JPS6388197A

JPS6388197A - モノクロナル抗体の安定化方法

Info

Publication number: JPS6388197A
Application number: JP23002386A
Authority: JP
Inventors: Masahide Kondo; 雅英近藤; Kuniyo Inoue; 國世井上
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1986-09-30
Filing date: 1986-09-30
Publication date: 1988-04-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明はモノクロナル抗体を変性失活に対して安定化す
るための方法、更には、多価アルコールにより安定化さ
れたモノクロナル抗体の安定化方法に関する。

［発明の背景］１９７５年に、ケーラーとミルスタインはＢ細胞ハイブ
リドーマを作成し、モノクロナル抗体を産生ずる方法を
開発した（Ｋ′６旧ｅｒ，Ｇ，Ｈｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ。

（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ　２５６，４９５）　。この
技術によりモノクロナル抗体が均質な抗体として大組に
供給される道が間かれた。今日では、モノクロナル抗体
は、医学，生物学分野で広範な研究のみならず、分析。

診断，治療Ｊ３よびｖＩＪ質の精製などに用いられてい
る。

従来より用いられて来たポリクロナル抗体は特定抗原の
複数個の抗原決定部位を認識する袴数種の抗体分子（免
疫グロブリン）の温合物と考えられている。従ってポリ
クロナル抗体は抗原で感作された動物の血清から調製さ
れるという作業の非能率、頻雑さに加えて、均一の性質
をもったロフトが大舟にえられないという難点がある。

一方、モノクロナル抗体は、−旦ハイブリドーマが樹立
されると、このハイブリドーマを培養することにより均
一で単一な免疫グロブリン分子を生産することが可能に
なる。こうしてえられたモノクロナル抗体は単一の抗原
特異性をもち、性質の均一な抗体が恒常的に提供される
。

一般にポリクロナル抗体は抗血清の形、抗血清の凍結乾
燥品の形あるいは抗血清中にふくまれる免疫グロブリン
画分の凍結乾燥品の形で供せられる。これらの中には、
無数の分子種の異なった免疫グロブリン分子が含まれて
いると考えられ、抗体のクラス、サブクラス、分子量、
電気的性質。

抗原決定部位、抗原に対する親和性など蛋白質化学的性
質に差がある。従って、抗血清から免疫グロブリン画分
のみを純粋で、均一な免疫グロブリンに精製することは
不可能である。

このことは、「ポリクロナル抗体」という概念は、必然
的に、血清成分を含有することを言外に意味している。

即ち、単一な蛋白質分子であるモノクロナル抗体とは異
なった概念である。

モノクロナル抗体はポリクロナル抗体に比べると特に分
析１診断などの目的では、工業的に取扱う上で有利な点
が多い。しかし、残念なことには、モノクロナル抗体は
、一般に熱、酸、アルカリ。

有癲溶媒、界面活性剤、高イオン強度、撹拌などの化学
的および物理的作用により、変性、失活されやすい。こ
れは明らかに不利な点であり、抗体の精製、輸送、保存
および診Ｉ！１７薬や免疫吸着性クロマトグラフィー用
担体の作成時の物理的、化学的あるいは生化学的処理に
Ｊ５いて変性をひきおこす相当な影響が与えられる。モ
ノクロナル抗体のもつこの不利な点のために多くの抗体
の適用例では、ポリクロナル抗体が使用されている。一
般にポリクロナル抗体はよりよい安定性を有するが、特
異性が低く、目的とする抗原に関連した抗原に対して交
叉反応性を示す。即ち、ポリクロナル抗体を使用する場
合には、試験の正確さ及び信頼性に限界がある。

例えば、治療剤テオフィリン又はアミノフィリンに対し
て特異的なポリフロナル抗体は、その他の共通したキサ
ンチン、例えばカフェインやテオブロミンに対して交叉
反応性を示す。従って血中テオフィリン濃度を免疫アッ
セイにより追跡している患者には、コーヒー、紅茶、コ
ーラ、ココア及び類似の物質の摂取が禁止される。安定
でさらに特異的なモノクロナル抗体を用いる免疫アッセ
イは、この問題をより減少させる。それゆえ、モノクロ
ナル抗体の変性、失活をひきおこす物理的。

