KR20180100228A - Hbv를 치료하기 위한 수단 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 치료 또는 백신 접종용 개선된 재조합 백신 접종 벡터뿐만 아니라 상기 재조합 백신 접종 벡터를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HBV에 대한 백신 접종 방법에 사용하기 위한 재조합 백신 접종 벡터, 및 상기 재조합 백신 접종 벡터를 포함하는 백신을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

HBV를 치료하기 위한 수단 및 방법
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 치료 또는 백신 접종용 개선된 재조합 백신 접종 벡터, 상기 재조합을 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 HBV에 대한 백신 접종 방법에 사용하기 위한 재조합 백신 접종 벡터 및 HBV에 대한 백신 접종용 키트에 관한 것이다.
2억 4천만 명 이상의 사람들이 만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염으로 고통 받고 있다. 승인된 치료 옵션은 뉴클레오사(타)이드 유사체 및 인터페론 α이다. 뉴클레오사(타)이드 유사체는 조절하지만 B형 간염을 치료하지는 않으며 내성 바이러스의 출현과 관련하여 잠재적으로 값 비싼 장기 치료가 필요하다. 인터페론 α 치료는 부작용에 의해 제한되며 환자의 15-20%만 치료할 수 있다.
이 바이러스는 게놈의 전체 염기 서열 변이에 따라 이의 외피(envelope) 단백질 상에 존재하는 항원 에피토프에 기초한 상이한 항체 반응을 유도하는 4가지 주요 혈청형(adr, adw, ayr, ayw)과 8가지 유전형(A-I)으로 나뉜다. 상기 유전형은 뚜렷한 지역적 분포를 가지며 바이러스의 진화와 전염을 추적하는데 사용된다. 유전형 간의 차이는 질병의 심각성, 합병증의 경로와 가능성, 치료 및 백신 접종에 대한 반응에 영향을 미친다. 또한, 유전자아형(subgenotype), 예. A1-5가 존재한다. 중부 유럽과 미국에서 우세한 유전형은 A2이다. 그러나 감염된 사람의 1%만이 A2 유전아형을 가지고 있으며, 대다수의 환자는 유전형 B, C 또는 D의 HBV를 가지고 있다. 기존의 HBV 백신은 다른 유전(아)형 보다 백신에 포함된 HBV 항원과 동일한 유전(아)형의 HBV에 대해 보다 나은 보호를 제공한다는 것이 입증되었다.
숙주 적응 면역 체계는 효율적인 HBV 조절에 필수적이라는 것이 잘 알려져 있다. HBV 소형 표면 항원(HBsAg)에 대해 나타낸 중화 항체는 비-감염된 간세포로의 바이러스 확산을 방지하고 HBsAg에서 항-HBs로의 혈청 전환은 HBV-감염의 임상 종점을 나타낸다(Rehermann and Nascimben, Nat Rev Immunol 2005; 5 : 215-29). 바이러스를 제거하는 환자는 강력한 다클론성 및 다특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 생성하는 반면, 만성 감염은 항바이러스성 T-세포의 고갈 및 진행성 기능 장애와 관련이 있다 (Rehermann et al., J Exp Med 1995; 181 : 1047-58). HBV 면역 기증자로부터 골수를 얻은 골수 이식 환자에서 만성 HBV-감염이 해결된다는 임상적 관찰은 감염 제어에 있어 T-세포의 강력한 역할을 뒷받침한다 (Ilan et al., Gastroenterology 1993; 104 : 1818-21). 이러한 관찰에 기초하여, 치료적 백신 접종은 내인성 HBV-특이적 T-세포 반응을 활성화시키도록 설계되었다. 그러나 만성적으로 감염된 환자의 수많은 임상 시도는 항-HBV 면역 반응에 일시적인 영향을 미치고 HBV 조절에 실패하였다 (Kutscher et al, Microb Biotechnol 2012; 5 : 270-82). 높은 수준의 순환 바이러스성 항원에 대한 지속적인 노출은 내성과 작동세포(effector cell) 기능장애를 유발하기 때문에 면역 요법 접근에 대한 주요 장애물인 것으로 보인다.
또한, 치료적 백신 접종과 바이러스성 혈증을 조절하지만 항원 수치의 순환에 영향을 주지 않는 항바이러스 치료와 병용하면 백신의 효능과 임상 결과가 향상되지 않는다 (Michel et al., J Hepatol 2011, 54 : 1286-96).
새로운 면역 요법 전략의 개발을 촉진하기 위해, 수직으로 전염된 만성 HBV 감염의 모델인 HBV-형질전환 마우스 (HBVtg)가 개발되었다 (Guidotti et al., J Virol 1995; 69 : 6158-69). HBVtg 마우스는 간세포에서 HBV를 복제하여 HBcAg, HBsAg 및 B형 간염 항원(HBeAg)을 생산하고 혈액 내로 전염성 바이러스를 방출한다 (Guidotti et al., J Virol 1995; 69 : 6158-69). HBV 항원의 발현은 출생시에 시작되며 마우스는 HBV-암호화된 단백질에 대해 면역학적으로 내성이 있으나 (Shimizu et al., J Immunol 1998; 161 : 4520-9), 이러한 내성은 파괴될 수 있다 (Buchmann et al., Vaccine 2013; 31 : 1197-203).
변형된 백시니아 바이러스 안카라 (Modified Vaccinia virus Ankara, MVA)는 폭스바이러스(Poxviridae)의 계열에 속하는 오소폭스바이러스(Orthopoxvirus)의 구성원인 백시니아 바이러스와 관련이 있다. MVA는 CVA(chicken embryo fibroblasts of the Ankara strain of vaccinia virus) 상 516 연속 계대에 의해 생성되었다 (Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975) 참조). 이들 장기간 계대의 결과로서, 생성된 MVA 바이러스의 게놈은 약 31 킬로베이스의 게놈 서열이 결실되어 있고, 따라서 조류 세포로의 복제를 위해 제한된 고도의 숙주 세포로 기술되었다 (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). 다양한 동물 모델에서 생성된 MVA가 유의적으로 무해함을 보여주었다 (Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand 41 : 225-34 (1978)). 그러나, 여전히 폭스바이러스에 대한 방어 면역 반응을 일으켰다. 따라서, 이 MVA 균주는 인간 천연두 질병에 대한 면역 접종을 위한 백신으로 임상 시험에서 시험되었다 (Mayr et al., Z. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987), Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974)). 이 연구는 고위험 환자를 포함하여 120,000명이 넘는 인간을 대상으로 실시되었고, 백시니아-기반 백신과 비교하여 MVA가 독성을 감소시키고 잘 견디며, 여전히 우수한 특이한 면역 반응을 유도함을 입증하였다.
다음 수십 년 동안, MVA는 재조합 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 또는 재조합 백신으로 사용하기 위해 제작되었다 (Sutter, G.et al., Vaccine 12 : 1032-40 (1994)). 백신이나 의약품의 개발을 위한 MVA 균주가 기술되었다. 미국 특허 번호 6,761,893 및 6,193,752 참조하시오. 그러한 균주는 구분되는 비-인간 세포 및 세포주, 특히 CEF(chicken embryo fibroblasts)에서 생식 복제가 가능하지만, 다른 공지된 백시니아 균주의 복제를 허용하는 것으로 알려진 인간 세포주에서는 유의한 생식 복제가 불가능하다.
상기에 기초하여, HBV에 대한 치료적 백신 접종에 사용될 수 있는 개선된 수단 및 방법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다. 이러한 수단과 방법은 중화 항체 반응과 HBV의 다중 아형에 대한 다-특이적 T 세포 반응을 병행하여 유도해야 한다.
본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 치료 또는 백신 접종용 신규 재조합 백신 접종 벡터, 상기 MVA를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 MVA를 이용한 HBV 백신 접종 방법에 관한 것이다. 본 발명의 수단 및 방법은 대상체에서 HBV에 대한 T 세포 반응뿐만 아니라 항체 반응을 유도하는 것으로 관찰되며, 또한 유도된 면역 반응은 광범위하고 다양한 HBV 유전형 및 혈청형에 대해 효과적일 것으로 구상된다.
본원에 사용된 "재조합 백신 접종 벡터"는 약독화된 바이러스 또는 박테리아를 말한다. 이 문맥에서 "벡터"는 운반체로 사용되는 바이러스 또는 박테리아를 의미한다. 전형적으로, 이 약독화된 바이러스 또는 박테리아는 항원을 암호화하는 핵산을 대상체의 세포에 도입하는데 사용된다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터는 약독화된 살모넬라 균주일 수 있다. 그러나, 대안적으로 대장균, 시겔라, 여시니아(Yersinia), 락토바실러스, 마이코박테리아, 리스테리아 또는 비브리오의 약독화된 균주와 같은 다른 원핵생물이 사용될 수 있다. 미생물의 적절한 균주의 예로는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 더블린(Salmonella dublin), 살모넬라 엔테 레티디스(Salmonella enteretidis), 시겔라 렉세네리(Shigella flexeneri), 시겔라 손넬(Shigella sonnel)을 포함한다. 약독화된 살모넬라 균주는 가장 특징적인 점막 백신 운반체 중 하나이다. 약독화되나 침습성의 재조합 살모넬라 균주는 몇 가지 병원체의 보호 에피토프를 점막 관련 림프구 조직으로 운반하여 운반체 및 외래 항원 모두에 대한 점막, 전신 및 CTL 면역 반응을 유도하는 경구 백신 벡터로 사용되었다.
또한, 본 발명의 재조합 백신 접종 벡터는 약독화된 살모넬라 균주, CMV-, VSV- 계열 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 홍역 벡터일 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터는 감염성을 갖는 바이러스 입자일 수 있는 바이러스 벡터일 수 있으며, 이는 세포 내로 유전자를 도입하기 위한 운반체이기도하다. 바이러스 백신 접종 벡터는 당업자에게 익숙하다. 본 발명에 의해 특히 고려되는 것은 폭스바이러스 벡터이다. 재조합 폭스바이러스는 표준 유전자 조작 방법에 의해 생산되는 폭스바이러스일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 백신 접종 벡터는 MVA이다.
MVA는 벡터 시스템으로 특히 바람직하다. 예를 들어, 소형 폭스바이러스에 대한 백신 접종 후 단기간에 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하는데 효과적일 수 있는 효능이 증명되었다. 이의 안전성이 확립되었다. 면역-저하된 대상체에서 면역 반응을 유발할 수 있는 능력이 알려져 있다.
그러나 MVA가 HBV에 대한 백신으로 사용하는 이점을 제외하고는 HBV 백신의 가장 큰 문제점은 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 유도할 수 있고 이 면역 반응은 바람직하게 HBV의 다중 유전형 및/또는 혈청형을 가리키는 것이다. 벡터, 백신 접종 계획 및 HBV 항원의 선택은 모두 백신 접종의 효과에 기여할 수 있다.
본 발명은 상이한 HBV 유전형 및/또는 혈청형 유래의 HBV 항원 조합의 용도를 포함한다. 이 조합은 여러 HBV 균주에 대한 광범위한 면역 반응뿐만 아니라 단일 HBV 유전형 유래의 항원만을 포함하는 백신과 비교하여 각 HBV 유전형에 대한 강력한 면역 반응을 유도하였다. 실제로, 본 발명의 수단 및 방법을 사용하여, 본 발명자들은 낮은, 중간의 및 심지어 높은 항원 수준을 갖는 대상체에서의 면역 내성을 극복할 수 있었다.
MVA-기반 백신은 여러 가지 이유로 유리하다. 예를 들어, 바람직한 MVA 균주인 MVA-F6 (Sutter and Staib, 2003. Curr. Drug Target Infect. Disord., 3 : 263-271), 원발성 CEF 세포에서 잘 자라며 인간 세포에서는 복제하지 않는다. 인간 세포에서 바이러스성 유전자와 조작된 유전자가 발현되지만 전염성 바이러스는 생성되지 않는다. MVA의 제한된 숙주 범위는 인간을 포함하여 광범위한 포유동물 종에서 인비보에서 관찰된 비-독성 표현형을 설명할 수 있다. MVA는 수많은 독성 연구에서 안전하다는 것이 입증되었다. 재조합 MVA의 제조, 생산 및 용도는 예를 들어 WO 97/02355, Sutter and Staib, 2003 (supra) 및 WO 2003/008533에 기술되었다.
본 발명은 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게 B형 간염 바이러스(HBV) 유래의 하나 이상의 항원을 발현하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)를 포함한다. 상기 하나 이상의 항원은 HBV 유래의 외피 단백질 (HBs-항원), HBV 유래의 코어 단백질 (HBc-항원) 또는 HBV 유래의 폴리머라제의 RT 도메인에서 선택될 수 있다. 상기 외피 단백질은 예를 들어 HBV 유전형 A2 혈청형 adw2와 같은 HBV 유전형 A 혈청형 adw 등의 HBV 혈청형 adw의 외피 단백질일 수 있다. 상기 코어 단백질은 예를 들어 HBV 유전형 D 혈청형 ayw와 같은 HBV 혈청형 ayw의 코어 단백질일 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게 MVA는 하나 이상의 외피 단백질을 발현할 수 있으며, 상기 하나 이상의 외피 단백질은 HBV의 다양한 유전형 또는 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MVA는 HBV 유전형 A 혈청형 adw의 외피 단백질뿐만 아니라 유전형 C의 외피 단백질을 발현할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 MVA는 하나 이상의 코어 단백질을 발현할 수 있으며, 상기 하나 이상의 코어 단백질은 HBV의 다양한 유전형 또는 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 MVA는 유전형 C의 코어 단백질뿐만 아니라 HBV 유전형 D 혈청형 ayw의 코어 단백질을 발현할 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게 MVA는 또한 HBV 유래의 폴리머라제 또는 HBV 폴리머라제의 RT 도메인을 발현할 수 있다. 이 폴리머라제는 임의의 유전형이나 혈청형일 수 있다. 상기 폴리머라제는 바람직하게 HBV 유전형 D 유래 폴리머라제일 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게는 MVA는 (a) B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질 (HBs-항원); 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게는 간염의 대형 외피 또는 소형 외피 단백질 B 바이러스 유전형 A 혈청형 adw; 바람직하게는 소형 외피 단백질이고, 및 (b) B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원); 여기서 상기 코어 단백질은 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며, 및 다음 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: (c) SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 외피 단백질 (HBs-항원), (d) SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 (HBc-항원) 및/또는 (e) SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 폴리머라제의 RT 도메인. 본 발명의 MVA는 항원 (a), (b), (c), 항원 (a), (b), (d), 또는 항원 (a), (b), (e), 항원 (a), (b), (c), (d), 항원 (a), (b), (c), (e), 항원 (a), (b), (d), (e), 또는 항원 (a), (b), (c), (d), (e)와 같은 HBV의 3개, 바람직하게는 4개 또는 가장 바람직하게는 5개의 HBV 항원을 발현할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 HBV의 "외피(envelope) 단백질", "HBs-항원" 또는 "HBsAg"은 B형 간염 바이러스(HBV)의 표면 항원을 의미한다. 상기 "외피 단백질", "HBs-항원" 또는 "HBsAg"은 별개의 mRNA에서 번역되는 3가지 변이체, 소형, 중형 및 대형 외피 단백질 중 어느 하나와 관련될 수 있다. 3가지 변이체 모두 공통적으로, S 유전자의 주요 친수성 영역(MHR) 내의 코돈 위치 124 내지 147에 위치한 "a" 결정체 에피토프가 있다. 이 "a" 결정체는 급성 B형 간염의 초기 면역 반응 과정에서 항-HBs 항체들의 주요 표적들 중 하나이다. 상기 용어 "외피 단백질", "HBs-항원" 또는 "HBsAg"는 임의로 외피 단백질의 면역원성 단편과 관련될 수 있다. 외피 단백질의 면역원성 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 단축된, 즉 N-말단 아미노산 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 결여되어 있는, 임의의 전장 외피 단백질 유래의 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 그러한 단편은 외피 단백질의 1차 서열의 바람직하게 적어도 70개, 바람직하게 적어도 80개, 바람직하게 적어도 90개, 바람직하게 적어도 100개, 더욱 바람직하게 적어도 125개, 가장 바람직하게 적어도 150개의 연속적인 아미노산을 포함하며 일반적으로 면역원성이다. 전형적으로, 그러한 면역원성 단편은 소형 외피 단백질의 아미노산 위치에 상응하는 적어도 아미노산 99 내지 168의 전장 단백질과 비교하여 포함한다.
본 명세서에서 HBV의 "코어 단백질" 또는 "HBc-항원"은 뉴클레오캡시드의 구조 단백질을 의미한다. 전장 코어 단백질은 길이가 183개 길이의 아미노산이며, 조립 도메인(아미노산 1 내지 149) 및 핵산-결합 도메인(아미노산 150 내지 183)으로 이루어진다. 34-잔기의 핵산-결합 도메인은 매우 기본이고 이의 기능과 일치하는 17개의 아르기닌 갖는다. 코어 단백질은 용액에서 이량체이다; 이 이량체들은 20면체 캡시드로 자기 조립한다. 아미노산 1 내지 149만을 포함하는 절단된 코어 단백질이 캡시드를 형성할 수 있음이 이해된다. 상기 용어 "코어 단백질" 또는 "HBc-항원"은 임의로 코어 단백질의 면역원성 단편과 관련될 수 있다. 코어 단백질의 면역원성 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 단축된, 즉 N-말단 아미노산 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 결여되어 있는, 임의의 전장 코어 단백질 유래의 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 그러한 단편은 코어 단백질의 1차 서열의 바람직하게 적어도 100개, 보다 바람직하게 125개, 가장 바람직하게 149개의 연속적인 아미노산을 포함하며, 일반적으로 면역원성이다. 전형적으로, 이러한 면역원성 단편은 SEQ ID NO : 11에 기재된 서열 위치에 상응하는 아미노산 18 내지 143의 전장 코어 단백질과 비교하여 포함한다. 전형적인 예로는 SEQ ID NO : 11에 기재된 전장 코어 단백질의 아미노산 1 내지 149로 이루어진 코어 단백질 단편이다.
