KR20220090497A - B형 간염 바이러스 백신 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 단리된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 및 관련된 B형 간염 바이러스 (HBV) 백신에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 HBV 백신에 사용될 수 있는 이러한 폴리펩타이드를 발현하기 위한 바이러스 벡터뿐만 아니라, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 벡터 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법 및 대상체의 HBV를 치료하는 방법에 관한 것이다. 지리적 영역에 존재하는 HBV 유전자형의 에피토프를 효율적으로 포함하는 항원 아미노산 서열을 사용하여 지리적 영역 내의 다양성을 포함하도록 백신 항원을 설계하는 단계를 포함하는 HBV 백신을 설계하고 생성하는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다.
Description
정부 권리 진술
본 발명은 미국 에너지부에 의해 수여된 계약 번호 DE-AC52-06NA25396 하에 미국 정부의 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 보유한다.
서열목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 이에 의해 본 명세서에 참조로 포함된다. 서열목록이 포함된 텍스트 파일의 파일명은 930185_414WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 186 KB로 2020년 8월 21일에 생성되었으며 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되어 있다.
본 발명의 대상은 일반적으로 B형 간염 바이러스 (HBV), 특히 HBV 백신에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스 (HBV) 감염은 전세계적으로 건강에 대한 중대한 문제로 대두되었다. HBV 감염은 감염된 성인의 5 내지 10%에서 만성 간 질병을 유발하고, 주산기 전염의 경우 비율이 역전되어 90% 초과가 만성 질병으로 진행한다. 치료되지 않은 만성 B형 간염 (CHB) 감염은 괴사성 염증 및 진행성 간 손상으로 진행되어 간경변 및 간세포 암종 (HCC)으로 이어진다. CHB는 HCC 발병 위험을 20배 증가시키는 것으로 추정되며 HCC 사례의 약 54%를 차지한다. HCC는 매년 약 800,000건의 새로운 사례가 진단되는 세 번째로 치명적인 암 형태이다. 매우 효과적인 (95% 초과) 예방 백신이 1980년대 초에 구현되었으나; 이러한 HBV 백신은 일단 감염이 확립되면 비효율적이다. 예방 백신의 광범위한 사용에도 불구하고 전 세계적으로 연간 2억 4000만 내지 3억 4000만 명의 만성 HBV 보균자와 780,000명 이상의 관련 사망이 발생한다. 새로운 HBV 감염의 대다수는 중국, 동남아시아 및 사하라 사막 이남의 아프리카와 같은 고도의 엔데믹 (endemic) 지역에서 발생한다. HBV 감염은 성적, 병원 또는 혈액 매개 감염을 통해 발생한다.
HBV 게놈은 4개의 중첩 오픈 리딩 프레임: 중합효소 (P, 또는 Pol), 중심 (C), 표면 항원 (HBsAg) (S), 기능이 완전히 이해되지는 않았지만 간암 발병과 관련이 있는 "X"라는 유전자로 구성된 3.2 kB 이중 가닥 DNA 분자이다. 문헌[Locarnini et al. Antivir Ther. 2010;15 Suppl 3:3-14]. 또한 유사종(quasispecies)을 생성하는 높은 돌연변이율을 나타내는 HIV 또는 HCV와 같은 다른 소형 만성 바이러스와 달리 HBV의 소형 (3.2 kb) DNA 게놈은 중첩 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로 인해 돌연변이 능력이 더 제한적이다. 숙주 내 돌연변이는 제한적이지만 백신과 같은 치료법을 설계할 때 고려해야 하는 고유한 HBV 유전자형이 전 세계적으로 발견된다.
만성 HBV 감염에 대한 현재의 치료 표준은 항바이러스제(antiviral) 및 인터페론-α를 사용한 치료이다.
현재까지, HBV에 대한 치료 백신접종은 효과가 없었다. 다수의 가능한 이유가 있다. 개체를 감염시키는 HBV 서열을 확인하는 것은 효과적인 치료를 제공할 특정 백신을 결정하는데 유용하다. HBV 게놈을 시퀀싱하고 검사하는 협력 컨소시엄으로 개발된 "HBVdb"라는 HBV 데이터베이스는 약 5000개의 HBV 전체 게놈을 확인하였다. 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Hayer et al. Nucleic Acids Res., 41:D566-D570 2013]을 참조한다. 그러나 일반적으로 서열이 중복되고 동일한 환자 또는 매우 밀접한 집합으로부터 다수의 서열이 단리되었기 때문에 HBVdb가 확인한 진정으로 고유한 총 HBV 전체 게놈의 수는 대략 3000개이다. HBVdb로 확인된 HBV 게놈은 다른 유전자형 (A, B, C, CB, D, DC, DE, E 및 F)으로 분류될 수 있다. 유전자형의 분포는 전 세계 인구에 걸쳐 다양하다. 예를 들어, 아시아, 특히 중국의 개체 샘플에서 HBVdb에서 사용할 수 있는 데이터 세트 서열의 거의 75%가 유전자형 B와 C를 포함한다. 반면에 유럽에서 HBV 감염의 절반 이상이 유전자형 A 및 D에 의한 감염을 나타낸다.
항바이러스제 및 인터페론-α를 사용한 치료는 바이러스 복제를 억제하고 선천적 면역계를 자극하지만, 바이러스를 거의 제거하지 않으며 (연간 1 내지 4%), 환자는 종종 평생 치료가 필요하다. 더욱이, 이러한 요법에 대한 개별 반응은 질병이 진행됨에 따라 다르며 장기간 치료는 내성 돌연변이와 광범위한 부작용을 초래할 수 있다. 가장 효과적인 직접 항바이러스 요법인 테노포비르 (tenofovir)와 엔테카비르 (entecavir)는 비용이 많이 들고 전문가 지침과 알고리즘을 사용하는 일부 환자에게만 사용된다. 요법이 실패하거나 사용되지 않으면 간 염증이 만성화되고 손상 및 재생 주기가 섬유증, 비정상적인 간 구조 및 가능하게는 HCC로 이어질 수 있다. 따라서, HBV의 제거 및 궁극적인 치료로 이어지는 효과적인 면역 반응을 일으키는 효과적인 면역요법이 긴급하게 요구되고 있다.
만성 HBV에 감염된 소수의 개체는 이의 감염이 자발적으로 제거될 것이며, 이는 혈액에서 측정된 표면 항원의 손실에 의해 확인되는 바와 같다. 이 비율은 연간 1% 정도이고 직접 작용하는 항바이러스제로 최소한으로 개선된다. 가장 효과적인 제거는 중증 부작용이 있고 종종 내성이 낮은 유형 1 인터페론으로 치료를 받는 순환 표면 항원의 양적 수준이 낮은 개체에서 발생한다.
감염을 제거하는데 필요한 T 세포가 고갈되거나 내성이 생겨 간에서 HBV의 효과적인 제거로 이어지지 않기 때문에 치료 백신 접종은 또한 부분적으로 효과가 없었다. 따라서 천연 감염에 의해 유도되지는 않지만 감염된 간세포의 표면에 디스플레이되는 펩타이드 서열을 여전히 인식하는 T 세포를 유도할 필요가 있다.
CMV/HBV 백신은 HBV의 제거 및 궁극적인 치료로 이어지는 효과적인 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 활성 간 내재 효과기(effector) CD8+ T 세포 (TEM) 반응의 유도는 HBV 제거에 중요하다. 따라서, CHB 환자의 간에서 새로운 에피토프를 인식하는 지속적인 효과기 HBV 특이적 CD8+ T 세포의 유도는 HBV를 제어하고 궁극적으로 제거하기에 충분해야 한다.
따라서, 상이한 유전자형의 HBV에 감염된 개체를 위한 효과적인 백신 접종을 확인하는 것이 당업계에 여전히 요구되고 있다. 그리고, 만성 HBV 감염에 대해 현재 이용가능한 백신의 효과가 없기 때문에, 당업계에는 이러한 감염을 치료하는데 사용될 수 있는 백신을 개발할 필요가 있다. 또한 임상 시험을 준비하기 위해 치료 HBV 백신을 설계, 제조 및 시험할 필요가 남아 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법은 이러한 요구를 다룬다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 11 또는 서열번호 14 내지 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 16 내지 36에 제시된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드를 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오타이드는 HBV 백신에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 11 또는 서열번호 14 내지 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 HBV에 대한 면역 반응을 생성하거나 HBV 감염을 치료 또는 예방하기 위한 상기 언급된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 36에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) (CMV) 벡터를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 11, 서열번호 14 내지 15, 및 서열번호 24 내지 26 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 아미노산 서열을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 서열은 발현이 개선되도록 정렬된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 서열번호 1 내지 36에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 CMV 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 HBV에 대한 면역 반응을 생성하거나 HBV 감염을 치료 또는 예방하는데 있어서 상기 언급된 벡터 또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 용도를 제공한다.
또한 본 명세서에서는 하나 이상의 HBV 에피센서스 (episensus) 항원을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 일부 실시양태에서, 백신의 항원은 폴리펩타이드로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 항원은 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항원은 동일하거나 상이한 프로모터에 의해 발현될 수 있는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 일부 실시양태에서, 항원은 상이한 바이러스 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 실시양태에서, HBV 백신은 2개 이상의 HBV 에피센서스 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, HBV 백신은 사이토메갈로바이러스 (CMV) 벡터 및 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 백신은 예방 백신이다. 일부 실시양태에서, 백신은 치료 백신이다.
일부 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 또는 백신 중 2개 이상을 포함하는 조성물, 예를 들어¸ 면역원성 조성물을 제공한다.
또한 대상체에서 HBV를 치료하는 방법으로서, 유효량의 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물을 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 제공된다. 또한 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법으로서, 유효량의 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물을 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 또한, HBV에 대한 면역 반응을 생성하는 방법으로서, 유효량의 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물을 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
또한, 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물이 HBV를 치료하거나, HBV 감염으로부터 대상체를 보호하거나, HBV에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 일부 실시양태가 본 명세서에 제공된다.
본 개시내용은 또한 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물의 용도를 제공한다. 본 개시내용은 또한 HBV에 대한 면역 반응을 생성하거나 유도하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물의 용도를 제공한다.
전장 서열, 이의 영역, 또는 이의 임의의 조합을 포함하여 HBV C, S, P로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 에피센서스 항원을 포함하는 HBV 폴리펩타이드가 본 명세서에서 제공된다.
하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신이 본 명세서에 추가로 제공된다. 또한 본 명세서에서는 하나 이상의 에피센서스 항원을 발현할 수 있는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 일부 실시양태에서, HBV 에피센서스 항원은 2개 이상의 에피센서스 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, HBV 백신은 예방 백신이다. 일부 실시양태에서, HBV 백신은 치료 백신이다.
본 개시내용은 대상체에서 HBV 감염을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 유효량의 상기 언급된 면역원성 조성물 또는 백신을 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 대상체를 위한 면역원성 조성물 또는 백신을 설계 및 생성하는 방법으로서, 대상체에서 HBV 바이러스를 시퀀싱하는 단계, 대상체에 존재하는 바이러스 내의 다양성을 포함하도록 설계된 백신 항원을 선택하는 단계 및 백신 항원을 벡터에 삽입하는 단계를 포함하는 방법이 추가로 제공된다. 또한 대상체에서 HBV 감염을 치료하는 방법으로서, 유효량의 개시된 면역원성 조성물 또는 백신을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
또한, 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 에피센서스 항원을 설계하는 단계; (b) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 생성하는 단계; 및 (c) 이를 필요로 하는 대상체에 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 명세서에 제공되는 방법의 에피센서스 항원은 서열번호 1 내지 11 및 서열번호 14 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함한다.
도 1. HBV 게놈 조직. 유사종을 생성하는 높은 돌연변이율을 나타내는 HIV 또는 HCV와 같은 다른 소형 만성 바이러스와는 달리, HBV의 작은 (3.2 kb) DNA 게놈은 중첩 오픈 리딩 프레임 (ORF)으로 인해 돌연변이 능력이 더 제한적이다.
도 2a 및 도 2b. HBVdb에서 사용 가능한 3041개 HBV 서열의 세계 분포. HBV의 유전자형은 전 세계에 분포되어 있다. 확인된 샘플링 국가의 서열만이 맵에 표시된다.
도 3a 및 도 3b. HBVdb에서 이용 가능한 아시아와 중국의 HBV 서열 분포. 아시아, 특히 중국에서 유전자형의 약 75%는 유전자형 B와 C이다.
도 4a 및 도 4b. 도 4a: 1개, 2개 및 3개의 에피센서스 서열을 사용한 HBV의 전체 프로테옴 (proteome) 범위. 도 4a는 단일 에피센서스 서열 (상단 패널)이 HBV의 게놈에 걸쳐 다양하고 제한된 범위를 제공함을 보여준다. 2개의 에피센서스 서열 (중간 패널) 또는 3개의 에피센서스 서열 (하단 패널)를 사용하면 범위가 개선된다. 도 4b: 3개의 에피센서스 서열은 정확한 9량체 매치의 수에서 알 수 있듯이 1개 또는 2개의 에피센서스 서열보다 더 적절한 범위를 제공한다.
도 5a 내지 도 5c. 전세계 HBV 집단(Global HBV population)을 사용하여 개발된 1, 2 또는 3개의 에피센서스 서열이 사용되는 경우 전체 프로테옴 범위. 전세계 HBV 집단을 사용하여 개발된 2개 또는 3개의 에피센서스 서열을 사용하면 B 및 C HBV 집단을 사용하여 개발된 에피센서스 서열과 비교하여 B와 C에 유사한 범위를 제공하면서 모든 주요 유전자형의 범위를 실질적으로 개선한다.
도 6. HBV 게놈의 4개의 보존된 영역과 관련하여 2개의 에피센서스 서열을 사용한 HBV의 전체 프로테옴 범위. 29개의 N-말단 아미노산과 P 단백질의 N-말단을 포함하는 초가변 영역이 창으로 표시된다. 초가변 영역은 추가 분석으로부터 제거된다.
도 7a 및 도 7b. 1개 (도 7a) 또는 2개 (도 7b) 에피센서스 서열이 중국 샘플, 중국 외의 샘플 및 전세계 샘플 코호트에서 사용될 때 가능한 T 세포 에피토프 (PTE)의 범위. X축은 범위 비율을 나타낸다. 회색 히스토그램은 무작위로 선택된 1000개의 천연 균주에 의한 가능한 T 세포 에피토프 범위를 나타낸다.
도 8. 다양한 에피센서스 서열에 대한 범위의 비교. 2_ChinaGlobal_Epi (2_CHGL_epi) 서열은 전세계 샘플의 0.809개 (80.9%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공한다. 2_CHGL_epi 서열은 중국 샘플에서 0.879개 (87.9%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공하고 중국 외의 샘플에서 0.772개 (77.2%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공한다.
도 9a 및 도 9b. 중국 샘플 (도 9a, 왼쪽), 중국 외의 샘플 (도 9a, 중간) 및 전세계 샘플의 코호트 (도 9a, 오른쪽)의 1_D.vac, 1_C.ref, 1_CH_epi, 1_GL_epi, 2_CH_epi, 2_CHGL_epi, 및 3_GL_epi의 보존된 영역 범위의 비교. 도 9b는 모든 주요 유전자형에서 1_D.vac, 1_GL_epi 및 2_CHGL_epi의 보존된 영역 범위를 도시한다.
