ES2202658T3 - Heterociclos sustituidos que contienen nitrogeno como inhibidores de la proteina-quinasa p38. - Google Patents

Heterociclos sustituidos que contienen nitrogeno como inhibidores de la proteina-quinasa p38.

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ES2202658T3
ES2202658T3 ES97952517T ES97952517T ES2202658T3 ES 2202658 T3 ES2202658 T3 ES 2202658T3 ES 97952517 T ES97952517 T ES 97952517T ES 97952517 T ES97952517 T ES 97952517T ES 2202658 T3 ES2202658 T3 ES 2202658T3
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Guy W. Bemis
Francesco Gerald Salituro
John Patrick Duffy
John E. Cochran
Edmund Martin Harrington
Mark A. Murcko
Keith P. Wilson
Michael Su
Vincent P. Galullo
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A INHIBIDORES DE LA P38, UNA PROTEINA QUINASA DE MAMIFEROS QUE INTERVIENE EN LA PROLIFERACION CELULAR, MUERTE CELULAR Y RESPUESTA A ESTIMULOS EXTRACELULARES. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA LA PRODUCCION DE ESTOS INHIBIDORES. EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN LOS INHIBIDORES DE LA INVENCION Y PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DE LAS COMPOSICIONES EN EL TRATAMIENTO Y PREVENCION DE DISTINTOS TRASTORNOS.

Description

Heterociclos sustituidos que contienen nitrógeno como inhibidores de la proteína-quinasa p38.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a inhibidores de p38, una proteína-quinasa de mamíferos implicada en la proliferación celular, muerte celular y respuesta a estímulos extracelulares. La invención también se refiere a métodos para producir estos inhibidores. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los inhibidores de la invención, y métodos para usar esas composiciones para tratar y prevenir diferentes trastornos.
Antecedentes de la invención
Las proteína-quinasas están implicadas en diferentes respuestas celulares a señales extracelulares. Recientemente, se ha descubierto una familia de proteína-quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Son miembros de esta familia las Ser/Thr-quinasas que activan sus sustratos por fosforilación [B. Stein et al., Ann. Rep. Med. Chem., 31, pp. 289-98 (1996)]. Las propias MAPK son activadas por una variedad de señales incluyendo factores de crecimiento, citoquinas, radiación UV, y agentes que inducen tensiones.
Una MAPK particularmente interesante es p38. p38, también conocida como proteína de unión a fármaco antiinflamatorio supresora de citoquina (CSBP) y RK, se aisló de células pre-B de murino que fueron transfectadas con el receptor de lipopolisacáridos (LPS) CD14 e inducidas con LPS. Desde entonces se ha asilado y secuenciado p38, así como el cDNA que la codifica en seres humanos y en el ratón. Se ha observado activación de p38 en células estimuladas por tensiones, tales como tratamiento de lipopolisacáridos (LPS), UV, anisomicina, o choque osmótico, y por citoquinas, tales como IL-1 y TNF.
La inhibición de la quinasa p38 conduce al bloqueo de la producción tanto de IL-1 como de TNF. La IL-1 y el TNF estimulan la producción de otras citoquinas proinflamatorias tales como IL-6 e IL-8, y se han implicado en enfermedades inflamatorias agudas y crónicas y en la osteoporosis postmenstrual [R.B. Kimble et al., Endocrinol., 136, pp. 3054-61 (1995)].
Basándose en este descubrimiento, se cree que p38, junto con otras MAPK, tienen un papel en la mediación de la respuesta celular a estímulos inflamatorios, tales como acumulación de leucocitos, activación de macrófago/monocito, reabsorción tisular, fiebre, respuestas de fase aguda y neutrofilia. Además, las MAPK, tales como p38, se han implicado en el cáncer, agregación de plaquetas inducida por trombina, trastornos de inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunes, muerte celular, alergias, osteoporosis y enfermedades neurodegenerativas. Los inhibidores de p38 también se han implicado en la zona de control del dolor por inhibición de la inducción de la prostaglandina-endoperóxido-sintasa-2. Se exponen otras enfermedades asociadas con la sobreproducción de IL-1, IL-6, IL-8 o TNF en el documento WO 96/21654.
Otros autores ya han empezado a intentar desarrollar fármacos que inhiban específicamente las MAPK. Por ejemplo, la publicación PCT WO 95/31451 describe compuestos de pirazol que inhiben las MAPK, y en particular la p38. Sin embargo, la eficacia de estos inhibidores in vivo todavía se está investigando.
De acuerdo con esto, todavía es muy necesario desarrollar otros inhibidores específicos de p38 potentes, que sean útiles para tratar diferentes estados asociados con la activación de p38.
Sumario de la invención
La presente invención resuelve este problema proporcionando compuestos que demuestran una inhibición fuerte y específica de p38.
Estos compuestos tienen la fórmula general:
1 
\newpage
en las que cada uno de Q_{1} y Q_{2} se selecciona independientemente de sistemas de anillo heterociclo o carbociclo aromático de 5-6 miembros, o sistemas de anillo bicíclico de 8-10 miembros que constan de anillos carbociclo aromáticos, anillos heterociclo aromáticos o una combinación de un anillo carbociclo aromático y un anillo heterociclo aromático.
Los anillos que forman Q_{1} están sustituidos con 1 a 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; O-alquilo (C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONR'; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; CN; N(R')C(O)R^{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}.
Los anillos que forman Q_{2} están opcionalmente sustituidos con hasta 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo lineal o ramificado C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; O-alquilo (C_{1}-C_{3}); O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONR'; R^{3}; OR^{3}; NR^{3}; SR^{3}; C(O)R^{3}; C(O)N(R')R^{3}; C(O)OR^{3}; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; N = C-N(R')_{2}; o CN.
R' se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}; alquenilo (C_{2}-C_{3}) o alquinilo; fenilo o fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, metoxi, ciano, nitro, amino, hidroxi, metilo o etilo.
R^{3} se selecciona de sistemas de anillo carbociclo o heterociclo aromático de 5-6 miembros.
R^{4} es alquilo (C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} SO_{2}N(R^{2})_{2}; o un sistema de anillo carbociclo o heterociclo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} o SO_{2}N(R^{2})_{2}.
X se selecciona de -S-, -O-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -S(O_{2})-N(R^{2})-, -N(R^{2})-S(O_{2})-, -N(R^{2})-C(O)O-, -O-C(O)-N(R^{2}), -C(O)-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -C(O)-N(R^{2})-, -N(R^{2})-C(O)-, -N(R^{2})-, -C(R^{2})_{2}-, o -C(OR^{2})_{2}-.
Cada R se selecciona independientemente de hidrógeno, -R^{2}, -N(R^{2})_{2}, -OR^{2}, SR^{2}, -C(O)-N(R^{2})_{2}, -S(O_{2})-N(R^{2})_{2}, o -C(O)-OR^{2}, en el que dos R adyacentes están opcionalmente unidos entre sí, y junto con cada Y a los que están respectivamente unidos, forman un anillo carbociclo o heterociclo de 4-8 miembros;
R^{2} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), o alquenilo (C_{1}-C_{3}); cada uno opcionalmente sustituido con -N(R')_{2}, -OR', SR', -C(O)-N(R')_{2}, -S(O_{2})-N(R')_{2}, -C(O)-OR', o R^{3}.
Y es N o C;
A, si está presente, es N o CR';
n es 0 ó 1;
R_{1} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), OH, o O-alquilo(C_{1}-C_{3}).
En otra realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los inhibidores de p38 de esta invención. Estas composiciones se pueden usar en métodos para tratar o prevenir una variedad de trastornos, tales como cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades óseas destructivas, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas, enfermedades víricas, y enfermedades neurodegenerativas. Estas composiciones también son útiles en métodos para prevenir la muerte celular e hiperplasia, y por lo tanto se pueden usar para tratar o prevenir la reperfusión/isquemia en ataque de apoplejía, ataques cardiacos, e hipoxia de órgano. Las composiciones también son útiles en métodos para prevenir la agregación de plaquetas inducida por trombina. Cada uno de estos métodos descritos antes también son parte de la presente invención.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona inhibidores de p38 que tienen la fórmula general:
2
en las que cada uno de Q_{1} y Q_{2} se selecciona independientemente de sistemas de anillo heterociclo o carbociclo aromático de 5-6 miembros, o sistemas de anillo bicíclico de 8-10 miembros que constan de anillos carbociclos aromáticos, anillos heterociclos aromáticos o una combinación de un anillo carbociclo aromático y un anillo heterociclo aromático.
Los anillos que forman Q_{1} están sustituidos con 1 a 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONR'; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; CN; N(R')C(O)R^{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}.
Los anillos que forman Q_{2} están opcionalmente sustituidos con hasta 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo lineal o ramificado C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; R^{3}; OR^{3}; NR^{3}; SR^{3}; C(O)R^{3}; C(O)N(R')R^{3}; C(O)OR^{3}; C(O)N(R')R^{3}; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; N = C-N(R')_{2}; o CN.
R' se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}); alquenilo (C_{2}-C_{3}) o alquinilo; fenilo o fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, metoxi, ciano, nitro, amino, hidroxi, metilo o etilo.
R^{3} se selecciona de sistemas de anillo carbociclo o heterociclo aromático de 5-6 miembros.
R^{4} es alquilo (C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} o SO_{2}N(R^{2})_{2}; o un sistema de anillo carbociclo o heterociclo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} o SO_{2}N(R^{2})_{2}.
X se selecciona de -S-, -O-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -S(O_{2})-N(R^{2})-, -N(R^{2})-S(O_{2})-; -N(R^{2})-C(O)O-, -O-C(O)-N(R^{2}), -C(O)-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -C(O)-N(R^{2})-, -N(R^{2})-C(O)-, -N(R^{2})-, -C(R^{2})_{2}-, o -C(OR^{2})_{2}-.
Cada R se selecciona independientemente de hidrógeno, -R^{2}, -N(R^{2})_{2}, -OR^{2}, SR^{2}, -C(O)-N(R^{2})_{2}, -S(O_{2})-N(R^{2})_{2}, o -C(O)-OR^{2}, en el que dos R adyacentes están opcionalmente unidos entre sí, y junto con cada Y a los que están respectivamente unidos, forman un anillo carbociclo o heterociclo de 4-8 miembros;
Cuando dos componentes R forman un anillo junto con los componentes Y a los que están unidos respectivamente, será evidente para los expertos en la técnica, que se perderá un hidrógeno terminal de cada componente R no condensado. Por ejemplo, si una estructura de anillo está formada por unión de estos dos componentes R entre sí, siendo uno -NH-CH_{3} y siendo el otro-CH_{2}-CH_{3}, se perderá un hidrógeno terminal de cada componente R (indicado en negrita). Por lo tanto, la parte resultante de la estructura de anillo tendrá la fórmula -NH-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-.
R_{2} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), o alquenilo (C_{1}-C_{3}); cada uno opcionalmente sustituido con -N(R')_{2}, -OR', SR', -C(O)-N(R')_{2}, - S(O_{2})-N(R')_{2}, -C(O)-OR', o R^{3}.
Y es N o C;
A, si está presente, es N o CR';
n es 0 ó 1;
R_{1} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), OH, o O- alquilo(C_{1}-C_{3}). Será evidente para los expertos en la técnica, que si R_{1} es OH, el inhibidor resultante puede tautomerizar dando como resultado un compuesto de fórmula:
3
que también son inhibidores de p38 de esta invención.
De acuerdo con otra realización preferida, Q_{1} se selecciona de fenilo o piridilo que contiene de 1 a 3 sustituyentes, en el que al menos uno de dichos sustituyentes está en la posición orto, y dichos sustituyentes se seleccionan independientemente de cloro, fluoro, bromo, -CH_{3}, -OCH_{3}, -OH, -CF_{3}, -OCF_{3}, -O(CH_{2})_{2}CH_{3}, NH_{2}, 3,4-metilendioxi, -N(CH_{3})_{2}, -NH-S(O)_{2}-fenilo, -NH-C(O)O-CH_{2}-4-piridina, -NH-C(O)CH_{2}-morfolina, -NH-C(O)CH_{2}-N(CH_{3})_{2}, -NH-C(O)CH_{2}-piperazina, -NH-C(O)CH_{2}-pirrolidina, -NH-C(O)C(O)-morfolina, -NH-C(O)C(O)-piperazina, -NH-C(O)C(O)-pirrolidina, -O-C(O)CH_{2}-N(CH_{3})_{2}, o -O-(CH_{2})_{2}-N(CH_{3})_{2}.
