ES2259049T3 - Hidrolizados de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un hidrolizado de proteínas: - que puede obtenerse por la hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas; - que comprende aminoácidos libres y péptidos; - en el cual la fracción molar de al menos un amino-ácido libre, presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres; - en el cual la fracción molar del al menos un amino-ácido libre en el hidrolizado de proteínas es al menos 25%; y - en el cual el cociente de aminoácidos (AAQ) en el hidrolizado de proteínas es de al menos 10%.

Description

Hidrolizados de proteínas.

Campo de la invención

La presente invención describe hidrolizados de proteínas y su uso en composiciones alimenticias.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a hidrolizados de proteínas y su uso en alimentos.

Proteínas hidrolizadas procedentes de una diversidad de fuentes se utilizan ampliamente en la industria alimentaria. Por ejemplo, aquéllas se emplean comúnmente como un componente en sopas deshidratadas, como saborizantes y en otros alimentos elaborados para obtener v.g. saborizadores de alimentos después de una reacción de Maillard. Aquéllas encuentran también uso médico como suplementos dietéticos para pacientes que sufren una diversidad de enfermedades y trastornos metabólicos. Desarrollos relativamente nuevos son su uso en productos para consumidores con necesidades no médicas tales como los atletas o gente sometida a una dieta de adelgazamiento y en aplicaciones de cuidado personal. Adicionalmente, proteínas hidrolizadas in situ juegan un papel importante en el desarrollo de sabores en productos alimenticios fermentados. En los últimos productos, los cultivos iniciadores microbianos utilizados excretan usualmente enzimas proteolíticas responsables de la hidrólisis de la materia prima a aminoácidos. La transformación metabólica de estos aminoácidos conduce a compuestos con sabores potentes y materias volátiles características v.g. de productos lácteos fermentados tales como queso o yogures, diversos productos cárnicos, cervezas y vinos.

Aunque los hidrolizados de proteínas convencionales se preparan sometiendo la fuente de proteínas a condiciones clínicas severas, ha surgido un interés creciente en la obtención de tales hidrolizados por hidrólisis enzimática. Tanto la ruta química como la enzimática están encaminadas a liberar niveles elevados de aminoácidos a partir de la fuente de proteínas con eficiencia máxima y coste mínimo. Por dicha razón, fuentes de proteínas disponibles a precios económicos tales como harina de soja y gluten de trigo son sustratos populares para la preparación de hidrolizados. Para liberar tantos aminoácidos como sea posible, la ruta enzimática emplea o bien mezclas complejas de varias endo- y exoproteasas (v.g. la Solicitud de Patente Internacional WO 94/25580) o combina endoproteasas con una exoproteasa simple pero de amplio espectro (Solicitud de Patente Internacional WO-A-98/27827). En todos los casos, la finalidad es obtener un alto grado de hidrólisis y un producto final que contiene una gran diversidad de aminoácidos
libres.

El documento EP-A-0495391 describe un proceso de hidrólisis de proteínas que utiliza endo- y exoproteasas con la temperatura de 5-75ºC y pH 3-9. La tasa de hidrólisis se controla para controlar la cantidad de MCDP.

Mingawa et al (Journal of Food Science 1989, vol 54, 1225-1229) describe un hidrolizado de caseína que contiene una cantidad elevada de leucina.

Aunque los aminoácidos libres como tales pueden suscitar cierto número de impresiones de sabor, estas impresiones de sabor son muy básicas (amargo, dulce, agrio y "umami") y las concentraciones de aminoácidos requeridas para percibir estos sabores son altas. Valores umbral para aminoácidos individuales pueden variar desde 0,3 a 80 milimoles/litro. A pesar de estos altos valores umbral, los aminoácidos libres pueden crear efectos sensoriales importantes en gamas de concentración mucho menores por varios mecanismos.

Uno de estos mecanismos implica glutamato libre y puede crear fuertes efectos intensificadores del sabor debido a la sinergia entre glutamato y 5'-ribonucleótidos. Si se combina con concentraciones apropiadas de 5'-ribonucleótidos tales como 5'-IMP y 5'-GMP, se sabe que el umbral de detección del sabor umami generado por el glutamato se reduce casi en dos órdenes de magnitud.

Otro mecanismo de intensificación del sabor implica reacciones de Maillard. Comparados con los aminoácidos libres, los productos Maillard en los cuales se han hecho reaccionar aminoácidos libres con azúcares exhiben características de sabor y olor mucho más acusadas. En las reacciones de Maillard pueden desarrollarse sistemas de sabor y olor extraordinariamente complejos con valores umbral que son varias órdenes de magnitud menores que los registrados para los aminoácidos libres.

Los productos Maillard se forman a temperaturas elevadas usualmente durante la cochura, el horneado o la tostadura cuando se preparan los alimentos. Durante estos tratamientos, se desarrollan simultáneamente color y una gran diversidad de aromas. En estas reacciones, los grupos amino reaccionan con compuestos reductores como un primer paso que conduce finalmente a una familia entera de caminos de reacción. En los alimentos, los compuestos amino implicados son predominantemente aminoácidos libres y proteínas, y los compuestos reductores representan fundamentalmente azúcares reductores. Factores que influyen en la reacción de Maillard incluyen el tipo de azúcar y aminoácido implicados, así como factores físicos tales como el pH, la temperatura, la actividad de agua (aw), el tiempo de reacción, etcétera.

Tanto los mono- como los disacáridos pueden tomar parte en la reacción de Maillard. Hablando en términos generales, las aldosas son más reactivas que las cetosas y las pentosas más que las hexosas o disacáridos, etcétera, en tanto que el tipo de azúcar influye fuertemente en la cantidad de compuestos saborizantes generada, y el aminoácido implicado en la reacción determina en gran parte la naturaleza de sabor formado. Por ejemplo, la inclusión de metionina pura en los sistemas de reacción de Maillard conduce a menudo a notas de reminiscencias vegetales o de estofado, la cisteína pura conduce a sabores de tipo carne, la prolina, hidroxiprolina y leucina puras conducen a aromas de repostería (R.F. Hurrell, Food Flavours, Part A: Introduction, Elsevier Scientific Publishing Company, compiladores: I.D. Morton y A.J. Macleod). Dado que estos resultados se han obtenido utilizando aminoácidos puros en lugar de mezclas de varios aminoácidos, como sucede en los ingredientes alimenticios, es evidente que el resultado representa solamente una simplificación aproximada de la situación natural. Análogamente, los azúcares que existen naturalmente en los alimentos causarán cierto impacto, y complicarán y afectarán adicionalmente al desarrollo del sabor y el aroma.

Aparte de las reacciones de Maillard, los aminoácidos pueden sufrir también importantes transiciones químicas a las temperaturas del ambiente. Las transiciones del último tipo dependen de enzimas y son muy comunes en alimentados fermentados tales como cerveza, yogur, curación del queso, y procesos de maduración de la carne y del vino. En estos procesos de fermentación, se liberan aminoácidos libres a partir de las materias primas utilizadas por la actividad de enzimas proteolíticas de la materia prima o de los iniciadores microbianos utilizados. Durante la fase de maduración, la actividad metabólica microbiana convierte luego los aminoácidos libres en derivados con propiedades sensoriales incrementadas. Por ejemplo, L-leucina, L-isoleucina y L-valina conducen a la formación de alcoholes valiosos de tipo fúsel tales como alcoholes amílicos e isobutanol en la fermentación de la cerveza. La L-leucina es conocida como el precursor para compuestos cárnicos curados tales como 3-metilbutanal y 3-metilbutanol, en tanto que la L-fenilalanina puede conducir a benzacetaldehído. Análogamente, materias volátiles del queso tales como metanotiol y disulfuro de dimetilo han sido atribuidas a la presencia de metionina en el queso así como ácido metilpropanoico y metilpropanal a la valina. En conformidad con ello, el método de "fermentación sobre las heces" utilizado en la fabricación del vino y que se sabe genera vinos con sabor más intenso, puede adscribirse a la presencia incrementada de amino-ácidos tales como ácido aspártico, arginina, alanina, leucina y lisina.

Los procesos de la técnica anterior para hidrólisis de proteínas (documento WO 94/25580 y WO 98/27827) están encaminados a liberar todos los aminoácidos disponibles y la presencia de tantos aminoácidos diferentes hará más confusa la nota de sabor o aroma pronunciada deseada en el producto final.

El documento WO98/14599 se refiere a ciertos polipéptidos obtenidos de Aspergillus oryzae y a hidrolizados preparados con estos polipéptidos en combinación con endopeptidasas (específicas o inespecíficas) y exopeptidasas (específicas o inespecíficas). El documento WO98/14599 menciona hidrolizados que tienen un contenido incrementado de Leu, Gly, Ala y/o Pro, tales como 1,1 veces mayores, pero no se mencionan usos para tales hidrolizados.

La solicitud de patente europea EP-A-799577 describe un hidrolizado de proteínas de lactosuero en el cual el contenido de Phe (fenilalanina) está reducido. Este hidrolizado de proteínas de lactosuero se utiliza como alimento para pacientes afectados de PKU (fenilcetonuria).

Voigt et al (Food Chemistry 51 (1994) pp. 7-14) describe la producción de los precursores de aroma específico de cacao por proteólisis in vitro de proteínas de semillas. Precursores de aroma específico de cacao pueden obtenerse únicamente por hidrólisis específica de un solo sustrato, que está constituido por proteínas globulínicas de la clase de la vicillina del cacao.

Descripción de la invención

De acuerdo con la presente invención, el efecto de sabor deseado puede obtenerse si la fracción molar de un solo aminoácido libre deseado en el hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención es al menos 2,5 veces mayor (factor de enriquecimiento) que lo se habría obtenido por hidrólisis ácida del mismo sustrato que contuviera las proteínas. Se demuestra por la presente invención que tales hidrolizados de proteínas pueden obtenerse por ciertas combinaciones de enzimas, a menudo con un sustrato que contiene la proteína seleccionada.

La presente invención proporciona entre otros un hidrolizado de proteínas:

-

que puede obtenerse por la hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas;

-

que comprende aminoácidos libres y péptidos;

-

en el cual la fracción molar de al menos un aminoácido libre, presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres, por lo que el factor de enriquecimiento es al menos 2,5, preferiblemente al menos 3 y más preferiblemente al menos 3,5;

-

en el cual la fracción molar del al menos un aminoácido libre en el hidrolizado de proteínas es al menos 25%; y

-

en el cual el cociente de aminoácidos (AAQ) en el hidrolizado de proteínas es de al menos 10%.

La invención se refiere adicionalmente a una composición alimenticia que comprende un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención.

La presente invención se refiere adicionalmente a un proceso para preparar un hidrolizado de proteínas, proceso que comprende:

-

hidrolizar en condiciones acuosas a una temperatura de 5 a 75ºC, y a un pH de 3 a 9, un sustrato que contiene proteínas con una endoproteasa y una exoproteasa, con lo cual la acción combinada de endoproteasa y exoproteasa deja en libertad al menos un aminoácido libre del sustrato que contiene proteínas, e incubar la endoproteasa y la exoproteasa durante un período de tiempo adecuado para obtener un hidrolizado de proteínas, en el cual la fracción molar de al menos un aminoácido libre presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres;

-

en el cual la fracción molar del al menos un aminoácido libre en el hidrolizado de proteínas es al menos 25%; y

-

en el cual el cociente de aminoácidos (AAQ) en el hidrolizado de proteínas es al menos 10%.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un hidrolizado de proteínas caracterizado porque es o bien:

(a)

un hidrolizado de proteínas de lactosuero o hidrolizado de proteínas de maíz que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%;

(b)

un hidrolizado de proteínas de lactosuero que comprende una fracción molar de lisina libre de al menos 25%;

(c)

un hidrolizado de proteínas de soja que comprende una fracción molar de arginina libre de al menos 25%;

(d)

un hidrolizado de proteínas de soja que comprende una fracción molar de lisina libre de al menos 25%;

(e)

un hidrolizado de hemoglobina que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%; o

(f)

un hidrolizado de proteínas de seroalbúmina bovina (BSA) que comprende una fracción molar de glutamato libre de al menos 25%.

En general, el AAQ será menor que 40%, estando comprendido preferiblemente el AAQ entre 15 y 30%. En general, la fracción molar del al menos un aminoácido es menor que 80%, estando comprendida preferiblemente esta fracción molar entre 25 y 50%, y más preferiblemente entre 25 y 40%.

Preferiblemente, la hidrólisis del sustrato que contiene proteínas es una hidrólisis enzimática, más preferiblemente una hidrólisis enzimática por una endoproteasa y una exoproteasa.

Se ha encontrado que composiciones alimenticias que comprenden los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención obtienen un sabor mejorado v.g. después que han sido fermentadas, procesadas, cocinadas y/o después de reaccionar con azúcares reductores.