본원에 사용된 "면역원성(immunogenic)"은 항원 또는 에피토프와 같은 특정 물질이 인간 또는 동물의 신체에서 면역 반응을 일으키는 능력을 의미한다. 즉, 면역원성(immunogenicity)은 체액 및/또는 세포 매개 면역 반응을 유도하는 능력이다. 면역 반응을 유도하는 항원의 능력을 체액 및/또는 세포 매개 면역 반응일 수 있는 면역원성이라 한다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, HBV 유래의 임의의 자연 발생 HBs-항원, HBc-항원 또는 폴리머라제가 면역원성인 것으로 가정된다. 또한, 자연 발생 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산이 교환, 결실 또는 삽입된 HBV-항원, HBc-항원 또는 HBV의 폴리머라제의 많은 변이체가 있다고 가정한다. 예시적인 예로서, 자연 발생 HBs-항원의 면역원성 변이체는 HBs-항원이며, 여기서 "a" 결정체 에피토프는 다른 혈청형의 HBs-항원의 "a" 결정체로 대체된다. 전형적으로, 자연 발생 HBs-항원, HBc-항원 또는 폴리머라제의 면역원성 변이체는 자연 발생 HBs-항원, HBc-항원 또는 폴리머라제의 아미노산 서열과 90%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게 MVA는 B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질을 포함한다. 그러한 외피 단백질은 소형, 중형 또는 대형 외피 단백질일 수 있고, 소형 또는 대형 외피 단백질이 바람직하며, 소형 외피 단백질이 가장 바람직하다. 상기 외피 단백질은 바람직하게 유전형 A, 혈청형 adw (A/adw), 바람직하게 HBV A2/adw2이다. 그러나, HBV adw의 자연 발생 외피 단백질의 면역원성을 갖는 임의의 자연 발생 또는 조작된 외피 단백질이 본 발명에 적합하다. 바람직한 외피 단백질은 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 동일하거나, 또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 8에 기재된 아미노산 서열를 포함하거나 이들로 이루어진다. 또한, 외피 단백질은 N- 및/또는 C 말단에 추가의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 외피 단백질은 N- 및/또는 C 말단에 추가의 아미노산을 바람직하게 30개 이하, 바람직하게 25개 이하, 바람직하게 20개 이하, 바람직하게 15개 이하, 바람직하게 10개 이하, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 바람직하게 3개 이하, 바람직하게 2개 이하, 바람직하게 1개 이하를 갖는다. 이들 아미노산은 바람직하게는 P2A 또는 T2A와 같은 자가-절단 부위의 단편이며, 이는 Kim et al. 2011, PLoS ONE, 6 (4) : e18556에 기술되어 있다. 따라서, 상기 외피 단백질은 임의로 N-말단에 추가 프롤린 및/또는 이의 C 말단에 추가 서열 GSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID NO: 9)를 포함한다. 따라서, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO: 10에 기재된 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, 바람직하게 MVA는 B형 간염 바이러스 혈청형 ayw의 코어 단백질을 포함한다. 코어 단백질은 바람직하게 HBV 유전형 D/ayw이다. HBV 세포의 자연 발생 코어 단백질의 면역원성을 갖는 자연 발생 또는 조작된 코어 단백질은 본 발명에 적합하다. 바람직한 구현예에서, 코어 단백질은 전장 단백질의 아미노산 1 내지 149로 이루어진 전장 코어 단백질의 단편이다. 바람직한 코어 단백질은 SEQ ID NO: 11에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게는 약 100% 동일하거나, 또는 바람직하게는 SEQ ID NO: 11에 제시된 아미노산 서열를 포함하거나 이들로 이루어진다. 또한, 상기 코어 단백질은 N- 및/또는 C 말단에 추가의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 코어 단백질은 N- 및/또는 C 말단에 추가의 아미노산을 바람직하게 30개 이하, 바람직하게 25개 이하, 바람직하게 20개 이하, 바람직하게 15개 이하, 바람직하게 10개 이하, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 바람직하게 3개 이하, 바람직하게 2개 이하, 바람직하게 1개 이하를 갖는다. 이들 아미노산은 바람직하게 P2A 또는 T2A와 같은 자가-절단 부위의 단편이다. 따라서, 상기 코어 단백질은 임의로 N-말단에 추가 프롤린 및/또는 이의 C 말단에 SEQ ID NO: 12로 기재된 추가 서열을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 전장 아미노산 1 내지 149로 이루어지고 C 말단 서열을 갖는 코어 단백질의 단편은 캡시드에 조립하는 능력을 여전히 갖는 것으로 고려되며 추가의 C-말단 서열은 캡시드 형성을 간섭하지 않는 것으로 생각된다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, MVA는 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열과 바람직하게 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%상, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 단백질 (HBs-항원)을 포함할 수 있다. SEQ ID NO: 1은 HBV 균주의 전 세계적 분포를 나타내는 500개의 HBV 서열의 정렬에 기초하여 생성된 유전형 C 균주의 대형 외피 단백질의 공통 서열이다. GenBank 수탁 번호 ABV02797 (2007년 9월 12일자 버전 ABV02797.1 GI: 157057635)을 갖는 HBV의 추정된 prepre-S 단백질 유래 서열에 상응하는 SEQ ID NO: 1에 대해 99%의 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 외피 단백질의 예시적이 예인, A-결정체(항-HBs 항체의 가장 중요한 표적 서열)는 2개의 아미노산을 교환함으로써 ayw(혈청형에 대한 항체의 형성)로 변형되었다. 필수적으로 SEQ ID NO: 4와 동일한 서열을 갖는 HBV-균주의 존재는 필수 공정(접힘/가공/존재)이 암호화된 단백질에 대해 기능적임을 보장한다. 따라서, 본 발명에 의해 또한 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 외피 단백질이 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100%의 서열 동일성을 갖는 외피 단백질임을 고려한다. 또한, 유전형 C 균주의 외피 단백질에 대한 공통 서열은 유전형 B 균주의 외피 단백질에 대한 공통 서열과 매우 유사하다. 면역원성 외피 단백질은 유전형 C 균주에 대한 외피 단백질 공통 서열을 기반으로 하며, 동시에 유전형 B 균주의 외피 단백질에 대한 공통 서열과 매우 유사하기 때문에, 이 면역원성 외피 단백질은 적어도 유전형 B 및 유전형 C 균주의 광범위한 스펙트럼에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. SEQ ID NO : 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 외피 단백질은 임의로 SEQ ID NO : 1에 상응하는 단편과 적어도 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 이의 면역원성 단편을 또한 의미하는 것으로 이해된다. 또한, 상기 외피 단백질은 N- 또는 C 말단에 추가 아미노산을 가질 수 있다. 상기 외피 단백질은 N- 및/또는 C 말단에 바람직하게 30개 이하, 바람직하게 25개 이하, 바람직하게 20개 이하, 바람직하게 15개 이하, 바람직하게 10개 이하, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 바람직하게 3개 이하, 바람직하게 2개 이하, 바람직하게 1개 이하의 추가 아미노산을 갖는다. 이들 아미노산은 바람직하게 P2A 또는 T2A와 같은 자가-절단 부위의 단편이다. 따라서, 상기 외피 단백질은 선택적으로 N-말단에 추가 프롤린 및/또는 이의 C 말단에 추가 서열 GSGEGRGSLLTCGDVEENPG (SEQ ID NO : 13)를 포함한다. 따라서, 상기 외피 단백질은 SEQ ID NO : 14에 기재된 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, MVA는 SEQ ID NO : 2에 기재된 아미노산 서열과 바람직하게 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 코어 단백질(HBc-항원)을 포함할 수 있다. SEQ ID NO : 2는 HBV 균주의 전세계 분포를 나타내는 500개의 HBV-서열의 정렬에 기초하여 생성된 유전형 C 균주의 코어 단백질의 공통 서열이다. SEQ ID NO : 2에 대해 100% 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO : 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 코어 단백질의 예시적인 예로는 GenBank 수탁 번호 NP_647607 (2015년 7월 9일자 버전 NP_647607.1 GI : 21326588)을 갖는 HBV의 캡시드 단백질로부터 유래된 서열과 본질적으로 동일하다. 따라서, 본 발명에 의해 또한 SEQ ID NO : 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역 원성 코어 단백질이 SEQ ID NO : 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 코어 단백질인 것을 고려한다. 또한, 유전형 C 균주에 대한 공통 서열은 유전형 B 균주의 공통 서열과 동일하다. 면역원성 코어 단백질은 유전형 B 균주의 코어 단백질에 대한 공통 서열과 동일한 유전형 C 균주에 대한 코어 단백질 공통 서열을 기반으로 하기 때문에, 이 면역원성 코어 단백질은 적어도 유전형 B 및 유전형 C 균주의 광범위한 스펙트럼에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. SEQ ID NO : 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 코어 단백질은 바람직하게 SEQ ID NO : 2의 상응하는 단편과 바람직하게 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게는 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 이의 면역원성 단편을 또한 의미하는 것으로 이해된다. 예시적인 예로서, 이러한 면역원성 단편은 SEQ ID NO : 2의 아미노산 1 내지 149와 90%의 서열 동일성을 갖는 단편일 수 있다. 상기 코어 단백질은 또한 N- 또는 C-말단에 추가의 아미노산을 가질 수 있다. 상기 코어 단백질은 N- 및/또는 C-말단에 바람직하게 30개 이하, 바람직하게 25개 이하, 바람직하게 20개 이하, 바람직하게 15개 이하, 바람직하게 10개 이하, 바람직하게 5개 이하, 바람직하게 4개 이하, 바람직하게 3개 이하, 바람직하게 2개 이하, 바람직하게 1개 이하의 추가 아미노산을 갖는다. 이들 아미노산은 바람직하게 P2A 또는 T2A와 같은 자기 절단 부위의 단편이다. 따라서, 상기 코어 단백질은 임의로 N-말단에 추가의 프롤린을 포함한다. 상기 코어 단백질은 SEQ ID NO : 9 또는 13에 기재된 추가 서열을 이의 C 말단에 임의로 추가 포함할 수 있다. 따라서 상기 코어 단백질은 SEQ ID NO : 15에 기재된 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, MVA는 SEQ ID NO : 3에 기재된 아미노산 서열과 바람직하게 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인을 포함할 수 있다. SEQ ID NO : 3은 HBV 균주의 전세계 분포를 나타내는 500개의 HBV-서열의 정렬에 기초하여 생성된 유전형 A, B, C 및 D 균주의 RT 도메인의 공통 서열이다. 이러한 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인에 대한 예시적인 예로는 SEQ ID NO : 3에 97%의 서열 동일성을 갖는 SEQ ID NO : 6에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다. SEQ ID NO : 6은 GenBank 수탁 번호 AFY09280 (2013년 1월 31일자 버전 AFY09280.1 GI : 425891330)을 갖는 HBV의 부분 폴리머라제로부터 유래된 폴리머라제의 RT 도메인의 아미노산 서열과 대응한다. SEQ ID NO : 6은 유전형 A, B, C 및 D의 생성된 공통 서열과 가장 높은 유사성을 갖는 자연 발생 폴리머라제의 RT 도메인이기 때문에 전형적인 예이다. 이 서열을 갖는 HBV-균주의 존재는 필수적 과정(접힘/가공/제공)이 암호화된 RT-도메인에 대해 기능적임을 보장한다. 따라서, 본 발명에 의해 또한 SEQ ID NO : 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 면역원성 RT 도메인이 SEQ ID NO : 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 외피 단백질인 것을 고려한다. 폴리머라제의 RT 도메인은 몇몇 고도로 보존된 에피토프를 포함하고, 본 발명의 MVA에 포함된 폴리머라제의 RT 도메인은 유전형 A, B, C 및 D 균주에 대한 RT 도메인 공통 서열에 기초하고 있기 때문에, 폴리머라제의 이 면역원성 RT 도메인은 적어도 유전형 A, B, C 및 D 균주의 광범위한 스펙트럼에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명은 또한 폴리머라제의 RT 도메인이 전장 폴리머라제로 포함될 수 있다고 생각한다. 따라서, 면역원성 RT 도메인을 포함하는 전장 폴리머라제 또는 절단된 전장 폴리머라제도 본 발명의 범위 내에 있다. SEQ ID NO : 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%의 서열 동일성을 갖는 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인은 임의로 SEQ ID NO : 3의 상응하는 단편과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는 이의 면역원성 단편을 또한 지칭한다.
본원에 기술된 바와 같은 재조합 백신 접종 벡터, MVA는 또한 바람직하게 CD70 분자를 포함하거나 추가로 발현할 수 있다. 바람직하게 CD70은 인간 CD70이다.
CD70은 CD27에 대한 리간드이며, CD27L로도 알려져 있다. 이것은 타입 II 막 관통 단백질이며 (T 및 B 세포 림프종과 같이) 고도로 활성화된 림프구에서 발현된다. 또한 신장 세포 암에서 발현되며 종양 표적으로 평가된다. CD70 리간드 발현은 일반적으로 밀접하게 조절되지만, CD27L이 B 세포에 지속적으로 발현되면 광범위하고 효과적인 기억-유사 T 세포 풀이 발생한다 (Arens, R. et al 2004 J Exp Med 199 (11) 1595-605). 만성 바이러스 감염에서 CD70 신호는 결과와 관련있을 수 있다.
CD27/CD70은 그들의 T-세포 형성 특성으로 잘 알려진 종양 괴사 인자 수용체/종양 괴사 인자("TNFR/TNF") 슈퍼패밀리(superfamily)의 구성원이다. CD27/CD70 중 이 부류는 CD30/CD30L, CD40/CD40L, OX40/OX40L, 4-1BB/4-1BBL, GITR/GITRL 및 Fas/FasL을 포함한다. 1차 및 2차 T-세포 반응에 대한 OX40L 및 4-1BBL과 같은 다른 것들 중에서 CD70의 역할은 광범위한 전염병 모델에서 조사되었다[Hendrick et al., "CD27 is required for generation and long-term maintenance of T-cell immunity," Nature Immunol. 1(5):433-440 (2000); Matter et al., "Virus-induced polyclonal B-cell activation improves protective CTL memory via retained CD27 expression on memory CTL," Eur. J. Immunol. 35(11):3229-3239 (2005); A. Schildknecht et al., "Priming of CD8+ T-cell responses by pathogens typically depends on CD70-mediated interactions with dendritic cells," Eur . J. Immunol . 37(3):716-728 (2007)]. 흥미롭게도, 특히 수지상 세포("DCs") 상의 CD70을 포함하는 공동-자극 분자의 상향 조절은 TLR/CD40 자극을 조합함으로써 유도될 수 있다[Sanchez et al., "Combined TLR/CD40 stimulation mediates potent cellular immunity by regulating dendritic cell expression of CD70 in vivo," J. Immunol . 178(3):1564-1572 (2007)].
따라서, 본 발명에 의해 또한 CD70이 SEQ ID NO : 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 90%, 바람직하게 적어도 약 91%, 바람직하게 적어도 약 92%, 바람직하게 적어도 약 93%, 바람직하게 적어도 약 94%, 바람직하게 적어도 약 95%, 바람직하게 적어도 약 96%, 바람직하게 적어도 약 97%, 바람직하게 적어도 약 98%, 바람직하게 적어도 약 99%, 바람직하게 약 100% 서열 동일성을 갖는다는 것을 고려한다.
본 발명의 재조합 백신 접종 벡터, MVA는 바람직하게 광범위한 HBV 스펙트럼에 대한 치료적 백신 접종에 최적화되어 있으며 빈번하게 발생하는 여러 HBV 유전형의 항원 서열을 포함한다. 따라서 이 MVA는 HBV의 다양한 유전형과 혈청형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 HBV D/ayw 항원(들)만을 포함하는 MVA 백신과 비교하여 HBV A/adw 유래의 HBs-항원과 HBV D/ayw 유래의 HBc-항원의 조합이 HBV의 유전형 A 및 D에 대한 광범위한 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라 HBV D/adw에 대한 더욱 강력한 T 세포 반응을 유도할 것이다. 또한, 본 발명의 MVA는 또한 유전형 C HBV 균주의 공통 서열에 기초한 HBs-항원 또는 HBc-항원을 발현할 수 있다. 유전형 C HBV 균주의 이러한 공통 서열은 또한 유전형 B 균주의 공통 서열과 매우 유사하거나 동일하다. 이는 이들 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 본 발명의 MVA가 적어도 유전형 B 및 유전형 C 균주에 대한 광범위한 면역 반응을 유도함을 의미한다. 또한, 본 발명의 MVA는 유전형 A, B, C 및 D 균주의 공통 서열을 기초로 하고 고도로 보존된 항원을 함유하는 폴리머라제의 RT 도메인을 발현할 수 있다. 따라서, 이 RT 도메인을 MVA에 도입하면 적어도 HBV의 유전형 A, B, C 및 D에 대한 광범위한 면역 반응의 유도가 더욱 촉진될 것이다. 그러므로, 본 발명의 MVA는 적어도 MBV의 유전형 A, B, C 및 D에 대한 효과적인 백신이다.
용어 "항원"은 세포 항원-특이적 면역 반응 또는 체액성 항체 반응을 만들기 위해 숙주의 면역계를 자극하는 하나 이상의 에피토프를 함유하는 분자를 말한다. 항원은 단백질, 폴리펩타이드, 항원 단백질 단편 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 항원은 임의의 공지된 바이러스, 박테리아, 기생충, 프리온, 식물, 원생동물 또는 곰팡이로부터 유래될 수 있으며, 전체 유기체로부터 유래될 수 있다. 이 용어는 또한 종양 항원을 포함한다. 폴리에피토프, 플랭킹(flanking) 에피토프 및 기타 재조합 또는 합성으로 유도된 항원과 같은 합성 항원도 본원에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항원은 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
용어 "에피토프"와 관련하여, 용어 "항원"은 (더 긴) 서열, 특히 (더 긴) 아미노산 서열 또는 단백질 서열을 지칭하는 반면, "항원성 에피토프" 또는 "항원의 에피토프"는 더 긴 서열로부터 더 짧은 서열의 스트레치를 포함한다. 따라서, 용어 "항원"은 에피토프를 포함한다. 용어 "항원"은 또한 본원에 기술된 바와 같은 단백질, 폴리펩타이드 및 항원성 단백질 단편의 변이체를 포함한다. 또한, 용어 "항원"은 천연 서열과 동일한 서열뿐만 아니라 결실, 부가, 삽입 및 치환과 같은 천연 서열에 대한 변이를 포함한다. 바람직하게 항원 변이체는 기준 항원(즉, 파생된 항원)과 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 65%, 적어도 약 70% 또는 75%, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 일반적으로 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 보다 더 일반적으로 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 가장 일반적으로 적어도 약 99%의 아미노산 동일성을 갖는다.
본원에서 "항원성 에피토프"로도 지칭되는 에피토프는 여전히 숙주에서 면역 반응을 유도하는 항원의 일부를 형성한다. 그러나, 에피토프는 파생된 항원의 정확한 서열에 한정되지 않는다. 따라서, 용어 "에피토프"는 천연 서열과 동일한 서열뿐만 아니라 결실, 부가, 삽입 및 치환과 같은 천연 서열에 대한 변이를 포함한다. 바람직하게, 에피토프 변이체는 기준 에피토프(즉, 파생된 에피토프)과 적어도 약 50%, 적어도 약 60% 또는 65%, 적어도 약 70% 또는 75%, 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 보다 일반적으로 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93% 또는 94%, 보다 더 일반적으로 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 가장 일반적으로 적어도 약 99%의 아미노산 동일성을 갖는다.
두 핵산과 아미노산 간의 서열 동일성을 측정하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 둘 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 "동일성(%)"을 측정함으로써 비교될 수 있다. 두 서열의 동일성(%)은 핵산 또는 아미노산 서열이든, 두 개의 정렬된 서열 간의 정확한 일치 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다.
본원에 기술된 항원 또는 에피토프에 대한 "아미노산 서열 동일성(%)"은 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭(gaps)을 도입하여 최대 서열 동일성(%)을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 고려하지 않은 후. 기준 서열(즉, 파생된 항원 또는 에피토프)의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성(%)을 측정하기 위한 정렬은 예를 들어 BLAST, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
"뉴클레오타이드 서열 동일성(%)"에서도 동일하게 적용 가능하며, 이를 준용한다.
예를 들어, 핵산 서열에 대한 적절한 정렬은 스미스 및 와터맨(Smith and Waterman, 1981)의 Advances in Applied Mathematics 2 : 482-489의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이 알고리즘은 Dayhoff(Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, and normalized by Gribskov (1986), Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763)에 의해 개발된 스코어링 매트릭스를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성(%)을 측정하기 위한 이 알고리즘의 예시적인 구현은 "BestFit" 유틸리티 응용에서 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공된다. 이 방법의 기본 매개 변수는 Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (Genetics Computer Group, Madison, Wis에서 이용 가능)에 설명되어 있다. 본 발명의 맥락에서 동일성(%)을 확립하는 바람직한 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되고 IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, Calif)에 의해 배포된 Edinburgh University에 의해 저작권 보호된 프로그램의 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이 패키지 세트에서 Smith-Waterman 알고리즘을 사용할 수 있으며, 여기서 기본 매개 변수(default parameters)가 스코어링 테이블(예, 12의 갭 오픈 페널티, 1의 캡 확장 페널티, 6의 갭)에 사용된다. 생성된 데이터에서 "일치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 간의 동일성 또는 유사성(%)을 계산하기 위한 다른 적합한 프로그램은 당업계에 일반적으로 공지되어 있으며, 예를 들어 다른 정렬 프로그램은 기본 매개 변수로 사용되는 BLAST이다. 예를 들어 BLASTN 및 BLASTP는 다음 기본 매개 변수를 사용하여 사용할 수 있다: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+ GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PI. 이 프로그램의 세부 사항은 다음 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: http://wvw.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
본 발명의 MVA에서 HBV 항원을 암호화하는 핵산은 개별적인 발현 카세트에 포함되거나, 바람직하게는 모두 함께 단일 발현 카세트에 포함될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "발현 카세트"는 적절한 숙주 세포에서 특정 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지시할 수 있는 RNA 서열뿐만 아니라 DNA를 포함한다. 일반적으로, 그것은 관심있는 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하며, 이는 종결 시그널 및/또는 다른 조절 요소에 선택적으로 작동 가능하게 연결된다. 상기 발현 카세트는 전사 조절 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 발현 카세트는 또한 뉴클레오타이드 서열의 적절한 번역에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자연 발생적이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태로 수득된 것일 수 있다. 코딩 영역은 일반적으로 관심있는 단백질을 코딩한다. 관심있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트는 또한 키메라일 수 있으며, 이는 이의 구성 요소 중 적어도 하나가 이의 다른 구성 요소 중 적어도 하나에 대해 이종(異種)임을 의미한다. 전형적으로, 본원의 발현 카세트는 MVA 게놈에서 자연 발생이 아니며(즉, 이종 또는 외인성 또는 외래) 감염된 세포에서 전사할 수 있다.