도 10a 및 도 10b. 야생형 유전자형 D 서열 및 1_GL_epi 서열과 비교하여 2_CHGL_epi 서열을 사용한 1089개의 중국 HBV 서열 (도 10a) 및 모든 3041개의 전세계 HBV 서열 (도 10b)의 보존된 영역 범위. 유전자형 D 서열은 Transgene and GlobeImmune의 백신에 사용된다.
도 11a 내지 11d. 도 11a 및 도 11b는 미국 및 유럽에서 효율적인 에피토프 범위를 위해 개발된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원을 나타내고; 항원 작제물은 도 11a에서 시작하여 도 11b에서 계속된다. 중심 (C), PreS1 및 PreS2, 표면 항원 (S), 중합효소 (P) 서열로부터 유래된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원은 제시된 순서로 표시된다. 막관통 (TM) 도메인에 결실이 있거나 항원이 HBV의 단백질 순서에 따라 재정렬된 서열로부터 유래된 에피센서스 항원의 변이체는 응집을 최소화하고 발현을 최대화하기 위해 개발되었다. 도 11c는 C-말단에 삽입된 혈구응집소 (HA) 에피토프 태그를 각각 포함하는 동일한 항원에 대한 작제물을 나타낸다. 도 11d는 SDS 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-page)에 이어 면역블롯에 의해 측정된 각 작제물에 조작된 HA 에피토프 태그에 대한 항체로 개발된 항원의 바이러스 발현을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b. 도 12a는 PreS1 및 PreS2, 표면 항원 (S), 중합효소 (P) 및/또는 중심 (C) 서열로부터 유래된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원을 나타낸다. 4개의 항원은 도시된 바와 같이 P 단백질로부터 유래된 서열에 결실을 갖는다. 작제물 내로 조작된 V5 또는 헤마글루티닌 (HA) 에피토프 태그; V5 태그는 N' 말단에 삽입되었고 HA 태그는 C' 말단에 삽입되었다. 도 12b는 SDS-page에 이어 면역블롯에 의해 측정된 각 작제물에 조작된 V5 또는 HA 에피토프 태그에 대한 항체로 개발된 항원의 바이러스 발현을 나타낸다.
도 2a 및 도 2b. HBVdb에서 사용 가능한 3041개 HBV 서열의 세계 분포. HBV의 유전자형은 전 세계에 분포되어 있다. 확인된 샘플링 국가의 서열만이 맵에 표시된다.
도 3a 및 도 3b. HBVdb에서 이용 가능한 아시아와 중국의 HBV 서열 분포. 아시아, 특히 중국에서 유전자형의 약 75%는 유전자형 B와 C이다.
도 4a 및 도 4b. 도 4a: 1개, 2개 및 3개의 에피센서스 서열을 사용한 HBV의 전체 프로테옴 (proteome) 범위. 도 4a는 단일 에피센서스 서열 (상단 패널)이 HBV의 게놈에 걸쳐 다양하고 제한된 범위를 제공함을 보여준다. 2개의 에피센서스 서열 (중간 패널) 또는 3개의 에피센서스 서열 (하단 패널)를 사용하면 범위가 개선된다. 도 4b: 3개의 에피센서스 서열은 정확한 9량체 매치의 수에서 알 수 있듯이 1개 또는 2개의 에피센서스 서열보다 더 적절한 범위를 제공한다.
도 5a 내지 도 5c. 전세계 HBV 집단(Global HBV population)을 사용하여 개발된 1, 2 또는 3개의 에피센서스 서열이 사용되는 경우 전체 프로테옴 범위. 전세계 HBV 집단을 사용하여 개발된 2개 또는 3개의 에피센서스 서열을 사용하면 B 및 C HBV 집단을 사용하여 개발된 에피센서스 서열과 비교하여 B와 C에 유사한 범위를 제공하면서 모든 주요 유전자형의 범위를 실질적으로 개선한다.
도 6. HBV 게놈의 4개의 보존된 영역과 관련하여 2개의 에피센서스 서열을 사용한 HBV의 전체 프로테옴 범위. 29개의 N-말단 아미노산과 P 단백질의 N-말단을 포함하는 초가변 영역이 창으로 표시된다. 초가변 영역은 추가 분석으로부터 제거된다.
도 7a 및 도 7b. 1개 (도 7a) 또는 2개 (도 7b) 에피센서스 서열이 중국 샘플, 중국 외의 샘플 및 전세계 샘플 코호트에서 사용될 때 가능한 T 세포 에피토프 (PTE)의 범위. X축은 범위 비율을 나타낸다. 회색 히스토그램은 무작위로 선택된 1000개의 천연 균주에 의한 가능한 T 세포 에피토프 범위를 나타낸다.
도 8. 다양한 에피센서스 서열에 대한 범위의 비교. 2_ChinaGlobal_Epi (2_CHGL_epi) 서열은 전세계 샘플의 0.809개 (80.9%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공한다. 2_CHGL_epi 서열은 중국 샘플에서 0.879개 (87.9%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공하고 중국 외의 샘플에서 0.772개 (77.2%)의 정확한 전체 서열 범위를 제공한다.
도 9a 및 도 9b. 중국 샘플 (도 9a, 왼쪽), 중국 외의 샘플 (도 9a, 중간) 및 전세계 샘플의 코호트 (도 9a, 오른쪽)의 1_D.vac, 1_C.ref, 1_CH_epi, 1_GL_epi, 2_CH_epi, 2_CHGL_epi, 및 3_GL_epi의 보존된 영역 범위의 비교. 도 9b는 모든 주요 유전자형에서 1_D.vac, 1_GL_epi 및 2_CHGL_epi의 보존된 영역 범위를 도시한다.
도 10a 및 도 10b. 야생형 유전자형 D 서열 및 1_GL_epi 서열과 비교하여 2_CHGL_epi 서열을 사용한 1089개의 중국 HBV 서열 (도 10a) 및 모든 3041개의 전세계 HBV 서열 (도 10b)의 보존된 영역 범위. 유전자형 D 서열은 Transgene and GlobeImmune의 백신에 사용된다.
도 11a 내지 11d. 도 11a 및 도 11b는 미국 및 유럽에서 효율적인 에피토프 범위를 위해 개발된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원을 나타내고; 항원 작제물은 도 11a에서 시작하여 도 11b에서 계속된다. 중심 (C), PreS1 및 PreS2, 표면 항원 (S), 중합효소 (P) 서열로부터 유래된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원은 제시된 순서로 표시된다. 막관통 (TM) 도메인에 결실이 있거나 항원이 HBV의 단백질 순서에 따라 재정렬된 서열로부터 유래된 에피센서스 항원의 변이체는 응집을 최소화하고 발현을 최대화하기 위해 개발되었다. 도 11c는 C-말단에 삽입된 혈구응집소 (HA) 에피토프 태그를 각각 포함하는 동일한 항원에 대한 작제물을 나타낸다. 도 11d는 SDS 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-page)에 이어 면역블롯에 의해 측정된 각 작제물에 조작된 HA 에피토프 태그에 대한 항체로 개발된 항원의 바이러스 발현을 나타낸다.
도 12a 및 도 12b. 도 12a는 PreS1 및 PreS2, 표면 항원 (S), 중합효소 (P) 및/또는 중심 (C) 서열로부터 유래된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원을 나타낸다. 4개의 항원은 도시된 바와 같이 P 단백질로부터 유래된 서열에 결실을 갖는다. 작제물 내로 조작된 V5 또는 헤마글루티닌 (HA) 에피토프 태그; V5 태그는 N' 말단에 삽입되었고 HA 태그는 C' 말단에 삽입되었다. 도 12b는 SDS-page에 이어 면역블롯에 의해 측정된 각 작제물에 조작된 V5 또는 HA 에피토프 태그에 대한 항체로 개발된 항원의 바이러스 발현을 나타낸다.
I. 정의
본 명세서의 양태와 관련된 다양한 용어가 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한 해당 기술 분야에서 통상적인 의미를 가져야 한다. 기타 구체적으로 규정된 용어는 본 명세서에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 내용상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포"에 대한 언급은 2개 이상의 세포의 조합 등을 포함한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 모두 또는 이의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 하며 "및/또는"과 동의어로 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "~를 포함하다" 및 "~를 갖다"는 동의어로 사용되며, 이러한 용어 및 변용례는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
양, 시간적 기간 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 명시된 값으로부터 ±20%까지의 변화를 포함하는 것을 의미하며, 이러한 변동은 개시된 방법을 수행하기에 적합하다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 표시되지 않는 한, 다음 명세서 및 첨부된 청구범위에 설명된 수치 매개변수는 획득하고자 하는 적절한 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한 청구범위의 범위에 대한 균등물 원칙의 적용을 제한하고자 하는 것은 아니나, 각 수치 매개변수는 적어도 기록된 유효 자릿수의 관점에서 일반적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 개시내용의 넓은 범위를 제시하는 수치 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 예에 기재된 수치 값은 가능한 한 정확하게 기록된다. 그러나 모든 수치 값은 필수적으로 각각의 테스트 측정에서 기록된 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오차를 포함한다.
"~를 포함하다"라는 용어는 청구범위에 언급된 명시된 특징, 정수, 단계 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. "~로 필수적으로 이루어진"이라는 용어는 특정 재료 또는 단계 및 청구 대상의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 청구범위의 범위를 제한한다.
"실질적으로"라는 단어는 "완전히"를 배제하지 않으며; 예를 들어, Y가 "실질적으로 부재하는" 조성물은 Y가 완전히 부재할 수 있다. 필요한 경우, "실질적으로"라는 단어는 본 명세서에서 제공된 정의에서 생략될 수 있다.
상기 및 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 관련 장애, 병태 또는 부작용의 치료와 관련하여 적절한 결과를 획득하기 위해 필요한 기간 동안 투여시 유효한 양을 지칭한다. 성분의 유효량은 선택된 특정 백신, 성분 또는 조성물, 투여 경로 및 개체에서 적절한 결과를 이끌어내는 성분의 능력뿐만 아니라, 질병 상태 또는 완화될 병태의 중증도, 호르몬 수준, 연령, 성별, 개체의 체중, 환자의 상태 및 치료되는 병리학적 병태의 중증도, 동시 약물 또는 특수 식단 다음으로는 특정 환자와 같은 인자, 당업자가 인식할 수 있는 기타 인자에 의해 환자마다 다양하다는 것이 이해될 것이며, 적절한 투여량은 담당 의사의 재량에 따른다. 투여 요법은 개선된 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 유효량은 또한 성분의 임의의 독성 또는 유해한 효과보다 치료학적으로 유익한 효과가 더 큰 양이다.
"투여하는"이라는 용어는 화합물 또는 조성물을 직접 투여하거나, 체내에서 균등량의 활성 화합물 또는 물질을 형성할 전구약물, 유도체 또는 유사체를 투여하는 것을 의미한다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호 혼용되며, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물로 예방적 치료를 포함하는 치료가 제공되는 동물, 예를 들어 인간을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간 및 비인간 동물을 지칭한다. "비인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류, 예를 들어 인간이 아닌 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 랫트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 말 및 파충류, 양서류, 닭, 칠면조와 같은 비포유류를 포함한다.
용어 "에피센서스"는 에피토프 기반 공통 서열을 지칭한다. 이는 에피토프가 천연 서열의 참조 세트의 에피토프와 가능한 한 근접하게 매칭되는 서열이다. 용어 "에피토프" 및 "가능한 에피토프"는 종종 훨씬 더 긴 천연 또는 백신 항원 서열의 k-문자 하위 서열의 맥락에서 k 문자의 서열 (통상적으로 k는 8 내지 12 범위임)을 지칭한다. T 세포는 면역 반응에서 이러한 펩타이드를 인식할 수 있다.
용어 "EpiGraph"는 최적 에피센서스 서열을 제공하는 서열, 또는 조합될 때 다양한 바이러스 서열 집합의 최적 범위를 제공하는 서열 세트를 생성하기 위해 개발된 컴퓨터 전략을 지칭한다. EpiGraph 방법은 종래에 PCT 출원 WO 2016/054654 A1 및 문헌[Theiler, et al., Sci. Rep. 6:33987 (2016)]에 기재되었으며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. EpiGraph 방법은 다양한 바이러스 집합에 존재하는 가능한 T 세포 에피토프 (PTE, 일반적으로 9량체 펩타이드 서열)의 최대 범위로 인위적이지만 완전한 항원 세트를 생성한다. EpiGraph는 이전의 모자이크 백신 설계 방법에 대한 다음 단계이다. 그래프 기반 EpiGraph 방법은 유전자 알고리즘을 사용하는 모자이크보다 훨씬 더 강력한 계산 능력을 제공하므로 훨씬 더 많은 조합을 고려하여 PTE 범위를 개선할 수 있다. EpiGraph와 모자이크 방법은 모두 천연 균주보다 T 세포 에피토프 다양성을 더 많이 포함하는 단백질 항원을 생성한다. HBV, HIV 및 HCV 모자이크는 천연 균주 또는 공통 면역원의 조합보다 더 광범위하고 깊이 있는 세포 면역 반응을 유도하였다. HBV 모자이크 및 HIV 모자이크는 1상 임상 시험에 있다. 일부 실시양태에서, EpiGraph 알고리즘은 HBV의 보존된 영역에 해당하는 "에피센서스" 서열을 설계하는데 사용된다.
"에피센서스 서열"이라는 용어는 HBV 서열의 집단을 기반으로 하는 EpiGraph 알고리즘을 사용하여 설계된 인위적 항원의 아미노산 서열을 지칭한다. HBV 서열 집단의 "중심"인 에피센서스 서열은 집단의 최대 평균 에피토프 범위를 제공하는 계산에 의해 유도된 서열이다. "에피센서스 항원"은 에피센서스 아미노산 서열을 포함하는 항원이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "요법" (및 치유 또는 완화를 포함하는 이의 상이한 형태)은 감염된 이들의 치료를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는"은 병태, 질병 또는 장애의 적어도 하나의 역효과 또는 부정적 효과 또는 증상을 경감 또는 감소시키는 것을 포함한다. 이 병태, 질병 또는 장애는 HBV 감염일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "방지" 또는 "예방"은 대상체가 예를 들어, HBV 또는 관련 바이러스에 감염되는 것을 방지하거나 대상체의 감염 위험을 감소시키거나, 전염을 중단시키거나, 전염 위험을 감소시키는 것을 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 합당한 이익/위험 비율로 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제가 되는 합병증이 없이 인간 및 동물의 조직과의 접촉에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "백신", "면역원성 화합물" 및 "면역원성 조성물"은 대상체에서 면역 반응을 유도하는 화합물 또는 조성물을 지칭하기 위해 상호 혼용된다. 예방 백신은 새로운 감염에 대한 일정 정도의 보호를 제공한다. 치료 백신은 기존 감염의 치료를 보조한다.
