ES2798649T3 - Conjugados de anticuerpos que contienen agonistas de receptores tipo Toll - Google Patents

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Bernhard Hubert Geierstanger
Timothy Z Hoffman
Shailaja Kasibhatla
Tetsuo Uno
Xing Wang
Tom Yao-Hsiang Wu
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Abstract

Un conjugado de Formula (II), o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo: **(Ver fórmula)** en donde: R50 es **(Ver fórmula)** en que el * indica el punto de union a Ab; Ab es un anticuerpo o fragmento de union a antigeno del mismo que se une especificamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3; R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6; R3 es L1OH; L1 es -(OH2)m-; L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(OH2)nNHO(=O)(OH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, - C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, - C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-,-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-, - C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)(CH2)nC(R7)2-,- C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n- o - C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n; R40 es **(Ver fórmula)** -S-,-NHC(=O)CH2-, -S(=O)2CH2CH2-, -(CH2)2S(=O)2CH2CH2-, -NHS(=O)2CH2CH2,-NHC(=O)CH2CH2-, - CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2-, **(Ver fórmula)** cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6; cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH; cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, - CN, -NO2 y -OH; cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; R12 es H, metilo o fenilo; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4; cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4; cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, e y es un numero entero de 1 a 16.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de anticuerpos que contienen agonistas de receptores tipo Toll
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de EE.UU. N ° 62/247896, presentada el 29 de octubre de 2015.
Listado de Secuencias
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado por vía electrónica en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 5 de octubre de 2016, se denomina PAT057064-WO-PCT_SL.txt y tiene un tamaño de 55.525 bitios.
Campo De La Invención
La invención proporciona conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas de receptores tipo toll y el uso de tales conjugados para el tratamiento del cáncer.
Antecedentes De La Invención
La inmunidad innata es una respuesta inmune rápida no específica que lucha contra las agresiones medioambientales, incluidos patógenos, tales como bacterias o virus. La inmunidad adaptativa es una respuesta inmune más lenta pero más específica, que confiere inmunidad duradera o protectora al huésped e implica la diferenciación y activación de linfocitos T naive en células T auxiliares CD4+ y/o células T citotóxicas CD8+, para fomentar la inmunidad celular y humoral. Las células de presentación de antígenos del sistema inmune innato, tales como las células dendríticas o los macrófagos, sirven como un enlace crítico entre los sistemas inmunes innato y adaptativo al fagocitar y procesar los antígenos extraños y presentarlos en la superficie celular a las células T, activando así la respuesta de células T.
Los receptores tipo Toll (TLR) son receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que se expresan predominantemente en células dendríticas, macrófagos, monocitos, células asesinas naturales y linfocitos T. Los TLR se unen a patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPS) de bacterias, hongos, protozoos y virus, y actúan como una primera línea de defensa contra los patógenos invasores. La activación de TLR conduce a una absorción de antígenos incrementada, maduración y capacidad estimuladora de células T de las células dendríticas. Los TLR comprenden un dominio de repetición rico en leucina (LRR) N-terminal extracelular, seguido de una región rica en cisteína, un dominio de transmembrana y una cola intracelular (citoplasmática) que contiene una región conservada denominado el dominio de receptores de Toll/IL-1 (TIR). El dominio LRR es importante para la unión del ligando y la señalización asociada y es una característica común de los PRR. El dominio TIR es importante en las interacciones proteína-proteína y está asociado con la inmunidad innata. Los TLR son esenciales para inducir la expresión de genes implicados en las respuestas inflamatorias y desempeñan papeles críticos en el desarrollo de la inmunidad adquirida específica para antígenos.
Mientras que los agonistas de TLR se han descrito previamente en el documento US2012/231023 A1, que describe una composición adyuvante que comprende un anticuerpo específico para células anti-dendríticas (DC) conjugado con un agonista de TLR, los agonistas de TLR difieren estructuralmente de los descritos en la presente en varios puntos. Además, el documento US2012/231023 A1 no describe un conjugado en el que el anticuerpo se une específicamente a Her2 humano.
Sigue existiendo la necesidad de nuevas inmunoterapias para el tratamiento de enfermedades, en particular el cáncer.
Sumario De La Invención
La invención proporciona conjugados de anticuerpos que comprenden agonistas de receptores tipo toll, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, composiciones farmacéuticas de los mismos y combinaciones de los mismos, que son útiles para el tratamiento de enfermedades, en particular, el cáncer. La invención proporciona, además, una cantidad eficaz de un conjugado de anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento, la prevención o la mejoría del cáncer en un sujeto que lo necesita. La invención también proporciona compuestos que comprenden agonistas de TLR7 y un enlazador que son útiles para conjugar con un anticuerpo anti-HER2 y de ese modo hacer los conjugados inmuno-estimuladores de la invención. En la presente se describen diversas realizaciones de la invención.
En un aspecto de la invención, son compuestos que tienen la estructura de Fórmula (I), y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, que son agonistas de TLR7:
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000005_0001
R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
En un aspecto de la invención, son compuestos que tienen la estructura de Fórmula (I), y las sales farmacéuticamente
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000007_0001
cada uno de los R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4sustituido con -C(=O)Oh y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
En un aspecto de la invención, son compuestos de Fórmula (I) que tienen la estructura de Fórmula (la) o Fórmula (lb),
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000008_0001
R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
En un aspecto de la invención, son compuestos de Fórmula (I) que tienen la estructura de Fórmula (la) o Fórmula (lb),
Figure imgf000008_0002
R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
L1 es -(CH2)m-;
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-,
Figure imgf000009_0001
cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo Ci-Ca;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Otro aspecto de la invención son los conjugados de anticuerpos que tienen la estructura de Fórmula (II), y sus sales farmacéuticamente aceptables:
Figure imgf000010_0001
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
L1 es -(CH2)m-;
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-,-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-,-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-,-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-,-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)(CH2)nC(R7)2-,-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n- o -C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n;
Figure imgf000011_0001
cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4sustituido con -C(=O)Oh y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Otro aspecto de la invención son conjugados de anticuerpos que tienen la estructura de Fórmula (II), y sus sales farmacéuticamente aceptables:
Figure imgf000012_0001
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000013_0001
cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Otro aspecto de la invención son conjugados de anticuerpos de Fórmula (II), que tienen la estructura de Fórmula (IIa) Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000014_0001
cada R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Otro aspecto de la invención son conjugados de anticuerpos de Fórmula (II), que tienen la estructura de Fórmula (IIa) o Fórmula (IIb), y sus sales farmacéuticamente aceptables:
Figure imgf000014_0002
rmua a rmua
donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH
Figure imgf000015_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo Ci-Ce;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que incluye una cantidad terapéuticamente efectiva de un conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (IIa) o Fórmula (lib), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, y un soporte farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es el uso de una cantidad efectiva de conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (IIa) o Fórmula (lib), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para el tratamiento de un cáncer HER2-positivo, en un sujeto que necesite un tratamiento de este tipo. Un cáncer HER2-positivo puede ser cualquier cáncer gástrico, cáncer de esófago, adenocarcinoma de unión gastroesofágica, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, osteosarcoma, neuroblastoma, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello. Un cáncer HER2-positivo puede tener una alta expresión de HER2 (p. ej., puede tener una puntuación IHC de 3+) o una expresión baja de HER2 (p. ej., puede tener una puntuación IHC de 2+).
Otro aspecto de la invención es el uso de un conjugado de anticuerpos de Fórmula (II), Fórmula (IIa) o Fórmula (II b), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en la fabricación de un medicamento para tratar un cáncer HER2-positivo.
Otro aspecto de la invención es un conjugado de anticuerpos para uso en un método de tratamiento médico, en donde el método de tratamiento médico es para tratar un cáncer HER2-positivo, y en donde el conjugado de anticuerpos es un conjugado de anticuerpos de Fórmula (II), Fórmula ( IIa) o Fórmula (IIb), o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. Además, un aspecto adicional de la invención es un conjugado de anticuerpos para su uso en un método para suprimir un cáncer HER2-positivo durante un período sostenido y/o reducir la recurrencia de un cáncer HER2-positivo, en comparación con un anticuerpo anti-HER2 solo.
Los conjugados de anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para tratar no solo tumores que expresan HER2 altos (p. ej., que tienen puntuaciones IHC 3+), sino también tumores que expresan HER2 más bajos (p. ej., que tienen puntuaciones IHC 2+).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 representa los resultados después de un tratamiento único de conjugado anti-HER2-mAb2-(C-1) en el modelo de tumor de xenoinjerto N87. Se observó una regresión del tumor para todas las dosis testadas, incluyendo 1 mg/kg (rombo negro), 2,5 mg/kg (triángulo negro), 5 mg/kg (círculo negro) y 10 mg/kg (cuadrado negro) en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Una regresión de los tumores gástricos N87 no se observó en ratones de xenoinjerto N87 tratados con 10 mg/kg de mAb2 anti-HER2 no conjugado solo (triángulo en blanco), o un conjugado de anticuerpo de control de isotipo (C-1) (rombo en blanco) en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
La FIG. 2 representa los resultados después del tratamiento de tumores de xenoinjerto N87 humano con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-1) o mAb1 anti-HER2-(C-5). Se observó la regresión de los tumores de xenoinjerto N87 humanos después del tratamiento con 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-1) (cuadrado negro) o 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (triángulo negro), mientras que el tratamiento con 0,3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-1) (círculo negro) o 0,3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (rombo negro) resultó en estasis del tumor, en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Una regresión de los tumores gástricos N87 no se observó en ratones de xenoinjerto N87 tratados con un conjugado de anticuerpo de control de isotipo (C-5) (rombo en blanco) en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
La FIG. 3 representa los resultados después del tratamiento de tumores de xenoinjerto N87 humanos con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-5). Se observó la regresión de los tumores de xenoinjerto N87 humanos después del tratamiento con 5 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (cuadrado negro) o 3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (círculo negro), mientras que el tratamiento con 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (triángulo negro) resultó en estasis del tumor, en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
La FIG. 4 representa los resultados después del tratamiento de tumores de xenoinjerto N87 humanos con una dosis única de mAb1 anti-HER2 conjugado con diferentes compuestos.. Se observó una regresión inicial, seguida de estasis de tumores de xenoinjerto N87 humano después del tratamiento con 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (triángulos negros), mAb1 anti-HER2-(C-60) (triángulos en blanco), mAb1 anti-HER2-(C-59) (cuadrado negro), mAb1 anti-HER2-(C-61) (cuadrado en blanco), mAb1 anti-HER2-(C-35) (hexágono negro) , mAb1 anti-HER2-(C-37) (hexágono en blanco), mAb1 anti-HER2 (C-64) (rombo negro) o mAb1 anti-HER2-(C-62) (rombo en blanco), en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
Las FIGs. 5A y 5B representan los resultados del tratamiento de tumores de mama de ratón MMC (ratHER2-positivos) con una dosis única de conjugado anti-ratHER2 -(C-46). Los resultados demuestran que se observó una regresión completa del tumor en siete de ocho ratones tratados con conjugado anti-ratHER2-(C-46) (FIG. 5A), pero solo en tres de ocho ratones tratados con el anticuerpo anti-ratHER2 desnudo (FIG. 5B). El tratamiento se inició cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 200 mm3 en el modelo singénico de cáncer de mama MMC. Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
La FIG. 6 representa los resultados después del tratamiento de tumores de xenoinjerto de mama HCC1954 humanos con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-5). Se observó la regresión de los tumores de xenoinjerto HCC1954 humanos después del tratamiento con 10 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (cuadrado negro) o 3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (círculo negro), mientras que el tratamiento con 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (triángulo negro) resultó en estasis del tumor, en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Una regresión de los tumores no se observó en los ratones de xenoinjerto HCC1954 tratados 10 mg/kg de un conjugado de anticuerpo de control de isotipo (C-5) (rombo en blanco) o mAb1 anti-.HER2 no conjugado en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
La FIG. 7 representa los resultados después del tratamiento de tumores de xenoinjerto de ovario SKOV3 humanos con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-5). Se observó la regresión de los tumores de xenoinjerto SKOV3 humanos después del tratamiento con 10 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (cuadrado negro), mientras que el tratamiento con 3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) (círculo negro) resultó en una regresión inicial del tumor, seguida de un crecimiento renovado del tumor, en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Una regresión de los tumores no se observó en los ratones de xenoinjerto SKOV3 tratados con 10 mg/kg de un conjugado de anticuerpo de control de isotipo (C-5) (rombo en blanco) o mAb1 anti-.HER2 no conjugado solo (triángulo en blanco), en comparación con animales no tratados (círculo en blanco). Los datos representan los volúmenes del tumor medios (media /- EMT) a lo largo del tiempo (post-dosis).
Las FIGs. 8A-8C representan imágenes representativas de ImmunoHistoChemistry (IHC) que muestran la expresión de HER2 en tumores de xenoinjertos N87 (FIG. 8A), HCC1954 (FIG. 8B) y SKOV3 (FIG. 8C). Los tumores se puntuaron en base a su nivel de expresión de HER2 como 3+ (N87 y HCC1954) y 2+ (s Ko V3).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente se describen diversas realizaciones enumeradas de la invención. Se reconocerá que las características especificadas en cada realización se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención.
A lo largo del texto de esta solicitud, si hubiera una discrepancia entre el texto de la memoria descriptiva (p. ej., la Tabla 1) y el listado de secuencias, prevalecerá el texto de la memoria descriptiva.
Definiciones
El término "alquilo C4-C6", tal como se usa en la presente, se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal o ramificada completamente saturado que contiene de 4 a 6 átomos de carbono. Ejemplos no limitantes de grupos "alquilo C4-C6",incluyen n-butilo, isobutilo, sec.-butilo, terc.-butilo, n-pentilo, isopentilo y hexilo.
Tal como se utiliza en la presente, "HER2" (también conocidos como ERBB2; NEU; NGL; TKR1; CD340; p185; MLN19; HER-2/neu) se refiere a un receptor de tirosina quinasa transmembrana de la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGF). HER2 comprende un dominio de unión extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio de tirosina quinasa intracelular. HER2 no tiene un dominio de unión a ligando propio y, por lo tanto, no puede unirse a factores de crecimiento, sin embargo, HER2 se une estrechamente a otros miembros de la familia de receptores de EGF unidos a ligando, tales como HERI o HER3, para formar un heterodímero, estabilizando la unión a ligando y potenciando la activación mediada por quinasa de vías de señalización aguas abajo. El gen HER2/NEU humano se mapea en la ubicación cromosómica 17q12, y la secuencia genómica del gen HER2/NEU se puede encontrar en GenBank en NG_007503.1. En seres humanos existen cinco isoformas de HER2: A, B, C, D y E; el término "HER2" se utiliza en la presente para referirse colectivamente a todas las isoformas de HER2. Tal como se utiliza en la presente, una proteína HER2 humana también abarca proteínas que tienen en toda su longitud al menos aproximadamente un 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con las isoformas de HER2: A, B, C, D y E, en donde dichas proteínas todavía tienen al menos una de las funciones de HER2. Las secuencias de ARNm y proteínas para la isoforma A de HER2 humana, la isoforma más larga, son:
Receptor tirosina quinasa 2 erb-b22 (ERBB2) de Homo sapiens, variante de transcrito 1, ARNm [NM_004448.3] 1 gcttgctccc aatcacagga gaaggaggag gtggaggagg agggctgctt gaggaagtat
61 aagaatgaag ttgtgaagct gagattcccc tccattggga ccggagaaac caggggagcc
121 ccccgggcag ccgcgcgccc cttcccacgg ggccctttactgcgccgcgcgcccggcccc
181 cacccctcgc agcaccccgc gccccgcgcc ctcccagccg ggtccagccg gagccatggg
241 gccggagccg cagtgagcac catggagctg gcggccttgt gccgctgggg gctcctcctc
301 gccctcttgc cccccggagc cgcgagcacc caagtgtgca ccggcacaga catgaagctg 361 cggctccctg ccagtcccga gacccacctg gacatgctcc gccacctcta ccagggctgc 421 caggtggtgc agggaaacct ggaactcacctacctgccca ccaatgccag cctgtccttc 481 ctgcaggata tccaggaggt gcagggctac gtgctcatcg ctcacaacca agtgaggcag 541 gtcccactgc agaggctgcg gattgtgcga ggcacccagc tctttgagga caactatgcc 601 ctggccgtgctagacaatgg agacccgctg aacaatacca cccctgtcac aggggcctcc 661 ccaggaggcctgcgggagctgcagcttcga agcctcacag agatcttgaa aggaggggtc 721 ttgatccagc ggaaccccca gctctgctac caggacacga ttttgtggaa ggacatcttc 781 cacaagaaca accagctggctctcacactg atagacacca accgctctcg ggcctgccac 841 ccctgttctc cgatgtgtaa gggctcccgctgctggggag agagttctga ggattgtcag 901 agcctgacgc gcactgtctg tgccggtggc tgtgcccgct gcaaggggcc actgcccact 961 gactgctgcc atgagcaglg tgctgccggc tgcacgggcc ccaagcactc tgactgcctg 1021 gcctgcctcc acttcaacca cagtggcatc tgtgagctgc actgcccagc cctggtcacc 1081 tacaacacag acacgtttga gtccatgccc aatcccgagg gccggtatac attcggcgcc 1141 agctgtgtga ctgcctgtcc ctacaactac ctttctacgg acgtgggatc ctgcaccctc 1201 gtctgccccc tgcacaacca agaggtgaca gcagaggatg gaacacagcg gtgtgagaag 1261 tgcagcaagc cctgtgcccg agtgtgctat ggtctgggca tggagcactt gcgagaggtg 1321 agggcagtta ccagtgccaa tatccaggag tttgctggct gcaagaagat ctttgggagc 1381 ctggcatttc tgccggagag ctttgatggg gacccagcct ccaacactgc cccgctccag 1441 ccagagcagc tccaagtgtt tgagactctg gaagagatca caggttacct atacatclca 1501 gcatggccgg acagcctgcc tgacctcagc gtcttccaga acctgcaagt aatccgggga 1561 cgaattctgc acaatggcgc ctactcgctg accctgcaag ggctgggcat cagctggctg 1621 gggctgcgct cactgaggga actgggcagt ggactggccc tcatccacca taacacccac 1681 ctctgcttcg tgcacacggt gccctgggac cagctctltc ggaacccgca ccaagctctg 1741 ctccacactg ccaaccggcc agaggacgag tgtgtgggcg agggcctggc ctgccaccag 1801 ctgtgcgccc gagggcactg ctggggtcca gggcccaccc agtgtgtcaa ctgcagccag 1861 ttccttcggg gccaggagtg cgtggaggaa tgccgagtac tgcaggggct ccccagggag 1921 tatgtgaatg ccaggcactg tttgccgtgc caccctgagt gtcagcccca gaatggctca 1981 gtgacctgttttggaccgga ggctgaccag tgtgtggcct gtgcccacta taaggaccct 2041 cccttctgcg tggcccgctg ccccagcggt gtgaaacctg acctctccta catgcccatc 2101 tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc cagccttgcc ccatcaactg cacccactcc 2161 tgtgtggacc tggatgacaa gggctgcccc gccgagcaga gagccagccc tctgacgtcc 2221 atcatctctg cggtggttgg cattctgctg gtcgtggtcttgggggtggt ctttgggatc
2281 ctcatcaagc gacggcagca gaagatccgg aagtacacga tgcggagact gctgcaggaa 2341 acggagctgg tggagccgct gacacctagc ggagcgatgc ccaaccaggcgcagatgcgg 2401 atcctgaaag agacggagct gaggaaggtg aaggtgcttg gatctggcgcttttggcaca 2461 gtctacaagg gcatctggat ccctgatggg gagaatgtga aaattccagt ggccatcaaa 2521 gtgttgaggg aaaacacatc ccccaaagcc aacaaagaaa tcttagacga agcatacgtg 2581 atggctggtg tgggctcccc atatgtctcc cgccttctgg gcatctgcct gacatccacg 2641 gtgcagctgg tgacacagct tatgccctat ggctgcctct tagaccatgt ccgggaaaac 2701 cgcggacgcctgggctccca ggacctgctg aactggtgta tgcagattgc caaggggatg 2761 agctacctgg aggatgtgcg gctcgtacac agggacttgg ccgctcggaa cgtgctggtc 2821 aagagtccca accatgtcaa aattacagacttcgggctgg ctcggctgct ggacattgac 2881 gagacagagt accatgcaga tgggggcaag gtgcccatca agtggatggc gctggagtcc 2941 attctccgcc ggcggttcac ccaccagagt gatgtgtgga gttatggtgt gactgtgtgg 3001 gagctgatga cttttggggc caaaccttac gatgggatcc cagcccggga gatccctgac 3061 ctgctggaaa agggggagcg gctgccccag ccccccatct gcaccattga tgtctacatg 3121 atcatggtca aalgltggat gattgactct gaatgtcggc caagattccg ggagttggtg 3181 tctgaattct cccgcatggc cagggacccc cagcgctttg tggtcatcca gaatgaggac 3241 ttgggcccag ccagtccctt ggacagcaccttctaccgct cactgctgga ggacgatgac 3301 atgggggacc tggtggatgc tgaggagtat ctggtacccc agcagggctt cttctgtcca 3361 gaccctgccc cgggcgctgg gggcatggtc caccacaggc accgcagctc atctaccagg 3421 agtggcggtg gggacctgac actagggctg gagccctctg aagaggaggc ccccaggtct 3481 ccactggcac cctccgaagg ggctggctcc gatgtatttg atggtgacct gggaatgggg 3541 gcagccaagg ggctgcaaag cctccccaca catgacccca gccctctaca gcggtacagt 3601 gaggacccca cagtacccct gccctctgag actgatggct acgttgcccc cctgacctgc 3661 agcccccagc ctgaatatgt gaaccagcca gatgttcggc cccagccccc ttcgccccga
3721 gagggccctc tgcctgctgc ccgacctgct ggtgccactctggaaaggcc caagactctc
3781 tccccaggga agaatggggt cgtcaaagac gtttttgcct ttgggggtgc cgtggagaac
3841 cccgagtact tgacacccca gggaggagct gcccctcagc cccaccctcc tcctgccttc
3901 agcccagccttcgacaacct ctattactgg gaccaggacc caccagagcg gggggctcca
3961 cccagcacct tcaaagggac acctacggca gagaacccag agtacctggg tctggacgtg
4021 ccagtgtgaa ccagaaggcc aagtccgcag aagccctgat gtgtcctcag ggagcaggga
4081 aggcctgact tctgctggca tcaagaggtg ggagggccct ccgaccactt ccaggggaac
4141 ctgccatgcc aggaacctgt cctaaggaac cttccttcct gcttgagttc ccagatggct
4201 ggaaggggtc cagcctcgtt ggaagaggaa cagcactggg gagtctttgt ggattctgag
4261 gccctgccca atgagactct agggtccagl ggatgccaca gcccagcttg gccctttcct
4321 tccagatcct gggtactgaa agccttaggg aagctggcct gagaggggaa gcggccctaa
4381 gggagtgtct aagaacaaaa gcgacccatt cagagactgt ccctgaaacc tagtactgcc
4441 ccccatgagg aaggaacagc aatggtgtca gtatccaggc tttgtacaga gtgcttttct
4501 gtttagtttt tacttttttt gttttgtttt tttaaagatg aaataaagac ccagggggag
4561 aatgggtgtt gtatggggag gcaagtgtgg ggggtccttc tccacaccca ctttgtccat
4621 ttgcaaatat attttggaaa acagctaaaa aaaaaaaaaa aaaa (SEQ ID NO: 25)
Precursor del receptor proteína tirosina quinasa erbB-2 isoforma a [Homo sapiens] [NP_004439.2]
MELAALCRWG LLLALLPPGA ASTQVCTGTD MKLRLPASPE THLDMLRHLY QGCQVVQGNL ELTYLPTNAS LSFLQDIQEV QGYVLIAHNQ VRQVPLQRLR IVRGTQLFED NYALAVLDNG DPLNNTTPVT GASPGGLREL QLRSLTEILK GGVLIQRNPQ LCYQDTILWK DIFHKNNQLA LTLIDTNRSR ACHPCSPMCK GSRCWGESSE DCQSLTRTVC AGGCARCKGP LPTDCCHEQC AAGCTGPKHS DCLACLHFNH SGICELHCPA LVTYNTDTFE SMPNPEGRYT FGASCVTACP YNYLSTDVGS CTLVCPLHNQ EVTAEDGTQR CEKCSKPCAR VCYGLGMEHL REVRAVTSAN IQEFAGCKKI FGSLAFLPES FDGDPASNTA PLQPEQLQVF ETLEEITGYL YISAWPDSLP DLSVFQNLQV IRGRILHNGA YSLTLQGLGI SWLGLRSLRE LGSGLALIHH NTHLCFVHTV PWDQLFRNPH QALLHTANRP EDECVGEGLA CHQLCARGHC WGPGPTQCVN CSQFLRGQEC VEECRVLQGL PREYVNARHC LPCHPECQPQ NGSVTCFGPE ADQCVACAHY KDPPFCVARC PSGVKPDLSY MPIWKFPDEE GACQPCPINC THSCVDLDDK GCPAEQRASP LTSIISAVVG ILLVVVLGW FGILIKRRQQ KIRKYTMRRL LQETELVEPL TPSGAMPNQA QMRILKETEL RKVKVLGSGA FGTVYKGIWI PDGENVKIPV AIKVLRENTS PKANKEILDE AYVMAGVGSP YVSRLLGICL TSTVQLVTQL MPYGCLLDHV RENRGRLGSQ DLLNWCMQIA KGMSYLEDVR LVHRDLAARN VLVKSPNHVK ITDFGLARLL DIDETEYHAD GGKVPIKWMA LESILRRRFT HQSDVWSYGV TVWELMTFGA KPYDGIPARE IPDLLEKGER LPQPPICTID VYMIMVKCWM IDSECRPRFR ELVSEFSRMA RDPQRFVVIQ NEDLGPASPL DSTFYRSLLE DDDMGDLVDA EEYLVPQQGF FCPDPAPGAG GMVHHRHRSS STRSGGGDLT LGLEPSEEEA PRSPLAPSEG AGSDVFDGDL GMGAAKGLQS LPTHDPSPLQ RYSEDPTVPL PSETDGYVAP LTCSPQPEYV NQPDVRPQPP SPREGPLPAA RPAGATLERP KTLSPGKNGV VKDVFAFGGA VENPEYLTPQ GGAAPQPHPP PAFSPAFDNL YYWDQDPPER GAPPSTFKGT PTAENPEYLG LDVPV
(SEQ ID NO: 26)
El ARNm y las secuencias de proteínas de las otras isoformas HER2 humanas se pueden encontrar en GeneBank con los siguientes N°s de acceso:
Isoforma B de HER2: NM_001005862.2 (ARNm)— > NP_001005862.1 (proteína);
Isoforma C de HER2: NM_001289936.1 (ARNm)— > NP_001276865.1 (proteína);
Isoforma D de HER2: NM_001289937.1 (ARNm)— > NP_001276866.1 (proteína);
Isoforma E de HER2: NM_001289938.1 (ARNm)— > NP_001276867.1 (proteína).
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de proteína o polipéptido derivada de una molécula de inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, de cadena múltiple o sencilla, o inmunoglobulinas intactas, y pueden proceder de fuentes naturales o de fuentes recombinantes. Un "anticuerpo" que se produce de forma natural es una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada una de las cadenas pesadas está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres dominios: CH1, CH2 y CH3. Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta por un dominio, Cl. Las regiones VH y VL se pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada una de las VH y VL está compuesto por tres CDR y cuatro FR dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema de complemento clásico. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo camelisado o un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo (p. ej., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
La expresión "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a al menos una porción de un anticuerpo, que conserva la capacidad de interactuar específicamente (p. ej., mediante unión, impedimento estérico, estabilización/desestabilización, distribución espacial) con un epítopo de un antígeno . Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, fragmentos de anticuerpos scFv, Fvs enlazados por disulfuro (sdFv), un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, anticuerpos lineales, anticuerpos de dominio único, tales como sdAb (VL o VH), dominios VHH de camélidos, anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos, tal como un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de bisagra y una CDR aislada u otros fragmentos de unión a epítopos de un anticuerpo. Un fragmento de unión al antígeno también se puede incorporar a anticuerpos de dominio único, maxicuerpos, minicuerpos, nanocuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, p. ej., Hollinger y Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005). Fragmentos de unión a antígeno también pueden injertarse en armazones basados en polipéptidos tales como una fibronectina tipo III (Fn3) (véase la Patente de EE.UU. N° 6.703.199, que describe minicuerpos del polipéptido fibronectina). El término "scFv" se refiere a una proteína de fusión que comprende al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena ligera y al menos un fragmento de anticuerpo que comprende una región variable de una cadena pesada, en donde las regiones variables de la cadena ligera y pesada están enlazadas contiguamente, p. ej., a través de un enlazador sintético, p. ej., un enlazador de polipéptido corto y flexible, y capaz de expresarse como un polipéptido de cadena sencilla, y en donde el scFv retiene la especificidad del anticuerpo intacto del que se deriva. A menos que se especifique, tal como se utiliza en la presente, un scFv puede tener las regiones variables VL y VH en cualquier orden, p. ej., con respecto a los extremos N-terminal y C-terminal del polipéptido, el scFv puede comprender VL-enlazador-VH o puede comprender VH-enlazador-VL.
La expresión "región determinante de complementariedad" o "CDR", tal como se utiliza en la presente, se refieren a las secuencias de aminoácidos dentro de regiones variables de anticuerpo que confieren especificidad de antígeno y afinidad de unión. Por ejemplo, en general, hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada (p. ej., CDR1H, CDR2H, c Dr 3H) y tres CDR una de las regiones variables de la cadena ligera (CDR1L, CDR2L, CDR3L). Los límites precisos de la secuencia de aminoácidos de una CDR dada pueden determinarse utilizando cualquiera de un cierto número de esquemas bien conocidos, incluidos los descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5.a Ed. Public Health Service, Institutos Nacionales de la Salud, Bethesda, MD (esquema de numeración de "Kabat"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 (esquema de numeración de "Chotia") o una combinación de estos. En un esquema combinado de numeración de Kabat y Chothia para una región CDR dada (por ejemplo, HC CDR1, HC CDR2, HC CDR3, LC CDR1, LC CDR2 o LC CDR3), en algunas realizaciones, las CDR corresponden a los residuos de aminoácidos que se definen como parte de la CDR de Kabat, junto con los residuos de aminoácidos que se definen como parte de la CDR de Chothia.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o de lo contrario interactuar con una molécula. Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activas tales como aminoácidos o carbohidratos o cadenas laterales de azúcares y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede ser "lineal" o "conformacional". Los epítopos conformacionales y lineales se distinguen porque la unión al primero pero no al último se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Las expresiones "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se utilizan en la presente, se refieren a polipéptidos, que incluyen anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, etc., que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica o se derivan de la misma fuente genética. Este término también incluye preparaciones de moléculas de anticuerpos de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal tiene una especificidad y afinidad de unión únicas para un epítopo particular.
La expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente, incluye anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto la región marco como la CDR se derivan de secuencias de origen humano. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de tales secuencias humanas, p. ej., secuencias de la línea germinal humana, o versiones mutadas de secuencias de la línea germinal humana o anticuerpo que contiene secuencias marco consensuadas derivadas del análisis de secuencias marco humanas, por ejemplo, tal como se describe en Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86). Las estructuras y ubicaciones de los dominios variables de inmunoglobulina, p. ej., CDR, se pueden definir utilizando esquemas de numeración bien conocidos, p. ej., el esquema de numeración de Kabat, el esquema de numeración de Chothia o una combinación de Kabat y Chothia (véase, p. ej., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds.. Kabat et al.; Al Lazikani et al., (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948); Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edic., NIH Publication n° 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services; Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:877-883; y Al-Lazikani et al., (1997) J. Mal. Biol 273:927-948).
Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias humanas (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo , o una sustitución conservadora para fomentar la estabilidad o la fabricación). Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", tal como se utiliza en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se hayan injertado en secuencias marco humanas.
La expresión "anticuerpo humano recombinante", tal como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana. o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., de un transfectoma, anticuerpos aislados de una colección recombinante, combinatoria de anticuerpos humanos, y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implican el corte y empalme de todo o una parte de un gen de inmunoglobulina humana, secuencias a otras secuencias de ADN. Anticuerpos humanos recombinantes de este tipo tienen regiones variables en las que las regiones marco y de CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en determinadas realizaciones, anticuerpos humanos recombinantes de este tipo pueden someterse a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
La expresión "región Fc", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende el CH3, CH2 y al menos una porción de la región bisagra de un dominio constante de un anticuerpo. Opcionalmente, una región Fc puede incluir un dominio CH4, presente en algunas clases de anticuerpos. Una región Fc puede comprender la región bisagra completa de un dominio constante de un anticuerpo. En una realización, la invención comprende una región Fc y una región CH1 de un anticuerpo. En una realización, la invención comprende una región CH3 de la región Fc de un anticuerpo. En otra realización, la invención comprende una región Fc, una región CH1 y una región C kappa/lambda del dominio constante de un anticuerpo. En una realización, una molécula de unión de la invención comprende una región constante, p. ej., una región constante de cadena pesada. En una realización, dicha región constante está modificada en comparación con una región constante de tipo salvaje. Es decir, los polipéptidos de la invención descritos en la presente pueden comprender alteraciones o modificaciones a uno o más de los tres dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2 o c H3) y/o al dominio de la región constante de la cadena ligera (CL). . Las modificaciones de ejemplo incluyen adiciones, deleciones o sustituciones de uno o más aminoácidos en uno o más dominios. Dichos cambios pueden incluirse para optimizar la función efectora, la semivida, etc.
La expresión "especificidad de unión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de un sitio de combinación de anticuerpo individual para reaccionar con un determinante antigénico y no con un determinante antigénico diferente. El sitio de combinación del anticuerpo se encuentra en la porción Fab de la molécula y se construye a partir de las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras. La afinidad de unión de un anticuerpo es la fuerza de la reacción entre un único determinante antigénico y un único sitio de combinación en el anticuerpo. Es la suma de las fuerzas atractivas y repulsivas que operan entre el determinante antigénico y el sitio de combinación del anticuerpo.
El término "afinidad", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la fuerza de interacción entre el anticuerpo y el antígeno en sitios antigénicos únicos. Dentro de cada uno de los sitios antigénicos, la región variable del "brazo" del anticuerpo interactúa a través de fuerzas no covalentes débiles con el antígeno en numerosos sitios; cuantas más interacciones, más fuerte es la afinidad.
La expresión "modificaciones de secuencia conservadoras" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras de este tipo incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Se pueden introducir modificaciones en un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención mediante técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las que el residuo de aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido las familias de residuos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales de carácter básico (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales de carácter ácido (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales apolares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales con ramificaciones beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de un anticuerpo pueden reemplazarse por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede analizarse utilizando los ensayos funcionales descritos en la presente.
El término "homólogo" o "identidad" se refiere a la identidad secuencial de subunidades entre dos moléculas poliméricas, p. ej., entre dos moléculas de ácido nucleico, tales como dos moléculas de ADN o dos moléculas de ARN, o entre dos moléculas polipeptídicas. Cuando una posición de subunidad en las dos moléculas está ocupada por la misma subunidad monomérica; p. ej., si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas o idénticas en esa posición. La homología entre dos secuencias es una función directa del número de posiciones coincidentes u homólogas; p. ej., si la mitad (p. ej., cinco posiciones en un polímero de diez subunidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 50%; si el 90% de las posiciones (p. ej., 9 de 10) son coincidentes u homólogas, las dos secuencias son homólogas en un 90%. El porcentaje de "identidad de secuencia" se puede determinar comparando dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en que el fragmento de la secuencia de aminoácidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (p. ej., huecos o colgantes) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje puede calcularse determinando el número de posiciones en las que se produce el residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para proporcionar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de la secuencia. El resultado es el porcentaje de identidad de la secuencia objeto con respecto a la secuencia de consulta.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que típicamente se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen carcinoma, linfoma, blastoma (que incluye meduloblastoma y retinoblastoma), sarcoma (que incluye liposarcoma y sarcoma de células sinoviales), tumores neuroendocrinos (que incluyen tumores carcinoides, gastrinoma y cáncer de células de los islotes), mesotelioma, schwannoma (que incluye neuroma acústico), meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o neoplasias linfoides. Ejemplos más particulares de este tipo de cánceres incluyen cáncer de células escamosas (p. ej., cáncer de células escamosas epiteliales), cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma de pulmón escamoso, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, neuroblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer de esófago, tumores del tracto biliar, así como cáncer de cabeza y cuello.
Un "cáncer HER2-positivo" o "cáncer que expresa HER2" es un cáncer que comprende células que tienen proteína HER2 presente en su superficie celular. Se conocen muchos métodos en la técnica para detectar o determinar la presencia de HER2 en una célula cancerosa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la presencia de HER2 en la superficie celular puede determinarse por inmunohistoquímica (IHC), citometría de flujo, transferencia Western, ensayo inmunofluorescente, radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA), fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo (HTRF) o tomografía por emisión de positrones (PET).
El término "combinación" o la expresión "combinación farmacéutica", tal como se utilizan en la presente, significan un producto que es el resultado de la mezcladura o combinación de más de un principio activo e incluye combinaciones tanto fijas como no fijas de los ingredientes activos. La expresión "combinación fija" significa que los ingredientes activos, a modo de ejemplo, un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales, se administran a un sujeto simultáneamente en forma de una sola entidad o dosificación. La expresión "combinación no fija" significa que los ingredientes activos, a modo de ejemplo, un compuesto de la invención y uno o más agentes terapéuticos adicionales, se administran a un sujeto como entidades separadas simultánea, concurrente o secuencialmente sin límites de tiempo específicos, en donde dicha administración proporciona niveles terapéuticamente efectivos de los ingredientes activos en el cuerpo del sujeto. Esto último también se aplica a la politerapia, p. ej., la administración de 3 o más ingredientes activos.
El término "composición" o la expresión "composición farmacéutica", tal como se utilizan en la presente, se refieren a una mezcla de un compuesto de la invención con al menos uno y opcionalmente más de otro componente químico farmacéuticamente aceptable, tal como soportes, estabilizadores, diluyentes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o excipientes.