발현 카세트에서 뉴클레오타이드 서열의 발현은 숙주 세포가 일부 특정 외부 자극에 노출된 경우에만 전사를 개시하는 구성 프로모터 또는 유도성 프로모터의 조정 하에 있을 수 있다. 본 발명의 발현 카세트에서, 프로모터는 바람직하게는 폭스바이러스성 프로모터이다. 이러한 폭스바이러스성 프로모터는 자연 발생 프로모터 또는 합성 프로모터일 수 있다. 예시적인 예로서, 상기 폭스바이러스성 프로모터는 Pr7.5 프로모터, 하이브리드 초기/후기 프로모터, PrS 프로모터, WO 2010/102822 또는 WO 2005/054484에 기술된 프로모터 중 하나와 같은 합성 또는 천연 초기 또는 후기 프로모터, 또는 카우폭스 바이러스 ATI 프로모터이다. 예를 들어 폭스바이러스성 프로모터는 P7.5이다(SEQ ID NO: 17) (Endo et al., J Gen Virol. 1991 Mar; 72 (Pt 3): 699-703). 그러나, 바람직한 프로모터는 P7.5 보다 강한 프로모터, 예를 들어 SEQ ID NO: 18에 기재된 서열을 갖는 US 2011/0064769에 기술된 프로모터 PH5이다.
항원 또는 이의 에피토프를 암호화하는 핵산 서열은 바람직하게 코돈 최적화된다. "코돈-최적화된" 핵산 서열은 원하는 숙주 세포, 바람직하게는 인간 숙주 세포에 의해 선호되는 코돈으로 치환된 코돈을 함유하는 핵산 서열을 지칭한다. 핵산 서열은 동일한 번역된 폴리펩타이드 서열을 갖지만, 대안적인 코돈 사용법으로, 특히 표적 유기체의 가장 빈번한 코돈을 사용하여 코돈-최적화된 핵산 서열로 전환된다. 항원의 코돈-최적화된 핵산 서열을 생성하는 방법은 보통 표적 유기체에서 고발현 유전자와 관련이 없는 일반적으로 항원의 자연 발생 서열에서 코돈을 확인하고 이들을 표적 유기체의 유전자 발현에 널리 사용되는 것으로 알려져 있는 코돈으로 대체하는 것을 포함한다. 코돈-최적화된 핵산 서열은 원하는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 서열에 대해 개선된 발현을 나타낼 수 있다. 코돈 최적화된 서열이 비-최적화된 서열 보다 단백질 생산의 개선을 유도하는지 여부는 숙련자에 의해 조사될 수 있다.
희귀 코돈은 암호화된 단백질의 발현을 차단하거나 감소시킬 수 있기 때문에, 코돈 최적화(codon optimization)는 원하는 숙주에 대한 희귀 코돈의 사용을 피한다. 또한, 바람직하게 원하는 숙주에 대한 핵산 신호를 도입할 수 있는 치환은 피한다. 그러한 신호는 스플라이스 시그널, 종결 시그널 및 개시 시그널을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 사용된 벡터의 유형에 따라 다음 서열 모티프가 회피되는데, 예를 들어 많은 다른 벡터, 내부 TATA-박스, 카이 부위 및 리보솜 진입 부위에서 백시니아 바이러스 초기 전사 종결 신호를 피할 필요가 없다.; AT 리치 및 GC 리치 서열 스트레치; ARE, INS 및 CRS 서열 요소; 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (cryptic) 스플라이스 도너 및 어셉터 부위 및 브렌치 포인트; 및 백시니아 초기 전사 종결 시그널: (TTTTTNT).
코돈 최적화 기술은 당업계에 공지되어 있다. 상이한 뉴클레오타이드로 뉴클레오타이드의 치환은 다른 뉴클레오타이드에 의한 뉴클레오타이드의 기술적 또는 인공적인 대체를 의미한다. 바람직하게는, 치환된 뉴클레오티드는 암호화된 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 치환은 동일 아미노산을 코딩하는 2개의 상동성 뉴클레오타이드 서열 내의 코돈을 확인하고 코돈이 여전히 동일한 아미노산을 코딩하도록 2개의 상동성 뉴클레오타이드 서열 중 하나에서 코돈을 변경함으로써 수행될 수 있다. 상기 변경은 상동성 뉴클레오타이드 서열 중 하나, 둘 또는 모두에서 이루어질 수 있다.
본 발명은 모든 HBV 항원이 바람직하게 몇몇 항원을 포함하는 단일 폴리펩타이드 사슬로 번역되는 것으로 생각된다. 상기 폴리펩타이드 사슬에서, 항원 서열은 바람직하게 자가-절단 부위 서열에 의해 분리된다. 따라서, 몇몇 항원을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 다중 폴리펩타이드 사슬로 번역-후 절단될 것이며, 다중 폴리펩타이드 사슬 각각은 단일 HBV 항원을 포함할 수 있다. 이 접근법은 모든 HBV 항원이 대략 동등한 수준으로 발현된다는 장점이 있다. 몇몇 항원을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 위한 바람직한 배열은 - N-말단 내지 C-말단 - HBV A/adw 유래의 외피 단백질, P2A 부위, HBV D/ayw 유래의 코어 단백질, P2A 부위, 본원에 기술된 B형 간염 바이러스 유래의 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인, T2A 부위, 본원에 기술된 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 외피 단백질(HBs-항원), T2A 부위, 본원에 기술된 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 코어 단백질(HBs-항원)이다. 바람직한 구현예에서, 몇몇 항원을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO : 7에 기재된 서열을 포함한다. 도 16B에 나타낸 바와 같이, 2개의 상이한 외피 단백질은 세포막에 위치하고, 서브바이러스성 입자로 분비될 수 있다. 이러한 서브바이러스성 입자는 다양한 HBV 유전형 유래의 외피 단백질을 모두 포함할 수 있고 유도된 면역 반응을 증가시킬 수 있는 항원-제공 세포에 의해 흡수될 수 있다. 코어 입자는 빈 캡시드를 형성할 수 있으며, 상기 빈 캡시드는 다양한 HBV 유전형 유래의 코어 단백질을 유사하게 포함할 수 있다. 그러한 캡시드는 다수의 HBV 유전형에 대한 면역 반응을 유발한다. 폴리머라제는 프로테아좀(proteasome)에서 분해되어 HLA 상황에 의해 제시될 것이다. 본원에 기술된 배열은 단지 부분적으로 가공된 단백질, 즉 자가-절단 부위가 절단되지 않은 단백질의 대부분이 분비된 바이러스 유사 입자에 혼입되며, 이는 아마도 면역 반응을 증가시킬 것이고, 특히 적응 면역 반응을 향상시키고 확장시킬 것이라는 장점을 추가로 갖는다(도 18 참조).
본 발명은 MVA 게놈의 다양한 삽입 부위에 결합된 HBV 유전자를 포함하는 재조합 MVA를 포함한다. "다양한 삽입 부위"는 HBV 항원 각각을 암호화하는 HBV 유전자가 MVA 게놈 내의 동일하거나 하나 이상의 상이한 삽입 부위에 삽입될 수 있음을 의미하며, 동일한 삽입 부위가 바람직하다. 다르다는 것은, 예를 들어, 제1 삽입 부위는 제2 삽입 부위와 동일하지 않다는 것을 의미한다.
예시적인 예로서, HBV 유전자는 MVA의 유전자 간 영역(IGR)에 삽입될 수 있다. 그러한 IGR은 IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137 및 IGR 148/149에서 선택될 수 있다. 그러나, HBV 유전자가 MVA의 자연 발생 결실 부위 I, II, III, IV, V 또는 VI에 삽입되는 것이 바람직하며, 적어도 하나 또는 바람직하게 모든 HBV 유전자(들)는 자연 발생 결실 부위 III에 삽입되는 것이 바람직하다. 예시적인 예로서, 모든 HBV 유전자는 본원에 기술된 단일 ORF(open reading frame) 상의 단일 발현 카세트에 포함될 수 있으며, 상기 단일 발현 카세트가 자연 발생 결실 부위 III에 삽입된다.
재조합 MVA 바이러스는 당업계에 공지된 일상적인 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폭스바이러스를 수득하거나 외래 코딩 서열을 폭스바이러스 게놈에 삽입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 방법은 다음 참고문헌들에 기술되어 있다: Molecular Cloning, A laboratory Manual. Second Edition. By J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2003: DNA 복제, DNA 및 RNA 분리, 웨스턴 블랏 분석, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술과 같은 표준 분자 생물학 기술을 설명한다. Virology Methods Manual. Edited by Brian W J Mahy and Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: 바이러스 처리 및 조작 기술을 설명한다. Molecular Virology: A Practical Approach. Edited by AJ Davison and RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors. Current Protocols in Molecular Biology. Publisher: John Wiley and Son Inc. 1998. Chapter 16, section IV: 백시니아 바이러스 벡터를 이용한 포유동물 세포에서의 단백질 발현: MVA의 조작, 조작 및 유전 공학 기술 및 노하우를 기술한다.
본 발명에 따른 재조합 폭스바이러스의 생성을 위해서는 다양한 방법이 적용될 수 있다. 바이러스에 삽입될 DNA 서열은 폭스바이러스의 DNA 부분과 상응하는 DNA가 삽입된 대장균 플라스미드 구조물에 위치할 수 있다. 별도로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 연결될 수 있다. 프로모터-유전자 연결은 비-필수 궤적을 포함하는 폭스바이러스성 DNA 영역에 인접한 DNA 서열과 상응하는 DNA에 의해 양 말단이 측위되도록 프로모터-유전자 연결이 플라스미드 구조물에 위치될 수 있다. 생성된 플라스미드 구조물은 대장균 박테리아 내에서 증식시킴으로써 증폭되고 분리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 함유하는 상기 분리된 플라스미드는 폭스바이러스에 의해 이 배양물의 감염과 함께 닭 배아 섬유아세포(CEFs)와 같은 세포 배양물 내로 형질감염될 수 있다. 플라스미드와 바이러스 게놈에서 동종 폭스바이러스성 DNA의 재조합은 외래 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 폭스바이러스를 생성할 수 있다.
예를 들어, CEF 세포와 같은 적절한 세포 배양의 세포는 폭스바이러스로 감염 될 수 있다. 감염된 세포는 바람직하게는 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제1 플라스미드 벡터로, 바람직하게는 폭스바이러스 발현 조절 요소의 전사 조절 하에서 형질감염될 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 플라스미드 벡터는 또한 외인성 서열의 삽입을 폭스바이러스성 게놈의 선택된 부분 내로 유도할 수 있는 서열을 포함한다. 선택적으로, 상기 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마커 및/또는 선별 유전자를 포함하는 카세트를 함유한다. 적합한 마커 또는 선별 유전자는 예를 들어 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 네오마이신-포스포리보실 트랜스퍼라제 또는 다른 마커를 인코딩하는 유전자이다. 선별 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 폭스바이러스의 식별 및 분리를 단순화한다. 그러나, 재조합 폭스바이러스는 또한 PCR 기술에 의해 확인될 수 있다. 이어서, 추가의 세포를 전술한 바와 같이 수득된 재조합 폭스바이러스로 감염시키고 제2 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 이 유전자가 폭스바이러스성 게놈의 다른 삽입 부위에 도입될 수 있는 경우, 제2 벡터는 또한 폭스바이러스의 게놈에 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 통합을 나타내는 폭스바이러스-상동 서열이 다르다. 상동 재조합이 발생한 후에, 둘 이상의 외래 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 분리될 수 있다. 상기 재조합 바이러스에 추가의 외래 유전자를 도입하기 위해, 감염 및 형질감염의 단계가 감염을 위해 이전 단계에서 분리된 재조합 바이러스를 사용하고 형질감염용 추가 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 추가 벡터를 사용함으로써 반복될 수 있다.
한편, 전술한 바와 같이 감염 및 형질감염의 단계는 상호 교환 가능하다. 즉, 적합한 세포는 외래 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 처음에 형질감염될 수 있고, 이후에 폭스바이러스에 감염될 수 있다. 추가 대안으로서, 또한 각각의 외래 유전자를 다양한 바이러스에 도입하고, 수득된 모든 재조합 바이러스와 함께 세포를 공동-감염시키고 모든 외래 유전자를 포함하는 재조합체를 선별하는 것이 가능하다. 세 번째 대안은 인비트로 DNA 게놈과 외래 서열의 연결 및 헬퍼 바이러스를 사용하여 재조합된 백시니아 바이러스 DNA 게놈의 재구성이다. 네 번째 대안은 박테리아 인공 염색체(BAC)로 클로닝된 백시니아 바이러스 게놈과 백시니아 바이러스 게놈에서의 목적 통합 부위에 인접한 서열에 상응하는 DNA 서열이 측위된 선형 외래 서열 사이에 E.coli 또는 또 다른 박테리아 종에서의 상동 재조합이다.
본 발명에 따른 재조합 MVA 바이러스는 고도의 복제가 제한되어 매우 약독화되기 때문에 인간 및 심지어 면역 손상된 인간을 포함하여 광범위한 포유동물의 치료를 위한 이상적인 후보이다. 또한, MVA-기반 백신의 생산은 MVA가 CEF 세포에서 편리하게 배양될 수 있기 때문에 기존 백신의 기존 생산 능력과 다소 독립적이다. 따라서, 본 발명의 MVA-기반 백신은 단기간에 대량으로 생산될 수 있다. 또한, 본 발명의 MVA 벡터 백신은 많은 HBV 항원을 전달할 수 있으므로, 높은 수준의 체액성 및 세포성 면역을 동시에 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인간을 비롯한 살아있는 동물의 면역 반응을 유도하기 위한 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다.
상기 백신은 바람직하게 104 내지 109 TCID50/ml의 농도 범위, 바람직하게 105 내지 5 x 108 TCID50/ml의 농도 범위, 더욱 바람직하게 106 내지 108 TCID50/ml의 농도 범위 및 매우 바람직하게 107 내지 108 TCID50/ml의 농도 범위의 MVA 바이러스를 포함한다.
인간에 대한 백신 접종량은 바람직하게 106-109 TCID50, 가장 바람직하게 106 TCID50 또는 107 TCID50 또는 108 TCID50의 투약량을 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 일반적으로 담체, 항생제, 방부제, 보조제, 희석제 및/또는 안정제와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능하고/거나 승인된 첨가제를 포함할 수 있다. 그러한 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 코폴리머, 지질 응집체 등과 같은 크고 느리게 대사되는 분자이다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 본 발명에 따른 MVA의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 상기 담체의 특성은 투여 경로에 달려 있다. 상기 약제학적 조성물은 활성을 강화시키거나 치료에 사용되는 다른 제제를 추가로 함유할 수 있다. 그러한 부가적인 인자 및/또는 제제는 본 발명에 따른 면역화 방법에 적용되어 시너지 효과를 일으키거나 부작용을 최소화하기 위한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 MVA의 제제 및 투여 기술은 "Remington 's Pharmaceutical Sciences"(Muck Publishing Gompany, Easton, PA, 최신판)에서 찾을 수 있다.
상기 백신의 제조를 위해, 본 발명에 따른 재조합 MVA는 생리학적으로 허용 가능한 형태로 전환될 수 있다. 이는 천연두에 대한 백신 접종에 사용된 폭스바이러스 백신의 제조 경험을 토대로 수행될 수 있다(Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392에 기술됨).
예를 들어, 정제된 바이러스는 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.4에 제제화 된 5x108 TCID50/ml의 역가로 -80 ℃에서 저장할 수 있다. 백신 주사의 제조를 위해, 예를 들어, 102-108 입자의 바이러스를 앰플, 바람직하게는 유리 앰플 내 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민의 존재 하에 100 ㎖의 인산염 완충 식염수(PBS)에서 동결 건조시킬 수 있다. 대안적으로, 상기 백신 주사는 제형에서 바이러스의 단계적 동결 건조에 의해 제조될 수 있다. 이 제제는 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐 피롤리돈 또는 항산화제 또는 불활성 기체, 안정화제 또는 인비보 투여에 적합한 재조합 단백질(예: 인간 혈청 알부민)과 같은 기타 보조제를 함유할 수 있다. 상기 유리 앰플은 밀봉되어 4 ℃에서 실온으로 수개월 동안 보관할 수 있다. 그러나 필요하지 않는 한, 상기 앰플은 -20 ℃ 이하의 온도에서 보관하는 것이 바람직하다.
백신 접종 또는 치료를 위해, 상기 동결 건조물을 수용액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 트리스 버퍼에 용해시켜 전신 또는 국소적, 즉, 비경 구, 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 투여 경로로 투여할 수 있다. 투여 방식, 투여량 및 투여 횟수는 당업자에 의해 공지된 방식으로 최적화될 수 있다.
바람직한 백신 또는 약제학적 조성물은 본원에 기술된 본 발명의 재조합 MVA를 포함하는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 재조합 MVA는 치료 또는 백신 접종, 바람직하게 치료적 백신 접종, 바람직하게 HBV에 대해 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명의 재조합 MVA는 감염성 질환 또는 B형 간염과 같은 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용한 약제 또는 백신의 제조에 유리하게 사용될 수 있다.
본 발명은 B형 간염에 대한 백신 접종 방법을 추가로 고려한다. 백신 접종 방법은 치료적 백신 접종 방법, 즉 질병 치료 방법일 수 있다. 본 발명의 백신 접종 방법에서, 본원에 기술된 바와 같은 HBV adw 유래의 외피 단백질을 발현하는 MVA 바이러스 및 본원에 기술된 바와 같은 HBV ayw 유래의 코어 단백질을 발현하는 MVA 바이러스가 대상체에 투여된다. 상기 대상체는 본원에서 정의된 임의의 대상체, 바람직하게 인간 대상체일 수 있다. 상기 대상체는 바람직하게 투여가 필요하다. 본 발명의 백신 접종 방법에서, HBV adw 유래의 외피 단백질 및 HBV ayw 유래의 코어 단백질은 두 개의 상이한 MVA에 의해 발현될 수 있으며, 각각의 MVA는 외피 단백질 또는 코어 단백질 중 어느 하나를 발현한다. 이 경우 두 가지 MVA 모두를 대상체에 투여해야 한다. 그러나, HBV adw 유래의 외피 단백질 및 HBV ayw 유래의 코어 단백질은 또한 동일한 MVA에 의해 발현될 수 있다. 이 경우 하나의 MVA만 대상체에 투여해야 한다. 후술되는 실시예가 바람직하다는 것이 이해된다.
