ES2583179T3

ES2583179T3 - Métodos y organismos para la producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento

Info

Publication number: ES2583179T3
Application number: ES08782639.2T
Authority: ES
Inventors: Anthony P. Burgard; Stephen J. Van Dien; Mark J. Burk
Original assignee: Genomatica Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2008-08-06
Publication date: 2016-09-19
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: EP2679676A1; US20090047719A1; CA2695706C; HUE040654T2; EP2185708B1; EP2679685A1; CA2695706A1; ES2695125T3; US20110201071A1; EP2679685B1; WO2009023493A1; CA3175485A1; PL2679676T3; EP2679684A1; US20170240931A1; US20200095616A1; EP2679676B1; AU2008287072A1; TR201814888T4; BRPI0815138A2

Abstract

Un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabólicas que comprenden la perturbación de los genes adhE, ldhA, pflAB y mdh, en el que el microorganismo comprende además una ruta biosintética de 1,4-butanodiol (BDO) que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato:semialdehído succínico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el ácido nucleico exógeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO).

Description

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obligatoria confiere capacidad de biosíntesis de 4-HB sobre el organismo microbiano hospedador.

Se ilustran en el presente documento tres requisitos de las rutas biosintéticas de 4-HB que se muestran a fines ilustrativos en la figura 2. Un requisito de la ruta biosintética de 4-HB incluye la biosíntesis de 4-HB a partir de succinato. Los enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen la semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Otro requisito de la ruta biosintética de 4-HB incluye la biosíntesis del succinato a través de la succinil-CoA. Los enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen la succinil-CoA sintetasa, la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Un tercer requisito de la ruta biosintética de 4-HB incluye la biosíntesis de 4-HB a partir de αcetoglutarato. Los enzimas que participan en esta ruta biosintética de 4-HB incluyen glutamato:semialdehído succínico transaminasa, glutamato decarboxilasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Cada una de estas rutas biosintéticas de 4-HB, sus sustratos, reactivos y productos se describen además adicionalmente en los Ejemplos.

Los organismos microbianos no naturales divulgados se pueden producir introduciendo ácidos nucleicos expresables que codifican una o más de los enzimas que participan en una o más rutas biosintéticas de 4-HB. Dependiendo del organismo microbiano hospedador seleccionado para la biosíntesis, se pueden expresar los ácidos nucleicos para alguna o todas las rutas biosintéticas de 4-HB concretas. Por ejemplo, si un hospedador seleccionado es deficiente en ambas enzimas de la ruta del succinato a 4-HB (la ruta del succinato), y esta ruta se selecciona para la biosíntesis de 4-HB, entonces se introducen ácidos nucleicos expresables de la semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa en el hospedador para la posterior expresión exógena. Como alternativa, si el hospedador seleccionado es deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, entonces se necesita un ácido nucleico codificante de esta enzima para conseguir la biosíntesis de 4-HB.

De manera análoga, cuando se selecciona la biosíntesis de 4-HB para producirse a través de la ruta del succinato a succinil-CoA (la ruta de la succinil-CoA), los ácidos nucleicos que codifican las deficiencias del hospedador respecto a los enzimas succinil CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA y/o 4hidroxibutanoato deshidrogenasa deben expresarse exógenamente en el hospedador receptor. La selección de la biosíntesis de 4-HB a través de la ruta del α-cetoglutarato al semialdehído succínico (la ruta del α-cetoglutarato) utilizará la expresión exógena para cubrir las deficiencias del hospedador respecto a una o más de los enzimas glutamato: semialdehído succínico transaminasa, glutamato decarboxilasa y/o 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.

Dependiendo de los constituyentes de la ruta biosintética de 4-HB de un organismo microbiano hospedador seleccionado divulgado, los biocatalizadores de 4-HB microbianos no naturales incluirán al menos un ácido nucleico que codifica una ruta de 4-HB expresada exógenamente y hasta los ácidos nucleicos que codifican las seis rutas de 4-HB. Por ejemplo, se puede establecer la biosíntesis de 4-HB a partir de las tres rutas en un hospedador deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa mediante la expresión exógena de un ácido nucleico que codifica una 4hidroxibutanoato deshidrogenasa. Por el contrario, se puede establecer la biosíntesis de 4-HB a partir de las tres rutas en un hospedador deficiente en las seis enzimas mediante la expresión exógena de las seis semialdehído succínico deshidrogenasas independientes de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdehído succínico transaminasa, glutamato decarboxilasa y 4hidroxibutanoato deshidrogenasa.

Con las enseñanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderán que el número de ácidos nucleicos codificantes que se introducen en una forma expresable serán equivalentes a las deficiencias de la ruta de 4-HB del organismo microbiano hospedador seleccionado. Por tanto, un organismo microbiano no natural de la divulgación puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis ácidos nucleicos codificantes que codifican las anteriores enzimas que constituyen las rutas biosintéticas de 4-HB. En algunos aspectos, los organismos microbianos no naturales pueden incluir también otras modificaciones genéticas que facilitan u optimizan la biosíntesis de 4-HB o que transmiten otras funciones útiles para el organismo microbiano hospedador. Una de dichas funcionalidades adicionales puede incluir, por ejemplo, el aumento de la síntesis de uno

o más de los precursores de la ruta de 4-HB tal como succinato, succinil-CoA y/o α-cetoglutarato.

En algunos aspectos, un organismo microbiano no natural de la divulgación se genera a partir de un hospedador que contiene la capacidad enzimática de sintetizar 4-HB. En este aspecto específico puede ser útil aumentar la síntesis o la acumulación de un producto de la ruta de 4-HB hasta, por ejemplo, impulsar las reacciones de la ruta de 4-HB hacia la producción de 4-HB. La síntesis aumentada o acumulación se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, la sobreexpresión de ácidos nucleicos que codifican una o más de los enzimas de la ruta de 4-HB anteriormente descrita. Se puede producir la sobreexpresión del enzima o enzimas de la ruta de 4-HB, por ejemplo, mediante la expresión exógena del gen o genes endógenos, o mediante la expresión exógena del gen o genes heterólogos. Por tanto, los organismos que se producen naturalmente pueden generarse fácilmente para convertirse en organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la invención mediante la sobreexpresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco o los seis ácidos nucleicos que codifican los enzimas de la ruta biosintética de 4-HB. Además, se puede generar un organismo no natural mediante mutagénesis de un gen endógeno que da como resultado un aumento en la actividad de un enzima en la ruta biosintética de 4-HB.

En aspectos especialmente útiles, se emplea la expresión exógena. La expresión exógena confiere la capacidad de personalizar la expresión y/ los elementos reguladores del hospedador y la aplicación para conseguir un nivel de expresión deseado que controla el usuario. Sin embargo, se puede utilizar también la expresión endógena en otros aspectos tales como mediante la eliminación de un efector regulador negativo o la inducción del promotor del gen

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al., Met. Eng. 7:329-336 (2005)).

Los organismos microbianos no naturales divulgados se construyen utilizando métodos bien conocidos en la técnica como se ilustra anteriormente para expresar de forma exógena al menos un ácido nucleico que codifica un enzima de una ruta de 4-HB en cantidades suficientes para producir 4-HB monomérico. Los niveles ilustrativos de expresión de enzimas 4-HB en cada ruta se describen adicionalmente a continuación en los Ejemplos. Siguiendo las enseñanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los organismos microbianos no naturales divulgados pueden conseguir la biosíntesis del 4-HB monomérico dando como resultado concentraciones intracelulares entre aproximadamente 0,1-25 mM o más. En general, la concentración intracelular de 4-HB monomérico está entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 5-15 mM y más particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o más. Las concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos ilustrativos puede conseguirse también a partir de los organismos microbianos que no se producen naturalmente de la divulgación.

Como se describe adicionalmente a continuación, una condición de crecimiento ilustrativa para conseguir la biosíntesis de 4-HB incluye condiciones de cultivo o fermentación anaerobias. En determinados aspectos, los organismos microbianos que no se producen naturalmente divulgados se pueden mantener, cultivar o fermentar en condiciones de cultivo anaerobias o sustancialmente anaerobias. En resumen, las condiciones anaerobias se refieren a un entorno desprovisto de oxígeno. Las condiciones sustancialmente anaerobias incluyen, por ejemplo, un cultivo, una fermentación discontinua o continua de tal manera que la concentración de oxígeno disuelto en el medio permanezca entre 0 y 10% de saturación. Las condiciones sustancialmente anaerobias incluyen también células en crecimiento o en reposo en un medio líquido o en agar sólido en el interior de una cámara precintada mantenida con una atmósfera de menos de un 1% de oxígeno. El porcentaje de oxígeno puede mantenerse mediante, por ejemplo, burbujeo en el cultivo una mezcla de N2/CO2 u otro gas o gases no de oxígeno adecuados.

La descripción divulga también un biocatalizador microbiano que no se produce naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosintética del ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO) que incluye al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdehído succínico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el ácido nucleico exógeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4butanodiol (BDO).

Se pueden generar también organismos microbianos que no se produce naturalmente que biosintetizan BDO. Siguiendo las enseñanzas y directrices proporcionadas anteriormente para la construcción de organismos microbianos que sintetizan 4-HB, se pueden incorporar rutas de BDO adicionales en los organismos microbianos productores de 4-HB para generar organismos que sintetizan también BDO y otros compuestos de la familia BDO. En la figura 3 se ilustra la síntesis química de BDO y sus productos posteriores. Los organismos microbianos no naturales de la invención capaces de la biosíntesis de BDO evitan esta síntesis química utilizando 4-HB como punto de entrada como se ilustra en la figura 2. Como se describe adicionalmente a continuación, se pueden usar productores de 4-HB para convertir químicamente 4-HB en GBL y a continuación, en BDO o THF, por ejemplo. Como alternativa, se pueden modificar adicionalmente los productores de 4-HB para incluir capacidades biosintéticas para la conversión de 4-HB y/o GBL en BDO.