Incluso son más preferidos fenilo o piridilo que contienen al menos 2 de los sustituyentes antes indicados estando ambos en la posición orto.
Algunos ejemplos específicos de Q_{1} preferidos, son:
4
5
6
7
Más preferiblemente, Q_{1} se selecciona de 2-fluoro-6-trifluorometilfenilo, 2,6-difluorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2-cloro-4-hidroxifenilo, 2-cloro-4-aminofenilo, 2,6-dicloro-4-aminofenilo, 2,6-dicloro-3-aminofenilo, 2,6-dimetil-4-hidroxifenilo, 2-metoxi-3,5-dicloro-4-piridilo, 2-cloro-4,5-metilendioxi-fenilo, o 2-cloro-4-(N-2-morfolino-acetamido)fenilo.
De acuerdo con una realización preferida, Q_{2} es fenilo o piridilo que contiene de 0 a 3 sustituyentes, en el que cada sustituyente se selecciona independientemente de cloro, fluoro, bromo, metilo, etilo, isopropilo, -OCH_{3}, -OH, -NH_{2}, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}, -OCH_{3}, -C(O)OH, -C(O)OCH_{3}, -CH_{2}NH_{2}, -N(CH_{3})_{2}, -CH_{2}-pirrolidina y -CH_{2}OH.
Algunos ejemplos específicos de Q_{2} preferidos, son:
8
9
10
11
2-piridilo no sustituido o fenilo no sustituido.
Son más preferidos los compuestos en los que Q_{2} se selecciona de fenilo, 1-isopropilfenilo, 3,4-dimetilfenilo, 2-etilfenilo, 3-fluorofenilo, 2-metilfenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo, 3-clorofenilo, 2-carbometoxifenilo, 2-carboxifenilo, 2-metil-4-clorofenilo, 2-bromofenilo, 2-piridilo, 2-metilenhidroxifenilo, 4-fluorofenilo, 2-metil-4-fluorofenilo, 2-cloro-4-fluorofenilo, 2,4-difluorofenilo, 2-hidroxi-4-fluorofenilo o 2-metilenhidroxi-4-fluorofenilo.
De acuerdo todavía con otra realización preferida, X es -S-, -O-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -NR-, -C(R_{2})- o -C(O)-, Más preferiblemente, X es S.
De acuerdo con otra realización preferida, n es 1 y A es N.
De acuerdo con otra realización preferida, cada Y es C.
De acuerdo con una realización incluso más preferida, cada Y es C y los R unidos a esos componentes Y se seleccionan de hidrógeno o metilo.
En la siguiente tabla se exponen algunos de los inhibidores específicos de esta invención.
TABLA 1 Compuestos de fórmula Ia y Ib
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17
De acuerdo con otra realización, la presente invención proporciona métodos para preparar inhibidores de p38 de la fórmula (Ia) antes representada. Estos métodos implican hacer reaccionar un compuesto de fórmula II:
18 
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en el que cada una de las variables de la fórmula anterior son las mismas que las definidas antes para los inhibidores de esta invención, con un reactivo con grupo lábil de fórmula IIa:
19
en la que R' es como se ha definido antes, o un reactivo con grupo lábil de fórmula IIb:
20
en las que cada uno de L_{1}, L_{2} y L_{3} representan independientemente un grupo lábil.
El reactivo con grupo lábil usado en esta reacción se añade en exceso, solo o con un codisolvente, tal como tolueno. La reacción se lleva a cabo a una temperatura entre 25ºC y 150ºC.
Entre los reactivos con grupo lábil de fórmula IIA que son útiles para preparar los inhibidores de p38 de esta invención, se incluyen dimetilacetal de la dimetilformamida, dimetilacetal de la dimetilacetamida, ortoformiato de trimetilo, dietilacetal de la dimetilformamida y otros reactivos relacionados. Preferiblemente el reactivo con grupo lábil de fórmula IIa usado para preparar los inhibidores de esta invención es el dimetilacetal de la dimetilformamida.
Entre los reactivos con grupo lábil de fórmula IIb que son útiles para preparar los inhibidores de p38 de esta invención, se incluyen fosgeno, carbonildiimidazol, carbonato de dietilo y trifosgeno.
Los métodos más preferidos para preparar los compuestos de esta invención usan compuestos de fórmula II en la que cada una de las variables se definen en términos de las elecciones más preferidas y las más preferidas expuestas antes para los compuestos de esta invención.
Puesto que el origen de R_{1} es el reactivo con grupo lábil (C-R' o C = O), su identidad dependerá, por supuesto, de la estructura de este reactivo. Por lo tanto, en compuestos donde R_{1} es OH, el reactivo usado debe ser IIB. Igualmente, cuando R_{1} es H o alquilo (C_{1}-C_{3}), el reactivo usado debe ser IIa. Con el fin de generar inhibidores en los que R_{1} es O-alquilo(C_{1}-C_{3}), primero se genera un compuesto en el que R_{1} es OH, seguido de alquilación de este hidroxi por técnicas patrón, tales como tratamiento con hidruro de Na en DMF, yoduro de metilo o yoduro de etilo.
Los propios precursores inmediatos de los inhibidores de esta invención de fórmula Ia (es decir, compuestos de Fórmula II) se pueden sintetizar por cualquiera de los esquemas de síntesis representados a continuación:
Esquema 1
21
En el Esquema 1, el orden de las etapas 1) y 2) se puede invertir. También, el nitrilo inicial se puede sustituir por un ácido correspondiente o por un éster. Alternativamente, se pueden usar otros restos conocidos de carbóxilo o carboxamida latente en lugar del nitrilo (véase el esquema 2). Se pueden incorporar en este esquema variaciones tales como ácidos carboxílicos, ésteres carboxílicos, oxazolinas u oxazolidinonas, usando posteriores métodos de desprotección y funcionalización conocidos en la técnica.
La base usada en la primera etapa del Esquema 1 (y en el siguiente Esquema 2) se selecciona de hidruro sódico, amiduro sódico, LDA, hexametildisilazuro de litio, hexametildisilazuro de sodio, o una serie de otras bases no nucleófilas que desprotonarán la posición alfa al nitrilo.
También, la adición de HX-Q_{2} en una sola etapa representada antes, se puede sustituir por dos etapas - - la adición de un derivado de X protegido o no protegido, seguido de adición de un derivado de Q_{2} en la posterior etapa.
Esquema 2
22
En el Esquema 2, Z se selecciona de COOH, COOR', CON(R')_{2}, oxazolina, oxazolidinona o CN. R' es como se ha definido antes.
De acuerdo con otra realización, la presente invención proporciona métodos para preparar inhibidores de p38 de la fórmula (Ib) antes representada. Estos métodos implican hacer reaccionar un compuesto de fórmula III:
23
en el que cada una de las variables de la fórmula anterior son las mismas que las definidas antes para los inhibidores de esta invención, con un reactivo con grupo lábil de fórmula:
24
como se ha descrito antes.
A continuación se representan dos esquemas de síntesis completos de los inhibidores de p38 de fórmula (Ib) de esta invención.
Esquema 3
25
En el esquema 3, se puede tratar un derivado sustituido de Q_{1} con una base tal como hidruro sódico, amiduro sódico, LDA, hexametildisilazuro de litio, hexametildisilazuro de sodio o cualquiera de otras bases no nucleófilas para desprotonar la posición alfa al grupo Z, que representa un resto amida enmascarado. Alternativamente, Z es un ácido carboxílico, éster carboxílico, oxazolina u oxazolidinona. Después el anión que resulta de la desprotonación se pone en contacto con un compuesto heterociclo que lleva nitrógeno que contiene dos grupos lábiles, o grupos lábiles latentes, en presencia de un catalizador de paladio. Un ejemplo de dichos compuestos puede ser 2,6-dicloropiridina.
En la etapa dos, se introduce el resto de anillo Q_{2}. Esto se puede llevar a cabo usando muchas reacciones conocidas en la técnica que dan como resultado la producción de compuestos de biarilo. Un ejemplo puede ser la reacción de un compuesto de aril-litio con el producto intermedio de piridina preparado en la etapa 1. Alternativamente, un compuesto aril-metálico tal como un aril-estannano o un ácido aril-borónico se puede hacer reaccionar con la parte de haluro de arilo del producto intermedio de piridina en presencia de un catalizador de Pdº.
En la etapa 3, el grupo Z se desprotege y/o funcionaliza para formar el compuesto amida. Cuando Z es un ácido carboxílico, éster carboxílico, oxazolidona u oxazolidinona, se usan variaciones de los métodos de desprotección y funcionalización que son conocidos en la técnica para preparar la amida. Finalmente en la etapa 4, el compuesto amida se cicla al producto final usando reactivos tales como acetal de DMF o reactivos similares solos o en un disolvente orgánico.
Esquema 4
26
El Esquema 4 es similar excepto que primero se genera un producto intermedio biarilo antes de la reacción con la materia prima de Q_{1}.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona inhibidores de p38 similares a los de las fórmulas anteriores Ia y Ib, pero en las que el C = N en el anillo que lleva el sustituyente Q_{1} está reducido. Estos inhibidores tienen la fórmula:
27
en las que A, Q_{1}, Q_{2}, R, R', X, Y y n se definen de la misma forma expuesta para los compuestos de las fórmula Ia y Ib. Estas definiciones se mantienen para todas las realizaciones de cada una de esas variables (es decir, básico, preferido, más preferido, y el más preferido). R^{5} se selecciona de hidrógeno, -CR'_{2}OH, -C(O)R^{4}, -C(O)OR^{4}, -CR'_{2}OPO_{3}H_{2}, -PO_{3}H_{2}, y sales de -PO_{3}H_{2}.
Cuando R^{5} no es hidrógeno, se espera que los compuestos resultantes sean formas profármaco que se deben escindir in vivo para producir un compuesto en el que R^{5} es hidrógeno.
De acuerdo con otras realizaciones preferidas, en los compuestos de fórmula Ic, A es preferiblemente nitrógeno, n es preferiblemente 1, y X es preferiblemente azufre. En compuestos de fórmula Ic o Id, Q_{1} y Q_{2} preferiblemente son los mismos restos indicados antes para estas variables en los compuestos de fórmulas Ia y Ib.
Los compuestos de fórmulas Ic y Id se pueden preparar directamente a partir de compuestos de fórmulas Ia o Ib que contienen un hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{3} o alquenilo o alquinilo C_{2}-C_{3} en la posición de R_{1} (por ejemplo, donde R_{1} = R'). Los esquemas de síntesis para estos compuestos se representan en los siguientes Esquemas 5 y 6.
Esquema 5
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Esquema 6
29
En estos esquemas, los compuestos de fórmula Ia o Ib se reducen por reacción con un exceso de hidruro de diisobutilaluminio o reactivo equivalente, para dar los compuestos con el anillo reducido de fórmula Ic o Id, respectivamente.
La adición de un componente R^{5} distinto de hidrógeno en el nitrógeno del anillo se logra haciendo reaccionar los compuestos de fórmula Ic o Id antes indicados con el(los) reactivo(s) adecuado(s). Se proporcionan ejemplos de dichas modificaciones en la siguiente sección de Ejemplos.
En la siguiente tabla se exponen algunos inhibidores específicos de fórmula Ic de esta invención.
TABLA 2 Compuestos de fórmula Ic
30
31
32
33
34 
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De acuerdo todavía con otra realización, la invención proporciona inhibidores de p38 de fórmulas:
35
en las que A, Q_{1}, Q_{2}, R, X, Y y n se definen de la misma forma expuesta para los compuestos de fórmulas Ia y Ib. Estas definiciones se mantienen para todas las realizaciones de cada una de estas variables (es decir, básica, preferida, más preferida y la más preferida). Más preferiblemente, en compuestos de fórmula Ie, Q_{2} es fenilo no sustituido.
Q_{3} es un sistema de anillo carbociclo o heterociclo aromático de 5-6 miembros, o un sistema de anillo bicíclico de 8-10 miembros que comprende anillos carbociclo aromáticos, anillos heterociclo aromáticos o una combinación de un anillo carbociclo aromático y un anillo heterociclo aromático. Los anillos de Q_{3} están sustituidos con 1 a 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONR'; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; CN; N(R')C(O)R_{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; -N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}.
De acuerdo con una realización preferida, Q_{3} está sustituido con 2 a 4 sustituyentes, en el que al menos uno de dichos sustituyentes está presente en la posición orto relativa al punto de unión de Q_{3} al resto del inhibidor. Cuando Q_{3} es un anillo bicíclico, los 2 sustituyentes en las posiciones orto están en el anillo que está más cerca (es decir, directamente unido) al resto de la molécula de inhibidor. Los otros dos sustituyentes opcionales pueden estar presentes en cualquiera de los anillos. Más preferiblemente, ambas posiciones orto están ocupadas por uno de dichos sustituyentes.