또한, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같이, CD70 분자를 추가로 발현하는 HBV adw 유래의 외피 단백질을 발현하는 MVA 바이러스; 및 본원에 기술된 바와 같이, 대상체에 투여되는 CD70 분자를 추가로 발현하는 HBV ayw 유래의 코어 단백질을 발현하는 MVA 바이러스를 포함한다. 상기 대상체는 본원에서 정의된 임의의 대상체, 바람직하게는 인간 대상체일 수 있다. 상기 대상체는 바람직하게는 투여가 필요하다. 또한, 상기 대상체는 바람직하게 치유적 치료가 필요한 만성 B형 간염 환자이다. 본 발명의 백신 접종 방법에서, HBV adw 유래의 외피 단백질과 CD70 분자 및 HBV ayw 유래의 코어 단백질과 CD70 분자는 두 개의 상이한 MVA에 의해 발현될 수 있으며, 각각의 MVA는 상기 외피 단백질과 CD70 또는 상기 코어 단백질 및 CD70을 발현한다. 이 경우 두 가지 MVA를 모두 대상체에 투여해야 한다. HBV adw 유래의 외피 단백질 및 HBV ayw 유래의 코어 단백질 및 CD70 분자는 또한 동일한 MVA에 의해 발현될 수 있다. 이 경우 하나의 MVA만 대상체에 투여해야 한다. 후술되는 실시예가 바람직하다는 것이 이해된다.
또한, 본 발명의 백신 접종 방법은 본 발명의 MVA를 대상체에 투여하는 것을 포함하고, 상기 MVA는 바람직하게 유효량인 것으로 이해된다.
본 발명의 백신 접종 방법은 적어도 둘의 백신 접종 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 면역 반응은 HBV a/adw 유래의 외피 단백질 및/또는 HBVD/ayw 유래의 코어 단백질과 같은 "유리" 단백질이 프라임 백신 접종에 사용되는 프라임/부스트 요법에 의해 유도되며, 본 발명의 하나 이상의 재조합 MVA가 적어도 하나의 부스트 백신 접종에 사용된다.
따라서, 첫 번째 단계(프라임)에서 "단백질 백신"을 대상체에 투여할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단백질 백신"은 HBV A/adw 유래의 외피 단백질 및/또는 HBV D/ayw 유래의 코어 단백질, 바람직하게는 외피 단백질 및 코어 단백질을 포함하는 조성물을 지칭한다. 상기 외피 단백질 및 상기 코어 단백질 모두 바람직하게는 "유리" 단백질이며, 이는 바람직하게는 바이러스 입자에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 외피 단백질 및 코어 단백질은 단독으로 또는 서로 조합하여 투여되는 두 가지 조성물로 존재할 수 있다. 상기 외피 단백질 및 상기 코어 단백질은 또한 단일 조성물로 포함될 수 있다. 상기 "단백질 백신"에 포함된 외피 단백질 또는 코어 단백질은 미생물, 예를 들어 박테리아 또는 곰팡이 세포에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다.
상기 "단백질 백신"은 바람직하게 본질적으로 바이러스 입자가 없으며, 특히 MVA가 본질적으로 없다는 것을 이해한다. 본원에서 "본질적으로 없다"는 것은 단백질 백신이 103 TCID50/ml 미만, 바람직하게 102 TCID50/ml 미만, 바람직하게 101 TCID50/ml 미만, 바람직하게 100 TCID50/ml 미만, 바람직하게 10-1 미만 TCID50/ml, 바람직하게 10-2 TCID50/ml 미만을 포함하는 것을 의미한다. 상기 단백질 백신은 적합한 면역보강제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "면역보강제"는 항원 또는 이의 단편에 대한 숙주의 면역 반응(항체 및/또는 세포 매개)을 강화, 증가 또는 증강시키는 물질을 지칭한다. 적합한 면역보강제는 당업자에게 공지되어 있다. 바람직한 면역보강제는 폴리[디(카르복시에틸페녹시)]포스파젠(PCEP), 면역 자극 올리고뉴클레오타이드, 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, 사포닌 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 TLR 작용제는 TLR 3 작용제, TLR 4 작용제, TLR 7 작용제, TLR 8 작용제 또는 TLR 9 작용제이고, 상기 면역 자극 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게 폴리 I/C, 폴리 ICLC (폴리 I/C의 안정화된 형태) CpG, Rig-I 리간드, STING 리간드, 사이클릭 디-AMP, 사이클릭 디-CMP, 사이클릭 디-GMP, TLR7 작용제, TLR8 작용제, CTA1DD 또는 dmLT 또는 이들의 조합이다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 단백질 백신이 알루미늄 프리 면역보강제, 예를 들어 CpG 면역보강제 또는 PCEP를 포함하면, 본 발명의 백신 접종 방법에 의해 보다 강한 T 세포 반응이 유도된다는 것을 발견하였다. Engerix-B와 같은 HBV 항원을 포함하는 통상적인 백신은 전형적으로 수산화알루미늄과 같은 알루미늄 함유 면역보강제를 포함하기 때문에 이러한 발견은 놀랍다. 결과적으로, 본원에 기술된 단백질 백신은 바람직하게는 CpG 면역보강제 또는 PCEP 또는 둘 모두를 포함한다. 본 발명은 추가로 바이러스 벡터, 바람직하게는 MVA 바이러스 벡터를 제공하며, 상기 면역보강제는 사이클릭 디-AMP이다.
추가 단계(부스트)에서, 본원에 기술된 하나 이상의 재조합 MVA가 대상체에 투여된다. 하나 이상의 재조합 MVA는 본원에 기술된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신에 포함될 수 있다.
전형적으로, 재조합 MVA는 프라임 백신 접종 후 적어도 약 1일, 바람직하게 적어도 약 5일, 바람직하게 적어도 약 1주, 바람직하게 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게 약 2주 내지 약 5주, 바람직하게 약 3주 내지 약 4주 투여된다.
또한, 백신 접종 요법이 프라임 백신 접종 후, 둘 이상의 부스트 백신 접종을 포함한다는 것이 본 발명에 포함된다. 바람직한 구현예에서, 단백질 백신은 프라임 백신 접종 및 첫 번째 부스트 백신 접종에 사용된다. 또한, 상기 단백질 백신을 사용하는 두 번째, 세 번째 또는 추가의 부스트 백신 접종 단계가 수행될 수 있다는 것도 본 발명에 의해 구상된다. 단백질 백신으로 부스트 백신 접종한 다음, 부스트 백신 접종은 본원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 재조합 MVA를 투여함으로써 수행된다. 상기 재조합 MVA의 첫 번째 투여가 두 번째, 세 번째 또는 추가의 투여(추가의 부스트 백신 접종)가 뒤따를 수 있음도 본 발명에 포함된다.
그러한 경우, 상기 단백질 백신으로 첫 번째 부스트 백신 접종은 이전 백신 접종 단계 후 적어도 약 1일, 바람직하게 적어도 약 5일, 바람직하게 적어도 약 1주, 바람직하게 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게 약 2주 내지 약 5주, 바람직하게 약 3주 내지 약 4주 수행된다. 재조합 MVA 또는 단백질 백신으로 임의의 후속 부스트 백신 접종은 이전 백신 접종 후 약 1일 이상, 바람직하게 약 5일 이상, 바람직하게 약 1주 이상, 바람직하게 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게 약 2주 내지 약 5주, 바람직하게 약 3주 내지 약 4주 수행된다.
본 발명의 백신 접종 방법은 또한 프라임-부스트 백신 접종 전에 siRNA 및/또는 shRNA로 대상체의 치료를 포함할 수 있다. 그러한 siRNA 또는 shRNA는 HBV 유전자를 표적으로 하는 것으로 계획되어 HBV로 감염된 대상체에 상기 표적화된 HBV 유전자의 발현을 감소시킨다. 바람직하게는, siRNA 및/또는 shRNA는 상기 표적화된 HBV 유전자를 인코딩하는 RNA의 3 '영역을 표적으로 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 표적화된 HBV 유전자를 인코딩하는 RNA의 표적화된 3 '영역은 RNA의 폴리 A 테일의 상류에 위치한다(즉, 상기 표적화된 영역은 폴리 A 테일의 5 '또는 다른 말로는 5'에서 3 '방향으로 표적화된 영역이 먼저 오고 이어서 폴리 A 테일이 뒤따른다). siRNA가 사용된다면 적어도 하나의 HBV 유전자가 표적화될 것으로 예상된다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 모든 HBV 유전자가 표적화된다. 하나의 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 HBV 유전자를 표적화할 수 있다. 그러나, 하나 이상의 siRNA 및/또는 shRNA가 HBV 유전자를 표적화하는데 사용될 수도 있다. 그러한 siRNA 및/또는 shRNA로의 치료는 표적 유전자의 발현(즉, 번역)을 적어도 약 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 또는 85%, 바람직하게 적어도 약 90% 감소시키는 것으로 생각된다. 그러한 siRNA 및/또는 shRNA로 대상체의 치료는 프라임-부스트 백신 접종으로 시작하기 전, 1일 내지 20주, 1주 내지 19주, 2주 내지 18주, 3주 내지 17주, 4주 내지 16주, 5주 내지 15주, 6주 내지 14주, 7주 내지 13주, 바람직하게 약 8주 수행될 수 있다. 본 발명자는 놀랍게도 프라임-부스트 백신 접종으로 시작하기 전 그러한 siRNA 및/또는 shRNA의 치료가 프라임-부스트 백신 접종 후 생성된 T 세포 반응을 증가시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명에 따른 면역 방법은 치료학적 유효량의 단백질 백신 또는 재조합 MVA를 사용할 것이다. 또한, 치료 유효량은 증상의 개선, 예, 그러한 증상의 치료, 치유, 예방 또는 개선을 초래하기에 충분한 화합물/성분의 양을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 면역화는 예방적 및/또는 치료적 둘 다일 수 있다. 면역 반응에 영향을 미치는 본 발명의 유효량은 항원 또는 백신의 유형, 투여 수단, 표적 부위, 대상체 인간 또는 동물 여부, 및 치료가 예방적 또는 치료적인지를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라진다. 재조합 MVA의 바람직한 투여량은 본원에 기술되어 있다.
본 발명은 조류를 비롯한 대상 동물을 면역화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 방법은 대상체에 MVA의 투여량을 투여하는 단계를을 포함한다. 상기 동물은 래트, 토끼, 돼지, 마우스 및 인간을 포함하는 포유동물이다. 가장 바람직하게, 상기 대상체는 인간이다. 하나의 구현예에서, 상기 대상체는 성인이다.
투여는 당업자에 의해 결정되는 임의의 투여 경로에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 투여는 비경구, 장 점막, 바람직하게 근육 내, 정맥 내, 피하(예, 긁힘 또는 주사에 의한), 비강(예, 흡입에 의한) 또는 구강이다. 바람직한 투여 방식은 비경구 또는 점막이다.
또한, 본 발명은 근육 내 투여를 제공하며, 투여는 면역보강제의 투여를 포함한다. 바람직하게, 상기 면역보강제는 사이클릭 디-AMP를 포함한다.
추가로, 본 발명은 또한 피하 또는 근육 내 투여를 포함하며, 상기 투여는 면역보강제의 투여를 포함한다. 바람직하게, 상기 면역보강제는 폴리 I/C 또는 Rig-I-리간드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 백신 접종 벡터가 MVA가 아니라 MVA와 동일한 항원을 발현하는 하나 이상의 살모넬라 균주인 전술된 백신 접종 방법을 고려한다. 따라서, 본원에 기술된 백신 접종 방법은 살모넬라 균주를 이용한 백신 접종 방법에 대해 준용된다. 그러한 백신 접종 방법은 바람직하게는 점막 백신 접종 방법이며, 상기 단백질 백신은 바람직하게 CTA1DD 또는 dmLT로 면역보강된다.
본 발명은 또한 이들 방법에 사용하기 위한 본원의 방법에 개시된 임의의 화합물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 개시된 백신 접종 방법에 사용하기위한 재조합 MVA를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 재조합 백신 접종 벡터 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신을 고려한다. 이미 언급했듯이 "백신"은 대상체의 병리학 적 상태를 예방하거나 치료하는데 사용할 수 있다. 상기 용어는 서브유닛 백신, 즉 항원이 본질상 결합되어 있는 전체 유기체로부터 분리되고 분리된 항원을 함유하는 백신 조성물 뿐만 아니라 특히 항원 및/또는 이의 에피토프를 운반하는 본 발명의 재조합 폭스바이러스를 함유하는 조성물을 포함한다. 상기 백신은 활성 성분의 면역 활성을 증진시키는 하나 이상의 추가 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 또한, 백신은 약제학적 조성물에 통상적인 추가 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신은 바람직하게 인간 및/또는 가축용으로 사용된다.
본 발명의 상기 백신 또는 상기 조성물, 예를 들어 MVA 바이러스를 포함하는 백신은 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제, 항생제, 보존제, 보조제, 희석제 및/또는 안정화제를 포함할 수 있다. 그러한 보조 물질은 물, 식염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등일 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체 등과 같은 크고 느리게 대사되는 분자이다. US 2011/0052627 Col. 7에 기재된 다른 담체도 조성물에 첨가될 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 바이알/용기가 1차 접종(프라이밍 접종) 및 추가 접종(부스트 접종)을 위한 임의로 추가 바이알을 포함하는 프라임/부스트 면역화를 위한 적어도 둘의 바이알/용기를 포함하는 키트를 포함하며, 상기 추가 바이알은 바람직하게 본 발명의 재조합 백신 접종 벡터를 포함한다. 상기 키트는 또한 적어도 하나의 추가 접종("부스팅 접종")을 위한 본원에 기술된 재조합 백신 접종 벡터를 포함하는 적어도 하나의 추가 바이알/용기를 포함한다. 상기 키트는 대상체에 재조합 백신 접종 벡터를 투여하기 위한 지시 사항을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 바람직한 대상체가 인간인 것을 고려한다. 상기 지시 사항은 본원에서 정의된 단백질 백신 및/또는 재조합 백신 접종 벡터가 특정 시점에서 다회(즉, 2, 3, 4, 5, 6 등) 투여량으로 대상체에 투여됨(예, 이전 투여 후 적어도 4주, 적어도 6주, 적어도 8주)을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 상기 지침 사항은 상기 단백질 백신 및/또는 재조합 백신 접종 벡터가 적어도 3회 또는 적어도 4회의 투여량으로 투여되어야 함을 나타낸다.
본원에 기술된 키트 또한 본 발명에 의해 고려되며, 상기 키트에 포함된 백신(들)은 비경구 투여에 적합하다. 그러한 키트에서, 상기 단백질 백신은 바람직하게 PCEP 및/또는 CpG 백신으로 면역보강될 수 있으며, 상기 재조합 백신 벡터는 바람직하게는 본 발명의 MVA일 수 있다.
본원에 기술된 키트 또한 본 발명에 의해 고려되며, 상기 키트에 포함된 백신(들)은 점막 투여에 적합하다. 그러한 키트에서, 상기 단백질 백신은 바람직하게 CTA1DD, dmLT, PCEP, c-di-AMP, c-di-CMP, c-diGMP 또는 이들의 조합으로 면역보강될 수 있으며, 상기 재조합 백신 접종 벡터는 바람직하게 살모넬라 균주, CMV-, VSV-계열 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 홍역 벡터, 바람직하게는 본 발명의 살모넬라 균주일 수 있다.
추가로, 본원에 기술된 키트 또한 본 발명에 의해 고려되며, 상기 키트에 포함된 백신(들)은 점막 투여에 적합하다. 그러한 키트에서, 상기 단백질 백신은 바람직하게 CTA1DD, dmLT, PCEP, 폴리 I/C, 리그 I-리간드, c-di-AMP, c-di-CMP, c-diGMP 또는 이들의 조합으로 면역보강될 수 있으며, 상기 재조합 백신 접종 벡터는 바람직하게 살모넬라 균주, CMV-, VSV-계열 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 홍역 벡터일 수 있다.
또한, 본 발명은 단백질 조성물이 근육 내 투여에 적합한 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 조성물은 적어도 하나의 사이클릭-디-AMP인 면역보강제를 포함한다.
또한, 키트 또한 본 발명에 의해 고려되며, 상기 단백질 조성물이 피하 또는 근육 내 투여에 적합하다. 바람직하게, 상기 조성물은 적어도 하나의 폴리 I/C인 면역보강제를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 재조합 MVA를 포함하는 (숙주) 세포를 제공한다. 폭스바이러스에 허용되는 세포의 예는 COS, HEK-293, BHK, CHO, TM4, CVI, VERO-76, HELA, MDCK, BRL 3A 및 NIH/3T3 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. MVA의 경우, 바람직한 세포는 CEF 및 BHK 세포이다. 추가의 세포주는 당업자에게 공지되어있다. 세포 내로의 폭스바이러스 구조물의 도입은 칼슘 포스페이트 형질감염, 전기 천공법, 감염 및 당업계에 공지되어 있고 Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons, Inc. New York과 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 재조합 폭스바이러스에 감염된 (숙주) 세포를 제공한다. 따라서, 상기 (숙주) 세포를 MVA 바이러스 벡터로 감염시키고, 삽입될 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터와 같은 추가 벡터로, 바람직하게 MVA 또는 폭스바이러스 발현 조절 요소 또는 합성 PrS 프로모터와 같은 프로모터의 전사 조절 하에 형질감염할 수 있다, 전술된 바와 같이, 상기 플라스미드 벡터는 이종 서열의 삽입을 자연적으로 발생하는 결실 부위 또는 유전자 간 부위 중 하나에 인접하는 것과 같은 폭스바이러스 게놈의 선택된 부분으로 유도할 수 있는 서열을 포함한다.
본원에 사용되는 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 주어진 값 또는 범위의 10% 또는 5%의 편차와 같은 20%의 편차 내를 의미한다.
도 1 : 단백질- 프라임 / MVA - 부스트 백신 접종은 면역 원성이 매우 높다. (A) HBV 아형 ayw의 S 및 코어 오픈 리딩 프레임은 폭스바이러스성 프로모터 P7.5 및 PH5 각각의 조절 하에 MVA 게놈의 결실 III (del III)에 삽입되었다. (B) MVA-S (1x108 i. u.), MVA-코어 (1x108 i. u.) 또는 MVAwt (1x108 i. u.)로 야생형 마우스 (n = 3)를 1회(0 일; 채워진 막대) 또는 2회(0일과 21일; 스트라이프 막대) 1x108 iu) 백신 접종하였다. 8일(프라임 후) 또는 27일(부스트 후)에, 비장 세포를 HBsAg (S190 및 S208)- 또는 HBcAg (C93)-유래 펩타이드로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색(ICS)D으로 IFNγ 발현을 분석하였다. (C) C57BL/6 마우스에 12μg의 재조합 HBsAg 또는 HBcAg 백신 접종하였다. CpG를 면역보강제로 사용하였다. 8일에, 비장 세포를 HBsAg- 또는 HBcAg-유래 펩타이드로 자극하고 ICS에 의한 IFNγ 발현을 분석하였다. (D) C57BL/6 마우스에 12 μg의 재조합 CpG 면역보강된 HBcAg 또는 HBsAg로 프라임 백신 접종하고, 21일에, MVA-코어(1x108 i. u.) 또는 MVA-S(1x108 i. u.)로 부스트 접종하였다. 27일에, 비장 세포를 HBsAg- 또는 HBcAg-유래 펩타이드로 자극하고 ICS에 의한 IFNγ 발현을 분석하였다. 혈청을 경쟁적 ELISA(오른쪽 패널)에 의해 항-HBc 또는 면역 분석법(중간 패널)에 의해 항-HBs에 대해 분석하였다. IFNγ 생성 T-세포의 빈도는 백그라운드를 제거한 것이다. S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff); i. u. 감염 단위(infectious units).
도 2: 백신 접종-유도된 HBV -특이적 항체- 및 CD4+ T-세포 반응은 항원혈 증과 역 상관관계에 있다. (A-D) 저(low), 중(medium) 및 고(high) 항원혈증의 HBVtg 마우스(n = 4)를 CpG 면역보강된 HBsAg 또는 HBcAg로 면역화시켰다. 21일에, 마우스에 MVA-S (1x108 i. u.) 또는 MVA-코어 (1x108 i. u.)를 각각 부스트 접종하였다. 27일 (부스트 후 6일), (A) 항-HBs 및 (B) 항-HBc 항체에 대해 혈청을 분석하였다. (C) 저-항원혈증 HBVtg 마우스의 비장 세포 및 간-관련 림프구를 HBsAg로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색에 의해 IFNγ-발현 CD4+ T-세포를 분석하였다. IFNγ 생성 T-세포의 빈도는 백그라운드를 제거한 것이다. S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff); neg. = 네가티브; i. u. 감염 단위(infectious units).