La expresión "un isómero óptico" o "un estereoisómero", tal como se utilizan en la presente, se refiere a cualquiera de las diversas configuraciones estereoisómeras que pueden existir para un compuesto dado de la presente invención e incluye isómeros geométricos. Se sobreentiende que un sustituyente puede estar unido a un centro quiral de un átomo de carbono. El término "quiral" se refiere a moléculas que tienen la propiedad de no ser superponibles en su compañero de imagen especular, mientras que el término "aquiral" se refiere a moléculas que son superponibles en su compañero de imagen especular. Por lo tanto, la invención incluye enantiómeros, diastereómeros o racematos del compuesto. "Enantiómeros" son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1:1 de un par de enantiómeros es una mezcla "racémica". El término se utiliza para designar una mezcla racémica cuando sea apropiado. Los "diastereoisómeros" son estereoisómeros que tienen al menos dos átomos asimétricos, pero que no son imágenes especulares entre sí. La estereoquímica absoluta se especifica de acuerdo con el sistema R-S de Cahn-Ingold-Prelog. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada uno de los carbonos quirales se puede especificar ya sea como R o S. Los compuestos resueltos, cuya configuración absoluta es desconocida, se pueden designar (+) o (-) dependiendo de la dirección (dextrógira o levógira) en la que desvían el plano de luz polarizada a la longitud de onda de la línea D del sodio. Determinados compuestos descritos en la presente contienen uno o más centros o ejes asimétricos y, por tanto, pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de su estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-.
La expresión "soporte farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en la presente, incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (p. ej., agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, sales, conservantes, estabilizadores de fármacos, aglutinantes, excipientes, agentes de desintegración, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes y combinaciones de los mismos, como conocerían los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Salvo en lo que concierne a cualquier soporte convencional que sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una sal que no anula la actividad biológica y las propiedades de los compuestos de la invención, y no provoca irritación significativa a un sujeto al que se administra.
El término "sujeto", tal como se utiliza en la presente, abarca mamíferos y no mamíferos. Ejemplos de mamíferos incluyen seres humanos, chimpancés, simios, monos, vacas, caballos, ovejas, cabras, cerdos; conejos, perros, gatos, ratas, ratones, cobayas. Ejemplos de no mamíferos incluyen aves, peces. Con frecuencia el sujeto es un ser humano.
La expresión "un sujeto que necesita dicho tratamiento" se refiere a un sujeto que se beneficiaría biológica, médicamente o en calidad de vida de dicho tratamiento.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un conjugado de anticuerpos de la invención que provocará la respuesta biológica o médica de un sujeto, por ejemplo, la reducción o inhibición de una actividad enzimática o proteica, o mejorar los síntomas, aliviar afecciones, retrasar o demorar la progresión de la enfermedad, o prevenir una enfermedad, etc. En una realización no limitante, la expresión "una cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de un conjugado de anticuerpos de la invención que, cuando se administra a un sujeto, es efectivo para aliviar, inhibir, prevenir y/o mejorar al menos parcialmente una afección, un trastorno o una enfermedad.
La expresión "agonista de TLR7", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto o conjugado de anticuerpo capaz de activar el Receptor tipo Toll 7 (TLR7).
El término "tratar", la expresión "que tratan" o el término "tratamiento", tal como se utilizan en la presente, se refieren a métodos para aliviar, moderar o mejorar una enfermedad o síntomas de afección, prevenir síntomas adicionales, mejorar o prevenir las causas metabólicas subyacentes de síntomas, inhibir la enfermedad o afección, detener el desarrollo de la enfermedad o afección, aliviar la enfermedad o afección, provocar la regresión de la enfermedad o afección, aliviar una afección provocada por la enfermedad o afección, o detener los síntomas de la enfermedad o afección ya sea profiláctica y/o terapéuticamente.
Los nombres de los compuestos proporcionados en la presente se obtuvieron utilizando ChemDraw Ultra versión 12.0 (CambridgeSoft®) o JChem versión 5.3.1 (ChemAxon).
Los nombres de los compuestos proporcionados en la presente se obtuvieron utilizando ChemDraw Ultra versión 12.0 (CambridgeSoft®) o JChem versión 5.3.1 (ChemAxon).
A menos que se especifique lo contrario, la expresión "compuestos de la presente invención", "compuestos de la invención" o "compuestos proporcionados en la presente" se refiere a compuestos de Fórmula (I) y sub-formulas de los mismos (es decir, compuestos de Fórmula (la) y Fórmula (lb) ) y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros (incluidos diastereoisómeros y enantiómeros), tautómeros y compuestos marcados isotópicamente (incluidas las sustituciones de deuterio) de los mismos.
A menos que se especifique lo contrario, la expresión "conjugado de anticuerpo de la invención" se refiere a conjugados de Fórmula (II) y sub-formulas de los mismos (es decir, compuestos de Fórmula (Ila) y Fórmula (lIb) ) y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros (incluidos diastereoisómeros y enantiómeros), tautómeros y compuestos marcados isotópicamente (incluidas las sustituciones de deuterio) de los mismos.
Tal como se utiliza en la presente, se debe interpretar que el término "un", "una", "el/la" y términos similares utilizados en el contexto de la presente invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente o el contexto lo contradiga claramente.
Compuestos Inmunoestimuladores de la Invención
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R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada uno de los R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Determinados aspectos y ejemplos de los compuestos de la invención se proporcionan en la siguiente lista de realizaciones enumeradas adicionales. Se reconocerá que las características especificadas en cada realización se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención.
Realización 1. El compuesto de Fórmula I, sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:
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Figure imgf000028_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4sustituido con -C(=O)Oh y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 2. El compuesto de Fórmula (I) que tiene la estructura de Fórmula (la) o Fórmula (lb), y sus sales
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R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
L1 es -(CH2)m-;
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-,-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-,-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)(CH2)nC(R7)2-,-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n- o -C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n;
R4 es
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Figure imgf000030_0001
R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo Ci-Ca;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo Ci-Ca, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo Ci-Ca, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, - N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo Ci-a, fluoro, benciloxi sustituido con -C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi Ci-4sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 3. El compuesto de Fórmula (la) o Fórmula (Ib), y sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde: R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-Ca o -alquilo C4-Ca;
R3 es L1OH;
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 4. El compuesto de Fórmula (I) que tiene la estructura de Fórmula (la) o Fórmula (lb), y sus sales
Figure imgf000032_0002
Figure imgf000033_0001
R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 5. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000034_0001
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 6. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2; R2 es -alquilo C4-C6;
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0001
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Realización 7. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000035_0002
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4
y
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Realización 8. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde:
R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000036_0001
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 9. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000036_0002
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 10. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
L2 es -(CH2)n- o -C(=O)(CH2)n;
R4 es -ONH2 o -NH2;;
y
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 11. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000036_0003
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 12. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde R1 es -NHR2. Realización 13. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde R1 es-NHCHR2R3. Realización 14. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde R2 es -alquilo C4. Realización 15. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde R2 es -alquilo C5.
Realización 16. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: R2 es -alquilo C6. Realización 17. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde: R3 es LiOH.
Realización 18. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde: ;Li es -(CH2)-.
Realización 19. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde: Li es -(CH2CH2)-.
Realización 20. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -(CH2)n-*, -((CH2)nO)t(CH2)n-*, -(CH2)nX1(CH2)n-*, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*,-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-* o -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n*, en que el * designa el punto de unión a R4
Realización 21. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -C(=O)(CH2)n*-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-*,-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-*, C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-*, -C(=O)X2XaC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-VC(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-* o -c(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-*, en que el * designa el punto de unión a R4.
Realización 22. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -(CH2)n-* o -C(=O)(CH2)n-*, en que el * designa el punto de unión a R4
Realización 23. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -(CH2CH2)-* o -C(=O)(CH2CH2)-*, en que el * designa el punto de unión a R4.
Realización 24. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-*, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*,-C(=O)(CH2)nC(R7)2-*, -C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-* o -(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*, en que el * designa el punto de unión a R4.
Realización 25. El compuesto de Fórmula I , Fórmula la o Fórmula lb , en donde:
Figure imgf000037_0001
Realización 29. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
R4 es
Figure imgf000038_0001
Realización 30. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: R4 es -SR7 u -OH. Realización 31. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde R5 es
Figure imgf000038_0002
Realización 32. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: Xi es
Figure imgf000038_0003
Realización 33. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: Xi es
Figure imgf000038_0004
Realización 34. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: Xi es
N í'nT
Realización 35. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X2 es
Figure imgf000038_0005
Realización 36. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde: X2 es
Figure imgf000039_0001
Realización 37. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X2 es
Figure imgf000039_0002
Realización 38. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X2 es
Figure imgf000039_0003
Realización 40. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X3 es
Figure imgf000039_0004
Realización 41. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X3 es
Figure imgf000039_0005
Realización 42. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X3 es
Figure imgf000039_0006
Realización 43. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X3 es
Figure imgf000039_0007
Realización 44. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: X3 es
Figure imgf000039_0008
Realización 45. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde: R6 es 2-piridilo o 4-piridilo. Realización 46. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde cada uno de los R7 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6.
Realización 47. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los R7 es H. Realización 48. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los R7 es alquilo C1-C6.
Realización 49. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (Ib), en donde:cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 50. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los m es 1 o 2. Realización 51. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 52. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los n es 2 o 3. Realización 53. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Realización 54. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
Realización 55. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), seleccionado de:
1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido (2R)-2-amino-3-((1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico;
ácido (6R)-6-(2-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido (2S)-2-amino-3-((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxi bencil)piperazin-1-il)etil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico;
ácido (6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;
1-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-1 H-pirrol-2,5-diona;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido (2R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico;
ácido (2R,5S)-2-ammo-19-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico;
ácido (2R,5R)-2-ammo-19-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico;
ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1 -il)-16-carboxi-1, 14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico;
ácido (16R,19R)-19-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico;
ácido (16S,19R)-19-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico;
1-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,l5,18-hexaoxahenicosil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido (2R)-2-amino-28-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,l9,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico;
ácido (2R,5S)-2-amino-28-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,19,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico; ácido (2R,5R)-2-amino-28-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,19,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico; ácido (28R)-28-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1 -il)-25-carboxi-1,23-dioxo-4,7,1o,13,16,19-hexaoxa-26-tia-22-azanonacosan-29-oico;
ácido (25R,28R)-28-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-25-carboxi-1,23-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-26-tia-22-azanonacosan-29-oico; ácido (25S,28R)-28-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-25-carboxi-1,23-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-26-tia-22-azanonacosan-29-oico;
1-((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1 H-1,2,3-tri azol-4-il)metil)-1 H-pirrol-2,5-diona;
ácido (2R)-2-amino-3-((2-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-2-oxoetil)tio)pentanodioico; N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida;
ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1 -il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico;
ácido (16S,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico;
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico;
ácido (20R)-20-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico;
ácido (17R,20R)-20-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico;
ácido (17S,20R)-20-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico;
5-(4-((4-(3-aminopropil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina;
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona;
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida;
ácido (2R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico;
ácido (2R,5S)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico;
ácido (2R,5R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico;
ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico;
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico;
ácido (16S,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico;
4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)piperazina-1-carboxamida;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
1-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;
1- ((1-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1 H-pirrol-2,5-diona;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((l-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3- metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((l-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico;
N-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,l8-hexaoxahenicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida;
4- (4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2- ((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo;
ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico;
(S)-1-(3-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona;
1-(3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona;
ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4- metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona;
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-aminoetoxi)propan-1-ona;
N-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida;
(S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona;
(S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona;
(S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidi n-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida;
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida;
5- (4-((4-(2-(2-(aminooxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina;
N-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)-2-(aminooxi)acetamida;
5-(4-((4-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina;
N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida;
5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo;
5-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo;
ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(((S)-1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico;
ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico;
5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo;
ácido (S)-2-ammo-6-(5-((3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanamido)hexanoico;
5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo;
ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico;
5- (4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de perfluorofenilo;
3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanoato de perfluorofenilo;
3- (2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)propanoato de perfluorofenilo;
ácido (S)-2-ammo-6-(3-(3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanamido)hexanoico y
N-(15-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecil)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida.
Realización 56. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), seleccionado de:
1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona;
1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-pirrol-2,5-diona;
1-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-1 H-pirrol-2,5-diona y
1-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona.
Realización 57. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), seleccionado de:
ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico;
4- (4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((R)-6- amino-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-fenilpropanamido)hexanamido)bencilo; 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencilo; ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico;
ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico;
N-(2-((5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida;
1- (4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-metil-4-(metiltio)pentan-l-ona;
ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico;
(2R,2'R)-3,3'-((2-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-oxoetoxi)imino)propano-1,3-diil)bis(sulfanodiil))bis(ácido 2-aminopropanoico);
ácido (R)-2-amino-6-((((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)metil)-17-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-10,17-dioxo-8,14-dioxa-4-tia-7,11-diazaheptadec-6-enoico y 2- (4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etan-1-ol.
Además, la sustitución con isótopos más pesados, particularmente deuterio (es decir, 2H o D) puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo incrementada o requisitos de dosis reducidos o una mejora en el índice terapéutico. Se entiende que el deuterio en este contexto se considera un sustituyente de un compuesto de fórmula (I). La concentración de un isótopo más pesado de este tipo, específicamente deuterio, puede definirse por el factor de enriquecimiento isotópico. La expresión "factor de enriquecimiento isotópico", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la relación entre la abundancia isotópica y la abundancia natural de un isótopo especificado. Si un sustituyente en un compuesto de esta invención se denomina deuterio, dicho compuesto tendrá un factor de enriquecimiento isotópico para cada uno de los átomos de deuterio designados de al menos 3500 (52,5% de incorporación de deuterio en cada uno de los átomos de deuterio designados), al menos 4000 (60% de incorporación de deuterio), al menos 4500 (67,5% de incorporación de deuterio), al menos 5000 (75% de incorporación de deuterio), al menos 5500 (82,5% de incorporación de deuterio), al menos 6000 (90% de incorporación de deuterio), al menos 6333,3 (95% de incorporación de deuterio), al menos 6466,7 (97% de incorporación de deuterio), al menos 6600 (99% de incorporación de deuterio) o al menos 6633,3 (99,5% de incorporación de deuterio).
Solvatos farmacéuticamente aceptables de acuerdo con la invención incluyen aquellos en los que el disolvente de cristalización puede estar isotópicamente sustituido, p. ej., D2O, d6-acetona, d6-DMSO.
Procedimientos para Hacer Compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos
En la presente se describen procedimientos generales para preparar compuestos de Fórmula (I) y sub-formulas de los mismos. En las reacciones descritas, los grupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, imino, tiol o carboxi, en los casos en los que estos se deseen en el producto final, pueden protegerse para evitar su participación no deseada en las reacciones. Dentro del alcance de este texto, únicamente un grupo que se pueda eliminar fácilmente que no sea constituyente del producto final particular deseado de los compuestos de la presente invención se denomina un "grupo protector", a menos que el contexto indique lo contrario. La protección de grupos funcionales con grupos protectores de este tipo, los propios grupos protectores y sus reacciones de escisión se describen, por ejemplo, en trabajos de referencia estándares tales como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres y Nueva York 1973, en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", tercera edición, Wiley, Nueva York 1999, en "The Peptides"; volumen 3 (editores: E. Gross y J. Meienhofer), Academic Press, Londres y Nueva York 1981, en "Methoden der organischen Chemie" (Methods of Organic Chemistry), Houben Weyl, 4a edición, volumen 15/l, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, en H.-D. Jakubke y H. Jeschkeit, "Aminosauren, Peptide, Proteine" (Aminoácidos, Péptidos, Proteínas), Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach, y Basel 1982, y en Jochen Lehmann, "Chemie der Kohlenhydrate: Monosaccharide und Derivate" (Química de carbohidratos: monosacáridos y derivados), Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974. Una característica de los grupos protectores es que se pueden eliminar fácilmente (es decir, sin que se produzcan reacciones secundarias indeseadas), por ejemplo, mediante solvolisis, reducción, fotólisis o como alternativa en condiciones fisiológicas (por ejemplo, mediante escisión enzimática).
En determinadas realizaciones, los compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos, proporcionados en la presente, se preparan como una sal por adición de ácidos farmacéuticamente aceptable haciendo reaccionar la forma de base libre de un compuesto de Fórmula (I) y sus sub-formulas, con una cantidad estequiométrica de un ácido orgánico o ácido inorgánico farmacéuticamente aceptable apropiado o un reactivo de intercambio aniónico adecuado.
Reacciones de este tipo se llevan a cabo típicamente en agua o en un disolvente orgánico, o en una mezcla de los dos. Generalmente, en los casos en los que sea posible, es deseable el uso de medios no acuosos, tales como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo.
Alternativamente, las formas de sal de compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos, se preparan utilizando sales de los materiales de partida o compuestos intermedios.
Se pueden preparar sales de los compuestos de la presente invención que tienen al menos un grupo formador de sales de un modo conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las sales de los compuestos de la presente invención que tienen grupos ácidos se pueden formar, por ejemplo, tratando los compuestos con compuestos metálicos tales como sales de metales alcalinos de ácidos orgánicos carboxílicos adecuados, por ejemplo, la sal de sodio del ácido 2-etilhexanoico, con compuestos orgánicos de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como los correspondientes hidróxidos, carbonatos o hidrogenocarbonatos, tales como hidróxido, carbonato o hidrogenocarbonato de sodio o potasio, con los correspondientes compuestos de calcio o con amoniaco o una amina orgánica adecuada, usándose preferentemente cantidades estequiométricas o solo un pequeño exceso de agente formador de la sal. Las sales por adición de ácidos de los compuestos de la presente invención se obtienen de la manera habitual, p. ej., tratando los compuestos con un ácido o un reactivo de intercambio de aniones adecuado. Sales internas de compuestos de la presente invención que contienen grupos formadores de sales de carácter ácido y básico, p. ej., un grupo carboxi libre y un grupo amino libre, pueden formarse, p. ej., mediante la neutralización de sales, tales como sales por adición de ácidos, al punto isoeléctrico, p. ej., con bases débiles, o por tratamiento con intercambiadores de iones.
Las sales se pueden convertir en los compuestos libres de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las sales de metales y de amonio se pueden convertir, por ejemplo, mediante el tratamiento con ácidos adecuados, y las sales de adición de ácido, por ejemplo, mediante el tratamiento con un agente básico adecuado.
Todas las etapas del procedimiento arriba mencionadas se pueden llevar a cabo en condiciones de reacción que son conocidas por los expertos en la técnica, incluidas las mencionadas específicamente, en ausencia o, habitualmente, en presencia de disolventes o diluyentes, incluidos, por ejemplo, disolventes o diluyentes que son inertes hacia los reactivos utilizados y los disuelven, en ausencia o presencia de catalizadores, agentes de condensación o neutralizantes, por ejemplo, intercambiadores de iones, tales como intercambiadores de cationes, p. ej., en forma H+, dependiendo de la naturaleza de la reacción y/o de los reaccionantes a temperatura reducida, normal o elevada, por ejemplo en un intervalo de temperaturas de aproximadamente -100 °C a aproximadamente 190 °C, que incluye, por ejemplo, de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 150 °C, por ejemplo, de -80 a -60 °C, a temperatura ambiente, de -20 a 40 °C o a temperatura de reflujo, bajo presión atmosférica o en un recipiente cerrado, cuando sea apropiado bajo presión y/o en una atmósfera inerte, por ejemplo, bajo una atmósfera de argón o nitrógeno.
Sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los compuestos de Fórmula (I) y las sub-fórmulas de los mismos, incluyen formas de sales acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofilinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato y xinafoato.
El ácido orgánico o los ácidos inorgánicos utilizados para formar determinadas sales por adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos, incluyen ácido acético, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzoico, ácido bencenosulfónico, ácido carbónico, ácido alcanforsulfónico, ácido cáprico, cloroteofilinato, ácido cítrico, ácido etanodisulfónico, ácido fumárico, ácido D-glicero-D-gulo-heptónico, ácido galáctarico, ácido galactárico/ácido múcico, ácido glucéptico, ácido glucoheptonoico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutamático, ácido glutárico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido bromhídrico, ácido clorhídrico, ácido yodhídrico, ácido isetiónico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido laurilsulfúrico, ácido málico, ácido maleico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido mesílico, ácido metanosulfónico, ácido múcico, ácido naftoico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido naftalenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido nicotínico, ácido nítrico, ácido octadecanoico, ácido oleaico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido fosfórico, ácido poligalacturónico, ácido propiónico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfosalicílico, ácido sulfúrico, ácido tartárico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético y ácido trifenilacético.
En una realización, la presente invención proporciona 3-(3-fluoro-4-(3-(piperidin-4-il)propoxi)fenil)-1 -metil-1 H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina en forma de una sal acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofillinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato o xinafoato.
En una realización, la presente invención proporciona 3-(4-(((1r,4r)-4-aminociclohexil)metoxi)-3-fluorofenil)-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina en forma de una sal acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofillinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato o xinafoato.
En una realización, la presente invención proporciona 3-(4-((4-aminobiciclo[2.2.2]octan-1-il)metoxi)-3-fluorofenil)-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina en forma de una sal acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofillinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato o xinafoato.
En una realización, la presente invención proporciona 3-(4-((4-aminobiciclo[2.2.2]octan-1-i)metoxi)-3-clorofenil)-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-6-amina en forma de una sal acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofillinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato o xinafoato.
En una realización, la presente invención proporciona 4-((2-cloro-4-(6-metoxi-1-metil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)fenoxi)metil)biciclo[2.2.2]octan-1-amina en forma de una sal acetato, adipato, ascorbato, aspartato, benzoato, besilato, bencenosulfonato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, bromuro/hidrobromuro, sulfonato de alcanfor, camsilato, caprato, cloruro/hidrocloruro, cloroteofillinato, citrato, edisilato, etanodisulfonato, fumarato, gluceptato, glucoheptonato, gluconato, glucuronato, glutamato, glutarato, glicolato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metanosulfonato, metilsulfato, mucato, naftoato, napsilato, 2-napsilato, naftalenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/hidrógeno-fosfato/dihidrógeno-fosfato, poligalacturonato, propionato, sebacato, estearato, succinato, sulfosalicilato, sulfato, tartrato, tosilato, p-toluenosulfonato, trifluoroacetato, trifenatato, trifenilacetato o xinafoato.
Se pueden encontrar listas de sales por adición de ácidos adecuadas adicionales, p. ej., en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 20a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" de Stahl y Wermuth mencionadas específicamente o, por ejemplo, agua, ésteres, tales como alcanoatos inferiores de alquilo inferior, por ejemplo acetato de etilo, éteres, tales como éteres alifáticos, por ejemplo, dietiléter, o éteres cíclicos, por ejemplo tetrahidrofurano o dioxano, hidrocarburos aromáticos líquidos, tales como benceno o tolueno, alcoholes, tales como metanol, etanol o 1- o 2-propanol, nitrilos, tales como acetonitrilo, hidrocarburos halogenados, tales como como cloruro de metileno o cloroformo, amidas de ácido, tales como dimetilformamida o dimetilacetamida, bases, tales como bases de nitrógeno heterocíclico, por ejemplo piridina o N-metilpirrolidin-2-ona, anhídridos del ácido carboxílico, tales como anhídridos de ácido alcanoico inferior, por ejemplo anhídrido acético, hidrocarburos cíclicos, lineales o ramificados, tales como ciclohexano, hexano o isopentano, metilciclohexano o mezclas de esos disolventes, por ejemplo soluciones acuosas, a menos que se indique lo contrario en el descripción de los procedimientos. Dichas mezclas de disolventes también se pueden utilizar en el procesamiento, por ejemplo, mediante cromatografía o partición.
En ciertas realizaciones, los compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos se preparan o forman, como solvatos (p. ej., hidratos). En ciertas realizaciones, hidratos de compuestos de Fórmula (I) y sub-fórmulas de los mismos, se preparan por recristalización a partir de una mezcla de disolventes acuosos/orgánicos, utilizando disolventes orgánicos, tales como dioxina, tetrahidrofurano o metanol. Además, los compuestos de la presente invención, incluidas sus sales, también se pueden obtener en forma de sus hidratos o pueden incluir otros disolventes utilizados para su cristalización.
Los compuestos de la presente invención pueden formar solvatos de forma inherente o por diseño con disolventes farmacéuticamente aceptables (que incluyen agua); por lo tanto, se pretende que la invención englobe tanto formas solvatadas como no solvatadas. El término "solvato" se refiere a un complejo molecular de un compuesto de la presente invención (incluidas las sales farmacéuticamente aceptables del mismo) con una o más moléculas de disolvente. Moléculas disolventes son aquellas comúnmente utilizadas en la técnica farmacéutica, que se sabe que son inocuas para el receptor, p. ej., agua, etanol. El término "hidrato" se refiere al complejo en donde la molécula disolvente es agua.
Cualquier átomo asimétrico (p. ej., carbono o similar) del o de los compuestos de la presente invención puede estar presente en configuración racémica o enriquecida enantioméricamente, por ejemplo, la configuración (R), (S) o (R,S). En ciertas realizaciones, cada uno de los átomos asimétricos tiene al menos 50% de exceso enantiomérico, al menos 60% de exceso enantiomérico, al menos 70% de exceso enantiomérico, al menos 80% de exceso enantiomérico, al menos 90% de exceso enantiomérico, al menos 95% de exceso enantiomérico, o al menos 99% de exceso enantiomérico en la configuración (R) o (S). Los sustituyentes en átomos con dobles enlaces insaturados pueden estar presentes, si es posible, en forma cis (Z) o trans (E).
Por consiguiente, tal como se utiliza en la presente, un compuesto de la presente invención puede estar en forma de uno de los posibles isómeros, rotámeros, atropisómeros, tautómeros o mezclas de estos, por ejemplo, como racematos, isómeros ópticos (enantiómeros), diastereómeros, isómeros geométricos (cis o trans) sustancialmente puros o mezclas de estos.
Cualquier mezcla resultante de isómeros puede separarse en base a los productos fisico-químicos (antípodas), racematos o mezclas de los mismos.
Cualesquiera mezclas de isómeros resultantes se pueden separar en base a las diferencias físico-químicas de los constituyentes, en isómeros, diastereómeros, racematos puros o sustancialmente puros, geométricos u ópticamente puros, por ejemplo, por cromatografía y/o cristalización fraccionada.
Cualesquiera racematos resultantes de productos finales o intermedios puede resolverse en las antípodas ópticas por métodos conocidos, p. ej., por separación de sus sales diastereoméricas, obtenidas con un ácido o base ópticamente activo, y liberando el compuesto de carácter ácido o básico ópticamente activo. En particular, se puede emplear un resto de carácter básico para resolver los compuestos de la presente invención en sus antípodas ópticas, p. ej., por cristalización fraccionada de una sal formada con un ácido ópticamente activo, p. ej., ácido tartárico, ácido dibenzoil tartárico, ácido diacetil tartárico, ácido di-0,0'-p-toluoil tartárico, ácido mandélico, ácido málico o ácido alcanfor-10-sulfónico. Los productos racémicos también se pueden resolver mediante cromatografía quiral, p. ej., cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando un adsorbente quiral.
En ciertas realizaciones, los compuestos de Fórmula (I) o sub-fórmulas de los mismos se preparan como sus estereoisómeros individuales. En otras realizaciones, los compuestos de Fórmula (I), o sub-fórmulas de los mismos, se preparan como sus estereoisómeros individuales haciendo reaccionar una mezcla racémica del compuesto con un agente de resolución ópticamente activo para formar un par de compuestos diastereoisoméricos, separando los diastereómeros y recuperando los enantiómeros ópticamente puros. En ciertas realizaciones, la resolución de enantiómeros se lleva a cabo utilizando derivados diastereoméricos covalentes de los compuestos de Fórmula (I), o sub-fórmulas de los mismos, o utilizando complejos disociables (p. ej., sales diastereoméricas cristalinas). Los diastereómeros tienen propiedades físicas (p. ej., puntos de fusión, puntos de ebullición, solubilidad, reactividad, etc.) diferentes y se separan fácilmente aprovechando estas diferencias. En ciertas realizaciones, los diastereómeros se separan por cromatografía o por técnicas de separación/resolución basadas en diferencias de solubilidad. Después, el enantiómero ópticamente puro se recupera, junto con el agente de resolución, por cualquier medio práctico que no provoque racemización. Se puede encontrar una descripción más detallada de las técnicas aplicables para la resolución de estereoisómeros de compuestos a partir de su mezcla racémica en Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc., 1981.
Mezclas de isómeros obtenibles de acuerdo con la invención pueden separarse de una manera conocida por los expertos en la técnica en los isómeros individuales; los diastereoisómeros se pueden separar, por ejemplo, mediante la partición entre mezclas de disolventes polifásicos, recristalización y/o separación cromatográfica, por ejemplo sobre gel de sílice o, p. ej., mediante cromatografía líquida de presión media sobre una columna de fase inversa, y los racematos se pueden separar, por ejemplo, mediante la formación de sales con reactivos formadores de sales ópticamente puros y la separación de la mezcla de diastereoisómeros así obtenibles, por ejemplo, por cristalización fraccionada, o por cromatografía sobre materiales de columna ópticamente activos. o como mezclas de los mismos, por ejemplo, como isómeros ópticos puros, o como mezclas de isómeros, tales como racematos y mezclas de diastereoisómeros, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos. Se pretende que la presente invención incluya todos los posibles isómeros de este tipo, incluidas las mezclas racémicas, mezclas diastereoméricas y formas ópticamente puras. Isómeros (R) y (S) ópticamente activos pueden prepararse utilizando sintones quirales o reactivos quirales, o pueden resolverse utilizando técnicas convencionales. Si el compuesto contiene un doble enlace, el sustituyente puede tener la configuración E o Z. Si el compuesto contiene un cicloalquilo disustituido, el sustituyente del cicloalquilo puede tener una configuración cis o trans. También se pretende que todas las formas tautoméricas estén incluidas.
Productos intermedios y finales pueden elaborarse y/o purificarse de acuerdo con métodos estándares, p. ej., utilizando métodos cromatográficos, métodos de distribución, (re)cristalización. La invención se refiere también a aquellas formas del procedimiento en las cuales se utiliza como material de partida un compuesto que se puede obtener como compuesto intermedio en cualquier etapa del proceso y se llevan a cabo las etapas restantes del procedimiento, o en las cuales un material de partida se forma en las condiciones de reacción o se utiliza en forma de derivado, por ejemplo, en una forma protegida o en forma de una sal, o un compuesto que se puede obtener mediante el procedimiento de acuerdo con la invención se produce en las condiciones del procedimiento y se procesa posteriormente in situ. Todos los materiales de partida, bloques de construcción, reactivos, ácidos, bases, agentes deshidratantes, disolventes y catalizadores utilizados para sintetizar los compuestos de la presente invención están disponibles comercialmente o pueden producirse mediante métodos de síntesis orgánicos conocidos por un experto en la técnica.
Compuestos de Fórmula (I) y sus sub-fórmulas (Fórmula (Ia) y Fórmula (Ib)) se preparan mediante procedimientos descritos en los esquemas generales de la presente y como se ilustra en los Ejemplos.
El Esquema 1A ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de fórmula (A1), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. En el esquema 1A, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 1A, R1 es como se describe en la presente y R4 es un resto reactivo que puede reaccionar con un tiol, un disulfuro, una amina, una cetona, una dicetona, una azida o un alquino. El Esquema 1B ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de fórmula (A1), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. En el esquema 1B, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 1B, R1 es como se describe en la presente y el resto R4 que tiene un grupo amino (tal como una hidroxilamina o una amina) y RB se tiene un resto de un grupo amino protegido, en que Prot es un grupo protector tal como Boc, Fmoc y Cbz.
Scheme 1
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Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P.
El Esquema 2A ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de fórmula (A2), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. En el esquema 2A, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 2A, R1 es como se describe en la presente y R4 es un resto reactivo que puede reaccionar con un tiol, un disulfuro, una amina, una cetona, una dicetona, una azida o un alquino. El Esquema 2B ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de fórmula (A2), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. En el esquema 2B, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 2B, R1 es como se describe en la presente y el resto R4que tiene un grupo amino (tal como una hidroxilamina o una amina) y RB se tiene un resto de un grupo amino protegido, en que Prot es un grupo protector tal como Boc, Fmoc y Cbz.
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Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P.
El Esquema 3A ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ia), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P. En el esquema 3A, el enlazador (L2) es cualquier resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La-C(=O)).. El Esquema 3B ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (I), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P. En el Esquema 3B, el enlazador (L2) comprende un resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La-C(=O)), y RB es un resto que tiene un grupo amino protegido, en que Prot es un grupo protector como Boc, Fmoc y Cbz.
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El Esquema 4A ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ib), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P. En el esquema 4A, el enlazador (L2) es cualquier resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La-C(=O)).. El Esquema 4B ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ib), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P. En el Esquema 4B, el enlazador (L2) comprende un resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La C(=O)), y RB es un resto que tiene un grupo amino protegido, en que Prot es un grupo protector como Boc, Fmoc y
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R1, R7, R8, R9 y R10 son como se definen en la presente.
El Esquema 5 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para preparar ciertos compuestos de Fórmula (B1) , en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) por alquilación de la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A1). En el Esquema 5, el enlazador (La) se funcionaliza inicialmente con un aldehído terminal (es decir, -La-C(=O)H) y luego se hace reaccionar con la amina secundaria del compuesto intermedio (i nt-A1). También en el Esquema 5, R1 es como se describe en la presente y R4 es un resto reactivo que puede reaccionar con un tiol, un disulfuro, una amina, una cetona, una dicetona, una azida o un alquino.
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Una N-alquilación de este tipo se puede lograr utilizando un agente reductor tal como NaCNBH3, NaBH4 o NaBH(OAC)3.
El Esquema 6 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para preparar ciertos compuestos de Fórmula (B2) , en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) por alquilación de la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A2). En el Esquema 6, el enlazador (La) se funcionaliza inicialmente con un aldehído terminal (es decir, -La-C(=O)H) y luego se hace reaccionar con la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A2). También en el Esquema 6, R1 es como se describe en la presente y R4 es un resto reactivo que puede reaccionar con un tiol, un disulfuro, una amina, una cetona, una dicetona, una azida o un alquino.
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Una N-alquilación de este tipo se puede lograr utilizando un agente reductor tal como NaCNBH3, NaBH4 o NaBH(OAC)3.
El Esquema 7 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ia), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) por alquilación de la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A1). En el Esquema 7, el resto enlazador, La, inicialmente funcionalizado con un aldehído terminal (es decir, -L'-C(=O)H) se hace luego reaccionar con la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A1), formando con ello el enlazador, L2, que comprende el resto enlazador La con un grupo -CH2- terminal. Una N-alquilación de este tipo se puede lograr utilizando un agente reductor tal como NaCNBhb, NaBhU o NaBH(OAC)3.
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El Esquema 8 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ib), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) por alquilación de la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A2). En el Esquema 8, el resto enlazador (La), inicialmente funcionalizado con un aldehído terminal (es decir, -L'-C(=O)H) se hace luego reaccionar con la amina secundaria del compuesto intermedio (int-A2), formando con ello el enlazador, L2, que comprende el resto enlazador La con un grupo -CH2- terminal. Una N-alquilación de este tipo se puede lograr utilizando un agente reductor tal como NaCNBH3, NaBH4 o NaBH(OAC)3.
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y
R1 y R7 son como se definen en la presente.
El Esquema 9 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (A1), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. En el esquema 9, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 9, R1 es como se describe en la presente, R4 es
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Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P.
El Esquema 10 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (A2), en que el resto -enlazador-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. En el esquema 10, el enlazador es cualquier enlazador (L') que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -L'-C(=O)). También en el Esquema 10, R1 es como se describe en la presente, R4 es
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Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P.
El Esquema 11 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ia), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A1) mediante un enlace amida. En el esquema 11, el enlazador (L2) comprende un resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La-C(=O)).. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU,
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El Esquema 12 ilustra un esquema sintético no limitante utilizado para hacer ciertos compuestos de Fórmula (Ib), en donde el resto -L2-R4 está unido al compuesto intermedio (int-A2) mediante un enlace amida. En el esquema 12, el enlazador (L2) comprende un resto enlazador (La) que tiene un resto carbonilo terminal (es decir, -La-C(=O)).. Una formación de enlaces amida de este tipo se puede lograr utilizando calor, acoplamiento EDCI, acoplamiento HATU, acoplamiento HBTU, acoplamiento TBTU o acoplamiento T3P.
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R1 y R7 son como se definen en la presente.
Compuestos Intermedios
Se proporcionan a continuación las síntesis de los compuestos intermedios utilizados para preparar los compuestos de Fórmula (I) y sus sub-fórmulas (es decir, compuestos de Fórmula (la) y Fórmula (lb)) de la invención.
Compuesto Intermedio 1
Síntesis de 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1)
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Etapa 1: Preparación de 4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoato de metilo (3)
Un matraz de fondo redondo se cargó con 4-doro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-2-amina (1, disponible comercialmente, 1,0 equiv.), 4-(bromometil)-3-metoxibenzoato de metilo (2, disponible comercialmente, 1,0 equiv.), carbonato de cesio (1,0 equiv.) y DMF (1,0 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas y el disolvente se separó en vacío. A la mezcla resultante se añadió EtOAc y el disolvente se separó en vacío. A esta mezcla se añadió DCM y el disolvente se separó en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por cromatografía ISCO (MeOH al 0-10%:DCM, gradiente) para proporcionar 4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoato de metilo (3) en forma de un sólido.
Etapa 2: (4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxifenil)metanol (4)
Se preparó una suspensión de hidruro de litio y aluminio (LAH) (1,0 equiv., polvo) en THF (0,3 M) en un matraz de fondo redondo, se enfrió a 0 °C y se agitó vigorosamente durante 15 minutos. A esta mezcla se añadió en porciones 4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenzoato de metilo (3, 1,0 equiv. de la etapa anterior). El baño de hielo se retiró y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, añadiéndose LAH adicional hasta que se completó la reacción). Et2O se añadió a la mezcla de reacción y la mezcla se transfirió después a un matraz Erlenmeyer y se enfrió a 0 °C bajo agitación vigorosa. La reacción se enfrió luego bruscamente mediante la adición lenta de una solución saturada de sulfato de sodio. Se obtuvo un precipitado blanco y la mezcla se filtró a través de una frita que contiene Celite y se lavó con THF y Et2O. Los componentes volátiles se separaron luego en vacío y el material se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 3: 4-(4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (5)
A un matraz de fondo redondo se añadió cloruro de tionilo (10,0 equiv.) que contenía (4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxifenil)metanol (4, 1.0 equiv. De la etapa 2) en DCM (0,1 M) a 0 °C. Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, la mezcla de reacción se enfrió de nuevo a 0 °C y se enfrió bruscamente lentamente por adición de NaOH (1,0 M, 40,0 equiv.) y NaHCO3 (ac.) saturado. El material se transfirió a un embudo separador y se lavó con DCM 3 veces. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y los componentes volátiles se separaron en vacío. El producto bruto resultante se disolvió luego en DMF (0,1 M) en un matraz de fondo redondo y se utilizó sin purificación adicional. A este material se añadió piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (1,0 equiv.) y base de Huenig (1,2 equiv.) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con EtOAc, se transfirió a un embudo separador y se lavó con NaCl (ac.) saturado 2 veces y agua 2 veces. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y los componentes volátiles se separaron en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10%:DCM, gradiente) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (5) en forma de un sólido.
