DE60117405T2

DE60117405T2 - Proteinhydrolysat

Info

Publication number: DE60117405T2
Application number: DE60117405T
Authority: DE
Inventors: Veronique Delest; Luppo Edens; Gerrit Jan KORTES; Jean-Bernard Thierry NAEYE
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2021-10-18
Also published as: ATE318083T1; ES2259049T3; JP2004511241A; DK1337157T3; AU2002215961A1; JP4202748B2; WO2002032231A1; PT1337157E; US6875456B2; US20040067279A1; EP1337157B1; WO2002032232A3; EP1337157A2; AU1142001A; DE60117405D1; WO2002032232A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt Proteinhydrolysate und ihre Verwendung in Nahrungsmittelzusammensetzungen.
Allgemeiner Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteinhydrolysate und ihre Verwendung in Nahrungsmitteln.
Hydrolysierte Proteine aus einer Vielfalt von Quellen werden in der Nahrungsmittelindustrie weit verbreitet verwendet. Beispielsweise werden sie gewöhnlich als eine Komponente in Trockensuppen als Aromastoffe und in anderen Nährmitteln eingesetzt, um z.B. nach einer Maillard-Reaktion Nahrungsmittelaromastoffe zu erhalten. Sie finden auch medizinische Verwendung als Nahrungsergänzungsmittel für Patienten, die an einer Vielfalt an Erkrankungen und Stoffwechselstörungen leiden. Verhältnismäßig neue Entwicklungen sind ihre Verwendung in Produkten für Verbraucher mit nichtmedizinischem Bedarf wie Athleten oder Personen während einer Schlankheitskur und in Anwendungen der Körperpflege. Zudem spielen in situ hydrolysierte Proteine eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Geschmacksstoffen in fermentierten Nahrungsmittelprodukten. In den letztgenannten Produkten scheiden die verwendeten mikrobiellen Starterkulturen gewöhnlich proteolytische Enzyme aus, die für die Hydrolyse des Rohmaterials zu Aminosäuren verantwortlich sind. Die metabolische Umwandlung dieser Aminosäuren führt zu wirksamen Aromaverbindungen und flüchtigen Stoffen, die z.B. für fermentierte Molkereiprodukte, wie z.B. Käse oder Joghurt, verschiedene Fleischprodukte, Biere und Weine, kennzeichnend sind.
Obwohl herkömmliche Proteinhydrolysate durch Einwirkung von rauhen chemischen Bedingungen auf die Proteinquelle hergestellt werden, bestand ein zunehmendes Interesse an der Gewinnung solcher Hydrolysate durch enzymatische Hydrolyse. Sowohl der chemische als auch der enzymatische Weg zielen darauf ab, mit maximaler Effizienz und niedrigsten Kosten aus der Proteinquelle hohe Gehalte an Aminosäuren freizusetzen. Aus diesem Grund sind billig verfügbare Proteinquellen wie Sojamehl und Weizengluten beliebte Substrate zum Herstellen von Hydrolysaten. Um so viele Aminosäuren wie möglich freizusetzen, werden auf dem enzymatischen Weg entweder komplexe Gemische aus mehreren Endo- und Exoproteasen eingesetzt (z.B. internationale Patentanmeldung WO 94/25 580) oder es werden Endoproteasen mit einer einzelnen, jedoch einer Exoprotease mit breitem Spektrum, kombiniert (internationale Patentanmeldung WO-A-98/27 827). In allen Fällen ist es das Ziel, einen hohen Grad an Hydrolyse und ein Endprodukt zu erhalten, das eine große Vielfalt an freien Aminosäuren enthält.
EP-A-0 495 391 beschreibt ein Proteinhydrolyseverfahren unter Verwendung von Endo- und Exoproteasen bei einer Temperatur von 5 bis 75°C und einem pH-Wert von 3 bis 9. Die Hydrolysegeschwindigkeit wird gesteuert, um die Menge an MCDP zu steuern. Mingawa et al. (Journal of Food Science 1989, Bd. 54, 1.225 bis 1.229) beschreiben ein Kaseinhydrolysat, das hohe Anteile an Leucin enthält.
Obwohl freie Aminosäuren selbst eine Anzahl von Geschmackseindrücken auslösen können, sind diese Geschmackseindrücke sehr fundamental (bitter, süß, sauer und „umami"), und die Aminosäurekonzentration, die zum Wahrnehmen dieser Geschmacksrichtungen erforderlich ist, ist hoch. Schwellenwerte für einzelne Aminosäuren können in dem Bereich von 0,3 bis 80 Millimol/Liter liegen. Trotz dieser hohen Schwellenwerte können freie Aminosäuren durch eine Anzahl von Mechanismen in viel niedrigeren Konzentrationsbereichen größere sensorische Wirkungen erzeugen.
In einen dieser Mechanismen ist freies Glutamat einbezogen, und er kann aufgrund der Synergie zwischen Glutamat und 5'-Ribonukleotiden starke geschmacksverstärkende Wirkungen erzeugen. Es ist bekannt, daß Glutamat, wenn es mit den passenden Konzentrationen von 5'-Ribonukleotiden, wie z.B. 5'-IMP und 5'-GMP, kombiniert wird, den Schwellenwert der Wahrnehmung des Umami-Geschmacks, der von Glutamat erzeugt wird, um fast zwei Größenordnungen herabsetzt. In einen anderen geschmacksverstärkenden Mechanismus sind Maillard-Reaktionen einbezogen. Im Vergleich zu freien Aminosäuren weisen Maillard-Produkte, in denen freie Aminosäuren mit Zuckern zur Reaktion gebracht worden sind, sehr viel eindrucksvollere Geschmacks- und Geruchskennzeichen auf. In Maillard-Reaktionen können sich überwältigend komplexe Geschmacks- und Geruchssysteme mit Schwellenwerten entwickeln, die mehrere Größenordnungen niedriger sind als diejenigen, die für die freien Aminosäuren verzeichnet werden.
Maillard-Produkte werden bei erhöhten Temperaturen gewöhnlich beim Kochen, Backen oder Rösten, wenn Nahrungsmittel hergestellt werden, gebildet. Während dieser Behandlungen entwickeln sich sowohl die Farbe als auch eine Reihe von Aromen. Bei diesen Reaktionen reagieren Aminogruppen mit reduzierenden Verbindungen als ein erster Schritt und führen letztendlich zu einer ganzen Familie von Reaktionswegen. In Nahrungsmitteln sind die beteiligten Aminoverbindungen vorwiegend freie Aminosäuren und Proteine, und die reduzierenden Verbindungen vertreten in erster Linie reduzierende Zucker. Zu Faktoren, welche die Maillard-Reaktion beeinflussen, gehören der Typ von Zucker und Aminosäure, die beteiligt sind, ebenso wie physikalische Faktoren, wie z.B. der pH-Wert, die Temperatur, die Wasseraktivität (aw), die Reaktionsdauer usw.
Sowohl Mono- als auch Disaccharide können an der Maillard-Reaktion teilnehmen. Im allgemeinen sind Aldosen reaktionsfähiger als Ketosen, und Pentosen reaktionsfähiger als Hexosen oder Disaccharide, und während der Typ des Zuckers in starkem Maße die Menge an erzeugten Aromastoffen beeinflußt, bestimmt die Aminosäure, die an der Reaktion beteiligt ist, in hohem Maße die Natur des gebildeten Geschmacks. Beispielsweise führt die Einbeziehung von reinem Methionin in Maillard-Reaktionssysteme oftmals zu Gemüse- oder Schmornoten, reines Cystein führt zu fleischartigen Geschmacksrichtungen, reines Prolin, Hydroxyprolin und Leucin zu Gebäckaromen (R. F. Hurrell, Food Flavours, Part A: Introduction, Elsevier Scientific Publishing Company, Eds.: I. D. Morton and A. J. Macleod). Da diese Ergebnisse unter Verwendung von reinen Aminosäuren und nicht von Gemischen aus mehreren Aminosäuren, wie sie in Nahrungsmittelzutaten vorkommen, erhalten wurden, ist es offensichtlich, daß das Ergebnis nur eine grobe Vereinfachung der natürlichen Situation darstellt. Gleichermaßen werden die Zucker, die natürlich in Nahrungsmitteln vorkommen, eine Wirkung aufweisen und die Entwicklung von Geschmack und Aroma weiter komplizieren und beeinflussen.
Außer Maillard-Reaktionen können Aminosäuren auch bei Raumtemperaturen bedeutende chemische Umwandlungen durchlaufen. Der letztgenannte Typ von Umwandlungen ist enzymabhängig und in fermentierten Nahrungsmitteln, wie z.B. Bier, Joghurt, bei Reifungsvorgängen von Käse, Fleisch und Wein, ziemlich gewöhnlich. Bei diesen Fermentationsverfahren werden aus den verwendeten Rohmaterialien durch proteolytische Enzymaktivität entweder des verwendeten Rohmaterials oder der mikrobiellen Starter freie Aminosäuren freigesetzt. Während der Reifungsphase werden die freien Aminosäuren dann durch mikrobielle metabolische Aktivität in Derivate mit verbesserten sensorischen Eigenschaften umgewandelt. Beispielsweise führen L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin zu der Bildung wertvoller Fuselalkohole wie Amylalkohole und Isobutanol bei der Biergärung. L-Leucin ist als die Vorstufe von Pökelfleischverbindungen, wie z.B. 3-Methylbutanal und 3-Methylbutanol, bekannt, während L-Phenylalanin zu Benzacetaldehyd führen kann. In ähnlicher Weise wurden flüchtige Stoffe von Käse, wie z.B. Methanthiol und Dimethylsulfid, auf das Vorkommen von Methionin in Käse zurückgeführt, ebenso wie Methylpropansäure und Methylpropanal auf Valin. Entsprechend kann das „Sur-Lie"-Verfahren, das zur Weinherstellung verwendet wird und von dem bekannt ist, daß es geschmackvollere Weine erzeugt, auf die vermehrte Gegenwart von Aminosäuren, wie z.B. Asparaginsäure, Arginin, Alanin, Leucin und Lysin, zurückgeführt werden.
Verfahren des Standes der Technik zur Proteinhydrolyse (WO 94/25 580 und WO 98/27 827) sind darauf ausgerichtet, alle verfügbaren Aminosäuren freizusetzen, und die Gegenwart so vieler verschiedener Aminosäuren wird den gewünschten ausgeprägten Geschmack oder Aromanote in dem Endprodukt undeutlich machen.
WO 98/14 599 betrifft bestimmte Polypeptide, die von Aspergillus oryzae erhalten werden, und Hydrolysate, die aus diesen Polypeptiden in Kombination mit (spezifischen oder unspezifischen) Endopeptidasen und (spezifischen oder unspezifischen) Exopeptidasen hergestellt werden. WO 98/14 599 nennt Hydrolysate, die einen erhöhten Gehalt an Leu, Gly, Ala und/oder Pro, wie z.B. 1,1 mal höher, aufweisen; jedoch werden keine Verwendungen für solche Hydrolysate genannt.
Die europäische Patentanmeldung EP-A 799 577 beschreibt ein Molkeproteinhydrolysat, wobei der Phe-Gehalt (Phenylalanin) verringert ist. Dieses Molkeproteinhydrolysat wird als Nahrungsmittel für Patienten verwendet, die an PKU (Phenylketonurie) leiden.
Voigt et al. (Food Chemistry 51 (1994) S. 7 bis 14) beschreiben die Herstellung der kakaospezifischen Aromavorstufen durch In-vitro-Proteolyse von Samenproteinen. Kakaospezifische Aromavorstufen können nur durch spezifische Hydrolyse nur eines Substrats erhalten werden, das die Globulinproteine der Kakao-Vicillin-Klasse sind.
Beschreibung der Erfindung
Erfindungsgemäß kann der gewünschte Geschmackseffekt erhalten werden, wenn der Molenbruch einer einzelnen gewünschten freien Aminosäure in dem erfindungsgemäßen Proteinhydrolysat mindestens 2,5 mal größer ist (Anreicherungsfaktor), als durch saure Hydrolyse des gleichen proteinhaltigen Substrats erhalten worden wäre. Die vorliegende Erfindung zeigt, daß solche Proteinhydrolysate durch bestimmte Kombinationen von Enzymen, oftmals mit einem ausgewählten proteinhaltigen Substrat, erhalten werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem ein Proteinhydrolysat bereit,

– das durch die enzymatische Hydrolyse eines proteinhaltigen Substrats erhältlich ist,
– das freie Aminosäuren und Peptide enthält,
– wobei der Molenbruch mindestens einer freien Aminosäure, die in dem Proteinhydrolysat vorliegt, um mindestens den Faktor 2,5, vorzugsweise um mindestens den Faktor 3, insbesondere um mindestens den Faktor 3,5, größer ist als in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist, der Anreicherungsfaktor somit mindestens 2,5, vorzugsweise mindestens 3 und insbesondere mindestens 3,5, beträgt,
– wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure in dem Proteinhydrolysat bei mindestens 25% liegt und
– wobei der Aminosäurequotient (ASQ) in dem Proteinhydrolysat mindestens 10% beträgt.

Die Erfindung betrifft ferner eine Nahrungsmittelzusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat umfaßt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen eines Proteinhydrolysats, wobei das Verfahren umfaßt:

– Hydrolysieren eines proteinhaltigen Substrats mit einer Endoprotease und einer Exoprotease unter wäßrigen Bedingungen bei einer Temperatur von 5 bis 75°C und einem pH-Wert von 3 bis 9, wobei die gemeinsame Wirkung der Endoprotease und der Exoprotease mindestens eine freie Aminosäure aus dem proteinhaltigen Substrat freisetzt, und Inkubieren der Endoprotease und der Exoprotease während eines Zeitraums, der geeignet ist, um ein Proteinhydrolysat zu erhalten, wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure, die in dem Proteinhydrolysat vorliegt, um mindestens den Faktor 2,5, vorzugsweise um mindestens den Faktor 3, insbesondere um mindestens den Faktor 3,5, größer ist als in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist,
– wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure in dem Proteinhydrolysat bei mindestens 25% liegt und
– der Aminosäurequotient (ASQ) in dem Proteinhydrolysat mindestens 10% beträgt.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Proteinhydrolysat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es entweder

(a) ein Molkeproteinhydrolysat oder ein Maisproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin ist,
(b) ein Molkeproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin ist,
(c) ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Arginin ist,
(d) ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Lysin ist,
(e) ein Hämoglobinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin ist oder
(f) ein Rinderserumalbumin-(BSA)-Proteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Glutamat ist.

