ES2227727T3

ES2227727T3 - Preparados farmaceuticos liofilizados estables de anticuerpos monoclonales o policlonales.

Info

Publication number: ES2227727T3
Application number: ES97951238T
Authority: ES
Inventors: Georg Kallmeyer; Gerhard Winter; Christian Klessen; Heinrich Woog
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: CA2272245C; PT941121E; US20140248274A1; AU7824201A; EP0941121B1; WO1998022136A3; JP2001503781A; DK0941121T3; KR100514207B1; CN1244805A; ATE276762T1; EP0852951A1; ID19029A; AR012540A1; JP2009046494A; AU5484198A; TR199901696T2; JP5153532B2; KR20000053328A; AU735411C

Abstract

LA INVENCION TRATA DE PREPARACIONES FARMACEUTICAS LIOFILIZADAS DE ANTICUERPOS MOMO - O POLICLONALES, QUE CONTIENEN UN AZUCAR O AMINOAZUCAR, UN AMINOACIDO Y UN TENSIOACTIVO COMO AGENTE ESTABILIZADOR. ADEMAS TRATA LA INVENCION DE UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE ESTOS LIOFILIZADOS ESTABLES, ASI COMO LA UTILIZACION DE UN AZUCAR O AMINOAZUCAR, DE UN AMINOACIDO Y DE UN TENSIOACTIVO COMO ESTABILIZADORES DE AGENTES TERAPEUTICOS O DE DIAGNOSTICO QUE CONTIENEN ANTICUERPOS.

Description

"Preparados farmacéuticos liofilizados estables de anticuerpos monoclonales o policlonales".

La invención se refiere a preparados farmacéuticos liofilizados de anticuerpos mono- o policlonales, que contienen un azúcar o aminoazúcar, un aminoácido y un tensioactivo como estabilizantes. La invención se refiere a demás a un procedimiento para la fabricación de estos liofilizados estables y al uso de un azúcar o aminoazúcar, de un aminoácido y de un tensioactivo como estabilizadores de los productos terapéuticos o de diagnóstico que contienen anticuerpos.

La fabricación de inmunoglobulinas, en especial de anticuerpos monoclonales y policlonales para fines terapéuticos y de diagnóstico es actual de una importancia grande y continuamente creciente.

El uso de anticuerpos en calidad de principio farmacológico es ya conocido desde hace mucho tiempo y abarca numerosas posibilidades de aplicación. Los anticuerpos se utilizan con éxito p.ej. para la profilaxis del tétanos, para la terapia contra microorganismos patógenos o para la neutralización de sus toxinas o incluso en caso de envenenamiento por mordedura de serpientes.

Si se identifica el antígeno que participa en el mecanismo de la patología, como suele ocurrir en numerosas indicaciones infecciosas y en algunas indicaciones oncológicas para la terapia con anticuerpos, entonces se recurre a la terapia especializada en anticuerpos.

En los ensayos clínicos y preclínicos se aplican actualmente anticuerpos para bajar el nivel de colesterol, para influir en el sistema angiotensina/renina y en enfermedades autoinmunes, p.ej. el lupus, la encefalitis autoinmune, la esclerosis múltiple, la poliartritis y la miastenia grave autoinmune.

Tiene además una gran importancia terapéutica su utilización contra intoxicaciones provocadas por sustancias de peso molecular bajo, p.ej. fragmentos de Fab de los anticuerpos antigoxina, en el inicio de intoxicaciones provocadas por la digoxina o los glicósidos cardíacos de la digitoxina o de la uabaína. Por otro lado, los anticuerpos se utilizan en el ámbito del diagnóstico para identificar, purificar y determinar el contenido de proteínas.

Un gran progreso en la preparación de anticuerpos se ha experimentado gracias a la tecnología genética, que en la segunda mitad de la década de los años 1970 y en la década de los años 1980 ha revolucionado la producción de anticuerpos monoclonales en cultivos celulares.

Para poder abastecer este amplio abanico de posibilidades de aplicación se necesitan preparados farmacéuticos de anticuerpos mono- y policlonales que sean estables al almacenaje. Existe una serie de publicaciones dedicadas a formulaciones líquidas de anticuerpos mono- y policlonales. Las formulaciones líquidas de anticuerpos se describen por ejemplo en los documentos EP-0 280 358, EP-0 170 983, WO 89/11298, EP-0 352 500 y JP 63088197.

Según el documento EP-0 280 358 se añade dextrano a la solución de anticuerpos con el fin de estabilizarla contra determinadas hormonas, consiguiéndose de este modo una estabilidad superior a nueve meses. Según EP-0 170 983 para estabilizar un anticuerpo monoclonal termolábil durante el calentamiento se utiliza una ovalbúmina hidrolizada, con lo cual el anticuerpo almacenado a 45ºC sigue estando disponible para el uso durante 7 días. Otros estabilizadores que se conocen por el documento JP 63088197 para formulaciones líquidas son los polihidroxialcoholes (p.ej. glicerina, inositol, polivinilalcohol) o el azúcar (p.ej. sacarosa o glucosa) y los glicitoles (p.ej. la sorbita, la manita). En el WO 89/11298 se indican como posibilidades adicionales de estabilización líquida de anticuerpos monoclonales el uso de la maltosa en tampón fosfato provisto de cloruro sódico. En el documento EP-0 352 500 se describe la estabilización líquida de anticuerpos monoclonales con polietilenglicol 4000 y 3-propiolactona.

Sin embargo, las formulaciones líquidas por razones de estabilidad al almacenaje no son en general una solución óptima, puesto que en el transcurso del tiempo durante el almacenaje, a temperaturas elevadas, durante el transporte a través de diversas zonas climáticas o por almacenaje incorrecto (p.ej. cuando se producen interrupciones en la cadena del frío), pueden precipitar las proteínas o sus agregados y por ello las soluciones presentan un menor porcentaje de proteínas y enturbian. Por lo tanto, no está asegurado en estos casos el uso intachable de las soluciones.