化学的な１．１１に対して、モノクロナル抗体を安定化
する方法および安定なモノクロナル抗体組成物が当該技
術分野で要望されている。

モノクロナル抗体の安定性を増大させる方法のいくつか
は知られている。

例えば、１１間昭５７−９７２３号公報には、血清アル
ブミン、卵アルブミン又はコラーゲン繊維から誘導され
る蛋白質が記載されている。また、特開昭６１−７６４
２３号公報には、卵アルブミン自体ではモノクロナル抗
体に熱安定性を付与しないと言及しつつ、卵アルブミン
が加水分解されたときに限り、安定性が付与されると記
載されている。

しかし、これらの方法においては、単一な蛋白質として
のモノクロナル抗体に外来の蛋白質を加えることにより
、もはや、モノクロナル抗体が蛋白質化学的に純粋では
ない状態をつくり出してしまうという問題が生じる。

例えば、モノクロナル抗体を診断薬や免疫親ｆ１］竹り
ロマトグラフィー用担体の形に加工して使用するとき、
モノクロナル抗体を固相担体に吸名や化学結合で結合し
、免疫アッセイや免疫親和性クロマトグラフィーに供さ
れるとき、また、酵素や蛋白性の毒物、薬物との結合に
より標識され、免疫アッセイに又治療診断に供するとぎ
、さらには蛋白質加水分解酵素の作用による限定加水分
解により、モノクロナル抗体の断片を作成するときなど
、これらのすべての処理において、モノクロナル抗体に
添加された蛋白質は妨害的に作用してしまい、当該モノ
クロナル抗体の用途を著しく限定することになる。

蛋白質は、個々に非常に特異的で異なった物性をもつ。

例えば、ｐＨや温度に関していえば、至適ｐＨや至適温
度のまわりの非常に狭い範囲においてのみ安定に存在し
うるのであり、その両側では、急速に失活・変性する。

しかもこの挙動は、個々の蛋白質においてかなり異なっ
ており、実用的な意味において一般化して論じることは
困難である。この複雑さは、蛋白質の構成アミノ酸の複
雑さによるのみならず、その蛋白質溶液にふくまれる添
加物や塩と蛋白質との相互作用や溶液物性への影響、さ
らに溶液の粘度、イオン強度、ｐＨ。

温度や水の構造の変化などにより決定されると考えられ
る。従来、塩類やポリオール類や糖類を添加して蛋白質
を安定化しようとした例は数多い。

しかし、これらは、リゾチーム、アルブミン、リボヌク
レアーゼＡ、キモトリプシノーゲンなど分子世数万以下
の単純蛋白質であり、サブユニット構造や補欠因子、あ
るいは蛋白質に結合した糖鎖をもつものに対して応用さ
れた報告は知られていない。モノクロナル抗体を構成す
る免疫グロブリンはＧ、Ｍ、Ａ、Ｅなどのクラスがある
が最も一般的で分子量の小さいＧタイプ（Ｉ　ＱＧ）で
も４本のポリペプチド鎖が数個のジスルフィド結合で連
結された分子量約１６万の高分子である。

１　にｌＧ５個がジスルフィド結合でつながれたＭタイ
プ（Ｉｃ＋Ｍ）では、分子９は、約８０万である。

さらに、それぞれのクラスは、いくつかのり−ブクラス
に分類される。

従来知られているポリオール類などの添加による蛋白質
の安定化は、個々の蛋白質において一定たりする。とり
わけ、Ｍポリビニルアルコールやエチレングリコール、
プロピレングリコールの作用は蛋白質により、かなり異
なっている。例えば、エチレングリコール（３０％）は
リゾチーム、ストレプトミセス・ズブチリシン・インヒ
ビターなどを安定化させる方向に作用するがキモトリプ
シノーゲンは編成させる。さらに、グリセロール（３０
％）はキモトリプシノーゲンに対して、はとんど安定化
を示さないが前二者に対しては、グリセロールはよい安
定化剤である。一方、三者に対してイノシトール〈３０
％）は最良の安定化剤であることは知られている。

［発明の目的］本発明は、以上の観点からなされたもので、その目的は
、他の夾雑蛋白質なしにモノクロナル抗体を安定化させ
る方法を提供するところにある。

［発明の構成１本発明者等は、従来技術のもつ問題点を克服すべく鋭意
研究をかさねた結果、モノクロナル抗体溶液に多価アル
コール類を２〜６０小ｆｎ％含有させることによりモノ
クロナル抗体が安定化することを見出し、本発明に到達
した。