도 3: 백신 접종-유도된 HBV -특이적 CD8+ T-세포 빈도는 항원혈증과 역 상관관계에 있다. 저, 중, 고 항원혈증의 HBVtg 마우스 (n = 4)를 12㎍ CpG 면역보강된 HBsAg 또는 HBcAg으로 면역화시켰다. 21일에, 마우스에 MVA-S(1x108 i. u.) 또는 MVA-코어 (1x108 i. u.)를 부스트 접종하였다. 27일에, 비장 세포(A) 및 간-관련 림프구(B)를 HBsAg (S109 및 S208)- 또는 HBcAg (C93)-특이적 펩타이드로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색로 IFNγ 발현을 분석하였다. 상단 및 중간 패널은 예시적인 동물을 나타내며, 가장 낮은 패널은 백그라운드 제거(background subtraction) 후에 IFNγ-생성 T-세포의 빈도를 제공한다. i. u. 감염 단위(infectious units).
도 4: 백신 접종에 의해 유도된 HBV -특이적 CD8+ T 세포의 기능성. 야생형 마우스, 중 및 저 항원혈증성 HBVtg 마우스에 CpG 면역보강된 HBsAg으로 면역화시켰다. 21일째, 마우스에 MVA-S(1x108 i. u.)로 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에, CD107a 및 IFNγ 발현에 대해 S-특이적 비장 유래 CD8+ T-세포를 분석하였다(A). (B) 펩타이드 S190로 자극 후, IFNγ-, IL-2 및 TNFα-발현에 대해 S-특이적 비장 또는 간 유래 CD8+ T- 세포를 분석하였다. (C) S190-특이적 CD8+ T-세포의 멀티머 염색 및 CD127 및 KLRG-1 표면 발현을 위한 동시 염색. i. u. 감염 단위(infectious units).
도 5: 고 항원혈증성 HBVtg 마우스에서 이종 백신 접종은 T-세포 내성를 파괴한다. (A) S 아형 ayw 및 adw 오픈 리딩 프레임은 강한 폭스바이러스 프로모터 PH5의 조절 하에 MVA 게놈의 결실 III (del III)에 위치하였다. (B)-(D) 고 항원혈증성 HBVtg 마우스 (n> 4)에 0일과 14일째 상기 제시된 면역보강제와 함께 16 μg HBsAg (아형 ayw 또는 adw)과 16 μg HBcAg (아형 ayw)을 백신 접종하였다. 28일째, 마우스에 MVA-PH5-S (5x107 i. u; 아형 ayw 또는 adw) 및 MVA-코어 (5x107 i. u.)를 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에 (B) 비장 세포 (좌측 패널) 및 간-관련 림프구 (LAL, 우측 패널)를 분리하고 펩타이드 S109 및 S208 (제시된 경우 아형 adw) 또는 C93으로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색로 IFNγ-발현을 분석하였다. (C) 비장 세포와 LAL은 HBsAg-특이적 15-mer 펩타이드(아미노산 145-226, 아형 ayw 커버링)의 C-말단 풀(pool)로 자극하고 ICS로 IFNγ-발현 CD4+ T-세포를 분석하였다. (D) IFNγ를 발현하는 S208-특이적 CD8+ T-세포의 대표적인 FACS 플롯으로 TNFα 및 IL-2 발현을 분석하였다. IFNγ 생성 T-세포 빈도의 평균±SEM은 백그라운드 제거를 나타낸다. ns: 유의하지 않음(not significant). * p <0.05, ** p <0.01 students t-test; i. u. 감염 단위(infectious units).
도 6: 고 항원혈증성 HBVtg 마우스에서 이종 백신 접종은 혈청 전환을 유도한다. (A)-(D) 고-항원혈증성 HBVtg 마우스 (n> 4)에 0일과 14일째 CpG와 PCEP가 면역보강된 16 μg HBcAg (아형 ayw)과 16 μg HBsAg (제시된 대로 아형 ayw 또는 adw)를 접종하였다. 28일에 마우스에 MVA-PH5-S (5x107 i.u.; 아형 ayw 또는 adw) 및 MVA- 코어 (5x107 i.u.)를 부스트 접종하였다. 대조군으로 5마리의 고 항원혈증성 HBVtg 마우스에 0일과 14일째 면역보강제 CpG와 PCEP를 접종한 다음 1x108 MVA-wt를 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에, (A) 항-HBs 또는 (B) 항-HBc 항체의 존재에 대해 혈청을 분석하였다. (C) HBVtg 마우스의 항-HBs 양성 혈청을 아형 ayw HBsAg의 중화 능에 대해 분석하였다. (D)는 백신 접종 전후의 혈청 HBsAg 수치를 나타낸다. 평균±SEM을 나타낸다. ns: 유의하지 않음. S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff). ** p <0.01 students t-test.
도 7: MVA 벡터에 의한 HBV 항원의 발현. (A) 및 (B) 마우스 NIH-3T3 세포를 MVA-S, MVA-코어 또는 MVAwt (10의 MOI)로 감염시켰다. 감염 후 16시간(A) 총 세포 용해물을 웨스턴 블롯으로 HBsAg 및 HBcAg 발현에 대해 분석하였다. 상등액에서 분비된 HBsAg(B)는 HBsAg-특이적 ELISA으로 측정되었다. S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff).
도 8: CpG 면역보강된 HBsAg로 백신 접종. 고-항원혈증성 HBVtg 마우스를 면역보강제인 CpG를 함유하는 12 ㎍ HBsAg로 면역화시켰다. 21일째, 마우스에 MVA-S를 부스트 접종하였다. 프라임 면역 후 0, 27, 35, 42, 49 및 56일에 혈청을 HBsAg 및 항-HBs의 수준에 대해 분석하였다. S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff).
도 9: 단백질- 프라임 백신 접종에 대한 면역보강제의 비교 . (A)-(C) 야생형 마우스에 0일째 상기 제시된 면역보강제와 함께 16 μg HBsAg (아형 ayw)과 16 μg HBcAg (아형 ayw)를 백신 접종하였다. 28일에 마우스에 MVA-PH5-S (5x107 i.u.;아형 ayw) 및 MVA-코어(5x107 i.u) 부스트 후 6일에 혈청을 (A) 항-HBs 및 (B) 항-HBc의 존재에 대해 분석하였다. (C) 부스트 후 6일에 비장 세포를 HBsAg (S190 및 S208adw)- 또는 HBcAg (C93)-특이적 펩타이드로 자극 후 ICS로 분석하였다. 바는 백그라운드 제거 후 IFNγ 양성으로 염색된 CD8+ 세포의 백분율 (평균±SEM)을 보여준다. i. u. 감염 단위(infectious units).
도 10: HBVtg 마우스의 그룹화. 마우스를 HBVtg 마우스의 경우 혈청에서 측정된 바이러스 역가와 밀접하게 관련되는 항원 수준에 따라 그룹화하였다.
도 11: T-세포를 자극하기 위해 사용되는 펩타이드 . 이 표는 마우스 Kb/Kd MHS-1 대립 형질에 의해 제한된 CD8+ T-세포 반응을 측정하는데 사용되는 펩타이드의 서열을 나타낸다. S 풀(pool)은 마우스 및 인간의 CD4+ 및 CD8+ T-세포 반응을 광범위하게 측정하는데 사용되었다.
도 12: 실시예 4의 백신 접종 계획에 대한 그래프 개요. 고 항원혈증성 HBVtg 마우스 (≥4)에 16 μg의 HBsAg (아형 ayw 또는 adw) 및 16 μg의 HBcAg (아형 ayw)로 백신 접종하였다. 28일째 마우스에 MVA-PH5-S (5x10e7 i.u.; 아형 ayw 또는 adw) 및 MVA-코어 (5x10e7 i.u.)를 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에, (B) 비장 세포(좌측 패널) 및 간-관련 림프구(LAL, 우측 패널)를 분리하고 펩타이드 S109 및 S208 (제시된대로 아형 adw) 또는 C93으로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색(ICS)로 IFNγ 발현을 분석하였다.
도 13: HBV 특이적 CD8+ T 세포의 멀티머 및 세포 내 사이토카인 염색의 상관관계. HBVtg 마우스를 면역보강제인 CpG를 함유하는 12 ㎍ HBsAg로 면역화시켰다. 21일째, 마우스에 MVA-S를 부스트 접종하였다. HBV-특이적 T-세포 반응은 펩타이드 S190으로 생체 외(ex vivo)로 재자극한 후 S190 멀티머 염색 또는 ICS에 의해 28일에 검출되었다.
도 14: 혈청 면역 복합체의 검출. HBVtg 마우스를 CpG로 면역보강된 HBsAg으로 면역화시켰다. 21일째, 마우스에 MVA-S(1x108 i.u.)를 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에, 혈청을 침전된 면역 복합체에서 항-HBs, HBsAg 및 HBsAg에 대해 분석하였다. i. u. 감염 단위(infectious units). nd; 검출 불가.
도 15: 다양한 백신 면역보강제의 비교. 야생형 CH57Bl/6 마우스를 다양한 면역보강제 제제로 복합화된 HBcAg 및 HBsAg로 면역화시켰다. 1: CpG + 명반(alumn) 하이드록사이드; 2: 폴리포스파젠 PCEP + 명반; 3: PCEP + CpG + 명반; 4: CpG만; 5: PCEP만; 6: CpG + PCEP. 28일에 모든 동물을 MVA 발현 코어 및 S 아형 adw로 부스트 접종하였다. 도 15A-B는 28일 (단백질 프라임만) 및 34일 (단백질 프라임 + MVA 부스트) 후 항-HBs (도 15A) 및 항-HBc (도 15B) 항체 반응을 나타낸다. 도 15C-D는 프라임 (도 15C) 후 및 MVA-부스트 (도 15D) 후 S 및 코어 에피토프에 대한 CD8+ T-세포 반응을 나타낸다 (도 15D). 도 15E는 HBV 아형 ayw을 감염 전에 제시된 혈청 희석물과 함께 배양하고 감염된 세포에 의한 HBsAg 분비를 4, 7 및 10일 후에 측정하는 중화 검정을 나타낸다.
도 16: 다항원성 오픈 리딩 프레임. 도 16A는 SEQ ID NO: 7로 나타낸 다 항원성 폴리펩타이드 사슬의 구조를 도시한다. 도 16B는 HBsA/adw 및 C/ayw 항원을 포함하는 서브바이러스 입자의 형성을 개략적으로 도시한다. 도 16c는 HBcD/ayw 및 C/ayw 항원을 포함하는 빈 캡시드의 형성을 개략적으로 도시한다.
도 17은 SEQ ID NO : 7로 나타낸 다항원성 폴리펩타이드 사슬에서 유래된 완전히 가공된 단백질 및 이의 운명의 개략도.
도 18은 SEQ ID NO : 7로 나타낸 다항원성 폴리펩타이드 사슬에서 유래된 부분적으로 가공되지 않은 단백질 및 이의 예상 운명의 개략도. 부분적으로 가공되지 않은 대부분은 분비된 바이러스-유사 입자/필라멘트로의 결합으로 인해 면역 반응을 증가시키는 것으로 추측된다(특히, 적응 면역 반응을 강화시키고 확대시킨다):
도 19: C-말단 돌출부를 포함하는 HBV A2/ adw2의 소형 외피 단백질의 아미노산 서열( SEQ ID NO : 10). 밑줄 친 서열은 C-말단 돌출부가 없는 HBV A2/adw2의 소형 외피 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 8)에 해당한다. C-말단 돌출부는 SEQ ID NO : 9에 해당하는 P2A 분열 단편이다.
도 20: N- 및 C-말단 돌출부를 포함하는 HBV D/ ayw의 코어 단백질 단편 1-149의 아미노산 서열( SEQ ID NO : 12). 밑줄 친 서열은 N- 및 C- 말단 돌출부가 없는 HBV D/ayw의 코어 단백질 단편 1-149의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 11)에 해당한다. C-말단 돌출부는 SEQ ID NO : 9에 해당하는 P2A 분열 단편이다.
도 21: N- 및 C-말단 돌출부를 포함하는 HBV 폴리머라제의 RT 도메인의 아미노산 서열( SEQ ID NO:16 ). 밑줄 친 서열은 N- 및 C- 말단 돌출부가 없는 HBV 폴리머라제의 RT 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 6)에 해당한다. C- 말단 돌출부는 SEQ ID NO : 13에 해당하는 T2A 절단 단편이다.
도 22: N- 및 C-말단 돌출부를 포함하는 HBV C/ ayw의 대형 외피 단백질의 아미노산 서열( SEQ ID NO : 14). 밑줄 친 서열은 N- 및 C-말단 돌출부가 없는 HBV C/AYW의 대형 외피 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 4)에 해당한다. C-말단 돌출부는 SEQ ID NO : 13에 해당하는 T2A 절단 단편이다.
도 23: N-말단 돌출부를 포함하는 HBV C/ ayw의 코어 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 15). 밑줄 친 서열은 N-말단 돌출부가 없는 HBV C/ayw의 코어 단백질의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 5)에 해당한다.
도 24는 HBV 폴리머라제의 RT-도메인 공통 서열의 아미노산 서열( SEQ ID NO : 3)을 나타낸 것이다.
도 25: 유전형 C HBV 균주의 대형 외피 단백질의 공통 서열의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 1).
도 26: 유전형 C HBV 균주의 코어 단백질의 공통 서열의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 2).
도 27: RNAi와 치료적 백신 접종의 조합. (A) 시험 배치. HBVxfs 형질전환 마우스는 HBV-특이적 siRNA (siHBV), 무관한 siRNA (siNEG)를 투여받거나 치료하지 않고 남겨 두었다. 8주 후, 모든 마우스는 HBV 코어 및 표면 항원(HBcAg 및 HBsAg)으로 단백질 프라임-MVA 부스트하여 면역 치료를 강화하였다. (B) HBV-특이적 siRNA/shRNA 디자인의 개략도.
도 28: HBV 항원 수준 및 항체 반응 및 CD8+ T-세포 반응. (A) 혈청 HBeAg 및 HBeAg 수준의 동역학. (B) 희생 (91일, 13 주(W))의 시점에서 생쥐의 혈청 내 항-HBs 항체. (C) 프라임-부스트 백신 접종 후 간 및 비장에서 측정된 CD8+ T-세포 반응.
도 29 : 최적 MVA 투여량 추정.
저(low) 및 중(medium) 항원혈증성 HBVtg 마우스를 혈청 HBeAg 수준에 따라 분류하였다. (A) HBVtg 마우스 그룹 (n = 3-4)을 c-di-AMP가 면역보강된 미립자 HBcAg 15μg로 2주 간격, 2회 면역화시켰다. 28일째, 마우스에 4가지 상이한 투여량의 MVA- 코어 (각각 3x106, 1x107, 3x107, 1x108 PFU)를 부스트 접종하였다. HBsAg, HBeAg, 항-HBs 및 항-HBc 항체 (B) 및 ALT 수준 (C)에 대해 0일 및 35일(부스트 후 7일)에 마우스 혈청을 분석하였다. (D) 35일에 HBVtg 마우스의 비장 세포 및 간-관련 림프구를 분리하고, MVA-유래 펩타이드 B8R 또는 HBcAg-유래 펩타이드 c93으로 자극하고, 세포 내 사이토카인 염색으로 IFNγ- 발현 CD8+ T-세포를 분석하였다. IFNγ 생성 T-세포의 빈도는 백그라운드 제거한 것이다. i.m.-근육 내 면역화; S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff). PFU-흑사병 형성 단위; U-단위; IU- 국제 단위.
도 30: 단백질 프라이밍용 면역보강제로 c- di - AMP의 평가. 중 및 고 항원혈증성 HBVtg 마우스를 혈청 HBeAg 수준에 따라 분류하였다. (A) HBVtg 마우스 그룹 (n = 7)을 미립자 HBsAg 15μg과 c-di-AMP, 또는 CpG/PCEP의 조합으로 면역보강된 HBcAg 15μg의 혼합물로 2주 간격으로 면역화시켰다. 28일째, 마우스에 108 MVA-S/코어를 부스트 접종하였다. c-di-AMP로 2회 주사되고 '빈(empty)' MVA (MVAwt)로 부스트 접종된 HBVtg 마우스 (n = 4)를 대조군으로 사용하였다. 0일과 34일(부스트 후 6일)에서의 마우스 혈청을 ALT 수준 (B), HBsAg, HBeAg, 항-HBs 및 항-HBc 항체 (C-D)에 대해 분석하였다. (E) 34일에 HBVtg 마우스 (n = 4)의 비장 세포 및 간-관련 림프구를 분리하고 HBcAg-유래 펩타이드 c93 또는 HBsAg-유래 펩타이드 s208로 자극하고 세포 내 사이토카인 염색으로 IFNγ-발현 CD8+ T-세포를 분석하였다. IFNγ 생성 T-세포의 빈도는 백그라운드 제거한 것이다. i.m.-근육 내 면역화; S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff). PFU-흑사병 형성 단위; IU- 국제 단위.
도 31: 다양한 면역보강제(c- di - AMP , 폴리 - IC 및 RIG -I 리간드)에 대한 최적 전달 경로의 추정 저 및 중 항원혈증성 HBVtg 마우스를 혈청 HBeAg 수준에 따라 분류하였다. (A) HBVtg 마우스 그룹 (n = 5)을 미립자 HBsAg 15 μg과 c-di-AMP, 폴리-IC 또는 RIG-I 리간드를 면역보강된 HBcAg 15 μg의 혼합물로 2주 간격으로 면역화시켰다. 28일째, 마우스에 6x107 MVA-S/코어를 부스트 접종하였다. 면역화는 근육 내 경로에 의해서만 수행되거나 단백질 프라이밍은 피하 투여 후 복강 내 부스트에 의해 수행된다. HBsAg, HBeAg, 항-HBs 및 항-HBc 항체 (A)에 대해 0일 및 34일에서의 마우스의 혈청을 분석하였다. HBVtg 마우스의 무게를 실험 (B)에 걸쳐 매주 모니터링하였다. (C) 34일에, HBVtg 마우스의 비장 세포 및 간-관련 림프구를 분리하고, MVA- 유래 펩타이드 B8R, HBsAg-유래 펩타이드 s208 또는 HBcAg-유래 펩타이드 c93으로 자극하였다. 이어서, 세포 내 사이토카인 염색으로 IFNγ-발현 CD + T-세포에 대한 세포를 분석하였다. IFNγ-생성 T-세포의 빈도는 백그라운드 제거한 것이다. i.m.-근육 내 면역화; S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff). PFU-흑사병 형성 단위; IU- 국제 단위.
도 32: C57BL /6 마우스에서 새로운 MVA 구조물( MVA HBVvac )의 평가 (A) MVA-S/코어 및 MVA-HBVVac의 도식 묘사. (B) 제시된 MVA 클론을 생산하는 세포에서의 용해물의 웨스턴 블랏 분석. 다클론항체를 사용하여 비-글리코실화 및 글리코실화된 S에 대한 염색. (C) C57BL/6 마우스 그룹 (n = 5)에 미립자 HBsAg 20 μg과 c-di-AMP가 면역보강된 HBcAg 20 μg의 혼합물을 1회 프라임 접종하였다. 2주 후, 6x107 MVA-S/코어 또는 HBsAg, HBcAg 및 HBV 폴리머라제의 RT 도메인을 발현하는 6x107 MVA-HBVvac을 마우스에 부스트 접종하였다. (D) 항-HB 및 항-HBc 항체에 대해 21일(부스트 후 6일)에서의 마우스 혈청을 분석하였다. (E) 21일에, 비장 세포를 분리하고 MVA-유래 펩타이드 B8R, HBsAg-, HBcAg- 및 HBV RT-특이적 펩타이드 및 펩타이드 풀로 자극하였다. 난백 알부민-유래 펩타이드 SIINFEKL을 음성대조군로 사용하였다. 이어서, 세포 내 사이토카인 염색으로 IFNγ-발현 CD8+ T-세포를 분석하였다. 적색 화살표는 양성 RT-특이 CD8+ T-세포 반응을 나타낸다. i.m.-근육 내 면역화; S/CO: 시그널 투 컷오프(signal to cutoff). PFU-흑사병 형성 단위; IU- 국제 단위.