En cambio, en una formulación de liofilizado, la eliminación del agua reduce al mínimo la formación de productos de degradación (p.ej. por desaminación o por hidrólisis) y también la formación de agregados. El contenido residual de agua ("agua fijada") puede contribuir a dar estabilidad, en especial en presencia de azúcares (Hsu y col., Dev. Biol. Stand. 74, 255-267, 1991 y Pikal y col. Dev. Biol. Stand. 74, 21-27, 1991).

Por la bibliografía técnica se conocen igualmente las formulaciones de liofilizados con anticuerpos especiales, pero no existen teorías concordantes en cuanto al problema de la estabilización. Por ejemplo, en el documento WO 93/00807 se describe la estabilización de biomateriales, como son las proteínas humanas, las hormonas de crecimiento, las interleucinas, las interferonas, las enzimas y los anticuerpos mono- y policlonales, en los que la estabilización se realiza mediante un sistema de dos componentes de materiales crioprotectores (p.ej. polietilenglicoles) y un compuesto que puede formar puentes de hidrógeno con las proteínas. El inconveniente de estos preparados consiste en que la adición de compuestos de peso molecular elevado, como son los polietilenglicoles, en el supuesto de que no sufran una degradación biológica, conduce a una acumulación de los mismos en el cuerpo que puede traducirse en efectos secundarios potencialmente tóxicos. Por otro lado, los polímeros ya es sabido que en función de su peso molecular pueden actuar como antígenos.

Según el documento JP 60146833 se consigue una estabilización durante un período de un año de los liofilizados de un anticuerpo monoclonal lábil a la congelación mediante la adición de albúmina (albúmina humana, de caballo o de ternera). En el documento EP-0 303 088 se describe también la albúmina de suero humano (HSA) en combinación con un hidrato de carbono (p.ej. dextrosa, sacarosa o maltosa) para estabilizar un anticuerpo monoclonal destinado al tratamiento de infecciones de Pseudomonas aeruginosa.

La albúmina de suero humano (combinada con azúcares y aminoácidos) es también el principio de estabilización de anticuerpos monoclonales según el documento EP-0 413 188. Según el documento JP 01075433 se utiliza una mezcla de albúmina de suero humano, manita y polietilenglicol para estabilizar un anticuerpo monoclonal humano en forma liofilizada. Otro ejemplo del uso de macromoléculas, p.ej. polietilenglicoles y proteínas de protección, por ejemplo las albúminas de suero humano, para estabilizar gamma-globulinas durante la liofilización se describe en el documento WO 84/00890.

Hagiwara y col. describen en WO 93/01835 la estabilización de un anticuerpo monoclonal humano por liofilización con manita y glicina en una solución que contiene tampón fosfato y cloruro sódico. Se obtienen preparados estables en cuanto a congelación, liofilización y reconstitución.

Draber y col. (J. Immun. Methods 181, 37-43, 1995) consiguen una formulación estable de anticuerpos monoclonales IgM a partir del ratón a 4ºC por adición únicamente de trehalosa y combinación con polietilenglicol 8000. De todos modos, los anticuerpos a 50ºC solamente son estables durante un período de tiempo de 14 días. Con otros mono- y disacáridos solos, p.ej. sacarosa, maltosa, lactosa o galactosa, no consigue la estabilización de estos anticuerpos.

En el documento WO 89/11297 se convierte un anticuerpo monoclonal de ratón en un liofilizado estable con un hidrato de carbono (maltosa) y un tampón de pH ácido (tampón acetato). El inconveniente estriba en este caso en la limitación del tampón al intervalo ácido.

La gelatina polímera como protección de congelación y medio estabilizador de un liofilizado se describe en WO 92/15331. La estabilización se realiza también en combinación con un ácido carboxílico (p.ej. ácido cítrico) o sus sales y un alcohol primario, secundario o terciario o un aminoácido en un intervalo de pH de 6,8 a 8,1.

En toda una serie de patentes recién mencionadas se proponen como estabilizadores aditivos y adyuvantes farmacéuticos que no son inocuos desde el punto de vista médico. Por ejemplo, los polímeros (como el PEG o las gelatinas) y las proteínas (p.ej. la albúmina del suero) conllevan un cierto riesgo por su origen y por sus propiedades físico-químicas y pueden desencadenar reacciones alérgicas, sin descartar incluso el choque anafiláctico. Las proteínas de origen humano y animal así como las proteínas obtenidas a partir de cultivos celulares llevan un riesgo residual de impurezas víricas. Pero existen también otras impurezas de tipo proteínico, difícilmente detectables en las analíticas, pueden por sus propiedades provocar reacciones de tipo inmunológico en el hombre.

La adición de compuestos poliméricos, p.ej. de polietilenglicoles (PEG) o gelatinas puede conducir, en caso de ausencia de biodegradación, a la acumulación en el organismo y por tanto a efectos secundarios potencialmente tóxicos. En función del peso molecular, los polímeros pueden comportarse como antígenos. Por otro lado, la pureza de los polímeros es difícil de garantizar debido a los catalizadores que se emplean en su fabricación o a las cantidades residuales de monómero o de otras fracciones de polímero. Por las razones aludidas, el uso de polímeros en las formas de administración farmacéutica, sobre todo en las formas medicamentosas que se aplican por vía subcutánea, debería evitarse en lo posible, sobre todo cuando la estabilización puede realizarse por otros métodos.

En cambio, el uso de azúcares solos sin otros aditivos no garantiza en todos los casos el efecto protector deseado para la liofilización de anticuerpos.

El objetivo que se plantea la presente invención es, por lo tanto, desarrollar una formulación farmacéutica de anticuerpos mono- o policlonales que esté fundamentalmente libre de adyuvantes farmacéuticos poliméricos y proteínicos de los tipos recién mencionados. Lo dicho se aplica también al caso de anticuerpos que son lábiles con respecto a los procesos de congelación o con respecto a los procesos de congelación y descongelación múltiples.

Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que se pueden obtener liofilizados farmacéuticos estables de anticuerpos mono- y policlonales, si estos contienen como aditivos azúcar o aminoazúcar, un aminoácido o un tensioactivo. Los liofilizados constan con preferencia de a) el anticuerpo, b) un azúcar o aminoazúcar, c) un aminoácido, d) un tampón para ajustar el valor del pH y e) un tensioactivo. Son preferidos en especial aquellos liofilizados que solo contienen un único aminoácido o dos aminoácidos distintos.

Estos preparados son bien tolerados fisiológicamente, tienen una composición relativamente simple y pueden dosificarse con precisión. Además son estables, es decir, no presentan productos de descomposición ni agregados proteínicos detectables, tanto en procesos de congelación y descongelación múltiples, como en un almacenaje prolongado. Los liofilizados pueden almacenarse sin problemas de estabilidad a la temperatura del frigorífico (4-12ºC) o incluso a temperatura ambiente (18-23ºC) durante un período de tiempo por lo menos de tres meses, con preferencia por lo menos de seis meses y sobre todo por lo menos de uno a dos años. Son además estables incluso a temperaturas más elevadas (por ejemplo hasta 30ºC). La estabilidad al almacenaje se manifiesta por ejemplo en que durante el período mencionado de almacenaje solamente puede detectarse un número muy bajo de partículas, cuando los liofilizados se reconstituyen en recipientes con agua para inyección o con soluciones isotónicas. Los recipientes contienen en especial menos de 6000 partículas de un tamaño superior a 10 \mum y/o menos de 600 partículas de un tamaño superior a 25 \mum. Las soluciones preparadas de este modo son estables durante un tiempo de hasta cinco días, con preferencia de hasta tres días.

Es especialmente ventajoso el hecho de que los preparados, debido a la combinación elegida de aditivos, producen una protección a la congelación. Esto permite en particular la realización de la liofilización hasta temperatura de -45ºC, que perjudicar negativamente la estabilidad de los anticuerpos. Además, los liofilizados que llevan la combinación de aditivos de la invención son estables a largo plazo y estables al almacenaje incluso a temperaturas más elevadas. Después de la reconstitución con agua no presentan formación de partículas, es decir, las soluciones están fundamentalmente libres de turbidez, sobre todo si se comparan con formulaciones convencionales.

Los preparados de la invención tienen además la ventaja que estar fundamentalmente exentos de adyuvantes poliméricos o proteínicos, cuya utilización no estaría libre de problemas desde el punto de vista médico. Por el hecho de que ahora puedan obtenerse por disolución de los liofilizados una productos terapéuticos o de diagnóstico, provisto de anticuerpos, en forma líquida, con un pH de 5 a 8, con preferencia con un pH de 6,0 a 7,4 (pH de la sangre: 7,2-7,4), los productos resultantes tienen además la ventaja de ser compatibles y poderse aplicarse prácticamente sin dolor. Esto es importante sobre todo en el caso de la administración subcutánea, ya que en ella se manifiestan con más facilidad las intolerancias (faltas de compatibilidad) que en la administración intravenosa.

Los preparados de la invención pueden fabricarse en general en los intervalos de concentración de anticuerpo relevantes desde el punto de vista clínico, por ejemplo hasta 20 mg/ml, con preferencia hasta 10 mg/ml. Las concentraciones preferidas se sitúan en más de 0,01 mg/ml, en especial en más de 0,05 o de 0,1 mg/ml. Se emplean en especial concentraciones por ejemplo de 0,05 a 10 mg/ml o de 0,1 a 5 mg/ml, o bien de 5, 8 o 10 mg/ml. Los volúmenes a inyectar de las soluciones empleadas se sitúan en menos de 2 ml, con preferencia en 1 ml para el caso de las inyecciones subcutáneas o intravenosas. Los volúmenes inyectados pequeños son ventajosos sobre todo en el caso de aplicación subcutánea, porque provocan una irritación mecánica menor en el tejido subcutáneo. Las soluciones en el fondo pueden emplearse como aditivos de soluciones para infusión o directamente como soluciones para infusión. En el caso de utilizarse como aditivos de soluciones de infusión, su concentración de anticuerpos se sitúa en valores más altos, por ejemplo hasta en 10 mg/ml. Estas soluciones concentradas de anticuerpos se añaden entonces a las soluciones de infusión habituales, de modo que la concentración de anticuerpo en la solución de infusión aplicada se sitúe en el intervalo terapéuticamente relevante. Este intervalo abarca normalmente de 0,001 a 0,5 mg/ml.

Las formas de administración individual pueden fabricarse en el marco de la producción farmacéutica ya sea en forma de soluciones de infusión o de inyección listas para el uso en forma de liofilizados. En caso de utilizar los medicamentos en forma de liofilizados, los envases monodosis, por ejemplo viales o ampollas de vidrio de 10 ml de capacidad, contienen el anticuerpo en cantidades comprendidas entre 0,1 y 500 mg, con preferencia entre 10 y 100 mg, en función de la dosis de anticuerpo terapéuticamente relevante en cada caso. El liofilizado puede contener eventualmente otros adyuvantes farmacéuticamente usuales. El liofilizado se disuelve en una cantidad conveniente de solución reconstituyente y puede utilizarse entonces ya sea directamente en forma de solución inyectable, ya sea como aditivo de una solución de infusión. En el caso de utilizarlo como aditivo para solución de infusión, se disuelve el liofilizado por lo general con 10 ml de una solución de reconstitución y se añade a una solución de sal común fisiológica (0,9% de NaCl) de 250 ml. La solución de infusión resultante se administra entonces al paciente en un período de tiempo comprendido habitualmente en unos 30 minutos.

