CN1069217C - 一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白及其制备方法。通过血浆级分得到组分Ⅱ+Ⅲ沉淀后，进一步处理而得到Ⅱ沉淀或免疫血清球蛋白粉未或组分Ⅲ滤液，最终制备静脉注射免疫血清球蛋白产品过程中，应用一种或多种物质加入到产品溶液中，此类物质可以是糖醇或碳水化合物。所制成品没有经化学修饰和裂解，总蛋白浓度5±1%，其浊度小于15NTU，PH在4.5-5.5范围内，含有稳定剂，具有生理耐受的晶体渗透压，单体含量大于90%，纯度大于96%，抗补体活性不小于0.3mg/CH50。产品主要用于静脉注射，虽然也可肌注。

Description

一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白及其制备方法

本发明涉及一种血制品及其制备方法，具体地说，本发明涉及一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白及其制备方法。

肌肉注射丙种球蛋白产品如用于静脉注射是不安全的，引发相当的不良反应率，特别是丙种球蛋白缺乏症的病人。反应时血清补体水平降低主要是由于注射的丙种球蛋白与补体结合所致。丙种球蛋白结合补体的能力，称为抗补体活性，在血浆级分过程中由于蛋白变性而大大地增强，特别是与大分子量的物质的聚合。这些聚合物的补体结合机理是抗体-抗原复合物的形成机理。如用超速离心方法除去这类聚合物(100,000×重力)，就可得到静脉注射耐受性较好的低抗补体活性的产品。

已有好几种途径致力于使丙种球蛋白安全地用于静脉注射。所有方法都依赖于消除它的抗补体活性。超速离心法技术上不太实用，而且用此法制成的丙种球蛋白贮存时其抗补体活性又会增强。在pH4.0下用胃蛋白酶处理丙种球蛋白以裂解分子得到沉降因子为5S的分子量约10,000的片段。虽然此片段保留了二价抗体活性，免除了抗补体活性，注射耐受性和效果较好，但治疗有效时间很短，因它的半排出期仅为18小时，在丙种球蛋白缺乏症患者身上半排出期可略长，相比未经修饰的丙种球蛋白半排出期为19.8天，故很快的被排泄掉。虽然用胃蛋白酶处理的丙种球蛋白半排出期明显缩短可能部分是由于其分子体积大大地被减小的缘故，但有证据表明代谢速率与被胃蛋白酶消化的分子部分的特殊性能有关。在本发明中，分子的这部分保持完整。用胃蛋白酶处理的另一个缺点是产品中剩余的胃蛋白酶具有动物属性，能够刺激人体中抗体的产生，特别是在重复注射用。使用具有人体属性的胞质素可以避免这个困难，也是另一种方法的基础所在。

人纤溶酶处理的丙种球蛋白使其裂解为3个分子量约为50,000的组分。当足够低浓度的胞质素被使用时，只有15％的分子被裂解，85％仍保持为完整的丙种球蛋白。此完整的未被消化的丙种球蛋白仅有很小的抗补体活性，静脉注射时无不良作用。此法的缺点是无法除去全部的胞质素。所以，即使产品贮存在4℃时降解仍继续发生。

在pH4.0，37℃培养丙种球蛋白不同长的时间，观察到抗补体活性降低到很低的水平。推测这是因为少量的血清酶成分存在于丙种球蛋白之中。和胞质素处理的丙种球蛋白相比较，发现这个″pH4.0丙种球蛋白″在贮存过程中以不可预料的速率抗补体活性重新增强，所以在注用时必须重新确认抗补体活性。纤溶酶处理的丙种球蛋白和pH4.0丙种球蛋白在体内与未经修饰的丙种球蛋白相比，有较短的半排出期。例如，正常病人pH4.0丙种球蛋白半排出期为14天，纤溶酶处理的16天。

在巴黎的法国国立输血中心通过对严格挑选的新鲜血浆的仔细的级分和过滤，制造出含有低抗补体活性的静脉注射丙种球蛋白。很明显，它没有完全的除去抗补体活性，需小心注射，而一些病人仍发生不良反应。为避免此不良反应，可在注射前用可的松，但抗补体活性的不完全去除限制了它的广泛应用。