도 33: CD70을 추가로 발현하는 재조합 백신 접종 벡터( rMVA )의 구조물의 뉴클레오타이드 서열( SEQ ID NO : 27). 상기 구조물의 다양한 도메인은 다음과 같이 표시된다: DEL III-인접 서열 1, mH5 프로모터, HB코어 단백질, P2A, 인간 CD70 분자, IRES (EMCV), eGFP, Del III-인접 서열 2.
도 34: C57BL /6 마우스에서 CD70을 발현하는 MVA의 평가. (A) MVA코어 및 MVA코어-CD70의 도식 묘사. 두 벡터 모두 HBV 코어 유전형 D 서열과 GFP를 발현하여보다 쉽게 정제할 수 있다. 또한, MVA코어-CD70은 CD70 유전자를 발현한다. (B) C57BL/6 마우스 그룹 (n = 6-7)에 PCEP와 CpG가 면역보강된 20μg 미립자 HBcAg을 근육 내 1회 프라임 접종하였다. 3주 후, 마우스에 108 i.u. MVA코어 또는 108 MVA코어-CD70 또는 108 MVA-야생형(MVAwt)을 복강 내 주사하여 부스트 접종하였다. (C) 35일에 비장 세포를 분리하고 MVA-유래 펩타이드 B8R 또는 코어-펩타이드 C93으로 자극하였다. 난백 알부민-유래 펩타이드 SIINFEKL은 음성 대조군으로 사용되었다. 이어서, 세포 내 사이토카인 염색로 IFNγ-발현 CD8+ T-세포에 대해 세포를 분석하였다. 데이터는 그룹당 평균±SD로 얻는다. 점(dot)은 개별 마우스에서 측정된 값을 나타낸다. i. u.-감염 단위.
도 35: HBV 형질전환 마우스에서 CD70을 발현하는 MVA의 평가. (A) MVA코어 및 MVA코어-CD70의 도식 묘사. 두 벡터 모두 HBV 코어 유전형 D 서열과 GFP를 발현하여 보다 쉽게 정제할 수 있다. 또한, MVA코어-CD70은 CD70 유전자를 발현한다. (B) 1.3배 초과하는 게놈 (n = 5-6)을 갖는 형질전환 마우스 그룹에 PCEP 및 CpG로 면역보강된 20㎍ 미립자 HBcAg를 근육 내 1회 프라임 접종하고 3주 후, 108 i.u. MVA코어 또는 108 MVA코어-CD70을 복강 내 주사하여 부스트 접종하였다. 108 MVA-야생형(MVAwt)으로 처리된 2마리의 마우스를 대조군으로 사용하였다. (C) 35일에, 간-관련 림프구(LAL)를 분리하고 MVA-유래 펩타이드 B8R 또는 코어-펩타이드 C93으로 자극하였다. 자극받지 않은 세포는 음성 대조군으로 사용되었다. 세포를 세포 내 사이토카인 염색 후 유동 세포 계측법으로 IFNγ(적색) 및 IL-2(청색)에 대해 분석하였다. 3마리 대표 동물에 대한 FACS 플롯을 보여준다.
실시예
마우스 및 백신 접종
C57BL/6 야생형(wt) 및 HBV-형질전환 마우스(F. Chisari, The Scripps Institute, La Jolla, CA, USA에 의해 친절하게 제공된 균주 HBV1.3.32 (Guidotti et al., J Virol 1995; 69:6158-69)(HBV 유전형 D, 아형 ayw))는 기관 지침에 따라 특정 병원균이 없는 조건 하에서 사내 브리딩으로 입수되었다. 단백질 백신 접종을 위해, 50 μl PBS 내 합성 포스포로티오에틴 CpG ODN 1668 31.91 μg 및/또는 25 또는 50 μg의 PCEP(poly[di(sodiumcarboxylatoethyl-phenoxy)phosphazene])와 혼합된 재조합 효모 HBsAg 또는 대장균 HBcAg (APP Latvijas BiomedicT nas, Riga, Latvia)로 마우스를 피하 면역화시켰다. MVA 백신 접종을 위해, 마우스를 500㎕ PBS 내 각각의 재조합 MVA 1x108 감염 유닛을 복강 내 백신 접종하였다.
세포 내 사이토카인 염색, 멀티머 염색 및 탈과립 분석
이전에 기술된 바와 같이(Stross et al., Hepatology 2012; 56 : 873-83), 비장 세포와 간-관련 림프구(LAL)를 분리하고 1 mg/ml 브레펠딘(Brefeldin) A (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany)의 존재 하에 H2-kb- 또는 H-2Db-제한된 펩타이드 (도 10)(jpt Peptide Technologies, Berlin, Germany) 또는 재조합 HBsAg (Rheinbiotech-Dynavax, Dusseldorf, Germany로 친절하게 제공됨)로 5시간 동안 자극하였다. 세포를 에티듐 모노아자이드 브로마이드(ethidium monazide bromide)(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)로 생존/사멸-염색하였으며, 항-CD16/CD32-Fc-블록(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)으로 차단하였다. 표면 마커를 PB-접합된 항-CD8a 및 PE-접합된 항-CD4 (eBiosciences, Eching, Germany)로 염색하였다. 세포 내 사이토카인 염색(ICS)은 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 사용하여 제조자의 권고에 따라 FITC 항-IFNγ (XMG1.2), PE-Cy7 항-TNFa 및 APC 항 IL-2 (eBiosciences, Eching, Germany)를 수행하였다.
탈과립화 분석을 위해, 비장 세포를 모넨신(Monensin), 브레펠딘 A, FITC-접합 항-CD107a 항체 및 APC-접합 항-CD107b 항체의 존재 하에 펩타이드로 5시간 동안 자극하고, 제조자의 권고에 따라 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences, Heidelberg, Germany)를 사용하여 PerCP-Cy5.5 IFNγ(eBiosciences, Eching, Germany)로 surface Pacific Blue CD8a 염색 및 ICS를 수행하였다.
멀티머 염색의 경우, 비장 세포 및 LAL을 20분 동안 PE-접합된 S190 (VWLSVIWM, SEQ ID NO: 19) 또는 MVA B8R (TSYKFESV, SEQ ID NO: 20) 멀티머로 염색한 후, 20분 동안 항-Fc 수용체 항체 (클론 2.4G2)의 존재 하에 Pacific Blue CD8a, FITC KLRG1 및 APC CD127 (eBiosciences, Eching, Germany)로 염색하였다. 데이터는 aFACSCanto II (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)에 대한 FACS 분석에 의해 수집하고 FlowJo 소프트웨어 (Treestar, Ashland, USA)를 사용하여 분석하였다.
혈청 분석
HBsAg, HBeAg, 항-HBs 및 항-HBc의 혈청 수준을 AXSYMTM 분석법 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)을 사용하여 1:20 희석액에서 측정하였다. 실시간 폴리머라제 사슬 반응에 의한 혈청 HBV 역가의 정량화는 전술한 바와 같이 수행되었다(Untergasser et al., Hepatology 2006; 43 : 539-47).
중화 검정
전술한 바와 같이 [Lucifora et al., J Hepatol 2011; 55 : 996-1003]과 같이 분화되고 배양된 HepaRG 세포를 백신 접종된 마우스로부터의 연속 혈청 희석(1:33, 1 : 100, 1 : 333 및 1 : 1000) 하에서 200개의 DNA-함유 포위된 HBV 입자/세포 (아형 ayw)로 2회 감염시켰다. 양성 대조군으로 Hepatect ™ CP 항체 (Biotest Pharma GmbH, Dreieich, Germany) 0.8 국제 단위가 사용되었다. 감염 후 24시간, 세포를 PBS로 3 회 세척하고, 1 ㎖의 분화 배지를 첨가하였다. 상등액을 감염 후 4일, 7일 및 10일에 수집하였고, HBsAg를 1:20 희석하여 면역 분석법으로 검출하였다.
통계 분석
통계 분석은 Prism5 소프트웨어 (GraphPad, San Diego, USA)를 사용하여 수행하였다. 결과는 평균±표준 오차로 나타낸다. 그룹 간의 차이는 two-tailed Student's t-tests을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다.
MVA 백신의 생성
재조합 MVA는 이전에 기술된 바와 같이(Staib et al., Biotechniques 2003; 34 : 694-6, 698, 700), 상동성 재조합 및 숙주 범위 선택에 의해 생성되었다. 전체 HBcAg (유전형 D, 아형 ayw) 및 HBsAg 오픈 리딩 프레임 (유전형 D, 아형 ayw 또는 adw)을 MVA 전달 플라스미드 pIIIΔHR-PH5 또는 pIIIΔHR-P7.5로 클로닝함으로써, HBV 단백질을 초기/후기 백시니아 바이러스-특이적 프로모터 PH5 (HBcAg ayw/HBsAg ayw/HBsAg adw) 또는 P7.5 (HBsAg ayw)의 제어 하에 위치시켰다. 각 바이러스의 제작 후, 유전자 발현, 삽입된 DNA의 서열 및 바이러스 순도를 확인하였다. 백신 제제의 생성을 위해 MVA를 CEF에서 일상적으로 증식하고, 수크로오스를 통한 초원심분리에 의해 정제하고, 1 mM 트리스-HCl pH 9.0에서 재구성하고, 표준 방법에 따라 적정하였다 (Staib et al., Methods Mol Biol 2004; 269:77-100).
면역블랏
NIH-3T3 마우스 섬유아세포(CRL-1658)를 10% FCS, 100U/ml 페니실린 및 100㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 세포를 감염 16시간 후 용해 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.02 % NaN3 및 100 μg/ml 페닐메틸술포닐플루오라이드)에서 수거하고, 12% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 용해시키고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(0.45 μM, Bio-Rad, Munich, Germany) 상에 블랏팅하였다. 멤브레인을 4 ℃에서 항-HBc (antiserum H800; Schaller가 친절히 제공), 항-HBs (Murex HBsAg 버전 3, Abbott, Abbott Park, IL, USA) 또는 항-액틴(Sigma, Munich, Germany) 항체와 함께 각각 1 : 10000, 1:50 및 1 : 10000 희석으로 배양하였다. 서양고추냉이 과산화효소(Horseradish peroxidase)로 표지된 2차 마우스 및 토끼 항체(Dianova, Hamburg, Germany)를 21 ℃에서 1시간 동안 1 : 5000으로 희석하여 사용하였다. 항체를 5% 탈지유가 함유된 인산염 완충 식염수에 희석시켰다. 향상된 화학 발광을 지시대로 사용하였다 (Roche, Mannheim, Germany).
배양된 세포의 상등액에서 분비된 HBsAg을 Abbott AxSYM HBsAg 분석(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)을 사용하여 측정하였다.
실시예 1: 단백질- 프라임 / MVA - 부스트 백신 접종은 강력한 항- HBV 면역을 유도한다
HBs (MVA-S) 또는 HBc (MVA-core)를 발현하는 두 가지 MVA 백신은 HBV 유전형 D, 아형 ayw (도 1A)로부터 생성되었다. 웨스턴 블랏팅과 HBsAg ELISA로 MVA에서의 정확한 단백질 발현을 확인하였다 (도 7A, B).
면역원성을 시험하기 위해, C57BL/6 (wt) 마우스를 MVA-S, MVA-코어 또는 MVAwt (108 감염 유닛)으로 i.p. 면역화시키고, 면역화 후 8일에 IFNγ-생성 CD8+ T-세포의 빈도를 세포 내 사이토카인 염색(ICS)로 측정하였다. i.p. 경로는 체계적인 MVA 분포가 의도되어 사용되었다. MVA-S, MVA-코어 및 MVAwt 면역화는 MVA-유래된 면역 우성 B8R 펩타이드에 대해 비슷한 CD8+ T-세포 반응을 유도하였으며, 이는 두 번째 면역화 후에 추가로 부스트되었다 (도 1B). 대조적으로, HBV-특이적 CD8+ T-세포 반응은 검출되지 않았다 (도 1B).
HBV-특이적 면역을 유도하기 위해, 우리는 이종 프라임-부스트 백신 접종을 수행하였다. 마우스에 면역보강제로 CpG와 함께 12ug의 재조합 미립자 HBsAg 또는 HBcAg (아형 ayw)를 투여하였다. HBsAg 백신 접종 후 8일, S190 및 S208 펩타이드로 자극에 대한 반응으로 IFNγ를 분비하는 비장 CD8+ T-세포의 빈도는 약 0.6%였지만 HBcAg 면역화 후에 C93에 대한 CD8+ T-세포 반응은 거의 검출되지 않았다 (도 1C). 21일에 MVA-S 또는 MVA-코어로 부스트 접종은 높은 빈도의 HBsAg- 또는 HBcAg-특이적 CD8+ T-세포뿐만 아니라 높은 항-HBs 또는 항-HBc 역가를 각각 유도할 수 있었다 (도 1D). 종합하면, 이 데이터는 이종 프라임-부스트 백신 접종이 HBV-특이적 T-세포를 유도하는데 필요하다는 것을 나타낸다.
실시예 2: 고 항원혈증은 항- HBV 면역의 유도를 방지한다
HBV-특이적 면역 반응의 유도에 대한 HBV 항원 부하(load)의 영향을 조사하기 위하여, 백신 접종 전에 이들 혈청 HBeAg 수준에 따라 HBV1.3.32 형질전환(HBVtg) 마우스를 저, 중, 고- 항원혈증 그룹으로 분류하였다 (도 10). 부스트 후 6일, HBsAg/MVA-S를 투여한 마우스의 항-HBs 역가는 중-항원혈증 그룹에서의 마우스와 비교하여 저-항원혈증 그룹에서 더 높았으며, 고-항원혈증 마우스에서는 검출되지 않았다 (도 2A). MVA-S 부스트 후 35일 동안 모니터했을지라도, 고-항원혈증 마우스는 검출 가능한 항-HBs 역가를 나타내지 않았고 HBsAg는 낮은 수준으로 지속되었다 (도 11). 항-HBs가 과량의 HBsAg에 의해 복합화되어 검출을 피할 수 있는지 여부를 연구하기 위해, 우리는 131개의 단백질 복합체를 우레아와 함께 용해시키고 면역 분석을 반복하였다. 이로서 우리는 백신 접종된 높고 중간의 하지만 낮지 않은 항원혈증 HBVtg 마우스에서 HBsAg-항-HBs 면역 복합체를 발견하였다 (도 14). 그러나 HBcAg-특이적 항체는 모든 그룹으로부터 HBcAg/MVA-코어 백신 마우스의 혈청에서 검출되었지만, 역가는 항원혈증과 반비례하는 경향을 다시 나타내었다 (도 2B). 백신 접종으로 유도된 CD4+ T-세포 반응을 분석하기 위하여, 우리는 HBsAg로 비장 세포와 간-관련 림프구(LAL)를 자극하였다. 우리가 wt 마우스에서 HBsAg-특이적 CD4+ T-세포의 높은 빈도를 발견했지만, 어느 그룹에서나 HBVtg 마우스에서 HBV-특이적 CD4+ T-세포를 검출하지 않았다 (도 2C, D).
항체 역가와 마찬가지로, 항원혈증과 HBV-특이적 CD8+ T-세포 반응 간에 역 상관관계를 관찰하였다. 고 항원혈증 마우스에서 HBsAg/MVA-S 뿐만 아니라 HBcAg/MVA- 코어 면역화는 검출 가능한 HBsAg- 또는 HBcAg-특이적 CD8+ T-세포 - 말초 (비장)에서도 간에서도 HBV-복제 부위에서는 유도되지 않았다(도 3A, B). 중간 또는 낮은 HBeAg 부담을 가진 마우스는 HBsAg/MVA-S에 대한 S190- 및 S208-특이적 CD8+ T-세포 반응과 HBcAg/MVA-C 백신 접종에 대한 C93-특이적 T-세포 반응을 보였다. 저-항원혈증 마우스에서 HBV-특이적 CD8+ T-세포 빈도는 중-항원혈증 마우스에서 발견된 것 보다 높았다. 중요하게, MVA B8R-특이적 CD8+ T-세포 빈도는 항원혈증과는 독립적이었으며, 동일한 백신 접종 효율을 나타내는 모든 그룹 간에 비교 가능하였다 (도 3A, B).
만성 감염과 항원 지속 동안, CD8+ T-세포는 고갈되고 기능 장애가 있는 표현형을 나타낼 수 있다. 그러한 상태에서 항원-특이적 T-세포의 수는 IFNγ 생산과 같은 기능 검사를 통해 과소 평가된다. 따라서 S190-, C93- 및 B8R-특이적인 멀티머-염색을 수행하였으며, B8R-특이적 멀티머 양성 CD8+ T-세포가 쉽게 검출할 수 있는 반면 면역화된 고-항원혈증 마우스의 비장이나 간에서 HBV-특이적 CD8+ T-세포를 검출하지 못하였다. 이는 백신이 실제로 이 그룹에서 HBV-특이적 T-세포를 유도하지 못했음을 시사한다. 저- 및 중-항원혈증 그룹에서, HBV-S190-특이적 및 MVA-B8R-특이적 반응은 멀티머-양성 및 IFNγ-양성 CD8+ T-세포의 유사한 비율을 나타내었다 (도 13). 종합하면, HBV 항원 수준은 이종 프라임-부스트 백신 접종에 의해 HBV-특이적 항체 및 T-세포 반응이 얼마나 효율적으로 유발될 수 있는지에 영향을 미친다.
실시예 3: 항원혈증은 백신 접종 유발 반응의 특질에 영향을 미친다
CD8+ T-세포의 중요한 이펙터 기능으로는 CD107a의 표면 발현에 의해 분석할 수 있는 펩타이드 자극에 대한 반응으로 탈과립화하는 능력뿐만 아니라 IFNγ 외에 IL-2 및 TNFα의 생성이 포함된다. S190 펩타이드 자극 시 HBsAg/MVA-S 면역화에 의해 wt 마우스 및 저-항원혈증 HBVtg 마우스에서 유도된 IFNγ+ S190-특이적 비장 CD8+ T-세포는 유사한 비율로 탈과립시켰으며(각각 72.3% 및 73.4%) (도 4A), 중-항원혈증 마우스에서 유래된 비장 및 간 CD8+ T-세포에서 IL-2 및 TNFα의 유사한 발현을 나타내었고, 이는 또한 펩타이드 자극 시 더 적은 정도에서(62%) IL-2 발현이 부족하지만 탈과립화가 가능하였다 (도 4B).
멀티머-결합 세포가 증식하기 위한 분화 상태를 측정하기 위하여, CD127 및 KLRG-1을 염색하였다. wt 및 저-항원혈증 HBVtg 마우스의 백신 접종은 간 및 비장에서 S190-특이적 CD127+ KLRG-1-멀티머-결합 세포의 높은 백분율을 유도하였으며, 이는 증식하고 새로운 이펙터 세포 자손을 일으킬 잠재력을 가진 수명이 긴 세포의 일시적인 전구체로 간주된다 (도 4C). 그러나 중-항원혈증 마우스에서, 이들 세포는 거의 검출되지 않았다 (도 4C). 이러한 데이터는 HBV 항원 발현이 CD8+ T-세포의 다 기능성, 특히 이펙터 세포 IL-2 분비 및 증식능을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 단백질- 프라임 백신 접종에 대한 면역보강제의 비교 .
