir la actividad del sistema inmunitario adaptativo y/o promover los mecanismos homeostáticos inmunitarios aumentando el nivel de actividad en relación con el nivel de actividad inicial. Preferentemente, el sistema inmunitario adaptativo se modula hacia la regulación inmunitaria (y no la activación inmunitaria, por lo tanto, reduciendo la inflamación).
Los defectos y trastornos asociados con el sistema inmunitario adaptativo, particularmente relacionados con la función de los linfocitos T, están asociados con muchas enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias. Las respuestas de los linfocitos T asociadas con Th1, Th2 y Th17 están asociadas con enfermedades atópicas, inflamatorias y autoinmunitarias. Las terapias que mejoran o aumentan las poblaciones de linfocitos T reguladores (Treg) son importantes para controlar enfermedades provocadas por respuestas celulares de Th1, Th2 y Th17 excesivas.
En determinadas realizaciones, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa para regular el sistema inmunitario innato de un sujeto.
Como se usa en esta invención, la expresión "sistema inmunitario innato", también conocido como sistema inmunitario no específico, comprende las células y los mecanismos que proporcionan al huésped una defensa inmediata contra la infección por otros organismos de una manera no específica. Esto significa que las células del sistema innato reconocen y responden a los patógenos de manera genérica, pero a diferencia del sistema inmunitario adaptativo, no confiere inmunidad protectora o de larga duración al huésped.
Como se usa en esta invención, la expresión "regular el sistema inmunitario innato" significa inducir la actividad del sistema inmunitario innato y/o aumentar el nivel de actividad en relación con el nivel de actividad inicial de manera que promueva la homeostasis inmunitaria.
La pérdida o desregulación de la función inmunitaria innata, ya sea debido a la pérdida de la barrera epitelial, péptidos inmunitarios innatos tales como defensinas, quimiocinas y citocinas o una señalización defectuosa de TLR se asocian con un mayor riesgo de enfermedades inflamatorias, en varios órganos del cuerpo, incluido el intestino. Dichas enfermedades incluyen la enfermedad inflamatoria del intestino.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, restaura la tolerancia inmunológica.
Como se usa en esta invención, la expresión "tolerancia inmunológica" se refiere al proceso por el cual el sistema inmunitario no ataca a un antígeno, tal como un autoantígeno.
Como se usa en esta invención, la expresión "restaurar la tolerancia inmunológica" se refiere a una restauración de la tolerancia inmunológica con respecto a uno o más antígenos (tal como un autoantígeno) en un sujeto, de modo que el nivel de tolerancia inmunológica con respecto al antígeno sea mayor en comparación con los niveles en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, activa las células dendríticas y/o las células epiteliales.
Como se usa en esta invención, la expresión "activa las células dendríticas" se refiere a una regulación positiva de uno o más marcadores celulares (tales como marcadores celulares I-A/I-E, CD80 y CD86 y CD40) y/o un aumento en la producción de una o más citocinas (tales como IL-10 y TGFp) por células (tales como células dendríticas) en un sujeto en comparación con los niveles en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
El término "I-A/I-E", como se usa en esta invención, se refiere a marcadores celulares de MHC de clase II.
El CD40 tiene una función esencial en la inmunidad y es una de las moléculas coestimuladoras mejor caracterizadas. Este receptor, un miembro de la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, se expresa por células presentadoras de antígenos profesionales, tales como las células dendríticas. CD40 se une a su ligando CD40L, que se expresa transitoriamente en los linfocitos T y otras células no inmunitarias en condiciones inflamatorias.
CD40L es un ejemplo de un marcador de linfocitos T. CD3, CD4, CD25, FoxP3, CTLA-4, Ly6g y CD11b son ejemplos adicionales de marcadores de linfocitos T.
CD80 y CD86 se expresan en células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas) y son necesarias para el desarrollo y la coestimulación de las respuestas de los linfocitos T. Las moléculas CD28 y CTLA-4 de los linfocitos T sirven como receptores para los antígenos coestimuladores CD80 y CD86. CD3, CD4, CD25, FoxP3, CTLA-4, Ly6g y CD11b son ejemplos de marcadores de linfocitos T reguladores colónicos.
Sin desear quedar ligado a la teoría, el agotamiento de Ly6g (por ejemplo, Ly6g6c y ly6g6e) aumenta el riesgo de infección, tanto en el intestino como en el tracto respiratorio y está asociado con enfermedades tales como neutropenia. Por lo tanto, en una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, sirve para su uso en el tratamiento de la neutropenia.
En determinadas realizaciones, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa para mantener la homeostasis inmunitaria en un sujeto. Como se usa en esta invención, "mantener la homeostasis inmunitaria" se refiere a la autorregulación del sistema inmunitario del cuerpo para mantener la tolerancia oral o la estabilidad inmunitaria en respuesta a condiciones cambiantes. La tolerancia oral se refiere a las respuestas inmunitarias normales a los alimentos y las bacterias comensales en un intestino sano. Estas se pierden en la enfermedad celíaca y las enfermedades inflamatorias del intestino tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Por lo tanto, en una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se usa en el tratamiento de la enfermedad celíaca y enfermedades inflamatorias del intestino tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.
En una realización, el número de marcadores celulares en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o 50 % más del marcador celular en la célula o células, o más de un 100 % más del marcador celular en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen el marcador celular aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan el marcador celular, o más de un 100 % más de células que tengan el marcador celular, en comparación con el número de células con el marcador celular en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, las células son linfocitos T.
En otra realización, las células son células del tubo digestivo (tales como células del intestino).
En una realización adicional, las células linfocitos T regulares del intestino delgado y/o del colon y pueden ser CD4 o CD8 positivos.
En una realización, el marcador celular es un marcador de linfocitos T. En otra realización, el marcador celular es un marcador de linfocitos T colónicos.
Los marcadores que son de tipo I-A/I-E son ejemplos de un marcador celular. CD40 es otro ejemplo de un marcador celular que se encuentra en las células dendríticas.
En una realización, el nivel de una citocina en un sujeto aumenta de manera que el nivel de citocina sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel de citocina en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
Los ejemplos de células dendríticas incluyen células dendríticas de médula ósea y células dendríticas de la mucosa intestinal.
Como se usa en esta invención, la expresión "activa las células epiteliales" se refiere a un aumento en la expresión de uno o más genes proinflamatorios por las células epiteliales en un sujeto en comparación con los niveles de expresión en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "gen proinflamatorio", como se usa en esta invención, se refiere a un gen que, cuando se expresa, promueve la inflamación. Los ejemplos de genes proinflamatorios incluyen genes que codifican, pero sin limitación, IL1-P, IL4, IL5, IL6, IL8, IL12, IL13, IL17, IL21, IL22, IL23, IL27, IFNy, CCL2, CCL3, CCL5, CCL20, CXCL5, CXCL10, CXCL12, CXCL13 y TNF-a.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, regula positivamente la producción de una citocina.
La expresión "regula positivamente la producción de una citocina", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de una citocina en un sujeto en comparación con el nivel de la citocina en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, el nivel de la citocina se aumenta de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En otra realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, regula positivamente la producción de IL-10 y/o TGFp.
La expresión "regula positivamente la producción de IL-10", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de IL-10 en un sujeto en comparación con el nivel de IL-10 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, el nivel de IL-10 se aumenta de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En algunas realizaciones, IL-10 se produce por células dendríticas tales como células dendríticas derivadas de médula ósea y células dendríticas de la mucosa intestinal, en particular subconjuntos CD103+.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, regula positivamente la producción de marcadores de superficie celular implicados en las respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos en una célula o células de un sujeto.
Los ejemplos de marcadores de superficie celular implicados en las respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos incluyen CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H y/o el equivalente de la especie.
Los marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD317/BST-2) pueden tener diferentes nombres en diferentes especies o el marcador de superficie celular puede no haberse identificado todavía en las células de una especie particular. La expresión "equivalente de la especie", como se usa en esta invención, abarca estos marcadores de superficie celular.
La expresión "regula positivamente la producción de CD40", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD40 en un sujeto en comparación con el nivel de CD40 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan el marcador celular CD40 y/o se aumenta el número de marcadores CD40 en una célula.
En una realización, el número del marcador celular CD40 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más del marcador celular en la célula o células, o más de un 100 % más del marcador celular en la célula o células, en comparación con el número del marcador celular en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen el marcador celular CD40 aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan el marcador celular, o más de un 100 % más de células que tengan el marcador celular, en comparación con el número de células con el marcador celular en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de I-A/I-E", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de I-A/I-E en un sujeto en comparación con el nivel de I-A/I-E en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares I-A/I-E y/o se aumenta el número de marcadores celulares I-A/I-E en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares I-A/I-E en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de los marcadores celulares I-A/I-E en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares I-A/I-E en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares I-A/I-E en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares I-A/I-E se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares I-A/I-E, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares I-A/I-E, en comparación con el número de células con marcadores celulares I-A/I-E en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de CD317/BST-2", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD317/BST-2 en un sujeto en comparación con el nivel de CD317/BST-2 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares CD317/BST-2 y/o se aumenta el número de marcadores celulares CD317/BST-2 en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares CD317/BST-2 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares CD317/BST-2 en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares CD317/BST-2 en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares CD317/BST-2 en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares CD317/BST-2 se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares CD317/BST-2, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares CD317/BST-2, en comparación con el número de células con marcadores celulares CD317/BST-2 en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de CD103", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD103 en un sujeto en comparación con el nivel de CD103 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares CD103 y/o se aumenta el número de marcadores celulares CD103 en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares CD103 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares CD103 en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares CD103 en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares CD103 en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares CD103 se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares CD103, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares CD103, en comparación con el número de células con marcadores celulares CD103 en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de CD80", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD80 en un sujeto en comparación con el nivel de CD80 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares CD80 y/o se aumenta el número de marcadores celulares CD80 en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares CD80 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares CD80 en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares CD80 en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares CD80 en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares CD80 se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares CD80, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares CD80, en comparación con el número de células con marcadores celulares CD80 en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de CD86", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD86 en un sujeto en comparación con el nivel de CD86 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares CD86 y/o se aumenta el número de marcadores celulares CD86 en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares CD86 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares CD86 en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares CD86 en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares CD86 en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares CD86 se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares CD86, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares CD86, en comparación con el número de células con marcadores celulares CD86 en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de CD83", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de CD83 en un sujeto en comparación con el nivel de CD83 en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares CD83 y/o se aumenta el número de marcadores celulares CD83 en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares CD83 en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares CD83 en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares CD83 en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares CD83 en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares CD83 se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares CD83, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares CD83, en comparación con el número de células con marcadores celulares CD83 en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "regula positivamente la producción de Siglec-H", como se usa en esta invención, se refiere a un aumento en el nivel de Siglec-H en un sujeto en comparación con el nivel de Siglec-H en un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Por ejemplo, se aumenta el número de células que llevan uno o más marcadores celulares Siglec-H y/o se aumenta el número de marcadores celulares Siglec-H en una célula.
En una realización, el número de los marcadores celulares Siglec-H en la célula o células de un sujeto se regula positivamente de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de marcadores celulares Siglec-H en la célula o células, o más de un 100 % de marcadores celulares Siglec-H en la célula o células, en comparación con el número de marcadores celulares Siglec-H en la célula o células del sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, el número de células en un sujeto que tienen marcadores celulares Siglec-H se aumenta de tal forma que haya al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % más de células que tengan marcadores celulares Siglec-H, o más de un 100 % más de células que tengan marcadores celulares Siglec-H, en comparación con el número de células con marcadores celulares Siglec-H en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla, y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho Fla, y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En algunas realizaciones, la producción de CD40 I-A/I-E, CD317/BST-2, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H es mediante células dendríticas (tales como células dendríticas CD103+ tolerogénicas expandidas por FLT3L).
En una realización, la expresión de uno o más genes de IFN de tipo I en una célula o células de un sujeto se regula negativamente.
En una realización, el nivel de expresión de uno o más genes de IFN de tipo I se disminuye de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % menor en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
Los ejemplos de genes de IFN de tipo I incluyen, pero sin limitación, IFN-p1, IFN-p3, Ifi202b, Ifi203, IFI44, IFTI, MXI, OASI, OAS2, OAS3, OASL, Irf3 y Irf4.
En una realización, la expresión de uno o más genes proinflamatorios en una célula o células de un sujeto se regula negativamente.
En una realización, el nivel de expresión de uno o más genes proinflamatorios se disminuye de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % menor en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "microbiota intestinal", como se usa en esta invención, se refiere a microorganismos que viven en el tracto digestivo de los animales huésped. Estos microorganismos realizan una amplia diversidad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas.
Como se usa en esta invención, la expresión "mejorar la microbiota intestinal" se refiere a aumentar el número y/o tipo de microorganismos presentes en el intestino de un sujeto (por ejemplo, el huésped), y/o aumentar la actividad de dichos microorganismos en términos de sus funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Por ejemplo, el número (es decir, niveles) de bacterias del grupo XIVa de Clostridium se aumenta y el número de E. coli se reduce; tal mejora en la microbiota intestinal puede tener lugar en sujetos con enfermedad inflamatoria del intestino (EII) una vez que se ha administrado al sujeto la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, el número de microorganismos presentes en el intestino de un sujeto (por ejemplo, el huésped), se aumenta de tal forma que el número de microorganismos sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, los tipos de microorganismos presentes en el intestino de un sujeto (por ejemplo, el huésped) se aumentan de tal forma que haya al menos un 5 %, 10 % o un 15 % más de tipos de microorganismos en comparación con los tipos en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
Como se usa en esta invención, la expresión "regular el apetito" se refiere a la capacidad de modular (es decir, aumentar o disminuir) el deseo de un sujeto de ingerir alimentos.
En una realización, se estimula (es decir, aumenta) el apetito del sujeto.
Sin desear quedar ligado a la teoría, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, ejerce un efecto estimulante sobre el apetito de un sujeto regulando negativamente la expresión de genes asociados con la supresión del apetito (tal como los genes que codifican las hormonas de saciedad). Agt, Cartpt, Cck, Cxcl12 y Gcg son ejemplos de genes asociados con la regulación del apetito, y la regulación negativa de uno o más de estos genes está asociada con la supresión del apetito.
Cck y Gcg son ejemplos de hormonas de saciedad.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, estimula el apetito en el sujeto de tal forma que el sujeto consume al menos un 5 %, 10 % o un 15 % más de alimento en comparación con el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos. Además, o como alternativa, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, estimula el apetito en el sujeto de tal forma que después de 1 mes desde la administración el peso del sujeto es al menos un 2 %, 5 % o un 10 % superior en comparación con el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, reduce el nivel de colecistoquinina (Cck) y/o glucagón (Gcg) en la sangre de un sujeto.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, reduce el nivel de colecistoquinina (Cck) y/o glucagón (Gcg) en la sangre de un sujeto en al menos un 5 %, 10 %, 15 % o un 20 % en comparación con el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, regula negativamente la expresión del gen que codifica colecistoquinina (Cck) y/o la expresión del gen que codifica glucagón (Gcg) en una célula o células de un sujeto.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, disminuye la expresión del gen que codifica colecistoquinina (Cck) de tal forma que el nivel de expresión sea al menos un 5 %, 10 %, 15 % o un 20 % menor en comparación con el nivel de expresión en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2) y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2).
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, disminuye la expresión del gen que codifica glucagón (Gcg) de tal forma que el nivel de expresión sea al menos un 5 %, 10 %, 15 % o un 20 % menor en comparación con el nivel de expresión en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
La expresión "mejorar la salud del tubo digestivo", como se usa en esta invención, se refiere a reducir el nivel de inflamación en el tubo digestivo o parte del mismo y/o mejorar la microbiota intestinal.
En una realización, el nivel de inflamación en el tubo digestivo es al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % menor en comparación con el nivel de inflamación en el tubo digestivo de un sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, regula la expresión de al menos un gen seleccionado de Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a. Muchos de estos genes son genes de la barrera intestinal y antimicrobianos y, por lo tanto, funcionan para reducir la invasividad de los patógenos intestinales y también reducen el número de patógenos viables.
En una realización, la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en genes relacionados con TLR (por ejemplo, Tlr5, Tlr1 y Vnn1), genes que codifican péptidos antimicrobianos (por ejemplo, Defb37, Pla2g, Muc16 y Itln), genes de la función de la barrera intestinal (por ejemplo, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3 y Magi3), genes inmunitarios innatos (por ejemplo, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a) en una célula o células de un sujeto se regula positivamente.
En una realización, la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en genes relacionados con TLR (por ejemplo, Tlr5, Tlr1 y Vnn1), genes que codifican péptidos antimicrobianos (por ejemplo, Defb37, Pla2g, Muc16 y Itln), genes de la función de la barrera intestinal (por ejemplo, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3 y Magi3), genes inmunitarios innatos (por ejemplo, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a) se aumenta de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a en una célula o células de un sujeto se regula positivamente.
En una realización, el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en Tlr5, Tlr1, Vnn1, Defb37, Pla2g, Muc16, Itln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a se aumenta de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor, o más de un 100 % mayor, en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización, se modula la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en genes que codifican acetil-CoA acetiltransferasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, butiril-CoA deshidrogenasa y fosfoenolpiruvato carboxicinasa [ATP] en una célula o células de un sujeto.
En una realización, el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en genes que codifican acetil-CoA acetiltransferasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, butiril-CoA deshidrogenasa y fosfoenolpiruvato carboxicinasa [ATP] se modula de tal forma que el nivel sea al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 50 % mayor o menor en comparación con el nivel en el sujeto antes de la administración al sujeto de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En esta invención se describe un microorganismo transformado (tal como un, por ejemplo, una Roseburia spp tal como R. hominis o R. intestinalis) en el que la expresión de una flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) tal como FlaA1 o FlaA2 se mejora en comparación con el microorganismo equivalente antes de la transformación, y usos del mismo para diversos usos terapéuticos y nutricionales como se describe en esta invención. Por ejemplo, el microorganismo transformado puede haberse transformado con una secuencia de nucleótidos (tal como un promotor) de tal forma que el microorganismo sea capaz de regular positivamente la expresión del gen que codifica una flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) tal como FlaA1 o FlaA2. En otro ejemplo, el microorganismo transformado puede haberse transformado con un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) tal como FlaA1 o FlaA2 unida operativamente a una secuencia reguladora (tal como un promotor) de tal forma que el microorganismo sea capaz de sobreexpresar el gen que codifica la flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) tal como FlaA1 o FlaA2.
Como se usa en esta invención, la expresión "vector de expresión" se refiere a una construcción de ADN que contiene una secuencia codificante de ADN (por ejemplo, secuencia génica) que está unida operativamente a una o más secuencias de control adecuadas capaces de afectar a la expresión de la secuencia codificante en un huésped. Dichas secuencias de control incluyen un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados, y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del huésped, o puede, en algunos casos, integrarse en el propio genoma. El plásmido es la forma más comúnmente usada de vector de expresión. Sin embargo, la descripción pretende incluir tales otras formas de vectores de expresión que sirven de funciones equivalentes y que son, o se vuelven, conocidas en la técnica.
La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los elementos están en una disposición que les permite estar funcionalmente relacionados. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si controla la transcripción de la secuencia codificante.
Tejidos
En una realización, el tejido u órgano es el tubo digestivo o una sección del mismo (por ejemplo, el esófago, el estómago o el intestino, tales como el intestino delgado o el intestino grueso y el colon) u otros sitios de la mucosa (tales como los conductos nasales y los pulmones).
En una realización, el tejido u órgano es el tubo digestivo o parte del mismo.
Los ejemplos de partes del tubo digestivo incluyen el esófago, el estómago y el intestino (tales como el intestino delgado (por ejemplo, el duodeno, el yeyuno y el íleon) y/o el intestino grueso (por ejemplo, el intestino ciego, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente y el colon sigmoide)).
Sujeto
En una realización, el sujeto es un animal monogástrico.
Los ejemplos de animales monogástricos incluyen aves de corral, seres humanos, ratas, cerdos, perros, gatos, caballos y conejos.
En otra realización, el sujeto es un mamífero tal como un mamífero monogástrico.
Los ejemplos de mamíferos monogástricos incluyen omnívoros (tales como seres humanos, ratas y cerdos), carnívoros (tales como perros y gatos) y herbívoros (tales como caballos y conejos).
En una realización, el sujeto es un ser humano.
Típicamente, TLR5 es capaz de expresarse en las células de dicho sujeto.
T rastornos
La flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótido, puede usarse en el tratamiento de un trastorno en un sujeto, donde dicho trastorno es un trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario.
En una realización, el trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario afecta al tubo digestivo, o una sección del mismo, de dicho sujeto.
En una realización, el trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario afecta a un sitio de la mucosa de un sujeto. Los ejemplos de sitios de la mucosa incluyen el tubo digestivo o una sección del mismo (por ejemplo, el esófago, el estómago o el intestino, tal como el intestino delgado o el intestino grueso y el colon), los conductos nasales y los pulmones.
En una realización, el trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, enfermedad celíaca, dermatitis atópica, rinitis, síndrome del intestino irritable (SII), colitis, enfermedad inflamatoria del intestino (EII), colitis ulcerosa, pouchitis, enfermedad de Crohn, dispepsia funcional, enfermedades atópicas, enterocolitis necrotizante y combinaciones de los mismos.
En una realización, el trastorno inflamatorio es colitis. En una realización adicional, la enfermedad inflamatoria es enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o pouchitis.
En una realización, el trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario afecta al intestino.
En una realización, el trastorno intestinal es SII. La fisiopatología precisa del SII aún no se ha dilucidado. Estudios recientes han descrito inflamación de la mucosa y alteraciones en la microbiota intestinal en pacientes con SII y una correlación de la enfermedad con infecciones intestinales.
En una realización adicional, el trastorno intestinal es enfermedad de Crohn.
En una realización, el trastorno es un trastorno autoinmunitario.
En una realización, el trastorno autoinmunitario se selecciona del grupo que consiste en colitis ulcerosa, pouchitis, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, alergias (incluida la enfermedad celíaca), dermatitis atópica y rinitis.
En particular, debido a su función en la restauración de la tolerancia inmunitaria, las enfermedades autoinmunitarias, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes tipo I son de particular relevancia.