Der ASQ wird im allgemeinen weniger als 40% betragen; vorzugsweise beträgt der ASQ zwischen 15 und 30%. Der Molenbruch der mindestens einen Aminosäure beträgt im allgemeinen weniger als 80%; vorzugsweise beträgt dieser Molenbruch zwischen 25 und 50%, insbesondere zwischen 25 und 40%.
Die Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats ist vorzugsweise eine enzymatische Hydrolyse, insbesondere eine enzymatische Hydrolyse durch eine Endoprotease und eine Exoprotease.
Wir haben festgestellt, daß Nahrungsmittelzusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate enthalten, einen verbesserten Geschmack erhalten, z.B. nachdem sie fermentiert, verarbeitet, gekocht und/oder mit reduzierenden Zuckern zur Reaktion gebracht wurden.
Der Molenbruch einer bestimmten freien Aminosäure in einer Zusammensetzung ist definiert als die molare Konzentration dieser freien Aminosäure in der Zusammensetzung, geteilt durch die Summe der molaren Konzentrationen aller freien Aminosäuren Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin in derselben Zusammensetzung ×100%. In dieser Beschreibung bedeutet gesamte oder alle Aminosäuren durchweg die Gesamtmenge von Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tyrosin und Valin.
Die Bestimmung des Molenbruchs einer bestimmten freien Aminosäure in der enzymatisch hydrolysierten Zusammensetzung sowie einer bestimmten freien Aminosäure in einer Zusammensetzung, die durch das vollständige Hydrolysieren des proteinhaltigen Substrats erhalten wurde, ist in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben.
Zudem wurden die Gesamtmengen an freiem Gln und Glu bzw. an freiem Asn und Asp, die während der enzymatischen Hydrolyse freigesetzt werden, erfaßt, um den Vergleich mit der Menge an freiem Glu und Asp zu ermöglichen, die nach der vollständigen Hydrolyse mit starker Säure (saure Hydrolyse desamidiert Gln und Asn-Reste, was „zusätzliches" freies Glu und freies Asp ergibt) erhalten wird. Im allgemeinen ist für Glu und Gln die Summe der Molenbrüche von Glu und Gln um mindestens einen Faktor von 2,5 (Anreicherungsfaktor), vorzugsweise mindestens um einen Faktor von 3, insbesondere um mindestens einen Faktor von 3,5, größer als die Summe der Molenbrüche von Glu und Gln in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist. Der Anreicherungsfaktor einer freien Aminosäure bedeutet den Molenbruch der freien Aminosäure, die in einem Proteinhydrolysat gegenwärtig ist, geteilt durch den Molenbruch der freien Aminosäure in Proteinhydrolysat, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert ist. Wenn das Glu/Gln-Verhältnis bekannt ist, beispielsweise im Falle eines einzelnen Kettenproteins (siehe z.B. Beispiel 8), können Glu und Gln getrennt berechnet werden. Für Asp und Asn ist die Summe der Molenbrüche von Asp und Asn um mindestens einen Faktor von 2,5, vorzugsweise um mindestens einen Faktor von 3, insbesondere um mindestens einen Faktor von 3,5, größer als die Summe der Molenbrüche von Asp und Asn in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert ist. In der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert" oder „vollständiges Hydrolysieren eines proteinhaltigen Substrats zu freien Aminosäuren" die saure Hydrolyse des proteinhaltigen Substrats, die gemäß dem Verfahren von Waters (Milford, MA, USA) durchgeführt wird, das in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben wurde.
Erfindungsgemäße Proteinhydrolysate sind durch die Gegenwart bestimmter freier Aminosäuren mit verhältnismäßig großen Molenbrüchen gekennzeichnet. Daher ist der Gesamtgrad der Hydrolyse dieser Proteinhydrolysate noch begrenzt. In dieser Patentanmeldung wird durchweg der Aminosäurequotient (ASQ) verwendet, um eine Maßeinheit des Hydrolysegrades zu quantitativ zu bestimmen. Der ASQ ist die Gesamtmenge an freien Aminosäuren, die in einem Hydrolysat gegenwärtig ist, das durch enzymatisches Hydrolysieren eines proteinhaltigen Substrats erhalten wird, bezogen auf die Gesamtmenge an Aminosäuren, die in einem Hydrolysat gegenwärtig ist, das durch vollständiges Hydrolysieren des proteinhaltigen Substrats zu freien Aminosäuren erhalten wird. Der ASQ wird als eine Prozentzahl ausgedrückt. Der ASQ kann durch Dividieren der Summe der molaren Konzentrationen aller freien Aminosäuren, die in einem Hydrolysat gegenwärtig sind, durch die Summe der molaren Konzentrationen aller Aminosäuren, die in dem Hydrolysat gegenwärtig sind, wenn das proteinhaltige Substrat vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert ist (×100%), berechnet werden. Die Proteinhydrolysate der Erfindung können ASQ aufweisen, die in dem Bereich von 10 bis 50%, vorzugsweise von 10 bis 40%, liegen.
Bevorzugte Aminosäuren sind diejenigen Aminosäuren, die in der Lage sind, wünschenswerte nahrungsmittelverträgliche Geschmacksstoffverbindungen (Geschmack und Aroma) zu erzeugen. Beispielsweise ist bekannt, daß Glycin beim Erwärmen mit dem passenden Zucker ein fleischbrühenartiges Geschmacksprofil, Leucin ein schokoladen- oder brotkrustenartiges Geschmacksprofil, Phenylalanin ein schokoladen- oder karamellartiges Geschmacksprofil und Lysin ein kartoffel- oder kochfleischartiges Geschmacksprofil erzeugen kann.
Die Proteinhydrolysate, die erfindungsgemäß an einer spezifischen Aminosäure oder einer Reihe von Aminosäuren angereichert sind, können gemeinsam mit einem ausgewählten Zucker verwendet werden, um einem Nahrungsmittel oder einer Nahrungsmittelzutat ein spezifisches Geschmacksprofil zu verleihen. Dieses spezifische Geschmacksprofil kann während der Koch-, Back- oder Röstphase der Nahrungsmittelherstellung erzeugt werden, wie es beispielsweise beim Backen von Brot besonders in der Kruste erfolgt (wobei ein Proteinhydrolysat der Erfindung dem Teig zugegeben oder oben auf den Teig gegeben wurde). Das Proteinhydrolysat und ein passender Zucker können jedoch auch vorher zur Reaktion gebracht werden (in der Abwesenheit der anderen Nahrungsmittelzutaten), um eine geeignete Aromazutat zu erhalten.
Die Umwandlung von freien Aminosäuren zu Geschmacksstoffverbindungen durch die Einwirkung von Mikroorganismen ist beträchtlich weniger gut dokumentiert als Umwandlungen, in die Maillard-Reaktionen einbezogen sind. Obwohl viele Aminosäuren bei der Aromaentwicklung von fermentierten Produkten wie Käse, fermentierten Würsten und Bieren angezeigt wurden, ist bekannt, daß hydrophobe Aminosäuren wie Valin, Leucin, Isoleucin und Phenylalanin sowie schwefelhaltige Aminosäuren wie Methionin von besonderer Bedeutung sind. Während des Alterns von Wein sind die hohen Gehalte an freiem Arginin, Lysin und Alanin besonders hervorstechend.
So sind besonders Gly, Leu, Val, Pro, Phe, Met und Lys Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie beim Erwärmen mit einem passenden Zucker wünschenswerte Geschmacksstoffverbindungen erzeugen. Zudem sind Val, Leu, Ile, Phe, Met, Arg, Lys und Ala als Aminosäuren beschrieben, die bei der Fermentation durch den geeigneten Mikroorganismus ebenfalls in Geschmacksstoffverbindungen umgewandelt werden können. Daher ist in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die freie Aminosäure aus Glu, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Pro, Met, Lys, Arg, His, Gly, Ala, Ser oder Thr ausgewählt, stärker bevorzugt ist die Aminosäure aus Glu, Pro, Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Pro, Met, Phe, Lys oder Arg ausgewählt, am stärksten bevorzugt ist die Aminosäure aus Glu, Leu, Pro, Phe, Lys oder Arg ausgewählt.
Proteinhaltige Substrate, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind proteinhaltige Materialien, die zum Verzehr durch Mensch oder Tier geeignet sind. Der Proteingehalt des proteinhaltigen Materials ist vorzugsweise wesentlich, was bedeutet, daß mindestens 20 Gew.-% Protein sind. Das proteinhaltige Substrat enthält, basiert auf Gewicht/Trockengewicht, vorzugsweise mindestens 40% Protein, stärker bevorzugt mindestens 50%, am stärksten bevorzugt mindestens 70% Protein.
Beispiele für proteinhaltige Substrate, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind pflanzliche Proteine, wie z.B. Sojaprotein, Weizengluten, Rapssamenprotein, Erbsenprotein, Alfalfaprotein, Sonnenblumenprotein, Bohnenprotein, Baumwoll- oder Sesamsamenprotein, Maisprotein, Gerstenprotein, Hirseprotein, Kartoffelprotein, Reisprotein, Kaffeeproteine, und vom Tier stammendes Protein, wie z.B. Milchprotein (z.B. Kasein, Molkeprotein), Eiweiß, Fischprotein, Fleischprotein einschließlich Gelatine, Kollagen, Blutprotein (z.B. Hämoglobin), Haar, Federn und Fischmehl. Zu bevorzugten proteinhaltigen Substraten gehören Molkeprotein, Hämoglobin, Gelatine, Kasein, Maisprotein, Sojaprotein und Gluten.
Da die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate selektiv an spezifischen Aminosäuren angereichert sind, ist es einleuchtend, daß proteinhaltige Substrate, die auch zu den normalen Zutaten der relevanten Endprodukte (Nahrungsmittelzusammensetzungen) gehören, bevorzugt sind. Außerdem sind proteinhaltige Substrate, die außergewöhnlich reich an spezifischen Aminosäuren sind, bevorzugte Quellen für die Proteinhydrolysate. Typische Beispiele für die letztgenannten proteinhaltigen Substrate sind Molkeprotein (reich an Leu und Lys), Weizengluten (reich an Gln und Pro), chemisch desamidiertes Weizengluten (reich an Glu und Pro), Maisprotein (reich an Leu und Pro), Hämoglobin (reich an Leu, His und Val), Fischkonzentrat oder Kasein (reich an Met und Lys), Erdnuß- (reich an Arg), Reisprotein (reich an Phe und Arg) oder eine Proteinfraktion, wie z.B. die α-Lactalbumin-Fraktion von Molke, die reich an Tryptophan ist. Die erhaltenen Proteinhydrolysate können Nahrungsmittelzusammensetzungen Geschmäcke verleihen, und diese Geschmäcke sind vorzugsweise nicht mit dem proteinhaltigen Substrat verknüpft. Beispielsweise wird von einem Kakaoproteinhydrolysat erwartet, daß es in der Lage ist, für einen Kakaogeschmack zu sorgen, wohingegen nicht erwartet wird, daß ein Molke- oder ein Reisproteinhydrolysat für einen Kakaogeschmack sorgen kann. Daher sorgen die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate vorzugsweise für neuartige und unerwartete Geschmäcke, die nicht mit der Quelle des proteinhaltigen Substrats in Zusammenhang stehen. Beispielsweise sorgt ein Molkeproteinhydrolysat z.B. für einen Fleisch-, Käse- oder Kakaogeschmack anstatt für einen Molkeproteingeschmack.
Erfindungsgemäße Proteinhydrolysate können durch Hydrolysieren des proteinhaltigen Substrats mit geeigneten Endoproteasen und Exoproteasen erhalten werden. Während bei enzymatischen Proteinhydrolyseverfahren des Standes der Technik typischerweise Rohgemische aus mehreren Endo- und Exoproteasen mit breiter Spezifität verwendet werden (WO 9 425 580, WO 9 827 827), erfordert das erfindungsgemäße Hydrolyseverfahren eine sorgfältige Auswahl von Kombinationen von Endo- und Exoprotease(n). Die Endo- und Exoproteasen, die zum Erzeugen eines Proteinhydrolysats durch enzymatische Hydrolyse eines proteinhaltigen Substrats geeignet sind, wobei das Proteinhydrolysat im Vergleich mit dem Säurehydrolysat des proteinhaltigen Substrats mindestens 2,5fach an bestimmten Aminosäuren angereichert ist, weisen vorzugsweise eine Bevorzugung des Spaltens neben eines bestimmten Aminosäurerestes oder einer ausgewählten Reihe von Aminosäureresten auf. Zudem sind sowohl die Endo- als auch die Exoproteasen, die zum Erzeugen eines Proteinhydrolysats durch enzymatische Hydrolyse eines Proteinsubstrats geeignet sind, wobei das Proteinhydrolysat im Vergleich mit dem Säurehydrolysat des proteinhaltigen Substrats mindestens 2,5fach an bestimmten Aminosäuren angereichert ist, vorzugsweise rein, was bedeutet, daß die Endo- und/oder die Exoprotease hauptsächlich, zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 75%, stärker bevorzugt zu mindestens 90% und am stärksten bevorzugt zu mindestens 95%, auf einer einzigen proteolytischen Aktivität beruht. In Abhängigkeit von dem Grad der Selektivität der Exopeptidase ist eine reine oder weniger reine Endoprotease erforderlich. In Abhängigkeit von dem Grad der Selektivität der Endopeptidase ist eine reine oder weniger reine Exoprotease erforderlich. Die Selektivität der Endo- und diejenige der Exoprotease sollten sich mindestens überschneiden, um die gewünschten Proteinhydrolysate zu erhalten. Daher sind beispielsweise zum Erhalten eines Proteinhydrolysats, bei dem die freie Aminosäure Leucin um mindestens einen Faktor von 2,5 mal größer ist als bei dem Säurehydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, Endo- und Exoproteasen erforderlich, die gegenüber Leucin eine gewisse Selektivität aufweisen. Proteasen mit hoher Reinheit können beispielsweise durch Reinigung von rohen proteolytischen Enzympräparaten oder durch Herstellen des Enzyms unter Verwendung von überproduzierenden rekombinanten DNA-Stämmen erhalten werden. Die Proteasen, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind vorzugsweise rekombinant und/oder für Anwendungen mit Nahrungsmittelgüte handelsüblich. Proteasen, die unter Verwendung von rDNA-Techniken hergestellt werden, d.h. durch Klonieren des Gens, das die proteolytische Aktivität in einem Wirtsorganismus kodiert, der dieses Gen überexprimiert, stellen gewöhnlich Enzympräparate bereit, die weniger kontaminierende enzymatische Aktivitäten aufweisen und daher keine kostspieligen Rückgewinnungsschritte erfordern. Zu gut bekannten Wirtsorganismen, die klonierte Gene überexprimieren gehören Hefen, Pilze oder Bakterien (beispielsweise Saccharomyces, Kluyveromyces, Aspergillus, Trichoderma, E. coli, Bacillus usw.)
Um erfindungsgemäße Proteinhydrolysate zu erhalten, kann das proteinhaltige Substrat unter Verwendung einer Kombination aus einer Endo- und einer Exoprotease hydrolysiert werden, wobei mindestens eine von der Endo- und der Exoprotease, vorzugsweise sowohl die Endo- als auch die Exoprotease, rein und selektiv für eine spezifische Reihe von Aminosäure(n) sind oder die Aminosäure(n) bevorzugt freisetzen, die in dem Proteinhydrolysat angereichert werden soll(en).
Geeignete Endoproteasen können aus tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Material stammen. Dazu gehören rekombinante Enzyme, z.B. Enzyme, die durch Genmanipulationstechniken erhalten werden. Zu bevorzugten selektiven Endoproteasen, die eine Bevorzugung zum Spalten neben bestimmten Aminosäuren aufweisen, gehören Trypsin (EC 3.4.21.4), Elastase (EC 3.4.21.36), Chymotrypsin (EC 3.4.21.1), Thermolysin (EC 3.4.24.27), Prolyloligopeptidase (EC 3.4.21.26), Glutamylendopeptidase I (EC 3.4.21.19), mikrobielle Collagenase (EC 3.4.24.3), Peptidyl-Asp-metallopeptidase (EC 3.4.24.33), Glycylendopeptidase (EC 3.4.22.25), Saccharolysin (EC 3.4.24.37), neutrale Protease (EC 3.4.24.28), Streptogrisin B (EC 3.4.21.81), Glutamylendopeptidase II (EC 3.4.21.82), manipulierte prolinspezifische Petidyl-prolyl-cis-trans-isomerasen und Enzyme mit rennetartiger Spezifität, beispielsweise mikrobielles Rennet, z.B. Mucorpepsin (EC 3.4.23.23). Zu bevorzugten nichtselektiven Endoproteasen, die keine starke Bevorzugung des Spaltens neben spezifischen Aminosäuren aufweisen, die aber beinah neben einer ausgewählten Gruppe von Aminosäuren spalten, gehören beispielsweise Subtilisin (EC 3.4.21.14) und Papain (EC 3.4.22.2).
Zu geeigneten Exopeptidasen (oder Exoproteasen; die Ausdrücke sind untereinander austauschbar) können Carboxypeptidasen und/oder Aminopeptidasen gehören. Diese Exoenzyme können von tierischem, pflanzlichem oder mikrobiellem Material stammen. Dazu gehören rekombinante Enzyme, die z.B. durch Genmanipulationstechniken erhalten werden.
Zu bevorzugten selektiven Carboxypeptidasen, die eine Bevorzugung des Spaltens neben bestimmten Aminosäuren aufweisen, gehören Carboxypeptidase B (EC 3.4.17.2), CPD-I (pep G) und CPD-II (pep F) von A. niger (Dal Degan et al., Appl. Environ Microbiol, 58 (7): 2.144 bis 2.152, 1992).
Zu bevorzugten nichtselektiven Carboxypeptidasen, die keine starke Bevorzugung des Spaltens neben bestimmten Aminosäuren aufweisen, die aber fast neben jedem Aminosäurerest spalten, gehören CPD-S₁ von P. janthinellum und CPD-Y von S. cerevisae (Dal Degan et al., Appl. Environ Microbial, 58 (7): 2.144 bis 2.152, 1992).
Zu bevorzugten selektiven Aminopeptidasen, die eine Bevorzugung des Spaltens neben bestimmten Aminosäuren aufweisen, gehören Prolyliminopeptidase (EC 3.4.11.5), bakterielle Leucylaminopeptidase von Aeromonas proteolytica (EC 3.4.11.10) oder Leucylaminopeptidase von Aspergillus-Spezies und Methionylaminopeptidase (EC 3.4.11.18) und die phenylalaninspezifischen Aminopeptidasen, die in EP 773 990 beschrieben sind.
Zu bevorzugten nichtselektiven Aminopeptidasen, die keine starke Bevorzugung des Spaltens neben bestimmten Aminosäuren aufweisen, die aber neben fast jeder Aminosäure spalten, gehört thermophile Aminopeptidase (EC 3.4.11.12).
Zu bevorzugten Kombinationen von Endo- und Exoproteasen gehören:

(a) Streptogrisin B oder Trypsin oder die Endoprotease Papain mit CPD II (um Arg oder Lys freizusetzen),
(b) Chymotrypsin oder Thermolysin oder neutrale Protease mit CPD I (um Tyr, Phe oder Trp freizusetzen),
(c) Thermolysin oder neutrale Protease mit bakterieller Leucylaminopeptidase oder Leucylaminopeptidase von Aspergillus (um Leu, Ile, Phe oder Val freizusetzen),
(d) neutrale Protease oder Subtilisin mit CPD I (um Phe oder Ala freizusetzen),
(e) Elastase mit CPD I (um Ala freizusetzen),
(f) rennetartige Proteasen mit Leucylaminopeptidase von Aspergillus oder Methionylaminopeptidase (um Met freizusetzen) und
(g) manipulierte prolinspezifische Peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (Cyproase) mit Prolylaminopeptidase (um Pro freizusetzen),
(h) prolinspezifische Endoprotease mit Malzenzymen oder CPD-Y (um Pro freizusetzen),
(i) Glutamylendopeptidase mit CPD-I (um Glu freizusetzen).

Um Proteinhydrolysate mit Aminosäuren in ihrer am höchsten angereicherten Form und mit optimalen Geschmackskennzeichen zu erhalten, könnte die bevorzugte Kombination von Endo- und Exoprotease mit dem passenden oder ausgewählten proteinhaltigen Substrat kombiniert werden. Durch Inkubieren bevorzugter selektiver Enzymkombinationen mit proteinhaltigen Substraten, die verhältnismäßig reich an einer oder mehreren gewünschten Aminosäuren sind, können bevorzugte Enzym-Substrat-Kombinationen festgestellt werden.
Zu bevorzugten Kombinationen von Enzymen und Substraten, um angereicherte Proteinhydrolysate zu erhalten, gehören:

(a) Molkeprotein mit Trypsin oder Papain und einer Carboxypeptidase CPD II (um Lys oder Arg anzureichern), oder Molkeprotein mit Thermolysin und einer Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica oder einer anderen Leucylaminopeptidase (um Leu anzureichern),
(b) Maisprotein mit Thermolysin und einer Leucylaminopeptidase (um Leu anzureichern),
(c) Reisprotein mit Thermolysin und Leucylaminopeptidase von Aspergillus (um Phe und Leu freizusetzen) und
(d) Gluten mit manipulierter prolinspezifischer Peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (Cyproase) und Prolylaminopeptidase (um Pro freizusetzen),
(e) Maisprotein mit Thermolysin und einer Leucinaminopeptidase (um Leu anzureichern),
(f) Sojaproteinisolat mit Trypsin oder Papain und einer Carboxypeptidase CPD II (um Arg und Lys anzureichern),
(g) BSA mit Glutamylendopeptidase und CPD-I (um Glu freizusetzen),
(h) Hämoglobin mit Thermolysin und Leucylaminopeptidase (um Leu anzureichern).

Kombinationen von Substrat und Enzymen (Endo- und Exoproteasen) können beispielsweise die folgenden Proteinhydrolysate ergeben:

– ein Molkeproteinhydrolysat mit einem Molenbruch an freiem Leucin von mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 27%, insbesondere mindestens 30% oder einen Molenbruch an freiem Lysin von vorzugsweise mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 35% und insbesondere mindestens 40%,
– ein Maisproteinhydrolysat mit einem Molenbruch an freiem Leucin von mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 30%, insbesondere mindestens 35%,
– ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Molenbruch an freiem Arginin von mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 30% oder einem Molenbruch an freiem Lysin von mindestens 25%,
– BSA-Hydrolysat mit einem Molenbruch an freiem Glutamat von mindestens 25%,
– ein Hämoglobinhydrolysat mit einem Molenbruch an freiem Leucin von mindestens 25%, vorzugsweise mindestens 30%, insbesondere mindestens 35%.