本発明で使用されろ多価アルコール類は非蛋白性であり
、透析あるいはゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの方法で容易にモノクロナル抗体を分離可能であ
り、かつ、モノクロナル抗体に通常施される化学的処理
に対して不活性な化合物である。この多価アルコール類
としては、イノシトール、グリセロール、ポリごニルア
ルコール、糖類又は糖アルコールをあげることができる
１゜ここで糖類とは、単糖類、二糖類及び重合度が１０
００以下の多糖類をいい、例えばグルコース。

シュクロース、アミロース、デキストラン等をあげるこ
とができる。このうち、入手の容易さ、モノクロナル抗
体溶液への溶解性２価格等を考慮するとグルコース、シ
ュクロースが好ましい。又糖アルコールとしては、Ｃ−
Ｃ６の糖を還元して得られるもので、例えばエリトリト
ール、リビ１〜−ル、ソルビトール、マンニトール、ガ
ラクチトール等をあげることができる。これらの多価ア
ルコール類から選ばれる少なくとも一種をモノクロナル
抗体溶液に２〜６０重量％の温度で添加すればよい。多
価アルコール類の種類によって、添加量に差があるが、
通常２重量％未満では安定化の効果がなく、６０重量％
を越えてもその効果には差異がない。また、モノクロナ
ル抗体は、水もしくは緩衝液に溶解しておけばよい。

本発明で用いられる多価アルコール類の溶解度は、かな
りばらつきがあり、モノクロナル抗体の安定化のための
最適濃度には、ばらつきが生じる。ここで、グリセロー
ルとしては、２〜６０重量％、好ましくは２０重ω％以
上がよい。イノシトールは２〜６０　ｉｎ　ｆｆｉ％で
安定化効果を示すが、好ましくは２０〜４０重徂％であ
った。

ポリビニルアルコールは重合度５０〜２０００において
、モノクロナル抗体の安定性に寄与する。

重合度５０のときには、２０重量％以上において安定化
効果を示す。しかし、重合度が増大するにつれ、安定化
効果を示すポリビニルアルコール濃度は低下する。例え
ば、重合度５０−０のときには、５〜７重量％で最大の
安定化を示し、重合度２０００のときは、２〜３　Ｎ　
ｒｌｉ％で最大の安定化を示す。

糖類のうち、単糖類や三糖類の場合は、２〜６０重量％
のとき、好ましくは２０〜４０重伍％のとき、安定化効
果を示した。

重合度が３〜１０００の多糖類については、濃度が２〜
６０重ｎ１％好ましくは１０〜３０重量％で安定化が達
せられた。

糖アルコールの場合は、２〜６０重量％、好ましくは２
０〜３５重量％で安定化効果がみられた。

本発明の方法において溶液の温度は、蛋白質を取扱う際
の常識として低温、すなわち１０℃以下、好ましくは４
℃以下に保存することが望ましい。

実質的には、２５℃にて数日間保存するには、問題はな
い。しかし、これより高い温度、たとえば６０℃以上で
数日間以上、糖類と蛋白質とを混合した状態で加熱する
と、糖のカルボニル基と蛋白質のアミン基の間でアミン
・カルボニル反応（メイラード反応）と呼ばれる反応が
おこり、褐色色素が形成されることがある。しかし、か
かる高温でモノクロナル抗体溶液を数日間にわたり保存
することは、現実的ではない。さらに本発明の多価アル
コール類は、凍結乾燥および凍結と融解という物理的操
作においても、モノクロナル抗体を安定化する。即ち、
これらの物理的操作によって、リン酸緩衝生理食塩水（
ＰＢＳ）中のモノクロナル抗体の活性は通常５〜１０％
失活するが、この失活を多価アルコール類を添加するこ
とによって完全に抑制することが可能となった。

［実施例］以下に実滴例を用いて本発明をより詳細に説明するが、
本発明は、この実／Ｍ例のみにより限定されるものでは
ない。

実施例１及び比較例１マウス抗ヒト・インスリン・モノクロナル抗体（ｒｑＧ
ｌ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、　ｐＨ７，４に１
μｇ／ｍｌ！になるように溶解した。対象としては、何
も添加せず、試料用溶液にはグリセロール、マンニトー
ル、イノシトール、ソルビトール、エチレングリコール
、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（重
合度２００）。