II. 항원
본 명세서에서는 특정 HBV 집단으로부터 유래되는 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 11 또는 서열번호 14 내지 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 16 내지 36에 제시된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 29에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 16, 21, 27, 28, 또는 34에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 20, 22, 23, 30, 31, 33, 35, 또는 36에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 폴리펩타이드는 서열번호 17 및 18에 제시된 아미노산 서열 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리펩타이드 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 특정 실시양태에서, 면역원성 조성물은 상기 언급된 폴리펩타이드 중 하나를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 단일 폴리펩타이드 또는 2개 이상의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있는 상기 언급된 폴리펩타이드 중 2개 이상을 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리펩타이드는 EpiGraph 방법을 사용하여 야생형 HBV 서열로부터 유래된 서열을 포함하는 에피센서스 항원이다. EpiGraph 알고리즘에서 천연 서열은 큰 결절점 그래프를 특징으로 하며, 각 결절점은 천연 서열에 나타나는 에피토프에 해당한다. 유도된 간선은 해당하는 두 에피토프 열이 "일치"할 때 두 결절점을 연결하며, 이는 제1 열의 마지막 k 내지 1 문자가 제2 열의 첫 번째 k 내지 1 문자와 일치함을 의미한다. 두 열이 일치하면 길이가 함께 k+1인 열을 형성한다. 더욱 일반적으로, 결절점 및 간선의 이 그래프를 통한 경로는 그래프의 각 결절점에 해당하는 k량체 하위 열을 포함하는 단일 열에 해당한다. 각 결절점은 참조 세트에서 해당 결절점에 해당하는 하위 열을 나타내는 서열의 수에 따라 가중치가 부여된다. EpiGraph 알고리즘은 동적 프로그래밍 방식을 사용하여 이 전체 그래프를 통해 이러한 가중치의 합을 최대화하고 따라서 가장 큰 범위를 제공하는 경로를 찾는다.
일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV C 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV Pol (P) 또는 S 단백질, 또는 또 다른 HBV 단백질로부터 유래된다. 에피센서스 항원은 전장 단백질 서열, 전장 단백질 서열의 영역, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV C, P, 및 S 단백질 중 2개 이상으로부터 유래되는 에피토프를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 PreS1 도메인 또는 PreS2 도메인으로부터 유래되는 하나 이상의 에피토프를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV의 보존된 영역으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV C, S, 및 P 중 하나 이상의 보존된 영역으로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV 게놈에서 그의 순서에 대해 재정렬된 서열에 의해 2개 이상의 HBV C, P 및 S 단백질로부터 유래된 서열을 포함한다. 에피센서스 항원 내 서열의 재정렬은 항원의 더 효율적이거나 그렇지 않으면 개선된 시험관내 발현을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아미노산의 결실 또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 HBV 단백질로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 야생형 단백질에 존재하는 적어도 하나의 기능을 불활성화시킨다. 예를 들어, PreS1은 단백질의 N 말단에서 미리스토일화 서열을 제거함으로써 불활성화될 수 있거나, Pol은 효소 활성 부위를 결실 또는 돌연변이시킴으로써 불활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 돌연변이가 HBV 리보뉴클레아제 H (RNAseH)의 활성 부위에 존재하고 RNAseH 활성의 손실을 초래한다. 예시적인 돌연변이가 표 1에 제시되어 있다.
특정 실시양태에서, 에피센서스 항원은 선택된 HBV 집단을 사용하여 개발되고, 이는 그 집단의 중심인 에피센서스 항원을 생성한다. 예를 들어, HBV 집단은 선택된 지리적 위치, 예컨대 아시아, 북아메리카, 남아메리카, 유럽, 아프리카 또는 호주에 존재하는 HBV 유전자형일 수 있다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국에서HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아시아 또는 더욱 구체적으로, 중국의 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV 다중-유전자형 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 집단 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 북아메리카의 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV 다중-유전자형 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카에서HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 남아메리카의 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV 다중-유전자형 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 집단 에피센서스 항원은 유럽의 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 유럽의 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV 다중-유전자형 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 아메리카의 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 호주의 HBV 다중-유전자형 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 호주의 HBV A 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 호주의 HBV B 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 호주의 HBV C 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 호주의 HBV CB 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV D 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV DC 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV DE 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV E 영역 전염병에 중심이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 HBV F 영역 전염병에 중심이다.
다른 실시양태에서, 에피센서스 항원은 개시된 백신의 HBV 전세계 세트에 중심이다.
일부 실시양태에서, HBV 에피센서스 항원은 중국으로부터의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 1_CH_epi (서열번호 1)이다. 일부 실시양태에서, HBV 에피센서스 항원은 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 1_GL_epi (서열번호 2)이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 2개 이상의 개별 에피센서스 항원의 조합이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 중국으로부터의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 2개의 에피센서스 항원을 포함하는 2_CH_epi를 포함한다 (서열번호 3 및 서열번호 4). 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 중국으로부터의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원 Epi1 (서열번호 5), 및 용액에 이미 고정된 Epi1과 함께 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 제2 에피센서스 항원 Epi2 (서열번호 6)을 포함하는 2_CHGL_epi를 포함한다. 즉, Epi2는 Epi1이 이미 존재하는 상태에서 개발되어 Epi1과 상보적이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 Epi3 (서열번호 7) 및 Epi4 (서열번호 8)를 포함하는 2_CHGL_epi의 변형된 형태를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 3개의 에피센서스 항원 (서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11)을 포함하는 3_GL_epi를 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), GenBank 수탁번호 Y07587을 포함한다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), GenBank 수탁번호 GQ358158을 포함한다. 수탁번호 Y07587 및 GQ358158의 참조 유전자 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 서열번호 14의 변형된 유전자형 D 서열이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 서열번호 15의 재배열된 유전자형 D 서열이다. 일부 실시양태에서, 에피센서스 항원은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36에 제시된 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시양태에서, HBV 에피센서스 항원은 서열번호 1 내지 서열번호 36에 제시된 서열 중 2개 이상을 포함한다.
또한, 상기 언급된 에피센서스 항원 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신이 본 명세서에서 제공된다. 에피센서스 항원은 DNA, RNA 또는 폴리펩타이드로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백신은 단일 항원을 포함한다. 다른 실시양태에서, 백신은 2개 이상의 항원을 포함하며, 이는 단일 폴리펩타이드로서 또는 2개 이상의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백신은 선택된 지리적 위치에 존재하는 유전자형과 같은 선택된 HBV 유전자형에 대한 효율적인 에피토프 범위를 제공하는 에피센서스 항원을 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 백신은 중국으로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 2개의 에피센서스 항원을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백신은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열을 포함하는 에피센서스 항원을 포함하며, 이는 1개의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신은 중국으로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 에피센서스 항원 및 전세계 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 에피센서스 항원을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백신은 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 서열을 포함하는 에피센서스 항원을 포함하며, 이는 하나의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, 백신은 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 서열을 포함하는 에피센서스 항원을 포함하며, 이는 하나의 폴리펩타이드 또는 2개의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신은 전세계 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 3개의 에피센서스 항원을 포함한다. 특정 실시양태에서, 백신은 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 11에 제시된 서열을 포함하는 에피센서스 항원을 포함하며, 이는 하나의 폴리펩타이드, 2개의 폴리펩타이드, 또는 3개의 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다.
III. 폴리뉴클레오타이드 및 벡터
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 상기 언급된 항원 중 임의의 것을 인코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 36 중 하나 이상에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 특정 숙주에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 11 또는 서열번호 14 내지 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 16 내지 36에 제시된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 19 또는 29에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 16, 21, 27, 28, 또는 34에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 20, 22, 23, 30, 31, 33, 35, 또는 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 14에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 25에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 26에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩한다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17 및 18에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 추가로 인코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드 중 2개 이상을 포함하는 조성물, 예를 들어 면역원성 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 백신을 제공한다. 특정 실시양태에서, 백신은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함한다.
본 명세서에서는 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 것을 포함하는 벡터를 추가로 제공한다. 사용될 수 있는 벡터는 다음에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드, 박테리아 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터에는 사이토메갈로바이러스 벡터가 포함된다. 치료 백신 전달에 사용하기 위한 CMV 벡터의 장점은 특정 CD8+ T 세포 반응을 유도하고 보다 강력하고 지속적인 반응을 유도하는데 사용할 수 있다는 것이다. 동물 모델에서 이러한 바이러스 벡터를 기반으로 하는 백신이 바이러스 감염을 제거할 수 있는 것으로 나타났으며 (문헌[Hansen et al., Science 340:1237874 (2013)]), 따라서 이러한 접근 방식은 치료 백신에 대한 가능성이 있다 (또한 문헌[Hansen et al, Science 351:714-720 (2016)])
다른 바이러스 벡터는 백시니아 앙카라 (vaccinia Ankara) 및 카나리아 수두 (canary pox)를 포함하는 폭스바이러스; 아데노바이러스 유형 5 (Ad5)를 포함하는 아데노바이러스; 풍진; 센다이 바이러스 (sendai virus); 랍도바이러스 (rhabdovirus); 알파바이러스 (alphavirus); 및 아데노 연관 바이러스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 백신 항원은 백신의 DNA, RNA 또는 단백질 성분으로 전달될 수 있다. 에피센서스 항원은 필수적으로 임의의 방식의 백신 항원 전달에 적합할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 발현 벡터가 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항원을 인코딩하는 핵산을 전달하는데 사용되는 벡터-기반 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 예를 들어, 발현 벡터는 폭스바이러스, 아데노바이러스, 풍진, 센다이 바이러스, 랍도바이러스, 알파바이러스, 또는 아데노 연관 바이러스 골격일 수 있다.
일부 실시양태에서, CMV 벡터는 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법에 사용된다. 다수의 양태에서 만성 HBV 감염은 CMV 벡터에 의한 면역치료적 개입에 특히 적합하다.
첫째, 성숙한 면역계를 가진 대다수의 개체는 효과적인 면역 반응을 쉽게 유발하고 급성 감염을 제거한다. 이러한 면역 제거는 대부분 사이토카인 생성 CD8+ T 세포에 의해 매개되기 때문에 활성 간 상주 효과기 CD8+ T 세포 (TEM) 반응의 유도가 HBV 제거에 중요한 것으로 보인다. 따라서 CHB 환자의 간에서 지속적인 효과기 HBV 특이적 CD8+ T 세포의 유도는 HBV를 제어하고 궁극적으로 제거하기에 충분해야 한다. CMV 기반 벡터에 의해 유도된 TEM-빈도는 접종된 붉은털 원숭이 (RM)의 간에서 특히 높다 (문헌[Hansen et al., Nature 473:523-527 (2011)], 첨부된 도 1).
둘째, 유사종을 초래하는 높은 돌연변이율을 나타내는 HIV 또는 HCV와 같은 다른 소형 만성 바이러스와 달리, HBV의 소형 (3.2 kb) DNA 게놈은 중첩 개방 판독 프레임 (ORF)으로 인해 돌연변이 능력이 더욱 제한된다 (도 1).
불행히도, 통상적인 백신 접종 접근법 (예를 들어, 펩타이드 기반, 단백질 기반, DNA, 및 심지어 DNA와 수두 바이러스 벡터 모두를 포함하는 이종 프라임-부스트 T 세포 유도 요법)에 의해 유도된 T 세포는 수개월 후 더 이상 주변부에서 검출되지 않으며, 이는 바이러스 반동의 원천을 잠재적으로 제공할 수 있는 잔류 HBV 게놈의 생존을 완전히 방지하기에는 너무 짧을 수 있다. 이와 달리, CMV-벡터 유도 TEM만이 수년 동안 높은 빈도로 순환계 및 간에서 지속적으로 유지된다 (문헌[Hansen et al., Nature 2011]).
특정 실시양태에서, 벡터는 HCMV 또는 RhCMV 골격 및 항원을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 인간 CMV (HCMV) 벡터 또는 붉은털 원숭이 CMV (RhCMV) 벡터를 포함한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 임의의 것을 인코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 2개 이상을 인코딩한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 하나 이상을 인코딩한다.
본 개시내용은 각각이 상기 언급된 항원 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 2개 이상의 벡터를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
일부 실시양태에서, CMV 벡터에는 외피 단백질 pp71을 인코딩하는 UL82 유전자가 부재한다. 일부 실시양태에서, UL82 유전자는 상기 언급된 항원 중 하나 이상을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 대체된다. 일부 실시양태에서, CMV 벡터는 UL128-UL130 유전자 영역이 부재한다. 일부 실시양태에서, CMV 벡터는 UL146-UL147 유전자 영역이 부재한다. 일부 실시양태에서, CMV 벡터는 UL128-UL130 유전자 영역이 부재하고 UL146 내지 147 유전자 영역이 부재한다. 일부 실시양태에서, CMV 벡터는 완전한 UL128-UL130 유전자 영역 및 완전한 UL146-UL147 유전자 영역을 갖는다. UL128-UL130 유전자 영역은 UL128 유전자, UL130 유전자, 및 UL128 유전자와 UL130 유전자 사이의 임의의 영역을 포함한다. UL146-UL147 유전자 영역은 UL146 유전자, UL147 유전자, 및 UL146 유전자와 UL147 유전자 사이의 임의의 영역을 포함한다.
특정 양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. CMV 벡터에 의해 유발된 면역 반응은 기존의 항-벡터 면역의 영향을 받지 않으므로 다른 항원에 대해 동일한 벡터를 순차적으로 사용할 수 있다 (문헌[Hansen et al., Nature Medicine 15:293 내지 299 (2009)]). 부분적으로, 수퍼 감염 능력은 CD8+ T 세포에 대한 MHC-I 매개 항원 제시의 바이러스 성 억제제 때문이다 (문헌[Hansen et al., Science 328:102 내지 106 (2010)]). 대부분의 CHB 환자를 포함하여 거의 전체 인간 인구가 HCMV에 만성적으로 감염되어 있기 때문에 수퍼 감염은 중요한 특징이며 수용체 CMV 상태에 관계없이 CMV 벡터를 사용할 수 있다. CMV 벡터는 고유한 면역학을 가지고 있다. 특정의 변형된 RhCMV/SIV 벡터의 놀랍고 예상치 못한 특징은 이러한 벡터가 SIV 감염 자체에 대한 반응으로 또는 SIV 항원을 발현하는 임의의 다른 벡터 플랫폼에 대한 반응으로 통상적인 MHCIa-제한된 CD8+ T 세포에 의해 인식되는 임의의 에피토프를 인식하지 못하는 CD8+ T 세포를 유도한다는 발견이다. 그럼에도 불구하고, CMV-벡터 유발 CD8+ T 세포는 PCT/US2016/017373에 제시된 바와 같이 소정의 항원 내에서 3배 많은 펩타이드를 인식했으며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다 (또한 문헌[Hansen et al., Science 2013, 2016] 참조).