Die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate können durch Inkubieren der proteinhaltigen Substrate mit den geeigneten Enzymen, Endo- und Exoprotease, unter pH- und Temperaturbedingungen hergestellt werden, die für die Proteinhydrolyse geeignet sind. Geeignete pH-Werte und Temperaturen hängen von den optimalen Bedingungen für Proteasen ab, die von etwa pH 3 bis 9 und einer Temperatur von etwa 5 bis 75°C variieren können. Ausnahmsweise können Bedingungen außerhalb dieser Bereiche optimal für die Enzyme sein.
Die Enzyme und die Bedingungen der Proteinhydrolyse werden ausgewählt, um das gewünschte Proteinhydrolysat der Erfindung zu erhalten. Wenn es beispielsweise wünschenswert ist, ein Molkeproteinhydrolysat zu erhalten, das mit Leucin angereichert ist, dann wird ein Molkeproteinsubstrat ausgewählt und mit leucinspezifischen Endo- und Exoproteasen unter Bedingungen, die für die Endo- und Exoproteasen geeignet sind, um aus Molkeprotein spezifisch das Leucin freizusetzen. Beispielsweise wird Molkeprotein während fünf Stunden mit Thermolysin und Leucylaminopeptidase von Aeromonas proteolytica bei einem pH-Wert von 8 bei 40°C hydrolysiert, um ein Molkeproteinhydrolysat zu erhalten, wobei der Molenbruch an freiem Leucin, das in dem Proteinhydrolysat gegenwärtig ist, mindestens um den Faktor 2,5 größer ist als in einem Hydrolysat des gleichen Molkeproteinsubstrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist. Um zum Vergleich ein Molkeproteinhydrolysat zu erhalten, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist, wurde Molkeprotein gemäß Waters (Milford, MA, USA; siehe Abschnitt Materialien und Verfahren) sauer hydrolysiert.
Um ein erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat zu erhalten, wird das proteinhaltige Substrat in Wasser gegeben, um eine wäßrige Suspension zu erhalten. Das proteinhaltige Substrat kann in einem Anteil im Bereich von 1 bis 18%, vorzugsweise von 3 bis 15%, insbesondere von 5 bis 13% Trockengewicht proteinhaltiges Substrat/Gesamtgewicht der Suspension zugegeben werden. Der Anteil kann von der Löslichkeit des proteinhaltigen Substrats in Wasser abhängig sein. Die Endo- und die Exoprotease können bereits in dem Wasser gegenwärtig sein, dem das proteinhaltige Substrat zugegeben wird, oder die Endo- und die Exoprotease können zugegeben werden, nachdem die wäßrige Suspension des proteinhaltigen Substrats hergestellt wurde. Das proteinhaltige Substrat, die Endo- und die Exoprotease können zusammen inkubiert werden, oder die Exoprotease kann nach der Inkubation des proteinhaltigen Substrats mit der Endoprotease inkubiert werden, wobei die Endoprotease wahlweise inaktiviert worden ist, bevor die Inkubation der Exoprotease begonnen wurde. Die Bedingungen von Temperatur, pH-Wert und dergleichen werden vorzugsweise erfüllt, bevor die Enzyme zu dem Wasser oder der Suspension gegeben werden. Sobald die Enzyme (Endo- und Exoprotease) und das proteinhaltige Substrat in direktem Kontakt sind, beginnt die Proteinhydrolyse. Während der Proteinhydrolyse kann der pH-Wert auf einen konstanten pH-Wert reguliert werden oder nicht. Wenn der pH-Wert auf einen konstanten pH-Wert reguliert wird (oder auf einen pH-Wert, der in dem vorgeschriebenen Bereich gehalten wird), kann der pH-Wert z.B. durch Zugabe einer beliebigen nahrungsmittelverträglichen Säure oder Alkali eingestellt werden. Beispielsweise kann Natrium- oder Kaliumhydroxid als nahrungsmittelverträgliches Alkali verwendet werden, und Salzsäure kann als nahrungsmittelverträgliche Säure verwendet werden.
Sobald das gewünschte Proteinhydrolysat in der wäßrigen Suspension erhalten worden ist, wird die Proteinhydrolyse vorzugsweise durch Inaktivieren der vorhandenen Enzyme beendet. Die Inaktivierung kann durch Senken des pH-Wertes auf unter 5 oder durch Erhöhen des pH-Wertes auf über 8 in Kombination mit Erwärmen der Suspension auf über mindestens 7°C, vorzugsweise mindestens 90°C, bewirkt werden. Ausnahmsweise können Bedingungen außerhalb dieser Bereiche erforderlich sein, um die Proteasen zu inaktivieren. Die Inaktivierung sollte jedoch die Aminosäuren und Peptide, die in der wäßrigen Suspension gegenwärtig sind, nicht beeinflussen. Der Fachmann ist in der Lage, die besten Bedingungen zum Inaktivieren der Proteasen auszuwählen.
Die wäßrige Suspension, die das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat enthält, wird vorzugsweise weiter behandelt, um ein Proteinkonzentrat in der Form beispielsweise eines Pulvers oder einer Paste zu erhalten. Die wäßrige Suspension, die das Proteinhydrolysat enthält, kann z.B. zentrifugiert und/oder (ultra)filtriert, dann z.B. durch Eindampfen konzentriert und wahlweise in jeder beliebigen bequemen Weise, wie z.B. Sprühtrocknen, Gefriertrocknen, Wirbelbettbehandlung oder einer Kombination dieser Verfahren, getrocknet werden. Der Fachmann wird verstehen, daß das gewählte Verfahren von der Formulierung des Produktes (und seiner weiteren Verwendung) abhängen wird. Wenn das Proteinhydrolysat beispielsweise mit einem spezifischen Zucker kombiniert werden soll, um beim Erwärmen ein spezifisches Reaktionsprodukt entstehen zu lassen, dann wird das Proteinhydrolysat keinen rauhen Bedingungen ausgesetzt, die unerwünschte (vorzeitige) Maillard-Reaktionen auslösen würden. Wenn das Proteinhydrolysat in einem Nahrungsmittelfermentationsverfahren verwendet werden soll, dann sollten die verwendeten Bedingungen zur Gewinnung des Proteinhydrolysats nicht die freien Aminosäuren beeinflussen, die bei der Fermentation die gewünschten Geschmäcke erzeugen werden. Das fertige Proteinhydrolysatprodukt wird vorzugsweise in eine konzentrierte Form formuliert, wie z.B. zu einer konzentrierten Flüssigkeit, einer Paste, einem Pulver oder einem Granulat. Das konzentrierte Produkt umfaßt mindestens 20% Trockensubstanz (Gewicht Trockensubstanz/Gesamtgewicht), vorzugsweise mindestens 30% Trockensubstanz (Gewicht Trockensubstanz/Gesamtgewicht), insbesondere mindestens 40% Trockensubstanz (Gewicht Trockensubstanz/Gesamtgewicht). Ein Granulat oder ein Pulver umfaßt mindestens 80% Trockensubstanz (Gewicht Trockensubstanz/Gesamtgewicht), vorzugsweise mindestens 90% Trockensubstanz (Gewicht Trockensubstanz/Gesamtgewicht).
Alternativ kann die wäßrige Suspension, die nach der Proteinhydrolyse erhalten wird und das Proteinhydrolysat enthält, direkt zur Herstellung von umgesetzten Geschmacksstoffen oder fermentierten Geschmacksstoffen verwendet werden. Zur Herstellung eines umgesetzten Geschmacksstoffs beispielsweise kann die wäßrige Suspension, die das Proteinhydrolysat enthält, z.B. nach dem Zentrifugieren oder Konzentrieren mit einem Zucker ergänzt werden und danach erwärmt werden. Nach der Reaktion kann eine umgesetzte Geschmacksstoffzusammensetzung erhalten werden, z.B. durch Konzentrieren und/oder Trocknen des erwärmten Produktes. Zur Herstellung eines fermentierten Geschmacksstoffs kann die wäßrige Suspension, die das Proteinhydrolysat enthält, z.B. nach dem Zentrifugieren oder Konzentrieren mit einem Mikroorganismus mit Nahrungsmittelgüte unter Bedingungen, die für den Mikroorganismus geeignet sind, das Proteinhydrolysat zu fermentieren, inkubiert werden. Nach der Fermentation kann ein fermentierter Geschmacksstoff erhalten werden, z.B. durch Konzentrieren und/oder Trocknen des fermentierten Produktes.
Proteinhydrolysate, die freie Aminosäuren und Peptide enthalten und nach der enzymatischen Hydrolyse eines proteinhaltigen Substrats unter Verwendung von Endoprotease und Exoprotease erhalten werden, wobei der Molenbruch mindestens einer freien Aminosäure, die in dem Proteinhydrolysat gegenwärtig ist, um mindestens einen Faktor von 2,5, vorzugsweise um mindestens um einen Faktor von 3, insbesondere um mindestens einen Faktor von 3,5, größer als in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist, können in verschiedenen Anwendungen, einschließlich Nahrungsmitteln, verwendet werden. Die Proteinhydrolysate der Erfindung können beispielsweise in kosmetischen Formulierungen zum Behandeln von Haar oder Haut verwendet werden oder Sportgetränken zugegeben werden, um die Wiedererlangung der körperlichen Ausdauer zu verbessern. Besonders geeignet sind die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate zur Verwendung bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, fermentierten Nahrungsmitteln und fermentierten Nahrungsmittelgeschmacksstoffen und zur Verwendung bei der Herstellung von umgesetzten Geschmacksstoffzusammensetzungen, wobei das Proteinhydrolysat mit einem Zucker zur Reaktion gebracht wird, um eine umgesetzte Geschmacksstoffzusammensetzung zu erhalten. Bemerkenswerte und herausragende Geschmackskennzeichen können erhalten werden, wenn die Proteinhydrolysate der Erfindung in den obigen Nahrungsmittelpräparaten verwendet werden. Daher ist ein erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat vorzugsweise in der Lage, den Geschmack einer Nahrungsmittelzusammensetzung zu verbessern.
Das Proteinhydrolysat der Erfindung kann zur Herstellung von fermentierten Nahrungsmittelzutaten oder -produkten, wie oben beschrieben, verwendet werden. Fermentierte Nahrungsmittelzutaten oder Produkte werden durch mindestens einen Fermentationsschritt hergestellt, wobei entweder Enzyme, die dem behandelten Nahrungsmittel endogen sind, aktiv beteiligt sind oder Mikroorganismen mit Nahrungsmittelgüte mit einem Nahrungsmittel inkubiert werden, um das fermentierte Nahrungsmittel zu erhalten.
Beispiele für fermentierte Nahrungsmittel sind beispielsweise Fleischprodukte, wie z.B. Schinken oder Würste, oder Joghurt, Käse, Bier, Whisky, Wein und Champagner. Fermentierte Nahrungsmittelgeschmacksstoffe sind Geschmacksstoffe, die aus einem fermentierten Nahrungsmittel erhalten werden. Diese fermentierten Nahrungsmittelgeschmacksstoffe können durch Inkubieren des Proteinhydrolysats der Erfindung mit einem Mikroorganismus mit Nahrungsmittelgüte, der das Proteinhydrolysat zu wünschenswerten Nahrungsmittelgeschmacksstoffen fermentieren wird, erhalten werden.
In ein Verfahren zum Herstellen eines fermentierten Nahrungsmittelproduktes, wobei ein erfindungsgemäßes Proteinhydrolysat verwendet worden ist, wird die Zugabe des Proteinhydrolysates vor oder während der Fermentation dieses fermentierten Nahrungsmittelproduktes einbezogen sein. Die dem Produkt endogenen Enzyme oder die Fermentation bewirkenden Organismen werden die spezifische Aminosäure in zusätzliche Geschmacksstoffe umwandeln, die für diesen Typ von fermentiertem Nahrungsmittel kennzeichnend sind. Auf diese weise können auch Geschmäcke, die für diesen Typ von fermentierten Nahrungsmittelprodukten nicht kennzeichnend sind, erzeugt werden, was fermentierte Nahrungsmittelprodukte mit überraschenden neuen Geschmäcken ergibt.
Das fermentierte Nahrungsmittelprodukt kann beispielsweise Käse sein, und die freie Aminosäure, deren Molenbruch mindestens 2,5 mal größer ist als beim Säurehydrolysat, ist Met, Leu oder Phe. In diesem Fall kann das mit Aminosäure angereicherte Proteinhydrolysat der Milch kurz vor oder während des Milchgerinnungsverfahrens zugegeben werden. Um die Verluste an den vorhandenen freien Aminosäuren zu minimieren, kann das Hydrolysat etwas später in dem Herstellungsverfahren zugegeben werden. Bei der Herstellung von Cheddar-Käse beispielsweise kann das Hydrolysat direkt zusammen mit dem Salz dem geraspelten Quark zugegeben werden. Gleichermaßen können die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate in enzymmodifizierten Käse eingebunden werden, um die Bildung von natürlichen Käsearomen zu beschleunigen. Zur Verbesserung solcher Molkereiprodukte wird das Proteinhydrolysat vorzugsweise von Milchproteinen, wie z.B. Kasein oder Molke, gewonnen.
Das fermentierte Nahrungsmittelprodukt kann Bier sein, und die freie Aminosäure, deren Molenbruch mindestens 2,5 mal größer ist als beim Säurehydrolysat, ist Leu, Ile oder Val. In diesem Fall kann das Proteinhydrolysat von Reis- oder Gersten- oder Maisprotein erhalten werden (z.B. für Lagerbiere, um das Aromaprofil des Endproduktes zu verbessern), oder es kann von Weizengluten (z.B. für Weizenbiere, um das Aromaprofil des Endproduktes zu verbessern) erhalten werden. Bei der Herstellung von Bieren können die mit Aminosäure angereicherten Proteinhydrolysate gleich nach dem Whirlpool oder Zentrifuge und vor dem Behälter, in dem die Fermentation durch die Brauhefe erfolgt, zugegeben werden.
Das fermentierte Nahrungsmittelprodukt kann auch ein fermentiertes oder gepökeltes Fleischprodukt sein, wofür das Proteinhydrolysat aus einem Fleisch- oder Blutprotein erhalten werden kann, und die freie Aminosäure, deren Molenbruch mindestens 2,5 mal größer ist als beim Säurehydrolysat, kann Leu, Ile, Phe, Lys, His, Pro oder Gly sein. Bei fermentierten Fleischprodukten kann das Proteinhydrolysat zusammen mit den anderen Verbindungen wie Salz und Dextrose oder mit der mikrobiellen Starterkultur eingebunden werden. Bei gepökelten Fleischprodukten kann das Proteinhydrolysat verwendet werden, um durch Lösen des Hydrolysats zusammen mit zweckmäßigen Mengen von Glucose, Salz und Nitrit einen „Sud" zu erzeugen. Die Impfung mit einem geeigneten Gemisch aus Säure und aromabildenden Mikroorganismen, wie z.B. Lactobacilli und Staphylococcus carnosus, erzeugt nach einigen wenigen Tagen der Inkubation bei Temperaturen zwischen 10 und 22°C einen aromatischen Sud. Nach der Zugabe von Diphosphat zur Neutralisierung des sauren pH-Wertes kann der Sud in das Fleisch, z.B. einen Schinken, eingespritzt werden. Das Kochen des Fleisches, vorzugsweise in einem Beutel, um die Aromen darin zu bewahren, ergibt schließlich ein sicheres und geschmackvolles Produkt. Zur Anregung der Bildung von flüchtigen Geschmacksstoffverbindungen aus dem mit Aminosäure angereicherten Proteinhydrolysat sind geeignete mikrobielle Starterstämme unerläßlich. Das erfindungsgemäße Proteinhydrolysat kann auch gemeinsam mit Nitritsalz verwendet werden, um trockenen gepökelten Schinken herzustellen.
Das Proteinhydrolysat der Erfindung kann zur Herstellung von umgesetzten Geschmacksstoffen verwendet werden. Das Proteinhydrolysat und eine Zucker enthaltende Zusammensetzung werden dann zur Reaktion gebracht, um die umgesetzte Geschmacksstoffzusammensetzung zu erhalten. Zucker können z.B. aus Aldosen und Ketosen sowie aus Disacchariden, wie z.B. Xylose, Xylulose, Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose oder Gemischen davon, ausgewählt werden.
