ES2761912T3 - Composiciones de ARNi del virus de la hepatitis B (HBV) y métodos de uso de las mismas - Google Patents

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Abstract

Un agente de ARNi bicatenario para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39), y dicha cadena antiparalela comprende 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de ARNi del virus de la hepatitis B (HBV) y métodos de uso de las mismas
En todo el mundo, más de 400 millones de personas están infectadas crónicamente con e1HBV y, por lo tanto, tienen un mayor riesgo de desarrollar enfermedades hepáticas graves, tales como hepatitis crónica, cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (HCC), lo que da como resultado una estimación de 600000 muertes cada año.
La evolución natural de la infección crónica por el HBV incluye cuatro fases consecutivas: (1) fase temprana "inmunotolerante", altos niveles de replicación del virus e inflamación del hígado mínima; (2) fase inmunorreactiva, inflamación hepática significativa y aminotransferasas en el suero elevadas; con algunos pacientes que progresan a (3) fase "no replicativa", seroconversión a anti-HBe; nivel de viremia indetectable o bajo (inferior a 2000 UI/ml por ensayos basados en PCR); resolución de la inflamación hepática; y (4) hepatitis B crónica HBeAg negativo, debido a la aparición de mutaciones virales específicas, que impiden la producción de HBeAg pero no impiden la replicación del virus. Esta forma de hepatitis B crónica (CHB) se caracteriza por niveles fluctuantes de ADN de1HBV en el suero y aminostransferasas en el suero (ALT y AST), y enfermedad hepática progresiva. Es importante tener en cuenta que la CHB se puede presentar como CHB HBeAg-positivo o HBeAg-negativo. Los estudios longitudinales de pacientes con CHB indican que la incidencia acumulada a los 5 años de desarrollar cirrosis varía de 8 a 20%. La incidencia acumulada a los 5 años de descompensación hepática es aproximadamente de 20%. La incidencia mundial de HCC ha aumentado y actualmente constituye el quinto cáncer más común. La incidencia anual de HCC relacionado con el HBV es alta, oscila entre 2 y 5% cuando se establece la cirrosis.
El objetivo principal del tratamiento para el HBV es suprimir permanentemente la replicación de1HBV y mejorar la enfermedad hepática. Los objetivos a corto plazo clínicamente importantes son lograr la seroconversión de HBeAg, normalización de ALT y AST en el suero, resolución de la inflamación del hígado y prevenir la descompensación hepática. El objetivo final del tratamiento es lograr una respuesta duradera para prevenir el desarrollo de cirrosis, cáncer de hígado y prolongar la supervivencia. La infección por el HBV no se puede erradicar por completo debido a la persistencia de una forma particular de ADN circular cerrado covalentemente viral (ADN ccc de1HBV) en los núcleos de los hepatocitos infectados. Sin embargo, el aclaramiento inducido por el tratamiento de1HBsAg en suero es un marcador de terminación de la infección crónica por el HBV y se ha asociado con el mejor resultado a largo plazo.
Los métodos convencionales actuales de tratamiento para el HBV incluyen inmunoterapias basadas en interferón o timosina a1 y la supresión de la producción viral por inhibición de la polimerasa de1HBV. Los inhibidores de la polimerasa del HBV son efectivos para reducir la producción viral, pero tienen poco o ningún efecto en la reducción rápida del HBsAg o pueden reducir lentamente el HBsAg con tratamiento a largo plazo en un número limitado de pacientes (como es el caso del fumarato de tenofovir disoproxilo). La inmunoterapia basada en interferón puede lograr una reducción tanto de la producción viral como de la eliminación temprana de HBsAg de la sangre, pero solo en un pequeño porcentaje de sujetos tratados. La función generalmente aceptada de HBsAg en la sangre es secuestrar anticuerpos anti-HBsAg y permitir que las partículas virales infecciosas escapen de la detección inmunitaria, que es probablemente una de las razones por las cuales la infección por HBV sigue siendo una afección crónica. Además, HBsAg, HBeAg y HBcAg tienen todos propiedades inmunoinhibidoras y la persistencia de estas proteínas virales en la sangre de pacientes después de la administración de cualquiera de los tratamientos actualmente disponibles para el HBV, es probable que tenga un impacto significativo en evitar que los pacientes logren el control inmunológico de su infección por el HBV.
Aunque las tres proteínas primarias del HBV (HBsAg, HBeAg y HBcAg) tienen todas propiedades inmunoinhibidoras, el HBsAg comprende la abrumadora mayoría de la proteína del HBV en la circulación de sujetos infectados por el HBV. Además, aunque que la eliminación (a través de seroconversión) de HBeAg o las reducciones en la viremia en el suero no están correlacionadas con el desarrollo del control sostenido de la infección por HBV fuera del tratamiento, la eliminación de HBsAg sérico de la sangre (y la seroconversión) en la infección por HBV es un indicador de pronóstico bien reconocido de respuesta antiviral en el tratamiento que conducirá al control de la infección por HBV fuera del tratamiento (aunque esto solo ocurre en una pequeña fracción de pacientes que reciben inmunoterapia). Por lo tanto, aunque la reducción de las tres proteínas principales de1HBV (HBsAg, HBeAg y HBcAg) puede dar como resultado la eliminación óptima del efecto inhibidor, la eliminación de1HBsAg solo es probablemente suficiente en y por sí misma para eliminar la mayor parte de la inhibición viral de la función inmunitaria en sujetos con infección por HBV. La publicación internacional WO2012/024170 describe la inhibición del HBV mediada por interferencia de a Rn .
Por lo tanto, en ausencia de cualquier régimen de tratamiento actual que pueda restablecer el control inmunológico del HBV en una gran proporción de pacientes, es necesario un tratamiento eficaz contra la infección por e1HBV que pueda inhibir la replicación viral y restablecer el control inmunológico en la mayoría de los pacientes. Por consiguiente, son necesarias en la técnica terapias alternativas y terapias de combinación para sujetos infectados con HBV y/o que tienen una enfermedad asociada con el HBV.
La invención se define por las reivindicaciones. Se refiere a un agente de ARNi bicatenario para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forma una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GUGUGCAc Uu CGCu UcACA -3' (SEQ IDNO: 39), y dicha cadena antiparalela comprende 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40),
en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados,
en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido en el extremo 3', y
en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente. La invención también proporciona dicho agente de ARNi bicatenario para usar en un método para reducir la carga viral del virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado con HBV; y dicho agente de ARNi bicatenario para usar en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV). La presente descripción proporciona composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen del virus de la hepatitis B (HBV). El gen del HBV puede estar en una célula, p. ej., una célula en un sujeto, tal como un ser humano.
También se describen métodos y terapias para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la inhibición o reducción de la expresión de un gen del HBV, p. ej., una infección por h Bv y/o una enfermedad asociada con el HBV, tal como la infección crónica por hepatitis B (CHB), cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (HCC), usando composiciones de ARNi que realizan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen del HBV para inhibir la expresión de un gen de1HBV. Los agentes de ARNi de la descripción se han diseñado para dirigirse a regiones en el genoma de1HBV que se conservan en los 8 serotipos de HBV. Además, los agentes de ARNi se han diseñado para inhibir todas las etapas del ciclo de vida del HBV, p. ej., replicación, ensamblaje, secreción de virus y secreción de antígenos subvirales, inhibiendo la expresión de más de un gen del HBV. En particular, dado que la transcripción del genoma de1HBV produce ARN policistrónicos que se superponen, un agente de ARNi de la invención que se dirige a un solo gen del HBV produce una inhibición significativa de la expresión de la mayoría o todos los transcritos de1HBV. Por ejemplo, debido a que el genoma del HBV se transcribe en un solo ARNm, un agente de ARNi de la invención que se dirige al gen S dará como resultado la inhibición no solo de la expresión del gen S sino también de la expresión "secuencia abajo" del gen de transcriptasa inversa. Además, los agentes de ARNi se han diseñado para inhibir la replicación viral del HBV dirigiéndose a los genes estructurales del HBV y el gen X de1HBV permitiendo así que el sistema inmunitario de un sujeto detecte y responda a la presencia de HBsAg para producir anticuerpos anti-HBV para eliminar una infección por el HBV. Sin pretender estar limitado por la teoría, se cree que una combinación o subcombinación de las propiedades anteriores y los sitios objetivo específicos y/o las modificaciones específicas en estos agentes de ARNi, confieren a los agentes de ARNi de la invención mejores eficacia, estabilidad, seguridad, potencia y durabilidad.
Por consiguiente, se describen agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, y dicha cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido en el extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, la una o más de las 3 diferencias de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la cadena antiparalela es un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena antiparalela.
En otro caso, la una o más de las 3 diferencias de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la cadena antiparalela es un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena paralela.
En un caso, todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados.
En un caso, la cadena paralela y la cadena antiparalela comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos con cualquiera de las secuencias dadas en cualquiera de las Tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26.
En una realización, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En un caso, la al menos una cadena comprende un saliente en 3' de al menos 1 nucleótido. En otro caso, la al menos una cadena comprende un saliente en 3' de al menos 2 nucleótidos.
En un caso, la región de doble cadena tiene una longitud de 15-30 pares de nucleótidos. En otra realización, la región de doble cadena tiene 17-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro caso más, la región de doble cadena tiene 17-25 pares de nucleótidos de longitud. En un caso, la región de doble cadena e tiene 23-27 pares de nucleótidos de longitud. En otro caso, la región de doble cadena tiene 19-21 pares de nucleótidos de longitud. En otro caso más, la región de doble cadena tiene 21-23 pares de nucleótidos de longitud.
En un caso, cada cadena tiene 15-30 nucleótidos. En otro caso, cada cadena tiene 19-30 nucleótidos.
En una realización, el ligando es
Figure imgf000004_0001
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000004_0002
en donde X es O o S.
En un caso, el agente de ARNi se selecciona del grupo de agentes de ARNi dados en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26.
Se describen agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-UCGUGGUGGACUUCUCuCa -3' (SEQ ID NO: 5), y dicha cadena antiparalela comprende 5'-UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID nO: 6), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente.
La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
Se describen también agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente. La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
Se describen también agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente. La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
Se describen también agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde la cadena paralela comprende 5'-CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37), y la cadena antiparalela comprende 5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente. La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
Se describen también agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente. La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
La presente invención proporciona agentes de ARNi bicatenarios para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los agentes de ARNi bicatenarios incluyen una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente.
La presente descripción también proporciona agentes de ARNi que comprenden secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas que son al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos paralelas y antiparalelas anteriores.
En una realización, todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela comprenden una modificación.
En una realización, al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En una realización, el imitador de 5'-fosfato es un 5'-vinil-fosfato (5'-VP).
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antiparalela comprende 5'-usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17) y la cadena antiparalela comprende 5'-usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu-3' (SEQ ID NO: 21) y la cadena antiparalela comprende 5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu-3' (SEQ ID NO: 23) y la cadena antiparalela comprende 5'-PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-Metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35) y la cadena antiparalela comprende 5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; dA, dC, dG, y dT son desoxirribosa A, C, G, y T; y s es un conector fosforotioato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25) y la cadena antiparalela comprende 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua-3' (SEQ ID NO: 27) y la cadena antiparalela comprende 5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otra realización, la cadena paralela comprende 5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41) y la cadena antiparalela comprende 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En una realización, el ligando es
Figure imgf000007_0001
En una realización, el agente de ARNi conjugado al ligando se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000007_0002
en donde X es O o S.
En una realización, el P es un imitador de 5'-fosfato. En una realización, el imitador de 5'-fosfato es un 5-vinil-fosfato (5'-VP).
También se describen composiciones que comprenden dos o más agentes de ARNi bicatenario para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (h Bv ) en una célula, en donde cada agente de ARNi bicatenario comprende independientemente una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde cada de dichas cadenas paralelas comprende independientemente al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y cada una de dichas cadenas antiparalelas comprende independientemente al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de cada una de dichas cadenas paralelas y sustancialmente todos los nucleótidos de cada una de dichas cadenas antiparalelas son nucleótidos modificados independientemente, en donde cada una de dichas cadenas paralelas se conjuga independientemente con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, la una o más de las 3 diferencias de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la cadena antiparalela es un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena antiparalela. En otra realización, la una o más de las 3 diferencias de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la cadena antiparalela es un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena paralela.
En un caso, todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados.
En un caso, la cadena paralela y dicha cadena antiparalela comprenden una región de complementariedad que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de una cualquiera de las secuencias dadas en una cualquiera de las Tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26.
En un caso, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
También se describen composiciones para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, comprendiendo la composición (a) un primer agente de ARNi bicatenario que comprende una primera cadena paralela y una primera cadena antiparalela que forma una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha primera cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente; y (b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha segunda cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera y la segunda cadenas paralelas comprenden cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ ID NO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos anteriores), y en donde la primera y segunda cadenas antiparalelas comprenden independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6),
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8),
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10),
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud con las secuencias de nucleótidos anteriores).
En un caso, la primera y segunda cadena paralelas y/o todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena antiparalela comprenden una modificación.
En un caso, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En un caso, el primer y segundo agentes de ARNi se seleccionan del grupo que consiste en:
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13)
5'-usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14);
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15)
5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16);
5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17)
5'-usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18);
5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19)
5'-PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20);
5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21)
5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22);
5'- csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 23)
5'-PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24);
5'-csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35)
5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25)
5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 27)
5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28); y
5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41)
5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; dA, dC, dG, y dT son desoxirribosa A, C, G y T; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, el primer y segundo agentes de ARNi son 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15) 5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16); 5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21) 5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otro caso, el primer y segundo agentes de ARNi son 5'-gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25) 5'-usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26); y 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca - 3' (SEQ ID NO: 41) 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
También se describe un agente de ARNi bicatenario que comprende los agentes de ARNi citados en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26.
La presente invención también proporciona células que comprenden el agente de ARNi bicatenario de la invención. Se describen vectores que comprenden el agente de ARNi bicatenario de la invención.
En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes de ARNi bicatenarios de la invención.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administrará en una solución no tamponada. En una realización, la solución no tamponada es solución salina o agua.
En otro caso, el agente de ARNi bicatenario se administrará con una solución tampón. En un caso, la solución tampón comprende acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato o cualquier combinación de los mismos. En otro caso, la solución tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
También se describen métodos para inhibir la expresión del gen del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con el agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención; y mantener la célula producida durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen del HBV, inhibiendo así la expresión del gen de1HBV en la célula.
En un caso, el gen del HBV se selecciona del grupo que consiste en C, X, P, S y una combinación de los mismos. También se describen métodos para inhibir la replicación de un virus de hepatitis B (HBV) en una célula. Los métodos incluyen poner en contacto la célula con el agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención; y mantener la célula producida durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de HBV, inhibiendo así la replicación de1HBV en la célula.
En un caso, la célula está dentro de un sujeto. En un caso, el sujeto es un ser humano.
En un caso, el sujeto padece una enfermedad asociada al HBV.
En un caso, la expresión del gen del HBV se inhibe en al menos aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100%.
En un caso, la replicación del HBV en la célula se inhibe en al menos aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100%.
También se describen métodos para reducir el nivel de ADN del virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, reduciendo así el nivel de ADN ccc de HBV en el sujeto.
También se describen métodos para reducir el nivel de un antígeno del virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, reduciendo así el nivel del antígeno del HBV en el sujeto.
En un caso, el antígeno del HBV es HBsAg. En otro caso, el antígeno del HBV es HBeAg.
También se describen métodos para reducir la carga viral del virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, reduciendo así la carga viral de HBV en el sujeto.
También se describen métodos para reducir el nivel de alanina aminotransferasa (ALT) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, reduciendo así el nivel de ALT en el sujeto.
También se describen métodos para reducir el nivel de aspartato aminotransferasa (AST) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, reduciendo así el nivel de AST en el sujeto.
También se describen métodos para aumentar el nivel de anticuerpos anti-virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado con HBV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, aumentando así el nivel de anticuerpos anti-HBV en el sujeto.
También se describen métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, tratando de ese modo a dicho sujeto.
También se describen métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno asociado con el virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi bicatenario de la invención, o la composición, o el vector, o la composición farmacéutica de la invención, tratando de ese modo a dicho sujeto.
En un caso, el trastorno asociado al HBV se selecciona del grupo que consiste en infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular.
En un caso, el trastorno asociado al HBV es hepatitis crónica y el sujeto es HBeAg positivo. En otra realización, el trastorno asociado con el HBV es hepatitis crónica y el sujeto es negativo para HBeAg.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de a Rní bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ ID NO: 5) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ ID NO: 5) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde la cadena paralela comprende 5'- CGUGGUGGUCUUc Uc UAAa Uu -3' (SEQ ID NO: 37), (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y la cadena antiparalela comprende 5'-AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde la cadena paralela comprende 5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y la cadena antiparalela comprende 5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'- GuGUGCACUUc Gc UUCa Ca -3' (SEQ ID NO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde dicha cadena paralela comprende 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), y dicha cadena antiparalela comprende 5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a la secuencia de nucleótidos anterior), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
En una realización, todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela comprenden una modificación.
En una realización, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En una realización, el imitador de 5'-fosfato es un 5'-vinil-fosfato (5'-VP).
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antiparalela comprende 5'-usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17) y la cadena antiparalela comprende 5'-usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-Metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21) y la cadena antiparalela comprende 5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'- csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 23) y la cadena antiparalela comprende 5'- PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'- csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35) y la cadena antiparalela comprende 5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; dA, dC, dG, y dT are desoxirribosa A, C, G y T; y s es un conector fosforotioato.
En un caso, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25) y la cadena antiparalela comprende 5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En otro caso, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua-3' (SEQ ID NO: 27) y la cadena antiparalela comprende 5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-Metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otra realización, la cadena paralela comprende 5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca - 3' (SEQ ID NO: 41) y la cadena antiparalela comprende 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En una realización, el ligando es
Figure imgf000014_0001
En una realización, el agente de ARNi se conjuga con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000014_0002
en donde X es O o S.
En un caso, el trastorno asociado al HBV se selecciona del grupo que consiste en infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular.
En un caso, el trastorno asociado al HBV es hepatitis crónica y el sujeto es positivo para HBeAg. En otra realización, el trastorno asociado con el HBV es hepatitis crónica y el sujeto es negativo para HBeAg.
Se describen también métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. La composición incluye: (a) un primer agente de ARNi bicatenario que comprende una primera cadena paralela y una primera cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha primera cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; y (b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha segunda cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera y segunda cadena paralelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ IDNO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), y en donde la primera y segunda cadena antiparalelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%; 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), tratando así al sujeto.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene un trastorno asociado al virus de la hepatitis B (HBV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula. La composición incluye: (a) un primer agente de ARNi bicatenario que comprende una primera cadena paralela y una primera cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha primera cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; y (b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha segunda cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera y segunda cadena paralelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ IDNO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), y en donde la primera y segunda cadena antiparalelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), tratando así al sujeto.
En una realización, todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena paralela y todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena antiparalela comprenden una modificación.
En una realización, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En un caso, el primer y segundo agente de ARNi se seleccionan del grupo que consiste en:
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13)
5'-usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14);
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15)
5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16);
5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17)
5'-usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18);
5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19)
5'-PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20);
5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21)
5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22);
5'- csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu- 3' (SEQ ID NO: 23)
5'-PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24);
5'-csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35)
5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfUcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25)
5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 27)
5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28); y
5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41)
5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; dA, dC, dG, y dT son desoxirribosa A, C, G y T; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En un caso, el primer y segundo agentes de ARNi son
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15)
5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16); y
5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21) 5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En otro caso, el primer y segundo agentes de ARNi son
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25)
5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26); y
5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41) 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En una realización, el ligando es
Figure imgf000017_0001
En una realización, el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000017_0002
en donde X es O o S.
En un caso, el sujeto es un ser humano.
En un caso, el trastorno asociado al HBV se selecciona del grupo que consiste en infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular.
En un caso, el trastorno asociado al HBV es hepatitis crónica y el sujeto es positivo para HBeAg. En otra realización, el trastorno asociado con el HBV es hepatitis crónica y el sujeto es negativo para HBeAg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario es para administrar en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario es para administrar en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar en una dosis de aproximadamente 3 mg/kg. En una realización, el agente de ARNi bicatenario se debe administrar en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg.
En un caso, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg dos veces por semana.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis fija de aproximadamente 50 mg a 200 mg.
En una realización, el agente de ARNi bicatenario se administra por vía subcutánea. En otra realización, el agente de ARNi bicatenario se administra por vía intravenosa.
En un caso, el agente de ARNi se administra en dos o más dosis.
En un caso, el agente de ARNi se administra a intervalos seleccionados del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas y una vez cada aproximadamente 96 horas.
En un caso, el agente de ARNi se administra dos veces por semana. En otra realización, el agente de ARNi se administra cada dos semanas.
En un caso, los métodos de la invención incluyen además administrar al sujeto un agente terapéutico adicional. En una realización, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente antiviral, un inhibidor de la transcriptasa inversa, un estimulador inmunitario, una vacuna terapéutica, un inhibidor de entrada viral, un oligonucleótido que inhibe la secreción o liberación de HbsAg, un inhibidor de cápside, un inhibidor de ADN ccc y una combinación de cualquiera de los anteriores.
En otro caso, los métodos de la invención incluyen además administrar administrar al sujeto un inhibidor de la transcriptasa inversa. En otra realización más, los métodos de la invención incluyen además administrar al sujeto un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inmunoestimulador.
En un caso, el inhibidor de la transcriptasa inversa se selecciona del grupo que consiste en tenofovir disoproxilo fumarato (TDF), tenofovir alafenamida, lamivudina, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudina y AGX-1009. En algunos casos, los métodos de la invención comprenden además el tratamiento del virus de la hepatitis D (HDV) en el sujeto. Los métodos de tratamiento pueden incluir cualquier método de tratamiento conocido en la técnica. En ciertos casos, el HDV se trata en el sujeto usando uno de los más agentes de ARNi que se dirigen a1HBV como se describe en la presente memoria.
En algunos casos, los métodos de la invención incluyen además métodos para modular, p. ej., disminuir, la expresión de PD-L1. Se proporcionan composiciones y métodos para reducir la expresión de PD-L1, por ejemplo, en la publicación PCT n° WO2011/127180, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria por referencia.
En un caso, el inmunoestimulador se selecciona del grupo que consiste en interferón alfa 2a pegilado (PEG-IFN-a2a), interferón alfa-2b, una interleuquina-7 humana recombinante y un agonista del receptor 7 de tipo Toll (TLR7). En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno asociado con el virus de la hepatitis B (HBV), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario,
en donde el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región bicatenaria,
en donde la cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29, y dicha cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30,
en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antiparalela son nucleótidos modificados,
en donde la cadena paralela se conjuga con un ligando unido en el extremo 3', y
en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
En otro aspecto, la presente descripción también proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, comprendiendo dicha composición
(a) un primer agente de ARNi bicatenario que comprende una primera cadena y una primera cadena antiparalela que forman una región de doble cadena,
en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados,
en donde dicha primera cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; y
(b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena,
en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados,
en donde la segunda cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y
en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y dicha primera cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2,
en donde la segunda cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29, y la segunda cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30, tratando así al sujeto.
En algunos casos, la primera cadena paralela comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ IDNO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37)
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ IDNO: 39), (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a las secuencias de nucleótidos anteriores), y la segunda cadena antiparalela comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38);
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12); y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de toda su longitud a las secuencias de nucleótidos anteriores).
En algunos aspectos, todos los nucleótidos de la cadena paralela y todos los nucleótidos de la cadena antiparalela comprenden una modificación.
En ciertas realizaciones, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En algunas realizaciones, el ligando es
Figure imgf000020_0001
En una realización específica, el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000020_0002
en donde X es O S.
En ciertos casos, los agentes de ARNi bicatenario y composiciones proporcionados en la presente memoria se usan para el tratamiento de una infección por HDV y/o un trastorno asociado con HDV.
También se describen métodos para inhibir la replicación de un virus de la hepatitis D (HDV) en una célula. Los métodos incluyen (a) poner en contacto la célula con un agente de ARNi bicatenario, composición, vector o la composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria; y (b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen de1HBV, inhibiendo así la replicación del HDV en la célula. En ciertos casos, la célula está en un sujeto. En ciertos casos, el sujeto es un ser humano.
También se describen métodos para reducir el nivel de un antígeno del virus de la hepatitis D (HDV) en un sujeto infectado por HDV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, composición, vector o la composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria, reduciendo así el nivel del antígeno de HDV, p. ej., S-HDAg o L-HDAg, en el sujeto.
También se describen métodos para reducir la carga viral del virus de la hepatitis D (HDV) en un sujeto infectado por HDV. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi bicatenario, composición, vector o composición farmacéutica proporcionada aquí, reduciendo así la carga viral de HDV en el sujeto.
También se describen métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis D (HDV), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de a Rní bicatenario, composición, vector o composición farmacéutica proporcionada en la presente memoria, tratando así al sujeto.
En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena. La cadena paralela y cadenas antiparalelas se pueden seleccionar de los siguientes agentes de ARNi en donde, la cadena paralela comprende 5'-UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ ID NO: 5), y la cadena antiparalela comprende 5'-UgAGAGAa GuCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6); la cadena paralela comprende 5'-GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7), y la cadena antiparalela comprende 5'-UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8); la cadena paralela comprende 5'-CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ IDNO: 9), y la cadena antiparalela comprende 5'-AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID nO: 10); la cadena paralela comprende 5'-CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37), y la cadena antiparalela comprende 5'-AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38); la cadena paralela comprende 5'-GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y la cadena antiparalela comprende 5'-UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12); o la cadena paralela comprende 5'-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39), y la cadena antiparalela comprende 5'-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40), en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente, tratando así al sujeto.
En ciertas realizaciones, todos los nucleótidos de la cadena paralela y todos los nucleótidos de la cadena antiparalela comprenden una modificación. En ciertas realizaciones, el al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato. En ciertas realizaciones el imitador de 5'-fosfato es un 5'-vinil-fosfato (5'-VP).
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13) y la cadena antiparalela comprende 5'-usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17) y la cadena antiparalela comprende 5'-usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19) y la cadena antiparalela comprende 5'-PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21) y la cadena antiparalela comprende 5'-AfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-csgsugguGfgAfCfljfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 23) y la cadena antiparalela comprende 5'-PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'-csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35) y la cadena antiparalela comprende 5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; dA, dC, dG, y dT are desoxirribosa A, C, G y T; y s es un conector fosforotioato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25) y la cadena antiparalela comprende 5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En ciertos casos, la cadena paralela comprende 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 27) y la cadena antiparalela comprende 5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertas realizaciones, la cadena paralela comprende 5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41) y la cadena antiparalela comprende 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; y s es un conector fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el ligando es
Figure imgf000022_0001
En ciertas realizaciones, el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000022_0002
en donde X es O o S.
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis D (HDV). Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, comprendiendo la composición (a) un primer agente de ARNi bicatenario que comprende una primera cadena paralela y una primera cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la primera cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; y (b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la segunda cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera y segunda cadena paralelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ ID NO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ IDNO: 39), y en donde la primera y segunda cadena antiparalelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40), tratando así al sujeto.
En ciertas realizaciones, todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena paralelas y todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena antiparalelas comprenden una modificación. En ciertas realizaciones, el al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, el primer y segundo agente de ARNi se seleccionan del grupo:
5'- uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 13)
5'- usGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 14);
5'- uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15)
5'- PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16);
5'- gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 17)
5'- usAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 18);
5'- gsusgcacUfuCfGfCfuucaccucua - 3' (SEQ ID NO: 19)
5'- PusAfsgagGfugaagcgAfaGfugcacsusu - 3' (SEQ ID NO: 20);
5'- csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21)
5'- asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22);
5'- csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 23)
5'- PasAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 24);
5'-csgsuggudGgucdTucucuaaauu - 3' (SEQ ID NO: 35)
5'- asdAsuugagagdAagudCcaccagcsusu - 3' (SEQ ID NO: 36);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25)
5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26);
5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 27)
5'- PusAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 28); y
5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID NO: 41)
5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; dA, dC, dG y dT son desoxirribosa A, C, G y T; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, el primer y segundo agentes de ARNi son
5'-uscsguGfgUfGfGfacuucucuca - 3' (SEQ ID NO: 15)
5'-PusGfsagaGfaAfGfuccaCfcAfcgasusu - 3' (SEQ ID NO: 16); y
5'-csgsugguGfgAfCfUfucucUfCfaauu - 3' (SEQ ID NO: 21)
5'-asAfsuugAfgAfgAfaguCfcAfccagcsasg - 3' (SEQ ID NO: 22), en donde A, C, G, y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, el primer y segundo agentes de ARNi son 5'- gsgsuggaCfuUfCfUfcucaAfUfuuua - 3' (SEQ ID NO: 25) 5'- usAfsaaaUfuGfAfgagaAfgUfccaccsasc - 3' (SEQ ID NO: 26); y 5'- gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca -3' (SEQ ID nO: 41) 5'- usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu -3' (SEQ ID NO: 42), en donde A, C, G y U son ribosa A, C, G o U; a, g, c y u son 2'-O-metil (2'-OMe) A, U, C o G; Af, Cf, Gf o Uf son 2'-fluoro A, G, C o U; s es un conector fosforotioato; y P es un 5'-fosfato o imitador de 5'-fosfato.
En ciertas realizaciones, el ligando es
Figure imgf000024_0001
En ciertas realizaciones, el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000024_0002
en donde X es O o S.
En ciertos casos, el sujeto es un ser humano.
En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 3 mg/kg. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg dos veces por semana. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra en una dosis fija de aproximadamente 50 mg a 200 mg.
En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra por vía subcutánea. En ciertos casos, el agente de ARNi bicatenario se administra por vía intravenosa.
En ciertos casos, el agente de ARNi se administra en dos o más dosis. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra en intervalos seleccionados del grupo que consiste en una vez cada aproximadamente 12 horas, una vez cada aproximadamente 24 horas, una vez cada aproximadamente 48 horas, una vez cada aproximadamente 72 horas, y una vez cada aproximadamente 96 horas. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra dos veces por semana. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra en semanas alternas. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra una vez al mes. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra en meses alternos. En ciertos casos, el agente de ARNi se administra una vez cada tres meses.
En ciertos casos, el agente de ARNi se administra al sujeto con un agente terapéutico adicional. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, un agente antiviral, un inhibidor de la transcriptasa inversa, un inmunoestimulador, una vacuna terapéutica, un inhibidor de entrada viral, un oligonucleótido que inhibe la secreción o liberación de HbsAg, un inhibidor de la cápside, un inhibidor de ADN circular cerrado covalentemente (ccc) del HBV y una combinación de cualquiera de los anteriores.
En ciertos casos, el agente adicional es un inhibidor de la transcriptasa inversa. En ciertas realizaciones, el agente adicional es un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inmunoestimulador. Los inhibidores de la transcriptasa inversa de ejemplo incluyen tenofovir disoproxilo fumarato (TDF), tenofovir alafenamida, lamivudina, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudina y AGX-1009. Los inmunoestimuladores de ejemplo incluyen interferón alfa 2a pegilado (PEG-IFN-a2a), interferón alfa-2b, una interleuquina-7 humana recombinante y un agonista del receptor 7 similar a Toll (TLR7).
Se describen también métodos de tratamiento de un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis D (HDV), que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, comprendiendo la composición (a) un primer agente de a Rní bicatenario que comprende una primera cadena y una primera cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la primera cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; y (b) un segundo agente de ARNi bicatenario que comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la segunda cadena paralela está conjugada con un ligando unido al extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, y la primera cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, en donde la segunda cadena paralela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 29, y la segunda cadena antiparalela comprende al menos 15 nucleótidos contiguos que difieren en no más de 3 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 30, tratando así al sujeto.
En ciertos casos, la primera cadena paralela comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ IDNO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ ID NO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ ID NO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ ID NO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ ID NO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ IDNO: 39), y
la segunda cadena antiparalela comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40).
En ciertas realizaciones, todos los nucleótidos de la cadena paralela y todos los nucleótidos de la cadena antiparalela comprenden una modificación. En ciertas realizaciones, el agente adicional es al menos uno de los nucleótidos modificados que se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En ciertas realizaciones, el ligando es
Figure imgf000026_0001
En ciertas realizaciones, el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000026_0002
La figura 1 representa esquemáticamente la estructura del genoma del HBV bicatenario de aproximadamente 3.2 kb. La replicación del genoma del HBV se produce a través de un intermedio de ARN y produce 4 transcritos virales que se superponen (un transcrito de aproximadamente 3.5 kb, un transcrito de aproximadamente 2.4 kb, un transcrito de aproximadamente 2.1 kb y un transcrito de aproximadamente 0.7 kb) que codifica siete proteínas virales (pre-S1, pre-S2, S, P, X, pre-C y C) traducidos a lo largo de tres marcos de lectura.
La figura 2 es un gráfico que representa la disminución logarítmica de los niveles en el suero de HBsAg normalizados respecto a los niveles en el suero de HBsAg predosis, después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg de los agentes de ARNi indicados.
La figura 3 es un gráfico que representa la disminución logarítmica de los niveles en el suero de HBsAg normalizados respecto a los niveles en el suero de HBsAg predosis, después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg de los agentes de ARNi indicados.
La figura 4 es un gráfico que representa el porcentaje de HBsAg predosis que queda en los días 5 y 10 después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg de los agentes de ARNi indicados. La figura 4 también representa el porcentaje de HBsAG que queda el día 10 después de la dosis en relación con el porcentaje de HBsAG que queda el día 10 después de la dosis en un animal al que se le administran 3 mg/kg de un ARNbc de control que se dirige a la transteritina de ratón/rata (mrTTR).
La figura 5 es una gráfica que representa la disminución logarítmica de los niveles en el suero de HBsAg normalizados respecto a los niveles en el suero de HBsAg predosis, después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg de AD-65403.
La figura 6A es un gráfico que representa la disminución de los niveles en el suero de HBsAg normalizados respecto a los niveles en el suero de HBsAg predosis, en una escala lineal estándar después de la administración de una dosis subcutánea única de 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 9 mg/kg de AD-66810.
La figura 6B es un gráfico que representa la disminución de los niveles en el suero de HBsAg normalizados respecto a los niveles en el suero de HBsAg predosis, en una escala log10 después de la administración de una dosis subcutánea única de 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 9 mg/kg de AD-66810.
La figura 7 es un gráfico que muestra la disminución de los niveles plasmáticos de HBsAg normalizados respecto a los niveles plasmáticos de HBsAg predosis, en una escala log10 después de la administración de tres dosis subcutáneas semanales de 3 mg/kg de AD-66810.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen del virus de la hepatitis B (HBV). El gen puede estar en una célula, p. ej., una célula en un sujeto, tal como un ser humano. El uso de estos ARNi permite la degradación dirigida de los ARNm del gen correspondiente (gen del HBV) en mamíferos.
Los agentes de ARNi se han diseñado para dirigirse a regiones en el genoma de1HBV que están conservadas en los 8 serotipos del HBV. Además, los agentes de ARNi se han diseñado para inhibir todas las etapas del ciclo de vida del HBV, p. ej., replicación, ensamblaje, secreción de virus y secreción de antígenos sub-virales, inhibiendo la expresión de más de un gen del HBV. En particular, puesto que la transcripción del genoma de1HBV produce ARN policistrónicos que se superponen, un agente de ARNi que se dirige a un solo gen de1HBV produce una inhibición significativa de la expresión de la mayoría o todos los transcritos del HBV. Por ejemplo, debido a que el genoma del HBV se transcribe en un solo ARNm, un agente de ARNi dirigido al gen S dará como resultado la inhibición no solo de la expresión del gen S sino también de la expresión del gen de la polimerasa "secuencia abajo". Además, los agentes de ARNi se han diseñado para inhibir la replicación viral del HBV dirigiéndose a los genes estructurales del HBV, y el gen X del HBV permitiendo así al sistema inmunitario de un sujeto detectar y responder a la presencia de HBsAg para producir anticuerpos anti-HBV para eliminar una infección por HBV. Sin pretender estar limitados por la teoría, se cree que una combinación o sub-combinación de las propiedades anteriores y los sitios objetivo específicos y/o las modificaciones específicas en estos agentes de ARNi confieren a los agentes de ARNi eficacia, estabilidad, seguridad, potencia y durabilidad mejoradas.
Usando ensayos in vitro e in vivo, los autores de la presente invención han demostrado que los ARNi que se dirigen a un gen del HBV pueden mediar potentemente en la ARNi, dando como resultado una inhibición significativa de la expresión de más de un gen del HBV. Los autores de la presente invención también han demostrado que los agentes de ARNi de la invención son excepcionalmente estables en el citoplasma y el lisosma. Por lo tanto, los métodos y composiciones que incluyen estos ARNi son útiles para tratar a un sujeto que tiene una infección por el HBV y/o una enfermedad asociada al HBV, tal como la hepatitis B crónica (CHB).
También se describen métodos para tratar a un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la inhibición o reducción de la expresión de un gen del HBV, p. ej., una enfermedad asociada a1HBV, tal como infección crónica por el virus de la hepatitis B (CHB), usando composiciones de ARNi que efectúan la escisión mediada por el complejo silenciador inducido por ARN (RISC) de transcritos de ARN de un gen de HBV.
Dosis muy bajas de los ARNi, en particular, pueden mediar específica y eficientemente la interferencia de ARN (ARNi), dando como resultado una inhibición significativa de la expresión del gen correspondiente (gen de1HBV). Los ARNi incluyen una cadena de ARN (la cadena antiparalela) que tiene una región que tiene aproximadamente 30 nucleótidos o menos de longitud, p. ej., 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19­ 28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud, cuya región es sustancialmente complementaria a al menos parte de un transcrito de ARNm de un gen de1HBV.
La siguiente descripción detallada describe cómo hacer y usar composiciones que contengan ARNi para inhibir la expresión de un gen del HBV, así como composiciones, usos y métodos para tratar sujetos que tienen enfermedades y trastornos que se beneficiarían de la inhibición y/o reducción de la expresión de un gen de1HBV. I. Definiciones
Con el fin de que la presente descripción se pueda entender más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Además, debe observarse que siempre que se cite un valor o intervalo de valores de un parámetro, se pretende que los valores e intervalos intermedios de los valores citados también sean parte de esta invención.
Los artículos "un" y "una" se usan en la presente memoria para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento, p. ej., una pluralidad de elementos.
El término "que incluye" se usa en la presente memoria para significar, y se usa indistintamente con la frase "que incluye pero no limitado a".
El término "o" se usa en la presente memoria para significar, y se usa indistintamente con el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en la presente memoria, "virus de la hepatitis B", usado indistintamente con el término "HBV" se refiere al conocido virus de ADN hepatotrópico no citopático que pertenece a la familia Hepadnaviridae.
El genoma del HBV es ADN circular parcialmente bicatenario, con marcos de lectura que se superponen (véase, p. ej., la figura 1).
Hay cuatro genes conocidos codificados por el genoma del HBC, llamados C, X, P y S. La proteína central es codificada por el gen C (HBcAg). El antígeno de la hepatitis B (HBeAg) es producido por el procesamiento proteolítico de la proteína pre-núcleo (pre-C). La ADN polimerasa es codificada por el gen P. El gen S es el gen que codifica el antígeno de superficie (HBsAg). El gen de HBsAg es un marco de lectura abierto largo pero contiene tres codones de "inicio" (ATG) en el marco que dividen el gen en tres secciones, pre-S1, pre-S2 y S. Debido a los múltiples codones de inicio, se producen polipéptidos de tres tamaños diferentes llamados grande, medio y pequeño (pre-S1 pre-S2 S, pre-S2 S o S). La función de la proteína no estructural codificada por el gen X no se entiende totalmente, pero está asociada con el desarrollo del cáncer de hígado y codifica una proteína señuelo que permite que el HBsAg en la sangre secuestre anticuerpos anti-HBsAg y permite que partículas virales infecciosas escapen de la inmunodetección.
Las proteínas codificadas por el genoma del HBV incluyen: proteínas de envoltura: i) pequeño, antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg); ii) medio - preS2 más HBsAg; iii) grande - preS1 más preS2 más HBsAg; proteína de nucleocápside, antígeno nuclear de la hepatitis B (HBcAg). El antígeno e de la hepatitis B (HBeAg) es una proteína no estructural producida durante la replicación del HBV que comparte 90% de aminoácidos con el HBcAg de la nucleocápside; y la proteína X es una proteína no estructural (HBx) que funciona en el citoplasma para activar varias vías de señalización, muchas de las cuales están controladas por la modulación del calcio citosólico y en el núcleo para regular la transcripción a través de una interacción directa con diferentes factores de transcripción y, en algunos casos, mejorar su unión a elementos de transcripción específicos.
El HBV es uno de los pocos virus de ADN que usa la transcriptasa inversa en el proceso de replicación que implica múltiples etapas, incluyendo la entrada, desprendimiento y transporte del genoma del virus al núcleo. Inicialmente, la replicación del genoma del HBV implica la generación de un intermedio de ARN que después se transcribe de forma inversa para producir el genoma viral del ADN.
Tras la infección de una célula con HBV, el ADN circular relajado genómico viral (ADNrc) es transportado al núcleo celular y se convierte en ADN circular cerrado covalentemente episomal (ADNccc), que sirve como molde de transcripción para los ARNm virales. Después de la transcripción y la exportación nuclear, el ARN pregenómico viral citoplasmático (ARNpg) se ensambla con la polimerasa del h Bv y las proteínas de la cápside para formar la nucleocápside, dentro de la cual la transcripción inversa catalizada por polimerasa produce a Dn de cadena negativa, que posteriormente se copia en ADN de cadena positiva para formar la progenie del genoma del ADNrc. Las nucleocápsides maduras se empaquetan con proteínas de envoltura viral para salir como partículas de virión o se transportan al núcleo para amplificar el depósito de ADNccc a través de la ruta de amplificación de ADNccc intracelular. El ADNccc es un componente esencial del ciclo de replicación de1HBV y es responsable para el establecimiento de la infección y persistencia vírica.
La infección por el HBV da como resultado la producción de dos partículas diferentes: 1) el propio virus de1HBV (o partícula Dane) que incluye una cápside viral ensamblada a partir del HBcAg y está cubierta por e1HBsAg y es capaz de reinfectar células y 2) partículas subvirales (o SVP), que son partículas similares a lipoproteínas de alta densidad compuestas de lípidos, colesterol, ésteres de colesterol y las formas pequeña y mediana del antígeno de superficie de la hepatitis B HBsAg, que no son infecciosas. Por cada partícula viral producida, se liberan 1000-10000 SVP en la sangre. Como tales SVP (y la proteína HBsAg que llevan) representan la abrumadora mayoría de la proteína viral en la sangre. Las células infectadas por el HBV también secretan un producto proteolítico soluble de la proteína pre-núcleo llamado antígeno e del HBV (HBeAg).