De acuerdo con otra realización preferida, Q_{3} es un anillo carbociclo monocíclico, en el que cada sustituyente en orto se selecciona independientemente de halógeno o metilo. De acuerdo con otra realización preferida, Q_{3} contiene 1 ó 2 sustituyentes adicionales independientemente seleccionados de NR'_{2}; OR'; CO_{2}R', CN, N(R')C(O)R^{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}.
Preferiblemente, Q_{3} se selecciona de cualquiera de los restos Q_{3} presentes en los compuestos expuestos en la siguiente Tabla 3, o de cualquiera de los restos Q_{3} presentes en los compuestos Ig expuestos en la siguiente Tabla 4.
Los expertos reconocerán que los compuestos de fórmula Ie son los precursores directos de algunos de los inhibidores de p38 de fórmula Ia y fórmula Ic de esta invención (es decir, aquellas en las que Q_{1} = Q_{3}). Los expertos también reconocerán que los compuestos de fórmula Ig son precursores de algunos de los inhibidores de p38 de fórmula Ib y Id de esta invención (es decir, aquellas en las que Q_{1} = Q_{3}). De acuerdo con esto, la síntesis de los inhibidores de fórmula Ie se ha representado antes en los Esquemas 1 y 2, en los que Q_{1} se sustituye por Q_{3}. Igualmente, la síntesis de los inhibidores de fórmula Ig se ha representado antes en los Esquemas 3 y 4, en los que Q_{1} se sustituye por Q_{3}.
La síntesis de los inhibidores de fórmula If y fórmula Ih se representa a continuación en los Esquemas 7 y 8.
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Esquema 7
36
Esquema 8
37
El esquema 8 representa la síntesis de los compuestos de tipo Ih. Por ejemplo, el tratamiento de un derivado dibromado inicial, tal como 2,6-dibromopiridina, con una amina en presencia de una base tal como hidruro sódico, da el derivado de 2-amino-6-bromo. El tratamiento de este producto intermedio con un análogo de ácido fenilborónico (un ácido Q_{2}-borónico) tal como ácido fenil-borónico en presencia de un catalizador de paladio, da el derivado disustituido que después se puede acilar para dar el producto final. El orden de las dos primeras etapas de esta síntesis se puede invertir.
Sin querer ligarse por la teoría, los autores de la invención creen que la sustitución diorto en el anillo Q_{3} de los inhibidores de fórmula Ie y Ig, y la presencia de un nitrógeno unido directamente al anillo Q_{1} en los inhibidores de fórmula If e Ih produce un "aplanamiento" del compuesto que permite que inhiba p38 eficazmente.
Un inhibidor de fórmula Ie preferido de esta invención, es uno en el que A es carbono, n es 1, X es azufre, cada Y es carbono, cada R es hidrógeno, Q_{3} es 2,6-diclorofenilo y Q_{2} es fenilo, haciéndose referencia a este compuesto como compuesto 201. Un inhibidor de fórmula Ig preferido de esta invención, es uno en el que Q_{3} es 2,6-diclorofenilo, Q_{2} es fenilo, cada Y es carbono y cada R es hidrógeno. A este compuesto se hace referencia aquí como compuesto 202. Otros compuestos de fórmula Ig preferidos de esta invención son los listados en la siguiente Tabla 4.
Los compuestos Ih preferidos de esta invención son los representados en la siguiente Tabla 5. Otros compuestos Ih preferidos, son aquellos en los que Q_{1} es fenilo independientemente sustituido en las posiciones 2 y 6 por cloro o fluoro; cada Y es carbono; cada R es hidrógeno; y Q_{2} es 2-metilfenilo, 4-fluorofenilo, 2,4-difluorofenilo, 2-metilenhidroxi-4-fluorofenilo o 2-metil-4-fluorofenilo.
Se representan algunos inhibidores específicos de fórmulas Ie, Ig y Ih en las siguientes tablas.
TABLA 3 Inhibidores de fórmula Ie
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TABLA 4 Inhibidores de fórmula Ig
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47
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TABLA 5 Compuestos inhibidores Ih
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50
La actividad de los inhibidores de p38 de esta invención se puede ensayar in vitro, in vivo o en una línea celular. Entre los ensayos in vitro se incluyen ensayos que determinan la inhibición de la actividad de la quinasa o actividad de la ATPasa de p38 activada. Ensayos in vitro alternos cuantifican la capacidad del inhibidor de unirse a p38, y se puede medir llevando a cabo radiomarcaje del inhibidor antes de la unión, aislando el complejo inhibidor/p38 y determinando la cantidad de radiomarcaje unido, o llevando a cabo un experimento de competición donde se incuban los nuevos inhibidores con p38 unido a radioligandos conocidos.
Los ensayos de cultivo celular del efecto inhibidor de los compuestos de esta invención, pueden determinar las cantidades de TNF, IL-1, IL-6 o IL-8 producidas en las sangre entera o sus fracciones celulares en células tratadas con inhibidor comparado con células tratadas con testigos negativos. El nivel de estas citoquinas se puede determinar mediante el uso de ELISA disponible en el comercio.
Un ensayo in vivo útil para determinar la actividad inhibidora de los inhibidores de p38 de esta invención, es la supresión de edema de las patas traseras en ratas con artritis adyuvante inducida por Mycobacterium butyricum. Éste se describe en J. Med. Chem., 39, pp. 3929-37 (1996) de J.C. Boehm et al., cuya descripción se incorpora aquí como antecedente. Los inhibidores de p38 de esta invención también se pueden ensayar en modelos animales de artritis, reabsorción ósea, choque por endotoxinas y función inmune, como se describe en J. Pharmacol. Experimental Therapeutics, 279, pp. 1453-61 (1996), de A.M. Badger et al., cuya descripción se incorpora aquí como antecedente.
Los inhibidores de p38 o sus sales farmacéuticas se pueden formular en composiciones farmacéuticas para administrar a animales o seres humanos. Estas composiciones farmacéuticas, que constan de una cantidad de inhibidor de p38 eficaz para tratar o prevenir un estado mediado por p38 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, son otra realización de la presente invención.
La expresión "estado mediado por p38", tal como se usa en la presente invención, significa cualquier enfermedad o estado perjudicial en el que se sepa que p38 juega un papel. Esto incluye, estados que se sabe que son causados por la sobreproducción de IL-1, TNF, IL-6 o IL-8. Entre dichos estados se incluyen, sin limitación, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos óseos destructivos, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en ataque de apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de órgano, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, agregación de plaquetas inducida por trombina, y estados asociados con la prostaglandina-endoperoxidasa-sintasa-2.
Entre las enfermedades inflamatorias que se pueden tratar o prevenir se incluyen, pero no se limitan, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma, alergias, y síndrome de dificultad respiratoria del adulto. Entre las enfermedades autoinmunes que se pueden tratar o prevenir, se incluyen, pero no se limitan, glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Grave, gastritis autoinmune, diabetes, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, dermatitis atópica, hepatitis activa crónica, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, psoriasis, o enfermedad de injerto contra huésped.
Entre los trastornos óseos destructivos que se pueden tratar o prevenir se incluyen, pero no se limitan, osteoporosis, osteoartritis y trastorno óseo relacionado con mieloma múltiple.
Entre las enfermedades proliferativas que se pueden tratar o prevenir se incluyen, pero no se limitan, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, melanoma metastático, sarcoma de Kaposi, y mieloma múltiple.
Entre los trastornos angiogénicos que se pueden tratar o prevenir se incluyen tumores sólidos, neovascularización ocular, hemangioma infantil.
Entre las enfermedades infecciosas que se pueden tratar o prevenir se incluyen, pero no se limitan, sepsis, choque séptico, y Shigellosis.
Entre las enfermedades víricas que se pueden tratar o prevenir se incluyen, pero no se limitan, infección de hepatitis aguda (incluyendo hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C), infección por VIH y retinitis por CMV.
Entre las enfermedades neurodegenerativas que se pueden tratar o prevenir con los compuestos de esta invención se incluyen, pero no se limitan, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquémias cerebrales o enfermedad neurodegenerativa causada por lesión traumática.
Los "estados mediados por p38" también incluyen isquemia/reperfusión en ataque de apoplejía, ataques cardiacos, isquemia miocárdica, hipoxia de órgano, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, y agregación de plaquetas inducida por trombina.
Además, los inhibidores de p38 en esta invención también pueden inhibir la expresión de proteínas proinflamatorias inducibles tales como la prostaglandina-endoperoxidasa-sintasa-2 (PGHS-2), denominada también ciclooxigenasa 2 (COX-2). Por lo tanto, otros "estados mediados por p38" son edema, analgesia, fiebre y dolor tal como dolor neuromuscular, cefalea, dolor por cáncer, dolor dental y dolor de artritis.
Las enfermedades que se pueden tratar o prevenir con los inhibidores de p38 de esta invención también se pueden agrupar convenientemente por la citoquina (IL-1, TNF, IL-6, IL-8) que se cree que es responsable de la enfermedad.
Por lo tanto, una enfermedad o estado mediado por IL-1 incluye artritis reumatoide, osteoartritis, ataque de apoplejía, endotoxemia y/o síndrome de choque tóxico, reacción inflamatoria inducida por endotoxinas, enfermedad inflamatoria del intestino, tuberculosis, ateroesclerosis, degeneración muscular, caquexia, artritis psoriática, síndrome de Reiter, gota, artritis traumática, artritis causada por rubéola, sinovitis aguda, diabetes, enfermedad de célula !03! pancreática y enfermedad de Alzheimer.
Entre las enfermedades o estados mediados por TNF se incluyen la artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis, artritis gotosa y otros estados artríticos, sepsis, choque séptico, choque endotóxico, sepsis por bacterias gram negativas, síndrome de choque tóxico, dificultad respiratoria del adulto, malaria cerebral, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, silicosis, sarcoidosis pulmonar, enfermedades de reabsorción ósea, lesión por reperfusión, reacción de injerto contra huésped, rechazos de aloinjerto, fiebre y mialgias debido a infección, caquexia secundaria a la infección, SIDA, CRS o formación queloide maligna, formación de tejido de cicatriz, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa o piresis. Las enfermedades mediadas por TNF también incluyen infecciones víricas, tales como por VIH, CMV, influenza y herpes; e infecciones víricas veterinarias, tales como infecciones por lentivirus, incluyendo, pero sin limitar, virus de la anemia infecciosa equina, virus de artritis caprina, virus visna o virus maedi; o infecciones por retrovirus, incluyendo virus de inmunodeficiencia felina, virus de inmunodeficiencia bovina, o virus de inmunodeficiencia canina.
Entre las enfermedades o estados mediados por IL-8 se incluyen enfermedades caracterizadas por infiltración neutrófila masiva, tales como psoriasis, enfermedad inflamatoria del intestino, asma, lesión por reperfusión cardiaca y renal, síndrome de dificultad respiratoria del adulto, trombosis y glomerulonefritis.
Además, los compuestos de esta invención se pueden usar por vía tópica para tratar o prevenir estados producidos o exacerbados por IL-1 o TNF. Entre dichos estados se incluyen articulaciones inflamadas, eczema, psoriasis, estados inflamatorios de la piel tales como quemaduras solares, estados de inflamación del ojo tales como conjuntivitis, piresis, dolor y otros estados asociados con la inflamación.
Además de los compuestos de esta invención, también se pueden usar las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención en composiciones para tratar o prevenir los trastornos antes identificados.
Entre las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención se incluyen las derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Entre los ejemplos de sales de ácido adecuadas se incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidrocloruro, hidrobromuro, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ácidos, tales como el oxálico, aunque por sí mismos no son farmacéuticamente aceptables, se pueden usar para preparar sales útiles como productos intermedios para obtener los compuestos de la invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Entre las sales derivadas de bases adecuadas se incluyen sales de metal alcalino (por ejemplo, sodio o potasio), metal alcalino-térreo (por ejemplo, magnesio), amonio y N-(Cl-4-alquil)4+. Esta invención también prevé la cuaternización de cualesquiera grupos básicos que contengan nitrógeno de los compuestos aquí descritos. Se pueden obtener productos solubles o dispersables en agua o aceite mediante dicha cuaternización.