还原丙种球蛋白分子中二硫键，然后用中止剂反应，这对抗补体活性的影响也有研究。用0.2M胱氨酸处理7％的丙种球蛋白液，然后与0.2M碘乙酰胺反应，可以几乎完全地去除抗补体活性，而单独使用上述两个试剂效果则不明显。由于碘乙酰胺的毒性，故研究者没有进一步考虑有此方法制备静脉注射丙种球蛋白。

也有方法首先还原丙种球蛋白分子中的双硫键成-SH基团，然后再烷化这个-SH基团。然后分出产物，进行除菌。产品可静脉注射，无明显的和潜在的抗补体活性，而且半排出期和抗体活性与非修饰丙种球蛋白比较无改变。还有用羟丙酸β-内酯处理制得的静脉注射丙种球蛋白。然而羟丙酸β-内酯被认为是致癌物质。胰蛋白酶也应用于静脉注射丙种球蛋白的制备。近年来，离子交换色谱法，聚乙二醇和树脂级分法也已被发展起来。

国内迄今尚无卫生部批准的正式销售的IVIG产品。卫生部成都生物制品研究所研制的静脉注射丙种球蛋白产品已获得卫生部试生产批准文号。其制剂是一种冻干产品，制品pH为4.0。

本发明的一个目的是提供一种具有特定的酸度，其中单体含量大于90％，具有适宜的抗补体活性，可广谱地治疗病人的经过非化学修饰和裂解处理的一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白。

本发明的再一个目的是提供所述液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白的制备方法。

本发明的目的可通过下列构思实现：一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白的制备方法，包括

i)在0℃、pH 7.4下向血浆里加入乙醇，使其在血浆里的浓度达8体积％，通过离心除去组分I沉淀；

ii)向离心上清液中加入-15℃或更冷的乙醇，使溶液中乙醇的浓度为25体积％，用pH4.0的缓冲液调节到pH6.9，温度调节到-5℃±1℃，形成组分II+III的沉淀；该方法的特征在于：

iii)在0-10℃下使ii)所得的沉淀再悬浮于含醋酸盐和选自糖醇、甘氨酸或碳水化合物的水溶液中，加入-15℃或更冷的乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到18-22％，调节pH至5.0-7.0，在-4.0℃到-6.0℃的温度下离心得到沉淀；

iv)使iii)中得到的沉淀再悬浮于含醋酸盐和选白糖醇、甘氨酸或碳水化合物的水溶液中，搅拌使沉淀溶解成溶液，再调节pH5.5±0.5，在-6.0℃下加入乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到25％，在-5.0到-7.0℃下离心分离除去所形成的沉淀；

v)使iv)得到的上清液在-4.0℃到-7.0℃下经过滤澄清，超滤浓缩和洗涤，调节配制，从而制得液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白。

所制备的液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白进一步含有稳定剂，pH为4.5-5.5，没有经化学修饰和裂解，总蛋白浓度5±1％，其浊度小于15NTU，单体含量大于90％，纯度大于96％，抗补体活性不小于0.3mg/CH50。

下面详细阐述本发明的内容：

本发明中制造过程的原料是健康人新鲜冰冻血浆或回收血浆，和免疫血浆如抗破伤风、麻疹等特种免疫血浆。在正常情况下，健康人血浆中含有白蛋白，α球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白等多种成分，其中白蛋白占约55％，α球蛋白占约14％，β球蛋白占约16％，γ球蛋白占约11％。″人免疫血清球蛋白″用来定义这样一个物质，  在文献中通常也称为丙种球蛋白(γ球蛋白)，免疫丙种球蛋白和免疫球蛋白G。在电泳分析中，免疫血清球蛋白主要出现在γ球蛋白部分，γ球蛋白几乎全部是Ig，因此过去曾将γ球蛋白用作Ig的同义语。按Ig的免疫化学特异性，可将Ig分成五类，即IgG，IgA，IgM，IgD和IgE，分子量和分子大小各有不同。