Los azúcares utilizados en la invención pueden ser mono-, di- o trisacáridos. En calidad de monosacáridos se toman en consideración por ejemplo la glucosa, la manosa, la galactosa, la fructosa y la sorbosa. En calidad de disacáridos se toman en consideración por ejemplo la sacarosa, la lactosa, la maltosa y la trehalosa. En calidad de trisacárido se toma en consideración con preferencia la rafinosa. Son preferidos en especial según la invención la sacarosa, la lactosa, la maltosa, la rafinosa o la trehalosa. En lugar de maltosa pueden utilizarse también los disacáridos estereoisómeros, como son la celobiosa, la gentiobiosa y la isomaltosa.

En calidad de aminoazúcares se denominan y se emplean en general aquellos monosacáridos que en lugar de un grupo hidroxi contienen un grupo amino (-NH_{2}, -NHR, NR_{2}) o un grupo amino acilado (-NH-CO-R). Según la invención son especialmente preferidos para ello la glucosamina, la N-metilglucosamina, la galactosamina y el ácido neuramínico. El contenido en azúcar o el contenido en aminoazúcar se sitúa por ejemplo en 2000 mg como máximo, con preferencia en 1000 mg como máximo, en especial en 800 ó en 500 mg como máximo por cada forma de administración individual. En calidad de límite inferior para el contenido de azúcar se toman en consideración por ejemplo cantidades de 10, 50 o 100 mg. Los intervalos preferidos son de 200 a 1000 mg, en especial de 400 a 800 mg. Las cantidades indicadas aquí por cada forma individual de administración se refieren a formas individuales de administración que se comercializan en forma de liofilizados. Tales liofilizados se envasan con preferencia en frascos de inyección que tienen una capacidad de 10 ml. Después de disolver el liofilizado con una solución de reconstitución de 10 ml se obtienen formas líquidas de administración que pueden aplicarse directamente. La concentración de azúcar en estas soluciones inyectables se sitúa en 200 mg/ml como máximo, con preferencia en 100 mg/ml como máximo, referidos a las cantidades de los azúcares empleados indicadas en la introducción.

En calidad de aminoácidos empleados según la invención se toman en consideración los aminoácidos básicos, por ejemplo la arginina, la lisina, la histidina, la ornitina, etc., empleándose los aminoácidos con preferencia en forma de sus sales inorgánicas (con ventaja en forma de sales del ácido fosfórico, es decir, fosfatos de aminoácidos). Para el caso de utilizar aminoácidos libres, el ajuste del pH deseado se efectúa por adición de una sustancia tampón idónea, fisiológicamente compatible, p.ej. de un ácido inorgánico, en especial de ácido fosfórico, de ácido sulfúrico, de ácido acético, de ácido fórmico o de sus sales. El uso de fosfatos tienen la ventaja especialmente en este caso de que se obtienen liofilizados especialmente estables. Se ha constatado que es ventajoso que los preparados estén fundamentalmente exentos de ácidos orgánicos, p.ej. ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, etc. o bien que no estén presentes los correspondientes aniones (malato, oxalato, citrato, succinato, fumarato, etc.).

Como aminoácidos se toman en consideración con preferencia la arginina, la lisina o la ornitina. Pueden utilizarse además los aminoácidos de carácter ácido, como son p. ej. el ácido glutámico o el ácido aspártico, o los aminoácidos neutros, p.ej. la isoleucina, la leucina y la alanina, o los aminoácidos aromáticos, p.ej. la fenilalanina, la tirosina y el triptófano. El contenido de aminoácidos en los preparados acuosos de la invención se sitúa en 100 mg/ml como máximo, con preferencia en 50 mg/ml como máximo o en 30 mg/ml como máximo. Como límite inferior se toman en consideración concentraciones de 1,5 o de 10 mg/ml. Las concentraciones preferidas se sitúan por ejemplo en el intervalo entre 3 y 30 mg/ml o bien entre 10 y 25 mg/ml. Para el caso en que las formas de administración correspondientes se comercialicen en forma de liofilizados, tales liofilizados se presentarán con preferencia en frascos de inyección (volumen: por ejemplo 10 ml). Tales formas individuales de administración contienen los aminoácidos en una cantidad de hasta 1000 mg, con preferencia de hasta 500 mg o bien hasta 300 mg.

En calidad de tensioactivos se toman en consideración todos los tensioactivos utilizados habitualmente en los preparados farmacéuticos, con preferencia los polisorbatos y los polímeros polietoxilados y polipropoxilados, p.ej. el Tween®. Para la estabilización de los anticuerpos basta con cantidades bajas de tensioactivo, por ejemplo de 0,05 a 0,5 mg/ml, con preferencia de 0,1 mg/ml. En las formas individuales de administración recién mencionadas, la cantidad de tensioactivo se sitúa entre 0,5 y 5 mg en el caso de un liofilizado que se envase en un frasco de inyección de 10 ml.