Entre los vehículos farmacéuticamente aceptables que se pueden usar en estas composiciones farmacéuticas se incluyen, pero no se limita, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato potásico, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrógeno-fosfato disódico, hidrógeno-fosfato potásico, cloruro sódico, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato magnésico, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol, y grasa de lana.
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar por vía oral, parenteral, por pulverizador de inhalación, por vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, o por un depósito implantado. El término "parenteral" tal como se usa aquí, incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión. Preferiblemente, las composiciones se administran por vía oral, intraperitoneal o intravenosa.
Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable por vía parenteral, por ejemplo en forma de una solución en 1,3- butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar está el agua, solución de Ringer y solución de cloruro sódico isotónica. Además, se usan convencionalmente aceites fijos estériles como un disolvente o medio de suspensión. Para este propósito se puede usar cualquier aceite fijo insípido, incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicérido son útiles para preparar productos inyectables, como son los aceites farmacéuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva, o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones de aceite también pueden contener un diluyente o dispersante alcohol de cadena larga, tal como carboximetil-celulosa o agentes de dispersión similares que se usan normalmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Con propósitos de formulación también se pueden usar otros tensioactivos usados normalmente tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan normalmente para fabricar formas de dosificación sólidas, líquidas u otras formas farmacéuticamente aceptables.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar por vía oral en cualquier forma de dosificación aceptable por vía oral, incluyendo, pero sin limitar, cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, entre los vehículos que se usan normalmente se incluyen lactosa y almidón de maíz. Típicamente también se añaden agentes lubricantes, tales como estearato magnésico. Para administración oral en forma de una cápsula, entre los diluyentes útiles se incluyen lactosa y almidón de maíz secado. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el ingrediente activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también se pueden añadir algunos edulcorantes, agentes de sabor o colorantes.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar en forma de supositorios para administrar por vía rectal. Estos se pueden preparar mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Entre dichos materiales se incluyen manteca de cacao, cera de abeja y polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar por vía tópica, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye zonas u órganos fácilmente accesibles por aplicación tópica, incluyendo enfermedades de los ojos, la piel, o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicas adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas zonas u órganos.
La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior se puede llevar a cabo en una formulación de supositorio rectal (véase antes) o en una formulación de enema adecuada. También se pueden usar parches transdérmicos vía tópica.
Para las aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en una pomada adecuada que contiene el componente activo suspendido o disuelto en uno o más vehículos. Entre los vehículos para administración tópica de los compuestos de esta invención se incluyen, pero no se limitan, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsionante y agua. Alternativamente, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en una loción o crema adecuada que contiene los componentes activos suspendidos o disueltos en uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Entre los vehículos adecuados se incluyen, pero no se limitan, aceite mineral, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua.
Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticas se pueden formular como suspensiones micronizadas en solución salina estéril de pH ajustado e isotónica, o preferiblemente como soluciones en solución salina estéril de pH ajustado e isotónica, con o sin un conservante tal como cloruro de benzalconio. Alternativamente, para usos oftálmicos las composiciones farmacéuticas se pueden formular en una pomada tal como vaselina.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar por aerosol nasal o por inhalación. Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y se pueden preparar como soluciones en solución salina, usando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/o otros agentes solubilizantes o de dispersión convencionales.
La cantidad de inhibidor de p38 que se puede combinar con los materiales vehículo para preparar una sola forma de dosificación variará dependiendo del paciente tratado, y el modo de administración particular. Preferiblemente, las composiciones se deben formular de forma que se pueda administrar una dosificación entre 0,01-100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor a un paciente que recibe estas composiciones.
También hay que entender que una dosificación y régimen de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico usado, la edad, el peso corporal, la salud general, sexo, alimentación, tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos, y el criterio del médico que lo trata y la gravedad de la enfermedad particular que se está tratando. La cantidad de inhibidor también dependerá del compuesto particular en la composición.
De acuerdo con otra realización, la invención proporciona métodos para tratar o prevenir un estado mediado por p38 que comprende la etapa de administrar a un paciente una de las composiciones farmacéuticas antes descritas. El término "paciente", tal como se usa aquí, significa un animal, preferiblemente un ser humano.
Preferiblemente, este método se usa para tratar o prevenir un estado seleccionado de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos óseos destructivos, trastornos proliferativos, enfermedades infecciosas, enfermedades degenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en ataque de apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de órgano, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, y agregación de plaquetas inducida por trombina.
De acuerdo con otra realización, los inhibidores de esta invención se usan para tratar o prevenir enfermedades o estados mediados por IL-1. IL-6, IL-8 o TNF. Dichos estados se han descrito antes.
Dependiendo del estado particular mediado por p38 que se va a tratar o prevenir, se pueden administrar fármacos adicionales, que se administran normalmente para tratar o prevenir ese estado, junto con los inhibidores de esta invención. Por ejemplo, se pueden combinar agentes quimioterapéuticos u otros agentes antiproliferativos con los inhibidores de p38 de esta invención para tratar enfermedades proliferativas.
Estos agentes adicionales se pueden administrar por separado de la composición que contiene el inhibidor de p38, como parte de un régimen de dosificación múltiple. Alternativamente, esos agentes pueden formar parte de una sola forma de dosificación, mezclados entre sí con el inhibidor de p38 en una sola composición.
Con el fin de que la invención aquí descrita se pueda entender de forma más completa, se exponen los siguientes ejemplos. Hay que entender que estos ejemplos tienen sólo propósitos ilustrativos y no se deben considerar limitantes de esta invención de ninguna forma.
Ejemplo 1 Síntesis del compuesto 1 inhibidor de p38
En los siguientes 4 ejemplos se exponen ejemplos de las síntesis de varios compuestos de fórmula Ia.
51
A una suspensión de amiduro sódico, al 90% (1,17 g, 30 mmoles) en tetrahidrofurano seco (20 ml), se añadió una solución de cianuro de bencilo (2,92 g, 25,0 mmoles) en tetrahidrofurano seco (10 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se añadió una solución de 3,6-dicloropiridazina (3,70 g, 25,0 mmoles) en tetrahidrofurano seco (10 ml). Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se diluyó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. Después la mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo. Las capas se separaron y la orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró a vacío.
El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: acetato de etilo en n-hexano al 30%) para dar 3,71 g (16,20 mmoles - 54%) de producto en forma de un sólido blanco.
52
A una suspensión de hidruro sódico, al 95% (0,14 g, 6,0 mmoles) en tetrahidrofurano seco (10 ml) se añadió tiofenol (0,66 g, 6,0 ml) a temperatura ambiente. Después la mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos. A la mezcla de reacción se añadió una solución del producto de la etapa A anterior (1,31 g, 5,72 mmoles) en etanol absoluto (20 ml). Después la mezcla de reacción se llevó a reflujo y se agitó durante una hora. La mezcla de reacción fría se concentró a vacío. El residuo se diluyó con una solución de hidróxido sódico 1 N (10 ml), y después se extrajo con cloruro de metileno. La fase orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró a vacío.
El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice (eluyente; acetato de etilo en n-hexano al 20%) para dar 0,66 g (2,19 mmoles \sim 40%) de producto en forma de un sólido blanco.
53
Una mezcla del producto de la etapa B (0,17 g, 0,69 mmoles) y ácido sulfúrico concentrado (5 ml) se calentó a 100ºC durante una hora. La solución se enfrió y se ajustó a pH 8 con una solución saturada de bicarbonato sódico. La mezcla de reacción se extrajo con cloruro de metileno. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró a vacío para dar 0,22 g (0,69 mmoles \sim 100%) de compuesto pre-1 en forma de un aceite naranja. ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) d 7,7 (d), 7,5 (d), 7,4 (m), 7,3-7,2 (m).
54
Una solución del compuesto pre-1 de la etapa C (0,22 g, 0,69 mmoles) y dimetilacetal de la N,N-dimetilformamida (0,18 g, 1,5 mmoles) en tolueno (5 ml) se calentó a 100ºC durante una hora. Después de enfriar, el sólido resultante se filtró y se disolvió en acetato de etilo caliente. El producto precipitó con la adición gota a gota de éter dietílico. Después el producto se filtró y se lavó con éter dietílico para dar 0,038 g del compuesto 1 (que se representa en la Tabla 1) en forma de un sólido amarillo. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 8,63 (s), 7,63-7,21 (m,), 6,44 (d).
Ejemplo 2 Síntesis del compuesto 2 inhibidor de p38
55
El primer producto intermedio representado antes se preparó de una forma similar al Ejemplo 1A, usando 4-fluorofenilacetonitrilo, para dar 1,4 g (5,7 mmoles, \sim 15%) de producto.
56 
\newpage
El producto intermedio anterior se preparó de una forma similar al Ejemplo 1B. Esto dio 0,49 g (1,5 mmoles, 56%) de producto.
57
El producto intermedio anterior se preparó de una forma similar al Ejemplo 1C. Esto dio 10 g (0,29 mmoles, 45%) de compuesto pre-2. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 7,65-7,48 (m), 7,47-7,30 (m), 7,29-7,11 (m), 7,06-6,91 (m), 5,85 (s, ancho).
58
El compuesto 2 (que se representa en la Tabla 1) se preparó a partir del compuesto pre-2 de una forma similar al Ejemplo 1D. Esto dio 0,066 g de producto. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 8,60 (s), 7,62-7,03 (m), 6,44 (d).
Ejemplo 3 Síntesis del compuesto 6 inhibidor de p38
59
El primer producto intermedio de la preparación del compuesto 6 se preparó de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1A, usando 2,6-diclorofenilacetonitrilo, para dar 2,49 g (8,38 mmoles, \sim 28%) de producto.
60 
\newpage
La siguiente etapa de la síntesis del compuesto 6 se llevó a cabo de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1B. Esto dio 2,82 g (7,6 mmoles, 91%) de producto.
61
El producto intermedio final, compuesto pre-6, se preparó de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1C. Esto dio 0,89 g (2,3 mmoles, 85%) de producto. ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) d 7,5-7,4 (dd), 7,4 (m), 7,3 (d), 7,2 (m), 7,05 (d).
62
La etapa final de la síntesis del compuesto 6 (que se representa en la Tabla 1) se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 1D. Esto dio 0,066 g de producto. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 8,69 (s), 7,65-7,59 (d), 7,58-7,36 (m), 7,32-7,22 (m), 6,79 (d), 6,53 (d).
Ejemplo 4 Preparación del compuesto 5 inhibidor de p38
63
El primer producto intermedio de la síntesis del compuesto 5 se preparó de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1A, usando 2,4-diclorofenilacetonitrilo, para dar 3,67 g (12,36 mmoles, 49%) de producto.
64 
\newpage
El segundo producto intermedio se preparó de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1B. Esto dio 3,82 g (9,92 mmoles, 92%) de producto
65
El producto intermedio final, compuesto pre-5, se preparó de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1C. Esto dio 0,10 g (0,24 mmoles, 92%) de producto. ^{1}H RMN (500 MHz, CD_{3}OD) d 7,9 (d), 7,7 (d), 7,6-7,5 (dd), 7,4-7,3 (m), 2,4 (s).
66
La etapa final en la preparación del compuesto 5 (que se representa en la Tabla 1) se llevó a cabo de una forma similar a la descrita en el Ejemplo 1D. Esto dio 0,06 g de producto. ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 8,64 (s), 7,51-7,42 (m), 7,32-7,21 (m), 6,85 (d), 2,42 (s).
Otros compuestos de fórmula Ia de esta invención se pueden sintetizar de una forma similar usando las materias primas adecuadas.
Ejemplo 5 Preparación de un compuesto de fórmula Ib inhibidor de p38
A continuación se presenta un ejemplo de la síntesis de un inhibidor de p38 de fórmula Ib de esta invención.
67
A una suspensión de amiduro sódico, 90% (1,1 eq.) en tetrahidrofurano seco se añadió una solución de cianuro de 2,6-diclorobencilo (1,0 eq.) en tetrahidrofurano seco a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se añadió una solución de 2,6-dicloropiridina (1 eq.) en tetrahidrofurano seco. La reacción se controló por TLC, y cuando se completó la mezcla de reacción se diluyó con una solución acuosa saturada de bicarbonato sódico. Después la mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el producto puro.
68
A una solución de 4-fluorobromobenceno (1 eq.) en tetrahidrofurano seco a -78ºC se añadió t-butil-litio (2 eq., solución en hexanos). Después la mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos. A la mezcla de reacción se añadió una solución del producto de la Etapa A (1 eq.) en THF seco. Después la mezcla de reacción se controló y se llevó lentamente a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se hidrolizó con agua y después se extrajo con cloruro de metileno. La fase orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró a vacío. El residuo se purificó por cromatografía en gel de sílice para dar el producto.