上述血浆原料通过经典的孔氏法(Cohn method 6)除去组分I沉淀后(Cohn等，J.Am.Chem.Soc.，68，459(1946)；Oncley等，J.Am.Chem.Soc.，71，541(1949))，又通过我们称之为″改良的孔氏冷酒精分离法″进行分离。具体的操作如下。加入-15℃或更冷的95％酒精使其溶液中酒精浓度达到20％，用pH4.0的缓冲液调节pH至6.9。在此过程中随着酒精浓度的增大，温度逐渐的降低到-5℃，随后维持这个-5℃的温度。所用的pH4.0缓冲液，其中醋酸钠对醋酸的摩尔比为0.2，较方便的配制方法是200ML 4M醋酸钠和400ML 10M醋酸混合，用水稀释至1升即可。此pH4.0缓冲液在水稀释8倍后在25℃下用pH计测量，pH仍应为4.00+(-)0.02。组分II+III沉淀形成，通过在-5℃下的离心可分离出来，电泳测定表明其主要成分是β和γ球蛋白。它含有几乎所有的免疫球蛋白和协同凝聚因素，也含有大量的胆甾醇和脂类物质。组分II+III沉淀可贮藏于-20℃以下的冰库中，以备用来制造静脉注射免疫球蛋白。

组分II+III沉淀重新悬浮于含有醋酸盐(如醋酸钠)和糖醇(或碳水化合物)的水溶液中，此时醋酸盐可以是醋酸钠或相似物质，糖醇可以是甘露糖醇，山梨醇，或相似物质；碳水化合物可以是麦芽糖，葡萄糖，果糖，或相似物质。溶液温度需维持在0-10℃之间，太高的温度会使蛋白变性。通过加入-15℃或更冷的95％酒精使得其溶液中酒精浓度达到19％，及调节溶液pH至pH到5.6-5.9，在此过程中逐渐的降低产品温度到-4.0--6.0℃，这样组分II+III-W沉淀就可形成，选择这样的条件，除去了大部分的胆固醇及类胡萝卜素色素，绝大部分的抑制活性物质也被除去。在这沉淀中，主要含有丙种球蛋白，协同凝聚因素，纤溶酶原和凝血酶原。在温度-4.0--6.0℃条件下，控制流速不大于60Kg/小时，通过离心得到组分II+III-W。

组分II+III-W沉淀重新悬浮于含有醋酸盐和糖醇(或是诸如甘氨酸的氨基酸或碳水化合物)的水溶液中，见前所述。pH调节用pH4.0缓冲液。当悬浮溶解结束后用pH4.0缓冲液调节溶液pH至5.5+(-)0.5，加入95％-15℃或更冷的酒精以提高悬浮液酒精浓度，在加酒精过程中降低温度至-6.0℃，但降低温度需防止结冰。充分的搅拌数小时使沉淀形成完全。沉淀用离心方法除去，离心时温度为-5.0--7.0℃，流速控制在不大于60Kg/小时。得到沉淀为组分III，放弃不用。组分III沉淀其中含有协同凝聚因素，纤溶酶原和凝血酶原，在这步离心时除去。剩余的组分III离心上清液然后用过滤方法澄清，温度仍控制在-4.0--7.0℃。此离心上清液过滤后称之为组分III滤液，含有大量的丙种球蛋白成分，可进一步应用孔氏法沉淀离心得到组分II沉淀。组分II，根据超速离心研究表明，主要含有平均分子量为160,000的沉降系数为7的丙球(占85％)，其它蛋白主要是9S(沉降系数为9)物质，分子量约300,000。组分II沉淀(大约含有30％固体)可冷冻干燥得到免疫血清球蛋白粉末，再溶解就可制成16.5％的肌注无菌溶液。在本发明中，上述免疫血清球蛋白粉末，湿的组分II膏体或组分III滤液都可用于下一步的制造过程。

湿的组分II膏体或冻干的免疫血清球蛋白粉末溶解于适当的水中或其它生理适用的溶液中，制备成浓度约为1-10％的溶液。组分III滤液可直接用于下一步。

上述溶液通过加入生理适应的酸溶液如盐酸调节pH至3.5-5.0，最好在3.8-4.2之间，通常说来，pH需恰当的调节，使溶液中蛋白单体物质浓度达到最大。当然，pH也不能太低，否则易引起凝聚。温度也应对免疫血清球蛋白物质没有有害的影响。如温度控制在0-20℃(对组分II或冻干免疫血清球蛋白)，或-5-+5℃(对组分III滤液)可得到较好的结果。此时不必将溶液放置一段时间后再进行下一步；当然，如果没有什么不利影响，也可放置一段时间。