La estabilización de anticuerpos realizada mediante los adyuvantes citados se refiere en principio a los anticuerpos monoclonales y policlonales y a sus fragmentos Fab. Se toman en consideración con preferencia los anticuerpos humanizados y los anticuerpos modificados (ver las patentes US-5 624 821; EP-0 592 106; PCT/EP 96/00098). El peso molecular de los anticuerpos se sitúa entre 50 kDa y 200 kDa por unidad de monómero, el peso molecular se sitúa con preferencia entre 80 y 150 kDa. Los anticuerpos de la invención pueden estabilizarse en especial contra el virus de la hepatitis B (ver WO 94/11495), contra los virus de la SIDA, contra los virus de la citomegalia, contra los virus de meningoencefalitis (FSME), contra los virus de la rubéola, contra los virus del sarampión, contra los gérmenes de la rabia, contra la bacteria Pseudomonas aeruginosa, contra los virus de la varicela zoster, contra los gérmenes del tétanos, contra el factor de van Willebrandt (ver WO 96/17078), el NGFR (nerve growth factor receptor), el PDGFR (platelet derived growth factor receptor; Shulman, Sauer, Jackman, Chang, Landolfi, J. Biol. Chem. 272(28), 17400-4, 1997; la selectina, en especial la E-selectina, la L-selectina (ver Takashi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2244-2248, 1990; WO 94/12215) o la P-selectina; la integrina o el gérmen de la difteria. La concentración de anticuerpos puede situarse con preferencia hasta en 8 mg/ml. Se sitúa en especial entre 0,05 y 2 mg/ml. La cantidad de anticuerpos en la forma individual de administración, por ejemplo en un liofilizado en un frasco de inyección de 10 ml, se sitúa en 100 mg como máximo, con preferencia en 80 mg, en 50 mg, en 20 mg o en 10 mg. La concentración de anticuerpos después de la reconstitución de los liofilizados con un volumen de 10 ml se sitúa en el intervalo de 1 a 10 mg/ml, con preferencia de 5 a 8 mg/ml.

Además de los aditivos ya citados azúcar, aminoácidos y tensioactivo, los liofilizados de la invención pueden contener adyuvantes fisiológicamente compatibles, elegidos entre ácidos, bases, tampones y medios isotonificadores para ajustar el valor del pH entre 5 y 8, con preferencia entre 6,0 y 7,4. La capacidad tamponante de los preparados se ajusta de tal manera que en el momento de disolver los liofilizados con las soluciones habituales de reconstitución, por ejemplo agua para fines de inyección, la concentración de tampón de sitúe entre 10 y 20 mmoles/l, con preferencia en 15 mmoles/l.

El orden de la adición de los distintos adyuvantes o del anticuerpo es independiente en alto grado en lo que respecto al proceso de fabricación y el experto en la materia sabrá elegir el más idóneo. El valor deseado para el pH de la solución se ajusta mediante la adición de bases, por ejemplo hidróxidos alcalinos, hidróxidos alcalinotérreos o hidróxido amónico. Para ello se utiliza con preferencia el hidróxido sódico. El ajuste del valor deseado del pH es posible en principio mediante la adición de soluciones básicas. En este sentido se toman en consideración en general las sales de bases fuertes con ácidos débiles, p.ej. el acetato sódico, el citrato sódico, el hidrogenofosfato disódico o el dihidrogenofosfato sódico o el carbonato sódico. Para el caso de que la solución del adyuvante farmacéutico tenga un pH básico, el ajuste se realiza mediante valoración con un ácido, hasta alcanzar el pH deseado. Como ácidos se toman en consideración los ácidos orgánicos e inorgánicos fisiológicamente compatibles, por ejemplo el ácido clorhídrico, el ácido fosfórico, el ácido acético, el ácido cítrico o en general las soluciones habituales de sustancias que poseen un pH ácido. Las sustancias preferidas en este sentido son sales de ácidos fuertes con bases débiles, por ejemplo el dihidrogenofosfato sódico o el hidrogenofosfato disódico. El pH de la solución se ajusta con preferencia con ácido fosfórico o con una solución acuosa de hidróxido sódico.

Para la fabricación de formas medicamentosas parenterales bien toleradas es conveniente añadir adyuvantes isotonificantes, en el supuesto de que con las propiedades osmóticas del anticuerpo y de los adyuvantes añadidos para la estabilización no se haya alcanzado todavía la isotonía. Para ello se utilizan sobre todo adyuvantes de buena compatibilidad, no ionizados. La adición de sales, p.ej. NaCl, debería realizarse únicamente en pequeñas cantidades, en especial no debería rebasarse con preferencia un valor de 30 mmoles/l en la solución inyectable o para infusión, lista para la aplicación.

Los preparados farmacéuticos pueden contener además otros adyuvantes y aditivos. Pueden añadirse antioxidantes, por ejemplo glutationa o ácido ascórbico y sustancias similares.

Para la fabricación de los liofilizados se preparan en primer lugar las soluciones acuosas farmacéuticas que contienen el anticuerpo. Se prepara con preferencia una solución de anticuerpo tamponada que contenga cloruro sódico. A esta solución de anticuerpo se le mezcla una solución acuosa con los aditivos azúcar, aminoácido y tensioactivo, ajustándose el pH con un ácido o una base a un valor entre 5 y 8. La adición de ácido fosfórico o sales fosfato y cloruro sódico se realiza en una cantidad tal que se obtengan las concentraciones ya definidas anteriormente. A continuación se realiza la filtración en condiciones estériles y la liofilización de la solución obtenida.

Con la presente invención pueden transformarse sin merma de la calidad incluso las soluciones acuosas inestables que contienen anticuerpos sensibles a la congelación en preparados estables, incluso a temperaturas elevadas, gracias a la liofilización.

Los liofilizados de la invención tienen además la ventaja de que, aparte de evitar dañar al anticuerpo con la congelación, no presentan disminución alguna del contenido en anticuerpos después de un almacenaje prolongado a 50ºC y no sufren formación de agregados ni precipitación en forma de copos. Son, pues, estables en lo que respecta al contenido de anticuerpos y a la pureza. Se evitan las formaciones de partículas, lo cual se traduce en valores bajos de turbidez después de la reconstitución de los liofilizados con agua para fines de inyección.

A continuación se ilustra la invención con mayor detalle mediante los ejemplos de ejecución.

En los ejemplos de 1 a 10 se indica la manera de formular los liofilizados de la invención, de fabricarlos y de analizar la estabilidad de los anticuerpos que contienen.

Los ensayos comparativos, realizados sin adyuvantes o con sacarosa sola o con manita como sustitutivo del componente azúcar o con el componente aminoácido solo o solamente con el componente azúcar y aminoácido sin tensioactivo, ponen de manifiesto que la elección de la combinación de los aditivos de la presente invención es determinante para conseguir una formulación estable. Tanto la sacarosa sola, el aminoácido solo o ambos componentes sin el tensioactivo conducen a formulaciones inestables.