Como se usa en esta invención, el término "medicamento" abarca medicamentos para uso tanto en seres humanos como en animales en medicina humana y veterinaria. Además, el término "medicamento" como se usa en esta invención, significa cualquier sustancia que proporcione un efecto terapéutico y/o beneficioso. El término "medicamento", como se usa en esta invención, no se limita necesariamente a sustancias que necesitan aprobación de comercialización, sino que puede incluir sustancias que pueden usarse en cosméticos, nutracéuticos, alimentos (incluidos piensos y bebidas, por ejemplo), cultivos probióticos, complementos nutricionales y remedios naturales. Además, el término "medicamento", como se usa en esta invención, abarca un producto diseñado para su incorporación en un pienso animal, por ejemplo, pienso para ganado y/o pienso para mascotas.
Aplicaciones profilácticas
La flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para su uso según la invención, también puede usarse en aplicaciones profilácticas. En aplicaciones profilácticas, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para su uso según la invención, se administran a un paciente susceptible o en riesgo de padecer una enfermedad particular en una cantidad que sea suficiente para reducir, al menos parcialmente, el riesgo de desarrollar una enfermedad. Tal cantidad se define como "una dosis profiláctica eficaz". Las cantidades precisas dependen de una serie de factores específicos, tales como el estado de salud y el peso del sujeto.
Encapsulación
En una realización, se encapsula la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia del polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización adicional, se encapsula la composición farmacéutica que comprende la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En otra realización, se encapsula el complemento nutricional que comprende la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o la secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos.
En una realización adicional, el pienso, producto alimenticio, complemento dietético o aditivo alimentario está encapsulado.
El término "encapsulado", como se usa aquí, se refiere a un medio para proteger el polipéptido, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, de un entorno incompatible mediante separación física de manera que pueda suministrarse al sitio diana (por ejemplo, el intestino) sin degradación o con una degradación significativa para que el polipéptido, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, puedan tener un efecto sobre el sitio diana. Un ejemplo es una cápsula con recubrimiento entérico.
Incluso cuando el objetivo de la encapsulación es el aislamiento del polipéptido, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, de su entorno, el recubrimiento o cubierta protectora debe romperse en el momento de la acción deseada. La ruptura del recubrimiento o cubierta protectora se produce típicamente mediante la aplicación de estímulos químicos y físicos tales como presión, ataque enzimático, reacción química y desintegración física.
Por ejemplo, la encapsulación asegura que el polipéptido, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, puedan ingerirse de manera que el polipéptido, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped pueda suministrarse al intestino (es decir, el sitio diana) en una cantidad que sea eficaz para producir un efecto en el intestino.
Composición farmacéutica
La composición farmacéutica puede ser cualquier composición farmacéutica. En una realización, la composición farmacéutica debe administrarse por vía oral, enteral o rectal. Por ejemplo, la composición puede ser una composición comestible. "Comestible" significa un material aprobado para consumo humano o animal.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria.
Se pueden encontrar ejemplos de dichos excipientes adecuados para las diversas formas diferentes de composiciones farmacéuticas descritas en esta invención en "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edición, (1994), editado por A Wade y PJ Weller.
Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985).
Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.
La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico se puede seleccionar con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado.
Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol.
Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares.
Se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes saporíferos en la composición farmacéutica. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.
Complementos nutricionales
Los portadores, diluyentes y excipientes nutricionalmente aceptables incluyen los adecuados para el consumo humano o animal y que se usan como estándar en la industria alimentaria. Los portadores, diluyentes y excipientes nutricionalmente aceptables típicos serán familiares para el experto en la técnica.
Piensos/productos
En esta invención se describen piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos y aditivos alimentarios que contienen flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o Roseburia (tal como la especie bacteriana Roseburia hominis, o la especie bacteriana Roseburia intestinalis).
Los términos "pienso", "producto alimenticio", "aditivo alimentario" y "complemento dietético", como se usan en esta invención, pretenden cubrir todos los productos consumibles que pueden ser sólidos, gelatinosos o líquidos.
Los productos alimenticios adecuados pueden incluir, por ejemplo, productos alimenticios funcionales, composiciones alimenticias, alimento para mascotas, pienso para ganado, alimentos saludables, piensos y similares. En un caso, el producto alimenticio es un alimento saludable.
Como se usa en esta invención, la expresión "producto alimenticio funcional" significa un alimento que es capaz de proporcionar no solo un efecto nutricional, sino que también es capaz de proporcionar un efecto beneficioso adicional al consumidor. Por consiguiente, los alimentos funcionales son alimentos ordinarios que tienen componentes o ingredientes (tales como los descritos en esta invención) incorporados que imparten al alimento un beneficio funcional específico, por ejemplo médico o fisiológico, distinto de un efecto puramente nutricional.
Los ejemplos de productos alimenticios específicos que son aplicables a la presente invención incluyen productos a base de leche, postres listos para comer, polvos para reconstitución con, por ejemplo, leche o agua, bebidas de leche con chocolate, bebidas de malta, platos preparados, platos instantáneos o bebidas para seres humanos o composiciones alimenticias que representen una dieta completa o parcial destinada a mascotas o ganado.
El pienso, producto alimenticio, complemento dietético o aditivo alimentario descrito en esta invención está destinado a seres humanos, mascotas o ganado, tales como animales monogástricos. El pienso, producto alimenticio, complemento dietético o aditivo alimentario puede estar destinado a animales seleccionados del grupo que consiste en perros, gatos, cerdos, caballos o aves de corral. El producto alimenticio, complemento dietético o aditivo alimentario puede estar destinado a especies adultas, en particular adultos humanos.
La expresión "producto a base de leche", como se usa en esta invención, significa cualquier producto a base de leche o suero líquido o semisólido que tenga un contenido de grasa variable. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, tal como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos lácteos agrios. Otro grupo importante incluye las bebidas lácteas, tales como bebidas de suero, leches fermentadas, leches condensadas, leches para lactantes o bebés; leches aromatizadas, helados; alimentos que contienen leche, tales como dulces.
Los piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos o aditivos alimentarios pueden ser, o pueden añadirse a, complementos alimenticios, también denominados en esta invención complementos dietéticos o nutricionales o aditivos alimentarios.
Los piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos o aditivos alimentarios también se pueden usar en la nutrición animal (por ejemplo, en la nutrición de los cerdos), particularmente en el período de destete temprano y período de engorde de crecimiento. Se espera que los piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos o aditivos alimentarios mejoren la función inmunitaria, reduzcan y prevengan enfermedades infecciosas, alteren beneficiosamente la composición de la microbiota y mejoren el crecimiento y el rendimiento de los animales, por ejemplo, a través de una mayor eficiencia de conversión del pienso.
Probióticos o producto bioterapéutico vivo
La flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, puede usarse en un producto bioterapéutico vivo o probiótico.
En determinadas realizaciones, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, están comprendidos en una composición probiótica.
Como se usa en esta invención, el término "probiótico" significa preparaciones de células microbianas o componentes de células microbianas con un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar del huésped (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al "Probiotics: how should they be defined" Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
En una realización, la composición probiótica es una composición administrable por vía oral de bacterias probióticas metabólicamente activas, es decir, vivas y/o liofilizadas, o destruidas por calor no viables, irradiadas o lisadas. La composición probiótica puede contener otros ingredientes. La composición probiótica se puede administrar por vía oral, es decir, en forma de comprimido, cápsula o polvo. Los productos encapsulados se prefieren para R. hominis y R. intestinalis ya que son anaerobios. Se pueden incluir otros ingredientes (tales como vitamina C, por ejemplo) como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos (tales como los que mejoran la colonización y la supervivencia in vivo). Como alternativa, la composición probiótica de la invención puede administrarse por vía oral como alimento o producto nutricional, tal como un producto lácteo fermentado a base de leche o suero, o como un producto farmacéutico.
Una dosis diaria adecuada de las bacterias probióticas es de aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (UFC); por ejemplo, de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 x 101° UFC; en otro ejemplo, de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 101° UFC.
En una realización, la composición probiótica contiene las especies bacterianas y/o componentes celulares de las mismas, como principios activos, en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1011 UFC/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 a aproximadamente 1 x 101° UFC/g. La dosis puede ser de 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.
Típicamente, un probiótico se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico adecuado. Un prebiótico suele ser un carbohidrato no digerible, tal como un oligo o polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.
En una realización, la composición probiótica incluye un prebiótico en una cantidad de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 30 % en peso, con respecto al peso total de la composición (por ejemplo, del 5 al 20 % en peso). Los carbohidratos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: fructo-oligosacáridos (o FOS), fructooligosacáridos de cadena corta, inulina, isomalt-oligosacáridos, pectinas, xilo-oligosacáridos (o XOS), quitosanooligosacáridos (o COS), beta -glucanos, almidones resistentes y modificados con goma de cultivo, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras de cítricos. En una realización, los prebióticos son los fructooligosacáridos de cadena corta (por simplicidad mostrados a continuación en esta invención como FOSs-c.c); dichos FOSs-c.c. no son carbohidratos digeribles, generalmente obtenidos por conversión del azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.
Administración
Las composiciones farmacéuticas, los complementos nutricionales, piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos o aditivos alimentarios de la presente invención pueden adaptarse para las vías de administración oral, rectal, vaginal, parenteral, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intratecal, intrabronquial, subcutánea, intradérmica, intravenosa, nasal, bucal o sublingual.
En una realización, las composiciones farmacéuticas o los complementos nutricionales de la presente invención están adaptados para las vías de administración oral, rectal, vaginal, parenteral, nasal, bucal o sublingual.
En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas o los complementos nutricionales de la presente invención están adaptados para la administración oral.
Para la administración oral, se hace un uso particular de comprimidos prensados, píldoras, comprimidos, geles, gotas y cápsulas.
Otras formas de administración comprenden soluciones o emulsiones que se pueden inyectar por vía intravenosa, intraarterial, intratecal, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o intramuscular, y que se preparan a partir de soluciones estériles o esterilizables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden estar en forma de supositorios, pesarios, suspensiones, emulsiones, lociones, ungüentos, cremas, geles, aerosoles, soluciones o polvos para espolvorear.
Un medio alternativo de administración transdérmica es mediante el uso de un parche cutáneo. Por ejemplo, el principio activo se puede incorporar a una crema que consiste en una emulsión acuosa de polietilenglicoles o parafina líquida. En otro ejemplo, el principio activo también se puede incorporar a un ungüento que consiste en una cera blanca o una base de parafina blanda blanca junto con los estabilizadores y conservantes que se requieran.
Las composiciones farmacéuticas, los complementos nutricionales, piensos, productos alimenticios, complementos dietéticos o aditivos alimentarios pueden formularse en forma farmacéutica unitaria, es decir, en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, o un múltiplo o subunidad de una dosis unitaria.
Dosificación
Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una dosis apropiada de la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, a administrar a un sujeto sin demasiada experimentación. Típicamente, un médico determinará la dosis real que será más adecuada para un paciente individual y dependerá de una diversidad de factores, incluyendo la actividad de la cepa bacteriana específica empleada, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de esa cepa, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el modo y tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, la gravedad de la afección particular y la terapia a la que se está sometiendo el individuo. Las dosis descritas en esta invención son ilustrativas del caso promedio. Por supuesto, puede haber casos individuales donde se necesiten intervalos de dosificación superiores o inferiores.
Combinaciones
En una realización, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, se administran en combinación con al menos uno o dos, o tres o cuatro o cinco agentes activos diferentes. En tales casos, la flagelina de Roseburia, y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia y/o el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), y/o el vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o la célula huésped que comprende dicho vector, y/o la célula huésped que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, puede administrarse consecutiva, simultánea o secuencialmente con uno o más de agentes activos diferentes.
El al menos uno o dos, o tres o cuatro o cinco agentes activos diferentes pueden seleccionarse del grupo que consiste en: flagelinas de Roseburia, el polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), una o más secuencias de polinucleótidos que codifican dicha flagelina de Roseburia, una o más secuencias de polinucleótidos que codifican dicho polipéptido Fla (tal como FlaA1 o FlaA2), uno o más vectores que comprenden dicha una o más secuencias de polinucleótidos, una o más células huésped que comprenden dicho uno o más vectores, una o más células huésped que comprenden dicha una o más secuencias de polinucleótidos, y microorganismos (por ejemplo, Roseburia tales como R. hominis y/o R. intestinalis).
El al menos uno o dos, o tres o cuatro o cinco agentes activos diferentes pueden ser un microorganismo (por ejemplo, una Roseburia, tal como R. hominis y/o R. intestinalis). Los ejemplos de microorganismos adecuados incluyen: A2-183 de Roseburia hominis y L1-82 de Roseburia intestinalis.
Identidad de secuencia u homología de secuencia
Los términos "polipéptido", "secuencia de polipéptidos", "proteína" y "secuencia de aminoácidos" se usan indistintamente en esta invención.
Las expresiones "secuencia de polinucleótidos" y "secuencia de nucleótidos" se usan indistintamente en esta invención.
La presente invención también abarca el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia u homología de secuencia con la secuencia o secuencias de aminoácidos de un polipéptido descrito en esta invención (por ejemplo, variantes, homólogos y derivados) o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifique tal polipéptido (en lo sucesivo en esta invención denominada "secuencia(s) homóloga(s)"). Aquí, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una determinada homología con las secuencias de aminoácidos en cuestión y las secuencias de nucleótidos en cuestión. Aquí, el término "homología" puede equipararse con "identidad".
En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye un aminoácido o una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos un 50, 60, 70, 75, 80, 85 o un 90 % idéntica, en algunas realizaciones, al menos un 95, 96, 97, 98 o un 99 % idéntica a la secuencia en cuestión. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
En algunas realizaciones, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que tiene una o varias adiciones, deleciones y/o sustituciones en comparación con la secuencia en cuestión.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere al uso de una proteína cuya secuencia de aminoácidos se representa en esta invención o una proteína derivada de esta proteína (precursora) mediante sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 aminoácidos, o más aminoácidos, tales como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora y que tienen la actividad de la proteína precursora.
En algunas realizaciones, la presente invención se refiere al uso de una secuencia de ácido nucleico (o gen) que codifica una proteína cuya secuencia de aminoácidos se representa en esta invención o que codifica una proteína obtenida a partir de esta proteína (precursora) mediante sustitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 aminoácidos, o más aminoácidos, tales como 10 o más de 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora y que tienen la actividad de la proteína precursora.
En el presente contexto, se considera que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos un 50, 60, 70, 75, 85 o un 90 % idéntica, en algunas realizaciones, al menos un 95, 96, 97, 98 o un 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido descrito en esta invención (la secuencia en cuestión). Normalmente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias o equivalentes que codifican el dominio o dominios, etc., como la secuencia en cuestión. Aunque la homología también se puede considerar en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.
La secuencia de aminoácidos homóloga y/o la secuencia de nucleótidos pueden proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserva la actividad funcional y/o mejora la actividad del polipéptido.
En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos como se describe en esta invención tiene al menos un 50, 60, 70, 75, 80, 85 o un 90 % de identidad, en algunas realizaciones, al menos un 95, 96, 97, 98 o un 99 % de identidad con la secuencia en cuestión.
En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos como se describe en esta invención tiene al menos un 50, 60, 70, 75, 80, 85 o un 90 % de identidad, en algunas realizaciones, al menos un 95, 96, 97, 98 o un 99 % de identidad con la secuencia en cuestión.
Las comparaciones de homología se pueden realizar visualmente, o más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente pueden calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología se puede calcular sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. A esto se le llama alineamiento "sin huecos". Típicamente, dichos alineamientos sin huecos se realizan solo en un número relativamente corto de residuos.
Aunque este es un procedimiento muy sencillo y consistente, no tiene en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias idénticas de otro modo, una inserción o deleción hará que los siguientes residuos de aminoácidos se desalineen, lo que potencialmente da como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los procedimientos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineamientos óptimos que toman en consideración posibles inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación de homología general. Esto se logra insertando "huecos" en el alineamiento de secuencias para intentar maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos asignan "penalizaciones por huecos" a cada hueco que se produce en el alineamiento de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencias con la menor cantidad de huecos posibles, que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas, obtendrá una puntuación más alta que una con muchos huecos. Se usan típicamente "costes de huecos afines" que cobran un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización menor por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más usado comúnmente. Las elevadas penalizaciones por huecos producirán, por supuesto, alineamientos optimizados con menos huecos. La mayor parte de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por huecos. Típicamente, los valores predeterminados se usan cuando se usa dicho software para comparaciones de secuencias.
Por lo tanto, el cálculo del % máximo de homología requiere en primer lugar la producción de un alineamiento óptimo, teniendo en cuenta las penalizaciones por huecos. Un programa informático adecuado para realizar tal alineamiento es Vector NTI (Invitrogen Corp.). Los ejemplos de software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero sin limitación, el paquete b La ST (véase Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. - Capítulo 18), BLAST 2 (véanse FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov). FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para búsquedas en línea y fuera de línea (véase Ausubel et al 1999, páginas 7­ 58 a 7-60).
Aunque el % de homología final se puede medir en términos de identidad, el propio procedimiento de alineamiento no se basa típicamente en una comparación de pares de todo o nada. En cambio, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud escalada que asigna puntuaciones a cada comparación por pares en función de la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo comúnmente usada es la matriz BLOSUM62, la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. Los programas Vector NTI generalmente usan los valores públicos predeterminados o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se proporciona (véase el manual del usuario para obtener más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores predeterminados para el paquete Vector NTI.
Como alternativa, el porcentaje de homologías se puede calcular usando la característica de alineamiento múltiple en Vector NTI (Invitrogen Corp.), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).
Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de homología, por ejemplo, el % de identidad de secuencia. El software típicamente hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.
En caso de que se usen penalizaciones por huecos al determinar la identidad de secuencia, se pueden usar los siguientes parámetros para el alineamiento por pares, por ejemplo:
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En una realización, puede usarse CLUSTAL con la penalización por huecos y la extensión de hueco configuradas como se ha definido anteriormente.
En una realización, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina sobre al menos 20 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 30 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 40 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 50 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 60 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 100 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 200 nucleótidos contiguos, por ejemplo, sobre al menos 300 nucleótidos contiguos.
En una realización, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se puede determinar en toda la secuencia.
Recombinante
En una realización, la secuencia de polipéptidos y/o polinucleótidos de flagelina de Roseburia para su uso en la presente invención es una secuencia recombinante, es decir, una secuencia que se ha preparado usando técnicas de ADN recombinante.
Estas técnicas de ADN recombinante están dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Dichas técnicas se explican en la bibliografía, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Polipéptido
En una realización, la secuencia de polinucleótidos de flagelina de Roseburia para su uso en la presente invención es una secuencia sintética, es decir, una secuencia que se ha preparado mediante síntesis química o enzimática in vitro. Incluye, pero sin limitación, secuencias elaboradas con un uso óptimo de codones para organismos huésped, tales como las levaduras metilotróficas Pichia y Hansenula.
Expresión de enzimas
La secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención puede incorporarse en un vector replicable recombinante. El vector puede usarse para replicar y expresar la secuencia de nucleótidos, en forma de proteína, en y/o a partir de una célula huésped compatible.
La expresión se puede controlar usando secuencias de control, por ejemplo, secuencias reguladoras.
La proteína producida por una célula huésped recombinante mediante la expresión de la secuencia de nucleótidos puede secretarse o puede estar contenida intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Las secuencias codificantes pueden diseñarse con secuencias señal que dirigen la secreción de las secuencias codificantes de sustancia a través de una membrana celular procariota o eucariota particular.
Vector de expresión
En una realización, la presente invención usa un vector (tal como un vector de expresión) que comprende al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una flagelina de Roseburia.
La expresión "vector de expresión" significa una construcción adecuada para la expresión in vivo o in vitro.
En una realización, el vector de expresión se incorpora al genoma de un organismo huésped adecuado. El término "incorporado" en una realización incluye la incorporación estable en el genoma.
La secuencia de nucleótidos de la presente descripción puede estar presente en un vector en el que la secuencia de nucleótidos está unida operativamente a secuencias reguladoras capaces de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos por una célula huésped u organismo huésped adecuado.
Los vectores para su uso en la presente invención pueden transformarse en una célula huésped u organismo huésped adecuado como se describe en esta invención para proporcionar la expresión de un polipéptido de la presente descripción.
La elección del vector, por ejemplo, un vector de plásmido, cósmido o fago dependerá a menudo de la célula huésped en la que se va a introducir.
Los vectores para su uso en la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables, tales como un gen, que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Como alternativa, la selección se puede realizar mediante transformación conjunta (como se describe en el documento WO91/17243).
Los vectores pueden usarse in vitro, por ejemplo, para la producción de ARN o usarse para transfectar, transformar, transducir o infectar una célula huésped.
Por lo tanto, en una realización adicional, la descripción proporciona un procedimiento para hacer secuencias de nucleótidos de la presente descripción mediante la introducción de una secuencia de nucleótidos de la presente descripción en un vector replicable, la introducción del vector en una célula huésped compatible y el crecimiento de la célula huésped en condiciones que causan la replicación del vector.
El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de dichas secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 y pIJ702.
Un vector de expresión puede comprender al menos dos, tres, cuatro o cinco secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia.
Los ejemplos de vectores de expresión incluyen pGEX-6P-1, pCR-Blunt II-TOPO y T7-MAT-Tag-FLAG-.
El vector de expresión pGEX-6P-1 puede usarse para clonar flagelinas recombinantes. El vector de expresión pGEX-6P-1 comprende un promotor tac para la expresión de alto nivel químicamente inducible de proteínas recombinantes etiquetadas con GST, un gen laclq interno para su uso en cualquier huésped de E. coli, un gen AmpR para la selección de ampicilina y un sitio de proteasa PreScission para escindir, si se desea, la proteína del producto de fusión.
El vector de clonación pCR-Blunt II-TOPO puede usarse para clonar flagelinas recombinantes, en particular aquellas que son insolubles después de la lisis celular. Típicamente, este vector permite la clonación de ADN de alta eficiencia de productos de PCR de extremos romos. El vector comprende genes de resistencia a kanamicina y zeocin para la selección en E. coli, y el inserto está flanqueado por múltiples sitios de restricción para la escisión.