69
Se calentó una mezcla del producto de la etapa B y ácido sulfúrico concentrado a 100ºC durante una hora. La solución se enfrió y se ajustó a pH 8 con una solución saturada de bicarbonato sódico. La mezcla de reacción se extrajo con cloruro de metileno. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se concentró a vacío para dar el producto. El producto final se purificó por cromatografía ultrarrápida en gel de sílice.
70 
\hskip10cm
Compuesto inhibidor de p38
Se calienta una solución del producto de la Etapa C (1 eq.) y dimetilacetal de la N,N-dimetilformamida (2 eq.) en tolueno a 100ºC durante una hora. Después de enfriar, la mezcla resultante se filtra y se disuelve en acetato de etilo caliente. El producto precipita con la adición gota a gota de éter dietílico. Después el producto se filtra y se lava con éter dietílico para dar un inhibidor de p38 de fórmula Ib. El producto final se purifica más por cromatografía en gel de sílice.
Otros compuestos de fórmula Ib de esta invención se pueden sintetizar de una forma similar usando las materias primas adecuadas.
Ejemplo 6 Síntesis del compuesto 103 inhibidor de p38
71
Este ejemplo expone una síntesis típica de un compuesto de fórmula Ic.
A.
El compuesto 12 inhibidor de p38 se prepara esencialmente como se ha expuesto en el Ejemplo 4, excepto que se usa 4-fluorotiofenilo en la Etapa B.
B.
El compuesto 12 se disolvió en THF seco (5 ml) a temperatura ambiente. A esta solución se añadió hidruro de diisobutilaluminio (solución 1 M en tolueno, 5 ml, 5 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se hidrolizó por adición de sal de Rochelle. Las capas se separaron y se aisló la capa orgánica, se lavó con agua, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato magnésico y se filtró para dar el compuesto 103 bruto. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 2%. Así se obtuvo el compuesto 103 puro (210 mg, 50% de rendimiento): ^{1}H RMN (500 MHz, CDCl_{3}) d 7,51 (m, 1H), 7,38 (d, 2H), 7,20 (t, 2H), 7,08 (t, 2H), 6,70 (s ancho, 1H), 6,30 (dd, 2H), 5,20 (s, 2H).
Ejemplo 7 Síntesis del compuesto 201 inhibidor de p38
72
Se disolvió el nitrilo inicial mostrado arriba (5,9 g, 31,8 mmoles) en DMF (20 ml) a temperatura ambiente. Después se añadió hidruro sódico (763 mg, 31,8 mmoles), dando como resultado una solución de color amarillo brillante. Después de 15 minutos se añadió una solución de 2,5-dibromopiridina (5,0 g, 21,1 mmoles) en DMF (10 ml) seguido de tetraquis(trifenilfosfina)paladio (3 mmoles). Después la solución se refluyó durante 3 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con acetato de etilo. Después se aisló la capa orgánica, se lavó con agua y después con salmuera, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se evaporó a vacío hasta un aceite bruto. La cromatografía en columna ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo al 10% en hexano dio el producto (5,8 g, 84%) en forma de un sólido de color hueso.
73
El bromuro preparado en la etapa A (194,8 mg, 0,57 mmoles) se disolvió en xileno (15 ml). A esta solución se añadió tiofenilestannano (200 \mul, 587 mmoles) y tetraquis(trifenilfosfina)paladio (25 mg). La solución se refluyó toda la noche, se enfrió, se filtró y se evaporó a vacío. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice eluyendo con cloruro de metileno, para dar el producto puro (152 mg, 72%) en forma de un aceite amarillo.
74
Se disolvió el nitrilo preparado en la etapa B (1,2 g, 3,37 mmoles) en ácido acético glacial (30 ml). A esta solución se añadió agua (120 \mul, 6,67 mmoles) seguido de tetracloruro de titanio (760 \mul, 6,91 mmoles), que dio como resultado una reacción exotérmica. Después la reacción se refluyó durante dos horas, se enfrió y se vertió en HCl 1 N. La capa acuosa se extrajo con cloruro de metileno. Se volvió a lavar la capa orgánica con NaOH 1 N, se secó sobre sulfato magnésico y se filtró por una tapón de gel de sílice. El tapón se eluyó primero con cloruro de metileno para separar las materias primas sin reaccionar, y después con acetato de etilo para dar el compuesto 201. El acetato de etilo se evaporó para dar el compuesto 201 puro (1,0 g, 77%).
Ejemplo 8 Síntesis del compuesto 110 inhibidor de p38
75
El nitrilo inicial (3,76 g, 11,1 mmoles) se disolvió primero en ácido acético glacial (20 ml). A esta solución se añadió tetracloruro de titanio (22,2 mmoles) y agua (22,2 mmoles) y la solución se calentó a reflujo durante 1 hora. Después la mezcla de reacción se enfrió y se diluyó con agua/acetato de etilo. Después se aisló la capa orgánica, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato magnésico. Después se filtró la capa orgánica y se evaporó a vacío. El producto bruto resultante se cromatografió en gel de sílice eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 5% para dar el producto puro en forma de una espuma amarilla (2,77 g, 70%).
76
La amida preparada en la etapa A (1,54 g, 4,3 mmoles) se disolvió en tolueno (20 ml). Después se añadió dimetilacetal de la N,N-dimetilformamida (1,53 g, 12,9 mmoles), la solución resultante se calentó durante 10 minutos y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después la reacción se evaporó a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 2-5%. Después el material recuperado se disolvió en acetato de etilo caliente. La solución se dejó enfriar dando como resultado la cristalización del producto puro en forma de un sólido amarillo (600 mg, 40%). Había material adicional (-800 mg) disponible en las aguas madres.
77
El bromuro de la etapa B (369 mg, 1 mmol) se disolvió en THF (1 ml). Después se añadió hidruro de diisobutilaluminio (solución 1,0 M, 4 mmoles), la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y después la reacción se hidrolizó con metanol (1 ml). Después se añadió una solución saturada de sales de Rochelle y la mezcla se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se aisló, se secó sobre sulfato magnésico, se evaporó y el residuo se cromatografió en gel de sílice eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 1-3% para dar un sólido naranja brillante (85 mg, 23% de rendimiento).
78
El bromuro preparado en la etapa C (35,2 mg, 0,1 mmoles) se disolvió en xileno (12 ml). A esta solución se añadió tiofenol (0,19 mmoles) seguido de metóxido de tributilestaño (0,19 mmoles). La solución resultante se calentó a reflujo durante 10 minutos, seguido de adición de tetraquis(trifenilfosfina)-paladio (0,020 mmoles). La reacción se calentó y se controló la desaparición del bromuro inicial. Después la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se pasó por un tapón de gel de sílice. El tapón se eluyó inicialmente con cloruro de metileno para separar el reactivo de estaño en exceso, y después con metanol en acetato de etilo al 5% para eluir el inhibidor de p38. El filtrado se concentró y se volvió a cromatografiar en gel de sílice usando metanol en acetato de etilo al 5% como eluyente para dar el compuesto 110 puro (20 mg, 52%).
Ejemplo 9 Síntesis del compuesto 202 inhibidor de p38
79
El nitrilo inicial (2,32 g, 12 mmoles) se disolvió en DMF (10 mmoles) a temperatura ambiente. Después se añadió hidruro sódico (12 mmoles) dando como resultado una solución de color amarillo brillante. Después de 15 minutos, se añadió una solución de 2,6-dibromopiridina (2,36 g, 10 mmoles) en DMF (5 ml), seguido de tetraquis(trifenilsfosfina)paladio (1,0 mmoles). Después la solución se refluyó durante 3 horas. Después la reacción se enfrió a temperatura ambiente y se diluyó con acetato de etilo. Se aisló la capa orgánica, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato magnésico, se filtró y se evaporó a vacío hasta un aceite bruto. La cromatografía en columna ultrarrápida eluyendo con acetato de etilo en hexano al 10% dio el producto (1,45 g, 42%) en forma de un sólido blanco.
80
El compuesto de bromo preparado en la etapa A (1,77 g, 5,2 mmoles) se disolvió en tolueno (20 ml) y la solución resultante se desgasificó. En atmósfera de nitrógeno, se añadió una solución de ácido fenilborónico (950 mg, 7,8 mmoles) en etanol (4 ml) y una solución de carbonato sódico (1,73 g, 14 mmoles) en agua (4 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una hora y después se enfrió a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua y salmuera. Después la capa orgánica se secó con sulfato magnésico, se filtró y se concentró a vacío. El residuo se purificó en gel de sílice eluyendo con acetato de etilo en hexano al 30% para dar el producto en forma de un sólido blanco (1,56 g, 88%).
81 
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El nitrilo de la etapa B (700 mg, 2,07 mmoles) se disolvió en ácido sulfúrico concentrado (10 ml) y se calentó a 80ºC durante 1 hora. Después la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el pH se ajustó a 8 usando hidróxido sódico 6 N. Después la mezcla se extrajo con acetato de etilo. Se aisló la capa orgánica, se secó con sulfato magnésico y se evaporó a vacío para dar el compuesto 202 en forma de una espuma amarilla (618 mg, 84%).
Ejemplo 10 Síntesis del compuesto 410
82
En un matraz de fondo redondo de 100 ml y secado con llama, se añadieron 2,28 g (93,8 mmoles) de virutas de magnesio a 50 ml de tetrahidrofurano anhidro. Se añadió un cristal de yodo que formó un color marrón claro. A la solución se añadieron 1,5 ml de una muestra de 10,0 ml (79,1 ml) de 2-bromo-5-fluorotolueno. La solución se calentó a reflujo. El color marrón perdió intensidad, y se mantuvo el reflujo cuando se quitó la fuente de calor externa indicando la formación del reactivo de Grignard. Cuando el reflujo disminuyó, se añadió otra porción de 1,0-1,5 ml de bromuro dando como resultado un reflujo vigoroso. El procedimiento se repitió hasta que se añadió todo el bromuro. La solución verde oliva se calentó a reflujo externamente durante una hora para asegurar que se completaba la reacción. La solución se enfrió en un baño con hielo, y se añadió mediante jeringuilla a una solución de 9,3 ml (81,9 mmoles) de borato de trimetilo en 100 ml de tetrahidrofurano a -78ºC. Después de añadir el reactivo de Grignard se quitó el matraz del baño de enfriamiento y la solución se agitó a temperatura ambiente toda la noche. La solución blanca grisácea se vertió en 300 ml de H_{2}O y los productos volátiles se evaporaron a vacío. Se añadió HCl (400 ml de solución 2 N) y la mezcla blanca lechosa se agitó durante una hora a temperatura ambiente. Precipitó un sólido blanco. La mezcla se extrajo con éter dietílico y el extracto orgánico se secó (MgSO_{4}) y se evaporó a vacío para dar 11,44 g (94%) del ácido borónico en forma de un sólido blanco.
83
En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se disolvieron 7,92 g (33,4 mmoles) de 2,6-dibromopiridina en 50 ml de tolueno anhidro formando una solución incolora y transparente. Se añadió el ácido 4-fluoro-2-metilbenceno-borónico (5,09 g, 33,1 mmoles) preparado en la etapa A, formándose una suspensión blanca. Se añadió carbonato de talio (17,45 g, 37,2 mmoles) seguido de una cantidad catalítica de Pd(Ph_{3})_{4} (150 mg). La mezcla se calentó a reflujo toda la noche, se enfrió y se filtró por una almohadilla de gel de sílice. La sílice se lavó con CH_{2}Cl_{2} y el filtrado se evaporó para dar un sólido blanco. El sólido se disolvió en una cantidad mínima de CH_{2}Cl_{2}/hexano al 50% y se cromatografió en una columna corta de gel de sílice usando CH_{2}Cl_{2} al 30% para dar 6,55 g (74%) de la 2-bromo-6-(4-fluoro-2-metilfenil)piridina en forma de un sólido blanco.
84
En un matraz de fondo redondo de 50 ml, se disolvieron 550 mg (2,07 mmoles) de 2-bromo-6-(4-fluoro-2-metilfenil)piridina preparada en la etapa B en 30 ml de tetrahidrofurano anhidro formando una solución incolora y transparente. Se añadió 2,6-difluoroanilina (2,14 ml, 2,14 mmoles) seguido de 112 mg (2,79 mmoles) de una suspensión de NaH al 60% en aceite mineral. Se observó evolución de gas junto con una reacción exotérmica suave. La solución se calentó a reflujo toda la noche y después se enfrió. La mezcla de reacción se vertió en NH_{4}Cl al 10% y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. El extracto orgánico se secó (MgSO_{4}) y se evaporó a vacío para dar un aceite marrón que era una mezcla de producto y materia prima. El material se cromatografió en una columna corta de gel de sílice usando CH_{2}Cl_{2}/hexano al 50% para dar 262 mg (40%) de 2-(2,6-difluorofenil)-6-(4-fluoro-2-metilfenil)piridina en forma de un aceite incoloro.