Las formulaciones de la invención no son sensibles a la congelación y se puede prescindir por completo de polímeros o proteínas considerados tóxicos, como son los polietilenglicoles, las gelatinas, las albúminas de suero. Los tensioactivos utilizados son cantidades relativamente pequeñas de tensioactivos de buena compatibilidad fisiológica.

El anticuerpo utilizado en los siguientes ejemplos de ejecución contra el virus de la hepatitis B (HBV) es un anticuerpo monoclonal (MAB) recombinante humano obtenido de una célula de ratón. Posee un peso molecular de 147 kDa y se dirige contra el antígeno de superficie (HBsAg) del virus de la hepatitis B. El anticuerpo monoclonal reconoce la determinante "a" del HBsAg, que es constante en prácticamente todas las variantes conocidas del virus. Este anticuerpo puede utilizarse por ejemplo en las siguientes indicaciones médicas: tratamiento de la hepatitis crónica, contra la que de momento no existía ninguna posibilidad satisfactoria de tratamiento; tratamiento de la inmunoprofilaxis pasiva en los pacientes de trasplante de hígado que son positivos de HBsAg. En el centro y en el norte de Europa y en EE.UU. existe un 2% de la población que son portadores del virus de la hepatitis B, en el sur de Europa llegan hasta el 3%, en África y en lejano Oriente alcanzan un 10-15%. Como consecuencia de esta infección crónica cabe mencionar el desarrollo del carcinoma hepatocelular en un 100%, lo cual se traduce en una mortalidad del 40% en los portadores de este virus.

Otros anticuerpos que pueden utilizarse en el sentido de la invención son con preferencia los anticuerpos contra la L-selectina, contra el receptor NGF y contra el receptor PDGF.

En el ejemplo 1 se muestra el comportamiento de una solución acuosa que contiene cloruro sódico y tampón fosfato de un anticuerpo monoclonal contra el virus de la hepatitis B (MAB HBV; nombre INN: Tuvirumab) a pH = 5, pH = 6,5 y pH = 8 después de congelar y descongelar. Se observa que la congelación y descongelación dañan al anticuerpo monoclonal.

En el ejemplo 2 se pone de manifiesto la posibilidad de estabilizar un preparado de la invención con sacarosa o maltosa y un aminoazúcar (N-metilglucosamina o galactosamina) y fosfato de arginina y Tween 20, con una concentración del anticuerpo de 2 mg/ml, es decir 2 mg en el liofilizado.

En el ejemplo 2a se muestra el mismo preparado que en el ejemplo 2, pero con una concentración de anticuerpo de 8 mg/ml. En los ejemplos 2 y 2a se aprecia que con la combinación de los adyuvantes mencionados no solo se evita el daño del anticuerpo durante la congelación, sino que se ejerce además una influencia positiva en la estabilidad al almacenaje a largo plazo.

En el ejemplo 3 se ilustra la necesidad de los aminoácidos y del tensioactivo en el preparado de la invención. El uso de la sacarosa como único formador de estructura conduce a un liofilizado inestable.

En el ejemplo 4 se describe la variación del componente aminoácido. Se pone de manifiesto que tanto la variación de los aminoácidos básicos en forma de arginina o de ornitina, como la sustitución de los aminoácidos básicos por un aminoácido neutro, p.ej. por leucina o por aminoácido ácido p.ej. por ácido aspártico, conduce a un preparado estable al almacenaje.

En el ejemplo 5 se compara la liofilización de una formulación con sacarosa, arginina y Tween 20 así como tampón fosfato y cloruro sódico en diversos valores de pH (pH 5, pH 6,5 y pH 8). Los datos obtenidos indican que una liofilización dentro de este intervalo de pH es posible sin merma de la estabilidad.

Si se sustituye el tensioactivo mencionado Tween 20 por un componente del grupo de compuestos tensioactivos formado por polímeros polietoxilados y polipropoxilados (nombre comercial: Pluronic®), como en el ejemplo 6, se obtiene también una estabilidad suficiente del preparado de la invención.

En el ejemplo 7 se constata la inestabilidad de una formulación con manita como formador de estructura en lugar de la sacarosa, la maltosa o el aminoazúcar (ver ejemplo 2).

Si se omiten el azúcar y el tensioactivo de la formulación, como se indica en el ejemplo 8, entonces el preparado resulta inestable.

Una combinación de azúcar (p.ej. sacarosa) y aminoácidos sin tensioactivo, como se indica en el ejemplo 9, permite obtener buenos resultados en los parámetros de contenido y agregados, pero la turbidez aumenta de forma notable si se compara con las formulaciones de la invención que llevan azúcar, aminoácido y tensioactivo.

En el ejemplo 10 se pone de manifiesto que también otros anticuerpos monoclonales pueden estabilizarse con una combinación de azúcar, aminoácido y tensioactivo. El anticuerpo anti-L-selectina es estable por ejemplo en una concentración de 7 mg en el liofilizado. La liofilización se realiza partiendo de un volumen de 1 ml de una solución acuosa.

Métodos de análisis para determinar la estabilidad

Se almacenan los preparados liofilizados en condiciones definidas y con exclusión de la luz y después se analizan. Para los análisis se emplean los siguientes métodos de ensayo.

OD 280: densidad óptica a 280 nm. Determinación fotométrica del contenido de proteína, la absorción UV tiene lugar por los cromóforos existentes en las cadenas laterales, p.ej. restos triptófano, tirosina y fenilalanina. Especificación: 95-105%.

HPLC-SE: cromatografía de alta eficacia con exclusión de tamaño (size exclusion) para la determinación de agregados. Especificación: máx. un 2%.