El vector de expresión T7-MAT-Tag-FLAG- puede usarse para clonar flagelinas recombinantes, en particular aquellas que son insolubles después de la lisis celular. El sitio de clonación múltiple (MCS, por sus siglas en inglés) está flanqueado por la secuencia MAT (etiqueta de afinidad por metales) y la secuencia del péptido FLAG (Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), lo que da como resultado la producción de flagelina de doble etiqueta, que puede purificarse adicionalmente mediante columnas de afinidad. Este vector de expresión también comprende un promotor pT7/lac (operón lac del fago T7) para la expresión de alto nivel inducible por IPTG de flagelinas recombinantes MAT-ORF-FLAG, un gen lacl interno que reprime la transcripción en el estado inicial en cualquier huésped de E. coli, y un gen AmpR para la selección de ampicilina.
Secuencias reguladoras
En algunas aplicaciones, la secuencia de nucleótidos para su uso en la presente invención está unida operativamente a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de nucleótidos, tal como la de la célula huésped elegida. A modo de ejemplo, la presente invención incluye el uso de un vector que comprende la secuencia de nucleótidos unida operativamente a tal secuencia reguladora, es decir, el vector es un vector de expresión.
El término "unida operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia reguladora "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.
La expresión "secuencias reguladoras" incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.
El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión a la ARN polimerasa.
La expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica una flagelina de la presente descripción también se puede lograr mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, regiones promotoras, líderes de secreción y terminadoras.
En una realización, la secuencia de nucleótidos según la presente descripción está unida operativamente al menos a un promotor.
Incluso pueden usarse otros promotores para dirigir la expresión del polipéptido de la presente descripción.
Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de la secuencia de nucleótidos en un huésped bacteriano, fúngico o de levadura se conocen bien en la técnica.
El promotor puede incluir adicionalmente características para asegurar o aumentar la expresión en un huésped adecuado. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas tal como una caja Pribnow o una caja TATA.
Construcciones
El término "construcción", que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "casete" e "híbrido", incluye una secuencia de nucleótidos para su uso según la presente invención unida directa o indirectamente a un promotor.
Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo espaciador adecuado tal como una secuencia intrónica, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, el intermedio del promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente descripción. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" en relación con la presente descripción que incluye la unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no incluyen la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína normalmente asociada con el promotor del gen de tipo silvestre y cuando ambos se encuentran en su entorno natural.
La construcción puede incluso contener o expresar un marcador, lo que permite la selección de la construcción genética.
Para algunas aplicaciones, la construcción de la presente descripción comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente descripción unida operativamente a un promotor.
Células huésped
La expresión "célula huésped", en relación con la presente descripción, incluye cualquier célula que comprenda la secuencia de nucleótidos y/o un vector de expresión como se describe en esta invención. Típicamente, la célula huésped es capaz de producir de forma recombinante una proteína que tiene las propiedades específicas que se definen en esta invención.
Los ejemplos de células huésped incluyen bacterias tales como Roseburia spp. y células competentes. Los ejemplos de Roseburia spp son Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis y Roseburia inulinivorans. Los ejemplos de células competentes incluyen células de E. coli competentes (tales como E. coli BL21 (DE3) pLysS y/o E. coli B21 Rosetta).
Por lo tanto, una realización adicional de la presente descripción proporciona células huésped transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos de la presente descripción. Además, o como alternativa, una realización adicional de la presente descripción proporciona células huésped transformadas o transfectadas con una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un promotor, tal como un promotor heterólogo o exógeno) que es capaz de regular positivamente (sobreexpresar) la expresión de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, el gen, tal como un gen homólogo o un gen endógeno) que codifica una flagelina de la presente descripción en comparación con el microorganismo equivalente antes de la transformación. Las células se elegirán para que sean compatibles con dicho vector y pueden ser, por ejemplo, células bacterianas (por ejemplo, procariotas), fúngicas o de levadura.
La secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina de la presente descripción puede ser heteróloga u homóloga a la célula huésped. Típicamente, cuando la secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina es homóloga a la célula huésped, la célula huésped comprende múltiples copias de la secuencia de nucleótidos. Además, o como alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina está unida operativamente a un promotor heterólogo; típicamente dicho promotor es capaz de regular positivamente (sobreexpresar) la secuencia de nucleótidos homologa que codifica la flagelina.
En un ejemplo, la célula huésped comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de flagelina de la presente descripción (tal como una secuencia de nucleótidos homóloga o endógena) bajo el control de un promotor heterólogo o exógeno.
En una realización, la célula huésped se transforma o se transfecta con una o más secuencias de nucleótidos que codifican al menos una flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) seleccionada del grupo que consiste en Fla1, Fla2, Fla3 y Fla4. En otra realización, la célula huésped se transforma o se transfecta con una o más secuencias de nucleótidos que codifican al menos una flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) seleccionada del grupo que consiste en Fla2, Fla1 y Fla4. En una realización adicional, la célula huésped se transforma o se transfecta con una secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) Fla2.
La célula huésped puede comprender múltiples copias de secuencias de polinucleótidos que codifican flagelinas de Roseburia.
Una célula huésped puede comprender al menos 1, 2, 3, 4 o 5 secuencias de polinucleótidos que codifican al menos 1, 2, 3, 4 o 5 flagelinas de Roseburia.
En una realización, la célula huésped comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica al menos una flagelina de Roseburia obtenida o que puede obtenerse a partir de una especie de Roseburia y al menos una secuencia de polinucleótidos adicional que codifica al menos una flagelina de Roseburia obtenida o que puede obtenerse a partir de una especie diferente de Roseburia. Por ejemplo, la célula huésped comprende al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de R. hominis (por ejemplo, Fla1 o Fla2) y al menos una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de R. intestinalis (por ejemplo, Fla1 o Fla 2).
Una célula huésped puede comprender al menos 1,2, 3, 4 o 5 vectores de expresión que comprenden al menos 1, 2, 3, 4 o 5 secuencias de polinucleótidos que codifican flagelina de Roseburia.
En una realización, la célula huésped comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica flagelinas de Roseburia obtenidas o que pueden obtenerse a partir de una especie de Roseburia y al menos un vector de expresión adicional que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica flagelinas de Roseburia obtenidas o que pueden obtenerse a partir de una especie diferente de Roseburia. Por ejemplo, la célula huésped comprende al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de R. hominis (por ejemplo, Fla1 o Fla2) y al menos un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de R. intestinalis (por ejemplo, Fla1 o Fla 2 ).
La secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina puede ser endógena o exógena a la célula huésped. Típicamente, cuando la secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina es endógena a la célula huésped, la célula huésped comprende múltiples copias de la secuencia de nucleótidos. Además, o como alternativa, la secuencia de nucleótidos que codifica la flagelina está unida operativamente a un promotor exógeno; típicamente dicho promotor es capaz de regular positivamente (sobreexpresar) la secuencia de nucleótidos endógena que codifica la flagelina.
Los ejemplos de organismos huésped bacterianos adecuados son especies bacterianas grampositivas o gramnegativas.
En una realización, la célula huésped es un microorganismo.
En una realización, la célula huésped es una especie de bacteria de ácido láctico, una especie de Lactococcus, una especie de Bifidobacterium, una especie de Lactobacillus o una especie de Propionibacterium.
Los ejemplos de bacterias de ácido láctico incluyen, pero sin limitación, Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Lactococcus spp., Streptococcus spp., Aerococcus spp., Carnobacterium spp., Enterococcus spp., Oenococcus spp., Sporolactobacillus spp., Tetragenococcus spp., Vagococcus spp., y Weisella spp.
Los ejemplos de Lactobacillus spp incluyen Lactobacillus paracasei, L. acidophilus, L. fermentum, L. brevis, L. gasseri, L. plantarum, L. bulgaricus, L. helveticus, L. reuteri, L. casei, L. jensenii, L. rhamnosus, L. crispatus, L. johnsonii, L. salivarius, L. acetotolerans, L. acidifarinae, L. acidipiscis, L. agilis, L. algidus, L. alimentarius, L. amylolyticus, L. amylophilus, L. amylotrophicus, L. amylovorus, L. animalis, L. antri, L. apodemi, L. aviarius, L. bifermentans, L. buchneri, L. camelliae, L. catenaformis, L. ceti, L. coleohominis, L. collinoides, L. composti, L. concavus, L. coryniformis, L. crustorum, L. curvatus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. dextrinicus, L. diolivorans, L. equi, L. equigenerosi, L. farraginis, L. farciminis, L. fornicalis, L. fructivorans, L. frumenti, L. fuchuensis, L. galUnarum, L. gastricus, L. ghanensis, L. graminis, L. hammesii, L. hamsteri, L. harbinensis, L. hayakitensis, L. hilgardii, L. homohiochii, L. iners, L. ingluviei, L. intestinalis, L. kalixensis, L.
kefiranofaciens, L. kefiri, L. kimchii, L. kitasatonis, L. kunkeei, L. leichmannii, L. lindneri, L. malefermentans, L. mail, L. manihotivorans, L. mindensis, L. mucosae, L. murinus, L. nagelii, L. namurensis, L. nantensis, L. oligofermentans, L. oris, L. panis, L. pantheris, L. parabrevis, L. parabuchneri, L. paracollinoides, L. parafarraginis, L. parakefiri, L. paralimentarius, L. paraplantarum, L. pentosus, L. perolens, L. pontis, L. psittaci, L. rennini, L. rimae, L. rogosae, L. rossiae, L. ruminis, L. saerimneri, L. sakei, L. sanfranciscensis, L. satsumensis, L. secaliphilus, L. sharpeae, L. siliginis, L. spicheri, L. suebicus, L. thailandensis, L. ultunensis, L. vaccinostercus, L. vaginalis, L. versmoldensis, L. vini, L. vitulinus, L. zeae y L. zymae.
Los ejemplos de Propionibacterium incluyen, pero sin limitación, Propionibacterium freudenrechli subsp. shermanii (PAB), Propionibacterium acidifaciens, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium acnes, Propionibacterium australiense, Propionibacterium avidum, Propionibacterium cyclohexanicum, Propionibacterium freudenrelchli subsp. freudenrelchli, Propionibacterium granulosum, Propionibacterium jensenii, Propionibacterium microaerophilum, Propionibacterium propionicum y Propionibacterium thoenii.
En una realización, la Propionibacterium es Propionibacterium freudenrechli subsp. shermanii (PAB).
Los ejemplos de Bifidobacterium incluyen, pero sin limitación, Bifidobacterium adolescentis, B. breve, B. longum, B. animalis, B. infantis, B. thermophilum, B. bifidum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium angulatum y B. lactis.
En otra realización, la célula huésped es una Firmicute, por ejemplo, una especie de Roseburia, tal como Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis o Roseburia inulinivorans). En una realización, la célula huésped comprende al menos una secuencia de polinucleótidos heteróloga que codifica una flagelina de Roseburia. Además, o como alternativa, la célula huésped comprende al menos dos copias de una secuencia de polinucleótidos homóloga que codifica una flagelina de Roseburia; por ejemplo, la célula huésped comprende al menos 3, 4 o 5 copias homólogas de una secuencia de polinucleótidos que codifica una flagelina de Roseburia.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la presente descripción, y/o la conveniencia de un procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden usarse huéspedes eucariotas tales como levaduras u otros hongos. En general, se usan células de levadura sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se secretan escasamente de la célula de levadura o, en algunos casos, no se procesan correctamente (por ejemplo, hiperglucosilación en levadura). En estos casos, debe seleccionarse un organismo huésped fúngico diferente.
El uso de células huésped adecuadas, tales como células huésped de levadura, hongos y plantas, puede proporcionar modificaciones postraduccionales (por ejemplo, miristoilación, glucosilación, truncamiento, lipidación y fosforilación de tirosina, serina o treonina) según sea necesario para conferir una actividad biológica óptima sobre productos de expresión recombinantes de la presente descripción.
La célula huésped puede ser una cepa deficiente en proteasa o sin proteasa. Ésta puede ser, por ejemplo, la cepa Aspergillus oryzae JaL 125 deficiente en proteasa que tiene eliminado el gen de la proteasa alcalina denominado "alp". Esta cepa se describe en el documento WO97/35956.
La expresión "célula huésped" no incluye las secuencias codificantes de nucleótidos nativas en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor nativo, que también se encuentra en su entorno natural.
Organismo
El término "organismo" en relación con la presente descripción incluye cualquier organismo que pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la presente descripción y/o productos obtenidos a partir de la misma, y/o donde un promotor puede permitir la expresión del secuencia de nucleótidos según la presente descripción cuando está presente en el organismo.
Los organismos adecuados pueden incluir una bacteria (tal como un procariota), un hongo, una levadura o una planta.
La expresión "organismo transgénico" en relación con la presente descripción incluye cualquier organismo que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la presente descripción y/o los productos obtenidos a partir del mismo, y/o donde un promotor puede permitir la expresión de la secuencia de nucleótidos según la presente descripción dentro del organismo. En una realización, la secuencia de nucleótidos se incorpora al genoma del organismo.
La expresión "organismo transgénico" no incluye las secuencias codificantes de nucleótidos nativas en su entorno natural cuando están bajo el control de su promotor nativo, que también se encuentra en su entorno natural.
Por lo tanto, el organismo transgénico de la presente descripción incluye un organismo que comprende una cualquiera de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según la presente descripción, construcciones según la presente descripción, vectores según la presente descripción, plásmidos según la presente descripción, células según la presente descripción, o los productos de los mismos.
Por ejemplo, el organismo transgénico puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la presente descripción (tal como una secuencia de nucleótidos homóloga) bajo el control de un promotor heterólogo.
Transformación de células/organismos huésped
Como se ha indicado anteriormente, el organismo huésped puede ser un organismo procariota o eucariota. Los ejemplos de huéspedes procariotas adecuados incluyen Roseburia hominis, Roseburia cecicola, Roseburia faecis, Roseburia intestinalis, Roseburia inulinivorans, E. coli y Bacillus subtilis.
Las enseñanzas sobre la transformación de huéspedes procariotas están bien documentadas en la técnica, por ejemplo, véase Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se usa un huésped procariota, entonces es posible que la secuencia de nucleótidos deba modificarse adecuadamente antes de la transformación, tal como mediante la eliminación de intrones.
Las células de hongos filamentosos se pueden transformar usando diversos procedimientos conocidos en la técnica, tales como un proceso que implica la formación de protoplastos y la transformación de los protoplastos seguido de la regeneración de la pared celular de una manera conocida. El uso de Aspergillus como microorganismo huésped se describe en el documento EP 0238023.
Otro organismo huésped puede ser una planta. Se puede encontrar una revisión de las técnicas generales usadas para transformar plantas en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol
42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/Abril de 1994 17-27). Se pueden encontrar enseñanzas adicionales sobre la transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.
Las enseñanzas generales sobre la transformación de hongos, levaduras y plantas se presentan en las siguientes secciones.
Hongo transformado
Un organismo huésped puede ser un hongo, tal como un moho. Los ejemplos de tales huéspedes adecuados incluyen cualquier miembro perteneciente a los géneros Thermomyces, Acremonium, Aspergillus, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma y similares.
En una realización, el organismo huésped puede ser un hongo filamentoso.
La transformación de hongos filamentosos se analiza en el documento US-A-5741665 que establece que las técnicas estándar para la transformación de hongos filamentosos y el cultivo de hongos se conocen bien en la técnica. Se encuentra una extensa revisión de las técnicas aplicadas a N. crassa, por ejemplo, en Davis y de Serres, Methods Enzymol (1971) 17A: 79-143.
Se revisan enseñanzas adicionales que también se pueden utilizar para transformar hongos filamentosos en el documento US-A-5674707.
Además, la expresión génica en hongos filamentosos se enseña en Punt et al. (2002) Trends Biotechnol 2002 May;20(5):200-6, Archer & Peberdy Crit Rev Biotechnol (1997) 17(4):273-306.
La presente descripción abarca la producción de hongos filamentosos transgénicos según la presente descripción preparada mediante el uso de estas técnicas estándar.
En una realización, el organismo huésped puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.
También se puede preparar un Aspergillus transgénico según la presente descripción siguiendo, por ejemplo, las enseñanzas de Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. págs. 641-666). Levadura transformada
En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura.
Se proporciona una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en levadura en, por ejemplo, Methods Mol Biol (1995), 49:341-54 y Curr Opin Biotechnol (1997) Oct;8(5):554-60
A este respecto, la levadura, tal como la especie Saccharomyces cerevisi o Pichia pastoris (véase FEMS Microbio! Rev (200024(1):45-66), puede usarse como vehículo para la expresión de genes heterólogos.
Se proporciona una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos en E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2a edición, Academic Press Ltd.).
Para la transformación de levadura, se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, se puede preparar una Saccharomyces transgénica según la presente descripción siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the u Sa 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); y Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163-168).
Las células de levadura transformadas pueden seleccionarse usando diversos marcadores selectivos, tales como marcadores auxótrofos, marcadores de resistencia a antibióticos dominantes.
Plantas transformadas/células vegetales
Un organismo huésped adecuado para la presente descripción puede ser una planta. En este sentido, el principio básico en la construcción de plantas modificadas genéticamente es insertar información genética en el genoma de la planta para obtener un mantenimiento estable del material genético insertado. Se puede encontrar una revisión de las técnicas generales en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/abril 1994 17-27).
La infección directa de tejidos vegetales por Agrobacterium es una técnica sencilla que ha sido ampliamente empleada y que se describe en Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208.
Otras técnicas para transformar plantas incluyen la transformación balística, la técnica de carburo de triquitas de silicio (véanse Frame BR, Drayton p R, Bagnaall Sv , Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA y Wang K (1994) Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal 6: 941-948) y técnicas de transformación viral (por ejemplo, véase Meyer P, Heidmann I y Niedenhof I (1992) The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Gene 110: 213-217).
Se pueden encontrar enseñanzas adicionales sobre la transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.
Las células vegetales se pueden cultivar y mantener según procedimientos de cultivo de tejidos bien conocidos, tales como cultivar las células en un medio de cultivo adecuado provisto de los factores de crecimiento necesarios, tales como aminoácidos, hormonas vegetales, vitaminas, etc.
En una realización adicional, la presente descripción se refiere a un sistema de vectores que lleva una secuencia o construcción de nucleótidos según la presente descripción y que es capaz de introducir la secuencia o construcción de nucleótidos en el genoma de un organismo, tal como una planta. El sistema de vectores puede comprender un vector, pero puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema de vectores normalmente se denomina sistema de vectores binarios. Los sistemas de vectores binarios se describen con más detalle en Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.
Un sistema ampliamente empleado para la transformación de células vegetales usa el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 y Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Después de cada procedimiento de introducción del promotor o construcción o secuencia de nucleótidos deseada según la presente descripción en las plantas, puede ser necesaria la presencia y/o inserción de secuencias de ADN adicionales. Si, por ejemplo, para la transformación se usa el plásmido Ti o Ri de las células vegetales, al menos el límite derecho y, a menudo, sin embargo, se pueden conectar el límite derecho e izquierdo del ADN-T de los plásmidos Ti y Ri, como áreas flanqueantes de los genes introducidos. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha estudiado intensamente y se describe en el documento EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Capítulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; y An et al., EMBO J. (1985) 4:277-284.
Cultivo y producción
Las células huésped transformadas con la secuencia de nucleótidos de la presente descripción y/o un vector de expresión de la presente descripción pueden cultivarse en condiciones que conduzcan a la producción del polipéptido codificado y que faciliten la recuperación del polipéptido de las células y/o el medio de cultivo.
El medio usado para cultivar las células puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer la célula huésped en cuestión y obtener la expresión del polipéptido.
La proteína producida por una célula recombinante puede mostrarse en la superficie de la célula.
La proteína puede secretarse de las células huésped y puede recuperarse convenientemente del medio de cultivo usando procedimientos bien conocidos.
Secreción
En algunas realizaciones, la proteína se secreta del huésped de expresión al medio de cultivo desde donde se puede recuperar la proteína. De acuerdo con la presente descripción, la secuencia líder de secreción puede seleccionarse basándose en el huésped de expresión deseado. También se pueden usar secuencias señal híbridas con el contexto de la presente descripción.
Los ejemplos típicos de secuencias líder de secreción heterólogas son las que se originan a partir del gen de la amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - versiones tanto de 18 como de 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus), el gen del factor a (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces y Hansenula) o el gen de la a-amilasa (Bacillus).
A modo de ejemplo, la secreción de proteínas heterólogas en E. coli se revisa en Methods Enzymol (1990) 182:132-43.
Detección
Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés), el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) y la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).
Los expertos en la técnica conocen una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación y pueden usarse en diversos ensayos de aminoácidos y nucleicos.
Varias empresas tales como Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) y US Biochemical Corp (Cleveland, OH) suministran kits y protocolos comerciales para estos procedimientos.
Las moléculas indicadoras o marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen los documentos US-A-3.817.837; US-A-3.850.752; US-A-3.939.350; US-A-3.996.345; US-A-4.277.437; US-A-4.275.149 y US-A-4.366.241.
Además, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes como se muestra en el documento US-A-4.816.567.
Proteínas de fusión
La secuencia de aminoácidos para su uso según la presente descripción puede producirse como una proteína de fusión, por ejemplo, para facilitar la extracción y la purificación. Los ejemplos de compañeros de proteínas de fusión incluyen glutatión-S-transferasa (GST), 6xHis, GAL4 (dominios de activación transcripcional y/o de unión al ADN) y (p-galactosidasa). También puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítica entre el compañero de la proteína de fusión y la secuencia de proteína de interés para permitir la eliminación de las secuencias de proteína de fusión.
Típicamente, la proteína de fusión no obstaculizará la actividad de la secuencia de proteína.
Se han revisado sistemas de expresión de fusión génica en E. coli en Curr Opin Biotechnol (1995) 6(5):501-6.
En otra realización, la secuencia de aminoácidos se puede ligar a una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para el cribado de bibliotecas de péptidos para agentes capaces de afectar a la actividad de la sustancia, puede ser útil codificar una sustancia quimérica que exprese un epítopo heterólogo que sea reconocido por un anticuerpo disponible comercialmente.
La presente invención se describe adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto en la técnica. Dichas técnicas se explican en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, J. Sambrook, E. F.
Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunds Edición, Libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap.
9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; y E. M. Shevach y W. Strober, 1992 y suplementos periódicos, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York, n Y.