85
En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se disolvieron 262 mg (834 mmoles) de la 2-(2,6-difluorofenil)-6-(4-fluoro-2-metilfenil)piridina preparada en la etapa C en 30 ml de CHCl_{3} anhidro formando una solución incolora y transparente. Se añadió clorosulfonil-isocianato (1,0 ml, 11,5 mmoles) y la solución amarillo claro se agitó a temperatura ambiente toda la noche. Se añadió agua ( 30 ml) produciendo una reacción exotérmica suave y evolución vigorosa de gas. Después de agitar toda la noche, se separó la capa orgánica, se secó (MgSO_{4}) y se evaporó a vacío para dar un aceite marrón que era una mezcla de producto y materia prima. El material se cromatografió en una columna corta de gel de sílice usando EtOAc/CH_{2}Cl_{2} al 10%. La materia prima recuperada se volvió a someter a las condiciones de reacción y se purificó de la misma forma para dar un total de 205 mg (69%) de la urea en forma de un sólido blanco.
Ejemplo 11 Síntesis del compuesto 138
86
El compuesto 103 (106 mg, 0,25 mmoles) se disolvió en THF (0,5 ml) y a esta solución se añadió trietilamina (35 \mul, 0,25 mmoles) seguido de un exceso de formaldehído (solución acuosa al 37%, 45 mg). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. Después la mezcla de reacción se evaporó en un rotavapor a presión reducida y el residuo se disolvió en cloruro de metileno y se aplicó a una columna ultrarrápida de gel de sílice. La columna se eluyó con metanol en cloruro de metileno al 2% para dar el producto puro (78 mg, 70% de rendimiento).
Ejemplo 12 Síntesis de profármacos del compuesto 103
87 
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El compuesto 138 (1 equivalente) se disuelve en cloruro de metileno y a esta solución se añade trietilamina (1 equivalente) seguido de cloruro de dibencilfosforilo (1 equivalente). La solución se agita a temperatura ambiente y se controla por TLC el consumo de la material prima. Después la capa de cloruro de metileno se diluye con acetato de etilo y se lava con HCl 1 N, solución saturada de bicarbonato sódico y solución saturada de NaCl. Después la capa orgánica se seca, se evapora en el rotavapor y el producto bruto se purifica en gel de sílice. Después el producto puro se disuelve en metanol y los ésteres de dibencilo se desprotegen con paladio sobre carbón al 10% en atmósfera de hidrógeno. Cuando la reacción se observa que se ha completado, el catalizador se filtra sobre celita y el filtrado se evapora en el rotavapor para dar el producto fosfato.
88
El compuesto 103 (210 mg, 1,05 mmoles) se disolvió en THF (2 ml) y se enfrió a -50ºC en atmósfera de nitrógeno. A esta solución se añadió hexametildisilizanuro de litio (1,1 mmoles) seguido de cloruro de cloroacetilo (1,13 mmoles). La reacción se quitó del baño de enfriamiento y se dejó calentar a temperatura ambiente, y después de esto la reacción se diluyó con acetato de etilo y se hidrolizó con agua. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó y se evaporó en el rotavapor a sequedad. El producto bruto se cromatografió en gel de sílice ultrarrápida usando acetato de etilo en hexano al 25% como eluyente, para dar 172 mg (70%) del producto puro deseado, que se usó en las siguientes reacciones.
89
El compuesto de cloroacetilo se disuelve en cloruro de metileno y se trata con un exceso de dimetilamina. La reacción se controla por TLC y cuando se completa se separan todos los productos volátiles para dar el producto deseado.
Ejemplo 13 Síntesis de los compuestos 34 y 117
90
El nitrilo del Ejemplo 5, etapa A (300 mg, 1,0 mmoles) se disolvió en etanol (10 ml) y a esta solución se añadió tiourea (80,3 mg, 1,05 mmoles). La reacción se llevó a reflujo durante 4 horas, momento en el que la TLC indicó que se había consumido toda la materia prima. La reacción se enfrió y se separaron todos los productos volátiles a presión reducida, y el residuo se disolvió en acetona (10 ml).
Después, a esta solución se añadió 2,5-difluoronitrobenceno (110 \mul, 1,01 mmoles) seguido de carbonato potásico (200 mg, 1,45 mmoles) y agua (400 \mul). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente toda la noche. Después la reacción se diluyó con cloruro de metileno (25 ml) y se filtró por un tapón de algodón. Se separaron todos los productos volátiles a presión reducida y el residuo se cromatografió en gel de sílice ultrarrápida eluyendo con un gradiente de acetato de etilo en hexano 10%-25% para dar el producto deseado (142 mg, 33%).
91
El producto nitrilo de la etapa A (142 mg, 0,33 mmoles) se mezcló con ácido sulfúrico concentrado (2 ml), se calentó a reflujo durante 1 hora y después se dejó enfriar a temperatura ambiente. Después la mezcla se diluyó con acetato de etilo y se neutralizó cuidadosamente con solución (acuosa) saturada de carbonato potásico. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con agua, salmuera y se secó sobre sulfato magnésico. La mezcla se filtró y se evaporó a sequedad. El residuo se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional (127 mg, 85% de rendimiento).
92
La amida de la etapa B (127 mg, 0,28 mmoles) se disolvió en THF (3 ml) y a esta solución se añadió dimetilacetal de la dimetilformamida (110 \mul, 0,83 mmoles). La reacción se calentó a reflujo durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. Todos los productos volátiles se separaron a vacío y el residuo se cromatografió en gel de sílice ultrarrápida eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 2,5% para dar el compuesto 34 deseado puro (118 mg, 92%).
93
Se añadió una solución de hexahidrato de dicloruro de níquel (103 mg, 0,44 moles) en una mezcla de benceno/metanol (0,84 ml/0,84 ml) a una solución del compuesto 34 (100,8 g, 0,22 mmoles) en benceno (3,4 ml), y esta solución se enfrió a 0ºC. Después a esta solución se añadió borohidruro sódico (49 mg, 1,3 mmoles). La reacción se agitó mientras se dejaba calentar a temperatura ambiente. La reacción se evaporó a vacío y el residuo se trató por cromatografía ultrarrápida eluyendo con metanol en cloruro de metileno al 2% para dar el producto puro deseado, el compuesto 117 (21 mg, 25% de rendimiento).
Ejemplo 14 Síntesis de los compuestos 53 y 142
94
El producto indicado en la reacción anterior se sintetizó usando el procedimiento del ejemplo 1 etapa B, usando cloropiridazina (359 mg, 1,21 mmoles) y 2, 4-difluorotiofenol (176 mg, 1,21 mmoles). El producto se obtuvo después de cromatografía ultrarrápida en gel de sílice (451 mg, 92%).
95
La reacción anterior se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 1, etapa C, usando 451 mg de materia prima y 5 ml de ácido sulfúrico concentrado para dar el producto indicado (425 mg, 90%).
96
La reacción anterior se llevó a cabo como se ha descrito en el Ejemplo 1, etapa D, usando amida inicial (410 mg, 0,96 mmoles) y dimetilacetal de la dimetilformamida (3 mmoles). La reacción se calentó a 50ºC durante 30 minutos y se trató como se ha descrito previamente. Se obtuvo el compuesto 53 (313 mg, 75%).
97
El Compuesto 34 (213 mg, 0,49 mmoles) se disolvió en THF (10 ml), se enfrió a 0ºC, y a esta solución se añadió Borano en THF (1 M, 0,6 mmoles). La reacción se agitó durante 30 minutos, se hidrolizó con agua y se diluyó con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó y se evaporó en el rotavapor. El residuo se purificó en gel de sílice eluyendo con un gradiente de metanol en cloruro de metileno de 1% a 5% para dar el compuesto 142 (125 mg, 57%).
Ejemplo 15 Clonación de la quinasa p38 en células de insecto
Se han identificado dos variantes de ayuste de la quinasa p38 humana, CSBP1 y CSBP2. Se usaron oligonucleótidos cebadores específicos para amplificar la región de codificación del cDNA de CSBP2 usando una biblioteca de células HeLa (Stratagene) como molde. El producto de la reacción en cadena de la polimerasa se clonó en el vector pET-15b (Novagen). El vector de transferencia de baculovirus pVL-(His)6-p38 se construyó por subclonación de un fragmento XbaI-BamHI de pET15b-(His)6-p38 en los sitios complementarios en el plásmido pVL 1392 (Pharmigen).
El plásmido pVL-(His)6-p38 dirigió la síntesis de una proteína recombinante que constaba de un péptido de 23 restos (MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLE, donde LVPRGS representa un sitio de escisión por trombina) condensado en el marco al extremo N de p38, confirmado por la secuenciación de DNA y la secuenciación N-terminal de la proteína expresada. El cultivo de monocapa de células de insecto Spodoptera frugiperda (Sf9) (ATCC) se mantuvo en medio de TNM-FH (Gibco BRL) complementado con suero bovino fetal al 10% en un matraz T a 27ºC. Las células Sf9 en fase logarítmica se cotransfectaron con DNA vírico lineal de virus de la polihedrosis nuclear Autographa califonica (Pharmigen) y vector de transferencia pVL-(His)6-p38 usando lipofectina (Invitrogen). Los clones de baculovirus recombinante individuales se purificaron por ensayo de placa usando agarosa de bajo punto de fusión al 1%.
Ejemplo 16 Expresión y purificación de la quinasa p38 recombinante
Se hicieron crecer células de Trichoplusia ni (Tn-368) High-Five® (Invitrogen) en suspensión de medio sin proteína Excel-405 (JRH Bioscience) en un matraz agitador a 27ºC. Las células con una densidad de 1,5 x 10^{6} células/ml se infectaron con el baculovirus recombinante descrito antes con una multiplicidad de infección de 5. El nivel de expresión de p38 recombinante se siguió por inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-p-38 de conejo (Santa Cruz Biotechnology). La masa de células se recogió 72 horas después de infección, cuando el nivel de expresión de p38 alcanzó su máximo.
La pasta de células congelada de células que expresan p38 marcado en (His)_{6} se descongeló en 5 volúmenes de Tampón A (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 8,0, NaCl 200 mM, \beta-mercaptoetanol 2 mM, glicerina al 10%, y PMSF 0,2 mM). Después de disrupción mecánica de las células en un microfluidizador, el lisato se centrifugó a 30.000 x g durante 30 minutos. El líquido sobrenadante se incubó de forma discontinua durante 3-5 horas a 4ºC con resina con afinidad por metales Talon® (Clontech) con una proporción de 1 ml de resina por 2-4 mg de p38 esperada. La resina se sedimentó por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos y se lavó bien de forma discontinua con Tampón A. Se formó una suspensión de la resina y se vertió en una columna (aproximadamente 2,6 x 5,0 cm) y se lavó con Tampón A + imidazol 5 mM.
La (His)_{6}-p38 se eluyó con Tampón A + imidazol 100 mM y posteriormente se dializó toda la noche a 4ºC frente a 2 litros de Tampón B (HEPES 50 mM, pH 7,5, \beta-glicerofosfato 25 mM, glicerina al 5%, DTT 2 mM). El marcador His_{6} se eliminó por adición de 1,5 unidades de trombina (Calbiochem) por mg de p38 e incubación a 20ºC durante 2-3 horas. La trombina se hidrolizó por adición de PMSF 0,2 mM, y después la muestra entera se cargó en una columna de 2 ml de benzamidina-agarosa (Amercian International Chemical).
El flujo por fracciones se cargó directamente en una columna Q-Sepharose de 2,6 x 5,0 cm (Pharmacia) previamente equilibrada en Tampón B + PMSF 0,2 mM. La p38 se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna a NaCl 0,6 M en Tampón B. Se recogió el pico de proteína eluida y se dializó toda la noche a 4ºC frente a Tampón C (HEPES 50 mM pH 7,5, glicerina al 5%; NaCl 50 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,2 mM).