Etapa 4: 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (7)
Se cargó un matraz de fondo redondo con 4-(4-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (5, 1,0 equiv. de la etapa 3), pentilamina disponible comercialmente (6, 3,0 equiv.), base de Huenig (5,0 equiv.) y DMSO (0,5 M). La mezcla de reacción se calentó a 120 °C y se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió luego a temperatura ambiente y se añadió agua. Esta mezcla se congeló luego y la mayoría de los componentes volátiles se separaron por liofilización. La mezcla de reacción bruta se purificó por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10% (el MeOH contenía NH30,7 N):DCM, gradiente) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (7) en forma de un sólido.
Etapa 5: 5-(2-m etoxi-4-(p iperazm -1-nm etn)bencn)-N 4-pentn-5H-pirro lo[3,2-d]p irím idm a-2,4-d iam m a (Int-1)
HCI en dioxano (4,0 M, 20,0 equiv.) se añadió una solución de 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc-butilo. (6, 1,0 equiv. de la etapa 4) en DCM (0,1 M) en un matraz de fondo redondo a 0 ° C. Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Luego se añadió NH3 en MeOH (0,7 N) a la mezcla de reacción y los componentes volátiles se separaron en vacío. La adición de NH3 en MeOH (0,7 N) y la separación de componentes volátiles en vacío se repitieron dos veces más. La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 20% (el MeOH contenía NH30,7 N):DCM, gradiente) para proporcionar 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,91 (d, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,52 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,61 (s, 2H), 3,54 (t, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,22 (m, 4H), 2,69 (m, 4H), 1,51 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,18 (m, 2H), 0,89 (s, 3H). LRMS [M+H] = 438,3.
Compuesto Intermedio 2
Síntesis de (S)-2-((2-amino-5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-MmetN)bencN)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4-il)amino)hexan-1-ol (Int-2)
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Etapa 1: Preparación de 3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibenzoato de etilo (9)
Un matraz de fondo redondo se cargó con 4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-2-amina (1, disponible comercialmente, 1,0 equiv.), 3-(bromometil)-4-metoxibenzoato de etilo (8, disponible comercialmente, 1,0 equiv.), carbonato de cesio (1,0 equiv.) y DMF (1,0 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. El disolvente se separó luego en vacío. A esta mezcla se añadió EtOAc y el disolvente se separó en vacío. A esta mezcla se añadió DCM y el disolvente se separó en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por cromatografía ISCO (MeOH al 0-10%:DCM, gradiente) para proporcionar 3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibenzoato de etilo (9) en forma de un sólido.
Etapa 2: (3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxifenil)metanol (10)
Se preparó una suspensión de LAH (1,0 equiv., polvo) en THF (0,3 M) en un matraz de fondo redondo, se enfrió a 0 °C y se agitó vigorosamente durante 15 minutos. A esta mezcla se añadió en porciones 3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibenzoato de etilo (9, 1,0 equiv. de la etapa 1). Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas (si la reacción no se completaba en este momento, se añadió LAH adicional y la agitación continuó hasta que se completó la reacción). Después, la mezcla de reacción se transfirió a un matraz Erlenmeyer utilizando Et2O. La mezcla se enfrió a 0 °C y se agitó vigorosamente. La reacción se enfrió luego bruscamente mediante la adición lenta de una solución saturada de sulfato de sodio. Se obtuvo un precipitado blanco y la mezcla se filtró a través de una frita que contiene Celite y se lavó con THF y Et2O. Los componentes volátiles se separaron luego en vacío y el material se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional.
Etapa 3: 4-(3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (11)
A un matraz de fondo redondo se añadió cloruro de tionilo (10,0 equiv.) que contenía (3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxifenil)metanol (10, 1,0 equiv. de la etapa 2) en DCM (0,1 M) a 0 °C. Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. Después, la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se enfrió bruscamente lentamente por adición de NaOH (1,0 M, 40,0 equiv.) y NaHCO3 (ac.) saturado. El material se transfirió a un embudo separador y se lavó con DCM 3 veces. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y los componentes volátiles se separaron en vacío. El producto bruto resultante se disolvió luego en DMF (0,1 M) en un matraz de fondo redondo y se utilizó sin purificación adicional. A este material se añadió piperazina-1-carboxilato de terc-butilo (1,0 equiv.) y base de Huenig (1,2 equiv.) y se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con EtOAc, se transfirió a un embudo separador y se lavó con NaCl (ac.) saturado 2 veces y agua 2 veces. Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio, se filtraron y los componentes volátiles se separaron en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10%:DCM, gradiente) para proporcionar 4-(3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (11) en forma de un sólido.
Etapa 4: 4-(3-((2-ammo-4-((1-hidroxihexan-2-M)ammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de (S)-terc.-butilo (12)
Se cargó un matraz de fondo redondo con 4-(3-((2-amino-4-cloro-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo (11, 1,0 equiv. de la etapa 3), (S)-2-aminohexan-1-ol disponible comercialmente (3,0 equiv.), base de Huenig (5,0 equiv.) y DMSO (0,5 M). La mezcla de reacción se calentó a 120 °C y se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción se enfrió luego a temperatura ambiente y se añadió agua. Esta mezcla se congeló luego y la mayoría de los componentes volátiles se separaron por liofilización. La mezcla de reacción bruta se purificó por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10% (el MeOH contenía NH30,7 N):DCM, gradiente) para proporcionar 4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de (S)-terc.-butilo (12) en forma de un sólido.
Etapa 5: Ejemplo 1-(S)-2-((2-ammo-5-(2-metoxi-5-(piperazm-1-MmetN)bencN)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-4-il)amino)hexan-1-ol (Int-2)
HCI en dioxano (4,0 M, 20,0 equiv.) se añadió una solución de 4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de (S)-terc.-butilo (12, 1,0 equiv. de la etapa 4) en DCM (0,1 M) en un matraz de fondo redondo a 0 ° C. Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Luego se añadió NH3 en MeOH (0,7 N) a la mezcla de reacción y los componentes volátiles se separaron en vacío. La adición de NH3 en MeOH (0,7 N) y la separación de componentes volátiles en vacío se repitieron dos veces más. La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 20% (el MeOH contenía NH30,7 N):DCM, gradiente) para proporcionar (S)-2-((2-amino-5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4-il)amino)hexan-1-ol (Int-2) en forma de un sólido: 1H (CD3OD): 57,50 (d, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,63 (s, 1H), 6,29 (d, 1H), 5,69 (d, 1H), 5,40 (d, 1H), 4,34 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,51 (m, 2H), 3,42 (s, 2H), 3,12 (m, 4H), 2,56 (m, 2H), 1,48 (m, 1H), 1,21 (m, 3H), 0,96 (m, 2H), 0,83 (t, 3H). LRMS [M+H] = 468,3.
Compuesto intermedio 3
Síntesis de 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-3) 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-3) se preparó de acuerdo con la síntesis de (S)-2-((2-amino-5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-4-il)amino)hexan-1-ol (Int-2), excepto que se utilizó N-pentilamina disponible comercialmente en lugar de (S)-2-aminohexan-1-ol en la Etapa 4. 1H RMN (CD3OD): 57,42 (d, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,70 (s, 1H), 6,25 (d, 1H), 5,54 (d, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,52 (t, 2H), 3,46 (s, 2H), 3,14 (m, 4H), 2,60 (m, 4H), 1,48 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,13 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 438,3.
Conjugados de anticuerpos de la invención
Los conjugados de anticuerpos de la invención comprenden un agonista de TLR7 y tienen la estructura de Fórmula
Figure imgf000059_0001
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH
Figure imgf000060_0001
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cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Determinados aspectos y ejemplos de los compuestos de la invención se proporcionan en la siguiente lista de realizaciones enumeradas adicionales. Se reconocerá que las características especificadas en cada realización se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales de la presente invención.
Realización 58. Los conjugados de anticuerpos de Fórmula (II), en donde:
R50 es
Figure imgf000061_0001
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000062_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 59. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) que tiene la estructura de Fórmula (Ila) o Fórmula (lIb), y sus sales farmacéuticamente aceptables,
Figure imgf000063_0001
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000064_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3, -N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 60. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (IIa) o Fórmula (IIb), y sus sales farmacéuticamente aceptables, en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
L1 es -(CH2)m-;
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n- o -C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n;
R40 es
Figure imgf000066_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
R12 es H, metilo o fenilo;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 61. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) que tiene la estructura de Fórmula (Ila) o Fórmula (lIb), y
Figure imgf000066_0002
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000066_0003
Figure imgf000067_0001
cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 62. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
R2 es alquilo C4-C6;
R3 es L1OH;
Figure imgf000067_0002
cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 63. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n, -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n- o -C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n;
R40 es
Figure imgf000068_0001
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 64. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000068_0002
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 65. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000069_0001
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4, e
y es un número entero de 1 a 16.
Realización 66. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2;
R2 es alquilo C4-C6;
Figure imgf000069_0002
cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y y es un número entero de 1 a 16.
Realización 67. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R1 es -NHR2. Realización 68. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R1 es-NHCHR2R3. Realización 69. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R2 es -alquilo C4. Realización 70. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R2 es -alquilo C5. Realización 71. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R2 es -alquilo C6. Realización 72. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: R3 es L1OH; Realización 73. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: L1 es -(CH2)-. Realización 74. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: L1 es -(CH2CH2)-. Realización 75. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde:
L2 es -(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)n-, -(CH2)nX1(CH2)n-, -(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, - (CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, -((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n.
Realización 76. El compuesto de Fórmula (I), Fórmula (la) o Fórmula (lb), en donde: L2 es -C(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, - C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-, -C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-, - C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-, -C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n- o -C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-.
Realización 77. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (llb), en donde: L2 es -(CH2)n- o -C(=O)(CH2)n-Realización 78. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (lib), en donde: L2 es -C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-, -C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-, - C(=O)(CH2)nC(R7)2-, -C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n- o -(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-.
Realización 79. El conu ado de anticuerpo de Fórmula II , Fórmula lIa o Fórmula (lIb), en donde:
Figure imgf000070_0001
Realización 80. El conu ado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Figure imgf000070_0002
Realización 81. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (llb), en donde: R40 es
Figure imgf000070_0003
Realización 82. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (llb), en donde: R40 es
Figure imgf000070_0004
Realización 83. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (llb), en donde: R40 es
Figure imgf000070_0005
Realización 84. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (llb), en donde: R40 es
Figure imgf000070_0006
Realización 85. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:
Figure imgf000070_0007
Realización 86. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: Xi es
Figure imgf000071_0001
Realización 87. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II). Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X1 es
Figure imgf000071_0002
Realización 88. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X1 es
Figure imgf000071_0003
Realización 89. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II). Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X2 es
Figure imgf000071_0004
Realización 90. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X2 es
Figure imgf000071_0005
Realización 91. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X2 es
Figure imgf000071_0006
Realización 92. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X2 es
Figure imgf000071_0007
Realización 93. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II). Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X2 es
Figure imgf000071_0008
Realización 94. El conu ado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X3 es
Figure imgf000071_0009
Realización 95. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II). Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X3 es
Figure imgf000071_0010
Realización 96. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II) Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde: X3 es
Figure imgf000072_0001
Realización 97. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (IIb), en donde: X3 es
Figure imgf000072_0002
Realización 98. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (IIb), en donde: X3 es
Figure imgf000072_0003
Realización 99. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (Ila) o Fórmula (Ilb), en donde:cada uno de los m se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4.
Realización 100. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde cada uno de los m es 1 o 2.
Realización 101. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (Ilb), en donde cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4.
Realización 102. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde cada uno de los n es 2 o 3.
Realización 103. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde:cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
Realización 104. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (Ilb), en donde cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5 y 6.
Realización 105. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde y es un número entero de 1 a 16.
Realización 106. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde y es un número entero de 1 a 8.
Realización 107. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lIa) o Fórmula (lIb), en donde y es un número entero de 1 a 4.
Realización 108. El conjugado de anticuerpo de Fórmula (II), Fórmula (lia) o Fórmula (Ilb), seleccionado de:
Figure imgf000072_0004
Figure imgf000077_0001
en donde y es un número entero de 1 a 4 y Ab es un anticuerpo anti-HER2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Figure imgf000077_0002
Figure imgf000080_0001
También se proporcionan protocolos para algunos aspectos de la metodología analítica para evaluar los conjugados de anticuerpos de la invención. Una metodología analítica de este tipo y los resultados pueden demostrar que los conjugados tienen propiedades favorables, por ejemplo, propiedades que los harían más fáciles de fabricar, más fáciles de administrar a los pacientes, más eficaces y/o potencialmente más seguros para los pacientes. Un ejemplo es la determinación del tamaño molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en la que la cantidad de especies de anticuerpos deseadas en una muestra se determina en relación con la cantidad de contaminantes de alto peso molecular (p. ej., dímero, multímero o anticuerpo agregado) o contaminantes de bajo peso molecular (p. ej., fragmentos de anticuerpos, productos de degradación o cadenas de anticuerpos individuales) presentes en la muestra. En general, es deseable tener mayores cantidades de monómero y menores cantidades de, por ejemplo, anticuerpos agregados debido al impacto de, por ejemplo, los agregados en otras propiedades de la muestra de anticuerpos, tal como la tasa de aclaramiento, la inmunogenicidad y la toxicidad. Un ejemplo adicional es la determinación de la hidrofobicidad por cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC), en donde la hidrofobicidad de una muestra se evalúa en relación con un conjunto de anticuerpos estándares de propiedades conocidas. En general, es deseable tener una baja hidrofobicidad debido al impacto de la hidrofobicidad en otras propiedades de la muestra de anticuerpos, tales como agregación, agregación a lo largo del tiempo, adherencia a las superficies, hepatotoxicidad, tasas de aclaramiento y exposición farmacocinética. Véase See Damle, N.K., Nat Biotechnol. 2008; 26(8):884-885; Singh, S.K., Pharm Res. 2015; 32(11 ):3541-71. Cuando se mide por cromatografía de interacción hidrofóbica, las puntuaciones más altas del índice de hidrofobicidad (es decir, elución más rápida de la columna HIC) reflejan una hidrofobicidad más baja de los conjugados. Como se muestra en el Ejemplo 70 y la Tabla 3, la mayoría de los conjugados de anticuerpos testados mostraron un índice de hidrofobicidad superior a 0,8. En algunas realizaciones, se proporcionan conjugados de anticuerpos que tienen un índice de hidrofobicidad de 0,8 o mayor, según se determina por cromatografía de interacción hidrofóbica.
Anticuerpo anti-HER2
Conjugados de anticuerpos proporcionados en la presente incluyen un anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo (p. ej., fragmento de unión a antígeno) que se une específicamente a HER2 humano (anticuerpo anti-HER2). La sobre-expresión de HER2 se observa en muchos tipos de cánceres, tales como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, osteosarcoma, neuroblastoma o cáncer de cabeza y cuello. Conjugados de anticuerpos que comprenden un anticuerpo anti-HER2 pueden fijar específicamente como objetivo cánceres o tumores HER2-positivos.
En algunas realizaciones, los conjugados de anticuerpos proporcionados en la presente incluyen un anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo del mismo que se une específicamente a HER2 humano, p. ej., un anticuerpo monoclonal anti-HER2 humano o humanizado. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo que se une específicamente a HER2 humano puede seleccionarse de trastuzumab, pertuzumab, margetuximab o HT-19, o un fragmento de anticuerpo del mismo o un mutante de cisteína específico del sitio.
Trastuzumab (nombre comercial Herceptin o Herclon) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une a la porción yuxtamembrana del dominio extracelular del receptor de HER2 (Hudis CA, N Engl J Med. 2007; 357(1):39-51). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de trastuzumab se describieron en la Patente de EE.UU. N° 5.821.337. Trastuzumab interactúa con tres regiones de bucle formadas por los residuos 557-561, 570-573 y 593-603 de HER2 humano (Cho et al., Nature 421: 756-760, 2003). Trastuzumab interfiere con la señalización de HER2 posiblemente mediante la prevención de la dimerización del receptor de HER2, la facilitación de la destrucción endocitótica del receptor de h ER2, la inhibición del desprendimiento del dominio extracelular (Hudis CA, N Engl J Med. 2007; 357(1 ):39-51). Otro mecanismo de acción importante de un anticuerpo anti-HER2 es la mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En la ADCC, el anticuerpo anti-HER2 se une a células tumorales y luego recluta células inmunes, tales como los macrófagos, a través de las interacciones del receptor Fcy (FcyR). Trastuzumab tiene una región Fc de IgG humana conservada y es capaz de reclutar células efectoras inmunes que son responsables de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos (Hudis CA, N Engl J Med. 2007; 357(1):39-51). Trastuzumab obtuvo la aprobación de la f Da de EE. UU. en septiembre de 1998 para el tratamiento del cáncer de mama metastásico en pacientes cuyos tumores sobre-expresan HER2 y que recibieron uno o más regímenes de quimioterapia para su enfermedad metastásica.
Pertuzumab (también denominado 2C4, Omnitarg, Perjeta) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se une al dominio extracelular del receptor de HER2 e inhibe la dimerización de HER2 con otros receptores de HER. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de pertuzumab se describieron en la Patente de EE.UU. N° 7.560.111. Pertuzumab interactúa principalmente con los residuos dentro de la región 245-333 de HER2 humano, particularmente los residuos His 245, Val 286, Ser 288, Leu 295, His 296 o Lys 311 (Franklin et al., Cancer Cell 5: 317-328, 2004). Se demostró que pertuzumab es más efectivo que trastuzumab en la interrupción de la formación de los complejos HER1-HER2 y HER3-HER2 en líneas celulares de cáncer de mama y próstata (Agus et al., J Clin Oncol.
2005; 23(11):2534-43. Epub, 7 de febrero de 2005). Pertuzumab no requiere citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos para su eficacia, porque no se requiere una región Fc intacta para su actividad (Agus et al., J Clin Oncol.
2005; 23(11):2534-43. Epub, 7 de febrero de 2005). Pertuzumab recibió la aprobación de la FDA de EE. UU. para su uso en combinación con trastuzumab y docetaxel para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama metastásico HER2-positivo que no recibieron terapia anti-HER2 o quimioterapia para la enfermedad metastásica en junio de 2012.
Margetuximab (también denominado MGAH22) es otro anticuerpo monoclonal anti-HER2 (Véase http://www.macrogenics.com/products-margetuximab.html). La región Fc de margetuximab se optimizó de modo que haya aumentado la unión a los FcyR activadores, pero disminuyó la unión a los FcyR inhibitorios en las células efectoras inmunes. Margetuximab se encuentra actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama avanzado recidivante o refractario cuyos tumores expresan HER2 en el nivel 2+ por inmunohistoquímica y carecen de evidencia de amplificación del gen HER2 por FISH.
HT-19 es otro anticuerpo monoclonal anti-HER2 que se une a un epítopo en HER2 humano distinto del epítopo de trastuzumab o pertuzumab y se demostró que inhibe la señalización de HER2 de manera equiparable a trastuzumab y potencia la degradación de HER2 en combinación con trastuzumab y pertuzumab (Bergstrom D.A. et al., Cancer Res.2015; 75:LB-231).
Otros anticuerpos monoclonales anti-HER2 adecuados incluyen los anticuerpos anti-HER2 descritos en las patentes de EE.UU. N°: 9.096.877; 9.017.671; 8.975.382; 8.974.785; 8.968.730; 8.937.159; 8.840.896; 8.802.093; 8.753.829; 8.741.586; 8.722.362; 8.697.071; 8.652.474; 8.652.466; 8.609.095; 8.512.967; 8.349.585; 8.241.630; 8.217.147; 8.192.737; 7.879.325; 7.850.966; 7.560.111; 7.435.797; 7.306.801; 6.399.063; 6.387.371; 6.165.464; 5,772,997; 5,770,195; 5.725.856; 5.720.954; 5.677.171.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-HER2 o fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento de unión a antígeno) comprende un dominio VH que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier dominio VH descrito en la Tabla 1. Otros anticuerpos anti-HER2 adecuados o fragmentos de anticuerpo (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) pueden incluir aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad en el dominio VH con las regiones Vh representadas en las secuencias descritas en la Tabla 1. La presente divulgación en ciertas realizaciones también proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que específicamente se unen a HER2, en el que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej.,., fragmentos de unión a antígeno) comprenden una VH CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VH CDR enumeradas en la Tabla 1. En realizaciones particulares, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a HER2, que comprende (o alternativamente, consiste en) una, dos, tres, cuatro, cinco o más VH CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VH CDR enumeradas en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-HER2 o fragmento de anticuerpo (p. ej., un fragmento de unión a antígeno) comprende un dominio VL que tiene una secuencia de aminoácidos de cualquier dominio VL descrito en la Tabla 1. Otros anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de anticuerpo (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) adecuados pueden incluir aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad en el dominio VL con las regiones VL representadas en las secuencias descritas en la Tabla 1. La presente divulgación también proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. e/.,.,fragmentos de unión a antígeno) que específicamente se unen a HER2, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. e/.,fragmentos de unión a antígeno) comprenden una VL CDR que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las VL CDR enumeradas en la Tabla 1. En particular, la invención proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. e¡., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a HER2, que comprende (o alternativamente, consiste en) una, dos, tres o más VL CDR que tienen una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las VL CDR enumeradas en la Tabla 1.
Tabla 1. Secuencias de anticuerpos monoclonales anti-HER2 ilustrativas
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Otros anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de anticuerpo (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) descritos en la presente incluyen aminoácidos que han sido mutados, pero que tienen al menos 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad en las regiones CDR representadas en las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, incluye secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones CDR en comparación con las regiones CDR representadas en la secuencia descrita en la Tabla 1.
También se proporcionan en la presente secuencias de ácidos nucleicos que codifican VH, VL, cadena pesada de longitud completa y cadena ligera de longitud completa de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a HER2, p. ej., las secuencias de ácidos nucleicos en la Tabla 1. Secuencias de ácidos nucleicos de este tipo pueden optimizarse para la expresión en células de mamíferos.
Otros anticuerpos anti-HER2 descritos en la presente incluyen aquellos en los que los aminoácidos o ácidos nucleicos que codifican los aminoácidos han sido mutados, pero tienen al menos 80, 85, 90 95, 96, 97, 98 o 99 por ciento de identidad con las secuencias descritas en la Tabla 1. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos incluyen secuencias de aminoácidos mutantes en las que no se han mutado más de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las regiones variables en comparación con las regiones variables representadas en la secuencia descrito en la Tabla 1, al tiempo que conserva sustancialmente la misma actividad terapéutica.
Dado que cada uno de los anticuerpos proporcionados se une a HER2, las secuencias VH, VL, de cadena ligera de longitud completa y de cadena pesada de longitud completa (secuencias de aminoácidos y las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos) se pueden "mezclar y combinar" para crear otros anticuerpos de unión a HER2 descritos en la presente. Dichos anticuerpos de unión a HER2 "mezclados y emparejados" se pueden testar utilizando ensayos de unión conocidos en la técnica (p. ej., ELISA, ensayos descritos en la Ejemplificación). Cuando las cadenas se mezclan y emparejan, una secuencia VH de un emparejamiento VH/VL particular debe reemplazarse por una secuencia VH estructuralmente similar. Una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse por una secuencia de cadena pesada de longitud completa estructuralmente similar. Una secuencia VL de un emparejamiento VH/VL particular debe reemplazarse por una secuencia VL estructuralmente similar. Una secuencia de cadena pesada de longitud completa de un emparejamiento particular de cadena pesada de longitud completa/cadena ligera de longitud completa debe reemplazarse por una secuencia de cadena ligera de longitud completa estructuralmente similar.
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región de unión a antígeno del mismo que tiene: una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; en donde el anticuerpo se une específicamente a HER2. En otra realización, la invención proporciona (i) un anticuerpo monoclonal aislado que tiene: una cadena pesada de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 21, 23, 30 o 32; y una cadena ligera de longitud completa que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o (ii) una proteína funcional que comprende una porción de unión a antígeno de la misma.
En otra realización, la presente divulgación proporciona anticuerpos de unión a HER2 que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y las CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera tal como se describe en la Tabla 1, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 1, 4 y 6. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 2 y 5. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de los anticuerpos se muestran en la SEQ ID NO: 3. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 11 y 14. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO 12 y 15. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VL de los anticuerpos se muestran en las SEQ ID NO: 13 y 16.
Dado que cada uno de los anticuerpos se une a HER2 y que la especificidad de unión al antígeno es proporcionada principalmente por las regiones CDR1, CDR2 y CDR3, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VL y las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 de VK se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y emparejar, aunque cada uno de los anticuerpos debe contener una CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y una CDR1, CDR2 y c DR3 de VL para crear otras moléculas de unión a HER2 descritas en la presente. Anticuerpos de unión a HER-2 "mezclados y emparejados" de este tipo pueden testarse utilizando los ensayos de unión conocidos en la técnica y los descritos en los Ejemplos (p. ej., El iSa ). Cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular debe ser reemplazada por una o varias secuencias CDR estructuralmente similares. De igual manera, cuando las secuencias de CDR de VL se mezclan y emparejan, la secuencia CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VL particular debe ser reemplazada por una o varias secuencias CDR estructuralmente similares. Resultará fácilmente aparente para el experto ordinario en la técnica que se pueden crear nuevas secuencias de VH y VL sustituyendo una o más secuencias de la región VH y/o VL CDR con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR mostradas en la presente para los anticuerpos monoclonales de la presente divulgación.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal aislado o una región de unión a antígeno del mismo que comprende una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NO: 1, 4 y 6; una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 y 5; una CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; una CDR1 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 11 y 14; una CDR2 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12 y 15; y una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 13 y 16; en donde el anticuerpo se une específicamente a HER2.
En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une específicamente a HER2 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (p. ej., fragmento de unión a antígeno) que se describe en la Tabla 1.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, el anticuerpo que se une específicamente a HER2 humano comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a un epítopo en HER2 humano. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a un epítopo en HER2 humano, en donde el epítopo comprende uno o más de los residuos 557-561, 570-573 y 593- 603 de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a un epítopo en HER2 humano, en donde el epítopo comprende uno o más de los residuos 245- 333 de SEQ ID NO: 26. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) que se unen específicamente a un epítopo en HER2 humano, en donde el epítopo comprende uno o más de los siguientes residuos: His 245, Val 286, Ser 288, Leu 295, His 296, o Lys 311 de SEQ ID NO: 26.
Una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, p. ej., utilizando las técnicas descritas en la presente invención. Alternativamente, durante el proceso de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede dilucidar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible después cribar competitivamente anticuerpos que se unan al mismo epítopo. Un método para lograr esto es realizar estudios de competencia cruzada para encontrar anticuerpos que se unan de manera competitiva entre sí, p. ej., los anticuerpos compiten por unirse al antígeno. En la Solicitud de Patente Internacional N° WO 2003/48731 se describe un procedimiento de alto rendimiento para anticuerpos de "agrupación" basado en su competencia cruzada. Como apreciará un experto en la materia, prácticamente cualquier cosa a la que un anticuerpo pueda unirse específicamente podría ser un epítopo. Un epítopo puede comprender aquellos residuos a los que se une el anticuerpo.
M odificación del M arco o R egión Fc
Anticuerpos y conjugados de anticuerpos descritos en la presente pueden comprender anticuerpos modificados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que comprenden modificaciones a los residuos marco dentro de VH y/o VL, p. ej., para mejorar las propiedades del conjugado anticuerpo/anticuerpo.
En algunas realizaciones, se realizan modificaciones en el marco para disminuir la inmunogenicidad de un anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "retro-mutar" uno o más residuos marco a una secuencia de la línea germinal correspondiente. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias marco del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo. Para "hacer coincidir" las secuencias de la región marco con la configuración de la línea germinal deseada, los residuos pueden "retro-mutar" a una secuencia de la línea germinal correspondiente mediante, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio. Dichos anticuerpos "retromutados" también pretenden ser abarcados por la invención.
Otro tipo de modificación del marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de una región marco, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para separar los epítopos de células T para reducir con ello la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. A este enfoque también se le alude como "desinmunización" y se describe con más detalle en la Publicación de Patente de EE.u U. N° 20030153043 de Carr et al.
Además o como alternativa a las modificaciones realizadas dentro de un marco o regiones CDR, los anticuerpos descritos en la presente pueden modificarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno.
Además, un anticuerpo descrito en la presente puede modificarse químicamente (p. ej.,., uno o más restos químicos pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación.
En una realización, la región de bisagra de CH1 se modifica de manera que el número de residuos cisteína en la región de bisagra se altera, p. ej.,., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la Patente de EE.UU. N° 5.677.425 de Bodmer et al. El número de residuos cisteína en la región de bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmento de unión a antígeno) útiles en conjugados de anticuerpos descritos en la presente incluyen anticuerpos modificados o modificados genéticamente, tales como un anticuerpo modificado para introducir uno o más residuos cisteína como sitios para la conjugación a un resto de fármaco (Junutula JR, et al.: Nat Biotechnol 2008, 26: 925-932). En una realización, la invención proporciona un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo que comprende una sustitución de uno o más aminoácidos con cisteína en las posiciones descritas en la presente. Los sitios para la sustitución de cisteína están en las regiones constantes del anticuerpo y, por lo tanto, son aplicables a una diversidad de anticuerpos, y los sitios se seleccionan para proporcionar conjugados estables y homogéneos. Un anticuerpo o fragmento modificado puede tener dos o más sustituciones de cisteína, y estas sustituciones pueden utilizarse en combinación con otros métodos de modificación y conjugación de anticuerpos tal como se describe en la presente. Métodos para insertar cisteína en ubicaciones específicas de un anticuerpo son conocidos en la técnica, véase, p. ej., Lyons et al, (1990) Protein Eng., 3:703-708, documentos WO 2011/005481, WO2014/124316, WO 2015/138615. En ciertas realizaciones, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo modificado comprende una sustitución de uno o más aminoácidos con cisteína en su región constante seleccionada de las posiciones 117, 119, 121, 124, 139, 152, 153, 155, 157, 164, 169, 171, 174, 189, 205, 207, 246, 258, 269, 274, 286, 288, 290, 292, 293, 320, 322, 326, 333, 334, 335, 337, 344, 355, 360, 375, 382, 390, 392, 398, 400 y 422 de una cadena pesada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE. En algunas realizaciones, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo comprende una sustitución de uno o más aminoácidos con cisteína en su región constante seleccionada de las posiciones 107, 108, 109, 114, 129, 142, 143, 145, 152, 154, 156, 159, 161, 165, 168, 169, 170, 182, 183, 197, 199, y 203 de una cadena ligera del anticuerpo o fragmento de anticuerpo, en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE y en donde la cadena ligera es un cadena ligera kappa humana. En ciertas realizaciones, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una combinación de sustitución de dos o más aminoácidos con cisteína en sus regiones constantes, en donde las combinaciones comprenden sustituciones en las posiciones 375 de una cadena pesada de anticuerpo, posición 152 de una cadena pesada de anticuerpo, posición 360 de una cadena pesada de anticuerpo, o posición 107 de una cadena ligera de anticuerpo y en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE. En ciertas realizaciones, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una sustitución de un aminoácido con cisteína en sus regiones constantes, en donde la sustitución es la posición 375 de una cadena pesada de anticuerpo, la posición 152 de una cadena pesada de anticuerpo, la posición 360 de una cadena pesada de anticuerpo , la posición 107 de una cadena ligera de anticuerpo, la posición 165 de una cadena ligera de anticuerpo o la posición 159 de una cadena ligera de anticuerpo y en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE, y en donde la cadena ligera es una cadena kappa.
En realizaciones particulares, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una combinación de sustitución de dos aminoácidos con cisteína en sus regiones constantes, en donde el anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende cisteínas en las posiciones 152 y 375 de una cadena pesada de anticuerpo, en donde las posiciones están numerados de acuerdo con el sistema de la UE.
En otras realizaciones particulares, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una sustitución de un aminoácido con cisteína en la posición 360 de una cadena pesada de anticuerpo y en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE.
En otras realizaciones particulares, un anticuerpo modificado o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una sustitución de un aminoácido con cisteína en la posición 107 de una cadena ligera de anticuerpo y en donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el sistema de la UE, y en donde la cadena ligera es una cadena kappa.
En realizaciones adicionales, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (p ej., fragmento de unión a antígeno) útiles en conjugados de anticuerpos descritos en la presente incluyen anticuerpos modificados o modificados genéticamente, tales como un anticuerpo modificado para introducir uno o más de otros aminoácidos reactivos (distintos de cisteína), incluyendo Pcl, pirrolisina , etiquetas de péptidos (tales como etiquetas S6, A1 e ybbR) y aminoácidos no naturales, en lugar de al menos un aminoácido de la secuencia nativa, proporcionando así un sitio reactivo en el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para conjugación con un resto de fármaco de Fórmula (I) o sub-fórmulas de la misma. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden modificarse para incorporar Pcl o pirrolisina (W. Ou et al. (2011) PNAS 108 (26), 10437-10442; documento WO2014124258) o aminoácidos no naturales (J.Y. Axup, et al. Proc Nati Acad Sci u Sa , 109 (2012), págs. 16101-16106; para revisión, véase C.C. Liu y P.G. Schultz (2010) Annu Rev Biochem 79, 413-444; C.H. Kim, et al., (2013) Curr Opin Chem Biol. 17, 412-419) como sitios para la conjugación a un fármaco. De forma similar, se pueden introducir en un anticuerpo etiquetas peptídicas para los métodos de conjugación enzimática (Strop P. et al. Chem Biol. 2013, 20(2):161-7; Rabuka D., Curr Opin Chem Biol. 2010 Dec;14(6):790-6; Rabuka D,et al., Nat Protoc. 2012, 7(6):1052-67). Otro ejemplo es el uso de 4'- fosfopanteteinil transferasas (PPTasa) para la conjugación de análogos de Coenzima A (documento WO2013184514). Los métodos para conjugar dichos anticuerpos alterados o modificados con cargas o combinaciones de enlazador-carga son conocidos en la técnica.
En otra realización, una región de bisagra de Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra de Fc de modo que el anticuerpo ha deteriorado la unión de la Proteína A de Estafilococcilo (SpA) con respecto a la unión SpA del dominio de bisagra de Fc nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. N° 6.165.745 de Ward et al.
En aún otras realizaciones, se altera una región Fc reemplazando al menos un residuo aminoácido por un residuo aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden reemplazarse por un residuo aminoácido diferente, de modo que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector, pero retenga la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo precursor. El ligando efector en el que se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe, p. ej., en las patentes de e E.u U. N° 5.624.821 y 5.648.260, ambas por Winter et al.
En otra realización, puede remplazarse uno o más aminoácidos seleccionados de restos aminoacídicos con un residuo aminoácido diferente de modo que el anticuerpo tenga unión alterada a C1q y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) reducida o anulada. Este enfoque se describe, p. ej., en la Patente de EE.UU. N° 6,194,551 de Idusogie et al.
En otra realización, se altera uno o más restos aminoacídicos para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo de fijar el complemento. Este enfoque se describe, p. ej., en la publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al. Los residuos de aminoácidos alotípicos incluyen la región constante de una cadena pesada de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3, así como la región constante de una cadena ligera del isotipo kappa tal como se describe por Jefferis et al., MAbs. 1: 332-338 (2009).
En aún otra realización, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP), por ejemplo, modificando uno o más residuos aminoácidos para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor activador de Fcy, o para disminuir la afinidad del anticuerpo por un receptor Fcy inhibidor. Los receptores Fcy activadores humanos incluyen FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa y FcYRIIIb, y el receptor Fcy inhibidor humano incluye FcYRIlb. Este enfoque se describe, p. ej., en la publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han mapeado sitios de unión en IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604, 2001). Se ha descrito la optimización de las funciones efectoras mediadas por Fc de anticuerpos monoclonales, tales como la función ADCC/ADCP incrementada (véase Strohl, W.R., Current Opinion in Biotechnology 2009; 20: 685-691.) En algunas realizaciones, un conjugado de anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una mutación o una combinación de mutaciones que confieren una función ADCC/ADCP potenciada, p. ej., una o más mutaciones seleccionadas de G236A, S239D, F243L, P247I, D280H, K290S, R292P, S298A, S298D, S298V, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, A339D, A339Q, A339T, P396L (todas las posiciones por numeración de la UE).
En otra realización, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo de mediar en la ADCC y/o ADCP, por ejemplo, modificando uno o más aminoácidos para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor activador que típicamente no reconocería el anticuerpo precursor, tal como FcaRI. Este enfoque se describe en, p. ej., Borrok et al., mAbs. 7(4):743-751. En realizaciones particulares, un conjugado de anticuerpo comprende una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende una mutación o una fusión de una o más secuencias de anticuerpos que confieren una función ADCC y/o ADCP potenciada.
En todavía otra realización, se modifica la glucosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el "antígeno". Dichas modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar de este modo la glicosilación en ese sitio. Una aglicosilación de este tipo puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un enfoque de este tipo se describe,p. ej., en las patentes de EE.UU. N° 5.714.350 y 6.350.861, por Co et al.
Adicionalmente o de forma alternativa, se puede preparar un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tenga cantidades mayores de estructuras de GlcNac entrecruzadas. Se ha demostrado que patrones de glicosilación alterados de este tipo aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Modificaciones de este tipo de los carbohidratos se pueden conseguir, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glicosilación alterada. En la técnica se han descrito células con una maquinaria de glicosilación alterada y estas se pueden utilizar como células hospedadoras en las que se expresan los anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con una glicosilación alterada. Por ejemplo, el documento EP 1.176.195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación. La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados a Asn (297), que también resulta en hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula huésped (véase también Shields et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). Publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas celulares diseñadas para expresar glicosil transferasas modificadoras de glicoproteína (p. ej., beta (1,4) -N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas exhiben estructuras de GlcNac bisectantes incrementadas que dan como resultado una actividad incrementada de ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al., Nat. Biotech. 17:176-180, 1999).
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. Son posibles varios enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de Estados Unidos n.° 6277375 de Ward. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para que contenga una epítopo de unión a receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG tal como se describe en las patentes de EE.UU. N° 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.