Materiales y procedimientos
FLAGELINAS DEL GÉNERO ROSEBURIA
Diversidad de flagelinas
Se clonaron, se expresaron, se purificaron y se analizaron flagelinas de bacterias del género Roseburia, en particular, Roseburia hominis y Roseburia intestinalis.
Las figuras B1A y B1B muestran un análisis SDS de flagelinas recombinantes.
Nomenclatura de la proteína flagelina:
Género Roseburia
Especie Roseburia
Roseburia hominis
Roseburia hominis FlaA1 (También se denomina en esta invención RhFlaA1 o Rh1)
Roseburia hominis FlaA2 (También se denomina en esta invención RhFlaA2 o Rh2)
Roseburia intestinalis
Roseburia intestinalis FlaA1 (También se denomina en esta invención RiFlaA1 o Ri1 o RI1)
Roseburia intestinalis FlaA2 (También se denomina en esta invención RiFlaA2 o Ri2 o RI2)
Roseburia intestinalis FlaA3 (También se denomina en esta invención RiFlaA3 o Ri3 o RI3)
Roseburia intestinalis FlaA4 (También se denomina en esta invención RiFlaA1 o Ri4 o RI4)
Véanse:
ELY, B., ELY, T.W., CRYMES, W.B.,JR y MINNICH, S.A., 2000. A family of six flagellin genes contributes to the Caulobacter crescentus flagellar filament. Journal of Bacteriology, 182(17), págs. 5001-5004.
IBRAHIM, G.F., FLEET, G.H., LYONS, M.J. y WALKER, R.A., 1985. Method for the isolation of highly purified Salmonella flagellins. Journal of clinical microbiology, 22(6), págs. 1040-1044. NEVILLE, B.A., FOr De , B.M., CLAESSON, M.J., DARBY, T., COGHLAN, A., NALLY, K., ROSS, R.P. y O'TOOLE, P.W., 2012. Characterization of pro-inflammatory flagellin proteins produced by Lactobacillus ruminis and related motile Lactobacilli. PloS one, 7(7), págs. e40592. Ng , S.Y., ChABAN, B. y JARRELL, K.F., 2006. Archaeal flagella, bacterial flagella and type IV pili: a comparison of genes and posttranslational modifications. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 11 (3­ 5), págs. 167-191.
WATSON, R.O. y GALAN, J.E., 2005. Signal transduction in Campylobacter jejuni-induced cytokine production. Cellular microbiology, 7(5), págs. 655-665.
Condiciones del crecim iento bacteriano
Se cultivó de forma anaerobia A2-183T (=DSM 16839T=NCIMB 14029T) de R. hominis a 37 °C en medio YCFA. El cultivo se centrifugó y el sedimento se resuspendió en un ml de medio YCFA, complementado con cisteína al 2 % (p/v, Sigma-Aldrich) y ácido ascórbico al 3 % (p/v, Sigma-Aldrich).
Se cultivó de forma anaerobia R. intestinalis L1-82T (=DSM 14610T=NCIMB 13810T) a 37 °C en medio YCFA. El cultivo se centrifugó y el sedimento se resuspendió en un ml de medio YCFA, complementado con cisteína al 2 % (p/v, SigmaAldrich) y ácido ascórbico al 3 % (p/v, Sigma-Aldrich).
Ratones
Se adquirieron ratones C3H/HeN y C57BI/6 de Harlan Laboratories. Se proporcionaron C3H/HeN GF y se mantuvieron en la instalación de cría de roedores gnotobióticos del INRA en Jouy-en-Josas (plataforma ANAXEM, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Francia). Se proporcionaron TLR5KO GF y C57BI/6 de tipo silvestre por Andrew Gewirtz (Center for Inflammation, Immunity, and Infection and Department of Biology, Georgia State University, Atlanta, GA 30303, EE.UU.) y se mantuvieron en la instalación de cría de roedores gnotobióticos del INRA en Jouy-en-Josas. Se proporcionaron TLR5KO convencionales y BOY/J de tipo silvestre por Adam Cunningham (MRC Centre for Immune Regulation, Institute of Microbiology and Infection, Division of Immunity and Infection University of Birmingham, Reino Unido). Los procedimientos de gestión y experimentales se aprobaron por los respectivos comités locales de revisión ética.
Experimentos en animales
Se realizaron experimentos en animales libres de gérmenes en la instalación de cría de roedores gnotobióticos del INRA en Jouy-en-Josas (plataforma ANAXEM, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Francia). Se asignaron ratones macho C3H/HeN GF a grupos de control (N = 8) y de tratamiento (N = 10) y se enjaularon individualmente en aisladores de plástico. Los días 0, 1 y 2, los animales del grupo de tratamiento recibieron 100 pl de cultivo de R. hominis por sonda nasogástrica, mientras que los animales de control recibieron 100 pl de medio YCFA. Se recogieron muestras de íleon, colon ascendente y ciego a los 14d y 28d.
Seis ratones macho C3H/HeN GF se trataron con MG1655 (K12) de E. coli como se ha descrito anteriormente, y tres animales se sacrificaron a los 10d y 22d para dar N = 3. Se inocularon tres ratones TLR5KO GF y tres ratones C57BI/6 WT con cultivo de R. hominis como se ha descrito anteriormente para evaluar la importancia funcional de las flagelinas de R. hominis. Después de 28d, estos animales se sacrificaron junto con sus equivalentes GF. Veintidós ratones hembra C57BL/6 recibieron una dosis diaria de 50 pl de 109 UFC de R. hominis durante 14 días. Los animales de control recibieron una dosis de medio de cultivo solo. A partir del día 8, los ratones recibieron DSS (PM 50 kDa, 30 g/l) en el agua de bebida durante 6 días. Los animales se sacrificaron el día 14 y se realizó el muestreo de tejido como se ha descrito anteriormente.
Experimentos de cultivo tisu lar
Se cultivaron células Caco-2 (células de adenocarcinoma colorrectal epitelial de Homo sapiens) y HT29 (adenocarcinoma colorrectal de Homo sapiens) en placas Transwell dentro de una estación de trabajo anaerobia. Se recogió el cultivo de A2-183 de R. hominis o L1-82T de R. intestinalis en fase exponencial y se añadieron 100 pl de suspensión bacteriana (108 UFC/ml) a los pocillos experimentales. Se recogieron células bacterianas (no adherentes y adherentes) y eucariotas (Caco-2 y HT-29) después de 2 h y 4 h de incubación y se almacenaron en RNAlater. Para los experimentos de cultivo de tejidos con flagelinas recombinantes, se cultivaron 5x104 células Caco-2 en placas de 24 pocillos a 37 °C en una atmósfera humidificada al 75 % de CO2 al 5 %. Las células alcanzaron la confluencia el día 5-6 y se usaron tres días después de la confluencia. Las células se incubaron con flagelinas recombinantes a una concentración final de 100 ng/pl durante 2 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 75 % de CO2 al 5 %.
Análisis por FISH
El análisis FISH se realizó en secciones de tejido intestinal fijadas con formalina tamponadas neutras usando una sonda bacteriana general Eub338 y una sonda específica de A2-183 de R. hominis de nuevo diseño y una sonda específica de R. intestinalis L1-82T.
Construcción de la biblioteca de R. hom inis
Se aisló ADN cromosómico de R. hominis para la construcción de bibliotecas de tamaño pequeño y la pirosecuenciación usando un kit de aislamiento de ADN microbiano UltraClean™ (Mo Bio Laboratories Inc) y se aisló ADN de alto peso molecular para bibliotecas de fosmidos usando un kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega).
Análisis de m icromatrices
Micromatriz bacteriana
Se aisló ARN bacteriano del contenido del ciego de ratón y se procesó adicionalmente usando kits comerciales siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los productos de PCR amplificados a partir de 6000 clones en la biblioteca de plásmidos de E. coli de R. hominis se dispusieron por duplicado en portaobjetos de microscopio recubiertos con aminosilano (Corning) usando un MicroGrid II TAS (BioRobotics).
Análisis de micromatrices de ratón
Se extrajo el ARN total de tejido del íleon y del colon ascendente, se procesó en ARNc/ARNa marcado con biotina (dependiendo del kit Affymetrix usado) y se hibridó con matriz de ratón GeneChip NuGO y matriz de genoma de ratón GeneChip (Affymetrix) usando técnicas estándar. El análisis de los datos se realizó con los paquetes de software R (http://www.r-project.org) y Bioconductor (http://www.bioconductor.org).
Análisis de RT-PCR
Los cebadores específicos de R. hominis 5'-CCCACTGACAGAGTATGTAATGTAC-3' y 5'-GCACCACCTGTCACCAC-3' se usaron para el análisis por PCR de muestras fecales para validar los niveles de colonización intestinal. El análisis de PCR en tiempo real se realizó usando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems) con la mezcla maestra de PCR verde Power SYBR (Applied Biosystems). Todas las muestras se realizaron por triplicado. Se usó GyrA como gen de referencia para la normalización. Para la expresión génica del huésped, el ARN eucariota total aislado del íleon y el colon ascendente se transcribió de forma inversa en ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). El análisis de PCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems) con el kit de PCR verde QuantiFast SYBR (Qiagen) y los ensayos de cebador QuantiTect (Qiagen). Todas las muestras se realizaron por triplicado. Se seleccionó Hprt como gen de referencia para la normalización. Todos los datos de RT-PCR se analizaron en una escala logarítmica con base 2 mediante ANOVA unidireccional con un valor de corte significativo de P <0,05. Las diferencias se transformaron de nuevo para calcular los factores de cambio.
Transferencia de Western
Se produjeron anticuerpos policlonales de conejo inmunopurificados contra FlaA1 y FlaA2 de Roseburia hominis como se describe en Duck et al. (Duck et al. 2007). Para la transferencia de Western, se cultivó R. hominis en presencia de cantidades variables (0,01 g a 1 g de dieta/10 ml de cultivo) de comida estándar para ratones irradiada con UV durante 3 h, se filtró para eliminar los componentes de la dieta y se diluyó en tampón laemmli que contenía urea 8 M. Las muestras se cargaron en un gel Bis-Tris al 4-12 % NuPAGE® Novex® (Invitrogen) y se sometieron a electroforesis seguido de un procesamiento adicional usando el sistema de inmunodetección cromogénica WesternBreeze (Invitrogen). Se usaron los anticuerpos de FlaA1 y FlaA2 a 1:1000 y anti-ADN girasa A de control de carga (Abcam) a 1:300 seguido de anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina. La detección se realizó mediante el desarrollo del color del sustrato en relación con el desarrollo del color del control de carga.
Inmunofluorescencia
Se examinó la inmunolocalización de la flagelina de R. hominis en el contenido de colon de ratones usando antisueros específicos producidos contra secuencias peptídicas definidas de las proteínas flagelinas tanto FlaA1 como FlaA2. Los frotis de contenido intestinal se fijaron en metanol enfriado previamente, se incubaron con antisueros de conejo anti-FlaA1 o anti-FlaA2 (CovaLabs) a 4 °C durante una noche y se visualizaron usando anti-conejo 488 de burro Alexa (Molecular Probes).
Se examinaron los marcadores de linfocitos T en una criosección secuencial de 8 pm. Las secciones tisulares fijadas se incubaron con Ly6G-FITC, CD3-FITC, CD11b-FITC (BD Biosciences), se marcaron doblemente con anticuerpo primario FoxP3 (Abcam) y CD3-FITC (BD Biosciences) o IgG isoespecífica. Las secciones se contratiñeron con DAPI y se montaron con Vectashield (Vector Laboratories). Para la cuantificación de células positivas, se examinó un mínimo de cinco campos de visión de cada sección de ratón.
Clonación y purificación de flagelinas recombinantes
Se aislaron genes de flagelina de cultivos bacterianos líquidos de R. hominis, R. intestinalis, S. typhimurium, S. enteritidis, Eubacterium rectale 33656 y E. coli K12 mediante amplificación y purificación por PCR. Las células Caco-2 se incubaron con flagelinas recombinantes a una concentración final de 100 ng/pl durante 2 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 75 % de CO2 al 5 %.
Aislamiento de células intestinales y MLN
Se aislaron células del intestino delgado y del ganglio linfático mesentérico como se ha descrito previamente con modificaciones secundarias (Monteleone et al. 2008). Brevemente, las suspensiones celulares se incubaron con 100 U/ml de colagenasa VIII (Sigma-Aldrich) en RPMI complementado con FBS al 20 % a 37 °C durante 20 min (ganglios linfáticos mesentéricos) o 1 hora (trozos intestinales). A continuación, se analizaron las suspensiones de células individuales mediante citometría de flujo (como se describe).
Generación de cultivos y células dendríticas derivadas de la médula ósea
Se recogió médula ósea de fémur y tibia de ratones C3H/HeN y C57BI6. Para las células dendríticas derivadas de GMCSF, las células de médula ósea se resuspendieron a 1x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 20 ng/ml de rmGM-CSF y se sembraron a razón de 10 ml/placa en placas de cultivo tisular de 100 mm2. Después de tres días de cultivo, se recogieron células poco adherentes y se volvieron a colocar en placas con medio complementado con GM-CSF a 1x106/ml en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos. El día 5, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerlas el día 6. Para las células dendríticas derivadas de Flt3L, las células de médula ósea se resuspendieron a 2x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 200 ng/ml de rmFlt3 y se sembraron a 2 ml/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Las células se cultivaron durante 10 días con medio complementado con Flt3 añadido a cada pocillo el día 4. El día 9, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerse el día 10 y analizarse mediante citometría de flujo.
Citometría de flujo
Se incubaron suspensiones de células individuales de células de la lámina propia y células dendríticas en tampón de bloqueo (que contenía suero y anticuerpo CD16/CD32) a 4 °C durante 15 min antes de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos. Las células de la lámina propia se marcaron con anticuerpos contra CD4-FITC y CD25-APC (eBioscience), CD8-APC-Cy7 y CD3-PerCP (Biolegend) y B220-BV570 (BD Biosciences) de ratón. El marcaje intracelular de FoxP3 se realizó después de la tinción extracelular y la fijación/permeabilización celular según las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las células dendríticas derivadas de GMCSF se marcaron con anticuerpos CD11c-PE-Cy7, CD11-PerCP Cy5, I-A/I-E -APC-Cy7, CD80-PE, CD86-APC, CD8-FITC, B220-BV570. Las células dendríticas derivadas de Flt3 se marcaron con células CD11c-PE-Cy7-, CD11 b- o Siglec-H-PerCP Cy5-, I-A/I-E -APC-Cy7, CD317 -PE, CD40-APC, CD103-FITC, B220-BV570 se analizaron usando un software FACSArria (BD Biosciences) y FlowJo versión 7.2.5.
Matriz de perlas citométricas (CBA, por sus siglas en inglés)
Se aislaron células de médula ósea de fémur y tibia con medio RPMI de ratones C3H/HeN y C57BI/6 y se expandieron con Flt3L como se ha descrito previamente. Las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) después de 9 días de cultivo, y el sobrenadante se recogió el día 10. El experimento se realizó en tres ocasiones distintas para crear N = 3.
El análisis CBA se realizó en sobrenadantes de células usando el kit de tampón maestro de sensibilidad mejorada de ratón de matriz de perlas citométricas (BD Biosciences). Los estándares y las muestras se cargaron en una placa de 96 pocillos para su medición en un FACSArray (BD Biosciences). Los resultados se analizaron usando el software BD FCAP (BD Biosciences).
Histología
Se fijaron muestras de tejido de colon ascendente en formalina tamponada neutra (Sigma), se incorporaron a resina de curado en frío y se tiñeron secciones de tejido de 4 pm usando procedimientos estándar de hemotoxilina/eosina. Se obtuvieron imágenes de un área de sección transversal completa del colon de cada animal con un aumento de x200 en un microscopio Zeiss Axioskop usando una cámara Qlmaging controlada por el software Image Pro Plus. A continuación, cada campo de visión se puntuó de 0-4 según un procedimiento basado en Berg et al. (Berg et al. 1996). Se calculó el porcentaje medio de los campos de visión en un grado dado y se compararon los grupos de tratamiento mediante el análisis de la prueba de la t para datos emparejados.
Se describen protocolos detallados adicionales en los Materiales y procedimientos complementarios.
Materiales y procedimientos de información complementaria (SI, por sus siglas en inglés)
Condiciones del crecimiento bacteriano
Se cultivó de forma anaerobia A2-183T (=DSM 16839T=NCIMB 14029T) de R. hominis en medio YCFA sintético o M2GSC complejo. El cultivo se inoculó a partir de solución madre congelada en tubos Hungate y se incubó durante una noche a 37 °C. A continuación, las bacterias se cultivaron en placas de agar M2GSC durante 48 h en una estación de trabajo anaerobia MACS-MG-1000 (Don Whitley Scientific) en una atmósfera de N2 al 80 %, CO2 al 10 % y H2 al 10 % a 37 °C. El efecto de la mucina se investigó añadiendo mucina al 0,5 % (p/v) de estómago porcino tipo III (Sigma-Aldrich) al medio YCFA.
Para la colonización de ratones libres de gérmenes (GF), se cultivó R. hominis en medio YCFA durante una noche a 37 °C. El cultivo se centrifugó y el sedimento se resuspendió en un ml de medio YCFA, complementado con cisteína al 2 % (p/v, Sigma-Aldrich) y ácido ascórbico al 3 % (p/v, Sigma-Aldrich).
Ratones
Se adquirieron ratones C3H/HeN y C57BI/6 de Harlan Laboratories. Los ratones se alojaron dentro de aisladores de película flexible con filtros HEPA (Bell Isolation Systems) en la Universidad de Aberdeen. Se proporcionaron C3H/HeN GF y se mantuvieron en la instalación de cría de roedores gnotobióticos del INRA en Jouy-en-Josas (plataforma ANAXEM, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Francia). Se proporcionaron TLR5KO libres de gérmenes y C57BI/6 de tipo silvestre por Andrew Gewirtz (Center for Inflammation, Immunity, and Infection and Department of Biology, Georgia State University, Atlanta, GA 30303, EE.UU.) y se mantuvieron en la instalación de cría de roedores gnotobióticos del INRA en Jouy-en-Josas. Los procedimientos de gestión y experimentales se aprobaron por los respectivos comités locales de revisión ética.
Experimentos con ratones
Se asignaron dieciocho ratones macho C3H/HeN GF a grupos de control (N = 8) y de tratamiento (N = 10) y se enjaularon individualmente en aisladores de plástico. Los ratones se alimentaron a voluntad con una dieta comercial esterilizada (R03-40; UAR). Los días 0, 1 y 2, los animales del grupo de tratamiento recibieron 100 pl de cultivo de R. hominis por sonda nasogástrica, mientras que los animales de control recibieron 100 pl de medio YCFA. A los 14d y 28d, se sacrificaron cuatro animales de control y cinco animales tratados con R. hominis. El íleon y el colon ascendente se dividieron en cuatro partes iguales y se transfirieron a RNAlater (Ambion), formalina tamponada neutra (NBF; Sigma-Aldrich) o nitrógeno líquido. Todo el ciego se transfirió a RNAlater.
Para demostrar la especificidad de la respuesta a R. hominis, se trataron seis ratones macho C3H/HeN GF con MG1655 (K12) de E. coli, y se sacrificaron tres animales a los 10d y 22d como se ha descrito anteriormente para dar N = 3.
Se inocularon tres ratones TLR5KO GF y tres ratones C57BI/6 WT con cultivo de R. hominis como se ha descrito anteriormente para evaluar la importancia funcional de las flagelinas de R. hominis. Después de 28d, estos animales se sacrificaron junto con sus equivalentes GF.
Se usaron veintidós ratones hembra C57BL/6 (6 semanas de edad) para evaluar el efecto terapéutico de R. hominis durante la colitis inducida por DSS. Después de un período de aclimatación de 7-10 días, los ratones recibieron una dosis diaria de 50 pl de 109 UFC de R. hominis durante 14 días. Los animales de control recibieron una dosis de medio de cultivo solo. A partir del día 8, los ratones recibieron DSS (PM 50 kDa, 30 g/l) en el agua de bebida durante 6 días. Los animales se sacrificaron el día 14 y se realizó el muestreo de tejido como se ha descrito anteriormente.
Experimentos de cultivo tisular
Todos los reactivos de cultivo celular, a menos que se especifique de otro modo, se suministraron por Sigma-Aldrich. Para experimentos de cultivo tisular en condiciones anaerobias, se sembraron 2x105 células Caco-2 o HT29 en 1,5 ml de medio DMEM (alto contenido de glucosa, HEPES) complementado con suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco), penicilina, estreptomicina, anfotericina B y L-glutamina en los compartimentos superiores de una placa Transwell de seis pocillos (Corning). Los compartimentos inferiores contenían 3,0 ml del mismo medio. Las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 % hasta tres días después de la confluencia, se lavaron con solución de Hanks para eliminar los antibióticos y FCS y se redujeron en DMEM complementado con L-glutamina, selenito de sodio y transferrina durante 24 h sin antibióticos. A continuación, los insertos de Transwell se transfirieron a una caja de cultivo anaerobia dentro de la estación de trabajo anaerobia a 37 °C. El compartimento superior de cada inserto se llenó con medio celular DMEM anaerobio, mientras que el compartimento inferior se llenó con DMEM oxigenado.
El cultivo de A2-183 R. hominis se recogió en fase exponencial mediante centrifugación a 3.500xg durante 5 min. El sedimento se lavó y se resuspendió en 0,8 ml de DMEM anaerobio. Se añadieron cien microlitros de suspensión bacteriana (108 UFC/ml) en los pocillos experimentales. Los pocillos de control recibieron la misma cantidad de medio sin células bacterianas. Los controles adicionales incluyeron células bacterianas incubadas sin células Caco-2 o HT29. Se recogieron células bacterianas y eucariotas después de 2 h y 4 h de incubación. Tanto las bacterias adherentes como las no adherentes se aspiraron y se almacenaron en RNAlater (Ambion). La viabilidad de las células de R. hominis se ensayó colocándolas en placas de YCFA. Se recogieron células Caco-2 o células HT-29 de los pocillos y también se almacenaron en RNAlater.