이 놀라운 폭(breath)에 대한 근본적인 원인은 100마리 초과의 동물에서 소정의 항원 (CMV, SIV, TB)의 개별 펩타이드에 대한 제한 요소를 분석하여 결정되었으며 이는 CMV 벡터의 놀라운 특징을 보여준다: Rh 68-1 벡터에 의해 유도되는 펩타이드는 각각 MHC-I 유래 펩타이드 VMAPRTLLL (VL9)에 정상적으로 결합하는 비다형성 MHC-I 분자, MHC-E 또는 CD4+ T 세포에 의해 정상적으로 인식되는 MHC-II에 의해 제시되며, 억제 NKG2A NK 세포 수용체에 대한 리간드로 작용한다. (참고로, CD4+ T 세포는 모두 통상적인 것으로, 즉, MHC-II에 의해 제한됨). 놀랍게도, 전체 항원을 포함하는 중첩 펩타이드 풀에 대한 균주 68-1 RhCMV 유도 CD8+ T 세포 반응은 불변 사슬 유래 CLIP (MHC-II 억제) 또는 VL9 (MHC-E 억제)의 추가에 의해 완전히 차단될 수 있음으로써 모든 CD8+ T 세포 에피토프가 "비 통상적"임을 보여준다 (문헌[Hansen et al., Science 2016]). MHC-II 및 MHC-E 제한 CD8+ T 세포가 다른 감염병 및 암에서 때때로 관찰되며, RhCMV 면역 동물에서 이러한 T 세포의 다존재는 전례가 없고 진정으로 통상적인 인식을 깨는 것이다. 중요하게도, RhCMV-벡터 유도 MHC-II 및 MHC-E 및 MHC-Ia-비정규 (아래 논의됨) 제한 CD8+ T 세포는 SIV-감염된 CD4+ T 세포를 인식하며, 이는 SIV-감염된 세포에서 SIV가 이러한 반응을 준비할 수 없는 경우에도 비통상적인 항원 제시가 발생할 수 있음을 시사한다. HCV를 포함하는 다수의 만성 바이러스는 예측컨대 NK 세포에 대한 방어로서 HLA-E를 상향조절하므로, 이러한 고도로 보존된 MHC 분자가 면역요법을 위한 새로운 표적을 나타낸다. (HBV에 감염된 간세포에서 HLA-E의 발현은 HCV와 비교하여 덜 알려져 있지만 순환하는 HLA-E의 높은 수준은 만성 HBV 보균자에서 발견됨). 따라서 MHC-E 제한 CD8+ T 세포를 유도하는 능력은 이러한 고도로 보존된 제한 요소를 통해 HBV를 표적화할 가능성을 열어준다.
CMV 벡터에서 유전자 변형의 특정 패턴은 다양한 T 세포 반응과 관련이 있다. UL128-UL130 유전자 영역과 UL146-UL147 유전자 영역이 부재하는 벡터에 의해 비 통상적인 CD8+ T 세포가 유도된다 (문헌[Hansen et al., Science 2013, 2016, OHSU2346]). 이와 달리, 천연 RhCMV 감염 또는 RhCMV의 UL128-UL130 복원 형태 (Rh68-1)에 의해 유도된 CD8+ T 세포 반응은 통상적이며, 즉, MHC-I가 제한된다 (문헌[Hansen et al., Science 2013]). 그러나 UL128-UL130-완전한 벡터에 의해 유발된 통상적인 CD8+ T 세포 반응조차도 비-mCMV 벡터에 의해 유도된 것보다 현저히 더 광범위하다 (문헌[Hansen et al., Science 2013]). 더욱이, 면역 회피 유전자 US11이 "정규" (즉, 면역우성) MHC-I 에피토프를 인식하는 T 세포의 유도를 방지하기 때문에 이러한 광범위한 통상적인 CD8+ T 세포 반응은 전적으로 하위 우성 ("비정규") 에피토프에 유도된다 (문헌[Hansen et al. Al., Science 2013]). 따라서, 유전자 변형된 CMV 벡터는 각각이 중첩되지 않는 에피토프 세트를 인식하고 다음과 같이 분류되는 4개의 다른 CD8+ T 세포 집단을 유도할 수 있다: 1. 비통상적인 MHC-II 제한; 2. 비통상적인 MHC-E 제한; 3. 통상적인 MHC-I 제한, 비정규 (=하위우성); 4. 통상적인 MHC-I 제한, 표준 (=면역우성). UL128-UL130 및 UL146-UL147 유전자 영역의 존재 또는 부재는 통상적인 CD8+ T 세포로부터 비통상적인 CD8+ T 세포로의 전환을 결정하고, 표준 CD8+ T 세포는 UL128-UL130 및 UL146-UL147이 존재하는 벡터 및 UL128 내지 130 및 UL146-UL147이 부재하는 벡터 모두에서 US11의 부재시 유도된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 임의의 상기 언급된 벡터 및 항원을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 임의의 것을 인코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 2개 이상을 인코딩한다. 2개 이상의 폴리펩타이드는 동일하거나 상이한 프로모터에 의해 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오타이드는 상기 언급된 항원 중 하나 이상을 인코딩한다. 특정 실시양태에서, 백신은 상기 언급된 벡터 중 하나 이상 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다.
III. 치료 방법
특정 실시양태에서, 대상체에서 HBV를 치료하는 방법으로서, 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 백신은 지리적 영역 내에서 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하도록 선택된 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 폴리펩타이드의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, 백신은 재조합 바이러스 벡터에 제공될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 형태로 제공된다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 백신은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 면역 반응을 유도하거나 생성하는 방법이 제공된다. 이러한 방법은 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 지리적 영역 내에서 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하도록 선택된 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 폴리펩타이드의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, 백신은 재조합 바이러스 벡터에 제공될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 형태로 제공된다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 백신은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 대상체에서 HBV 감염을 치료하는 방법으로서, 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 지리적 영역 내에서 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하도록 선택된 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 폴리펩타이드의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, 백신은 재조합 바이러스 벡터에 제공될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 형태로 제공된다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 백신은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 개시내용은 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법으로서, 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 조성물 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 백신은 지리적 영역 내에서 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하도록 선택된 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 백신은 하나 이상의 폴리펩타이드의 형태로 제공된다. 다른 실시양태에서, 백신은 재조합 바이러스 벡터에 제공될 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 형태로 제공된다. 상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 백신은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 하나 이상의 에피센서스 서열을 결정하고, 하나 이상의 에피센서스 서열을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 포함하는 백신을 생성하고, 이를 필요로 하는 대상체에 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 하나 이상의 에피센서스 서열을 결정하고, 하나 이상의 에피센서스 서열의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 항원을 포함하는 백신을 생성하고, 이를 필요로 하는 대상체에게 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열은 1_CH_epi (서열번호 1), 1_GL_epi (서열번호 2), 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CH_epi, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CHGL_epi, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CHGL_epi, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 3_GL_epi, 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), 서열번호 14의 변형된 유전자형 D 서열 및 서열번호 15의 재정렬된 유전자형 D 서열을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36에 제시된 서열 중 하나 이상을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 36 중 2개 이상을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 상기 언급된 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 생성하고, 이를 필요로 하는 대상체에 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 언급된 에피센서스 항원 중 하나 이상을 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 생성하고, 이를 필요로 하는 대상체에 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열은 1_CH_epi (서열번호 1), 1_GL_epi (서열번호 2), 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CH_epi, 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CHGL_epi, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 2_CHGL_epi, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 3_GL_epi, 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), 서열번호 14의 변형된 유전자형 D 서열 및 서열번호 15의 재정렬된 유전자형 D 서열을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36에 제시된 서열 중 하나 이상을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 에피센서스 서열이 서열번호 1 내지 서열번호 36 중 2개 이상을 포함하는 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
상기 언급된 실시양태 중 임의의 것에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다.
HBV 백신 연구에서 최근의 돌파구는 HBV 감염을 예방하기 위한 효과기 기억 T 세포 (TEM)-유도 백신의 개념을 포함한다. 통상적인 백신 접근법에 의해 유도된 중추 기억 T 세포 (TCM)와 달리 TEM은 림프 조직 및 림프외 효과기 부위에서 지속적으로 유지되며 항바이러스 효과기 기능을 즉시 매개할 준비가 되어 있어 바이러스 진입 및 바이러스 재활성화 부위의 입구에서 지속적인 면역 보호를 제공한다. TEM을 유도하고 무기한 유지하는 가장 적합한 벡터 시스템은 CMV로부터 유래된다. 예상컨대 지속적으로 감염된 세포에서 지속적으로 낮은 수준의 재활성화 및/또는 유전자 발현으로 인해 CMV는 T 세포 고갈을 유발하지 않고 TEM 유지에 필요한 지속적이고 낮은 수준의 면역 자극을 적절한 양만큼 유지한다.
특정 실시양태에서, 면역원성 조성물 또는 백신은 치료 백신 상황에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 백신은 HBV와 같은 고도로 가변적인 병원체에 감염된 이들의 집단에서 에피토프의 적절한 범위를 제공하는 6 내지 10개의 항원 서열 세트를 확인하기 위해 k-수단 군집 분류 전략을 사용하여 설계할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체를 감염시키는 바이러스를 시퀀싱하고, 감염 바이러스에서 에피토프의 적절한 범위를 제공하는 2개 또는 3개의 백신 (또는 2개 또는 3개의 폴리펩타이드 또는 2개 또는 3개의 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 백신)을 전달한다. 따라서, 효율적인 에피토프 범위가 제공되며, 백신과 감염 균주 간의 에피토프 미스매치가 최소화된다.
제공된 특정 실시양태는 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 특정 CMV 유전자 영역이 부재하는 HCMV 골격 벡터를 포함하는 면역원성 조성물 또는 백신을 포함한다. 특정 실시양태에서, HCMV 골격에는 UL128-UL130 유전자 영역 (UL128 유전자, UL130 유전자, 및 UL128 유전자와 UL130 유전자 사이의 임의의 영역 포함) 및 UL146-UL147 유전자 영역 (UL146 유전자, UL147 유전자 및 UL146 유전자와 UL147 유전자 사이의 임의의 영역 포함)이 부재한다. 특정 실시양태는 또한 외피 단백질 pp71 (UL82) 유전자의 결실을 포함할 수 있다. (미국 특허 출원 공개 제 2014/0141038호; 제 2008/0199493호; 제 2013/0142823호; 및 국제 출원 공개 WO/2014/138209).
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HBV 감염 치료에 사용하기 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물 중 임의의 것을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물 중 임의의 것을 제공한다.
본 개시내용은 HBV 감염의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물 중 임의의 것의 용도를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 언급된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 면역원성 조성물, 백신, 또는 조성물 중 임의의 것의 용도를 추가로 제공한다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물을 투여하는 통상적인 경로는 제한 없이 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "비경구"는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 특정 실시양태에서, 투여는 경구, 정맥내, 비경구, 위내, 흉막내, 폐내, 직장내, 피내, 복강내, 종양내, 피하, 국소, 경피, 수조내, 척수강내, 비강내 및 근육내로부터 선택되는 경로로 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에 따른 약제학적 조성물은 환자에게 조성물을 투여할 때 그 안에 포함된 활성 성분이 생체이용가능하도록 제형화된다. 대상체 또는 환자에 투여될 조성물은 하나 이상의 투여 단위의 형태를 취할 수 있으며, 예를 들어 정제는 단일 투여 단위일 수 있고 액체 형태의 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물은 복수의 투여 단위를 유지할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이며; 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000]을 참조한다. 투여될 조성물은 임의의 경우 본 명세서의 교시에 따라 HBV의 치료 또는 예방을 위한 유효량의 본 개시내용의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물을 포함할 것이다.
조성물은 고체 또는 액체의 형태일 수 있다. 일부 실시양태에서, 담체 (들)는 미립자이고, 조성물은 예를 들어 정제 또는 분말 형태이다. 담체 (들)는 액체일 수 있으며, 조성물은 경구 오일, 주사 가능한 액체 또는 예를 들어 흡입 투여에 유용한 에어로졸이다. 경구 투여를 위해 의도된 경우, 약제학적 조성물은 바람직하게는 고체 또는 액체 형태이고, 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태는 본 명세서에서 고체 또는 액체로 고려되는 형태 내에 포함된다.
경구 투여용 고체 조성물로서, 약제학적 조성물은 분말, 과립제, 압축 정제, 환제, 캡슐, 씹는 검, 웨이퍼 (wafer) 등으로 제형화될 수 있다. 이러한 고체 조성물은 통상적으로 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함할 것이다. 또한, 다음 중 하나 이상이 존재할 수 있다: 카복시메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토스 또는 덱스트린, 알긴산, 알긴산나트륨과 같은 붕해제, 프리모겔 (Primogel), 옥수수 전분 등과 같은 부형제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스 (Sterotex)와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미와 같은 향미제; 및 착색제. 본 조성물이 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태인 경우, 상기 유형의 물질 이외에 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일과 같은 액체 담체를 포함할 수 있다.
조성물은 액체, 예를 들어 엘릭서 (elixir), 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 두 가지 예와 같이 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여를 위해 의도된 경우, 바람직한 조성물은 본 화합물에 추가하여 하나 이상의 감미제, 보존제, 염료/착색제, 및 향미 증진제를 포함한다. 주사로 투여되는 조성물에는 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충액, 안정화제, 등장제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
액체 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 기타 유사한 형태인지에 상관없이 하기 애주번트 (adjuvant) 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질알코올, 메틸파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제. 비경구 제제는 앰플, 일회용 주사기 또는 유리나 플라스틱으로 제조된 다회 투여량 바이알에 충전될 수 있다. 생리식염수가 바람직한 애주번트이다. 주사 가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균 상태이다. 비경구 또는 경구 투여를 위한 액체 조성물은 적절한 투여량이 획득되도록 본 명세서에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신 또는 조성물의 양을 포함해야 한다.
조성물은 국소 투여용일 수 있으며, 이 경우 담체는 용액, 에멀젼, 연고 또는 겔 기제를 적절하게 포함할 수 있다. 기제는 예를 들어 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 바세린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 밀랍, 광유, 희석제, 예를 들어 물 및 알코올, 유화제 및 안정화제. 증점제는 국소 투여용 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용의 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온삼투 장치를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 예를 들어 직장에서 용해되어 약물을 방출하는 좌제의 형태의 직장 투여용일 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유지성 기제를 포함할 수 있다. 이러한 기제에는 제한 없이 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.
조성물은 고체 또는 액체 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분 주위에 코팅 외피(coating shell)를 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 외피를 형성하는 물질은 일반적으로 불활성이며, 예를 들어 설탕, 셸락 (shellac) 및 기타 장용 코팅제로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 젤라틴 캡슐에 포장될 수 있다. 고체 또는 액체 형태의 조성물은 본 개시내용의 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물에 결합하여 화합물의 전달을 보조하는 제제를 포함할 수 있다. 이러한 능력으로 작용할 수 있는 적합한 제제는 단일클론 또는 다클론 항체, 하나 이상의 단백질, 또는 리포솜을 포함한다. 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투여 단위로 필수적으로 이루어질 수 있다. 에어로졸이라는 용어는 콜로이드 특성에서 가압 패키지로 구성된 시스템에 이르기까지 다양한 시스템을 나타내는데 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스 또는 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템에 의해 수행될 수 있다. 에어로졸은 활성 성분 (들)을 전달하기 위해 단일상, 2상 또는 3상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달에는 필요한 용기, 활성제, 밸브, 하위 용기 등이 포함되며, 이들은 함께 키트를 형성할 수 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 바람직한 에어로졸을 결정할 수 있다.