Las rutas de BDO adicionales a introducir en productores de 4-HB incluyen, por ejemplo, la expresión exógena en un fondo de hospedador deficiente o la sobreexpresión de una aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa. En ausencia de la acil-CoA sintetasa endógena capaz de modificar 4-HB, los organismos microbianos productores de BDO que no se producen naturalmente pueden incluir además una acil-CoA sintetasa exógena selectiva para 4-HB. En la Tabla 1 a continuación se relacionan alcohol y aldehído deshidrogenasas ilustrativos que se pueden usar para estas conversiones in vivo de 4-HB a BDO.

Tabla 1. Alcohol y aldehído deshidrogenasas para la conversión de 4-HB en BDO.

ALCOHOL DESHIDROGENASAS

ec: 1.1.1.1 alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.2 alcohol deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.4 (R,R)-butanodiol deshidrogenasa ec: 1.1.1.5 acetoína deshidrogenasa ec: 1.1.1.6 glicerol deshidrogenasa ec: 1.1.1.7 propanodiol-fosfato deshidrogenasa ec: 1.1.1.8 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+) ec: 1.1.1.11 D-arabinitol 4-deshidrogenasa ec: 1.1.1.12 L-arabinitol 4-deshidrogenasa ec: 1.1.1.13 L-arabinitol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.14 L-iditol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.15 D-iditol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.16 galactitol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.17 manitol-1-fosfato 5-deshidrogenasa

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ec: 1.1.1.18 inositol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.21 aldehído reductasa ec: 1.1.1.23 histidinol deshidrogenasa ec: 1.1.1.26 glioxilato reductasa ec: 1.1.1.27 L-lactato deshidrogenasa ec: 1.1.1.28 D-lactato deshidrogenasa ec: 1.1.1.29 glicerato deshidrogenasa ec: 1.1.1.30 3-hidroxibutirato deshidrogenasa ec: 1.1.1.31 3-hidroxibutirato deshidrogenasa ec: 1.1.1.35 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa ec: 1.1.1.36 acetoacetil-CoA reductasa ec: 1.1.1.37 malato deshidrogenasa ec: 1.1.1.38 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-descarboxilante) ec: 1.1.1.39 malato deshidrogenasa (descarboxilante) ec: 1.1.1.40 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-descarboxilante) (NADP+) ec: 1.1.1.41 isocitrato deshidrogenasa (NAD+) ec: 1.1.1.42 isocitrato deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.54 alil-alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.55 lactaldehído reductasa (NADPH) ec: 1.1.1.56 ribitol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.59 3-hidroxipropionato deshidrogenasa ec: 1.1.1.60 2-hidroxi-3-oxopropionato reductasa ec: 1.1.1.61 4-hidroxibutirato deshidrogenasa ec: 1.1.1.66 omega-hidroxidecanoato deshidrogenasa ec: 1.1.1.67 manitol 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.71 alcohol deshidrogenasa [NAD(P)+] ec: 1.1.1.72 glicerol deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.73 octanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.75 (R)-aminopropanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.76 (S,S)-butanodiol deshidrogenasa ec: 1.1.1.77 lactaldehído reductasa ec: 1.1.1.78 metilglioxal reductasa (dependiente de NADH) ec: 1.1.1.79 glioxilato reductasa (NADP+) ec: 1.1.1.80 isopropanol deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.81 hidroxipiruvato reductasa ec: 1.1.1.82 malato deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.83 D-malato deshidrogenasa (descarboxilante) ec: 1.1.1.84 dimetilmalato deshidrogenasa ec: 1.1.1.85 3-isopropilmalato deshidrogenasa ec: 1.1.1.86 cetol-ácido reductoisomerasa ec: 1.1.1.87 homoisocitrato deshidrogenasa ec: 1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA reductasa ec: 1.1.1.90 aril-alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.91 aril-alcohol deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.92 oxaloglicolato reductasa (descarboxilante) ec: 1.1.1.94 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [NAD(P)+] ec: 1.1.1.95 fosfoglicerato deshidrogenasa ec: 1.1.1.97 3-hidroxibencil-alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.101 acilglicerona-fosfato reductasa ec: 1.1.1.103 L-treonina 3-deshidrogenasa ec: 1.1.1.104 4-oxoprolina reductasa ec: 1.1.1.105 retinol deshidrogenasa ec: 1.1.1.110 indololactato deshidrogenasa ec: 1.1.1.112 indanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.113 L-xilosa 1-deshidrogenasa ec: 1.1.1.129 L-treonato 3-deshidrogenasa ec: 1.1.1.137 ribitol-5-fosfato 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.138 manitol 2-deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.140 sorbitol-6-fosfato 2-deshidrogenasa ec: 1.1.1.142 D-pinitol deshidrogenasa ec: 1.1.1.143 secuoyitol deshidrogenasa ec: 1.1.1.144 perilil-alcohol deshidrogenasa ec: 1.1.1.156 glicerol 2-deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.1.1.157 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa ec: 1.1.1.163 ciclopentanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.164 hexadecanol deshidrogenasa ec: 1.1.1.165 2-alquin-1-ol deshidrogenasa ec: 1.1.1.166 hidroxiciclohexanocarboxilato deshidrogenasa ec: 1.1.1.167 hidroximalonato deshidrogenasa ec: 1.1.1.174 ciclohexano-1,2-diol deshidrogenasa

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ec: 1.2.1.46 formaldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.47 4-trimetilamoniobutiraldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.48 aldehído deshidrogenasa de cadena larga ec: 1.2.1.49 2-oxoaldehído deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.51 piruvato deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.52 oxoglutarato deshidrogenasa (NADP+) ec: 1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.57 butanal deshidrogenasa ec: 1.2.1.58 fenilglioxilato deshidrogenasa (acilante) ec: 1.2.1.59 gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (NAD(P)+) (fosforilante) ec: 1.2.1.62 4-formilbencenosulfonato deshidrogenasa ec: 1.2.1.63 6-oxohexanoato deshidrogenasa ec: 1.2.1.64 4-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.65 salicilaldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.66 formaldehído deshidrogenasa dependiente de micotiol ec: 1.2.1.67 vanillin deshidrogenasa ec: 1.2.1.68 coniferil-aldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.69 fluoroacetaldehído deshidrogenasa ec: 1.2.1.71 semialdehído de succinilglutamato deshidrogenasa Por tanto, además de cualquiera de las diversas modificaciones ilustradas previamente para establecer la biosíntesis de 4-HB en un hospedador seleccionado, los organismos microbianos productores de BDO pueden incluir cualquiera de las combinaciones y permutaciones anteriores de las modificaciones metabólicas de la ruta de 4-HB así como cualquier combinación de expresión para la aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, la aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o una alcohol deshidrogenasa para generar rutas biosintéticas para BDO. Por tanto, los productores de BDO divulgados pueden tener la expresión exógena de, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o las 10 enzimas de cualquiera de las seis rutas de 4-HB y/o cualquiera de los enzimas de las 4 rutas de BDO.

El diseño y la construcción de los organismos microbianos genéticamente modificados se lleva a cabo usando métodos bien conocidos en la técnica para conseguir suficientes cantidades de expresión para producir BDO. En particular, los organismos bacterianos no naturales de la invención pueden conseguir la biosíntesis de BDO dando como resultado concentraciones intracelulares entre aproximadamente 0,1-25 mM o más. En general, la concentración intracelular de BDO está entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 515 mM y más particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o más. Las concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos ilustrativos pueden conseguirse también a partir de los organismos microbianos no naturales de la invención. Como con los productores de 4-HB, los productores de BDO también se pueden mantener, cultivar o fermentar en condiciones anaerobias.

Se describe además un método para la producción de 4-HB. El método incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene una ruta biosintética del ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdehído succínico transaminasa o glutamato decarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB). El método puede incluir adicionalmente la conversión química de 4-HB a GBL y de BDO o THF, por ejemplo.

Se entiende que, en los métodos descritos en el presente documento, cualquiera del uno o más ácidos nucleicos exógenos se puede combinar en un organismo microbiano no naturales divulgado siempre que se produzca el producto deseado, por ejemplo, 4-HB, BDO, THF o GBL. Por ejemplo, un organismo microbiano no natural que tiene una ruta biosintética de 4-HB puede comprender al menos dos ácidos nucleicos exógenos que codifican los enzimas deseadas, de tal manera que la combinación de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y la semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA; la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA y la succinil-CoA sintetasa; succinil-CoA sintetasa y glutamato decarboxilasa, y similares. Por tanto, se entiende que cualquier combinación de dos o más enzimas de una ruta biosintética puede estar incluida en un organismo microbiano no natural de la divulgación. De manera similar, se entiende que cualquier combinación de tres o más enzimas de una ruta biosintética puede estar incluida en un organismo microbiano no natural divulgados, por ejemplo, 4hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA y succinil-CoA sintetasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA y glutamato: semialdehído succínico transaminasa, y así sucesivamente, según se desee, siempre que la combinación de enzimas de la ruta biosintética deseada dé como resultado la producción del correspondiente producto deseado.

Cualquiera de los organismos microbianos que no se producen naturalmente descritos anteriormente puede cultivarse para producir los productos biosintéticos descritos. Por ejemplo, los productores de 4-HB pueden cultivarse para la producción biosintética de 4-HB. El 4-HB puede estar aislado o tratarse como se describe a continuación para generar GBL, THF y/o BDO. De manera similar, los productores de BDO pueden cultivarse para la producción biosintética de BDO. El BDO se puede aislar o someterse a tratamientos adicionales para la síntesis química de la familia de compuestos de BDO tales como los compuestos posteriores ilustrados en la figura 3.