La fracción molar de un cierto aminoácido libre en una composición se define como la concentración molar de dicho aminoácido libre en la composición, dividida por la suma de las concentraciones molares de todos los amino-ácidos libres alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina y valina en la misma composición, multiplicada por 100%. En esta memoria descriptiva, por el total de todos los aminoácidos se entiende el total de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina y valina.

La determinación de la fracción molar de un cierto aminoácido libre en la composición hidrolizada enzimáticamente así como de un cierto aminoácido libre en una composición obtenida por hidrólisis completa del sustrato que contiene proteínas se describe en la sección de Materiales y Métodos.

Adicionalmente, el total de las cantidades de Gln y Glu libres, así como de Asn y Asp libres, respectivamente, que se liberan durante la hidrólisis enzimática, se han tomado para permitir la comparación con la cantidad de Glu y Asp libres obtenidas después de la hidrólisis completa con ácido fuerte (la hidrólisis ácida desamida los residuos Gln y Asn, dando como resultado Glu libre y Asp libre "adicionales"). En general, para Glu y Gln, la suma de las fracciones molares de Glu y Gln es al menos un factor 2,5 (factor de enriquecimiento), preferiblemente al menos un factor 3, y más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que la suma de las fracciones molares de Glu y Gln en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres. Por el factor de enriquecimiento de un aminoácido libre se entiende la fracción molar del aminoácido libre presente en un hidrolizado de proteínas dividida por la fracción molar del aminoácido libre en un hidrolizado de proteínas que está hidrolizado completamente a aminoácidos libres. En el caso que se conoce la relación Glu/Gln, por ejemplo en el caso de una sola cadena proteínica (véase por ejemplo el Ejemplo 8) pueden calcularse por separado Glu y Gln. Para Asp y Asn, la suma de las fracciones molares de Asp y Asn es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que la suma de las fracciones molares de Asp y Asn en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres. En la presente invención, la expresión "hidrolizado completamente a aminoácidos libres" o "hidrolizar completamente un sustrato que contiene proteínas a aminoácidos libres" hace referencia a la hidrólisis ácida del sustrato que contiene proteínas realizada de acuerdo con el método de Waters (Milford MA, EE.UU.), método que se ha descrito en la sección de Materiales y Métodos.

Los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención se caracterizan por la presencia de ciertos aminoácidos libres en fracciones molares relativamente altas. Por esta razón, el grado de hidrólisis global de estos hidrolizados de proteínas es todavía limitado. A lo largo de esta solicitud de patente, se utiliza el Cociente de Aminoácidos (AAQ) para cuantificar una medida del grado de hidrólisis. AAQ es la cantidad total de aminoácidos libres presente en un hidrolizado obtenido por hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas referida a la cantidad total de aminoácidos presente en un hidrolizado obtenido por hidrólisis completa del sustrato que contiene proteínas a aminoácidos libres. AAQ se expresa como porcentaje. AAQ puede calcularse dividiendo la suma de las concentraciones molares de todos los aminoácidos libres presentes en un hidrolizado por la suma de las concentraciones molares de todos los amino-ácidos presentes en el hidrolizado cuando el sustrato que contiene proteínas se hidroliza completamente a aminoácidos libres (x 100%). Los hidrolizados de proteínas de la invención pueden tener valores AAQ que oscilan desde 10 a 50%, preferiblemente desde 10 a 40%.

Los aminoácidos preferidos son aquellos aminoácidos capaces de generar compuestos con sabor deseable, compatible con los alimentos (sabor y aroma). Por ejemplo, se sabe que por calentamiento con el azúcar apropiado, la glicina puede dar lugar a un perfil de sabor semejante a caldo de carne, la leucina a un perfil de sabor semejante a chocolate o corteza de pan, la fenilalanina a un perfil de sabor semejante a chocolate o caramelo, y la lisina a un perfil de sabor semejante a patata o carne hervida.

Los hidrolizados de proteínas enriquecidos en un aminoácido o una serie de aminoácidos específico(s) de acuerdo con la invención en combinación con un azúcar seleccionado pueden utilizarse para impartir un perfil de sabor específico a un alimento o ingrediente de alimentos. Este perfil de sabor específico puede generarse durante la fase de cochura, horneado o asado de la preparación alimenticia como ocurre por ejemplo durante la cocción del pan, especialmente en la corteza (en donde se ha añadido un hidrolizado de proteínas de la invención a la masa o sobre la masa). Sin embargo, el hidrolizado de proteínas y un azúcar apropiado pueden también hacerse reaccionar previamente (en ausencia de los otros ingredientes alimenticios) para obtener un ingrediente saborizante adecuado.

La conversión de los aminoácidos libres en compuestos con sabor por la acción de microorganismos está considerablemente menos bien documentada que las conversiones que implican reacciones de Maillard. Aunque se han indicado muchos aminoácidos en el desarrollo de aromas de productos fermentados tales como queso, salchichas fermentadas y cervezas, se sabe que son particularmente importantes aminoácidos hidrófobos tales como valina, leucina, isoleucina y fenilalanina así como aminoácidos que contienen azufre tales como metionina. Durante el envejecimiento del vino, son particularmente llamativos los niveles elevados de arginina, lisina y alanina libres.

Así, particularmente Gly, Leu, Val, Pro, Phe, Met y Lys son compuestos que se sabe proporcionan, después de calentamiento con un azúcar apropiado, compuestos con sabores deseables. Adicionalmente, Val, Leu, Ile, Phe, Met, Arg, Lys y Ala se describen como aminoácidos que, después de fermentación por el microorganismo apropiado, pueden convertirse asimismo en compuestos con sabor. Así, en una realización preferida de la invención, el aminoácido libre se selecciona de Glu, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Pro, Met, Lys, Arg, His, Gly, Ala, Ser o Thr, seleccionándose más preferiblemente el aminoácido de Glu, Pro, Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Pro, Met, Phe, Lys o Arg, y seleccionándose muy preferiblemente el aminoácido de Glu, Leu, Pro, Phe, Lys o Arg.

Sustratos que contienen proteínas que pueden utilizarse de acuerdo con la invención son materiales que contienen proteínas adecuados para consumo humano o animal. Preferiblemente, el contenido de proteínas del material que contiene proteínas es sustancial, lo que significa que al menos 20% p/p es proteína. Preferiblemente, el sustrato que contiene proteínas contiene al menos 40% de proteína, más preferiblemente al menos 50%, y muy preferente al menos 70% de proteína basado en peso/peso seco.

Ejemplos de sustratos que contienen proteínas que pueden utilizarse de acuerdo con la invención incluyen proteínas vegetales tales como proteína de soja, gluten de trigo, proteína de semilla de colza, proteína de guisante, proteína de alfalfa, proteína de girasol, proteína de habichuela fabácea, proteína de semilla de algodón o de sésamo, proteína de maíz, proteína de cebada, proteína de sorgo, proteína de patata, proteína de arroz, proteínas de café, y proteínas derivadas de origen animal tales como proteína de leche (v.g. caseína, proteínas de lactosuero), clara de huevo, proteínas de pescado, proteínas de carne con inclusión de gelatina, colágeno, proteína de sangre, (v.g. hemoglobina), pelo, plumas y harina de pescado. Sustratos preferidos que contienen proteínas incluyen proteínas de lactosuero, hemoglobina, gelatina, caseína, proteína de maíz, proteína de soja y gluten.

Dado que los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención están enriquecidos selectivamente en amino-ácidos específicos, es evidente que se prefieren los sustratos que contienen proteínas que pertenecen también a los ingredientes regulares de los productos finales relevantes (composiciones alimenticias). Adicionalmente, sustratos que contienen proteínas que son excepcionalmente ricos en aminoácidos específicos son fuentes preferidas para los hidrolizados de proteínas. Ejemplos típicos de los últimos sustratos que contienen proteínas son proteínas de lactosuero (rica en Leu y Lys), gluten de trigo (rico en Gln y Pro), gluten de trigo desamidado químicamente (rico en Glu y Pro), proteína de maíz (rica en Leu y Pro), hemoglobina (rica en Leu, His y Val), concentrado de pescado o caseína (rico(a) en Met y Lys), cacahuete (rico en Arg), proteína de arroz (rica en Phe y Arg) o fracción proteínica como por ejemplo la fracción de 1lactoalbúmina de lactosuero, que es rica en triptófano. Los hidrolizados de proteínas obtenidos pueden proporcionar sabores a composiciones alimenticias, y preferiblemente estos sabores no se asocian con el sustrato que contiene proteínas. V.g. se espera que un hidrolizado de proteínas de cacao sea adecuado para proporcionar un sabor de cacao, mientras que no se espera que un hidrolizado de proteínas de lactosuero o arroz pueda proporcionar un sabor de cacao. Así, preferiblemente los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención proporcionan sabores nuevos e inesperados que no están relacionados con la fuente del sustrato que contiene proteínas. Por ejemplo, un hidrolizado de proteínas de lactosuero proporciona v.g. un sabor de carne, queso o cacao en lugar de un sabor de proteínas de lactosuero.

Los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención pueden obtenerse por hidrólisis del sustrato que contiene proteínas con endo-proteasas y exo-proteasas adecuadas. Mientras que los procesos de hidrólisis enzimática de proteínas de la técnica anterior utilizan típicamente mezclas brutas de varias endo- y exoproteasas con especificidad amplia (documentos WO9425580; WO9827827), el proceso de hidrólisis de acuerdo con la presente invención requiere selección cuidadosa de combinaciones de endo- y exo-proteasa(s). Las endo- y exo-proteasas adecuadas para generar un hidrolizado de proteínas por hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas, estando dicho hidrolizado de proteínas enriquecido al menos 2,5 veces en ciertos aminoácidos en comparación con el hidrolizado ácido de dicho sustrato que contiene proteínas, tienen preferiblemente una preferencia para la escisión adyacente a un cierto residuo de aminoácido o cierto conjunto seleccionado de residuos de aminoácidos. Adicionalmente, tanto las endo- como las exo-proteasas adecuadas para generar un hidrolizado de proteínas por hidrólisis enzimática de un sustrato de proteínas, estando dicho hidrolizado de proteínas enriquecido al menos 2,5 veces en ciertos aminoácidos en comparación con el hidrolizado ácido de proteínas de dicho sustrato que contiene proteínas, son preferiblemente puras, lo que significa que la endo- y/o exo-proteasa está constituida principalmente, al menos en un 60%, preferiblemente al menos en un 75%, más preferiblemente al menos en un 90% y muy preferiblemente al menos en un 95%, por una sola actividad proteolítica. Dependiendo del grado de selectividad de la exopeptidasa, se requiere una endoproteasa pura o menos pura. Dependiendo del grado de selectividad de la endoproteasa, se requiere una exopeptidasa pura o menos pura. La selectividad de la endo- y exo-proteasa debería solaparse al menos para obtener los hidrolizados de proteínas deseados. Así, por ejemplo, para obtener un hidrolizado de proteínas cuyo aminoácido libre leucina es al menos un factor 2,5 veces mayor que para el hidrolizado ácido del mismo sustrato que contiene proteínas, se requieren endo- y exoproteasas que tienen cierta selectividad hacia la leucina. Pueden obtenerse proteasas de alta pureza por ejemplo por purificación de preparaciones de enzimas proteolíticas brutas, o por producción de la enzima utilizando cepas superproductoras de DNA recombinante. Las proteasas adecuadas en la presente invención son preferiblemente recombinantes y/o están disponibles comercialmente para aplicaciones de grado alimentario. Las proteasas producidas utilizando técnicas de rDNA, es decir clonación del gen codificante de la actividad proteolítica en un organismo hospedador que sobre-expresa este gen, proporcionan usualmente preparaciones enzimáticas que comprenden actividades enzimáticas menos contaminantes y por consiguiente pueden no requerir pasos costosos de recuperación. Organismos hospedadores bien conocidos que sobre-expresan genes clonados incluyen levaduras, hongos o bacterias (por ejemplo Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Trichoderma, E. coli, Bacillus,
etc.).

Con objeto de obtener hidroxilados de proteínas de acuerdo con la invención, el sustrato que contiene proteínas puede hidrolizarse utilizando una combinación de una endo- y una exoproteasa, en donde al menos una de la endo- o exoproteasa, preferente tanto la endo como la exoproteasa, son puras y selectivas para una serie específica de aminoácido(s) o liberan preferentemente el o los aminoácidos, que se desea enriquecer en el hidrolizado de proteínas.