Producción de A nticuerpos anti-HER 2
Anticuerpos anti-HER2 y fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) de los mismos pueden producirse por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo expresión recombinante, síntesis química y digestión enzimática de tetrámeros de anticuerpos, mientras que los anticuerpos monoclonales de longitud completa pueden obtenerse mediante, p. ej.,hibridoma o producción recombinante. La expresión recombinante puede ser a partir de cualesquiera células huéspedes apropiadas conocidas en la técnica, por ejemplo, células huéspedes de mamífero, células huéspedes bacterianas, células huéspedes de levadura, células huéspedes de insecto, etc.
También se proporcionan en la presente polinucleótidos que codifican anticuerpos descritos en la presente, p. ej., polinucleótidos que codifican regiones o segmentos variables de cadena pesada o ligera que comprenden regiones determinantes de la complementariedad tal como se describe en la presente. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica las regiones variables de la cadena pesada tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 8. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica las regiones variables de la cadena ligera tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica las regiones variables de la cadena pesada tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 10, 22 o 24. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica la cadena ligera tiene al menos 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% identidad de secuencia de ácido nucleico con un polinucleótido de SEQ ID NO: 20 o 34.
Algunos polinucleótidos descritos en la presente codifican una región variable de un anticuerpo anti-HER2. Algunos polinucleótidos descritos en la presente codifican tanto una región variable como una región constante de un anticuerpo anti-HER2. Algunas secuencias de polinucleótidos codifican un polipéptido que comprende regiones variables tanto de una cadena pesada como de una cadena ligera de un anticuerpo anti-HER2. Algunos polinucleótidos codifican dos segmentos de polipéptidos que respectivamente son sustancialmente idénticos a las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera de cualesquiera anticuerpos anti-HER2 descritos en la presente.
Secuencias de polinucleótidos se pueden producir mediante síntesis de ADN de fase sólida de novo o mediante mutagénesis por PCR de una secuencia existente (p. ej., secuencias tal como se describen en los Ejemplos que figuran más adelante) que codifica un anticuerpo anti-HER2 o su fragmento de unión. La síntesis química directa de ácidos nucleicos se puede lograr mediante métodos conocidos en la técnica tales como el método del fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90, 1979; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109, 1979; el método de dietilfosforoamidita de Beaucage et al., Tetra. Lett., 22:1859, 1981; y el método del soporte sólido de la patente de EE.UU. N.° 4 458 066. La introducción de mutaciones a una secuencia de polinucleótidos por PCR se puede realizar tal como se describe en, p. ej., PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification, H.A. Erlich (Ed.), Freeman Press, NY, NY, 1992; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. (Ed.), Academic Press, San Diego, CA, 1990; Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19:967, 1991; y Eckert et al., PCR Methods and Applications 1:17, 1991.
También se proporcionan vectores de expresión y células huéspedes para producir anticuerpos anti-HER2 arriba descritos. Se pueden emplear diversos vectores de expresión para expresar polinucleótidos que codifican cadenas de anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de unión. Tanto los vectores de expresión basados en virus como los no virales pueden utilizarse para producir anticuerpos en una célula huésped de mamífero.
Vectores no virales y sistemas incluyen plásmidos, vectores episomales, típicamente con un casete de expresión para expresar una proteína o ARN, y cromosomas artificiales humanos (véase, p. ej., Harrington et al., Nat Genet 15: 345, 1997). Por ejemplo, vectores no virales útiles para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos anti-HER2 en células de mamíferos (p. ej., seres humanos) incluyen pThioHis A, B y C, pCDNATM3.1/His, pEBVHis A, B y C (Invitrogen, San Diego, CA), vectores MPSV y numerosos otros vectores conocidos en la técnica para expresar otras proteínas. Vectores virales útiles incluyen vectores basados en retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, vectores basados en SV40, virus del papiloma, virus de Epstein Barr HBP, vectores del virus vaccinia y virus Semliki Forest (SFV). Véase, Brent et al., supra; Smith, Annu. Rev. Microbiol. 49:807, 1995; y Rosenfeld et al., Cell 68:143, 1992.
La elección del vector de expresión depende de las células huéspedes previstas en las que se ha de expresar un vector. Típicamente, los vectores de expresión contienen un promotor y otras secuencias reguladoras (p. ej., potenciadores) que están operativamente enlazados a polinucleótidos que codifican una cadena o fragmento de anticuerpo anti-HER2. En algunas realizaciones, se emplea un promotor inducible para evitar la expresión de secuencias insertadas excepto en condiciones inductoras. Promotores inducibles incluyen, p. ej., arabinosa, lacZ, promotor de metalotioneína o un promotor de choque térmico. Cultivos de organismos transformados pueden expandirse en condiciones no inductoras sin influenciar a la población para secuencias codificantes, cuyos productos de expresión son mejor tolerados por las células huéspedes. Además de promotores, también se pueden requerir o desear otros elementos reguladores para la expresión eficiente de una cadena o fragmento de anticuerpo anti-HER2. Elementos incluyen típicamente un codón de iniciación ATG y un sitio de unión al ribosoma adyacente u otras secuencias. Además, la eficacia de la expresión puede mejorarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véase, p. ej., Scharf et al., Results Probl. Cell Differ. 20: 125, 1994; y Bittner et al., Meth Enzymol., 153: 516, 1987). Por ejemplo, se puede utilizar un potenciador de SV40 o un potenciador de CMV para aumentar la expresión en células huéspedes de mamífero.
Vectores de expresión también pueden proporcionar una posición de secuencia de señal de secreción para formar una proteína de fusión con polipéptidos codificados por secuencias de anticuerpo anti-HER2 insertadas. Más a menudo, secuencias de anticuerpos anti-HER2 insertadas se enlazan a una secuencia señal antes de su inclusión en el vector. Vectores a utilizar para recibir secuencias que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada de anticuerpo anti-HER2 a veces también codifican regiones constantes o partes de las mismas. Dichos vectores permiten la expresión de regiones variables como proteínas de fusión con regiones constantes, conduciendo con ello a la producción de anticuerpos intactos o fragmentos de los mismos. Típicamente, dichas regiones constantes son humanas.
Células huéspedes para albergar y expresar cadenas de anticuerpos anti-HER2 pueden ser procariotas o eucariotas. E. coli es un huésped procariota útil para clonar y expresar polinucleótidos de la presente divulgación. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacteriaceae, tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, también se pueden preparar vectores de expresión, que contienen habitualmente secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huéspedes (p. Ej.,, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una diversidad de promotores bien conocidos, tales como un sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa o un sistema promotor de fago lambda. Los promotores habitualmente controlan la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora, y tienen secuencias de sitio de unión a ribosomas, para iniciar y completar la transcripción y la traducción. También se pueden emplear otros microbios, tales como levaduras, para expresar polipéptidos anti-HER2 descritos en la presente. También se pueden utilizar células de insectos combinadas con vectores de baculovirus.
En algunas realizaciones particulares, las células huéspedes de mamífero se utilizan para expresar y producir polipéptidos anti-HER2 de la presente divulgación. Por ejemplo, pueden ser una línea celular de hibridoma que expresa genes de inmunoglobulina endógena (p. ej., clones de hibridoma de mieloma) o una línea celular de mamífero que alberga un vector de expresión exógeno (p. ej., las células de mieloma SP2/0). Estas incluyen cualquier célula animal o humana normal mortal o normal o anómala inmortal. Por ejemplo, se ha desarrollado un cierto número de líneas celulares huéspedes adecuadas, capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, incluidas diversas líneas celulares CHO, líneas celulares Cos, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células B transformadas e hibridomas. El uso del cultivo de células de tejidos de mamíferos para expresar polipéptidos se discute generalmente en, p. ej., Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987. Vectores de expresión para células huéspedes de mamíferos pueden incluir secuencias de control de la expresión, tal como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (véase, p. ej., Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49-68, 1986), y los sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Los vectores de expresión contienen habitualmente promotores derivados de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Promotores adecuados pueden ser constitutivos, específicos para el tipo de célula, específicos para el estadio y/o modulables o regulables. Promotores útiles incluyen, un promotor de metalotioneína, un promotor tardío principal de adenovirus constitutivo, un promotor MMTV inducible por dexametasona, un promotor SV40, un promotor MRP polIII, un promotor constitutivo MPSV, un promotor CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor CMV inmediato-temprano humano), un promotor constitutivo de CMV y combinaciones de promotor-potenciador conocidas en la técnica.
Métodos para introducir vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótidos de interés varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden utilizar para otros huéspedes celulares (véase generalmente Sambrook et al., supra). Otros métodos incluyen, p. ej., electroporación, tratamiento con fosfato de calcio, transformación mediada por liposomas, inyección y microinyección, métodos balísticos, virosomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales, fusión a la proteína estructural VP22 del virus del herpes (Elliot y O'Hare, Cell 88:223, 1997), absorción de ADN potenciada por el agente y transducción ex vivo. Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, a menudo se deseará una expresión estable. Por ejemplo, líneas celulares que expresan de manera estable cadenas de anticuerpos anti-HER2 o fragmentos de unión pueden prepararse utilizando vectores de expresión descritos en la presente que contienen orígenes virales de replicación o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células se multipliquen durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiar al medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite la multiplicación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas en medios selectivos. Células resistentes, transfectadas de forma estable, pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula.
Procedimientos para Hacer conjugado de Anticuerpo de Fórmula (IIa) y Fórmula (IIb)
Un esquema de reacción general para la formación de conjugados inmunoestimuladores de Fórmula (II) se muestra en el Esquema 13 que figura más adelante:
Scheme 13
Figure imgf000099_0001
aquí: RGi es un grupo reactivo que reacciona con un grupo R4 compatible de un compuesto de Fórmula (la) para formar un correspondiente grupo R40, tal como maleimida que reacciona con un tiol para dar un anillo de succinimida, o una hidroxilamina que reacciona con una cetona para dar una oxima; R1, R4, L2, Ab y R40 son como se definen en la presente.
Un esquema de reacción general para la formación de conjugados inmunoestimuladores de Fórmula (IIb) se muestra en el Esquema 14 que figura más adelante:
Figure imgf000099_0002
en que: RG1 es un grupo reactivo que reacciona con un grupo R4 compatible de un compuesto de Fórmula (Ib) para formar un correspondiente grupo R40, tal como maleimida que reacciona con un tiol para dar un anillo de succinimida, o una hidroxilamina que reacciona con una cetona para dar una oxima; R1, R4, L2, Ab y R40 son como se definen en la presente.
Usos terapéuticos
Los conjugados de anticuerpos proporcionados son útiles en una diversidad de aplicaciones que incluyen el tratamiento del cáncer, tal como el cáncer HER2 positivo. En ciertas realizaciones, los conjugados de anticuerpos proporcionados en la presente son útiles para inhibir el crecimiento del tumor, reducir el volumen del tumor, inducir la diferenciación y/o reducir la tumorigenicidad de un tumor, p. ej., un tumor sólido HER2. Los métodos de uso pueden ser métodos in vitro, ex vivo, o in vivo.
En algunas realizaciones, en la presente se proporciona el uso de los conjugados de anticuerpos de la invención para tratar o prevenir enfermedades en un sujeto, p. ej., un paciente humano. Además se proporciona el uso de conjugados de anticuerpos en el tratamiento o la prevención de enfermedades en un sujeto. En algunas realizaciones, se proporcionan conjugados de anticuerpos para uso en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de enfermedades en un sujeto. En ciertas realizaciones, la enfermedad tratada con conjugados de anticuerpos es un cáncer, p. ej., un cáncer HER2-positivo. Diversos cánceres que pueden tratarse con los conjugados de anticuerpos se enumeran en la sección de definiciones anterior. El cáncer HER2-positivo puede ser cualquier cáncer que comprenda células que tengan proteína HER2 presente en su superficie celular. Por ejemplo, un cáncer HER2-positivo puede ser tumor primario o metástasis de cualquiera de cáncer gástrico, cáncer esofágico, adenocarcinoma de la unión gastroesofágica, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, osteosarcoma, neuroblastoma, glioblastoma, tumores neuroendocrinos y cáncer de cabeza y cuello. En ciertas realizaciones, el cáncer se caracteriza por células que expresan HER2 a las que se unen los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (p. ej., fragmentos de unión a antígeno) de los conjugados de anticuerpos. En ciertas realizaciones, el cáncer se caracteriza por la expresión concurrente de múltiples receptores del factor de crecimiento epidérmico humano además de la expresión de HER2. En algunas realizaciones, el cáncer HER2-positivo puede tener una alta expresión de HER2, p. ej., puede tener una puntuación de inmunohistoquímica (IHC) de 3+, que se define como una tinción de membrana intensa uniforme de > 30% de células tumorales invasivas según se determina por la puntuación IHC de la American Society of Clinical Oncology y el College of American Pathologists (ASCO/Ca P) (véase English et al., Mol Diagn Ther. abril 2013; 17 (2): 85-99). En algunas realizaciones, el cáncer HER2-positivo puede tener una expresión de HER2 relativamente baja, p. ej., puede tener una puntuación IHC de 2+, que se define como una tinción de membrana completa que no es uniforme o débil en intensidad, pero con una distribución circunferencial obvia en al menos 10% de las células o muy raramente tumores que muestran tinción de membranas completas de 30% o menos de células tumorales según la puntuación ASCO/CAP IHC (véase English et al., Mol Diagn Ther. abril 2013; 17 (2): 85-99).
En algunas realizaciones, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los conjugados de anticuerpos descritos en la presente para tratar un cáncer HER2-positivo en un sujeto que lo necesite. El cáncer HER2-positivo puede ser cualquier cáncer que comprenda células que tengan proteína HER2 presente en su superficie celular. En algunas realizaciones, el conjugado de anticuerpo utilizado es capaz de suprimir el cáncer HER2-positivo durante un período sostenido y/o reducir la recurrencia del cáncer HER2-positivo, en comparación con un anticuerpo anti-HER2 solo.
También se contempla que los conjugados de anticuerpos descritos en la presente se puedan utilizar para tratar diversas enfermedades o trastornos no malignos, tales como enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), úlceras gastrointestinales, enfermedad de Menetrier, hepatitis B, hepatitis C, adenomas secretores o síndrome de pérdida de proteínas, trastornos renales, trastornos angiogénicos, enfermedades oculares, tales como degeneración macular relacionada con la edad, presunto síndrome de histoplasmosis ocular o degeneración macular relacionada con la edad, patologías asociadas con los huesos, tales como osteoartritis, raquitismo y osteoporosis, síndrome de hiperviscosidad sistémico, enfermedad de Osler Weber-Rendu, enfermedad pulmonar oclusiva crónica o edema después de quemaduras, trauma, radiación, apoplejía, hipoxia o isquemia, nefropatía diabética, enfermedad de Paget, fotoenvejecimiento (p. ej., provocado por la radiación UV de la piel humana), hipertrofia prostática benigna, ciertas infecciones microbianas, incluidos los patógenos microbianos seleccionados de adenovirus, hantavirus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp. y Bordetella pertussis, trombo provocado por agregación plaquetaria, afecciones reproductivas, tales como endometriosis, síndrome de hiperestimulación ovárica, preeclampsia, hemorragia uterina disfuncional o menometrorragia, nefropatías agudas y crónicas (incluida la glomerulonefritis proliferativa), formación de cicatriz hipertrófica, choque endotóxico e infección fúngica, poliposis adenomatosis familiar, síndromes mielodisplásicos, anemia aplásica, lesión isquémica, fibrosis pulmonar, renal o hepática, estenosis pilórica hipertrófica infantil, síndrome obstructivo urinario, artritis psoriásica.
El método de administración de conjugados de anticuerpos de este tipo incluye la administración parenteral (p. ej., intravenosa), p. ej., inyección como un bolo o infusión continua a lo largo de un período de tiempo, administración oral, administración intramuscular, administración intratumoral, administración intramuscular, administración intraperitoneal, administración intracerobroespinal, administración subcutánea, administración intra-articular, administración intrasinovial, inyección a los ganglios linfáticos o administración intratecal.
Para el tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de conjugados de anticuerpos de la presente invención depende de diversos factores, tales como el tipo de enfermedad a tratar, la gravedad y el curso de la enfermedad, la capacidad de respuesta de la enfermedad, la terapia previa, el historial clínico del paciente, etcétera. Conjugados de anticuerpos se pueden administrar una vez o a lo largo de una serie de tratamientos que duran desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución del estado de la enfermedad (p. ej., reducción en el tamaño del tumor). Los programas de dosificación óptimos se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación de fármacos en el cuerpo del paciente y variarán dependiendo de la potencia relativa de un conjugado de anticuerpos particular. En algunas realizaciones, la dosificación es de 0,01 mg a 20 mg (p. Ej., 0,01 mg, 0,02 mg, 0,03 mg, 0,04 mg, 0,05 mg, 0,06 mg, 0,07 mg, 0,08 mg, 0,09 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3 mg, 0,4 mg, 0,5 mg, 0,6 mg, 0,7 mg, 0,8 mg, 0,9 mg, 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg, 13 mg, 14 mg, 15 mg, 16 mg, 17 mg, 18 mg, 19 mg, o 20 mg) por kg de peso corporal, y se pueden administrar una o más veces al día, semanal, mensual o anualmente. En ciertas realizaciones, el conjugado de anticuerpos de la presente invención se administra una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. En ciertas realizaciones, el conjugado de anticuerpo de la presente invención se administra solo una vez. El médico tratante puede estimar las tasas de repetición para la dosificación en función de los tiempos de permanencia medidos y las concentraciones del fármaco en fluidos o tejidos corporales.
Terapia Combinada
En ciertos casos, un conjugado de anticuerpos de la presente invención se puede combinar con otros agentes terapéuticos, tales como otros agentes anticancerígenos, agentes antialérgicos, agentes contra las náuseas (o anti­ eméticos), analgésicos, agentes citoprotectores y combinaciones de los mismos.
Agentes quimioterapéuticos generales considerados para su uso en terapias combinadas incluyen anastrozol (Arimidex®), bicalutamida (Casodex®), sulfato de bleomicina (Blenoxane®), busulfano (Myleran®), inyección de busulfano (Busulfex®), capecitabina (Xeloda®), N4- pentoxicarbonil-5-desoxi-5-fluorocitidina, carboplatino (Paraplatin®), carmustina (BiCNU®), clorambucilo (Leukeran®), cisplatino (Platinol®), cladribina (Leustatin®), ciclofosfamida (Cytoxan® o Neosar®), arabinósido de citosina (Cytosar-U®), inyección de liposoma de citarabina (DepoCyt®), dacarbazina (DTIC-Dome®), dactinomicina (Actinomicina D, Cosmegan), hidrocloruro de daunorrubicina (Cerubidine®), inyección de liposoma de citrato de daunorrubicina (DaunoXome®) dexametasona, docetaxel (Taxotere®), hidrocloruro de doxorrubicina (Adriamycin®, Rubex®), etopósido (Vepesid®), fosfato de fludarabina (Fludara®), 5-fluorouracilo (Adrucil®, Efudex®), flutamida (Eulexin®), tezacitibina, Gemcitabina (difluorodeoxicitidina), hidroxiurea (Hydrea® ), Idarubicina (Idamycin®), ifosfamida (IFEX®), irinotecán (Camptosar®), L-asparaginasa (ELSPAR®), leucovorina cálcica, melfalan (Alkeran®), 6-mercaptopurina (Purinethol®), metotrexato (Folex®) , mitoxantrona (Novantrone®), mylotarg, paclitaxel (Taxol®), fenix (Yttrium90/MX-DTPA), pentostatina, polifeprosan 20 con implante de carmustina (Gliadel®), citrato de tamoxifeno (Nolvadex®), tenipósido (Vumon®), 6-tioguanina, tiotepa, tirapazamina (Tirazone®), hidrocloruro de topotecan para inyección (Hycamptin®), vinblastina (Velban®), vincristina (Oncovin®), vinorelbina (Navelbine®), epirubicina (Ellence®), oxaliplatino (Eloxatin®), exemestano (Aromasin®), letrozol (Femara®) y fulvestrant (Faslodex®).
La expresión "combinación farmacéutica", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una combinación fija en una forma de dosificación unitaria, o una combinación no fija o un kit de partes para la administración combinada en la que dos o más agentes terapéuticos pueden administrarse independientemente al mismo tiempo o por separado dentro de los intervalos de tiempo, especialmente en los casos en los que estos intervalos de tiempo permiten que los participantes combinados muestren un efecto cooperativo, p. ej., sinérgico.
La expresión «terapia combinada» se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o trastorno terapéutico que se describe en la presente divulgación. Dicha administración engloba la coadministración de estos agentes terapéuticos de una manera sustancialmente simultánea, tal como en una única cápsula que tiene una proporción fija de los principios activos. Alternativamente, dicha administración abarca la co­ administración en recipientes múltiples o separados (p. ej., cápsulas, polvos y líquidos) para cada uno de los ingredientes activos. Los polvos y/o líquidos se pueden reconstituir o diluir hasta una dosis deseada antes de la administración. Además, tal administración también engloba el uso de cada tipo del agente terapéutico de una manera secuencial, ya sea aproximadamente a la vez o en momentos diferentes. En cualquier caso, la pauta de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación farmacológica para tratar las afecciones o trastornos descritos en la presente.
La terapia de combinación puede proporcionar "sinergia" y demostrar "sinergia", es decir, el efecto logrado cuando los ingredientes activos utilizados juntos es mayor que la suma de los efectos que resultan del uso de los compuestos por separado. Se puede lograr un efecto sinérgico cuando los ingredientes activos son: (1) co-formulados y administrados o suministrados simultáneamente en una formulación de dosis unitaria combinada; (2) suministrados por alternancia o en paralelo como formulaciones separadas; o (3) por algún otro régimen. Cuando se administra en terapia de alternancia, se puede lograr un efecto sinérgico cuando los compuestos se administran o administran secuencialmente, p. ej., mediante diferentes inyecciones en jeringas separadas. En general, durante la terapia de alternancia, una dosis efectiva de cada uno de los ingredientes activos se administra secuencialmente, es decir, en serie, mientras que en la terapia de combinación, las dosis efectivas de dos o más ingredientes activos se administran juntas.
En una realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más de otros anticuerpos anti-HER2, p .ej., trastuzumab, pertuzumab, margetuximab o HT-19 arriba descritos, o con otros conjugados anti-HER2, p. ej., ado-trastuzumab emtansine (también conocido como Kadcyla® o T-DM1) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesita.
En una realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de tirosina quinasa, incluyendo inhibidores de EGFR, inhibidores de Her3, inhibidores de IGFR e inhibidores de Met para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
Por ejemplo, inhibidores de tirosina quinasa incluyen hidrocloruro de erlotinib (Tarceva®); Linifanib (N-[4-(3-amino-1 H-indazol-4-il)fenil]-N'-(2-fluoro-5-metilfenil)urea, también conocida como ABT 869, disponible de Genentech); malato de sunitinib (Sutent®); Bosutinib (4-[(2,4-dicloro-5-metoxifenil)amino]-6-metoxi-7-[3-(4-metilpiperazin-1-il)propoxi]quinolin-3-carbonitrilo, también conocido como SKI- 606, y descrito en la Patente de Ee .UU. N° 6.780.996); Dasatinib (Sprycel®); Pazopanib (Votrient®); Sorafenib (Nexavar®); Zactima (ZD6474); e imatinib o mesilato de imatinib (Gilvec® y Gleevec®).
Inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) incluyen hidrocloruro de erlotinib (Tarceva®), Gefitinib (Iressa®); N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3"S")-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4 (dimetilamino)-2-butenamida, Tovok®); Vandetanib (Caprelsa®); Lapatinib (Tykerb®); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); dihidrocloruro de Canertinib (Cl-1033); 6-[4-[(4-etil-1-piperazinil)metil]fenil]-N-[(1R)-1-feniletil]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-amina (AEE788, CAS 497839-62-0); Mubritinib (TAK165); Pelitinib (EKB569); Afatinib (Gilotrif®); Neratinib (HKI-272); ácido N-[4-[[1-[(3-fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-il]amino]-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-carbámico, éster (3S)-3-morfolinilmetílico (BMS599626); N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aa,5p,6aa)-octahidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); y 4-[4-[[(1R)-1-feniletil]amino]-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-il]-fenol (PKI166, CAS187724-61-4).
Anticuerpos de EGFR incluyen Cetuximab (Erbitux®); Panitumumab (Vectibix®); Matuzumab (EMD-72000); Nimotuzumab (hR3); Zalutumumab; TheraCIM h-R3; MDX0447 (CAS 339151-96-1); y ch806 (mAb-806, CAS 946414­ 09-1).
Otros inhibidores de HER2 incluyen Neratinib (HKI-272, (2E)-N-[4-[[3-cloro-4-[(piridin-2-il)metoxi]fenil]amino]-3-ciano-7-etoxiquinolin-6-il]-4-(dimetilamino)but-2-enamida, y descrita en la Publicación PCT N° WO 05/028443); Lapatinib o Lapatinib ditosilato (Tykerb®); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidin-3-ol (BMS690514); (2E)-N-[4-[(3-cloro-4-fluorofenil)amino]-7-[[(3S)-tetrahidro-3-furanil]oxi]-6-quinazolinil]-4-(dimetiamino)-2-butenamida (BiBW-2992, CAS 850140-72-6); éster (3S)-3-morfolinilmetílico del ácido N-[4-[[1-[(3-fluorofenil)metil]-1H-indazol-5-il]amino]-5-metilpirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-6-il]-carbámico (BMS 599626, c As 714971-09-2); Canertinib dihidrocloruro (PD183805 o Cl-1033); y N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aa,5p,6aa)-octahidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]-4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8).
Inhibidores de HER3 incluyen LJM716, MM-121, AMG-888, RG7116, REGN-1400, AV-203, MP-RM-1, MM-111 y MEHD-7945A.
Inhibidores de MET incluyen Cabozantinib (XL184, CAS 849217-68-1); Foretinib (GSK1363089, anteriormente XL880, CAS 849217-64-7); Tivantinib (ARQ197, CAS 1000873-98-2); 1-(2-hidroxi-2-metilpropil)-N-(5-(7-metoxiquinolin-4-iloxi)piridin-2-il)-5-metil-3-oxo-2-fenil-2,3-dihidro-1H-pirazolo-4-carboxamida (AMG 458); Cryzotinib (Xalkori®, PF-02341066); (3Z)-5-(2,3-dihidro-1H-indol-1-ilsulfonil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol-2-il}metileno)-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (SU11271); (3z)-N-(3-clorofenil)-3-({3,5-dimetil-4-[(4-metilpiperazin-1-il)carbonil]-1H-pirrol-2-il}metileno)-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida (SU11274); (3Z)-N-(3-clorofenil)-3-{[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil)-1H-pirrol-2-il]metileno}-N-metil-2-oxoindolina-5-sulfonamida (SU11606); 6-[difluoro[6-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-1,2,4-triazolo[4,3-b]piridazin-3-il]metil]-quinolina (JNJ38877605, CAS 943540-75-8); 2-[4-[1-(quinolin-6-ilmetil)-1 H-[1,2,3]triazolo[4,5-b]pirazin-6-il]-1 H-pirazol-1-il]etanol (PF04217903, CAS 956905-27-4); N-((2R)-1,4-dioxan-2-ilmetil)-N-metil-N'-[3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-5-oxo-5H-benzo[4,5]ciclohepta[1,2-b]piridin-7-il]sulfamida (MK2461, CAS 917879-39-1); 6-[[6-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-1,2,4-triazolo[4,3-b]piridazin 3-il]tio]-quinolina (SGX523, CAS 1022150-57-7); y (3Z)-5-[[(2,6-diclorofenil)metil]sulfonil]-3-[[3,5-dimetil-4-[[(2R)-2-(1-pirrolidinilmetil)-1-pirrolidinil]carbonil]-1 H-pirrol-2-il]metileno]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona (PHA665752, CAS 477575-56-7).
Inhibidores de IGFR incluyen BMS-754807, XL-228, OSI-906, GSK0904529A, A-928605, AXL1717, KW-2450, MK0646, AMG479, IMCA12, MEDI-573 y BI836845. Véase, p. ej., , Yee, JNCl, 104; 975 (2012) para una revisión.
En otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de la vía de señalización de la proliferación, incluyendo inhibidores de MEK, inhibidores de BRAF, inhibidores de PI3K/Akt, inhibidores de SHP2 y también inhibidores de mTOR e inhibidores de CDK para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
Por ejemplo, inhibidores de la proteína quinasa activada por mitógenos (MEK) incluyen XL-518 (también conocido como GDC-0973, Cas N° 1029872-29-4, disponible de ACC Corp.); 2-[(2-cloro-4-yodofenil)amino]-N-(ciclopropilmetoxi)-3,4-difluoro-benzamida (también conocida comos CI-1040 o PD184352 y descrita en la Publicación PCT N° WO2000035436); N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)amino]- benzamida (también conocida como PD0325901 y descrita en la Publicación PCT N° WO2002006213); 2,3-bis[amino[(2-aminofenil)tio]metileno]-butanodinitrilo (también conocido como U0126 y descrito en la Patente de EE.UU. N° 2.779.780); N-[3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-yodofenil)aminoí-6-metoxifenil]-1-[(2R)-2,3-dihidroxipropil]-ciclopropanosulfonamida (también conocida como RDEA119 o BAY869766 y descrita en la Publicación PCT N° WO2007014011); (3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(etilamino)-8,9,16-trihidroxi-3,4-dimetil-3,4,9, 19-tetrahidro-1H-2-benzoxaciclotetradecina-1,7(8H)-diona] (también conocida como E6201 y descrita en la Publicación PCT N° WO2003076424); 2'-amino-3'-metoxiflavona (también conocida como PD98059 disponible de Biaffin GmbH & Co., KG, Alemania); Vemurafenib (PLX-4032, CAS 918504-65-1); (R)-3-(2,3-dihidroxipropil)-6-fluoro-5-(2-fluoro-4-yodofenilamino)-8-metilpirido[2,3-d]pirimidina-4,7(3H,8H)-diona (TAK-733, CAS 1035555-63-5); Pimasertib (AS-703026, CAS 1204531-26-9); y Trametinib dimetilsulfóxido (GSK-1120212, CAS 1204531-25-80).
Inhibidores de BRAF incluyen Vemurafenib (o Zelboraf®), GDC-0879, PLX-4720 (disponible de Symansis), Dabrafenib (o GSK2118436), LGX 818, CEP-32496, UI-152, RAF 265, Regorafenib (BAY 73-4506), CCT239065 o Sorafenib (o Sorafenib tosilato, o Nexavar®), o Ipilimumab (o MDX-010, MDX-101 o Yervoy).
Inhibidores de fosfoinositida 3-quinasa (PI3K) incluyen 4-[2-(1H-indazol-4-il)-6-[[4-(metilsulfonil)piperazin-1-il]metil]tieno[3,2-d]pirimidin-4-il]morfolina (también conocida como GDC0941, Rg 7321, GNE0941, Pictrelisib, o Pictilisib; y descrita en las Publicaciones PCT N° WO 09/036082 y WO 09/055730); 2-metil-2-[4-[3-metil-2-oxo-8-(quinolin-3-il)-2,3-dihidroimidazo[4,5-c]quinolin-1-il]fenil]propionitrilo (también conocido como BEZ 235 o NVP-BEZ 235, y descrito en la Publicación Pc T N° WO 06/122806); 4-(trifluorometil)-5-(2,6-dimorfolinopirimidin-4-il)piridin-2-amina (también conocida como BKM120 o NVP-BKM120, y descrita en la Publicación PCT N° WO2007/084786); Tozasertib (VX680 o MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-piridinil)-6-quinolinil]metileno]-2,4-tiazolidinadiona (GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(acetiloxi)-1-[(di-2-propenilamino)metileno]-4,4a,5,6,6a,8,9,9aoctahidro-11-hidroxi-4-(metoximetil)-4a,6a-dimetilciclopenta[5,6]nafto[1,2-c]piran-2,7,10(1H)-triona (PX866, CAS 502632-66-8); 8-fenil-2-(morfolin-4-il)-cromen-4-ona (LY294002, CAS 154447-36-6); (S)-N1-(4-metil-5-(2-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)piridin-4-il)tiazol-2-il)pirrolidina-1,2-dicarboxamide (también conocida como BYL719 o Alpelisib); 2-(4-(2-(1-isopropil-3-metil-1H-1,2,4-triazol-5-il)-5,6-dihidrobenzo[f]imidazo[1,2-d][1,4]oxazepin-9-il)-1H-pirazol-1-il)-2-metilpropanamida (también conocida como GDC0032, RG7604 o Taselisib).
Inhibidores de mTOR incluyen Temsirolimus (Torisel®); Ridaforolimus (anteriormente conocido como deferolimus, dimetilfosfinato de (1R,2R,4S;-4-[(2R)-2 [(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-dihidroxi-19,30-dimetoxi-15,17,21,23, 29,35-hexametil-2,3,10,14,20-pentaoxo-11,36-dioxa-4-azatriciclo[30.3.1.04,9] hexatriaconta-16,24,26,28-tetraen-12-il]propil]-2-metoxiciclohexilo, también conocido como AP23573 y MK8669, y descrito en la Publicación PCT N° Wo 03/064383); Everolimus (Afinitor® o RAD001); Rapamicina (AY22989, Sirolimus®); Simapimod (CAS 164301-51-3); (5-{2,4-bis[(3S)-3-metilmorfolin-4-il]pirido[2,3-d]pirimidin-7-il}-2-metoxifenil)metanol (AZD8055); 2-amino-8-[frans-4-(2-hidroxietoxi)ciclohexil]-6-(6-metoxi-3-piridinil)-4-metil-pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona (PF04691502, CAS 1013101-36-4); y W2-[1,4-dioxo-4-[[4-(4-oxo-8-fenil-4H-1-benzopiran-2-il)morfolinio-4-il]metoxi]butil]-L-arginilglicil-L-a-aspartil-L-serina, sal interna (SF1126, CAS 936487-67-1).
Inhibidores de CDK incluyen Palbociclib (también conocido como PD-0332991, Ibrance®, 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2- {[5-(1-piperazinil)-2-piridinil]amino}pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona).
En aún otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más pro-apoptóticos, que incluyen inhibidores de IAP, inhibidores de BCL2, inhibidores de MCI1, agentes TRAIL, inhibidores de CHK para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
Por ejemplo, inhibidores de IAP incluyen LCL161, GDC-0917, AEG-35156, AT406 y TL32711. Otros ejemplos de inhibidores de IAP incluyen los descritos en los documentos WO04/005284, WO 04/007529, WO05/097791, WO 05/069894, WO 05/069888, WO 05/094818, US2006/0014700, US2006/0025347, WO 06/069063, WO 06/010118, WO 06/017295 y WO08/134679.
Inhibidores de BCL-2 incluyen 4-[4-[[2-(4-clorofenil)-5,5-dimetil-1-ciclohexen-1-il]metil]-1-piperazinil]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-morfolinil)-1-[(feniltio)metil]propil]amino]-3-[(trifluorometil)sulfonil]fenil]sulfonil]benzamida (también conocida como ABT-263 y descrita en la Publicación p Ct N° WO 09/155386); Tetrocarcin A; Antimicina; Gossypol ((-)BL-193); Obatoclax; 2-amino-6-ciclopentil-4-(1-ciano-2-etoxi-2-oxoetil)-4H-cromona-3-carboxilato de etilo (HA14 -1); Oblimersen (G3139, Genasense®); Bak BH3 péptido; ácido acético (-)-gosipol (AT-101); 4-[4-[(4'-cloro[1,1'-bifenil]-2-il)metil]-1-piperazinil]-N-[[4-[[(1R)-3-(dimetilamino)-1-[(feniltio)metil]propil]amino]-3-nitrofenil]sulfonil]-benzamida (ABT-737, CAS 852808-04-9); y Navitoclax (ABT-263, CAS 923564-51-6).
Agonistas del receptor proapoptótico (PARA) incluyen DR4 (TRAILR1) y DR5 (TRAILR2), incluyendo Dulanermin (AMG-951, RhApo2L/TRAIL); Mapatumumab (HRS-ETR1, CAS 658052-09-6); Lexatumumab (HGS-ETR2, CAS 845816-02-6); Apomab (Apomab®); Conatumumab (AMG655, CAS 896731-82-1); y Tigatuzumab(CS1008, CAS 946415-34-5, disponible de Daiichi Sankyo).
Inhibidores de la quinasa de punto de control (CHK) incluyen 7-hidroxiestaurosporina (UCN-01); 6-bromo-3-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-5-(3R)-3-piperidinilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (SCH900776, CAS 891494-63-6); N-[(S)-piperidin-3- il]amida del ácido 5-(3-fluorofenil)-3-ureidotiofeno-2-carboxílico (AZD7762, CAS 860352-01-8); 4-[((3S)-1-azabiciclo[2.2.2]oct-3-il)amino]-3-(1H-bencimidazol-2-il)-6-cloroquinolin-2(1H)-ona (CHIR 124, CAS 405168-58-3); 7-aminodactinomicina (7-AAD), Isogranulatimida, debromohimenialdisina; N-[5-bromo-4-metil-2-[(2S)-2-morfolinilmetoxi]-fenil]-N'-(5-metil-2-pirazinil)urea (LY2603618, CAS 911222-45-2); Sulforafano (CAS 4478-93-7, isotiocianato de 4-metilsulfinilbutilo); 9,10,11,12-tetrahidro-9,12-epoxi-1H-diindolo[1,2,3-/:g:3',2',1'-M]pirrolo[3,4-/][1,6]benzodiazocina-1,3(2H)-diona (SB-218078, CAS 135897-06-2); y TAT-S216A (YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL (SEQ ID NO: 33)) y CBP501 ((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr).
En una realización adicional, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inmunomoduladores (p. ej., uno o más de un activador de una molécula coestimuladora o un inhibidor de una molécula de punto de control inmune) para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En ciertas realizaciones, el inmunomodulador es un activador de una molécula coestimuladora. En una realización, el agonista de la molécula coestimuladora se elige de un agonista (p. ej., un anticuerpo agonista o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una fusión soluble) de ligando OX40, CD2, CD27, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD30, CD40, BAFFR, HVEM, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 o CD83.
En ciertas realizaciones, el inmunomodulador es un inhibidor de una molécula de punto de control inmunitario. En una realización, el inmunomodulador es un inhibidor de PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y/o TGFRbeta. En una realización, el inhibidor de una molécula de punto de control inmunitario inhibe PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3 o CTLA4, o cualquier combinación de los mismos. El término "inhibición" o "inhibidor" incluye una reducción en un cierto parámetro, p. ej., una actividad, de una molécula dada, p. ej., un inhibidor del punto de control inmunitario. Por ejemplo, inhibición de una actividad, p.ej., por este término se incluye una actividad de PD-1 o PD-L1 de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más. Por lo tanto, la inhibición no necesita ser del 100%.