En algunos aspectos, las condiciones de cultivo incluyen crecimiento anaerobio o sustancialmente anaerobio o

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El GBL resultante se puede separar de 4-HB y otros componentes del cultivo usando una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Dichos métodos de separación incluyen, por ejemplo, los procedimientos de extracción ilustrados en los Ejemplos, así como los métodos que incluyen la extracción líquido-líquido continua, pervaporación, filtración con membrana, separación con membrana, ósmosis inversa, electrodiálisis, destilación, cristalización, centrifugación, filtración extractiva, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de adsorción, y ultrafiltración. Todos los métodos anteriores son bien conocidos en la materia. El GBL separado se puede purificar mediante, por ejemplo, destilación.

Otro compuesto posterior que se puede producir a partir de organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la divulgación incluye, por ejemplo, BDO. Este compuesto se puede sintetizar mediante, por ejemplo, hidrogenación química de GBL. Las reacciones de hidrogenación química son bien conocidas en la técnica. Un procedimiento ilustrativo incluye la reducción química de 4-HB y/o GBL o una mezcla de estos dos componentes que se derivan del cultivo usando un catalizador de hidrogenación heterogéneo u homogéneo junto con hidrógeno, o un agente reductor de tipo hidruro usado estequiométrica o catalíticamente, para producir 1,4-butanodiol.

Son igualmente aplicables otros procedimientos bien conocidos en la técnica para la anterior reacción química e incluye, por ejemplo, el documento WO Nº 82/03854 (Bradley, et al.), que describe la hidrogenolisis de la gammabutirolactona en fase vapor sobre catalizador de óxido de cobre y óxido de cinc. La patente británica nº 1.230.276, que describe la hidrogenación de la gamma-butirolactona usando un catalizador de óxido de cobre-óxido de cromo. La hidrogenación se lleva a cabo en fase líquida. Se ilustran también reacciones discontinuas que tienen presiones totales de reactor elevadas. Las presiones parciales de reactivos y productos en los reactores están también por encima de los respectivos puntos de rocío. La patente británica nº 1.314.126, que describe la hidrogenación de la gamma-butirolactona en fase líquida sobre un catalizador de óxido de níquel-cobalto-torio. Se ilustran reacciones discontinuas teniendo presiones totales elevadas y presiones parciales de componentes también por encima de los respectivos puntos de rocío de los componentes. La patente británica nº 1.344.557, que describe la hidrogenación de la gamma-butirolactona en fase líquida sobre un catalizador de óxido de cobre-óxido de cromo. Una fase vapor o una fase mixta que contiene vapor se indica como adecuada en algunos casos. Se ilustra un reactor tubular de flujo continuo utilizando presiones totales del reactor elevadas. La patente británica nº 1.512.751, que describe la hidrogenación de la gamma-butirolactona a 1,4-butanodiol en fase líquida sobre un catalizador de óxido de cobreóxido de cromo. Se ilustran reacciones discontinuas que tienen presiones totales de reactor elevadas y, cuando sea determinable, las presiones parciales de reactivos y productos estarán también por encima de los respectivos puntos de rocío. La patente de Estados Unidos nº 4.301.077, que describe la hidrogenación a 1,4-butanodiol de la gammabutirolactona sobre un catalizador de Ru--NI--Co--Zn. La reacción se puede llevar a cabo en fase líquida o fase gaseosa o en una fase líquido-gas mixta. Se ilustran reacciones en fase líquida de flujo continuo a presiones totales del reactor elevadas y productividades de reactor relativamente bajas. La patente de Estados Unidos nº 4.048.196, que describe la producción de 1,4-butanodiol mediante la hidrogenación en fase líquida de gamma-butirolactona sobre un catalizador de óxido de cobre-óxido de cinc. Se ilustra además un reactor tubular de flujo continuo que funciona a presiones totales de reactor elevadas y a presiones parciales de reactivos y productos elevadas. Y la patente de Estados Unidos nº 4.652.685, que describe la hidrogenación de lactonas a glicoles.

Un compuesto posterior adicional que se puede producir a partir de organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la divulgación incluye, por ejemplo, THF. Este compuesto se puede sintetizar mediante, por ejemplo, hidrogenación química de GBL. Un procedimiento ilustrativo bien conocido en la técnica aplicable para la conversión de GBL a THF incluye, por ejemplo, la reducción química de 4-HB y/o GBL o una mezcla de estos dos componentes que se derivan del cultivo usando un catalizador de hidrogenación heterogéneo u homogéneo junto con hidrógeno, o un agente reductor de tipo hidruro usado estequiométrica o catalíticamente, para producir tetrahidrofurano. Son igualmente aplicables otros procedimientos bien conocidos en la técnica para la anterior reacción química e incluyen, por ejemplo, la patente de Estados Unidos nº 6.686.310, que describe una ruta sol-gel de área superficial elevada preparada para catalizadores de hidrogenación. Se describen también procesos para la reducción de gamma butirolactona a tetrahidrofurano y 1,4-butanodiol.

Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de cultivo líquido, así como fermentación y otros procedimientos de cultivo a gran escala. Como se describe adicionalmente a continuación en los Ejemplos, se pueden obtener rendimientos particularmente útiles de los productos biosintéticos de la divulgación en condiciones de cultivo anaerobias o sustancialmente anaerobias.

Se proporciona además un método de fabricación de 4-HB. El método incluye fermentar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene una ruta biosintética del ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdehído succínico transaminasa o glutamato decarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir ácido 4-hidroxibutanoico monomérico (4-HB), comprendiendo el proceso una fermentación de alimentación discontinua y una separación discontinua; fermentación de alimentación discontinua y separación continua, o fermentación continua y separación continua.

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El cultivo y las hidrogenaciones químicas descritas anteriormente se pueden escalar hasta y crecer de forma continua para fabricar 4-HB, GBL, BDO y/o THF. Los procedimientos de crecimiento ilustrativos incluyen, por ejemplo, fermentación de alimentación discontinua y separación discontinua; fermentación de alimentación discontinua y separación continua, o fermentación continua y separación continua. Todos estos procesos son bien conocidos en la técnica. Emplear los productores de 4-HB permite la biosíntesis simultánea de 4-HB y la conversión química en GBL, BDO y/o THF empleando los anteriores procedimientos de hidrogenación simultáneos con métodos de cultivos continuos tales como fermentación. Son también conocidos en la técnica otros procedimientos de hidrogenación y se pueden aplicar igualmente a los métodos divulgados.

Los procedimientos de fermentación son particularmente útiles para la producción biosintética de cantidades comerciales de 4-HB y/o BDO. En general, y como con procedimientos de cultivo no continuos, la producción continua y/o casi continua de 4-HB o BDO incluirá cultivar un organismo productor de 4-HB o BDO no natural de la divulgación en nutrientes y medio suficientes para sostener y/o sostener casi el crecimiento en fase exponencial. El cultivo continuo en dichas condiciones puede incluir, por ejemplo, 1 día, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días o más. Además, el cultivo continuo puede incluir 1 semana, 2, 3, 4 o 5 o más semanas y hasta varios meses. Como alternativa, los organismos descritos en el presente documento pueden cultivarse durante horas, si resulta adecuado para una aplicación concreta. Debe entenderse que las condiciones de cultivo continuas y/o casi continuas pueden incluir también todos los intervalos de tiempo entre estos periodos ilustrativos.

Son bien conocidos en la técnica los procedimientos de fermentación. En resumen, la fermentación para la producción biosintética de 4-HB, BDO u otros productos derivados de 4-HB de la divulgación se puede utilizar en, por ejemplo, fermentación de alimentación discontinua y separación discontinua; fermentación de alimentación discontinua y separación continua, o fermentación continua y separación continua. Los ejemplos de procedimientos de fermentación discontinua y continua bien conocidos en la técnica se ilustran adicionalmente a continuación en los Ejemplos.

Además, con respecto a los procedimientos de fermentación anteriores utilizando los productores de 4-HB o BDO de la divulgación para la producción continua de cantidades sustanciales de 4-HB y BDO monoméricos, respectivamente, los productores de 4-HB también pueden, por ejemplo, someterse simultáneamente a procedimientos de síntesis química como se ha descrito anteriormente para la conversión química del 4-HB monomérico en, por ejemplo, GBL, BDO y/o THF. Los productores de BDO pueden, de manera similar, por ejemplo, someterse simultáneamente a procedimientos de síntesis química como se ha descrito anteriormente para la conversión química de BDO en, por ejemplo, THF, GBL, pirrolidonas y/u otros compuestos de la familia BDO. Además, los productos de los productores de 4-HB y BDO pueden separarse del cultivo de fermentación y someterse secuencialmente a conversión química, como se divulga en el presente documento.

En resumen, se puede llevar a cabo la hidrogenación de GBL en el caldo de fermentación como se describe en Frost et al., Biotechnology Progress 18: 201-211 (2002). Otro procedimiento para la hidrogenación durante la fermentación incluye, por ejemplo, los métodos descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.478.952. Este método se ilustra además en los ejemplos siguientes.

Por tanto, la descripción divulga adicionalmente un método de fabricación de γ-butirolactona (GBL), tetrahidrofurano (THF) o 1,4-butanodiol (BDO). El método incluye fermentar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene las rutas biosintéticas del ácido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), las rutas comprenden al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdehído succínico transaminasa, glutamato descarboxilasa, 1,4-butanodiol semialdehído deshidrogenasa independiente de CoA, 1,4-butanodiol semialdehído deshidrogenasa dependiente de CoA, 1,4-butanodiol alcohol deshidrogenasa, tanto dependiente de CoA como independiente de CoA, en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO), GBL o THF, comprendiendo la fermentación una fermentación de alimentación discontinua y separación discontinua; fermentación de alimentación discontinua y separación continua, o fermentación continua y separación continua.

Además de la biosíntesis de 4-HB, BDO y otros productos de la divulgación como se ha descrito en el presente documento, se pueden utilizar también los organismos microbianos no naturales y los métodos de la invención en diversas combinaciones entre sí y con otros organismos microbianos y métodos bien conocidos en la técnica para conseguir la biosíntesis del producto mediante otras rutas. Por ejemplo, una alternativa para producir BDO diferente que usan los productores de 4-HB y las etapas químicas o diferentes que usan los productores de BDO es directamente mediante la adición de otro organismo microbiano capaz de convertir 4-HB o un producto de 4-HB ilustrado en el presente documento en BDO.