Se recogió el cultivo de L1-82T (=DSM 14610T=NCIMB 13810T) de R. intestinalis en fase exponencial mediante centrifugación a 3.500xg durante 5 min. El sedimento se lavó y se resuspendió en 0,8 ml de DMEM anaerobio. Se añadieron cien microlitros de suspensión bacteriana (108 UFC/ml) en los pocillos experimentales. Los pocillos de control recibieron la misma cantidad de medio sin células bacterianas. Los controles adicionales incluyeron células bacterianas incubadas sin células Caco-2 o HT29. Se recogieron células bacterianas y eucariotas después de 2 h y 4 h de incubación. Tanto las bacterias adherentes como las no adherentes se aspiraron y se almacenaron en RNAlater (Ambion). La viabilidad de las células de R. intestinalis se ensayó colocándolas en placas de YCFA. Se recogieron células Caco-2 o células HT-29 de los pocillos y también se almacenaron en RNAlater.
Para experimentos de cultivo tisular con flagelinas recombinantes, se sembraron 5x104 células Caco-2 en placas de 24 pocillos en medio DMEM (alto contenido de glucosa, HEPES) complementado con suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco), penicilina, estreptomicina, anfotericina B y L-glutamina a 37 °C en una atmósfera humidificada al 75 % de CO2 al 5 %. Las células alcanzaron la confluencia el día 5-6 y se usaron 3 días después de la confluencia.
Antes de cualquier tratamiento, las células se lavaron dos veces con una solución salina equilibrada de Hanks y se mantuvieron en DMEM complementado con L-glutamina, selenio y transferrina durante 24 horas.
Construcción de la biblioteca de R. hom inis
Se aisló ADN cromosómico de R. hominis para la construcción de bibliotecas de tamaño pequeño y la pirosecuenciación usando un kit de aislamiento de ADN microbiano UltraClean™ (Mo Bio Laboratories Inc) y se aisló ADN de alto peso molecular para bibliotecas de fosmidos usando un kit de purificación de ADN genómico Wizard (Promega). La integridad del ADN se comprobó mediante electroforesis en gel.
El ADN se sometió a cizallamiento mecánicamente usando un kit nebulizador (Invitrogen) y se fraccionó mediante electroforesis en gel. Los fragmentos de ADN del tamaño deseado se escindieron del gel y se purificaron usando un gel Wizard® SV y un sistema de limpieza de PCR (Promega). La reparación del extremo se realizó con un kit de reparación de extremos de terminador de ADN (Lucigen). Se clonaron fragmentos de 1,5-3,5 kb usando el kit CloneSmart® LCAmp (Lucigen) y se construyó una biblioteca de 4-8 kb usando el vector pJAZZ®-OC (Lucigen). Las bibliotecas de fosmidos se construyeron usando el kit de producción de bibliotecas de fosmidos CopyControl™ (Epicenter Biotechnologies). Las colonias se recogieron usando un recolector de colonias automático (BioRobotics BioPick, Genomic Solutions) y se archivaron en placas de microtitulación de 384 pocillos que contenían 70 pl de medio 2xLB complementado con glicerol al 10 % y el antibiótico correspondiente. Las células se cultivaron durante una noche a 37 °C con agitación y se almacenaron a -80 °C.
Secuenciación, ensamblaje y anotación
Se generaron plantillas para la secuenciación de bibliotecas de tamaño pequeño mediante PCR usando un pl de biomasa de clones y los cebadores SL1 y SR2 que rodean el sitio de clonación de pSMART-LCAmp. Los productos de PCR se purificaron usando placas de filtro de limpieza de PCR Multiscreen (Millipore). El ADN recombinante de los clones pJAZz®-OC se aisló usando el sistema de purificación de ADN plasmídico Wizard® SV 96 (Promega). El ADN fosmídico se aisló usando el kit de purificación de ADN FosmidMAX™ (Epicenter). Se obtuvieron lecturas finales de fragmentos de ADN de bibliotecas WGS de R. hominis con diferentes tamaños de inserto usando secuenciadores de ADN CEQ8000 (Beckman Coulter) y ABI 3770 (Applied Biosystems). El ADN genómico de R. hominis también se secuenció usando los secuenciadores 454 GS20 (454 Life Sciences) y 454 FLX (Roche). Los datos de Sanger y 454 se ensamblaron con MIRA versión 3 (http://chevreux.org/projects_mira.html; (1). Se usó la canalización de anotaciones RAST (http://rast.nmpdr.org; (2)) para la anotación automática y manual del genoma y para análisis genómicos comparativos. La secuencia genómica anotada de A2-183 de R. hominis se envió a GenBank con el número de acceso CP003040.
Análisis de m icromatrices
Micromatriz bacteriana
Se aisló ARN bacteriano del contenido del ciego de ratón usando el mini kit RNeasy (Qiagen) y se procesó posteriormente con el kit MICROBEnrich™ (Ambion), el kit de enriquecimiento de ARNm bacteriano MICROBExpress™ (Ambion), y el kit de amplificación de ARN bacteriano de MessageAmp™ II (Applied Biosystems). El ARN se marcó con dCTP-Cy3 o dCTP-Cy5 durante la síntesis de ADNc (kit de marcaje de ADNc de primera hebra CyScribe; Amersham). Los productos marcados se purificaron usando el kit de purificación CyScribe GFX (Amersham). Los productos de PCR amplificados a partir de 6000 clones en la biblioteca de plásmidos RA8 de E. coli de R. hominis se dispusieron por duplicado en portaobjetos de microscopio recubiertos con aminosilano (Corning) usando un MicroGrid II TAS (BioRobotics). Los fragmentos amplificados de los genes constitutivos rpoD y gyrA se distribuyeron aleatoriamente en la matriz como controles. La hibridación de micromatrices se realizó en la estación de hibridación GeneTAC (Genomic Solutions). El marcaje con tinte se cambió por una segunda hibridación, y también se marcó una purificación de ARN separada y se hibridó dos veces, para garantizar la reproducibilidad y para obtener resultados estadísticamente significativos. En total, se hibridaron cuatro portaobjetos para cada comparación, para un total de 12 manchas de hibridación por clon amplificado. La fluorescencia se midió en dos canales usando un GeneTAC LS IV (Soluciones genómicas) con el software GeneTac Integrator versión 3.0.1. Las intensidades de las manchas se transformaron logarítmicamente y se aplicó la normalización de Loess para eliminar las diferencias en el etiquetado de la sonda y las eficiencias de hibridación. La prueba t de una muestra se usó en los valores de la razón logarítmica para probar la expresión diferencial. Los datos se consideraron significativos cuando el factor de cambio fue >2 y P <0,05.
Análisis de m icromatrices de ratón
Se extrajo el tejido del íleon y del colon ascendente de RNAlater y se lisó en Trizol (Invitrogen). El ARN se aisló usando etapas estándar de cloroformo/isopropanol. El ARN total se purificó adicionalmente con el kit RNeasy (Qiagen), incluida una etapa de digestión de DNasa I sin ARNasa (Qiagen). La integridad del ARN se determinó usando el bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). El ARN total se procesó en ARNc marcado con biotina usando el kit de etiquetado de diana de un ciclo (Affymetrix) o el ARNa marcado con biotina usando el equipo 3' IVT Express (Affymetrix). Se realizó la hibridación con matriz de ratón GeneChip NuGO y matriz de genoma de ratón GeneChip (Affymetrix) en una estación de fluidos GeneChip 450 (Affymetrix) en el Institute of Medical Sciences Microarray Core Facility (Universidad de Aberdeen, Reino Unido). Los chips se escanearon con un escáner Affymetrix GeneChip 3000 (Affymetrix). El análisis de la calidad de la imagen se realizó usando el software operativo Gene Chip (GCOS) (Affymetrix). Se realizaron análisis de datos adicionales con los paquetes de software disponibles gratuitamente (http://www.r-project.org) y Bioconductor (http://www.bioconductor.org). La prueba F moderada proporcionada por el paquete bioconductor limma se usó para probar la expresión diferencial. Los datos se consideraron significativos cuando P <0,05 usando el procedimiento de falso descubrimiento de Benjamini y Hochberg. El análisis estadístico se realizó por separado para cada uno de los dos puntos temporales. Todos los genes expresados diferencialmente (P <0,05) se importaron al software analítico MetaCore (GeneGo, St Joseph, MI) para generar mapas de vías. El análisis de enriquecimiento de la vía integrada se realizó usando las vías canónicas basadas en el conocimiento y las vías metabólicas endógenas. La clasificación de las vías integradas relevantes se basó en los valores de P calculados usando una distribución hipergeométrica. Los valores de P representaban la probabilidad de que un número dado de genes de la lista de entrada coincidiera con un determinado número de genes en el mapa por casualidad, considerando el número de genes en el experimento frente al número de genes en el mapa dentro del conjunto completo de todos los genes en los mapas.
La interpretación funcional basada en ontología génica (GO) de los datos se realizó usando DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov), una versión ampliada del programa original accesible por web (3). Se asignaron transcritos significativamente diferentes (P <0,05) en la categoría de GO "Proceso biológico" para descubrir patrones de la expresión génica enriquecidos significativamente para términos de GO específicos.
Se enviaron datos de micromatrices al National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (número de acceso GSE25544;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo).
Análisis de RT-PCR
Los cebadores específicos de R. hominis 5'-CCCACTGACAGAGTATGTAATGTAC-3' y 5-GCACCACCTGTCACCAC-3' se usaron para el análisis por PCR semicuantitativo y en tiempo real de muestras fecales para validar los niveles de colonización intestinal. Se diseñaron cebadores de PCR bacterianos adicionales usando la herramienta en línea Primer3Plus (4) y se adquirieron en Sigma-Aldrich. El análisis de PCR en tiempo real se realizó usando un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems) con la mezcla maestra de PCR verde Power SYBR (Applied Biosystems). La PCR se realizó de la siguiente manera: un ciclo a 95 °C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min, finalizando con una etapa de disociación. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Se usó GyrA como gen de referencia para la normalización debido a su baja variación entre muestras.
Para la expresión génica del huésped, se transcribieron de forma inversa 2 pg de ARN eucariota total aislado del íleon y el colon ascendente en ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) con cebadores aleatorios. El análisis de PCR en tiempo real se realizó utilizando un sistema de p Cr en tiempo real rápido 7500 (Applied Biosystems) con el kit de PCR verde QuantiFast SYBR (Qiagen) y los ensayos de cebador QuantiTect (Qiagen). Las condiciones de los ciclos de PCR fueron las siguientes: un ciclo a 95 °C durante 5 min, seguido de 40 ciclos a 95 °C durante 10 segundos y a 60 °C durante 30 segundos, finalizando con una etapa de disociación. Todas las muestras se realizaron por triplicado. Se seleccionó Hprt como gen de referencia para la normalización debido a su baja variación entre muestras.
Todos los datos de RT-PCR se analizaron en una escala logarítmica con base 2 mediante ANOVA unidireccional con un valor de corte significativo de P <0,05. Las diferencias se transformaron de nuevo para calcular los factores de cambio.
Transferencia de Western
Se produjeron anticuerpos policlonales de conejo inmunopurificados contra Fla1 y Fla2 de Roseburia hominis como se describe en Duck et al. (5) En resumen, se inmunizaron conejos hembra de color blanco New Zealand con péptido sintético en adyuvante completo de Freund y se reforzaron varias veces. Para Fla1 de R. hominis, se usaron el péptido NH2-CRSQVRGLNKASDNA-CONH2 y el péptido NH2-IDGNFTSKKLQVGSLC-COOH, mientras que para Fla2 de R. hominis, se usaron el péptido C-AQy Nd Da Ks VLEILK-COOH y el péptido C-GLNKASRNSQDGIS-CONH2. Después de la inmunización, los anticuerpos se purificaron en una columna de inmunoafinidad preparada acoplando los péptidos a 1 ml de perlas de sepharose activadas.
Para la transferencia de Western, se cultivó R. hominis en presencia de cantidades variables (0,01 g a 1 g de dieta/10 ml de cultivo) de comida estándar para ratones irradiada con UV durante 3 h, se filtró para eliminar los componentes de la dieta y se diluyó en tampón laemmli que contenía urea 8 M. Se cargaron treinta pl de cada muestra en pocillos de un gel Bis-Tris al 4-12 % NuPAGE® Novex® (Invitrogen) y se sometieron a electroforesis seguido de un procesamiento adicional usando el sistema de inmunodetección cromogénica WesternBreeze (Invitrogen). Los anticuerpos de Fla1 y Fla2 se diluyeron 1:1000 y la anti-ADN girasa A de control de carga (Abcam) se diluyó 1:300 en diluyente de anticuerpos y se incubaron durante una noche a 4 °C seguido de 1 h a temperatura ambiente con anti­ conejo conjugado con fosfatasa alcalina. La detección se realizó mediante el desarrollo del color del sustrato en relación con el desarrollo del color del control de carga.
Análisis por FISH
Se incluyeron tejidos fijados en formalina tamponada neutra en Technovit 8100 (Heraeus Kulzer). Se cortaron secciones de dos micrómetros utilizando un micrótomo rotatorio (Leica/Reichert Autocut). Se tomaron tres secciones por portaobjetos a 100 pm, 200 pm y 300 pm en el tejido, dando como resultado nueve secciones por animal.
Los portaobjetos se deshidrataron mediante incubaciones consecutivas en etanol al 50 % (v/v), 80 % y 96 % y se secaron a temperatura ambiente (TA). Las sondas FISH de ARNr 16S usadas fueron una sonda bacteriana general Eub338 (GCTGCCTCCCGTAGGAGT; Cy3) y una sonda específica de A2-183 de R. hominis de nuevo diseño (GTACATTACATACTCTGTCAGTG; FITC), que se sometió a pruebas exhaustivas para determinar su especificidad frente a un panel de aislados bacterianos intestinales. Se aplicó una sonda de diez microlitros (30 ng/pl) en 100 pl de tampón de hibridación a la muestra deshidratada y se incubó a la temperatura específica de la sonda. Los portaobjetos se lavaron en tampón de lavado a 50 °C durante 30 min, se sumergieron en agua enfriada con hielo para eliminar el tampón de lavado residual y se secaron bajo un flujo de aire comprimido. La contratinción se realizó con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Vector Laboratories Inc) y los portaobjetos se montaron con medio de montaje Vectashield para fluorescencia (Vector Laboratories Inc) para evitar la decoloración. Las bacterias se visualizaron usando un microscopio de fluorescencia Leica DM RBE (Leitz GMBH) y se fotografiaron con una cámara Penguin 600CL (Pixera) y el software Viewfinder 3.0 (Studio Lite). Se recuperaron imágenes de gran aumento (x630) usando el sistema Apochromatics (Leica).
Inmunofluorescencia
Se examinó la inmunolocalización de la flagelina de R. hominis en el contenido de colon de ratones colonizados con R. hominis usando antisueros específicos producidos contra secuencias peptídicas definidas de las proteínas flagelinas tanto Fla1 como Fla2. El contenido del intestino se diluyó en PBS, se extendió sobre portaobjetos de vidrio y se secó al aire. Los frotis se fijaron en metanol enfriado previamente durante 5 min a -20 °C, se incubaron con antisueros de conejo anti-Fla1 o anti-Fla2 (1:125, CovaLabs) durante una noche a 4 °C y se visualizaron usando anti conejo 488 de burro Alexa (1:1000, Molecular Probes).
Las secciones se fijaron en metanol enfriado previamente durante 30 min a -20 °C. La inmunolocalización de los marcadores de linfocitos T se examinó en criosecciones secuenciales (8 pm). Las secciones se fijaron en metanol enfriado previamente durante 30 min a -20 °C (Ly6G FITC, CD3 FITC, CD11b FITC, todos a 1:50 (Bd Biosciences)), o para FoxP3 doblemente marcado (1:500, Abcam) con CD3 FITC (1:100, BD Biosciences) fijado en paraformaldehído (PFA) al 1 % durante 2 min a TA seguido de 3 min en Triton X al 0,01 % en PBS. Todas las secciones se bloquearon con BSA al 10 % (Sigma) que contenía sueros preinmunes relevantes al 10 % en PBS (pH 7,4). Los tejidos fijados con metanol se incubaron con anticuerpos primarios durante 1 h a TA. Las secciones fijadas con PFA se incubaron con anticuerpos durante una noche a 4 °C. Se visualizó FoxP3 usando anti conejo 594 de cabra Alexa (1:1000, Molecular Probes). Las secciones se contramarcaron con DAPI y se montaron con Vectashield (Vector Laboratories). Para la cuantificación de las células positivas, se examinó un mínimo de cinco campos de visión de cada sección de ratón, usando software de imágenes y la configuración del microscopio descrita anteriormente.
Histología
Se fijaron muestras de tejido de colon ascendente durante tres horas en formalina tamponada neutra (Sigma) a temperatura ambiente con agitación constante. Las muestras se lavaron abundantemente en PBS y a continuación se transfirieron a etanol al 70 % y se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se orientaron para el corte transversal y se incorporaron en resina de curado en frío usando Technovit 8100 (Heraeus Kulzer) según las instrucciones del fabricante. El tejido incorporado se montó en Histoblocs usando Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Se cortaron secciones de cuatro micrómetros usando un micrótomo rotatorio (Leica Autocut) equipado con una cuchilla de vidrio (TAAB Laboratories Equipment Ltd.). Las secciones de tejido se tiñeron usando procedimientos estándar de hematoxilina/eosina. Se obtuvieron imágenes de un área de sección transversal completa de un colon ascendente de cada animal con un aumento de x200 en un microscopio Zeiss Axioskop usando una cámara Qlmaging controlada por el software Image Pro Plus. A continuación, cada campo de visión se puntuó de 0-4 según un procedimiento basado en Berg et al. (6). Las puntuaciones de histopatología fueron 0 = Criptas poco profundas, pocas o ninguna célula inflamatoria infiltrante, epitelio intacto, las células caliciformes parecen llenas de mucina (sin patología); 1 = Las criptas pueden exhibir una ligera hiperplasia de células epiteliales, pueden verse algunas células inflamatorias infiltrantes difusas entre las criptas, el epitelio luminal parece intacto, las células caliciformes pueden parecer ligeramente desprovistas de mucina; 2 = Las criptas parecen más profundas con evidencia clara de hiperplasia epitelial, depleción de mucina de las células caliciformes, células inflamatorias infiltrantes evidentes y pueden ser de naturaleza multifocal, aunque no se observan infiltrados en la submucosa; 3 = Las lesiones involucran un área más grande de la mucosa y/o son más frecuentes que las observadas en el grado 2. Las lesiones no involucran la submucosa. Las células epiteliales luminales presentan pequeñas erosiones. Las lesiones no son transmurales; 4 = El epitelio de la cripta parece erosionado. Puede haber abscesos. Las células epiteliales luminales parecen irregulares, a veces con pérdida completa. Se observa un infiltrado transmural, a menudo asociado con la pérdida completa de células epiteliales hacia el lumen.
Se calculó el porcentaje medio de los campos de visión en un grado dado y se compararon los grupos de tratamiento mediante el análisis de la prueba de la t para datos emparejados.
Clonación y purificación de flagelinas recombinantes
Se aislaron genes de flagelina de cultivos bacterianos líquidos de R. hominis, R. intestinalis, S. typhimurium, S. enteritidis, Eubacterium rectale 33656 y E. coli K12 mediante amplificación y purificación por PCR. El fragmento de flagelina purificado de R. hominis se insertó en el vector de expresión pT7-MAT-Tag-FLAG (Sigma) y los fragmentos de flagelina de S. enteritidis y E. coli K12 se insertaron en el vector de expresión pGEX-6P-1 (GE Healthcare). La flagelina recombinante se expresó mediante transformación de ADN plasmídico en células de E. coli BL21 Rosetta y E. coli BL21 (DE3), respectivamente, e inducción con IPTG 1 mM (isopropil b-D-galactosidasa). Se recuperaron flagelinas de lisados celulares con perlas FLAG (Sigma) y perlas Ni-NTA (níquel-nitriloacético) (Clontech, Takara) según las instrucciones del fabricante. La pureza de la preparación se evaluó mediante SDS-PAGE teñida con una solución de azul de Coomassie. La actividad de los fragmentos de flagelinas se determinó mediante ensayo de luciferasa (Promega) según las instrucciones del fabricante usando la línea de células Caco-2 transformada con NF-kB.
Las células Caco-2 se incubaron con flagelinas recombinantes a una concentración final de 100 ng/pl durante 2 h a 37 °C en una atmósfera humidificada al 75 % de CO2 al 5 %. Después del tratamiento, las células se lavaron dos veces con una solución de PBS y se recogieron para el aislamiento de ARN total.
Aislamiento de células intestinales y MLN
Se aislaron células del intestino delgado y del ganglio linfático mesentérico como se ha descrito previamente con modificaciones secundarias (7). Brevemente, las suspensiones celulares se incubaron con 100 U/ml de colagenasa VIII (Sigma-Aldrich) en RPMI complementado con FBS al 20 % a 37 °C durante 20 min (ganglios linfáticos mesentéricos) o 1 hora (trozos intestinales). A continuación, se analizaron las suspensiones de células individuales mediante citometría de flujo.
Generación de cultivos y células dendríticas derivadas de la médula ósea
Se recogió médula ósea de fémur y tibia de ratones C3H/HeN y C57BI6 como se ha descrito previamente (8-11). Para las células dendríticas derivadas de GMCSF, las células de médula ósea se resuspendieron a 1x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 20 ng/ml de rmGM-CSF y se sembraron a razón de 10 ml/placa en placas de cultivo tisular de 100 mm2. Después de tres días de cultivo, se recogieron células poco adherentes y se volvieron a colocar en placas con medio complementado con GM-CSF a 1x106/ml en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos. El día 5, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerlas el día 6. Para las células dendríticas derivadas de Flt3L, las células de la médula ósea se resuspendieron a 2x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 200 ng/ml de rmFlt3 y se sembraron a 2 ml/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Las células se cultivaron durante 10 días con 2 ml más de medio complementado con Flt3 añadido a cada pocillo el día 4. El día 9, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerlas el día 10. Las células se recogieron de las placas mediante pipeteo suave y se analizaron mediante citometría de flujo.