Medición de la turbidez: una vez reconstituido el liofilizado se efectúa la medición de la solución de anticuerpo sin diluir en un fotómetro de turbidez idóneo. Especificación: máx. 6 unidades de turbidez.

Ejemplo 1

Se prepara una solución patrón acuosa, provista de cloruro sódico y de tampón fosfato, del MAB contra el HBV descrito anteriormente y se analiza. La concentración del MAB se sitúa en 15 mg/ml.

En la tabla 1a se recoge por un lado la labilidad de congelación a -20ºC de la solución de anticuerpo monoclonal a diversos valores de pH, que se manifiesta ya al cabo de 4 semanas en una disminución del contenido en proteínas hasta el 92,1 o bien el 94,2 o bien el 94,0%. Se observa también una disminución del contenido en proteínas en caso de almacenaje a 25ºC. En las condiciones de almacenaje en frigorífico a 4-8ºC, el anticuerpo es lo suficientemente estable durante 9 meses.

En las tablas 1b-1d se indican los datos de estabilidad de las soluciones preparadas de anticuerpos monoclonales a valores de pH de 5, 6,5 y 8 a -20ºC, 4-8ºC y 25ºC. También en este caso se observa que solamente es aceptable el almacenaje a 4-8ºC.

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TABLA 1a Cambios en el contenido de anticuerpo en la solución de principio activo (tampón fosfato 10 mM, cloruro sódico 30 mM, agua para inyección)

1

Todos los datos en %. La determinación de las proteínas se realiza mediante la medición de la absorción a 280 nm (densidad óptica, OD 280).

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TABLA 1b Formación de agregados y valores de turbidez de la solución de principio activo de anticuerpo, pH = 5

2

TABLA 1c Formación de agregados y valores de turbidez de la solución de principio activo de anticuerpo, pH = 6,5

3

TABLA 1d Formación de agregados y valores de turbidez de la solución de principio activo de anticuerpo, pH = 8

4

Los agregados en % se determinan por cromatografía HPLC-SE; la turbidez se expresa en unidades de turbidez, determinadas con un fotómetro de turbidez.

Ejemplo 2

A las soluciones acuosas de los azúcares o aminoazúcares que se mencionan seguidamente, sacarosa (formulación 1), maltosa (formulación 2) y N-metilglucosamina (formulación 3), con tampón fosfato de arginina y como tensioactivo el Tween 20, se les añade una solución del anticuerpo monoclonal contra el virus HBV del ejemplo 1. Un cuadro sinóptico de la formulación se presenta en el ejemplo 2a. La concentración final del MAB es de 2 mg/ml. Después de ajustar el pH de las soluciones a 6,5 con ácido fosfórico, dichas soluciones se filtran en condiciones estériles (filtro de membrana de 0,22 \mum) y se envasan en frascos de inyección de vidrio (grupo hidrolítico I) estériles y despirogenizados (volumen envasado: 1 ml) y se liofilizan. Después de la liofilización se airean con nitrógeno los frascos de inyección, se cierran con tapón en máquinas automáticas en la cámara de liofilización y después se rebordean.

El almacenaje de los frascos de inyección rebordeados se realiza con exclusión de la luz durante un tiempo de 4 a 13 semanas a diversas temperaturas. Después de estos tiempos se determina la estabilidad de los liofilizados con los métodos de análisis ya descritos.

TABLA 2a

5

TABLA 2b

6

Leyendas

I: contenido de proteína en %, según OD 280

II: agregados en %, según cromatografía HPLC-SE

III: turbidez de la solución reconstituida en unidades de turbidez (número adimensional)

: n.d. no detectable (empleado también en otras tablas)

Ejemplo 2a

En el ejemplo 2a se representa la formulación 1 del ejemplo 2 con 8 mg/ml de anticuerpo (= formulación 1a). Se observa que en esta formulación son suficientemente estables incluso las concentraciones elevadas, de hasta 8 mg/ml de anticuerpo.

7

TABLA 3a

8

TABLA 3b

9

I: contenido de proteína en %, según OD 280

II: agregados en %, según cromatografía HPLC-SE

Ejemplo 3

Comparación de las formulaciones 1 y 4. La formulación 4 contiene solamente sacarosa en calidad de formador de estructura, no contiene fosfato de arginina ni Tween 20. La formulación 4 es inestable.

10

TABLA 4a

11

TABLA 4b

12

Leyendas

I: contenido de proteína en %, según OD 280

II: agregados en %, según cromatografía HPLC-SE

Ejemplo 4

Variación del componente aminoácido de la formulación. Las formulaciones con aminoácidos básicos, ácidos y neutros son estables.

13

TABLA 5

	aminoácido
formulación 1	arginina (básico)
formulación 5	ornitina (básico)
formulación 6	leucina (neutro)
formulación 7	ácido aspártico (ácido)

El pH se ajusta con ácido fosfórico o con una solución de hidróxido sódico.

TABLAS de 6a a 6d

Resultados del análisis de las formulaciones 1, 5, 6 y 7 después de 4 y 13 semanas de almacenaje.

a) Tabla 6a

14

b) Tabla 6b

15

c) Tabla 6c

16

\newpage

d) Tabla 6d

17

Ejemplo 5

En el ejemplo 5 se presenta la formulación 1 para diversos valores del pH, la fabricación de liofilizados se realiza del modo descrito en el ejemplo 2, el ajusta del pH de la solución de adyuvantes o de la solución de producto antes de la liofilización se efectúa con ácido fosfórico del 85%.

18

Se preparan los liofilizados con los valores de pH que se indican en la tabla 7.

Después del rebordeado de los frascos de inyección, estos se almacenan en condiciones definidas de temperatura, con exclusión de la luz. Después de un período de almacenaje de 4 semanas y de 13 semanas se analizan las muestras (contenido de proteínas en %, según OD 280; agregados en %, según cromatografía HPLC-SE; turbidez). La formulación es estable en todos los valores de pH.