Uno de dichos procedimientos incluye, por ejemplo, la fermentación de un organismo microbiano productor de 4-HB de la divulgación para producir 4-HB, como se describe anteriormente y a continuación. A continuación, se puede usar el 4-HB como un sustrato para un segundo organismo microbiano que convierte 4-HB en, por ejemplo, BDO, GBL y/o THF. El 4-HB se puede añadir directamente a otro cultivo del segundo organismo, o el cultivo original de los productores de 4-HB se puede agotar de estos organismos microbianos por, por ejemplo, separación celular, y después, la adición posterior del segundo organismo del caldo de fermentación se puede utilizar para producir el producto final sin etapas de purificación intermedias. Un segundo organismo ilustrativo que tiene la capacidad de utilizar bioquímicamente 4-HB como sustrato para la conversión de BDO, por ejemplo, es Clostridium acetobutylicum

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(véase, por ejemplo, Jewell et al., Current Microbiology, 13:215-19 (1986)).

En otros aspectos, los organismos microbianos no naturales y los métodos de la divulgación se pueden ensamblar en una amplia variedad de subrutas para conseguir la biosíntesis de, por ejemplo, 4-HB y/o BDO como se ha descrito. En estos aspectos, se pueden segregar rutas biosintéticas para un producto deseado de la invención en diferentes organismos microbianos y los diferentes organismos microbianos se pueden cultivar simultáneamente para producir el producto final. En dicho esquema biosintético, el producto de un organismo microbiano es el sustrato de un segundo organismo microbiano hasta que se sintetiza el producto final. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la biosíntesis de BDO como se ha descrito anteriormente para construir un organismo microbiano que contiene las rutas biosintéticas para la conversión de un sustrato tal como succinato endógeno mediante 4-HB en el producto final BDO. Como alternativa, también puede producirse BDO biosintéticamente a partir de organismos microbianos mediante cultivo simultáneo o fermentación simultánea usando dos organismos en el mismo recipiente. Siendo un primer organismo microbiano un productor de 4-HB con genes para producir 4-HB a partir de ácido succínico, y siendo un segundo organismo microbiano un productor de BDO con genes para convertir 4-HB en BDO.

Con las enseñanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderán que existe una amplia variedad de combinaciones y permutaciones de organismos microbianos que no se producen naturalmente y los métodos descritos junto con los otros organismos microbianos, con el cultivo simultáneo de otros organismos microbianos que no se producen naturalmente que tienen subrutas y con combinaciones de otros procedimientos químicos y/o bioquímicos bien conocidos en la técnica para producir productos de 4-HB, BDO, GBL y THF de la divulgación.

Un método informático para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la biosíntesis de un producto es la infraestructura informática OptKnock, Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 84: 647-57 (2003). OptKnock es un programa de modelación y simulación metabólica que sugiere estrategias de deleción de genes que dan como resultado microorganismos genéticamente estables que producen un exceso del producto diana. Específicamente, la infraestructura examina la totalidad de la red metabólica y/o bioquímica de un microorganismo con el fin de sugerir manipulaciones genéticas que fuercen la bioquímica deseada a ser un subproducto obligatorio del crecimiento celular. Al acoplar la producción bioquímica con el crecimiento de la célula a través de deleciones génicas u otras perturbaciones de los genes funcionales estratégicamente situadas, las presiones de selección sobre el crecimiento impuestas por las cepas diseñadas por ingeniería genética después de largos períodos de tiempo en un biorreactor conducen a mejoras en el rendimiento como resultado de la producción bioquímica acoplada al crecimiento obligatoria. Finalmente, cuando se realizan las deleciones génicas, existe una posibilidad poco importante de que las cepas diseñas reviertan a su estado original porque los genes seleccionados por OptKnock se eliminan completamente del genoma. Por tanto, esta metodología informática se puede utilizar bien para identificar rutas alternativas que conducen a la biosíntesis de 4-HB y/o BDO o bien utilizarse en relación con organismos microbianos no naturales para optimización adicional de la biosíntesis de 4-HB y/o BDO.

En resumen, OptKnock es un término que se utiliza en el presente documento para referirse a un método y sistema informático para modelar el metabolismo celular. El programa OptKnock se refiere a una infraestructura de modelos y métodos que incorporan restricciones concretas a los modelos de análisis del balance de flujo (FBA). Estas restricciones incluyen, por ejemplo, información cinética cualitativa, información cualitativa reguladora, y/o datos experimentales de micromatrices de ADN. OptKnock también calcula soluciones a diversos problemas metabólicos mediante, por ejemplo, estrechar los límites de flujo derivados de los modelos de balance de flujo y, posteriormente, sondear los límites de rendimiento de las redes metabólicas en la presencia de adiciones o deleciones de genes. La infraestructura informática OptKnock permite la construcción de formulaciones modelo que permiten una consulta efectiva de los límites de rendimiento de las redes metabólicas, y proporciona métodos para resolver los problemas de programación lineal entera mixta. Los métodos de modelación y simulación metabólica citados en el presente documento como OptKnock se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 10/043.440, presentada el 10 de enero de 2002, y en la patente internacional nº PCT/US02/00660, presentada el 10 de enero de 2002.

Otro método informático para identificar y diseñar alteraciones metabólicas que favorecen la producción biosintética de un producto es un sistema de modelación y simulación metabólica denominado SimPheny®. Este sistema y método informático se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con número de serie 10/173.547, presentada el 14 de junio de 2002, y en la solicitud de patente internacional nº PCT/US03/18838, presentada el 13 de junio de 2003.

SimPheny es un sistema informático que se puede utilizar para producir un modelo de red in silico y para simular el flujo de masa, energía o carga a través de las reacciones químicas de un sistema biológico para definir un espacio de soluciones que contiene todas y cada una de las posibles funcionalidades de las reacciones químicas del sistema, determinando de esta forma una gama de actividades permitidas por el sistema biológico. Este enfoque se denomina como modelación basada en restricciones, porque el espacio de soluciones está definido por restricciones tales como la estequiometría conocida de las reacciones incluidas, así como por la termodinámica de las reacciones y las restricciones de capacidad asociadas con los flujos máximos a través de las reacciones. El espacio definido por estas restricciones se puede interrogar para determinar las capacidades fenotípica y conductual del sistema biológico o de sus componentes bioquímicos. Los métodos de análisis tales como el análisis convexo, la programación lineal y el cálculo de rutas extremas descritos, por ejemplo, en Schilling et al., J. Theor. Biol. 203:229248 (2000); Schilling et al., Biotech. Bioeng. 71:286-306 (2000) y Schilling et al., Biotech. Prog. 15:288-295 (1999), se pueden utilizar para determinar dichas capacidades fenotípicas. Como se describe en los siguientes Ejemplos,

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Maximizar química (OptKnock) j sometido a maximizar biomasa j

sometido a

sustrato =

sustrato_captación {sustrato(s) limitante(s)}

atp ≥ atp_principal

dianaBiomasa ≥ biomasa

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donde químico es la producción del producto diana deseado, por ejemplo, succinato u otro producto bioquímico, y K es el número de desactivaciones permisibles. Destacar que poner el valor de K en cero devuelve la solución de biomasa máxima de la red completa, mientras que poner el valor de K en uno identifica la única desactivación de gen/reacción (yj =0) de tal forma que la red resultante implica la máxima sobreproducción dado su máximo rendimiento de biomasa. La restricción final garantiza que la red resultante cumple un mínimo rendimiento de biomasa. Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 647-57 (2003), proporcionan una descripción más detallada de la formulación del modelo y del procedimiento de resolución. Los problemas que contienen cientos de variables binarias se pueden resolver en unos pocos minutos o en varias horas usando CPLEX 8.0, GAMS: The Solver Manuals. 2003: GAMS Development Corporation, que se puede acceder a través de GAMS, Brooke et al., GAMS Development Corporation (1998), un entorno de modelado, en una estación de trabajo IBM RS6000-270. La infraestructura OptKnock ya ha sido capaz de identificar estrategias de deleción de genes prometedoras para la producción bioquímica en exceso, Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 647-57 (2003), Pharkya et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 887-899 (2003), y establece un marco sistemático que abarca de forma natural futuras mejoras en marcos de modelización metabólica y reguladora.

Cualquier solución del problema OptKnock de dos niveles anteriormente descrito proporcionará un conjunto de reacciones metabólicas a perturbar. La eliminación de cada reacción dentro del conjunto o la modificación metabólica puede dar como resultado 4-HB o BDO como producto obligado durante la fase de crecimiento del organismo. Como las reacciones son conocidas, una solución del problema OptKnock de dos niveles también proporcionará el gen o genes asociados que codifican una o más enzimas que catalizan cada reacción dentro del conjunto de reacciones. La identificación de un conjunto de reacciones y sus correspondientes genes que codifican los enzimas que participan en cada reacción es generalmente un proceso automatizado, que se realiza mediante la correlación de las reacciones con una base de datos de reacciones que incluye relaciones entre enzimas y genes codificantes.

Una vez identificado, el conjunto de reacciones a perturbar para obtener la producción de 4-HB o BDO se implementa en la célula u organismo diana mediante la perturbación funcional de al menos un gen que codifica cada reacción metabólica dentro del conjunto. Un medio especialmente útil para conseguir la perturbación funcional del conjunto de reacción es mediante la deleción de cada gen de codificación. Sin embargo, en algunos casos, puede ser beneficioso perturbar la reacción mediante otras anomalías genéticas entre las que se incluyen, por ejemplo, mutación, deleción de regiones reguladoras tales como promotores o sitios de unión a cis de los factores reguladores, o mediante truncamiento de la secuencia de codificación en cualquiera de numerosas ubicaciones. Estas últimas anomalías, que dan como resultado la deleción completa del conjunto génico pueden ser útiles, por ejemplo, cuando se desea una evaluación rápida del acoplamiento del succinato o cuando es menos probable que ocurra la reversión génica.