Las endoproteasas adecuadas pueden proceder de material animal, vegetal o microbiano. Las mismas incluyen enzimas recombinantes, v.g. enzimas obtenidas por técnicas de ingeniería genética. Endoproteasas selectivas preferidas, que tienen preferencia para la escisión adyacente a ciertos aminoácidos, incluyen tripsina (EC 3.4.21.4), elastasa (EC 3.4.21.36), quimotripsina (EC 3.4.21.1), termolisina (EC 3.4.24.27), prolil-oligopeptidasa (EC 3.4.21.26), glutamil-endopeptidasa I (EC 3.4.21.19), colagenasa microbiana (EC 3.4.24.3), peptidil-Asp-metalopeptidasa (EC 3.4.24.33), glicil-endopeptidasa (EC 3.4.22.25), sacarolisina (EC 3.4.24.37), proteasa neutra (EC 3.4.24.28), estreptogrisina B (EC 3.24.21.81), glutamil-endopeptidasa II (EC 3.4.21.82), peptidil-prolil-isomerasas cis-trans específicas de prolina modificadas por ingeniería genética y enzimas con especificidad de tipo cuajo, por ejemplo cuajo microbiano, v.g. pepsina de Mucor (EC 3.4.23.23). Endo-proteasas no selectivas preferidas, que no tienen una referencia acusada para escisión adyacente a aminoácidos específicos, pero que escinden en posición casi adyacente a un grupo de aminoácidos seleccionado, incluyen por ejemplo subtilisina (EC 3.4.21.14) y papaína (EC 3.4.22.2).

Exopeptidasas (o exoproteasas, términos que son intercambiables) adecuadas pueden incluir carboxipeptidasas y/o aminopeptidasas. Estas exoenzimas pueden originarse de material animal, vegetal o microbiano. Las mismas incluyen enzimas recombinantes, obtenidas v.g. por técnicas de ingeniería genética.

Carboxipeptidasas selectivas preferidas, que tienen preferencia para escindir en posición adyacente a ciertos aminoácidos, incluyen carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2), CPD-I (pep G) y CPD-II (pep F) de A. niger (Dal Degan, et al., Appl. Environ Microbiol, 58(7): 2144-2152, 1992).

Carboxipeptidasas no selectivas preferidas, que no tienen una preferencia acusada para escindir en posición adyacente a ciertos aminoácidos, pero que escinden en posición prácticamente adyacente a cualquier residuo de aminoácido, incluyen CPD-S_{1}, de P. janthinellum y CPD-Y de S. cerevisiae (Dal Degan, et al, Appl. Environ Microbial, 58(7): 2144-2152, 1992).

Aminopeptidasas selectivas preferidas, que tienen preferencia para escindir en posición adyacente a ciertos aminoácidos, incluyen proliliminopeptidasa (EC 3.4.11.5), leucil-aminopeptidasa bacteriana de Aeromonas proteolytica (EC 3.4.11.10) o leucil-aminopeptidasa de especies de Aspergillus, y metionil-aminopeptidasa (EC 3.4.11.18) y las aminopeptidasas específicas de fenilalanina que se describen en el documento EP 773990.

Aminopeptidasas no selectivas preferidas, que no tienen una preferencia acusada para escindir en posición adyacente a ciertos aminoácidos, pero que escinden en posición prácticamente adyacente a cualquier aminoácido, incluyen aminopeptidasa termófila (EC 3.4.11.12).

Combinaciones preferidas de endo- y exoproteasas incluyen:

(a)

estreptogrisina B o endoproteasa tripsina o papaína con CPD II (para liberar Arg o Lys);

(b)

quimotripsina o termolisina o proteasa neutra con CPD I (para liberar Tyr, Phe o Trp);

(c)

termolisina o proteasa neutra con leucil-aminopeptidasa bacteriana o leucil-aminopeptidasa de Aspergillus (para liberar Leu, Ile, Phe o Val);

(d)

proteasa neutra o subtilisina con CPD I (para liberar Phe o Ala);

(e)

elastasa con CPD I (para liberar Ala);

(f)

proteasas semejantes a cuajo con o leucil-aminopeptidasa de Aspergillus o metionil-aminopeptidasa (para liberar Met); y

(g)

peptidil-prolil cis-trans isomerasa específica de prolina, modificada por ingeniería genética (ciproasa) con prolil-amino-peptidasa (para liberar Pro);

(h)

endoproteasa específica de prolina con enzimas de malta o CPD-Y (para liberar Pro);

(i)

glutamil-endopeptidasa con CPD-I (para liberar Glu).

Para obtener hidrolizados de proteínas con aminoácidos en su forma más enriquecida y con características de sabor óptimas, la combinación preferida de endo- y exoproteasa podría combinarse con el sustrato que contenga proteínas apropiado o seleccionado. Por incubación de combinaciones de enzimas selectivas preferidas con sustratos que contienen proteínas que son relativamente ricos en uno o más aminoácidos deseados, pueden establecerse combinaciones enzima-sustrato preferidas.

Combinaciones preferidas de enzimas y sustratos, para obtener hidrolizados de proteínas enriquecidos incluyen:

(a)

proteínas de lactosuero con tripsina o papaína más una carboxi-peptidasa CPD II (para enriquecer en Lys o Arg), o proteínas de lactosuero con termolisina más una aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica u otra leucil-aminopeptidasa (para enriquecer en Leu);

(b)

proteína de maíz con termolisina más una leucil-aminopeptidasa (para enriquecer en Leu);

(c)

proteína de arroz con termolisina más leucil-aminopeptidasa de Aspergillus (para liberar Phe y Leu); y

(d)

gluten con peptidil-prolil cis-trans isomerasa específica de prolina modificada por ingeniería genética (ciproasa) y prolil-amino-peptidasa (para liberar Pro);

(e)

proteína de cereales con termolisina más una leucina-aminopeptidasa (para enriquecer en Leu);

(f)

aislado de proteína de soja con tripsina o papaína más una carboxi-peptidasa CPD II (para enriquecer en Arg y Lys);

(g)

BSA con glutamil-endopeptidasa y CPD-I (para liberar Glu);

(h)

hemoglobina con termolisina más leucil-aminopeptidasa (para enriquecer en Leu).

Combinaciones de sustrato y enzimas (endo- y exo-proteasas) pueden dar como resultado por ejemplo los hidrolizados de proteínas siguientes:

-

un hidrolizado de proteínas de lactosuero que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%, preferiblemente al menos 27%, más preferiblemente al menos 30%, o una fracción molar de lisina libre de, preferiblemente al menos 25%, preferiblemente al menos 35%, más preferiblemente al menos 40%;

-

un hidrolizado de proteína de cereales que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%, preferiblemente al menos 30%, más preferiblemente al menos 35%;

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un hidrolizado de proteína de soja que comprende una fracción molar de arginina libre de al menos 25%, preferiblemente al menos 30%, o una fracción molar de lisina libre de al menos 25%;

-

hidrolizado de BSA que comprende una fracción molar de glutamato libre de al menos 25%;

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un hidrolizado de hemoglobina que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%, preferiblemente l menos 30%, más preferiblemente al menos 35%.

Los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por incubación de los sustratos que contienen proteínas con las enzimas apropiadas, endo- y exoproteasa, en condiciones de pH y temperatura adecuadas para la hidrólisis de proteínas. El pH y las temperaturas adecuados dependen de las condiciones óptimas de las proteasas que pueden variar desde aproximadamente pH 3 a 9 y temperatura desde aproximadamente 5 a 75ºC. Excepcionalmente, condiciones fuera de estos intervalos pueden ser óptimas para las enzimas.

Las enzimas y condiciones para hidrólisis de las proteínas se seleccionan a fin de obtener el hidrolizado de proteínas deseado de la invención. V.g., cuando se desea obtener un hidrolizado de proteínas de lactosuero enriquecido en leucina, se selecciona un sustrato de proteínas de lactosuero y se hidroliza con endo- y exoproteasas específicas de leucina en condiciones adecuadas para que las endo- y exoproteasas liberen específicamente la leucina de la proteínas de lactosuero. V.g., la proteínas de lactosuero se hidroliza durante 5 horas con termolisina y leucil-aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica a un pH de 8 a 40ºC, para obtener un hidrolizado de proteínas de lactosuero en el cual la fracción molar de leucina libre presente en el hidrolizado de proteína es al menos un factor 2,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato de proteínas delactosuero que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres. Para obtener, a fines de comparación, un hidrolizado de proteínas de lactosuero que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres, se hidrolizó la proteínas de lactosuero en medio ácido de acuerdo con Waters (Milford, MA, EE.UU.; véase la sección de Materiales y Métodos).

Para obtener un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención, el sustrato que contiene proteínas se añade a agua para obtener una suspensión acuosa. El sustrato que contiene proteínas puede añadirse en una cantidad que varía desde 1 a 18%, preferiblemente desde 3 a 15%, más preferiblemente desde 5 a 13% en peso seco de sustrato que contiene proteínas/peso de suspensión total. La cantidad puede depender de la solubilidad del sustrato que contiene proteínas en agua. La endo- y exoproteasa pueden estar presentes ya en el agua a la que se añade el sustrato que contiene proteínas, o la endo- y exoproteasa pueden añadirse después que se ha preparado la suspensión acuosa del sustrato que contiene proteínas. El sustrato que contiene proteínas, endo- y exoproteasa pueden incubarse juntos, o la exoproteasa puede incubarse después de la incubación del sustrato que contiene proteínas con la endoproteasa, en cuyo caso opcionalmente la endoproteasa se ha desactivado antes que se haya iniciado la incubación de la exoproteasa. Las condiciones de temperatura, pH y análogas se ajustan preferiblemente antes de añadir las enzimas al agua o la suspensión. Una vez que las enzimas (endo- y exoproteasas) y el sustrato que contiene proteínas están en contacto directo, se inicia la hidrólisis de las proteínas. Durante la hidrólisis de las proteínas, el pH puede regularse o no a un pH constante. Si el pH se regula a un pH constante (o a un pH que se mantiene dentro de un intervalo preescrito), el pH puede ajustarse, v.g. por adición de cualquier ácido o álcali compatible con los alimentos. Por ejemplo, puede utilizarse hidróxido de sodio o potasio como álcali compatible con los alimentos, y puede utilizarse ácido clorhídrico como ácido compatible con los alimentos.

Una vez que el hidrolizado de proteínas deseado se ha obtenido en la suspensión acuosa, preferiblemente se detiene la hidrólisis de las proteínas por desactivación de las enzimas presentes. La desactivación puede efectuarse por disminución del pH por debajo de 5 o aumento del pH por encima de 8 en combinación con calentamiento de la suspensión por encima de al menos 70ºC, preferiblemente al menos 90ºC. Excepcionalmente pueden requerirse condiciones que se encuentran fuera de estos intervalos para desactivar las proteasas. Sin embargo, la desactivación no debería afectar a los aminoácidos y péptidos presentes en la suspensión acuosa. Una persona experta en la técnica puede seleccionar las condiciones óptimas para desactivar las proteasas.

La suspensión acuosa que comprende el hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención se tratará preferiblemente a continuación a fin de obtener un concentrado de proteínas en la forma de, por ejemplo, un polvo o pasta. La suspensión acuosa que comprende el hidrolizado de proteínas puede, v.g., centrifugarse y/o (ultra)filtrarse, y concentrarse a continuación v.g. por evaporación, y secarse opcionalmente de cualquier manera conveniente, tal como secado por pulverización, liofilización, tratamiento en lecho fluidizado, o una combinación de estos métodos. La persona experta en la técnica comprenderá que el método seleccionado dependerá de la formulación del producto (y de su uso ulterior). V.g., si se desea que el hidrolizado de proteínas se combine con un azúcar específico para inducir un producto específico de reacción después de calentamiento, el hidrolizado de proteínas no se expondrá entonces a condiciones severas que pudieran inducir reacciones de Maillard indeseables (prematuras). Si el hidrolizado de proteínas va a utilizarse en un proceso de fermentación de alimentos, entonces las condiciones utilizadas para recuperación del hidrolizado de proteínas no deberían afectar a los aminoácidos libres que generarán los sabores deseados después de la fermentación. El producto hidrolizado de proteínas final se formula preferiblemente en una forma concentrada tal como por ejemplo un líquido concentrado, una pasta, un polvo o un granulado. El producto concentrado comprende al menos 20% de materia seca (peso de materia seca/peso total), preferiblemente al menos 30% de materia seca (peso de materia seca/peso total) más preferiblemente al menos 40% de materia seca (peso de materia seca/peso total). Un granulado o polvo comprende al menos 80% de materia seca (peso de materia seca/peso total), preferiblemente al menos 90% de materia seca (peso de materia seca/peso total).

Alternativamente, la suspensión acuosa obtenida después de la hidrólisis de las proteínas que comprende el hidrolizado de proteínas puede utilizarse directamente en la preparación de sabores resultantes de la reacción o sabores resultantes de la fermentación. Por ejemplo, en la preparación de un sabor resultante de la reacción, la suspensión acuosa que comprende el hidrolizado de proteínas, v.g. después de centrifugación, o concentración, puede complementarse con un azúcar y calentarse después. Después de la reacción, puede obtenerse una composición de sabores resultantes de la reacción, v.g. por concentración y/o secado del producto calentado. En la preparación de un sabor resultante de la fermentación, la suspensión acuosa que comprende el hidrolizado de proteínas, v.g. después de centrifugación, o concentración, puede incubarse con un microorganismo de grado alimentario, en condiciones adecuadas para que el microorganismo fermente el hidrolizado de proteínas. Después de la fermentación, puede obtenerse un sabor resultante de la fermentación, v.g. por concentración y/o secado del producto fermentado.