Citometría de flujo
Se incubaron suspensiones de células individuales de células de la lámina propia, células de ganglios linfáticos mesentéricos y células dendríticas en tampón de bloqueo (que contenía suero y anticuerpo CD16/CD32) a 4 °C durante 15 min antes de la tinción con anticuerpos conjugados con fluorocromo específicos. Las células de la lámina propia se marcaron con anticuerpos contra CD4-FITC y CD25-APC (eBioscience), CD8-APC-Cy7, CD3-PerCP Cy5.5 y B220-BV570 (Biolegend) de ratón. El marcaje intracelular de FoxP3-PE (eBioscience) se realizó después de la tinción extracelular y la fijación/permeabilización celular según las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las células dendríticas derivadas de GM-CSF se marcaron con anticuerpos CD11b-PerCP Cy5.5 (BD Biosciences), CD11c-PE-Cy7, I-A/I-E -APC-Cy7, CD80-PE, CD86-APC, CD8-FITC, B220-BV570 (Biolegend). Las células dendríticas derivadas de Flt3L se marcaron con CD11c-PE-Cy7-, CD11b- o Siglec-H-PerCP Cy5.5 (Bioegend), I-A/I-E -APC-Cy7, CD317-PE, CD40-Alexa Fluor 647, CD103-FITC, B220-BV570. Las células se analizaron usando un software FACSAriall (BD Biosciences) y FlowJo versión 7.2.5.
Matriz de perlas citométricas (CBA, por sus siglas en inglés)
Se aislaron células de médula ósea de fémur y tibia con medio RPMI de ratones C3H/HeN y C57BI/6 y se expandieron con Flt3L como se ha descrito previamente. Las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelina (por ejemplo, flagelina de Roseburia) después de 9 días de cultivo, y el sobrenadante se recogió el día 10. El experimento se realizó en tres ocasiones distintas para crear N = 3.
El análisis CBA se realizó en sobrenadantes de células usando el kit de tampón maestro de sensibilidad mejorada de ratón de matriz de perlas citométricas (BD Biosciences) según las instrucciones del fabricante. Los estándares y las muestras se cargaron en una placa de 96 pocillos para su medición en un FACSArray (BD Biosciences). Los resultados se analizaron usando el software BD FCAP (BD Biosciences).
Análisis del peso corporal seco y de la canal lipídica
Se pesó la canal de ratón eviscerada, se liofilizó hasta un peso constante y a continuación se molió para su análisis. El contenido lipídico se determinó mediante extracción (1:100 p/v) con cloroformo/metanol (2:1 v/v) como se ha descrito previamente (12 ).
Clonación de flagelinas de Roseburia.
Am plificación p o r PCR del gen de flagelina a p a rtir de cultivo de bacterias líquido.
Las secuencias de flagelina A2-183 de Roseburia hominis se recuperaron del sitio web del National Center for biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Las secuencias de L1-82T (NCIMB = 13810; DSM = 14610 T) de Roseburia intestinalis se recuperaron del sitio web del National Center for biotechnology Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Los números de acceso para los genes y proteínas de flagelina se proporcionan en la Tabla B (Tabla B - resumen de los números de acceso para flagelinas de Roseburia descritas en esta invención) ***
Aislam iento de ARN tota l de bacterias
Se aisló ARN total de 1 ml de cultivo líquido de bacterias en fase logarítmica usando el mini kit RNAeasy (Qiagen, Sussex, Reino Unido), acoplado a la digestión con DNasa I sin ARNasa (Qiagen) y según el protocolo del fabricante. En resumen, se puso un mililitro de cultivo líquido en un tubo de 1,5 ml, se centrifugó a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El sedimento bacteriano se resuspendió en 100 pl de tampón TE que contenía lisozima (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) y se incubó a TA (temperatura ambiente). Las bacterias grampositivas RH (Roseburia hominis) se incubaron durante 10 min con una concentración de lisozima de 3 mg/ml. A continuación se añadieron al tubo trescientos cincuenta microlitros de tampón de lisis que contenía p-mercapto-etanol al 1 % para alterar las células mediante agitación vorticial y se añadieron 250 pl de etanol al 100 % (Molecular grade, Merck). Se aplicaron setecientos microlitros de la suspensión resultante a la minicolumna RNeasy equipada con un tubo de captura, se centrifugaron durante 15 segundos a 8.000 x g y se vació la captura. De nuevo, se aplicaron 350 pl de tampón de lavado a la columna, que se centrifugó durante 15 s a 8.000 x g y se descartó el flujo continuo. La digestión del ADN se realizó añadiendo a cada columna 30 unidades de DNasa I mezcladas con 70 pl de tampón RDD e incubando a TA durante 15 min. La columna se lavó de nuevo como se ha descrito previamente con 350 pl de tampón de lavado, a continuación dos veces con 500 pl de tampón RPE. Después de secar al aire la columna mediante centrifugación de la columna vacía durante 1 min a 8.000 x g, se añadieron directamente a la columna 40 pl de agua sin ARNasa y se incubaron 1 min a TA a centrifugar durante 1 min a 8.000 x g. El eluido que contenía el a Rn total se midió espectrofotométricamente usando la técnica Nanodrop para determinar la concentración. La integridad del ARN se verificó por el departamento de genómica de RINH (Universidad de Aberdeen, Reino Unido) con un bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). El ARN con un número de integridad (RIN) entre 9,5 y 10 se consideró de excelente calidad. El ARN total se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior.
Transcripción inversa
El ARN total se transcribió de forma inversa usando el kit de transcripción inversa Quantitect (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubó un microgramo de ARN total en un volumen total de 12 pl durante 2 min a 42 °C con tampón de eliminación de ADNg 1x y se mezcló adicionalmente con tampón RT Quantiscript 1x (3 pl), mezcla de cebadores RT (2 pl) y transcriptasa inversa Quantiscript (1 pl) en un volumen final de 20 pl. El programa de transcripción inversa fue de 15 min a 42 °C seguido de 3 min a 95 °C para inactivar la enzima. La concentración de ADN complementario (ADNc) resultante fue de 50 ng/pl y el ADNc se almacenó a -20 °C hasta su uso posterior.
Am plificación p o r PCR de genes de flagelina
Para amplificar la flagelina a partir del ADN genómico, se diseñaron manualmente cebadores directos e inversos y se adquirieron en Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido). La amplificación por PCR de los fragmentos de flagelina se realizó con un cebador directo que insertaba un sitio de restricción BgIII en el extremo 5' y un cebador inverso que insertaba una restricción Xhol en el extremo 3'.
Roseburia hominis (fla 1)
Cebador directo (5'-3'): CTCGAGAT ATGGT AGTACAGCACAA
Cebador inverso (5'-3'): CTTAGATCTCTGTAATAAGGATAATA
Roseburia hominis (fla2)
Cebador directo (5'-3'): CTCGAGATATGGTGGTTAATCATAA
Cebador inverso (5'-3'): CTTAGATCTTTTCAAAATCTCAAGCAC
Roseburia intestinalis (Fla1)
Cebador directo (5'-3'): GCAGGATCCATGCGTGGCGGAGACAAT
Cebador inverso (5'-3'): AATGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGCAGAATCTGCAA
Roseburia intestinalis (Fla2)
Cebador directo (5'-3'): CTCGAGATATGGTAGTTAATCATAA
Cebador inverso (5'-3'): CTTAGATCTTTTTAACATTTCCAACAC
Roseburia intestinalis (Fla3)
Cebador directo (5'-3'): CTCGAGATATGGTAGTACAGCACAA
Cebador inverso (5'-3'): CTTAGATCTCTGTAACAGAGAAAGTA
Roseburia intestinalis (Fla4)
Cebador directo (5'-3'): CCGGGATCCATGGTAGTACAGCACAAT
Cebador inverso (5'-3'): TTAGTGGTGGTGATGATGATGCTGTAACAGAGAAAG
Usando 1 |jl de cultivo bacteriano como molde, los genes de flagelina se amplificaron mediante PCR. El programa térmico para la amplificación se adaptó de Fermentas (Fermentas GMBH, Alemania) para determinar las funciones óptimas de la KOD polimerasa (Novagen, Madison, WI) y fue de 95 °C durante 2 min para la activación de la polimerasa seguido de 34 ciclos de amplificación, 95 °C durante 20 s, temperatura de hibridación durante 10 s y 70 °C durante 20 s finalizando con 2 min a 70 °C usando KOD polimerasa. Los detalles de la mezcla de PCR se dan en la Tabla 1. Los productos de PCR se procesaron en un gel de agarosa al 1 % durante 30 min a 120 V y las bandas de interés se escindieron y se purificaron. El inserto se clonó primero en el vector de clonación pCR™-Blunt II-TOPO usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante y mediante mezcla como se describe en la figura 1A y la Tabla 1.
Tabla 1 Composición de la mezcla para la inserción del producto de PCR en el vector de clonación pCR-Blunt II-TOPO. La solución salina y la mezcla de vector-enzima eran soluciones listas para usar.
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Separación electroforética y purificación de productos de PCR.
Para ver el producto de flagelina aislado amplificado por PCR, la reacción de PCR se mezcló con colorante de carga de color azul-naranja 1x (Promega) y se cargó en un gel de agarosa al 1 % (hecho de agarosa al 1 % diluido en tampón TAE (Tris base 40 mM, ácido acético al 0,1 % (v/v), EDTA 1 mM) hervido y vertido en una bandeja de gel) que contenía 0,5 pg/ml de bromuro de etidio para teñir los ácidos nucleicos. Las muestras migraron durante 30 min por debajo de 120 V usando TAE como tampón de migración. Cuando finalizó la migración, el gel se visualizó bajo ultravioleta (UV) y el producto se identificó usando un patrón de referencia y se cortó con un bisturí limpio. A continuación, la lámina de gel se transfirió a un tubo Eppendorf pesado previamente y se registró su peso por sustracción del peso del tubo vacío. El producto de PCR se purificó. Se añadió una solución de unión a la membrana a la lámina de gel en una relación de 10 pl de solución por cada 10 mg de lámina de gel de agarosa. A continuación, la mezcla se incubó a 65 °C durante 10 min con agitación frecuente con vórtice hasta que la lámina de gel se disolvió por completo. El tubo se centrifugó brevemente a TA para asegurarse de que todo el contenido estuviera en el fondo del tubo antes de avanzar a la purificación del ADN. A partir de este punto, la PCR de purificación implicó el uso de gel Wizard® SV y el sistema de limpieza de PCR (Promega, Southampton, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Se colocó una minicolumna SV por producto de PCR en un tubo de recogida. El producto de la PCR se añadió al conjunto de minicolumna SV y se incubó durante 1 min a temperatura ambiente (TA). La columna se centrifugó a 16.000 x g durante 1 min y se descartó el flujo continuo. A continuación, la columna se lavó añadiendo 700 pl de solución de lavado de membrana y se centrifugó durante 5 min a TA. Se descartó el flujo continuo y el conjunto se centrifugó de nuevo durante 1 min y se secó a TA durante 2 min para evaporar cualquier etanol residual. A continuación, la columna se transfirió a un tubo nuevo sin nucleasas de 1,5 ml. Para recuperar el producto de la PCR, se aplicaron 25 pl de agua sin nucleasas al centro de la columna y se eluyó el ADN mediante 1 min de incubación a TA y 1 min de centrifugado a 16.000 x g. La concentración del eluido se midió espectrofotométricamente usando Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) y se almacenó a -20 °C.
Digestión de la flagelina y vector de expresión.
Se mantuvieron en hielo doscientos microlitros de células competentes DH5a recién descongeladas y 4 pl de la mezcla del producto de PCR, y se dejaron en hielo durante 5 min. Se realizó un choque térmico durante 1 min a 42 °C y las células se volvieron a poner en hielo durante 5 min, antes de la adición de 400 pl de medio SOC. El medio SOC (Sigma) es un medio rico que se usa principalmente en la etapa de recuperación de las transformaciones de células competentes de Escherichia coli. El uso de SOC maximiza la eficiencia de transformación de las células competentes. Las células crecieron a 37 °C durante 1 hora y se pusieron en placas 200 pl de la mezcla en una placa de agar LB complementada con 50 pg/ml de kanamicina. Los clones positivos se prepararon como minipreparaciones, se hicieron nanogotas y se digirieron con BamH1 y Xho1 durante 2 horas para escindir la flagelina. El vector de expresión pT7-MAT-Tag-FLAG-2 (Sigma), representado en la figura 2A, también se digirió con BamH1 y Xho1. Después de la separación del producto en un gel de agarosa al 1 % y la purificación del vector y el fragmento digeridos, es decir, el vector y el inserto se ligaron a 4 °C durante una noche y se transformaron en DH5a de E.coli. Los productos de ligadura se pusieron en placas de agar LB complementado con 100 pg/ml de ampicilina. Los clones positivos se prepararon como minipreparaciones y se transformaron en células competentes de E.coli BL21 (DE3). Las colonias positivas se secuenciaron con cebadores apropiados para comprobar la presencia del inserto. Se prepararon alícuotas de glicerol de los clones positivos. Los vectores de expresión que codificaban flagelinas de Roseburia se prepararon adicionalmente como minipreparaciones y se transformaron en células competentes de E.coli para mejorar el rendimiento de la purificación; para Rh1, Rh2 y Ri2, las células competentes de E. coli eran E. coli BL21 Rosetta y para RI3, Ri1 Ri4, Se, St, K12, y Er, las células competentes de E. coli eran E.coli BL21 (DE3).
Expresión y purificación de flagelinas de Roseburia
Las E.coli transformadas (por ejemplo, BL21 Rosetta) que codificaba el gen de flagelina (RH1 o FLaA1) se cultivaron en 1 litros de medio LB con ampicilina (100 pg/ml), y se complementó con cloranfenicol (50 pg/ml) para células Rosetta, a 37 °C con agitación 180 rpm hasta la fase logarítmica. El cultivo se indujo durante 3 horas con IPTG 1 mM en las mismas condiciones, para permitir la expresión específica de la proteína flagelina. Las bacterias se sedimentaron mediante centrifugación a 4.000 x g, 4 °C, durante 10 min y se resuspendieron en 60 ml de tampón 1 (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM) y se sometieron a sonicación con un Soniprep 150 (Sanyo, Japón), durante 1 min cuando se usa BL21 (DE3), o 3 min cuando se usa Rosetta con 1 min de descanso después de cada minuto. El lisado celular se centrifugó a 9.000 x g durante 10 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El sedimento, que contiene proteínas insolubles, se resuspendió en 60 ml de tampón 2 (Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, Triton-X 100 al 0,5 %, DTT 1 mM) sonicado de nuevo hasta la resuspensión completa y se centrifugó a 5.000 x g durante 15 min a 4 °C. La fracción insoluble se lavó una segunda y una tercera vez con tampón 2. Se realizó un último lavado usando tampón 2 sin Tx-100 y DTT, como se ha descrito anteriormente. Para solubilizar las proteínas, la fracción insoluble se resuspendió mediante sonicación en 4 ml de tampón de urea (urea 2 M, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM) y se centrifugó a 5.000 x g, 5 min a TA. El sobrenadante se descartó por decantación y el sedimento se resuspendió en 2 ml de urea 4 M, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM mediante sonicación y se centrifugó a 5.000 x g, 5 min a TA. El sobrenadante se recogió por decantación y el sedimento se resuspendió en 2 ml de urea 8 M, Tris 50 mM (pH 7,4), solución de NaCl 150 mM mediante sonicación y se centrifugó a 5.000 x g, 5 min a TA. El sobrenadante se recogió por decantación y se mezcló con la fracción de urea 4 M, para elaborar una solución de urea 6 M que contenía flagelinas solubilizadas. Se lavó dos veces un mililitro de resina Talon (Clontech, Takara, Reino Unido) con 2 ml de tampón 1 (Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM) y se centrifugó a 1.000 x g, 2 min a TA. Se descartó el sobrenadante y se añadió la fracción de urea 6 M que contenía flagelina y se dejó en rotación a 4 °C durante 1 hora. Después de la centrifugación a 1.000 x g durante 2 min a TA, la resina se lavó dos veces con tampón que contenía urea 2 M, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, imidazol 15 mM. Después de la centrifugación, la resina se incubó durante 10 min con 300 pl de tampón de elución (Tris-HCl 360 mM, imidazol 680 mM, NaCl 360 mM, HCl 0,35 N, urea 1,43 M), se mezcló suavemente y se recogió el eluido después de centrifugación a 2.000 x g durante 2 min a TA. La elución se repitió una vez y los dos eluidos se mezclaron. Se realizó una segunda etapa de purificación usando perlas magnéticas anti-FLAG M2 (Sigma) para mejorar la pureza de la preparación de proteínas. Se añadieron lentamente cuatrocientos microlitros de agua ultrapura al eluido de la resina Talon, para obtener una concentración final de urea 0,9 M, adecuada para perlas FLAG. Se lavaron dos veces doscientos cincuenta microlitros de perlas magnéticas FLAG con 750 pl de tampón 1, mezclando y dejando en un soporte magnético (Ambion) para eliminar el sobrenadante. Se añadió el eluido Talon a las perlas y se hizo girar durante 30 min a 4 °C. Las perlas se lavaron cinco veces con 1 ml de urea 0,9 M, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM. La elución consistió en añadir a las perlas 250 pl de solución de péptido FLAG 200 pg/ml que contenía urea 0,9 M, Tris 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, mezclar bien e incubar durante 30 min a TA. Los tubos se colocaron en el soporte magnético y se recogió el producto final. Esta etapa de elución se repitió una vez y se dializaron adicionalmente 500 pl de productos finales en PBS con urea 0,9 M durante 1 hora a 4 °C, se prepararon como alícuotas y se almacenaron a -80 °C. La pureza de las preparaciones se evaluó mediante SDS-Pa Ge teñida con una solución de azul de Coomassie (figura 3A). Justo antes de su uso, la alícuota de proteína se dializó 1 hora frente a PBS, cambiando el tampón dos veces, en un slide-a-lyser de corte de peso molecular de 20 kDa (Pierce, Reino Unido) y se midió la concentración de proteína usando el procedimiento de Bradford. Los valores confirmados de la medición de endotoxinas fueron <0,25 Eu/ml.
La secuencia de nucleótidos que codifica Fla1 se muestra en la SEQ ID NO 1 y la secuencia de aminoácidos de Fla1 se muestra en la SEQ ID NO 2.
AT GGT AGT ACAGCACAAT CTT ACAGCAAT G AACGCT AACAG ACAGTT AGGT AT CACAAC
AGGCGCACAGGCT AAGT CTT CT G AG AAGTT AT CTT CT GGTT ACAAG AT CAACCGCGCAG
CAG AT G ACGCAGCAGGT CTT ACG ATTT CCG AG AAG AT G AG AAGCCAGGTT AG AGGCTT
AAAT AAAGCTT CT GACAACGCACAGG AT GGT GT AT CCCTT ATT CAGGT AGCT G AGGGT G
CATT AAGT GAG ACACACT CCAT CTT ACAGCGT AT G AAT G AGTT AGCAACT CAGGCAGCA
AACG AT ACCAAT ACAACCT C AG ACAG AACT GCAGTT CAGCAGG AG AT CAACCAGTT AGC
AT CT G AG AT CACCAG AAT CGCTT CT ACAACT CAGTT CAACACAAT G AACCT G AT CG AT GG
T AACTT CACAAGT AAGAAGCTT CAGGT AGGTT CCCTTT GCGG ACAGGCT AT CAC AAT CG
AT AT CT CT GAT AT GT CT GCT ACAGGT CTT GGCGTT AGCGG ATT AGT AGT AT CTT CCTT CT
CT GCAGCT GGT AAGGCAAT GT CT GCAGCT CAGG AT GCT AT CAGCT ACGT AT CTT CT AT G
CGTT CT AAGCT GGGT GC ATT ACAG AACAG ACTT G AGCACACAAT CT CCCACCT GG ACAA
CATTT CT G AGCACACAT CTT CT GCAG AGT CT CGT AT CCGT GAT ACAG AT ATGGCT GAAG
AG AT GGTT G AGT ACAGCAAG AACAACAT CCTT GCT CAGGCAGGACAGT CT AT GCTT GCT
CAGGCT AACCAGT CT ACT CAGGGT GT ATT AT CCTT ATT ACAGT AA (SEQ ID NO 1).
MVVQHNLTAMNANRQLGITTGAQAKSSEKLSSGYKINRAADDAAGLTISEKMRSQVRGLNK
ASDNAQDGVSLIQVAEGALSETHSILQRMNELATQAANDTNTTSDRTAVQQEINQLASEITRI
ASTTQFNTMNLIDGNFTSKKLQVGSLCGQAITIDISDMSATGLGVSGLVVSSFSAAGKAMSA
AQDAISYVSSMRSKLGALQNRLEHTISHLDNISEHTSSAESRIRDTDMAEEMVEYSKNNILAQ
AGQSMLAQANQSTQGVLSLLQ (SEQ ID NO 2).
La estructura de la flagelina consiste en cuatro dom inios DO, D1, D2 y D3. Véase la figura 4A.
D0: La hélice a del extremo N comienza desde Gln 2 y se extiende hasta Ser 32 (ND0). La hélice a del extremo C comienza en Ala 459 y se extiende hasta Ser 491 (CD0).
La región radial, que conecta los dominios D0 y D1, consiste en dos cadenas (Ns y Cs), una de Ser 32 a Ala 44 y la otra de Glu 454 a Ala 459.
D1: El segmento del extremo N se extiende desde Ala 44 a Gln 176 y el segmento del extremo C desde Asn 406 a Glu 454. El segmento del extremo N está formado por una hélice a (desde Ala 44 a Ala 99) (ND1a), seguido hacia arriba por un bucle que se conecta a la segunda hélice a más corta (ND1 b) que desciende y la cadena continúa hasta dos giros p, una horquilla p que apunta hacia abajo y una cadena extendida hacia arriba, y el resto de la cadena finalmente va en el dominio d2. La hélice a del extremo C en el dominio 1 (CD1) comienza en Asn 406 y se extiende hasta Glu 454.
Los dominios D0 y D1 se empaquetan en la estructura del protofilamento de modo que N-D0 se oriente hacia el exterior y C-D0 se exponga al canal central.
El dominio D2 comprende dos segmentos: El segmento del extremo N desde Lys 177 a Gly 189 y el segmento del extremo C desde Ala 284 a Glu 405. Está compuesto principalmente de hebras p excepto dos hélices 285-289 y 288­ 298.
El dom inio D3 comprende un segmento central desde Tyr 190 a Val 283. Está compuesto principalmente por hebras p con un tramo corto de pliegue helicoidal (199-209).