Para identificar soluciones productivas adicionales para el problema OptKnock de dos niveles anteriormente descrito que proporcione conjuntos adicionales de reacciones a perturbar o modificaciones metabólicas que puedan dar como resultado una biosíntesis, incluyendo la biosíntesis de 4-HB u otro producto bioquímico acoplada al crecimiento, se puede implementar otro método de optimización, denominado de cortes enteros. Este método progresa resolviendo el problema OptKnock anteriormente ilustrado de forma iterativa con la incorporación de una restricción adicional que se denomina corte entero en cada iteración. La restricción de corte entero evita eficazmente que el procedimiento de resolución seleccione exactamente el mismo conjunto de reacciones identificado en cualquier iteración anterior que obligatoriamente acopla la biosíntesis del producto con el crecimiento. Por ejemplo, si una modificación metabólica acoplada con el crecimiento anteriormente identificada especifica que las reacciones

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1, 2, y 3 se deber perturbar, entonces, la siguiente restricción impide las mismas reacciones se consideren

simultáneamente en posteriores soluciones: y1+y2+y3 ≥ 1. El método de corte entero es bien conocido en la técnica y se puede encontrar descrito en, por ejemplo, la referencia, Burgard et al., Biotechnol. Prog., 17: 791-797 (2001). Análogamente a todos los métodos descritos en el presente documento con referencia a su uso combinado con la infraestructura informática OptKnock para modelización y simulación metabólica, el método de corte entero para reducir la redundancia en el análisis informático iterativo también se puede aplicar a otras infraestructuras informáticas bien conocidas en la materia incluyendo, por ejemplo, SimPheny®.

Las restricciones del tipo anterior impiden la identificación de conjuntos de reacción más grandes que incluyen conjuntos ya identificados. Por ejemplo, el uso del método de optimización de corte entero anterior en una iteración posterior impediría la identificación de un cuádruple conjunto de reacciones que especifique que las reacciones 1, 2, y 3 se deben perturbar, ya que estas reacciones se han identificado con anterioridad. Para garantizar la identificación de todos los posibles conjuntos de reacciones que conducen a la producción biosintética de un producto, se puede utilizar una modificación del método de corte entero.

En resumen, el procedimiento de corte entero modificado comienza con la iteración 'cero' que calcula la producción máxima del producto bioquímico deseado para el crecimiento óptimo con una red natural. Este cálculo corresponde a una solución OptKnock con K igual a 0.

A continuación, se consideran desactivaciones simples y se introducen dos conjuntos de parámetros, objstoreiter e ystoreiter,j, para guardar la función objetivo (químico) e información se activación-desactivación de la reacción (yj), respectivamente, en cada iteración, iter. A continuación, las siguientes restricciones se añaden sucesivamente a la formulación OptKnock en cada iteración.

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En la ecuación anterior, ε y M son números pequeños y grandes, respectivamente. En general, ε se puede ajustar a aproximadamente 0,01 y M se puede ajustar a aproximadamente 1000. Sin embargo, también se pueden utilizar números más grandes y/o más pequeños que los citados. M garantiza que la restricción solamente puede ser vinculante para estrategias de desactivación anteriormente identificadas, mientras que ε garantiza que la adición de desactivaciones a una estrategia previamente identificada debe llevar a un aumento de al menos ε en la producción bioquímica durante el crecimiento óptimo. Esta estrategia pasa a deleciones dobles cuando una estrategia de deleción única no consigue mejorar la cepa natural. Después se consideran las deleciones triples cuando ninguna estrategia de deleción doble mejora la cepa natural, y así sucesivamente. El resultado final es una lista ordenada, representada por la producción bioquímica deseada en el crecimiento óptimo, de diferentes estrategias de deleción que se diferencian entre sí como mínimo en una inactivación. Este procedimiento de optimización, así como la identificación de una amplia variedad de conjuntos de reacciones que, cuando se perturban, conducen a la biosíntesis, incluyendo la producción acoplada con el crecimiento, de un producto bioquímico. Con las enseñanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderán que los métodos y diseños de la ingeniería metabólica ilustrada en el presente documento se pueden aplicar análogamente para identificar nuevas rutas biosintéticas y/o al acoplamiento obligatorio entre el crecimiento de la célula o el microorganismo y cualquier producto bioquímico.

Los métodos anteriormente ilustrados e ilustrados adicionalmente en los Ejemplos siguientes permiten la construcción de las células y organismos que producen de forma biosintética, incluyendo el acoplamiento obligado entre la producción de un producto bioquímico deseado y el crecimiento de la célula u organismo diseñados para contener las alteraciones genéticas deseadas. En este sentido, se han identificado alteraciones genéticas que dan como resultado la biosíntesis de 4-HB y 1,4-butanodiol. Las cepas de microorganismos construidas con las alteraciones metabólicas identificadas producen niveles elevados de 4-HB o BDO en comparación con los microorganismos sin modificar. Estas cepas se pueden utilizar provechosamente para la producción comercial de 4-HB, BDO, THF y GBL, por ejemplo, en un proceso de fermentación continuo sin estar sometidas a presiones de selección negativa.

Por tanto, los métodos informáticos descritos en el presente documento permiten la identificación e implementación de modificaciones metabólicas que se identifican mediante un método in silico seleccionado para OptKnock o SimPheny. El conjunto de modificaciones metabólicas puede incluir, por ejemplo, la adición de una o más rutas enzimáticas biosintéticas y/o la perturbación funcional de una o más reacciones metabólicas entre las que se incluyen, por ejemplo, la perturbación por deleción del gen.

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enzima, en donde la una o más perturbaciones génicas transmiten una producción estable acoplada al crecimiento de 1,4-butanodiol en el microorganismo no natural. La una o más perturbaciones génicas pueden ser, por ejemplo, las descritas en la Tabla 6 o 7. La una o más perturbaciones génicas pueden comprender perturbaciones que comprenden una deleción del uno o más genes, tales como los genes divulgados en la Tabla 6 ó 7.

Como se divulga en el presente documento, el microorganismo no natural puede ser una bacteria, levadura u hongo. Por ejemplo, el microorganismo no natural puede ser una bacteria tal como Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida. El microorganismo no natural también puede ser una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, y Pichia pastoris.

Un microorganismo no natural de la divulgación puede comprender un conjunto de modificaciones metabólicas que acoplan obligatoriamente la producción de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, comprendiendo el conjunto de modificaciones metabólicas la perturbación de uno o más genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden adhE, ldhA, pflAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh; adhE, ldhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, ldhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; y adhE, ldhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk, o un ortólogo del mismo, en el que el microorganismo muestra una producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable.

En un aspecto, se divulga un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabólicas obligadas para acoplar la producción de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, comprendiendo el conjunto de modificaciones metabólicas la perturbación de uno o más genes, o un ortólogo del mismo, en el que el conjunto de modificaciones metabólicas comprende la perturbación de adhE y ldhA, en el que el microorganismo muestra una producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable. En un aspecto adicional, el conjunto de modificaciones metabólicas puede comprender además la perturbación de mdh. En otro aspecto, el conjunto de modificaciones metabólicas puede comprender además la perturbación de uno o más genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB, y gdhA y puede incluir, por ejemplo, la perturbación de sfcA y maeB. En otro aspecto más, el conjunto de modificaciones metabólicas puede comprender además la perturbación de uno o más genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, y gsk, incluyendo la perturbación de todos los pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE y ycdW, y puede comprender además la perturbación de prpC y gsk. Cualquiera de los conjuntos de modificaciones metabólicas anteriormente descritas puede comprender además la perturbación de pflAB. En un aspecto particular, el conjunto de modificaciones metabólicas comprende la perturbación de uno o más genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden adhE, ldhA, pflAB, mdh, y aspA, incluyendo hasta la totalidad de los genes adhE, ldhA, pflAB, mdh, y aspA.

Un microorganismo no natural descrito puede comprender además una ruta biosintética 1,4-butanodiol (BDO) que comprende al menos un ácido nucleico exógeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdehído succínico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el ácido nucleico exógeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4butanodiol (BDO), como se divulga en el presente documento.

Se proporciona adicionalmente un método para producir un microorganismo no natural que tiene una producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable identificando in silico un conjunto de modificaciones metabólicas que requieren la producción de 1,4-butanodiol durante el crecimiento exponencial bajo un conjunto definido de condiciones, y modificar genéticamente un microorganismo para que contenga el conjunto de modificaciones metabólicas que requieren la producción de 1,4-butanodiol. Dichos métodos pueden incluir adicionalmente la adición de genes exógenos que expresan las actividades enzimáticas deseadas en un microorganismo. Dicho conjunto de modificaciones metabólicas se puede identificar por un método in silico seleccionado entre OptKnock o SimPheny (véase anteriormente y los Ejemplos V-VII).

La divulgación describe adicionalmente un microorganismo producido con los métodos divulgados en el presente documento. Adicionalmente, se divulga un método para producir 1,4-butanodiol acoplado al crecimiento de un microorganismo. El método puede incluir las etapas de cultivar en la fase de crecimiento exponencial, en cantidad suficiente de nutrientes y medio, un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabólicas que acoplan obligatoriamente la producción de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, en el que el microorganismo muestra una producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable, y aislar el 1,4butanodiol producido a partir del microorganismo no natural. El conjunto de modificaciones metabólicas que comprende la perturbación de uno o más genes se puede seleccionar entre el conjunto de genes que comprenden adhE, ldhA, pflAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh; adhE, ldhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, ldhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, ldhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, ldhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, ldhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, ldhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; y adhE, ldhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk, o un ortólogo del mismo.