Hidrolizados de proteínas que comprenden los amino-ácidos libres y péptidos obtenidos después de la hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas, utilizando endoproteasa y exoproteasa, en los cuales la fracción molar de al menos un aminoácido libre presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres, pueden utilizarse en varias aplicaciones con inclusión de alimentos. Los hidrolizados de proteínas de la invención pueden utilizarse por ejemplo en formulaciones cosméticas para el tratamiento del cabello o la piel, o pueden añadirse a bebidas para deportes a fin de mejorar la recuperación de la resistencia física. Particularmente, los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención son adecuados para uso en la preparación de alimentos, alimentos fermentados y sabores de alimentos fermentados, y para uso en la preparación de composiciones con sabores resultantes de la reacción, en las cuales el hidrolizado de proteínas se hace reaccionar con un azúcar para obtener una composición de sabor resultante de la reacción. Pueden obtenerse características de sabor notables y extraordinarias cuando los hidrolizados de proteínas de la invención se utilizan en las preparaciones de alimentos anteriores. Así, un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención es preferiblemente capaz de mejorar el sabor de una composición alimenticia.

El hidrolizado de proteínas de la invención puede utilizarse en la preparación de ingredientes o productos alimenticios fermentados como se ha descrito arriba. Los ingredientes o productos alimenticios fermentados se preparan por al menos un paso de fermentación, en el cual enzimas endógenas al alimento tratado están implicadas activamente o microorganismos de grado alimentario se incuban con un producto alimenticio para obtener el producto alimenticio fermentado. Ejemplos de productos alimenticios fermentados son por ejemplo productos cárnicos tales como jamones, salchichas o yogur, queso, cerveza, whisky, vino y champán. Los sabores de alimentos fermentados son sabores obtenidos de un producto alimenticio fermentado. Estos sabores de alimentos fermentados pueden obtenerse por incubación del hidrolizado de proteínas de la invención con un microorganismo de grado alimentario, que fermentará el hidrolizado de proteínas para obtener sabores de alimentos deseables.

Un proceso para obtener un producto alimenticio fermentado, en el cual se ha utilizado un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención, implicará la adición del hidrolizado de proteínas antes, o durante la fermentación de dicho producto alimenticio fermentado. Las enzimas endógenas del producto o los organismos de fermentación convertirán el aminoácido específico en sabores adicionales característicos para este tipo de alimento fermentado. Asimismo, pueden producirse de este modo sabores no característicos de este tipo de productos alimenticios fermentados, dando como resultado productos alimenticios fermentados con nuevos sabores sorprendentes.

El producto alimenticio fermentado puede ser por ejemplo queso, y el aminoácido libre cuya fracción molar es al menos 2,5 veces mayor que la del hidrolizado ácido es Met, Leu o Phe. En este caso, el hidrolizado de proteínas enriquecido en aminoácidos puede añadirse a la leche inmediatamente antes o durante el proceso de coagulación de la leche. Para minimizar las pérdidas de los aminoácidos libres presentes, el hidrolizado puede añadirse algo más tarde en el proceso de producción. Por ejemplo, en la producción del queso Cheddar, el hidrolizado puede añadirse directamente junto con la sal a la cuajada desmenuzada. Análogamente, los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención pueden incorporarse en Quesos Modificados con Enzimas para acelerar adicionalmente la formación de aromas de queso naturales. Para la mejora de dichos productos lácteos, el hidrolizado de proteínas se deriva preferiblemente de proteínas de leche tales como caseína o lactosuero.

El producto alimenticio fermentado puede ser cerveza, y el aminoácido libre cuya fracción molar es al menos 2,5 veces mayor que la del hidrolizado ácido es Leu, Ile o Val. En este caso, el hidrolizado de proteínas puede obtenerse de proteína de arroz, cebada o maíz (v.g., para las cervezas rubias a fin de mejorar los perfiles de aromas del producto final) o puede obtenerse a partir de gluten de trigo (v.g. para cervezas de trigo a fin de mejorar el perfil de aromas del producto final). En la producción de las cervezas, los hidrolizados de proteínas enriquecidos en aminoácidos pueden añadirse inmediatamente después de la centrifugadora turbulenta ("whirlpool") o centrífuga y aguas arriba del recipiente en el que tiene lugar la fermentación por la levadura de cerveceros.

El producto alimenticio fermentado puede ser también un producto cárnico fermentado o curado para el cual el hidrolizado de proteínas puede obtenerse a partir de una proteína de carne o sangre y el aminoácido libre cuya fracción molar es al menos 2,5 veces mayor que la del hidrolizado ácido puede ser Leu, Ile, Phe, Lys, His, Pro o Gly. Con los productos cárnicos fermentados, el hidrolizado de proteínas puede incorporarse junto con los otros compuestos tales como sal y dextrosa o con el cultivo iniciador microbiano. Con los productos cárnicos curados, el hidrolizado de proteínas puede utilizarse para producir una "infusión" por disolución del hidrolizado junto con cantidades apropiadas de glucosa, sal y nitrito. La inoculación con una mezcla adecuada de ácido y microorganismos productores de aromas tales como Lactobacilli y Staphylococcus carnosus genera una infusión aromática después de unos cuantos días de incubación a temperaturas entre 10 y 22ºC. Después de la adición de difosfato para neutralizar el valor ácido del pH, la infusión puede inyectarse en la carne, v.g. un jamón. La cocción de la carne, preferiblemente en una bolsa que mantenga confinados los aromas, proporciona finalmente como resultado un producto sabroso e inocuo. Para estimular la formación de compuestos con sabores de materias volátiles a partir del hidrolizado de proteínas enriquecido en aminoácidos, son indispensables cepas iniciadoras microbianas adecuadas. El hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención puede utilizarse también en combinación con sal nitrito para preparar jamón curado seco.

El hidrolizado de proteínas de la invención puede utilizarse en la preparación de sabores resultantes de la reacción. El hidrolizado de proteínas y una composición que comprende azúcar se hacen reaccionar luego para obtener la composición de sabor resultante de la reacción. Los azúcares pueden seleccionarse, v.g., de aldosas y cetosas así como disacáridos tales como xilosa, xilulosa, glucosa, fructosa, maltosa, sacarosa o mezclas de los mismos.

El hidrolizado de proteínas y al menos un azúcar reductor se calientan para iniciar una serie de reacciones conocidas como las reacciones de Maillard. Los grupos amino (particularmente de aminoácidos libres) reaccionan con compuestos reductores como primer paso. Ello irá seguido de una serie entera de otros caminos de reacción, y finalmente dará como resultado una composición con sabor resultante de la reacción (compleja). Por el uso del hidrolizado de proteínas de acuerdo con la invención, pueden obtenerse nuevos tipos de sabores. Estos sabores (resultantes de la reacción) pueden añadirse a los productos alimenticios a fin de mejorar el sabor de los mismos. Para preparar el sabor resultante de la reacción, el hidrolizado de proteínas enriquecido en aminoácidos y el azúcar deseado se disuelven en agua en una relación apropiada y se calientan luego. Después de la disipación de toda el agua, el proceso de calentamiento puede detenerse inmediatamente o puede continuarse hasta alcanzar temperaturas próximas a 120ºC o incluso 180ºC. Las condiciones de incubación finales conducen a perfiles de sabores y aromas muy diferentes. Finalmente, el producto seco y resultante de la reacción puede recuperarse como un polvo y utilizarse como ingrediente de saborización.

Alternativamente, un hidrolizado de proteínas y azúcar pueden hacerse reaccionar en mezclas que contienen agua y v.g. aceite o grasa, o en ausencia total de agua, v.g. por disolución de azúcar e hidrolizado en un sistema esencialmente anhidro tal como por ejemplo un polialcohol. La ventaja de este último enfoque es que incluso a temperaturas superiores a 100ºC la reacción tiene lugar en un líquido y asimismo el producto final es un líquido que facilita la dosificación del ingrediente saborizante.

Materiales y Métodos

La proteína de soja aislada se obtuvo como Soyamin 90 HV de Lucas Meyer (Hamburgo, Alemania).

El gluten de cereales (gluten de maíz) se obtuvo como Maisin 13875 de Cerestar (Krefeld, Alemania).

La proteínas de lactosuero se obtuvo como WPC 80 o WPC 75 de Havero Hoogwegt (Gorinchem, Países Bajos).

La hemoglobina se obtuvo como HGP "po-feed" (aproximadamente 90% de proteínas) de Harimex (Loenen, Países Bajos).

La seroalbúmina bovina se obtuvo como polvo de Fracción V de pureza 98% de Sigma-Aldrich.

K. lactis (ATCC 8585) se obtuvo de ATCC: American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE.UU.; el cultivo iniciador Bitec LS-25 Plus contiene una mezcla de lactobacilli y Staphylococcus carnosus y está disponible comercialmente de Gewürzmüller; Doetinchem, Países Bajos. La levadura utilizada en los experimentos de cocción del pan se obtuvo como levadura en bloque reciente de DSM Gist, Delft, Países Bajos. El cultivo iniciador de queso DS 5 LT1 se obtuvo también de DSM Gist.

Las enzimas se adquirieron y utilizaron como tales o se obtuvieron como muestras de laboratorio con o sin pasos de purificación adicionales. La aminopeptidasa de Aeromonas y la termolisina se adquirieron de Sigma. La aminopeptidasa de Aeromonas tal como se adquirió tenía una actividad de 50-150 (Sigma) unidades por mg de proteína. Se preparó una solución stock que contenía 15,3 mg de sólidos (tal como se obtuvo) por ml de agua, lo que corresponde a una actividad de 630 unidades Sigma/ml. La termolisina tal como se adquirió tenía una actividad de 50-100 unidades (Sigma) por mg de proteína. Se preparó una solución stock que contenía 50 mg de sólidos (tal como se obtuvo) por ml de agua, lo que corresponde a una actividad de 2200 unidades Sigma/ml. La tripsina (200 FIP-U/g) se adquirió de Merck (Darmstadt, Alemania) y se dosificó como el polvo seco.

La termoasa C160 (termolisina) (lote no. P9EB761) de 1.650.000 PU (unidades de proteasa)/gramo se obtuvo de Daiwa Kasei KK (Osaka, Japón).

La Corolasa LAP (leucil-aminopeptidasa de Aspergillus) (lote 1999-07-20) con una actividad de 350.000 unidades LAP/gramo se obtuvo de Röhm Enzyme (Darmstadt, Alemania).

La Collupulina (papaína) con una actividad de aproximadamente 5000 NF/miligramo se obtuvo de DSM Gist (Seclin, Francia).

La glutamilendopeptidasa de B. intermedius se aisló a partir de un cultivo de B. Subtilis como ha sido descrito por Shevelev, A.B. et al en Plasmid (2000), 43(3), 190-199. La actividad de la enzima purificada hacia Z-Glu-pNA en las condiciones descritas era aproximadamente 1 unidad por miligramo.

La carboxipeptidasa CPD-II (PepF) se obtuvo del filtrado de cultivo de una cepa de A. niger superproductora que contenía copias múltiples del gen pepF. Utilizando la información de la secuencia de pepF como se ha publicado (van den Hombergh et al. (1994) Gene 151, 73-79) se diseñaron iniciadores oligonucleotídicos que fusionan directamente el promotor de glucoamilasa (glaA) de A. niger más secuencias 5' no codificantes, al gen estructural pepF del codón de iniciación ATG hasta el codón de parada TAA, utilizando reacciones PCR conocidas por las personas expertas en la técnica. Ejemplos análogos de fusiones de genes estructurales al promotor de glucoamilasa han sido descritos (documentos EP-A-0 420 358, EP-A-0 463 706 y WO 99/38956). En primer lugar, el gen estructural pepF se amplificó por PCR de DNA cromosómico de A. niger GAM4 (CBS513.88) y se purificó. En segundo lugar, la región promotora del gen glaA se amplificó por PCR utilizando, en el extremo 3', un iniciador que solapa el extremo 5' del gen estructural pepF. En tercer lugar, se fusionaron los dos fragmentos PCR por PCR de fusión con un iniciador oligonucleotídico 5' del promotor glaA, y un iniciador oligonucleotídico que solapaba el codón de parada de pepF en la dirección inversa. En cuarto lugar, el fragmento de fusión resultante se clonó en el vector de expresión de A. niger pGBTOP8 (documento WO 99/38956), dando como resultado un plásmido de fusión que contenía el promotor glaA, el gen estructural PepF y el terminador glaA. Este plásmido se digirió con Not I y se cotransformó con pGBBAAS-1, digerido con Xho I, para dar A. niger GAM4 (CBS513.88), esencialmente como se describe en el documento WO 99/38956. Los transformantes seleccionados para crecimiento sobre placas de acetamida se analizaron utilizando PCR de colonias para comprobar la presencia de la casete de expresión pepF, utilizando técnicas conocidas. Se cultivaron transformantes PepF de A. niger en matraces de sacudidas utilizando el método que se ha descrito previamente (documento WO 99/38956). Después de crecimiento durante 6 días a 34ºC, el cultivo se sometió a ultrafiltración para separar el micelio. La enzima CPD II se purificó utilizando una versión simplificada del método descrito por Dal Degan et al (Appl. Environ. Microbiol. 58(7) pp 2144-2152 (1992)). Después de dilución con una cantidad adecuada de tampón A, el ultrafiltrado se aplicó a una columna Q Sepharose FF en un sistema Akta. El tampón A era tampón de fosfato 50 mM de pH 6,0 y el tampón B era tampón de fosfato 50 mM de pH 6,0 que contenía NaCl 1 M. La elución se realizó con un gradiente desde 10% tampón B (en tampón A) a 50% tampón B (en tampón A). Las fracciones activas se agruparon sobre la base de actividad enzimática para el péptido sintético FA-Ala-Lys-OH (Bachem) a pH 4,1. La actividad de la enzima final, sustancialmente purificada era 1176 U/ml y se ensayó sobre FA-Ala-Lys-OH 5 mM en acetato de sodio 50 mM/EDTA 1 mM de pH 4,1. La tasa de hidrólisis se midió a 331 nm durante minutos a 25ºC. Una unidad se define como 1 micromol de tampón escindido por minuto.