La proteína dializada se concentró en un Centriprep (Amicon) a 3-4 ml y se aplicó a una columna Sephacryl 
\hbox{S-100HR}
de 2,6 x 100 cm (Pharmacia). La proteína se eluyó con un caudal de 35 ml/h. Se recogió el pico principal, se ajustó a DTT 20 mM, se concentró a 10-80 mg/ml y se congeló en partes alícuotas a -70ºC o se usó inmediatamente. Ejemplo 17 Activación de p38
P38 se activó combinando p38 0,5 mg/ml con MKK6 doblemente mutante DD 0,005 mg/ml en Tampón B + MgCl_{2} 10 mM, ATP 2 mM, Na_{2}VO_{4} 0,2 mM durante 30 minutos a 20ºC. Después, la mezcla de activación se cargó en una columna MonoQ de 1,0 x 10 cm (Pharmacia) y se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna a NaCl 1,0 M en Tampón B. P38 activada eluyó después del ADP y ATP. El pico de p38 activada se recogió y se dializó frente a Tampón B + Na_{2}VO_{4} 0,2 mM para separar el NaCl. La proteína dializada se ajustó a fosfato potásico 1,1 M por adición de una solución madre 4,0 M, y se cargó en una columna HIC de 1,0 x 10 cm (Rainin Hydropore) previamente equilibrada en Tampón D (glicerina al 10%, \beta-glicerofosfato 10 mM, DTT 2,0 mM) + K_{2}HPO_{4} 1,1 M. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna a tampón D + K_{2}HPO_{4} 50 mM. P38 doblemente fosforilada eluyó como el pico principal y se recogió para diálisis frente a Tampón B + Na_{2}VO_{4} 0,2 mM. p38 activada se almacenó a -70ºC.
Ejemplo 18 Ensayos de inhibición de p38 A. Inhibición de la fosforilación del péptido receptor de EGF
Este ensayo se llevó a cabo en presencia de MgCl_{2} 10 mM, \beta-glicerofosfato 25 mM, glicerina al 10% y tampón HEPES 100 mM a pH 7,6. Para una determinación de CI_{50} típica, se preparó una solución madre que contenía todos los componentes anteriores y p38 activado (5 nM). La solución madre se dividió en partes alícuotas en viales. Se introdujo en cada vial un volumen fijo de DMSO o inhibidor en DMSO (la concentración final de DMSO en la reacción era 5%), se mezcló y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió a cada vial péptido receptor de EGF, KRELVEPLTPSGEAPNQALLR, un aceptor de fosforilo en la reacción catalizada por quinasa p38 (1), a una concentración final de 200 \muM. La reacción de la quinasa se inició con ATP (100 \muM) y los viales se incubaron a 30ºC. Después de 30 minutos, las reacciones se pararon con volúmenes iguales de ácido trifluoroacético al 10% (TFA).
El péptido fosforilado se cuantificó por análisis de HPLC. La separación del péptido fosforilado del péptido no fosforilado se logró en una columna de fase inversa (Deltapack, 5 \mum, C18 100D, part nº 011795) con un gradiente binario de agua y acetonitrilo, conteniendo cada uno TFA al 0,1%. La CI_{50} (concentración de inhibidor que produce 50% de inhibición) se determinó representando gráficamente el % de actividad que quedaba frente a la concentración de inhibidor.
B. Inhibición de la actividad de ATPasa
Este ensayo se llevó a cabo en presencia de MgCl_{2} 10 mM, \beta-glicerofosfato 25 mM, glicerina al 10% y tampón HEPES 100 mM a pH 7,6. Para una determinación de Ki típica, se determinó la Km para el ATP en la actividad de ATPasa de la reacción de p38 activada, en ausencia de inhibidor y en presencia de dos concentraciones de inhibidor. Se preparó una solución madre que contenía todos los componentes anteriores y p38 activada (60 nM). La solución madre se dividió en partes alícuotas en viales. Se introdujo en cada vial un volumen fijo de DMSO o inhibidor en DMSO (la concentración final de DMSO en la reacción era 2,5%), se mezcló y se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se inició por adición de diferentes concentraciones de ATP y después incubando a 30ºC. Después de 30 minutos, las reacciones se pararon con 50 \mul de EDTA (concentración final 0,1 M), pH 8,0. Se cuantificó el producto de la actividad de ATPasa de p38, el ADP, por análisis por HPLC.
La separación del ADP del ATP se logró en una columna de fase inversa (Supelcosil, LC-18, 3 \mum, part nº 5-8985) usando un gradiente de disolvente binario de la siguiente composición: Disolvente A - tampón de fosfato 0,1 M que contenía hidrógeno-sulfato de tetrabutilamonio 8 mM (Sigma Chemical Co., Catálogo nº T-7158), Disolvente B - Disolvente A con 30% de metanol.
La Ki se determinó a partir de los datos de velocidad en función de las concentraciones de inhibidor y ATP. Los resultados para varios de los inhibidores de esta invención, se representan en la siguiente Tabla 6.
TABLA 6
Compuesto K_{i} (\muM)
1 > 20
2 15
3 5,0
5 2,9
6 0,4
Otros inhibidores de p38 de esta invención también inhibirán la actividad de ATPasa de p38.
C. Inhibición de la producción de IL-1, TNF, IL-6 e IL-8 en CMSP estimuladas con LPS
Se diluyeron de forma seriada los inhibidores en DMSO a partir de una solución madre 20 mM. Se prepararon al menos 6 diluciones seriadas. Después se prepararon soluciones madre de inhibidor 4x añadiendo 4 \mul de una dilución de inhibidor a 1 ml de medio RPMI1640/suero bovino fetal al 10%. Las soluciones madre de inhibidor 4x contenían inhibidor con concentraciones de 80 \muM, 32 \muM, 12,8 \muM, 5,12 \muM, 2,048 \muM, 0,819 \muM, 0,328 \muM, 0,131 \muM, 0,052 \muM, 0,021 \muM etc. Las soluciones madre de inhibidor 4x se calentaron previamente a 37ºC antes de usarlas.
Se separaron leucocitos de sangre humana reciente de otras células en un tubo Vacutainer CPT de Becton & Dickinson (que contenía 4 ml de sangre y suficiente DABS sin Mg^{2+}/Ca^{2+} para llenar el tubo) por centrifugación a 1500 x g durante 15 min. Se separaron las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) situadas en la parte superior del gradiente en el tubo Vacutainer y se lavaron dos veces con medio RPMI1640/suero bovino fetal al 10%. Las CMSP se recogieron por centrifugación a 500 x g durante 10 min. Se determinó el número de células totales usando una cámara de Neubauer, y las células se ajustaron a una concentración de 4,8 x 10^{6} células/ml en medio de cultivo celular (RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10%).
Alternativamente, se usó directamente en el ensayo la sangre entera que contenía un anticoagulante.
Se pusieron 100 \mul de suspensión de células o sangre entera en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Después se añadieron 50 \mul de la solución madre de inhibidor 4 x a las células. Finalmente, se añadieron 50 \mul de una solución madre de trabajo de lipopolisacáridos (LPS) (16 ng/ml en medio de cultivo celular) para dar una concentración final de 4 ng/ml de LPS en el ensayo. El volumen de ensayo total del vehículo testigo también se ajustó a 200 \mul añadiendo 50 \mul de medio de cultivo celular. Las células CMSP o la sangre entera se incubaron toda la noche (durante 12-15 horas) a 37ºC/CO_{2} al 5% en una atmósfera humidificada.
Al día siguiente las células se mezclaron en un agitador durante 3-5 minutos antes de centrifugación a 500 x g durante 5 minutos. Los líquidos sobrenadantes del cultivo de células se recogieron y se analizaron por ELISA los niveles de IL-Ib (R & D Systems, Quantikine kits, #DBL50), TNF-\alpha (BioSource, #KHC3012), IL-6 (Endogen, #EH2-IL6) e IL-8 (Endagen, #EH2-IL8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos de ELISA se usaron para generar curvas de dosis-respuesta a partir de las cuales se obtuvieron los valores de CI_{50}.
En la siguiente Tabla 7 se muestran los resultados del ensayo de quinasa ("quinasa", subsección A anterior), IL-1, y TNF en CMSP estimuladas con LPS ("célula") e IL-1m TNF e IL-6 en sangre entera ("SE") para diferentes inhibidores de p38 de esta invención:
98
99
100
101
102
103
104
105 
\newpage
Para los valores de CI_{50} de quinasa, "+++" representa < 0,1 \muM, "++" representa entre 0,1 y 1,0 \muM, y "+" representa > 1,0 \muM. Para los valores de IL-1 y TNF celular, "+++" representa < 0,1 \muM, "++" representa entre 0,1 y 0,5 \muM, y "+" representa > 0,5 \muM. Para todos los valores de ensayo con sangre entera ("SE"), "+++" representa < 0,25 \muM, "++" representa entre 0,25 y 0,5 \muM, y "+" representa > 0,5 \muM. En todos los ensayos indicados en la tabla anterior, "N.D." representa un valor no determinado.
Otros inhibidores de p38 de esta invención también inhibirán la fosforilación del péptido receptor de EGF, y la producción de IL-1, TNF e IL-6, así como de IL-8 en CMSP estimuladas con LPS o en sangre entera.
D. Inhibición de IL-6 y de la producción de IL-6 en CMSP estimuladas con IL-1
Este ensayo se llevó a cabo en CMSP exactamente de la misma forma que antes, excepto que se añadieron 50 \mul de una solución madre de trabajo de IL-1b (2 ng/ml en medio de cultivo celular) al ensayo, en lugar de la solución madre de trabajo (LPS).
Se recogieron los líquidos sobrenadantes del cultivo de células como se ha descrito antes y se analizaron por ELISA los niveles de IL-6 (Endogen, #EH2-IL6) e IL-8 (Endogen, #EH2-IL8) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos de ELISA se usaron para generar curvas de dosis-respuesta a partir de los cuales se obtuvieron los valores de CI_{50}.
En la siguiente Tabla 8 se muestran los resultados para el compuesto 6 inhibidor de p38:
TABLA 8
Citoquina ensayada CI_{50} (\muM)
IL-6 0,60
IL-8 0,85
E. Inhibición de la inducción de prostaglandina-endoperóxido-sintasa-2 (PGHS-2 o COX-2) inducida por LPS en CMSP
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (CMSP) de capas leucocitarias de sangre humana reciente por centrifugación en un tubo Vacutainer CPT (Becton & Dickinson). Se sembraron 15 x 10^{6} células en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos que contenía RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 \mug/ml, y L-glutamina 2 mM. Se añadió el compuesto 6 (anterior) con concentraciones finales de 0,2, 2,0 y 20 \muM en DMSO. Después se añadió LPS con una concentración final de 4 ng/ml para inducir la expresión de la enzima. El volumen final del cultivo era 10 ml/pocillo.
Después de incubación toda la noche a 37ºC, CO_{2} al 5%, las células se recogieron por rascado y posterior centrifugación, después se separaron los líquidos sobrenadantes, y las células se lavaron dos veces en DPBS enfriado con hielo (solución salina tamponada con Dulbecco, BioWhittaker). Se produjo la lisis de las células en hielo durante 10 min en 50 \mul de tampón de lisis frío (Tris-HCl 20 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, Triton-X-100 al 1%, ácido desoxicólico al 1%, SDS al 0,1%, EDTA 1 mM, aprotinina al 2% (Sigma), pepstatina 10 \mug/ml, leupeptina 10 \mug/ml, PMSF 2 mM, benzamidina 1 mM, DTT 1 mM) que contenía Benzonase (DNAsa de Merck). La concentración de proteína de cada muestra se determinó usando el ensayo de BCA (Pierce) y albúmina de suero bovino como patrón. Después la concentración de proteína de cada muestra se ajustó a 1 mg/ml con tampón de lisis frío. A 100 \mul de lisato se añadió un volumen igual de tampón de carga de SDS-PAGE x2, y la muestra se hirvió durante 5 min. Las proteínas se fraccionaron por tamaños (30 \mul/calle) en geles de gradiente de SDS-PAGE al 4-20% (Novex) y posteriormente se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa por medios electroforéticos durante 2 horas a 100 mA en tampón de transferencia Towbin (Tris 25 mM, glicina 192 mM) que contenía metanol al 20%. La membrana se trató previamente durante 1 hora a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (leche seca sin grasa al 5% en DPBS complementado con Tween-20 al 0,1%) y se lavó 3 veces en DPBS/Tween-20 al 0,1%. La membrana se incubó toda la noche a 4ºC con una dilución 1:250 del anticuerpo monoclonal anti-COX-2 (Transduction Laboratoires) en tampón de bloqueo. Después de 3 lavados en DPBS/Tween-20, la membrana se incubó con una dilución1:1000 de Ig de ratón de antisuero de oveja conjugado con peroxidasa de rábano picante (Amersham) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Después la membrana se lavó otra vez 3 veces en DPBS/Tween-20 al 0,1% y se usó un sistema de detección de ECL (SuperSignal® CL-HRP Substrate System, Pierce) para determinar los niveles de expresión de la COX-2.