Sin desear quedar ligado a la teoría, se cree que dos regiones esenciales de la proteína flagelina involucradas en el reconocimiento y activación de TLR5 son los aminoácidos en las posiciones 79-117 de la SEQ ID NO 2 (dominio N-D1) y los aminoácidos en las posiciones 408-439 de la SEQ ID NO 2 (dominio C-D1), así como el aminoácido alanina (A) en la posición 411 de la SEQ ID NO 2, el aminoácido glutamina (Q) en la posición 412 de la SEQ ID NO 2 y el aminoácido serina (S) en la posición 420 de la SEQ ID NO 2.
EJEMPLOS
R. hom inis coloniza preferentemente el colon
Se inocularon ratones C3H/HeN libres de gérmenes (GF) con tres sondas nasogástricas de R. hominis en días consecutivos. Los inventores informan de la primera monocolonización exitosa de ratones libres de gérmenes con una única especie bacteriana del filo Firmicutes. La colonización exitosa se logró usando un medio de inoculación que contenía ácido ascórbico al 3 % y cisteína al 2 % para proteger esta bacteria sensible al oxígeno. El análisis del tejido intestinal mediante hibridación in situ fluorescente (FiSh , por sus siglas en inglés) reveló que R. hominis colonizaba tanto el íleon como el colon, pero se encontró mucho más en el colon. También se encontraron bacterias estrechamente asociadas con la mucosa colónica (figura S1A). La colonización se validó y se cuantificó adicionalmente mediante PCR usando cebadores específicos de R. hominis con números que se aproximan a 1x101° bacterias/g de heces (figura S1B-C). Las heces de animales GF resultaron negativas para la presencia de cualquier bacteria.
El genoma de R. hom inis revela genes únicos que promueven las interacciones con el huésped.
La secuencia genómica completa de A2-183 de R. hominis se generó y se representa por un solo cromosoma de 3.592.125 pb (figura 1A). La anotación automática y manual del genoma utilizando la plataforma RAST reveló la presencia de cuatro operones ribosómicos, 66 ARN y 3.273 proteínas predichas. El grupo más grande de genes pertenecía a la categoría del subsistema carbohidratos (271 genes), que codificaban proteínas involucradas en el metabolismo de los carbohidratos, seguido del metabolismo de proteínas (197) y los aminoácidos y derivados (175) (figura 1B). Otras categorías funcionales importantes incluyeron motilidad y quimiotaxis (49) y latencia y esporulación (12). El análisis genómico comparativo estableció que el pariente más cercano en términos de estructura y función genómica entre los genomas bacterianos completos es Eubacterium rectale (Mahowald et al. 2009), lo cual no es sorprendente dada la estrecha relación taxonómica de estos organismos (Duncan et al. 2006, Aminov et al. 2006). La reconstrucción comparativa de los dos genomas con 1.095 genes reveló que diferían en aproximadamente un 25 % de los genes. En particular, estas diferencias abarcan genes que codifican funciones importantes para la interacción con el huésped. Por ejemplo, los genes de motilidad y quimiotaxis que codifican las proteínas de ensamblaje fimbria! de tipo IV PilB y PilC estaban presentes en E. rectale pero ausentes en R. hominis, mientras que la proteína de bastón del cuerpo basal flagelar FlgC, la proteína del complejo del cuerpo basal del gancho flagelar FliE, la proteína flagelina FlaB y la proteína del interruptor motora flagelar FliG eran exclusivas de R. hominis (Tabla S1). Los dos genomas bacterianos también se diferenciaron por 42 genes de carbohidratos, lo que refleja sus necesidades nutricionales divergentes. Curiosamente, R. hominis es único en el sentido de que expresa dos genes de flagelina que son tanto del tipo FLA como opuestos a las flagelinas homólogas a FliC expresadas por especies bacterianas de Salmonella y E. coli.
Tabla S1. Análisis comparativo de los genomas de R. hom inis y E. rectale. El análisis genómico comparativo mostró que Eubacterium rectale es el pariente conocido más cercano de R. hominis en términos de estructura y función genómica, y los dos genomas difieren en aproximadamente un 25 % de los genes. (A) Genes presentes en R. hominis pero ausentes en E. rectale y (B) genes presentes en E. rectale pero ausentes en R. hominis.
Tabla S1A. Genes presentes en R. hominis pero ausentes en E. rectale.
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Tabla S1B. Genes presentes en E. rectale pero ausentes en R. hominis.
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R. hom inis responde al entorno intestinal al regular positivamente los genes de motilidad, movilización y quim iotaxis
Para determinar los genes expresados diferencialmente por R. hominis en respuesta a la asociación con el huésped y la dieta, se construyó una micromatriz usando 6.000 fragmentos de PCR de la biblioteca de secuenciación de tamaño de inserto pequeño. La posterior validación por PCR en tiempo real se realizó en 42 genes expresados diferencialmente (Tablas s 2 y S3), que se agrupan en regiones específicas del genoma de R. hominis como se ilustra en la figura 2A. Para distinguir entre los efectos del entorno intestinal y los componentes dietéticos, se aisló ARN bacteriano de cuatro condiciones experimentales diferentes: (i) in vivo, del ciego de ratones monoasociados; (ii) in vitro, de bacterias cultivadas en medios de cultivo; (iii) in vitro, de bacterias cultivadas en presencia de componentes dietéticos; y (iv) de bacterias incubadas en la superficie de células confluentes Caco-2 y HT-29.
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Tabla S3. Índice de experimentos de PCR de R. hom inis representados en un mapa del genoma circular. Lista de experimentos de PCR de R. hominis como se muestra en el mapa circular del genoma.
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Se identificaron cincuenta genes expresados diferencialmente (in vivo frente a in vitro). El descubrimiento más sorprendente fue la alta regulación positiva in vivo de genes implicados en la transferencia de conjugación/movilización, los genes de tipo mobA y mobL (figura 2A). La presencia de dichos genes en los estudios transcripcionales fue sorprendente ya que no se asignaron genes identificables a fagos, profagos, elementos transponibles y plásmidos en la característica de categoría del subsistema. Esta diferencia en la detección y asignación de genes se debe probablemente a las limitaciones reconocidas de la anotación de categorías del subsistema. El efecto estimulante de los compuestos dietéticos fue mucho menos pronunciado, lo que sugiere que el entorno intestinal per se es un inductor importante de genes implicados en la transferencia génica horizontal.
Otros subsistemas inducidos por el entorno intestinal incluyeron el transporte de membranas, en particular el transporte de magnesio, y la motilidad y la quimiotaxis que incluyen múltiples proteínas de quimiotaxis aceptoras de metilo y genes del operón flagelar (figura 2B). R. hominis posee múltiples genes de flagelina flaA1, flaA2, flaA3 y flaB. En el entorno del intestino del ratón, la expresión de flagelina se verificó mediante transferencia de Western e inmunocitoquímica usando bacterias aisladas tanto de ratones colonizados in vivo como de cultivos in vitro desarrollados en presencia de dieta, con anticuerpos específicos producidos contra las proteínas flagelinas recombinantes FlaA1 y FlaA2 (RH1 y RH2) (figura 2C). Esta validación positiva de la expresión de flagelina in vivo es consistente con informes anteriores que indican que solo ciertos subconjuntos de Firmicutes producen flagelos in vivo (Turnbaugh et al. 2008) a diferencia de otras especies bacterianas que regulan negativamente de forma activa la expresión de la proteína bacteriana. La expresión de genes del metabolismo catabólico en R. hominis en el entorno intestinal también se vio afectada por el entorno intestinal (figura 2D). Los genes implicados incluyen acetil-CoA acetiltransferasa, 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, butiril-CoA deshidrogenasa y fosfoenolpiruvato carboxicinasa [ATP].
Para investigar adicionalmente los efectos de la adaptación del huésped en el transcriptoma de R. hominis, se realizó la estimulación in vitro de células epiteliales intestinales humanas (Caco-2 y HT-29). Esto mostró que el gen de transferencia de conjugación/movilización proteína 1 mobA/mobL, que se indujo por adaptación al intestino de ratón, también se aumentó en ambas líneas celulares (figura 2E). De acuerdo con los datos in vivo, el gen de flagelina MotA se reguló positivamente en células Caco-2. Los genes involucrados en el metabolismo del butirato mostraron diferencias entre las dos líneas celulares, observándose una regulación negativa en las células Caco-2 y una regulación positiva en las células HT-29.
R. hom inis influye en las vías de señalización innatas del huésped principalmente en el colon
La colonización de ratones GF con R. hominis se correlacionó con un aumento de la expresión del gen del huésped, que fue más alta en el colon (figura 3A y Tabla S4). La expresión diferencial fue más profunda 28d después de la colonización, con 159 genes regulados positivamente y 143 genes regulados negativamente. El número de genes expresados diferencialmente en el íleon a los 14d fue similar al del colon ascendente, con 79 genes regulados positivamente y 119 genes regulados negativamente. La expresión diferencial en el íleon fue muy baja a los 28d, según los niveles de colonización reducidos. La respuesta transcriptómica difirió en los dos puntos temporales, como lo muestra la clara separación de los transcritos significativos mediante el análisis del mapa de calor (figura 3B). La validación positiva por PCR en tiempo real de los datos de Affymetrix se muestra en la figura 3C.
Tabla S4. Datos de Affym etrix entre animales inoculados con R. hom inis y animales GF. El análisis de micromatrices de Affymetrix se realizó en ARN aislado de tejido de íleon y colon ascendente. Los datos se consideraron significativos cuando P <0,05 usando el procedimiento de falso descubrimiento de Benjamini y Hochberg. (A) Transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente a los 14d. (B) Transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente a los 28d. (C) Transcritos expresados diferencialmente en el íleon a los 14d.
(D) Transcritos expresados diferencialmente en el íleon a los 28d.
Tabla S4A. Transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente a los 14d entre animales inoculados con R. hominis y animales libres de gérmenes.
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Tabla S4B. Transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente a los 28d entre animales inoculados con R. hominis y animales libres de gérmenes.
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1435829_at B930008K04Rik Gen B930008K04 de ADNc de RIKEN -1,78 0,004961 2,78 N u GO_e mt010210_at Cacna2d2 Canal de calcio, dependiente del voltaje, alfa -1,80 0,035702 0,172/delta subunidad 2
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Tabla S4C. Transcritos expresados diferencialmente en el íleon a los 14d entre animales inoculados con R. hominis y animales libres de gérmenes.
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Tabla S4D. Transcritos expresados diferencialmente en el íleon a los 28d entre animales inoculados con R. hominis y animales libres de gérmenes.
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Los genes implicados en la inmunidad innata y la función de la barrera intestinal se indujeron significativamente por la presencia de R. hominis en el colon ascendente. La "respuesta inmunitaria innata" del proceso GO (GO: 0045087) se reguló positivamente e incluyó los importantes genes Tlr5, Tlr1 y Vnn1 relacionados con TLR. La regulación positiva de Tlr5 fue de particular interés, dada la inducción correspondiente de genes flagelares y proteína flagelina en R. hominis durante la colonización intestinal, y puede inferir una función para esta vía de señalización innata en la mediación de respuestas inmunitarias innatas y adaptativas. Otros genes inmunitarios innatos afectados en el colon por R. hominis incluían los péptidos antimicrobianos Defb37, Pla2g3, Muc16 y Itin y los genes de función de la barrera intestinal Sprr1a, Cldn4, Pmp22, Crb3 y Magi3. Los genes inmunitarios innatos que muestran regulación positiva en el íleon en respuesta a R. hominis incluían Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 y Tcfe2a. Curiosamente, en esta invención se muestra la regulación negativa de la vía NF-kB (GO:0043124) (figura S2) por R. hominis, que, al igual que B. thetaiotaomicron (Kelly et al. 2004), puede contribuir a la homeostasis inmunitaria mediante la regulación negativa de esta cascada inflamatoria.
Para demostrar que estas respuestas son específicas de R. hominis, se investigó la respuesta de animales libres de gérmenes a otra bacteria comensal. Las respuestas de expresión génica a la colonización con E. coli MG1655 (K12) se compararon con R. hominis después de 10-14d y 22-28d después de la colonización. Durante este intervalo de tiempo, se observaron grandes diferencias en la expresión génica en respuesta a R. hominis pero no a E. coli, lo que indica que R. hominis es biológicamente muy activo en el intestino, en contraste con el impacto mínimo de E. coli (figura S3). La respuesta a E. coli deducida de los datos de expresión génica en el colon ascendente parecía ser principalmente una respuesta de anticuerpos mediada por linfocitos B.
R. hom inis afecta a las vías de los linfocitos T principalmente en el colon
La mayoría de las vías afectadas a los 14d se agruparon en las categorías de diferenciación celular, regulación del ciclo celular y remodelación tisular. Es importante destacar que la respuesta inmunitaria fue una vía principal inducida a los 28d en el colon ascendente. Las vías significativamente afectadas en esta categoría estaban involucradas principalmente en la función de los linfocitos T, incluida la señalización de IL-10 y la regulación de la función de los linfocitos T por CTLA-4 (Tabla S5). Los genes involucrados en estas vías mostraron tanto regulación positiva como regulación negativa, por lo que, aunque estas vías se vieron afectadas significativamente por la presencia de R. hominis, los efectos funcionales netos precisos sobre la diferenciación de los linfocitos T requirieron una mayor investigación. Para aclarar el papel de R. hominis en relación con la diferenciación de linfocitos T, se trataron ratones convencionales con R. hominis durante 14 días y se determinó el impacto en subconjuntos de linfocitos T tanto en la lámina propia como en los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN, por sus siglas en inglés). El tratamiento con R. hominis aumentó la población de linfocitos T CD3+CD4+CD25+FoxP3+ en ambas ubicaciones (figura 4). Se evaluó el número de células CD3+FoxP3+ doblemente positivas en la lámina propia del colon ascendente y descendente de animales C3H/HeN y C57BI6 monoasociados y se confirmó un aumento significativo de los linfocitos T reguladores en ratones tratados con R. hominis (figura 5A). El proceso GO para la "polimerización de actina" (GO:0030041) (Arpc3, Capg, Cdc42ep5 y Rhoc) se reguló positivamente a los 28d en el colon en ratones colonizados con R. hominis (figura S2). La polimerización de actina en la sinapsis inmunitaria es necesaria para la activación de los linfocitos T y la función efectora. En general, estos datos indican que R. hominis afecta activamente la respuesta inmunitaria adaptativa en el colon al influir positivamente en la regulación de linfocitos T.
Tabla S5. Análisis de la vía de respuesta del sistema inmunitario de los transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente entre ratones tratados con R. hom inis y ratones libres de gérmenes a los 28d. Los genes expresados diferencialmente (P<0,05) se importaron en el software analítico GeneGo MetaCore para determinar las vías canónicas significativamente enriquecidas en cada grupo. * El número de genes en cada mapa que se expresan diferencialmente en la comparación de tratamiento específico. ** El número total de genes en cada mapa.
La inducción de la familia de genes Ly6 en el colon ascendente estaba relacionada con estos resultados.
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En particular, el producto génico anclado a GPI de Ly6g6c se reguló positivamente 25 veces, y el gen relacionado Ly6g6e se reguló positivamente dos veces a los 28d. La mayoría de las células hematopoyéticas, incluidos los neutrófilos y las células dendríticas plasmocitoides, expresan uno o más miembros de la familia Ly6. Además, se ha propuesto una posible función de Ly6 en la activación, diferenciación y maduración de los linfocitos T (Mallya, Campbell y Aguado 2006). La ¡nmunocitoquímica confirmó el aumento de la presencia de células Ly6G+, CD11b+ y CD3+ FoxP3+ en ratones colonizados con R. hominis (figura 5B).
Las flagelinas de R. hom inis modulan la diferenciación de linfocitos T
La influencia de las bacterias en la diferenciación de los linfocitos T puede reflejar la matriz de ligandos de TLR mostrados. Por ejemplo, recientemente se ha demostrado el acoplamiento entre la señalización de TLR5 y las respuestas de los linfocitos T CD4+ para los patógenos flagelados (Letran et al. 2011). Curiosamente, dependiendo del entorno experimental, la flagelina puede cebar una variedad de respuestas de linfocitos T, incluidas las respuestas Th1, Th2, Th17 y Treg (Wilson et al. 2012).
Se investigó la funcionalidad de las flagelinas bacterianas FIaA1 (RH1) y FlaA2 (RH2) usando proteínas de flagelina recombinantes solubles novedosas, generadas frente a las secuencias de flagelina de R. hominis únicas. La capacidad de RH1 y RH2 se comparó y se contrastó con diversas flagelinas comensales y patógenas, generadas usando protocolos idénticos, para activar respuestas de señalización en líneas de células epiteliales intestinales y células dendríticas derivadas de médula ósea expandidas con FLT3L o GM-CSF.
Las células epiteliales tratadas con concentraciones idénticas de diferentes flagelinas bacterianas revelaron patrones distintos de expresión génica (figura 6A). Es importante destacar que no se detectó contaminación por endotoxinas en las preparaciones de proteínas recombinantes. Salmonella enteritidis (SE) fue más potente que E. coli K12 (EC) o la flagelina RH1. La flagelina RH1 también mostró una fuerte respuesta pero agrupada en un clado distinto junto con EC comensal. Se demostró que las respuestas eran dependientes de TLR5 utilizando células epiteliales que expresaban TLR5 dominante-negativo. Por el contrario, se demostró que RH2 era mínimamente activo; generalmente no fue proinflamatorio ni activó la firma genética conservada (IL-8, CXCL-1, CXCL-2 y CXCL-10) inducida por otras flagelinas bacterianas recombinantes. La proteína de flagelina RH1 es más biológicamente activa que la RH2 in vitro; aunque ambas proteínas recombinantes se expresaron in vivo, RH1 también se reguló positivamente de forma significativa al nivel de expresión génica in vivo. Se demostró que la flagelina RH1 de R. hominis inducía diferentes respuestas en células dendríticas derivadas de Flt3L y GM-CSF en relación con E. coli comensal y Salmonella enteritidis patógena (figura 6B-C). En particular, RH1 fue única en su capacidad para activar DC expandidas con Flt3L, con regulación positiva de I-A/I-E y CD40 y la producción de IL-10 por DC derivadas de médula ósea de ratones tanto C3H/HeN como C57BI/6. La relación de IL-10/IL-12 estaba particularmente elevada en las DC de C57BI/6 (figura 6D), que se encontró que eran CD103+ Siglec-H+. De acuerdo con las observaciones en esta invención, varios informes recientes también han demostrado que la flagelina puede activar poblaciones de DC CD103+ (Flores-Langarica et al.
2012, Kinnebrew et al. 2012).
Para evaluar la importancia funcional de R. hominis y sus flagelinas, se monocolonizaron ratones WT y TLR5KO libres de gérmenes. El mapa de calor que muestra genes expresados diferencialmente tanto para TLR5KO como para de tipo silvestre colonizados con R. hominis reveló un efecto muy fuerte de TLR5 (figura S4). Aunque las vías de los linfocitos T todavía estaban influenciadas por la colonización de R. hominis en ratones TLR5KO, las respuestas estaban más relacionadas con las vías de IL4, IL5, IL-6, IL-9 y no con IL-10 y CTLA-4 (Tabla S6). Además, el número de células CD3+FoxP3+ doblemente positivas en la lámina propia de los ratones TLR5KO no aumentó con el tratamiento con R. hominis (figura 6E), en contraste con los animales C3H/HeN y C57BI6 monoasociados (figura 5A).
Tabla S6. Análisis de la vía de respuesta del sistema inmunitario de los transcritos expresados diferencialmente en el colon ascendente entre ratones TLR5 KO y ratones WT, monocolonizados con R. hominis. Los genes expresados diferencialmente (P<0,05) se importaron en el software analítico GeneGo MetaCore para determinar las vías canónicas significativamente enriquecidas en cada grupo. * El número de genes en cada mapa que se expresan diferencialmente en la comparación de tratamiento específico. ** El número total de genes en cada mapa.
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La observación en esta invención de que R. hominis influye en los Treg en ratones convencionales y libres de gérmenes y no en TLR5KO es consistente con informes de interacciones de flagelina-TLR5 que promueven los linfocitos T reguladores CD4+CD25+Foxp3+ (Crellin et al. 2005, Hossain et al. 2011). De manera similar, recientemente se ha descrito la capacidad de una proteína de fusión de flagelina-ovoalbúmina para suprimir la producción de IL-4 por los linfocitos T CD4(+) del receptor de OVA-linfocitos T a través de un mecanismo dependiente de IL-10 (Schulke et al. 2011), lo que indica que la flagelina puede influir en la diferenciación direccional de subconjuntos de linfocitos T. Además, el impacto de TLR5KO en las respuestas de los linfocitos T impulsadas por R. hominis infiere que RH1 (la flagelina de señalización) fue crucial en la mediación de las respuestas de Treg y no RH2 (la flagelina de no señalización). Finalmente, una observación adicional fue la mejora de los genes de IFN de tipo I en ratones TLR5KO (incluyendo Ifi202b, Ifi203 y Irf4), lo que sugiere que la señalización de TLR5 puede amortiguar las respuestas de interferón de tipo I.
R. hom inis modula los genes de la respuesta inmunitaria innata tanto en el íleon como en el colon y atenúa la co litis en ratones tratados con DSS
Se usó el modelo de ratón DSS para ensayar la eficacia terapéutica de R. hominis, debido al control de las vías inflamatorias, así como a los efectos positivos sobre la inducción de Treg en ratones monoasociados. Los ratones recibieron una dosis diaria (~50 pl, 109 UFC) durante un período de 14 días, y se les administró DSS (PM 50 kDa, 30 g/l) en el agua de bebida desde el día 8 en adelante. La expresión génica de un panel de biomarcadores proinflamatorios mostró que los ratones DSS no tratados tenían una fuerte elevación de todos los genes investigados en comparación con los ratones de tipo silvestre, con una inducción génica que variaba de 4 a 49 veces (figura 7A). La inducción de genes proinflamatorios fue significativamente menor en los ratones tratados con R. hominis en comparación con los ratones no tratados, lo que indica fuertes beneficios terapéuticos de la administración oral de R. hominis. El análisis histológico mostró la presencia de inflamación grave en el colon ascendente de DSS sin tratar, mientras que la mucosa colónica de los animales tratados con R. hominis era normal, con bajo nivel de inflamación, consistente con la expresión reducida del gen inflamatorio (figura 7B y C).