La inhibición de una molécula inhibidora se puede realizar a nivel de ADN, ARN o proteína. En algunas realizaciones, se puede utilizar un ácido nucleico inhibidor (p. ej., un ARNdc, ARNip o ARNhp), para inhibir la expresión de una molécula inhibidora. En otras realizaciones, el inhibidor de una señal inhibidora es un polipéptido, p. ej., un ligando soluble (p. ej., PD-1-Ig o CTLA-4 Ig), o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la molécula inhibidora; p. ej., un anticuerpo o fragmento del mismo (al que también se alude en la presente como "una molécula de anticuerpo") que se une a PD-1, PD-L1, PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y/o TGFR beta, o una combinación de los mismos.
En una realización, la molécula de anticuerpo es un anticuerpo completo o fragmento del mismo (p. ej., un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv)). En aún otra realización, la molécula de anticuerpo tiene una región constante de cadena pesada (Fc) elegida, p. ej., de las regiones constantes de cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE; en particular, elegido de, p. ej., las regiones constantes de la cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, más particularmente, la región constante de la cadena pesada de IgG1 o IgG4 (p. Ej.,., IgG1 o IgG4 humana). En una realización, la región constante de la cadena pesada es IgG1 humana o IgG4 humana. En una realización, la región constante se altera, p. ej., muta, para modificar las propiedades de la molécula de anticuerpo (p. ej., para aumentar o disminuir uno o más de la unión al receptor Fc, la glicosilación del anticuerpo, el número de residuos cisteína, la función de la célula efectora o la función del complemento).
En ciertas realizaciones, la molécula de anticuerpo está en forma de una molécula de anticuerpo biespecífica o multiespecífica. En una realización, la molécula de anticuerpo biespecífica tiene una primera especificidad de unión a PD-1 o PD-L1 y una segunda especificidad de unión, p. ej., una segunda especificidad de unión a TIM-3, LAG-3 o PD-L2. En una realización, la molécula de anticuerpo biespecífica se une a PD-1 o PD-L1 y TIM-3. En otra realización, la molécula de anticuerpo biespecífica se une a PD-1 o PD-L1 y LAG-3. En otra realización, la molécula de anticuerpo biespecífica se une a PD-1 y PD-L1. En aún otra realización, la molécula de anticuerpo biespecífica se une a PD-1 y PD-L2. En otra realización, la molécula de anticuerpo biespecífica se une a TIM-3 y LAG-3. Cualquier combinación de las moléculas mencionadas anteriormente puede hacerse en una molécula de anticuerpo multiespecífico, p. ej., un anticuerpo triespecífico que incluye una primera especificidad de unión a PD-1 o PD-1, y una segunda y tercera especificidades de unión a dos o más de: TIM-3, LAG-3, o PD-L2.
En ciertas realizaciones, el inmunomodulador es un inhibidor de PD-1, p. ej., PD-1 humano. En otra realización, el inmunomodulador es un inhibidor de PD-L1, p. ej., PD-L1 humano. En una realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1 es una molécula de anticuerpo para PD-1 o PD-L1. El inhibidor de PD-1 o PD-L1 puede administrarse solo o en combinación con otros inmunomoduladores, p. ej., en combinación con un inhibidor de LAG-3, TIM-3 o CTLA4. En una realización ilustrativa, el inhibidor de PD-1 o PD-L1, p. ej., la molécula de anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1, se administra en combinación con un inhibidor de LAG-3, p. ej., una molécula de anticuerpo anti-LAG -3. En otra realización ilustrativa, el inhibidor de PD-1 o PD-L1, p. ej., la molécula de anticuerpo anti-PD-1 o PD-L1, se administra en combinación con un inhibidor de TIM-3, p. ej., una molécula de anticuerpo anti-TIM-3. En aún otra realización, el inhibidor de PD-1 o PD-L1, p. ej., la molécula de anticuerpo anti-PD-1 se administra en combinación con un inhibidor de LAG-3, p. ej., una molécula de anticuerpo anti-LAG -3, y un inhibidor de TIM-3, p. ej.,una molécula de anticuerpo anti-TIM-3.
Otras combinaciones de inmunomoduladores con un inhibidor de PD-1 (p. ej., uno o más de PD-L2, CTLA4, TIM3, LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 y/o TGFR) también están dentro de la presente invención. Cualquiera de las moléculas de anticuerpo conocidas en la técnica o descritas en la presente puede utilizarse en las combinaciones de inhibidores de molécula de punto de control mencionadas anteriormente.
En una realización, el inhibidor de PD-1 es un anticuerpo anti-PD-1 elegido entre Nivolumab, Pembrolizumab o Pidilizumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es Nivolumab. Nombres alternativos para Nivolumab incluyen MDX-1106, MDX-1106-04, ONO-4538 o Bm S-936558. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es Nivolumab (Número de registro CAS: 946414-94-4). Nivolumab es un anticuerpo monoclonal de tipo IgG4 totalmente humano que bloquea de manera específica PD1. nivolumab (clon 5C4) y otros anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PD1 se describen en la Patente de EE.UU. N° 8.008.449 y la Publicación PCT N° WO2006/121168.
En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es Pembrolizumab. Pembrolizumab (nombre comercial KEYTRUDA anteriormente Lambrolizumab, también conocido como Merck 3745, MK-3475 o SCH-900475) es un anticuerpo monoclonal IgG4 humanizado que se une a PD1. Pembrolizumab se describe, p. ej., en Hamid, O. et al. (2013) New England Journal of Medicine 369 (2): 134-44, Publicación PCT N° WO2009/114335 y Patente de EE.UU. N° 8.354.509
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 es Pidilizumab. Pidilizumab (CT-011; Cure Tech) es un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1k humanizado que se une a PD1. Pidilizumab y otros anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humanizados se describen en la publicación PCT N° WO2009/101611. Otros anticuerpos anti-PD1 se describen en la Patente de EE.UU. N° 8.609.089, la Publicación de EE.UU. N° 2010028330 y/o la Publicación de EE.UU. N° 20120114649. Otros anticuerpos anti-PD1 incluyen AMP 514 (Amplimmune).
En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es una inmunoadhesina (p. ej., una inmunoadhesina que comprende una porción extracelular o de unión a PD-1 de PD-LI o PD-L2 fusionada a una región constante (p. ej., una región Fc de una secuencia de inmunoglobulina). En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-1 es AMP-224.
En algunas realizaciones, el inhibidor de PD-LI es un anticuerpo anti-PD-LI. . En algunas realizaciones, el inhibidor anti-PD-LI se elige de YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736 o MDX 1105MSB-0010718C (al que también se alude como A09-246-2) descrito en, p. ej., el documento WO 2013/0179174, y que tiene una secuencia descrita en este documento (o una secuencia sustancialmente idéntica o similar a la misma, p. ej., una secuencia al menos 85%, 90%, 95% idéntica o superior a la secuencia especificada).
En una realización, el inhibidor de PD-L1 es MDX-1105. MDX-1105, también conocido como BMS 936559, es un anticuerpo anti-PD-LI descrito en la Publicación PCT N° WO 2007/005874.
En una realización, el inhibidor de PD-L1 es YW243.55.S70. El anticuerpo YW243.55.S70 es un anti-PD-LI descrito en la Publicación PCT N° WO 2010/077634.
En una realización, el inhibidor de PD-L1 es MDPL3280A (Genentech / Roche). MDPL3280A es un anticuerpo monoclonal de tipo IgG1 optimizado para Fc humano que se une a PD-L1. MDPL3280A y otros anticuerpos monoclonales humanos contra PD-L1 se divulgan en la Patente de EE. UU. N.°: 7943743 y la Publicación de EE. UU. N.°: 20120039906.
En otras realizaciones, el inhibidor de PD-L2 es AMP-224. AMP-224 es un receptor soluble de fusión PD-L2 Fc que bloquea la interacción entre PD1 y B7-H1 (B7-DCIg; Amplimmune; p. ej., descrito en las Publicaciones PCT N° WO2010/027827 y WO2011/066342).
En una realización, el inhibidor LAG-3 es una molécula de anticuerpo anti-LAG-3. En una realización, el inhibidor de LAG-3 es BMS-986016.
En aún otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con una o más citoquinas, que incluyen interferón IL2, IL15, IL7 or IL21 para uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En aún otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más agonistas del receptor STING (estimulador de genes de interferón), p. ej., los compuestos descritos en el documento WO 2014/189805 para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de la angiogénesis, p. ej., Bevacizumab (Avastin®), axitinib (Inlyta®); Brivanib alaninato (BMS-582664, 2-aminopropanoato de (S)-((R)-1-(4-(4-fluoro-2-metil-1H-indol-5-iloxi)-5-metilpirrolo[2,1-/][1,2,4]triazin-6-iloxi)propan-2-ilo)); Sorafenib (Nexavar®); Pazopanib (Votrient®); Sunitinib malato (Sutent®); Cediranib (AZD2171, CAS 288383-20-1); Vargatef (BIBF1120, CAS 928326-83-4); Foretinib (GSK1363089); Telatinib (BAY57-9352, CAS 332012-40-5); Apatinib (YN968D1, CAS 811803-05-1); Imatinib (Gleevec®); Ponatinib (AP24534, CAS 943319-70-8); Tivozanib (AV951, CAS 475108-18-0); Regorafenib (BAY73-4506, CAS 755037-03-7); Vatalanib dihidrocloruro (PTK787, CAS 212141-51-0); Brivanib (BMS-540215, CAS 649735-46-6); Vandetanib (Caprelsa® o AZD6474); Motesanib difosfato (AMG706, CAS 857876-30-3, N-(2,3-dihidro-3,3-dimetil-1H-indol-6-il)-2-[(4-piridinilmetil)amino]-3-piridinacarboxamida, descrita en la Publicación PCT N° WO 02/066470); Dovitinib ácido diláctico (TKI258, CAS 852433-84-2); Linfanib (ABT869, CAS 796967-16-3); Cabozantinib (XL184, CAS 849217-68-1); Lestaurtinib (CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1, 1 -dimetiletil)-2-oxazolil]metil]tio]-2-tiazolil]-4-piperidinacarboxamida (BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-amino-1-((4-((3-metoxifenil)amino)pirrolo[2,1-f][1,2,4]triazin-5-il)metil)piperidi n-3-ol (BMS690514); N-(3,4-dicloro-2-fluorofenil)-6-metoxi-7-[[(3aa,5p,6aa)-octahidro-2-metilciclopenta[c]pirrol-5-il]metoxi]- 4-quinazolinamina (XL647, CAS 781613-23-8); 4-metil-3-[[1-metil-6-(3-piridinil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4-il]amino]-N-[3-(trifluorometil)fenil]-benzamida (BHG712, CAS 940310-85-0); o Aflibercept (Eylea®) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de la proteína de choque térmico, p. ej.,Tanespimicina (17-alilamino-17-demetoxigeldanamicina, también conocida como KOS-953 y 17-AAG, disponible from SIGMA, y descrita en la Patente de EE.UU. N° 4.261.989); Retaspimicina (IPI504), Ganetespib (STA-9090); [6-cloro-9-(4-metoxi-3,5-dimetilpiridin-2-ilmetil)-9H-purin-2-il]amina (BIIB021 o c Nf2024, CAS 848695-25-0); éster glicina frans-4-[[2-(aminocarbonil)-5-[4,5,6,7-tetrahidro-6,6-dimetil-4-oxo-3-(trifluorometil)-1H-indazol-1-il]fenil]amino]ciclohexílico (SNX5422 o PF04929113, CAS 908115-27-5); 5-[2,4-dihidroxi-5-(1-metiletil)fenil]-W-etil-4-[4-(4-morfolinilmetil)fenil]-3Isoxazolocarboxamida (AUY922, CAS 747412-49-3); o 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de HDAC u otros modificadores epigenéticos. Inhibidores de HDAC ilustrativos incluyen Voninostat (Zolinza®); Romidepsin (Istodax®); Treicostatina A (TSA); Oxamflatin; Vorinostat (Zolinza®, ácido Suberoilanilida hidroxámico; Piroxamida (ácido siberoil-3-aminopiridinamida hidroxámico); Trapoxin A (RF-1023A); Trapoxin B (RF-10238); ciclo[(aS,2S)-a-amino-r|-oxo-2-ox¡ranoctano¡l-0-met¡l-D-t¡ros¡l-L-¡soleuc¡l-L-prol¡l] (Cyl-1); ciclo[(aS,2S)-a-amino-r|-oxo-2-ox¡ranoctano¡l-0-met¡l-D-t¡ros¡l-L-¡soleuc¡l-(2S)-2-p¡per¡d¡nacarbon¡lo] (Cyl-2); ciclic[L-alanil-D-alanil-(2S)-r|-oxo-L-a-aminooxiranoctanoil-D-prolil] (HC-toxina); ciclo[(aS,2S)-a-amino-r|-oxo-2-oxiranoctanoil-D-fenilalanil-L-leucil-(2S)-2-piperidinacarbonilo] (WF-3161); Clamidocina ((S)-(2-metilalanil-L-fenilalanil-D-prolil-r|-oxo-L-a-aminooxiranoctanoílo)cíclico; Apicidina (ciclo(8-oxo-L-2-aminodecanoil-1-metoxi-L-triptofil-L-isoleucil-D-2-piperidinacarbonil); Romidepsina (Istodax®, FR-901228); 4-fenilbutirato; Espirucostatina A; Milproina (ácido valproico); Entinostat (MS-275, N-(2-aminofenil)-4-[N-(piridina-3-il-metoxicarbonil)-amino-metil]-benzamida); Depudecina (4,5:8,9-dianhidro-1,2,6,7,11-pentadeoxi- D-freo-D-/do-undeca-1,6-dienitol); 4-(acetilamino)-N-(2-aminofenil)-benzamida (también conocida como CI-994); N1-(2-aminofenil)-N8-fenil-octanodiamida (también conocida como BML-210); 4-(dimetilamino)-N-(7-(hidroximino)-7-oxoheptil)benzamida (también conocida como M344); (E)-3-(4-(((2-(1H-indol-3-il)etil)(2-hidroxietil)amino)-metil)fenil)-N-hidroxiacrilamida; Panobinostat (Farydak®); Mocetinostat y Belinostat (también conocido como PXD101, Beleodaq® o (2£)-N-hidroxi-3-[3-(fenilsulfamoil)fenil]prop-2-enamida), o quidamida (también conocida como CS055 o HBI-8000, (E)-N-(2-amino-5-fluorofenil)-4-((3-(piridin-3-il)acrilamido)metil)benzamida). Otros modificadores epigenéticos incluyen inhibidores de EZH2 (potenciador del homólogo zeste 2), EED (desarrollo de ectodermo embrionario) o LSD1 (histona desmetilasa 1A o KDM1A específica para lisina) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En aún otra realización, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con uno o más inhibidores de indolamina-pirrol 2,3-dioxigenasa (IDO), por ejemplo, Indoximod (también conocido como NLG-8189), a -ciclohexil-5H-imidazo[5,1-a]isoindol-5-etanol (también conocido como NLG919), o (4E)-4 -[(3-cloro-4-fluoroanilino)-nitrosometilideno]-1,2, 5-oxadiazol-3-amina (también conocida como INCB024360) para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado de anticuerpos de la presente invención en combinación con dos o más de cualquiera de los inhibidores, activadores, inmunomoduladores, agonistas o modificadores descritos anteriormente para su uso en el tratamiento del cáncer en un sujeto que lo necesite. Por ejemplo, el conjugado de anticuerpos de la presente invención puede utilizarse en combinación con uno o más inhibidores de punto de control y/ o uno o más activadores inmunitarios.
Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a extracción quirúrgica de células cancerosas y/o radioterapia.
Composiciones Farmacéuticas
Para preparar composiciones farmacéuticas o estériles que incluyen uno o más conjugados de anticuerpos descritos en la presente, siempre que el conjugado de anticuerpos se pueda mezclar con un soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Formulaciones de agentes terapéuticos y de diagnóstico se pueden preparar mezclando con soportes, excipientes o estabilizadores fisiológicamente aceptables en forma de, p. ej., polvos liofilizados, suspensiones espesas, soluciones acuosas, lociones o suspensiones (véase, p. ej., The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Hardman et al., Goodman y Gilman, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y., 2001; Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, y Wilkins, Nueva York, N.Y., 2000; Avis, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY, 1993; Lieberman, et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY, 1990; Lieberman, et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY, 1990; Weiner y Kotkoskie, Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 2000).
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpos de la presente invención es una preparación de liofilizado. En ciertas realizaciones, una composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpos es un liofilizado en un vial que contiene un conjugado de anticuerpos, histidina, sacarosa y polisorbato 20. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpos es un liofilizado en un vial que contiene un conjugado de anticuerpos, succinato de sodio y polisorbato 20. En ciertas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende el conjugado de anticuerpos es un liofilizado en un vial que contiene un conjugado de anticuerpos, trehalosa, citrato y polisorbato 8. El liofilizado puede reconstituirse, p. ej., con agua, solución salina, para inyección. En una realización específica, la solución comprende el conjugado de anticuerpos, histidina, sacarosa y polisorbato 20 a un pH de aproximadamente 5,0. En otra realización específica, la solución comprende el conjugado de anticuerpos, succinato de sodio y polisorbato 20. En otra realización específica, la solución comprende el conjugado de anticuerpos, deshidrato de trehalosa, deshidrato de citrato, ácido cítrico y polisorbato 8 a un pH de aproximadamente 6,6. Para la administración intravenosa, la solución obtenida generalmente se diluirá adicionalmente en una solución de soporte.
La elección de un régimen de administración con fines terapéuticos depende de varios factores, que incluyen la velocidad de renovación sérica o tisular de la entidad, el nivel de síntomas, la inmunogenicidad de la entidad y la accesibilidad de las células diana en la matriz biológica. En ciertas realizaciones, un régimen de administración maximiza la cantidad de agente terapéutico administrado al paciente compatible con un nivel aceptable de efectos secundarios. En consecuencia, la cantidad de agente biológico administrado depende en parte de la entidad particular y de la gravedad de la afección que se esté tratando. Se encuentra disponible una guía para seleccionar dosis apropiadas de anticuerpos, citoquinas y moléculas pequeñas (véase, p. ej.,Wawrzynczak, Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, Reino Unido, 1996; Kresina (ed.), Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y., 1991; Bach (ed.), Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, Nueva York, N.Y., 1993; Baert et al., New Engl. J. Med. 348:601-608, 2003; Milgrom et al., New Engl. J. Med. 341:1966-1973, 1999; Slamon et al., New Engl. J. Med. 344:783-792, 2001; Beniaminovitz et al., New Engl. J. Med. 342:613-619, 2000; Ghosh et al., New Engl. J. Med. 348:24-32, 2003; Lipsky et al., New Engl. J. Med. 343:1594-1602, 2000).
El médico realiza la determinación de la dosis apropiada, p. ej., utilizando parámetros o factores conocidos o sospechosos en la técnica que afectan el tratamiento o que se predice que afectarán el tratamiento. Generalmente, la dosis comienza con una cantidad algo menor que la dosis óptima y luego se aumenta en pequeños incrementos hasta que se logra el efecto deseado u óptimo en relación con cualquier efecto secundario negativo. Medidas de diagnóstico importantes incluyen las de los síntomas, por ejemplo, de la inflamación o el nivel de citocinas inflamatorias producidas.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, la sal o la amida de los mismos, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado de salud general y el historial médico previo del paciente tratado, y como factores conocidos en las artes médicas.
Composiciones que comprenden el conjugado de anticuerpos de la invención pueden proporcionarse por infusión continua, o por dosis a intervalos de, p. ej., un día, una semana o 1-7 veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas o una vez cada ocho semanas. Las dosis se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, tópica, oral, nasal, rectal, intramuscular, intracerebral o por inhalación. Un protocolo de dosificación específico es uno que involucra la dosis o frecuencia de dosis máximas que evita efectos secundarios no deseables significativos.
Para los conjugados de anticuerpos de la invención, la dosis administrada a un paciente puede ser de 0,0001 mg/kg a 100 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis puede estar entre 0,001 mg/kg y 50 mg/kg, 0,005 mg/kg y 20 mg/kg, 0,01 mg/kg y 20 mg/kg, 0,02 mg/kg y 10 mg/kg, 0,05 y 5 mg/kg, 0,1 mg/kg y 10 mg/kg, 0,1 mg/kg y 8 mg/kg, 0,1 mg/kg y 5 mg/kg, 0,1 mg/kg y 2 mg/kg, 0,1 mg/kg y 1 mg/kg del peso corporal del paciente. La dosis del conjugado de anticuerpos puede calcularse utilizando el peso del paciente en kilogramos (kg) multiplicado por la dosis a administrar en mg/kg.
Las dosis de los conjugados de anticuerpos de la invención pueden repetirse y las administraciones pueden estar separadas por menos de 1 día, al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses, 4 meses, 5 meses o al menos 6 meses. En algunas realizaciones, un conjugado de anticuerpos de la invención se administra dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, o con menos frecuencia. En una realización específica, las dosis de los conjugados de anticuerpos de la invención se repiten cada 2 semanas.
Una cantidad efectiva para un paciente particular puede variar dependiendo de factores tales como la condición a tratar, la salud general del paciente, el método, la vía y la dosis de administración y la gravedad de los efectos secundarios (véase, p. ej., Maynard et al., A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, Fla., 1996; Dent, Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., Londres, Reino Unido, 2001).
La vía de administración puede ser, p. ej., aplicación tópica o cutánea, inyección o infusión por vía subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, intraocular, intraarterial, intracerebroespinal, intralesional o mediante sistemas de liberación sostenida o un implante (véase, p. ej., , Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556, 1983; Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981; Langer, Chem. Tech. 12: 98-105, 1982; Epstein et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030-4034, 1980; Pat. De EE.UU. N° 6.350.466 y 6.316.024). Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante o un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección, o ambos. Además, también se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y una formulación con un agente aerosolizante. Véase, p. ej., las Pat. de EE.UU. N° 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las Publicaciones PCT N° WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903.
Ejemplos de ingredientes adicionales de este tipo son bien conocidos en la técnica.
Métodos para la administración conjunta o el tratamiento con un segundo agente terapéutico, p. ej., una citoquina, un esteroide, agente quimioterapéutico, antibiótico o radiación, son conocidos en la técnica (véase, p. ej., Hardman et al., (Eds.) (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Gilman, 10.a edición, McGraw-Hill, Nueva York, N.Y.; Poole y Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice: A Practical Approach, Lippincott, Williams y Wilkins , Phila., Pa .; Chabner y Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams y Wilkins, Phila., Pa.). Una cantidad eficaz de un agente terapéutico puede disminuir los síntomas en al menos 10%; en al menos 20%; al menos 30%; al menos 40% o al menos 50%.
Terapias adicionales (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos), que pueden administrarse en combinación con los conjugados de anticuerpos de la invención pueden administrarse con menos de 5 minutos de diferencia, menos de 30 minutos de diferencia, 1 hora de diferencia, a aproximadamente 1 hora de diferencia, a aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas de diferencia, a aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, a aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, a aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, a aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, a aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, a aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, a aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, a aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, a aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, a aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, a aproximadamente 12 horas a 18 horas de diferencia, a 18 horas a 24 horas de diferencia, a 24 horas a 36 horas de diferencia, a 36 horas a 48 horas de diferencia, a 48 horas a 52 horas de diferencia, a 52 horas a 60 horas de diferencia, a 60 horas a 72 horas de diferencia, a 72 horas a 84 horas de diferencia, a 84 horas a 96 horas de diferencia o a 96 horas a 120 horas de diferencia de los conjugados de anticuerpos de la invención. Las dos o más terapias se pueden administrar dentro de una misma visita del paciente.
En ciertas realizaciones, los conjugados de anticuerpos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Restos de fijación de objetivo ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 5.416.016 expedida a Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de Proteina A tensioactivo (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p 120 (Schreier et al, (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEb S Lett.
346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
La invención proporciona protocolos para la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden conjugados de anticuerpos de la invención, solos o en combinación con otras terapias a un sujeto que lo necesite. Las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias combinadas de la presente invención pueden administrarse de forma concomitante o secuencial a un sujeto. La terapia (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias combinadas de la presente invención pueden administrarse también de forma cíclica. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (p. ej., un primer agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo, seguida de la administración de una segunda terapia (p. ej., un segundo agente profiláctico o terapéutico) durante un período de tiempo y repetir esta administración secuencial, es decir, el ciclo, con el fin de reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias (p. ej., agentes) para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias (p. ej., agentes), y/o mejorar la eficacia de las terapias.
Las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) de las terapias combinadas de la invención pueden administrarse de forma simultánea a un sujeto.
El término "simultánea" no se limita a la administración de terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) exactamente al mismo tiempo, sino que significa que una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos de los mismos se administra a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que los anticuerpos o conjugados de anticuerpos de la invención pueden actuar junto con la o las otras terapias para proporcionar un beneficio incrementado que si se administraran de otra manera. Por ejemplo, cada terapia se puede administrar a un sujeto al mismo tiempo o de forma secuencial en cualquier orden en diferentes momentos; sin embargo, si no se administran al mismo tiempo, deben administrarse lo suficientemente próximas en el tiempo para proporcionar el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Cada terapia se puede administrar a un sujeto por separado, en cualquier forma apropiada y por cualquier vía adecuada. En diversas realizaciones, las terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos), se administran a un sujeto con menos de 5 minutos de diferencia, menos de 15 minutos de diferencia, menos de 30 minutos de diferencia, menos de 1 hora de diferencia, a aproximadamente 1 hora de diferencia, a aproximadamente 2 horas de diferencia, a aproximadamente 2 horas a aproximadamente 3 horas de diferencia, a aproximadamente 3 horas a aproximadamente 4 horas de diferencia, a aproximadamente 4 horas a aproximadamente 5 horas de diferencia, a aproximadamente 5 horas a aproximadamente 6 horas de diferencia, a aproximadamente 6 horas a aproximadamente 7 horas de diferencia, a aproximadamente 7 horas a aproximadamente 8 horas de diferencia, a aproximadamente 8 horas a aproximadamente 9 horas de diferencia, a aproximadamente 9 horas a aproximadamente 10 horas de diferencia, a aproximadamente 10 horas a aproximadamente 11 horas de diferencia, a aproximadamente 11 horas a aproximadamente 12 horas de diferencia, a aproximadamente 24 horas de diferencia, a aproximadamente 48 horas de diferencia, a aproximadamente 72 horas de diferencia o a 1 semana de diferencia. En otras realizaciones, se administran dos o más terapias (p. ej., agentes profilácticos o terapéuticos) dentro de la misma visita del paciente.
Los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas se pueden administrar a un sujeto en la misma composición farmacéutica. Alternativamente, los agentes profilácticos o terapéuticos de las terapias combinadas se pueden administrar simultáneamente a un sujeto en composiciones farmacéuticas diferentes. Los agentes profilácticos o terapéuticos se pueden administrar a un sujeto por las mismas vías de administración o diferentes.
EJEMPLOS
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Síntesis de 1-(3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencN)piperazm-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-1)
Figure imgf000109_0001
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), HBTU (1,2 equiv.), base de Huenig' (3,0 equiv.), ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)propanoico (1,2 equiv.) y DMSO (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y después la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-1) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CDCla): 57,35 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,72 (s, 2H), 6,69 (d, 1H), 6,40 (s, 1H), 5,46 (t, 1H), 5,33 (s, 2H), 4,16 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,82 (m, 6H), 3,40 (m, 4H), 3,21 (m, 2H), 2,67 (m, 4H), 1,39 (m, 2H), 1,26 (m, 2H), 1,14 (m, 2H), 0,86 (t, 3H). LRMS [M+H] = 589,3.
Ejemplo 2
Síntesis de ácido (2R)-2-amino-3-((1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-2)
Figure imgf000109_0002
Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-1, 1,0 equiv.) y se disolvió en tampón ACN-PBS (1:2, 0,02 M). A esta mezcla se añadió L-cisteína (2,0 equiv.) disuelta en tampón DPBS (0,07 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2R)-2-amino-3-((1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-2) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA de una mezcla de diastereoisómeros: 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,28 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,26 (m, 2H), 4,02 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,78 (m, 6H), 3,55 (m, 2H), 3,44 (m, 1H), 3,23 (m, 3H), 3,12 (m, 2H), 2,76 (m, 2H), 2,53 (m, 1H), 1,53 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 710,3.
Ejemplo 3
Síntesis de ácido (6R)-6-(2-((3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico (C-3)
Figure imgf000110_0001
Un matraz de fondo redondo se cargó con ácido (2R)-2-amino-3-((1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-1) y se disolvió en tampón PBS (pH 7,5, fosfato 100 mM con EDTA 5 nM) y acetonitrilo (1:1, 0,012 M). La mezcla de reacción se agitó luego a 40 °C durante 6 horas. En este punto se dejó que la mezcla de reacción bruta enfriar a temperatura ambiente y se purificó por RP-HPLC (NH4OAc 0,5 M en ACN:NH4OAc 10 mM en H2O, columna C18 para proporcionar ácido (6R)-6-(2-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico (C-3) en forma de un sólido en forma de una mezcla de regioisómeros y diastereoisómeros. 1H RMN (CD3OD): 57,38 (d, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,74 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,52 (s, 2H), 4,24 (m, 1H), 3,93 (s, 3H), 3,82 (m, 1H), 3,67 (s, 2H), 3,60 (m, 4H), 3,54 (t, 2H), 3,43 (m, 2H), 3,18 (m, 1H), 3,01 (m, 1H), 2,87 (m, 1H), 2,58 (m 7H), 1,50 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 1,17 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 710,4.
Ejemplo 4
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-ammo-2-carboxietN)tio)-4-((3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-4a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-4b)
Figure imgf000110_0002
Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-1, 1,0 equiv.) , L-cisteína (1,0 equiv.) y PBS:MeCN (2:1, 0,008 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se añadió NaOH 1 M (20,0 equiv.) a la mezcla de reacción. Después, la reacción se agitó durante 3 horas adicionales, luego la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (NH4OAc 0,5 mM en MeCN:NH4OAc 10 mM en H2O, columna C18) para proporcionar una mezcla de ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-4a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-4b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-4aSR), C-4aRR), (C-4bRR) y (C-4bRR) que figuran a continuación) en forma de un sólido: 1H RMN (DMSO): 57,88 (s, 1 ), 7,26 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,77 (d, 1H), 6,64 (s, 1H), 6,46 (s, 1H), 6,01 (s, 1H), 5,40 (s, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,36 (m, 17H), Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metox¡bencil p¡peraz¡n-1-¡l -3-oxoprop¡l am¡no)-4-oxobutano¡co;(C-4aSR);
Figure imgf000111_0001
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)--m x n il r z n-1- l - - x r l am¡no)-4-oxobutano¡co (C-4aRR);
Figure imgf000111_0002
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metox¡benc¡l)piperaz¡n-1-¡l)-3-oxoprop¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-4bRR);
Figure imgf000111_0003
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico;(C-4bSR).
Ejemplo 5
Síntesis de 1-(2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencN)piperazm-1-il)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-5)
Figure imgf000111_0004
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-Nmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetaldehído (4,0 equiv.), cianoborohidruro de sodio (13,0 equiv.) y MeOH (0,04 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y la mezcla de reacción bruta se purificó después por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentNamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-5) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CDCla): 57,32 (d, 1H), 7,12 (d, 1H), 6,87 (d, 1H), 6,72 (s, 2H), 6,70 (d, 1H), 6,41 (d, 1H), 5,45 (t, 1H), 5,31 (s, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,73 (t, 2H), 3,40 (m, 4H), 3,17 (m, 6H), 2,89 (m, 4H), 1,39 (m, 2H), 1,26 (m, 2H), 1,14 (m, 2H), 0,86 (t, 3H). LRMS [M+H] = 561,3.
Nota: 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetaldehído se preparó añadiendo 1-(2-hidroxietil)-1H-pirrol-2,5-diona (1.0 equiv.), peryodinano de Dess-Martin (1,5 equiv.) y DCM (0,1 M) a un matraz de fondo redondo y agitación a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se filtró, los componentes volátiles se separaron en vacío y el producto se utilizó sin purificación adicional.
Ejemplo 6
Síntesis de ácido (2S)-2-amino-3-((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-6)
Figure imgf000111_0005
Ácido (2S)-2-amino-3-((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-6 ) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 2, excepto porque se utilizó el Compuesto (C -5) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar ácido (2S)-2-amino-3-((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-2,5-dioxopirrolidin-3-il)tio)propanoico (C-6 ) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA de una mezcla de diastereoisómeros: 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,21 (m, 1H), 7,02 (m, 1H), 6,78 (m, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,56 (m, 2H), 4,21 (m, 1H), 4,09 (s, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,95 (m, 3H), 3,75 (m, 2H), 3,54 (t, 2H), 3,43 (m, 1H), 3,34 (m, 1H), 3,22 (m, 2H), 3,03 (m, 6 H), 2,84 (m, 2H), 2,63 (m, 1H), 1,52 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,18 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 682,4.
Ejemplo 7
Síntesis de ácido (6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico (C-7)
Figure imgf000112_0001
Ácido (6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico (C-7) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 3, excepto porque se utilizó el Compuesto (C -5) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar ácido (6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-2-oxoetil)-5-oxotiomorfolina-3-carboxílico (C-7) en forma de un sólido en forma de una mezcla de regioisómeros y diastereoisómeros: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,10 (s, 1H), 6,91 (d, 1H), 6,72 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,51 (s, 2H), 4,13 (m, 1H), 3,92 (s, 3H), 3,88 (m, 1H), 3,58 (s, 2H), 3,52 (t, 2H), 3,40 (m, 2H), 3,16 (m, 1H), 2,99 (m, 1H), 2,86 (m, 1H), 2,67 (m 10H), 1,49 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 1,17 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 682,3.
Ejemplo 8
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-ammo-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazm-1-il)etil)ammo)-4-oxobutanoico (C-8a) y ácido 2 -(((R)-2 -amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-8b)
Figure imgf000112_0002
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-8a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-8b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-5) en lugar del Compuesto (C-1), para dar una mezcla de Compuestos (C-8a) y (C-8b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-8aSR), C-8aRR), (C-8bRR) y (C-8bRR) que figuran a continuación), en forma de un sólido: 1H RMN (DMSO): 57,81 (s, 1), 7,33 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,76 (d, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,48 (s, 1H), 6,10 (s, 1H), 5,45 (s, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,37 (m, 17H), 2,35 (m, 8H), 1,90 (s, 2H), 1,41 (m, 2H), 1,20 (m, 2H), 1,08 (m, 2H), 0,80 (t, 3H). LRMS [M+H] = 700,4.
Figure imgf000112_0003
Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;(C-8aSR);
Figure imgf000113_0001
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metox¡bencil p¡peraz¡n-1-¡l et¡l am¡no -4-oxobutano¡co (C-8aRR);
Figure imgf000113_0002
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metox¡bencil p¡peraz¡n-1-¡l et¡l am¡no -4-oxobutano¡co (C-8bRR);
Figure imgf000113_0003
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)amino)-4-oxobutanoico;(C-8bSR).
Ejemplo 9
Síntesis de 1-(2-(3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-9)
Figure imgf000113_0004
1-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-9) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanoico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pi rrol-1 -il)propanoico, para proporcionar 1-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-9) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 123H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,81 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,38 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,86 (m, 4H), 3,67 (m, 4H), 3,56 (m, 4H), 3,24 (m, 4H), 2,61 (t, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,20 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 633,3.
Ejemplo 10
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-10a) y ácido 2- (((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3- metoxibencil)piperazm-1-il)-3-oxopropoxi)etil)ammo)-4-oxobutanoico (C-10b)
Figure imgf000113_0005
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-10a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-10b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-9) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-10a) y (C-10b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-10aSR), C-10aRR), (C-l0bRR) y (C-10bRR) que figuran a continuación), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (CD3OD): 57,35 (d, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,77 (m, 1H), 6,23 (s, 1H), 5,56 (s, 2H), 4,32 (m, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,86 (m, 3H), 3,72 (m, 3H), 3,54 (m, 10H), 3,21 (m, 4H), 2,67 (m, 4H), 1,52 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS[M+H] = 772,4.
Figure imgf000114_0002
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-
Figure imgf000114_0003
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-10bSR).
Ejemplo 11
Síntesis de 1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-11)
Figure imgf000114_0001
1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-11) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 3-(2-(2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)propanoico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico para proporcionar 1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-11) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,80 (s, 2H), 6,24 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,32 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,74 (t, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,58 (m, 12H), 3,64 (m, 4H), 3,20 (m, 4H), 2,68 (m, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,32 (m, 2H), 1,20 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 721,4.
Ejemplo 12
Síntesis de ácido (2R)-2-ammo-19-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico (C-12a) y ácido (19R)-19-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico (C-12b)
Figure imgf000115_0001
Ácido (2R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico (C-12a) y ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico (C-12b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-11) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-12a) y (C-12b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-12aSR), C-12aRR), (C-12bRR) y (C-12bSR) que figuran a continuación), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,31 (s, 1H), 7,06 (d, 1H), 6,79 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57(s, 2H), 4,34 (s, 2H), 4,23 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,86 (m, 4H), 3,76 (m, 4H), 3,58 (m, 14H), 3,27 (m, 4H), 3,22 (m, 2H), 2,84 (m, 1H), 2,71 (m, 2H), 1,53 m, 2H , 1,31 m, 2H , 1,19 m, 2H , 0,88 t, 3H). LCMS [M+H] = 860,4.
Figure imgf000115_0002
Ácido (2R,5S)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico (C-12aSR);
M
Figure imgf000115_0003
ácido (2R,5R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,19-dioxo-10,13,16-trioxa-4-tia-7-azanonadecan-1-oico (C-12aRR);
Figure imgf000115_0004
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1 ,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico (C-12bRR);
Figure imgf000115_0005
ácido (16S,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,14-dioxo-4,7,10-trioxa-17-tia-13-azaicosan-20-oico (C-12bSR).
Ejemplo 13
Síntesis de 1-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-13)
Figure imgf000116_0001
1-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-13) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-oico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico para proporcionar 1-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-13) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 5 7,38 (d, 1H), 7,27 (d, 1H), 7,07 (d, 1H), 6,84 (d, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,25 (d, 1H), 5,59 (s, 2H), 4,36 (s, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,65 (m, 32H), 3,20 (m, 4H), 2,71 (m, 2H), 1,55 (m, 2H), 1,32 (m, 2H), 1,21 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). LCMS [M+H] = 853,5.