Los resultados de los métodos mencionados indican que el compuesto 6 inhibe la expresión de la PGHS-2 inducida por LPS en CMSP.
Aunque en lo que antecede se han presentado una serie de realizaciones de esta invención, es evidente que nuestra construcción básica se puede alterar para proporcionar otras realizaciones que usan los métodos de la invención.

Claims (37)

1. Un compuesto de fórmula:
107
o una de sus sales farmacéuticamente aceptables, en las que:
cada uno de Q_{1} y Q_{2} se selecciona independientemente de sistemas de anillo heterociclo o carbociclo aromático de 5-6 miembros, o sistemas de anillo bicíclico de 8-10 miembros que constan de anillos carbociclo aromáticos, anillos heterociclo aromáticos o una combinación de un anillo carbociclo aromático y un anillo heterociclo aromático;
en los que:
Q_{1} está sustituido con 1 a 4 sustituyentes, independientemente seleccionados de halógeno; alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONHR'; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; CN; N(R')C(O)R^{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}; y
Q_{2} está opcionalmente sustituido con hasta 4 sustituyentes, independientemente seleccionados de halógeno; alquilo lineal o ramificado C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R', S(O_{2})N(R')_{2}, N = C-N(R')_{2}, R^{3}, o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONHR'; R^{3}; OR^{3}; NHR^{3}; SR^{3}; C(O)R^{3}; C(O)N(R')R^{3}; C(O)OR^{3}; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; N = C-N(R')_{2}; o CN.
en los que R' se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}); alquenilo (C_{2}-C_{3}) o alquinilo; fenilo o fenilo sustituido con 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de halógeno, metoxi, ciano, nitro, amino, hidroxi, metilo o etilo.
R^{3} se selecciona de un sistema de anillo carbociclo o heterociclo aromático de 5-6 miembros.
R^{4} es alquilo (C_{1}-C_{4}) opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} o SO_{2}N(R^{2})_{2}; o un sistema de anillo carbociclo o heterociclo de 5-6 miembros opcionalmente sustituido con N(R')_{2}, OR', CO_{2}R', CON(R')_{2} o SO_{2}N(R^{2})_{2.}
X se selecciona de -S-, -O-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -S(O_{2})-N(R^{2})-, -N(R^{2})-S(O_{2})-, -N(R^{2})-C(O)O-, -O-C(O)-N(R^{2}), -C(O)-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -C(O)-N(R^{2})-, -N(R^{2})-C(O)-, -N(R^{2})-, -C(R^{2})_{2}-, o -C(OR^{2})_{2}-;
cada R se selecciona independientemente de hidrógeno, -R^{2}, -N(R^{2})_{2}, -OR^{2}, SR^{2}, -C(O)-N(R^{2})_{2}, -S(O_{2})-N(R^{2})_{2}, o -C(O)-OR^{2}, en el que dos R adyacentes están opcionalmente unidos entre sí, y junto con cada Y a los que están respectivamente unidos, forman un anillo carbociclo o heterociclo de 4-8 miembros, o cuando Y es N, el R unido a él es un par de electrones solitario;
R^{2} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), o alquenilo (C_{1}-C_{3}); cada uno opcionalmente sustituido con -N(R')_{2}, -OR', SR', -C(O)-N(R')_{2}, -S(O_{2})-N(R')_{2}, -C(O)-OR', o R^{3}.
Y es N o C;
A, si está presente, es N o CR';
n es 0 ó 1; en las que cuando n es 0, el enlace entre el nitrógeno del anillo y el carbono que lleva X-Q_{2} es un enlace sencillo; y
R_{1} se selecciona de hidrógeno, alquilo (C_{1}-C_{3}), OH, o O-alquilo(C_{1}-C_{3}).
2. Un compuesto de fórmula:
108
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en las que A, Q_{1}, Q_{2}, R, R', X, Y y n se definen de la misma forma expuesta para los compuestos de fórmulas Ia y Ib; y
R^{5} se selecciona de hidrógeno, -CR'_{2}OH, -C(O)R^{4}, -C(O)OR^{4}, -CR'_{2}O-PO_{3}H_{2}, y -PO_{3}H_{2}.
3. Un compuesto de fórmula:
109
o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en las que:
Q_{3} es un sistema de anillo carbociclo o heterociclo aromático de 5-6 miembros; o un sistema de anillo bicíclico de 8-10 miembros que consta de anillos carbociclo aromáticos, anillos heterociclo aromáticos o una combinación de un anillo carbociclo aromático y un anillo heterociclo aromático; en las que Q_{3} está sustituido con 1 a 4 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de halógeno; alquilo C_{1}-C_{3} opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; O-alquilo(C_{1}-C_{3}) opcionalmente sustituido con NR'_{2}, OR', CO_{2}R' o CONR'_{2}; NR'_{2}; OCF_{3}; CF_{3}; NO_{2}; CO_{2}R'; CONHR'; SR'; S(O_{2})N(R')_{2}; SCF_{3}; CN; N(R')C(O)R_{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; -N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}; y
A, Q_{1}, Q_{2}, R, R', X, Y y n se definen como en la reivindicación 1.
4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Q_{1} se selecciona de fenilo o piridilo que contiene de 1 a 3 sustituyentes independientemente seleccionados de cloro, fluoro, bromo, -CH_{3}, -OCH_{3}, -OH, -CF_{3}, -OCF_{3}, -O(CH_{2})_{2}CH_{3}, NH_{2}, 3,4-metilendioxi, -N(CH_{3})_{2}, -NH-S(O)_{2}-fenilo, -NH-C(O)O-CH_{2}-4-piridina, -NH-C(O)CH_{2}-morfolina, -NH-C(O)CH_{2}-N(CH_{3})_{2}, -NH-C(O)CH_{2}-piperazina, -NH-C(O)CH_{2}-pirrolidina, -NH-C(O)C(O)-morfolina, -NH-C(O)C(O)-piperazina, -NH-C(O)C(O)-pirrolidina, -O-C(O)CH_{2}-N(CH_{3})_{2}, o -O-(CH_{2})_{2}-N
(CH_{3})_{2}, y en el que al menos uno de dichos sustituyentes está en la posición orto.
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que Q_{1} contiene al menos dos sustituyentes, y ambos están en la posición orto.
6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 4, en el que Q_{1} se selecciona de:
110
111
1110
112
113
1130
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 6, en el que Q_{1} se selecciona de 2-fluoro-6-trifluorometilfenilo, 2,6-difluorofenilo, 2,6-diclorofenilo, 2-cloro-4-hidroxifenilo, 2-cloro-4-aminofenilo, 2,6-dicloro-4-aminofenilo, 2,6-dicloro-3-aminofenilo, 2,6-dimetil-4-hidroxifenilo, 2-metoxi-3,5-dicloro-4-piridilo, 2-cloro-4,5-metilendioxi-fenilo, o 2-cloro-4-(N-2-morfolino-acetamido)fenilo.
8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que Q_{2} se selecciona de fenilo o piridilo, y en el que Q_{2} contiene opcionalmente hasta 3 sustituyentes, cada uno de los cuales se selecciona independientemente de cloro, fluoro, bromo, metilo, etilo, isopropilo, -OCH_{3}, -OH, -NH_{2}, -CF_{3}, -OCF_{3}, -SCH_{3}, -OCH_{3}, -C(O)OH, -C(O)OCH_{3}, -CH_{2}NH_{2}, -N(CH_{3})_{2}, -CH_{2}-pirrolidina y -CH_{2}OH.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, en el que Q_{2} se selecciona de:
114
115
1150
116
1160
117
2-piridilo no sustituido o fenilo no sustituido.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en el que Q_{2} se selecciona de fenilo, 1-isopropilfenilo, 3,4-dimetilfenilo, 2-etilfenilo, 3-fluorofenilo, 2-metilfenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo, 3-clorofenilo, 2-carbometoxifenilo, 2-carboxifenilo, 2-metil-4-clorofenilo, 2-bromofenilo, 2-piridilo, 2-metilenhidroxifenilo, 4-fluorofenilo, 2-metil-4-fluorofenilo, 2-cloro-4-fluorofenilo, 2,4-difluorofenilo, 2-hidroxi-4-fluorofenilo o 2-metilenhidroxi-4-fluorofenilo.
11. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que X se selecciona de -S-, -O-, -S(O_{2})-, -S(O)-, -NR-, -C(R_{2})-, o -C(O)-.
12. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 10, en el que X es S.
13. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que n es 1 y A es N.
14. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada Y es C.
15. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 14, en el que cada R unido a Y se selecciona independientemente de hidrógeno o metilo.
16. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto se selecciona de uno cualquiera de los compuestos 2 a 3, o 5 a 53, representados en la Tabla 1.
17. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho compuesto se selecciona de uno cualquiera de los compuestos 101 a 145 expuestos en la Tabla 2.
18. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que Q_{3} está sustituido con 2 a 4 sustituyentes, en el que al menos uno de dichos sustituyentes está presente en la posición orto con respecto al punto de unión de Q_{3} al resto del inhibidor.
19. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 18, en el que ambas posiciones orto están ocupadas con uno de dichos sustituyentes independientemente seleccionados.
20. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 19, en el que Q_{3} es un anillo carbociclo monocíclico; y cada uno de dichos sustituyentes orto en Q_{3} se selecciona independientemente de halógeno o metilo.
21. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 19, en el que Q_{3} contiene de 1 a 2 sustituyentes además de dichos sustituyentes en orto, seleccionándose independientemente dichos sustituyentes adicionales de NR'_{2}, OR', CO_{2}R', CN; N(R')C(O)R^{4}; N(R')C(O)OR^{4}; N(R')C(O)C(O)R^{4}; N(R')S(O_{2})R^{4}; N(R')R^{4}; N(R^{4})_{2}; OR^{4}; OC(O)R^{4}; OP(O)_{3}H_{2}; o N = C-N(R')_{2}.
22. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho compuesto es un compuesto de fórmula Ie, y se selecciona de uno cualquiera de los compuestos 201 ó 203 a 209, expuestos en la Tabla 3.
23. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho compuesto es un compuesto de fórmula Ig, y se selecciona de uno cualquiera de los compuestos 202/301, 302 a 399, o 1301, expuestos en la Tabla 4.
24. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho compuesto es un compuesto de fórmula Ih, y se selecciona de uno cualquiera de los compuestos 401 a 412, expuestos en la Tabla 5.
25. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, eficaz para inhibir p38, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
26. Un uso de un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones 1-24 para preparar una composición farmacéutica para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades óseas destructivas, enfermedades proliferativas, enfermedades infecciosas, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en ataque de apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de órgano, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, agregación de plaquetas inducida por trombina o estados asociados con la prostaglandina-endoperoxidasa-sintasa-2.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad inflamatoria seleccionada de pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma, alergias, o síndrome de dificultad respiratoria del adulto.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune seleccionada de glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerodermia, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves, gastritis autoinmune, diabetes, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, dermatitis atópica, hepatitis activa crónica, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, psoriasis, o enfermedad de injerto contra huésped.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir un trastorno óseo destructivo seleccionado de osteoartritis, osteoporosis o trastorno óseo relacionado con mieloma múltiple.
30. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad proliferativa seleccionada de leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, melanoma metastático, sarcoma de Kaposi, y mieloma múltiple.
31. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa seleccionada de sepsis, choque séptico o Shigellosis.
32. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad vírica seleccionada de infección de hepatitis aguda, infección por VIH o retinitis por CMV.
33. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia cerebral o enfermedad degenerativa producida por lesión traumática.
34. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir la isquemia/reperfusión en ataque de apoplejía o isquemia miocárdica, isquemia renal, ataques cardiacos, hipoxia de órgano o agregación de plaquetas inducida por trombina.
35. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir un estado asociado con la prostaglandina-endoperoxidasa-sintasa-2, seleccionado de edema, fiebre, analgesia o dolor.
36. El uso de acuerdo con la reivindicación 35, en el que dicho dolor se selecciona de dolor neuromuscular, cefalea, dolor por cáncer, dolor dental o dolor por artritis.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho uso es para tratar o prevenir un trastorno angiogénico seleccionado de tumores sólidos, neovascularización ocular, o hemangioma infantil.
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