シコクロース、グルコース、デキス１〜ラン、キシリト
ールを各々３０重ω％となるように、又、ポリビニルア
ルコール（重合度５００）を７重け％となるように添加
した。それぞれの溶液を７０℃に加熱し、０．５−ずつ
１０分おきにサンプリングし、０．０５％（Ｖ／Ｖ）ツ
イーン２０及び０．５％（Ｖ／Ｖ）ウシ血清アルブミン
含有ＰＢＳ、４．５＃ｌｌ！と混合し、４℃に一昼夜保
存した。

インスリンを結合させた９６穴マイクロタイタープレー
トへこの加熱処理モノクロナル抗体を結合させ、数回洗
浄ののち、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したヤギの
抗マウスＩｇＧ−ポリクロナル抗体でインスリンに結合
したマウス・モノクロナル抗体を捕捉し２，２−アミン
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
ニアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を基質として、ペルオキ
シダーゼ活性を、マイクロタイター・リーダー（使用フ
ィルター：４１４ｎｍ及び４９２ｎｍ）を用いて測定す
ることにより、モノクロナル抗体の吸着量、即ち活性を
求めた。すべての場合に、マウス・モノクロナル抗体の
活性の対数は７０℃での加Ｐ１９０分間までは直線的に
低下した。６０分加熱したときの残存活性を表１に示し
た。

表１ｎ　　実施例２及び比較例２マウス抗β　ミクロプロブリン・モノクロナル抗体＜１
（ＪＧ　　ｂ）を用いて実施例１と同様の実験をした。

残存活性は表２のとおりであった。

実施例３及び比較例３マウス抗β２ミクロプロブリン・モノクロナル抗体（ｒ
　ｑＭ）を用いて実施例１と同様の実験を行った。ただ
し、ベルオキシダーぜ標識ヤギ抗マウスＩｇＭポリクロ
ナル抗体を用いた。

残存活性は表３のとありであった。

実流例４及び比較例４マウス抗ヒト・インスリン・モノクロナル抗体（ＪｇＧ
　　）をりん酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）。

０Ｈ７，４に１μｇ／威になるように溶解し、これにマ
ンニトールを０．５，１０，１５，２０゜３０重量％と
なるように溶解さぜ、実施例１と同様に７０℃、１時間
の加熱処理を行い、モノクロナル抗体の残存活性を澗定
した。

結果は表４のとおりであった。

実施例５及び比較例５マウス抗ヒト・インスリン・モノクロナル抗体（ＩｏＧ
ｌ）を１μｇ／ｄになるようにりんＩｌ！ｉ緩衝食塩水
、ｐＨ７，４に溶解し、これに各種重合度のポリビニル
アルコール（ＰＶＡ）を５重量％になるように溶解し、
実施例１と同様に７０℃。

１時間の加熱処理を行い、モノクロナル抗体の残存活性
を測定し、表５の結果を得た。対照はポリビニルアルコ
ールを含まない場合の残存活性である。

表５［発明の効果］以上の説明から明らかなように、多価アルコール類を２
〜６０　Ｎｕ　ｆｆ１％添加したモノクロナル抗体は、
変性に対して安定となる。又、これらの多価アルコール
類は、非蛋白性であり、透析もしくはゲル濾過１．イオ
ン交換クロマトグラフィー等により容易にモノクロナル
抗体と分離可能であり、さらに通常モノクロナル抗体に
施される化学的処理に対して不活性であるため、モノク
ロナル抗体の取扱いを従前以上に容易とし、よって各種
分析。

診１ｆＩｉ等の技術分野における本発明の利用価値は高
い。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）モノクロナル抗体を変性に対して安定化する方法
においてモノクロナル抗体溶液に多価アルコール類を２
〜６０重量％含有させることを特徴とするモノクロナル
抗体の安定化方法。
（２）多価アルコール類が、グリセロール、イノシトー
ル、ポリビニルアルコール、糖類又は糖アルコールであ
る特許請求の範囲第（１）項記載の方法。
（３）糖類がシユクロース又はグルコースである特許請
求の範囲第（２）項記載の方法。
（４）糖アルコールがソルビトール、マンニトール、ガ
ラクチトール、リビトール又はエリトリトールである特
許請求の範囲第（２）項記載の方法。