Ejemplo 14
Síntesis de ácido (2R)-2-ammo-28-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,19,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico (C-14a) y ácido (28R)-28-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metN)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-25-carboxi-1,23-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-26-tia-22-azanonacosan-29-oico (C-14b)
Figure imgf000116_0002
Ácido (2R)-2-amino-28-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,19,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico (C-14a) y ácido (28R)-28-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-25-carboxi-1,23-dioxo-4,7,10,13,16,19-hexaoxa-26-tia-22-azanonacosan-29-oico (C-14b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-13) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-14a) y (C-14b), en forma de sus diastereoisómeros respectivos (Compuestos (C-14aSR), (C-14aRR), (C-14bRR) y (C-14bSR) que figuran a continuación), en forma de un sólido en forma de la sal HCI (después de la purificación por RP-HPLC, el producto se disolvió en acetonitrilo, se trató con exceso de HCl 2 N, y luego se liofilizó): 1H RMN (CD3OD): 57,47 (s, 1H), 7,39 (d, 1H), 7,13 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,25 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,38 (s, 2H), 4,32 (m, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,77 (m, 4H), 3,76 (m, 4H), 3,64 (m, 28H), 3,55 (m, 5H), 3,31 (m, 4H), 3,12 (m, 1H), 2,86 (m, 1H), 2,72 (s, 2H), 2,62 (m, 1H), 1,54 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,20 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). LCMS [M+H] = 992,4.
Meo.
Figure imgf000116_0003
Ácido (2R,5S)-2-amino-28-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,28-dioxo-10,13,16,19,22,25-hexaoxa-4-tia-7-azaoctacosan-1-oico (C-14aSR);
Figure imgf000117_0001
Etapa 1: 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propan-1-ona se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 3- (2-(2-azidoetoxi)etoxi)propanoico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico.
Etapa 2: Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)propan-1-ona (1,0 equiv.), CuSO4 (0,25 equiv.), sal de sodio del ácido L-ascórbico (1,1 equiv .), 1- (prop-2-in-1-il) -1H-pirrol-2,5-diona (2,2 equiv.) y una mezcla de t-BuOH/agua (1:1, v/v, 0,012 M). La mezcla de reacción se colocó bajo vacío y posteriormente se lavó abundantemente con N2 (esto se repitió cuatro veces más). La mezcla de reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante 2 horas y la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 1-((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-15) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,94 (s, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,29 (s, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,85 (s, 2H), 6,81 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,73 (s, 2H), 4,52 (t, 2H), 4,36 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,85 (t, 2H), 3,84 (m, 4H), 3,66 (t, 2H), 3,54 (m, 6H), 3,27 (m, 4H), 2,63 (t, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 758,4.
Ejemplo 16
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4- oxobutanoico (C-16a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-16b)
Figure imgf000118_0001
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-16a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-16b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-15) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-16a) y (C-16b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-16aSR), C-16aRR), (C-16bRR) y (C-16bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (CD3OD): 57,91 (s, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,06 (d, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,54 (s, 2H), 4,44 (m, 2H), 4,34 (s, 2H), 4,25 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 4,83 (m, 6H), 3,68 (t, 2H), 3,55 (m, 6H), 3,25 (m, 2H), 2,86 (m, 1H), 2,64 (m, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 897,4
MeO
Figure imgf000118_0002
Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-1 R
Figure imgf000118_0003
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-16aRR ;
Figure imgf000118_0004
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-
Figure imgf000118_0005
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-16bSR).
Ejemplo 17
Síntesis de N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-17)
Figure imgf000119_0001
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-17) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 3-(2-(2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)propanamido)etoxi)etoxi)propanoico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico para proporcionar N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-17) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,28 (d, 1H), 7,06 (d, 1H), 6,82 (d, 1H), 6,80 (s, 2H), 6,24 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,37 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,84 (m, 4H), 3,40 (m, 4H), 3,56 (m, 6 H), 3,48 (t, 2H), 3,20 (m, 6 H), 2,69 (t, 2H), 2,45 (t, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 748,4.
Ejemplo 18
Síntesis de ácido (19R)-19-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico (C-18a) y ácido (20R)-20-ammo-1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico (C-18b)
Figure imgf000119_0002
Ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1 -il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico (C-18a) y ácido (20R)-20-amino-1 -(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico (C-18b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-17) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-18a) y (C-18b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-18aSR), (C-18aRR), (C-18bRR) y (C-18bSR) que figuran más delante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,07 (d, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,25 (d, 1H), 5,57(s, 2H), 4,35 (s, 2H), 4,19 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,76 (m, 3H), 3,60 (s, 4H), 3,53 (m, 4H), 3,41 (m, 1H), 3,36 (m, 2H), 3,22 (s, 2H), 2,70 (t, 2H), 2,42 (2H), 1,53 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 887,4.
Meo.
Figure imgf000119_0003
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-(carboximetil)-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,14-diazaicosan-20-oico (C-18aRR);
Figure imgf000120_0003
ácido (17S,20R)-20-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-17-carboxi-1,11,15-trioxo-4,7-dioxa-18-tia-10,14-diazahenicosan-21-oico (C-18bSR).
Ejemplo 19
Síntesis de 5-(4-((4-(3-ammopropN)piperazm-1-N)metM)-2-metoxibencM)-N4-pentN-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidma-2,4-diamina (C-19)
Figure imgf000120_0001
5-(4-((4-(3-aminopropil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-19) se preparó en una secuencia de dos etapas. En la primera etapa, un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), (3-bromopropil)carbamato de terc.-butilo (1,2 equiv.), base de Huenig (2,4 equiv.), y DMF (0,2 M). La mezcla de reacción se calentó a 60 °C y luego se agitó durante 18 horas. La mezcla de reacción bruta se enfrió luego a temperatura ambiente y se purificó por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 20%:DCM) para proporcionar (3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)carbamato de terc.-butilo. En la segunda etapa, se utilizó un procedimiento similar a la última etapa en la síntesis de (Int-1) para obtener 5-(4-((4-(3-aminopropil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-19) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,24 (d, 1H), 7,10 (d, 1H), 6,85 (d, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,11 (s, 1H), 5,42 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,52 (s, 2H), 3,35 (m, 2H), 2,80 (t, 2H), 2,51 (m, 4H), 2,45 (m, 4H), 1,72 (m, 2H), 1,40 (m, 2H), 1,28 (m, 4H), 1,15 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 495,3.
Ejemplo 20
Síntesis de 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-i)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1 -ona (C-20)
Figure imgf000120_0002
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-i)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-20) se preparó siguiendo un procedimiento del Ejemplo 19, excepto que se utilizó ácido 2,2-dimetil-4-oxo-3,8,11-trioxa-5-azatetradecan-14-oico en lugar de (3-bromprpopil)carbamato de terc.-butilo para proporcionar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-i)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-20) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,24 (d, 1H), 7,11 (s, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,57 (d, 1H), 6,12 (d, 1H), 5,42 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,76 (t, 2H), 3,59 (m, 12H), 3,37 (t, 2H), 2,76 (t, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,45 (m, 4H), 1,41 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,16 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). LRMS [M+H] = 597,4.
Ejemplo 21
Síntesis de N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida (C-21)
Figure imgf000121_0001
Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-20) (1,0 equiv.), DIEA (10,0 equiv.) y DMF (0,004 M) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego se cargó un matraz separado con 2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (1,5 equiv.), DIEA (10,0 equiv.) y Dm F (0.006 M). Esta mezcla también se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego las dos soluciones se mezclaron y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)acetamida (C-21) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H r Mn (CD3CN): 57,30 (d, 1H), 7,05 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,82 (s, 2H), 6,74 (s, 1H), 6,68 (d, 1H), 6,21 (d, 1H), 6,08 (t, 1H), 5,38 (s, 2H), 4,08 (s, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,70 (t, 2H), 3,41 (m, 14H), 3,29 (m, 2H), 2,55, (t, 2H), 2,38 (m, 4H), 1,41 (m, 2H), 1,26 (m, 2H), 1,13 (m, 2H), 0,85 (t, 3H). LCMS [M+H] = 734,4.
Ejemplo 22
Síntesis de ácido (2R)-2-ammo-19-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico (C-22a) y ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico (C-22b)
Figure imgf000121_0002
Ácido (2R)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico (C-22a) y ácido (19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico (C-22b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-21) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-22a) y (C-22b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-22aSR), (C-22aRR), (C-22bRR) y (C-22bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,08 (d, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57(s, 2H), 4,34 (s, 2H), 4,20 (m, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,82 (m, 9H), 3,56 (m, 9H), 3,38 (m, 3H), 3,21 (m, 2H), 2,70 (t, 2H), 1,54 (m, 2H), 1,32 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). LCMS [M+H] = 873,4.
Figure imgf000121_0003
Ácido (2R,5S)-2-amino-19-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-(carboximetil)-6,9,19-trioxo-13,16-dioxa-4-tia-7,10-diazanonadecan-1-oico (C-22aSR);
Figure imgf000122_0004
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibenc¡l)p¡peraz¡n-1-il)-16-carbox¡-1,11,14-trioxo-4,7-d¡oxa-17-t¡a-10,13-d¡aza¡cosan-20-o¡co (C-22bRR);
Figure imgf000122_0001
ácido (16R,19R)-19-amino-1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-16-carboxi-1,11,14-trioxo-4,7-dioxa-17-tia-10,13-diazaicosan-20-oico (C-22bSR).
Ejemplo 23
Síntesis de 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)piperazina-1-carboxamida (C-23)
Figure imgf000122_0002
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1 equiv.), (2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de 4-nitrofenilo (0,9 equiv.), trietilamina (3,0 equiv.) y DMSO (0,01 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)metil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)piperazina-1-carboxamida (C-23) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,96 (s, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,05 (d, 1H), 6,85 (s, 2H), 6,79 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,74 (s, 2H), 4,53 (t, 2H), 4,35 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,86 (t, 2H), 3,85 (m, 4H), 3,54 (m, 12H), 3,22 (m, 6H), 1,53 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 817,4.
Nota: (2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de 4-nitrofenilo
Figure imgf000122_0003
se preparó utilizando el siguiente procedimiento:
Etapa 1: Trietilamina (2.5 equiv.) y dicarbonato de di-terc.-butilo (1,1 equiv.) se añadieron a una solución de 2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etanamina (1,0 equiv.) en CH2O 2 (0,05 M) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción se concentró entonces en vacío y el residuo se purificó utilizando RP-C18 ISCO y luego se liofilizó para dar (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc.-butilo.
Etapa 2: Una solución de (2-(2-(2-(2-azidoetoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc.-butilo (1 equiv.) y 1-(prop-2-in-1-il)-1H-pirrol-2,5-diona (2,0 equiv.) en f-BuOH (0,08 M) se lavó abundantemente con gas N2 cinco veces y luego se añadieron sal de sodio del ácido L-ascórbico (1,0 equiv. 0,16 M en H2O) y CuSO4 (0,2 equiv. 0,03 M en H2O). La mezcla de reacción se lavó abundantemente de nuevo con gas N2 cinco veces y después se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se purificó luego por ISCO RP-C18 y se liofilizó para proporcionar (2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc.-butilo. Etapa 3: Una solución de (2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)metil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de terc.-butilo en TFA (0,02 M) se concentró en vacío para proporcionar 1-((1-(23-amino-3,6,9,12,15,18,21-heptaoxatricosil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1H-pirrol-2,5-diona. LCMS [M+H] = 354,2.
Etapa 4: Carbonoclorhidrato de 4-nigtrofenilo (1,10 equiv.) y trietilamina (2,50 equiv.) se añadieron a una solución de 1-((1-(2-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etoxi)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1H-pirrol-2,5-diona (1 equiv.) en CH2Q 2 (0,01 M) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La mezcla de reacción se concentró después en vacío, se purificó por RP-C18 ISCO y luego se liofilizó para proporcionar (2-(2-(2-(2-(4-((2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)metil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)etoxi)etoxi)etoxi)etil)carbamato de 4-nitrofenilo. lCm S [M+H] = 519,2.
Ejemplo 24
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-ammo-2-carboxietN)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24a) y 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24b)
Figure imgf000123_0001
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24a) y 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-23) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-24a) y (C-24b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-24aSR), C-24aRR), (C-24bRR) y (C-24bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó
Figure imgf000123_0002
Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico C-24aSR ;
Figure imgf000123_0003
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24aRR);
Figure imgf000124_0001
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24bRR);
Figure imgf000124_0002
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-1-oxo-5,8,11-trioxa-2-azatridecan-13-il)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-24bsR).
Ejemplo 25
Síntesis de 1-(2-(2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-25)
Figure imgf000124_0003
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), 2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)acetaldehído (4,0 equiv.), cianoborohidruro de sodio (13,0 equiv.) y MeOH (0,04 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 1-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-25) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,16 (d, 1H), 6,96 (d, 1H), 6,83 (s, 2H), 6,76 (d, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,53 (s, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,84 (s, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,71 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,54 (m, 2H), 3,35 (m, 4H), 3,27 (t, 2H), 2,95 (m, 4H), 1,52 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 605,4.
Nota: 2-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)acetaldehído se preparó añadiendo 1-(2-(2-hidroxietoxi)etil)-1H-pirrol-2,5-diona (1.0 equiv.), peryodinano de Dess-Martin (1,5 equiv.) y DCM (0,1 M) a un matraz de fondo redondo y agitando la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se filtró, los componentes volátiles se separaron en vacío y el producto se utilizó sin purificación adicional.
Ejemplo 26
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-26a) y ácido 2 -(((R)-2 -amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-26b)
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-26a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico (C-26b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-25) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-26a) y (C-26b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-26aSR), C-26aRR), (C-26bRR) y (C-26bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en FhO, columna C18): LCMS [M+H] = 744,4
Figure imgf000125_0001
Ácido (S)-3-(((R)-2-am¡no-2-carbox¡et¡l)t¡o)-4-((2-(2-(4-(4-((2-am¡no-4-(pent¡lam¡no)-5H-p¡rrolo[3,2-d]pir¡m¡d¡n-5-¡l)met¡l)-3-metox¡benc¡l)p¡peraz¡n-1-il)etox¡)et¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-26aSR);
MeO
Figure imgf000125_0002
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-¡l)met¡l)-3-metox¡benc¡l)p¡peraz¡n-1-il)etox¡)et¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-26aRR);
Figure imgf000125_0004
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etil)amino)-4-oxobutanoico;(C-26bSR).
Ejemplo 27
Síntesis de 1-((1-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-27)
Figure imgf000125_0003
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), 2-azidoacetaldehído (4,0 equiv.), cianoborohidruro de sodio (32,0 equiv.) y MeOH (0,02 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% TFA en H2O, columna C18) para proporcionar 5-(4-((4-(2-azidoetil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina en forma de un sólido. LCMS [M+H] = 507,3.
Etapa 2: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(4-((4-(2-azidoetil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (1,0 equiv), 1-(prop-2-in-1-il)-1H-pirrol-2,5-diona (2,3 equiv.) y una mezcla de t-BuOH y agua (2:1, v/v, 0,008 M). La mezcla de reacción se desgasificó en vacío y se lavó abundantemente con N2 cinco veces para separar el O2. Sal de sodio del ácido L-ascórbico (1,1 equiv en 0,5 ml de H2O, desgasificada bajo y enjuagada con abundante agua se purgó con N2 cinco veces para separar el O2), se añadió utilizando una jeringa a la mezcla de reacción, a continuación, se añadió utilizando una jeringa CuSO4 (0,2 equiv. en 0,5 ml de agua, desgasificada en vacío y enjuagada con N2 cinco veces para separar el O2). La mezcla de reacción se agitó entonces a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó después por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 1-((1-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-27) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,95 (s, 1H), 7,36 (d, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,02 (d, 1H), 6,86 (s, 2H), 6,79 (d, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,76 (s, 2H), 4,52 (t, 2H), 4,26 (s, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,54 (t, 2H), 2,85 (m, 8H), 2,94 (t, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,18 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LCMS [M+H] = 642,4.
Nota: 2-azidoacetaldehído se preparó añadiendo 2-azidoetanol (1,0 equiv.), peryodinano de Dess-Martin (1,5 equiv.) y DCM (0,20 M) a un matraz de fondo redondo y agitando la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción se filtró, los componentes volátiles se separaron en vacío y el producto se utilizó sin purificación adicional.
Ejemplo 28
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-ammo-2-carboxietN)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-28a) y ácido 2-(((R)-2-ammo-2-carboxietN)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-28b)
Figure imgf000126_0001
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-28a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-28b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-27) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-28a) y (C-28b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-28aSR), C-28aRR), (C-28bRR) y (C-28bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TfA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): LCMS [M+H] = 781,4
H
Figure imgf000126_0002
Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-l m l - -m x n l r z n-1- l etil)-1H-1,2,3-tr¡azol-4-¡l)met¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-28aSR);
Figure imgf000126_0003
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-¡l met¡l -3-metox¡benc¡l p¡peraz¡n-1-¡l etil)-1H-1,2,3-tr¡azol-4-¡l)met¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-28aRR);
Figure imgf000126_0004
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-¡l)met¡l)-3-metox¡benc¡l)p¡peraz¡n-1-il)et¡l)-1H-1,2,3-tr¡azol-4-¡l)met¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-28bRR);
Figure imgf000126_0005
ácido (S)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil)amino)-4-oxobutanoico (C-28bSR).
Ejemplo 29
Síntesis de N-(21-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-29)
Figure imgf000127_0001
N-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-29) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)-3-oxo-7,10,13,16,19,22-hexaoxa-4-azapentacosan-25-oico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-di hidro-1 H-pirrol-1-il)propanoico para proporcionar N-(21-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-21-oxo-3,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-lH-pirrol-1-il)propanamida (C-29) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (DMSO): 58,00 (t, 1H), 7,42 (d, 1H), 7,38 (s, 3H), 7,20 (s, 1H), 7,00 (s, 2H), 6,95 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,30 (s, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,59 (m, 4H), 3,49 (m, 28H), 3,35 (t, 2H), 3,14 (m, 2H), 2,32 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,21 (m, 2H), 1,09 (m, 2H), 0,81 (t, 3H). LRMS [M+H] = 924,4.
Ejemplo 30
Síntesis de 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (C-30)
Figure imgf000127_0002
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), HOAT (2,0 equiv.), base de Huenig (14,0 equiv.), ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo (1,2 equiv.) y piridina:DMF (1:4, 0,02 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, y la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo en forma de un sólido: LCMS [M+H] = 1065,5.
Etapa 2: 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo se disolvió en DMF (0,007 M) y se añadió piperidina (100,0 equiv.). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo en forma de un sólido: LCMS [M+H] = 843,5.
Etapa 3: Un matraz de fondo redondo se cargó con 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-amino)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (1,0 equiv.), ácido 3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanoico (1,1 equiv.), base de Huenig (5,0 equiv.), HATU (1,05 equiv.) y DMF (0,004 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)-5-ureidopentanamido)bencilo (C-30) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 1038,5.
Ejemplo 31
Síntesis de ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-ammo-4-(pentilammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboml)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-31)
Figure imgf000128_0001
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), HOAT (2,0 equiv.), base de Huenig (14,0 equiv.), triacetato de (3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,2 equiv.) y piridina:DMF (1:4, 0,015 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar triacetato de (3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo en forma de un sólido: LCMS [M+H] = 1212,4.
Etapa 2: Triacetato de (3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,0 equiv.) se disolvió en MeOH, THF y agua (2:1:0,4) (0,005 M). Luego se añadió LiOH (8,0 equiv.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico en forma de un sólido: Lc Ms [M+H] = 850,4.
Etapa 3: Un matraz de fondo redondo se cargó con ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (1,0 equiv.), ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico (2,0 equiv.), base de Huenig (6,0 equiv.), HBTU (1,8 equiv.) y DMF (0,003 M). La reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en a Cn : TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-31) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 1001,3.
Ejemplo 32
Síntesis de (S)-1-(3-(4-(3-((2-ammo-4-((1-hidroxihexan-2-il)ammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazm-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-32)
Figure imgf000128_0002
(S)-1-(3-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1 -il)-3-oxopropil)-1 H-pirrol-2,5-diona (C-32) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto porque se utilizó el Compuesto (Int-2) en lugar del Compuesto (Int-1), para proporcionar (S)-1-(3-(4-(3-((2-amino-4((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-32) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,49 (d, 2H), 7,21 (d, iH), 6,82 (s, 2H), 6,77 (d, 1), 6,28 (d, 1H), 5,67 (d, 1H), 5,51 (d, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,18 (s, 2H), 3,98 (s, 3H), 3,76 (t, 2H), 3,54 (dd, 1H), 3,46 (dd, 1H), 3,16 (m, 4H), 3,05 (m, 4H), 2,71 (t, 2H), 1,48 (m, 1H), 1,26 (m, 3H), 1,05 (m, 1H), 0,84 (t, 3H). LRMS [M+H] = 619,4.
Ejemplo 33
Síntesis de 1-(3-(4-(3-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-4-metoxibencN)piperazm-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-33)
Figure imgf000129_0001
1-(3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-33) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 1, excepto que se utilizó el Compuesto (Int-3) en lugar del Compuesto (Int-1) para proporcionar 1-(3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)-1H-pirrol-2,5-diona (C-33) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. LRMS [M+H] = 589,3.
Ejemplo 34
Síntesis de ácido 3-(((R)-2-ammo-2-carboxietN)tio)-4-((3-(4-(3-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34b)
Figure imgf000129_0002
Ácido 3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34a) y ácido 2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34b) se prepararon siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 4, excepto que se utilizó el Compuesto (C-33) en lugar del Compuesto (C-1), para proporcionar una mezcla de Compuestos (C-34a) y (C-34b) en forma de sus respectivos diastereoisómeros (Compuestos (C-34aSR), C-34aRR), (C-34bRR) y (C-34bSR) que figuran más adelante), en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. La mezcla de reacción bruta se purificó mediante RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18): 1H RMN (DMSO): 57,51 (s, 2H), 7,39 (m, 2H), 7,27 (d, 1H), 7,15 (d, 1H), 6,59 (s, 1H), 6,22 (t, 1H), 5,56 (s, 2H), 3,86 (s, 4H), 3,66 (m, 3H), 3,42 (m, 8H), 3,25 (m, 4H), 3,08 (m, 2H), 2,81 (m, 3H), 2,65 (m, 1H), 1,43 (m, 2H), 1,22 (m, 3H), 1,07 (m, 2H), 0,83 (t, 3H). LCMS
Figure imgf000129_0003
Ácido (S)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34aSR);
Figure imgf000130_0001
ácido (R)-3-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metox¡bencil p¡peraz¡n-1-¡l -3-oxoprop¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-34aRR);
Figure imgf000130_0002
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metox¡bencil)p¡peraz¡n-1-¡l)-3-oxoprop¡l)am¡no)-4-oxobutano¡co (C-34bRR);
Figure imgf000130_0003
ácido (R)-2-(((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)-4-((3-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropil)amino)-4-oxobutanoico (C-34bSR).
Ejemplo 35
Síntesis de 1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencM)piperazm-1-il)-2-(aminooxi)etanona (C-35)
Figure imgf000130_0004
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), ácido 2-(((terc.-butoxicarbonil)amino)oxi)acético (1,1 equiv.), HATU (1,05 equiv.), base de Huenig (5,0 equiv.) y DMF (0,2 M). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 18 horas y la mezcla de reacción bruta se purificó luego por cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 20%:DCM) para proporcionar (2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-oxoetoxicarbamato de terc.-butilo.
Etapa 2: HCI (20,0 equiv., 4 M en dioxano) se añadió un matraz de fondo redondo cargado con (2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-oxoetoxicarbamato de terc.-butilo (1,0 equiv.) y DCM (0,1 M) a 0 °C. Luego se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Los componentes volátiles se separaron en vacío. MeOH (con NH4OH al 8%) se añadió al residuo resultante y los componentes volátiles se separaron en vacío. Esto se repitió 2 veces más. La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10% (NH4OH al 8%):DCM) para suministrar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona (C-35) en forma de un sólido: 1H RMN (CDCla): 57,12 (d, 1H), 7,00 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,69 (d, 1H), 6,38 (d, 1H), 5,52 (t, 1H), 5,30 (s, 2H), 4,35 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,64 (s, 2H), 3,52 (m, 2H), 3,38 (m, 4H), 2,44 (m, 4H), 1,62 (s, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,38 (m, 2H), 1,25 (m, 2H), 1,12 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 511,4.
Ejemplo 36
Síntesis de 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-aminoetoxi)propan-1-ona (C-36)
Figure imgf000131_0001
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-i)-3-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-36) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 35, excepto que se utilizó ácido 3-(2-((terc.-butoxicarbonil)amino)etoxi)propanoico en lugar de ácido 2-(((terc.-butoxicarbonil)amino)oxi)acético para proporcionar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-aminoetoxi)propan-1-ona (C-36) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 5 7,26 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,59 (d, 1H), 6,13 (d, 1H), 5,43 (s, 2H), 4,57 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,73 (t, 2H), 3,58 (m, 4H), 3,54 (m, 2H), 3,37 (m, 2H), 2,93 (t, 2H), 2,66 (m, 2H), 2,44 (m, 4H), 1,41 (m, 2H), 1,27 (m, 2H), 1,15 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 553,4.
Ejemplo 37
Síntesis de N-(2-(3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-37)
Figure imgf000131_0002
N-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-37) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 35, excepto que se utilizó 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-aminoetoxi)propan-1-ona (C-36) en lugar de Int-1 para proporcionar N-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-37) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,27 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,59 (d, 1H), 6,13 (d, 1H), 5,44 (s, 2H), 4,08 (s, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,72 (t, 2H), 3,56 (m, 8H), 3,40 (m, 4H), 2,64 (t, 2H), 2,44 (m, 4H), 1,43 (m, 2H), 1,27 (m, 2H), 1,14 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 626,4.
Ejemplo 38
Síntesis de (S)-1-(4-(3-((2-ammo-4-((1-hidroxihexan-2-N)ammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona (C-38)
Figure imgf000131_0003
(S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona (C-38) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 35, excepto porque se utilizó el Compuesto (Int-2) en lugar del Compuesto (Int-1), para proporcionar (S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-(aminooxi)etanona (C-38) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,54 (d, 1), 7,40 (d, 1H), 7,13 (d, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,29 (d, 1H), 5,69 (d, 1H), 5,48 (d, 1H), 4,36 (m, 3H), 3,96 (s, 3H), 3,74 (m, 2H), 3,51 (m, 4H), 2,66 (m, 4H), 1,49 (m, 1H), 1,38 (m, 3H), 1,24 (m, 2H), 0,96 (m, 2H), 0,84 (t, 3H). LRMS [M+H] = 541,3.
Ejemplo 39
(S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-39)
Figure imgf000132_0001
(S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-39) se preparó siguiendo un procedimiento similar del Ejemplo 35, excepto que se utilizó Compuesto (Int-2) en lugar de Compuesto (Int-1) y ácido 2,2-dimetil-4-oxo-3,8,11-trioxa-5-azatetradecan-14-oico en lugar de ácido 2-(((terc.-butoxicarbonil)amino)oxi)acético para proporcionar (S)-1-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)propan-1-ona (C-39) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,56 (d, 1H), 7,44 (d, 1 h ), 7,16 (d, 1H), 6,77 (s, 1H), 6,31 (d, 1H), 5,71 (d, 1H), 5,50 (d, 1H), 4,38 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,78 (m, 4H), 3,72 (m, 2H), 3,67 (m, 6H), 3,53 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 2,77 (m, 2H), 2,69 (m, 4H), 1,51 (m, 1H), 1,26 (m, 3H), 1,02 (m, 2H), 0,86 (t, 3H). LRMS [M+H] = 627,5.
Ejemplo 40
Síntesis de (S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-ammo-4-((1-hidroxihexan-2-N)ammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-40)
Figure imgf000132_0002
(S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-40) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 35, excepto porque se utilizó el Compuesto (C-39) en lugar del Compuesto (Int-1), para proporcionar (S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-40) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,54 (d, 1H), 7,47 (d, 1H), 7,17 (d, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,30 (d, 1H), 5,68 (d, 1H), 5,50 (d, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,09 (s, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,73 (m, 8H), 3,56 (m, 4H), 3,43 (t, 2H), 3,23 (m, 2H), 2,88 (m, 4H), 2,66 (t, 2H), 1,49 (m, 1H), 1,26 (m, 3H), 1,04 (m, 2H), 0,84 (t, 3H). LRMS [M+H] = 700,4.
Ejemplo 41
Síntesis de N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-41)
Figure imgf000132_0003
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-41) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 35, excepto que se utilizó Compuesto (C-20) en lugar de Compuesto (Int-1) para proporcionar N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-41) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,25 (d, 1H), 7,11 (s, 1H), 6,86 (d, 1H), 6,58 (d, 1H), 6,12 (d, 1H), 5,43 (s, 2H), 4,10 (s, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,76 (t, 2H), 3,60 (m, 12H), 3,44 (t, 2H), 3,36 (t, 2H), 2,66 (t, 2H), 2,46 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,15 (m, 2H), 0,89 (t, 3H). LRMS [M+H] = 670,4.
Ejemplo 42
Síntesis de 5-(4-((4-(2-(2-(aminooxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-42)
Figure imgf000133_0001
Etapa 1. En la primera etapa se cargó un matraz de fondo redondo con 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil) bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.) y 2-(2-((1,3-dioxoisoindolin-2-il)oxi)etoxi)acetaldehído (1,2 equiv.) en DCE (0,02 M) y a esta mezcla se añadió ácido acético (6,0 equiv.), la mezcla se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (3,0 equiv.). La agitación continuó durante otras 3 horas a temperatura ambiente. Los componentes volátiles se separaron luego en vacío. El residuo se disolvió en MeOH y se purificó por HPLC de fase inversa, utilizando una columna C18 (eluyendo con acetonitrilo al 10-50%-H2O que contenía TFA al 0,05%) para suministrar 2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)isoindolina-1,3-diona. LCMS [M+H]= 671,40.
Etapa 2. Un matraz de fondo redondo se cargó con 2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)isoindolina-1,3-diona (1,0 equiv.), hidrato de hidrazina (10,0 equiv.), MeOH (0,02 M) y agua (0,2 M). La mezcla se agitó durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se purificó por HPLC de fase inversa, utilizando una columna C18 (eluyendo con acetonitrilo al 10-50%-H2O que contenía TFA al 0,05%). Las fracciones que contenían el producto deseado se agruparon y se concentraron a presión reducida, el residuo se disolvió luego en MeOH y se cargó en una columna de resina MP Sphere PL-HCO3 pre­ acondicionada y se eluyó con MeOH y el eluyente se concentró para proporcionar 5-(4-((4-(2-(2-(aminooxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-42) en forma de un sólido: 1H RMN (CDaOD): 57,22 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 6,83 (d, 1H), 6,56 (d, 1H), 6,10 (d, 1H), 5,40 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,76 (m, 2H), 3,60 (m, 4H), 3,50 (s, 2H), 3,34 (d, 3H), 2,59 (m, 4H), 2,49 (s, 4H), 1,38 (m, 2H), 1,26 (m, 2H), 1,12 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LCMS [M+H] = 541,40.
Nota: 2-(2-((1,3-dioxoisomdoNn-2-N)oxi)etoxi)acetaldehído se preparó en un procedimiento de dos etapas:
Etapa 1: A una solución de N-hidroxiftalimida (1,0 equiv.), dietilenglicol (1,0 equiv.) y trifenilfosfina (1,3 equiv.) en THF (0,2 M) se añadió DEAD (solución 2,2 M en tolueno, 1,3 equiv.) a 0°C. La solución resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró en vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluido con EtOA al 20-70%/ hexanos). El producto todavía contenía algo de Ph3PO después de esta cromatografía, luego se re-purificó por cromatografía de fase inversa (columna C18, se eluyó con CH3CN al 20-40-100%/agua) para proporcionar 2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)isoindolina-1,3-diona LCMS [M+H] = 252,10.
Etapa 2: A una mezcla agitada de 2-(2-(2-hidroxietoxi)etoxi)isoindolina-1,3-diona (1,0 equiv.) y bicarbonato de sodio (2,0 equiv.) en DCM seco (0,08 M) se añadió peryodinano de Dess -Martin (2,0 equiv.) y la mezcla resultante se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. . La mezcla de reacción se diluyó con DCM, luego se lavó con solución de NaOH 1 N y salmuera, la capa orgánica se separó y se secó sobre MgSO4 y se evaporó en vacío. La mezcla bruta se purificó por cromatografía sobre gel de sílice (eluida con EtAOc al 30-70%/Hexanos) para suministrar 2-(2-((1,3-dioxoisoindolin-2-il)oxi)etoxi)acetaldehído. LCMS [M+H] = 250,10.
Ejemplo 43
Síntesis de N-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)-2-(aminooxi)acetamida (C-43)
Figure imgf000133_0002
N-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)-2-(aminooxi)acetamida (C-43) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 35, excepto que se utilizó Compuesto (C-19) en lugar de Compuesto (Int-1) para proporcionar N-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)-2-(aminooxi)acetamida (C-43) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,12 (d, 1H), 6,98 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,45 (d, 1H), 6,00 (d, 1H), 5,30 (s, 2H), 3,97 (s, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,41 (s, 2H), 3,25 (s, 2H), 2,40 (s, 6H), 2,27 (m, 3H), 1,63 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,17 (m, 3H), 1,02 (m, 2H), 0,77 (t, 3H). LCMS [M+H] = 568,40.
Ejemplo 44
Síntesis de 5-(4-((4-(2-(2-(2-ammoetoxi)etoxi)etN)piperazm-1-N)metN)-2-metoxibencM)-N4-pentN-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-44)
Figure imgf000134_0001
5-(4-((4-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-44) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 19, excepto que se utilizó (2-(2-(2-bromoetoxi)etoxi)etil)carbamato de terc.-butilo en lugar de (3-bromopropil)carbamato de terc.-butilo para proporcionar 5-(4-((4-(2-(2-(2-aminoetoxi)etoxi)etil)piperazin-1-il)metil)-2-metoxibencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (C-44) en forma de un sólido: 1H RMN (CDaOD): 57,36 (d, 1H), 7,13 (d, 1H), 6,92 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,21 (s, 1H), 5,51 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,69 (m, 12H), 3,53 (t, 2H), 3,12 (m, 2H), 2,84 (m, 8H), 1,50 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,17 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 569,3.
Ejemplo 45
Síntesis de N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-45)
Figure imgf000134_0002
N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-43) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 35, excepto que se utilizó Compuesto (C-44) en lugar de Compuesto (Int-1) para proporcionar N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)etoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-45) en forma de un sólido: 1H RMN (CDCla): 57,20 (s, 1H), 6,97 (d, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,87 (s, 1H), 6,76 (d, 1H), 6,56 (d, 1H), 6,17 (d, 1H), 5,84 (s, 2H), 5,21 (s, 2H), 4,69 (m, 2H), 4,07 (s, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,53 (m, 8H), 3,45 (m, 2H), 3,39 (s, 2H), 3,24 (m, 2H), 2,52 (t, 2H), 2,40 (m, 8H), 1,22 (m, 2H), 1,16 (m, 2H), 1,02 (m, 2H), 0,78 (t, 3H). LRMS [M+H] = 642,4.
Ejemplo 46
Síntesis de 5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-46)
Figure imgf000134_0003
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), diisopropilamina (1,3 equiv.), disuccinimidal glutarato (1,3 equiv.) y d Ms O (0,1 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar 5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-46) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (Dm So ): 57,41 (s, 1H), 7,37 (s, 3H), 7,19 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,56 (s, 2H), 4,30 (s, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,44 (m, 4H), 3,35 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,80 (m, 8H), 2,71 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,44 (m, 2H), 1,20 (m, 2H), 1,09 (m, 2H), 0,80 (t, 3H). LRMS [M+H] = 649,3.
Ejemplo 47
Síntesis de 5-(4-(3-((2-ammo-4-((1-hidroxihexan-2-M)ammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-47)
Figure imgf000135_0001
5-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-47) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 46, excepto porque se utilizó el Compuesto (Int-2) en lugar del Compuesto (Int-1), para proporcionar 5-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de (s)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-47) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (DMs O): 57,54 (s, 1H), 7,43 (s, 3H), 7,22 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 6,28 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,67 (d, 1H), 5,50 (d, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,39 (s, 1H), 4,22 (m, 2H), 3,89 (s, 3H), 3,36 (m, 4H), 3,28 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,82 (m, 8H), 2,72 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,34 (m, 2H), 1,15 (m, 2H), 0,86 (m, 2H), 0,77 (t, 3H). LRMS [M+H] = 679,3.
Ejemplo 48
Síntesis de ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(((S)-1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-48)
Figure imgf000135_0002
Un matraz de fondo re4dondo se cargó con 5-(4-(3-((2-amino-4-((1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de (S)-2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-47) (1,0 eq), Boc-Lys-OH (2,0 eq), DIEA (5,0 eq) y DMF (30 mM). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y los componentes volátiles se separaron en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó utilizando RP-HPLC (t Fa al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para obtener ácido (S)-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(((S)-1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)-2-((terc.-butoxicarbonil)amino)hexanoico lCm S [M+1] = 810,5. Ácido (S)-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(((S)-1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)-2-((terc.-butoxicarbonil)amino)hexanoico se trató con TFA al 30% en volumen en DCM 0,1 M y los componentes volátiles se separaron en vacío para obtener ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(((S)-1-hidroxihexan-2-il)amino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-48) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,49 (m, 2H), 7,21 (d, 1H), 6,77 (s, 1H), 6,29 (d, 1H), 5,68 (d, 1H), 5,50 (d, 1H), 4,36 (m, 1H), 4,20 (m, 2H), 3,99 (S, 3H), 3,93 (m, 1H), 3,76 (m, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,19 (m, 4H), 2,44 (t, 2H), 2,24 (t, 2H), 2,16 (m, 4H), 1,88 (m, 4H), 1,51 (m, 2H), 1,25 (m, 6H), 1,03 (m, 2H), 0,84 (t, 3H). LRMS [M+H] = 710,3.
Ejemplo 49
Síntesis de ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-49)
Figure imgf000135_0003
Ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-49) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 48, excepto porque se utilizó el Compuesto (C-46) en lugar del Compuesto (C-47), para proporcionar ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-49) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,01 (d, 1H), 6,78 (d, 1H), 6,23 (s, 1H), 5,56 (s, 2H), 4,07 (m, 2H), 3,95 (s, 3H), 3,79 (m, 1H), 3,73 (m, 2H), 3,55 (m, 2H), 2,98 (m, 4H), 2,43 (t, 2H), 2,23 (t, 2H), 2,04 (m, 4H), 1,89 (m, 4H), 1,54 (m, 6H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 680,4.