Se han determinado ocho genotipos de HBV, designados A a H, cada uno con una distribución geográfica distinta. El virus no es citopático, y la inmunidad celular específica de virus es el principal determinante para el resultado de la exposición al HBV, infección aguda con resolución de enfermedades hepáticas con 6 meses o infección crónica por HBV que frecuentemente está asociada con daño hepático progresivo.
El término "HBV" incluye cualquiera de los ocho genotipos de HBV (A a H). La secuencia de aminoácidos y de codificación completa de la secuencia de referencia del genoma del HBV se pueden encontrar, por ejemplo, en los n° de acceso en GenBank GI: 21326584 (SEQ ID NO: 1) y GI: 3582357 (SEQ ID NO: 3).
Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de HBV están fácilmente disponibles usando bases de datos disponibles al público, p. ej., GenBank, UniProt y OMIM.
El término "HBV", como se usa en la presente memoria, también se refiere a variaciones de secuencia de ADN de origen natural del genoma de HBV.
Como se usa en la presente memoria, "virus de la hepatitis D", usado indistintamente con el término "HDV" se refiere al conocido virus de ADN hepatotrópico no citopático que pertenece a la familia Hepadnaviridae. Véase, p. ej., Ciancio y Rizzetto, Nat. Rev. 11:68-71, 2014; Le Gal y col., Emerg. Infectar. Dis. 12:1447-1450, 2006; y Abbas y afzal, World J. Hep., 5:666-675, 2013. A menos que se indique lo contrario, HDV se refiere a todos los clados y variantes de HDV.
El HDV produce una proteína, en concreto, HDAg. Viene en dos formas; un HDAg grande de 27 kDa (también denominado en la presente memoria 1HD, L-HDAg y antígeno de HDV grande) y un HDAg pequeño de 24 kDa (también denominado en la presente memoria sHD, S-HDAg y antígeno de HDV pequeño). Los extremos N de las dos formas son idénticos, difieren en 19 aminoácidos en el extremo C del HDAg grande. Ambas isoformas se producen a partir del mismo marco de lectura que contiene un codón de parada UAG en el codón 196, que normalmente produce solo el HDAg pequeño. Sin embargo, la edición por la enzima celular adenosina desaminasa-1 cambia el codón de parada a UCG, permitiendo que se produzca el HDAg grande. A pesar de tener 90% de secuencias idénticas, estas dos proteínas tienen funciones divergentes durante el curso de una infección. HDAg-S se produce en las primeras etapas de una infección y entra al núcleo y mantiene la replicación viral. HDAg-L, en cambio, se produce durante las últimas etapas de una infección, actúa como un inhibidor de la replicación vírica y es necesaria para el ensamblaje de las partículas víricas.
Ejemplos adicionales de secuencias de ARNm de HDV están fácilmente disponibles usando bases de datos disponibles al público, p. ej., GenBank, UniProt y OMIM.
El término "HDV", como se usa en la presente memoria, también se refiere a variaciones de secuencia de ADN de origen natural del genoma del HDV.
Como se usa en la presente memoria, "secuencia objetivo" se refiere a una porción contigua de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen de HBV, que incluye ARNm que es un producto del procesamiento de ARN de un producto de transcripción primario. En una realización, la porción objetivo de la secuencia será al menos lo suficientemente larga como para servir como sustrato para la escisión dirigida por ARNi en o cerca de esa porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm formada durante la transcripción de un gen del HBV.
La secuencia objetivo puede ser de aproximadamente 9-36 nucleótidos de longitud, p. ej., aproximadamente 15-30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la secuencia objetivo puede ser de aproximadamente 15-30 nucleótidos, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18­ 26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21­ 25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud. Los intervalos y longitudes intermedios a los intervalos y longitudes mencionados anteriormente también está contemplado que son parte de la invención.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleótidos que se describe mediante la secuencia a la que se hace referencia usando la nomenclatura de nucleótidos estándar.
"G", "C", "A", "T" y "U" representa cada uno en general un nucleótido que contiene guanina, citosina, adenina, timidina y uracilo como base, respectivamente. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" también se puede referir a un nucleótido modificado, como se detalla más adelante, o un resto de reemplazo sustituto (véase, p. ej., Tabla 2). El experto en la técnica sabe muy bien que la guanina, citosina, adenina y uracilo se pueden reemplazar por otros restos sin alterar sustancialmente las propiedades de apareamiento de bases de un oligonucleótido que comprende un nucleótido que lleva dicho resto de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede hacer el emparejamiento de bases con nucleótidos que contienen adenina, citosina o uracilo. Por lo tanto, los nucleótidos que contienen uracilo, guanina o adenina se pueden reemplazar en las secuencias de nucleótidos del ARNbc presentado en la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. En otro ejemplo, la adenina y la citosina en cualquier parte del oligonucleótido se pueden reemplazar por guanina y uracilo, respectivamente, para formar el apareamiento de bases G-U de Wobble con el ARNm objetivo. Las secuencias que contienen dichos restos de reemplazo son adecuadas para las composiciones y métodos caracterizados en la invención.
Los términos "ARNi", "agente de ARNi", "agente ARNi", "agente de interferencia de ARN" como se usan indistintamente en la presente memoria, se refieren a un agente que contiene ARN tal como se define ese término en la presente memoria, y que media la escisión dirigida de un transcrito de ARN a través de una ruta del complejo silenciador inducido por ARN (RISC). El ARNi dirige la degradación específica de secuencia del ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (ARNi). El ARNi modula, p. ej., inhibe, la expresión de un gen del HBV (p. ej., uno o más genes del HBV) en una célula, p. ej., una célula en un sujeto, tal como un sujeto mamífero.
En un caso, un agente de ARNi incluye un ARN monocatenario que interacciona con una secuencia de ARN objetivo, p. ej., una secuencia de ARNm objetivo del HBV, para dirigir la escisión del ARN objetivo. Sin desear estar limitado por la teoría, se cree que el ARN bicatenario largo introducido en las células es descompuesto en ARNip por una endonucleasa de Tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc en ARN interferentes cortos de 19-23 pares de bases con dos salientes 3' característicos de dos bases (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). Los ARNip después se incorporan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip, permitiendo que la cadena antiparalela complementaria guíe el reconocimiento del objetivo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). Tras unirse al ARNm objetivo adecuado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden el objetivo para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un ARNip monocatenario (ARNmc) generado dentro de una célula y que promueve la formación de un complejo RISC para efectuar el silenciamiento del gen objetivo, es decir, un gen de1HBV. Por consiguiente, el término "ARNip" también se usa en la presente memoria para referirse a un ARNi como se ha descrito antes.
En otro caso, el agente de ARNi puede ser un ARNip monocatenario que se introduce en una célula u organismo para inhibir un ARNm objetivo. Los agentes de ARNi monocatenarios se unen a la endonucleasa RISC, Argonaute 2, que después escinde el ARNm objetivo. Los ARNip monocatenarios son generalmente de 15-30 nucleótidos y están modificados químicamente. El diseño y ensayos de los ARNip monocatenarios se describen en la patente de EE.UU. n° 8101348 y en Lima et al., (2012) Cell 150:883-894. Cualquiera de las secuencias de nucleótidos antiparalela descritas en la presente memoria se puede usar como un ARNip monocatenario como se describe en la presente memoria o modificado químicamente por los métodos descritos en Lima et al., (2012) Cell 150:883-894.
En otro caso, un "ARNi" para usar en las composiciones, usos y métodos de la invención es un ARN bicatenario y se denomina en la presente memoria un "agente de ARNi bicatenario", "molécula de ARN bicatenario (ARNbc)", "agente de ARNbc "o" ARNbc ". El término "ARNbc" se refiere a un complejo de moléculas de ácido ribonucleico, que tiene una estructura de dúplex que comprende dos cadenas de ácido nucleico antiparalelas y sustancialmente complementarias, mencionadas como de orientaciones "paralela" y "antiparalela" con respecto a un ARN objetivo, es decir, un gen del HBV. En algunos casos, un ARN bicatenario (ARNbc) desencadena la degradación de un ARN objetivo, p. ej., un ARNm, a través de un mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional denominado en la presente memoria interferencia de ARN o ARNi.
En general, la mayoría de los nucleótidos de cada cadena de una molécula de ARNbc son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en la presente memoria, cada una o ambas cadenas también pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, p. ej., un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, como se usa en esta memoria descriptiva, un "agente de ARNi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas; un agente de ARNi puede incluir modificaciones sustanciales en múltiples nucleótidos. Como se usa en la presente memoria, la expresión "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleótidos modificado y/o una nucleobase modificada. Por lo tanto, la expresión nucleótido modificado abarca sustituciones, adiciones o eliminación de, p. ej., un grupo funcional o átomo, a enlaces internucleósidos, restos de azúcar o nucleobases. Las modificaciones adecuadas para usar en los agentes de la invención incluyen todos los tipos de modificaciones descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica.
Cualquiera de dichas modificaciones, como se usa en una molécula de tipo ARNip, está comprendida por el "agente de a Rní" para los fines de esta memoria descriptiva y reivindicaciones.
La región de dúplex puede ser de cualquier longitud que permita la degradación específica de un ARN objetivo deseado a través de una ruta de RISC, y puede variar de aproximadamente 9 a 36 pares de bases de longitud, p. ej., aproximadamente 15-30 pares de bases de longitud, por ejemplo, aproximadamente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 o 36 pares de bases de longitud, tal como aproximadamente 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19­ 25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases de longitud. También se contemplan intervalos y longitudes intermedios de los intervalos y longitudes mencionados antes.
Las dos cadenas que forman la estructura de dúplex pueden ser porciones diferentes de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. Cuando las dos cadenas son parte de una molécula más grande y, por lo tanto, están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva que forma la estructura de dúplex, la cadena de ARN de conexión se denomina un "bucle en horquilla". Un bucle en horquilla puede comprender al menos un nucleótido no apareado. En algunas realizaciones, el bucle en horquilla puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 23 o más nucleótidos no apareados.
Cuando las dos cadenas sustancialmente complementarias de un ARNbc están compuestas por moléculas de ARN separadas, no es necesario, pero esas moléculas pueden estar conectadas covalentemente. Cuando las dos cadenas están conectadas covalentemente por medios distintos de una cadena ininterrumpida de nucleótidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva que forma la estructura de dúplex, la estructura de conexión se denomina un "conector". Las cadenas de ARN pueden tener el mismo número o un número diferente de nucleótidos. El número máximo de pares de bases es el número de nucleótidos en la cadena más corta del ARNbc menos cualquier saliente que esté presente en el dúplex. Además de la estructura de dúplex, un ARNi puede comprender uno o más salientes de nucleótidos.
En un caso, un agente de ARNi es un ARNbc, cada cadena del cual comprende 24-30 nucleótidos, que interacciona con una secuencia de ARN objetivo, p. ej., una secuencia de ARNm objetivo de1HBV, para dirigir la escisión del ARN objetivo. Sin desear estar limitados por la teoría, el ARN bicatenario largo introducido en las células es descompuesto en ARNip por una endonucleasa de Tipo III conocida como Dicer (Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). Dicer, una enzima similar a la ribonucleasa III, procesa el ARNbc en ARN interferentes cortos de 19-23 pares de bases con dos salientes característicos 3' de dos bases (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363) Los ARNip después se incorporan en un complejo silenciador inducido por ARN (RISC) donde una o más helicasas desenrollan el dúplex de ARNip, permitiendo que la cadena antiparalela complementaria guíe el reconocimiento del objetivo (Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). Tras la unión al ARNm objetivo adecuado, una o más endonucleasas dentro del RISC escinden el objetivo para inducir el silenciamiento (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188).
Como se usa en la presente memoria, la expresión "saliente de nucleótidos" se refiere a al menos un nucleótido no apareado que sobresale de la estructura de dúplex de un ARNi, p. ej., un ARNbc. Por ejemplo, cuando un extremo 3' de una cadena de un ARNbc se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa, hay un saliente de nucleótidos. Un ARNbc puede comprender un saliente de al menos un nucleótido; alternativamente, el saliente puede comprender al menos dos nucleótidos, al menos tres nucleótidos, al menos cuatro nucleótidos, al menos cinco nucleótidos o más. Un saliente de nucleótidos puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, que incluye un desoxinucleótido/nucleósido. El o los salientes pueden estar en la cadena paralela, la cadena antiparalela o cualquier combinación de los mismos. Además, el o los nucleótidos de un saliente pueden estar presentes en el extremo 5', el extremo 3' o en ambos extremos de una cadena antiparalela o paralela de un ARNbc.
En un caso, la cadena antiparalela de un ARNbc tiene un saliente de 1-10 nucleótidos, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' y/o el extremo 5'. En una realización, la cadena paralela de un ARNbc tiene un saliente de 1-10 nucleótidos, p. ej., de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, en el extremo 3' y/o el extremo 5'. En otro caso, uno o más de los nucleótidos en el saliente se reemplaza por un tiofosfato de nucleósido.
"Romo" o "extremo romo" significa que no hay nucleótidos no apareados en ese extremo del agente de ARNi bicatenario, es decir, no hay saliente de nucleótidos. Un agente de ARNi de "extremo romo" es un ARNbc que es de doble cadena en toda su longitud, es decir, no hay saliente de nucleótidos en ninguno de los extremos de la molécula. Los agentes ARNi incluyen agentes de ARNi con salientes de nucleótidos en un extremo (es decir, agentes con un saliente y un extremo romo) o con salientes de nucleótidos en ambos extremos.
La expresión "cadena antiparalela" o "cadena guía" se refiere a la cadena de un ARNi, p. ej., un ARNbc, que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia objetivo, p. ej., un ARNm de HBV. Como se usa en la presente memoria, la expresión "región de complementariedad" se refiere a la región en la cadena antiparalela que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo una secuencia objetivo, p. ej., una secuencia de nucleótidos de HBV, como se define en la presente memoria. Cuando la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia objetivo, los apareamientos erróneos pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula. En general, los apareamientos erróneos más tolerados están en las regiones terminales, p. ej., dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos del extremo 5' y/o 3' del ARNi. En un caso, un agente de ARNi bicatenario incluye un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena antiparalela. En otro caso, un agente de ARNi bicatenario incluye un apareamiento erróneo de nucleótidos en la cadena paralela. En un caso, el apareamiento erróneo de nucleótidos está, por ejemplo, dentro de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos desde el extremo 3' del ARNi. En otro caso, el apareamiento erróneo de nucleótidos está, por ejemplo, en el nucleótido 3'-terminal del ARNi.
La expresión "cadena paralela" o "cadena pasajera" como se usa en la presente memoria, se refiere a la cadena de un a Rní que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la cadena antiparalela tal como se define ese término en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "región de escisión" se refiere a una región que se encuentra inmediatamente adyacente al sitio de escisión. El sitio de escisión es el sitio en el objetivo en el que se produce la escisión. En algunos casos, la región de escisión comprende tres bases en cada extremo e inmediatamente adyacente al sitio de escisión. En algunos casos, la región de escisión comprende dos bases en cada extremo e inmediatamente adyacente al sitio de escisión. En algunas realizaciones, el sitio de escisión ocurre específicamente en el sitio unido por los nucleótidos 10 y 11 de la cadena antiparalela, y la región de escisión comprende los nucleótidos 11, 12 y 13.
Como se usa en la presente memoria, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótidos en relación con una segunda secuencia de nucleótidos, se refiere a la capacidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótidos para hibridarse y formar un estructura de dúplex en ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótidos, como entenderá el experto en la técnica. Dichas condiciones pueden ser, por ejemplo, condiciones restrictivas, donde las condiciones restrictivas pueden incluir: NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido de lavado (véase, p. ej., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se pueden aplicar otras condiciones, tales como las condiciones fisiológicamente relevantes que se pueden encontrar dentro de un organismo. El experto en la técnica podrá determinar el conjunto de condiciones más adecuadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de acuerdo con la aplicación final de los nucleótidos hibridados.
Secuencias complementarias dentro de un ARNi, p. ej., dentro de un ARNbc como se describe en la presente memoria, incluye el apareamiento de bases del oligonucleótido o polinucleótido que comprende una primera secuencia de nucleótidos con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende una segunda secuencia de nucleótidos en toda la longitud de una o ambas secuencias de nucleótidos. Dichas secuencias se pueden denominar "completamente complementarias" entre sí en la presente memoria. Sin embargo, cuando se hace referencia a una primera secuencia como "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en la presente memoria, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar una o más, pero generalmente no más de 5, 4, 3 o 2 pares de bases mal apareadas tras la hibridación para un dúplex de hasta 30 pares de bases, a la vez que conserva la capacidad de hibridarse en las condiciones más relevantes para su aplicación final, p. ej., inhibición de la expresión génica a través de una ruta RISC. Sin embargo, cuando dos oligonucleótidos están diseñados para formar, tras la hibridación, uno o más salientes monocatenarios, dichos salientes no se considerarán apareamientos erróneos con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNbc que comprende un oligonucleótido de 21 nucleótidos de longitud y otro oligonucleótido de 23 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido más largo comprende una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementario al oligonucleótido más corto, todavía se puede denominar "completamente complementario" para los fines descritos en la presente memoria.
Las secuencias "complementarias", como se usan en la presente memoria, también pueden incluir, o estar formadas completamente de pares de bases no Watson-Crick y/o pares de bases formadas a partir de nucleótidos no naturales y modificados, en la medida en que se cumplan los requisitos anteriores con respecto a su capacidad de hibridación. Dichos pares de bases que no son de Watson-Crick incluyen, entre otros, el apareamiento de bases G:U de Wobble o Hoogstein.
Los términos "complementario", "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" en la presente memoria se pueden usar con respecto al apareamiento de bases entre la cadena paralela y la cadena antiparalela de un ARNbc, o entre la cadena antiparalela de un agente de ARNi y una secuencia objetivo, como se entenderá del contexto de su uso.
Como se usa en la presente memoria, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a al menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (p.ej., un ARNm que codifica un gen del HBV). Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a al menos una parte de un ARNm de HBV si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm que codifica un gen del HBV.
Por consiguiente, en algunos casos, los polinucleótidos de cadena antiparalela descritos en la presente memoria son completamente complementarios a la secuencia del HBV objetivo. En otros casos, los polinucleótidos de cadena antiparalela descritos en la presente memoria son sustancialmente complementarios a la secuencia de1HBV objetivo y comprenden una secuencia de nucleótidos contigua que es al menos aproximadamente 80% complementaria en toda su longitud a la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1, o un fragmento de SEQ ID NO: 1, tal como aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente% 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% complementaria.
En un caso, un agente de ARNi incluye una cadena paralela que es sustancialmente complementaria a un polinucleótido antiparalelo que, a su vez, es complementario a una secuencia objetivo de1HBV, y en donde el polinucleótido de cadena paralela comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es al menos aproximadamente 80% complementaria en toda su longitud a la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 38 y 40, o un fragmento de cualquiera de las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 12, 38 y 40, tal como aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente% 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% complementaria. En otro caso, un agente de ARNi incluye una cadena antiparalela que es sustancialmente complementaria con la secuencia objetivo de1HBV y comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es al menos aproximadamente 80% complementaria en toda su longitud a la región equivalente de la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 37, y 39 o un fragmento de cualquiera de las SEQ ID NO:5, 7, 9, 11, 37 y 39, tal como aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente % 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% complementaria.
En algunos casos, la mayoría de los nucleótidos de cada cadena son ribonucleótidos, pero como se describe en detalle en la presente memoria, cada una o ambas cadenas también pueden incluir uno o más no ribonucleótidos, p. ej., un desoxirribonucleótido y/o un nucleótido modificado. Además, un "ARNi" puede incluir ribonucleótidos con modificaciones químicas. Dichas modificaciones pueden incluir todos los tipos de modificaciones descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica. Cualquiera de dichas modificaciones, como se usa en una molécula de ARNi, está comprendida por "ARNi" para los fines de esta memoria descriptiva y reivindicaciones.
En un aspecto de la descripción, un agente para usar en los métodos y composiciones de la invención es una molécula de ácido nucleico antiparalelo monocatenario que inhibe un ARNm objetivo por un mecanismo de inhibición antiparalelo. La molécula de ARN antiparalelo monocatenario es complementaria a una secuencia dentro del ARNm objetivo. Los oligonucleótidos antiparalelos monocatenarios pueden inhibir la traducción de una forma estequiométrica por el apareamiento de bases con el ARNm y obstruir físicamente la maquinaria de traducción, véase Dias, N. et al., (2002) Mol Cáncer Ther 1:347-355. La molécula de ARN antiparalelo monocatenario puede tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud y tener una secuencia que es complementaria a una secuencia diana. Por ejemplo, la molécula de ARN antiparalelo monocatenario puede comprender una secuencia que es al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias antiparalelas descritas en la presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, un "sujeto" es un animal, tal como un mamífero, incluyendo un primate (tal como un ser humano, un primate no humano, p. ej., un mono y un chimpancé), un no primate (tal como una vaca, un cerdo, un camello, una llama, un caballo, una cabra, un conejo, una oveja, un hámster, un cobayo, un gato, un perro, una rata, un ratón, un caballo y un ballena) o un pájaro (p. ej., un pato o un ganso). En un caso, el sujeto es un ser humano, tal como un ser humano tratado o evaluado por una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión y/o replicación del gen del HBV; un ser humano en riesgo de una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión y/o replicación del gen de1HBV; un ser humano que tiene una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión y/o replicación del gen del HBV; y/o ser humano tratado por una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión y/o replicación del gen del HBV, como se describe en la presente memoria. En otro caso, el sujeto tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV). En otro caso, el sujeto tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV) y una infección por el virus de la hepatitis D (HDV).
Como se usa en la presente memoria, los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a un resultado beneficioso o deseado que incluye, pero no se limita a, alivio o mejora de uno o más síntomas asociados con la expresión del gen del HBV y/o replicación del HBV no deseadas, p. ej., la presencia de ADN ccc de HBV en el suero y/o hígado, la presencia de antígeno del HBV en el suero y/o hígado, p. ej., HBsAg y/o HBeAg, ALT elevada, AST elevada, ausencia o nivel bajo de anticuerpos anti-HBV, daño hepático; cirrosis; hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular; síndrome similar a la enfermedad del suero; anorexia; náuseas; vómitos, fiebre baja; mialgia; fatigabilidad; agudeza gustativa y sensaciones olfativas alteradas (aversión a alimentos y los cigarrillos); y/o dolor del cuadrante superior derecho y epigástrico (intermitente, leve a moderado); encefalopatía hepática; somnolencia; alteraciones en el patrón de sueño; confusión mental; coma; ascitis; hemorragia gastrointestinal; coagulopatía ictericia; hepatomegalia (hígado blando, levemente agrandado); esplenomegalia; eritema palmar; arañas vasculares, desgaste muscular; angiomas en araña; vasculitis; sangrado varicoso; edema periférico; ginecomastia; atrofia testicular; venas colaterales abdominales (caput medusae); altos niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), dentro de un intervalo de 1000-2000 UI/ml, aunque también se pueden identificar valores 100 veces por encima del límite superior de la normalidad (ULN); niveles de ALT superiores a los niveles de AST; niveles elevados de gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina (ALP) (p. ej., no más de 3 veces el ULN); niveles de albúmina ligeramente bajos; niveles elevados de hierro en suero; leucopenia (es decir, granulocitopenia); linfocitosis; velocidad de sedimentación globular (ESR) aumentada; supervivencia de los glóbulos rojos acortada; hemólisis; trombocitopenia; una prolongación de la razón internacional normalizada (INR); la presencia en el suero y/o hígado de HBsAg, HBeAg, inmunoglobulina M (IgM) anticuerpo del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc); anticuerpo de superficie de hepatitis B (anti-HBs), anticuerpo de hepatitis B e (anti-HBe), y/o ADN de HBV; elevación de las aminotransferasas (<5 veces el ULN); niveles de ALT mayores que los niveles de AST; niveles de bilirrubina aumentados, tiempo de protrombina (PT) prolongado; hiperglobulinemia; la presencia de anticuerpos no específicos de tejido, tal como los anticuerpos antimúsculo liso (ASMA) o los anticuerpos antinucleares (ANA) (10-20%); la presencia de anticuerpos específicos de tejido, tales como los anticuerpos contra la glándula tiroides (10-20%); niveles elevados de factor reumatoide (RF); hiperbilirrubinemia, PT prolongado, recuentos bajos de plaquetas y glóbulos blancos, niveles de AST superiores a los niveles de ALT; niveles elevados de fosfatasa alcalina (ALP) y GGT; lobular, con cambios hepatocelulares degenerativos y regenerativos, e inflamación acompañante; necrosis predominantemente centrolobulillar ya sea detectable o indetectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada en ausencia de tratamiento.
El término "inferior en el contexto del nivel de expresión génica del HBV y/o la replicación de1HBV en un sujeto o un marcador o síntoma de enfermedad se refiere a una disminución estadísticamente significativa de dicho nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o más y preferiblemente está por debajo de un nivel aceptado como dentro del intervalo normal para un individuo sin dicho trastorno. En ciertos casos, la expresión del objetivo se normaliza, es decir, disminuye a un nivel aceptado cono dentro del intervalo normal para un individuo sin dicho trastorno, p. ej., el nivel de un marcador de enfermedad, como ALT o AST, se reduce a un nivel aceptado como dentro del intervalo normal para un individuo sin dicho trastorno.
Como se usa en la presente memoria, "prevención" o "prevenir", cuando se usa en referencia a una enfermedad, trastorno o afección del mismo, que se beneficiaría de una reducción en la expresión de un gen y/o replicación del HBV, se refiere a una reducción en la probabilidad de que un sujeto desarrolle un síntoma asociado con dicha enfermedad, trastorno o afección, p. ej., un síntoma de infección por HBV no deseada, como la presencia de ADN ccc de HBV en el suero y/o hígado, la presencia de ADN de HBV en el suero, la presencia de antígeno de HBV en el suero y/o hígado, p. ej., HBsAg y/o HBeAg, ALT elevada, AST elevada, la ausencia o nivel bajo de anticuerpos anti-HBV, una lesión hepática; cirrosis; hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular; síndrome similar a la enfermedad del suero; anorexia; náuseas; vómitos, fiebre baja; mialgia; fatigabilidad; agudeza gustativa y sensaciones olfativas alteradas (aversión a alimentos y los cigarrillos); y/o dolor del cuadrante superior derecho y epigástrico (intermitente, leve a moderado); encefalopatía hepática; somnolencia; alteraciones en el patrón de sueño; confusión mental; coma; ascitis; hemorragia gastrointestinal; coagulopatía ictericia; hepatomegalia (hígado blando, levemente agrandado); esplenomegalia; eritema palmar; arañas vasculares, desgaste muscular; angiomas en araña; vasculitis; sangrado de varices; edema periférico; ginecomastia; atrofia testicular; venas colaterales abdominales (caput medusae); niveles altos de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), dentro de un intervalo de 1000-2000 UI/ml, aunque también se pueden identificar valores 100 veces por encima del límite superior de la normalidad (ULN); niveles de ALT mayores que los niveles de AST; niveles elevados de gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina (ALP) (p. ej., no más de 3 veces el ULN); niveles de albúmina ligeramente bajos; niveles elevados de hierro en suero; leucopenia (es decir, granulocitopenia); linfocitosis; velocidad de sedimentación globular (ESR) aumentada; supervivencia de los glóbulos rojos acortada; hemólisis; trombocitopenia; una prolongación de la razón internacional normalizada (INR); la presencia en el suero y/o hígado de HBsAg, HBeAg, inmunoglobulina M (IgM) anticuerpo del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc); anticuerpo de superficie de hepatitis B (anti-HBs), anticuerpo de hepatitis B e (anti-HBe), y/o ADN de HBV; elevación de las aminotransferasas (<5 veces el ULN); niveles de ALT superiores a los niveles de AST; niveles de bilirrubina aumentados, tiempo de protrombina (PT) prolongado; hiperglobulinemia; la presencia de anticuerpos no específicos de tejido, tal como los anticuerpos antimúsculo liso (ASMA) o los anticuerpos antinucleares (ANA) (10-20%); la presencia de anticuerpos específicos de tejido, tales como los anticuerpos contra la glándula tiroides (10-20%); niveles elevados de factor reumatoide (RF); hiperbilirrubinemia, PT prolongado, recuentos bajos de plaquetas y glóbulos blancos, niveles de AST superiores a los niveles de ALT; niveles elevados de fosfatasa alcalina (ALP) y GGT; lobular, con cambios hepatocelulares degenerativos y regenerativos, e inflamación acompañante; necrosis predominantemente centrolobulillar ya sea detectable o indetectable. La probabilidad de desarrollar, p. ej., fibrosis hepática, se reduce, por ejemplo, cuando un individuo que tiene uno o más factores de riesgo de fibrosis hepática, p. ej., infección crónica por hepatitis B, no logra desarrollar fibrosis hepática o desarrolla fibrosis hepática con menos gravedad en relación con una población que tiene los mismos factores de riesgo y que no recibe el tratamiento como se describe en la presente memoria. La falta de desarrollo de una enfermedad, trastorno o condición, o la reducción en el desarrollo de un síntoma asociado con dicha enfermedad, trastorno o afección (p. ej., en al menos aproximadamente 10% en una escala clínicamente aceptada para esa enfermedad o trastorno), o la presentación de retrasada de síntomas retrasados (p. ej., en días, semanas, meses o años) se considera prevención eficaz.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "enfermedad asociada al virus de la hepatitis B" o "enfermedad asociada al HBV" es una enfermedad o trastorno que es causado por, o está asociado con la infección y/o replicación del HBV. La expresión "enfermedad asociada al HBV" incluye una enfermedad, trastorno o afección que se beneficiaría de la reducción en la expresión del gen y/o replicación de1HBV. Los ejemplos no limitantes de enfermedades asociadas al HBV incluyen, por ejemplo, infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular.
En una realización, una enfermedad asociada al HBV es la infección por el virus de la hepatitis D. El virus de la hepatitis D o el virus de la hepatitis delta (HDV) es un patógeno humano. Sin embargo, el virus es defectuoso y depende de las funciones auxiliares obligatorias proporcionadas por el virus de la hepatitis B (HBV) para la transmisión; de hecho, el HDV requiere una infección por el HBV asociada o preexistente para volverse infeccioso y proliferar, en particular, la envoltura viral que contiene el antígeno de superficie de la hepatitis B. E1HDV puede conducir a formas crónicas agudas y graves de enfermedad hepática en asociación con e1HBV. La infección por hepatitis D y/o hepatitis delta es altamente endémica en varios países africanos, la región amazónica y el Medio Oriente, mientras que su prevalencia es baja en países industrializados, excepto en el Mediterráneo.
La transmisión del HDV puede ocurrir a través de una infección simultánea con e1HBV (coinfección) o superpuesta al estado de portador de hepatitis B crónica o hepatitis B (superinfección). Tanto la superinfección como la coinfección con HDV producen complicaciones más graves en comparación con la infección con e1HBV solo. Estas complicaciones incluyen una mayor probabilidad de experimentar insuficiencia hepática en infecciones agudas y un progreso rápido a cirrosis hepática, con una mayor probabilidad de desarrollar cáncer de hígado en infecciones crónicas. En combinación con el virus de la hepatitis B, la hepatitis D tiene la tasa de mortalidad más alta de todas las infecciones de hepatitis, con un 20%.
En un caso, una enfermedad asociada al HBV es la hepatitis B aguda. La hepatitis B aguda incluye inflamación del hígado que dura menos de seis meses. Los síntomas típicos de la hepatitis B aguda son fatiga, anorexia, náuseas y vómitos. A menudo se observan valores muy altos de aminotransferasa (> 1000 U/L) e hiperbilirrubinemia. Los casos graves de hepatitis B aguda pueden progresar rápidamente a insuficiencia hepática aguda, marcada por una función sintética hepática deficiente. Esto a menudo se define como un tiempo de protrombina (PT) de 16 segundos o una relación internacional normalizada (INR) de 1.5 en ausencia de enfermedad hepática previa. La hepatitis B aguda puede evolucionar a hepatitis B crónica.
En un caso, una enfermedad asociada al HBV es la hepatitis crónica. La hepatitis B crónica (CHB) incluye inflamación del hígado que dura más de seis meses. Los sujetos que padecen la enfermedad de la hepatitis B crónica pueden ser inmuno-tolerantes o tener una infección crónica inactiva sin ninguna evidencia de enfermedad activa, y también son asintomáticos. Los pacientes con hepatitis crónica activa, especialmente durante el estado replicativo, pueden tener síntomas similares a los de la hepatitis aguda. La persistencia de la infección por e1HBV en sujetos con CHB es el resultado del ADN ccc del HBV. En un caso, un sujeto que tiene CHB es HBeAg positivo. En otra realización, un sujeto que tiene CHB es HBeAg negativo. Los sujetos que tienen CHB tienen un nivel de ADN de HBV en el suero de menos de aproximadamente 105 y una elevación persistente en las transaminasas, por ejemplo ALT, AST y gamma-glutamil transferasa. Un sujeto que tiene CHB puede tener una puntuación de biopsia hepática de menos de aproximadamente 4 (p. ej., una puntuación necroinflamatoria). Además, un sujeto que tiene CHB puede tener
En un caso, una enfermedad asociada al HBV es la hepatitis B fulminante aguda. Un sujeto que tiene hepatitis B fulminante aguda tiene síntomas de hepatitis aguda y síntomas adicionales de confusión o coma (debido a la fallo del hígado para detoxificar sustancias químicas) y hematomas o sangrado (debido a la falta de factores de coagulación de la sangre).
Los sujetos que tienen una infección por HBV, p. ej., CHB, pueden desarrollar fibrosis hepática. Por consiguiente, en un caso, una enfermedad asociada al HBV es la fibrosis hepática. La fibrosis hepática, o cirrosis, se define histológicamente como un proceso hepático difuso caracterizado por fibrosis (exceso de tejido conectivo fibroso) y la conversión de la arquitectura hepática normal en nódulos estructuralmente anormales.
Los sujetos que tienen una infección por HBV, p. ej., CHB, pueden desarrollar enfermedad hepática en etapa terminal. Por consiguiente, en una realización, una enfermedad asociada a1HBV es una enfermedad hepática en etapa terminal. Por ejemplo, la fibrosis hepática puede progresar hasta un punto en el que el cuerpo ya no pueda compensar, p. ej., función hepática reducida, como resultado de fibrosis hepática, y da como resultado, p. ej., síntomas mentales y neurológicos e insuficiencia hepática.
Los sujetos que tienen una infección por HBV, p. ej., CHB, pueden desarrollar carcinoma hepatocelular (HCC), también conocido como hepatoma maligno. Por consiguiente, en un caso, una enfermedad asociada a1HBV es el HCC. El HCC se desarrolla comúnmente en sujetos que tienen CHB y puede ser fibrolamelar, pseudoglandular (adenoide), pleomórfico (célula gigante) o de células claras.
Un "trastorno asociado al HDV" o un trastorno asociado al virus de la hepatitis D" es una enfermedad o trastorno asociado con la expresión de un HDV. Los ejemplos de trastornos asociados a1HDV incluyen, infección por el virus de la hepatitis B, hepatitis B aguda, hepatitis D aguda; hepatitis D fulminante; hepatitis D crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática terminal y carcinoma hepatocelular.
"Cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, pretende incluir la cantidad de un agente de ARNi que, cuando se administra a un paciente para tratar a un sujeto que tiene una infección por HBV y/o enfermedad asociada a HBV, es suficiente para efectuar el tratamiento de la enfermedad (p.ej., disminuyendo, mejorando o manteniendo la enfermedad existente o uno o más síntomas de la enfermedad). La "cantidad terapéuticamente eficaz" puede variar dependiendo del agente de ARNi, cómo se administra el agente, la enfermedad y su gravedad y antecedentes, edad, peso, antecedentes familiares, genotipo, etapa de los procesos patológicos mediados por la expresión del gen del HBV, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que se va a tratar.
"Cantidad profilácticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, pretende incluir la cantidad de un agente de ARNi que, cuando se administra a un sujeto que todavía no experimenta o muestra síntomas de una infección por HBV y/o enfermedad asociada a HBV, pero que puede estar predispuesto, es suficiente para prevenir o mejorar la enfermedad o uno o más síntomas de la enfermedad. Mejorar la enfermedad incluye disminuir el curso de la enfermedad o reducir la gravedad de la enfermedad que se desarrolla más tarde. La "cantidad profilácticamente eficaz" puede variar dependiendo del agente de ARNi, cómo se administra el agente, el grado de riesgo de enfermedad y los antecedentes, edad, peso, antecedentes familiares, genotipo, los tipos de tratamientos anteriores o concomitantes, si los hay, y otras características individuales del paciente que se va a tratar.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad profilácticamente eficaz" también incluye una cantidad de un agente de ARNi que produce algún efecto local o sistémico deseado con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento. Los agentes de ARNi empleados en los métodos descritos se pueden administrar en una cantidad suficiente para producir una relación beneficio/riesgo razonable aplicable a dicho tratamiento.
El término "muestra", como se usa en la presente memoria, incluye una colección de fluidos, células o tejidos similares aislados de un sujeto, así como fluidos, células o tejidos presentes dentro de un sujeto. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, líquido cefalorraquídeo, fluidos oculares, linfa, orina, saliva y similares. Las muestras de tejido pueden incluir muestras de tejidos, órganos o regiones localizadas. Por ejemplo, las muestras se pueden obtener de órganos particulares, partes de órganos, o fluidos o células dentro de esos órganos. En ciertos casos, las muestras se pueden obtener del hígado (p. ej., hígado entero o ciertos segmentos de hígado o ciertos tipos de células en el hígado, tales como, p. ej., hepatocitos), la retina o partes de retina (p. ej., epitelio pigmentario retiniano), el sistema nervioso central o partes del sistema nervioso central (p. ej., ventrículos o plexo coroideo), o el páncreas o ciertas células o partes de los páncreas. En algunos casos, una "muestra obtenida de un sujeto" se refiere al líquido cefalorraquídeo obtenido del sujeto. En casos preferidos, una "muestra obtenida de un sujeto" se refiere a sangre o plasma extraído del sujeto. En otros casos, una "muestra obtenida de un sujeto" se refiere a tejido hepático (o subcomponentes del mismo) o a tejido retiniano (o subcomponentes del mismo) obtenidos del sujeto.
II. ARNi
La presente descripción proporciona ARNi que inhiben la expresión de uno o más genes de1HBV. En un caso, el agente ARNi incluye moléculas de ácido ribonucleico bicatenario (ARNbc) para inhibir la expresión de un gen del HBV en una célula, tal como una célula dentro de un sujeto, p. ej., un mamífero, tal como un ser humano que tiene una enfermedad asociada al HBV, p. ej., hepatitis B crónica. El ARNbc incluye una cadena antiparalela que tiene una región de complementariedad que es complementaria a al menos una parte de un ARNm formado en la expresión de un gen del HBV. La región de complementariedad tiene aproximadamente 30 nucleótidos o menos de longitud (p. ej., aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 o 18 nucleótidos o menos de longitud). Tras entrar en contacto con una célula que expresa el gen del HBV, el ARNi inhibe la expresión del gen del HBV en al menos aproximadamente 10% según lo analizado, por ejemplo, por un método basado en PCR o ADN ramificado (ADNb), o por un método basado en proteínas, tal como por análisis de inmunofluorescencia, usando, por ejemplo, técnicas de transferencia Western o citometría de flujo.
Un ARNbc incluye dos cadenas de ARN que son complementarias y se hibridan para formar una estructura de dúplex en condiciones en las que se usará el ARNbc. Una cadena de un ARNbc (la cadena antiparalela) incluye una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y generalmente completamente complementaria, a una secuencia objetivo. La secuencia objetivo puede derivar de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión de un gen de HBV. La otra cadena (la cadena paralela) incluye una región que es complementaria a la cadena antiparalela, de modo que las dos cadenas se hibridan y forman una estructura de dúplex cuando se combinan en condiciones adecuadas. Como se describe en otra parte en la presente memoria y como se conoce en la técnica, las secuencias complementarias de un ARNbc también pueden estar contenidas como regiones autocomplementarias de una sola molécula de ácido nucleico, en oposición a estar en oligonucleótidos separados.
En general, la estructura de dúplex es de entre 15 y 30 pares de bases de longitud, p. ej., entre, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18­ 24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20- 29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21­ 23 o 21-22 pares de bases de longitud. También se contemplan intervalos y longitudes intermedios a los intervalos y longitudes mencionados anteriormente.
De manera similar, la región de complementariedad con la secuencia diana tiene una longitud entre 15 y 30 nucleótidos, p. ej., entre 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19­ 25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21- 29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 nucleótidos de longitud. También se contemplan intervalos y longitudes intermedios a los intervalos y longitudes mencionados anteriormente.
En algunos casos, el ARNbc tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. En general, el ARNbc es lo suficientemente largo como para servir como sustrato para la enzima Dicer. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica que los ARNbc más largos que aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud pueden servir como sustratos para Dicer. Como también reconocerá el experto en la técnica, la región de un ARN dirigido para escisión con mayor frecuencia formará parte de una molécula de ARN más grande, a menudo una molécula de ARNm. Cuando sea pertinente, una "parte" de un ARNm objetivo es una secuencia contigua de un objetivo de ARNm de longitud suficiente para permitir que sea un sustrato para la escisión dirigida por la ARNi (es decir, la escisión por una ruta de RISC).
Un experto en la técnica también reconocerá que la región de dúplex es una porción funcional primaria de un ARNbc, p. ej., una región de dúplex de aproximadamente 9 a 36 pares de bases, p. ej., aproximadamente 10-36, 11­ 36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14­ 34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14-33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10­ 31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19­ 28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 o 21-22 pares de bases. Por lo tanto, en un caso, en la medida en que se convierte en procesado a un dúplex funcional, de p. ej., 15-30 pares de bases, que se dirigen a un ARN deseado para la escisión, una molécula de ARN o complejo de moléculas de ARN que tienen una región de dúplex mayor que 30 pares de bases es un ARNbc. Por lo tanto, un experto en la materia reconocerá que un ARNmi puede ser un ARNbc. En otro caso, un ARNbc no es un ARNmi natural. En otro caso, un agente de a Rní útil para dirigir la expresión del gen del HBV objetivo no se genera en la célula objetivo por escisión de un ARNbc más grande.
Un ARNbc como se describe en la presente memoria puede incluir además uno o más salientes de nucleótidos monocatenarios p. ej., 1, 2, 3 o 4 nucleótidos. Los ARNbc que tienen al menos un saliente de nucleótidos pueden tener propiedades inhibidoras inesperadamente superiores en relación con sus homólogos de extremos romos. Un saliente de nucleótidos puede comprender o consistir en un análogo de nucleótido/nucleósido, que incluye un desoxinucleótido/nucleósido. El o los salientes pueden estar en la cadena paralela, la cadena antiparalela o cualquier combinación de los mismos. Además, el o los nucleótidos de un saliente pueden estar presentes en el extremo 5', el extremo 3' o en ambos extremos de una cadena antiparalela o paralela de un ARNbc.