본 개시내용의 조성물은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드용 담체 분자 (예를 들어, 지질 나노입자, 나노규모 전달 플랫폼 등)를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
약제학적 조성물은 약제학 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사에 의한 투여 목적의 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물 및 선택적으로, 염, 완충액 및/또는 안정화제 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 멸균 증류수와 조합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 분자의 용해 또는 균질한 현탁액을 촉진하기 위해 분자와 비공유결합에 의해 상호작용하는 화합물이다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양으로 조성물 (들)을 제공한다.
조성물은 유효량으로 투여되며, 이는 사용된 특정 화합물의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 기간; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 투여 방식 및 시간; 배출 속도; 약물 조합; 특정 장애 또는 병태의 중증도; 및 치료를 받고 있는 대상체를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 실시양태를 보다 상세하게 기재하기 위해 제공된다. 이는 실시양태를 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 문서, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참조로 포함되며 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 실시에 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1:
치료 백신으로 사용하기 위한 에피센서스 항원의 확인
HBV에 대한 에피센서스 항원을 PCT 출원 WO 2016/054654 A1 및 문헌[Theiler, et al., Sci. Rep. 6:33987 (2016)]에 기재된 바와 같은 EpiGraph 방법을 사용하여 개발하였으며, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한 EpiGraph 알고리즘을 사용하기 위한 도구는 hiv.lanl.gov/content/sequence/EPIGRAPH/epigraph.html에서 이용 가능하다.
각 대상체에 대한 설계 백신을 구축하는 것은 실현 가능하지 않지만, 백신 선택 사항의 작은 참조 세트 내에서 적절한 매치를 획득하고자 하는 대상체로부터 바이러스를 시퀀싱하는 것은 가능하다. 중국 기반 HBV B 유전자형 시험 집단을 사용하여 치료 효과를 제공할 백신을 확인하였다. 아시아 기반 참조 백신 세트와 전세계 백신 세트를 설계하였으며, 아시아 기반 유전자형을 업데이트하였다. HBV 게놈의 보존 영역은 C 단백질 (N 말단의 처음 29개 아미노산 제외), S 단백질 및 P 단백질에 존재한다. P 단백질의 N-말단의 고도로 가변적인 영역은 고려에서 제거되었다 (도 6 참조).
대상체가 어떤 바이러스를 접할 수 있는지 알 수 없는 예방 백신의 경우와 달리, 치료 백신의 경우 감염 바이러스 서열을 획득하여 매치할 수 있다.
면역원성 조성물 또는 백신에 사용하기 위한 항원의 선택은 두 가지 인자를 고려한다: 항원 에피토프는 가능한 한 대상체의 감염 바이러스의 많은 에피토프와 매치해야 하고 항원과 대상체의 감염 바이러스 사이의 에피토프 미스매치는 가능한 한 적게 함으로써, 가능한 한 백신 반응이 관련 에피토프에서 표적화되도록 한다.
HBV 주요 유전자형 내의 계통 발생은 구조가 거의 명확하지 않은 경향이 있다. 오히려 이는 염기 근처에 매우 긴 외부 분지와 매우 짧고 정확하게 규정되지 않은 내부 분지가 있는 "별모양체"이다. 이 구조의 일부는 하위 유형 내 재조합으로 인한 것일 수 있다. 정량화하기는 어렵지만 재조합은 확실히 상대적으로 자주 발생하고 있으며 하위 유형 간 재조합 양태에서 볼 수 있는 것과 유사하게 광범위할 가능성이 있다. 계통수의 구조를 감안할 때 계통수에 대한 군집 분류를 사용하여 가능한 백신의 참조 세트를 규정하는 것은 유전자형 내 연관이 에피토프 관점에서 의미가 제한적이기 때문에 효과적이지 않을 것이다. 대신, 관련 척도에 의해 서열 관계를 고려해야 하며, 참조 세트는 천연 균주와 추정되는 백신 설계 간의 가능한 에피토프 유사성을 기반으로 선택해야 한다.
EpiGraph 서열을 아미노산 9량체를 사용하여 확인하였지만 (도 4a 참조), 이 방법은 임의의 길이 k량체를 기준점으로 사용할 수 있으며, k는 추정 가능한 에피토프 길이이다. 과거 모자이크 작업에서 9량체에 대한 최적의 해결 방법은 다른 근사한 길이 (8, 10, 11, 12)에 대해 거의 최적이었고 이는 EpiGraph 방법에서도 마찬가지일 것으로 예상된다.
a) 하나의 에피센서스 서열; b) 2개의 에피센서스 서열; c) 3개의 에피센서스 서열; d) 하나의 천연 HBV 유전자형 서열; e) 2개의 천연 HBV 유전자형 서열을 포함하는 백신의 에피토프 범위가 도 4a 내지 도 7b에 비교되어 있다. 일반적으로 유전자형 기반 백신은 해당 유전자형에 대해 더욱 적절한 범위를 제공하지만 다른 유전자형에 대해서는 부적절한 범위를 제공한다. 도 5a 내지 도 5c의 데이터는 2가 및 3가 Global EpiGraph 서열이 모든 주요 유전자형의 범위를 실질적으로 개선하며 B 및 C 특이적 백신과 비교하여 B 및 C의 유사한 범위를 제공함을 나타낸다. 예를 들어, 도 5a 내지 도 5c에서 볼 수 있는 바와 같이, 유전자형 D 범위는 3개의 에피센서스 항원이 사용될 때 약 90%이며, 이와 달리, B 또는 C 특이적 백신 또는 심지어 B+C 특이적 백신의 범위는 약 50%이다.
실시예 2:
에피센서스 항원의 일시적 발현
EpiGraph 방법을 사용하여 에피토프 매치를 최대화하도록 설계된 항원은 천연 서열과 유사하지만 더 이상 천연 단백질을 인코딩하지 않는다. 이러한 인위적 아미노산 서열의 발현에 대한 이론적인 지침은 이러한 서열의 작제에서 준수되지만, 단백질은 예상치 못한 발현 프로파일을 나타내거나 안정적인 전장 단백질을 발현하지 못할 수 있다.
포유류 세포와 관련하여 이러한 서열의 발현 프로파일을 평가하기 위해, WO 2016/054654에 기재된 방법을 사용하여 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 합성하고 일시적 형질감염을 위해 클로닝하였으며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. 간단히 말해서, 플라스미드 벡터 (pcDNA3.1 및 pOri)에 대한 적합한 클로닝 부위를 포함시켜 작제물을 인코딩하는 DNA를 합성하였다 (Genscript, Piscataway, NJ). 모든 삽입물은 숙주에 최적화된 코돈이었다. 각 작제물을 또한 문헌[Kulkarni et al. Vaccine (2011)]에 기재된 바와 같은 천연 서열의 나머지 효소 활성이 제거되도록 변형시켰으며, 상기 문헌의 전문은 본 명세서에 참조로 포함된다. 빈 벡터의 재순환을 방지하기 위해 플라스미드 벡터를 적합한 엔도뉴클레아제로 선형화하고 송아지 장 포스파타제로 처리하였다. 벡터 및 삽입 단편을 아가로스 겔 전기영동으로 분해하여 분해 단편 크기를 확인하고 PCR 정제 키트 (Thermo Scientific)로 결찰을 위해 세척하였다. 신속한 결찰 키트 (Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 실온에서 15분 동안 약 3:1의 삽입물 대 벡터 비율로 삽입물을 선형화된 벡터에 연결하고, 화학적으로 적격인 E. 콜라이(coli) (DH5-알파)로 형질전환하고, 항생제 선택 플레이트에 플레이팅하였다. 생성된 콜로니로부터의 DNA를 삽입물에 대한 제한 분해에 의해 스크리닝하였다.
벡터 프로모터 및 폴리 (A) 서열에 대해 적절한 방향으로 정확한 삽입물 각각을 포함하는 클론을 플라스미드 DNA 정제를 위해 액체 배양물에서 성장시켰다. 12웰 조직 배양 플레이트에서 활발하게 성장하는 컨플루언스 이하 293T 또는 HELA 세포에 리포솜이 제조되는 동안 500 μl의 새로운 배지 (DMEM 10% FBS)를 공급하였다. 플라스미드 DNA를 포함하는 리포솜을 생성하기 위해 250 μl의 무혈청 배지를 500 ng의 플라스미드 DNA와 혼합하고 250 μl의 무혈청 배지와 2 ul의 지질을 혼합하였다 (Lipofectamine 2000, Invitrogen). 실온에서 5분 인큐베이션 후, 이들 용액을 조합하고, 혼합하고, 20분 동안 인큐베이션하였다. 이 과정에서 형성된 DNA 포함 리포솜 (500 μl)을 배양액에 적가하고 12 내지 16시간 동안 인큐베이션한 후 형질감염 혼합물을 새로운 배지로 교체한다. 인큐베이션의 추가 하루 후, 배지를 긁어 내고 원심분리하여 수확하였다. 상청액을 흡인으로 제거하고 세포 펠렛을 5% SDS 및 10% 2-머캅토에탄올을 포함하는 100 μl 겔 로딩 염료에 재현탁시키고 QiaShred 컬럼 (Qiagen, Valencia, CA)을 통한 원심분리에 의해 용해시켰다.
각 작제물에 조작된 V5 또는 헤마글루티닌 에피토프 태그에 대한 항체로 개발된 에피센서스 항원의 발현을 SDS 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-page) 및 웨스턴 블롯팅에 의해 확인하였다. 간단히 말해서, NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 겔을 제조하고 20 내지 50 ug 총 단백질을 로딩하고 110 내지 120 볼트에서 90분 동안 전기영동하였다. 분리된 단백질을 90분 동안 30 볼트에서 반건식 또는 습식 이동에 의해 PVDF 막으로 이동시켰다. 비특이적 결합을 0.1% 트윈 내지 20 (PBS-T)이 포함된 트리스 완충 식염수 중 10% 무지방 분유 용액으로 60분 동안 차단하였다. HA (Sigma) 또는 V5 (Invitrogen) 항체를 5% 우유 용액에 희석하고 1시간 동안 막과 함께 인큐베이션한 후 TBS-T로 3회 세척한 다음 양고추냉이 퍼옥시다제 접합 염소 항-마우스 (Invitrogen) 2차 항체의 1:10000 희석액을 1시간 동안 첨가하였다. 후속적으로 블롯을 TBS-T에서 3회 세척하고 효소 결합 화학 발광 (ECL 키트 (Thermo-Pierce))으로 전개시키고 디지털 겔 이미징 시스템으로 시각화하였다.
실시예 3:
CMV 벡터 BAC 작제물로 에피센서스 항원의 조작 및 재작제 바이러스로부터의 발현
에피센서스 항원을 이들이 생성되는 바이러스 서열 및 HBV의 유전자형의 스펙트럼을 나타내는 T-세포 에피토프의 적절한 범위를 제공하도록 설계하였다. 이러한 항원을 가장 효과적으로 활용하기 위해 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 경쟁 플랫폼의 CD8+ T 세포 스펙트럼의 3배를 생성하는 것으로 나타난 CMV 벡터로 조작하였다. CMV 벡터의 광범위한 항원 제시 및 평생 발현 특성은 SIV에 감염된 붉은털 원숭이를 보호하고 치료하는 능력을 입증하였다. CMV 벡터와 조합된 에피센서스 항원 설계 알고리즘은 광범위한 예방 백신에 적용될 때 유전자형 내 및 전체에 걸쳐 훨씬 더 큰 범위의 HBV를 제공할 수 있다.
일시적 형질감염 시스템에서 발현을 입증한 에피센서스 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 갈락토키나제 및 카나마이신 선택과 재조합하여 BAC를 사용하여 CMV 골격으로 전달하였다. (문헌[Warming et al. Nucleic Acids Research. 2005. 33(4):1-12; and Paredes and Yu Curr Protoc Microbiol. 2012. Feb; Chapter 14:Unit14E.4]; 상기 문헌 모두 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 또한, HBV 단백질 또는 단백질 도메인, 예컨대 중심 (C) 단백질, 표면 항원 (S) 단백질, PreS1 도메인, PreS2 도메인 및 중합효소 (P) 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열을 개선된 발현을 위해 도 11a 및 도 11b에 나타낸 바와 같이 야생형 HBV에서 발생하는 순서에 대비하여 재정렬할 수 있다.
BAC 재조합은 모 BAC를 포함하는 E. 콜라이 균주 SW105에서 온도 및 대사산물 조절된 재조합 효소를 사용하여 대형 DNA 서열의 조작을 용이하게 한다. 재조합은 단계 1: 항생물질 내성 유전자 카나마이신 (kan)과 갈락토키나제 (galK) 서열을 표적 영역에 삽입하는 단계, 그 후, 2단계: galK/kan 카세트를 대상 항원으로 교체하는 단계로 이루어진 순차적인 2단계 공정이다. 단계 1에서는 kan에서 양성 선택 후 galK/kan 삽입물을 포함하는 재조합체를 생성하고 2단계에서는 2-데옥시-갈락토스 (DOG)에서 음성 선택 후 대상 항원을 포함하는 재조합체를 생성한다. 두 단계 모두에서 삽입할 서열을 galK/kan 카세트 또는 삽입 부위에 인접하는 HCMV 서열에 대해 긴 (50+ bp) 상동성 아암을 갖는 프라이머를 사용하여 대상 항원을 포함하는 주형 DNA로부터 표준 PCR에 의해 증폭한다.
galK/kan 카세트 삽입을 위한 박테리아 세포를 준비하기 위해 (단계 1), 5 mL 배양물을 12.5 ug/mL 클로람페니콜이 포함된 2 x YT 또는 Terrific Broth에서 30℃에서 밤새 성장시키고 다음날 아침 1:50으로 희석하였다. 박테리아를 30℃에서 추가로 약 2 내지 4시간 동안 성장 (OD600 = 0.5 내지 0.6까지)시킨 다음, 재조합 효소를 유도하기 위해 42℃에서 15분 동안 진탕하여 열 충격을 가하였다. 이 유도 후, 박테리아를 펠렛팅(pelleting) (3000 rpm, 10분, 4℃)한 다음 얼음 물로 3회 세척하였다. E. 콜라이 세포는 PCR 산물을 수용할 수 있는 전기 감응성이 되고 BAC의 표적 영역으로의 서열의 삽입에 대해 재조합 감응성이 되었다. 정제된 삽입물 (300 ng)을 얼음 위에서 40 μl의 감응성 E. 콜라이와 조합하고 1 mm 큐벳으로 옮기고 Bio-rad Gene Pulser Xcell을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 후, 박테리아를 5 mL 배양 배지를 첨가하여 희석하고 2시간 동안 30℃에서 진탕하여 회수하고 클로람페니콜/카나마이신 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이트를 30℃에서 2일 동안 인큐베이션하고 콜로니를 제한 분해 및 재조합 사건을 위한 PCR에 의해 스크리닝하였다.
galK/kan 삽입물에 대해 양성인 BAC 작제물을 galK/kan 카세트가 대상 항원을 포함하는 PCR 단편과의 재조합에 의해 교체되는 제2 단계로 진행하였다. 단계 2에서 galK/kan 카세트의 교체를 위한 박테리아 세포를 준비하기 위해, 박테리아를 상기한 바와 같이 성장시키고 전기천공하였다. 전기천공 회수를 위해 5 mL 배양 배지를 첨가하여 박테리아를 희석하고 30℃에서 적어도 4 내지 4.5시간 동안 진탕하여 회수시켰다. 그런 다음 세포를 펠렛팅하고 (3000 rpm, 10분, 4℃), 1x M9 배지로 3회 세척한 후, 글리세롤, 류신, 비오틴, DOG 및 클로람페니콜이 첨가된 M63 최소 배지 플레이트에 플레이팅하였다. 이어서, 콜로니를 PCR에 의해 스크리닝하여 대상 항원의 galK/kan 카세트의 교체를 확인하였다. 양성 클론을 DOG 플레이트에 다시 스트리킹 (streaking)하고 BAC DNA를 제한 분해 및 시퀀싱에 의한 추가 특성화를 위해 단리한다.