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barrera termodinámica. También se estudió si esta reacción se puede acercar a la factibilidad termodinámica variando las concentraciones supuestas de los metabolitos participantes. Por ejemplo, las energías de Gibbs estándar suponen concentraciones de 1 M para todos los compuestos participantes (excepto el agua). En un entorno anaerobio, NADH estará presente en una concentración varias veces superior a la de NAD. Suponiendo [NADH]=5×[NAD], los inventores calcularon el efecto sobre ΔGt' usando la ecuación

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Este cambio dio como resultado una diferencia de solo aproximadamente 1 kcal/mol en los valores de delta G para la semialdehído succínico deshidrogenasa. También se utilizó la ecuación 3 para calcular otros efectos sobre ΔGt, tales como una concentración de succinato elevada para impulsar las reacciones. Una diferencia de 1000 veces en las concentraciones de succinato y semialdehído succínico contribuyó a aproximadamente 5 kcal/mol a delta G. Tomado conjuntamente con una incertidumbre supuesta de 8 kcal/mol, la posibilidad de que la semialdehído succínico deshidrogenasa actúe en la dirección del semialdehído succínico en algún conjunto de condiciones fisiológicas no se puede eliminar. Así, los autores siguen considerando la ruta directa desde succinato hasta 4-HB en su análisis teórico posterior.

Se analizaron en dos microbios las capacidades de producción microbiana de 4-hidroxibutirato, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, usando los modelos metabólicos in silico de cada organismo. Las rutas potenciales para dar 4-HB progresan mediante un compuesto de succinato, succinil-CoA, o alfa-cetoglutarato como se muestra en la figura 2.

La primera etapa en la ruta de producción de 4-HB desde succinato implica la conversión de succinato en semialdehído succínico mediante un semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADH o NADPH. En

E. coli, gabD es una semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADP que forma parte de una agrupación de genes implicada en la captación y degradación del 4-aminobutirato (Niegemann et al., Arch. Microbiol. 160:454-460 (1993); Schneider et al., J. Bacteriol. 184:6976-6986 (2002)). Se cree que sad codifica el enzima para la actividad de la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NAD (Marek and Henson, más arriba). S. cerevisiae contiene solamente la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de NADPH, teóricamente asignada a UGA2, que se encuentra en el citosol (Huh et al., Nature 425:686-691 (2003)). Los cálculos del rendimiento máximo suponiendo la ruta del succinato para dar 4-HB tanto en E. coli como en S. cerevisiae requiere solamente la asunción de que se ha añadido una 4-HB deshidrogenasa no natural a sus redes metabólicas.

La ruta desde succinil-CoA hasta 4-hidroxibutirato se describe en la patente de Estados Unidos nº 6.117.658 como parte de un proceso para fabricar polihidroxialcanoatos que comprenden unidades monoméricas de 4-hidroxibutirato. Clostridium kluyveri es un ejemplo de organismo conocido que tiene actividad semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA (Sohling y Gottschalk, más arriba; Sohling y Gottschalk, más arriba). En este estudio, se supone que dicha enzima, derivada de C. kluyveri u otro organismo, se expresa en E. coli o S. cerevisiae junto con una 4-HB deshidrogenasa no natural o heteróloga para completar la ruta desde succinil-CoA hasta 4-HB. La ruta desde alfa-cetoglutarato hasta 4-HB se ha demostrado en E. coli dando como resultado la acumulación de poli(ácido 4-hidroxibutírico) hasta un 30% del peso celular seco (Song et al., más arriba). Como E. coli y S. cerevisiae tienen de forma natural o endógena glutamato:semialdehído succínico transaminasa y glutamato descarboxilasa (Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250 (2001)), la ruta desde AKG hasta 4-HB se puede completar en ambos organismos suponiendo solamente que está presente una 4-HB deshidrogenasa no natural.

EJEMPLO II

Producción de ácido 4-hidroxibutanoico en E. coli

Este Ejemplo describe los rendimientos biosintéticos del ácido 4-hidroxibutanoico resultantes de cada ruta bioquímica.

En esta sección, se calcularon los rendimientos teóricos máximos de 4-HB procedente de glucosa suponiendo que cada una de las tres rutas metabólicas representadas gráficamente en la figura 2 son funcionales en E. coli. Un modelo metabólico a escala genómica de E. coli, similar al descrito en Reed et al., Genome Biol. 4:R54 (2003), se usó como base para el análisis. Se calculó la ganancia energética, en términos de moléculas de ATP producidas, de cada ruta de rendimiento máximo suponiendo condiciones anaerobias, salvo que se indique otra cosa. Se supone que el 4-hidroxibutirato sale de E. coli mediante el mecanismo de cotransporte paralelo de protones, como es el caso de la mayoría de los ácidos orgánicos. Es también posible que GBL se secrete por difusión simple, y, en este caso, el rendimiento energético sería más favorable que en el caso considerado aquí. También se investigó el impacto de la especificidad del cofactor (es decir, la dependencia de NADH o NADPH) de los enzimas participantes sobre el rendimiento máximo y el rendimiento energético de cada ruta.

En las Tablas 3 A-C se muestran los resultados del análisis. Desde un punto de vista energético y de rendimiento, la ruta del succinato a 4-HB es la más prometedora con la condición que se puedan superar las preocupaciones termodinámicas planteadas en el Ejemplo I. Específicamente, los cálculos revelan que el rendimiento máximo teórico de 4-HB a partir de glucosa es de 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 moles C/moles C) suponiendo que la ruta de 4-HB a

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succinato es funcional. Además, la producción anaerobia de 4-HB mediante succinato daría como resultado una producción neta de 1,8, 1,5, o 1,1 mol de ATP por glucosa dependiendo de la especificidad del cofactor supuesta de los enzimas participantes. Estos rendimientos energéticos son comparables con los 2,0 ATP por glucosa que se pueden obtener mediante fosforilación del sustrato debido a la producción de etanol o lactato sugiriendo el potencial de la producción anaerobia de homo-4-HB en E. coli.

La ruta de la succinil-CoA de 4-HB es la segunda ruta más prometedora cuando se considera el rendimiento máximo y el rendimiento energético. Se puede conseguir en E. coli un rendimiento de 1,33 mol/mol de 4-HB si al menos una de las etapas de la ruta se supone dependiente de NADH. Sin embargo, como esta ruta requiere la formación de succinil-CoA, su rendimiento energético es considerablemente menor que el de la ruta del succinato. Se anticipa un requerimiento de oxígeno a altos rendimientos de 4-HB si se supone que las etapas de la semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA y de la 4-HB deshidrogenasa dependen de NADPH. En este caso, la producción de 4-HB en el rendimiento máximo no daría como resultado una ganancia neta de ATP y no podría soportar las demandas de mantenimiento energético necesarias para la supervivencia de E. coli. Por tanto, se podría originar algo de energía de la fosforilación oxidativa para permitir la producción homofermentativa de 4-HB. La ruta del alfa-cetoglutarato hacia 4-HB es la menos favorable de las tres rutas potenciales con un rendimiento máximo conseguible de 1,0 mol de 4-HB por mol de glucosa. Además del rendimiento máximo menor, esta ruta requiere la utilización de 1,5 moles de oxígeno por mol de glucosa convertido en 4-HB. El rendimiento energético de esta ruta no se ve afectado por la supuesta especificidad del cofactor de la 4-HB deshidrogenasa.

Tabla 3. La estequiometría global de conversión del sustrato a 4-HB suponiendo que las rutas de producción de A) succinato, B) succinil-CoA, o C) alfa-cetoglutarato son funcionales en E. coli. La glucosa y el oxígeno se captan mientras que el resto de moléculas se producen.

A) Ruta del succinato

Especificidad del cofactor: 2 etapas de NADH 1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH 2 etapas de NADPH

Glucosa: -1,000 -1,000 -1,000

Oxígeno: 0,000 0,000 0,000

Protones: 1,333 1,333 1,333

4HB: 1,333 1,333 1,333

CO2: 0,667 0,667 0,667

H2O: 0,667 0,667 0,667

ATP: 1,800 1,510 1,097

B) Ruta de la succinil-CoA

Especificidad del cofactor: 2 etapas de NADH 1 etapa de NADH 1 etapa de NADPH 2 etapas de NADPH 2 etapas de NADPH

Glucosa: -1,000 -1,000 -1,000 -1,000

Oxígeno: 0,000 0,000 -0,036 0,000

Protones: 1,333 1,333 1,325 1,294

4HB: 1,333 1,333 1,325 1,294

CO2: 0,667 0,667 0,698 0,082

H2O: 0,667 0,667 0,698 0,470

ATP: 0,467 0,177 0,000 0,000

C) Ruta del alfa-cetoglutarato

Especificidad del cofactor: 1 etapas de NADH 1 etapa de NADPH

Glucosa: -1,000 -1,000

Oxígeno: -1,500 -1,500

Protones: 1,000 1,000

4HB: 1,000 1,000

CO2: 2,000 2,000

H2O: 2,000 2,000

ATP: 5,500 5,500

A fin de corroborar las predicciones de cálculo propuestas en este informe, las cepas que expresan una ruta completa hacia 4-HB se pueden construir y someter a ensayo. La corroboración se lleva a cabo con E. coli (Ejemplo II) y S. cerevisiae (Ejemplo III). En E. coli, los genes relevantes se expresan en un operón sintético tras un promotor inducible en un plásmido con un número de copias medio o alto; por ejemplo, el promotor PBAD que se induce por arabinosa, en un plásmido de la serie pBAD (Guzman et al., J. Bacteriol. 177:4121-4130 (1995)). En S. cerevisiae, los genes se integran en el cromosoma tras del promotor PDC1, sustituyendo el gen natural de la piruvato carboxilasa. Se ha notificado que esto da como resultado una mayor expresión de los genes extraños que desde un plásmido (Ishida et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:1964-1970 (2005)), y garantizarán también la expresión durante las condiciones anaerobias.