Un ARNbc se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica como se describe más adelante, p. ej., mediante el uso de un sintetizador de ADN automático, tales como los disponibles en el mercado, por ejemplo, de Biosearch, Applied Biosystems, Inc.
Los compuestos de ARNi se pueden preparar usando un procedimiento de dos etapas. Primero, las cadenas individuales de la molécula de ARN bicatenario se preparan por separado. Después se reasocian las cadenas componentes. Las cadenas individuales del compuesto de ARNip se pueden preparar usando síntesis orgánica en fase de disolución o en fase sólida o ambas. La síntesis orgánica ofrece la ventaja de que las cadenas de oligonucleótidos que comprenden nucleótidos no naturales o modificados se pueden preparar fácilmente. Los oligonucleótidos monocatenarios de la invención se pueden preparar usando síntesis orgánica en fase de disolución o en fase sólida o ambos.
En un aspecto, un ARNbc incluye al menos dos secuencias de nucleótidos, una secuencia paralela y una secuencia antiparalela. La cadena paralela se selecciona del grupo de secuencias proporcionadas en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26, y la cadena antiparalela correspondiente de la cadena paralela se selecciona de grupo de secuencias de una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26. En este aspecto, una de las dos secuencias es complementaria a la otra de las dos secuencias, siendo una de las secuencias sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión de un gen del HBV. Como tal, en este aspecto, un ARNbc incluirá dos oligonucleótidos, donde un oligonucleótido se describe como la cadena paralela en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26, y el segundo oligonucleótido se describe como la cadena antiparalela correspondiente de la cadena paralela en cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26. En un caso, las secuencias sustancialmente complementarias de los ARNbc están contenidas en oligonucleótidos separados. En otro caso, las secuencias sustancialmente complementarias del ARNbc están contenidas en un solo oligonucleótido.
Se entenderá que, aunque algunas de las secuencias en las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 se describen como secuencias modificadas y/o conjugadas, el ARN del ARNi del invención p. ej., un ARNbc de la invención, puede comprender una cualquiera de las secuencias expuestas en las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 que está no modificada, no conjugada y/o modificada y/o conjugada de manera diferente a la descrita en las mismas.
El experto es consciente de que los ARNbc tienen una estructura de dúplex de entre aproximadamente 20 y 23 pares de bases, p. ej., 21, pares de bases se han determinado como particularmente eficaces para inducir interferencia de ARN (Elbashir et al., EMBO 2001, 20: 6877-6888). Sin embargo, otros han descubierto que estructuras de dúplex de ARN más cortas o más largas también pueden ser eficaces (Chu y Rana (2007) RNA 14: 1714-1719; Kim et al. (2005) Nat Biotech 23: 222-226). En las realizaciones descritas antes, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótidos proporcionadas en cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26, los ARNbc descritos en la presente memoria pueden incluir al menos una cadena de una longitud mínima de 21 nucleótidos. Se puede esperar razonablemente que los dúplex más cortos que tengan una de las secuencias de una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 menos solo unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos puedan ser igualmente eficaces en comparación con los ARNbc descritos antes. Por lo tanto, están contemplados los ARNbc que tienen una secuencia de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos derivados de una de las secuencias de una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26, y que difieren en su capacidad para inhibir la expresión de un gen del HBV en no más de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25 o 30% de inhibición de un ARNbc que comprende la secuencia completa.
Además, los ARN proporcionados en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 identifican un sitio(s) en un trascrito de HBV que es propenso a la escisión mediada por RISC. Como tal, la presente descripción presenta características adicionales de ARNi que se dirigen dentro de uno de estos sitios. Como se usa en la presente memoria, se dice que un ARNi se dirige dentro de un sitio particular de un transcrito de ARN si el ARNi promueve la escisión del transcrito en cualquier lugar dentro de ese sitio particular. Dicho ARNi generalmente incluirá al menos aproximadamente 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias proporcionadas en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 acopladas a secuencias de nucleótidos adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en un gen del HBV.
Aunque una secuencia objetivo en general tiene una longitud de aproximadamente 15-30 nucleótidos, existe una amplia variación en la idoneidad de secuencias particulares en este intervalo para dirigir la escisión de cualquier ARN objetivo dado. Varios paquetes de software y las pautas establecidas en la presente memoria proporcionan una guía para la identificación de secuencias diana óptimas para cualquier diana genética determinada, pero también se puede adoptar un enfoque empírico en el que una "ventana" o "máscara" de un tamaño dado (como ejemplo no limitante, 21 nucleótidos), literal o figurativamente (incluyendo, p. ej., in silico) se pone en la secuencia de ARN objetivo para identificar secuencias en el intervalo de tamaños que pueden servir como secuencias objetivo. Al mover la "ventana" de secuencia progresivamente un nucleótido hacia arriba o hacia abajo de una ubicación de la secuencia objetivo inicial, se puede identificar la siguiente secuencia objetivo potencial, hasta que se identifique el conjunto completo de posibles secuencias para cualquier tamaño objetivo seleccionado. Este proceso, acoplado con la síntesis sistemática y los ensayos de las secuencias identificadas (usando ensayos como se describe en la presente memoria o como se conoce en la técnica) para identificar aquellas secuencias que funcionan de manera óptima, pueden identificar aquellas secuencias de ARN que, cuando se dirigen con un agente de ARNi, median la mejor inhibición de la expresión del gen objetivo. Así, aunque las secuencias identificadas, por ejemplo, en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26 representan secuencias objetivo eficaces, está contemplado que se puede lograr una optimización adicional de la eficacia de la inhibición "caminando por la ventana" progresivamente un nucleótido hacia arriba o hacia abajo de las secuencias dadas para identificar secuencias con iguales o mejores características de inhibición.
Además, está contemplado que para cualquier secuencia identificada, p. ej., en una cualquiera de las tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26, se podría lograr una mayor optimización mediante la adición o eliminación sistemática de nucleótidos para generar secuencias más largas o más cortas y ensayar esas secuencias generadas caminando por la ventana, de tamaño más largo o más corto, hacia arriba o hacia abajo del ARN objetivo desde ese punto. De nuevo, el acoplamiento de este enfoque para generar nuevos objetivos candidatos con ensayo de la eficacia de los ARNi basados en esas secuencias objetivo en un ensayo de inhibición como se conoce en la técnica y/o como se describe en la presente memoria, puede conducir a mejoras adicionales en la eficacia de la inhibición. Aún más, dichas secuencias optimizadas se pueden ajustar, p. ej., por la introducción de nucleótidos modificados como se describe en la presente memoria o como se conoce en la técnica, la adición o cambios en el saliente, u otras modificaciones como se conocen en la técnica y/o descritas en la presente memoria para optimizar aún más la molécula (p. ej., aumentar de estabilidad en el suero o vida media circulante, aumentar la estabilidad térmica, mejorar el suministro transmembrana, dirigirse a una ubicación particular o tipo de célula, aumentar la interacción con enzimas de la ruta de silenciamiento, aumentar de la liberación de los endosomas) como inhibidor de la expresión.
Un ARNi como se describe en la presente memoria puede contener uno o más apareamientos erróneos con la secuencia objetivo. En una realización, un ARNi como se describe en la presente memoria no contiene más de 3 apareamientos erróneos. Si la cadena antiparalela del ARNi contiene apareamientos erróneos con una secuencia objetivo, es preferible que el área de apareamientos erróneos no se encuentre en el centro de la región de complementariedad. Si la cadena antiparalela del ARNi contiene apareamientos erróneos con la secuencia objetivo, es preferible que el apareamiento erróneo esté limitado a estar dentro de los últimos 5 nucleótidos desde el extremo 5' o 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para un agente ARNi de 23 nucleótidos, la cadena que es complementaria a una región de un gen del HBV, generalmente no contiene ningún apareamiento erróneo dentro de los 13 nucleótidos centrales. Se pueden usar los métodos descritos en la presente memoria o los métodos conocidos en la técnica para determinar si un ARNi que contiene un apareamiento erróneo con una secuencia diana es eficaz para inhibir la expresión de un gen del HBV. La consideración de la eficacia de los ARNi con apareamientos erróneos en la inhibición de la expresión de un gen del HBV es importante, especialmente si se sabe que la región particular de complementariedad en un gen del HBV tiene una variación de secuencia polimórfica dentro de la población.
III. ARNi modificados
En un caso, el ARN del ARNi p. ej., un ARNbc, no está modificado, y no comprende, p. ej., modificaciones químicas y/o conjugaciones conocidas en la técnica y descritas en la presente memoria. En otro caso, el ARN de un ARNi, p. ej., un ARNbc, está químicamente modificado para mejorar la estabilidad u otras características beneficiosas. En ciertas realizaciones de la invención, sustancialmente todos los nucleótidos de un ARNi de la invención están modificados. En otros casos, están modificados todos los nucleótidos de un ARNi de la invención. Los ARNi en los que "sustancialmente todos los nucleótidos están modificados" están en gran parte, pero no totalmente, modificados y pueden incluir no más de 5, 4, 3, 2 o 1 nucleótidos no modificados.
Los ácidos nucleicos presentados en la invención se pueden sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en la técnica, tales como los descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EE.UU. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, modificaciones finales, p. ej., modificaciones en el extremo 5' (fosforilación, conjugación, enlaces invertidos) o modificaciones en el extremo 3' (conjugación, nucleótidos de ADN, enlaces invertidos, etc.); modificaciones de base, p. ej., sustitución con bases estabilizadoras, bases desestabilizadoras o bases que dan apareamiento de bases con un repertorio expandido de parejas, eliminación de bases (nucleótidos abásicos) o bases conjugadas; modificaciones de azúcar (p. ej., en la posición 2' o en la posición 4') o sustitución del azúcar; y/o modificaciones de la cadena principal, incluyendo modificación o sustitución de los enlaces fosfodiéster. Los ejemplos específicos de compuestos de ARNi útiles en las realizaciones descritas en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a ARN que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los ARN que tienen cadenas principales modificadas incluyen, entre otros, aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Para los propósitos de esta memoria descriptiva, y como se hace referencia a veces en la técnica, los ARN modificados que no tienen un átomo de fósforo en su cadena principal internucleósida también se pueden considerar oligonucleósidos. En algunas realizaciones, un ARNi modificado tendrá un átomo de fósforo en su cadena principal internucleósida.
Las cadenas principales de ARN modificadas incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotrirésteres, fosfonatos de metilo y otros alquilo que incluyen 3'-alquilen-fosfonatos y fosfonatos de quiral, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos de estos unidos 2'-5', y los que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están unidos 3'-5' a 5'-3' o 2'-5 'a 5'-2'. También se incluyen diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.
Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no se limitan a las patentes de EE.UU. n° 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5625050; 6028188; 6124445; 6160109; 6169170; 6172209 6239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639; 6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029; y patente US RE39464.
Las cadenas principales de ARN modificadas que no incluyen un átomo de fósforo tienen cadenas principales formadas por enlaces internucleósidos de cicloalquilo o alquilo de cadena corta, heteroátomos mixtos y enlaces internucleósidos de alquilo o cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte por la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilen-formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alquenos; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH2.
Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. n° 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; y 5677439.
En otros casos, están contemplados miméticos de ARN adecuados para usar en ARNi, en los que tanto el azúcar como el enlace internucleósidos, es decir, la cadena principal, de las unidades de nucleótidos se reemplazan por nuevos grupos. Las unidades base se mantienen para la hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico adecuado. Uno de estos compuestos oligómeros, un mimético de ARN que ha mostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se conoce como ácido nucleico peptídico (PNA). En los compuestos de PNA, la cadena principal de azúcar de un ARN se reemplaza por una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero no se limitan a, patentes de EE.UU. n° 5539082; 5714331 y 5719262. Los compuestos de PNA adicionales adecuados para usar en los ARNi se describen, por ejemplo, en Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
También se describen los ARN con cadenas principales de fosforotioato y oligonucleósidos con cadenas principales con heteroátomos, y en particular, --CH2--NH--CH2-, --CH2—N(CH3)—O--CH2— [conocido como cadena principal de metileno (metilimino) o MMI], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- y --N(CH3)-CH2-CH2-[en donde la cadena principal de fosfodiéster natural se representa como --O--P--O--CH2--] de las patentes de EE.Uu . mencionadas antes n° 5489677, y las cadenas principales de amida de las patentes de EE.UU. mencionadas antes n° 5602240. En algunas realizaciones, los ARN caracterizados en la presente memoria tienen estructuras de cadena principal de morfolino de las patentes de EE.UU. mencionadas antes n° 5034506.
Los ARN modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los ARNi, p. ej., ARNbc, caracterizados en la presente memoria pueden incluir uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 sustituidos o no sustituidos o C2 a C10. Las modificaciones adecuadas de ejemplo incluyen O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. En otras realizaciones, los ARNbc incluyen uno de los siguientes en la posición 2': alquilo inferior C1 a C10, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un ARNi, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un ARNi y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En algunas realizaciones, la modificación incluye un 2'-metoxietoxi (2 -O--CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2 'MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78: 486-504) es decir, un grupo alcoxi-alcoxi. Otra modificación de ejemplo es 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, como se describe en los ejemplos más adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2.
Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2 -OCH3), 2'-aminopropoxi (2 -OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También se pueden hacer modificaciones similares en otras posiciones en el ARN de un ARNi, en particular en la posición 3' del azúcar en el nucleótido 3' terminal o en los ARNbc unidos 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal5'. Los ARNi también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de EE.UU. que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no se limitan a las patentes de EE.UU. n° 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; y 5700920.
Un ARNi también puede incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (a menudo denominadas en la técnica simplemente como "base"). Como se usa en la presente memoria, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales tales como desoxitimina (dT), 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros alquilo de adenina y guanina, derivados de -propilo y otros alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2 tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halogeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-daazaadenina y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Nucleobases adicionales incluyen las descritas en la Pat. de EE.UU. n° 3687808, las descritas en "Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine", Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; las descritas en "The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering", páginas 858­ 859, Kroschwitz, J.L., ed. John Wiley & Sons, 1990, las descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, y las descritas por Sanghvi, Y.S., capítulo 15, dsRNA Research and Applications, páginas 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993. Algunas de estas nucleobases son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligómeros caracterizados en la invención. Estos incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que incluyen 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad de dúplex del ácido nucleico en 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., Eds., DsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pág. 276-278) y son sustituciones de bases de ejemplo, incluso más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietilo.
Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. mencionadas antes, n° 3687808 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121 5596091; 5614617; 5681941; 5750692; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672; y 7495088.
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más restos de azúcar bicíclicos. Un "azúcar bicíclico" es un anillo de furanosilo modificado por unión por puente dos átomos. Un "nucleósido bicíclico" ("BNA") es un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un agente de la invención puede incluir uno o más ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Un ácido nucleico bloqueado es un nucleótido que tiene un resto ribosa modificado en el que el resto ribosa comprende un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4'. En otras palabras, un LNA es un nucleótido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH2-O-2'. Esta estructura "bloquea" eficazmente la ribosa en la conformación estructural 3'-endo. Se ha mostrado que la adición de ácidos nucleicos bloqueados a los ARNip aumenta la estabilidad del ARNip en el suero y reduce los efectos fuera del objetivo (Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33 (1): 439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6 (3): 833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12): 3185-3193). Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos para usar en los polinucleótidos de la invención incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertos casos, los agentes polinucleotídicos antiparalelos de la invención incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puente de 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominado "etilo restringido" o "cET") y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos; véase, p. ej., la Pat. de EE.UU. n° 7399845); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos; véase, p. ej., la Patente de EE.UU. n° 8278283); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos; véase, p. ej., la Patente de EE.UU. n° 8278425); 4'-CH2-O-N(Ch3)-2' (véase, p. ej., la publicación de patente de EE.UU. n° 2004/0171570); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (véase, p. ej., la patente de EE.UU. n° 7427672); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, p. ej., Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos; véase, p. ej., la patente de EE.UU. n° 8,278,426)..
Las patentes de EE.UU. representativas y las publicaciones de patentes de EE.UU. adicionales que enseñan la preparación de nucleótidos de ácido nucleico bloqueados incluyen, pero no se limitan a las siguientes: patentes de EE.UU. n° 6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 6998484; 7053207; 7034133;7084125; 7399845; 7427672; 7569686; 7741457; 8022193; 8030467; 8278425; 8278426; 8278283; US 2008/0039618; y US 2009/0012281.
Cualquiera de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones estereoquímicas del azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la publicación internacional WO 99/14226).
El ARN de un ARNi también se puede modificar para incluir uno o más nucleótidos de etilo restringido. Como se usa en la presente memoria, un "nucleótido de etilo restringido" o "cEt" es un ácido nucleico bloqueado que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-0-2'. En una realización, un nucleótido de etilo restringido está en la conformación S denominada en la presente memoria "S-cEt".
Un ARNi también puede incluir uno o más "nucleótidos conformacionalmente restringidos" ("CRN"). Los CRN son análogos de nucleótidos con un conector que conecta los carbonos C2' y C4' de la ribosa o los carbonos C3 y -C5' de la ribosa. El CRN bloquea el anillo de ribosa en una conformación estable y aumenta la afinidad de hibridación con el ARNm. El conector tiene una longitud suficiente para colocar el oxígeno en una posición óptima para la estabilidad y la afinidad, lo que da como resultado menos arrugamiento del anillo de ribosa.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los CRN mencionados antes incluyen, pero no se limitan a la publicación de patente de e E.UU. n° 2013/0190383; y publicación PCT WO 2013/036868. Uno o más de los nucleótidos de un ARNi también pueden incluir un nucleótido sustituido con hidroximetilo. Un "nucleótido sustituido con hidroximetilo" es un 2'-3'-seco-nucleótido acíclico, también denominado una modificación de "ácido nucleico desbloqueado" ("UNA").
Las publicaciones de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de UNA incluyen, pero no se limitan a la patente de EE.UU. n° 8314227; y publicaciones de patentes de EE.UU. n° 2013/0096289; 2013/0011922; y 2011/0313020.
Las modificaciones potencialmente estabilizadoras de los extremos de las moléculas de ARN pueden incluir N-(acetilaminocaproil)-4-hidroxipolinol (Hyp-C6-NHAc), N-(caproil-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6), N-(acetil-4-hidroxiprolinol (Hyp-NHAc), timidina-2'-0-desoxitimidina (éter), N-(aminocaproil)-4-hidroxiprolinol (Hyp-C6-amino), 2-docosanoiluridina-3"-fosfato, base invertida dT (idT) y otros. La descripción de esta modificación se puede encontrar en la publicación PCT n° WO 2011/005861.
Otras modificaciones de los nucleótidos de un ARNi incluyen un fosfato 5' o imitador de fosfato 5', p. ej., un fosfato o imitador de fosfato 5'-terminal en la cadena antiparalela de un agente de ARNi. Los imitadores de fosfato adecuados se describen, por ejemplo, en la publicación de Patente de EE.UU. n° 2012/0157511.
A. Motivos que comprenden ARNi modificados
Los agentes de ARNi bicatenarios pueden incluir agentes con modificaciones químicas como se describe, por ejemplo, en la publicación internacional 2013/075035, presentado el 16 de noviembre de 2012. Como se muestra en la presente memoria y en la publicación PCT No. WO 2013/075035, se puede obtener un resultado superior mediante la introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en una cadena paralela y/o cadena antiparalela de un agente de ARNi, en particular en o cerca del sitio de escisión. En algunos casos, la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi pueden de otro modo estar completamente modificadas. La introducción de estos motivos interrumpe el patrón de modificación, si está presente, de la cadena paralela y/o antiparalela. El agente de ARNi se puede conjugar opcionalmente con un ligando derivado de GalNAc, por ejemplo en la cadena paralela. Los agentes de ARNi resultantes presentan una actividad superior de silenciamiento génico.
Más específicamente, se ha descubierto sorprendentemente que cuando la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi bicatenario están completamente modificadas para tener uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de al menos uno cadena de un agente de ARNi, la actividad de silenciamiento génico del agente de ARNi mejoró de manera superior.
Por consiguiente, la descripción proporciona agentes de ARNi bicatenarios capaces de inhibir la expresión de un gen diana (es decir, gen del HBV) in vivo. El agente de ARNi comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela. Cada cadena del agente de ARNi puede variar de 12-30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada cadena puede tener entre 14-30 nucleótidos de longitud, 17-30 nucleótidos de longitud, 25-30 nucleótidos de longitud, 27-30 nucleótidos de longitud, 17-23 nucleótidos de longitud, 17-21 nucleótidos de longitud, 17-19 nucleótidos de longitud, 19-25 nucleótidos de longitud, 19-23 nucleótidos de longitud, 19-21 nucleótidos de longitud, 21-25 nucleótidos de longitud o 21-23 nucleótidos de longitud.
La cadena paralela y la cadena antiparalela típicamente forman un ARN bicatenario dúplex ("ARNbc"), también denominado en la presente memoria como un "agente de ARNi". La región de dúplex de un agente de ARNi puede tener 12-30 pares de nucleótidos de longitud. Por ejemplo, la región de dúplex puede tener entre 14-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-30 pares de nucleótidos de longitud, 27-30 pares de nucleótidos de longitud, 17-23 pares de nucleótidos de longitud, 17-21 pares de nucleótidos de longitud, 17-19 pares de nucleótidos de longitud, 19-25 pares de nucleótidos de longitud, 19-23 pares de nucleótidos de longitud, 19-21 pares de nucleótidos de longitud, 21-25 pares de nucleótidos de longitud o 21-23 pares de nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la región de dúplex se selecciona de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26 y 27 nucleótidos de longitud.
En un caso, el agente de ARNi puede contener una o más regiones salientes y/o grupos de protección en los extremos 3', 5' o ambos extremos de una o ambas cadenas. El saliente puede tener 1-6 nucleótidos de longitud, por ejemplo 2-6 nucleótidos de longitud, 1-5 nucleótidos de longitud, 2-5 nucleótidos de longitud, 1-4 nucleótidos de longitud, 2-4 nucleótidos de longitud, 1-3 nucleótidos de longitud, 2-3 nucleótidos de longitud o 1-2 nucleótidos de longitud. Los salientes pueden ser el resultado de que una cadena sea más larga que la otro, o el resultado de que dos cadenas de la misma longitud estén escalonadas. El saliente puede formar apareamiento erróneo con el ARNm objetivo o puede ser complementario a las secuencias de genes que están siendo objetivo o puede ser otra secuencia. La primera y la segunda cadenas también se pueden unir, p. ej., por bases adicionales para formar una horquilla, o por otros conectores no bases.
En un caso, los nucleótidos en la región saliente del agente de ARNi puede ser cada uno independientemente un nucleótido modificado o no modificado que incluye, pero no se limita a modificado en 2'-azúcar, tal como 2-F, 2'-Ometil, timidina (T), 2'-O-metoxietil-5-metiluridina (Teo), 2'-O-metoxietiladenosina (Aeo), 2'-O-metoxietil-5-metilcitidina (m5Ceo) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, TT puede ser una secuencia de saliente para cualquier extremo en cualquiera de las cadenas. El saliente puede formar un apareamiento erróneo con el ARNm objetivo o puede ser complementario a las secuencias de genes que están siendo objetivo o puede ser otra secuencia.
Los salientes 5' o 3' en la cadena paralela, cadena antiparalela o ambas cadenas del agente de ARNi pueden estar fosforilados. En algunos casos, la región o regiones salientes contienen dos nucleótidos que tienen un fosforotioato entre los dos nucleótidos, donde los dos nucleótidos pueden ser iguales o diferentes. En un caso, el saliente está presente en el extremo 3' de la cadena paralela, cadena antiparalela o ambas cadenas. En un caso, este saliente 3' está presente en la cadena antiparalela. En un caso, este saliente 3' está presente en la cadena paralela.
El agente de ARNi puede contener solo un saliente único, que puede fortalecer la actividad de interferencia de ARNi, sin afectar a su estabilidad general. Por ejemplo, el saliente monocatenario puede encontrarse en el extremo 3'-terminal de la cadena paralela o, alternativamente, en el extremo 3'-terminal de la cadena antiparalela. El ARNi también puede tener un extremo romo, situado en el extremo 5 'de la cadena antiparalela (o en el extremo 3' de la cadena paralela) o viceversa. En general, la cadena antiparalela del ARNi tiene un saliente de nucleótidos en el extremo 3', y el extremo 5' es romo. Sin desear estar limitados por la teoría, el extremo romo asimétrico en el extremo 5' de la cadena antiparalela y el saliente del extremo 3' de la cadena antiparalela favorecen la carga de la cadena guía en el proceso RISC.
En un caso, el agente de ARNi es un oligómero de doble extremo romo de 19 nucleótidos de longitud, en donde la cadena paralela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 7, 8, 9 del extremo 5'. La cadena antiparalela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En otro caso, el agente de ARNi es un oligómero de doble extremo romo de 20 nucleótidos de longitud, en donde la cadena paralela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 8, 9, 10 del extremo 5'. La cadena antiparalela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En otro caso más, el agente de ARNi es un oligómero de doble extremo romo de 21 nucleótidos de longitud, en donde la cadena paralela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'. La cadena antiparalela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5'.
En un caso, el agente de ARNi comprende una cadena paralela de 21 nucleótidos y una cadena antiparalela de 23 nucleótidos, en donde la cadena paralela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 9, 10, 11 del extremo 5'; la cadena antiparalela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en las posiciones 11, 12, 13 del extremo 5', en donde un extremo del agente de ARNi es romo, mientras que el otro extremo comprende un saliente de 2 nucleótidos. Preferiblemente, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antiparalela.
Cuando el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antiparalela, puede haber dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos del saliente, y el tercer nucleótido es un nucleótido apareado junto al nucleótido del saliente. En un caso, el agente de ARNi además tiene dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la cadena paralela como en el extremo 5' de la cadena antiparalela. En un caso, cada nucleótido en la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi, incluyendo los nucleótidos que forman parte de los motivos, son nucleótidos modificados. En un caso, cada resto se modifica independientemente con un 2'-O-metilo o 3'-fluoro, p. ej., en un motivo alternativo. Opcionalmente, el agente de ARNi comprende además un ligando (preferiblemente GalNAc3).
En un caso, el agente de ARNi comprende una cadena paralela y una antiparalela, en donde la cadena paralela tiene 25-30 restos de nucleótidos de longitud, en donde empezando a partir del nucleótido terminal 5' (posición 1), las posiciones 1 a 23 de la primera cadena comprenden en al menos 8 ribonucleótidos; la cadena antiparalela tiene 36-66 restos de nucleótidos de longitud y, empezando a partir del nucleótido terminal 3', comprende al menos 8 ribonucleótidos en las posiciones apareadas con las posiciones 1-23 de la cadena paralela para formar un dúplex; en donde al menos el nucleótido 3' terminal de la cadena antiparalela no está apareado con la cadena paralela, y hasta 6 nucleótidos 3' terminales consecutivos no están apareados con la cadena paralela, formando así un saliente monocatenario 3' de 1-6 nucleótidos; en donde el extremo 5' de la cadena antiparalela comprende 10-30 nucleótidos consecutivos que no están apareados con la cadena paralela, formando así un saliente monocatenario 5' de 10-30 nucleótidos; en donde al menos los nucleótidos 5' terminal y 3' terminal de la cadena paralela están apareados con nucleótidos de la cadena antiparalela cuando las cadenas paralela y antiparalela están alineadas para una complementariedad máxima, formando así una región sustancialmente de dúplex entre las cadenas paralela y antiparalela; y la cadena antiparalela es suficientemente complementaria a un ARN objetivo a lo largo de al menos 19 ribonucleótidos de longitud de la cadena antiparalela para reducir la expresión del gen objetivo cuando el ácido nucleico bicatenario se introduce en una célula de mamífero; y en donde la cadena paralela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-F en tres nucleótidos consecutivos, donde al menos uno de los motivos ocurre en o cerca del sitio de escisión. La cadena antiparalela contiene al menos un motivo de tres modificaciones 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión.
En un caso, el agente de ARNi comprende cadenas paralela y antiparalela, en donde el agente de ARNi comprende una primera cadena que tiene una longitud que es de al menos 25 y como máximo 29 nucleótidos y una segunda cadena que tiene una longitud que es como máximo de 30 nucleótidos con al menos un motivo de tres modificaciones de 2'-O-metilo en tres nucleótidos consecutivos en la posición 11, 12, 13 desde el extremo 5'; en donde el extremo 3' de la primera cadena y el extremo 5' de la segunda cadena forman un extremo romo y la segunda cadena es 1-4 nucleótidos más larga en su extremo 3' que la primera cadena, en donde la región de la región de dúplex que tiene al menos 25 nucleótidos de longitud, y la segunda cadena es lo suficientemente complementaria a un ARNm objetivo a lo largo de al menos 19 nucleótidos de la longitud de la segunda cadena para reducir la expresión del gen objetivo cuando el agente de ARNi se introduce en una célula de mamífero, y en donde la escisión por dicer del agente de ARNi da como resultado preferentemente un ARNip que comprende el extremo 3' de la segunda cadena, reduciendo así la expresión del gen objetivo en el mamífero. Opcionalmente, el agente de ARNi comprende además un ligando.
En un caso, la cadena paralela del agente de ARNi contiene al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos ocurre en el sitio de escisión en la cadena de paralela.
En un caso, la cadena antiparalela del agente de ARNi también puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, donde uno de los motivos ocurre en o cerca del sitio de escisión en la cadena antiparalela
Para un agente de ARNi que tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el sitio de escisión de la cadena antiparalela está típicamente alrededor de las posiciones 10, 11 y 12 desde el extremo 5'. Por lo tanto, los motivos de tres modificaciones idénticas pueden ocurrir en las posiciones 9, 10, 11; posiciones 10, 11, 12; posiciones 11, 12, 13; posiciones 12, 13, 14; o posiciones 13, 14, 15 de la cadena antiparalela, empezando la cuenta desde el 1er nucleótido desde el extremo 5' de la cadena antiparalela, o, empezando la cuenta desde el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex desde el extremo 5' de la cadena antiparalela. El sitio de escisión en la cadena antiparalela también puede cambiar de acuerdo con la longitud de la región de dúplex del ARNi desde el extremo 5'.
La cadena paralela del agente de ARNi puede contener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en el sitio de escisión de la cadena; y la cadena antiparalela puede tener al menos un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en o cerca del sitio de escisión de la cadena. Cuando la cadena paralela y la cadena antiparalela forman un ARNbc dúplex, la cadena paralela y la cadena antiparalela pueden estar tan alineadas que un motivo de los tres nucleótidos en la cadena paralela y un motivo de los tres nucleótidos en la cadena antiparalela tienen al menos una superposición de nucleótidos, es decir, al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la cadena paralela forma un par de bases con al menos uno de los tres nucleótidos del motivo en la cadena antiparalela. Alternativamente, al menos dos nucleótidos se pueden solapar, o los tres nucleótidos se pueden solapar.
En un caso, la cadena paralela del agente de ARNi puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. El primer motivo puede ocurrir en o cerca del sitio de escisión de la cadena y los otros motivos pueden ser una modificación del flanco. El término "modificación de flanco" en la presente memoria se refiere a un motivo que ocurre en otra porción de la cadena que está separada del motivo en o cerca del sitio de escisión de la misma cadena. La modificación de ala es adyacente al primer motivo o está separada por al menos uno o más nucleótidos. Cuando los motivos son inmediatamente adyacentes entre sí, entonces la química de los motivos es distinta una de otra y cuando los motivos están separados por uno o más nucleótidos entonces las químicas pueden ser iguales o diferentes. Dos o más modificaciones de flanco pueden estar presentes. Por ejemplo, cuando están presentes dos modificaciones de flanco, cada modificación de flanco puede ocurrir en un extremo con respecto al primer motivo que está en o cerca del sitio de escisión o en cualquiera de los lados del motivo guía.
Al igual que la cadena paralela, la cadena antiparalela del agente de ARNi puede contener más de un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, con al menos uno de los motivos que ocurre en o cerca del sitio de escisión de la cadena. Esta cadena antiparalela también puede contener una o más modificaciones de ala en un alineamiento similar a las modificaciones de ala que pueden estar presentes en la cadena paralela.
En un caso, la modificación de ala en la cadena paralela o la cadena antiparalela del agente de ARNi típicamente no incluye los primeros uno o dos nucleótidos terminales en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos de la cadena. En otro caso, la modificación de ala en la cadena paralela o cadena antiparalela del agente de ARNi típicamente no incluye los primeros uno o dos nucleótidos apareados dentro de la región de dúplex en el extremo 3', extremo 5' o ambos extremos de la cadena.
Cuando la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi contienen cada una al menos una modificación de ala, las modificaciones de ala pueden caer en el mismo extremo de la región de dúplex y tener una superposición de uno, dos o tres nucleótidos.
Cuando la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi contienen cada una al menos dos modificaciones de ala, la cadena paralela y la cadena antiparalela se pueden alinear de manera que dos modificaciones cada una de una cadena caigan en un extremo de la región de dúplex, teniendo una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones cada una de una cadena caigan en el otro extremo de la región de dúplex, teniendo una superposición de uno, dos o tres nucleótidos; dos modificaciones en una cadena caen a cada lado del motivo principal, teniendo una superposición de uno, dos o tres nucleótidos en la región de dúplex. En un caso, todos los nucleótidos en la cadena paralela y la cadena antiparalela del agente de ARNi, incluyendo los nucleótidos que forman parte de los motivos, pueden estar modificados. Cada nucleótido puede estar modificado con la misma o diferente modificación que puede incluir una o más alteraciones de uno o ambos de los oxígenos de fosfato no enlazantes y/o de uno o más de los oxígenos de fosfato enlazantes; alteración de un constituyente del azúcar ribosa, p. ej., del hidroxilo 2 'en el azúcar ribosa; reemplazo en su totalidad del resto fosfato por conectores "desfosfo"; modificación o reemplazo de una base natural; y reemplazo o modificación de la cadena principal de ribosa-fosfato.
Como los ácidos nucleicos son polímeros de subunidades, muchas de las modificaciones ocurren en una posición que se repite dentro de un ácido nucleico, p. ej., una modificación de una base, o un resto fosfato, o un O no enlazante de un resto fosfato. En algunos casos, la modificación ocurrirá en todas las posiciones objeto en el ácido nucleico, pero en muchos casos no lo hará. A modo de ejemplo, una modificación solo puede ocurrir en una posición terminal 3' o 5', solo puede ocurrir en una región terminal, p. ej., en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena. Una modificación puede ocurrir en una región de doble cadena, una región de cadena sencilla o en ambas. Una modificación puede ocurrir solo en la región de doble cadena de un ARN o puede ocurrir solo en una región de una sola cadena de un ARN. Por ejemplo, una modificación de fosforotioato en una posición de O no enlazante solo puede ocurrir en uno o ambos extremos, solo puede ocurrir en una región terminal, p. ej., en una posición en un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de una cadena, o puede ocurrir en regiones de cadena doble y cadena sencilla, particularmente en los extremos. El extremo o los extremos 5' se pueden fosforilar.
Es posible, p. ej., para mejorar la estabilidad, incluir bases particulares en salientes, o incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos, en salientes de cadena sencilla, p. ej., en un saliente de 5' o 3', o en ambos. Por ejemplo, puede ser deseable incluir nucleótidos de purina en salientes. En algunas realizaciones, todas o algunas de las bases en un saliente de 3' o 5' pueden estar modificadas, p. ej., con una modificación descrita en la presente memoria. Las modificaciones pueden incluir, p. ej., el uso de modificaciones en la posición 2' del azúcar de ribosa con modificaciones que son conocidas en la técnica, p. ej., el uso de desoxirribonucleótidos, modificados con 2'-desoxi-2'-fluoro (2'-F) o 2'-O-metilo en lugar del ribo-azúcar de la nucleobase, y modificaciones en el grupo fosfato, p. ej., modificaciones de fosforotioato. Los salientes no es necesario que sean homólogos con la secuencia objetivo. En un caso, cada resto de la cadena paralela y la cadena antiparalela se modifica independientemente con LNA, CRN, cET, UNA, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C- alilo, 2'-desoxi, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Las cadenas pueden contener más de una modificación. En una realización, cada resto de la cadena paralela y la cadena antiparalela se modifica independientemente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro.
Al menos dos modificaciones diferentes están típicamente presentes en la cadena paralela y la cadena antiparalela. Esas dos modificaciones pueden ser las modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro, u otras.
En un caso, el Na y/o Nb comprenden modificaciones de un patrón que alterna. La expresión "motivo que alterna", como se usa en la presente memoria, se refiere a un motivo que tiene una o más modificaciones, produciéndose cada modificación en nucleótidos alternos de una cadena. El nucleótido que alterna se puede referir a uno de cada dos nucleótido o uno de cada tres nucleótidos, o un patrón similar. Por ejemplo, si A, B y C representan cada uno un tipo de modificación del nucleótido, el motivo que alterna puede ser 'ABABABABABAB ...", "AABBAABBAABB...", "AABAABAABAAB ...", "AAABAAABAAAB....", " AAABBBAAABBB ..." o ABCABCABCABC ...", etc.
El tipo de modificaciones contenidas en el motivo que alterna puede ser igual o diferente. Por ejemplo, si A, B, C, D representan cada uno un tipo de modificación en el nucleótido, el patrón que alterna, es decir, las modificaciones en dada dos nucleótidos, pueden ser las mismas, pero cada una de la cadena paralela o cadena antiparalela se puede seleccionar entre varias posibilidades de modificaciones dentro del motivo que alterna tal como "ABABAB ...", "ACACAC ..." "BDBDBD ..." o "CDCDCD ...", etc.
En un caso, el agente de ARNi de la invención comprende el patrón de modificación para el motivo que alterna en la cadena paralela que en relación con el patrón de modificación para el motivo que alterna en la cadena antiparalela se desplaza. El desplazamiento puede ser tal que el grupo modificado de nucleótidos de la cadena paralela corresponda a un grupo de nucleótidos modificado de forma diferente de la cadena antiparalela y viceversa. Por ejemplo, la cadena paralela cuando se aparea con la cadena antiparalela en el ARNbc dúplex, el motivo que alterna en la cadena paralela puede comenzar con "ABABAB" desde 5'-3' de la cadena y el motivo que alterna en la cadena antiparalela puede comenzar con "BABABA" desde 5'-3' de la cadena dentro de la región de dúplex. Como otro ejemplo, el motivo que alterna en la cadena paralela puede comenzar con "AABBAABB" desde 5'-3' de la cadena y el motivo que alterna en la cadena antiparalela puede comenzar con "BBAABBAA" desde 5'-3' de la cadena dentro de la región de dúplex, de modo que hay un desplazamiento completo o parcial de los patrones de modificación entre la cadena paralela y la cadena antiparalela.
En un caso, el agente de ARNi comprende el patrón del motivo que alterna de la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F en la cadena paralela inicialmente tiene un desplazamiento con respecto al patrón del motivo que alterna de la modificación 2'-O-metilo y la modificación 2'-F en la cadena antiparalela inicialmente, es decir, el nucleótido modificado con 2'-O-metilo en los pares de bases de la cadena paralela con un nucleótido modificado con 2'-F en la cadena antiparalela y viceversa. La posición 1 de la cadena paralela puede comenzar con la modificación 2'-F, y la posición 1 de la cadena antiparalela puede comenzar con la modificación 2'-O-metilo.
La introducción de uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la cadena paralela y/o cadena antiparalela interrumpe el patrón de modificación inicial presente en la cadena paralela y/o cadena antiparalela. Esta interrupción del patrón de modificación de la cadena paralela y/o antiparalela al introducir uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos en la cadena paralela y/o antiparalela mejora sorprendentemente la actividad de silenciamiento del gen al gen objetivo.
En un caso, cuando el motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos se introduce en cualquiera de las cadenas, la modificación del nucleótido al lado del motivo es una modificación diferente a la modificación del motivo. Por ejemplo, la parte de la secuencia que contiene el motivo es "... NaYYYNb...", donde "Y" representa la modificación del motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos, y "Na" y "Nb" representan una modificación del nucleótido al lado del motivo "YYY" que es diferente a la modificación de Y, y donde Na y Nb pueden ser modificaciones iguales o diferentes. Alternativamente, Na y/o Nb pueden estar presentes o ausentes cuando hay una modificación de ala presente.
El agente de ARNi puede comprender además al menos un enlace internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato. La modificación del enlace internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato puede ocurrir en cualquier nucleótido de la cadena paralela o cadena antiparalela o en ambas cadenas en cualquier posición de la cadena. Por ejemplo, la modificación del enlace internucleótidos puede ocurrir en todos los nucleótidos en la cadena paralela y/o cadena antiparalela; cada modificación de enlace internucleótidos puede ocurrir en un patrón que alterna en la cadena paralela y/o cadena antiparalela; o la cadena paralela o la cadena antiparalela pueden contener ambas modificaciones de enlace internucleótidos en un patrón que alterna. El patrón que alterna de la modificación del enlace internucleótidos en la cadena paralela puede ser igual o diferente de la cadena antiparalela, y el patrón que alterna de la modificación del enlace internucleótidos en la cadena paralela puede tener un desplazamiento con respecto al patrón que alterna de la modificación del enlace internucleótidos en la cadena antiparalela. En una realización, un agente de ARNi bicatenario comprende 6-8 enlaces internucleótidos de fosforotioato. En una realización, la cadena antiparalela comprende dos enlaces internucleótidos de fosforotioato en el extremo 5' y dos enlaces internucleótidos de fosforotioato en el extremo 3', y la cadena paralela comprende al menos dos enlaces internucleótidos de fosforotioato en el extremo 5' o el extremo 3'-terminal.
En un caso, el ARNi comprende una modificación de enlace internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato en la región saliente. Por ejemplo, la región saliente puede contener dos nucleótidos que tienen un enlace internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato entre los dos nucleótidos. También se pueden hacer modificaciones de enlace internucleótidos para unir los nucleótidos salientes con los nucleótidos apareados terminales dentro de la región de dúplex. Por ejemplo, al menos 2, 3, 4 o todos los nucleótidos salientes pueden estar unidos por enlace internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato, y opcionalmente, puede haber enlaces internucleótidos de fosforotioato o metilfosfonato adicionales que unen el nucleótido saliente con un nucleótido apareado que está al lado del nucleótido saliente. Por ejemplo, puede haber al menos dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en los que dos de los tres nucleótidos son nucleótidos salientes, y el tercero es un nucleótido apareado al lado del nucleótido saliente. Estos tres nucleótidos terminales pueden estar en el extremo 3' de la cadena antiparalela, el extremo 3' de la cadena paralela, el extremo 5' de la cadena antiparalela y/o el extremo 5' de la cadena antiparalela.
En un caso, el saliente de 2 nucleótidos está en el extremo 3' de la cadena antiparalela, y hay dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales, en donde dos de los tres nucleótidos son los nucleótidos salientes, y el tercer nucleótido es un nucleótido apareado al lado del nucleótido saliente. Opcionalmente, el agente de ARNi puede tener adicionalmente dos enlaces internucleótidos de fosforotioato entre los tres nucleótidos terminales tanto en el extremo 5' de la cadena paralela como en el extremo 5' de la cadena antiparalela.