La colonización de R. hom inis influye en la composición corporal y la expresión de genes de saciedad
También fueron evidentes las acciones metabólicas significativas de R. hominis en ratones monoasociados. Todos los procesos GO "regulación negativa de la respuesta a los alimentos" (GO: 0032096), "regulación negativa del apetito" (GO: 0032099) y "regulación de la secreción de catecolaminas" (GO: 0050433) se regularon negativamente en el colon después de la colonización con R. hominis (figura S5). Estos datos infieren que R. hominis ejerce un efecto estimulante sobre el apetito del huésped. Los genes involucrados en estos procesos fueron Agt, Cartpt, Cck y Cxcl12, con factores de cambio que variaban de 2 a 12 veces. Cck, en particular, desempeña un papel importante en la digestión y la saciedad como supresor del hambre. Gcg también mostró una regulación negativa en este sitio intestinal.
Para establecer si estos cambios genéticos tenían relevancia fisiológica en relación con la ingesta de alimentos y la composición corporal, se realizaron análisis de composición y peso de la canal seca. El peso de la canal seca de los ratones asociados con R. hominis fue significativamente más pesado en comparación con los animales GF, y las diferencias fueron más perceptibles a los 14d (figura S6A). El análisis adicional de lípidos de la canal mostró que la adiposidad total también fue significativamente mayor en los animales tratados con R. hominis a los 14d (figura S6B). Estos hallazgos son consistentes con datos recientes que revelan la función de Firmicutes en la recolección de energía a través de la fermentación dietética, pero también apoyan la idea de que las bacterias intestinales de hecho pueden modular el eje cerebro-intestino y las hormonas reguladoras del apetito.
Análisis
La evolución conjunta a largo plazo del mutualismo huésped-microbio probablemente ha impulsado la selección de especies bacterianas funcionalmente importantes en el intestino, la mayoría de las cuales no están muy representadas en otros ecosistemas. Actualmente, existe información limitada sobre la contribución de los miembros individuales de la comunidad microbiana a las funciones intestinales, particularmente en relación con el desarrollo del sistema inmunitario de las mucosas.
Un trabajo reciente que usa un modelo de colonización reversible basado en E. coli (HA 107) ha demostrado que se requieren bacterias vivas en números cercanos a 108 UFC por gramo de contenido para los efectos inmunoinductores sobre IgA (Hapfelmeier et al. 2010). Se han investigado las funciones específicas de SFB y Bacteroides fragilis en el intestino de ratón para definir sus contribuciones individuales a la biología de los linfocitos T y se ha demostrado que ambas bacterias son potentes inductores de linfocitos Treg y Th17 (Mazmanian et al. 2005, Gaboriau-Routhiau et al.
2009, Ivanov et al. 2009). Los efectos de los miembros individuales del grupo XlVa Firmicutes no se han informado previamente, aunque se ha observado su presencia en la ASF y la contribución de un cultivo mixto de 46 cepas de Clostridial, que también afecta a la diferenciación de linfocitos T (Geuking et al. 2011, Atarashi et al. 2011).
Se informa aquí de la primera monoasociación exitosa del intestino de ratón libre de gérmenes con una bacteria anaerobia, R. hominis, que es miembro del filo Firmicutes. La extrema sensibilidad al oxígeno de bacterias como Roseburia requiere estrictas técnicas de cultivo anaerobio, lo que dificulta la caracterización funcional. Se ha establecido la monocolonización estable de R. hominis en ratones libres de gérmenes y se ha producido la secuencia genómica anotada completa para descubrir su organización metabólica, fisiología y propiedades simbióticas. Se descubrió que las respuestas transcripcionales de R. hominis después de la colonización podrían atribuirse tanto al entorno intestinal del huésped como a la dieta. Los efectos impulsados por el huésped dominaron la respuesta de R. hominis después de la monoasociación. Estos incluyeron los subsistemas de transferencia génica, transporte de membranas, quimiotaxis y motilidad. La fuerte regulación positiva de los genes involucrados en la transferencia de movilización respalda la opinión de que el entorno intestinal es muy propicio para el intercambio genético horizontal entre miembros de la microbiota intestinal. Por lo tanto, este entorno puede acelerar la diseminación de genes importantes para la supervivencia, colonización y función bacteriana dentro del ecosistema intestinal. La función de la motilidad y el aparato flagelar en la colonización del huésped está bien elaborado para las bacterias patógenas, pero se sabe mucho menos sobre la función de las proteínas flagelares en las bacterias comensales. Los experimentos in vivo revelaron un efecto estimulante del entorno intestinal del huésped sobre la expresión de genes de flagelina.
Se ha establecido una función clara para R. hominis en la promoción de la función de la barrera intestinal y la inmunidad innata en el colon de ratón. Las uniones estrechas, las uniones de huecos y las uniones adherentes operan para limitar la translocación bacteriana a la capa subepitelial (Werth et al. 2010). Tanto la enfermedad de Crohn como la colitis ulcerosa se caracterizan por la pérdida de la función de barrera y la integridad de la unión estrecha. Curiosamente, la disbiosis de la microbiota intestinal en la Ell se asocia con una reducción de Firmicutes (Spor, Koren & Ley 2011, Qin et al. 2010). La observación en esta invención de que R. hominis mejora activamente la expresión de genes de barrera sugiere que su pérdida en pacientes con Ell puede ser funcionalmente significativa. La activación de los complejos de unión estrecha no es solo una prerrogativa de R. hominis; otros comensales, tales como Bacteroides thetaiotaomicron y Lactobacillus acidophilus, también mejoran la función de la barrera mucosa (Hooper et al. 2001, Ukena et al. 2007), infiriendo oportunidades probióticas con estas bacterias en la EII humana.
Los efectos de R. hominis sobre el sistema inmunitario intestinal son intrigantes. Los efectos más fuertes se observaron en el colon ascendente y genes tales como Ly6g6c estaban fuertemente regulados positivamente, así como las vías involucradas en la regulación y diferenciación de los linfocitos T y la polimerización de actina en la sinapsis inmunitaria, que están implicadas en la activación y las funciones efectoras de los linfocitos T. Las vías de los linfocitos T más afectadas incluían las relacionadas con IL-10, ICOS y CTLA-4, todas involucradas en el apoyo a la diferenciación de Treg. Es importante destacar que se han demostrado aumentos significativos de las células CD3+CD4+CD25+FoxP3+ en el colon de ratones libres de gérmenes y ratones convencionales colonizados con R. hominis usando tanto citometría de flujo como inmunocitoquímica. Estos hallazgos complementan los datos recientes sobre otras especies de Clostridium que impulsan la diferenciación de Treg. Claramente, R. hominis puede, como una sola especie bacteriana, promover la expansión de los linfocitos T de la mucosa e influir en la diferenciación de los linfocitos T.
Las señales de flagelina son percibidas por los receptores TLR5 del huésped y muchas estructuras patógenas de flagelina inducen fuertes respuestas proinflamatorias (Hayashi et al. 2001). La señalización a través de TLR5 en respuesta a comensales flagelados residentes puede ser importante para la homeostasis, ya que la deleción de TLR5 da como resultado colitis espontánea en ratones (Vijay-Kumar et al. 2007). La expresión mejorada de flagelina FlaA1 (RH1) de R. hominis in vivo y su potencia en la activación de células epiteliales y BMDC es de gran interés. Otro trabajo ha demostrado que los mutantes de flagelina de E. coli tienen una ventaja de colonización sobre las cepas flageladas de tipo silvestre, posiblemente debido a la ausencia de reconocimiento innato por la señalización de TLR5 (De Paepe et al. 2011, Giraud et al. 2008). En esta invención se muestra que para determinados Firmicutes, la expresión o posiblemente regulación positiva de flagelina es una respuesta natural a la colonización intestinal. La proteína flagelina de R. hominis permanece expresada in vivo y se correlaciona con una colonización sostenida, ausencia de inflamación manifiesta y expansión de linfocitos T de un fenotipo regulador. La reciente confirmación de genes de flagelina en SFB (Prakash et al. 2011, Sczesnak et al. 2011) puede correlacionarse con las respuestas de los linfocitos T del huésped inducidas por esta bacteria (Gaboriau-Routhiau et al. 2009, Ivanov et al. 2009). Curiosamente, RH1 indujo un efecto único en cultivos epiteliales y de DC en comparación con otras flagelinas, aunque todas las estructuras ensayadas poseen el Arg90 conservado asociado con flagelinas que se unen y activan TLR5 (Yoon et al. 2012) lo que sugiere que otras diferencias de secuencia/estructurales pueden explicar las respuestas de señalización únicas mediadas por RH1. La importancia de la señalización de flagelina-TLR5 en las respuestas de Treg inducidas por R. hominis se confirmó usando TLR5KO. Sin desear quedar ligado a la teoría, determinadas estructuras de flagelina comensales pueden ayudar a dirigir las respuestas de tolerancia inmunitaria a través de TLR5 expresado en subconjuntos de CD103+DC o Treg (Flores-Langarica et al. 2012, Kinnebrew et al. 2012, Crellin et al. 2005). Además, el efecto homeostático inmunitario de R. hominis se confirmó en ratones tratados con DSS, aunque otros restos de señalización, tales como butirato, también pueden contribuir a la tolerancia inmunitaria. Estos datos sugieren un beneficio terapéutico potencial de R. hominis en la EII.
Un efecto biológico adicional interesante de la colonización con R. hominis fue la regulación de genes que influyen en las respuestas a los alimentos y el control del apetito. En particular, las hormonas de la saciedad Cck y Gcg se redujeron significativamente. Los efectos de Cck sobre la ingesta de alimentos están mediados por una vía aferente vagal. Esta es la principal vía neuronal por la cual la información sobre los nutrientes ingeridos llega al sistema nervioso central para influir tanto en la función intestinal como en la conducta alimentaria. Cck actúa sobre el sistema vagal para disminuir la expresión de moléculas que estimulan el apetito y la alimentación, y para aumentar la expresión de moléculas que inhiben la alimentación y disminuyen el apetito (Npy2r y Cartpt, ambos regulados negativamente dos veces en el estudio actual). Hasta ahora no se ha informado de ningún vínculo entre Cck, Gcg y bacterias comensales, sin embargo, tanto los ácidos grasos como las proteínas son potentes inductores de Cck y Gcg (Geraedts et al. 2010). R. hominis produce ácidos grasos de cadena corta tales como butirato con colas alifáticas de menos de seis carbonos; se ha informado que esta actividad metabólica reduce el efecto estimulante sobre la Cck plasmática observado con ácidos grasos de cadena más larga (McLaughlin et al. 1999). El análisis del peso de la canal reveló que tanto el peso corporal como el contenido lipídico aumentaron significativamente con R. hominis, en consonancia con el aumento de peso corporal observado en la convencionalización de ratones libres de gérmenes (Turnbaugh et al. 2006). Queda por ver si esto es un efecto directo de una reducción en las hormonas de la saciedad como se ve en el estudio actual, ya que la participación de Cck y Gcg no se ha informado previamente. Sin embargo, es importante reconocer que previamente se ha demostrado un vínculo entre la colonización de la microbiota y la recolección de energía de la dieta, en parte a través de la liberación de SCFA (Turnbaugh et al. 2006) (Tremaroli, Kovatcheva-Datchary y Backhed 2010). Dado que R. hominis es un importante productor de butirato, es probable que este mecanismo también contribuya a la eficiencia metabólica observada después del tratamiento con R. hominis.
En resumen, la monoasociación del intestino murino con R. hominis indujo fuertes eventos de expresión génica bidireccional que culminaron en la adaptación bacteriana comensal y la tolerancia del huésped. El producto de flagelina RH1 parece ejercer un efecto de señalización único, que preferentemente impulsa la expansión de los Treg. Se ha demostrado la importancia de TLR5 para dirigir la diferenciación y la expansión de Treg. En conjunto, estos datos destacan la funcionalidad adicional de las flagelinas comensales, la señalización de TLR5 y la dirección neta de la respuesta de los linfocitos T de la mucosa.
Ensayos funcionales
Modelo in vitro
Análisis de la respuesta de las células epiteliales intestinales (IEC, por sus siglas en inglés) a diferentes flagelinas recombinantes.
El análisis molecular de la expresión del gen CCL20 (un gen proinflamatorio) después de la estimulación de las IEC con respecto a diferentes flagelinas recombinantes (figura D.2), flagelinas patógenas (SE, ST, LF y HM) indujo niveles similares pero no idénticos de ARNm de CCL20, y las flagelinas comensales mostraron niveles de inducción mucho más variables. Las flagelinas de ER (Eubacterium rectale 33656), K12 (Escherichia coli K12), RH1 y RI3 indujeron CCL20 en niveles similares a las flagelinas patógenas, RI1 y RI4 tenían actividad estimuladora intermedia, r H2 se reveló como un inductor bajo de CCL20 en HT-29 y carecía de de potencial agonista en las células Caco-2, y RI2 no tuvo actividad observable en ninguna línea celular. En conclusión, los inventores distinguieron tres categorías de agonistas de TLR5 (i) aquellos con actividad inmunoestimuladora nula o muy baja, (ii) aquellos con actividad inmunoestimuladora intermedia y (iii) aquellos con alta actividad inmunoestimuladora.
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La Tabla D2 indica diferencias significativas entre cada tratamiento calculado con la prueba de la t para datos emparejados en HT-29 (parte superior derecha) y Caco-2 (parte inferior izquierda). Las pruebas T usadas fueron unilaterales para comparar tratamientos con células no estimuladas (sin estim.) y bilaterales para comparar un tratamiento con otro. NS (no significativo); *(p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).
Se determinó el análisis celular e inmunológico de los efectos de las flagelinas recombinantes sobre las IEC mediante la medición de citocinas, CXCL8, CXCL10 y CCL2 (MCP-1) secretadas. Las IECS se estimularon durante 24 h con flagelinas recombinantes (figura D3).
Las flagelinas ST, SE, K12, ER, RI3 y RH1 indujeron la secreción de niveles variables pero similares de quimiocinas IL-8, IP-10 y MCP-1, mientras que RI1, RI2, RI4 y RH2, especialmente en Caco-2 se comportaron como agonistas bajos de TLR5, induciendo cantidades significativamente menores de quimiocinas secretadas.
Tabla D3b
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Las Tablas D3a, D3b, D3c y D3d indican diferencias significativas entre cada tratamiento calculadas con la prueba de la t para datos emparejados. El lado superior derecho de la Tabla D3a y D3b dan valores de t para IL-8 y el lado inferior izquierdo para IP-10, y las Tablas D3c y D3d dan valores de t para MCP-1. NS (no significativo); *(p<0,05); ** (p<0,01); *** (p<0,001).
Como se muestra en la figura D4, la neutralización de TLR5 con un anticuerpo específico anti-TLR5 abolió la respuesta inflamatoria mediada por flagelina, independientemente del origen de la flagelina comensal o patógena. Por lo tanto, los efectos proinflamatorios de la flagelina observados en las células Caco-2 dependen de la activación de TLR5.
Generación de cultivos y células dendríticas derivadas de la médula ósea
Se recogió médula ósea de fémur y tibia de ratones C3H/HeN y C57BI6. Para las células dendríticas derivadas de GMCSF, las células de médula ósea se resuspendieron a 1x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 20 ng/ml de rmGM-CSF y se sembraron a razón de 10 ml/placa en placas de cultivo tisular de 100 mm2 Después de tres días de cultivo, se recogieron células poco adherentes y se volvieron a colocar en placas con medio complementado con GM-CSF a 1x106/ml en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos. El día 5, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerlas el día 6. Para las células dendríticas derivadas de Flt3L, las células de la médula ósea se resuspendieron a 2x106/ml en RPMI complementado con FCS al 10 % y 200 ng/ml de rmFlt3 y se sembraron a 2 ml/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 12 pocillos. Las células se cultivaron durante 10 días con medio complementado con Flt3 añadido a cada pocillo el día 4. El día 9, las células se estimularon con 100 ng/ml de flagelinas antes de recogerlas el día 10 y se analizaron por citometría de flujo.
Se realizó un análisis de citometría de flujo de células dendríticas derivadas de GM-CSF/IL-4 (figura D5) y células dendríticas derivadas de Flt3L (figura D6) estimuladas con flagelinas recombinantes. La flagelina Rh1 fue más potente para inducir la respuesta celular en células dendríticas derivadas de GM-CSF/IL-4, teniendo Ri4 y Ri3 una respuesta similar a las flagelinas comensales K12 y Er y las flagelinas patógenas SE y ST. Por el contrario, Rh2 y Ri2 no indujeron una respuesta celular con las células dendríticas derivadas de GM-CSF/IL-4, pero aumentaron significativamente las respuestas celulares a las células dendríticas derivadas de Flt3L. Estas flagelinas, y en particular Ri1, se distinguen por su capacidad para provocar diferencias en las respuestas con la activación de células dendríticas derivadas de Flt3L. Esta respuesta significa la especificidad de las flagelinas para un subconjunto específico de células dendríticas. Estas células dendríticas derivadas de Flt3L se clasifican como células dendríticas plasmocitoides que desempeñan una función importante en la tolerancia inmunológica.
Modelo in vivo
Se usaron ratones BOY/J WT y TLR5KO para evaluar la importancia funcional de R. hominis y sus flagelinas. Los ratones se colonizaron con R. hominis. Los animales se sacrificaron y se realizó un muestreo de tejido intestinal. Se extrajo el intestino delgado para su análisis inmunológico mediante citometría de flujo.
Se realizó un análisis de citometría de flujo de poblaciones de linfocitos T, en particular, linfocitos T reguladores (Treg), en la lámina propia del intestino delgado (figura 6 A y B). El porcentaje de células FoxP3+CD25+ en la población de linfocitos T CD4+ fue significativamente mayor en los ratones BOY/J WT en comparación con los ratones TLR5KO. Esto indica que R. hominis y más específicamente las flagelinas influyen en los Treg al promover los linfocitos T reguladores CD4+ FoxP3+CD25+. Por lo tanto, se puede concluir que las flagelinas son importantes para dirigir la respuesta inmunitaria del huésped a través de interacciones de TLR5.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una flagelina de Roseburia, y/o una secuencia de polinucleótidos que codifica dicha flagelina de Roseburia, y/o un vector que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o una célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos, para uso en medicina.
2. La flagelina de Roseburia, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1 , donde la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos que tienen al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos y combinaciones de los mismos.
3. La flagelina de Roseburia, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos según la reivindicación 1 o 2 para su uso según la reivindicación 1 o 2 , donde la flagelina de Roseburia comprende un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad con los aminoácidos 79-117 y 408­ 439 de SEQ ID NO:2.
4. La flagelina de Roseburia, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la flagelina de Roseburia:
(a) se obtiene o puede obtenerse a partir de Roseburia hominis;
(b) es un polipéptido que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 4; y/o
(c) es un polipéptido que tiene la secuencia de polipéptidos mostrada como SEQ ID NO 2 o SEQ ID NO 4.
5. La flagelina de Roseburia, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de polinucleótidos se selecciona del grupo que consiste en:
(a) secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos; o
(b) secuencias de polinucleótidos que tienen al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 9 o SEQ ID NO 11 o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de los mismos; y combinaciones de los mismos.
6. La flagelina de Roseburia, y/o la secuencia de polinucleótidos, y/o el vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicho vector, y/o la célula huésped, incluyendo las bacterias, que comprende dicha secuencia de polinucleótidos según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la secuencia de polinucleótidos:
(a) puede obtenerse a partir de Roseburia hominis;
(b) tiene una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 4 o que codifica un polipéptido que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO 2 o la SEQ ID NO 4; o
(c) tiene una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO 1 o la SEQ ID NO 3 o que tiene la secuencia de polinucleótidos mostrada como SEQ ID NO 1 o SEQ ID NO 3.
7. La célula huésped, incluyendo las bacterias, según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la célula huésped:
(a) aumenta la producción de linfocitos T reguladores en un sujeto;
(b) aumenta la producción de IL-10 y/o TGFp en una célula o células de un sujeto
(c) aumenta la producción de marcadores de superficie celular implicados en las respuestas inmunitarias y el reconocimiento de antígenos, tal como CD40, I-A/I-E, CD317/BST-2, CD103, CD80, CD86, CD83 y/o Siglec-H y/o el equivalente de especie en una célula o células de un sujeto, opcionalmente donde la célula, o células, es una célula dendrítica; y/o
(d) disminuye la expresión de uno o más genes de IFN de tipo I en una célula o células de un sujeto.
8. La célula huésped, incluyendo las bacterias, según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la célula huésped es un microorganismo, levadura, hongo o célula vegetal, opcionalmente donde la célula huésped es una bacteria, por ejemplo, donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en especies de Roseburia, especies de bacterias de ácido láctico, especies de Lactococcus, una especie de Bifidobacterium, una especie de Lactobacillus o una especie de Propionibacterium.
9. La célula huésped, incluyendo las bacterias, según cualquier reivindicación anterior para su uso según cualquier reivindicación anterior, donde la célula huésped expresa una flagelina de Roseburia exógena o variantes, homólogos, fragmentos o derivados de la misma y combinaciones de los mismos.
10. La célula huésped, incluyendo las bacterias, según la reivindicación 9 para su uso según la reivindicación 9, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario en un sujeto.
11. Una composición farmacéutica y/o un complemento nutricional que comprende una célula huésped que expresa una flagelina de Roseburia exógena, donde la flagelina de Roseburia se selecciona del grupo que consiste en polipéptidos que tienen al menos un 75 % de identidad con la SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID n O 6, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 10 o SEQ ID NO 12 y un excipiente, portador o diluyente farmacéutica y/o nutricionalmente aceptable.
12. La composición farmacéutica y/o el complemento nutricional según la reivindicación 11, donde dicha célula huésped está encapsulada.
13. La composición farmacéutica y/o el complemento nutricional según la reivindicación 11 o 12 para uso en medicina.
14. La composición farmacéutica y/o el complemento nutricional según la reivindicación 13 para su uso según la reivindicación 13, donde la composición farmacéutica y/o el complemento nutricional es para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio y/o un trastorno autoinmunitario en un sujeto.
15. Un procedimiento para producir una composición farmacéutica y/o un complemento nutricional según la reivindicación 11, comprendiendo dicho procedimiento mezclar la célula huésped con un excipiente, portador o diluyente farmacéutica o nutricionalmente aceptable; opcionalmente donde la célula huésped está encapsulada.
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