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Tabla 8. Genes correspondientes a desactivar para evitar que se produzca una reacción concreta en E. coli.

Abreviatura de la reacción: Estequiometría de la reacción* Genes que codifican la(s) enzima(s) que catalizan cada reacción&

ACKr: [c]: ac + atp <==> actp + adp (b3115 o b2296 o b1849)

ACS: [c]: ac + atp + coa --> accoa + amp + ppi b4069

ACt6: ac[p] + h[p] <==> ac[c] + h[c] No asociada a ningún gen

ADHEr: [c]: etoh + nad <==> acald + h + nadh (b0356 o b1478 o b1241)

[c]: acald + coa + nad <==> accoa + h + nadh: (b1241 o b0351)

AKGD: [c]: akg + coa + nad --> co2 + nadh + succoa (b0116 y b0726 y b0727)

ASNS2: [c]: asp-L + atp + nh4 --> amp + asn-L + h + ppi b3744

ASPT: [c]: asp-L --> fum + nh4 b4139

ATPS4r: adp[c] + (4) h[p] + pi[c] <==> atp[c] + (3) h[c] + h2o[c] (((b3736 y b3737 y b3738) y (b3731 y b3732 y b3733 y b3734 y b3735)) o ((b3736 y b3737 y b3738) y (b3731 y b3732 y b3733 y b3734 y b3735) y b3739))

CBMK2: [c]: atp + co2 + nh4 <==> adp + cbp + (2) h (b0521 o b0323 o b2874)

EDA: [c]: 2ddg6p --> g3p + pyr b1850

ENO: [c]: 2pg <==> h2o + pep b2779

FBA: [c]: fdp <==> dhap + g3p (b2097 o b2925 o b1773)

FBP: [c]: fdp + h2o --> f6p + pi (b4232 o b3925)

FDH2: for[p] + (2) h[c] + q8[c] --> co2[c] + h[p] + q8h2[c] for[p] + (2) h[c] + mqn8[c] --> co2[c] + h[p] + mql8[c] ((b3892 y b3893 y b3894) o (b1474 y b1475 y b1476))

FRD2: [c]: fum + mql8 --> mqn8 + succ [c]: 2dmmql8 + fum --> 2dmmq8 + succ (b4151 y b4152 y b4153 and b4154)

FTHFD: [c]: 10fthf + h2o --> for + h + thf b1232

FUM: [c]: fum + h2o <==> mal-L (b1612 o b4122 o b1611)

G5SD: [c]: glu5p + h + nadph --> glu5sa + nadp + pi b0243

G6PDHy: [c]: g6p + nadp <==> 6pgl + h + nadph b1852

GLCpts: glc-D[p] + pep[c] --> g6p[c] + pyr[c] ((b2417 y b1101 y b2415 y b2416) o (b1817 y b1818 y b1819 y b2415 y b2416) o (b2417 y b1621 y b2415 y b2416))

GLU5K: [c]: atp + glu-L --> adp + glu5p b0242

GLUDy: [c]: glu-L + h2o + nadp <==> akg + h + nadph + nh4 b1761

GLYCL: [c]: gly + nad + thf --> co2 + mlthf + nadh + nh4 (b2904 y b2903 y b2905 y b0116)

HEX1: [c]: atp + glc-D --> adp + g6p + h b2388

ICL: [c]: icit --> glx + succ b4015

LDH_D: [c]: lac-D + nad <==> h + nadh + pyr (b2133 o b1380)

MALS: [c]: accoa + glx + h2o --> coa + h + mal-L (b4014 o b2976)

MDH: [c]: mal-L + nad <==> h + nadh + oaa b3236

ME2: [c]: mal-L + nadp --> co2 + nadph + pyr b2463

MTHFC: [c]: h2o + methf <==> 10fthf + h b0529

NADH12: [c]: h + mqn8 + nadh --> mql8 + nad b1109

[c]: h + nadh + q8 --> nad + q8h2

[c]: 2dmmq8 + h + nadh --> 2dmmql8 + nad

NADH6: (4) h[c] + nadh[c] + q8[c] --> (3) h[p] + nad[c] + q8h2[c] (4) h[c] + mqn8[c] + nadh[c] --> (3) h[p] + mql8[c] + nad[c] 2dmmq8[c] + (4) h[c] + nadh[c] --> 2dmmql8[c] + (3) h[p] + nad[c] (b2276 y b2277 y b2278 y b2279 y b2280 y b2281 y b2282 y b2283 y b2284 y b2285 y b2286 y b2287 y b2288)

PFK: [c]: atp + f6p --> adp + fdp + h (b3916 o b1723)

PFLi: [c]: coa + pyr --> accoa + for (((b0902 y b0903) y b2579) o (b0902 y b0903) o (b0902 y b3114) o (b3951 y b3952))

PGDH: [c]: 6pgc + nadp --> co2 + nadph + ru5p-D b2029

PGI: [c]: g6p <==> f6p b4025

PGL: [c]: 6pgl + h2o --> 6pgc + h b0767

PGM: [c]: 2pg <==> 3pg (b3612 o b4395 o b0755)

PPC: [c]: co2 + h2o + pep --> h + oaa + pi b3956

101 Tabla 9. Nombres de los metabolitos correspondientes a las abreviaturas utilizadas en la Tabla 8.

PPCK: [c]: atp + oaa --> adp + co2 + pep b3403

PRO1z: [c]: fad + pro-L --> 1pyr5c + fadh2 + h b1014

PYK: [c]: adp + h + pep --> atp + pyr b1854 o b1676)

PYRt2: h[p] + pyr[p] <==> h[c] + pyr[c] No asociada a ningún gen

RPE: [c]: ru5p-D <==> xu5p-D (b4301 o b3386)

SO4t2: so4[e] <==> so4[p] (b0241 o b0929 o b1377 o b2215)

SUCD4: [c]: q8 + succ --> fum + q8h2 (b0721 y b0722 y b0723 y b0724)

SUCOAS: [c]: atp + coa + succ <==> adp + pi + succoa (b0728 y b0729)

SULabc: atp[c] + h2o[c] + so4[p] --> adp[c] + h[c] + pi[c] + so4[c] ((b2422 y b2425 y b2424 y b2423) o (b0763 y b0764 y b0765) o (b2422 y b2424 y b2423 y b3917))

TAL: [c]: g3p + s7p <==> e4p + f6p (b2464 o b0008)

THD2: (2) h[p] + nadh[c] + nadp[c] --> (2) h[c] + nad[c] + nadph[c] (b1602 y b1603)

THD5: [c]: nad + nadph --> nadh + nadp (b3962 o (b1602 y b1603))

TPI: [c]: dhap <==> g3p b3919

Abreviatura del metabolito: Nombre del metabolito

10fthf: 10-Formiltetrahidrofolato

1pyr5c: 1-Pirrolina-5-carboxilato

2ddg6p: 2-Deshidro-3-desoxi-D-gluconato 6-fosfato

2dmmq8: 2-Demetilmenaquinona 8

2dmmql8: 2-Demetilmenaquinol 8

2pg: D-Glicerato 2-fosfato

3pg: 3-Fosfo-D-glicerato

6pgc: 6-Fosfo-D-gluconato

6pgl: 6-Fosfo-D-glucono-1,5-lactona

ca: Acetato

acald: Acetaldehído

accoa: Acetil-CoA

actp: Acetil fosfato

adp: ADP

akg: 2-Oxoglutarato

amp: AMP

asn-L: L-Asparagina

asp-L: L-Aspartato

atp: ATP

cbp: Carbamoil fosfato

co2: CO2

coa: Coenzima A

dhap: Dihidroxiacetona fosfato

e4p: D-Eritrosa 4-fosfato

etoh: Etanol

f6p: D-Fructosa 6-fosfato

fad: Flavina adenina dinucleótido oxidado

fadh2: Flavina adenina dinucleótido reducido

fdp: D-Fructosa 1,6-bisfosfato

de: Formiato

fum: Fumarato

g3p: Gliceraldehído 3-fosfato

g6p: D-Glucosa 6-fosfato

glc-D: D-Glucosa

glu5p: L-Glutamato 5-fosfato

glu5sa: L-Glutamato 5-semialdehído

glu-L: L-Glutamato

glx: Glioxilato

gly: Glicina

h: H+

h2o: H2O

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principal de la fermentación. A destacar que se prevé que el succinato sea el producto de fermentación principal de la red natural y se supone la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa.

Las Tablas 10 y 11 listan reacciones cuya deleción afecta negativamente el rendimiento máximo de BDO en una

5 cepa intermedia, denominada como AB3, que carece de ADHEr, LDH_D, y PFLi, así como una cepa que carece de ASPT y MDH además de las deleciones de AB3. A destacar que las deleciones sugeridas otorgan gran importancia a la obtención de piruvato deshidrogenasa, citrato sintasa, y actividad de aconitasa en condiciones completamente anaerobias. Si se puede conseguir suficiente actividad piruvato deshidrogenasa, una alternativa es dejar PFLi intacto y complementar su actividad con una formiato deshidrogenasa no natural que captura un equivalente reductor

10 mientras convierte el formiato en dióxido de carbono.

La Figura 8 y la Tabla 12 representan gráficamente los intervalos de flujo que la red de E. coli puede conseguir cuando alcanza bien el rendimiento máximo de BDO (casos 1-4) o el rendimiento máximo de biomasa (caso 5) en condiciones anaerobias. Los casos 1 y 2 suponen que no se han producido deleciones de genes. El caso 2 muestra

15 intervalos de flujo más restringidos que el caso 1 porque se ha impuesto una restricción adicional que refuerza el rendimiento máximo de BDO. Los casos 3 y 4 son análogos a los casos 1 y 2, salvo que los flujos codifican las reacciones de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi se han ajustado a cero. En el caso 5 se muestran los intervalos de flujo, suponiendo una maximización del rendimiento de biomasa en presencia de desactivaciones de ADHE, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi.