Das Proteinhydrolysat und mindestens ein reduzierender Zucker werden erwärmt, um eine Reihe von Reaktionen einzuleiten, die als Maillard-Reaktionen bekannt sind. Aminogruppen (besonders von freien Aminosäuren) reagieren mit reduzierenden Verbindungen als erster Schritt. Eine ganze Familie anderer Reaktionswege wird folgen und ergibt schließlich eine (komplexe) umgesetzte Geschmacksstoffzusammensetzung. Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Proteinhydrolysats können neuartige Typen von Geschmacksstoffen erhalten werden. Diese (umgesetzten) Geschmacksstoffe können Nahrungsmittel zugegeben werden, um den Geschmack von Nahrungsmitteln zu verbessern. Zur Herstellung des umgesetzten Geschmacksstoffes werden das mit Aminosäure angereicherte Proteinhydrolysat und der gewünschte Zucker in einem zweckmäßigen Verhältnis in Wasser gelöst und dann erwärmt. Nach der Abführung des gesamten Wassers kann der Heizvorgang sofort beendet oder fortgesetzt werden, um Temperaturen von etwa 120°C oder sogar 180°C zu erreichen. Die letztgenannten Inkubationsbedingungen führen zu erheblich unterschiedlichen Geschmacks- und Aromaprofilen. Schlußendlich kann das trockene umgesetzte Produkt als ein Pulver gewonnen und als eine Aromazutat verwendet werden.
Alternativ können Proteinhydrolysat und Zucker in Gemischen, die Wasser und z.B. Öl oder Fett enthalten, oder in der völligen Abwesenheit von Wasser z.B. durch Lösen von Zucker und Hydrolysat in einem im wesentlichen wasserfreien System, wie z.B. einem Polyalkohol, zur Reaktion gebracht werden. Der Vorteil dieses letzten Ansatzes ist, daß die Reaktion sogar bei Temperaturen über 100°C in einer Flüssigkeit stattfindet und auch das Endprodukt eine Flüssigkeit ist, was das Dosieren der Aromazutat erleichtert.
Materialien und Verfahren
Isoliertes Sojaprotein wurde als Soyamin 90 HV von Lucas Meyer (Hamburg, Deutschland) erhalten.
Maisgluten wurde als Maisin 13875 von Cerestar (Krefeld, Deutschland) erhalten.
Molkeprotein wurde entweder als WPC 80 oder WPC 75 von Havero Hoogwegt (Gorinchem, Niederlande) erhalten.
Hämoglobin wurde als HGP po-feed (etwa 90% Protein) von Harimex (Loenen, Niederlande) erhalten.
Rinderserumalbumin wurde als 98%ig reines Pulver Fraction V von Sigma-Aldrich erhalten.
K. lactis (ATCC 8585) wurde von ATCC erhalten: American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA; die Starterkultur Bitec LS-25 Plus enthält ein Gemisch von Lactobacilli und Staphylococcus carnosus und ist im Handel von Gewürzmüller, Doetinchem, Niederlande erhältlich. Die Hefe, die bei den Brotbackversuchen verwendet wurde, wurde als frische Blockhefe von DSM Gist, Delft, Niederlande erhalten. Die Käse-Starterkultur DS 5 LT1 wurde ebenfalls von DSM Gist erhalten.
Die Enzyme wurden entweder erworben und unverändert verwendet oder als Laborproben mit oder ohne zusätzliche Reinigungsschritte verwendet. Aminopeptidase von Aeromonas und Thermolysin wurden von Sigma erworben. Die Aminopeptidase von Aeromonas wies, wie erworben, eine Aktivität von 50 bis 150 (Sigma-)Einheiten pro mg Protein auf. Eine Stammlösung wurde hergestellt, die 15,3 mg Feststoffe (wie erhalten) pro ml Wasser enthielt, was einer Aktivität von 630 Sigma-Einheiten/ml entspricht. Das Thermolysin wies, wie erworben, eine Aktivität von 50 bis 100 (Sigma-)Einheiten pro mg Protein auf. Eine Stammlösung wurde hergestellt, die 50 mg Feststoffe (wie erhalten) pro ml Wasser enthielt, was einer Aktivität von 2.200 Sigma-Einheiten/ml entspricht. Trypsin (200 FIP-U/g) wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) erworben. und als trockenes Pulver dosiert.
Thermoase C160 (Thermolysin) (Los-Nr. P9EB761) 1.650.000 PU (Proteaseeinheiten)/Gramm wurde von Daiwa Kasei KK (Osaka, Japan) erhalten.
Corolase LAP (Leucylaminopeptidase von Aspergillus) (Charge 1999-07-20) mit einer Aktivität von 350.000 LAP-Einheiten/Gramm wurde von Röhm Enzyme (Darmstadt, Deutschland) erhalten.
Flüssiges Collupulin (Papain) mit einer Aktivität von etwa 5.000 NF/Milligramm wurde von DSM Gist (Seclin, Frankreich) erhalten.
Glutamylendopeptidase von B. intermedius wurde aus einer B.-subtilis-Kultur, wie beschrieben von Shevelev, A. B. et al. in Plasmid (2000), 43 (3), 190 bis 199, erhalten. Die Aktivität des gereinigten Enzyms gegenüber Z-Glu-pNA unter den beschriebenen Bedingungen betrug etwa 1 Einheit pro Milligramm.
Carboxypeptidase CPD-II (PepF) wurde aus dem Kulturfiltrat eines überproduzierenden A.-niger-Stammes erhalten, der Mehrfachkopien des pepF-Gens enthält.
Unter Verwendung der pepF-Sequenzinformationen, wie veröffentlicht (van den Hombergh et al. (1994), Gene 151, 73 bis 79) wurden Oligonukleotid-Primer entworfen, die den Glucoamylase-(glaA)-Promoter von A.-niger und 5'-nichtkodierende Sequenzen direkt fusionieren, an das pepF-Strukturgen von dem ATG-Startcodon bis zu dem TAA-Stoppcodon, unter Verwendung von PCR-Reaktionen, die dem Fachmann bekannt sind. Analoge Beispiele für Fusionen von Strukturgenen mit dem Glucoamylasepromoter sind beschrieben worden (EP-A-0 420 358, EP-A-0 463 706 und WO 99/38 956). Zuerst wurde das pepF-Strukturgen aus chromosomaler DNA von A.-niger GAM4 (CBS513.88) mittels PCR amplifiziert und gereinigt. Zweitens wurde die Promoterregion des glaA-Gens mittels PCR unter Verwendung, an dem 3'-Ende, eines Primers, der das 5'-Ende des pepF-Strukturgens überlappt, amplifiziert. Drittens wurden die beiden PCR-Fragmente mittels Fusions-PCR mit einem Oligonukleotid-Primer 5' von dem glaA-Promoter und einem Oligonukleotid-Primer, der das Stoppcodon von pepF in der umgekehrten Richtung überlappt, fusioniert. Viertens wurde das resultierende Fusionsfragment in A.-niger-Expressionsvektor pGBTOP8 (WO 99/38 956) kloniert, was ein Fusionsplasmid ergab, das den glaA-Promotor, das pepF-Strukturgen und den glaA-Terminator enthielt. Dieses Plasmid wurde mit NotI verdaut und mit pGBBAAS-1 co-transformiert, mit XhoI verdaut, zu A.-niger GAM4 (CBS513.88), im wesentlichen wie in WO 99/38 956 beschrieben. Transformanten, die zur Züchtung auf Acetamidplatten ausgewählt wurden, wurden unter Verwendung von Kolonie-PCR analysiert, um unter Verwendung bekannter Techniken die Gegenwart der pepF-Expressionskassette zu prüfen. A.-niger-PepF-Transformanten wurden unter Verwendung des Verfahrens, das oben beschrieben (WO 99/38 956) ist, in Schüttelkolben kultiviert. Nach 6tägigem Wachstum bei 34°C wurde die Kultur ultrafiltriert, um das Mycel zu entfernen. Das CPD-II-Enzym wurde unter Verwendung einer vereinfachten Version des Verfahrens, das von Dal Dagan et al. beschrieben ist (Appl. Environ. Microbiol. 58 (7), S. 2.144 bis 2.152 (1992)) gereinigt. Nach Verdünnung mit einer angemessenen Menge von Puffer A wurde das Ultrafiltrat auf eine Q-Sepharose-FF-Säule in einem Akta-System gegeben. Der Puffer A war 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0, und Puffer B war 50 mM Phosphat pH 6,0 und enthielt 1 M NaCl. Die Elution wurde mit einem Gradienten von 10% Puffer B (in Puffer A) bis 50% Puffer B (in Puffer A) durchgeführt. Aktive Fraktionen wurden auf der Grundlage der enzymatischen Aktivität gegenüber dem synthetischen Peptid FA-Ala-Lys-OH (Bachem) bei einem pH-Wert von 4,1 vereinigt. Die Aktivität des fertigen, im wesentlichen gereinigten Enzyms betrug 1.176 U/ml und wurde an 5 mM FA-Ala-Lys-OH in 50 mM Natriumacetat/1 mM EDTA pH 4,1 analysiert. Die Hydrolysegeschwindigkeit wurde bei 331 nm während Minuten bei 25 Grad C gemessen. Eine Einheit ist definiert als 1 Mikromol gespaltenes Substrat pro Minute.
Carboxypeptidase CPD-I (PepG) wurde aus einer Kulturbrühe von A. niger ebenfalls gemäß F. Dal Degan et al. isoliert (Appl. Environ. Microbiol., 58 (7), S. 2.144 bis 2.152 (1992), mit der Ausnahme, daß der CABS-Sepharose-Schritt ausgespart wurde. Die Aktivität des fertigen, im wesentlichen gereinigten Enzyms wurde unter Verwendung der Aktivitätsmeßvorschrift für dieses Enzym, wie bereitgestellt, an FA-Phe-Ala-OH (Bachem) bei einem pH-Wert von 4,5 und 25 Grad C zu 150 Einheiten/ml bestimmt.
Aminopeptidase II von Bacillus stearothermophilus (Stamm NCIMB 8924) wurde gemäß der Arbeitsweise, die von Stoll et al. beschrieben ist (BBA 438 (1976), 212 bis 220), isoliert. Die Reinheit des Enzyms wurde mittels Gel-Elektrophorese unter nativen und denaturierenden Bedingungen (SDS) geprüft. Die Identität des isolierten Enzyms wurde mittels Edman-Abbaus von 9 Aminosäuren des aminoterminalen Endes des Enzyms bestätigt. Das Enzym wurde durch die Zugabe von CoCl₂ aktiviert. Unter Verwendung des Lowry-Reagenzes wurde die Proteinkonzentration der fertigen Enzymlösung mit 7,2 mg Protein pro ml bewertet. Unter Verwendung von Leucin-p-nitroanilid als dem Substrat wurde die Exopeptidaseaktivität dieser Lösung zu 420 Einheiten pro ml bestimmt. Die Aktivitätsprüfung wurde bei einem pH-Wert von 7,2 mit 3 Millimol pro Liter Substrat während 15 Minuten bei 25°C durchgeführt, und die Absorption wurde bei 400 Nanometern gegen eine Blindprobe gemessen.
Bestimmung der molaren Konzentrationen der freien Aminosäuren in einem Hydrolysat
Die Enzyminkubationen mit den verschiedenen Proteinsubstraten wurden unter Schütteln unter pH- und Temperaturbedingungen durchgeführt, die in den Beispielen spezifiziert sind. Die Inkubationen wurden nach den angegebenen Zeitspannen durch Zentrifugieren während 15 Minuten mit maximal zulässiger Geschwindigkeit in entweder einer Eppendorf-Zentrifuge oder in einer Heraeus-Megafuge 3,0 R, um jegliches ungelöstes Proteinsubstrat zu entfernen, beendet. Anschließend wurde der pH-Wert des klaren Überstandes eingestellt und dann auf 95°C erwärmt, um jegliche proteolytische Restaktivität zu zerstören. Ein zusätzlicher gebildeter Niederschlag wurde mittels einer weiteren Zentrifugierung entfernt. Nach dem Entfernen wurde der klare Überstand im gefrorenen Zustand gehalten, bis die Aminosäureanalyse durchgeführt werden konnte. Alternativ wurde der klare Überstand lyophilisiert, um weiteres Prüfen in Anwendungsexperimenten zu ermöglichen.
Die Aminosäureanalyse wurde an dem klaren Überstand gemäß dem PicoTag-Verfahren durchgeführt, wie spezifiziert in dem Bedienerhandbuch des Amino Acid Analysis Systems von Waters (Milford, MA, USA). Die Aminosäureanalyse erfolgte sofort nach dem Auftauen des Probenmaterials. Zu diesem Zweck wurde eine geeignete Probe von der aufgeschmolzenen Flüssigkeit genommen, in verdünnte Säure gegeben und homogenisiert. Von der letztgenannten Lösung wurde eine neue Probe genommen, getrocknet und unter Verwendung von Phenylisothiocyanat derivatisiert. Die verschiedenen gegenwärtigen derivatisierten Aminosäuren wurden unter Verwendung von HPLC-Verfahren quantitativ bestimmt.
Bestimmung der molaren Konzentrationen der freien Aminosäuren in einem Hydrolysat, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert ist.
Die saure Hydrolyse der Proteinhydrolysate zur Gewinnung freier Aminosäuren wurde mittels Dampfphasenhydrolyse über 6 N HCl, ebenfalls gemäß Waters, durchgeführt. Kurz dargestellt ist dieses Verfahren das folgende: Eine Probe des klaren proteinhaltigen Überstandes, der nach der Enzymhydrolyse erhalten wurde, wird in einer verdünnten HCl-Lösung homogenisiert. Die resultierende Lösung wird dann einer Dampfphasenhydrolyse gemäß Waters unterworfen. Nach dieser sauren Hydrolyse werden die Aminosäuren derivatisiert und gemäß dem PicoTag-Verfahren (siehe oben) analysiert.
Da bei der sauren Hydrolyse Trp und Cys zerstört werden, sind diese Aminosäuren nicht in die dargebotenen Daten einbezogen. Jedoch werden Gln- und Asn-Reste bei der sauren Hydrolyse zu Glu und Asp umgewandelt, so daß die Werte für Glu und Gln und für Asp und Asn üblicherweise summiert wurden, um einen Vergleich mit den Daten zu ermöglichen, die vor der sauren Hydrolyse erhalten wurden. Nur in Beispiel 8 wurde eine unterschiedliche Verfahrensweise angewendet.
Beispiele
Beispiel 1
Aminosäuren wie Leucin und Valin sind damit in Verbindung gebracht worden, in Maillard-Produkten brotenkrustenartige Gerüche zu erzeugen. Um die Bildung solcher Gerüche während des Brotbackens zu begünstigen, wäre es vorteilhaft, ein natürliches Proteinhydrolysat zu erzeugen, das verhältnismäßig reich an diesen beiden Aminosäuren ist. Um eine selektive Aminosäureanreicherung zu erzielen, wurde ein Proteinsubstrat, das verhältnismäßig reich an Leucin und Valin ist, mit einer selektiven Endoprotease und einer selektiven Exoprotease kombiniert. Das Enzym Thermolysin mikrobiellen Ursprungs ist bekannt dafür, daß es Peptidbindungen auf der aminoterminalen Seite voluminöser hydrophober Aminosäuren wie Ile, Leu, Val und Phe spaltet.
Obwohl in der wissenschaftlichen Literatur verschiedene selektive Aminopeptidasen bekannt sind, sind die meisten von ihnen aus Säugetiergewebe isoliert worden oder bekannt dafür, daß sie membrangebunden sind. Die letzten beiden Merkmale machen diese Enzyme für Anwendungen mit Nahrungsmittelgüte und solche mit niedrigen Kosten weniger attraktiv. Eine Ausnahme ist die bakterielle Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica (EC 3.4.11.10). Dieses Enzym ist mikrobiellen Ursprungs, leicht löslich und weist eine deutliche Bevorzugung von hydrophoben Aminosäuren auf, und nur Asparagin-, Glutamin- und Cysteinsäure sind äußerst beständig gegenüber Entfernen (Prescott, J. M. und Wilkes, S. H., Methods in Enzymol: 45, 530 (1976)).
Um ohne gleichzeitige Freisetzung von unerwünschten Aminosäuren soviel Leucin wie möglich freizusetzen, ist es einleuchtend, daß das Proteinsubstrat, das zur enzymatischen Hydrolyse verwendet wird, sorgfältig ausgewählt werden sollte. Von den vielen handelsüblichen Proteinsubstraten sind nur Molkeproteinisolat, Hämoglobin und Maisproteinisolat verhältnismäßig reich an Leucin und Valin. In diesem Beispiel wurde Molkeproteinisolat (WPC 80) verwendet.
Das Proteinsubstrat, Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica wurden alle gleichzeitig unter den unten spezifizierten Bedingungen inkubiert. Nach Inkubation während 5 Stunden wurden die Flüssigkeiten verarbeitet, wie in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Ausgefällter oder ungelöster Stoff wurde mittels Zentrifugieren während 15 Minuten bei Höchstgeschwindigkeit in einer Eppendorf-Zentrifuge entfernt. Der Überstand wurde entfernt und in gefrorenem Zustand bei –20°C gehalten.
Proben des Überstandes wurden sofort nach dem Auftauen gemäß dem Picotag-Verfahren von Waters (Milford, MA, USA) auf den Aminosäuregehalt hin analysiert.
Tabelle 1 stellt die Verteilung der Aminosäuren, wie sie nach der Hydrolyse mit 6 N HCl vorlag, im Vergleich zu der Verteilung der Aminosäuren, die nach der Inkubation mit den Enzymen festgestellt wurde, bereit. Für alle relevanten freien Aminosäuren wurden der Anreicherungsfaktor, der Molenbruch und die ASQ-Werte gemäß den bereitgestellten Definitionen berechnet. Die Molenbrüche und die Anreicherungsfaktoren sind für alle Aminosäuren angegeben (als T + Ae bzw. T + Ae/6 N HCl, siehe Tabelle 1). Werte für Trp und Cys wurden ausgespart, Werte für Glu und Gln sowie Asp und Asn wurden in Tabelle 1 zu einem Wert summiert.
Tabelle 1: Substrat Molkeproteinisolat
Legende:

T + Ae = Molenbruch von Aminosäuren nach Behandlung mit Thermolysin + Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica; sofern nicht anders angegeben, bezieht sich in allen weiteren Beispielen die Menge an zugegebenem Enzym auf die Enzympräparate, die in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben sind.
6 N HCl = Molenbruch von Aminosäuren, erhalten nach Hydrolyse mit 6 N HCl von hydrolysiertem Molkeprotein nach Enzyminkubation (Waters) Molenbruch von AS nach T + Ae-Inkubation
T + Ae/6 N HCl = Molenbruch von AS nach Hydrolyse mit 6 N HCl Diese Spalte (T + Ae/6N HCl) zeigt den Anreicherungsfaktor einer freien Aminosäure.

Bedingungen: Zu 2 Millilitern 100 Millimol/Liter Phosphatpuffer, die 10 Gew.-% WPC 80 enthielten, wurden 20 Mikroliter Thermolysin (Sigma) und 33 Mikroliter Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica zugegeben; die Inkubation erfolgte während 5 Stunden bei 40°C, pH 8,0.
Trotz der begrenzten Selektivität der beiden verwendeten Enzyme lieferte ihre Kombination mit dem Molkeproteinisolat ein eindrucksvolles Ergebnis: Leucin, Isoleucin und Valin zusammen stellten viel mehr als 50% aller verfügbaren freien Aminosäuren dar (was mindestens 3 mal mehr ist, als unter Verwendung des Säurehydrolysats von Molke erhalten werden kann). Trotzdem sind die Molenbruchwerte von Isoleucin und Valin (beide 21,5%) zu niedrig in diesem Experiment, so daß in dem Hydrolysat als Ganzem nur Leucin (Molenbruch 33,3%) die Vorgabe erfüllt. Die Höhe des ASQ betrug bei dieser Inkubation etwa 15%.
Beispiel 2
In Beispiel 1 wurde Molkeproteinisolat mit Thermolysin und einer selektiven Aminopeptidase, die von Aeromonas proteolytica erhalten wurde, inkubiert, wobei es das Ziel war, die Ausbeute hinsichtlich einer spezifischen Aminosäure zu maximieren, die sich in diesem Fall als Leucin erwies. Obwohl ein zufriedenstellendes Ergebnis erhalten wurde, blieb es unklar, ob das Ergebnis durch die Selektivität der Endoprotease oder die Selektivität der verwendeten Exoprotease bedingt war.
In diesem Beispiel wurden Inkubationen mit Thermolysin und entweder mit der selektiven Aminopeptidase von Aeromonas oder mit der Aminopeptidase AP II mit breitem Spektrum von Bacillus stearothermophilus durchgeführt. Die thermophile Aminopeptidase AP II mit breitem Spektrum wurde aus dem Bacillus-stearothermophilus- Stamm NCIMB8924, wie vorher in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben, isoliert.
Die Enzyminkubation wurde unter den Bedingungen durchgeführt, die unterhalb von Tabelle 2 spezifiziert sind, wonach die Reaktion beendet wurde und das Reaktionsgemisch wie in Beispiel 1 verarbeitet wurde. Die verhältnismäßig kurze Inkubationsdauer wurde gewählt, um das unspezifische Spaltungsmuster von Aminopeptidase AP II im Verhältnis zu der Aminopeptidase von Aeromonas so weit wie möglich zu minimieren.
Tabelle 2: Substrat Molkeproteinisolat
Legende:

T + Ae = Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica
T + AP = Thermolysin und AP II von B. stearothermophilus
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Molkeprotein nach Enzyminkubation (Waters)

Bedingungen: T + AP: Zu 1.850 Mikrolitern 100 Millimol/Liter Phosphatpuffer, die 1 Millimol/Liter CoCl₂ und 10 Gew.-% WPC 80 enthielten, wurden 10 Mikroliter Thermolysin (Sigma) und 140 Mikroliter AP II von B. stearothermophilus zugeben. Die Inkubation erfolgte während 1 Stunde bei 60 Grad C, pH 8,0.
T + Ae: wie in Beispiel 1, jedoch mit einer Inkubationsdauer von nur 1 Stunde.
Die kombinierten Aktivitäten von Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas ergaben eine Ausbeute an Leucin, die einen Molenbruch von 36% aller verfügbaren freien Aminosäuren (was mindestens 3 mal mehr war, als durch saure Hydrolyse erhalten wurde) und einen Anreicherungsfaktor von 3,3 darstellt. Beide Inkubationen zeigten einen ASQ-Wert von etwa 12%.
Bei der Inkubation mit Thermolysin und AP II stellt Leucin 22% oder nur etwa 2 mal mehr dar, als durch saure Hydrolyse erhalten wurde, und erfüllt nicht die Forderung eines Molenbruchs von mindestens 25%. Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas stellen somit die bevorzugte Kombination zur Freisetzung von Leucin aus Molkeprotein dar.
Beispiel 3
In Beispiel 1 und 2 wurde der selektive Abbau von Molkeproteinisolat durch Analyse des Gehaltes an freien Aminosäuren nach Inkubation mit verschiedenen Enzymen demonstriert. In Beispiel 2 wurde gezeigt, daß die Kombination von Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas ein Hydrolysat ergab, das im Vergleich zu einem Säurehydrolysat bedeutend an Leucin angereichert war (3,3fach). Das Kombinieren von Thermolysin mit dem Enzym AP II von B. stearothermophilus ergab ein Hydrolysat, das mit Leucin angereichert war, d.h. um einen Faktor von 2,1 im Vergleich zu einem Säurehydrolysat.
Um festzustellen, ob solche Unterschiede zu wahrnehmbaren Geruchseffekten in Maillard-Reaktionen führen können oder nicht, wurde eine Anzahl von Experimenten durchgeführt. In einem ersten Experiment wurde 0,13 g reines Leucin mit Glucose (0,19 g), Fructose (0,19 g), Maltose (0,39 g) oder Sucrose (0,39 g) in Wasser unter Rühren bei einer Temperatur von 135°C zur Reaktion gebracht. Das Ziel dieses Experimentes war es herauszufinden, welcher Zucker in Kombination mit dem Überschuß an vorhandenem Leucin beim Freisetzen von Gerüchen am wirksamsten ist. Nach etwa 90 Minuten Erwärmen war das gesamte vorhandene Wasser verdampft. Nach etwa 60 Minuten Erwärmen (wobei etwas Wasser zurückblieb) begannen die Fläschchen, die Glucose und Fructose enthielten, einen süßen, brotkrustenartigen Geruch zu entwickeln, während die Fläschchen, die Maltose und Sucrose enthielten, nur einen Eindruck von Kakao ergaben. Nach. dem Erwärmen während 100 Minuten bei 135°C erzeugten Glucose und Fructose einen nur schwachen Geruch, während Maltose und Sucrose einen stärker ausgeprägten süßen, brotkrustenartigen Geruch erzeugten.
Da die Inkubation mit Fructose den stärksten brotkrustenartigen Geruch ergab, wurde dieser Zucker zum Durchführen von Maillard-Reaktionen mit den Hydrolysaten, die in Beispiel 2 spezifiziert sind, ausgewählt.
Unter Verwendung der Daten, welche die gesamten freien Aminosäuren betreffen, die bei jeder Inkubation gegenwärtig sind, wurden 3 Reaktionsfläschchen vorbereitet, die identische Mengen an freien Aminosäuren enthielten (etwa 40 Mikromol in zwei Millilitern). Falls erforderlich, wurde etwas Wasser zugegeben, um identische Volumina in jedem der 3 Fläschchen zu erhalten. Zum Schluß wurde jedem Fläschchen ein geringer Überschuß an Fructose zugegeben (55 Mikromol) und die Reaktion durch Erwärmen der Fläschchen auf eine Temperatur von 127°C eingeleitet.
Nach der Abführung des gesamten Wassers wurde eine erfahrene Jury gebeten, die von jedem Fläschchen freigesetzten Gerüche zu kommentieren. Ihre Kommentare sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
Das verwendete Substrat fügt den anfänglichen Geruchsprofilen einen bedeutenden Milchcharakter hinzu. Gegenüber den Proben, die mit Thermolysin und Aminopeptidase von Aeromonas behandelt wurden, können den Proben, die mit Thermolysin und AP II behandelt wurden, bedeutende Unterschiede in der Geruchsfreisetzung zugeschrieben werden. Ein Anreicherungsfaktor für bestimmte Aminosäuren von nur 2,1, wie er bei dem Verdau mit Thermolysin und AP II erhalten wurde, ist anscheinend unangemessen, um in Maillard-Reaktionen erheblich abweichende Gerüche zu erzeugen.
Tabelle 3
Legende:

T + Ae = Molkeproteinhydrolysat, hergestellt mit Thermolysin + Aminopeptidase von Aeromonas proteolytica
T + AP II = Molkeproteinhydrolysat, hergestellt mit Thermolysin + AP II von Bacillus stearothermophilus

Beispiel 4
In Beispiel 3 haben wir gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Proteinhydrolysate in der Lage sind, in Maillard-Experimenten spezifische Aromen zu erzeugen. Das Ziel des gegenwärtigen Beispiels ist es zu zeigen, daß erfindungsgemäße Proteinhydrolysate auch verwendet werden können, um bei der Inkubation mit Mikroorganismen die Bildung spezifischer Aromen anzuregen.
Ausgehend von Hämoglobinpulver der Handelsqualität (HGP Po-Feed von Harimex, Niederlande) wurde eine 5%ige (Gew./Vol.) Suspension in destilliertem Wasser hergestellt, wonach der pH-Wert unter Verwendung von 4 N HCl auf 7,0 eingestellt wurde.
Eine Portion von 500 ml dieser Suspension wurde mit einem Thermolysin der Industriequalität (Thermoase C160 von Daiwa Kasei, Japan) inkubiert, und eine andere Portion von 500 ml der Suspension wurde mit diesem Thermolysin und einer leucinspezifischen Aminopeptidase von Aspergillus von Industriequalität (Corolase LAP von Röhm Enzyme, Deutschland) inkubiert. Je 500 ml Suspension wurden 2,5 Gramm des Thermoasepulvers und 0,2 ml der Corolase-LAP-Flüssigkeit zugegeben. Beide Enzyminkubationen wurden bei 50°C während 4 Stunden durchgeführt und die Reaktionen dann durch Ansäuern der Flüssigkeiten auf pH 3,0 unter Verwendung von 4 N HCl beendet. Sofort danach wurden die beiden angesäuerten Suspensionen zentrifugiert (während 30 Minuten bei 3.500 U/min in einer Megafuge 3.0 R von Heraeus), um die Häme aus dem Hämoglobin zu fällen, und die beiden Überstände wurde abgenommen und einer Wärmebehandlung von 30 Minuten bei 95 Grad C unterworfen. Von dem Überstand, der von der Inkubation mit Thermoase und Corolase LAP stammte, wurde eine kleine Probe zur Aminosäureanalyse verwendet. Danach wurden beide Überstände lyophilisiert. Die Suspension, die nur mit Thermoase inkubiert wurde, ergab 20 Gramm trockenes Pulver, und die Suspension, die mit den 2 Enzymen inkubiert wurde, ergab 18 Gramm trockenes Pulver.
Die Analyse der freien Aminosäuren, die in dem Hämoglobinhydrolysat gegenwärtig waren, das durch Inkubation mit sowohl der Endo- (d.h. Thermoase) als auch der Exoprotease (d.h. Corolase LAP) hergestellt war, zeigte eine beträchtliche Anreicherung an Leucin, Isoleucin und Methionin (Tabelle 4). Die Molenbruchwerte von sowohl Isoleucin als auch Methionin sind jedoch niedriger als die geforderten 25%, so daß nur Leucin die Vorgabe erfüllt. Der Aminosäurequotient des Präparats, der gemäß der Arbeitsweise bestimmt wurde, die in dem Abschnitt Materialien und Verfahren kurz dargestellt ist, betrug 15%, und der Molenbruch von Leucin betrug 37%. Die Freisetzung von Aminosäuren durch Inkubieren von Hämoglobin mit Thermoase allein war sehr begrenzt, so daß diese Daten in der Tabelle ausgespart wurden.
Tabelle 4: Substrat Hämoglobin
Legende:

T + C = Thermoase + Corolase LAP
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Hämoglobin nach Enzyminkubation

Bedingungen: Hämoglobin, 5 Gew.-% in 500 ml Wasser, pH 7 und inkubiert mit 2,5 Gramm Thermoasepulver und 200 Mikrolitern Corolase LAP während 4 Stunden bei 50 Grad C.
Um zu beweisen, daß ein Proteinhydrolysat, das an spezifischen Aminosäuren erfindungsgemäß angereicht ist, in unterschiedlichen Fermentationsverfahren spezifische Aromen erzeugen kann, wurde eine Anzahl von Experimenten durchgeführt.
In einem ersten Experiment wurde die Hefe Kluyveromyces lactis in Minimalmedium, ergänzt mit entweder dem mittels Thermoase oder dem mittels Thermoase/Corolase LAP hydrolysierten Hämoglobin gezüchtet, wonach Aromen der beiden Fermentationsbrühen von einer erfahrenen Jury verglichen wurden. Minimalmedien, die 40 Gramm NaCl/Liter, 14,2 Gramm Na₂HPO₄ und 0,34 Gramm KNO₃/Liter enthielten, wurden auf einen End-pH-Wert von 5,5 eingestellt und mit 0,5 Gramm/Liter entweder des mittels Thermoase hydrolysierten Hämoglobinpulvers oder mittels Thermoase/Corolase LAP hydrolysierten Hämoglobinpulvers ergänzt. Die beiden Medien wurden in duplo in Flaschen (50 ml in 100-ml-Flaschen) gefüllt und während 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nach dem Erreichen einer Temperatur von etwa 30°C wurden die Flaschen mit 1% einer ausgewachsenen Vorkultur von K. lactis (ATCC 8585) geimpft, die zentrifugiert und in dem gleichen Volumen von physiologischer Salzlösung resuspendiert wurde, um die Hauptmenge an freien Aminosäuren, die in dem YEPD-Medium, das für die Vorkultur verwendet wurde, gegenwärtig waren, zu entfernen. Dann wurden die Flaschen verschlossen und während 7 Tagen ohne Schütteln bei 20°C inkubiert.
Nach dem erneuten Öffnen der Flaschen wurde der Geruch der Atmosphäre oberhalb der beiden Medien von Mitgliedern der Jury gerochen. Ihre Beobachtungen sind in Tabelle 5 spezifiziert.
In einem zweiten Experiment wurde eine gewerbliche Fleischstarterkultur, die verschiedene Lactobazillen und Staphylococcus carnosus enthielt, in Minimalmedium in der Gegenwart von Dextrose und Nitrit gezüchtet und wiederum mit entweder dem mittels Thermoase oder dem mittels Thermoase/Corolase LAP hydrolysierten Hämoglobinpulver ergänzt. Nach der Inkubation wurde der Geruch der beiden Fermentationsflaschen von einer erfahrenen Jury verglichen. In diesem Experiment enthielt das Medium 6 Gramm Dextrose/Liter, 20 Gramm Colorozo-Salz/Liter (Colorozo-Salz ist ein gewerbliches Präparat, das von Verstegen, Rotterdam, Niederlande geliefert wird und 0,6% Nitrit in NaCl enthält) und 1 Gramm/Liter entweder des mittels Thermoase oder Thermoase/Corolase LAP hydrolysierten Hämoglobinpulvers. Der pH-Wert der beiden Medien wurde auf 5,5 eingestellt und mit 0,3 Gramm Starterkulter Bitec LS-25 Plus pro Liter Medium geimpft, d.h. ohne vorherige Sterilisation des Mediums. Die Fermentation erfolgte in geschlossenen Flaschen (50 ml in einer 100-ml-Flasche) bei 22°C während 30 Stunden, dann 15°C während 2 Tagen und dann 6°C während 3 Tagen. Während dieses Zeitraums fiel der pH-Wert beider Fermentationen auf etwa 4,0.
Wie vorher wurde der Geruch der Fermentationen sofort nach dem Öffnen der Flaschen untersucht. Die Beobachtungen der Jury sind in Tabelle 5 verzeichnet.
Tabelle 5 – Geruchseindrücke von Minimalmedien, ergänzt mit verschiedenen Hämoglobinhydrolysaten und geimpft mit verschiedenen mikrobiellen Starterkulturen
In einem dritten Experiment wurde das Hämoglobinpräparat, das erfindungsgemäß an Leucin angereichert war, in einer industriell hergestellten, trockenen, fermentierten Wurst vom Cervelat-Typ geprüft.
Zu diesem Zweck wurden größere Portionen des Hämoglobinhydrolysats nur mit Thermoase oder mit Thermoase und Corolase LAP unter Erfüllung der Spezifikationen, die in Tabelle 4 veranschaulicht sind, hergestellt. Nach der Lyophilisation wurden Mengen von 75 Gramm jedes Pulvers zu zwei 8-Kilogramm-Portionen des Gemisches aus Fleisch, Kollagen, Fett, gekochter Schwarte, Dextrose, Natriumascorbat zugegeben und gründlich vermischt. Außer Salz (mit 0,6% Nitrit) und Pfeffer wurden keine anderen Gewürze eingebunden, um die Identifizierung von Aromaunterschieden, die durch die spätere Zugabe der Hydrolysate verursacht werden, zu erleichtern. Zu einer dritten Portion des Fleischteiges wurde kein Hydrolysat gegeben. Vor der Zugabe des Hydrolysats enthielt der Fleischteig etwa 17% Fleischprotein. In allen drei Präparaten wurde Bitec LS-25 Plus als die Starterkultur verwendet.
Nach Inkubationszeiträumen von 21 Tagen und 49 Tagen bei 18 Grad C, um Wasserverluste von mindestens 20% zu erhalten, wurden die Würste in Scheiben geschnitten und von einer erfahrenen Jury beurteilt. Würste, die aus dem Teig hergestellt waren, der das Hämoglobinhydrolysat mit hohen Gehalten an freiem Leucin enthielt, wurden als einen kräftigeren, stärker brühigen Geschmack aufweisend erachtet als Würste, die aus Teig ohne zugegebenes Hydrolysat hergestellt waren.
Der Geschmack von Würsten, die das Hydrolysat enthielten, das nur mit Thermoase inkubiert war, lag dazwischen, war deutlicher als derjenige des Bezugsmaterials, aber weniger kräftig als derjenige des Teiges, der mit hohen Gehalten an freiem Leucin angereichert war.
Beispiel 5
Erfindungsgemäße Hydrolysate können nicht nur verwendet werden, um Wurst brühigere Aromaprofile zu geben, sondern sind auch nützlich, um Brot mit einem ausgeprägteren Brotaroma zu backen.
Wie Molkeprotein und Hämoglobin ist Maisprotein sehr reich an Leucin, aufgrund seines kennzeichnenden Getreidearomas aber viel besser zur Einbindung in Brot geeignet als jede dieser Alternativen. Unter Verwendung der gleichen Kombination von Thermoase und Corolase LAP, die in Beispiel 4 verwendet wurde, wurde Maisprotein (Maisin 13875 von Cerestar, Krefeld, Deutschland) unter Bedingungen, die in der Legende der Tabelle 6 spezifiziert sind, verdaut. Nach der Inkubation wurden die Enzyme durch Senken des pH-Wertes unter Verwendung von 4 N HCl auf 5,0, gefolgt vom Erwärmen während 45 Minuten auf 95 Grad C, inaktiviert. Es wurden Proben für die Aminosäureanalyse genommen, wonach der Rest des Materials lyophilisiert wurde.
Die Aminosäureanalyse der enzymatischen Hydrolysate sowie der 6-N-HCl-Hydrolysate zeigt, daß freies Leucin mit einem ASQ von 32%, einem Anreicherungsfaktor von 5,8 und einem Molenbruch von 41,8% reichlich erzeugt wird. Außer Leucin erfüllt keine andere Aminosäure die Anforderungen.
Vor der Zugabe zu dem Teig wurden Mengen von 1,11, 5,56 und 11,13 Gramm lyophilisiertem Hydrolysat in 20 ml Wasser aufgelöst. Eine Portion von 20 ml Wasser enthielt kein Hydrolysat. Dann wurde jede dieser Portionen Wasser von 20 Milliliter mit Brotteig vermischt, der 2.000 Gramm Mehl, 40 g Salz, 44 Gramm frische Hefe und weitere 1.150 Milliliter Wasser enthielt, die 80 Milligramm Ascorbinsäure, 50 Milligramm Fermizyme P200 und 120 Milligramm Fermizyme HS2000 (beide von DSM Bakery Ingredients, Delft, Niederlande) enthielten.
Nach einer Vorgärdauer von 35 Minuten bei 30 Grad C wurde dem Teig eine weitere Gärdauer von 75 Minuten bei 34 Grad C ermöglicht. Das Backen erfolgte während 10 Minuten bei 280 Grad C, gefolgt von weiteren 20 Minuten bei 225 Grad C. Am folgenden Tag wurde das Brot in Scheiben geschnitten und von einer erfahrenen Jury bewertet.
Die geringste Hydrolysatdosierung (1,11 Gramm je 3.100 Gramm Teig) wies keine bemerkbare Auswirkung auf das Brotaroma auf. Die höchste Zugabestufe (11,13 Gramm pro 3.100 Gramm Teig) ergab jedoch ein kräftiges, blumiges Aroma, das von dem Brot ohne zugegebenes Hydrolysat deutlich unterschieden werden konnte. Diese hohe Zugabestufe wies leider eine negative Auswirkung auf das Laibgesamtvolumen aus. Die Zugabe von 5,56 Gramm Hydrolysat ergab eine weniger intensive Auswirkung auf das Aroma, wies aber keine nachteilige Auswirkung auf das Laibvolumen auf.
Tabelle 6: Substrat Maisprotein
Legende:

T + C = Thermoase + Corolase LAP
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Maisprotein nach Enzyminkubation

Bedingungen: Zu 500 ml Wasser, das 6 Gew.-% Maisin enthielt, wurden 2,5 Gramm Thermoase und 0,2 Milliliter Corolase LAP gegeben. Die Inkubation erfolgte während 4 Stunden bei 50°C und einem Anfangs-pH-Wert von 7.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die selektive Anreicherung von Molkeproteinisolat (WPC 75) mit Lysin oder Leucin unter Verwendung neuer Kombinationen von Enzymen für dieses spezielle Substrat. Die beiden gebildeten Hydrolysate wurden dann verwendet, um die organoleptischen Eigenschaften von Käse zu beeinflussen.
Die Rolle von Leucin in verschiedenen aromaerzeugenden Verfahren ist in dieser Anmeldung angemessen veranschaulicht worden. Die Verwendung von Lysin, um kartoffelartige Geschmäcke in Maillard-Reaktionen zu erzeugen, ist ebenfalls bekannt. Zudem ist Lysin mit der Geschmacksentwicklung von fermentativen Produkten wie Käse und „Sur-Lie"-Weinen in Verbindung gebracht worden.
Molkeproteinisolat ist äußerst reich an Lysin und Leucin, weist aber einen verhältnismäßig niedrigen Gehalt an Arginin auf. Um Leucin selektiv freizusetzen, wurde wieder die Enzymkombination von Thermoase und Corolase LAP verwendet (siehe Tabelle 7). Um selektiv Lysin freizusetzen, wurde das Molkeprotein zuerst mit Pankreas-Trypsin (von Merck) inkubiert, um auf der Carboxylseite von Arginin oder Lysin zu spalten, und dann, bei einem niedrigeren pH-wert, mit der Carboxypeptidase CPD II (PepF) von A. niger inkubiert. CPD II weist eine starke Bevorzugung des Freisetzens von basischen Aminosäuren wie Arg und Lys auf. Einzelheiten der letztgenannten Inkubation sind in Tabelle 8 bereitgestellt.
Die Enzyminkubation und die nachfolgende Verarbeitung erfolgten, wie in dem Abschnitt Materialien und Verfahren beschrieben. Aus den Daten, die mit der Kombination von Thermoase und Corolase LAP erhalten wurden, ist offensichtlich, daß nur Leucin mit einem Anreicherungsfaktor von 3,1, einem ASQ-Wert von 19,1% und einem Molenbruch von 34,1% (Tabelle 7) die Kriterien erfüllt. Bei der Inkubation mit Trypsin und CPD II sind sowohl Lysin als auch Arginin in dem Endhydrolysat beträchtlich überrepräsentiert, aber nur Lysin erfüllt mit einem Anreicherungsfaktor von 17,3, einem ASQ-Wert von 10,4% und einem Molenbruchwert von 44% die Kriterien (Tabelle 8).
Tabelle 7: Substrat Molkeprotein
Legende:

T + C = Thermoase + Corolase LAP
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Molkeprotein nach Enzyminkubation

Bedingungen: WPC 75 wurde in 500 Millilitern Wasser zu einer Konzentration von 6 Gew.-% gelöst, wonach 0,1 Gramm Thermoase sowie 0,20 Milliliter Corolase LAP zugegeben wurden. Die Inkubation erfolgte während 4 Stunden bei 50°C, wobei der pH-Wert kontinuierlich auf 7 eingestellt wurde.
Tabelle 8: Substrat Molkeprotein
Legende:

Tr + F = Trypsin + CPD II
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Molkeprotein nach Enzyminkubation