Ejemplo 50
Síntesis de 5-((3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencM)piperazm-1-il)propil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-50)
Figure imgf000136_0001
5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-50) se preparó siguiendo un procedimiento similar al del Ejemplo 46, excepto que se utilizó Compuesto (C-19) en lugar de Compuesto (Int-1) para proporcionar 5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo (C-50) en forma de un sólido de la sal de TFA: 1H RMN (d Ms O): 58,00 (s, 1H), 7,40 (m, 4H), 7,02 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,55 (d, 1H), 6,21 (d, 1H), 5,53 (s, 2H), 3,83 (, m, 5H), 3,00 (m, 8H), 2,81 (m, 4H), 2,69 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 1,84 (m, 2H), 1,75 (m, 4H), 1,45 (m, 2H), 1,22 (m, 4H), 1,09 (m, 4H), 0,80 (t, 3H). LRMS [M+H] = 706,4.
Ejemplo 51
Síntesis de ácido (S)-2-amino-6-(5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-51)
Figure imgf000136_0002
Ácido (S)-2-amino-6-(5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-51) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 48, excepto porque se utilizó el Compuesto (C-50) en lugar del Compuesto (C-47), para proporcionar ácido (S)-2-amino-6-(5-((3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)propil)amino)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-51) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,35 (d, 1H), 7,12 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,75 (d, 1H), 6,22 (s, 1H), 5,52 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,86 (t, 1H), 3,71 (s, 2H), 3,54 (, m, 2H), 3,22 (m, 8H), 3,05 (m, 2H), 2,82 (m, 2H), 2,21 (m, 4H), 1,89 (m, 4H), 1,53 (m, 6H), 1,30 (m, 4H), 1,18 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 737,4.
Ejemplo 52
Síntesis de 5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-52)
Figure imgf000136_0003
5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (C-52) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 46, excepto que se utilizó el Compuesto (Int-3) en lugar del Compuesto (Int-1) para proporcionar 5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1 -ilo (C-52) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LRMS [M+H] = 649,4.
Ejemplo 53
Síntesis de ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-53)
Figure imgf000137_0001
Ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-53) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 48, excepto que se utilizó el Compuesto (C-52) en lugar del Compuesto (C-47) para proporcionar ácido (S)-2-amino-6-(5-(4-(3-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-4-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanamido)hexanoico (C-53) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (DMSO): 58,22 (s, 3H), 7,79 (t, 1H), 7,51 (s, 2H), 7,42 (m, 2H), 7,27 (t, 1H), 7,17 (d, 1H), 6,61 (s, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,05 (m, 2H), 3,87 (s, 5H), 3,42 (m, 3H), 3,02 (m, 3H), 2,89 (m, 2H), 2,31 (t, 2H), 2,09 (t, 2H), 1,72 (m, 4H), 1,41 (m, 5H), 1,22 (m, 2H), 1,07 (m, 2H), 0,83 (t, 3H). LRMS [M+H] = 680,4.
Ejemplo 54
Síntesis de 5-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencN)piperazm-1-il)-5-oxopentanoato de perfluorofenilo (C-54)
Figure imgf000137_0002
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), DIEA (3,0 equiv.), glutarato de bis(perfluorofenilo) (2,0 equiv.) y DMF (0,01 M). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas y después la mezcla de reacción bruta se purificó por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) proporcionando 5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-5-oxopentanoato de perfluorofenilo (C-54) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA. LCMS [M+1] = 718,4.
Nota: Glutarato de bis(perfluorofenilo) se preparó mediante adición de dicloruro de glutamilo (1,0 equiv.), THF (0,15 M) y trietilamina (2,2 equiv.) a un matraz de fondo redondo y enfriando la mezcla de reacción a 0 °C. Luego se añadió lentamente una solución de 2,3,4,5,6-pentafluorofenol (2,1 equiv.) en THF (1,2 M). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtró a través de gel de sílice y luego se concentró en vacío. El residuo se purificó mediante columna de gel de sílice eluida con hexano-acetato de etilo (9:1) y se concentró para dar glutarato de bis(perfluorofenilo) en forma de un sólido.LCMS [M+23] = 487,2.
Ejemplo 55
Síntesis de 3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-55)
Figure imgf000137_0003
3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-55) se preparó en forma de un sólido en forma de la sal de TFA siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 54, excepto que se utilizó 3,3'-oxidipropanoato de bis(perfluorofenilo) en lugar de glutarato de bis(perfluorofenilo). 1H RMN (Acetonitrilo-da) 57,33 (d, 1H), 7,30 (d, 1H), 6,95 (d, 1H), 6,73 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 6,06 (m, 1H), 5,43 (s, 2H), 4,18 (s, 2H), 3,92 (s, 3H), 3,81 (t, 2H), 3,74 (t, 2H), 3,47 (m, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,60 (t, 2H), 2,14 (d, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,15 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 748,4. 19F RMN (471 MHz, Acetonitrilo-ds) 5 -154,71 (d, 2F), -160,40 (d, 1F), -164,57 (dd, 2F).
Ejemplo 56
Síntesis de 3-(2-(3-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-56)
Figure imgf000138_0001
3-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-56) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 54, excepto que se utilizó 3,3'-(etano-1,2-diilbis(oxi))dipropanoato de bis(perfluorofenilo) en lugar de glutarato de bis(perfluorofenilo) para obtener 3-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-54). LRMS [M+H] = 792,4.
Ejemplo 57
Síntesis de ácido (S)-2-amino-6-(3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanamido)hexanoico (C-57)
Figure imgf000138_0002
Un matraz de fondo re4dondo se cargó con 3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanoato de perfluorofenilo (C-55) (1,0 equiv), Boc-Lys-OH (2,0 equiv), DIEA (5,0 equiv.) y DMF (30 mM). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y los componentes volátiles se separaron en vacío. La mezcla de reacción bruta se purificó utilizando RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para obtener ácido (S)-6-(3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanamido)-2-((terc.-butoxicarbonil)amino)hexanoico. LCMS [M+1] = 810,5. El compuesto protegido con boc se trató con TFA al 30% en volumen en DCM 0,1 M y luego los componentes volátiles se separaron en vacío para obtener ácido (S)-2-amino-6-(3-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)propanamido)hexanoico (C-57) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (DMSO): 58,18 (m, 3H), 7,80 (s, 1H), 7,41 (m, 4H), 7,18 (s, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,59 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,56 (s, 2H), 4,24 (m, 1H), 3,86 (m, 7H), 3,56 (m, 4H), 3,44 (m, 4H), 3,01 (m, 4H), 2,60 (m, 2H), 2,28 (m, 2H), 1,74 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,38 (m, 3H), 1,21 (m, 3H), 1,09 (m, 2H), 0,80 (t, 3H). LCMS [M+1] = 710,5.
Ejemplo 58
Síntesis de N-(15-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecil)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (C-58)
Figure imgf000138_0003
N-(15-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecil)-5-((3aS,4s,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (C-58) se preparó siguiendo un procedimiento similar al Ejemplo 46, excepto que se utilizó 17-oxo-21-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)-4,7,10,13-tetraoxa-16-azahenicosan-1-oato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo en lugar de glutarato de disuccinimidal para proporcionar N-(15-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadecil)-5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahidro-1H-tieno[3,4-d]imidazol-4-il)pentanamida (C-58) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (DMSO): 57,84 (m, 2H), 7,42 (m, 4H), 7,22 (m, 1H), 6,94 (d, 1H), 6,56 (d, 1H), 6,42 (s, 1H), 6,37 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,29 (m, 2H), 4,11 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 3,60 (m, 4H), 3,48 (m, 16H), 3,37 (m, 4H), 3,16 (m, 4H), 3,08 (m, 2H), 2,80 (m, 1H), 2,56 (m, 2H), 2,05 (m, 2H), 1,58 (m, 1H), 1,45 (m, 5H), 1,23 (m, 4H), 1,07 (m, 2H), 0,80 (t, 3H). LRMS [M+H] = 911,6.
Ejemplo 59
Síntesis de 4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencM)piperazma-1-carboxilato de 4-((R)-6-ammo-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-M)propanamido)-3-fenilpropanamido)hexanamido)bencilo (C-59)
Figure imgf000139_0001
4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((R)-6-amino-2-((S)-2-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)-3-fenilpropanamido)hexanamido)bencilo (C-59) se preparó en forma de un sólido en forma de la sal de TFA de acuerdo con el esquema mostrado para el Ejemplo (C-30), excepto que se utilizó ((S)-1-(((R)-6-amino-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxohexan-2-il)amino)-1-oxo-3-fenilpropan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo en lugar de ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo en la primera etapa: 1H RMN (CD3OD): 58,26 (d, 1H), 7,91 (t, 1H), 7,61 (d, 2H), 7,35 (m, 3H), 7,25 (m, 3H), 7,19 (m, 3H), 7,03 (d, 1H), 6,79 (d, 1H), 6,76 (s, 2H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 4,41 (m, 1H), 4,33 (s, 2H), 3,98 (t, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,70 (m, 3H), 3,54 (t, 2H), 3,24 (m, 4H), 3,10 (m, 1H), 3,02 (m, 1H), 2,83 (m, 1H), 2,47 (t, 2H), 1,92 (m, 2H), 1,52 (m, 4H), 1,42 (m, 2H), 1,30 (m, 3H), 1,18 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 1013,5.
Ejemplo 60
Síntesis de 4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencilo (C-60)
Figure imgf000139_0002
4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carboxilato de 4-((S)-2- ((S)-2-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)-3-metilbutanamido)propanamido)bencilo (C-60) se preparó en forma de un sólido en forma de la sal de TFA de acuerdo con el esquema mostrado para el Ejemplo (C-30), excepto que se utilizó ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo en lugar de ((S)-3-metil-1-(((S)-1-((4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenil)amino)-1-oxo-5-ureidopentan-2-il)amino)-1-oxobutan-2-il)carbamato de (9H-fluoren-9-il)metilo en la primera etapa: 1H RMN (CD3OD): 59,65 (s, 1H), 8,20 (d, 1H), 7,97 (d, 1H), 7,60 (m, 2H), 7,34 (m, 2H), 7,31 (s, 1H), 7,22 (d, 1H), 7,03 (d, 1H), 6,80 (m, 2H), 6,77 (s, 2H), 6,23 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 4,48 (t, 1H), 4,31 (s, 3H), 4,15 (t, 1H), 3,95 (m, 4H), 3,68 (m, 4H), 3,62 (m, 2H), 3,53 (m, 8H), 2,49 (t, 2H), 2,11 (m, 1H), 1,52 (m, 2H), 1,44 (d, 3H), 1,28 (m, 2H), 1,18 (m, 2H), 0,98 (m, 6H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 952,6.
Ejemplo 61
Síntesis de ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3- metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-61)
Figure imgf000140_0001
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargo con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), HOAT (2,0 equiv.), base de Huenig (14,0 equiv.), triacetato de (3s,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-((((4-nitrofenoxi)carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,2 equiv.) y piridina:DMF (1:4, 0,015 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en a Cn : TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar triacetato de (3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo en forma de un sólido: LCMS [M+H] = 1212,4.
Etapa 2: Triacetato de (3S,4R,5R,6R)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,0 equiv.) se disolvió en MeOH, THF y agua (2:1:0,4) (0,005 M). Luego se añadió LiOH (8,0 equiv.) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico en forma de un sólido: Lc Ms [M+H] = 850,4.
Etapa 3: Un matraz de fondo redondo se cargó con ácido (2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (1,0 equiv.), ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico (2,0 equiv.), base de Huenig (6,0 equiv.), HBTU (1,8 equiv.) y DMF (0,003 M). La reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en a Cn : TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-61) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 1001,3.
Ejemplo 62
Síntesis de ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-N)metN)-3-metoxibencM)piperazma-1-carbonM)oxi)metM)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirroM-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-62)
Figure imgf000140_0002
Ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-carbonil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-62) se preparó en forma de un sólido en forma de la sal de TFA de acuerdo con el esquema mostrado para el Ejemplo (C-61), excepto que se utilizó ácido 3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanoico en lugar de ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1 -il)propanoico en la última etapa: 1H RMN (CD3OD): 5 8,20 (d, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,21 (m, 2H), 7,05 (m, 1H), 6,99 (d, 1H), 6,78 (m, 3H), 6,23 (d, 1H), 5,55 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 3,92 (m, 4H), 4,81 (d, 1H), 4,00 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,89 (d, 1H), 3,62 (m, 9H), 3,53 (m, 8H), 2,90 (m, 3H), 2,66 (t, 2H), 2,37 (t, 2H), 1,51 (m, 2H), 1,29 (m, 2H), 1,17 (m, 2H), 0,87 (t, 3H). LRMS [M+H] = 1045,4.
Ejemplo 63
Síntesis de N-(2-((5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanamida (C-63)
Figure imgf000141_0001
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-5-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentN-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo (1,3 equiv.), base de Huenig (20,0 equiv.) y DMF (0,03 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-metil-4-(metildisulfanil)pentan-1-ona en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 614,3.
Etapa 2: Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentNamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-metil-4-(metildisulfanil)pentan-1-ona (1,0 equiv.), (2s ,3S)-1,4-dimercaptobutano-2,3-diol (1,0 equiv.) y dimetilacetamida:H2O (1:1, 0,03 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego por RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pmmidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-mercapto-4-metilpentan-1-ona en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 568,3.
Etapa 3: Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-mercapto-4-metilpentan-1-ona (1,0 equiv.), 2-pi ridi n-2-ildisulfanil)etan-1-amina sal HCl (2,0 equiv.), base de Huenig (10,0 equiv.) y THF:PBS (1:1, 0,03 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción bruta se purificó luego utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-mercapto-4-((2-aminoetil)disulfanil)-4-metilpentan-1-ona en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 643,4.
Etapa 4: Un matraz de fondo redondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-((2-aminoetil)disulfanil)-4-metilpentan-1-ona (1,0 equiv.), ácido 3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)propanoico (1,0 equiv.), base de Huenig (5,0 equiv.), HATU (1,0 equiv.) y DMF (0,02 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar N-(2-((5-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-metil-5-oxopentan-2-il)disulfanil)etil)-3-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -il)propanamida (C-63) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,37 (d, 1H), 7,26 (d, 1H), 7,08 (m, 1H), 6,83 (d, 1H), 6,81 (s, 2H), 6,24 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,37 (s, 2H), 4,20 (a, 4H), 3,97 (s, 3H), 3,75 (t, 2H), 3,55 (t, 2H), 3,38 (m, 2H), 3,38 (a, 4H), 2,72 (t, 2H), 2,55 (m, 2H), 2,45 (t, 2H), 1,89 (m, 2H), 1,54 (m, 2H), 1,31 (m, 8H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 794,4.
Ejemplo 64
Síntesis de 1-(4-(4-((2-ammo-4-(pentNammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencN)piperazm-1-il)-4-metil-4-(metiltio)pentan-1-ona (C-64)
Figure imgf000142_0001
1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-metil-4-(metiltio)pentan-l-ona (C-63) se preparó siguiendo el procedimiento descrito para el compuesto intermedio Int-1, excepto utilizando 4-metil-4-(metiltio)-1-(piperazin-1-il)pentan-1-ona en lugar de piperazina-1-carboxilato de terc.-butilo en la etapa 3. La mezcla de reacción bruta se purificó luego utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-4-metil-4-(metiltio)pentan-1-ona (C-64) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,05 (m, 1H), 6,81 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,58 (s, 2H), 4,34 (s, 2H), 3,90 (a, 4H), 3,96 (s, 3H), 3,55 (t, 2H), 3,28 (a, 4H), 2,55 (m, 2H), 1,95 (s, 3H), 1,80 (m, 2H), 1,54 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,27 (s, 6H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 582,4.
Ejemplo 65
Síntesis de ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-65)
Figure imgf000142_0002
Etapa 1: Un matraz de fondo redondo se cargó con 2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etan-1-ol (C-68) (1,0 equiv.), triclorofosfano (3,0 equiv.), trietilamina (9,0 equiv.) y THF (0,2 M) a 0°C y se deja agitar durante 1 h. La reacción se enfrió luego bruscamente mediante la adición lenta de agua helada y se lavó con EtOAc 3 veces. La capa acuosa que contenía el producto deseado se liofilizó a continuación. Hidrógeno-fosfato de 2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etilo se aisló y se utilizó en la siguiente etapa sin purificación adicional: LCMS [M+H] = 546,3.
Etapa 2: Un matraz de fondo redondo se cargó con triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-(hidroximetil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,0 equiv.), hidrógeno-fosfato de 2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etilo (2,0 equiv.), cloruro de pivaloílo (42,0 equiv.) y piridina (0,03 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. En este punto se añadió diyoduro (1,06 equiv.) en piridina:H2O (1:0,1, 0,14 M) y la mezcla se agitó durante 10 min. La mezcla de reacción bruta se purificó luego utilizando RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para obtener triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5 il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 1292,5.
Etapa 3: Un matraz de fondo redondo se cargó con triacetato de (2S,3R,4S,5S,6S)-2-(2-(3-((((9H-fluoren-9-il)metoxi)carbonil)amino)propanamido)-4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)fenoxi)-6-(metoxicarbonil)tetrahidro-2H-piran-3,4,5-triilo (1,0 equiv.), hidróxido de litio-H2O (10,0 equiv.) y MeOH:H2O (3:1,5, 0,007 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó luego utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: LCMS [M+H] = 930,4.
Etapa 4: Un matraz de fondo redondo se cargó con ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)-2-(3-aminopropanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (1,0 equiv.), ácido 3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-il)etoxi)propanoico (1,0 equiv.), base de Huenig (6,0 equiv.), HATU (1,0 equiv.) y DMF (0,005 M). La reacción se mantuvo agitando a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de reacción se purificó luego por RP-HPLC (TFA al 0,035% en ACN: TFA al 0,05% en H2O, columna C18) para proporcionar ácido (2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazina-1-il)etoxi)(hidroxi)fosforil)oxi)metil)-2-(3-(3-(2-(2,5-dioxo-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-il)etoxi)propanamido)propanamido)fenoxi)-3,4,5-trihidroxitetrahidro-2H-piran-2-carboxílico (C-65) en forma de un sólido en forma de la sal de TFA: 1H RMN (CD3OD): 58,19 (s, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,14 (m, 3H), 6,79 (s, 2H), 6,77 (d, 1H), 6,22 (d, 1H), 5,53 (s, 2H), 4,86 (s, 2H), 4,84 (d, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,95 (d, 1H), 3,92 (s, 3H), 4,00 (a, 4H), 3,76 (s, 2H), 3,62 (m, 5H), 3,53 (m, 10H), 3,27 (m, 2H), 2,85 (m, 4H), 2,63 (m, 2H), 2,37 (t, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,17 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H/2Z] = 563,4.
Ejemplo 66
Síntesis de ácido (2R,2'R)-3,3'-((2-((2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencN)piperazm-1-N)-2-oxoetoxi)immo)propano-1,3-diN)bis(sulfanodiN))bis(2-ammopropanoico (C-66)
Figure imgf000143_0001
Un matraz de fondo re4dondo se cargó con 1-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-aminooxi)etan-1-ona (C-35) (2,4 equiv), ácido (2R,2'R)-3,3'-((2-oxopropano-1,3-diil)bis(sulfanodiil))bis(2-aminopropanoico (1,0 equiv.) y etanol (0,02 M). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de reacción bruta se purificó utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar ácido (2R,2'R)-3,3'-((2-((2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pi rimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-2-oxoetoxi)imino)propano-1,3-diil)bis(sulfanodiil))bis(2-aminopropanoico (C-66) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,35 (d, 1H), 7,28 (d, 1H), 7,05 (m, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,23 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,32 (s, 2H), 4,20 (m, 1H), 4,05 (m, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,81 (m, 4H), 3,55 (m, 2H), 3,44 (m, 2H), 3,20 (m, 4H), 2,96 (m, 1H), 2,88 (m, 1H), 1,53 (m, 2H), 1,31 (m, 2H), 1,18 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 789,3.
Ejemplo 67
Síntesis de ácido (R)-2-amino-6-((((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)metil)-17-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-10,17-dioxo-8,14-dioxa-4-tia-7,11-diazaheptadec-6-enoico (C-67)
Figure imgf000144_0001
Un matraz de fondo re4dondo se cargó con N-(2-(3-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-3-oxopropoxi)etil)-2-(aminooxi)acetamida (C-37) (2,4 equiv), ácido (2R,2'R)-3,3'-((2-oxopropano-1,3-diil)bis(sulfanodiil))bis(2-aminopropanoico (1,0 equiv) y etanol (0,02 M). La mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de reacción bruta se purificó utilizando RP-C18 ISCO (ACN:H2O, con TFA como modificador) y luego se liofilizó para dar ácido (R)-2-amino-6-((((R)-2-amino-2-carboxietil)tio)metil)-17-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)-10,17-dioxo-8,14-dioxa-4-tia-7,11-diazaheptadec-6-enoico (C-67) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,36 (d, 1H), 7,29 (d, 1H), 7,07 (m, 1H), 6,80 (d, 1H), 6,24 (d, 1H), 5,57 (s, 2H), 4,57 (s, 2H), 4,31 (m, 2H), 4,11 (m, 1H), 4,03 (m, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,86 (a, 4H), 3,73 (t, 2H), 3,54 (m, 6H), 3,40 (m, 2H), 3,20 (m, 8H), 2,96 (m, 2H), 2,67 (t, 2H), 1,52 (m, 2H), 1,30 (m, 2H), 1,19 (m, 2H), 0,88 (t, 3H). LRMS [M+H] = 904,4.
Ejemplo 68
Síntesis de 2-(4-(4-((2-ammo-4-(pentMammo)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidm-5-M)metM)-3-metoxibencM)piperazm-1-il)etan-1-ol (C-68)
Figure imgf000144_0002
Un matraz de fondo redondo se cargó con 5-(2-metoxi-4-(piperazin-1-ilmetil)bencil)-N4-pentil-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidina-2,4-diamina (Int-1, 1,0 equiv.), 2-bromoetan-1-ol (1,3 equiv.), trietilamina (20,0 equiv.) y acetonitrilo (0,03 M). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción bruta se purificó entonces mediante cromatografía ISCO (MeOH al 0 - 10%:DCM) para proporcionar 2-(4-(4-((2-amino-4-(pentilamino)-5H-pirrolo[3,2-d]pirimidin-5-il)metil)-3-metoxibencil)piperazin-1-il)etan-1-ol (C-68) en forma de un sólido: 1H RMN (CD3OD): 57,22 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 6,83 (d, 1H), 6,55 (d, 1H), 6,10 (d, 1H), 5,39 (s, 2H), 3,93 (s, 3H), 3,66 (t, 2H), 3,50 (s, 2H), 3,32 (m, 2H), 3,20 (s, 1H), 2,51 (m, 10H), 1,37 (m, 2H), 1,27 (m, 2H), 1,25 (s, 1H), 1,12 (m, 2H), 0,86 (t, 3H). LRMS [M+H] = 482,4.
Ejemplo 69
Compuestos de Fórmula (I) se ensayaron para medir su actividad como agonistas del receptor 7 tipo toll.
Ensayo del gen in form ador
Células del riñón embrionario humano 293 (HEK293) se transfectaron de manera estable con TLR7 humano y un vector informador de luciferasa dirigido por NF-kB (pNifty-Luciferase). Como ensayo de control, se utilizaron HEK293 normales transfectadas con pNifty-Luc. Las células se cultivaron en DMEM complementado con L-glutamina 2 mM, FBS inactivado por calor al 10%, penicilina y estreptomicina al 1%, puromicina 2 |jg/ml (InvivoGen n° ant-pr-5) y 5 |jg/ml de blasticidina (Invitrogen n° 46- 1120). El tampón de ensayo Bright-Glo™ Luciferase y sustrato y fueron suministrados por Promega n° E263B y n° E264B (sustrato de ensayo y tampón, respectivamente). Greiner bio-one (n° 789163-G) suministró placas de fondo transparente de 384 pocillos y fueron placas personalizadas con código de barras.
Las células se colocaron en placas a razón de 25.000 células/pocillo en placas de 384 pocillos en un volumen final de 50 j l de medio. Se permitió que las células se adhirieran a las placas después de un cultivo durante la noche (18 horas) a 37°C y 5% de CO2. Los compuestos de control positivo y experimental diluidos en serie se dispensaron luego a cada uno de los pocillos y se incubaron durante 7 horas a 37°C y 5% de CO2. Las células estimuladas con DMSO solo también sirven como controles negativos. Después de la incubación, se añadieron 30 j l del tampón de ensayo de premezcla y tampón de sustrato a cada uno de los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La señal de luminiscencia se leyó en una máquina CLIPR con un tiempo de integración de 20 segundos por placa.
Se generan curvas de dosis-respuesta para cada uno de los compuestos y se determinaron los valores de CE50 como la concentración que da el 50% de la señal máxima.
Resultados de Ensayo Seleccionado
Diversos compuestos de Fórmula (I), en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, exhiben propiedades farmacológicas, por ejemplo, según se indicado por los tests in vitro descritos en esta solicitud. El valor de CE50 en esos experimentos se da como la concentración del compuesto de ensayo en cuestión que provoca una respuesta a medio camino entre la respuesta inicial y la máxima. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 2 |jM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 1 j M. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 500 nM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 250 nM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 100 nM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 50 nM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 25 nM. En otros ejemplos, compuestos de Fórmula (I) tienen valores de CE50 en el intervalo de 1 nM a 10 nM.
Para ilustrar la actividad in vitro de los compuestos de la invención, los valores de CE50 para la estimulación de TLR7 por ciertos compuestos de Fórmula (I) se enumeran en la Tabla 2. Se cree que el aducto de cisteína son supuestos catabolitos que surgen de la degradación dentro del lisosoma. (Bioconjugate Chem. 2006, 17, 114-124). Ciertos compuestos de la Tabla 2 son el resultado de la derivatización del compuesto original correspondiente con cisteína.
Tabla 2
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Ejemplo 70
Generación de conjugados de agonistas de TLR7 anti-HER2 por conjugación de agonistas de TLR7 a residuos cisteína específicos de mutantes de anticuerpos anti-HER2
Preparación de anticuerpo anti-HER2 con mutaciones específicas para Cisteína (Cvs)
La preparación de anticuerpos anti-HER2, p. ej., trastuzumab, con mutaciones de cisteína específicas del sitio se ha descrito previamente en los documentos WO 2014/124316 y WO 2015/138615. Brevemente, el ADN que codifica regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo anti-HER2, p. ej., trastuzumab, se sintetizó químicamente y se clonó en dos vectores de expresión de mamíferos, pOG-HC y pOG-LC, que contienen regiones constantes de IgG1 humana y cadena ligera kappa humana. Los vectores contienen un promotor de CMV y una secuencia señal: MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA (SEQ ID NO: 27). Se empleó mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para preparar construcciones mutantes Cys del anticuerpo anti-HER2, y las secuencias de construcciones mutantes Cys se confirmaron mediante secuenciación de ADN.
Por ejemplo, la cisteína se puede introducir en una o más de las siguientes posiciones (todas las posiciones por numeración de la UE) en un anticuerpo anti-HER2: (a) posiciones 152, 360 y/o 375 de la cadena pesada del anticuerpo, y (b) posiciones 107, 159 y/o 165 de la cadena ligera de anticuerpos. Por ejemplo, la cisteína se puede introducir en la posición 152 de la cadena pesada, dando como resultado un mAb4 anti-HER2, que tiene una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 30.
Mutantes Cys del anticuerpo anti-HER2 se expresaron en células 293 Freestyle™ co-transfectando plásmidos de cadena pesada y cadena ligera utilizando métodos de transfección transitoria tal como se describió previamente (Meissner, et al., Biotechnol Bioeng. 75:197-203 (2001)). Los anticuerpos expresados se purificaron de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar.
Se utilizaron métodos similares para clonar regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de trastuzumab en dos vectores para la expresión en células CHO. El vector de la cadena pesada codifica la región constante del anticuerpo IgG1 humano, incluye un péptido señal (MPLLLLLPLLWAGALA) (Se Q ID NO: 28), un promotor CMV para impulsar la expresión de la cadena pesada y secuencias señal y de selección apropiadas para la transfección estable en Células CHO. El vector de la cadena ligera codifica la región constante de la cadena ligera kappa humana, incluye un péptido señal (MSVLTQVLALLLLWLTGTRC) (SEQ ID NO: 29), un promotor CMV para impulsar la expresión de la cadena ligera y secuencias señal y de selección apropiadas para una transfección estable en células CHO. Para producir anticuerpos, un vector de cadena pesada y un vector de cadena ligera se co-transfectaron en una línea celular CHO. Las células se sometieron a selección, y las células transfectadas de forma estable se cultivaron en condiciones optimizadas para la producción de anticuerpos. Los anticuerpos se purificaron de los sobrenadantes celulares mediante cromatografía de afinidad de proteína A estándar.
Se realizaron mutaciones adicionales en la región constante de los vectores de anticuerpos utilizando métodos de mutagénesis estándares.
Reducción, re-oxidación y conjugación de anticuerpos anti-HER2 mutantes Cys contra agonistas de TLR7
Compuestos de Fórmula (I) de la invención que comprenden un enlazador se conjugaron con residuos Cys modificados genéticamente en un anticuerpo utilizando métodos descritos en Junutula JR, y col., Nature Biotechnology 26:925-932 (2008).
Debido a que los residuos Cys modificados genéticamente en anticuerpos expresados en células de mamíferos son modificados por aductos (disulfuros) tales como el glutatión (GSH) y/o la cisteína durante la biosíntesis (Chen et al.
2009), la Cys modificada tal como se expresó inicialmente no reacciona a los reaccionantes reactivos de tiol tales como grupos maleimido o bromo-acetamida o yodo-acetamida. Para conjugar los residuos Cys modificados genéticamente, aductos de glutatión o cisteína deben separarse mediante la reducción de disulfuros, lo que generalmente implica la reducción de todos los disulfuros en el anticuerpo expresado. Esto puede lograrse exponiendo primero el anticuerpo a un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT), seguido de una re-oxidación de todos los enlaces disulfuro nativos del anticuerpo para restaurar y/o estabilizar la estructura funcional del anticuerpo. Por consiguiente, para reducir los enlaces disulfuro nativos y el enlace disulfuro entre los aductos de cisteína o GSH de los residuos Cys modificados genéticamente, se añadió DTT recién preparado a mutantes Cys previamente purificados de trastuzumab, a una concentración final de 10 mM o 20 mM. Después de la incubación de anticuerpos con DTT a 37°C durante 1 hora, se dializaron mezclas contra PBS durante tres días con intercambio de tampón diario para separar el DTT y re­ oxidar los enlaces disulfuro nativos. El proceso de re-oxidación se controló mediante HPLC de fase inversa, que es capaz de separar el tetrámero de anticuerpos de las moléculas individuales de cadena pesada y ligera. Las reacciones se analizaron en una columna PRLP-S 4000A (50 mm x 2,1 mm, Agilent) calentada a 80°C y la elución de la columna se realizó mediante un gradiente lineal de acetonitrilo al 30-60% en agua que contenía TFA al 0,1% a un caudal de 1,5 ml / min. La elución de las proteínas de la columna se controló a 280 nm. Se permitió que continuara la diálisis hasta que se completara la re-oxidación. La re-oxidación restaura los disulfuros intra-cadena e inter-cadena, mientras que la diálisis permite que las cisteínas y los glutationes conectados a los residuos Cys recientemente introducidos se separen por diálisis.
Después de la re-oxidación, se añadieron compuestos que contienen maleimida a anticuerpos re-oxidados en tampón PBS (pH 7,2) en relaciones típicamente de 1,5:1, 2:1 o 5:1 a Cys modificadas genéticamente, y se realizaron incubaciones durante 1 hora. . Típicamente, el exceso de compuesto libre se separó mediante purificación sobre resina de Proteína A mediante métodos estándares, seguido de intercambio de tampón en PBS.
Mutantes Cys del anticuerpo anti-HER2, p. ej., trastuzumab, se redujeron alternativamente y se re-oxidaron utilizando un método sobre resina. Perlas de Proteína A Sepharose (1 ml por cada 10 mg de anticuerpo) se equilibraron en PBS (sin sales de calcio o magnesio) y luego se añadieron a una muestra de anticuerpo en modo discontinuo. Se preparó un material de cisteína 0,5 M disolviendo 850 mg de cisteína HCI en 10 ml de una solución preparada añadiendo 3,4 g de NaOH a 250 ml de fosfato de sodio 0,5 M pH 8,0 y luego se añadió cisteína 20 mM a la suspensión de anticuerpo/perla y se mezcló suavemente a temperatura ambiente durante 30-60 minutos. Las perlas se cargaron en una columna de gravedad y se lavaron con 50 volúmenes de lecho de PBS en menos de 30 minutos, luego la columna se tapó con perlas resuspendidas en un volumen de lecho de PBS. Para modular la velocidad de re-oxidación, se añadió opcionalmente cloruro de cobre 50 nM a 1 |jM. El progreso de la re-oxidación se controló separando una pequeña muestra de ensayo de la resina, eluyendo en tampón de elución de IgG (Thermo) y analizando por RP-HPLC tal como se describió arriba. Una vez que la re-oxidación progresó hasta la compleción deseada, la conjugación podría iniciarse inmediatamente mediante la adición de un exceso 2-3 molar de compuesto sobre cisteínas modificadas genéticamente, y permitiendo que la mezcla reaccionara durante 5-10 minutos a temperatura ambiente antes de lavar la columna con al menos 20 volúmenes de columna de PBS. Los conjugados de anticuerpos se eluyeron con tampón de elución de IgG y se neutralizaron con 0,1 volúmenes de fosfato de sodio 0,5 M pH 8,0 y el tampón se cambió a PBS. Alternativamente, en lugar de iniciar la conjugación con el anticuerpo en la resina, la columna se lavó con al menos 20 volúmenes de columna de PBS, y el anticuerpo se eluyó con tampón de elución de IgG y se neutralizó con tampón pH 8,0. Luego, los anticuerpos se utilizaron para reacciones de conjugación o se congelaron instantáneamente para uso futuro.
Propiedades de los conjugados agonistas anti-HER2-TLR7
Conjugados de anticuerpo-agonista de TLR7 se analizaron para determinar el grado de conjugación. Se extrapoló una relación de compuesto a anticuerpo a partir de datos de LC-MS para muestras reducidas y desglicosiladas. La LC/MS permite la cuantificación del número medio de moléculas de enlazador-carga útil (compuesto) unidas a un anticuerpo en una muestra conjugada. La HPLC separa el anticuerpo en cadenas ligera y pesada, y separa la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de acuerdo con el número de grupos de carga útil de enlazador por cadena. Los datos espectrales de masas permiten la identificación de las especies componentes en la mezcla, p. ej., LC, LC 1, LC 2, Hc , HC 1, HC 2, etc. A partir de la carga media en las cadenas LC y HC, se puede calcular la media de la relación compuesto a anticuerpo para un conjugado de anticuerpo. Una relación de compuesto a anticuerpo para una muestra de conjugado dada representa el número medio de moléculas de compuesto (enlazador-carga útil) unidas a un anticuerpo tetramérico que contiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.
Los conjugados se perfilaron utilizando cromatografía analítica de exclusión por tamaño (AnSEC) en columnas Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare) y/o Proteína KW-8035 jm 300 x 8 mm (Shodex); la agregación se analizó en base a la cromatografía analítica de exclusión por tamaño. Los conjugados también se perfilaron mediante cromatografía de interacción hidrofóbica analítica (AnHIC) en una columna TSKgel Butyl-NPR Tosoh Bioscience (King of Prussia, PA, EE.UU.) (100 mm x 4,6 mm, 2,5 jm ) instalada en un sistema Agilent 1260 LC (Santa Clara , CA, EE.UU.) utilizando un gradiente binario de tampón A (His-HCI 20 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 6,0) y tampón B (His-HCl 20 mM, isopropanol al 15%, pH 6,0) con muestras preparadas diluyendo aproximadamente 20 jg de anticuerpo (inicialmente en PBS) con 0,5 volúmenes de sulfato de amonio 3 M. El índice de hidrofobicidad se calcula contra una regresión lineal de cuatro muestras estándar de hidrofobicidad conocida. Se reseña la hidrofobicidad del pico más grande por área.
La mayoría de los conjugados alcanzaron una alta relación de compuesto a anticuerpo, fueron principalmente monoméricos y mostraron baja hidrofobicidad (alto índice de hidrofobicidad correspondiente a la elución temprana de la columna HlC). La conjugación a través de este método da como resultado eficiencias de conjugación superiores al 95% para la mayoría de los compuestos (Tabla 3). La mayoría de los conjugados contienen menos del 4% de material dimérico y oligomérico (Tabla 3). Un índice de hidrofobicidad (HI) de 0,80 o superior se considera una característica favorable . La mayoría de los conjugados mostraron valores de HI superiores a 0,8 (Tabla 3). Esto sugiere que los conjugados se pueden hacer de manera eficiente y tienen características favorables.
T l . Pr i n ni n i-HER2-TLR7
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Ejemplo 71
Generación de conjugados de agonistas anti-HER2-TLR7 a través de la reducción parcial de enlaces disulfuro nativos de anticuerpos anti-HER2 no modificados genéticamente
Algunos compuestos de la invención también se pueden conjugar con residuos cisteína nativos de anticuerpos no modificados genéticamente mediante un procedimiento que implica la reducción parcial de los anticuerpos (Doronina, S.O. et al., Nat. Biotechnol. 21, 778-784, 2003). Los enlaces disulfuro entre cadenas e intra-cadenas del anticuerpo anti-HER2 (a una concentración de 5 a 10 mg/ml) se redujeron primero parcialmente en PBS que contenía EDTA 2 mM añadiendo TCEP a una concentración final de 10 mM e incubando la mezcla a 37°C durante 1 hora. Después de la desalación y la adición de detergente PS-20 al 1% p/v, los anticuerpos parcialmente reducidos (1-2 mg/ml) se hicieron reaccionar durante la noche a 4°C con 0,5 a 1 mg de compuesto agonista de TLR7 por cada 10 mg de anticuerpo. Los conjugados resultantes se purificaron mediante cromatografía de Proteína A mediante métodos estándares y se intercambiaron tampones a PBS, y se perfilaron mediante MS, AnSEC y AnHIC tal como se describe arriba. La relación medida de compuesto a anticuerpo, el comportamiento de agregación y los datos de hidrofobicidad se resumen en la Tabla 3 para un ejemplo de conjugado realizado por reducción de mAb3 anti-HER2 seguido de conjugación con el Compuesto C-1.
Ejemplo 72
Generación de conjugados de agonistas anti-HER2-TLR7 utilizando 1,3-dicloropropan-2-ona para reconectar enlaces disulfuro intercadenas nativos de anticuerpos anti-HER2 no modificados genéticamente
En un método alternativo (Solicitud de Patente de Estados Unidos 20150150998), los enlaces disulfuro intercadenas de un anticuerpo anti-HER2 recombinante no modificado genéticamente pueden modificarse y conjugarse con un compuesto agonista de la invención utilizando las siguientes dos etapas.