바이러스 재작제: 바이러스를 재생하기 위해, BAC DNA를 바이러스 성장을 가능하게 하는 포유류 숙주 세포로 옮겼다. 간단히 말해서, BAC DNA를 엔도톡신 무함유 플라스미드 DNA 키트 (Macherey-Nagel)를 사용하여 정제하고 37℃, 5% CO2에서 DMEM과 1x 글루타맥스 및 9% FBS에서 성장한 1차 인간 섬유아세포의 컨플루언스 플라스크에 형질감염 (16 내지 24 ug BAC DNA/T150)하였다. 제조업체의 프로토콜 (ThermoFisher)에 따라 Lipofectamine 3000을 사용하여 형질감염을 수행하였다. 다음 날, 배지를 교체하고 세포를 매일 플라크 형성에 대해 모니터링하였다. 완전한 세포변성 효과 (CPE)에 도달하면 바이러스 상청액을 수확하고 실온에서 5분 동안 2500 x g에서 원심분리를 통해 정제하고 -80℃에서 저장하였다. 나머지 부착된 세포는 DPBS에서 세포 스크레이퍼로 수확하고 원심분리 (2,500 rpm, 5분)에 의해 펠렛팅하고 -80℃에서 저장하였다.
바이러스 에피센서스 항원 발현: 에피센서스 항원의 발현을 SDS 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-page)에 이어 각 작제물에 조작된 V5 또는 헤마글루티닌 (HA) 에피토프 태그에 대해 유도된 항체 또는 HBV 특이적 항체로 전개된 면역블롯에 의해 테스트하였다. 간단히 말해서, 세포 펠렛을 방사성면역침전 분석 (RIPA) 완충액에 재현탁에 의해 용해시키고 단백질을 표준 비신코닌산 분석 (BCA)을 사용하여 정량화한다. NuPAGE 4 내지 12% Bis-Tris 겔을 준비하고 총 단백질 20 내지 50 ug를 로딩하고 110 내지 130볼트에서 90분 동안 전기영동하였다. 분해된 단백질을 90분 동안 30볼트 또는 15V에서 하룻밤 반건식 또는 습식 이동에 의해 PVDF 막으로 이동시켰다. 비특이적 결합을 0.1% tween 내지 20 (PBS-T)이 포함된 트리스 완충 식염수 중 5% 무지방 분유 용액으로 60분 동안 차단하였다. 1차 항체를 5% 우유 용액에 희석하고 1시간 동안 막과 함께 인큐베이션한 후 TBS-T로 3회 세척한 다음 1시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제 접합 염소 항-마우스 2차 항체의 1:10,000 희석액을 첨가하였다. 이어서, 블롯을 TBS-T에서 3회 세척하고 효소 결합 화학 발광 (ECL 키트 (Thermo-Pierce))으로 전개시키고 디지털 겔 이미징 시스템으로 시각화하였다.
실시예 4:
집단 에피센서스 백신
초기에 CMV 벡터를 사용하여 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신 세트를 생성하기 위해 EpiGraph 방법을 사용하였지만, 다른 백신 전달 시스템을 이용할 수 있다.
가장 포괄적인 백신 치료를 결정하기 위해 상이한 에피센서스 항원 및 항원 조합의 총 58가지 전략을 테스트하였다. dbHBV의 HBV 샘플을 중국 샘플, 중국 외의 샘플 및 전세계 샘플의 세 그룹으로 나누었다. 전세계 샘플은 중국 샘플과 중국 외의 샘플의 조합으로 구성된다. 천연 D 및 천연 C 하위유형에 대한 백신을 대조군으로 사용하였다. 1개, 2개 또는 3개의 에피센서스 항원이 있는 백신을 각 그룹에 대해 테스트하였다.
대조군에는 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), GenBank 수탁번호 Y07587 및 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), GenBank 수탁번호 GQ358158을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신이 포함되었다. D 및 C 하위유형 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신을 (a) 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 1_CH_epi (서열번호 1) (b) 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 1_GL_epi (서열번호 2); (c) 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 2개의 에피센서스 항원 (서열번호 3 및 서열번호 4)을 포함하는 2_CH_epi, (d) 2_CHGL_epi, 2개의 에피센서스 항원 - 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원인 Epi1 (서열번호 5) 및 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발되고 Epi1이 이미 용액 중에 고정된 제2 에피센서스 항원 Epi2 (서열번호 6)를 포함하는 2_CHGL_epi; (e) 더 우수한 발현을 유도하도록 변형된 Epi1 및 Epi2의 변이체인 Epi7 및 Epi8 (각각 서열번호 7 및 서열번호 8); 및 (f) 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 3개의 에피센서스 항원 (서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11)을 포함하는 3_GL_epi를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신과 비교하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 중국으로부터의 샘플을 사용하여 개발된 제1 서열 및 전세계 세트를 사용하여 개발된 제2 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 2개의 에피센서스 항원 백신은 중국 서열의 약 88%, 중국 외의 서열의 약 77% 및 전세계 서열의 약 80%의 범위를 제공한다.
실시예 5:
에피토프 범위
특정 에피센서스 항원 서열을 포함하는 백신에 대한 HBV 에피토프 범위를 컴퓨터로 분석하였다. CMV에서 초기 테스트를 위한 백신 아암은 1) 중국 유전자형 전염병의 중심인 단일 집단 에피센서스 항원 2) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 단일 집단 에피센서스 항원; 3) 중국의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 2개의 집단 에피센서스 항원; 4) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 2개의 집단 에피센서스 항원; 5) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 3개의 집단 에피센서스 항원; 및 6) 2개의 집단 에피센서스 항원: 중국의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 제1 집단 에피센서스 항원 및 전세계 세트의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 제2 집단 에피센서스 항원을 포함하였다.
대조군에는 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), GenBank 수탁번호 Y07587; 및 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), GenBank 수탁번호 GQ358158을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신이 포함되었다. 그런 다음 본 발명자들은 D 및 C 하위유형 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신을 (a) 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 1_CH_epi (서열번호 1); (b) 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 1_GL_epi (서열번호 2); (c) 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 2개의 에피센서스 항원 (서열번호 3 및 서열번호 4)을 포함하는 2_CH_epi, (d) 2개의 에피센서스 항원 - 중국의 1044개 HBV 서열을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원인 Epi1 (서열번호 5) 및 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발되었으며 Epi1이 이미 용액에 고정된 제2 에피센서스 항원 Epi2 (서열번호 6)를 포함하는 2_CHGL_epi; (e) 더 우수한 발현을 유도하도록 변형된 Epi1 및 Epi2의 변이체인 Epi7 및 Epi8 (각각 서열번호 7 및 서열번호 8); 및 (f) 3041개 HBV 서열의 전세계 세트를 사용하여 개발된 3개의 에피센서스 항원 (서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11)을 포함하는 3_GL_epi을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신과 비교하였다.
도 9a 내지 도 10b에서 볼 수 있는 바와 같이, 2_CHGL_epi를 포함하는 백신은 중국의 서열에 대해 80% 이상의 정확한 범위, 중국 외의 서열에 대한 75% 이상의 정확한 범위, 및 80%의 정확한 전세계 범위를 제공한다. 이러한 데이터는 대조군 백신과 비교하여 모든 HBV 서열의 우수한 범위를 나타낸다.
실시예 6:
2세대 HBV 에피센서스 항원
대부분의 HBV 유전자형의 경우, 중심 (C)의 HBV N-말단 조립 도메인 (NTD)은 중심 입자 조립에 관여하고 C-말단 도메인은 프리게놈/역전사효소 복합체의 패키징에 관여한다. 표면 (S) 단백질은 단일 오픈 리딩 프레임의 산물이며 PreS1, PreS2 및 S의 세 가지 도메인으로 구분된다. 중합효소 (P) 단백질은 DNA 의존성 DNA 중합효소와 RNA 의존성 DNA 중합효소 (역전사효소) 활성을 모두 나타낸다. P 단백질은 캡슐화된 프리게놈 RNA 주형으로부터 HBV 게놈을 복제한다. P 단백질은 4개의 도메인으로 구성된다: (1) 보존된 티로신을 통해 단백질 프라이밍 기전에 관여하는 말단 단백질 (TP) 도메인; (2) 비보존 스페이서 도메인; (3) 역전사효소 도메인 (RNA-의존성 DNA 중합효소 (RT) 및 DNA-의존성 DNA 중합효소 (활성 부위: YMDD 보존 모티프)); 및 (4) RNase H 도메인 (리보뉴클레아제 H 활성).
에피센서스 항원을 생성되는 바이러스 서열의 스펙트럼을 나타내는 T 세포 에피토프의 적절한 범위를 제공하도록 설계하였다. HBV 유전자형 D에 의한 감염은 미국과 유럽에서 가장 널리 퍼진 HBV 감염 중 하나이다. 유전자형 D 에피센서스 (EpiD) 항원 또는 EpiD 항원을 인코딩하는 뉴클레오타이드를 포함하는 치료 백신은 특정 유전자형에 대해 사전 스크리닝된 환자에게 유익할 수 있다. 미국 및 유럽에서 HBV 유전자형에 대한 적절한 범위를 제공하는 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원 (서열번호 14)의 예가 본 명세서에서 제공된다. 하나의 변이체에서, 도 11a 및 도 11b에 도시된 바와 같이, 중심 (C) 단백질, PreS1 및 PreS2 도메인, 표면 항원 (S) 단백질, 및 중합효소 (P) 단백질로부터 유래된 HBV 유전자형 D 에피센서스 항원을 초기에 HBV 게놈: C-S-P ("CSP") (서열번호 14)에 나타나는 순서대로 사용하였으며 S-P-C ("SPC") (서열번호 15)로 재정렬하였다. S 단백질의 막관통 도메인 1 내지 2 또는 1 내지 4가 결실된 HBV 단백질 서열 ("CSP ΔTM1-2," "CSP ΔTM1-4," "SPC ΔTM1-2" 또는 "SPC ΔTM1-4")를 사용하여 응집을 감소시키고 발현을 개선하기 위해 추가 항원 변이체를 생성하였다. 따라서, HBV 에피센서스 항원은 또한 상기 언급된 변이체 중 하나 이상을 포함하는 HBV 단백질 서열로부터 유래될 수 있다.
또한, 중합효소 도메인의 활성 부위에 돌연변이 및/또는 결실된 P 단백질 변이체로부터 유래된 에피센서스 항원을 생성하여 가능한 독성을 감소시키고 안전성을 개선시켰다. 이러한 에피센서스 항원의 예는 예를 들어 서열번호 7, 8 및 15에 제공된다. 이러한 에피센서스 항원을 개발하는데 사용되는 서열에 존재하는 돌연변이는 하기 표 1에 제공된다. 상이한 돌연변이 또는 결실을 갖는 다른 P 단백질 변이체를 또한 사용할 수 있다.
위치 | 아미노산 (들) | 변형 |
538 내지 541 | YMDD | 결실 |
689 | D | A로 교체 |
718 | E | A로 교체 |
737 | D | V로 교체 |
777 | D | A로 교체 |
표의 왼쪽 열에 있는 위치는 HBV 유전자형 D의 전장 중합효소의 아미노산 번호를 나타낸다. YMDD 서열은 역전사효소 활성 부위이다. (문헌[Radziwill, et al., J Virol. 1990 Feb;64 (2):613-20] 참조, 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함됨). 다른 4개 아미노산 (D, E, D, D)은 RNAse H 활성 부위이다. (문헌[Tavis et al., PLoS Pathog. 2013 Jan;9 (1):e1003125] 참조; 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에서 참조로 포함됨)
이들 변이체 서열로부터 유래된 에피센서스 항원의 발현을 상기 기재된 바와 같이 SDS-page 및 웨스턴 블롯팅에 의해 테스트하였다 (도 11a 내지 도 11d). 막관통 (TM) 도메인을 제거해도 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 11d).
임의의 EpiD 항원 변이체에서도 유의한 응집이 관찰되지 않았다. 항원 융합의 단백질 순서는 효율적인 발현과 관련이 있었다. SPC 재정렬된 항원 융합 단백질은 현저하게 증가된 발현을 나타낸다.
HBV 에피센서스 항원은 하기 HBV 단백질 또는 단백질 도메인 중 하나 이상으로부터 유래될 수 있다: 중심 (C) 단백질, 표면 (S) 단백질, PreS1 단백질, PreS2 단백질, S 단백질의 막관통 도메인 1 내지 4 (TM1-4), 결정인자 및 중합효소 (P) 단백질. 에피센서스 항원은 다양한 HBV 단백질 및 결실 또는 돌연변이를 갖는 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있고/거나, 에피센서스 항원은 개선된 발현 또는 활성을 위해 HBV에서 그 순서에 대해 재정렬될 수 있다. 예시 목적으로, HBV 하위유형 D의 중심 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 16에 제공되고, HBV 하위유형 D의 PreS1 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 17에 제공되고, HBV 하위유형 D의 PreS2 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 18에 제공되고, HBV 하위유형 D의 표면 단백질 (S)로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 19에 제공되고, HBV 하위유형 D의 중합효소 (P) 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 20 또는 22에 제공되고, 표 1에 제시된 돌연변이 및 결실을 포함하는 HBV 하위유형 D의 중합효소 (P) 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열은 서열번호 23에 제공된다. 항원 서열이 "SPC" 순서인 HBV 하위유형 C 표면 단백질 (S), 중합효소 단백질 (P) 및 중심 단백질 (C)로부터 유래된 에피센서스 서열의 예는 서열번호 24에 제공된다. 표 1에 나타낸 것보다 더 큰 결실 영역을 갖는 P 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열의 예는 서열번호 25에 제공된 것으로서, HBV 하위유형 C 표면 단백질 (S), 아미노산 612 내지 838이 결실된 중합효소 단백질 (P), 및 서열번호 25에 제공된 중심 단백질 (C)로부터 유래된 에피센서스 서열; 및 서열번호 26에 제공된 것으로서, HBV 하위유형 D 표면 단백질 (S), 아미노산 601 내지 827이 결실된 중합효소 단백질 (P), 및 중심 단백질 (C)로부터 유래된 에피센서스 서열을 포함한다. 서열번호 25 및 26 모두 재정렬되어 "SPC" 순서로 항원 서열을 제공한다.