En un caso, el agente de ARNi comprende apareamiento(s) erróneo(s) con el objetivo, dentro del dúplex, o combinaciones de los mismos. El apareamiento erróneo puede ocurrir en la región saliente o en la región de dúplex.
El par de bases se puede clasificar basándose en su tendencia a promover la disociación o fusión (p. ej., en la energía libre de asociación o disociación de un apareamiento particular, el enfoque más sencillo es examinar los pares en pares individuales, aunque también se puede usar el análisis del vecino de al lado o similar). En términos de promover la disociación: se prefiere A:U frente a G:C; G:U se prefiere frente a G:C; e I:C se prefiere frente a G:C
(I = inosina). Se prefieren los apareamientos erróneos, p. ej., apareamientos no canónicos u otros distintos de los canónicos (como se describe en otra parte de la presente memoria) frente a los emparejamientos canónicos (A:T,
A:U, G:C); y se prefieren los apareamientos que incluyen una base universal frente a los apareamientos canónicos.
En un caso, el agente de ARNi comprende al menos una de las primeras 1, 2, 3, 4 o 5 pares de bases dentro de las regiones dúplex desde el extremo 5' de la cadena antiparalela seleccionadas independientemente del grupo de: A:U,
G:U, I:C y pares con apareamiento erróneo, p. ej., apareamientos no canónicos u otros distintos de los canónicos o apareamientos que incluyen una base universal, para promover la disociación de la cadena antiparalela en el extremo 5' del dúplex.
En un caso, el nucleótido en la posición 1 dentro de la región de dúplex del extremo 5' en la cadena antiparalela se selecciona del grupo que consiste en A, dA, dU, U y dT. Alternativamente, al menos una de las primeras 1, 2 o 3 pares de bases dentro de la región de dúplex desde el extremo 5' de la cadena antiparalela es un par de bases AU.
Por ejemplo, el primer par de bases dentro de la región de dúplex desde el extremo 5' de la cadena antiparalela es un par de bases AU.
En otro caso, el nucleótido en el extremo 3' de la cadena paralela es la desoxitimina (dT). En otra de realización, el nucleótido en el extremo 3' de la cadena antiparalela es desoxitimina (dT). En una realización, hay una secuencia corta de nucleótidos desoxitimina, por ejemplo, dos nucleótidos dT en el extremo 3' de la cadena paralela y/o antiparalela.
En un caso, la secuencia de la cadena paralela se puede representar mediante la fórmula (I):
5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
donde:
i y j son cada uno independientemente 0 o 1;
p y q son cada uno independientemente 0-6;
cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente;
cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np y nq representa independientemente un nucleótido saliente;
en donde Nb e Y no tienen la misma modificación; y
XXX, YYY y ZZZ representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos. Preferiblemente, YYY son todos nucleótidos modificados con 2'-F.
En un caso, el Na y/o Nb comprenden modificaciones del patrón que alterna.
En un caso, el motivo YYY ocurre en o cerca del sitio de escisión de la cadena paralela. Por ejemplo, cuando el agente de ARNi tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo YYY puede ocurrir en o en la proximidad del sitio de escisión (p. ej.: puede ocurrir en las posiciones 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10 11, 12, 13) de la cadena paralela, empezando a contar a partir del 1er nucleótido, desde el extremo 5'; u opcionalmente, empezando a contar en el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo
5'.
En un caso, i es 1 y j es 0, o i es 0 y j es 1, o tanto i como j son 1. Por lo tanto, la cadena paralela se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); o
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
Cuando la cadena paralela está representada por la fórmula (Ib), Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena paralela está representada como la fórmula (Ic), Nb representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la cadena paralela está representada como la fórmula (Id), cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Cada Na puede representar independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de X, Y y Z pueden ser iguales o diferentes entre sí.
En otros casos, i es 0 y j es 0, y la cadena paralela se puede representar mediante la fórmula:
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia).
Cuando la cadena paralela está representada por la fórmula (Ia), cada Na independientemente puede representar una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
En un caso, la secuencia de cadena antiparalela del ARNi se puede representar mediante la fórmula (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3' (II)
donde:
k y l son cada uno independientemente 0 o 1;
p' y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, cada secuencia comprende al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente; cada Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
cada np' y nq' representan independientemente un nucleótido saliente;
en donde Nb' e Y' no tienen la misma modificación; y
X'X'X ', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, el Na' y/o Nb' comprenden modificaciones del patrón que alterna.
El motivo Y'Y'Y' ocurre en o cerca del sitio de escisión de la cadena antiparalela. Por ejemplo, cuando el agente de ARNi tiene una región de dúplex de 17-23 nucleótidos de longitud, el motivo Y'Y'Y' puede aparecer en las posiciones 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; o 13, 14, 15 de la cadena antiparalela, empezando a contar desde el 1er nucleótido, desde el extremo 5'; u opcionalmente, empezando a contar en el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'. Preferiblemente, el motivo Y'Y'Y' ocurre en las posiciones 11, 12, 13.
En un caso, el motivo Y'Y'Y' son todos los nucleótidos modificados con 2'-OMe.
En un caso, k es 1 y l es 0, o k es 0 y l es 1, o tanto k como l son 1.
Por lo tanto, la cadena antiparalela se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc); o
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np'3' (IId).
Cuando la cadena antiparalela se representa por la fórmula (IIb), Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando la cadena antiparalela se representa como la fórmula (IIc), Nb' representa una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando la cadena antiparalela se representa como la fórmula (IId), cada Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Preferiblemente, Nb es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6.
En otros casos, k es 0 y l es 0 y la cadena antiparalela se puede representar mediante la fórmula:
5' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 3' (Ia).
Cuando la cadena antiparalela se representa como la fórmula (IIa), cada Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de X', Y' y Z' pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cada nucleótido de la cadena paralela y la cadena antiparalela se puede modificar independientemente con LNA, CRN, UNA, cEt, HNA, CeNA, 2'-metoxietilo, 2'-O-metilo, 2'-O-alilo, 2'-C-alilo, 2'-hidroxilo o 2'-fluoro. Por ejemplo, cada nucleótido de la cadena paralela y la cadena antiparalela se modifica independientemente con 2'-O-metilo o 2'-fluoro. Cada X, Y, Z, X', Y' y Z', en particular, pueden representar una modificación 2'-O-metilo o una modificación 2'-fluoro.
En un caso, la cadena paralela del agente de ARNi puede contener el motivo YYY que ocurre en las posiciones 9, 10 y 11 de la cadena cuando la región de dúplex es de 21 nt, empezando a contar desde el 1er nucleótido desde el extremo 5' opcionalmente, empezando a contar en el 1er nucleótido apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'; e Y representa la modificación 2'-F. La cadena paralela puede contener adicionalmente motivos XXX o motivos ZZZ como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y XXX y ZZZ representan cada uno independientemente una modificación 2'-OMe o modificación 2'-F.
En un caso, la cadena antiparalela puede contener el motivo Y'Y'Y' que ocurre en las posiciones 11, 12, 13 de la cadena, empezando a contar desde el 1er nucleótido desde el extremo 5' u, opcionalmente, empezando a contar en el 1er nucleótidos apareado dentro de la región de dúplex, desde el extremo 5'; e Y' representa la modificación 2'-O-metilo. La cadena antiparalela puede contener adicionalmente motivos X'X'X' o motivos Z'Z'Z' como modificaciones de ala en el extremo opuesto de la región de dúplex; y X'X'X' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente una modificación 2'-OMe o modificación 2'-F.
La cadena paralela representada por cualquiera de las fórmulas anteriores (Ia), (Ib), (Ic) y (Id) forma un dúplex con una cadena antiparalela que está representada por cualquiera de las fórmulas (IIa), (IIb), (IIc) y (IId), respectivamente.
Por consiguiente, los agentes de ARNi para usar en los métodos de la invención pueden comprender una cadena paralela y una cadena antiparalela, teniendo cada cadena de 14 a 30 nucleótidos, el dúplex de ARNi representado por la fórmula (III):
paralela: 5' np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
antiparalela: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
en donde:
i, j, k y l son cada uno independientemente 0 o 1;
p, p', q y q' son cada uno independientemente 0-6;
cada Na y Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-25 nucleótidos modificados, comprendiendo cada secuencia al menos dos nucleótidos modificados de manera diferente;
cada Nb y Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10 nucleótidos modificados;
en donde cada np', np, nq' y nq, cada uno de los cuales puede o no estar presente, representa independientemente un nucleótido saliente; y
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' y Z'Z'Z' representan cada uno independientemente un motivo de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos.
En un caso, i es 0 y j es 0; o i es 1 y j es 0; o i es 0 y j es 1; o tanto i como j son 0; o tanto i como j son 1. En otra realización, k es 0 y 1 es 0; o k es 1 y l es 0; k es 0 y l es 1; o tanto k y l son 0; o tanto k como l son 1.
Las combinaciones de ejemplo de la cadena paralela y cadena antiparalela que forman un dúplex de ARNi incluyen las siguientes fórmulas:
5' np-Na-YYY-Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq' 5'
(II Ia)
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5'
(lllb)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'
(lllc)
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5'
(llld)
Cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIIa), cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIIb), cada Nb representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 1-10, 1-7, 1-5 o 1-4 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIIc), cada Nb, Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados.
Cuando el agente de ARNi se representa como fórmula (IIId), cada uno Nb, Nb' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0 -2 o 0 nucleótidos modificados. Cada Na, Na' representa independientemente una secuencia de oligonucleótidos que comprende 2-20, 2-15 o 2-10 nucleótidos modificados. Cada uno de Na, Na', Nb y Nb' comprende independientemente modificaciones del patrón que alterna.
Cada uno de X, Y y Z en las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) pueden ser iguales o diferentes entre sí.
Cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), al menos uno de los nucleótidos Y puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Y'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes; o los tres nucleótidos Y forman pares de bases con los nucleótidos Y' correspondientes.
Cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIIb) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos Z puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos Z'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes; o los tres nucleótidos Z forman pares de bases con los nucleótidos Z' correspondientes.
Cuando el agente de ARNi se representa como la fórmula (IIIc) o (IIId), al menos uno de los nucleótidos X puede formar un par de bases con uno de los nucleótidos X'. Alternativamente, al menos dos de los nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes; o los tres nucleótidos X forman pares de bases con los nucleótidos X' correspondientes.
En un caso, la modificación en el nucleótido Y es diferente a la modificación en el nucleótido Y', la modificación en el nucleótido Z es diferente a la modificación en el nucleótido Z', y/o la modificación en el nucleótido X es diferente a la modificación en el nucleótido X'.
En un caso, cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones de Na son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro. En otro caso, cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro y np' > 0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino a mediante enlace de fosforotioato. En otro caso más, cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro, np' > 0 y al menos un np' está unido a un nucleótido vecino a través de un enlace de fosforotioato, y la cadena paralela se conjuga con uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente (descrito a continuación). En otro caso, cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIId), las modificaciones Na son modificaciones 2'-O-metil o 2'-fluoro, n p' > 0 y al menos una n p' está vinculada a un el nucleótido vecino a través del enlace de fosforotioato, la cadena paralela comprende al menos un enlace de fosforotioato, y la cadena paralela se conjuga con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, cuando el agente de ARNi se representa por la fórmula (IIIa), las modificaciones Na son modificaciones 2'-O-metilo o 2'-fluoro, np' > 0 y al menos un np' está unido a un el nucleótido vecino por enlace de fosforotioato, la cadena paralela comprende al menos un enlace de fosforotioato, y la cadena paralela se conjuga con uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, el agente de ARNi es un multímero que contiene al menos dos dúplex representados por las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en donde los dúplex están conectados por un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex se puede dirigir al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex se puede dirigir al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En un caso, el agente de ARNi es un multímero que contiene tres, cuatro, cinco, seis o más dúplex representados por las fórmulas (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId), en donde los dúplex están conectados por un conector. El conector puede ser escindible o no escindible. Opcionalmente, el multímero comprende además un ligando. Cada uno de los dúplex se puede dirigir al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los dúplex se puede dirigir al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
En un caso, dos agentes de ARNi representados por la fórmula (III), (IIIa), (IIIb), (IIIc) y (IIId) están unidos entre sí en el extremo 5' y uno o ambos extremos 3' y están opcionalmente conjugados con un ligando. Cada uno de los agentes se puede dirigir al mismo gen o dos genes diferentes; o cada uno de los agentes se puede dirigir al mismo gen en dos sitios objetivo diferentes.
Diversas publicaciones describen agentes de ARNi multímeros que se pueden usar en los métodos de la invención. Dichas publicaciones incluyen la publicación internacional WO2007/091269, la patente de EE.UU. N° 7858769, y las publicaciones internacionales WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 y WO2011/031520.
Como se describe con más detalle a continuación, el agente de ARNi que contiene conjugaciones de uno o más restos de carbohidratos con un agente de ARNi puede optimizar una o más propiedades del agente de ARNi. En muchos casos, el resto de carbohidrato se unirá a una subunidad modificada del agente de ARNi. Por ejemplo, el azúcar ribosa de una o más subunidades ribonucleótidas de un agente de ARNbc se puede reemplazar por otro resto, p. ej., un portador no carbohidrato (preferiblemente cíclico) al que está unido un ligando de carbohidrato. Una subunidad ribonucleótida en la que el azúcar ribosa de la subunidad se ha reemplazado de esta manera se denomina en la presente memoria subunidad de modificación de reemplazo de ribosa (RRMS). Un portador cíclico puede ser un sistema de anillo carbocíclico, es decir, todos los átomos del anillo son átomos de carbono, o un sistema de anillo heterocíclico, es decir, uno o más átomos del anillo pueden ser un heteroátomo, p. ej., nitrógeno, oxígeno, azufre. El portador cíclico puede ser un sistema de anillo monocíclico, o puede contener dos o más anillos, p. ej., anillos condensados. El portador cíclico puede ser un sistema de anillo completamente saturado, o puede contener uno o más dobles enlaces.
El ligando puede estar unido al polinucleótido a través de un portador. Los portadores incluyen (i) al menos un "punto de unión a la cadena principal", preferiblemente dos "puntos de unión a la cadena principal" y (ii) al menos un "punto de unión del anclaje". Un "punto de unión de la cadena principal" como se usa en la presente memoria se refiere a un grupo funcional, por ejemplo, un grupo hidroxilo, o en general, un enlace disponible para, y que es adecuado para la incorporación del portador en la cadena principal, p. ej., el fosfato o fosfato modificado, p. ej., cadena principal que contiene azufre, de un ácido ribonucleico. Un "punto de unión de anclaje" (TAP) en algunas realizaciones se refiere a un átomo del anillo constituyente del portador cíclico, p. ej., un átomo de carbono o un heteroátomo (distinto de un átomo que proporciona un punto de unión a la cadena principal), que conecta un resto seleccionado. El resto puede ser, p. ej., un carbohidrato, p. ej., monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido y polisacárido. Opcionalmente, el resto seleccionado está conectado por un anclaje intermedio al portador cíclico. Por lo tanto, el portador cíclico a menudo incluirá un grupo funcional, p. ej., un grupo amino, o en general, proporcionará un enlace, que es adecuado para la incorporación o anclaje de otra entidad química, p. ej., un ligando al anillo constituyente. Los agentes de ARNi se pueden conjugar con un ligando a través de un portador, en donde el portador puede ser un grupo cíclico o un grupo acíclico; preferiblemente, el grupo cíclico se selecciona de pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, [1,3]dioxolano, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo, quinoxalinilo, piridazinonilo, tetrahidrofurilo y decalina; preferiblemente, el grupo acíclico se selecciona de la cadena principal de serinol o cadena principal de dietanolamina.
En ciertos casos específicos, el agente de ARNi para usar en los métodos de la invención es un agente seleccionado del grupo de agentes citados en cualquiera de las Tablas 3, 4, 6, 7, 12, 13, 22, 23, 25 y 26. Estos agentes pueden comprender además un ligando.
IV. ARNi conjugados con ligandos
Otra modificación del ARN de un ARNi implica la unión química al ARN de uno o más ligandos, restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la captación celular del ARNi. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, restos lipídicos tales como un resto colesterol (Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553­ 6556), ácido cólico (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), un tioéter, p. ej., beril-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NYAcad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533-538), una cadena alifática, p. ej., dodecandiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al. , Biochimie, 1993, 75: 49-54), un fosfolípido, p. ej., 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-fosfonato de di-hexadecil-rac-glicerol o trietil-amonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36: 3651­ 3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969-973), o ácido adamantano-acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-365), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264: 229-237), o un resto octadecilamina o hexilaminocarboniloxicocolesterol (Crooke y col., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277: 923-937).
En un caso, un ligando altera la distribución, el objetivo o la vida de un agente de ARNi en el que se incorpora. En casos preferidos, un ligando proporciona una afinidad mejorada por un objetivo seleccionado, p. ej., molécula, célula o tipo de célula, compartimento, p. ej., un compartimento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo, como, p. ej., en comparación con una especie en la que está ausente de dicho ligando. Los ligandos preferidos no formarán parte del apareamiento de dúplex en un ácido nucleico en dúplex.
Los ligandos pueden incluir una sustancia natural, tal como una proteína (p. ej., albúmina de suero humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); carbohidrato (p. ej., un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, N-acetilgalactosamina, o ácido hialurónico); o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, p. ej., un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen el poliaminoácido es una polilisina (PLL), ácido poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli(L-lactida-co-glicólido), copolímero de éter de divinilo-anhídrido maleico, copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poliuretano, poli(ácido 2-etilacrílico), polímeros de N-isopropilacrilamida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímero, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa-helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, p. ej., un agente de direccionamiento celular o tisular, p. ej., una lectina, glicoproteína, lípidos o proteínas, p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula de riñón. Un grupo de direccionamiento puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glicoproteína, proteína tensioactiva A, carbohidrato de mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente, poliaminoacidos glicosilados, galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lípido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, vitamina A, biotina o un péptido RGD o mimético de péptido RGD.
Otros ejemplos de ligandos incluyen colorantes, agentes intercalantes (p. ej. acridinas), reticulantes (p. ej. psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, sapfirina), hidrocarburos aromáticos policíclicos (p. ej., fenazina, dihidrofenazina), endonucleasas artificiales (p. ej. EDTA), moléculas lipófilas, p. ej., colesterol, ácido cólico, ácido adamantano-acético, ácido 1-pireno-butírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados peptídicos (p. ej., péptido de antenapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (p. ej., PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (p. ej., biotina), facilitadores de transporte/absorción (p. ej., aspirina, vitamina E, ácido fólico), ribonucleasas sintéticas (p. ej., imidazol, bisimidazol, histamina, grupos de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complejos de Eu3+ de tetraazamacrociclos), dinitrofenilo, HRP o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, p. ej., glicoproteínas o péptidos, p. ej., moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos p. ej., un anticuerpo, que se une a un tipo de célula específico, tal como una célula hepática. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores hormonales. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, manosa multivalente N-acetil-gulucosamina o fucosa multivalente. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de quinasa p38 MAP o un activador de NF-kB.
El ligando puede ser una sustancia, p. ej., un fármaco que puede aumentar la absorción del agente de ARNi en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, p. ej., alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxón, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, japlaquinolida, latrunculina A, faloidina, swinholide A, indanocina o mioservina.
En algunos casos, un ligando unido a un ARNi como se describe en la presente memoria actúa como un modulador farmacocinético (modulador PK). Los moduladores PK incluyen lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a proteínas, PEG, vitaminas, etc. Los moduladores PK de ejemplo incluyen, pero no se limitan a colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden una serie de enlaces de fosforotioato se unen a proteínas del suero, por lo tanto, oligonucleótidos cortos, p. ej., oligonucleótidos de aproximadamente 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprende múltiples de enlaces fosforotioato en la cadena principal también son asequibles a la presente invención como ligandos (p. ej. como modulación PK de ligandos). Además, los aptámeros que se unen a los componentes del suero (p. ej., proteínas de suero) son también adecuados para su uso como ligandos moduladores PK en las realizaciones descritas en la presente memoria.
Los oligonucleótidos conjugados con ligando se pueden sintetizar mediante el uso de un oligonucleótido que lleva una funcionalidad reactiva colgante, tal como la derivada de la unión de una molécula conectora al oligonucleótido (descrito a continuación). Este oligonucleótido reactivo se puede hacer reaccionar directamente con ligandos disponibles en el mercado, ligandos que se sintetizan llevando cualquiera de una variedad de grupos protectores, o ligandos que tienen un resto de unión unido al mismo.
Los oligonucleótidos usados en los conjugados se pueden preparar de manera conveniente y rutinaria por la técnica bien conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dicha síntesis lo venden varios proveedores, incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, California). Se puede usar adicional o alternativamente cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la técnica. También se conoce el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.
En los oligonucleótidos conjugados con ligando y los nucleósidos unidos a secuencia que llevan unido molécula ligando específica de secuencia de la presente invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos pueden ensamblarse en un sintetizador de ADN adecuado que usa precursores de nucleótidos o nucleósidos estándar, o precursores conjugados de nucleótidos o de nucleósidos que ya llevan el resto de unión, precursores de ligandonucleótido o conjugado-nucleósido que ya llevan la molécula de ligando, o unidades estructurales que llevan ligando no nucleósido.
Cuando se usan precursores de conjugados de nucleótidos que ya llevan un resto de unión, típicamente se completa la síntesis de los nucleósidos unidos de secuencia específica, y la molécula de ligando después se hace reaccionar con el resto de unión para formar el oligonucleótido conjugado con ligando. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos o nucleósidos unidos de la presente invención se sintetizan mediante un sintetizador automático que usa derivados de fosforamiditas a partir de conjugados de ligando-nucleósido además de las fosforamiditas estándar y fosforamiditas no estándar que están disponibles en el mercado y se usan de forma rutinaria en síntesis de oligonucleótidos.
A. Conjugados de lípidos
En un caso, el ligando o conjugado es una molécula lipídica o basada en lípidos. Dicho lípido o molécula a base en lípidos se une preferiblemente a una proteína del suero, p. ej., albúmina del suero humana (HSA). Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, p. ej., un tejido objetivo no renal del cuerpo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser el hígado, incluyendo las células parenquimatosas del hígado. También se pueden usar otras moléculas que se pueden unir a la hSa como ligandos. Por ejemplo, se puede usar naproxeno o aspirina. Un lípido o un ligando basado en lípido puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o el transporte a una célula o membrana celular objetivo, y/o (c) se puede usar para ajustar la unión a una proteína del suero, p. ej., HSA.
Se puede usar un ligando basado en lípidos para inhibir, p. ej., controlar la unión del conjugado a un tejido objetivo. Por ejemplo, un lípido o ligando basado en lípidos que se une a la HSA más fuertemente será menos probable que se dirija al riñón y, por lo tanto, es menos probable que sea eliminado del cuerpo. Un lípido o ligando basado en lípidos que se une a la HSA con menos fuerza se puede usar para dirigir el conjugado al riñón.
En un caso, el ligando basado en lípidos se une a la HSA. Preferiblemente, se une a la HSA con una afinidad suficiente de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente a un tejido no renal. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte que la unión de ligando-HSA no se pueda revertir.
En otro caso, el ligando basado en lípidos se une a la HSA débilmente o no se une en absoluto, de modo que el conjugado se distribuirá preferiblemente al riñón. También se pueden usar otros restos que se dirigen a las células renales en lugar o además del ligando basado en lípidos.
En otro aspecto, el ligando es un resto, p. ej., una vitamina, que es absorbida por una célula objetivo, p. ej., una célula proliferativa. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, p. ej., del tipo maligno o no maligno, p. ej., células cancerosas. Las vitaminas de ejemplo incluyen la vitamina A, E y K. Otras vitaminas de ejemplo incluyen la vitamina B, p. ej., ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por las células diana, tales como células del hígado. También se incluyen HSA y lipoproteína de baja densidad (LDL).
B. Agentes de permeación celular
En otro aspecto, el ligando es un agente de permeación celular, preferiblemente un agente de permeación celular helicoidal. Preferiblemente, el agente es anfipático. Un agente de ejemplo es un péptido tal como tat o Antennapedia. Si el agente es un péptido, se puede modificar, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros, enlaces no peptídicos o pseudopeptídicos, y el uso de D-aminoácidos. El agente helicoidal preferiblemente es un agente alfa-helicoidal, que preferiblemente tiene una fase lipófila y una lipófoba.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético. Un peptidomimético (también denominado en la presente memoria oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. La unión de péptidos y peptidomiméticos a los agentes de ARNi puede afectar a la distribución farmacocinética del ARNi, tal como mejorando el reconocimiento y la absorción celular. El péptido o resto peptidomimético puede tener aproximadamente 5-50 aminoácidos de longitud, p. ej., aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 aminoácidos de longitud.
Un péptido o peptidomimético pueden ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrófobo (p. ej., que consiste principalmente de Tyr, Trp o Phe). El resto peptídico puede ser un péptido dendrímero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto peptídico puede incluir una secuencia de translocación de membrana hidrófoba (MTS). Un ejemplo de péptido que contiene MTS hidrófoba es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP (SEQ ID No : 43). Un análogo de RFGF (p. ej., la secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP (SEQ ID NO: 44) que contiene una MTS hidrófoba también puede ser un resto de direccionamiento. El resto peptídico puede ser un péptido de "suministro", que puede transportar moléculas polares grandes que incluyen péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat del HIV (GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 45) y la proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 46) son capaces de funcionar como péptidos de suministro. Un péptido o peptidomimético puede ser codificado por una secuencia aleatoria de ADN, tal como un péptido identificado a partir de una biblioteca de presentación en fagos, o una biblioteca combinatoria de un compuesto-una perla (OBOC) (Lam et al., Nature, 354: 82-84, 1991). Los ejemplos de un péptido o peptidomimético anclado a un agente de ARNbc a través de una unidad de monómero incorporada para fines de direccionamiento celular es un péptido de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), o imitador de RGD. Un resto peptídico puede variar en longitud de aproximadamente 5 aminoácidos a aproximadamente 40 aminoácidos. Los restos peptídicos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar la estabilidad o propiedades conformacionales directas. Se puede usar cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación.
Un péptido RGD para usar en las composiciones y métodos de la invención puede ser lineal o cíclico, y se puede modificar, p. ej., glicosilar o metilar, para facilitar el direccionamiento a un tejido o tejidos específicos. Los péptidos que contienen RGD y peptidiomimiméticos pueden incluir D-aminoácidos, así como miméticos de RGD sintéticos. Además de RGD, se pueden usar otros restos que se dirigen al ligando integrina. Los conjugados preferidos de este ligando se dirigen a PECAM-1 o VEGF.
Un "péptido de permeación celular" es capaz de permear una célula, p. ej., una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de permeación de célula microbiana puede ser, por ejemplo, un péptido lineal a-helicoidal (p. ej., LL-37 o ceropina P1), un péptido que contiene enlace disulfuro (p. ej., a-defensina, p-defensina o bactenecina), o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (p. ej., PR-39 o indolicidina). Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS). Por ejemplo, un péptido de permeación celular puede ser un péptido anfipático bipartito, tal como MPG, que se obtiene del dominio de péptido de fusión de HIV-1 gp41 y el NLS del antígeno T grande de SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).
C. Conjugados de carbohidratos
En algunos casos de las composiciones y métodos de la invención, un oligonucleótido de ARNi comprende además un carbohidrato. Los ARNi conjugados con carbohidratos son ventajosos para el suministro in vivo de ácidos nucleicos, así como composiciones adecuadas para uso terapéutico in vivo, como se describe en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, "carbohidrato" se refiere a un compuesto que es un carbohidrato per se compuesto por una o más unidades de monosacáridos que tienen al menos 6 átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono; o un compuesto que tiene como parte del mismo un resto de carbohidrato compuesto por una o más unidades de monosacárido que tiene cada una al menos seis átomos de carbono (que pueden ser lineales, ramificados o cíclicos), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los carbohidratos representativos incluyen los azúcares (mono-, di-, tri- y oligosacáridos que contienen aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades de monosacáridos), y polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa y gomas de polisacárido. Los monosacáridos específicos incluyen HBV y azúcares superiores (p. ej., HBV, C6, C7 o C8); los di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacárido (p. ej., HBV, C6, C7 o C8).
En un caso, un conjugado de carbohidrato para usar en las composiciones y métodos de la invención es un monosacárido. En un caso, el monosacárido es una N-acetilgalactosamina, tal como
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En otro caso, un conjugado de carbohidrato para usar en las composiciones y métodos se selecciona del grupo que consiste en:
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Otro conjugado de carbohidrato representativo para usar incluye, pero no se limita a
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En algunas realizaciones, el conjugado de carbohidrato comprende además uno o más ligandos adicionales como se ha descrito antes, tales como, pero no limitados a un modulador PK y/o un péptido de permeación celular.
Los conjugados (y conectores) de carbohidratos adicionales adecuados para usar en la presente invención incluyen los descritos en las publicaciones PCT N° WO 2014/179620 y WO 2014/179627, cuyo contenido entero de cada uno se incorpora en la presente memoria por referencia.
D. Conectores
En algunos casos, el conjugado o ligando descrito en la presente memoria se puede unir a un oligonucleótido de ARNi con diversos conectores que pueden ser escindibles o no escindibles.
El término "conector" o "grupo de unión" significa un resto orgánico que conecta dos partes de un compuesto, p. ej., une covalentemente dos partes de un compuesto. Los conectores típicamente comprenden un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR8, C (O), C (O)NH, SO, SO2, SO2NH o una cadena de átomos, tales como, pero no limitados a, alquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, sustituido o no sustituido, alquinilo sustituido o no sustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclilalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilhererociclilalquinilo, alquenilheterociclilalquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alquinilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilhereroarilo, cuyos uno o más metilenos pueden estar interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), arilo sustituido o no sustituido, heteroarilo sustituido o no sustituido, heterocíclico sustituido o no sustituido; donde R8 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido. En una realización, el conector está entre aproximadamente 1-24 átomos, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 átomos, 7-17, 8-17, 6-16, 7­ 16 u 8-16 átomos.
Un grupo de unión escindible es uno que es suficientemente estable fuera de la célula, pero que tras entrar en una célula objetivo se escinde para liberar las dos partes que el conector mantiene unidas. En una realización preferida, el grupo de unión escindible se escinde al menos aproximadamente 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o más, o al menos aproximadamente 100 veces más rápido en una célula diana o en condiciones de primera referencia (que se pueden seleccionar, p. ej., para imitar o representar las condiciones intracelulares) que en la sangre de un sujeto, o en condiciones de segunda referencia (que se pueden seleccionar, p. ej., para imitar o representar condiciones encontradas en la sangre o suero).
Los grupos de unión escindibles son susceptibles a los agentes de escisión, p. ej., pH, potencial de oxidorreducción o la presencia de moléculas degradantes. En general, los agentes de escisión son más frecuentes o se encuentran en niveles o con actividades más altas dentro de las células que en el suero o la sangre. Los ejemplos de dichos agentes degradantes incluyen: agentes de oxidorreducción que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, que incluyen, p. ej., enzimas oxidantes o reductoras o agentes reductores tales como mercaptanos, presentes en las células, que pueden degradar un grupo de unión escindible de oxidorreducción por reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un entorno ácido, p. ej., aquellos que dan como resultado un pH de cinco o inferior; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de unión escindible por ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser específicas del sustrato) y fosfatasas.
Un grupo de unión escindible, tal como un enlace disulfuro puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es 7,4, mientras que el pH intracelular promedio es ligeramente más bajo, en el intervalo de aproximadamente 7,1-7,3. Los endosomas tienen un pH más ácido, en el intervalo de 5.5-6.0, y los lisosomas tienen un pH incluso más ácido en torno a 5.0. Algunos conectores tendrán un grupo de unión escindible que se escinde a un pH preferido, liberando así un lípido catiónico del ligando dentro de la célula, o en el compartimento deseado de la célula.
Un conector puede incluir un grupo de unión escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de unión escindible incorporado en un conector puede depender de la célula a la que se dirige. Por ejemplo, un ligando que se dirige al hígado se puede unir a un lípido catiónico mediante un conector que incluye un grupo éster. Las células hepáticas son ricas en esterasas y, por lo tanto, el conector se escindirá de forma más eficaz en las células hepáticas que en tipos de células que no son ricas en esterasas. Otros tipos de células ricas en esterasas incluyen las células del pulmón, corteza renal y testículos.
Los conectores que contienen enlaces peptídicos se pueden usar cuando se dirigen a tipos de células ricas en peptidasas, como las células hepáticas y sinoviocitos.
En general, la idoneidad de un grupo de unión escindible candidato se puede evaluar probando la capacidad de un agente (o condiciones) degradante para escindir el grupo de unión candidato. También será deseable probar también en el grupo de unión escindible candidato la capacidad de resistir la escisión en la sangre o cuando está en contacto con otro tejido no objetivo. Por lo tanto, se puede determinar la susceptibilidad relativa a la escisión entre unas primeras y unas segundas condiciones, donde las primeras se seleccionan para ser indicativas de la escisión en una célula objetivo y las segundas se seleccionan para ser indicativas de la escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, p. ej., sangre o suero. Las evaluaciones se pueden llevar a cabo en sistemas sin células, en células, en cultivo celular, en cultivo de órganos o tejidos, o en animales completos. Puede ser útil hacer evaluaciones iniciales en condiciones sin células o de cultivo y confirmar mediante evaluaciones adicionales en animales completos. En realizaciones preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones intracelulares) en comparación con sangre o suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares).
i. Grupos de unión escindibles por oxidorreducción
En un caso, un grupo de unión escindible es un grupo de unión escindible por oxidorreducción que se escinde tras la reducción u oxidación. Un ejemplo de grupo de unión escindible por reducción es un grupo de enlace disulfuro (-S-S-). Para determinar si un grupo de unión escindible candidato es un "grupo de unión escindible por reducción" adecuado, o si, por ejemplo, es adecuado para usar con un resto ARNi particular y agente de direccionamiento particular, se pueden ver los métodos descritos en la presente memoria. Por ejemplo, un candidato puede se puede evaluar por incubación con ditiotreitol (DTT), u otro agente reductor usando reactivos conocidos en la técnica, que imitan la velocidad de escisión que se observaría en una célula, p. ej., una celda objetivo. Los candidatos también se pueden evaluar en condiciones que se seleccionan para imitar condiciones de sangre o suero. En unas, los compuestos candidatos se escinden como máximo aproximadamente en 10% en la sangre. En otras realizaciones, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos aproximadamente 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o aproximadamente 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones intracelulares) en comparación con la sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares). La velocidad de escisión de los compuestos candidatos se puede determinar usando ensayos cinéticos enzimáticos estándar en condiciones elegidas para imitar los medios intracelulares y en comparación con las condiciones elegidas para imitar los medios extracelulares.
ii) Grupos de unión escindibles basados en fosfato
En otro caso, un conector escindible comprende un grupo de unión escindible basado en fosfato. Un grupo de unión escindible basado en fosfato es escindido por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en las células son enzimas como las fosfatasas en las células. Ejemplos de grupos de unión basados en fosfato son -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Son realizaciones preferidas -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Una realización preferida es -OP(O)(OH)-O-. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos antes.
iii) Grupos de unión escindibles con ácido
En otro caso, un conector escindible comprende un grupo conector escindible con ácido. Un grupo de unión escindible con ácido es un grupo de unión que se escinde en condiciones ácidas. En realizaciones preferidas, los grupos de unión escindibles con ácido se escinden en un entorno ácido con un pH de aproximadamente 6.5 o inferior (p. ej., aproximadamente 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 o inferior), o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los orgánulos específicos de pH bajo, tales como los endosomas y los lisosomas, pueden proporcionar un entorno de escisión para los grupos de unión escindibles con ácido. Los ejemplos de grupos de unión escindibles con ácido incluyen, pero sin limitación, hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles con ácidos pueden tener la fórmula general -C=NN-, C(O)O -OC(O). Una realización preferida es cuando el carbono unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, un grupo alquilo sustituido o un grupo alquilo terciario tal como dimetilo pentilo o t-butilo. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos antes.
iv. Grupos de unión basados en éster
En otro caso, un conector escindible comprende un grupo de unión escindible basado en éster. Un grupo de unión escindible basado éster es escindido por enzimas tales como esterasas y amidasas en las células. Los ejemplos de grupos de unión escindibles basados en éster incluyen, pero no se limitan a ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos de unión éster escindibles tienen la fórmula general -C(O)O-, o -OC(O)-. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos antes.
v. Grupos de escisión basados en péptido
En otro caso más, un conector escindible comprende un grupo de unión escindible basado en péptido. Un grupo de unión escindible basado en péptido es escindido por enzimas tales como peptidasas y proteasas en las células. Los grupos de unión escindibles basados en péptidos son enlaces peptídicos formados entre aminoácidos para dar oligopéptidos (p. ej., dipéptidos, tripéptidos etc.) y polipéptidos. Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-). El grupo amida se puede formar entre cualquier alquileno, alquenileno o alquinileno. Un enlace peptídico es un tipo especial de enlace amida formado entre aminoácidos para dar péptidos y proteínas. El grupo de escisión basado en péptido en general está limitado al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos que producen péptidos y proteínas y no incluye todo el grupo funcional amida. Los grupos de unión escindibles basados en péptidos tienen la fórmula general -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos antes.
En un caso, un ARNi de la invención se conjuga con un carbohidrato a través de un conector. Los ejemplos no limitantes de conjugados de carbohidrato y a Rní con conectores de las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a,
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
( Fórmula X X X I) ,
cuando uno de X o Y es un oligonucleótido, el otro es un hidrógeno.
En algunos casos de las composiciones y métodos, un ligando es uno o más derivados de "GalNAc" (N-acetilgalactosamina) unidos mediante un conector ramificado bivalente o trivalente.
En un caso, un ARNbc de la invención se conjuga con un conector ramificado bivalente o trivalente seleccionado del grupo de estructuras mostradas en cualquiera de las fórmulas (XXXII) -(XXXV):
Figure imgf000064_0001
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B y q5C representan independientemente para cada caso 0-20 y en donde la unidad que se repite puede ser igual o diferente;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B,
Figure imgf000064_0002
T5C son cada para cada caso, ausente, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH o CH2O;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C son independientemente para cada caso ausente, alquileno, alquileno sustituido en donde uno o más metilenos pueden estar interrumpidos terminados en uno o más de O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C=C o C(O);
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C son cada uno independientemente para cada so, ausente, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-
Figure imgf000064_0003
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B y L5C representan el ligando; es decir, cada uno independientemente para cada caso, un monosacárido (tal como GalNAc), disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido o polisacárido; y Ra es H o cadena lateral de aminoácidos. Los derivados de GalNAc de conjugación trivalente son particularmente útiles para usar con agentes de ARNi para inhibir la expresión de un gen objetivo, tales como los de fórmula (XXXVI):
Fórmula XXXVI
Figure imgf000064_0004
en donde L 5A, L 5B y L 5C representan un monosacárido, tal como derivado de GalNAc.
Los ejemplos de grupos conectores ramificados bivalentes y trivalentes adecuados que se conjugan con derivados de GalNAc incluyen, pero no se limitan a, las estructuras mencionadas antes como fórmulas II, VII, XI, X y XIII.
Las patentes de EE.UU. representativas que enseñan la preparación de conjugados de ARN incluyen, pero no se limitan a, 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717 5580731; 5591584;
5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025;
4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830;
5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241 5391723;
5416203 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726;
5597696; 5599923; 5599928 y 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931; 6900297; 7037646; 8106022.
No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado se modifiquen uniformemente, y de hecho se pueden incorporar más de una de las modificaciones antes mencionadas en un solo compuesto o incluso en un solo nucleósido dentro de un ARNi. La presente descripción también incluye compuestos de ARNi que son compuestos quiméricos.
Los compuestos de ARNi "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son compuestos de ARNi, preferiblemente ARNbc, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad de monómero, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de ARNbc. Estos ARNi típicamente contienen al menos una región en donde el ARN se modifica para conferir así al ARNi mayor resistencia a la degradación por nucleasa, mayor captación celular y/o mayor afinidad de unión por el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del ARNi puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión del objetivo de ARN, mejorando así en gran medida la eficacia de la inhibición de la expresión génica por el ARNi. Por consiguiente, a menudo se pueden obtener resultados comparables con ARNi más cortos cuando se usan ARNbc quiméricos, en comparación con los desoxi ARNbc de fosforotioato que se hibridan con la misma región objetivo.
En ciertos casos, el ARN de un ARNi se puede modificar mediante un grupo no ligando. Se han conjugado una serie de moléculas no ligandos con ARNi para mejorar la actividad, distribución celular o captación celular del ARNi, y los procedimientos para realizar dichas conjugaciones están disponibles en la bibliografía científica. Dichos restos no ligandos han incluido restos lipídicos, tales como colesterol (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, p. ej., dodecandiol o restos undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), un fosfolípido, p. ej., 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), una cadena de poliamina o polietilenglicol (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), un resto palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o un resto de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicocolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923) Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichos conjugados de ARN se han citado antes. Los protocolos de conjugación típicos implican la síntesis de un ARN que lleva un aminoconector en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino después se hace reaccionar con la molécula que se conjuga usando los reactivos de acoplamiento o de activación adecuados. La reacción de conjugación se puede llevar a cabo con el ARN todavía unido al soporte sólido o después de la escisión del ARN, en fase de solución. La purificación del conjugado de ARN por HPLC normalmente proporciona el conjugado puro.
V. Suministro de un ARNi
El suministro de un ARNi a una célula p. ej., una célula en un sujeto, tal como un sujeto humano (p. ej., un sujeto que lo necesita, tal como un sujeto que tiene una enfermedad, trastorno o afección asociada con la infección por el HBV) se puede lograr en una serie de formas diferentes. Por ejemplo, el suministro se puede llevar a cabo poniendo en contacto una célula con un ARNi de la invención in vitro o in vivo. El suministro in vivo también se puede llevar a cabo directamente administrando una composición que comprende un ARNi, p. ej., un ARNbc, a un sujeto. Alternativamente, el suministro in vivo se puede llevar a cabo indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del ARNi. Estas alternativas se discuten más adelante.