20 La Tabla 12 muestra los intervalos de flujos metabólicos centrales que se pueden conseguir en condiciones anaerobias suponiendo que la PEP carboxiquinasa es reversible. Los valores de flujo en negrita se configuran como restricciones del sistema. Se consideran cinco casos: Caso 1, rendimiento máximo de BDO de la red natural; Caso 2, rendimiento máximo de ATP suponiendo rendimiento máximo de BDO de la red natural; Caso 3, rendimiento

25 máximo de BDO de la red con flujos a través de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero; Caso 4, rendimiento máximo de ATP suponiendo el rendimiento máximo de BDO de la red con flujos a través de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero; y Caso 5, rendimiento máximo de biomasa de la red con flujos a través de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero.

30 Tabla 12. Intervalos de flujos metabólicos centrales que se pueden conseguir en condiciones anaerobias suponiendo que la PEP carboxiquinasa es reversible. Las reacciones que se suponen inactivas en los casos 3, 4, y 5 se indican en negrita.

CASO 1: CASO 2 CASO 3 CASO 4 CASO 5

Abreviatura de la reacción: MIN MAX MIN MAX MIN MAX MIN MAX MIN MAX

mmol/gDW/h

GLCpts: 0,0 20,0 18,2 18,2 0,0 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

HEX1: 0,0 20,0 1,8 1,8 0,0 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0

G6PDHy: 0,0 27,3 0,0 0,0 0,0 15,3 0,0 0,0 0,0 0,0

PGL: 0,0 27,3 0,0 0,0 0,0 15,3 0,0 0,0 0,0 0,0

PGDH: 0,0 27,3 0,0 0,0 0,0 15,3 0,0 0,0 0,0 0,0

RPE: -6,4 18,2 0,0 0,0 -6,2 10,2 0,0 0,0 -0,2 -0,2

RPI: -9,1 0,0 0,0 0,0 -6,2 0,0 0,0 0,0 -0,2 -0,2

TKT1: -3,2 9,1 0,0 0,0 -3,1 5,1 0,0 0,0 -0,1 -0,1

TKT2: -3,2 9,1 0,0 0,0 -3,1 5,1 0,0 0,0 -0,2 -0,2

TAL: -3,2 9,1 0,0 0,0 -3,1 5,1 0,0 0,0 -0,1 -0,1

EDA: 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 10,5 0,0 0,0 0,0 0,0

PGDHY: 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 10,5 0,0 0,0 0,0 0,0

PGI: -7,3 20,0 20,0 20,0 4,7 20,0 20,0 20,0 20,0 20,0

FBP: 0,0 15,9 0,0 0,0 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 0,0

PFK: 7,3 35,9 20,0 20,0 9,5 32,7 20,0 20,0 19,7 19,7

FBA: 7,3 20,0 20,0 20,0 9,5 20,0 20,0 20,0 19,7 19,7

TPI: 7,3 20,0 20,0 20,0 9,5 20,0 20,0 20,0 19,7 19,7

GAPD: 27,3 40,0 40,0 40,0 29,5 40,0 40,0 40,0 39,3 39,3

PGK: 27,3 40,0 40,0 40,0 29,5 40,0 40,0 40,0 39,3 39,3

PGM: 27,3 43,6 40,0 40,0 29,5 43,6 40,0 40,0 39,0 39,0

ENO: 27,3 43,6 40,0 40,0 29,5 43,6 40,0 40,0 39,0 39,0

PYK: 0,0 29,5 0,0 0,0 0,0 29,5 1,8 1,8 10,7 10,7

PDH: 0,0 34,5 14,5 18,2 12,0 34,5 21,8 21,8 30,1 30,1

PFLi: 0,0 11,9 0,0 3,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

PPC: 0,0 15,9 0,0 0,0 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 0,0

PPCK: 5,5 51,4 21,8 21,8 5,5 30,9 18,2 18,2 8,1 8,1

CS: 9,1 34,1 18,2 18,2 13,1 32,7 18,2 18,2 7,5 7,5

CITL: 0,0 15,9 0,0 0,0 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 0,0

ACONT: 9,1 21,8 18,2 18,2 13,1 21,8 18,2 18,2 7,5 7,5

ICDHy: 1,8 21,4 18,2 18,2 1,8 21,3 14,5 14,5 0,2 0,2

AKGD: 0,0 21,4 0,0 18,2 0,0 21,3 0,0 14,5 0,0 0,0

112

CASO 1: CASO 2 CASO 3 CASO 4 CASO 5

Abreviatura de la reacción: MIN MAX MIN MAX MIN MAX MIN MAX MIN MAX

mmol/gDW/h

SUCOAS: 0,5 20,0 3,6 3,6 0,6 20,0 7,3 7,3 14,9 14,9

FRD: 0,0 12,7 3,6 3,6 0,0 8,7 3,6 3,6 7,5 7,5

FUM: -55,5 12,7 -14,5 3,6 -5,1 8,7 3,6 3,6 7,2 7,2

MDH: -50,9 33,2 -14,5 3,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

ICL: 0,0 18,2 0,0 0,0 0,0 18,2 3,6 3,6 7,2 7,2

MALS: 0,0 16,4 0,0 0,0 0,0 16,4 3,6 3,6 7,2 7,2

ME: 0,0 29,5 0,0 0,0 0,0 12,7 0,0 0,0 0,0 0,0

ASPTA: 0,0 66,7 0,0 18,2 0,0 7,5 0,0 0,0 0,6 0,6

ASPT: 0,0 66,7 0,0 18,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

LDH_D: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

ADHEr: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

PTAr: 5,9 37,7 21,8 21,8 9,1 34,5 21,8 21,8 0,1 0,1

ACKr: 5,9 37,7 21,8 21,8 9,1 34,5 21,8 21,8 0,1 0,1

GLUDc: 0,0 21,4 0,0 18,2 0,0 21,3 0,0 14,5 0,0 0,0

ABTA: 0,0 21,4 0,0 18,2 0,0 21,2 0,0 14,5 0,0 0,0

SSAL_coa: 0,5 37,7 3,6 21,8 0,6 34,5 7,3 21,8 14,8 14,8

ATPM: 0,0 15,9 15,9 15,9 0,0 12,7 12,7 12,7 7,6 7,6

BDOsyn: 21,8 21,8 21,8 21,8 21,8 21,8 21,8 21,8 14,8 14,8

1/h

BIOMASA: 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,21 0,21

Los dos primeros diseños de cuatro deleciones (nº 92 y nº 93) relacionados en la Tabla 7 (esto es, PEP carboxiquinasa supuesta reversible) se consideran más adelante debido a sus rendimientos de BDO previstos relativamente elevados. El diseño nº 92 (ADHEr, HEX1, PFLi, y PGI) necesitaría desactivaciones adicionales que 5 eliminaran la producción de succinato y lactato y el rendimiento máximo de BDO del diseño nº 93 (ADHEr, EDA, NADH6, PGI) solamente fue el 90% del máximo teórico de la red natural. Ambos diseños requieren la eliminación de PGI que, como se ha mencionado anteriormente, se descartó por indeseable debido a la importancia prevista de la glucolisis sobre la fermentación. El diseño nº 98 (ADHEr, ATPS4r, FDH2, NADH6) fue el primer diseño de cuatro deleciones que requiere la eliminación de la ATP sintasa sin requerir adicionalmente la desactivación de PGI. Sin

10 embargo, este diseño también requeriría la deleción de genes para evitar la producción de lactato y succinato para aumentar el rendimiento de BDO previsto a crecimiento máximo. Tras análisis posterior, se descubrió que casi todos los diseños prometedores de la Tabla 7 se podían mejorar garantizando que las deleciones (es decir, ADHEr, LDH_D, MDH, ASPT, y PFLi) también se habían implementado, si no se había especificado ya.

15 Los siguientes esfuerzos se centraron a continuación en identificar las deleciones de reacciones que pudieran suministrar el conjunto fundamental (esto es, ADHEr, LDH_D, MDH, ASPT, PFLi). La Tabla 13 muestra genes de E. coli conocidos responsables de catalizar las reacciones diana para su eliminación. La designación “[c]” se refiere a citosólico. Los genes que codifican estas reacciones, junto las reacciones del conjunto fundamental, se proporcionan en la Tabla 13. El efecto de las deleciones adicionales sobre los límites de la solución de BDO versus biomasa se

20 muestra en la figura 9. De forma notable, el acoplamiento entre el BDO y la producción de biomasa se vuelve cada vez más pronunciado a medida que se acumulan deleciones adicionales. El rendimiento de BDO previsto a crecimiento máximo tras acumular todas las deleciones es de 0,46 g/g. Finalmente, ninguna de las deleciones afectó negativamente el rendimiento teórico máximo de BDO.

25 Tabla 13. Genes de E. coli conocidos responsables de catalizar las reacciones diana para su eliminación.

Abreviatura de la reacción: Estequiometría de la reacción Genes que codifican la(s) enzima(s) que catalizan cada reacción&

ADHEr: [c]: etoh + nad <==> acald + h + nadh [c]: acald + coa + nad <==> accoa + h + nadh (b0356 o b1478 o b1241) (b1241 o b0351)

MDH: [c]: mal-L + nad <==> h + nadh + oaa b3236

ASPT: [c]: asp-L --> fum + nh4 b4139

LDH_D: [c]: lac-D + nad <==> h + nadh + pyr (b2133 o b1380)

DHAPT: [c]: dha + pep --> dhap + pyr (b1200 y b1199 y b1198 y b2415 y b2416)

DRPA: [c]: 2dr5p --> acald + g3p b4381

PYK: [c]: adp + h + pep --> atp + pyr (b1854 o b1676)

EDD: [c]: 6pgc --> 2ddg6p + h2o b1851

GLYCLTDx: [c]: glx + h + nadh --> gliclt + nad (b3553 o b1033)

GLYCLTDy: [c]: glx + h + nadph --> glyclt + nadp

113

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Claims

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