pH调节后需降低蛋白溶液的离子强度。组分III滤液pH调节后需先用常用的方法适当的降低其酒精浓度，增大其蛋白浓度达到1-10％的范围。离子强度(Γ/2)定义如下： $\mathrm{\Γ}/2=\frac{\mathrm{\Σ}\{{\left[C^2\right]}^2{\left(Z^{+}\right)}^2+{{[C}^{-}]}^2{\left(Z^{-}\right)}^2\}}{2}$ C⁺＝阳离子浓度，包括金属离子如Na⁺，K⁺，Ca⁺²，Mg⁺²，等；C^-＝阴离子浓度，包括卤素离子如Cl^-，Br^-，羧酸盐离子如醋酸，草酸阴离子；

Z⁺＝C⁺的电价；

Z^-＝C^-的电价

需使溶液的离子强度降低到0.001以下。可用超滤，透析等或相结合方法。例如，蛋白溶液在适宜的pH下至少需用5倍体积的水进行透析，通常需5-8倍体积的水进行交换洗涤才能使溶液离子强度降低到至少0.001。在此步处理过程中，小分子多肽类物质及一些杂质如酒精等的浓度降低到很小的水平。

降低离子强度后，调节蛋白浓度至接近终产品的浓度范围。比如，5％，10％，15％等。浓缩步骤可采用常见技术，以不损坏免疫血清球蛋白为目的，如，超滤，反渗透，蒸发等。上述洗涤和浓缩过程中溶液pH保持在3.5-5.0的范围内，最好在3.8-4.2范围内。温度在0-20℃范围内。

接下来，加入稳定剂以使上述蛋白溶液能够承受高温的处理。加入山梨醇至其浓度达33％，然后进行巴氏灭菌(60℃，10小时)。病毒灭活也可采用溶剂-清洁剂技术(本发明不包括此技术)。

经过病毒灭活处理后，调节pH至4.5-5.5，又经过洗涤和浓缩步骤(见上)以除去过量的稳定剂。最后使诸如山梨醇的稳定剂浓度达到适宜的浓度，以使溶液的渗透性到人体能接受。温度控制在0-20℃之间。蛋白浓度也用上述方法调节。pH维持在4.5-5.5。抗补体活性＞＝0.3mg/CH 50。

上述溶液然后除菌，通常用适当的滤器进行无菌过滤，然后罐装到成品瓶中，适宜人体使用。

上述制品主要用于静脉注射，虽然也可肌注。使用时可视情况配制或稀释到所需浓度，再注射。静脉注射时可单独使用，也可与其它血液制品混用，如全血，血浆，血浆蛋白组分，纤维蛋白原，凝血因子如：八因子，九因子浓缩制剂等，及白蛋白。本发明丙球产品基本上无抗补体活性。

实施例：

血浆原料通过孔氏冷酒精沉淀法(Cohn method 6)除去组分I沉淀后，加入-15℃或更冷的95％酒精使其溶液中酒精浓度达到20％，用pH4.0的缓冲液调节pH至6.9。在此过程中随着酒精浓度的增大，温度逐渐的降低到-5℃，随后维持这个-5℃的温度。组分II+III沉淀形成，通过在-5℃下的离心分离，组分II+III沉淀贮藏于-20℃以下的冰库中备用。

组分II+III沉淀重新悬浮于含有醋酸钠和甘氨酸的水溶液中，以混合成悬浮液。溶液温度维持在0-5℃之间。通过加入-15℃或更冷的95％酒精使得其溶液中酒精浓度达到18-22％，及用pH4.0缓冲液调节溶液pH至pH到5.8-7.2，在此过程中逐渐的降低产品温度到-4.0--6.0℃，这样组分II+III-W沉淀就可形成。在温度-4.0--6.0℃条件下，控制流速不大于66Kg/小时，通过离心得到组分II+III-W。离心上清液弃去不用。

上述组分II+III-W沉淀重新悬浮于含有醋酸钠和甘氨酸的水溶液中，见前所述。pH调节用pH4.0缓冲液。当悬浮溶解结束后用pH4.0缓冲液调节溶液pH至5.1+(-)0.3，加入95％-15℃或更冷的酒精以提高悬浮液酒精浓度至所需范围，在加酒精过程中降低温度至-6.0℃，降低温度需防止溶液结冰。充分的搅拌数小时使沉淀形成完全。沉淀用离心方法除去，离心时温度为-5.0--7.0℃，流速控制在不大于66Kg/小时。得到沉淀为组分III，放弃不用。剩余组分III离心上清液，用深层过滤方法澄清，温度仍控制在-4.0--7.0℃。此离心上清液过滤后称之为组分III滤液。