TABLA 7

	pH
formulación 8	5
formulación 9 (idéntica a la 1)	6,5
formulación 10	8

TABLA 8a

19

TABLA 8b

20

Leyendas

I: contenido de proteína en %, según OD 280

II: agregados en %, según cromatografía HPLC-SE

Ejemplo 6

La formulación descrita a continuación se fabrica del modo descrito anteriormente con el tensioactivo Pluronic F 68 en lugar del Tween 20.

El almacenaje y la prueba de estabilidad se efectúan de modo similar al descrito en los demás ejemplos.

21

Para fines comparativos se elige la formulación, que es idéntica a la formulación 11, excepto en que contiene el Tween 20 en lugar del Pluronic F 68. Ambas formulaciones son estables.

TABLA 9

22

Ejemplo 7

La formulación 12, descrita en este ejemplo, equivale fundamentalmente a la formulación 1, pero como compuesto formador de estructura se elige en este caso la manita en lugar de la sacarosa. Se aprecia una inestabilidad en la formulación de la manita.

23

TABLA 10

24

Ejemplo 8

Otra demostración de la necesidad de combinación de azúcar, aminoácido y tensioactivo se deriva de la comparación de la formulación 1, que contiene todos los componentes mencionados, con la formulación 13, que contiene anticuerpo, tampón fosfato, cloruro sódico y fosfato de arginina. Sin azúcar y sin tensioactivo se incrementa la formación de agregados y los valores de turbidez empeoran.

25

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\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 11

26

Ejemplo 9

Sin tensioactivo (Tween 20), solamente con sacarosa y arginina, se obtiene una formulación que es ciertamente estable, pero los valores de turbidez empeoran (formulación 14).

27

TABLA 12

28

Ejemplo 10

Los componentes de la composición siguiente forman parte de la formulación 15. El anticuerpo utilizado en este caso es un anticuerpo anti-L-selectina. Por los datos indicados en la tabla 13a relativos al análisis de la estabilidad se observa que la formulación empleada permite una estabilidad suficientemente buena. La composición de la fórmula 15:

29

TABLA 13a

30

TABLA 13b

31

I: contenido de proteína en %, según OD 280

II: agregados en %, según cromatografía HPLC-SE

Ejemplo 11 Estabilización del anticuerpo anti-L-NGFR (anti-L-receptor del factor de crecimiento de los nervios)

Formulación 16

Se prepara un liofilizado con la siguiente formulación (similar a la formulación 1).

32

La fabricación del liofilizado del anticuerpo anti-L-NGFR se lleva a cabo de modo similar a la fabricación de los liofilizados del MAB-HBV y del MAB-anti-L-selectina.

Para disolver el anticuerpo anti-L-NGFR en un tampón fosfato se mezclan una solución acuosa con los aditivos azúcar, aminoácido y tensioactivo a un pH de 5 a 8. La adición de las sales fosfato se realiza en una cantidad tal que se obtengan las concentraciones ya definidas previamente. A continuación se realiza la filtración en condiciones estériles y la liofilización de la solución resultante. Después de la liofilización se obtiene una torta de liofilización ópticamente intachable. El anticuerpo anti-L-NGFR permanece estable. Después de la reconstitución del liofilizado con agua para inyección se obtiene una solución transparente.

Claims

1. Preparado farmacéutico liofilizado estable de anticuerpos mono- o policlonales, que contiene un azúcar o un aminoazúcar, un aminoácido y un tensioactivo.

2. Preparado según la reivindicación 1, caracterizado porque el preparado está fundamentalmente exento de polietilenglicoles y/o exento de los adyuvantes proteínicos habituales en farmacia.

3. Preparado según la reivindicación 1 ó 2, que consta fundamentalmente de:

a) un anticuerpo mono- o policlonal,

b) un azúcar o un aminoazúcar,

c) un aminoácido,

d) un ácido inorgánico que actúa de sustancia tampón y

e) un tensioactivo.

4. Preparado según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque el azúcar es un mono-, di- o trisacárido, con preferencia la sacarosa, la maltosa, la trehalosa o la rafinosa.

5. Preparado según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque el aminoazúcar es la glucosamina, la N-metilglucosamina, la galactosamina o el ácido neuramínico.

6. Preparado según una de las reivindicaciones de 1 a 5, caracterizado porque el aminoácido es un aminoácido básico, ácido o neutro, con preferencia la arginina, la lisina, la histidina, la ornitina, la isoleucina, la leucina, la alanina, el ácido glutámico o el ácido aspártico.

7. Preparado según una de las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizado porque el tensioactivo es un polisorbato o un polímero poxietoxilado y polipropoxilado.

8. Preparado según una de las reivindicaciones de 1 a 7, caracterizado porque contiene adyuvantes fisiológicamente compatibles, elegidos entre el grupo formado por los ácidos, las bases, los tampones y/o los agentes isotonificantes.

9. Preparado farmacéutico acuoso de anticuerpos mono- o policlonales, que puede obtenerse por redisolución del liofilizado según una de las reivindicaciones de 1 a 8.

10. Preparado farmacéutico acuoso según la reivindicación 9, caracterizado porque la solución presenta un pH de 5 a 8, con preferencia de 6 a 7,4.

11. Procedimiento para la fabricación de un preparado farmacéutico liofilizado según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque se fabrica un preparado acuoso que contiene un anticuerpo monoclonal o policlonal como principio activo y un azúcar o aminoazúcar, un aminoácido y un tensioactivo como aditivos, así como otros aditivos farmacéuticos y a continuación se liofiliza la solución.

12. Uso de la combinación de adyuvantes compuesta por a) un azúcar o un aminoazúcar, b) un aminoácido y c) un tensioactivo para la fabricación de productos liofilizados, terapéuticos o de diagnóstico, que contienen anticuerpos.