Se aisló la carboxipeptidasa CPD-I (PepG) de un caldo de cultivo de A. niger de acuerdo también con F. Dal Degan et al. (Appl. Environ. Microbiol., 58 (7), pp 2144-2152 (1992) con la excepción de que se omitió el paso de CABS-Sepharose. Se estableció que la actividad de la enzima final, sustancialmente purificada era 150 unidades/ml sobre FA-Phe-Ala-OH (Bachem) a pH 4,5 y 25ºC utilizando el protocolo de medida de actividad para esta enzima tal como fue proporcionado.

La aminopeptidasa II de Bacillus stearothermophilus (cepa NCIMB 8924) se aisló de acuerdo con el procedimiento descrito por Stoll et al., (BBA 438 (1976) 212-220). La pureza de la enzima se ensayó por electroforesis en gel en condiciones naturales y desnaturalizantes (SDS). La identidad de la enzima aislada se confirmó por degradación Edman de 9 aminoácidos del extremo aminoterminal de la enzima. La enzima se activó por la adición de CoCl2. Utilizando el reactivo de Lowry, se estimó que la concentración de proteína de la solución enzimática final era 7,2 mg de proteína por ml. Utilizando leucina-p-nitroanilida como sustrato, se estableció que la actividad de exopeptidasa de esta solución era 420 unidades por ml. El ensayo de activad se llevó a cabo a pH 7,2 con 3 milimoles por litro de sustrato durante 15 minutos a 25ºC, y la absorción se midió a 400 nanómetros contra una muestra en blanco.

Determinación de las concentraciones molares de los aminoácidos libres en un hidrolizado

Las incubaciones enzimáticas con los diversos sustratos proteínicos se llevaron a cabo con agitación en condiciones de pH y temperatura especificadas en los ejemplos. Las incubaciones se terminaron después de los intervalos de tiempo indicados por centrifugación a la velocidad máxima disponible durante 15 minutos en una centrífuga Eppendorf o en un equipo Hereaus Megafuge 3.0 R para eliminar cualquier sustrato proteínico no disuelto. Subsiguientemente se ajustó el pH del sobrenadante claro y se calentó luego a 95ºC para destruir cualquier actividad proteolítica residual. Cualquier precipitado adicional formado se separó por otra centrifugación. Después de la eliminación, el sobrenadante claro se mantuvo congelado hasta que pudo llevarse a cabo el análisis de aminoácidos. Alternativamente, el sobrenadante claro se liofilizó para permitir ensayos ulteriores en experimentos de aplicación.

El análisis de aminoácidos se llevó a cabo sobre el sobrenadante claro de acuerdo con el método PicoTag como se especifica en el manual de operadores del Sistema de Análisis de Aminoácidos de Waters (Milford, MA, EE.UU.). El análisis de aminoácidos se realizó inmediatamente después de descongelar el material muestra. A este fin, se obtuvo una muestra adecuada del líquido fundido, se añadió a ácido diluido y se homogeneizó. Se tomó una nueva muestra de la última solución, se secó y se derivatizó utilizando isotiocianato de fenilo. Los diversos aminoácidos derivatizados presentes se cuantificaron utilizando métodos de HPLC.

Determinación de las concentraciones molares de los aminoácidos libres en un hidrolizado que está completamente hidrolizado a aminoácidos libres

La hidrólisis ácida de los hidrolizados de proteínas para obtener aminoácidos libres se llevó a cabo por hidrólisis en fase vapor sobre HCl 6N, asimismo de acuerdo con Waters. En resumen, este procedimiento es como sigue. Una muestra del sobrenadante claro que contiene proteínas obtenido después de hidrólisis enzimática se homogeneíza en una solución diluida de HCl. La solución resultante se somete luego a una hidrólisis en fase vapor de acuerdo con Waters. Después de esta hidrólisis ácida, los aminoácidos se derivatizan y se analizan de acuerdo con el método Picotag (véase anteriormente).

Dado que durante la hidrólisis ácida se destruyen Trp y Cys, estos aminoácidos no se incluyen en los datos presentados. Sin embargo, los residuos Gln y Asn se convierten en Glu y Asp durante la hidrólisis ácida, por lo que los valores para Glu y Gln, y para Asp y Asn se sumaron usualmente para permitir la comparación con los datos obtenidos antes de la hidrólisis ácida. Únicamente en el Ejemplo 8 se siguió un procedimiento diferente.

Ejemplos Ejemplo 1

Los aminoácidos tales como leucina y valina han sido implicados en productos Maillard que generan olores semejantes a la corteza de pan. Para proponer la formación de tales olores durante la cochura del pan, sería ventajoso generar un hidrolizado de proteínas naturales que sea relativamente rico en estos dos aminoácidos. Con objeto de conseguir un enriquecimiento en aminoácidos selectivo, un sustrato de proteínas relativamente rico en leucina y valina se combinó con una endoproteasa selectiva y una exoproteasa selectiva. Es sabido que la enzima termolisina de origen microbiano escinde los enlaces peptídicos en el lado del terminal amino de los aminoácidos voluminosos hidrófobos tales como Ile, Leu, Val, y Phe.

Aunque se conocen en la bibliografía científica diversas aminopeptidasas selectivas, la mayoría de ellas han sido aisladas a partir de tejidos de mamífero o se sabe que están fijadas a la membrana. Las dos últimas características hacen que estas enzimas sean menos atractivas para aplicaciones de grado alimentario y de bajo coste. Una excepción es la aminopeptidasa bacteriana de Aeromonas proteolytica (EC 3.4.11.10). Esta enzima es de origen microbiano, es soluble en todas proporciones y exhibe una preferencia clara para los aminoácidos hidrófobos, siendo sólo extremadamente resistentes a la separación los ácidos aspártico, glutámico y cisteico (Prescott, J.M. y Wilkes, S.H., Methods in Enzymol: 45, 530 (1976)).

Para liberar tanta leucina como fuera posible sin liberación concomitante de aminoácidos no deseados, es evidente que el sustrato proteínico utilizado para la hidrólisis enzimática debería seleccionarse cuidadosamente. Entre los muchos sustratos proteínicos disponibles comercialmente, únicamente el aislado de proteínas de lactosuero, la hemoglobina y el aislado de proteína de maíz son relativamente ricos en leucina y valina. En este ejemplo se utilizó el aislado de proteínas de lactosuero (WPC 80).

El sustrato proteínico, termolisina y la aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica se incubaron todos ellos simultáneamente en las condiciones que se especifican a continuación. Después de incubación durante 5 horas, los líquidos se procesaron como se describe en la sección de Materiales y Métodos. La materia precipitada o no disuelta se separó por centrifugación durante 15 minutos a la velocidad máxima en una centrífuga Eppendorf. El sobrenadante se separó y se guardó congelado a -20ºC.

Se analizaron muestras del sobrenadante respecto a contenido de aminoácidos de acuerdo con el método Picotag de Waters (Milford, MA, EE.UU.) inmediatamente después de la descongelación.

La Tabla 1 proporciona la distribución de los amino-ácidos tal como se presentan después de hidrólisis con HCl 6N en comparación con la distribución de los aminoácidos encontrada después de incubación con las enzimas. Para todos los aminoácidos libres relevantes, el factor de enriquecimiento, la fracción molar y los valores AAQ se calcularon de acuerdo con las definiciones proporcionadas. Las fracciones molares y los factores de enriquecimiento se proporcionan para todos los aminoácidos (como T+Ae y T+Ae/HCl 6N respectivamente, véase la Tabla 1). Se omitieron los valores de Trp y Cys, y los valores Glu y Gln, y Asp y Asn se sumaron como un solo valor en la Tabla 1.

TABLA 1 Aislado de sustrato de proteínas de lactosuero

Aminoácidos	T+Ae	6N HCl	T+Ae/6N HCl
Asn + Asp	0.3		11.2		0.0
Glu + Gln	1.0		18.1		0.1
Leu	33.3		10.8		3.1
Ile	21.5		6.1		3.5
Val	21.4		6.6		3.2
Phe	6.9		3.4		2.0
Tyr	0.4		3.1		0.1
Pro	0.0		5.3		0
Met	4.3		2.4		1.8
Lys	1.0		9.6		0.1
Arg	1.7		3.3		0.5
His	0.0		1.9		0
Gly	0.3		1.7		0.2
Ala	3.5		4.8		0.7
Ser	0.9		5.1		0.2
Thr	3.2		6.7		0.5
	99.7		100.1
Clave: T+Ae = \begin{minipage}[t]{138mm} fracción molar de aminoácidos después de tratamiento con termolisina + aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica; a no ser que se indique otra cosa, en todos los ejemplos ulteriores, la cantidad de enzima añadida se refiere a las preparaciones de enzima como se describen en la sección de Materiales y Métodos.\end{minipage}
\hskip0.6cm HCl 6N = \begin{minipage}[t]{135mm} fracción molar de aminoácidos obtenida después de hidrólisis con HCl 6N de proteínas de lactosuero hidrolizada después de incubación enzimática. (Waters)\end{minipage}

T+Ae/HCl 6N = \frac{\text{Fracción molar de AA después de incubación con T+Ae}}{\text{Fracción molar de AA después de hidrólisis con HCl 6N}}

Esta columna (T+Ae/HCl 6N) muestra el factor de enriquecimiento de un aminoácido libre.

Condiciones: A 2 mililitros de tampón de fosfato de 100 milimoles/litro que contenía 10% (p/p) de WPC 80, se añadieron 20 microlitros de termolisina (Sigma) y 33 microlitros de aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica. La incubación se realizó durante 5 horas a 40ºC; pH 8,0.

A pesar de la limitada selectividad de las enzimas utilizadas, su combinación con el aislado de proteínas de lactosuero produjo un resultado espectacular: leucina, isoleucina y valina juntas representaban mucho más del 50% de todos los aminoácidos libres disponibles (lo cual es al menos tres veces más que lo que puede obtenerse utilizando el hidrolizado ácido de lactosuero). Sin embargo, los valores de fracción molar de isoleucina y valina (ambos 21,5%) son demasiado bajos en este experimento, por lo que en el hidrolizado como un todo, únicamente cumple la leucina (fracción molar de 33,3%). El nivel de AAQ en esta incubación era aproximadamente 15%.

Ejemplo 2

En el Ejemplo 1 se incubó un aislado de proteínas de lactosuero con termolisina y una aminopeptidasa selectiva obtenida de Aeromonas proteolytica, siendo la finalidad maximizar el rendimiento en términos relativos de un aminoácido específico que en este caso resultó ser leucina. Aunque se obtuvo un resultado satisfactorio, quedó sin aclarar si el resultado era debido a la selectividad de la endoproteasa o a la selectividad de la exoproteasa utilizada.

En este ejemplo, se llevaron a cabo incubaciones con termolisina y con la aminopeptidasa selectiva de Aeromonas o con la aminopeptidasa de amplio espectro APII de Bacillus stearothermophilus. La aminopeptidasa APII termófila de amplio espectro se aisló de la cepa NCIMB8924 de Bacillus stearothermophilus como se describe anteriormente en la Sección de Materiales y Métodos en esta memoria.

La incubación enzimática se llevó a cabo en las condiciones especificadas más adelante en la Tabla 2, después de lo cual se paró la reacción y se procesó como se describe en el Ejemplo 1. El período de incubación relativamente corto se seleccionó para minimizar el patrón de escisión inespecífica de la aminopeptidasa AP II con relación a la aminopeptidasa de Aeromonas tanto como fuera posible.