En general, cualquier método de suministro de una molécula de ácido nucleico (in vitro o in vivo) se puede adaptar para usar con un ARNi de la invención (véase p. ej., Akhtar S. y Julian R.L. (1992) Trends Cell Biol. 2 (5): 139-144 y WO94/02595, que se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad). Para el suministro in vivo, los factores a considerar con el fin de suministrar una molécula de ARNi incluyen, por ejemplo, la estabilidad biológica de la molécula suministrada, la prevención de efectos no específicos y la acumulación de la molécula suministrada en el tejido objetivo. Los efectos no específicos de un ARNi se pueden minimizar mediante la administración local, por ejemplo, mediante inyección directa o implantación en un tejido o administrando la preparación por vía tópica. La administración local en un sitio de tratamiento maximiza la concentración local del agente, limita la exposición del agente a tejidos sistémicos que de otro modo podrían ser dañados por el agente o que pueden degradar el agente, y permite administrar una dosis total más baja de la molécula de ARNi. Varios estudios han demostrado la inactivación satisfactoria de productos génicos cuando se administra un ARNi localmente. Por ejemplo, el suministro intraocular de un ARNbc de VEGF por inyección intravítrea en macaco cangrejero (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24: 132-138) y las inyecciones subretinianas en ratones (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) mostraron ambos prevenir la neovascularización en un modelo experimental de degeneración macular relacionada con la edad. Además, la inyección intratumoral directa de un ARNbc en ratones reduce el volumen del tumor (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther. 11: 267-274) y puede prolongar la supervivencia de los ratones que llevan tumor (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14: 343-350; Li, S., et al (2007) Mol. Ther. 15:515-523). La interferencia de ARN también ha tenido éxito con el suministro local al SNC mediante inyección directa (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59- 66; Makimura, H. et al. (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., et al (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya, Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93: 594-602) y a los pulmones por administración intranasal (Howard, KA., et al (2006) Mol. Ther. 14: 476-484; Zhang, X., et al. (2004) J. Biol. Chem.
279: 10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Para administrar un ARNi de forma sistémica para el tratamiento de una enfermedad, el ARN se puede modificar o alternativamente suministrar usando un sistema de suministro de fármacos; ambos métodos actúan para prevenir la degradación rápida del ARNbc por endo- y exonucleasas in vivo. La modificación del ARN o del vehículo farmacéutico también puede permitir dirigir la composición de ARNi al tejido objetivo y evitar efectos no deseados fuera del objetivo. Las moléculas de ARNi se pueden modificar por conjugación química con grupos lipófilos tales como colesterol para mejorar la captación celular y prevenir la degradación. Por ejemplo, un ARNi dirigido contra ApoB conjugada con un resto de colesterol lipófilo se inyectó de forma sistémica en ratones y dio como resultado la inactivación génica del ARNm de apoB tanto en el hígado como en el yeyuno (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Se ha demostrado que la conjugación de un ARNi con un aptámero inhibe el crecimiento tumoral y media la regresión tumoral en un modelo de ratón de cáncer de próstata (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24: 1005-1015). En una realización alternativa, el ARNi se puede suministrar usando sistemas de suministro de fármacos tales como una nanopartícula, un dendrímero, un polímero, liposomas o un sistema de administración catiónico. Los sistemas de suministro catiónico cargados positivamente facilitan la unión de una molécula de ARNi (cargada negativamente) y también mejoran las interacciones en la membrana celular cargada negativamente para permitir la captación eficaz de un ARNi por la célula. Los lípidos catiónicos, los dendrímeros o los polímeros se pueden unir a un ARNi o inducir para formar una vesícula o micela (véase p. ej., Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129 (2): 107-116) que encierra un ARNi. La formación de vesículas o micelas previene todavía más la degradación del ARNi cuando se administra por vía sistémica. Los métodos para hacer y administrar complejos de ARNi catiónicos están en la experiencia de un experto en la técnica (véase p. ej., Sorensen, DR, et al (2003) J. Mol Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, que se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad). Algunos ejemplos no limitantes de sistemas de suministro de fármacos útiles para el suministro sistémico de ARNi incluyen DOTAp (Sorensen, DR., et al (2003), véase antes; Verma, UN., et al (2003), véase antes), Oligofectamina, "solid nucleic acid lipid particles" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), cardiolipina (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol.
26:1087-1091), polietilenimina (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. 16 de agosto Epub antes de impresión; Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), péptidos de Arg-Gly-Asp (RGD) (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487), y poliamidoaminas (Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res.
16:1799-1804). En algunas realizaciones, un ARNi forma un complejo con ciclodextrina para administración sistémica. Se pueden encontrar métodos para la administración y composiciones farmacéuticas de ARNi y ciclodextrinas en la patente de EE.UU. N° 7427605.
A. ARNi codificados por vector
El ARNi que se dirige al gen de HBV se puede expresar a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (véase, p. ej., Couture, A, et al, TIG (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., Publicación internacional PCT N° WO 00/22113, Conrad, Publicación internacional PCT N° WO 00/22114 y Conrad, patente de EE.UU. 6054299) La expresión puede ser transitoria (del orden de horas a semanas) o sostenida (semanas a meses o más), dependiendo de la construcción específica usada y el tipo de tejido o célula objetivo. Estos transgenes se pueden introducir como una construcción lineal, un plásmido circular o un vector viral, que puede ser un vector integrador o no integrador. El transgén también se puede construir para permitir que sea heredado como un plásmido extracromosómico (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92: 1292).
La cadena o cadenas individuales de un ARNi se pueden transcribir desde un promotor en un vector de expresión. Cuando se van a expresar dos cadenas separadas para generar, por ejemplo, un ARNbc, se pueden introducir simultáneamente dos vectores de expresión separados (p. ej., por transfección o infección) en una célula objetivo. Alternativamente, cada cadena individual de un ARNbc puede ser transcrita por promotores, los cuales están ambos ubicados en el mismo plásmido de expresión. En un caso, un ARNbc se expresa como polinucleótidos repetidos invertidos unidos por una secuencia de polinucleótidos conectora de manera que el ARNbc tiene una estructura de tallo y bucle.
Los vectores de expresión de ARNi son generalmente plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden usar vectores de expresión compatibles con células eucariotas, preferiblemente aquellos compatibles con células de vertebrados, para producir construcciones recombinantes para la expresión de un ARNi como se describe en la presente memoria. Los vectores de expresión de células eucariotas son bien conocidos en la técnica y están disponibles en varias fuentes comerciales. Típicamente, dichos vectores se proporcionan conteniendo sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ácido nucleico deseado. El suministro de vectores que expresan el ARNi puede ser sistémico, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células objetivo extraídas del paciente seguido de reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permita la introducción en una célula objetivo deseada.
Los plásmidos de expresión del ARNi se pueden transfectar a las células objetivo como un complejo con portadores lipídicos catiónicos (p. ej., Oligofectamina) o portadores basados en lípidos no catiónicos (p. ej., Transit-TKO™). La invención también contempla múltiples transfecciones de lípidos para inactivaciones génicas mediadas por ARNi que se dirigen a diferentes regiones de un ARN objetivo durante un período de una semana o más. La introducción exitosa de vectores en las células huésped se puede monitorear usando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria se puede señalar con un indicador, tal como un marcador fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP). La transfección estable de células ex vivo se puede asegurar usando marcadores que proporcionan la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (p. ej., antibióticos y drogas), tales como la resistencia a higromicina B.
Los sistemas de vectores virales que se pueden usar con los métodos y composiciones descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, (a) vectores de adenovirus; (b) vectores de retrovirus, incluyendo pero no limitados a vectores lentivirales, virus de la leucemia murina de Moloney, etc.; (c) vectores de virus adenoasociados; (d) vectores del virus del herpes simple; (e) vectores de SV 40; (f) vectores de virus de polioma; (g) vectores del virus del papiloma; (h) vectores de picornavirus; (i) vectores del virus de la viruela, tales como un ortopox, p. ej., vectores de virus vaccinia o avipox, p. ej. viruela del canario o viruela aviar; y (j) un adenovirus dependiente de auxiliar o Gutless. Los virus defectuosos en la replicación también pueden ser ventajosos. Diferentes vectores se incorporarán o no al genoma de las células. Las construcciones pueden incluir secuencias virales para la transfección, si se desea. Alternativamente, la construcción se puede incorporar en vectores capaces de replicación episomal, p. ej., vectores EPV y EBV. Las construcciones para la expresión recombinante de un ARNi generalmente requerirán elementos reguladores, p. ej., promotores, potenciadores, etc., para asegurar la expresión del ARNi en las células objetivo. Otros aspectos que considerar para vectores y construcciones se describen adicionalmente a continuación.
Los vectores útiles para el suministro de un ARNi incluirán elementos reguladores (promotor, potenciador, etc.) suficientes para la expresión del ARNi en la célula o tejido objetivo deseado. Los elementos reguladores se pueden elegir para proporcionar expresión constitutiva o regulada/inducible.
La expresión del ARNi se puede regular con precisión, por ejemplo, usando una secuencia reguladora inducible que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, p. ej., niveles circulantes de glucosa u hormonas (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Dichos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de la expresión de ARNbc en células o en mamíferos incluyen, por ejemplo, la regulación por ecdisona, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización e isopropil-beta-D1-tiogalactopiranosido (IPTG). Un experto en la técnica podría elegir la secuencia reguladora/promotora adecuada en función del uso previsto del transgén de ARNi.
Se pueden usar vectores virales que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican un ARNi. Por ejemplo, se puede usar un vector retroviral (véase Miller et al., Meth. Enzymol. 217: 581-599 (1993)). Estos vectores retrovirales contienen los componentes necesarios para el correcto empaquetamiento del genoma viral y la integración en el ADN de la célula hospedante. Las secuencias de ácido nucleico que codifican un ARNi se clonan en uno o más vectores, lo que facilita el suministro del ácido nucleico a un paciente. Se pueden encontrar más detalles sobre los vectores retrovirales, por ejemplo, en Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), que describe el uso de un vector retroviral para administrar el gen mdr1 a células madre hematopoyéticas con el fin de hacer que las células madre sean más resistentes a la quimioterapia. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica son: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93 644-651 (1994); Kiem y col., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg, Human Gene Therapy 4: 129 - 141 (1993); y Grossman y Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114 (1993). Los vectores lentivirales contemplados para usar incluyen, por ejemplo, los vectores basados en HIV descritos en las patentes de EE.UU. N° 6143520; 5665557 y 5981276.
Los adenovirus también están contemplados para usar en el suministro de ARNi. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos, p. ej., para suministrar genes a los epitelios respiratorios. Los adenovirus infectan de forma natural los epitelios respiratorios donde causan una enfermedad leve. Otros objetivos para los sistemas de suministro basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, células endoteliales y músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de ser capaces de infectar células que no se dividen. Kozarsky y Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993), presentan una revisión de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5: 3-10 (1994), demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes a los epitelios respiratorios de los monos rhesus. Se pueden encontrar otros casos del uso de adenovirus en terapia génica en Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91 225-234 (1993); Publicación PCT WO94/12649; y Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Se describe un vector AV adecuado para expresar un ARNi caracterizado en la invención, un método para construir el vector AV recombinante y un método para suministrar el vector a células objetivo en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Los vectores de virus adenoasociados (AAV) también se pueden usar para suministrar un ARNi de la invención (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993); Patente de EE.UU. N° 5436146) En una realización, el ARNi se puede expresar como dos moléculas de ARN monocatenarias complementarias separadas a partir de un vector de AAV recombinante que tiene, por ejemplo, los promotores de ARN U6 o H1, o el promotor de citomegalovirus (CMV). Los vectores AAV adecuados para expresar el ARNbc caracterizado en la invención, los métodos para construir el vector AV recombinante y los métodos para suministrar los vectores en las células objetivo se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher KJ et al. (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; patente N° 5252479; patente de EE.UU. N° 5139941; solicitud de patente internacional N° WO 94/13788; y solicitud de patente internacional N° WO 93/24641.
Otro vector viral adecuado para el suministro de un ARNi de la invención es un virus de la viruela tal como un virus vaccinia, por ejemplo, un virus vaccinia atenuado tal como el virus modificado Ankara (MVA) o NYVAC, un avipox como la viruela aviar o la viruela del canario.
El tropismo de los vectores virales se puede modificar mediante seudotipado de los vectores con proteínas de
envuelta u otros antígenos de superficie de otros virus, o sustituyendo diferentes proteínas de la cápside viral, según
sea adecuado. Por ejemplo, los vectores lentivirales se pueden seudotipar con proteínas de superficie del virus de la
estomatitis vesicular (VSV), rabia, ébola, Mokola y similares. Los vectores a Av se pueden hacer para dirigirse a
diferentes células por modificación genética de los vectores para expresar diferentes serotipos de proteínas de la
cápside; véase, p. ej., Rabinowitz JE et al. (2002), J Virol 76: 791-801, cuya descripción completa se incorpora en la
presente memoria como referencia.
La preparación farmacéutica de un vector puede incluir el vector en un diluyente aceptable, o puede incluir una
matriz de liberación lenta en la que está insertado el vehículo de suministro génico. Alternativamente, cuando el
vector completo de suministro génico se puede producir intacto a partir de células recombinantes, p. ej., vectores
retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de
genes.
VI. Composiciones farmacéuticas de la invención
La presente invención también incluye composiciones farmacéuticas y formulaciones que incluyen los ARNi de la
invención. En una realización, se proporcionan en la presente memoria composiciones farmacéuticas que contienen
un ARNi, como se describe en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones
farmacéuticas que contienen el ARNi son útiles para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o
actividad de un gen del HBV. Dichas composiciones farmacéuticas se formulan en función del modo de suministro.
Un ejemplo son las composiciones que se formulan para administración sistémica por suministro parenteral, p. ej.,
por suministro subcutáneo (SC) o intravenoso (IV). Otro ejemplo son las composiciones que se formulan para el
suministro directo el parénquima cerebral, p. ej., por infusión en el cerebro, tal como por infusión continua con
bomba. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar en dosis suficientes para inhibir la
expresión de un gen de HBV.
En un caso, un agente de ARNi de la invención se administra a un sujeto como una dosis basada en el peso. Una
"dosis basada en el peso" (p. ej., una dosis en mg/kg) es una dosis del agente de ARNi que cambiará dependiendo
del peso del sujeto. En otro caso, se administra un agente de ARNi a un sujeto como una dosis fija. Una "dosis fija"
(p. ej., una dosis en mg) significa que se usa una dosis de un agente de ARNi para todos los sujetos,
independientemente de cualquier factor específico relacionado con el sujeto, tal como el peso. En un caso particular,
una dosis fija de un agente de ARNi de la invención se basa en un peso o edad predeterminados.
En general, una dosis adecuada de un ARNi estará en el intervalo de aproximadamente 0.001 a aproximadamente
200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor al día, en general en el intervalo de aproximadamente
1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal al día. Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar en aproximadamente
0.01 mg/kg, aproximadamente 0.05 mg/kg, aproximadamente 0.5 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg,
aproximadamente 1.5 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg,
aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg o aproximadamente 50 mg/kg
por dosis individual.
Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8,
0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.
3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.
Figure imgf000068_0001
5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.
6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se
pretende que sean parte de esta descripción.
En otro caso, el ARNbc se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg,
aproximadamente 0.25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de
aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 45 mg/kg, de
aproximadamente 0.25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de
aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/kg, de
aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de
aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de
aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
En otro caso, el ARNbc se administra en una dosis de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 0.75 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente aproximadamente 0.75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 aproximadamente 1.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 aproximadamente 2.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 aproximadamente 3.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 4 aproximadamente 4.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 4 aproximadamente 7.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente g, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente g, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente g, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente g, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente aproximadamente 0.75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 aproximadamente 1.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 aproximadamente 2.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 3 aproximadamente 3.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 3 aproximadamente 4.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 3 aproximadamente 7.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente g, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente g, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente
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g, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 mg/kg. En una realización, el ARNbc se administra en una dosis de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
Por ejemplo, se puede administrar a los sujetos, p. ej., por vía subcutánea o intravenosa, una cantidad terapéutica individual de Ar Ní, tal como aproximadamente 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
En algunos casos, se administra a los sujetos, p. ej. por vía subcutánea o intravenosa, dosis múltiples de una cantidad terapéutica del ARNi, tal como una dosis de aproximadamente 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Una pauta de multidosis puede incluir la administración de una cantidad terapéutica de ARNi diaria, tal como durante dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, siete días, o más tiempo.
En otros casos, se administra a los sujetos, p. ej. por vía subcutánea o intravenosa, una dosis repetida de una cantidad terapéutica del ARNi, tal como una dosis de aproximadamente 0.1, 0.125, 0.15, 0.175, 0.2, 0.225, 0.25, 0.275, 0.3, 0.325, 0.35, 0.375, 0.4, 0.425, 0.45, 0.475, 0.5, 0.525, 0.55, 0.575, 0.6, 0.625, 0.65, 0.675, 0.7, 0.725, 0.75, 0.775, 0.8, 0.825, 0.85, 0.875, 0.9, 0.925, 0.95, 0.975, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Una pauta de dosis repetida puede incluir la administración de una cantidad terapéutica de ARNi de forma regular, tal como en días alternos, cada tercer día, cada cuarto día, dos veces por semana, una vez por semana, semanas alternas o una vez al mes.
En ciertos casos, por ejemplo, cuando una composición de la invención comprende un ARNbc como se describe en la presente memoria y un lípido, se puede administrar a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNi, tal como de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 9.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
En ciertos casos, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario incluye una modificación (p. ej., uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos), incluyendo uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión del agente, seis enlaces fosforotioato y un ligando, dicho agente se administra en una dosis de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg o de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios de los valores citados antes también se pretende que sean parte de esta descripción, p. ej., el agente de ARNi se puede administrar al sujeto en una dosis de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 0.45 mg/kg.
Por ejemplo, el agente de ARNi, p. ej. agente de ARNi en una composición farmacéutica, se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg, 0.0125 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.0175 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.0225 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.0275 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.0325 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.0375 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.0425 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.0475 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0525 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.0575 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.0625 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.0675 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.0725 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.0775 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.0825 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.0875 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.0925 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.0975 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.175 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.225 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.275 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.325 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.375 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.425 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.475 mg/kg o aproximadamente 0.5 mg/kg. Los valores intermedios de los valores citados antes también se pretende que sean parte de esta descripción.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 900 mg, p. ej., entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 550 mg o entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 125 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 175 mg, 200 mg, aproximadamente 225 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 275 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 325 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 375 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 425 mg, aproximadamente 450 mg, aproximadamente 475 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 525 mg, aproximadamente 550 mg, aproximadamente 575 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 625 mg, aproximadamente 650 mg, aproximadamente 675 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 725 mg, aproximadamente 750 mg, aproximadamente 775 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 825 mg, aproximadamente 850 mg, aproximadamente 875 mg o aproximadamente 900 mg.
La composición farmacéutica se puede administrar por infusión intravenosa a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de un periodo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, y 21, 22, 23, 24 o aproximadamente 25 minutos. La administración se puede repetir, por ejemplo, de forma regular, tal como de forma semanal, quincenal (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más tiempo. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración semanal o quincenal durante tres meses, la administración se puede repetir una vez al mes, durante seis meses o un año o más.
La composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el ARNi se puede administrar como dos, tres o más subdosis en intervalos adecuados a lo largo del día o incluso usando infusión continua o suministro a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNi contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño con el fin de lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también se puede combinar para el suministro durante varios días, p. ej., usando una formulación convencional de liberación sostenida que proporciona la liberación sostenida del ARNi durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica y son particularmente útiles para suministrar agentes en un sitio particular, tal como podría usarse con los agentes de la presente invención. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria.
En otros casos, una dosis única de las composiciones farmacéuticas puede ser duradera, de modo que las dosis posteriores se administran en intervalos de no más de 3, 4 o 5 días, o en intervalos de no más de 1, 2, 3 o 4 semanas. En algunos casos, se administra una dosis única de las composiciones farmacéuticas una vez por semana. En otros casos, una dosis única de las composiciones farmacéuticas de la invención se administra bimensualmente. En algunos casos, una sola dosis de las composiciones farmacéuticas de la invención se administra una vez al mes, una vez cada dos meses, o una vez trimestral (es decir, cada tres meses).
El experto en la técnica apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluyendo, pero no limitado a la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos. Las estimaciones de las dosis eficaces y las semividas in vivo para los ARNi individuales abarcados por la invención se pueden hacer usando metodologías convencionales o basándose en ensayos in vivo usando un modelo animal adecuado, como se describe en otra parte de la presente memoria.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar de una serie de formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y del área a tratar. La administración puede ser tópica
(p. ej., por un parche transdérmico), pulmonar, p. ej., por inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y transdérmica, oral o parenteral. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; subdérmica, p. ej., mediante un dispositivo implantado; o intracraneal, por ejemplo, por administración intraparenquimal, intratecal o intraventricular.
El ARNi se puede administrar de manera que se dirija a un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).
Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Los vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares pueden ser necesarios o deseables. Los condones, guantes y similares recubiertos también pueden ser útiles. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en las que los ARNi caracterizados en la invención están mezclados con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutros (p. ej., dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina d MpC, distearolifosfatidilcolina) negativos (p. ej., dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (p. ej., dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Los ARNi caracterizados en la invención se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los ARNi pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Los ácidos grasos y ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un éster alquílico C1-20 (p.
ej., miristato de isopropilo IPM), monoglicéridos, diglicéridos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos).
Las formulaciones tópicas se describen en detalle en la patente de EE.UU. N° 6747014.
A. Formulaciones de ARNi que comprenden montajes moleculares membranosos
Un ARNi para uso en las composiciones y métodos se puede formular para el suministro en un ensamblaje molecular membranoso, p. ej., un liposoma o una micela. Como se usa en la presente memoria, el término "liposoma" se refiere a una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en al menos una bicapa, p. ej., una bicapa o una pluralidad de bicapas. Los liposomas incluyen vesículas unilaminares y multilaminares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso. La parte acuosa contiene la composición de ARNi. El material lipófilo aísla el interior acuoso de un exterior acuoso, que típicamente no incluye la composición de ARNi, aunque en algunos ejemplos, puede. Los liposomas son útiles para la transferencia y suministro de principios al sitio de acción. Debido a que la membrana liposómica es estructuralmente similar a las membranas biológicas, cuando los liposomas se aplican a un tejido, la bicapa liposómica se fusiona con la bicapa de las membranas celulares. A medida que avanza la fusión del liposoma y la célula, el contenido acuoso interno que incluye el ARNi se suministra en la célula donde el ARNi se puede unir específicamente a un ARN objetivo y puede mediar el ARNi.
En algunos casos, los liposomas también están específicamente dirigidos, por ejemplo, para dirigir el ARNi a tipos de células particulares.
Un liposoma que contiene un agente de ARNi se puede preparar por una variedad de métodos. En un ejemplo, el componente lipídico de un liposoma se disuelve en un detergente de modo que se formen micelas con el componente lipídico. Por ejemplo, el componente lipídico puede ser un lípido catiónico anfipático o conjugad lipídico. El detergente puede tener una alta concentración de micelas críticas y puede ser no iónico. Los detergentes de ejemplo incluyen colato, CHAPS, octilglucósido, desoxicolato y lauroil sarcosina. Después se añade la preparación del agente de ARNi a las micelas que incluyen el componente lipídico. Los grupos catiónicos en el lípido interaccionan con el agente de ARNi y se condensan alrededor del agente de ARNi para formar un liposoma.
Después de la condensación, el detergente se elimina, p. ej., por diálisis, para dar una preparación liposomal de agente de ARNi.
Si es necesario, se puede añadir un compuesto vehículo que ayuda a la condensación durante la reacción d condensación, p. ej., por adición controlada. Por ejemplo, el compuesto vehículo puede ser un polímero distinto de un ácido nucleico (por ejemplo, espermina o espermidina). El pH también se puede ajustar para favorecer la condensación.
Los métodos para producir vehículos de suministro de polinucleótidos estables, que incorporan un complejo de polinucleótidos/lípido catiónico como componentes estructurales del vehículo de suministro, se describen adicionalmente, por ejemplo, en la publicación internacional WO 96/37194, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria por referencia. La formación de liposomas también puede incluir uno o más aspectos de métodos ejemplares descritos en Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987; patente de EE.UU. N° 4897355; patente de EE.UU. N° 5171678; Bangham, et al. M. Mol. Biol. 23:238, 1965; Olson, et al. Biochim. Biophys. Acta 557:9, 1979; Szoka, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194, 1978; Mayhew, et al. Biochim. Biophys. Acta 775:169, 1984; Kim, et al. Biochim. Biophys. Acta 728:339, 1983; y Fukunaga, et al. Endocrinol.
115:757, 1984. Las técnicas comúnmente usadas para preparar agregados de lípidos de tamaño adecuado para usar como vehículos de suministro incluyen sonicación y congelación-descongelación más extrusión (véase, p. ej., Mayer et al. Biochim. Biophys. Acta 858:161, 1986). La microfluidización se puede usar cuando se desean agregados consistentemente pequeños (50 a 200 nm) y relativamente uniformes (Mayhew et al. Biochim Biophys Acta 775: 169, 1984). Estos métodos se adaptan fácilmente para empaquetar preparaciones de agentes de ARNi en liposomas.
Los liposomas se dividen en dos grandes clases. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que interaccionan con las moléculas de ácido nucleico cargadas negativamente para formar un complejo estable. El complejo de ácido nucleico/liposoma cargado positivamente se une a la superficie celular cargada negativamente y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas se rompen, liberando su contenido en el citoplasma celular (Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).
Los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente, atrapan ácidos nucleicos en lugar de formar complejos con ellos. Dado que tanto el ácido nucleico como el lípido tienen una carga similar, se produce repulsión en lugar de formación de complejo. Sin embargo, algo de ácido nucleico queda atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Los liposomas sensibles al pH se han usado para suministrar ácidos nucleicos que codifican el gen de la timidina quinasa a monocapas de células en cultivo. Se detectó la expresión del gen exógeno en las células objetivo (Zhou et al., Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos distintos de la fosfatidilcolina derivada de forma natural. Las composiciones de liposomas neutros, por ejemplo, se pueden formar a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) o dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposomas aniónicos en general se forman a partir de dimiristoil osfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soja y PC de huevo. Otro tipo se forma a partir de mezclas de fosfolípidos y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.
Los ejemplos de otros métodos para introducir liposomas en células in vitro e in vivo incluyen la patente de EE.UU. N° 5283185; patente de EE.UU. N° 5171678; las publicaciones internacionales WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, J. Biol. Chem. 269:2550, 1994; Nabel, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307, 1993; Nabel, Human Gene Ther. 3:649, 1992; Gershon, Biochem. 32:7143, 1993; y Strauss EMBO J. 11:417, 1992.
También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome™ I (dilaurato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietilen-10-estearilo) y Novasome™ II (diestearato de glicerilo/colesterol/éter de polioxietilen-10-estearilo) se usaron para administrar ciclosporina-A en la dermis de piel de ratón Los resultados indicaron que tales sistemas liposomales no iónicos eran eficaces para facilitar el depósito de ciclosporina A en diferentes capas de la piel (Hu et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4 (6) 466).
Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", una expresión que, como se usa en la presente memoria, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a los liposomas, dan como resultado un tiempo de vida de circulación mejorado en relación con los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Los ejemplos de liposomas estabilizados estéricamente son aquellos en los que parte de la porción lipídica que forma vesículas del liposoma (A) comprende uno o más glucolípidos, tal como el monosialogangliósido GM1, o (B) se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Sin querer estar limitados por ninguna teoría en particular, se cree en la técnica que, al menos para los liposomas estabilizados estéricamente que contienen gangliósidos, esfingomielina o lípidos derivados de PEG, la mejor semivida en la circulación de estos liposomas estabilizados estéricamente procede de una absorción reducida en las células del sistema reticuloendotelial (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al., Cancer Research, 1993, 53, 3765).
En la técnica se conocen diversos liposomas que comprenden uno o más glicolípidos. Papahadjopoulos et al. (Ann. NY Acad. Sci., 1987, 507, 64) describieron la capacidad del monosialogangliósido Gm1, el sulfato de galactocerebrosido y el fosfatidilinositol para mejorar la semivida en la sangre de los liposomas. Estos hallazgos fueron expuestos por Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). La patente de EE.UU. N° 4837028 y la publicación internacional WO 88/04924, ambos de Allen et al., describen liposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliósido Gm1 o un éster de sulfato de galactocerebrósido. La patente de EE.UU. N° 5543152 (Webb et al.) describe liposomas que comprenden esfingomielina. Los liposomas que comprenden 1,2-sndimiristoilfosfatidilcolina se describen en la publicación internacional WO 97/13499 (Lim et al.)
En un caso, se usan liposomas catiónicos. Los liposomas catiónicos tienen la ventaja de poder fusionarse con la membrana celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse de manera tan eficiente con la membrana plasmática, son captados por macrófagos in vivo y se pueden usar para suministrar agentes de ARNi a los macrófagos.
Ventajas adicionales de los liposomas incluyen: los liposomas obtenidos de fosfolípidos naturales son biocompatibles y biodegradables; los liposomas pueden incorporar una amplia variedad de fármacos solubles en agua y lípidos; los liposomas pueden proteger a los agentes de ARNi encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y la degradación (Rosoff, en "Pharmaceutical Dosage Forms", Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, volumen 1, p. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposomas son la carga superficial de lípidos, el tamaño de las vesículas y el volumen acuoso de los liposomas.
Se puede usar un lípido catiónico sintético cargado positivamente, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) para formar pequeños liposomas que interaccionan espontáneamente con ácido nucleico para formar complejos de lípido-ácido nucleico que son capaces de fusionarse con los lípidos cargados negativamente de las membranas celulares de las células de cultivo tisular, dando como resultado el suministro del agente de ARNi (véase, p. ej., Felgner, P. L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 8:7413-7417, 1987 y patente de EE.UU. N° 4897355, para una descripción de DOTMA y su uso con ADN).
Un análogo de DOTMA, 1,2-bis(oleoiloxi)-3-(trimetilamonia)propano (DOTAP) se puede usar en combinación con un fosfolípido para formar vesículas que forman complejo con ADN. Lipofectin™ Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Maryland) es un agente eficaz para el suministro de ácidos nucleicos altamente aniónicos en células de cultivo tisular vivas que comprenden liposomas DOTMA cargados positivamente que interaccionan espontáneamente con polinucleótidos cargados negativamente para formar complejos. Cuando se usan suficientes liposomas cargados positivamente, la carga neta en los complejos resultantes también es positiva. Los complejos cargados positivamente preparados de esta manera se unen espontáneamente a superficies celulares cargadas negativamente, se fusionan con la membrana plasmática y suministran de forma eficaz ácidos nucleicos funcionales en, por ejemplo, células de cultivo de tejidos. Otro lípido catiónico disponible en el mercado, 1,2-bis(oleoiloxi)-3,3-(trimetilamonio)propano ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) difiere de DOTMA en que los restos de oleilo están unidos por éster, en lugar de enlaces éter.
Otros compuestos lipídicos catiónicos descritos incluyen los que se han conjugado a una variedad de restos que incluyen, por ejemplo, carboxiespermina que se ha conjugado con uno de los dos tipos de lípidos e incluye compuestos tales como la dioctaoleoilamida de 5-carboxiespermilglicina ("DOGS") (Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) y dipalmitoilfosfatidiletanolamina 5-carboxiespermilamida ("DPPES") (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 5171678).
Otro conjugado lipídico catiónico incluye la derivatización del lípido con colesterol ("DC-Chol") que se ha formulado en liposomas en combinación con DOPE (véase, Gao, X. y Huang, L., Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280, 1991). Se ha descrito que la lipopolilisina, hecha por conjugación de polilisina con DOPE, es eficaz para la transfección en presencia de suero (Zhou, X. et al., Biochim. Biophys. Acta 1065: 8, 1991). Para ciertas líneas celulares, se dice que estos liposomas que contienen lípidos catiónicos conjugados presentan una toxicidad más baja y proporcionan una transfección más eficaz que las composiciones que contienen DOTMA. Otros productos de lípidos catiónicos disponibles en el mercado incluyen DMRIE y DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) y Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland). Otros lípidos catiónicos adecuados para el suministro de oligonucleótidos se describen en las publicaciones internacionales Wo 98/39359 y WO 96/37194.
Las formulaciones liposomales son particularmente adecuadas para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas frente a otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen los efectos secundarios reducidos relacionados con la alta absorción sistémica del fármaco administrado, mayor acumulación del fármaco administrado en el objetivo deseado y la capacidad para administrar el agente de ARNi en la piel. En algunas implementaciones, los liposomas se usan para suministrar el agente de ARNi a las células epidérmicas y también para mejorar la penetración del agente de ARNi en los tejidos dérmicos, p. ej., en la piel. Por ejemplo, los liposomas se pueden aplicar por vía tópica. Se ha descrito el suministro tópico de fármacos formulados como liposomas a la piel (véase, p. ej., Weiner et al., Journal of Drug Targeting, 1992, vol. 2,405-410 y du Plessis et al., Antiviral Research, 18, 1992, 259-265; Mannino, R. J. y Fould-Fogerite, S., Biotechniques 6:682-690, 1988; Itani, T. et al. Gene 56:267-276. 1987; Nicolau, C. et al. Meth. Enz. 149:157-176, 1987; Straubinger, R. M. y Papahadjopoulos, D. Meth. Enz. 101:512-527, 1983; Wang, C. Y. y Huang, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855, 1987).
También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el suministro de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden tensioactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones liposomales no iónicas que comprenden Novasome I (dilaurato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-éter de estearilo) y Novasome II (diestearato de glicerilo/colesterol/polioxietilen-10-éter de estearilo) se usaron para administrar un medicamento a la dermis de la piel del ratón. Dichas formulaciones con el agente de ARNi son útiles para tratar un trastorno dermatológico.
Los liposomas que incluyen ARNi se pueden hacer muy deformables. Dicha deformabilidad puede permitir que los liposomas penetren a través de poros que son más pequeños que el radio promedio del liposoma. Por ejemplo, los transfersomas son un tipo de liposomas deformables. Los transfersomas se pueden hacer añadiendo activadores del borde de la superficie, generalmente tensioactivos, a una composición liposomal estándar. Los transfersomas que incluyen el agente de ARNi se pueden suministrar, por ejemplo, por vía subcutánea por infección con el fin de suministrar el agente de ARNi a los queratinocitos en la piel. Con el fin de atravesar la piel intacta de los mamíferos, las vesículas lipídicas deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro inferior a 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Además, debido a las propiedades de los lípidos, estos transfersomas pueden ser auto-optimizados (adaptables a la forma de los poros, p. ej., en la piel), se autorreparan y con frecuencia pueden alcanzar sus objetivos sin fragmentarse y, a menudo, se autocargan.
Otras formulaciones tratables por la presente invención se describen, por ejemplo, en publicación PCT N° WO 2008/042973.
Los transfersomas son otro tipo más de liposomas, y son agregados lipídicos muy deformables que son candidatos atractivos para vehículos de suministro de fármacos. Los transfersomas se pueden describir como gotitas de lípidos que son tan altamente deformables que pueden penetrar fácilmente a través de poros que son más pequeños que la gotita. Los transfersomas son adaptables al entorno en el que se usan, por ejemplo, se auto-optimizan (se adaptan a la forma de los poros de la piel), se autorreparan, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentarse y, a menudo, se autocargan. Para hacer transfersomas se pueden añadir activadores de borde de superficie, generalmente tensioactivos, a una composición liposomal estándar. Los transfersomas se han usado para suministrar seroalbúmina a la piel. Se ha mostrado que el suministro de seroalbúmina mediada por transfersoma es tan eficaz como la inyección subcutánea de una solución que contiene seroalbúmina.
Los tensioactivos encuentran una amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La forma más común de clasificar y ordenar las propiedades de los muchos tipos diferentes de tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es mediante el uso del equilibrio hidrófilo/lipófilo (h Lb ). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como "cabeza") proporciona el medio más útil para clasificar los diferentes tensioactivos usados en las formulaciones (Rieger, en "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1988, pág. 285).
Si la molécula de tensioactivo no está ionizada, se clasifica como un tensioactivo no iónico. Los tensioactivos no iónicos encuentran una amplia aplicación en productos farmacéuticos y cosméticos y se pueden usar en un amplio intervalo de valores de pH. En general, sus valores de HLB varían de 2 a aproximadamente 18, dependiendo de su estructura. Los tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etilenglicol, ésteres de propilenglicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas y los éteres no iónicos tales como los alcoholes grasos etoxilados, alcoholes propoxilados y los polímeros de bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de tensioactivos no iónicos.
Si la molécula de tensioactivo lleva una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como aniónico. Los tensioactivos aniónicos incluyen carboxilatos como jabones, acil-lactilatos, acilamidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tales como alquilsulfatos y alquilsulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquilbencenosulfonatos, acil-isetionatos, acil-tauratos y sulfosuccinatos y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de tensioactivo aniónico son los sulfatos de alquilo y los jabones.
Si la molécula tensioactiva lleva una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el tensioactivo se clasifica como catiónico. Los tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.
Si la molécula de tensioactivo tiene la capacidad de transportar una carga positiva o negativa, el tensioactivo se clasifica como anfótero. Los tensioactivos anfóteros incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfátidos.
Se ha revisado el uso de tensioactivos en fármacos, formulaciones y emulsiones (Rieger, en "Pharmaceutical Dosage Forms", Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, 1988, pág. 285).
El ARNi para usar en los métodos de la invención también se puede proporcionar como formulaciones micelares. Las "micelas" se definen en la presente memoria como un tipo particular de ensamblaje molecular en el que las moléculas anfipáticas están dispuestas en una estructura esférica de manera que todas las partes hidrófobas de las moléculas se dirigen hacia adentro, dejando las partes hidrófilas en contacto con la fase acuosa circundante. La disposición inversa existe si el entorno es hidrófobo.
Se puede preparar una formulación micelar mixta adecuada para el suministro a través de membranas transdérmicas mezclando una solución acuosa de la composición de ARNip, un alquil Cs a C22-sulfato de metal alcalino y compuestos que forman micelas. Los ejemplos de compuestos que forman micelas incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de manzanilla, extracto de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleína, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de onagra, mentol, trihidroxioxocolanil-glicina y sus sales farmacéuticamente aceptables, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno y análogos de los mismos, éteres de alquilo polidocanol y análogos de los mismos, quenodesoxicolato, desoxicolato y sus mezclas. Los compuestos que forman micelas se pueden añadir al mismo tiempo o después de la adición del alquilsulfato de metal alcalino. Las micelas mixtas se formarán sustancialmente con cualquier clase de mezclamiento de los ingredientes, pero mezclamiento enérgico con el fin de proporcionar micelas de tamaño más pequeño.
En un método, se prepara una primera composición micelar que contiene la composición de ARNip y al menos el alquilsulfato de metal alcalino. Después la primera composición micelar se mezcla con al menos tres compuestos formadores de micelas para formar una composición micelar mixta. En otro método, la composición micelar se prepara mezclando la composición de ARNip, el alquilsulfato de metal alcalino y al menos uno de los compuestos formadores de micelas, seguido de la adición de los compuestos formadores de micelas restantes, con mezclamiento enérgico.
Se puede añadir fenol y/o m-cresol a la composición micelar mixta para estabilizar la formulación y proteger contra el crecimiento bacteriano. Alternativamente, se puede añadir fenol y/o m-cresol con los ingredientes formadores de micelas. También se puede añadir un agente isotónico tal como glicerina después de la formación de la composición micelar mixta.
Para el suministro de la formulación micelar en forma de aerosol, la formulación se puede poner en un dispensador de aerosol y el dispensador se carga con un propulsor. El propulsor, que está bajo presión, está en forma líquida en el dispensador. Las proporciones de los ingredientes se ajustan de modo que las fases acuosa y de propulsor se conviertan en una, es decir, hay una fase. Si hay dos fases, es necesario agitar el dispensador antes de dispensar una parte del contenido, p. ej., a través de una válvula dosificadora. La dosis dispensada de agente farmacéutico se impulsa desde la válvula dosificada en un aerosol fino.
Los propulsores pueden incluir clorofluorocarbonos que contienen hidrógeno, fluorocarbonos que contienen hidrógeno, éter dimetílico y éter dietílico. En ciertas realizaciones, se puede usar HFA 134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano).
Las concentraciones específicas de los ingredientes esenciales se pueden determinar por experimentación relativamente sencilla. Para la absorción a través de las cavidades orales, a menudo es deseable aumentar, p. ej., al menos al doble o al triple, la dosis para inyección o administración a través del tracto gastrointestinal.
B. Partículas lipídicas
Los ARNi, p. ej., ARNbc de la invención se pueden encapsular completamente en una formulación lipídica, p. ej., un LNP u otra partícula de ácido nucleico-lípido.
Como se usa en la presente memoria, el término "LNP" se refiere a una partícula estable de ácido nucleico-lípido. Los LNP contienen típicamente un lípido catiónico, un lípido no catiónico y un lípido que evita la agregación de la partícula (p. ej., un conjugado de PEG-lípido). Los LNP son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que presentan tiempos de vidas en circulación prolongados después de inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (p. ej., sitios físicamente separados del sitio de administración). Los LNP incluyen "pSPLP", que incluye un complejo de agente de condensación-ácido nucleico encapsulado como se expone en la publicación PCT N° WO 00/03683. Las partículas de la presente invención tienen típicamente un diámetro medio de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 150 nm, más típicamente de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, más típicamente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 110 nm, lo más típicamente de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicas. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípidos de la presente invención son resistentes en solución acuosa a la degradación por una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen en, p. ej. las patentes de EE.UU. N° 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; publicación de EE.UU. N° 2010/0324120 y publicación PCT N° WO 96/40964.
En un caso, la relación de lípido a fármaco (relación masa/masa) (p. ej., relación de lípido a ARNbc) estará en el intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 50:1, de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 25:1, de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 15:1, de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 10:1, de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 9:1 o aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1. Los intervalos intermedios de los intervalos citados antes también está contemplado como parte de la invención.
El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(I-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(I-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DoTMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA), 1,2-Dilinoleiloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbamoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinoleioxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLinDAC), 1,2-Dilinoleioxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-Dilinoleiltio-3-dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-Linoleoil-2-linoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1,2-Dilinoleiloxi-3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), cloruro de 1,2-Dilinoleoil-3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-Dilinoleiloxi-3-(N-metilpiperazino)propano (DLin-MPZ) o 3-(N,N-Dilinoleilamino)-1,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Dioleilamino)-1,2-propanodio (DoAp ), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), 1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, (3aR,5s,6aS)-N,N-dimetil-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil)tetrahidro-3aH-ciclopenta[d][1,3]dioxol-5-amina (ALN100), 4-(dimethilamino)butanoato de (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-ilo (MC3), 1,1'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hidroxidodecil)amino)etil)(2-hidroxidodecil)amino)etil)piperazin-1-il)etilazanodiil)didodecan-2-ol (Tech G1) o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender de aproximadamente 20% en moles a aproximadamente 50% en moles o aproximadamente 40% en moles del lípido total presente en la partícula.
En otro caso, el compuesto 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se puede usar para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc. La síntesis del 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 61/107998 presentada el 23 de octubre, 2008, que se incorpora en la presente memoria por referencia.
En un caso, la partícula de lípido-ARNbc incluye 40% de 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano: 10% de DSPC: 40% de colesterol: 10% de PEG-C-DOMG (porcentaje en moles) con un tamaño de partículas de 63.0 ± 20 nm y una relación de ARNbc/lípido de 0.027.
El lípido ionizable/no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutro incluyendo, pero no limitado a distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil-PE, 16-O-dimetil-PE, 18-1 -trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), colesterol o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de aproximadamente 5% en moles a aproximadamente 90% en moles, aproximadamente 10% en moles o aproximadamente 58% en moles si el colesterol está incluido, del lípido total presente en la partícula.