Esquema 15
Conjugación en dos etapas con residuos cisteína nativos utilizando un puente de 1,3 dicloropropan-2-ona seguido de la adición a las cetonas introducidas.
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Etapa 1: Reducción de los puentes disulfuro intercadenas y re-puenteo con 1,3-dicloropropan-2-ona: TCEP • HCl (1,63 mM) se añadió a una solución de anticuerpo mAb3 anti-HER2 (136 |j M) y 1,3- dicloropropan-2-ona (33 mM) en tampón HEPES 0,1 M (pH 8,0) a 4°C. La mezcla resultante se agitó suavemente a 4°C durante 16 h. La mezcla de reacción se intercambió entonces con tampón en PBS utilizando una columna de desalación PD-10 (GE Healthcare). La solución resultante se concentró utilizando un filtro Amicon 50K para dar el anticuerpo anti-HER2 modificado. La modificación fue confirmada por ESI-MS (Eluyente A: agua ácido fórmico al 0,1%; Eluyente B: Acetonitrilo ácido fórmico al 0,04%; Gradiente: de 3 a 80% de B en 2 minutos - Caudal 1,0 ml/min. Columna: . Proswift Monolith 4,6*50 mm 40°C); 145398 Da (después de deglicosilación mediante PNGase F.
Etapa 2: Conjugación de los agonistas Compuesto (C-37): el anticuerpo anti-HER2 modificado (30 mg/ml) se hizo reaccionar con Compuesto (C-37) 3,0 mM que comprende un resto amino-oxi enlazado en tampón acetato de anilinio 0,1 M (pH 4,6) a una concentración final de 15% (v/v) de DMSO. La mezcla de reacción se incubó durante aproximadamente 16 horas a 23°C. La mezcla de reacción se intercambió entonces con tampón a PBS (pH 7,4) utilizando filtros Amicon 50K, dando lugar al conjugado compuesto-anti-HER2 modificado.
Se obtuvieron conjugados similares utilizando el Compuesto (C-35) para conjugar con el anticuerpo anti-HER2 modificado.
Los conjugados fueron perfilados por MS, AnSEC y AnHIC tal como se describió arriba. La relación medida de compuesto a anticuerpo, el comportamiento de la agregación y los datos de hidrofobicidad se resumen en la Tabla 3. Los dos conjugados de ejemplo lograron una alta relación de compuesto a anticuerpo, fueron principalmente monoméricos y mostraron una baja hidrofobicidad (alto índice de hidrofobicidad correspondiente a la elución temprana de la columna HIC). La conjugación a través de este método da como resultado eficiencias de conjugación superiores al 85% (Tabla 3). Los conjugados contienen menos del 2% de material dimérico y oligomérico (Tabla 3). Los conjugados mostraron valores de HI superiores a 0,85 (Tabla 3). Esto sugiere que los conjugados se pueden hacer de manera eficiente y tienen características favorables.
Ejemplo 73
Generación de conjugados de agonistas de TLR7 anti-HER2 por conjugación a residuos lisina nativos de anticuerpos anti-HER2
Los anticuerpos nativos pueden funcionalizarse con ciertos compuestos de la invención a través de métodos establecidos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-ratHER2 (7.16.4; adquirido de Bio X Cell; West Lebanon, NH) en PBS pH 7,2 a 4 mg/ml se mezcló con 760 j M de Compuesto C-47) con una concentración final de DMSO de 20% (v/v). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante la noche, y luego se enfrió bruscamente con T ris 50 mM pH 8. Se utilizaron métodos similares para preparar conjugados con mAb3 anti-HER2 o con Compuestos agonistas C-46 y C-50. Los conjugados de anticuerpos resultantes se purificaron por cromatografía de Proteína A por métodos estándares y se intercambió el tampón por PBS.
Los conjugados de anticuerpos fueron perfilados por MS, AnSEC y AnHIC tal como se describió arriba. La relación medida de compuesto a anticuerpo, el comportamiento de la agregación y los datos de hidrofobicidad se resumen en la Tabla 3. Varios conjugados de anticuerpos que habían reaccionado con lisina muestran elución tardía y/o colas de picos en las columnas AnSEC utilizadas, lo que sugiere la interacción de la columna, lo que hizo difícil la detección de agregado.
Ejemplo 74
Generación de conjugados agonistas de TLR7 anti-HER2 utilizando conjugación en dos etapas de un anticuerpo mutante anti-HER2 etiquetado con A1 con compuestos agonistas que contienen un grupo reactivo amino-oxi
La 4'-fosfopanteteinilación postraduccional es un método versátil para el marcaje específico para el sitio de proteínas recombinantes con moléculas pequeñas estructuralmente diversas (Yin J, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102: 15815-15820, 2005; Zhou Z, et al., ACS Chem. Biol. 2: 337-346, 2007). Este enfoque enzimático, que se basa en la acción catalítica de 4'-fosfopanteteinil transferasas (PPTasas) promiscuas, se adoptó para la preparación de conjugados de anticuerpos altamente homogéneos (véase el documento WO2013184514). El marcaje enzimático se logra incorporando secuencias de péptidos S6, ybbR y A1 de 11 o 12 meros en diversos sitios de la región constante de un anticuerpo. Por ejemplo, una etiqueta A1 de secuencia GDSLDMLEWSLM (SEQ ID NO: 31) se puede incorporar detrás del residuo E388 (numeración de la UE) en la cadena pesada del mAb2 anti-HER2 para producir mAb5 anti-HER2, que tiene una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO: 19 y una secuencia de cadena pesada de SEQ ID NO: 32. Una estrategia es un método de dos etapas para preparar conjugados de anticuerpo-compuesto específicos para el sitio mediante 4'-fosfopanteteinilación postraduccional (véase el documento WO2013184514). . La primera etapa de esta estrategia se basa en el marcaje catalizado por PPTasa de un anticuerpo etiquetado con péptidos con un análogo de CoA que contiene un grupo bioortogonal tal como un resto azido, alqueno, alquino, cetona o aldehído. Después de la purificación por afinidad del anticuerpo marcado bioortogonalmente, la segunda etapa del método de dos etapas implica la conjugación de un compuesto que comprende un resto reactivo con el grupo bioortogonal. A modo de ejemplo, la siguiente sección describe el método de dos etapas para anticuerpos mutantes anti-HER2 que contienen una inserción de etiqueta A1 en un sitio específico dentro de la región constante de la cadena pesada. Además, aunque el método de dos etapas se ejemplifica para la química de ligamiento de oxima, esta estrategia se puede extender a otras químicas bioortogonales, tales como la química clic, incluida la química clic sin cobre, el ligamiento de Staudinger, la química de clic basada en isonitrilo y el ligamiento de tetrazina
La química del ligamiento de oxima ha sido utilizada por varios grupos de investigación como un método bioortogonal eficiente para la preparación de conjugados de proteínas específicos para el sitio (Axup JY, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 109:16101-16106, 2012; Rabuka D , et al., Nat Protoc. 7:1052-1067, 2012). Con el fin de combinar la 4'-fosfopantetinilación postraduccional con ligamiento de oxima, se preparó un análogo de CoA modificado con cetona a partir de la molécula precursora de pantotenato correspondiente (Compuesto int-4) utilizando las enzimas biosintéticas de CoA CoAA, CoaD y CoAE (Worthington AS, Burkart MD (2006) Org Biomol Chem. 4:44-46) (Kosa NM, Haushalter RW, Smith AR, Burkart MD (2012) Nat Methods 9:981-984). Después, se utilizó la catálisis con PPTasa para conjugar enzimáticamente el grupo cetona bioortogonal con especificidad por un sitio en la etiqueta A1 incorporada de un anticuerpo anti-HER2. Específicamente, 2,5 |jM de mAb5 anti-HER2 se conjugaron con 30 |jM de análogo de cetona-CoA (Compuesto C-69) (12 equivalentes molares en relación con el anticuerpo) en presencia de aproximadamente 0,5 j M de AcpS PPTasa de Escherichia coli durante 2 días a 37°C en tampón Tris-HCl 75 mM (pH 8,0) complementado con MgCl2 12,5 mM y NaCl 20 mM. Para impulsar la reacción de conjugación a la compleción, la mezcla de reacción se complementó con Sfp PPTase de B. subtilius aproximadamente 1 j M, mientras que la concentración del Compuesto C-69 se incrementó a aproximadamente 60 j M. La reacción se incubó durante otros 4 días a temperatura ambiente. El marcaje del anticuerpo mAb5 anti-HER2 con el análogo de cetona-CoA (Compuesto C-69) se verificó obteniendo espectros ESI-MS desconvolucionados de la muestra reducida y desglicosilada. Las masas observadas estaban de acuerdo con los pesos moleculares calculados de las cadenas pesadas funcionalizadas con cetonas correspondientes. Después de separar las enzimas PPTasa y el exceso de análogo de cetona-CoA por cromatografía de afinidad de Proteína A (MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences), el anticuerpo activado con cetona, mAb5 anti-HER2-(C-69) se eluyó con tampón de elución Pierce™ IgG (Thermo Fisher Scientific) seguido de neutralización inmediata con tampón Tris-HCl 1 M (pH 8,0). La solución de anticuerpo neutralizado se intercambió con tampón en PBS y se concentró utilizando un filtro Amicon 50K.
La unión específica para el sitio de un grupo cetona permitió el ligamiento de oxima posterior de un compuesto agonista a mAb5 anti-HER2-(C-69) activado por cetona como lasegunda etapa del método de dos etapas. Se hicieron reaccionar 48 j M de anticuerpo funcionalizado con cetona con un exceso molar de 30 veces (1,4 mM) de los agonistas de aminooxi C-35 y C-37 en tampón acetato de anilinio 100 mM (pH 4,6) que contenía DMSO al 7% (v/v). Después de 17 horas de incubación a temperatura ambiente, se separó el exceso de reactivo aminooxi por ultrafiltración con un filtro Amicon 50K y lavado repetido con PBS. Los conjugados de anticuerpos fueron perfilados por MS, AnSEC y AnHIC tal como se describió arriba. La relación medida de compuesto a anticuerpo, el comportamiento de la agregación y los datos de hidrofobicidad se resumen en la Tabla 3. Como se muestra en la Tabla 3, el método de dos etapas proporcionó un marcaje casi cuantitativo de mAb5 anti-HER2-(C-69) activado por cetona con los agonistas aminooxi C-35 y C-37.
Análogo de Cetona-Coenzima A (Compuesto C-69)
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El compuesto (int-4) se convirtió en el análogo de CoA funcionalizado con cetona (C69) haciendo reaccionar 5 mM de compuesto (int-4) con 25 mM de ATP en presencia de CoAA de Staphylococcus aureus 10 |j M, CoAD de Escherichia coli 25 j M y CoAE de Escherichia coli 20 j M durante aproximadamente 16 h a 37°C en tampón HEPES 50 mM (pH 8,0) que contiene MgCh 20 mM. Después de la centrifugación de la mezcla de reacción a 20.817 x g durante 2 min, la enzima soluble se separó por ultrafiltración a través de un filtro centrífugo Amicon Ultra con un corte de 10 kDa. La conversión enzimática de compuesto (i-4) en el análogo de CoA funcionalizado con cetona (C59) se verificó mediante la formación de mAb5 anti-HER2-(C-69)-(C-35) y mAb5 anti-HER2-(C-69)-(C-37) (véase la Tabla 3).
Ejemplo 75
Testado de estabilidad in vitro de conjugados de agonistas anti-HER2-TLR7
La estabilidad del enlace formado entre cargas útiles que contienen maleimida y los residuos Cys del anticuerpo se potencia mediante la hidrólisis del anillo de succinimida formado en esta reacción. Los efectos de la hidrólisis del anillo de succinimida sobre la estabilidad de los conjugados de anticuerpos preparados con compuestos agonistas de la invención se estudiaron después de la incubación in vitro en suero de ratón. Los cambios en las masas resultantes de la desconjugación de cargas y la hidrólisis del anillo de succinimida de las cargas de maleimida conjugadas a los anticuerpos se monitorizaron mediante LC-MS. Se ha informado que la hidrólisis del anillo de succinimida es estimulada por ciertas condiciones tales como pH elevado, temperatura elevada o sales elevadas (J. Am. Chem. Soc.
1955, 77: 3922; Biochemistry 1976, 15: 2836; Biochem. J. 1979, 179: 191-197; J Pharm Sci. 1984, 73:1767-1771; Bioorg. Med. Chem. Lett. 17: 6286-6289, 2007). Para sondear la estabilidad in vitro de los conjugados, se incubaron conjugados mAb2 de anticuerpo anti-HER2 a 37°C en suero de ratón al 50-70%. Se tomaron cincuenta microgramos de muestras de conjugado en cada momento (típicamente 0, 8, 24, 48 y 72 horas) y se congelaron inmediatamente. Las muestras se descongelaron posteriormente para su procesamiento y análisis. Brevemente, los anticuerpos se trataron con PNGasaF para separar los glicanos enlazados a N y una enzima proteolítica que corta cerca de la región bisagra de la cadena pesada con el fin de separar el Fab del Fc antes de la reducción con DTT para romper los enlaces disulfuro. Fab de la cadena ligera, de la cadena pesada y fragmentos Fc de la cadena pesada fueron analizados después por ESI-MS. Las poblaciones relativas de anticuerpo desconjugado, conjugados con carga útil unida con anillo de succinimida hidrolizada y conjugados con carga útil unida con anillo de succinimida intacto, se calcularon a partir de las intensidades relativas de MS de las especies de conjugados correspondientes. El grado de desconjugación y el grado de hidrólisis de succinimida se muestran en las Tablas 4 y 5 para un subconjunto de conjugados. En general, los conjugados pierden menos del 13% del compuesto cargado durante una incubación in vitro de 72 horas y, en general, la hidrólisis del anillo de succinimida se completa por encima del 85% en 48 horas. Ciertos compuestos de la invención, ejemplificados por el Compuesto (C-5) y el Compuesto (C-21) exhiben una estabilidad del conjugado mejorada debido a una menor susceptibilidad a la desconjugación a través de la reacción inversa de maleimida y una mayor estabilización a través de la hidrólisis del anillo de succinimida.:
Tabla 4. Hidrólisis en anillo de succinimida de conjugados de agonista anti-HER2-TLR7 en función del tiempo de incubación in vitro en suero de ratón
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Tabla 5. Relación de compuesto a anticuerpo de conjugados de agonista anti-HER2-TLR7 en función del tiempo de incubación in vitro en suero de ratón
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Ejemplo 76
Ensayo in vivo de conjugados de agonistas anti-HER2-TLR7 en un modelo de xenoinjerto de tumor gástrico N87
Material y Métodos
Para el modelo de ratón xenoinjerto de carcinoma gástrico N87, se utilizaron ratones hembra SCID-beige de 6-8 semanas de edad (adquiridos de Harlan Laboratories) para la implantación. Células N87 (obtenidas de ATCC, Catálogo n° CRL-5822, lote de proveedor n° 7686255) se cultivaron en condiciones estériles en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante dos semanas. Las células se cultivaron en medio RPMI con suero bovino fetal al 10%. Las células se hicieron pasar cada 3-4 días con tripsina al 0,05%/EDTA. El día de la implantación, las células N87 se descamaron (pase x4) y se re-suspendieron en medio libre de suero RPMI1640 a una concentración de 1 x 106 células y matrigel al 50%/100 pl. Las células se sometieron a pruebas de Radii para asegurar que están libres de micoplasma y virus murinos.
Las células N87 se implantaron con una inyección subcutánea en el flanco inferior utilizando una aguja de 28 g (100 pl de volumen de inyección). Después del implante, los tumores se midieron con un calibrador y los ratones se pesaron dos veces por semana una vez que los tumores eran palpables. Los tumores se midieron luego dos veces por semana en dos dimensiones. Las medidas del calibrador se calcularon utilizando (L x W2)/2. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en instalaciones de animales SPF de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y los Reglamentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
Cuando los tumores de xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 200 mm3, se administró a los ratones por vía intravenosa 0,3-10 mg/kg de anticuerpo anti-HER2 o conjugado anti-HER2-agonista de TLR7. El anticuerpo de control del isotipo se generó expresando un anticuerpo contra una diana no encontrada en roedores y conjugando a través de métodos similares descritos para anticuerpos anti-HER2. Los tumores se midieron dos veces por semana. Los volúmenes medios de los tumores se representaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad). Se alcanzó un punto final para los estudios de eficacia cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen de 2000 mm3. Después de la inyección, los ratones también fueron monitorizados en cuanto a signos de deterioro clínico. Si por alguna razón los ratones mostraron signos de morbilidad, incluyendo dificultad respiratoria, postura encorvada, disminución de la actividad, parálisis de las patas traseras, taquipnea como signo de derrames pleurales, pérdida de peso cercana al 20% o 15% más otros signos, o si se vio afectada su capacidad para realizar actividades normales (alimentación, movilidad), los ratones fueron sacrificados.
Resultados
Los ratones con xenoinjerto de tumor gástrico N87 se trataron por vía intravenosa con una dosis única de conjugado mAb2 anti-HER2-(C-1), en que el Compuesto (C-1) se conjuga con Cys 152 y Cys 375 de la cadena pesada del mAb2 anti-HER2, a 1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg o 10 mg/kg. . Se observó una regresión completa de los tumores de xenoinjerto N87 en ratones tratados con conjugado mAb2 anti-HER2- (C-1) en todas las dosis testadas, incluida la dosis más baja testada-1 mg/kg (FIG. 1). No se observó regresión del tumor en ratones de xenoinjerto N87 tratados con 10 mg/kg de mAb2 anti-HER2 no conjugado solo, o un conjugado de anticuerpo de control del isotipo (C-1), en comparación con los animales no tratados (FIG. 1).
Los ratones con xenoinjerto de tumor gástrico N87 fueron tratados con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-1) o mAb1 anti-HER2-(C-5), a razón de 0,3 mg/kg o 1 mg/kg (10 ratones por grupo). Mientras que el tratamiento con una dosis única de 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2- (C-1) condujo a una regresión completa de los tumores de xenoinjerto humano N87, 0,3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-1) resultó en estasis del tumor (FIG. 2). De manera similar, aunque el tratamiento con una dosis única de 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) condujo a una regresión completa de los tumores de xenoinjerto humano N87, 0,3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) resultó en una estasis del tumor (FIG. 2). Una regresión de los tumores gástricos N87 no se observó en ratones de xenoinjerto N87 tratados con un conjugado de anticuerpo de control del isotipo-(C-5) en comparación con animales no tratados. Estos datos demostraron que la regresión del tumor se puede lograr con un solo tratamiento de un conjugado anti-HER2-agonista de TLR7 (p. ej., mAb1 anti-HER2-(C-1) o mAb1 anti-HER2-(C-5), mAb2 anti-HER2-(C-1)) en una dosis baja, p. ej., 1 mg/kg.
En un estudio separado, los ratones con xenoinjerto de tumor gástrico N87 fueron tratados con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-5), a 1 mg/kg, 3 mg/kg o 5 mg/kg (8 ratones por grupo). Si bien el tratamiento con una dosis única de 3 mg/kg o 5 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) condujo a una regresión completa de los tumores de xenoinjerto humano N87, 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) resultó en estasis del tumor (FIG. 3) en este estudio.
Además, los ratones con xenoinjerto de tumor gástrico N87 fueron tratados con una dosis única de mAb1 anti-HER2-(C-5), mAb1 anti-HER2-(C-35), mAb1 anti-HER2-(C-37 ), mAB1 anti-HER2-(C-59), mAb1 anti-HER2-(C-60), mAb1 anti-HER2-(C-61), mAb1 anti-HER2-(C-62) o mAb1 anti-HER2-(C-64) a 1 mg/kg (6 ratones por grupo). El tratamiento con una dosis única de 1 mg/kg de conjugado mAb1 anti-HER2 con diferentes compuestos dio como resultado la estasis del tumor (FIG. 4), similar a lo que se observó después de un tratamiento de dosis única de 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5).
Ejemplo 77
Testado in vivo de un conjugado agonista anti-ratHER2-TLR7 en el modelo singénico de cáncer de mama MMC (ratHER2+)
Material y Métodos
Para el modelo singeneico de cáncer de mama MMC (ratHER2+), ratones transgénicos FVB/N hembra de 6-10 semanas de edad que expresan el oncogén Erbb2 (c-neu) de rata activado que contiene la mutación Val664 a Glu664 (FVB-Tg(MMTV-Erbb2)NK1Mul/J; originalmente adquirido de Jackson Laboratories, criados en casa) se utilizaron para la implantación. Células MMC (derivadas de tumores obtenidos de ratones transgénicos FVB/N obtenido del Profesor Nora Disis, Universidad de Washington) se cultivaron en condiciones estériles en una incubadora de 37°C con 5% de CO2 durante dos semanas. Las células se cultivaron en medio DMEM con suero bovino fetal al 20% y Penicilina/Estreptomicina. Las células se hicieron pasar cada 3-4 días con tripsina al 0,05%/EDTA. El día de la implantación, las células se descamaron (pase x4) y se re-suspendieron en medio libre de suero RPMI1640 a una concentración de 2,5 x 105 células y matrigel al 10%/100 pl. Las células se sometieron a pruebas de Radii para asegurar que están libres de micoplasma y virus murinos.
Las células MMC se implantaron con una inyección subcutánea en el flanco inferior utilizando una aguja de calibre 28 (100 pl de volumen de inyección). Después del implante, los tumores se midieron con un calibrador y los ratones se pesaron 2 veces por semana una vez que los tumores eran palpables. Los tumores se midieron luego dos veces por semana en dos dimensiones. Las medidas del calibrador se calcularon utilizando (L x W2)/2. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en instalaciones de animales SPF de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y los Reglamentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3, se administró a grupos de ocho ratones por vía intravenosa 1 mg/kg de anticuerpo anti-ratHER2 (7.16.4, adquirido de Bio X Cell; West Lebanon, NH) o 1 mg/kg de conjugado anti -HER2 de rata-agonista de (anti-ratHER2-(C-46)). Los tumores se midieron dos veces por semana. Los volúmenes medios de los tumores se representaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad). Se alcanzó un punto final para los estudios de eficacia cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen de 2000 mm3. Después de la inyección, los ratones también fueron monitorizados en cuanto a signos de deterioro clínico. Si por alguna razón los ratones mostraron signos de morbilidad, incluyendo dificultad respiratoria, postura encorvada, disminución de la actividad, parálisis de las patas traseras, taquipnea como signo de derrames pleurales, pérdida de peso cercana al 20% o 15% más otros signos, o si se vio afectada su capacidad para realizar actividades normales (alimentación, movilidad), los ratones fueron sacrificados.
Resultados
Para probar la eficacia de los conjugados anti-ratHER2-(C-46) en el modelo singeneico de cáncer de mama MMC ratHER2 , los ratones portadores de tumores de mama subcutáneos MMC fueron tratados por vía intravenosa con 1 mg/kg de conjugado anti-ratHER2-(C-46), o anti-ratHER2 no conjugado (8 ratones por grupo). Como se muestra en las FIGs. 5A y 5B, se observó una regresión completa de los tumores de mama de ratón MMC (ratHER2+) en siete de ocho ratones tratados con una dosis única de conjugados anti-ratHER2- (C-46) (Figura 5A), pero solo en tres de ocho ratones tratados con el anticuerpo anti-ratHER2 desnudo (figura 5B).
Estos datos sugieren que el conjugado anti-ratHER2-(C-46) es terapéuticamente más efectivo contra el cáncer de mama singeneico ratHER2-positivo que el anticuerpo anti-ratHER2 no conjugado solo.
Ejemplo 78
Ensayo in vivo de conjugados de anti-HER2-agonista de TLR7 en un modelo de xenoinjerto de tumor de mama HCC1954
Material y Métodos
Para el modelo de ratón xenoinjerto de cáncer de mama HCC1954 se utilizaron ratones hembra SCID-beige de 6-8 semanas de edad (adquiridos de Harlan Laboratories) para la implantación. Células HCC1954 (obtenidas de ATCC, Catálogo n° CRL-2338, lote de proveedor n° 5107643) se cultivaron en condiciones estériles en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante dos semanas. Las células se cultivaron en medio RPMI con suero bovino fetal al 10%. Las células se hicieron pasar cada 3-4 días con tripsina al 0,05%/EDTA. El día de la implantación, las células HCC1954 se (recolectaron) descamaron (pase x17) y se re-suspendieron en medio libre de suero RPMI1640 a una concentración de 1 x 106 células y matrigel al 50%/100 pl. Las células se sometieron a pruebas de Radii para asegurar que están libres de micoplasma y virus murinos.
Las células HCC1954 se implantaron con una inyección subcutánea en el flanco inferior utilizando una aguja de 27 G (100 pl de volumen de inyección). Después del implante, los tumores se midieron con un calibrador y los ratones se pesaron dos veces por semana una vez que los tumores eran palpables. Los tumores se midieron luego dos veces por semana en dos dimensiones. Las medidas del calibrador se calcularon utilizando (L x W2)/2. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en instalaciones de animales SPF de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y los Reglamentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
Cuando los tumores de xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 200 mm3, se administró a los ratones por vía intravenosa 1-10 mg/kg de anticuerpo anti-HER2 o conjugado anti-HER2-agonista de TLR7. El anticuerpo de control del isotipo se generó expresando un anticuerpo contra una diana no encontrada en roedores y conjugando a través de métodos similares descritos para anticuerpos anti-HER2. Los tumores se midieron dos veces por semana. Los volúmenes medios de los tumores se representaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad). Se alcanzó un punto final para los estudios de eficacia cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen de 2000 mm3. Después de la inyección, los ratones también fueron monitorizados en cuanto a signos de deterioro clínico. Si por alguna razón los ratones mostraron signos de morbilidad, incluyendo dificultad respiratoria, postura encorvada, disminución de la actividad, parálisis de las patas traseras, taquipnea como signo de derrames pleurales, pérdida de peso cercana al 20% o 15% más otros signos, o si se vio afectada su capacidad para realizar actividades normales (alimentación, movilidad), los ratones fueron sacrificados.
Resultados
Los ratones con xenoinjerto de tumor de mama HCC1954 fueron tratados por vía intravenosa con una dosis única de conjugado mAb1 anti-HER2-(C-5), en que el Compuesto (C-5) se conjuga con Cys 152 y Cys 375 de la cadena pesada del mAb1 anti-HER2, a 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg (8 ratones por grupo). Si bien el tratamiento con una dosis única de 10 mg/kg o 3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) condujo a una regresión completa de los tumores de xenoinjerto humano HCC1954, 1 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) resultó en una regresión inicial del tumor, seguido de estasis del tumor (FIG. 6). No se observó regresión del tumor en ratones de xenoinjerto HCC1954 tratados con 10 mg/kg de mAb2 anti-HER2 no conjugado solo (FIG. 6).
Estos datos demuestran que la regresión del tumor se puede lograr en el xenoinjerto de tumor de mama HCC1954 con alta expresión de HER2 mediante un tratamiento único de un conjugado anti-HER2-agonista de TLR7 (mAb1 anti-HER2-(C-5)) a 3 mg / kg.
Ejemplo 79
Ensayo in vivo de conjugados de anti-HER2-agonista de TLR7 en un modelo de xenoinjerto de tumor de ovario SKOV3
Material y Métodos
Para el modelo de ratón xenoinjerto de ovario SKOV3 se utilizaron ratones hembra SCID-beige de 6-8 semanas de edad (adquiridos de Harlan Laboratories) para la implantación. Células SKOV3 (obtenidas de ATCC, Catálogo n° HTB-77, lote de proveedor n° 7349765) se cultivaron en condiciones estériles en una incubadora a 37°C con 5% de CO2 durante dos semanas. Las células se cultivaron en medio 5A de McCoy con suero bovino fetal al 10%.. Las células se hicieron pasar cada 3-4 días con tripsina al 0,05%/EDTA. El día de la implantación, las células SKOV3 se (recolectaron) descamaron (pase x11) y se re-suspendieron en medio libre de suero 5A de McCoy a una concentración de 5 x 106 células y matrigel al 50%/100 pl. Las células se sometieron a pruebas de Radii para asegurar que están libres de micoplasma y virus murinos.
Las células SKOV3 se implantaron con una inyección subcutánea en el flanco inferior utilizando una aguja de 28 ^ G (100 pl de volumen de inyección). Después del implante, los tumores se midieron con un calibrador y los ratones se pesaron dos veces por semana una vez que los tumores eran palpables. Los tumores se midieron luego dos veces por semana en dos dimensiones. Las medidas del calibrador se calcularon utilizando (L x W2)/2. Los ratones fueron alimentados con una dieta normal y alojados en instalaciones de animales SPF de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y los Reglamentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
Cuando los tumores de xenoinjertos alcanzaron aproximadamente 200 mm3, se administró a los ratones por vía intravenosa 3-10 mg/kg de anticuerpo anti-HER2 o conjugado anti-HER2-agonista de TLR7. El anticuerpo de control del isotipo se generó expresando un anticuerpo contra una diana no encontrada en roedores y conjugando a través de métodos similares descritos para anticuerpos anti-HER2. Los tumores se midieron dos veces por semana. Los volúmenes medios de los tumores se representaron utilizando el software Prism 5 (GraphPad). Se alcanzó un punto final para los estudios de eficacia cuando el tamaño del tumor alcanzó un volumen de 2000 mm3. Después de la inyección, los ratones también fueron monitorizados en cuanto a signos de deterioro clínico. Si por alguna razón los ratones mostraron signos de morbilidad, incluyendo dificultad respiratoria, postura encorvada, disminución de la actividad, parálisis de las patas traseras, taquipnea como signo de derrames pleurales, pérdida de peso cercana al 20% o 15% más otros signos, o si se vio afectada su capacidad para realizar actividades normales (alimentación, movilidad), los ratones fueron sacrificados.
Para la InmunoHistoQuímica (IHC), de HER2 se utilizaron directrices y protocolos estandarizados para la tinción de HER2 y la puntuación de xenoinjerto HER2 (véase, p. ej., English et al., Mol Diagn Ther. abril 2013; 17 (2): 85-99).
Resultados
Los ratones con xenoinjerto de tumor de ovario SKOV3 fueron tratados por vía intravenosa con una dosis única de conjugado mAb1 anti-HER2-(C-5), en que el Compuesto (C-5) se conjuga con Cys 152 y Cys 375 de la cadena pesada del mAb1 anti-HER2, a,3 mg/kg o 10 mg/kg. . Si bien el tratamiento con una dosis única de 10 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) condujo a una regresión completa de los tumores de xenoinjerto humano SKOV3, en 7 de 8 ratones, 3 mg/kg de mAb1 anti-HER2-(C-5) resultó en una regresión inicial del tumor, seguido de crecimiento renovado del tumor (FIG. 7). No se observó regresión del tumor en ratones de xenoinjerto SKOV3 tratados con 10 mg/kg de mAb1 antiHER2 no conjugado solo, o un conjugado de anticuerpo de control del isotipo (C-5), en comparación con los animales no tratados (FIG. 7).
Estos datos demuestran que la regresión del tumor se puede lograr mediante un tratamiento único de un conjugado anti-HER2-agonista de TLR7 (p. ej., mAb1 anti-HER2-(C-1) o mAb1 anti-HER2-(C-5)) a 10 mg/kg en un modelo de xenoinjerto en el que Her2 se expresa a niveles más bajos en comparación con los modelos de xenoinjerto N87 y HCC (FIG. 8C en comparación con las FIGs. 8A y 8B). En base al nivel de expresión de HER2, N87 y HCC1954 tienen una puntuación de 3+ IHC, y SKOV3 tiene una puntuación de 2+ IHC. Por lo tanto, los conjugados anti-HER2-agonista de TLR7 descritos en la presente pueden suprimir el crecimiento del tumor no solo en tumores que expresan HER2 alto (p. ej., que tienen puntuaciones de 3+ IHC), sino también en tumores que expresan HER2 bajo (p. ej., que tienen puntuaciones de 2+ IHC).

Claims (26)

  1. REIVINDICACIONES
    Figure imgf000188_0001
    Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano; R1 es -NHR2 o -NHCHR2R3;
    R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6;
    R3 es L1OH;
    Figure imgf000188_0002
    Figure imgf000188_0003
    Figure imgf000189_0001
    Figure imgf000190_0001
    cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
    cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
    cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
    cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH;
    R12 es H, metilo o fenilo;
    cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
    cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
    cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, e y es un número entero de 1 a 16.
  2. 2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde Ab se selecciona de trastuzumab, pertuzumab, margetuximab, o HT-19, o un mutante de cisteína específico para el sitio del mismo, en donde el mutante de cisteína específico para el sitio comprende cisteína en una o más de las siguientes posiciones (todas las posiciones por numeración de la UE): (a) posiciones 152, 360 y 375 de la cadena pesada del anticuerpo, y
    (b) posiciones 107, 159 y 165 de la cadena ligera del anticuerpo.
  3. 3. El conjugado de la reivindicación 1, en donde Ab se selecciona de cualquiera de los siguientes:
    (a) un anticuerpo que comprende:
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;
    (b) un anticuerpo que comprende:
    una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
    una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
    una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
    una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
    una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y
    una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
    (c) un anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17;
    (d) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
    (e) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
    (f) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o
    (g) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
  4. 4. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde Ab es un anticuerpo anti-HER2 humano o humanizado.
  5. 5. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde Ab es una región Fc modificada.
  6. 6. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde Ab comprende cisteína en una o más de las siguientes posiciones (todas las posiciones por numeración de la UE):
    (a) posiciones 152, 360 y 375 de la cadena pesada del anticuerpo, y
    (b) posiciones 107, 159 y 165 de la cadena ligera del anticuerpo.
  7. 7. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde Ab comprende cisteínas en las posiciones 152 y 375 de las cadenas pesadas de anticuerpos (todas las posiciones por numeración de la UE).
  8. 8. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el conjugado de anticuerpos de Fórmula (II) comprende la estructura de Fórmula (lia) o Fórmula (IIb):
    Figure imgf000191_0001
    cada uno de los n se selecciona independientemente de 1,2, 3 y 4;
    cada uno de los t se selecciona independientemente de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 and 18, e y es un número entero de 1 a 16.
  9. 9. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde
    R1 es -NHR2;
    R2 es alquilo C4-C6;
    L2 es -(CH2)n- o -C(=O)(CH2)n;
    R40 es
    Figure imgf000192_0001
    cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4, e
    y es un número entero de 1 a 16.
  10. 10. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el conjugado tiene un índice de hidrofobicidad de 0,8 o mayor, según se determina por cromatografía de interacción hidrofóbica.
  11. 11. Un conjugado que comprende cualquiera de las siguientes fórmulas:
    Figure imgf000192_0002
    Figure imgf000200_0001
    en donde Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a HER2 humano, e y es un número entero de 1 a 4.
  12. 12. El conjugado de la reivindicación 11, en donde Ab se selecciona de trastuzumab, pertuzumab, margetuximab, o HT-19, o un mutante de cisteína específico para el sitio del mismo, en donde el mutante de cisteína específico para el sitio comprende cisteína en una o más de las siguientes posiciones (todas las posiciones por numeración de la UE): (a) posiciones 152, 360 y 375 de la cadena pesada del anticuerpo, y
    (b) posiciones 107, 159 y 165 de la cadena ligera del anticuerpo.
  13. 13. El conjugado de la reivindicación 11, en donde Ab se selecciona de cualquiera de los siguientes:
    (a) un anticuerpo que comprende:
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 1 (HCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 2 (HCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
    una región determinante de la complementariedad de cadena pesada 3 (HCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 1 (LCDR1) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11;
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 2 (LCDR2) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y
    una región determinante de la complementariedad de cadena ligera 3 (LCDR3) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13;
    (b) un anticuerpo que comprende:
    una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
    una HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;
    una HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3;
    una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
    una LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; y
    una LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16;
    (c) un anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17;
    (d) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
    (e) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19;
    (f) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19; o
    (g) un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
  14. 14. El conjugado de la reivindicación 11, en donde Ab comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y una cadena Ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.
  15. 15. El conjugado de la reivindicación 14, en donde el compuesto está unido a las cisteínas en las posiciones 152 y 375 de la cadena pesada del anticuerpo (todas las posiciones por numeración de la UE).
  16. 16. El conjugado de la reivindicación 11, en donde y es aproximadamente 3 a 4.
  17. 17. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 11-16, en donde el conjugado tiene un índice de hidrofobicidad de 0,8 o mayor, según se determina por cromatografía de interacción hidrofóbica.
  18. 18. Una composición farmacéutica que comprende uno o más conjugados de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 y un soporte farmacéuticamente aceptable.
  19. 19. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 o la composición farmacéutica de la reivindicación 18 para uso en el tratamiento de un cáncer HER2-positivo en un sujeto que lo necesite.
  20. 20. El conjugado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el conjugado es capaz de suprimir el cáncer HER2-positivo durante un período sostenido y/o reducir la recurrencia del cáncer HER2-positivo, en comparación con un anticuerpo anti-HER2 solo.
  21. 21. El conjugado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el cáncer HER2-positivo se selecciona de cáncer gástrico, cáncer de esófago, adenocarcinoma de unión gastroesofágica, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer endometrial, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, osteosarcoma, neuroblastoma, glioblastoma y cáncer de cabeza y cuello.
  22. 22. El conjugado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el conjugado se administra al sujeto por vía intravenosa, intratumoral o subcutánea.
  23. 23. El conjugado para uso de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el conjugado se administra a una dosis de aproximadamente 0,01-20 mg por kg de peso corporal.
  24. 24. El conjugado para su uso de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende, además, administrar un segundo agente al sujeto.
  25. 25. Un compuesto que tiene la estructura de Fórmula (I), o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo:
    Figure imgf000202_0001
    R2 es -alquilo C3-C6 o -alquilo C4-C6; R3 es L1OH;
    Figure imgf000203_0001
    X2 es
    Figure imgf000204_0001
    R6 es 2-piridilo o 4-piridilo;
    cada R7 se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6;
    cada uno de los R8 se selecciona independientemente de H y alquilo C1-C6, F, Cl y -OH;
    cada uno de los R9 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C6, F, Cl, -NH2, -OCH3, -OCH2CH3,-N(CH3)2, -CN, -NO2 y -OH;
    cada uno de los R10 se selecciona independientemente de H, alquilo C1-6, fluoro, benciloxi sustituido con C(=O)OH, bencilo sustituido con -C(=O)OH, alcoxi C1-4 sustituido con -C(=O)OH y alquilo C1-4 sustituido con -C(=O)OH; cada uno de los m se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
    cada uno de los n se selecciona independientemente de 1, 2, 3 y 4;
    y
    cada uno de los t se selecciona independientemente de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.
  26. 26. Un conjugado que comprende el compuesto de la reivindicación 25 unido a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
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