TABLA 2 Aislado de sustrato de proteínas de lactosuero

Aminoácido	T + Ae	T + AP	6N HCl	T+Ae/6N HCl	T + AP/6N HCl
Asn + Asp	0.1		4.0		11.2		0	0.4
Gln Glu	0.5		3.1		18.1		0	0.2
Leu	36.0		22.4		10.8		3.3	2.1
Ile	18.9		11.4		6.1		3.1	1.9
Val	23.9		13.8		6.6		3.6	2.1
Phe	5.8		4.6		3.4		1.7	1.4
Tyr	0.1		4.2		3.1		0	1.4
Pro	0.2		0.0		5.3		0	0
Met	3.4		2.6		2.4		1.4	1.1
Lys	0.4		2.3		9.6		0	0.2
Arg	3.8		3.3		3.3		1.2	1
His	0.2		0.8		1.9		0.1	0.4
Gly	0.0		2.0		1.7		0	1.2
Ala	2.9		10.5		4.8		0.6	2.2
Ser	0.3		6.9		5.1		0.1	1.4
Thr	3.8		8.2		6.7		0.6	1.2
	100.3		100.1		100.1
Clave: T+Ae = termolisina más aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica
\hskip0.9cm T+AP = termolisina más AP II de B. Stearothermophilus
\hskip0.9cm HCl 6N = proteínas de lactosuero hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática (Waters)
Condiciones: T+AP: \begin{minipage}[t]{130mm} a 1850 microlitros de tampón de fosfato de concentración 100 milimoles/litro que contenía 1 milimol/litro de CoCl2 y 10% (p/p) de WPC 80 se añadieron 10 microlitros de termolisina (Sigma) y 140 microlitros de AP II de B. stearothermophilus. La incubación se realizó durante 1 hora a 60^{o}C, pH 8,0.\end{minipage}
\hskip1.9cm T+Ae: Como en el Ejemplo 1, pero con un período de incubación de 1 hora solamente.

Las actividades combinadas de termolisina y aminopeptidasa de Aeromonas produjeron leucina que representaba una fracción molar de 36% de todos los aminoácidos libres disponibles (lo cual era al menos 3 veces más que el valor obtenido por la hidrólisis ácida), un factor de enriquecimiento de 3,3. Ambas incubaciones exhibieron un valor AAQ de aprox. 12%.

En la incubación con termolisina y AP II la leucina representa 22% o muy aproximadamente 2 veces más que la cantidad obtenida por la hidrólisis ácida y que no cumple el requerimiento de una fracción molar de al menos 25%. La termolisina y la aminopeptidasa de Aeromonas representa por tanto la combinación preferida para liberación de leucina a partir de la proteínas de lactosuero.

Ejemplo 3

En los Ejemplos 1 y 2, se demostró la degradación selectiva de un aislado de proteínas de lactosuero por análisis del contenido de aminoácidos libres presentes después de incubación con diversas enzimas. En el Ejemplo 2 se demostró que la combinación de termolisina más aminopeptidasa de Aeromonas proporcionaba un hidrolizado que estaba significativamente enriquecido en leucina (3,3 veces) cuando se comparó con un hidrolizado ácido. La combinación de termolisina con enzima AP II de B. stearothermophilus proporcionó un hidrolizado en contenido de leucina, a saber por un factor de 2,1 comparado con un hidrolizado ácido.

Para establecer si tales diferencias pueden conducir o no a efectos de olor apreciables en reacciones de Maillard, se llevaron a cabo varios experimentos. En un primer experimento, se hicieron reaccionar 0,13 gramos de leucina pura con glucosa (0,19 g), fructosa (0,19 g), maltosa (0,39 g) o sacarosa (0,39 g) en agua, agitando a una temperatura de 135ºC. La finalidad de este experimento era descubrir qué azúcar es más eficaz en la liberación de olores en combinación con el exceso de leucina presente. Después de aproximadamente 90 minutos de calentamiento, toda el agua presente se había evaporado. Después de aproximadamente 60 minutos de calentamiento (con algo de agua restante), los viales que contenían glucosa y fructosa comenzaron a generar un olor dulce semejante a corteza de pan, mientras que los viales que contenían maltosa y sacarosa proporcionaban solamente una impresión de cacao. Después de calentamiento durante 100 minutos a 135ºC, la glucosa y la fructosa generaron sólo un olor débil, mientras que maltosa y sacarosa generaban un olor dulce más pronunciado semejante a corteza de pan.

Dado que la incubación con fructosa proporcionó el olor semejante a corteza de pan más fuerte, se seleccionó este azúcar para llevar a cabo reacciones de Maillard con los hidrolizados como se especifica en el Ejemplo 2.

Utilizando los datos concernientes a los aminoácidos libres totales presentes en cada incubación, se prepararon 3 viales de reacción que contenían cantidades idénticas de aminoácidos libres (aproximadamente 40 micromol en 2 mililitros). En caso necesario se añadió algo de agua para obtener volúmenes idénticos en cada uno de los 3 viales. Finalmente, se añadió un ligero exceso molar de fructosa (55 micromoles) a cada vial y se inició la reacción por calentamiento de los viales a una temperatura de 127ºC.

Después de la evaporación de toda el agua, se consultó un panel experimentado en solicitud de enjuiciamiento acerca de los olores liberados por cada vial. Sus comentarios se resumen en la Tabla 3.

El sustrato utilizado atribuye un carácter lácteo significativo a los perfiles de olor iniciales. Diferencias importantes en la liberación de olores pueden atribuirse a las muestras tratadas con termolisina más AP II frente a las muestras tratadas con termolisina más aminopeptidasa de Aeromonas. Un factor de enriquecimiento en aminoácidos particulares de 2,1 únicamente tal como se obtiene en la digestión con termolisina más AP II es aparentemente inadecuado para generar olores que se desvíen significativamente en las reacciones de Maillard.

TABLA 3

Minutos después de la	T + Ae	T + Ap II
disipación del agua
5	Lácteo, de queso fuerte	Lácteo, de queso flojo
20	Tostado agradable, de queso	Lácteo, de queso flojo
35	Tostado de cacao	No característico
Clave: T+Ae = \begin{minipage}[t]{138mm} Hidrolizado de proteínas de lactosuero preparado con termolisina más aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica\end{minipage}
\hskip0.6cm T+Ap II = \begin{minipage}[t]{138mm} Hidrolizado de proteínas de lactosuero preparado con termolisina +APII de Bacillus stearothermophilus\end{minipage}

Ejemplo 4

En el Ejemplo 3 se ha demostrado que los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención son capaces de generar aromas específicos en experimentos de Maillard. La finalidad del presente ejemplo es demostrar que los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención pueden utilizarse también para estimular la formación de aromas específicos después de incubación con micro-organismos.

A partir de polvo de hemoglobina de calidad comercial (HGP Po-Feed de Harimex, Países Bajos), se preparó una suspensión al 5% (p/v) en agua destilada después de lo cual se ajustó el pH a 7,0 utilizando HCl 4N.

Una porción de 500 ml de esta suspensión se incubó con una termolisina de grado industrial (Thermoase C160 de Daiwa Kasei, Japón) y otra porción de 500 ml de la suspensión se incubó con esta termolisina más una aminopeptidasa de grado industrial específica de leucina de Aspergillus (Corolase LAP de Röhm Enzyme, Alemania). Por cada 500 ml de suspensión se añadieron 2,5 gramos del polvo de Thermoase y 0,2 ml del líquido Corolase LAP. Ambas incubaciones enzimáticas se llevaron a cabo a 50ºC durante 4 horas y luego se pararon las reacciones por acidificación de los líquidos a pH 3,0 utilizando HCl 4N. Inmediatamente después, se centrifugaron las dos suspensiones acidificadas (durante 30 minutos a 3500 rpm en una centrífuga Heraeus Megafuge 3.0 R) para precipitar el hemo de la hemoglobina y los dos sobrenadantes se recogieron y se sometieron a un tratamiento térmico de 30 minutos a 95ºC. Del sobrenadante que se obtuvo a partir de la incubación con Thermoase y Corolase LAP se utilizó una pequeña muestra para análisis de aminoácidos. Después de ello se liofilizaron ambos sobrenadantes. La suspensión que se incubó exclusivamente con Thermoase proporcionó 20 gramos de polvo seco, y la suspensión que se incubó con las dos enzimas proporcionó 18 gramos de polvo seco.

El análisis de los aminoácidos libres presentes en el hidrolizado de hemoglobina preparado por incubación a la vez con la endo- (es decir Thermoase) y la exo-proteasa (es decir Corolase LAP) exhibió un enriquecimiento considerable de leucina, isoleucina y metionina (Tabla 4). Sin embargo, los valores de fracción molar tanto de isoleucina como de metionina son menores que el 25% requerido, por lo que únicamente cumple la leucina. El Cociente de Aminoácidos de la preparación determinada de acuerdo con el procedimiento reseñado en la Sección de Materiales y Métodos era 15% y la leucina representaba una fracción molar de 37%. La liberación de aminoácidos por incubación de hemoglobina con Thermoase sola era muy limitada, por lo que estos datos se omitieron de la Tabla.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4 Sustrato de hemoglobina

Aminoácido	T + C	6 N HCl	T + C/6 N HCl
Asn+Asp	0.2		10.7		0.0
Gln+Glu	0.4		6.7		0.1
LEU	36.6		13.3		2.8
ILE	3.6		0.6		6.1
VAL	15.1		9.5		1.6
PHE	9.9		5.5		1.8
TYR	3.9		2.2		1.7
PRO	0.0		4.5		0.0
MET	3.4		1.0		3.5
LYS	4.1		7.9		0.5
ARG	3.5		1.1		3.1
HIS	3.0		7.5		0.4
GLY	1.0		8.2		0.1
ALA	7.3		12.7		0.6
SER	1.0		5.0		0.2
THR	5.9		3.6		1.7
	99.0		100.0
Clase: T+C = Thermoase + Corolase LAP
\hskip0.9cm HCl 6N = hemoglobina hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} hemoglobina 5% (p/p) en 500 ml de agua de pH 7 e incubada con 2,5 gramos de polvo de Thermoase y 200 microlitros de Corolase LAP durante 4 horas a 50^{o}C.\end{minipage}

Para demostrar que un hidrolizado de proteínas enriquecido en aminoácidos específicos de acuerdo con la invención puede generar aromas específicos en procesos de fermentación diferentes, se llevaron a cabo varios experimentos.

En un primer experimento, se dejó crecer la levadura Kluyveromyces lactis en medio mínimo complementado con la Thermoase o la hemoglobina hidrolizada con Thermoase/Corolase LAP, después de lo cual fueron comparados los aromas de los dos caldos de fermentación por un panel experimentado. Medios mínimos que contenían 40 gramos de NaCl/litro, 14,2 gramos de Na_{2}HPO_{4} y 0,34 gramos de KNO_{3}/litro se ajustaron a un pH final de 5,5 y se complementaron con 0,5 gramos/litro del polvo de hemoglobina hidrolizado con Thermoase o el polvo de hemoglobina hidrolizado con Thermoase/Corolase LAP. Los dos medios se introdujeron en frascos (50 ml en frascos de 100 ml) por duplicado y se esterilizaron durante 20 minutos a 120ºC. Después de alcanzar una temperatura de aprox. 30ºC, los frascos se inocularon con 1% de un pre-cultivo totalmente desarrollado de K. lactis (ATCC 8585), que se centrifugó y se resuspendió en el mismo volumen de solución salina fisiológica para separar la mayor parte de los aminoácidos libres que estaban presentes en el medio YEPD utilizado para el precultivo. A continuación se cerraron los frascos y se incubaron sin agitación durante 7 días a 20ºC. Después de abrir nuevamente los frascos, el olor de la atmósfera encima de los dos medios fue apreciado por los miembros del panel. Sus observaciones se especifican en la Tabla 5.

En un segundo experimento, un cultivo comercial iniciador de carne que contenía diversos lactobacilos y Staphylococcus carnosus se dejó crecer en medios mínimos en presencia de dextrosa y nitrito, y se complementó de nuevo con el polvo de hemoglobina hidrolizado con Thermoase o con Thermoase/Corolase LAP. Después de la incubación, el olor de los dos frascos de fermentación fue comparado por un panel experimentado. En este experimento, el medio contenía 6 gramos de dextrosa/litro, 20 gramos de sal Colorozo/litro (la sal Colorozo es una preparación comercial suministrada por Verstegen, Rotterdam, Países Bajos y contiene 0,6% de nitrito en NaCl) y 1 gramo/litro del polvo de hemoglobina hidrolizado con Thermoase o hidrolizado con Thermoase/Corolase LAP. El valor de pH de los dos medios se ajustó a 5,5 y se inoculó con 0,3 gramos de cultivo iniciador Bitek LS-25Plus por litro de medio, es decir sin esterilización previa del medio. La fermentación tuvo lugar en frascos cerrados (50 ml en un frasco de 100 ml) a 22ºC durante 30 horas, a continuación 15ºC durante 2 días y por último 6ºC durante 3 días. Durante este periodo, el pH de ambas fermentaciones descendió a aproximadamente 4,0.