El lípido conjugado que inhibe la agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido que incluye, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropil (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer) o una mezcla de los mismos. El conjugado de PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6) o un PEG-diesteariloxipropilo (C]s). El lípido conjugado que evita la agregación de partículas puede ser de 0% en moles a aproximadamente 20% en moles o aproximadamente 2% en moles del lípido total presente en la partícula.
En algunos casos, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye además colesterol, p. ej., de aproximadamente 10% en moles a aproximadamente 60% en moles o aproximadamente 48% en moles del lípido total presente en la partícula.
En un caso, se pueden usar el lipidoide ND984HCl (MW 1487) (véase la solicitud de patente de EE.UU. N° 12/056230, presentada el 3/26/2008, que se incorpora en la presente memoria por referencia), colesterol (Sigma-Aldrich), y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) para preparar nanopartículas de lípido-ARNbc (es decir, partículas LNP01). Se pueden preparar soluciones madre de cada uno en etano como sigue: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. Las soluciones madre de ND98, colesterol, y PEG-Ceramida C16 después se pueden combinar, p. ej., en una relación molar de 42:48:10. La solución lipídica combinada se puede mezclar con ARNbc acuoso (p. ej., en acetato de sodio a pH 5) de modo que la concentración final de etanol es aproximadamente 35-45% y la concentración final de acetato de sodio es aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNbc típicamente se forman espontáneamente al mezclar. Dependiendo de la distribución del tamaño de partículas deseada, la mezcla de nanopartículas resultante se puede extruir a través de una membrana de policarbonato (p. ej., corte de exclusión 100 nm) usando, por ejemplo, un extrusora de termobarril, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). En algunos casos, se puede omitir la etapa de extrusión. La eliminación de etanol y el intercambio simultáneo de tampones se pueden lograr, por ejemplo, por diálisis o filtración de flujo tangencial. El tampón se puede intercambiar, por ejemplo, con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a aproximadamente pH 7, p. ej., aproximadamente pH 6.9, aproximadamente pH 7.0, aproximadamente pH 7.1, aproximadamente pH 7.2, aproximadamente pH 7.3 o aproximadamente pH 7.4.
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Isóm ero I ND98
Fórmula 1
Se describen formulaciones de LNP01, p. ej., en la publicación de solicitud internacional N° WO 2008/042973, que se incorpora en la presente memoria por referencia.
Se describen formulaciones de lípido-ARNbc de ejemplo adicionales en la tabla 1.
Tabla 1
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DSPC: distearoilfosfatidilcolina
DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
PEG-DMG: PEG-didimiristoil-glicerol (C14-PEG o PEG-C14) (PEG con PM medio de 2000)
PEG-DSG: PEG-diestiril-glicerol (C18-PEG o PEG-C18) (PEG con PM medio de 2000)
PEG-cDMA: PEG-carbamoil-1,2-dimiristiloxipropilamina (PEG con PM medio de 2000)
SNALP (1,2-Dilinoleniloxi-N,N-dimetilaminopropano (DLinDMA)) que comprende formulaciones que se describen en la publicación internacional n° WO2009/127060, presentada el 15 de abril, 2009.
XTC que comprende formulaciones que se describen, p. ej., en la publicación PCT N° WO 2010/088537.
MC3 que comprende formulaciones que se describen, p. ej., en la publicación de EE.UU. n° 2010/0324120, presentada el 10 de junio, 2010.
ALNY-100 que comprende formulaciones que se describen, p. ej., en la publicación PCT n° WO 2010/054406.
C12-200 que comprende formulaciones que se describen, p. ej., en la publicación PCT n° WO 2010/129709.
Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser convenientes espesantes, agentes de sabor, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. En algunos casos, las formulaciones orales son aquellas en las que los ARNbc caracterizados en la invención se administran junto con uno o más tensioactivos y quelantes potenciadores de la penetración. Los tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ásteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido láurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolánico, dicaprato, tricaprato, monooleína, dilaurina, 1-monocaprato de glicerilo, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina o un monoglicárido, un diglicárido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (p. ej., sodio). En algunas realizaciones, se usan combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación de ejemplo es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros potenciadores de la penetración incluyen éter de polioxietilen-9-laurilo, éter de polioxietilen-20-cetilo. Los ARNbc caracterizados en la invención se pueden suministrar por vía oral, en forma granular, incluyendo partículas secas pulverizadas, o formar un complejo para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de ARNbc incluyen poliaminoácidos; poliiminas; poliacrilatos; poli(acrilatos de alquilo), polioxietanos, poli(cianoacrilatos de alquilo); gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; poli(cianoacrilatos de alquilo); poliiminas derivatizadas con DEAE, polulanos, celulosas y almidones. Los agentes complejantes adecuados incluyen quitosano, N-trimetilquitosano, poli-L-lisina, polihistidina, poliornitina, poliesperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P(TDAE), poliaminoestireno (p. ej., pamino), poli(cianoacrilato de metilo), poli(cianoacrilato de etilo), poli(cianoacrilato de butilo), poli(cianoacrilato de isobutilo), poli(cinaoacrilato de isohexilo), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextrano, poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de hexilo), poli(ácido D,L-láctico), poli(ácido DL-láctico-co glicólico) (PLGA), alginato y polietilenglicol (PEG). Se describen formulaciones orales para ARNbc y su preparación con detalle en la patente de EE.UU. 6887906, publicación US N° 20030027780, y patente de EE.UU. N° 6747014.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimal (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitados a potenciadores de la penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones se pueden generar a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes. Son particularmente preferidas las formulaciones que se dirigen al hígado cuando se tratan trastornos hepáticos tales como el carcinoma hepático.
Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en forma de dosis unitaria, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar los ingredientes activos con el(los) vehículo(s) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y después, si es necesario, moldeando el producto.
Las composiciones se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles, tales como, pero no limitado a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
C. Formulaciones adicionales
i. Emulsiones
Las composiciones se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en forma de gotitas que generalmente supera 0.1 pm de diámetro (véase, por ejemplo, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., Volumen 1, pág. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, pág. 335; Higuchi et al., en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 301). Las emulsiones son a menudo sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mezcladas y dispersas entre sí. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad de agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag). Cuando una fase acuosa se divide finamente y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase oleosa en masa, la composición resultante se denomina emulsión de agua en aceite (ag/ac). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa en forma de gotitas diminutas en una fase acuosa en masa, la composición resultante se denomina emulsión de aceite en agua (ac/ag). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, fase oleosa o en sí misma como una fase separada. También pueden estar presentes excipientes farmacéuticos tales como emulsionantes, estabilizantes, colorantes y antioxidantes en las emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser emulsiones múltiples que se componen de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite en agua en aceite (ac/ag/ac) y de agua en aceite en agua (ag/ac/ag). Dichas formulaciones complejas a menudo proporcionan ciertas ventajas que no proporcionan las emulsiones binarias simples. Las emulsiones múltiples en las que las gotitas individuales de aceite de una emulsión ac/ag encierran gotitas de agua constituyen una emulsión de ag/ac/ag. Asimismo, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase oleosa continua proporciona una emulsión ac/ag/ac.
Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión se dispersa bien en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de emulsionantes o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser semisólida o sólida, como es el caso de las bases de pomada y cremas de tipo emulsión. Otros medios para estabilizar las emulsiones implican el uso de emulsionantes que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsionantes se pueden clasificar en general en cuatro categorías: tensioactivos sintéticos, emulsionantes naturales, bases de absorción y sólidos finamente dispersos (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199).
Los tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes tensioactivos, han encontrado una amplia aplicabilidad en la formulación de emulsiones y han sido revisados en la bibliografía (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Anse1HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), Nueva York, NY; Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, volumen 1, pág. 199). Los tensioactivos son típicamente anfifílicos y comprenden una parte hidrófila e hidrófoba. La relación de la naturaleza hidrófila a la hidrófoba del tensioactivo se ha denominado equilibrio hidrófilo/lipófilo (HLB) y es una herramienta valiosa para clasificar y seleccionar tensioactivos en la preparación de formulaciones. Los tensioactivos se pueden clasificar en diferentes clases según la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónico, aniónico, catiónico y anfótero (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich nG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 285).
Los emulsionantes naturales usados en formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfátidos, lecitina y goma arábiga. Las bases de absorción tienen propiedades hidrofílicas de modo que pueden absorber agua para formar emulsiones de ag/ac pero retienen sus consistencias semisólidas, tales como la lanolina anhidra y la vaselina hidrofílica. Los sólidos finamente divididos también se han usado como buenos emulsionantes, especialmente en combinación con tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estos incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metales pesados, arcillas que no se hinchan tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolín, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de aluminio y magnesio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o tristearato de glicerilo.
También se incluye una gran variedad de materiales no emulsionantes en las formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de las emulsiones. Estos incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservantes y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág.
335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199).
Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas naturales y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, goma arábiga, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa) y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o se hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan las emulsiones formando fuertes películas interfaciales alrededor de las gotitas de fase dispersa y aumentando la viscosidad de la fase externa.
Puesto que las emulsiones a menudo contienen una serie de ingredientes como carbohidratos, proteínas, esteroles y fosfátidos que pueden mantener fácilmente el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservantes. Los conservantes usados habitualmente incluidos en las formulaciones de emulsión incluyen metilparabeno, propilparabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido phidroxibenzoico y ácido bórico. También se añaden habitualmente antioxidantes a las formulaciones de emulsión para evitar el deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser depuradores de radicales libres tales como tocoferoles, galatos de alquilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado o agentes reductores tales como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y agentes sinérgicos antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.
La aplicación de formulaciones de emulsión por vías dermatológicas, orales y parenterales y métodos para su fabricación se han revisado en la bibliografía (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 199). Las formulaciones de emulsión para suministro oral se han usado muy ampliamente debido a la facilidad de formulación, así como a la eficacia desde el punto de vista de la absorción y biodisponibilidad (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Anse1HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág.
199). Los laxantes basados en aceite mineral, las vitaminas solubles en aceite y las preparaciones nutritivas con alto contenido de grasa se encuentran entre los materiales que se han administrado comúnmente por vía oral como emulsiones de ac/ag.
ii. Microemulsiones
Las composiciones de ARNi y ácidos nucleicos se pueden formular como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfifílico que es una sola solución líquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245). Típicamente, las microemulsiones son sistemas que se preparan dispersando primero un aceite en una solución acuosa de tensioactivo y añadiendo después una cantidad suficiente de un cuarto componente, generalmente un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, las microemulsiones también se han descrito como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas tensioactivas (Leung y Shah, en: Controlled Release of Drugs: Polymers y Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan habitualmente mediante una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, tensioactivo, cotensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo de agua en aceite (ag/ac) o de aceite en agua (ac/ag) depende de las propiedades del aceite y el tensioactivo usados y de la estructura y empaquetamiento geométrico de las cabezas polares y las colas de hidrocarburos de las moléculas de tensioactivo (Schott, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, pág. 271).
El enfoque fenomenológico que usa diagramas de fase se ha estudiado ampliamente y ha proporcionado un conocimiento integral, para un experto en la técnica, sobre cómo formular microemulsiones (véase, p. ej., Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., y Anse1HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8a ed.), Nueva York, NY; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, pág. 335) En comparación con las emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotitas termodinámicamente estables que se forman espontáneamente.
Los tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a tensioactivos iónicos, tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietileno y oleilo, ésteres de ácidos grasos y poliglicerol, monolaurato de tetraglicerol (ML310), monooleato de tetraglicerol (MO310), monooleato de hexaglicerol PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solo o en combinación con tensioactivos. El cotensioactivo, normalmente un alcohol de cadena corta como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial penetrando en la película de tensioactivo y, creando por consiguiente una película desordenada debido al espacio vacío generado entre moléculas de tensioactivo. Sin embargo, las microemulsiones se pueden preparar sin usar cotensioactivos y son conocidos en la técnica los sistemas de microemulsión autoemulsionantes sin alcohol. La fase acuosa puede ser típicamente, pero no limitada a agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propilenglicoles y derivados de etilenglicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales como Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácidos grasos, mono, di y tri-glicéridos de cadena media (C8-C12), ésteres de ácidos grasos y glicerilo polioxietilados, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.
Las microemulsiones son particularmente interesantes desde el punto de vista de la solubilización de fármacos y la absorción mejorada de fármacos. Se han propuesto microemulsiones basadas en lípidos (tanto de ac/ag como ag/ac) para mejorar la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (véase, p. ej., patentes de EE.UU. N° 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Encontrar. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones ofrecen ventajas de solubilización del fármaco mejorada, protección del fármaco frente a la hidrólisis enzimática, posible mejora de la absorción del fármaco debido a alteraciones inducidas por el tensioactivo en la fluidez y permeabilidad de la membrana, facilidad de preparación, facilidad de administración oral frente a formas farmacéuticas sólidas, potencia clínica mejorada y disminución de la toxicidad (véase, p. ej., patentes de EE.UU. N° 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138­ 143). A menudo, las microemulsiones se pueden formar espontáneamente cuando sus componentes se unen a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso cuando se formulan fármacos termolábiles, péptidos o ARNi. Las microemulsiones también han sido eficaces en el suministro transdérmico de componentes activos tanto en aplicaciones cosméticas como farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsiones de la presente invención faciliten la mayor absorción sistémica de ARNi y ácidos nucleicos del tracto gastrointestinal, así como mejoren la absorción celular local de ARNi y ácidos nucleicos.
Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tales como monoestearato de sorbitán (Grill 3), Labrasol y potenciadores de la penetración para mejorar las propiedades de la formulación y mejorar la absorción de los ARNi y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de la penetración usados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutico Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92). Cada una de estas clases se ha descrito antes.
iii) Micropartículas
Un agente de ARNi de la invención se puede incorporar en una partícula, p. ej., una micropartícula. Las micropartículas se pueden producir por secado por atomización, pero también se pueden producir por otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado en lecho fluido, secado a vacío, o una combinación de estas técnicas.
iv. Potenciadores de la penetración
Se describen diferentes potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficaz de ácidos nucleicos, en particular de ARNi, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución tanto en formas ionizadas como no ionizadas. Sin embargo, normalmente solo los fármacos lipófilos o solubles en lípidos atraviesan fácilmente las membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden atravesar las membranas celulares si la membrana a atravesar se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar a la difusión de fármacos no lipófilos a través de las membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipofílicos.
Los potenciadores de la penetración se pueden clasificar como pertenecientes a una de cinco categorías amplias, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes (véase, p. ej., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág.92). Cada una de las clases de potenciadores de la penetración mencionados antes se describe a continuación con mayor detalle.
Los tensioactivos (o "agentes tensioactivos") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado de que se mejora la absorción de ARNi a través de la mucosa. Además de las sales biliares y los ácidos grasos, estos potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, polioxietilen-9-éter de laurilo y polioxietilen-20-éter de cetilo) (véase, p. ej., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tales como FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Los diferentes ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de la penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido láurico, ácido cáprico (ácido n-decanoico), ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleína (1-monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, 1-monocaprato de glicerol, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, acilcolinas, ésteres de alquilo C1-20 de los mismos (p. ej., metilo, isopropilo y t -butilo), y mono y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (véase, p. ej., Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, pág. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
El papel fisiológico de la bilis incluye la facilitación de la dispersión y absorción de lípidos y vitaminas liposolubles (véase, por ejemplo, Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Brunton, Capítulo 38 en: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, Nueva York, 1996, pág. 934-935). Diversas sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de la penetración. Por lo tanto, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes naturales de la bilis, así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato sódico), ácido deshidrocólico (deshidrocolato sódico), ácido desoxicólico (desoxicolato sódico), ácido glucólico (glucolato sódico), ácido glicólico (glicocolato sódico), ácido glicodesoxicólico (glicodesoxicolato sódico), ácido taurocólico (taurocolato sódico), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicolato sódico), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato sódico), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato sódico (STDHF), glicodihidrofusidato sódico y éter de polioxietilen-9-laurilo (POE) (véase, p. ej., Malmsten, M. Surfactants and polimers in drug delivery, Informa Health Care, Nueva York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, Capítulo 39 en: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Los agentes quelantes, usados en relación con la presente invención, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de la solución formando complejos con los mismos, con el resultado de que se mejora la absorción de ARNi a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de la penetración en la presente invención, los agentes quelantes tienen la ventaja adicional de servir también como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ion metálico divalente para la catálisis y, por lo tanto, son inhibidas por los agentes quelantes (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (p. ej., salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovanilato), derivados N-acilo de colágeno, laureth-9 y derivados de N-aminoacilo de beta-dicetonas (enaminas) (véase, p. ej., Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel, 1990, 14, 43-51).
Como se usa en la presente memoria, los compuestos potenciadores de la penetración no tensioactivos no quelantes se pueden definir como compuestos que demuestran una actividad insignificante como agentes quelantes o como tensioactivos pero que, sin embargo, mejoran la absorción de ARNi a través de la mucosa alimentaria (véase, p. ej., Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de la penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1-alquil- y 1-alquenilazacicloalcanona (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como diclofenaco sódico, indometacina y fenilbutazona (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
También se pueden añadir agentes que mejoran la absorción de ARNi a nivel celular a composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, los lípidos catiónicos, como la lipofectina (Junichi et al., patente de EE.UU. N° 5705188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (Lollo et al., Solicitud PCT WO 97/30731), también se sabe que mejoran la absorción celular de ARNbcs. Los ejemplos de reactivos de transfección disponibles en el mercado incluyen, por ejemplo, Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine 2000™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), 293fectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Cellfectin™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), DMRIE-C™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), FreeStile™ MAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ 2000 c D (Invitrogen; Carlsbad, CA), Lipofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), iRNAMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA), Oligofectamine™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), Optifect™ (Invitrogen; Carlsbad, CA), X-reactivo de transfección tremeGENE Q2 (Roche; Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposomal DOTAP (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo de transfección liposomal DOSPER (Grenzacherstrasse, Suiza) o Fugene (Grenzacherstrasse, Suiza), reactivo Transfectam® (Promega; Madison, WI), reactivo de transfección TransFast™ (Promega; Madison, W i), reactivo Tfx™-20 (Promega; Madison, WI), reactivo Tfx™-50 (Promega; Madison, WI), DreamFect™ (OZ Biosciences; Marseille, Francia), EcoTransfect (OZ Biosciences; Marseille, Francia), reactivo de transfección TransPassaD1 (New England Biolabs; Ipswich, MA, EE.UU.), LyoVec™/LipoGen™ (Invitrogen; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección PerFectin (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección NeuroPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección GenePORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección GenePORTER 2 (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección Cytofectin (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección BaculoPORTER (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), reactivo de transfección TroganPORTER™ (Genlantis; San Diego, CA, EE.UU.), RiboFect (Bioline; Taunton, MA, EE.UU.), PlasFect (Bioline; Taunton, MA, EE.UU.), UniFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE.UU.), SureFECTOR (B-Bridge International; Mountain View, CA, EE.UU.) o HiFect™ (B-Bridge International, Mountain View, CA, EE.UU.), entre otros.
Se pueden usar otros agentes para mejorar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilenglicol y propilenglicol, pirroles como 2-pirrol, azonas y terpenos como limoneno y mentona.
v. Portadores
Ciertas composiciones también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa en la presente memoria, "compuesto portador" o "portador" se puede referir a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica per se) pero se reconoce como un ácido nucleico en procesos in vivo que reducen la biodisponibilidad de un ácido nucleico que tiene actividad biológica, por ejemplo, degradando el ácido nucleico biológicamente activo o promoviendo su eliminación de la circulación. La administración conjunta de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de esta última sustancia, puede dar como resultado una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñón u otros depósitos extracirculatorios, supuestamente debido a la competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNbc parcialmente fosforotioato en el tejido hepático se puede reducir cuando se coadministra con ácido poliinosínico, sulfato de dextrano, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
vi. Excipientes
A diferencia de un compuesto vehículo, un "vehículo farmacéutico" o "excipiente" es un disolvente, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte farmacéuticamente inerte para suministrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en cuenta la forma de administración planificada, para proporcionar el volumen, la consistencia, etc. deseados, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los vehículos farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes aglutinantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa, etc.); cargas (p. ej., lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etilcelulosa, poliacrilatos o hidrogenofosfato de calcio, etc.); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); disgregantes (p. ej., almidón, glicolato sódico de almidón, etc.); y agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sódico, etc.).
Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de forma perjudicial con ácidos nucleicos, también se pueden usar para formular las composiciones de la presente invención. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Las formulaciones para la administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en disolventes comunes tales como alcoholes o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para la administración no parenteral que no reaccionan de forma perjudicial con los ácidos nucleicos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
vii. Otros componentes
Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. Así, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales farmacéuticamente activos compatibles adicionales, tales como, por ejemplo, antiprurito, astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles para formular físicamente diversas formas farmacéuticas de las composiciones. de la presente invención, tales como colorantes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificadores, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, dichos materiales, cuando se añaden, no deberían interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, agentes de sabor y/o sustancias aromáticas y similares, que no interaccionan de forma perjudicial con el o los ácidos nucleicos de la formulación.
Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas caracterizadas en la invención incluyen (a) uno o más compuestos de ARNi y (b) uno o más agentes que funcionan por un mecanismo que no es de ARNi y que son útiles en el tratamiento de una infección por HBV. Los ejemplos de dichos agentes incluyen, pero no se limitan a agentes antivirales dirigidos a suprimir o destruir el HBV interfiriendo con la replicación viral; e inmunomoduladores dirigidos a ayudar al sistema inmunitario humano a montar una defensa contra el virus. Por el contrario, los inmunomoduladores, tales como los corticosteroides, que inducen una expresión potenciada de los antígenos virales y virus, y una supresión de la función de los linfocitos T, o el arabinósido de adenina, aciclovir o didesoxiinosina, no son beneficiosos para el tratamiento de la hepatitis B crónica. Los agentes adecuados se describen con más detalle a continuación.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, p. ej., para determinar la DL50 (la dosis letal para 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presentan índices terapéuticos altos.
Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de las composiciones caracterizadas en la presente memoria en la invención se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración usada. Para cualquier compuesto usado en los métodos caracterizados en la invención, se puede calcular inicialmente la dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante del compuesto o, cuando sea adecuado, del producto polipeptídico de una secuencia objetivo (p. ej., logrando una menor concentración del polipéptido) que incluye la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra la mitad de la inhibición máxima de síntomas) determinada en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en el plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.
Además de su administración, como se ha descrito antes, los ARNi se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos eficaces en el tratamiento de procesos patológicos mediados por la expresión de1HBV. En cualquier caso, el médico que lo administra puede ajustar la cantidad y el tiempo de la administración de ARNi en función de los resultados observados usando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente memoria.
VII. Métodos
La presente descripción proporciona métodos terapéuticos y profilácticos que incluyen administrar a un sujeto que tiene una infección por HBV y/o enfermedad, trastorno y/o afección asociada a1HBV, o propenso a desarrollar una enfermedad, trastorno y/o afección asociada al HBV (p. ej., CHB), composiciones que comprenden un agente de ARNi, o composiciones farmacéuticas que comprenden un agente de ARNi, o vectores que comprenden un ARNi de la invención.
Los métodos son útiles para tratar a un sujeto que tiene una infección por e1HBV, p. ej., un sujeto que se beneficiaría de la reducción en la expresión del gen del HBV y/o la replicación de1HBV. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para reducir el nivel de ADN ccc del virus de la Hepatitis B en un sujeto infectado por el HBV. En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para reducir el nivel de antígeno de HBV, p. ej., HBsAg y/o HBeAg, en un sujeto infectado por el HBV. En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para reducir la carga viral de HBV en un sujeto infectado por el HBV. La presente invención también proporciona métodos para reducir el nivel de alanina aminotransferasa (ALT) y/o aspartato aminotransferasa (AST) en un sujeto infectado por el HBV. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para aumentar el nivel de anticuerpos anti-HBV en un sujeto infectado por el HBV. En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene una infección por e1HBV. En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos para tratar a un sujeto que tiene una enfermedad asociada al h Bv , p. ej., infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular. Además, como la infección por HDV depende de las funciones auxiliares obligatorias proporcionadas por e1HBV para la transmisión, y los sujetos que tienen una infección por el HBV también pueden tener una infección por e1HDV, los métodos de tratamiento descritos en la presente memoria también son útiles para tratar a un sujeto que tiene una infección por e1HDV y/o un trastorno asociado al HDV, tal como infección por el virus de la hepatitis B, infección crónica por hepatitis B (CHB), infección crónica por hepatitis B (CHB), cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular (HCC). Los métodos de tratamiento (y usos) incluyen administrar al sujeto, por ejemplo, un ser humano, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi de la invención que se dirige a un gen de HBV o una composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi de la invención que se dirige a un gen de HBV o un vector de la invención que comprende un agente de ARNi que se dirige a un gen de HBV.
En un aspecto, la descripción proporciona métodos para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que tiene una infección por el HBV, p. ej., la presencia de ADN ccc de HBV en el suero y/o hígado, la presencia de ADN de HBV en el suero la presencia de antígeno del HBV en el suero y/o hígado, p. ej., HBsAg y/o HBeAg, ALT elevada, AST elevada, la ausencia o nivel bajo de anticuerpos anti-HBV, un daño hepático; cirrosis; infección por el virus de la hepatitis D, hepatitis delta, hepatitis B aguda; hepatitis B fulminante aguda; hepatitis B crónica; fibrosis hepática; enfermedad hepática en etapa terminal; carcinoma hepatocelular; síndrome similar a la enfermedad del suero; anorexia; náuseas; vómitos, fiebre baja; mialgia; fatigabilidad; agudeza gustativa y sensaciones olfativas alteradas (aversión a alimentos y los cigarrillos); y/o dolor del cuadrante superior derecho y epigástrico (intermitente, leve a moderado); encefalopatía hepática; somnolencia; alteraciones en el patrón de sueño; confusión mental; coma; ascitis; hemorragia gastrointestinal; coagulopatía ictericia; hepatomegalia (hígado blando, levemente agrandado); esplenomegalia; eritema palmar; arañas vasculares, desgaste muscular; angiomas en araña; vasculitis; sangrado varicoso; edema periférico; ginecomastia; atrofia testicular; venas colaterales abdominales (caput medusae); altos niveles de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), dentro de un intervalo de 1000-2000 UI/ml, aunque también se pueden identificar valores 100 veces por encima del límite superior de la normalidad (ULN); niveles de ALT superiores a los niveles de AST; niveles elevados de gamma-glutamil transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina (ALP) (p. ej., no más de 3 veces el ULN); niveles de albúmina ligeramente bajos; niveles elevados de hierro en el suero; leucopenia (es decir, granulocitopenia); linfocitosis; velocidad de sedimentación globular (ESR) aumentada; supervivencia de los glóbulos rojos acortada; hemólisis; trombocitopenia; una prolongación de la razón internacional normalizada (INR); la presencia en el suero y/o hígado de HBsAg, HBeAg, inmunoglobulina M (IgM) anticuerpo del núcleo de la hepatitis B (anti-HBc); anticuerpo de superficie de hepatitis B (anti-HBs), anticuerpo de e de hepatitis B (anti-HBe), y/o ADN de HBV; elevación de las aminotransferasas (<5 veces el ULN); niveles de ALT mayores que los niveles de AST; niveles de bilirrubina aumentados, tiempo de protrombina (PT) prolongado; hiperglobulinemia; la presencia de anticuerpos no específicos de tejido, tales como los anticuerpos antimúsculo liso (ASMA) o anticuerpos antinucleares (ANA) (10-20%); la presencia de anticuerpos específicos de tejido, tales como los anticuerpos contra la glándula tiroides (10-20%); niveles elevados de factor reumatoide (RF); hiperbilirrubinemia, PT prolongado, recuentos bajos de plaquetas y glóbulos blancos, niveles de AST superiores a los niveles de ALT; niveles elevados de fosfatasa alcalina (ALP) y GGT; lobular, con cambios hepatocelulares degenerativos y regenerativos, e inflamación acompañante; necrosis predominantemente centrolobulillar. Los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del agente de ARNi, p. ej., ARNbc, composiciones farmacéuticas o vectores, previniendo así al menos un síntoma en el sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión del gen del HBV, tal como un sujeto que tiene una infección por e1HBV o un sujeto que tiene tanto una infección tanto por el HBV como HDV.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona usos de una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente de ARNi de la invención para tratar a un sujeto, p. ej., un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen del HBV, tal como un sujeto que tiene una infección por HBV o un sujeto que tiene una infección tanto por HBV como HDV.
En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona usos de un agente de ARNi, p. ej., un ARNbc, que se dirige a un gen de HBV o composición farmacéutica que comprende un agente de ARNi que se dirige a un gen de HBV en la fabricación de un medicamento para tratar un sujeto, p. ej., un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen del HBV y/o la replicación del HBV, tal como un sujeto que tiene una infección por el HBV o un sujeto que tiene una infección tanto por el HBV como HDV, y un sujeto que tiene un trastorno que se beneficiaría de la reducción en la expresión del gen del HBV, p. ej., una enfermedad asociada a1HBV.
En otro aspecto, la descripción proporciona usos de un ARNi, p. ej., un ARNbc, de la invención para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen del HBV y/o la replicación del HBV.
En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona usos de un agente de ARNi de la invención en la fabricación de un medicamento para prevenir al menos un síntoma en un sujeto que padece un trastorno que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen del HBV y/o replicación de1HBV, tal como una enfermedad asociada al HBV.
En un caso, se administra un agente de ARNi que se dirige al HBV a un sujeto que tiene una infección por e1HBV o ambas, y una infección por el HBV y el VHD, y/o una enfermedad asociada a1HBV, de manera que la expresión de uno o más genes del HBV, los niveles de ADN ccc del VHC, niveles de antígeno de HBV, niveles de carga viral de HBV, ALT y/o AST, p. ej., en una célula, tejido, sangre u otro tejido o fluido del sujeto se reducen en al menos aproximadamente 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69 %, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos aproximadamente 99% o más cuando se administra al sujeto el agente de ARNbc.
En un caso, un agente de ARNi que se dirige al HBV se administra a un sujeto que tiene una infección por e1HBV o ambas y una infección por el HBV y HDV, y/o una enfermedad asociada al HBV, de modo que el nivel de anticuerpos anti-HBV, p. ej., en una célula, tejido, sangre u otro tejido o fluido del sujeto aumenta en al menos aproximadamente 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 62%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69 %, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos aproximadamente 99% o más cuando se administra al sujeto el agente de ARNbc.
Los métodos y usos incluyen la administración de una composición descrita en la presente memoria de modo que la expresión del gen del HBV objetivo disminuye, tal como durante aproximadamente 1, 2, 3, 45, 6, 7, 8, 12, 16, 18, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, o aproximadamente 80 horas. En una realización, la expresión del gen del HBV objetivo disminuye durante un período prolongado, p. ej., al menos aproximadamente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete días o más, p. ej., aproximadamente una semana, dos semanas, tres semanas o aproximadamente cuatro semanas o más tiempo.
La administración del ARNbc de acuerdo con los métodos y usos puede dar como resultado una reducción de la gravedad, signos, síntomas y/o marcadores de dichas enfermedades o trastornos en un paciente con una infección por el HBV o ambos y una infección por HBV y HDV, y/o enfermedad asociada a1HBV. Por "reducción" en este contexto se entiende una disminución estadísticamente significativa en dicho nivel. La reducción puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o aproximadamente 100%.
La eficacia del tratamiento o la prevención de la enfermedad se puede evaluar, por ejemplo, midiendo la evolución de la enfermedad, remisión de la enfermedad, gravedad de los síntomas, reducción del dolor, la calidad de vida, dosis de un medicamento requerido para mantener el efecto del tratamiento, nivel de un marcador de la enfermedad o cualquier otro parámetro medible adecuado para una enfermedad dada que está siendo tratada o que es el objetivo para la prevención. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica controlar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo cualquiera de dichos parámetros, o cualquier combinación de parámetros. Por ejemplo, la eficacia del tratamiento de CHB se puede evaluar, por ejemplo, mediante el control periódico de la carga viral y los niveles de transaminasas. La comparación de las lecturas últimas con las lecturas iniciales proporciona al médico una indicación de si el tratamiento es eficaz. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica controlar la eficacia del tratamiento o la prevención midiendo uno cualquiera de dichos parámetros, o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un a Rní que se dirige a1HBV o composición farmacéutica del mismo, "eficaz contra" una enfermedad asociada al HBV indica que la administración de una manera clínicamente apropiada produce un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tal como la mejora de síntomas, una cura, una reducción de la enfermedad, prolongación de la vida, mejora de la calidad de vida u otro efecto generalmente reconocido como positivo por los médicos familiarizados con el tratamiento de la infección por el HBV y/o una enfermedad asociada al h Bv y las causas relacionadas.
Un tratamiento o efecto preventivo es evidente cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado de la enfermedad, o porque no empeora o no desarrolla síntomas donde de otra manera se anticiparían. Como ejemplo, un cambio favorable de al menos 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferiblemente al menos 20%, 30%, 40%, 50% o más puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco de ARNi dado o formulación de ese fármaco también se puede considerar usando un modelo animal experimental para la enfermedad dada como se conoce en la técnica. Cuando se usa un modelo animal experimental, la eficacia del tratamiento se pone de manifiesto cuando se observa una reducción estadísticamente significativa en un marcador o síntoma.
Se puede administrar a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNi, tal como aproximadamente 0.01 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.55 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.65 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.75 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.85 mg/kg, 0.9 mg/kg, 0.95 mg/kg, 1.0 mg/kg, 1.1 mg/kg, 1.2 mg/kg, 1.3 mg/kg, 1.4 mg/kg, 1.5 mg/kg, 1.6 mg/kg, 1.7 mg/kg, 1.8 mg/kg, 1.9 mg/kg, 2.0 mg/kg, 2.1 mg/kg, 2.2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.4 mg/kg, 2.5 mg/kg de ARNbc, 2.6 mg/kg de ARNbc, 2.7 mg/kg de ARNbc, 2.8 mg/kg de ARNbc, 2.9 mg/kg de ARNbc, 3.0 mg/kg de ARNbc, 3.1 mg/kg de ARNbc, 3.2 mg/kg de ARNbc, 3.3 mg/kg de ARNbc, 3.4 mg/kg de ARNbc, 3.5 mg/kg de ARNbc, 3.6 mg/kg de ARNbc, 3.7 mg/kg de ARNbc, 3.8 mg/kg de ARNbc, 3.9 mg/kg de ARNbc, 4.0 mg/kg de ARNbc, 4.1 mg/kg de ARNbc, 4.2 mg/kg de ARNbc, 4.3 mg/kg de ARNbc, 4.4 mg/kg de ARNbc, 4.5 mg/kg de ARNbc, 4.6 mg/kg de ARNbc, 4.7 mg/kg de ARNbc, 4.8 mg/kg de ARNbc, 4.9 mg/kg de ARNbc, 5.0 mg/kg de ARNbc, 5.1 mg/kg de ARNbc, 5.2 mg/kg de ARNbc, 5.3 mg/kg de ARNbc, 5.4 mg/kg de ARNbc, 5.5 mg/kg de ARNbc, 5.6 mg/kg de ARNbc, 5.7 mg/kg de ARNbc, 5.8 mg/kg de ARNbc, 5.9 mg/kg de ARNbc, 6.0 mg/kg de ARNbc, 6.1 mg/kg de ARNbc, 6.2 mg/kg de ARNbc, 6.3 mg/kg de ARNbc, 6.4 mg/kg de ARNbc, 6.5 mg/kg de ARNbc, 6.6 mg/kg de ARNbc, 6.7 mg/kg de ARNbc, 6.8 mg/kg de ARNbc, 6.9 mg/kg de ARNbc, 7.0 mg/kg de ARNbc, 7.1 mg/kg de ARNbc, 7.2 mg/kg de ARNbc, 7.3 mg/kg de ARNbc, 7.4 mg/kg de ARNbc, 7.5 mg/kg de ARNbc, 7.6 mg/kg de ARNbc, 7.7 mg/kg de ARNbc, 7.8 mg/kg de ARNbc, 7.9 mg/kg de ARNbc, 8.0 mg/kg de ARNbc, 8.1 mg/kg de ARNbc, 8.2 mg/kg de ARNbc, 8.3 mg/kg de ARNbc, 8.4 mg/kg de ARNbc, 8.5 mg/kg de ARNbc, 8.6 mg/kg de ARNbc, 8.7 mg/kg de ARNbc, 8.8 mg/kg de ARNbc, 8.9 mg/kg de ARNbc, 9.0 mg/kg de ARNbc, 9.1 mg/kg de ARNbc, 9.2 mg/kg de ARNbc, 9.3 mg/kg de ARNbc, 9.4 mg/kg de ARNbc, 9.5 mg/kg de ARNbc, 9.6 mg/kg de ARNbc, 9.7 mg/kg de ARNbc, 9.8 mg/kg de ARNbc, 9.9 mg/kg de ARNbc, 9.0 mg/kg de ARNbc, 10 mg/kg de ARNbc, 15 mg/kg de ARNbc, 20 mg/kg de ARNbc, 25 mg/kg de ARNbc, 30 mg/kg de ARNbc, 35 mg/kg de ARNbc, 40 mg/kg de ARNbc, 45 mg/kg de ARNbc o aproximadamente 50 mg/kg de ARNbc. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
En ciertos casos, por ejemplo, cuando una composición comprende un ARNbc como se describe en la presente memoria y un lípido, se puede administrar a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNi, tal como de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 1.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 2.5 mg/kg, de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 3 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 3.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg, de aproximadamente 4 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 4.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 5.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 6.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 7.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 8.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, de aproximadamente 9 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 9.5 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
Por ejemplo, el ARNbc se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2,
9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9 o aproximadamente 10 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se
pretende que sean parte de esta descripción.
En otros casos, por ejemplo, cuando una composición de la invención comprende un ARNbc como se describe en la
presente memoria y una N-acetilgalactosamina, se puede administrar a los sujetos una cantidad terapéutica de
ARNi, tal como una dosis de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 15 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 20 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 25 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 35 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 45 a
aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 15 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 20 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 25 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 35 a
aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 5 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 10 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 25 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 30 a
aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 5 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 10 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 25 a
aproximadamente 30 mg/kg, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.25 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 0.75 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 1.5 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 2.5 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 3.5 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 4.5 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 7.5 a
aproximadamente 20 mg/kg, de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg o de aproximadamente 15 a
aproximadamente 20 mg/kg. En una realización, cuando una composición de la invención comprende un ARNbc
como se describe en la presente memoria y una N-acetilgalactosamina, se puede administrar a los sujetos una
cantidad terapéutica de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 mg/kg de ARNbc. Los valores e intervalos
intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
Por ejemplo, se puede administrar a los sujetos una cantidad terapéutica de ARNi, tal como aproximadamente 0.1,
0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5, 24, 24.5, 25, 25.5, 26, 26.5, 27, 27.5, 28, 28.5, 29, 29.5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o aproximadamente 50 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios también se pretende que sean parte de esta descripción.
En ciertos casos, por ejemplo, cuando un agente de ARNi bicatenario incluye una modificación (p. ej., uno o más motivos de tres modificaciones idénticas en tres nucleótidos consecutivos), incluyendo uno de dichos motivos en o cerca del sitio de escisión del agente, seis enlaces fosforotioato y un ligando, dicho agente se administra en una dosis de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.03 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.03 mg/kg a aproximadamente 0.05 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.04 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg, de aproximadamente 0.04 mg/kg a aproximadamente 0.06 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.5 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.4 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.3 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.2 mg/kg, de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 0.1 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.09 mg/kg, de aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.08 mg/kg o aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 0.07 mg/kg. Los valores e intervalos intermedios de los valores citados antes también se pretende que sean parte de esta descripción, p. ej., el agente de ARNi se puede administrar al sujeto en una dosis de aproximadamente 0.015 mg/kg a aproximadamente 0.45 mg/kg.
Por ejemplo, el agente de ARNi, p. ej., el agente de ARNi en una composición farmacéutica, se puede administrar en una dosis de aproximadamente 0.01 mg/kg, 0.0125 mg/kg, 0.015 mg/kg, 0.0175 mg/kg, 0.02 mg/kg, 0.0225 mg/kg, 0.025 mg/kg, 0.0275 mg/kg, 0.03 mg/kg, 0.0325 mg/kg, 0.035 mg/kg, 0.0375 mg/kg, 0.04 mg/kg, 0.0425 mg/kg, 0.045 mg/kg, 0.0475 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.0525 mg/kg, 0.055 mg/kg, 0.0575 mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.0625 mg/kg, 0.065 mg/kg, 0.0675 mg/kg, 0.07 mg/kg, 0.0725 mg/kg, 0.075 mg/kg, 0.0775 mg/kg, 0.08 mg/kg, 0.0825 mg/kg, 0.085 mg/kg, 0.0875 mg/kg, 0.09 mg/kg, 0.0925 mg/kg, 0.095 mg/kg, 0.0975 mg/kg, 0.1 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.15 mg/kg, 0.175 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.225 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.275 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.325 mg/kg, 0.35 mg/kg, 0.375 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.425 mg/kg, 0.45 mg/kg, 0.475 mg/kg o aproximadamente 0.5 mg/kg. Los valores intermedios de los valores citados antes también se pretende que sean parte de esta descripción.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 900 mg, p. ej., entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 100 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 200 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 550 mg, entre aproximadamente 300 mg a aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 850 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 750 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 700 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 650 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 600 mg, entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 550 mg o entre aproximadamente 400 mg a aproximadamente 500 mg.
En algunos casos, el agente de ARNi se administra como una dosis fija de aproximadamente 100 mg, aproximadamente 125 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 175 mg, 200 mg, aproximadamente 225 mg, aproximadamente 250 mg, aproximadamente 275 mg, aproximadamente 300 mg, aproximadamente 325 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 375 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 425 mg, aproximadamente 450 mg, aproximadamente 475 mg, aproximadamente 500 mg, aproximadamente 525 mg, aproximadamente 550 mg, aproximadamente 575 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 625 mg, aproximadamente 650 mg, aproximadamente 675 mg, aproximadamente 700 mg, aproximadamente 725 mg, aproximadamente 750 mg, aproximadamente 775 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 825 mg, aproximadamente 850 mg, aproximadamente 875 mg o aproximadamente 900 mg.
El ARNi se puede administrar por infusión intravenosa a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de un periodo de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, y 21, 22, 23, 24 o aproximadamente 25 minutos. La administración se puede repetir, por ejemplo, de forma regular, tal como de forma semanal, quincenal (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más tiempo. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos se pueden administrar con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración semanal o quincenal durante tres meses, la administración se puede repetir una vez al mes, durante seis meses o un año o más tiempo.
La administración del ARNi puede reducir la presencia de ADN ccc del HBV en el suero y/o hígado, la presencia de antígeno de HBV en el suero y/o hígado, p. ej., HBsAg y/o HBeAg, niveles de ALT y/o niveles de AST, p. ej., en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49 %, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos aproximadamente el 99% o más, por ejemplo, por debajo del nivel de detección del ensayo.