上述溶液通过加入盐酸调节pH至4.0-5.0之间。温度控制在约-5-+5℃范围内。

用超滤方法进行洗涤和浓缩(板式膜，分子量100,000，MilliporPellicon)。先浓缩蛋白溶液至较小的体积，再适宜的用注射用水洗涤降低酒精浓度，然后用7-8倍体积的水进行交换洗涤。使溶液离子强度降低到小于0.001(估计值)。在此步处理过程中，小分子多肽类物质及一些杂质如酒精等的浓度降低到很小的水平。蛋白浓度调节至接近终产品的浓度范围(5％)。浓缩步骤仍用超滤技术。上述洗涤和浓缩过程中溶液pH保持在3.5-5.0的范围内。温度在0-20℃范围内。

接下来，加入稳定剂以适上述蛋白溶液能够承受高温处理。加入山梨醇至浓度达33％，除菌过滤后进行巴氏灭菌，温度在60+/-0.5℃下，时间用10-11小时。

经过病毒灭火处理后，用盐酸调节pH至4.5-5.5，又经过洗涤和浓缩步骤(见上)以除去过量的稳定剂，最后使稳定剂浓度达到5％。温度控制在0-20℃之间。蛋白浓度也用上述方法调节。得到半成品。

上述溶液然后除菌，通常用适当的滤器进行无菌过滤，然后罐装到成品瓶中。

成品经质量检验，主要指标均符合要求。见下表：

     检测项目                       结果

      外观                          合格

      纯度                          97.8％

   蛋白质总量                       5.01％

    IgA含量                         4.44mg/dl

     PKa                            ＜35IU/ml

抗补体活性(ACA)                     0.50mg/CH50热稳定性(57℃，4小时)                   合格聚合物(高效液相)                      1.68％单体+双聚体(高效液相)                   98.21％碎片(高效液相)                        0.11％

Claims (6)

1.一种液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白的制备方法，包括

i)在0℃、pH 7.4下向血浆里加入乙醇，使其在血浆里的浓度达8体积％，通过离心除去组分I沉淀；

ii)向离心上清液中加入-15℃或更冷的乙醇，使溶液中乙醇的浓度为25体积％，用pH4.0的缓冲液调节到pH6.9，温度调节到-5℃±1℃，形成组分II+III的沉淀；该方法的特征在于：

iii)在0-10℃下使ii)所得的沉淀再悬浮于含醋酸盐和选自糖醇、甘氨酸或碳水化合物的水溶液中，加入-15℃或更冷的乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到18-22％，调节pH至5.0-7.0，在-4.0℃到-6.0℃的温度下离心得到沉淀；

iv)使iii)中得到的沉淀再悬浮于含醋酸盐和选自糖醇、甘氨酸或碳水化合物的水溶液中，搅拌使沉淀溶解成溶液，再调节pH5.5±0.5，在-6.0℃下加入乙醇，使溶液中乙醇的浓度达到25％，在-5.0到-7.0℃下离心分离除去所形成的沉淀；

v)使iv)得到的上清液在-4.0℃到-7.0℃下经过滤澄清，超滤浓缩和洗涤，调节配制，从而制得液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的糖醇选自甘露糖醇或山梨醇。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的碳水化合物选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，向v)所得的滤液中加入山梨醇使其在溶液里的最终浓度为33％，在60+/-0.5℃下加热10-11小时进行病毒灭活和灭菌。

5.一种根据权利要求1所述方法制备的液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白，其特征在于，它进一步含有稳定剂，pH为4.5-5.5，没有经化学修饰和裂解，总蛋白浓度5±1％，其浊度小于15NTU，单体含量大于90％，纯度大于96％，抗补体活性不小于0.3mg/CH50。

6.根据权利要求5所述的液体制剂静脉注射用免疫血清球蛋白，其特征在于，所述的稳定剂选自甘氨酸、甘露糖醇、山梨醇、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、乳糖或它们的混合物。