폴리포스파젠 면역보강제 PCEP가 CpG의 면역 자극 효과를 증진시킬 수 있는지를 조사하기 위해 CpG 대신 PCEP를 사용하거나 단백질 백신 제제를 위해 CpG에 첨가하고 HBsAg과 HBcAg를 결합하였다. 0일에 야생형 마우스에 각각 면역보강제와 함께 16 ㎍의 HBsAg (아형 ayw) 및 16 ㎍ HBcAg (아형 ayw)를 백신 접종하였다. 28일에, 마우스에 MVA-PH5-S (5x107 i.u.; 아형 ayw) 및 MVA- 코어 (5x107 i.u.)를 부스트 접종하였다. 부스트 후 6일에, 혈청을 항-HBs (도 9A) 및 항-HBc (도 9B)의 존재에 대해 분석하였다. 부스트 후 6일에, 비장 세포를 HBsAg (S190 및 S208adw)- 또는 HBcAg(C93)-특이적 펩타이드 (도 9C)로 자극한 후 ICS로 분석하였다. 바는 백그라운드 제거 후 IFNγ 양성으로 염색된 CD8+ 세포의 백분율(평균 ± SEM)을 보여준다. i. u. 감염 단위(infectious units).
wt 마우스에 단백질-프라임/MVA-부스트 백신 접종 후 CpG 단독에 대한 항-HBs 및 항-HBc 항체 반응 유도에 있어서 PCEP (단독 또는 CpG와의 조합)의 사용이 우수 하였지만, CD8+ T-세포 반응은 유사하였다 (도 9A-C).
실시예 5: 면역보강제 조합 비교
다음은 체액성 및 세포성 면역 반응에 대한 다양한 면역보강제의 효과를 측정하는 것을 목표로 하였다. 따라서, 야생형 CH57Bl/6 마우스는 다양한 면역보강제 제제로 복합화된 미립자 HBcAg 및 HBsAg로 프라임되었다. 그룹 1~3 (n = 3)에서 HBsAg은 알럼 하이드록사이드와 복합체를 형성하고 HBcAg, CpG 또는 폴리포스파젠 면역보강제 또는 이 둘 모두와 결합하였다. 그룹 4~6 (n = 3)은 미립자 HBcAg 및 CpG 또는 폴리포스파젠 중 하나로 또는 어떠한 알럼 없이 둘 모두와 함께 면역보강된 HBsAg을 사용하여 백신 접종되었다. 28일에, 모든 동물에 MVA 발현 코어 및 S 아형 adw를 부스트 접종하였다. HBs 및 HBc에 대한 항체 반응을 28일 (단백질 프라임만) 및 34일 (단백질 프라임 + MVA 부스트) 후에 측정하였다. 도 15A 및 도 15B는 특히 HBs에 대한 항체 반응은 알럼을 피할 때 예기치 않게 훨씬 더 두드러짐을 보여준다. 도 15C-D는 프라임 후(도 15C) 및 MVA-부스트 후(도 15D)의 S 및 코어 에피토프에 대한 CD8+ T-세포 반응을 나타낸다.
백신 제제가 알럼 포함하지 않을 때 T 세포 반응은 이미 프라임 후에 검출 가능하였다. 흥미롭게도, (B8R-특이적 반응으로 나타낸) 모든 그룹에서 동등한 효율을 가지고 MVA 부스트한 후, 모든 마우스는 코어-특이적 T 세포 반응을 나타내었고, 다시, 알럼 없이 백신 접종된 동물은 훨씬 더 현저한 S-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타내었다.
실시예 6: 이종 HBsAg 아형으로의 백신 접종은 T-세포 내성을 파괴하고 고-항원혈증 HBVtg 마우스에서 강한 항체 생산을 유도한다
마우스 혈청을 백신 접종 후 중화능을 분석하였다. HBsAg 아형 adw로 백신 접종된 마우스는 1 : 1000까지의 고 희석에서도 HBV 아형을 교차-중화시킬 수 있었다 (도 15E).
다음으로, 높은 HBV 항원 부하 존재 하에서 내성을 파괴하기 위해 이종 단백질-프라임/MVA-부스트 백신 접종의 면역 원성을 향상시키는 것을 목적으로 하였다.
더 강한 항원 트리거가 백신 접종 효율을 향상시키는지를 시험하기 위해, HBsAg를 발현하는 새로운 MVA는 또한 강한 프로모터 PH5의 조절 하에서 조작되고 (도 5A), 14일에 제2 단백질 백신 접종이 수행되었다(도 12). 또한, HBsAg의 아형 ayw(HBVtg 마우스와 동일) 및 adw를 비교하였다. 또한, PCEP는 단백질 백신 제제를 위해 CpG에 첨가되었고, 다수 HBV 항원에 대한 면역 반응을 달성하기 위해 프라임 및 부스트 동안 HBsAg 및 HBcAg를 결합하였다. 이 변형된 백신 요법(0일과 14일에 CpG 및 PCEP와 면역보강된 HBsAg/HBcAg 프라임을 결합한 다음, 강한 PH5 프로모터 하에서 항원을 발현하는 MVA-S/MVA- 코어를 사용하여 28일에 부스트함)을 적용하면 고-항원혈증 HBVtg 마우스의 내성을 파괴할 수 있었고 HBsAg- 및 HBcAg-특이적 CD8+ 및 CD4+ T-세포를 유도할 수 있었다 (도 5B, C).
다음으로, 백신과 표적 항원 사이의 부분적 불일치가 백신 유효성을 향상시키는지에 대해 조사하였다 (Schirmbeck et al., Eur J Immunol 2003; 33 : 3342-52). 백신 항원인 Sayw 또는 Sadw는 아형-특이적 펩타이드 S208으로 측정된 바와 같이(도 11), 두 아형 모두에 대해 CD8+ T-세포를 유도하였다(도 5B). 그러나, 이종 Sadw-함유 백신은 보다 강한 CD8+ 및 검출 가능한 CD4+ T 세포 반응을 유도하였다 (도 5B, C). 중-항원혈증 마우스에서 유래된 S-특이적 CD8+ T-세포에서 관찰한 바와 유사하게(도 4B), 비장 S208-특이적 CD8+ T-세포는 IFNγ를 분비하고 특정 TNFα를 분비하는 것으로 밝혀졌지만, IL-2의 한계 발현만을 나타내었다 (도 5D).
특히, Sayw는 함유하지 않고 Sayw만 함유한 Sayw 백신 제제는 고-항원혈증 마우스에 항-HBs 항체 반응을 유도할 수 있었지만(도 6A), 항-HBc 항체는 두 제제 모두에 의해 유도되었다 (도 6B). 중요하게, Sadw에 의해 생성된 항-HBs 항체는 아형 ayw의 HBV 입자를 중화시킬 수 있었다 (도 6C). Sadw 백신 접종 그룹에서 항-HBs 중화의 유도와 동시에 HBsAg의 수준이 낮은 수준으로 크게 떨어졌다 (도 6D). 이를 종합하면, 이는 변경된 백신 접종 계획이 실제로 HBVtg 마우스에서 B- 및 T-세포 내성을 파괴할 수 있음을 나타낸다.
실시예 7: 다-항원성 MVA에 의해 유도된 광범위한 면역 반응
다음으로, 다-항원성 MVA를 이용하여 하나, 둘 및 여러 개의 HBV 항원에 대한 면역 반응 유도를 비교하는 것을 목적으로 하였다. 예기치 않게 MVA 백신 벡터에 의해 코어가 동시에 발현될 때 S 또는 S 및 Pol에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응이 개선되었다.
실시예 8: RNAi 및 치료적 백신 접종의 조합
높은 역가 HBV 항원을 발현하는 HBV 형질전환 마우스, HBVxfs 균주를 모든 HBV RNA의 3 '영역을 표적으로 하는 HBV-특이적 siRNA로 처리하였다. siRNA 처리는 HBeAg 및 HBsAg 수준을 90% 감소시켰다. 8주 후, 동물에 항-HBs 항체 및 HBV-특이적 T 세포를 유도하기 위해 단백질 프라임-MVA-HBV 부스트 백신을 백신 접종하였다 (도 27). 단백질 백신으로, 미립자 HBsAg 및 HBcAg에 CpG 및 PCEP가 면역보강되었다. MVA 백신 벡터는 HBV S 및 코어 단백질의 완전한 오픈 리딩 프레임을 발현하였다. 대조군은 siRNA를 처리하지 않고 백신 접종도 하지 않고 이의 조합도 하지 않았다.
부스트 백신 접종 후 6일, 마우스를 희생시키고 HBeAg 및 HBsAg 수준 및 항-HBs 역가를 측정하였다 (도 28A, B). 간과 비장에서, T 세포를 분리하고, 생체 외에서(ex vivo) HBV-특이적 펩타이드로 자극하고, 세포 내 사이토카인 염색으로 인터페론 감마 발현을 위해 염색하고, 유동 세포 계측법으로 분석하였다 (도 28C).
실시예 9: 최적 MVA 투여량의 추정
첫 번째 실험 세트에서 HBVtg 마우스에 면역원성을 충분히 나타내며 면역 내성을 깨뜨릴 수 있는 이종 단백질-프라임/MVA-부스트 백신 접종을 위한 가장 낮은 MVA 투여량을 평가하고자 하였다. 따라서 저 및 중-항원혈증 HBVtg 마우스 그룹은 비스-(3 ', 5')-사이클릭 다이머릭 아데노신 모노포스페이트 (c-di-AMP)로 면역보강된 미립자 HBcAg 15μg로 2주 간격으로 2회 면역화되었다. 28일째, 마우스에 4가지 상이한 투여량의 MVA-코어 (각각 3x106, 1x107, 3x107, 1x108 PFU)를 부스트 접종하였다 (도 29A). 다양한 MVA 투여량을 사용하는 면역 요법에 의해 유도된 체액성 및 세포성 면역 반응을 부스트 면역화 후 7일(35일)에 평가하였다.
HBsAg, HBeAg, 항-HBs 및 항-HBc 항체에 대해 0일 및 35일(부스트 7일 후)의 마우스의 혈청을 분석하였다 (도 29B). 모든 면역화 요법은 35일에 HBVtg 마우스의 혈청에서 검출된 유사한 수준의 항-HBc 항체를 유도하였다. 또한, 모든 마우스 그룹은 혈액에서 HBsAg의 유의한 감소를 보였다. HBVtg 모델에서 HBsAg 혈청전환에 중요한 HBsAg가 면역화 요법에 포함되지 않았기 때문에 이 효과는 항-HBs 항체에 의해 매개되지 않았다. 흥미롭게도, 부스트로서 MVA-코어 (3x107 및 1x108 PFU)의 더 많은 투여량을 받은 그룹의 HBVtg 마우스는 혈청 HBeAg 수준에서 상당한 감소를 보였다 (도 29B). 또한, MVA-코어 (3x107 및 1x108 PFU)의 더 많은 투여량을 받은 마우스 그룹에서도 간 알라닌 트랜스퍼라제(ALT)의 약간의 상승이 관찰되었다 (도 29C). 이러한 결과는 이 두 그룹의 마우스에서 면역 프로토콜이 HBcAg-특이적 T 세포의 활성 증가로 인해 간에서 억제된 HBV 복제를 일으킨다는 것을 시사한다. 실제로, 간-관련 세포 림프구(LAL)와 비장 세포의 세포 내 IFNγ 염색은 더 높은 용량의 MVA-코어로 면역화된 HBVtg 마우스가 특히 간에서 보다 효과적인 HBV-특이적 CD8+ T 세포 반응을 나타낼 수 있음을 보여 주었다(도 29D). 동시에, MVA-특이적 CD8+ T 세포 반응은 면역화에 사용된 더 높은 MVA 투여량으로 유의하게 증가하지 않았다.
이 결과로부터 이종 단백질-프라임/MVA-부스트 백신 접종용 3x107 PFU의 MVA-코어 투여량이 저 및 중 항원혈증 HBVtg 마우스에서 면역 내성을 파괴하기에 충분하다고 결론지을 수 있다.
실시예 10: 단백질 프라이밍을 위한 면역보강제로서의 c- di - AMP의 평가.
균형 잡힌 Th1/Th2 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 안전하고 효과적인 면역보강제의 결핍은 임상 시험을 시작하는데 장애가 될 수 있다. 또한, 새로 확인된 세포질 패턴 인식 수용체 STING을 작동시키는 것은 치료 백신 접종에 대한 흥미로운 대안이다. 따라서 우리는 치료적 B형 간염 백신의 새로운 면역보강제로서 c-di-AMP의 효능을 조사하고자 하였다. 이 목적을 위해, 중 및 고 항원혈증 HBVtg 마우스 (n = 7) 마우스 그룹은 2개의 단백질 프라임과 MVA 부스트 면역처치를 받았다. 단백질 프라이밍을 위한 미립자 HBsAg 및 HBcAg를 결합하고 c-di-AMP 또는 이전에 확립된 CpG와 폴리포스파젠 (PCEP)의 조합으로 면역보강하였다. 28일째, 마우스에 MVA-S/코어의 혼합물을 부스트 접종하였다 (도 30A). c-di-AMP를 주사를 투여한 HBVtg 마우스 (n = 4)와 '비어있는' MVA (MVAwt)를 대조군으로 사용하였다. 체액성 및 세포성 면역 반응을 유도하기 위한 백신 제제의 효능을 34일(부스트 후 6일)에 비교하였다.
c-di-AMP 또는 CpG/PCEP 면역화 프로토콜 어느 것도 고 항원혈증성 HBVtg 마우스에서 혈청 HBeAg 수준에 영향을 미치지 않았다 (도 30C). 테스트된 두 백신 제제 모두 유의한 항-HBc 반응을 유도하였다. 그러나, c-di-AMP로 면역화하면 CpG/PCEP 요법과 비교하여 항-HBc 항체가 유의하게 높은 역가를 유도하였다 (p <0.05) (도 30C). 흥미롭게도, 두 면역화 프로토콜 모두 검사된 모든 HBVtg 마우스에서 항-HBs 혈청 전환에 대한 HBsAg을 초래하였다 (도 30D). c-di-AMP- 또는 CpG/PCEP-면역보강된 백신에 의해 유도된 높은 수준의 항-HBs 항체는 순환하는 HBsAg를 복합화시키고 이를 마우스의 혈청으로부터 제거하였다. 대조적으로, c-di-AMP만을 투여한 후 HBVtg 마우스에 MVAwt를 투여한 결과 어떠한 항-HBs도 발생하지 않았으며, 이들 마우스의 혈청 내 HBsAg 수치는 변하지 않았다. 중요하게, 두 백신 제제 모두 HBVtg 마우스에서 비장(p < 0.05) 및, 특히 간 관련 림프구(p < 0.05)에서 검출 가능한 유의한 HBsAg- 특이적 (s208) 및 HBcAg-특이적(c93) CD8+ T 세포 반응을 유도하였고(도 30E), ALT의 증가로 인한 경미한 T-세포-유도 간 손상을 동반하였다 (도 30B). c-di-AMP 또는 CpG/PCEP 요법에 의해 유도된 HBV-특이적 CD8+ T 세포 반응의 크기에는 통계적으로 유의한 차이가 없었다.
이러한 데이터를 고려할 때, c-di-AMP는 고 항원혈증 HBVtg 마우스에서도 치료적 단백질 프라임-MVA 부스트 백신 접종을 위한 강력한 면역보강제로 간주된다.
실시예 11: 다양한 면역보강제(c- di - AMP , 폴리 - LCIC 및 RIG -I 리간드)에 대한 최적 전달 경로의 평가
치료적 이종 단백질-프라임/MVA-부스트 백신용 단백질 프라이밍에 적합한 면역보강제에 대해 스크리닝이 확대되었다. 우리의 목적은 c-di-AMP의 효능을 치료적 B형 간염 백신에 대한 두 가지 잠재적 새로운 면역보강제인 폴리-LCIC 및 RIG-I 리간드와 비교하는 것이었다. 또한, 우리는 가장 효과적인 적용 경로를 찾기 위해 다양한 면역 프로토콜을 조사하였다. 이러한 목적으로, 저 및 중 항원혈증 HBVtg 마우스 (n = 5)의 그룹은 2개의 단백질 프라임 및 MVA 부스트 면역처치를 받았다 (도 30A). 단백질 프라이밍을 위한 미립자 HBsAg 및 HBcAg를 결합하고 c-di-AMP, 폴리-LCIC 또는 RIG-I 리간드로 면역보강하였다. 28일째, 마우스에 MVA-sAg 및 MVA-코어의 혼합물을 부스트 접종하였다. 면역화는 또한 근육 내(i.m.) 경로에 의해서만 수행되거나 단백질 프라이밍은 피하 투여(s.c.) 후 복강 내(i.p.) 부스트로 투여되었다. 다양한 백신 제제 및 적용 경로의 효능을 34일(부스트 후 6일)에 체액성 및 세포성 면역 반응 유도와 관련하여 비교하였다.
모든 백신 접종 프로토콜은 HBVtg 마우스의 혈청에서 HBsAg 수준을 강력하게 감소시켰다. 이는 검사된 모든 면역보강제와 전달 경로가 마우스의 혈액에서 HBsAg를 복합화시키는 항-HBs 항체를 높은 역가를 유도할 수 있다는 사실 때문이다. 유사하게, 유도된 항-HBc 항체의 수준은 마우스 그룹 간에 유사하였으며, 근육 내 면역화 경로가 유도 항-HBc에서 보다 강력하다는 약간의 경향이 있었다. 그럼에도 불구하고, HBeAg 수준에 의해 간접적으로 검출된 더 낮은 HBV 복제는 i.m 또는 s.c./i.p. 경로를 통한 c-di-AMP, 또는 i.m. 경로를 통한 폴리 LCIC를 투여받은 HBVtg 마우스 그룹에서만 관찰되었다 (도 31a). 불행하게도, 근육 내 방식으로 폴리-LCIC를 이용한 면역화만이 HBVtg 마우스에서 상당한 체중 감소를 초래하는 유일한 검사 프로토콜이었다 (도 31B). C-di-AMP는 비장 및 특히 면역화된 HBVtg 마우스의 간에서 HBcAg-특이적 (c93) 및 HBsAg-특이적 (s208) CD8+ T 세포 반응 모두를 유도하는데 있어서 우수한 것으로 여겨질 수 있으며, 이는 투여 경로가 독립적으로 사용되었다 (도 31C). 흥미롭게도 폴리-LCIC는 근육 내로 전달될 때 활발한 간 내 HBcAg-특이적 CD8+ T 세포 반응을 야기하였고, 반면에 s.c./i.p. 경로로 전달될 때 우세하게 HBsAg-특이적 (s208) CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. RIG-1 리간드는 HBV-특이적 체액성 반응을 유도할 수 있었으나, 주요한 HBV 특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하지는 못하였다. 대조군으로 사용된 MVA-특이적 CD8+ T 세포 반응은 비장 및 간에서 모든 면역화된 그룹에서 비교되었으며, 동일한 백신 효율을 나타낸다.
이러한 데이터는 c-di-AMP가 매우 강력한 면역보강제이고, 폴리-LCIC가 중간 효능을 나타내며, RIG-I 리간드가 치료적 단백질 프라임-MVA 부스트 백신 접종에 충분히 효과적이지 않다는 것을 입증한다. C-di-AMP는 i.m. 및 s.c./i.p. 적용 경로에서도 똑같이 효과적이었다.
실시예 12: C57BL /6 마우스에서의 새로운 MVA 구조물( MVA - HBVvac )의 평가.
추가로, HBV 폴리머라제의 HBsAg, HBcAg (주요 HBV 유전형 A, B, C, D를 포함하는 서열) 및 RT 도메인을 발현하는 신생 폴리시스트론 MVA(MVA-HBVvac)의 생체 내 면역원성을 평가하였다. 2개의 폴리시스트론 백신 접종 구조물의 개략적인 묘사는 모든 주요 HBV 유전형의 HBV 코어 및 S를 커버하는 HBVVac 뿐만 아니라 HBV 폴리머라제의 RT 도메인 및 HBV 코어 및 S를 발현하는 C/S (C/S)를 생성하였다 (도 32A). 단백질 발현은 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 도 32B는 HBVVAc 또는 S/C를 발현하는 다양한 재조합 MVA-클론에 의한 S-발현을 나타낸다.