La administración del ARNi puede aumentar la presencia de anticuerpos anti-HBV en el suero y/o hígado, por ejemplo, en una célula, tejido, sangre, orina u otro compartimento del paciente en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58 %, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o al menos aproximadamente 99% o más.
Antes de la administración de una dosis completa del ARNi, a los pacientes se les puede administrar una dosis más pequeña, tal como una infusión del 5%, y controlar sus efectos adversos, tales como una reacción alérgica. En otro ejemplo, se pueden controlar en el paciente efectos inmunoestimulantes no deseados, tales como el aumento de los niveles de citoquinas (p. ej., TNF-alfa o INF-alfa).
Debido a los efectos inhibidores en la expresión del HBV, una composición de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica preparada a partir de la misma puede mejorar la calidad de vida.
Un ARNi de la invención se puede administrar en forma "desnuda", donde el agente de ARNi modificado o no modificado se suspende directamente en un disolvente tampón adecuado o acuoso, como un "ARNi libre". Se administra un ARNi libre en ausencia de una composición farmacéutica. El ARNi libre puede estar en una solución tampón adecuada. La solución tampón puede comprender acetato, citrato, prolamina, carbonato o fosfato, o cualquier combinación de los mismos. En una realización, la solución tampón es solución salina tamponada con fosfato (PBS). El pH y la osmolaridad de la solución tampón que contiene el ARNi se pueden ajustar de modo que sea adecuado para administrar a un sujeto.
Alternativamente, un ARNi de la invención se puede administrar como una composición farmacéutica, tal como una formulación liposomal de ARNbc.
Los sujetos que se beneficiarían de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen de1HBV son aquellos que tienen una infección por el HBV y/o una enfermedad o trastorno asociado a1HBV como se describe en la presente memoria.
El tratamiento de un sujeto que se beneficiaría de una reducción y/o inhibición de la expresión del gen de1HBV incluye el tratamiento terapéutico y profiláctico.
La descripción proporciona además métodos y usos de un agente de ARNi o una composición farmacéutica del mismo para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción y/o inhibición de la expresión del gen de1HBV, p. ej., un sujeto que tiene una enfermedad asociada al HBV, en combinación con otros productos farmacéuticos. y/u otros métodos terapéuticos, p. ej., con productos farmacéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, los que se usan actualmente para tratar estos trastornos.
Por ejemplo, en ciertos casos, un ARNi que se dirige a uno o más genes de1HBV se administra en combinación con, p. ej., un agente útil en el tratamiento de una enfermedad asociada al HBV como se describe en otra parte en la presente memoria. Por ejemplo, los productos terapéuticos y métodos terapéuticos adicionales adecuados para tratar a un sujeto que se beneficiaría de la reducción en la expresión de1HBV, p. ej., un sujeto que tiene una enfermedad asociada al HBV, incluyen un agente de ARNi que se dirige a una porción diferente del genoma del HBV, un agente antiviral, un inhibidor de la transcriptasa inversa (p. ej., tenofovir disoproxil fumarato (TDF), tenofovir alafenamida, lamivudina, adefovir dipivoxil, entecavir (ETV), telbivudina y AGX-1009), un inmunoestimulador (p. ej., interferón alfa 2a pegilado (PEG-IFN-a2a), interferón alfa-2b, una interleuquina-7 humana recombinante y un agonista del receptor 7 de tipo Toll (TLR7)), una vacuna terapéutica (p. ej., GS-4774, DV-601 y TG1050), un inhibidor de entrada viral (p. ej., Myrcludex), un oligonucleótido que inhibe la secreción o liberación de HbsAg (p. ej., REP 9AC), un inhibidor de la cápside (p. ej., Bay41-4109 y NVR-1221), un inhibidor de ADN ccc (p. ej., IHVR-25) u otros agentes y/o procedimientos terapéuticos, p. ej., trasplante de hígado, quimioterapia, para tratar una enfermedad asociada al HBV, una combinación de cualquiera de los anteriores.
En ciertos casos, un primer agente de ARNi que se dirige a uno o más genes de HBV se administra en combinación con un segundo agente de ARNi que se dirige a una parte diferente del genoma de HBV. Por ejemplo, se puede administrar un primer agente de ARNi que se dirige a uno o más genes estructurales en combinación con un segundo agente de ARNi que se dirige al gen X. Por ejemplo, el primer agente de ARNi comprende una primera cadena paralela y una primera cadena antiparalela que forma una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha primera cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la primera cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde dicha primera cadena paralela se conjuga con un ligando unido en el extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos a través de un conector ramificado bivalente o trivalente; y el segundo agente de ARNi comprende una segunda cadena paralela y una segunda cadena antiparalela que forman una región de doble cadena, en donde sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de la segunda cadena antiparalela son nucleótidos modificados, en donde la segunda cadena paralela se conjuga con un ligando unido en el extremo 3', y en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unidos por un conector ramificado bivalente o trivalente; en donde la primera cadena paralela comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en 5'- UCGUGGUGGACUUCUCUCA -3' (SEQ IDNO: 5),
5'- GUGCACUUCGCUUCACCUCUA -3' (SEQ IDNO: 7),
5'- CGUGGUGGACUUCUCUCAAUU -3' (SEQ IDNO: 9),
5'- CGUGGUGGUCUUCUCUAAAUU -3' (SEQ IDNO: 37),
5'- GGUGGACUUCUCUCAAUUUUA -3' (SEQ IDNO: 11), y
5'- GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ IDNO: 39) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), y en donde la primera y segunda cadena antiparalelas comprende cada una independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
5'- UGAGAGAAGUCCACCACGAUU -3' (SEQ ID NO: 6);
5'- UAGAGGUGAAGCGAAGUGCACUU -3' (SEQ ID NO: 8);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCAG -3' (SEQ ID NO: 10);
5'- AAUUGAGAGAAGUCCACCAGCUU -3' (SEQ ID NO: 38),
5'- UAAAAUUGAGAGAAGUCCACCAC -3' (SEQ ID NO: 12), y
5'- UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40) (o una secuencia de nucleótidos que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a lo largo de la longitud entera a cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores), tratando así al sujeto.
En un caso, todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena paralela y/o todos nucleótidos de la primera y segunda cadena antiparalela comprenden una modificación.
En un caso, todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena paralela y/o todos los nucleótidos de la primera y segunda cadena antiparalela comprenden una modificación.
En un caso, el al menos uno de los nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un nucleótido desoxitimina (dT) 3'-terminal, un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, nucleótido modificado con 2'-hidroxilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
En ciertos casos, se administra un primer agente de ARNi que se dirige a uno o más genes de HBV en combinación con un segundo agente de ARNi que se dirige a un gen que es diferente de uno o más genes de HBV. Por ejemplo; el agente de ARNi que se dirige a uno o más genes de HBV se puede administrar en combinación con un agente de ARNi que se dirige a un gen CD274/PD-L1. Los ejemplos de agentes de ARNi que se dirigen a un gen CD274/PD-L1 se describen en la publicación internacional WO 2011/127180, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria como referencia. El primer agente de ARNi que se dirige a uno o más genes de HBV y el segundo agente de ARNi que se dirige a un gen diferente de uno o más 149 genes de HBV, p. ej., un gen CD274/PD-L1 y/o un gen de HDV, se pueden administrar como partes de la misma composición farmacéutica. Alternativamente, el primer agente de a Rní que se dirige a uno o más genes del HBV y el segundo agente de ARNi que se dirige a un gen diferente de uno o más genes del HBV, p. ej., un gen CD274/PD-L1 y/o un gen de HDV, se pueden administrar como partes de diferentes composiciones farmacéuticas.
CD274 o PD-L1 es una proteína transmembrana tipo I de 290 aminoácidos codificada por el gen CD274 en el cromosoma 19 de ratón y el cromosoma 9 humano. La expresión de CD274/PD-L1 está implicada en la evasión de respuestas inmunitarias implicadas en una infección crónica, p. ej., por virus (incluyendo, por ejemplo, VIH, HBV, VHC y HTLV, entre otros), por bacterias (incluyendo, por ejemplo, Helicobacter pylori, entre otros) y por parásitos (incluyendo, por ejemplo, Schistosoma mansoni).
PD-L1 puede influir en las respuestas inmunitarias al activar PD-1 o B7-1 (CD80) y modificar la señalización de TCR o BCR, pero también puede suministrar señales a las células que expresan PD-L1, es decir, señalización inversa a través de PD-L1. Los estudios de resonancia de plasmones superficiales demuestran una interacción específica y única entre PD-L1 y B7-1, con una afinidad de 1.7 pM y una afinidad de 0.5 pM para la interacción entre PD-L1 y PD-1. Los estudios de reticulación química indican que PD-L1 y B7-1, como PD-L1 y PD-1, también pueden interaccionar a través de sus dominios similares a IgV. La interfase de PD-L1:B7-1 se superpone al menos parcialmente con la interfase putativa de PD-L1:PD-1. Las interacciones de B7-1:PD-L1 pueden inducir una señal inhibitoria en las células T. La ligadura de PD-L1 en células T CD4 por B7-1, o la ligadura de B7-1 en células T CD4 por PD-L1, suministra una señal inhibidora funcionalmente significativa. Debido a que tanto PD-L1 como B7-1 se expresan en células T, células B, DC y macrófagos, existe el potencial de interacciones bidireccionales entre B7-1 y PD-L1 en estos tipos de células. Además, PD-L1 en células no hematopoyéticas puede interaccionar con B7-1 así como PD-1 en células T para regular las células (Keir ME et al., 2008. Annu Rev Immunol. 26: 677-704).
En infecciones virales crónicas en seres humanos, varios grupos han mostrado que la expresión de PD-1 es alta en células T específicas de HIV (Petrovas C et al., 2006, J. Exp. Med. 203:2281-92; Day CL et al., 2006, Nature 443: 350-54; Trautmann L et al., 2006, Nat. Med. 12: 1198-202), específicas de1HBV (Boettler T et al., 2006, J. Virol.
80:3532-40; Boni C et al. 2007, J. Virol. 81:4215-25) y específicas de HCV (Urbani S et al., 2006, J. Virol. 80:11398-403). PD-L1 también es regulada por aumento en monocitos CD14+ de sangre periférica y DC mieloides en pacientes con infección crónica por el HBV (Chen L et al., 2007, J. Immunol. 178:6634-41; Ceng L et al., 2006, J. Viral Hepat.13: 725-33), y en células CD14+ y células T en pacientes con HIV (Trabattoni D et al., 2003. Blood 101: 2514-20). El bloqueo de las interacciones PD-LPD-L in vitro invierte el agotamiento de células T CD8 y CD4 específicas de VIH, específicas de HBV (Boni C et al. 2007, J. Virol. 81: 4215-25), específicas de HCV y específicas de SIV (Velu V et al., 2007, J. Virol. 81: 5819-28) y restablece la proliferación y la producción de citoquinas (Petrovas C et al., 2006, J. Exp. Med. 203: 2281-92; Day CL et al., 2006, Nature 443: 350-54; Trautmann L et al., 2006, Nat. Med. 12: 1198-202; Urbani S et al., 2006, J. Virol. 80: 11398-403). Un trabajo reciente muestra que el núcleo del HCV, una proteína nucleocápside, puede regular por aumento la expresión de PD-1 y PD-L1 en células T de donantes sanos y que la regulación por aumento de PD-1 es mediada por la interacción del núcleo de1HCV con el receptor del complemento C1QBP (Yao ZQ et al., 2007, Viral Immunol. 20: 276-87).
Un sujeto al que se le ha administrado un primer agente de ARNi o un primer y segundo agente de ARNi de la invención se le puede administrar además con uno o más productos terapéuticos diferentes que funcionan por un mecanismo que no es de ARNi y que son útiles en el tratamiento de una infección por HBV. Los productos terapéuticos de ejemplo que se pueden usar en una terapia de combinación de la invención incluyen inmunomoduladores que estimulan el sistema inmunitario, por ejemplo, potenciando la actividad auxiliar de células T, maduración de linfocitos B, inhibiendo supresores de células T y potenciando la expresión de HLA tipo I. Los inmunomoduladores adecuados incluyen interferones que tienen una variedad de propiedades que incluyen efectos antivirales, inmunomoduladores y antiproliferativos.
Por ejemplo, el tratamiento actual para la hepatitis B crónica es la terapia con interferón, que se administra a sujetos que tienen una infección por HBV confirmada durante al menos seis meses, enzimas hepáticas elevadas (AST y ALT) y un virus que se divide activamente en la sangre (ensayos positivos de HBeAg, y/o ADN de1HBV). La terapia con interferón a produce una remisión sostenida a largo plazo de la enfermedad en aproximadamente el 35% de las personas con hepatitis B crónica, con normalización de las enzimas hepáticas y pérdida de los tres marcadores de una infección activa (HBeAg, ADN de HBV y HBsAg). Los sujetos con una infección aguda por e1HBV, cirrosis en etapa terminal u otros problemas médicos importantes típicamente no reciben tratamiento con interferón.
Además, la terapia con interferón para pacientes con cirrosis relacionada con e1HBV disminuye significativamente la tasa de carcinoma hepatocelular (CHC), en particular en pacientes con una mayor cantidad de ADN de1HBV en el suero. En pacientes con cirrosis compensada positiva para HBeAg, la remisión virológica y bioquímica después de la terapia con interferón se asocia con una mejor supervivencia. En pacientes con infección crónica por HBV, el aclaramiento de HBeAg después del tratamiento con interferón-a se asocia con mejores resultados clínicos.
La duración estándar de la terapia se considera 16 semanas. Los pacientes que exhiben un bajo nivel de replicación viral al final del régimen estándar se benefician más del tratamiento prolongado.
Otros agentes terapéuticos de ejemplo que se pueden usar en una terapia de combinación incluyen, por ejemplo, un agente antiviral, un análogo de nucleótido, un análogo de nucleósido, un inhibidor de la transcriptasa inversa (p. ej., Tenofovir disoproxil fumarato (TDF), tenofovir alafenamida, lamivudina, adefovir dipivoxilo, Entecavir (ETV), Telbivudina, a GX-1009, emtricitabina, clevudina, ritonavir, dipivoxilo, lobucavir, famvir, FTC, N-acetil-cisteína (NAC), PC1323, theradigm-HBV, timosina-alfa y ganciclovir), un inmunoestimulador (p. ej., interferón alfa 2a pegilado (PEG-IFN-a2a), interferón alfa-2b, una interleuquina-7 humana recombinante y un agonista del receptor 7 de tipo Toll (TLR7)), una vacuna terapéutica (p. ej., g S-4774, DV-601 y TG1050), un inhibidor de entrada viral (p. ej.,Myrcludex), un oligonucleótido que inhibe la secreción o liberación de HbsAg (p. ej., REP 9AC), un inhibidor de la cápside (p. ej., Bay41-4109 y NVR-1221), un inhibidor de ADN ccc (p. ej., IHVR-25) u otros agentes terapéuticos y/o procedimientos, p. ej., trasplante de hígado, quimioterapia, para tratar una enfermedad asociada a1HBV, una combinación de cualquiera de los anteriores.
En un caso, los métodos incluyen administrar a un sujeto que tiene una infección por HBV y/o enfermedad asociada al HBV un inhibidor de la transcriptasa inversa. En otra realización, los métodos de la invención incluyen administrar a un sujeto que tiene una infección por HBV y/o enfermedad asociada al HBV un inhibidor de la transcriptasa inversa y un inmunoestimulador.
El o los agentes de ARNi y un agente terapéutico y/o tratamiento adicional se pueden administrar al mismo tiempo y/o en la misma combinación, p. ej., por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional se puede administrar como parte de una composición separada o en tiempos separados y/o por otro método conocido en la técnica o descrito en la presente memoria.
La presente descripción también proporciona métodos para usar un agente de ARNi de la invención y/o una composición que contiene un agente de ARNi de la invención para reducir y/o inhibir la expresión de HBV en una célula. En otros aspectos, la presente descripción proporciona un ARNi de la invención y/o una composición que comprende un ARNi de la invención para usar en la reducción y/o inhibición de la expresión del gen de1HBV en una célula. En otros aspectos más, se proporciona el uso de un ARNi de la invención y/o una composición que comprende un ARNi de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir y/o inhibir la expresión del gen del HBV en una célula. En otro aspecto más, la presente descripción proporciona un ARNi de la invención y/o una composición que comprende un ARNi de la invención para usar en la reducción y/o inhibición de la replicación del HBV en una célula. En otros aspectos más, se proporciona el uso de un ARNi de la invención y/o una composición que comprende un ARNi de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir y/o inhibir la replicación del HBV en una célula. Los métodos y usos incluyen poner en contacto la célula con un ARNi, p. ej., un ARNbc, de la invención y mantener la célula durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm de un gen del HBV, inhibiendo de ese modo la expresión del gen de1HBV o inhibiendo la replicación del HBV en la célula.
La reducción en la expresión génica se puede evaluar por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, una reducción en la expresión del HBV se puede determinar determinando el nivel de expresión de ARNm de1HBV usando métodos rutinarios para un experto en la técnica, p. ej., transferencia Northern, qRT-PCR, determinando el nivel de proteínas del HBV usando métodos rutinarios para un experto en la técnica, tales como transferencia Western, técnicas inmunológicas, métodos de citometría de flujo, ELISA y/o determinando una actividad biológica del HBV.
En los métodos y usos, la célula se puede poner en contacto in vitro o in vivo, es decir, la célula puede estar en de un sujeto.
Una célula adecuada para el tratamiento usando los métodos puede ser cualquier célula que exprese un gen de HBV, p. ej., una célula infectada con HBV o una célula que comprende un vector de expresión que comprende un genoma de HBV o una parte de un gen de HBV. Una célula adecuada para usar en los métodos y usos de la invención puede ser una célula de mamífero, p. ej., una célula de primate (tal como una célula humana o una célula de primate no humana, p. ej., una célula de mono o una célula de chimpancé), un células que no es de primate (tal como una célula de vaca, una célula de cerdo, una célula de camello, una célula de llama, una célula de caballo, una célula de cabra, una célula de conejo, una célula de oveja, un hámster, una célula de cobaya, una célula de gato, una célula de perro, una célula de rata, una célula de ratón, una célula de león, una célula de tigre, una célula de oso o una célula de búfalo), una célula de ave (p. ej., una célula de pato o una célula de ganso), o una célula de ballena. En una realización, la célula es una célula humana, por ejemplo, una célula hepática humana.
La expresión del gen del HBV se puede inhibir en la célula en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17 %, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67 %, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o aproximadamente 100%, es decir, por debajo del nivel de detección del ensayo.
La replicación del HBV se puede inhibir en la célula en al menos aproximadamente 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34 %, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84 %, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o aproximadamente 100 %, es decir, por debajo del nivel de detección del ensayo.
Los métodos y usos in vivo pueden incluir administrar a un sujeto una composición que contiene un ARNi, donde el ARNi incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a al menos una parte de un transcrito de ARN del gen del HBV del mamífero a tratar. Cuando el organismo a tratar es un ser humano, la composición se puede administrar por cualquier medio conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, vías subcutánea, intravenosa, oral, intraperitoneal o parenteral, incluyendo intracraneal (p. ej., administración intraventricular, intraparenquimal e intratecal), intramuscular, transdérmica, por vía aérea (aerosol), nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En ciertas realizaciones, las composiciones se administran por inyección subcutánea. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por infusión o inyección intravenosa. En otras realizaciones, las composiciones se administran por inyección intramuscular.
En algunos casos, la administración es mediante una inyección de depósito. Una inyección de depósito puede liberar el ARNi de manera consistente a lo largo de un período de tiempo prolongado. Por lo tanto, una inyección de depósito puede reducir la frecuencia de dosificación necesaria para obtener un efecto deseado, p. ej., una inhibición deseada del HBV, o un efecto terapéutico o profiláctico. Una inyección de depósito también puede proporcionar concentraciones séricas más consistentes. Las inyecciones de depósito pueden incluir inyecciones subcutáneas o inyecciones intramusculares. En casos preferidos, la inyección de depósito es una inyección subcutánea.
En algunos casos, la administración es mediante una bomba. La bomba puede ser una bomba externa o una bomba implantada quirúrgicamente. En ciertos casos, la bomba es una bomba osmótica implantada por vía subcutánea. En otros casos, la bomba es una bomba de infusión. Se puede usar una bomba de infusión para infusiones intravenosas, subcutáneas, arteriales o epidurales. En casos preferidos, la bomba de infusión es una bomba de infusión subcutánea. En otras realizaciones, la bomba es una bomba implantada quirúrgicamente que suministra el ARNi al hígado.
El modo de administración se puede elegir en función de si se desea un tratamiento local o sistémico y en función del área a tratar. La ruta y el sitio de administración se pueden elegir para mejorar el direccionamiento.
En un aspecto, la presente descripción también proporciona métodos para inhibir la expresión de un gen de1HBV en un mamífero, por ejemplo, un ser humano. La presente invención también proporciona una composición que comprende un ARNi, p. ej., un ARNbc, que se dirige a un gen del HBV en una célula de un mamífero para usar en la inhibición de la expresión del gen del HBV en el mamífero. En otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de un ARNi, p. ej., un ARNbc, que se dirige a un gen del HBV en una célula de un mamífero en la fabricación de un medicamento para inhibir la expresión del gen del HBV en el mamífero.
Los métodos y usos incluyen administrar al mamífero, p. ej., un ser humano, una composición que comprende un ARNi, p. ej., un ARNbc, que se dirige a un gen del HBV en una célula del mamífero y mantener al mamífero durante un tiempo suficiente para obtener la degradación del transcrito de ARNm del gen de1HBV, inhibiendo así la expresión del gen del HBV en el mamífero.
La reducción en la expresión génica se puede evaluar en una muestra de sangre periférica del sujeto al que se le ha administrado ARNi por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., qRT-PCR, descrito en la presente memoria. La reducción en la producción de proteínas se puede evaluar por cualquier método conocido en la técnica y por métodos, p. ej., ELISA o transferencia Western, descritos en la presente memoria. En un caso, una muestra de biopsia hepática de punción sirve como material de tejido para controlar la reducción en la expresión del gen y/o proteína del HBV. En otro caso, una muestra de sangre sirve como material de tejido para controlar la reducción en la expresión del gen y/o proteína del HBV.
En un caso, la verificación de la escisión medicada por RISC del objetivo in vivo después de la administración del agente de ARNi se hace llevando a cabo 5'-RACE o modificaciones del protocolo como se conoce en la técnica (Lasham A et al., (2010) Nucleic Acid Res., 38 (3) p-e19) (Zimmermann et al. (2006) Nature 441: 111-4).
Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1. Síntesis de ARNi
Fuente de reactivos
Cuando la fuente de un reactivo no se proporciona específicamente en la presente memoria, dicho reactivo se puede obtener de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular con un estándar de calidad/pureza para su aplicación en biología molecular.
Transcritos
Diseño ARNip
La selección de diseños de ARNip que se dirigen al HBV era dirigida por dos factores principales: a) potencia y b), el deseo de emplear ARNip con apareamientos casi perfectos con una cobertura fraccionaria mayor de 90% del gran número de secuencias públicas del HBV de todos los serotipos conocidos (A a H). Las coordenadas para la selección de ARNip se determinaron en relación con la secuencia del genoma de referencia de1HBV de NCBI NC_003977.1 (N° de acceso en GenBank GI: 21326584 (SEQ ID NO: 1)). Se diseñaron, sintetizaron y cribaron in vitro un primer conjunto de ARNip que contenían modificaciones de estructura-actividad, incluyendo diferentes patrones de sustitución de O-metilo y 2'-fluoro, centrados en dos regiones adyacentes del genoma de1HBV que codifican el antígeno de superficie (HbSAg) y la polimerasa del HBV. Se diseñó, sintetizó y cribó un segundo conjunto de ARNip que se dirigían a regiones objetivo adicionales con particular atención a las posiciones 1581-1599 de la SEQ ID NO: 1 que codifican el gen X, además de HbSAg y la polimerasa.
En la Tabla 3 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela de1HBV no modificadas.
En la Tabla 4 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela de1HBV modificadas.
Síntesis de ARNip
Las secuencias de ARNip del HBV se sintetizaron a escala de 1 pmol en el sintetizador Mermade 192 (BioAutomation) usando la química de fosforamidita mediada por soporte sólido. El soporte sólido era vidrio de poro controlado (500 A) cargado con ligando GalNAc adaptado o soporte sólido universal (AM biochemical). Los reactivos de síntesis auxiliares, 2'-F y 2'-O-metil ARN y desoxi-fosforamiditas se obtuvieron de Thermo-Fisher (Milwaukee, WI) y Hongene (China). Se introdujeron las modificaciones 2'F 2'-O-metilo, GNA (ácidos nucleicos de glicol), 5' fosfato y abásicas empleando los fosforamiditos correspondientes. La síntesis de cadenas simples conjugadas con 3' GalNAc se llevó a cabo en un soporte de CPG modificado con GalNAc. El soporte sólido universal de CPG adaptado se usó para la síntesis de cadenas simples antiparalelas. El tiempo de acoplamiento para todas las fosforamiditas (100 mM en acetonitrilo) era de 5 minutos empleando 5-etiltio-1 H-tetrazol (ETT) como activador (0.6 M en acetonitrilo). Los enlaces de fosforotioato se generaron usando una solución 50 mM de 3-((dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tiona (DDTT, obtenido de Chemgenes (Wilmington, MA, EE.UU.)) en acetonitrilo/piridina anhidro (1:1 v/v). El tiempo de oxidación era 3 minutos. Todas las secuencias se sintetizaron con la eliminación final del grupo DMT ("DMT desactivado").
Una vez completada la síntesis en fase sólida, los oligorribonucleótidos se escindieron del soporte sólido y se desprotegieron en placas selladas de 96 pocilios profundos usando 200 pl de reactivos de metilamina acuosa a 6o°C durante 20 minutos. Al final de la etapa de escisión y desprotección, se dejó que la placa de síntesis alcanzara la temperatura ambiente y se precipitó mediante la adición de 1 ml de mezcla de acetontilo:etanol (9:1). Las placas se enfriaron a -80°C durante 2 h, el líquido sobrenadante se decantó cuidadosamente con la ayuda de una pipeta multicanal. El sedimento de oligonucleótidos se volvió a suspender en tampón de NaOAc 20 mM y se desalaron usando una columna de exclusión por tamaños HiTrap de 5 ml (GE Healthcare) en un sistema purificador AKTA equipado con un inyector automático A905 y un colector de fracciones Frac 950. Las muestras desaladas se recogieron en placas de 96 pocillos. Las muestras de cada secuencia se analizaron por LC-MS para confirmar la identidad, UV (260 nm) para la cuantificación y un conjunto seleccionado de muestras por cromatografía IEX para determinar la pureza.
La reasociación de cadenas sencillas de HBV se llevó a cabo en un robot de manipulación de líquidos Tecan. La mezcla equimolar de cadenas simples paralelas y antiparalelas se combinó y reasoció en placas de 96 pocillos. Después de combinar las cadenas simples complementarias, la placa de 96 pocillos se selló herméticamente y se calentó en un horno a 100°C durante 10 minutos y se dejó que llegara lentamente a temperatura ambiente durante un período de 2-3 horas. La concentración de cada dúplex se normalizó a 10 pM en 1X PBS.
Ejemplo 2. Cribado in vitro de dúplex de ARNip
Cultivo celular y transfecciones
Células Cos7 (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron hasta casi confluencia a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 en DMEM (ATCC) complementado con FBS al 10%, antes de ser liberadas de la placa por tripsinización. Las construcciones de Luciferasa Dual-Glo® generadas en el plásmido psiCHECK2 que contiene aproximadamente 1.1 kb de secuencias genómicas de HBV se transfectaron en aproximadamente 15x104 células usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. n° 11668-019). Para cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se añadieron 0.2 pl de Lipofectamine a 10 ng de vector plasmídico en 14.8 pl de Opti-MEM y se dejó que formara complejo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después la mezcla se añadió a las células que se volvieron a suspender en 80 pl de medio completo nuevo. Después de aproximadamente 24 horas, se retiró el medio y las células se volvieron a transfectar con ARNip. Cada ARNip se transfectó en células que se habían transfectado previamente con el vector psiCHECK2-HBV que tenía una correspondencia perfecta para el ARNip. La transfección de ARNip se realizó por adición de 14.8 pl de Opti-MEM más 0.2 pl de Lipofectamine ARNiMax por pocillo (Invitrogen, Carlsbad CA. cat. n° 13778-150) a 5 pl de dúplex de ARNip por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después la mezcla se añadió a las células previamente transfectadas con el plásmido psiCHECK2-HBV que tenía una correspondencia perfecta con la secuencia de ARNip. Las células se incubaron durante 24 horas antes de medir la luciferasa.
Se realizaron experimentos de dosis única en una concentración de dúplex final 10 nM y 0,01 nM.
Ensayo de luciferasa Dual-Glo®
Veinticuatro horas después de la transfección de los ARNips, se midieron luciferasa de luciérnaga (control de transfección) y de rinella (fusionada con la secuencia de HBV objetivo). Primero, los medios se eliminaron de las células. Después, se midió la actividad de luciferasa de luciérnaga añadiendo 75 pl de reactivo de luciferasa Dual-Glo® igual al volumen del medio de cultivo a cada pocillo y mezclando. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de medir la luminiscencia (500 nm) en un Spectramax (Molecular Devices) para detectar la señal de luciferasa de luciérnaga. La actividad de luciferasa de Renilla se midió a temperatura ambiente añadiendo 75 pl del reactivo Dual-Glo® Stop & Glo® que se añadió a cada pocillo y las placas se incubaron durante 10-15 minutos antes de medir de nuevo la luminiscencia para determinar la señal de luciferasa de Renilla. El reactivo Dual-Glo® Stop & Glo®, amortigua la señal de luciferasa de luciérnaga y mantiene la luminiscencia para la reacción de luciferasa de Renilla. La actividad de ARNip se determinó normalizando la señal de Renilla (HBV) respecto a la señal de luciérnaga (control) dentro de cada pocillo. Después se evaluó la magnitud de la actividad de ARNip en relación con las células que se transfectaron con el mismo vector pero que no se trataron con ARNip o se trataron con un ARNip no dirigido. Todas las transfecciones se realizaron en n = 2 o mayor.
La Tabla 5 muestra los resultados de una selección de dosis única en células Cos7 transfectadas con los ARNi de HBV indicados. Los datos se expresan como porcentaje de ARNm que queda en relación con el control negativo. Tabla 2. Abreviaturas de monómeros de nucleótidos usadas en la representación de secuencias de ácido nucleico. Se entenderá que, a menos que se indique lo contrario, estos monómeros, cuando están presentes en un oligonucleótido, están unidos entre sí por enlaces 5'-3'-fosfodiéster.
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Tabla 5. Selección de una sola dosis de HBV usando el ensayo de Dual-Glo Luciferase®
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Ejemplo 3. Síntesis y selección in vitro de dúplex de ARNip adicionales
Se sintetizaron moléculas de ARNi adicionales que se dirigen al genoma de1HBV como se ha descrito antes. En la Tabla 6 se muestra una lista detallada de las secuencias adicionales de la cadena paralela y antiparalela de1HBV no modificadas y en la Tabla 7 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela del HBV modificadas.
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Se llevó a cabo una selección de una dosis única de estos dúplex por duplicado transfectando los dúplex en células HepG2.215 y Hep3B y midiendo el ARN viral del HBV usando parejas de sonda/cebador para detectar el ARN del marco de lectura abierto (ORF) P del HBV (PORF-1_A y PORF-1_B) y/o conjuntos de cebadores para detectar el ORF S del HBV (SORF-2_A y So RF-2_B). Los resultados de los ensayos en células HepG2.2.15 se muestran en la Tabla 8 y los resultados de los ensayos en células Hep3B se proporcionan en la Tabla 9.
Tabla 8. Selección de una sola dosis de HBV en células HepG2.2.15
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Table 9. Selección de dosis única de HBV en células Hep3B
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También se analizó en un subconjunto de estos dúplex la estabilidad metabólica in vitro usando dos ensayos, un ensayo de estabilidad de tritosomas y un ensayo de estabilidad de citosol.
Para los ensayos de estabilidad de tritosomas, tritosomas de hígado de rata (producto adaptado Xenotech PR14044) se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron a 0,5 unidades/ml de fosfatasa ácida en tampón de citrato de sodio 20 mM pH 5,0. Se prepararon muestras de veinticuatro horas mezclando 100 pl de tritosomas en fosfatasa ácida de 0,5 unidades/ml con 25 pl de muestra de ARNip de 0,4 mg/ml en un tubo de microcentrífuga e incubando durante veinticuatro horas en un conjunto eppendorf Thermomixer a 37°C y 300 rpm. Después de veinticuatro horas de incubación, se añadieron a cada muestra 300 pl de tampón de carga de lisis Phenomenex (n° de cat. ALO-8498) y 12,5 pl de un ARNip de referencia interna de 0,4 mg/ml. Se prepararon muestras del tiempo 0 horas mezclando 100 pl de tritosomas en fosfatasa ácida de 0,5 unidades/ml con 25 pl de muestra de ARNip de 0,4 mg/ml, 300 pl de tampón de carga de lisis Phenomenex y 12,5 pl de un ARNip de referencia interno de 0,4 mg/ml. El ARNip se extrajo de las muestras de veinticuatro horas y muestras de 0 horas usando un kit de Phenomenex Clarity OTX Starter (Cat. n° KSO-8494). Después de extraer las muestras, se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se secaron usando un concentrador Labconco CentriVap (Cat. n° 7810010). Después las muestras se volvieron a suspender con 500 pl de agua sin nucleasas. Se procesaron cincuenta pl de cada muestra en un LC binario 1260 Infinity de Agilent Technologies con LC/MS de cuadrupolo Agilent Technologies 6130. El método de bomba cuaternaria se ejecutó durante 12,20 minutos a 0,400 ml/min con el siguiente esquema de tiempos:
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El método de la bomba binaria se ejecutó durante 12,20 minutos a 0,700 ml/min con el siguiente esquema de tiem o:
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Tanto la columna izquierda como la derecha se ajustaron a 75.00°C. La señal UV se midió a una longitud de onda de 260 nm. El porcentaje que quedaba de cada cadena se calculó usando la siguiente ecuación:
% Cadena restante=100*(Área del picocadena 24 h/Área del picoCadena 0 h*(Área del picoreferencia 24 h/Área del picoreferencia 0 h)).
Para los ensayos de estabilidad de citosol, citosoles de hígado de rata hembra (Xenotech Cat. n° R1500.C) se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron a 1 mg/ml en tampón Tris:HCl 50 mM pH 7.4, MgCl2 5 mM. Se prepararon muestras de veinticuatro horas mezclando 100 pl de citosol de 1 mg/ml con 25 pl de muestra de ARNip de 0,4 mg/ml en un tubo de microcentrífuga e incubando durante veinticuatro horas en un conjunto eppendorf Thermomixer a 37°C y 300 rpm. Después de veinticuatro horas de incubación, se añadieron a cada muestra 300 pl de tampón de carga de lisis Phenomenex (n° de cat. ALO-8498) y 12,5 pl de un ARNip de referencia interna de 0,4 mg/ml. Se prepararon muestras de tiempo 0 horas mezclando 100 pl de citosol de 1 mg/ml con 25 pl de muestra de ARNip de 0,4 mg/ml, 300 pl de tampón de carga de lisis Phenomenex y 12,5 pl de un ARNip de referencia interno de 0,4 mg/ml. El ARNip se extrajo de las muestras de veinticuatro horas y muestras de 0 horas usando un kit de Phenomenex Clarity OTX Starter (Cat. n° KSO-8494). Después de extraer las muestras, se transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se secaron usando un concentrador Labconco CentriVap (Cat. n° 7810010). Después las muestras se volvieron a suspender con 500 pl de agua sin nucleasas. Se procesaron 50 pl de cada muestra en un LC binario 1260 Infinity de Agilent Technologies con LC/MS de cuadrupolo Agilent Technologies 6130. El método de bomba cuaternaria se ejecutó durante 12,20 minutos a 0,400 ml/min con el siguiente esquema de tiempos:
Figure imgf000119_0001
El método de la bomba binaria se ejecutó durante 12,20 minutos a 0,700 ml/min con el siguiente esquema de tiempo:
Función tiem o Parámetro
Figure imgf000119_0002
Tanto la columna izquierda como la derecha se ajustaron a 75.00°C. La señal UV se midió a una longitud de onda de 260 nm. El porcentaje que quedaba de cada cadena se calculó usando la siguiente ecuación:
% Cadena restante = 100*(Área del picocadena 24 h/Área del picoCadena 0 h*(Área del picoreferencia 24 h/Área del picoreferencia 0 h)).
Los resultados de los ensayos de estabilidad de tritosomas de veinticuatro horas se proporcionan en la Tabla 10 y los resultados de los ensayos de estabilidad del citosol de veinticuatro horas se proporcionan en la Tabla 11.
Tabla 10. Ensayos de estabilidad de tritosomas de veinticuatro horas.
Figure imgf000119_0003
Tabla 11. Ensayos de estabilidad de citosol de veinticuatro horas.
Figure imgf000119_0004
Ejemplo 4. Síntesis y selección de dúplex de ARNip adicionales
Se diseñaron y sintetizaron moléculas de ARNi adicionales que se dirigen al genoma de1HBV como se ha descrito antes. En la Tabla 12 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena antiparalela y paralela de HBV no modificadas adicionales y en la Tabla 13 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela de HBV modificadas.
>CD X
■0o _OQ oc < 0 -o co0"O
"OO E
o 0 0 2 cQo _ 0 _ 0 _ 0 20Q _
0"O0O 0"O 0 O
O0 C0
_ 0 _Q 0
Figure imgf000121_0001
Figure imgf000122_0001
Se llevó a cabo una selección primaria de dosis única de estos dúplex de ARNi usando el ensayo de luciferasa Dual-Glo®, como se ha descrito antes. Los resultados de esta selección en células Cos7 transfectadas con los ARNi de HBV indicados se muestran en la Tabla 14. Los datos se expresan como porcentaje del ARNm restante en relación con el control negativo a las 24 horas.
Tabla 14. Selección primaria de dosis única de HBV en células Cos7 usando el ensayo Dual-Glo Luciferase®
Figure imgf000123_0001
Estos dúplex también se ensayaron para determinar la respuesta a la dosis para silenciar el ARN viral usando el ensayo Dual-Glo® Luciferase, como se ha descrito antes. Las dosis de los dúplex usadas para estos ensayos eran 50 nM, 8.333333333 nM, 1.388888889 nM, 0.231481481 nM, 0.038580247 nM, 0.006430041 nM, 0.001071674 nM, 0.000178612 nM, 2.97687 x 10-5nM, 4.96145 x 10-6 nM, 8.26909 x 10-7 nM, y 1.37818E x 10-7 nM, que representan una dilución 1 a 6 de los dúplex empezando en 50 nm en 12 dosis. Los resultados de esta selección en células cos7 transfectadas con los ARNi de HBV indicados se muestran en la tabla 15. Los datos se expresan como porcentaje de ARNm que queda con respecto al control negativo a las 24 horas.
Tabla 15. Selección de respuesta a la dosis en células Cos7 usando el ensayo de Dual-Glo Luciferase®
Figure imgf000123_0002
1 Medias de 5-7 repeticiones biológicas realizadas por triplicado
ND - No determinado
La eficacia in vitro y la potencia de estos dúplex también se analizaron. En particular, se determinó la respuesta a la dosis de los dúplex para silenciar el ARN viral en lisados de células HepG2.2.15 y Hep3B transfectadas y para silenciar HBsAg en líquidos sobrenadantes de células HepG2.2.15. Las células se transfectaron con 12 dosis separadas de los dúplex en el intervalo de 50 nM a 1x10'7 nM y a las setenta y dos horas después de la transfección, se determinó el nivel de ARN viral usando pares de cebador/sonda para detectar el ORF P y/o el ORF S. El nivel de HBsAg se determinó usando un ensayo ELISA.
Los resultados del silenciamiento del ARN viral del ORF P en células HepG2.2.15 usando los dúplex indicados se proporcionan en la Tabla 16. Los resultados del silenciamiento del ARN viral del ORF S en células HepG2.2.15 usando los dúplex indicados se proporcionan en la Tabla 17. Los resultados del silenciamiento de HBsAg en células HepG2.2.15 se proporcionan en la Tabla 18.
Los resultados del silenciamiento del ARN viral del ORF P en células Hep3B usando los dúplex indicados se proporcionan en la Tabla 19.
Tabla 16. Selección de respuesta a la dosis en células HepG2.2.15
Figure imgf000124_0001
ND - No determinado
Tabla 17. Selección de respuesta a la dosis en células HepG2.2.15
Figure imgf000124_0002
ND - No determinado
Tabla 18. Selección de respuesta a la dosis en células HepG2.2.15
Figure imgf000124_0003
ND - No determinado
Tabla 19. Selección de respuesta a la dosis en células Hep3B
Figure imgf000125_0001
ND- no determinado
También se ensayó en estos dúplex la estabilidad in vitro usando dos ensayos, un ensayo de estabilidad en tritosomas y un ensayo de estabilidad en citosol, como se ha descrito antes. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en la tabla 20.
Tabla 20. Ensayos de estabilidad en tritosomas y citosol de veinticuatro horas
Figure imgf000125_0002
También se llevaron a cabo selecciones de respuesta a la dosis de diferentes combinaciones de estos dúplex en células HepG2.215. Las dosis de los dúplex usadas para estos ensayos eran 50 nM, 8.333333333 nM, 1.388888889 nM, 0.231481481 nM, 0.038580247 nM, 0.006430041 nM, 0.001071674 nM, 0.000178612 nM, 2.97687 x 10-5 nM, 4.96145 x 10-6nM, 8.26909 x 10-7 nM, y 1.37818E x 10-7 nM, lo que representa una dilución de 1 a 6 de los dúplex empezando en 50 nM en 12 dosis. Setenta y dos horas después de transfección de estos dúplex, se determinaron el nivel de ARN viral (ORF P y ORF S) u el nivel de HBsAg secretado, como se ha descrito antes. Los resultados de estos ensayos se proporcionan en la tabla 21.
LO CM
c\i OQ _0 X
c0o '0O 0 (0/) O
< "O/) O
0 0-* 0 (/) 0 ■o >CD X
0 ■o (/) CO
o ■O _ 0 o co 0
0■O 'O o o _ 0 0 C0 CM
_ 0 O0
Figure imgf000126_0001
Ejemplo 5. Síntesis y selección in vitro de dúplex de ARNip adicionales
Se diseñaron y sintetizaron moléculas de ARNi adicionales que se dirigen al ORF X del genoma de1HBV como se ha descrito antes. En la Tabla 22 se muestra una lista detallada de las secuencias adicionales de la cadena paralela y antiparalela del HBV no modificadas. En la Tabla 23 se muestra una lista detallada de las secuencias adicionales de la cadena paralela y antiparalela del HBV modificado.