Bedingungen: WPC 75 wurde in 100 Millilitern Wasser zu einer Konzentration von 6 Gew.-% gelöst. Dann wurde 0,1 g Trypsinpulver (Merck) zugegeben und während 2 Stunden bei 60°C und einem Anfangs-pH von 7 inkubiert. Nach dem Senken des pH-Wertes unter Verwendung von 4 N HCl auf 5 wurde 0,2 Milliliter gereinigtes CPD II zugegeben und der Verdau während weiteren 3 Stunden bei 40°C, pH-Wert 5 fortgesetzt.
Da Spuren von aktiver Protease, die in dem Hydrolysat zurückbleiben, in dem Käse strenge Bitterkeit hervorrufen können, wurden beide Hydrolysate vor der Zugabe zu Käse einer Wärmebehandlung von 45 Minuten bei 95 Grad C und einem pH-Wert von 5 unterzogen.
Um die Auswirkung der beiden Hydrolysate auf die organoleptischen Kennzeichen von Käse zu prüfen, wurde das Ch-easy-Modell, entwickelt von NIZO in den Niederlanden (G. Smit et al., Voedingsmiddelentechnologie 8 (1995) 19 bis 21) angewendet. Pasteurisierte Ch-easy-Basis wurde auf 30 Grad C auskühlen lassen, wonach eine normale Starterkultur (in diesem Fall DS 5 LT1 von DSM Gist, Delft, Niederlande) zusammen mit 500 Milligramm eines der lyophilisierten Hydrolysate je 200 Gramm der noch flüssigen Ch-easy-Basis zugegeben wurde. Zu dem Bezugsmaterial wurde kein Hydrolysat gegeben. Nach gründlichem Mischen mit einem Glasstab wurde die flüssige Paste aseptisch in kleine Becher überführt, in denen das Material sich absetzen lassen wurde. Das Reifen von Ch-easy erfolgte während 2 Wochen bei 18 Grad C, wonach die verschiedenen Produkte von einer erfahrenen Verkostungsjury bewertet wurden.
Im Vergleich zu dem Bezugsmaterial ohne Zugaben wies das Ch-easy-Material, dem das mit Leucin angereicherte Hydrolysat zugegeben wurde, ein viel ausgeprägteres Geruchs- und Geschmacksprofil auf, das von einem viel älteren und reiferen Käse erwartet würde. Das Ch-easy-Material, dem das mit Leucin angereicherte Hydrolysat zugegeben wurde, erzeugte ein viel bescheideneres Geruchs- und Geschmacksprofil, und die Jurymitglieder fanden es schwierig, diesen Käse von der Bezugsprobe zu unterscheiden.
Die Textur des Käses mit den Zugaben erwies sich als der Textur des Käses ohne Zugaben ähnlich.
Beispiel 7
In Beispiel 6 haben wir gezeigt, daß durch Bilden der passenden Kombinationen von Enzymen verschiedene erfindungsgemäße Proteinhydrolysate aus einer einzigen Quelle von tierischem Protein hergestellt werden können. Überraschend war, daß Hydrolysate, die aus dem gleichen Rohmaterial erhalten wurden, bei der Inkubation mit einer geeigneten mikrobiellen Starterkultur zu verschiedenen Aromaprofilen führen können.
In diesem Beispiel veranschaulichen wir die Vielseitigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, indem verschiedene Enzyme auf ein industriell wichtiges pflanzliches Protein einwirken. Wiederum sind wir in der Lage, erfindungsgemäße Hydrolysate zu erzeugen, die mit verschiedenen Aminosäuren angereichert sind, in diesem Fall entweder mit Arginin als einer einzelnen freien Aminosäure oder mit Arginin und Lysin als zwei verschiedenen freien Aminosäuren. Das Potential solcher unterschiedlichen Hydrolysate zur Erzeugung unterscheidbarer Aromen in einem Maillard- oder einem Fermentationsverfahren ist in dem vorangehenden Text weitläufig beispielhaft dargestellt worden. Außer solchen aromaverstärkenden Aktivitäten wird freies Arginin auch als ein essentieller Nährstoff angesehen und ist mit der Sekretion von Hormonen, der Bildung von Stickstoffmonoxid und der Stimulierung der Wundheilung beim Menschen in Verbindung gebracht worden. Überdies ist behauptet worden, daß mit Arginin angereicherte Proteinhydrolysate nützliche Eigenschaften für Anwendungen der Körperpflege aufweisen. Somit sind erfindungsgemäße Hydrolysate ebenfalls als solche nützlich.
In diesem Experiment wurde Sojaproteinisolat (Soyamin 90 HV) zunächst mit einer Kombination von pflanzlicher Protease (Papain oder Collupulin) und einer Carboxypeptidase mikrobiellen Ursprungs (CPD II) inkubiert, um ein erfindungsgemäßes Hydrolysat zu ergeben, das mit freiem Arginin angereichert ist. Aus den Daten, die in Tabelle 9 bereitgestellt sind, folgt, daß nur diese Aminosäure mit einem Anreicherungsfaktor von 4,2 und Werten von 26,9% und 10,3% für den Molenbruch bzw. den ASQ alle Kriterien erfüllt.
Tabelle 9: Substrat Sojaproteinisolat
Legende:

Co + F = Collupulin + CPD II
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Sojaproteinhydrolysat nach Enzyminkubation

Bedingungen: Sojaproteinisolat wurde in 200 Millilitern Wasser zu einer Konzentration von 6 Gew.-% gelöst, wonach der pH-Wert auf 7,2 eingestellt und 1 ml Collupulin zugegeben wurde. Die Inkubation erfolgte während 2 Stunden bei 60°C. Dann wurde der pH-Wert auf 5 gesenkt, 0,5 Milliliter CPD II wurde zugegeben und der Verdau während weiteren 3 Stunden bei 40 Grad C, einem Anfangs-pH-Wert von 7,15 und CPD II, 3 Stunden 40°C, pH-Wert 5 fortgesetzt.
Bei der zweiten Inkubation wurde das Sojaproteinisolat mit einer Kombination von Protease tierischen Ursprungs (Trypsin von Merck) und dem mikrobiellen CPD II inkubiert. Bei dieser zweiten Inkubation erfüllen sowohl Arginin als auch Lysin mit einem Anreicherungsfaktor von 5,5 bzw. 3,9, Molenbruchwert von 34,7% bzw. 26,2% und einem ASQ-Wert von 11,7 alle Kriterien. Die Einzelheiten der zweiten Inkubation sind in Tabelle 10 bereitgestellt.
Tabelle 10: Substrat Sojaproteinisolat
Legende:

Tr + F = Trypsin + CPD II
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Sojaproteinisolat nach Enzyminkubation

Bedingungen: Sojaproteinisolat wurde in 200 Millilitern Wasser zu einer Konzentration von 6 Gew.-% gelöst. Nach der Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 wurde 0,2 g Trypsinpulver (Merck) zugegeben und während 2 Stunden und 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Dann wurde der pH-Wert auf 5,0 gesenkt und 0,5 ml CPD II zugegeben und während weiteren 3 Stunden wurde bei 40°C inkubiert.
Beispiel 8
Die wesentliche Rolle von freiem Glutamat in einer Anzahl von aromabildenden Verfahren ist gut dokumentiert, und MSG, das Natriumsalz von Glutaminsäure ist als die bedeutendste einzelne geschmacksverstärkende Komponente anerkannt. In diesem Licht betrachtet ist es wichtig zu veranschaulichen, daß in erfindungsgemäße Proteinhydrolysate Varianten einbezogen sind, die mit freier Glutaminsäure angereichert sind, mit der Folge bedeutenden Nutzens für das Aroma in entweder Maillard- oder fermentativen Verfahren.
Ein allgemeines Problem beim Aufzeigen der Anreicherung von Glutamat in erfindungsgemäßen Hydrolysaten ist die Messung seines Anreicherungsfaktors. Das Messen des Anreicherungsfaktors erfordert quantitative Daten auf der Stufe von freiem sowie von gebundenem Glutamat. Leider kann gebundenes Glutamat nicht bestimmt werden, da gebundenes Glutamin während der Behandlung mit 6 N HCl desaminiert und ebenfalls in Glutamat umgewandelt wird. Um das letztgenannte Problem zu umgehen, haben wir in diesem Beispiel eines derjenigen Proteinsubstrate verwendet, dessen Verhältnis von Glutamat zu Glutaminresten genau bekannt ist. Mit dieser Information kann der Gehalt an freiem Glutamat nach der Behandlung mit 6 N HCl durch eine einfache Multiplikation erhalten werden.
Hier wurde Rinderserumalbumin (Sigma) mit einem Verhältnis von Glu zu Gln von 91 zu 29 (Dairy Technology: Principles of Milk Properties and Processes; P. Walstra, Ed. Marcel Dekker, Inc.) verwendet und mit einem Gemisch aus einer gereinigten Glutamylendopeptidase und einem gereinigten CPD I unter Bedingungen verdaut, die in der Legende der Tabelle 11 spezifiziert sind.
Gemäß den Daten war Glutamat in dem resultierenden Hydrolysat mit einem Faktor von 2,7 angereichert. Die Werte für den Molenbruch und den ASQ betrugen 26,3 bzw. 19,3.
Tabelle 11: Substrat Rinderserumalbumin
Legende:

EG + G = Glutamylendopeptidase + CPD I
6 N HCl = mit 6 N HCl hydrolysiertes Rinderserumalbumin nach Enzyminkubation

Bedingungen: Rinderserumalbumin wurde in 2 Millilitern Wasser zu einer Konzentration von 5 Gew.-% gelöst, wonach der pH-Wert auf 8,0 eingestellt und 1 Milligramm Glutamylendopeptidase zugegeben und während 3 Stunden und 30 Minuten bei 50°C inkubiert wurde. Dann wurde der pH-Wert auf 5,0 gesenkt und 0,05 Milliliter CPD I zugegeben und während weiteren 25 Minuten bei 50°C inkubiert.

Claims

Proteinhydrolysat, – erhältlich durch die enzymatische Hydrolyse eines proteinhaltigen Substrats, – wobei das Proteinhydrolysat freie Aminosäuren und Peptide enthält, und – wobei der Molenbruch mindestens einer freien Aminosäure, die in dem Proteinhydrolysat vorliegt, um mindestens den Faktor 2,5, vorzugsweise um mindestens den Faktor 3, insbesondere um mindestens den Faktor 3,5, größer ist als in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist, – wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure in dem Proteinhydrolysat bei mindestens 25% liegt und – worin der Aminosäurequotient (ASQ) in dem Proteinhydrolysat mindestens 10% beträgt.
Proteinhydrolysat nach Anspruch 1, worin der ASQ 15 bis 50%, vorzugsweise 15 bis 40%, insbesondere 10 bis 30%, beträgt.
Proteinhydrolysat nach Anspruch 1 oder 2, worin die Hydrolyse, des proteinhaltigen Substrats eine enzymatische Hydrolyse, vorzugsweise eine enzymatische Hydrolyse durch eine Endoprotease und eine Exoprotease, ist.
Proteinhydrolysat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die mindestens eine freie Aminosäure aus Glu, Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Pro, Met, Lys, Arg, His, Gly, Ala, Ser oder Thr, vorzugsweise aus Glu, Pro, Ala, Gly, Leu, Ile, Val, Met, Pro, Phe, Lys oder Arg, insbesondere aus Glu, Leu, Pro, Phe, Lys oder Arg ausgewählt ist.
Proteinhydrolysat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Proteinhydrolysat in Form einer konzentrierten Flüssigkeit, einer Paste, eines Pulvers oder eines Granulats vorliegt.
Proteinhydrolysat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das proteinhaltige Substrat aus Molkeprotein, Hämoglobin, Rinderserumalbumin, Kasein, Reis, Gluten und Sojaprotein ausgewählt ist.
Proteinhydrolysat nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Proteinhydrolysat in der Lage ist, den Geschmack einer Nahrungsmittelzusammensetzung zu verbessern.
Verfahren zum Herstellen eines Proteinhydrolysats, das folgende Stufen umfaßt: Hydrolysieren eines proteinhaltigen Substrats mit einer Endoprotease und einer Exoprotease unter wäßrigen Bedingungen bei einer Temperatur von 5 bis 75°C und einem pH-Wert von 3 bis 9, wobei die gemeinsame Wirkung der Endoprotease und der Exoprotease mindestens eine freie Aminosäure aus dem proteinhaltigen Substrat freisetzt, und Inkubieren der Endoprotease und der Exoprotease während eines Zeitraums, der geeignet ist, um ein Proteinhydrolysat zu erhalten, wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure, die in dem Proteinhydrolysat vorliegt, um mindestens den Faktor 2,5, vorzugsweise um mindestens den Faktor 3, insbesondere um mindestens 3,5, größer ist als in einem Hydrolysat des gleichen proteinhaltigen Substrats, das vollständig zu freien Aminosäuren hydrolysiert worden ist, – wobei der Molenbruch der mindestens einen freien Aminosäure in dem Proteinhydrolysat bei mindestens 25% liegt und – der Aminosäurequotient (ASQ) in dem Proteinhydrolysat mindestens 10% beträgt.
Nahrungsmittelzusammensetzung, enthaltend ein Proteinhydrolysat nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Nahrungsmittelzusammensetzung nach Anspruch 9, worin die Nahrungsmittelzusammensetzung ein fermentiertes Nahrungsmittelprodukt ist, das vorzugsweise entweder (a) ein Käse ist und worin die Aminosäure in Form von Met vorliegt, (b) eine fermentierte Wurst ist und worin die Aminosäure in Form von Leu oder Phe vorliegt, (c) ein Bier ist und worin die Aminosäure in Form von Leu, Val oder Ile vorliegt, (d) ein Wein ist und worin die Aminosäure in Form von Arg oder Leu vorliegt oder (e) ein Whisky ist und worin die Aminosäure Val ist.
Nahrungsmittelzusammensetzung nach Anspruch 9, worin die Nahrungsmittelzusammensetzung ein umgesetzter Geschmacksstoff ist.
Proteinhydrolysat, dadurch gekennzeichnet, daß es entweder (a) ein Molkeproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin oder mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Lysin, (b) ein Maisproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin, (c) ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Arginin oder mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Lysin, (d) ein BSA-Proteinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Glu oder (e) ein Hämoglobinhydrolysat mit einem Molenbruch von mindestens 25% an freiem Leucin ist.
Verwendung eines Proteinhydrolysats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung einer Nahrungsmittelzusammensetzung.
Verfahren zum Herstellen eines fermentierten Proteinhydrolysat, wobei ein Proteinhydrolysat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 mit einem Mikroorganismus mit Nahrungsmittelqualität fermentiert wird.