Como anteriormente, el olor de las fermentaciones fue examinado inmediatamente después de la apertura de los frascos. Las observaciones del panel se registran en la Tabla 5.

TABLA 5 Impresiones de olor de medios mínimos complementados con diferentes hidrolizados de hemoglobina e inoculados con diferentes cultivos iniciadores microbianos.

	K. lactis (ATCC 8585)	Cultivo Iniciador de Carne
		(Bitec LS25 Plus)
Hidrolizado de Thermoase	Neutro	Neutro
Hidrolizado de Thermoase/	Mucho más pronunciado.	Mucho más pronunciado.
Corolase LAP	Ensilado/sidra.	Aldehídico fresco.

En un tercer experimento, la preparación de hemoglobina enriquecida en leucina de acuerdo con la invención se ensayó en una salchicha de tipo Frankfurt preparada industrialmente y fermentada en seco.

A este fin, se prepararon porciones mayores del hidrolizado de hemoglobina exclusivamente con Thermoase o Thermoase más Corolase LAP y que cumplían las especificaciones ilustradas en la Tabla 4. Después de liofilización, se añadieron cantidades de 75 gramos de cada polvo a dos porciones de 8 kilogramos de la mezcla de carne, colágeno, grasa, corteza cocida, dextrosa y ascorbato de sodio y se mezclaron concienzudamente. Aparte de sal (con 0,6% de nitrito) y pimienta, no se incorporó ninguna otra especia para facilitar la identificación de cualesquiera diferencias de aroma causadas por la adición de los hidrolizados posteriormente. A una tercera porción de la masa de carne no se añadió hidrolizado alguno. Antes de la adición del hidrolizado, la masa de carne contenía aproximadamente 17% de proteína de carne. Se utilizó Bitec LS-25 Plus como el cultivo iniciador en las tres preparaciones.

Después de períodos de incubación de 21 días y 49 días a 18ºC para alcanzar pérdidas de agua de 20% al menos, se cortaron en rodajas las salchichas y fueron enjuiciados por un panel experimentado. Se consideró que las salchichas preparadas con la masa que contenía el hidrolizado de hemoglobina con niveles altos de leucina libre tenían un sabor más fuerte y más jugoso que las salchichas preparadas a partir de mezcla batida sin adición alguna de hidrolizado. El sabor de las salchichas que contenían el hidrolizado incubado exclusivamente con Thermoase era intermedio, más franco que el material de referencia, pero menos fuerte que el de la masa enriquecida con niveles altos de leucina libre.

Ejemplo 5

Los hidrolizados de acuerdo con la invención no pueden utilizarse únicamente para dotar a las salchichas de perfiles de aroma más jugosos, sino que son útiles también para cocer pan con aromas de pan más pronunciados.

Al igual que la proteína de lactosuero y la hemoglobina, la proteína de cereales es muy rica en leucina pero mucho más adecuada para la incorporación en pan que cualquiera de estas alternativas debido a su aroma de cereales característico. Utilizando la misma combinación de Thermoase y Corolase LAP que se utilizó en el Ejemplo 4, se digirió proteína de cereales (Maisin 13875 de Cerestar, Krefeld, Alemania) en condiciones especificadas en la leyenda de la Tabla 6. Después de incubación, las enzimas se desactivaron por disminución del pH a 5,0 utilizando HCl 4N seguida por calentamiento durante 45 minutos a 95ºC. Se tomaron muestras para el análisis de aminoácidos, después de lo cual se liofilizó el resto del material.

El análisis de aminoácidos de los hidrolizados enzimáticos así como los hidrolizados con HCl 6N demuestra que se produce abundantemente leucina libre con un valor AAQ de 32%, un factor de enriquecimiento de 5,8 y como una fracción molar de 41,8%. Aparte de leucina, ningún otro aminoácido cumple los requerimientos.

Antes de la adición a la masa, se disolvieron cantidades de 1,11, 5,56 y 11,13 gramos de hidrolizado liofilizado en 20 ml de agua. Una porción de 20 ml de agua no contenía cantidad alguna de hidrolizado. A continuación se mezclaron cada una de estas porciones de 20 ml de agua con masa de pan que contenía 2000 gramos de harina, 40 gramos de sal, 44 gramos de levadura fresca y otros 1150 mililitros de agua que contenía 80 miligramos de ácido ascórbico, 50 miligramos de Fermizyme P200 y 120 miligramos de Fermizyme HS2000 (ambas de DSM Bakery Ingredients, Delft, Países Bajos).

Después de un periodo de pre-leudo de 35 minutos a 30ºC, se dejó a la masa otro periodo de leudo de 75 minutos a 34ºC. La cochura se llevó a cabo durante 10 minutos a 280ºC, seguido por otros 20 minutos a 225ºC. Al día siguiente, se cortó el pan en rodajas y fue evaluado por un panel experimentado.

La dosificación más baja de hidrolizado (1,11 gramos por 3100 gramos de masa) no tenía efecto apreciable alguno sobre el aroma del pan. Sin embargo, el nivel de adición más alto (11,13 gramos por 3100 gramos de masa) dio como resultado un aroma floral fuerte que podía diferenciarse claramente del pan sin adición alguna de liofilizado. Lamentablemente, este alto nivel de adición tenía un efecto negativo sobre el volumen global de la barra. La adición de 5,56 gramos de hidrolizado dio como resultado un efecto de aroma menos intenso pero que no tenía efecto perjudicial alguno sobre el volumen de la barra.

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TABLA 6 Sustrato de proteínas de cereales

Aminoácido	T + C	6N HCl	T + C/6N HCl
Asn+ Asp	0.8		0.1		0.1
Glu+Gln	1.1		0.2		0.1
Leu	41.8		7.2		5.8
Ile	11.2		3.0		3.8
Val	8.9		3.6		2,5
Phe	10.6		4.3		2.5
Tyr	2.4		3.6		0.7
Pro	2.8		11.6		0.2
Met	3.2		1.1		2.9
Lys	1.7		0.8		2.1
Arg	4.0		2.8		1.4
His	0.9		1.4		0.6
Gly	0.5		6.1		0.1
Ala	5.1		10.2		0.5
Ser	0.9		8.8		0.1
Thr	4.2		4.8		0.9
	100.0		100.0
Clave: T+C = Thermoase + Corolase LAP
\hskip0.9cm HCl 6N = proteína de cereales hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} a 500 ml de agua que contenía 6% (p/p) de Maisin se añadieron 2,5 gramos de Thermoase más 0,2 mililitros de Corolase LAP. La incubación se realizó durante 4 horas a 50^{o}C a un pH inicial de 7.\end{minipage}

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra el enriquecimiento selectivo de lisina o leucina a partir de aislado de proteínas de lactosuero (WPC 75) utilizando nuevas combinaciones de enzimas para este sustrato particular. Los dos hidrolizados formados se utilizaron luego para influir en las propiedades organolépticas de un queso.

El papel de la leucina en diversos procesos de generación de aromas ha sido ilustrado adecuadamente en esta solicitud. En uso de lisina para generar sabores semejantes a patata en reacciones de Maillard es también conocido. Adicionalmente, la lisina ha sido implicada en el desarrollo de sabores de productos de fermentación tales como queso y vinos "fermentados sobre las heces".

El aislado de proteínas de lactosuero es extremadamente rico en lisina y leucina, pero tiene un contenido relativamente bajo de arginina. Para liberar selectivamente leucina, se utilizó de nuevo la combinación de enzimas Thermoase y Corolase LAP (véase Tabla 7). Para liberar selectivamente lisina, se incubó primeramente la proteínas de lactosuero con tripsina pancreática (de Merck) a fin de escindir en el lado de carboxilo de la arginina o la lisina, y luego, a un pH más bajo, con la carboxipeptidasa CPD II (PepF) de A. niger. CPD II exhibe una preferencia acusada para liberar aminoácidos básicos como Arg y Lys. Detalles de la última incubación se proporcionan en la Tabla 8.

La incubación enzimática y el procesamiento subsiguiente fueron como se describe en la Sección de Materiales y Métodos. A partir de los datos obtenidos con la combinación de Thermoase y Corolase LAP, es evidente que únicamente la leucina cumple los criterios con un factor de enriquecimiento de 3,1, un valor AAQ de 19,1% y un valor de fracción molar de 34,1% (Tabla 7). En la incubación con tripsina y CPD II, tanto lisina como arginina están considerablemente sobre-representados en el hidrolizado final, pero únicamente la lisina cumple los criterios, con un factor de enriquecimiento de 17,3, un valor AAQ de 10,4% y un valor de fracción molar de 44% (Tabla 8).

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TABLA 7 Sustrato de proteínas de lactosuero

Aminoácido	T + C	6N HCl	T+ C/6N HCl
Asn + Asp	0.2		10.4		0.0
Gln + Glu	0.4		15.1		0.0
Leu	34.1		10.9		3.1
Ile	19.9		6.4		3.1
Val	21.0		6.5		3.2
Phe	4.4		2.7		1.6
Tyr	0.3		2.7		0.1
Pro	0.8		7.4		0.1
Met	6.7		1.9		3.5
Lys	1.5		8.5		0.2
Arg	2.9		0.9		3.0
His	1.5		1.8		0.8
Gly	0.8		3.2		0.3
Ala	2.4		7.9		0.3
Ser	0.4		5.9		0.1
Thr	2.8		7.8		0.4
	100.0		100.0
Clave: T+C = Thermoase + Corolase LAP
\hskip0.9cm HCl 6N: proteínas de lactosuero hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} Se disolvió WPC 75 en 500 mililitros de agua hasta una concentración de 6% (p/p), después de lo cual se añadieron 0,1 gramos de Thermoase más 0,20 mililitros de Corolase LAP. La incubación se realizó durante 4 horas a 50^{o}C mientras se ajustaba continuamente el pH a 7.\end{minipage}

TABLA 8 Proteínas de lactosuero sustrato

Aminoácido	Tr + F	6 N HCl	Tr + F/6N HCl
Asn + Asp	0.4		10.5		0.0
Gln + Glu	3.2		16.1		0.2
Leu	5.2		9.8		0.5
Ile	3.2		6.9		0.5
Val	5.1		6.2		0.8
Phe	5.0		2.6		2.0
Tyr	4.8		1.8		2.6
Pro	0.4		8.5		0.1
Met	5.1		2.0		2.5
Lys	44.2		2.6		17.3
Arg	14.9		2.3		6.4
His	5.2		2.1		2.5
Gly	0.1		3.4		0.0
Ala	1.9		8.5		0.2
Ser	0.3		8,0		0.0
Thr	0.9		8.7		0.1
	99.9		99.9
Clase: Tr+F = Tripsina más CPD II
\hskip0.9cm HCl 6N = Proteínas de lactosuero hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} Se disolvió WPC 75 en 100 mililitros de agua hasta una concentración de 6% (p/p). Se añadió a continuación 0,1 g de polvo de tripsina (Merck) y se incubó durante 2 horas a 60^{o}C y un pH inicial de 7. Después de disminución del pH a 5 utilizando HCl 4N, se añadieron 0,2 mililitros de CPD II purificada y se continuó la digestión durante 3 horas más a 40^{o}C, pH 5.\end{minipage}

Dado que las trazas de proteasa activa remanentes en el hidrolizado pueden causar un amargor acusado en el queso, ambos hidrolizados se sometieron a un tratamiento térmico de 45 minutos a 95ºC a pH 5 antes de la adición al
queso.

Para ensayar el efecto de ambos hidrolizados sobre las características organolépticas del queso, se adoptó el modelo Ch-easy desarrollado por la compañía NIZO en los Países Bajos (G. Smit et al., Voedingsmiddelentechnologie 8 (1995) 19-21). Se dejó enfriar la base pasteurizada Ch-easy a 30ºC, después de lo cual se añadió un cultivo iniciador regular (en este caso DS 5 LT1 de DSM Gist, Delft, Países Bajos) junto con 500 miligramos de uno cualquiera de los hidrolizados liofilizados por cada 200 gramos de la base Ch-easy todavía líquida. Al material de referencia no se añadió hidrolizado alguno. Después de mezcla concienzuda con una varilla de vidrio, la pasta líquida se transfirió asépticamente a pequeñas copas en las cuales se dejó sedimentar el material. La maduración de Ch-easy tuvo lugar durante dos semanas a 18ºC, después de lo cual los diversos productos fueron evaluados por un panel de sabores experimentado.

Comparado con el material de referencia sin adiciones, el material Ch-easy al que se añadió el hidrolizado enriquecido en leucina exhibía un perfil de olor y sabor mucho más pronunciado que el que podría esperarse a partir de un queso mucho más viejo y maduro. El material Ch-easy al que se añadió el hidrolizado enriquecido en lisina generaba un perfil de olor y sabor mucho más moderado y los panelistas encontraron difícil discriminar este queso de la referencia.