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000131_0001
Se llevó a cabo una selección de dosis única de estos dúplex en células Cos7 a 1 nm y 50 nm usando el ensayo de Dual-Glo® Luciferase descrito antes. Los resultados de los ensayos se proporcionan en la Tabla 24.
Tabla 24. Selección de una sola dosis de HBV usando el ensayo Luciferase® Dual-Glo
Figure imgf000132_0001
Basándose en estos ensayos, los agentes de ARNi que se dirigen a cinco sitios en el ORF X de HBV (nucleótidos 1551, 1577, 1580, 1806 y 1812 del número de acceso en GenBank NC_003977.1 se seleccionaron para la optimización del guiado y se diseñaron y sintetizaron agentes adicionales. Estos agentes adicionales se evalúan en ensayos in vitro como se ha descrito antes. En la Tabla 25 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela no modificadas adicionales que se dirige al ORF X de HBV. En la tabla 26 se muestra una lista detallada de las secuencias de la cadena paralela y antiparalela modificadas adicionales que se dirigen al ORF X de HBV.
También se evaluó la eficacia in vivo de estos agentes de ARNi usando un modelo de ratón de AAV-HBV (véase, p. ej., Yang, et al. (2014) Cell and Mol Immunol 11:71). Este modelo de ratón exhibe viremia de HBV sostenida después de infección con un virus recombinante adenoasociado (AAV) que porta un genoma de HBV replicable. La expresión hepática del gen del HBV en estos ratones imita la infección por HBV en seres humanos y estos ratones presentan inflamación hepática y daño hepático significativos, que se pone de manifiesto por el aumento de los niveles de ALT, fibrosis y esteatosis.
A estos ratones con AAV-HBV se les administró por vía subcutánea una dosis única de 3 mg/kg de AD-66808, AD-66809, AD-66810, AD-66811, AD-66812, AD-66813, AD-66814, AD-66815, AD- 66816 y AD-66817 y se determinó el nivel de HBsAg en el suero de los animales antes de la dosis y en día 14/15 después de la dosis. Los resultados de estos experimentos se proporcionan en la figura 2 y la Tabla 27 y demuestran que los niveles en el suero de HBsAg disminuyen después de una sola administración de estos agentes. La Tabla 27 también proporciona los resultados de una selección de dosis única en células Cos7 transfectadas con los ARNi de HBV indicados usando el ensayo de Luciferasa Dual-Glo®, como se ha descrito antes, para los mismos agentes de ARNi. Los datos se expresan como porcentaje de ARNm restante en relación con el control negativo a las 24 horas.
Figure imgf000134_0001

Figure imgf000135_0001
Tabla 27
Figure imgf000136_0001
1Número de ARN virales silenciados
Ejemplo 6. Selección in vivo de dúplex de ARNip
Se evaluó en un subconjunto de agentes de ARNi candidatos la eficacia in vivo usando el modelo de ratón de AAV-HBV descrito antes. A los ratones con AAV-HBV se les administró una dosis única de 3 mg/kg de AD-66019, AD-65375, AD-65047, AD-65377, AD-66111, AD-65421 o AD-66110 y se determinó el nivel de HBsAg en el suero de los animales antes de la dosis, y en los días 5 y 10 después de la dosis. Como control, a los ratones con AAV-HBV se les administró una dosis de 3 mg/kg de un ARNbc que se dirige a transteritina de ratón/rata (mrTTR). Los resultados de estos experimentos se representan en la figura 3 y demuestran que los niveles séricos de HBsAg disminuyen después de una sola administración de estos agentes.
La Figura 4 es un gráfico que representa el porcentaje de HBsAg predosis que queda los días 5 y 10 que también se determinó en estos animales después de la administración de una dosis única de 3 mg/kg. Los resultados de estos experimentos se representan en la Figura 4. La Figura 4 también representa el porcentaje de HBsAG restante el día 10 después de la dosis en relación con el porcentaje de HBsAG restante el día 10 después de la dosis en un animal al que se le administró 3 mg/kg de un ARNbc de control que se dirige a la transteritina de ratón/rata (mrTTR).
Basándose, al menos en parte, en los resultados de los ensayos in vitro e in vivo descritos anteriormente, se seleccionaron AD-65403, que silencia 3 ARN del HBV, y AD-66810, que silencia el gen X, como candidatos a fármacos (DC) para uso en monoterapia o en terapia combinada.
La Figura 5 demuestra que, en el modelo de infección por HBV en ratones con AAV-HBV, una dosis única de 3 mg/kg de AD-65403 logra una inactivación génica potente y específica de HBsAg. En particular, una dosis subcutánea única de 3 mg/kg de AD-65403 logra una reducción de hasta 3.9 log10 en los niveles de HBsAg, con una reducción media de HBsAg de 1.8 log105-10 días después de una dosis única.
Las Figuras 6A y 6B demuestran que, en el modelo de infección por HBV en ratones AAV-HBV, una sola dosis subcutánea de 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 9 mg/kg de AD-66810 logra la inactivación génica potente y específica de HBsAg, especialmente en las dosis más altas de AD-66810. El porcentaje de disminución de HBsAg en el suero se muestra en una escala de referencia en la Figura 6A y en una escala de log10 en la Figura 6B. La Figura 7 demuestra que, en el modelo de infección por HBV en ratones AAV-HBV, AD-66810 administrado en tres dosis semanales subcutáneas de 3 mg/kg, logra la inactivación génica potente y específica de HBsAg durante un período de más de 4 meses.
Ejemplo 7. Tratamiento de la infección por HBV con una combinación de agentes que se dirigen a1HBV
Se evalúa la eficacia in vivo de un subconjunto de agentes de ARNi de la invención usando el modelo de ratón con AAV-HBV descrito antes. A los ratones con AAV-HBV se les administra una o más dosis de AD-65403 y AD-66810, ya sea solos o combinados entre sí. Las pautas posológicas de ejemplo incluyen una dosis única de ARNi total de 3 mg/kg de AD-65403, AD-66810, o una combinación de AD-65403 y AD-66810 (es decir, 1.5 mg/kg de cada agente de ARNi para un total de 3 mg/kg de ARNi administrado como una mezcla o como dos dosis separadas); o una dosis única de 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, o 9 mg/kg de dosis total de agente de ARNi de AD-65403, AD-66810, o una combinación de AD-65403 y AD-66810. Los regímenes multidosis de ejemplo incluyen, por ejemplo, tres dosis semanales, una por semana usando cualquiera de los niveles de dosificación proporcionados en los regímenes de dosis única de ejemplo. Un agente de ARNi de control adecuado también se administra como un control como es habitual en la técnica.
El nivel de HBsAg se determina en el suero de los animales antes de la dosis, y a intervalos predeterminados después de la dosis, p. ej., cada cinco días después de la dosis hasta que el nivel de HBsAg vuelva al valor base para todos los animales. La administración de AD-65403, AD-66810 o una combinación de AD-65403 y AD-66810 da como resultado una inactivación génica sostenida y específica de HBsAg en el suero.
Ejemplo 8. Tratamiento de la infección por HDV con agentes de ARNi que se dirigen al virus de la hepatitis B
El virus de la hepatitis Delta (HDV) es un virus de ARN defectuoso que requiere la ayuda de1HBV para su replicación y ensamblaje de nuevos viriones. Por lo tanto, el HDV solo es infeccioso en presencia de infección activa por HBV. El genoma del HDV contiene solo un marco de lectura abierto transcrito activamente que codifica dos isoformas de antígeno de hepatitis delta. Las modificaciones postraduccionales de los antígenos delta pequeño y grande (S-HDAg y L-HDAg) que implican fosforilación e isoprenilación, respectivamente, confieren a estos antígenos sus propiedades específicas. El tratamiento eficaz del HBV también mejorará la infección por HDV.
Se conoce un modelo de chimpancé de HDV. Se evalúa la eficacia in vivo de un subconjunto de agentes de ARNi de la invención usando el modelo de HDV de chimpancé u otro modelo adecuado de HDV. Los chimpancés infectados con HDV reciben una o más dosis de AD-65403 y AD-66810, ya sea solas o en combinación entre sí. Los regímenes de dosificación de ejemplo incluyen una dosis única de 3 mg/kg de agente de ARNi total de AD-65403, AD-66810, o una combinación de AD-65403 y AD-66810 (es decir, 1.5 mg/kg de cada agente de ARNi para un total de 3 mg/kg de agente de ARNi administrado como una mezcla o como dos dosis separadas); o una dosis única de 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, o 9 mg/kg de dosis de agente de ARNi total de AD-65403, AD-66810, o una combinación de AD-65403 y AD-66810. Los regímenes de multidosis de ejemplo incluyen, por ejemplo, tres dosis semanales, una por semana usando cualquiera de los niveles de dosificación proporcionados en los regímenes de dosis única de ejemplo. También se administra un ARNi de control adecuado como control, como es habitual en la técnica.
El nivel de uno o más de ARN de S-HDAg, L-HDAg y HDV, opcionalmente en combinación con HBsAg, se determina en el suero de los animales antes de la dosis y a intervalos predeterminados después de la dosis, p. ej., cada cinco días para controlar los niveles de antígeno o ARN. La administración de AD-65403, AD-66810, o una combinación de AD-65403 y AD-66810 da como resultado una inactivación génica sostenida y específica de HBsAg en el suero que da como resultado la mejora de HDV como se demuestra, por ejemplo, por una disminución estadísticamente significativa en uno o más de ARN de S-HDAg, L-HDAg y HDV. Estos resultados demuestran que la administración de uno de o tanto de AD-65403 como AD-66810 es eficaz en el tratamiento de1HDV.

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Un agente de ARNi bicatenario para inhibir la expresión del virus de la hepatitis B (HBV) en una célula, en donde dicho agente de ARNi bicatenario comprende una cadena paralela y una cadena antiparalela que forman una región de doble cadena,
en donde dicha cadena paralela comprende 5-GUGUGCACUUCGCUUCACA -3' (SEQ ID NO: 39), y dicha cadena antiparalela comprende 5-UGUGAAGCGAAGUGCACACUU -3' (SEQ ID NO: 40),
en donde sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y sustancialmente todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela son nucleótidos modificados,
en donde dicha cadena paralela se conjuga con un ligando unido al extremo 3', y
en donde el ligando es uno o más derivados de GalNAc unido por un conector ramificado bivalente o trivalente.
2. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 1, en donde todos los nucleótidos de dicha cadena paralela y todos los nucleótidos de dicha cadena antiparalela comprenden una modificación.
3. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 1 o 2, en donde al menos uno de dichos nucleótidos modificados se selecciona del grupo que consiste en un desoxinucleótido, un nucleótido desoxitimina 3'-terminal (dT), un nucleótido modificado con 2'-O-metilo, un nucleótido modificado con 2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido bloqueado, un nucleótido desbloqueado, un nucleótido restringido conformacionalmente, un nucleótido de etilo restringido, un nucleótido abásico, un nucleótido modificado con 2'-amino, un nucleótido modificado con 2'-O-alilo, nucleótido modificado con 2'-C-alquilo, un nucleótido modificado con 2'-metoxietilo, un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, un nucleótido que comprende una base no natural, un nucleótido modificado con tetrahidropirano, un nucleótido modificado con 1,5-anhidrohexitol, un nucleótido modificado con ciclohexenilo, un nucleótido que comprende un grupo fosforotioato, un nucleótido que comprende un grupo metilfosfonato, un nucleótido que comprende un 5'-fosfato y un nucleótido que comprende un imitador de 5'-fosfato.
4. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 3, en donde el imitador de 5'-fosfato es un 5'-vinil-fosfato (5'-VP).
5. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 1, en donde la cadena paralela comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucaca-3' (SEQ ID NO: 41) y la cadena antiparalela comprende 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO: 42), en donde a, g, c, y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, 2'-OMe G, 2'-OMe C, y 2'-OMe U, respectivamente; Af, Cf, Gf, y Uf son 2'-fluoro A, 2'-fluoro C, 2'-fluoro G, y 2'-fluoro U, respectivamente; y s es un conector fosforotioato.
6. El agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ligando es
Figure imgf000397_0001
7. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 6, en donde el agente de ARNi está conjugado con el ligando como se muestra en el siguiente esquema
Figure imgf000398_0001
en donde X es O S.
8. El agente de ARNi bicatenario de la reivindicación 1, en donde la cadena paralela comprende 5'-gsusguGfcAfCfUfucgcuucacaL96-3' (SEQ ID NO: 1275) y la cadena antiparalela comprende 5'-usGfsugaAfgCfGfaaguGfcAfcacsusu-3' (SEQ ID NO: 1285), en donde a, g, c y u son 2'-O-metilo (2'-OMe) A, 2'-OMe G, 2'-OMe C, y 2'-OMe U, respectivamente; Af, Cf, Gf, y Uf son 2'-fluoro A, 2'-fluoro C, 2'-fluoro G, y 2'-fluoro U, respectivamente; s es un conector fosforotioato; y L96 es N-[tris(GalNAc-alquil)-amidodecanoil)]-4-hidroxiprolinol.
9. Una célula que contiene el agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Una composición farmacéutica que comprende (a) el agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y (b) una solución no tamponada o una solución tamponada.
11. Un método in vitro de inhibición de la expresión génica del virus de la hepatitis B (HBV) o inhibición de la replicación de un HBV en una célula, comprendiendo el método:
(a) poner en contacto la célula con el agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10; y
(b) mantener la célula producida en la etapa (a) durante un tiempo suficiente para obtener degradación del transcrito de ARNm de un gen del HBV, inhibiendo así la expresión o inhibiendo la replicación del gen de1HBV en la célula.
12. El método de la reivindicación 11, en donde la expresión génica del HBV o replicación de1HBV es inhibida en al menos aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 98% o aproximadamente 100%.
13. Un agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o composición farmacéutica de la reivindicación 10, para usar en un método de reducción de la carga viral del virus de la hepatitis B (HBV) en un sujeto infectado por el HBV.
14. Un agente de ARNi bicatenario de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o composición farmacéutica de la reivindicación 10 para usar en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una infección por el virus de la hepatitis B (HBV).
15. El agente de ARNi bicatenario para el uso de la reivindicación 13 o 14, en donde el sujeto es un ser humano.
16. El agente de ARNi bicatenario para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el agente de ARNi bicatenario es para administrar al sujeto en una dosis basada en peso de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o de aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg; una dosis basada en peso de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg; una dosis basada en peso de aproximadamente 3 mg/kg; una dosis basada en peso de aproximadamente 10 mg/kg; o una dosis fija de aproximadamente 50 mg a 200 mg.
17. El agente de ARNi bicatenario para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en donde el agente de ARNi bicatenario es para administrar por vía subcutánea o intravenosa.
18. El agente de ARNi bicatenario para usar según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en donde el agente de ARNi bicatenario es para administrar con un agente terapéutico adicional.
19. El agente de ARNi bicatenario para usar según la reivindicación 18, en donde el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en un agente antiviral, un inhibidor de transcriptasa inversa, un inmunoestimulador, una vacuna terapéutica, un inhibidor de la entrada de virus, un oligonucleótido que inhibe la secreción o liberación de HbsAg, un inhibidor de la cápside, un inhibidor de ADN de HBV circular covalentemente cerrado (ccc) y una combinación de cualquiera de los anteriores.
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JP (5) JP6728163B2 (es)
KR (3) KR102545316B1 (es)
CN (4) CN108064293A (es)
AU (4) AU2015346566B2 (es)
BR (2) BR122021001218B1 (es)
CA (2) CA3233743A1 (es)
CY (1) CY1122520T1 (es)
DK (1) DK3218489T3 (es)
ES (1) ES2761912T3 (es)
HK (1) HK1255502A1 (es)
HR (1) HRP20192177T1 (es)
HU (1) HUE047535T2 (es)
JO (2) JOP20200092A1 (es)
MA (2) MA40851A (es)
MX (2) MX2017005958A (es)
PL (1) PL3218489T3 (es)
PT (1) PT3218489T (es)
SG (3) SG11201703638XA (es)
SI (1) SI3218489T1 (es)
TW (4) TWI710633B (es)
WO (2) WO2016077321A1 (es)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
KR102434357B1 (ko) 2011-06-30 2022-08-18 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
EP3332007A4 (en) 2015-08-07 2019-07-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE THERAPY FOR HEPATITIS B VIRUS INFECTION
US10478503B2 (en) 2016-01-31 2019-11-19 University Of Massachusetts Branched oligonucleotides
MA45478A (fr) 2016-04-11 2019-02-20 Arbutus Biopharma Corp Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés
JOP20170161A1 (ar) * 2016-08-04 2019-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi للعدوى بفيروس التهاب الكبد ب
CN107703197B (zh) * 2016-08-08 2020-01-17 西南医科大学附属中医医院 一种快速检测乙肝环状dna的方法
CA3037042A1 (en) * 2016-09-14 2018-03-22 Janssen Biopharma, Inc. Modified oligonucleotides and methods of use
CA3043637A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide targeting strategy for hbv cccdna
EP4035659A1 (en) 2016-11-29 2022-08-03 PureTech LYT, Inc. Exosomes for delivery of therapeutic agents
CN118460536A (zh) * 2017-04-11 2024-08-09 阿布特斯生物制药公司 靶向组合物
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
KR20200015895A (ko) 2017-04-18 2020-02-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 (hbv)에 감염된 대상체의 치료 방법
JP2020516673A (ja) * 2017-04-18 2020-06-11 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｂｖ）感染を有する対象を処置する方法
AR111908A1 (es) * 2017-05-31 2019-08-28 Arbutus Biopharma Corp Composiciones terapéuticas y métodos de tratamiento de hepatitis b
JP7406793B2 (ja) 2017-06-23 2023-12-28 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ ２テイル自己デリバリー型ｓｉＲＮＡおよび関連方法
AU2018332216B2 (en) * 2017-09-14 2024-05-02 Janssen Biopharma, Inc. Galnac derivatives
CN118185936A (zh) 2017-10-20 2024-06-14 戴瑟纳制药公司 治疗乙型肝炎感染的方法
CN118236391A (zh) * 2017-12-01 2024-06-25 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN110997917B (zh) 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
AU2018374219C1 (en) * 2017-12-01 2023-05-11 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method therefor and use thereof
JP7273417B2 (ja) 2017-12-01 2023-05-15 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
CN110945130B (zh) 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
CN116375774A (zh) * 2017-12-29 2023-07-04 苏州瑞博生物技术股份有限公司 缀合物及其制备方法和用途
MA52661A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Centre Leon Berard Utilisation d'inhibiteurs de fubp1 dans le traitement d'une infection par le virus de l'hépatite b
CN108588097B (zh) * 2018-04-28 2021-07-13 北京锦篮基因科技有限公司 改造后的hbv基因组和相关组合物及其应用
CA3098623A1 (en) 2018-05-07 2019-11-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Extrahepatic delivery
EA202190528A1 (ru) * 2018-08-13 2021-04-23 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ АГЕНТОВ дцРНК ВИРУСА ГЕПАТИТА B (HBV) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
WO2020038377A1 (zh) 2018-08-21 2020-02-27 苏州瑞博生物技术有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
US11279930B2 (en) * 2018-08-23 2022-03-22 University Of Massachusetts O-methyl rich fully stabilized oligonucleotides
CN111655297A (zh) 2018-09-30 2020-09-11 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
AU2019370561A1 (en) * 2018-11-02 2021-06-17 Arbutus Biopharma Corporation Bivalent targeted conjugates
US20210388356A1 (en) * 2018-11-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double stranded oligonucleotide
EA202191736A1 (ru) 2018-12-20 2021-10-01 Вир Байотекнолоджи, Инк. Комбинированная терапия hbv
CN111378656B (zh) * 2018-12-28 2022-07-26 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种抑制埃博拉病毒的核酸、含有该核酸的药物组合物及其用途
CN111377985B (zh) * 2018-12-29 2023-11-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 化合物和缀合物及其制备方法和用途
CN109979531B (zh) * 2019-03-29 2021-08-31 北京市商汤科技开发有限公司 一种基因变异识别方法、装置和存储介质
BR112021022806A2 (pt) * 2019-05-13 2022-01-25 Vir Biotechnology Inc Método para tratar a infecção crônica por hbv, sirna, usos de um sirna, e de um sirna e peg-ifna e de um sirna, peg-ifna e um nrti, método, composição para uso ou uso e kit
JP2022533421A (ja) * 2019-05-22 2022-07-22 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、薬物組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
CN111973618B (zh) * 2019-05-23 2024-02-02 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与siRNA缀合物及制备方法和用途
CN110218728A (zh) 2019-06-28 2019-09-10 厦门甘宝利生物医药有限公司 一种新化合物及其应用
CN114502730A (zh) 2019-08-09 2022-05-13 马萨诸塞大学 经化学修饰的靶向snp的寡核苷酸
WO2021107097A1 (ja) * 2019-11-28 2021-06-03 株式会社ボナック Ｂ型肝炎治療用核酸分子
WO2021130270A1 (en) 2019-12-24 2021-07-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical combination of antiviral agents targeting hbv and/or an immune modulator for treatment of hbv
JP2023509870A (ja) 2019-12-24 2023-03-10 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー Ｈｂｖの処置のためのｈｂｖを標的とする治療用オリゴヌクレオチドとｔｌｒ７アゴニストとの医薬組合せ
US20230250125A1 (en) 2020-04-01 2023-08-10 Janssen Biopharma, Inc. Nucleic acid polymers
WO2021249352A1 (zh) 2020-06-10 2021-12-16 正大天晴药业集团股份有限公司 双链siRNA类似物的缀合物
WO2021249484A1 (zh) * 2020-06-10 2021-12-16 南京明德新药研发有限公司 缀合基团及其缀合物
JP2023528966A (ja) * 2020-06-11 2023-07-06 チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド 二本鎖ｓｉＲＮＡ類似体のコンジュゲート
AU2021297475A1 (en) * 2020-06-22 2023-01-05 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of Hepatitis D Virus infection
EP4171747A1 (en) 2020-06-24 2023-05-03 VIR Biotechnology, Inc. Engineered hepatitis b virus neutralizing antibodies and uses thereof
WO2022088342A1 (zh) * 2020-10-28 2022-05-05 苏州吉玛基因股份有限公司 一种靶向FOXP3基因的siRNA及其修饰方法
CN114621951A (zh) * 2020-12-10 2022-06-14 施能康生物科技有限公司 靶向乙肝病毒的核酸及其用途
EP4265724A1 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 OliX Pharmaceuticals, Inc. Rnai agent for inhibiting hbv expression and use thereof
CN114763367B (zh) * 2021-01-14 2024-08-06 施能康生物科技有限公司 化合物、缀合物及其用途
WO2022189861A1 (en) 2021-03-08 2022-09-15 Tollys Carbohydrate conjugates of tlr3 ligands and uses thereof
CN117836006A (zh) * 2021-08-04 2024-04-05 和博医药有限公司 用于递送治疗活性剂的配体缀合物
AU2022384619A1 (en) 2021-11-11 2024-04-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Pharmaceutical combinations for treatment of hbv
AU2022395876A1 (en) * 2021-11-29 2024-05-09 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. Composition and method for inhibiting expression of hepatitis b virus (hbv) protein
WO2023246750A1 (zh) * 2022-06-21 2023-12-28 正大天晴药业集团股份有限公司 用于抑制乙型肝炎病毒的双链核糖核酸

Family Cites Families (352)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US564562A (en) 1896-07-21 Joseph p
US513030A (en) 1894-01-16 Machine for waxing or coating paper
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
EP0366685B1 (en) 1987-06-24 1994-10-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
DE69033495T2 (de) 1989-10-24 2000-07-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modifizierte nukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5629153A (en) 1990-01-10 1997-05-13 Chiron Corporation Use of DNA-dependent RNA polymerase transcripts as reporter molecules for signal amplification in nucleic acid hybridization assays
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5610050A (en) 1990-04-20 1997-03-11 The General Hospital Corporation Methods of preventing viral replication
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
EP0535096A4 (en) 1990-06-18 1993-07-14 Us Commerce Eukaryotic expression vector system
US5981276A (en) 1990-06-20 1999-11-09 Dana-Farber Cancer Institute Vectors containing HIV packaging sequences, packaging defective HIV vectors, and uses thereof
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
JPH06502300A (ja) 1990-08-03 1994-03-17 サノフィ 遺伝子発現の抑制のための化合物及び方法
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
ATE317848T1 (de) 1991-12-24 2006-03-15 Isis Pharmaceuticals Inc Unterbrochene 2'-modifizierte oligonukleotide
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US20030206887A1 (en) 1992-05-14 2003-11-06 David Morrissey RNA interference mediated inhibition of hepatitis B virus (HBV) using short interfering nucleic acid (siNA)
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
IL105914A0 (en) 1992-06-04 1993-10-20 Univ California Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1994000569A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Genpharm International, Inc. Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
JPH07509133A (ja) 1992-07-17 1995-10-12 リボザイム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 動物疾患の処置のための方法および剤
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
EP0905253A3 (en) 1992-12-03 2000-11-02 Genzyme Corporation Adenoviral vector deleted of all E4-ORF except ORF6
US5478745A (en) 1992-12-04 1995-12-26 University Of Pittsburgh Recombinant viral vector system
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
AU6044994A (en) 1993-02-19 1994-09-14 Nippon Shinyaku Co. Ltd. Glycerol derivative, device and pharmaceutical composition
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
JPH08508492A (ja) 1993-03-30 1996-09-10 スターリング ウィンスロップ インコーポレイティド 非環式ヌクレオシド類似体及びそれらを含むオリゴヌクレオチド配列
DE69407032T2 (de) 1993-03-31 1998-07-02 Sanofi Sa Oligonucleotide mit amidverkettungen die phosphoesterverkettungen einsetzen
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
AU678085B2 (en) 1993-11-16 1997-05-15 Genta Incorporated Synthetic oligomers having chirally pure phosphonate internucleosidyl linkages mixed with non-phosphonate internucleosidyl linkages
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
WO1995027788A1 (fr) 1994-04-11 1995-10-19 Dainabot Co., Ltd. Polypeptide derive d'une variante du virus de l'hepatite b, gene le codant et adn associe
WO2000022114A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
EP0759979A4 (en) 1994-05-10 1999-10-20 Gen Hospital Corp ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES INHIBITION OF HEPATITIS C VIRUS
JPH07303485A (ja) 1994-05-13 1995-11-21 Tonen Corp Ｈｃｖアンチセンスｒｎａ、それを含む発現ベクター、及び該ｒｎａ又は発現ベクターを含むｈｃｖ関連疾患治療剤
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5646262A (en) 1994-07-28 1997-07-08 Georgetown University Antisense oligonucleotides against hepatitis B viral replication
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5665557A (en) 1994-11-14 1997-09-09 Systemix, Inc. Method of purifying a population of cells enriched for hematopoietic stem cells populations of cells obtained thereby and methods of use thereof
US5571026A (en) 1994-12-09 1996-11-05 Kcs Industries, Inc. Flat mount electrode socket
JP3269301B2 (ja) 1994-12-28 2002-03-25 豊田合成株式会社 ガラスラン用ゴム配合物
US6057153A (en) 1995-01-13 2000-05-02 Yale University Stabilized external guide sequences
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
AU5359496A (en) 1995-03-06 1996-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Improved process for the synthesis of 2'-o-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
EP0833613A1 (en) 1995-05-26 1998-04-08 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
EP1489184A1 (en) 1995-06-07 2004-12-22 Inex Pharmaceutical Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
EP0857217B1 (en) 1995-10-16 2005-04-13 Dana-Farber Cancer Institute Novel expression vectors and methods of use
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
CA2238379A1 (en) 1995-11-22 1997-06-12 The Johns-Hopkins University Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US5998203A (en) 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US5843770A (en) 1996-03-11 1998-12-01 The Immune Response Corporation Antisense constructs directed against viral post-transcriptional regulatory sequences
US5877162A (en) 1996-03-14 1999-03-02 Innovir Laboratories, Inc. Short external guide sequences
EP0957107B1 (en) 1996-05-16 2004-07-21 Nissin Food Products Co., Ltd. Novel compounds having antiviral activity
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6610478B1 (en) 1996-08-16 2003-08-26 Yale University Phenotypic conversion of cells mediated by external guide sequences
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
AUPO434196A0 (en) 1996-12-24 1997-01-23 Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The An improved therapeutic
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
DE19725803C1 (de) 1997-06-18 1999-02-11 Deutsches Krebsforsch HBV-gerichtete Antisense-Nukleinsäuren
CA2294988C (en) 1997-07-01 2015-11-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
ATE293123T1 (de) 1997-09-12 2005-04-15 Exiqon As Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
EP1019065A4 (en) 1997-09-17 2002-02-20 Univ East Carolina VARIETY OF TARGETED, HYBRIDIZING NUCLEIC ACIDS, THEIR SYNTHESIS, COMPOSITION, FORMULATION, KITS AND APPLICATION
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
JP2002510464A (ja) 1998-01-27 2002-04-09 サイトセル・リミテッド Ｒｎａプロモーターからのインビトロ転写を伴う核酸標的配列の検出方法
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
IL123998A (en) 1998-04-08 2004-09-27 Galmed Int Ltd Conjugates of bile salts and pharmaceutical preparations containing them
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
AU747597B2 (en) 1998-07-20 2002-05-16 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
BR9914772A (pt) 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
EP1147204A1 (en) 1999-01-28 2001-10-24 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
AU3243300A (en) 1999-02-23 2000-09-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7601494B2 (en) 1999-03-17 2009-10-13 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method of screening candidate compounds for susceptibility to biliary excretion
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
AU776362B2 (en) 1999-05-04 2004-09-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S L-ribo-LNA analogues
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
EP1238061A2 (en) 1999-11-24 2002-09-11 Pharmasset, Ltd. A new genotype of hepatitis b virus
WO2001040279A2 (en) 1999-12-03 2001-06-07 Innogenetics N.V. Hbv sequences
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
WO2002081628A2 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
US7833992B2 (en) 2001-05-18 2010-11-16 Merck Sharpe & Dohme Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
WO2001075164A2 (en) 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US6573048B1 (en) 2000-04-18 2003-06-03 Naxcor Degradable nucleic acid probes and nucleic acid detection methods
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
US7439016B1 (en) 2000-06-15 2008-10-21 Digene Corporation Detection of nucleic acids by type-specific hybrid capture method
US6680059B2 (en) 2000-08-29 2004-01-20 Tripep Ab Vaccines containing ribavirin and methods of use thereof
US6998484B2 (en) 2000-10-04 2006-02-14 Santaris Pharma A/S Synthesis of purine locked nucleic acid analogues
DK2813582T3 (en) 2000-12-01 2017-07-31 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wss E V Small RNA molecules that mediate RNA interference
CA2431839A1 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Paul O. P. Ts'o Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
US20030087855A1 (en) 2001-09-13 2003-05-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of protein kinase R expression
AU2002250254A1 (en) 2001-03-09 2002-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2002085908A1 (en) 2001-04-24 2002-10-31 Purdue Research Foundation Folate mimetics and folate-receptor binding conjugates thereof
JP2002335968A (ja) 2001-05-16 2002-11-26 Kokuritsu Iyakuhin Shokuhin Eisei Kenkyusho 新規転写因子、その遺伝子及びその結合ｄｎａ配列
JP4358521B2 (ja) 2001-05-18 2009-11-04 サーナ・セラピューティクス・インコーポレイテッド 細胞デリバリーのためのコンジュゲートおよび組成物
US7109165B2 (en) 2001-05-18 2006-09-19 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
WO2002096926A1 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Duke University Modulators of pharmacological agents
JP4210737B2 (ja) 2001-07-12 2009-01-21 ユニバーシティー オブ マサチューセッツ 遺伝子サイレンシングを仲介する低分子干渉リボ核酸のインビボにおける製造方法
WO2003008628A2 (en) 2001-07-20 2003-01-30 Ribozyme Pharmacuticals, Inc. Enzymatic nucleic acid peptide conjugates
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
DE10163098B4 (de) 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
WO2003050308A1 (en) 2001-12-06 2003-06-19 The Aaron Diamond Aids Research Center Highly-sensitive genomic assays employing chimeric bacteriophage standards
EP1432724A4 (en) 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
US9657294B2 (en) 2002-02-20 2017-05-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
ES2325660T3 (es) 2002-03-27 2009-09-11 Aegera Therapeutics Inc. Oligomeros nucleobasicos de iap no codificantes y usos de los mismos.
AU2003254334A1 (en) 2002-07-10 2004-02-02 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Rna-interference by single-stranded rna molecules
US20050239728A1 (en) 2002-07-31 2005-10-27 Pachuk Catherine J Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
DK1527176T4 (en) 2002-08-05 2017-07-03 Silence Therapeutics Gmbh ADDITIONAL NEW FORMS OF INTERFERRING RNA MOLECULES
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
CA2498772A1 (en) 2002-09-11 2004-03-25 Santaris Pharma A/S Modified pna molecules
EP1556402B1 (en) 2002-09-25 2011-06-22 University of Massachusetts In vivo gene silencing by chemically modified and stable sirna
EP1578765A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS CONTAINING SUGAR SUBSTITUTE AND COMPOSITIONS FOR USE IN GENE MODULATION
US9150605B2 (en) 2002-11-05 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2′-modified nucleosides for use in gene modulation
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US8090542B2 (en) 2002-11-14 2012-01-03 Dharmacon Inc. Functional and hyperfunctional siRNA
EP2298886A3 (en) 2002-11-22 2011-12-14 Bio-Think Tank Co., Ltd. Method for searching target base sequence of RNA interference, method for designing base sequence of polynucleotide for causing RNA interference, method for producing double-stranded polynucleotide, method for inhibiting gene expression, base sequence processing apparatus, program for running base sequence processing method on computer, recording medium, and base sequence processing system
WO2004063375A1 (en) 2003-01-15 2004-07-29 Hans Prydz OPTIMIZING siRNA BY RNAi ANTISENSE
JP4545091B2 (ja) 2003-01-24 2010-09-15 財団法人 東京都医学研究機構 Ｃ型肝炎ウイルスの働きを阻害するオリゴリボヌクレオチドまたはペプチド核酸
CN1257284C (zh) 2003-03-05 2006-05-24 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法
US8110674B2 (en) 2003-03-07 2012-02-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
JP2006522158A (ja) 2003-04-03 2006-09-28 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ｉＲＮＡ複合体
EP2669377A3 (en) 2003-04-17 2015-10-14 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US20070027099A1 (en) * 2003-05-19 2007-02-01 Lin Marie C Gene therapy of HBV infection via adeno-associated viral vector mediated long term expression of small hairpin RNA (shRNA)
US7067249B2 (en) * 2003-05-19 2006-06-27 The University Of Hong Kong Inhibition of hepatitis B virus (HBV) replication by RNA interference
SG173218A1 (en) 2003-06-12 2011-08-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
US8575327B2 (en) 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
CN1322898C (zh) 2003-06-17 2007-06-27 杭州新瑞佳生物医药技术开发有限公司 攻击人类乙型肝炎病毒的小干扰RNA分子（SiRNA）及其应用
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
US20100145038A1 (en) 2003-11-24 2010-06-10 Merck & Co., Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
ATE452188T1 (de) 2004-02-10 2010-01-15 Sirna Therapeutics Inc Rna-interferenz-vermittelte hemmung der genexpression unter verwendung multifunktioneller sina (short interfering nucleic acid)
JP4584986B2 (ja) 2004-04-27 2010-11-24 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド ２−アリールプロピル部分を含む１本鎖及び２本鎖オリゴヌクレオチド
CA2501422C (en) * 2004-04-29 2014-08-12 University Of Rochester Lymphoid chemokines in the diagnosis, monitoring and treatment of autoimmune disease
WO2006020768A2 (en) 2004-08-10 2006-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
DE602005024015D1 (de) 2004-08-23 2010-11-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc Expressionskonstrukte mit mehreren rna-polymerase-iii-promotoren
CN100494214C (zh) * 2004-12-07 2009-06-03 浙江大学 乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法
EP2316942B1 (en) 2004-12-22 2021-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved hbv and hcv sequences useful for gene silencing
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
EP2360249A1 (en) 2005-03-31 2011-08-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
KR20080036650A (ko) 2005-08-17 2008-04-28 시르나 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 Ｒｎａ 간섭을 매개하는 화학적으로 변형된 짧은 간섭 핵산분자
CN101426912A (zh) * 2005-08-17 2009-05-06 瑟纳治疗公司 介导rna干扰的化学修饰短干扰核酸分子
CN101305095B (zh) 2005-09-12 2012-09-26 索马根尼科斯公司 利用小干扰rna抑制病毒基因表达
CN100447243C (zh) 2005-11-15 2008-12-31 中国人民解放军第四军医大学 HBV特异性干涉靶位点基因及其siRNA和其在抗HBV感染中的应用
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
ES2516815T3 (es) 2006-01-27 2014-10-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos modificados en la posición 6
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
ES2564303T3 (es) 2006-04-07 2016-03-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compuestos de ARN inmunomodulador estabilizado (SIMRA) para TLR7 y TLR8
CA2651453C (en) 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
ES2611924T3 (es) 2006-10-03 2017-05-11 Arbutus Biopharma Corporation Formulaciones que contienen lípidos
CA2689042A1 (en) 2007-02-16 2008-08-28 Merck & Co., Inc. Compositions and methods for potentiated activity of biologicaly active molecules
US8748373B2 (en) * 2007-02-21 2014-06-10 Fox Chase Cancer Center Hepatitis B virus compositions and methods of use
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
BRPI0811170B8 (pt) 2007-05-22 2021-05-25 Arcturus Therapeutics Inc oligonucleotídeos de rna e complexos de rna substituídos por hidroximetila
AU2008260277C1 (en) 2007-05-30 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
CN101314047A (zh) * 2007-06-01 2008-12-03 中国科学院微生物研究所 治疗病毒感染的方法及其药物
WO2008154401A2 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
AU2008279509B2 (en) 2007-07-09 2011-07-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Stabilized immune modulatory RNA (SIMRA) compounds
WO2009082607A2 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
NZ588583A (en) 2008-04-15 2012-08-31 Protiva Biotherapeutics Inc Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
CN103275971A (zh) * 2008-06-13 2013-09-04 厦门大学 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点
CN101603042B (zh) * 2008-06-13 2013-05-01 厦门大学 可用于乙型肝炎病毒感染治疗的rna干扰靶点
CN101322847A (zh) 2008-06-23 2008-12-17 淮安市第四人民医院 基于siRNA池干扰的复合载体介导的抗乙肝病毒基因药物
US8034922B2 (en) * 2008-08-22 2011-10-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for modulating activity of capped small RNAs
CN105152939A (zh) 2008-11-10 2015-12-16 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于递送治疗剂的脂质和组合物
SG10201500318SA (en) 2008-12-03 2015-03-30 Arcturus Therapeutics Inc UNA Oligomer Structures For Therapeutic Agents
WO2010080724A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
WO2010088537A2 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved lipid formulation
US8883202B2 (en) 2009-05-05 2014-11-11 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid compositions
CA2764158A1 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof
SG10201912450XA (en) 2009-06-10 2020-03-30 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
WO2011005861A1 (en) 2009-07-07 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
PT2470656E (pt) 2009-08-27 2015-07-16 Idera Pharmaceuticals Inc Composição para inibir expressão de gene e suas utilizações
NZ598943A (en) 2009-10-16 2014-09-26 Glaxo Group Ltd Hbv antisense inhibitors
CA2792561C (en) 2010-04-06 2021-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene
WO2011139710A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
EP3587574B1 (en) 2010-08-17 2022-03-16 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of hepatitis b virus (hbv) gene expression using short interfering nucleic acid (sina)
CN101948827A (zh) 2010-08-19 2011-01-19 中国人民解放军第三〇二医院 一种低载量乙型肝炎病毒全基因组克隆的方法
CN101979553B (zh) * 2010-10-28 2015-07-01 百奥迈科生物技术有限公司 一种干扰HBV基因的siRNA分子及其抗病毒应用
SI3505528T1 (sl) 2011-04-21 2021-04-30 Glaxo Group Limited Modulacija izražanja virusa hepatitisa B (HBV)
KR102434357B1 (ko) * 2011-06-30 2022-08-18 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스의 유전자 발현 저해용 조성물 및 방법
SG11201401314PA (en) 2011-09-07 2014-09-26 Marina Biotech Inc Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
CN102559657A (zh) 2011-11-09 2012-07-11 中国人民解放军第三〇二医院 两片段连接法进行hbv全基因组克隆的方法
ES2923787T3 (es) * 2011-11-18 2022-09-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de iARN modificados
IL293434B2 (en) * 2011-11-18 2024-05-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc RNAI factors, preparations and methods of using them for the treatment of transthyretin-related diseases
US9133461B2 (en) * 2012-04-10 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the ALAS1 gene
CN103333890B (zh) 2012-12-21 2015-04-15 厦门成坤生物技术有限公司 治疗乙型病毒性肝炎的rna干扰制剂
CN103014045B (zh) * 2012-12-30 2014-09-17 中国人民解放军第三军医大学 表达特异性HBV shRNA的重组HBV载体及其构建方法和应用
WO2014126828A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel ph-switchable peptides for membrane insertion and pore formation
CN104031916B (zh) * 2013-03-04 2017-06-06 中国科学院上海生命科学研究院 新型RNAi前体及其制备和应用
EP3828275A1 (en) 2013-05-01 2021-06-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ttr expression
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
EP3332007A4 (en) 2015-08-07 2019-07-17 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNA INTERFERENCE THERAPY FOR HEPATITIS B VIRUS INFECTION
KR20180100228A (ko) 2016-01-12 2018-09-07 헬름홀츠 젠트룸 뮌헨-도이체스 포르슝스젠트룸 퓌르 게준드하이트 운트 움벨트 게엠베하 Hbv를 치료하기 위한 수단 및 방법
KR20200015895A (ko) 2017-04-18 2020-02-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 (hbv)에 감염된 대상체의 치료 방법
US10799808B2 (en) 2018-09-13 2020-10-13 Nina Davis Interactive storytelling kit

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016077349A1 (en) 2016-05-19
AU2021277625A1 (en) 2021-12-23
BR112017008868A2 (pt) 2018-01-16
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KR102545316B1 (ko) 2023-06-22
JO3573B1 (ar) 2020-07-05
JP2020172506A (ja) 2020-10-22
CY1122520T1 (el) 2021-01-27
JOP20200092A1 (ar) 2017-06-16
CN108064294A (zh) 2018-05-22
CN113699151A (zh) 2021-11-26
CA3233743A1 (en) 2016-05-19
TW201631156A (zh) 2016-09-01
TW202237849A (zh) 2022-10-01
JP7426973B2 (ja) 2024-02-02
EP3218489B1 (en) 2019-10-09
JP2022003055A (ja) 2022-01-11
PT3218489T (pt) 2019-12-18
AU2015346566A1 (en) 2017-06-08
EP3218487A1 (en) 2017-09-20
AU2015346513A1 (en) 2017-06-08
US10640770B2 (en) 2020-05-05
EP3218489A1 (en) 2017-09-20
AU2021277625B2 (en) 2024-02-29
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