C57BL/6 마우스 그룹(n = 5)은 미립자 HBsAg과 c-di-AMP가 면역보강된 HBcAg의 혼합물로 한 번 프라이밍되었다. 2주 후, 마우스는 MVA-S 및 MVA-코어의 혼합물 또는 동량의 새로운 MVA-HBVvac로 부스트되었다. 마우스를 21일째에 희생시켜 HBV-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 평가하였다 (도 32C).
새로운 폴리시스트로닉(polycistronic) MVA는 MVA-S 및 MVA-코어 구조물의 혼합물과 비교하여 유의한 항-HBs 및 항-HBc 항체 반응을 유도하였다 (도 32D). 더욱이, MVA-HBVvac 면역은 MVA-S와 MVA-코어의 혼합물에 의해 유도된 이들과 크기가 비슷한, 활발한 HBsAg-특이적 (s190, s208 및 Spool) 및 HBcAg-특이적 (c93, Cpool) CD8+ T 세포 반응 (췌장 세포 분석에 의해 결정됨)을 유도하였다 (도 32E). 또한, MVA-HBVvac 면역화는 프라이밍에 RT 단백질이 사용되지 않았더라도 낮은 수준에서 펩타이드 RT61, RT333 및 RT 펩타이드 풀 2 (화살표로 표시)에 대한 RT-특이적 CD8+ T 세포 반응이 검출되었다.
이 데이터는 폴리시스트론성 MVA (MVA-HBVvac)가 예상되는 모든 단백질을 발현하고 C57BL/6 마우스에서 우수한 생체 내 면역원성을 보임을 나타내었다.
실시예 13: CD70의 동시-발현에 의한 MVA 구조물의 면역원성 증가.
MVA-기반 백신 벡터의 생체 내 면역원성을 향상시키기 위하여, 바이시스트론성 방식으로 CD70을 발현시키는 MVA 벡터를 제조하였다 (도 34A).
C57BL/6 마우스 그룹(n = 6-7)은 CpG 및 PCEP로 면역보강된 미립자 HBcAg로 1회 프라임되었다. 2주 후, 마우스에 MVA-코어 또는 추가로 동량의 MVA코어-CD70 발현 CD70 또는 대조군으로 야생형 MVA를 부스트 접종하였다 (도 34B). 마우스를 35일째에 희생시켜 HBV-특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 평가하였다. 체액성 면역 반응은 MVA코어-CD70을 부스트 접종한 후 동일하게 나타났으나 MVA (B8R)-특이적 사이토카인에 대한 CD8+ T 세포 반응은 약하게 나타났으며, HBV (C93)-특이적 사이토카인에 대한 CD8+ T 세포 반응은 MVA코어-CD70로 부스트 접종된 마우스에서 유의하게 증가하였다 (도 34C). 반복 실험에서도 동일한 결과가 나타났다.
세 번째 실험에서, C57BL/6 백그라운드 상 HBV-형질전환 마우스 브레드 그룹(n = 5-6)에 백신 접종하였다. 이 동물들에서 치료적 백신 접종으로 인해 면역 내성이 깨질 수 있다. CpG 및 PCEP가 면역보강된 미립자 HBcAg로 1회 프라이밍 후, 마우스에 MVA- 코어 또는 동일한 양의 CD70을 발현하는 MVA코어-CD70을 부스트 접종하였다 (도 35A 및 B). 야생형 MVA로 백신 접종된 마우스는 대조군으로 사용되었다. MVA- 및 HBV-특이적 T 세포 반응을 평가하기 위해 마우스를 35일에 희생시켰다. 간 관련 림프구에 게이트된 CD8+ T 세포는 마우스가 MVA코어로 백신 접종된 마우스와 비교하여 MVA코어-CD70로 백신 접종되었을 때, MVA- 및 HBV코어-특이적 펩타이드 각각으로 재자극 시 IFNg 및 IL2의 분비를 현저히 나타내었다. MVAwt로 부스트된 마우스에서, MVA-특이적 T 세포 반응은 검출되었으나 HBV-특이적 T 세포 반응은 검출되지 않았다 (도 35C).
상기 결과와 관련하여, HBV-특이적 항원과 CD70의 동시 발현은 인 비보에서 HBV- 특이적 T 세포 반응으로 MVA-를 유의적으로 증가시킨다는 결론을 얻을 수 있다.
본 명세서에 예시적으로 설명된 실시예들은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부존재에도 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "포함하는", "함유하는", "담고 있는" 등의 용어는 제한없이 확대되어 해석될 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 및 표현은 설명의 용어로서 사용되었지만 제한이 아니며, 도시되고 설명된 특징 또는 그 일부의 등가물을 배제하는 용어 및 표현의 사용에 대한 의도는 없지만, 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것을 인식해야 한다. 따라서, 본 실시예가 바람직한 실시예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 통상의 기술자라면 이들의 변형예 및 수정예가 가능할 수 있으며, 이러한 수정예 및 변형예는 본 발명의 범위, 본 발명의 본 명세서에 기술된 모든 특허, 특허 출원, 참고서 및 심사 논문은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 있다.
본 발명은 본 명세서에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내용에 속하는 더 좁은 종 및 하위 전제 군도 각각이 본 발명의 일부를 형성한다. 제거된 물질이 본 명세서에서 구체적으로 인용되는지의 여부에 상관없이 속으로부터 임의의 구성을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 포괄적인 설명을 포함된다.
다른 실시예들은 다음의 청구 범위 내에 있다. 또한, 특징이 마쿠쉬 그룹으로 기술되는 경우, 본 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 구성원의 개별 구성원 또는 서브 그룹의 관점에서 기술됨을 인식할 것이다.
본원에 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌의 내용은 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Helmholtz Zentrum M?chen GmbH Protzer, Ulrike Bauer, Tanja Kosinska, Anna M?k-H?sl, Martin <120> Means and methods for treating HBV <130> HEL15387PCT <150> LU 92942 <151> 2016-01-12 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV genotype C large envelope protein consensus sequence <400> 1 Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu 1 5 10 15 Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro 20 25 30 Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn 35 40 45 Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly 50 55 60 Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln 65 70 75 80 Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser 85 90 95 Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu 100 105 110 Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His 115 120 125 Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val 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gcagctacgt 1380 atccatcgtg atggcatcta catggtacac atccaggtga cgctggccat ctgctcctcc 1440 acgacggcct ccaggcacca ccccaccacc ctggccgtgg gaatctgctc tcccgcctcc 1500 cgtagcatca gcctgctgcg tctcagcttc caccaaggtt gtaccattgc ctcccagcgc 1560 ctgacgcccc tggcccgagg ggacacactc tgcaccaacc tcactgggac acttttgcct 1620 tcccgaaaca ctgatgagac cttctttgga gtgcagtggg tgcgcccctg attgacccgc 1680 gggcccggga tccgcccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg 1740 gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 1800 aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 1860 cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 1920 gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 1980 ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 2040 caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 2100 agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 2160 ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa acgtctaggc 2220 cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataata tggccacaac 2280 catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga 2340 cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta 2400 cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac 2460 cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa 2520 gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt 2580 cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct 2640 ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca 2700 caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa 2760 cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc 2820 cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca 2880 ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt 2940 cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta 3000 aagcggccgc gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 3060 ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 3120 gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 3180 acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtcgtcgac ctgcagtcaa 3240 actctaatga ccacatcttt ttttagagat gaaaaatttt ccacatctcc ttttgtagac 3300 acgactaaac attttgcaga aaaaagttta ttagtgttta gataatcgta tacttcatca 3360 gtgtagatag taaatgtgaa cagataaaag gtattcttgc tcaatagatt ggtaaattcc 3420 atagaatata ttaatccttt cttcttgaga tcccacatca tttcaaccag agacgtttta 3480 tccaatgatt tacctcgtac tataccacat acaaaactag attttgcagt gacgtcgtat 3540 ctggtattcc taccaaacaa aattttactt ttagttcttt tagaaaattc taaggtagaa 3600 tctctatttg ccaatatgtc atctatggaa ttaccactag caaaaaatga tagaaatata 3660 tattgataca tcgcagctgg ttttgatcta ctatacttta aaaacgaatc agattccata 3720 attgcctgta tatcatcagc tgaaaaacta tgttttacac gtattccttc ggcatttctt 3780 tttaatgata tatcttgttt agacaatgat aaagttatca tgtccatgag agacgcgtct 3840 ccgtatcgta taaatatttc attagatgtt agacgcttca ttaggggtat acttctataa 3900 ggtttcttaa tcagtccatc attggttgcg tcaagaacta ctatcggatg ttgttgggta 3960 tctctagtgt tacacatggc cttactaaag tttgggtaaa taactatgat atctctatta 4020 attatagatg catatatttc atttgtcaag gatattagta tcgacttgct atcgtcatta 4080 atacgtgtaa tgtaatcata taaatcatgc gatagccaag gaaaatttaa atagatgttc 4140 atcatataat cgtcgctata attcatatta atacgttgac attgactaat ttgtaatata 4200 gcctcgccac gaagaaagct ctcgtattca gtttcatcga taaaggatac cgttaaatat 4260 aactggttgc cgatagtctc atagtctatt aagtggtaag tttcgtacaa atacagaatc 4320 cctaaaatat tatctaatgt tggattaatc tttaccataa ctgtataaaa tggagacgga 4380 gtcataacta ttttaccgtt tgtacttact ggaatagacg aaggaataat ctccggacat 4440 gctggtaaag acccaaatgt ctgtttgaag aaatccaatg ttccaggtcc taatctctta 4500 acaaaaatta cgatattcga tcccgatatc ctttgcattc tatttaccag catatcacga 4560 actatattaa gattatctat catgtctatt ctcccaccgt tatataaatc gcctccgcta 4620 agaaacgtta gtatatccat acaatggaat acttcatttc taaaatagta ttcgttttct 4680 aattctttaa tgtgaaatcg tatactagaa agggaaaaat tatctttgag 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gatatgggta 6420 gagtttttgt ccccgctcct tttggaggat cgcaagaatt tatttctaaa tctatgagag 6480 atcaacgaaa aggaagagta ggaagagtta at 6512

Claims (39)

  1. (a) B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피(envelope) 단백질 (HBs-항원), 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고; 및
    (b) B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며; 및
    다음 중 적어도 하나를 발현하는 재조합 백신 접종 벡터:
    (c) SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 외피 단백질 (HBs-항원); 및/또는
    (d) SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 면역원성 코어 단백질 (HBc-항원); 및/또는
    (e) SEQ ID NO: 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 B형 간염 바이러스 유래의 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (c)의 HBs-항원 및/또는 (d)의 HBc-항원이 B형 간염 바이러스 유전형 C 유래인 재조합 백신 접종 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    (c)의 면역원성 HBs-항원은 SEQ ID NO: 4에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 및/또는
    (d)의 면역원성 HBc 항원은 SEQ ID NO: 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 가지고, 및/또는
    (e)의 폴리머라제의 면역원성 RT 도메인은 SEQ ID NO: 6에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 재조합 백신 접종 벡터.
  4. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (b)의 B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질은 B형 간염 바이러스 유전형 D형 혈청형 ayw 유래의 HBc-항원의 아미노산 1-149를 포함하거나 이들로 이루어진 C-말단 절단된 코어 단백질인 재조합 백신 접종 벡터.
  5. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) CD70을 추가로 발현하는 재조합 백신 접종 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 CD70은 인간 CD70인 재조합 백신 접종 벡터.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    상기 CD70은 SEQ ID NO: 26에 기재된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 재조합 백신 접종 벡터.
  8. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 백신 접종 벡터는 바이러스, 바이러스 유사 입자 또는 박테리아인 재조합 백신 접종 벡터.
  9. 전술한 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 백신 접종 벡터는 MVA 바이러스인 재조합 백신 접종 벡터.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 재조합 벡터는 약독화된 살모넬라 균주, CMV-, VSV-계열 벡터, 아데노 바이러스 벡터 또는 홍역 벡터 재조합 백신 접종 벡터.
  11. 제 9 항에 있어서,
    (a), (b), (c), (d) 및/또는 (e)를 암호화하는 하나 이상, 바람직하게는 둘 이상, 바람직하게는 셋 이상, 바람직하게는 넷 이상, 바람직하게는 다섯 이상의 핵산 서열이 하나의 발현 카세트에 포함되는 MVA 바이러스.
  12. 제 9 항 또는 제 11 항에 있어서,
    (a), (b), (c), (d) 및/또는 (e)를 암호화하는 핵산 중 적어도 하나는 폭스바이러스성 프로모터의 조절 하에 있고, 상기 폭스바이러스성 프로모터는 바람직하게는 P7.5 또는 PH5인 MVA 바이러스.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    다이(die) 발현 카세트는 SEQ ID NO: 7에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 MVA 바이러스.
  14. 제 9 항 및 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a), (b), (c), (d) 및/또는 (e) 중에서 적어도 하나를 암호화하는 핵산 서열은 MVA 게놈의 결실 I (del I), 결실 II (del II), 결실 III (del III), 결실 IV (del IV), 결실 V (del V) 또는 결실 VI (del VI), 바람직하게는 결실 III (del III)에 삽입되는 MVA 바이러스,
  15. B형 간염 백신 접종 방법의 용도에 사용되는,
    (a) B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질 (HBs-항원)을 발현하는 MVA 바이러스; 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고, 및
    (b) B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원)을 발현하는 MVA 바이러스: 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D형 혈청형 ayw이며,
    상기 방법은,
    (i) 대상체에
    (a') B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질, 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고; 및/또는
    (b') B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며;
    를 투여하는 단계; 및
    (ii) (a)를 발현하는 MVA 바이러스 및 (b)를 발현하는 MVA 바이러스를 대상체에 투여하는 단계
    를 포함한다.
  16. 제 15 항에 있어서,
    (a)를 발현하는 MVA 바이러스 및/또는 (b)를 발현하는 MVA 바이러스는 CD70을 추가로 발현하는 MVA 바이러스.
  17. B형 간염 백신 접종 방법의 용도에 사용되는,
    (a) B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질 (HBs-항원), 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전자 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고, 및
    (b) B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며,
    을 발현하는 MVA 바이러스:
    상기 방법은,
    (i) 대상체에
    (a') B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질, 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고, 및/또는
    (b') B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며,
    를 투여하는 단계; 및
    (ii) 상기 MVA 바이러스를 대상체에 투여하는 단계
    를 포함한다.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 MVA 바이러스는 CD70을 추가로 발현하는 MVA 바이러스.
  19. 제 9 항 또는 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료 또는 백신 접종에 사용하기 위한 MVA 바이러스.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 용도는 B형 간염 백신 접종 방법이며,
    상기 방법은
    (i) 대상체에
    (a') B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질, 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고, 및/또는
    (b') B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며,
    를 투여하는 단계; 및
    (ii) 상기 MVA 바이러스를 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하는 MVA 바이러스.
  21. 제 15 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 접종 방법은 바람직하게 치료 백신 접종인 MVA 바이러스.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 접종 방법의 (i) 단계는 프라이밍 단계이고, 상기 백신 접종 방법의 (ii)은 부스팅 단계인 MVA 바이러스.
  23. 제 15 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i)의 외피 단백질 및/또는 코어 단백질이 하나 이상의 면역보강제와 함께 투여되되,
    상기 면역보강제는 바람직하게 PCEP(poly[di(sodium carboxylatoethylphenoxy)]phosphazene), 면역 자극 올리고뉴클레오타이드, TLR(a toll like receptor) 작용제, 사포닌 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되며,
    상기 TLR 작용제는 바람직하게 TLR 3 작용제, TLR 4 작용제, TLR 7 작용제, TLR 8 작용제 또는 TLR 9 작용제이며,
    상기 면역 자극 올리고뉴클레오타이드는 바람직하는 폴리 I/C, CpG, RIG-1 리간드, STING 리간드, 사이클릭 디-AMP(cyclic di-AMP), 사이클릭 디-CPM(cyclic di-CMP), 사이클릭 디-GMP(cyclic di-GMP), TLR 7 작용제, TLR 8 작용제, CTA1DD, 또는 dmLT인
    MVA 바이러스.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 면역보강제는 PCEP 및/또는 CpG 면역보강제인 MVA 바이러스.
  25. 제 23 항에 있어서,
    상기 면역보강제는 사이클릭 디-AMP인 MVA 바이러스.
  26. 제 15 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 단계는 (ii) 단계를 수행하기 전 약 1일 이상, 바람직하게는 약 5일 이상, 바람직하게는 약 1주 이상, 바람직하게는 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게는 약 2주 내지 약 5주, 약 3주 내지 약 4주 수행되는 MVA 바이러스.
  27. 제 15 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 접종 방법은 (i) 단계 후 및 (ii) 단계 전에 추가로 포함하는 MVA 바이러스:
    (i') 대상체에,
    (a') B형 간염 바이러스 혈청형 adw 유래의 외피 단백질, 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고, 및/또는
    (b') B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며,
    를 투여하는 단계;
    (i') 단계는 바람직하게 부스팅 단계이다.
  28. 제 27 항에 있어서,
    (i) 단계는 (i') 단계를 수행하기 전 약 1일 이상, 바람직하게 약 5일 이상, 바람직하게는 약 1주 이상, 바람직하게는 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게는 약 2주 내지 약 5주, 약 3주 내지 약 4주 수행되며,
    (i') 단계는 (ii) 단계를 수행하기 전 약 1일 이상, 바람직하게 약 5일 이상, 바람직하게는 약 1주 이상, 바람직하게는 약 1주 내지 약 8주, 바람직하게는 약 2주 내지 약 5주, 약 3주 내지 약 4주 수행되는;
    MVA 바이러스.
  29. 제 15 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여는 비경구 또는 점막 경로에 의한 것인 MVA 바이러스.
  30. 제 29 항에 있어서,
    투여는 근육 내이고, (i) 단계 및/또는 (i') 단계는 면역보강제의 투여를 포함하며, 상기 면역보강제는 사이클릭 디-AMP를 포함하는 MVA 바이러스.
  31. 제 29 항에 있어서,
    투여는 피하 또는 근육 내이고, (i) 단계 및/또는 (i') 단계는 면역보강제의 투여를 포함하며, 상기 면역보강제는 폴리 I/C 또는 RIG-I-리간드를 포함하는 MVA 바이러스.
  32. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 재조합 백신 접종 벡터 또는 MVA 바이러스를 포함하는 백신 또는 약제학적 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 재조합 백신 접종 벡터는 제 9 항 및 제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 MVA 바이러스 또는 제 10 항의 살모넬라 균주인 백신.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    상기 백신은 비경구 또는 점막 백신인 백신.
  35. (i) (a) B형 간염 바이러스 유전형 A 유래의 외피 단백질, 여기서 상기 외피 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 A 혈청형 adw 유래의 소형 또는 대형 외피 단백질이고, 상기 소형 또는 대형 외피 단백질은 바람직하게 소형 외피 단백질이고; 및/또는 (b) B형 간염 바이러스 혈청형 ayw 유래의 코어 단백질 (HBc-항원), 여기서 상기 코어 단백질은 바람직하게 B형 간염 바이러스 유전형 D 혈청형 ayw이며;을 포함하는 단백질 조성물
    (ii) 제 32 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항의 백신
    을 포함하는 키트.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 단백질 조성물은 비경구 투여에 적합하고, 상기 조성물은 바람직하게 PCEP 및/또는 CpG 면역보강제인 하나 이상의 면역보강제를 포함하는 키트.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 단백질 조성물은 점막 투여에 적합하고, 상기 조성물은 바람직하게 CTA1DD, dmLT, PCEP, 폴리 I/C, RIG-I-리간드, c-di-AMP, c-di-CMP 및 c-diGMP 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 면역보강제를 포함하는 키트.
  38. 제 35 항에 있어서,
    상기 단백질 조성물은 근육 내 투여에 적합하고, 상기 조성물은 바람직하게 사이클릭 디-AMP인 하나 이상의 면역보강제를 포함하는 키트.
  39. 제 35 항에 있어서,
    상기 단백질 조성물은 피하 또는 근육 내 투여에 적합하고, 상기 조성물은 바람직하게 폴리 I/C인 하나 이상의 면역보강제를 포함하는 키트.
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