La textura de los quesos con las adiciones resultó similar a la textura del queso sin adición alguna.

Ejemplo 7

En el Ejemplo 6 se ha demostrado que por la preparación de las combinaciones correctas de enzimas, pueden producirse diferentes hidrolizados de proteínas de acuerdo con la invención a partir de una única fuente de proteína animal. Resultó sorprendente que los hidrolizados que se obtienen a partir de la misma materia prima puedan conducir a perfiles de aroma diferentes después de incubación con un cultivo iniciador microbiano adecuado.

En este ejemplo se ilustra la versatilidad del proceso de acuerdo con la invención sometiendo una proteína vegetal industrialmente importante a diferentes enzimas. Una vez más, los autores de la invención han podido crear hidrolizados de acuerdo con la invención que están enriquecidos en diferentes aminoácidos. En este caso, en arginina como único aminoácido libre o en arginina más lisina como dos aminoácidos libres diferentes. El potencial de tales hidrolizados diferentes para generar aromas distinguibles en un proceso Maillard o un proceso de fermentación ha sido ilustrado ampliamente en el texto que antecede. Aparte de tales actividades de intensificación de aromas, se considera también que la arginina libre es un nutriente dietético esencial y ha sido implicada en la secreción de hormonas, en la formación de óxido nítrico y en la estimulación de la curación de las heridas en humanos. Adicionalmente se ha reivindicado que, los hidrolizados de proteínas enriquecidos en arginina poseen propiedades beneficiosas para aplicaciones de cuidado personal. Así pues, los hidrolizados de acuerdo con la invención son también útiles como tales.

En este experimento, se incubó primeramente aislado de proteína de soja (Soyamin 90 HV) con una combinación de proteasa de origen vegetal (papaína o Collupulina) y una carboxipeptidasa de origen microbiano (CPD II) para producir un hidrolizado de acuerdo con la invención que está enriquecido en arginina libre. De los datos proporcionados en la Tabla 9 se sigue que únicamente este aminoácido con un enriquecimiento de 4,2, y valores de 26,9% y 10,3% para la fracción molar y el valor AAQ respectivamente cumple todos los criterios.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 9 Sustrato de aislado de proteína de soja

Aminoácido	Co + F	6N HCl	Co + F/6N HCl
Asn + Asp	3.9		10.0		0.4
Gln + Glu	6.8		18.9		0.4
Leu	10.7		7.1		1.5
Ile	2.0		4.3		0.5
Val	3.9		5.5		0.7
Phe	3.3		3.8		0.9
Tyr	2.3		2.6		0.9
Pro	0.0		6,7		-
Met	2.6		1.0		2.7
Lys	19.9		6.3		3.1
Arg	26.9		6.4		4.2
His	3.7		2.1		1.8
Gly	5.5		8.0		0.7
Ala	3.8		5.9		0.7
Ser	3.1		6.9		0.4
Thr	2.7		4.4		0.6
	101		100.0
Clave: Co + F = Collupulina + CPD II.
\hskip0.9cm HCl 6N: hidrolizado de proteína de soja hidrolizado con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} El aislado de proteína de soja se disolvió en 200 mililitros de agua hasta una concentración de 6% (p/p), después de lo cual se ajustó el pH a 7,2 y se añadió 1 ml de Collupulina. La incubación se realizó durante 2 horas a 60^{o}C. Se rebajó luego el pH a 5, se añadieron 0,5 mililitros de CPD II y se continuó la digestión durante 3 horas más a 40^{o}C, pH inicial 7,15 y CPD II 3 horas a 40^{o}C, pH 5.\end{minipage}

En la segunda incubación, se incubó el aislado de proteína de soja con una combinación de proteasa de origen animal (tripsina de Merck) y la CPD II microbiana. En esta segunda incubación, tanto arginina como lisina cumplían todos los criterios, con factores de enriquecimiento de 5,5 y 3,9 respectivamente, valores de fracción molar de 34,7 y 26,2% respectivamente y un valor AAQ de 11,7%. Los detalles de la segunda incubación se proporcionan en la Tabla 10.

TABLA 10 Sustrato de aislado de proteína de soja

Aminoácido	Tr + F	6N HCl	Tr + F/6N HCl
Asn+Asp	1.6		10.8		0.1
Gln + Glu	2.6		19.5		0.1
Leu	7.3		7.1		1.0
Ile	1.7		4.4		0.4
Val	4.2		5.0		0.8
Phe	3.8		4.1		0.9
Val	3.8		2.0		1.9
Pro	0.8		6.7		0.1
Met	3.1		0.9		3.4
Lys	26.2		6.7		3.9
Arg	34.7		6.3		5.5
His	3.5		2.5		1.4
Gly	0.5		7.6		0.1
Ala	2.5		5.9		0.4
Ser	1.0		6.6		0.1
Thr	1.5		4.0		0.4
	98.6		100.1
Clave: Tr + F = Tripsina + CPD II
\hskip0.9cm HCl 6N = Aislado de proteína de soja hidrolizado con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} El aislado de proteína de soja se disolvió en 200 ml de agua hasta una concentración de 6% (p/p). Después de ajuste del pH a 7,0, se añadieron 0,2 gramos de polvo de tripsina (Merck) y se incubó durante 2 horas y 30 minutos a 60^{o}C. A continuación se rebajó el pH a 5,0, se añadieron 0,5 ml de CPD II y se incubó durante 3 horas más a 40^{o}C.\end{minipage}

Ejemplo 8

El papel esencial del glutamato libre en numerosos procesos de formación de aromas está bien documentado y MSG, la sal de sodio del ácido glutámico, está reconocida como el componente individual intensificador del sabor más importante. Mirado desde este punto de vista, es importante ilustrar que los hidrolizados de proteínas de acuerdo con la presente invención incluyen versiones que están enriquecidas en ácido glutámico libre con la implicación de beneficios importantes de aroma en procesos de Maillard o de fermentación.

Un problema general en la demostración del enriquecimiento de glutamato en los hidrolizados de acuerdo con la invención es la medida de su factor de enriquecimiento. La medida del factor de enriquecimiento requiere datos cuantitativos en cuanto al nivel de glutamato tanto libre como combinado. Lamentablemente, el glutamato combinado no puede establecerse debido a que, durante el tratamiento con HCl 6N, la glutamina combinada se desamina y se convierte también en glutamato. Para soslayar el último problema, en este ejemplo se ha utilizado uno de los sustratos proteínicos cuya relación de glutamato frente a los residuos glutamina se conoce exactamente. Una vez que se dispone de esta información, el nivel de glutamato libre después de tratamiento con HCl 6N se obtiene por una simple multiplicación.

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En este caso se utilizó seroalbúmina bovina (Sigma) con una relación de Glu a Gln de 91 a 29 (Dairy Technology: Principles of Milk Properties and Processes; P. Walstra, compilador Marcel Dekker, Inc.) y se digirió con una mezcla de una glutamil-endopeptidasa purificada y una CPD I purificada en las condiciones especificadas en la leyenda de la Tabla 11.

De acuerdo con los datos, en el hidrolizado resultante el glutamato estaba enriquecido con un factor de 2,7. Los valores para la fracción molar y el AAQ eran 26,3 y 19,3 respectivamente.

TABLA 11 Sustrato de seroalbúmina bovina

Aminoácidos	EG+ G	6N HCl	EG+ G/6N HCl
Asn + Asp	3.1		10.1		0.3
Glu	26.3		10.0		2.7
Gln	0.0		4.7		-
Leu	10.1		10.4		1.0
Ile	0.0		2.3		-
Val	2.7		6.0		0.5
Phe	5.1		4.7		1.1
Tyr	4.1		3.3		1.3
Pro	5.3		5.6		1.0
Met	0.8		0.9		0.9
Lys	10.7		11.5		1.0
Arg	5.3		4.2		1.3
His	4.4		3.4		1.3
Gly	3.0		3.3		0.9
Ala	11.7		8.6		1.4
Ser	2.3		4.8		0.5
Thr	5.1		6.2		0.8
	100.0		100.0
Clave: EG + G = Glutamil-endopeptidasa + CPD I.
\hskip0.9cm HCl 6N = Seroalbúmina bovina hidrolizada con HCl 6N después de incubación enzimática.
Condiciones: \begin{minipage}[t]{140mm} Se disolvió seroalbúmina bovina en 2 mililitros de agua hasta una concentración de 5% (p/p, después de lo cual se ajustó el pH a 8,0, se añadió 1 miligramo de glutamil-endopeptidasa, y se incubó durante 3 horas y 30 minutos a 50^{o}C. A continuación se rebajó el pH a 5,0, se añadieron 0,05 mililitros de CPD I y se incubó durante 25 minutos más a 50^{o}C.\end{minipage}

Claims (14)

1. Un hidrolizado de proteínas:

-

que puede obtenerse por la hidrólisis enzimática de un sustrato que contiene proteínas;

-

que comprende aminoácidos libres y péptidos;

-

en el cual la fracción molar de al menos un amino-ácido libre, presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres;

-

en el cual la fracción molar del al menos un amino-ácido libre en el hidrolizado de proteínas es al menos 25%; y

-

en el cual el cociente de aminoácidos (AAQ) en el hidrolizado de proteínas es de al menos 10%.

2. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el valor AAQ es de 15 a 50%, preferiblemente de 15 a 40%, y más preferiblemente de 10 a 30%.

3. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el cual la hidrólisis del sustrato que contiene proteínas es una hidrólisis enzimática, preferiblemente una hidrólisis enzimática con una endoproteasa y una exoproteasa.

4. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el al menos un aminoácido libre se selecciona de Glu, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Pro, Met, Lys, Arg, His, Gly, Ala, Ser o Thr, seleccionándose preferiblemente el aminoácido de Glu, Pro, Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Met, Pro, Phe, Lys o Arg, y seleccionándose muy preferiblemente el aminoácido de Glu, Leu, Pro, Phe, Lys o Arg.

5. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el hidrolizado de proteínas se encuentra en la forma de un líquido concentrado, una pasta, un polvo o un granulado.

6. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el sustrato que contiene proteínas se selecciona de proteínas de lactosuero, hemoglobina, seroalbúmina bovina, caseína, arroz, gluten y proteína de soja.

7. Un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el hidrolizado de proteínas es capaz de mejorar el sabor de un composición alimenticia.

8. Un proceso para preparar un hidrolizado de proteínas, proceso que comprende:

hidrolizar en condiciones acuosas a una temperatura de 5 a 75ºC, y a un pH de 3 a 9, un sustrato que contiene proteínas con una endoproteasa y una exoproteasa, con lo cual la acción combinada de endoproteasa y exoproteasa deja en libertad al menos un aminoácido libre del sustrato que contiene proteínas, e incubar la endoproteasa y la exoproteasa durante un período de tiempo adecuado para obtener un hidrolizado de proteínas, en el cual la fracción molar de al menos un aminoácido libre presente en el hidrolizado de proteínas es al menos un factor 2,5, preferiblemente al menos un factor 3, más preferiblemente al menos un factor 3,5 veces mayor que en un hidrolizado del mismo sustrato que contiene proteínas que se ha hidrolizado completamente a aminoácidos libres,

-

en el cual la fracción molar del al menos un amino-ácido libre en el hidrolizado de proteínas es al menos 25%; y

-

en el cual el Cociente de Aminoácidos (AAQ) en el hidrolizado de proteínas es al menos 10%.

9. Una composición alimenticia que comprende un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

10. Una composición alimenticia de acuerdo con la reivindicación 9, en la cual la composición alimenticia es un producto alimenticio fermentado, en el cual preferiblemente el producto alimenticio fermentado es: (a) queso y en el cual el aminoácido es Met; (b) salchicha fermentada y el aminoácido es Leu o Phe; (c) cerveza y el aminoácido es Leu, Val o Ile; (d) vino y el aminoácido es Arg o Leu; o (e) whisky y el aminoácido es Val.

11. Una composición alimenticia de acuerdo con la reivindicación 9, en la cual la composición alimenticia es un sabor resultante de la reacción.

12. Un hidrolizado de proteínas caracterizado porque el mismo es (a) un hidrolizado de proteínas de lactosuero que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%, o una fracción molar de lisina libre de al menos 25%; (b) un hidrolizado de proteína de maíz que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%, (c) un hidrolizado de proteína de soja que comprende una fracción molar de arginina libre de al menos 25%, o una fracción molar de lisina libre de al menos 25%, (d) un hidrolizado de proteína BSA que comprende una fracción molar de Glu libre de al menos 25%; o (e) un hidrolizado de hemoglobina que comprende una fracción molar de leucina libre de al menos 25%.

13. Uso de un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en la preparación de una composición alimenticia.

14. Un proceso para preparar un hidrolizado de proteínas fermentado, en el cual un hidrolizado de proteínas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 se fermenta con un microorganismo de grado alimentario.