결실된 영역을 갖는 P 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열의 추가 예는 도 12a에 나타나 있으며, P 단백질 아미노산 1 내지 200, 201 내지 400, 또는 401 내지 600의 결실을 포함한다. 도 12a의 작제물에 대한 발현 데이터는 도 12b에 제시되어 있다.
HBV의 중심 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열의 추가 예는 서열번호 27, 28, 및 34에 제공되어 있다. HBV의 표면 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열의 추가적 예는 서열번호 29에서 제공된다. HBV의 중합효소 단백질로부터 유래된 에피센서스 서열의 추가 예는 서열번호 30 내지 32 및 서열번호 35 내지 36에 제공된다.
HBV 단백질 및 단백질 도메인의 서열은 본 명세서에 개시된 서열과의 서열 정렬에 의해 임의의 HBV 하위유형에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, HBV의 천연 D 하위유형의 완전한 게놈 서열은 GenBank 수탁번호 Y07587로 제공된다 (본 명세서에 그 전체가 참조로 포함됨). P 단백질은 GenBank 참조 유전자 Y07587의 1 내지 1625 및 2309 내지 3182의 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. PreS 단백질은 GenBank 참조 유전자 Y07587의 1 내지 837 및 2850 내지 3182의 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. S 도메인은 GenBank 참조 유전자 Y07587의 뉴클레오타이드 157 내지 837에 의해 인코딩된다. PreC/C 단백질은 GenBank 참조 유전자 Y07587의 뉴클레오타이드 1816 내지 2454에 의해 인코딩된다. C 단백질은 GenBank 참조 유전자 Y07587의 1903 내지 2451 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. 또한, HBV의 천연 C 하위유형의 완전한 게놈 서열은 GenBank 수탁번호 GQ358158 (본 명세서에 그 전체가 참조로 포함됨)에 제공된다. P 단백질은 GenBank 참조 유전자 GQ358158의 1 내지 1623 및 2307 내지 3215의 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. S 단백질은 GenBank 참조 유전자 GQ358158의 1 내지 835 및 2848 내지 3215 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. PreC/C 단백질은 GenBank 참조 유전자 GQ358158의 1814 내지 2452 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다. C 단백질은 GenBank 참조 유전자 GQ358158의 1901 내지 2452 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된다.
실시예 7:
백신 테스트
컴퓨터로 설계된 에피센서스 항원을 포함하는 백신을 붉은털 원숭이 (RM)에서 테스트한다. CMV 기반 T 세포 반응은 훨씬 더 광범위할 것으로 예상되며 따라서 이전에 다른 벡터에 대해 보고된 것보다 훨씬 더 높은 백분율의 서열을 포함한다. 따라서 상대적으로 적은 수의 동물에 의한 경우에도 반응의 교차 반응성 가능성에 대한 서열 변이의 영향을 평가하기에 충분한 에피토프 반응이 있어야 한다. 백신에 대한 모든 반응의 수와 크기를 백신 매치 펩타이드 세트를 사용하여 결정한다. 표적 펩타이드가 결정되면 각 동물에서 양성인 펩타이드만을 사용하여 각 백신 반응성 펩타이드에 대한 천연 변이의 영향을 결정한다. 테스트되는 천연 변이체는 참조 패널에 존재하는 변이를 기반으로 한다. 비모수 및 전산 재샘플링 통계 방법은 크기 감소 또는 인식 제거에 대한 에피토프 변이의 영향을 평가하기 위한 기본 도구로 사용된다. 그러나 이 분석을 T 세포 반응 교차 반응성에 대한 보다 복잡한 상호작용의 영향을 조사하기 위해 필요에 따라 일반화된 선형 모델을 사용하여 보완한다.
CMV에서 초기 테스트를 위한 백신 아암은 1) 중국 유전자형 전염병의 중심인 단일 집단 에피센서스 항원; 2) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 단일 집단 에피센서스 항원; 3) 중국의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 2개의 집단 에피센서스 항원; 4) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 2개의 집단 에피센서스 항원; 5) 모든 HBV 전세계 샘플에 범위를 제공하는 3개의 집단 에피센서스 항원; 및 6) 2개의 집단 에피센서스 항원: 중국의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 제1 집단 에피센서스 항원 및 전세계 세트의 HBV 샘플에 대한 범위를 제공하는 제2 집단 에피센서스 항원, 7) HBV C 하위유형 에피토프에 대한 범위를 제공하는 절단된 Pol 서열을 사용하여 생성된 에피센서스 항원 (서열번호 25), 8) HBV D 하위유형 에피토프에 대한 범위를 제공하는 절단된 Pol 서열을 사용하여 생성된 에피센서스 항원 (서열번호 26)을 인코딩하는 벡터를 포함한다. 대조군에는 천연 D 하위유형 서열 (서열번호 12), GenBank 수탁번호 Y07587; 및 천연 C 하위유형 참조 서열 (서열번호 13), GenBank 수탁번호 GQ358158을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신이 포함되었다.
5마리의 붉은털원숭이 원숭이 (RM)의 최대 10개 코호트에 다음과 같이 106개의 PFU의 HCMV 벡터를 접종한다: 각각 최대 8개의 코호트에 위에 열거된 백신 1 내지 8 중 하나를 제공하고; 단일 코호트에 천연 D 하위유형을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신을 제공하고; 단일 코호트에 천연 C 하위유형을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 백신을 제공한다. 코호트 3에 에피센서스와 다른 조정된 백신 벡터를 제공하고 코호트 4에 에피센서스와 두 가지 조정된 백신 벡터를 제공한다.
붉은털원숭이 (RM)를 0일 및 12주에 피하 접종하고 1년 동안 일관되게 추적한다. HCMV 벡터에 의한 백신 접종은 기존의 항-RhCMV 면역의 영향을 받지 않으므로 RhCMV에 자연 감염된 동물을 이 실험에 사용한다. 유세포 분석 세포내 사이토카인 분석 (ICS)을 사용하여 각 동물에 투여된 백신 삽입물 내의 백신 서열을 포함하는 개별 연속 15량체 펩타이드에 대한 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 결정한다 (이는 전체 백신 유발 반응을 포함할 것임). 그런 다음 이러한 에피토프 특이적 T 세포가 표적 균주와 비표적 균주 모두에서 에피토프 변이체를 인식하는지를 결정한다. 균주 특이적 에피토프에 대한 반응을 나타내는 펩타이드의 경우 "모체" (백신 삽입 서열) 펩타이드 변이체에 대한 이러한 반응의 크기, 기능적 결합력, 기능적 특성 (IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 MIP-1β 생성 및 CD107 외부화)를 비교하여 기능적 교차 반응성의 정도를 결정한다. 선택된 경우, 절단 분석을 사용하여 유사한 비교 분석을 위한 중심 에피토프를 확인한다. 존재하는 MHC-II 제한된 CD8+ T 세포의 백분율을 결정하기 위해 MHC-I 및 MHC-II에 특이적인 mAb를 "차단"하고 불변 사슬에서 유래된 MHC-II 특이적 결합 펩타이드 CLIP를 사용하여 PBMC에서 인플루엔자 특이적 CD8+ T 세포 반응을 억제한다.
특정 실시양태가 예시되고 기재되었지만, 상기에 기재된 다양한 실시양태는 추가의 실시양태를 제공하기 위해 조합될 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
2019년 8월 29일에 출원된 미국 특허 출원 제 62/893,546호 및 2019년 11월 27일에 출원된 미국 가출원 제 62/941,125호를 포함하여 출원 데이터 시트에 나열되고/거나, 명세서에 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 공보물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원, 및 비특허 간행물은 달리 명시적으로 언급되지 않는 한 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다. 실시양태의 양태는 추가 실시양태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보물의 개념을 사용하기 위해 필요한 경우 변형될 수 있다.
이들 및 다른 변경은 상기 상세한 설명에 비추어 실시양태에 대해 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 용어는 청구범위를 명세서 및 청구범위에 개시된 특정 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 되며, 이러한 청구범위에 인정되는 균등물의 전체 범위와 함께 가능한 모든 실시양태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING
<110> Vir Biotechnology, Inc.
Triad National Security, LLC
Bruening, Eric
Douglas, Janet
Marshall, Emily
Yusim, Karina
Korber, Bette
Theiler, James
<120> HEPATITIS B VIRUS VACCINES
<130> 930185.414WO
<140> PCT
<141> 2020-08-28
<150> US 62/941,125
<151> 2019-11-27
<150> US 62/893,546
<151> 2019-08-29
<160> 36
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1057
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence 1_CH_epi
<400> 1
Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser
35 40 45
Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu
50 55 60
Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser
65 70 75 80
Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Ile
85 90 95
Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu
100 105 110
Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro
115 120 125
Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu
130 135 140
Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro
145 150 155 160
Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln
165 170 175
Ser Arg Glu Ser Gln Cys Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln
180 185 190
Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro
195 200 205
Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp
210 215 220
Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val
225 230 235 240
Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu
245 250 255
Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr
275 280 285
Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp
290 295 300
Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val
325 330 335
Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp
340 345 350
Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
355 360 365
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
370 375 380
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
385 390 395 400
Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
405 410 415
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
420 425 430
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
435 440 445
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
450 455 460
Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
465 470 475 480
Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
485 490 495
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
500 505 510
Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
515 520 525
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
530 535 540
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
565 570 575
Cys Leu Trp Val Tyr Ile Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
580 585 590
Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln
595 600 605
Phe Ser Arg Gly Ser Thr His Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro
610 615 620
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu
625 630 635 640
Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala
645 650 655
Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Arg Tyr Val
660 665 670
Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Arg Asn Ile Asn Tyr Gln His Gly Thr
675 680 685
Met Gln Asp Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
690 695 700
Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His
705 710 715 720
Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser
725 730 735
Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg
740 745 750
Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val
755 760 765
Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ser Ile
770 775 780
Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr
785 790 795 800
Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser
805 810 815
Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Leu Lys Ile Lys Gln Cys
820 825 830
Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln
835 840 845
Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly
850 855 860
Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala
865 870 875 880
Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu
885 890 895
Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe
900 905 910
Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Arg Arg
915 920 925
Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu
930 935 940
Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly
945 950 955 960
Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp
965 970 975
Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val
980 985 990
Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg
995 1000 1005
Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Leu Leu His Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr
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Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val
1315 1320 1325
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
1330 1335 1340
Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr
1345 1350 1355 1360
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
1365 1370 1375
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg
1380 1385 1390
Glu Ser Gln Cys
1395
<210> 16
<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence EpiD core(C)protein
<400> 16
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Lys Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence EpiD PreS1 domain
<400> 17
Met Gly Gln Asn Leu Ser Thr Ser Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp
1 5 10 15
His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro Asp Trp
20 25 30
Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr Trp Pro Asp Ala Asn Lys Val Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Phe Gly Leu Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu
50 55 60
Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Gln Thr Leu Pro Ala Asn
65 70 75 80
Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro
85 90 95
Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala
100 105
<210> 18
<211> 55
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence EpiD PreS2 domain
<400> 18
Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg
1 5 10 15
Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val
20 25 30
Asn Pro Val Pro Thr Thr Val Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg
35 40 45
Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn
50 55
<210> 19
<211> 226
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence EpiD Surface Antigen (S)
<400> 19
Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys
35 40 45
Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val
85 90 95
Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly
100 105 110
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp
130 135 140
Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys
145 150 155 160
Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu
180 185 190
Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile
195 200 205
Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val
210 215 220
Tyr Ile
225
<210> 20
<211> 832
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence EpiD polymerase (P)
<400> 20
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Arg Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1 5 10 15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
20 25 30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
35 40 45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro His Trp Lys Thr Pro Ser Phe Pro
65 70 75 80
Asn Ile His Leu His Gln Asp Ile Ile Lys Lys Cys Glu Gln Phe Val
85 90 95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Gln Leu Ile Met Pro
100 105 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Val Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
115 120 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Leu Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
130 135 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145 150 155 160
Glu Thr Thr His Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
165 170 175
Gln Glu Leu Gln His Gly Ala Glu Ser Phe His Gln Gln Ser Ser Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Arg Pro Pro Val Gly Ser Ser Leu Gln Ser Lys His Arg
195 200 205
Lys Ser Arg Leu Gly Leu Gln Ser Gln Gln Gly His Leu Ala Arg Arg
210 215 220
Gln Gln Gly Arg Ser Trp Ser Ile Arg Ala Gly Ile His Pro Thr Ala
225 230 235 240
Arg Arg Pro Phe Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Thr Thr Asn
245 250 255
Leu Ala Ser Lys Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gln Ser Pro Val Arg Lys
260 265 270
Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly
275 280 285
His Ala Val Glu Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln
290 295 300
Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser
305 310 315 320
Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu
325 330 335
Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro
340 345 350
Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn
355 360 365
Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe
370 375 380
Ser Arg Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn
385 390 395 400
Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser
405 410 415
Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala
420 425 430
Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala
435 440 445
Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met
450 455 460
Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro
485 490 495
Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro
500 505 510
Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg
515 520 525
Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu
530 535 540
Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr
545 550 555 560
Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys
565 570 575
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr
580 585 590
Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe
595 600 605
Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg
610 615 620
Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr
625 630 635 640
Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe
645 650 655
Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn
660 665 670
Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala
675 680 685
Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gln Arg Met
690 695 700
Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu
705 710 715 720
Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Leu Gly Thr
725 730 735
Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu
740 745 750
Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr
755 760 765
Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu
770 775 780
Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly
785 790 795 800
Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro
805 810 815
Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
820 825 830
<210> 21
<211> 183
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence Conserved region of EpiD
core(C); shortened
<400> 21
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
50 55 60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile
65 70 75 80
Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
85 90 95
Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110
Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
115 120 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
130 135 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr
145 150 155 160
Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser
165 170 175
Lys Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180
<210> 22
<211> 475
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence Conserved region of EpiD
polymerase (P)
<400> 22
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala
1 5 10 15
Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Tyr
20 25 30
Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr
35 40 45
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
50 55 60
Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
65 70 75 80
Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp
100 105 110
Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr
115 120 125
Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe
130 135 140
Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln
145 150 155 160
Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys
165 170 175
Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val
180 185 190
Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser
210 215 220
Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln
225 230 235 240
Asp His Ile Ile Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val
245 250 255
Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu
260 265 270
Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro
275 280 285
Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr
290 295 300
Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala
305 310 315 320
Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr
325 330 335
Gly Trp Gly Leu Val Met Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Leu
340 345 350
Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala
355 360 365
Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Leu Gly Thr Asp Asn Ser Val Val
370 375 380
Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala
385 390 395 400
Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu
405 410 415
Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Ser Arg Pro
420 425 430
Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr
435 440 445
Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe
450 455 460
Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro
465 470 475
<210> 23
<211> 471
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence Conserved region of EpiD mutant
polymerase(P)with mutations from Table 1
<400> 23
Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala
1 5 10 15
Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn Tyr
20 25 30
Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr
35 40 45
Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala
50 55 60
Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu
65 70 75 80
Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn
85 90 95
Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp
100 105 110
Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr
115 120 125
Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe
130 135 140
Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln
145 150 155 160
Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys
165 170 175
Leu Ala Phe Ser Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu
180 185 190
Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His
195 200 205
Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu His Phe Met
210 215 220
Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile
225 230 235 240
Gln Lys Ile Lys Glu Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile
245 250 255
Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala
260 265 270
Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys
275 280 285
Ile Gln Ser Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe
290 295 300
Leu Cys Lys Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro
305 310 315 320
Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Ala Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu
325 330 335
Val Met Gly His Gln Arg Met Arg Gly Thr Phe Leu Ala Pro Leu Pro
340 345 350
Ile His Thr Ala Ala Leu Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser
355 360 365
Gly Ala Asn Ile Leu Gly Thr Val Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys
370 375 380
Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu
385 390 395 400
Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Ala
405 410 415
Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly Leu Ser Arg Pro Leu Leu Arg Leu
420 425 430
Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro
435 440 445
Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu
450 455 460
His Val Ala Trp Arg Pro Pro
465 470
<210> 24
<211> 1410
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence HBV EpiC SPC FL
<400> 24
Met Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln
115 120 125
Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
130 135 140
Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile
145 150 155 160
Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Glu Asn Thr
165 170 175
Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe
180 185 190
Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp
195 200 205
Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn
210 215 220
Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile
225 230 235 240
Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
245 250 255
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr
260 265 270
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr
275 280 285
Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser
290 295 300
Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu
325 330 335
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
340 345 350
Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp
355 360 365
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe
370 375 380
Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Pro Leu
385 390 395 400
Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp Glu Ala Gly
405 410 415
Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly Leu Asn Arg
420 425 430
Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val Ser Ile Pro
435 440 445
Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser Ser Thr Val
450 455 460
Pro Val Phe Asn Pro Glu Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro His Ile His
465 470 475 480
Leu Gln Glu Asp Ile Ile Asn Arg Cys Gln Gln Tyr Val Gly Pro Leu
485 490 495
Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro Ala Arg Phe
500 505 510
Tyr Pro Asn Leu Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly Ile Lys Pro
515 520 525
Tyr Tyr Pro Glu His Ala Val Asn His Tyr Phe Lys Thr Arg His Tyr
530 535 540
Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg Glu Thr Thr
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu Gln Glu Leu
565 570 575
Gln His Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His Gly Asp Glu
580 585 590
Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser Pro Val Gly
595 600 605
Pro Cys Val Arg Ser Gln Leu Lys Gln Ser Arg Leu Gly Leu Gln Pro
610 615 620
Gln Gln Gly Ser Leu Ala Arg Gly Lys Ser Gly Arg Ser Gly Ser Ile
625 630 635 640
Arg Ala Arg Val His Pro Thr Thr Arg Arg Ser Phe Gly Val Glu Pro
645 650 655
Ser Gly Ser Gly His Ile Asp Asn Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Cys
660 665 670
Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Thr Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr
675 680 685
Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Ile
690 695 700
Pro Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Ile Phe Ser Cys
705 710 715 720
Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu
725 730 735
Thr His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His
740 745 750
Gly Glu His Asn Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly
755 760 765
Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg
770 775 780
Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser Thr His Val Ser
785 790 795 800
Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu
805 810 815
Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr
820 825 830
His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser
835 840 845
Ser Gly Leu Pro Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Thr Ser Arg Asn
850 855 860
Ile Asn Tyr Gln His Gly Thr Met Gln Asp Leu His Asp Ser Cys Ser
865 870 875 880
Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg
885 890 895
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile
900 905 910
Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser
915 920 925
Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe
930 935 940
Ser Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe
945 950 955 960
Thr Ser Ile Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro
965 970 975
Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val
980 985 990
Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Leu Lys Ile
995 1000 1005
Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys
1010 1015 1020
Val Cys Gln Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr
1025 1030 1035 1040
Gln Cys Gly Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser
1045 1050 1055
Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys
1060 1065 1070
Gln Tyr Leu Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys
1075 1080 1085
Gln Val Phe Ala Ala Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly
1090 1095 1100
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<223> Synthetic sequence 1epi_P2
<400> 35
Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
1 5 10 15
Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln
20 25 30
Phe Ser Arg Gly Asn Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro
35 40 45
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu
50 55 60
Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala
65 70 75 80
Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr
100 105 110
Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
115 120 125
Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His
130 135 140
Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser
145 150 155 160
Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg
165 170 175
Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val
180 185 190
Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val
195 200 205
Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr
210 215 220
Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser
225 230 235 240
Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys Met Cys
245 250 255
Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln
260 265 270
Arg Ile Val Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly
275 280 285
Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ser Lys Gln Ala
290 295 300
Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu
305 310 315 320
Asn Leu Tyr Pro Val Ala Arg Gln Arg Pro Gly Leu Cys Gln Val Phe
325 330 335
Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg
340 345 350
Met Arg Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Lys Leu Ile Gly
370 375 380
Thr Asp Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp
385 390 395 400
Leu Leu Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val
405 410 415
Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg
420 425 430
Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr
435 440 445
Gly Arg Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu
450 455 460
Pro Asp Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro
465 470 475 480
Pro
<210> 36
<211> 254
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic sequence 1epi_P2 minus P2c
<400> 36
Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
1 5 10 15
Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln
20 25 30
Phe Ser Arg Gly Asn Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro
35 40 45
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu
50 55 60
Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala
65 70 75 80
Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val
85 90 95
Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Phe Asn His Gln His Gly Thr
100 105 110
Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
115 120 125
Leu Leu Leu Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His
130 135 140
Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser
145 150 155 160
Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg
165 170 175
Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val
180 185 190
Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val
195 200 205
Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr
210 215 220
Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser
225 230 235 240
Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile Lys
245 250
Claims (111)
- 서열번호 1 내지 11 또는 서열번호 14 내지 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 서열번호 16 내지 36에 제시된 2개 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 19 또는 29, 서열번호 16, 21, 27, 28, 또는 34에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 20, 22, 23, 30, 31, 35, 또는 36에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열 및 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제2항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 9에 제시된 아미노산 서열, 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열, 및 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 폴리펩타이드.
- 제3항에 있어서, 서열번호 17 및 18에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드.
- 서열번호 1 내지 36에 제시된 하나 이상의 아미노산 서열을 인코딩(encoding)하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus) (CMV) 벡터.
- 제9항에 있어서, CMV 벡터는 인간 CMV (HCMV) 벡터 또는 붉은털 원숭이 CMV (RhCMV) 벡터인, CMV 벡터.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, CMV 벡터는 UL82 유전자가 부재하는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 벡터는 UL128-UL130 유전자 영역이 부재하고 UL146-UL147 유전자 영역이 부재하는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 벡터는 완전한(intact) UL128-UL130 유전자 영역 및 완전한 UL146-UL147 유전자 영역을 갖는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은 서열번호 1 내지 11, 서열번호 14 내지 15, 및 서열번호 24 내지 26 중 하나 이상을 포함하는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36 중 하나 이상을 포함하는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36 중 2개 이상을 포함하는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은
a) 서열번호 19 또는 29에 제시된 서열;
b) 서열번호 16, 21, 27, 28, 또는 34 중 임의의 하나에 제시된 서열; 및
c) 서열번호 20, 22, 23, 30, 31, 33, 35, 또는 36 중 임의의 하나에 제시된 서열
을 포함하는, CMV 벡터. - 제17항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은 서열번호 17 및 18 중 하나 이상을 추가로 포함하는, CMV 벡터.
- 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 서열은 발현이 개선되도록 정렬되는, CMV 벡터.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은
a) 서열번호 3에 제시된 서열; 및
b) 서열번호 4에 제시된 서열
을 포함하는, CMV 벡터. - 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은
a) 서열번호 5에 제시된 서열; 및
b) 서열번호 6에 제시된 서열
을 포함하는, CMV 벡터. - 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은
a) 서열번호 7에 제시된 서열; 및
b) 서열번호 8에 제시된 서열
을 포함하는, CMV 벡터. - 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 서열은
a) 서열번호 9에 제시된 서열;
b) 서열번호 10에 제시된 서열; 및
c) 서열번호 11에 제시된 서열
을 포함하는, CMV 벡터. - 제9항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 2개 이상의 CMV 벡터를 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 B형 간염 바이러스 (HBV) 백신.
- 하나 이상의 HBV 에피센서스 (episensus) 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 CMV 벡터를 포함하는 B형 간염 바이러스 (HBV) 백신.
- 제26항에 있어서, CMV 벡터는 인간 CMV (HCMV) 벡터 또는 붉은털 원숭이 CMV (RhCMV) 벡터인, 백신.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, CMV 벡터는 UL82 유전자가 부재하는, 백신.
- 제28항에 있어서, 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 UL82 유전자를 대체하는, 백신.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 벡터는 UL128-UL130 유전자 영역이 부재하고 UL146-UL147 유전자 영역이 부재하는, 백신.
- 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, CMV 벡터는 완전한 UL128-UL130 유전자 영역 및 완전한 UL146-UL147 유전자 영역을 갖는, 백신.
- 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드는 2개 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는, 백신.
- 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피센서스 항원은 서열번호 1 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 16 내지 23 및 서열번호 27 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제33항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제26항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 에피센서스 항원은 C 단백질, S 단백질, 또는 P 단백질 중 하나 이상으로부터 유래되는 하나 이상의 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제51항에 있어서, 에피센서스 항원은 C 단백질, S 단백질, 및 P 단백질의 보존 영역으로부터 유래되는 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, C 단백질, S 단백질, 및 P 단백질로부터 유래되는 에피센서스 서열은 발현이 개선되도록 정렬되는, 백신.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 에피센서스 항원은 PreS1 도메인, PreS2 도메인, 및 P 단백질의 비보존 영역 중 하나 이상으로부터 유리되는 에피센서스 서열을 추가로 포함하는, 백신.
- 제26항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 에피센서스 항원이 유래되는 적어도 하나의 단백질 서열은 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 백신.
- 제55항에 있어서, 돌연변이는 결실 또는 치환인, 백신.
- 제55항에 있어서, 돌연변이는 표 1에 제시된 P 단백질 돌연변이인, 백신.
- 제26항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 에피센서스 항원은 2개 이상의 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제58항에 있어서, 에피센서스 항원은 중국(China)으로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 2개의 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제59항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 3 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제58항에 있어서, 에피센서스 항원은 중국으로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 에피센서스 서열 및 전세계적 세트(Global set)로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제61항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제61항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- 제58항에 있어서, 에피센서스 항원은 전세계적 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 3개의 에피센서스 서열을 포함하는, 백신.
- 제64항에 있어서, 에피센서스 항원은 서열번호 9, 서열번호 10, 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 백신.
- a) 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원;
b) 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 벡터로서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 벡터
를 포함하는, HBV 백신. - 제66항에 있어서, 백신은
a) 2개 이상의 HBV 에피센서스 항원;
b) 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드; 또는
c) 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 2개 이상의 벡터로서, 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 HBV 에피센서스 항원을 인코딩하는 벡터
를 포함하는, 백신. - 제26항 내지 제67항 중 어느 한 항에 따른 2개 이상의 HBV 백신을 포함하는 조성물.
- 제68항에 있어서, 제1 HBV 백신은 중국으로부터의 HBV 샘플을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하고 제2 HBV 백신은 중국으로부터의 HBV 샘플을 사용하여 개발된 제2 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하는, 조성물.
- 제69항에 있어서, 제1 에피센서스 항원은 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고 제2 에피센서스 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제68항에 있어서, 제1 HBV 백신은 중국으로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하고 제2 HBV 백신은 전세계적 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 제2 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하는, 조성물.
- 제71항에 있어서, 제1 에피센서스 항원은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고 제2 에피센서스 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제71항에 있어서, 제1 에피센서스 항원은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하고 제2 에피센서스 항원은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제68항에 있어서, 제1 HBV 백신은 전세계적 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 제1 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하고 제2 HBV 백신은 전세계적 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 제2 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하고 제3 HBV 백신은 전세계적 세트로부터의 HBV 서열을 사용하여 개발된 제3 에피센서스 항원을 인코딩하거나 포함하는, 조성물.
- 제74항에 있어서, 제1 에피센서스 항원은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 제2 에피센서스 항원은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고 제3 에피센서스 항원은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 아시아(Asia)로부터의 HBV 서열에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제76항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 중국으로부터의 HBV 서열에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 미국으로부터의 HBV 서열에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 유럽으로부터의 HBV 서열에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 미국 및 유럽으로부터의 HBV 서열에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 서열의 전세계 세트에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 A 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 B 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 C 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 CB 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 D 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 DC 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 DE 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 E 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 HBV 유전자형 F 전염병에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 에피센서스 항원은 유전자형 A, B, C, CB, D, DC, DE, E, 및 F 이외의 HBV 유전자형에 중심인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 및 제76항 내지 제91항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 예방 백신인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 및 제76항 내지 제91항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 치료 백신인, 백신 또는 조성물.
- 제26항 내지 제67항 및 제76항 내지 제91항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는, 백신 또는 조성물.
- 대상체(subject)에서 HBV를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는 방법으로서, 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체의 HBV에 대한 면역 반응을 생성 또는 유도하는 방법으로서, 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 치료에 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물.
- 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물.
- 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 또는 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 HBV에 대한 면역 반응을 생성 또는 유도하는데 사용하기 위한, 폴리펩타이드, 벡터, 백신, 또는 조성물.
- HBV를 치료하는데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 및 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물의 용도.
- HBV 감염으로부터 대상체를 보호하는데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 및 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물의 용도.
- 대상체의 HBV에 대한 면역 반응을 생성 또는 유도하는데 사용하기 위한 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제8항, 제9항 내지 제23항, 제25항 내지 제67항 및 제76항 내지 제94항, 또는 제24항 또는 제68항 내지 제75항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 벡터, 백신 또는 조성물의 용도.
- 지리적 영역의 대상체를 위한 HBV 백신을 설계 및 생성하는 방법으로서,
(a) 지리적 영역 내의 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하는 하나 이상의 에피센서스 항원을 설계하는 단계; 및
(b) CMV 골격, 및 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 HBV 백신; 또는
에피센서스 항원을 포함하는 HBV 백신
중 하나를 생성하는 단계
를 포함하는 방법. - 대상체를 위한 HBV 백신을 설계 및 생성하는 방법으로서,
(a) 대상체에서 HBV 바이러스의 아미노산 서열을 결정하는 단계;
(b) 대상체에 존재하는 바이러스 내의 HBV 유전자형 다양성을 효율적으로 포함하도록 하나 이상의 에피센서스 항원을 설계하는 단계; 및
(c) CMV 골격, 및 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 HBV 백신; 또는
에피센서스 항원을 포함하는 HBV 백신
중 하나를 생성하는 단계
를 포함하는, 방법. - 효과기(effector) 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서,
(a) 하나 이상의 에피센서스 항원을 설계하는 단계;
(b) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 백신을 생성하는 단계; 및
(c) 이를 필요로 하는 대상체에 백신을 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체에서 HBV 감염을 치료하는 방법으로서,
(a) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체에서 HBV 감염을 예방하는 방법으로서,
(a) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체에서 HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
(a) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 대상체에서 효과기 기억 T 세포 반응을 유도하는 방법으로서,
(a) CMV 골격, 및 하나 이상의 에피센서스 항원을 인코딩하는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 생성하는 단계; 및
(b) 유효량의 면역원성 조성물을 대상체에 투여하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제104항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 에피센서스 항원은 서열번호 1 내지 11, 서열번호 14 내지 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
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