KR100559917B1 - ｐ38 프로테인 키나아제의 저해제로서 치환된 질소를 함유하는헤테로사이클 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 증식, 세포 괴사 및 세포외 자극에 대한 반응에 관여하는 포유류의 프로테인 키나아제인 p38의 저해제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 저해제의 제조 방법에 관한 것이다, 본 발명은 또한 본 발명의 저해제를 포함하는 약학적 조성물, 및 다양한 질병의 치료와 예방에 있어서 그러한 조성물을 사용하는 을 제공한다.

Description

ｐ38 프로테인 키나아제의 저해제로서 치환된 질소를 함유하는 헤테로사이클{SUBSTITUTED NITROGEN CONTAINING HETEROCYCLES AS INHIBITORS OF p38 PROTEIN KINASE}
본 발명은 세포 증식, 세포 괴사 및 세포외 자극에 대한 반응에 관여하는 포유류의 프로테인 키나아제인 p38의 저해제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 저해제의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 저해제를 포함하는 약학적 조성물 및 다양한 질병의 치료와 예방에 있어서 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
프로테인 키나아제는 세포외 시그널(signal)에 대한 다양한 세포의 반응에 관여한다. 최근, 미토겐(mitogen)에 의해 활성화되는 프로테인 키나아제(MAPK)의 한 부류가 발견되었다. 이 부류의 구성원은 인산화에 의해 그들의 기질을 활성화하는 Ser/Thr 키나아제들이다[B. Stein et al., Ann. Rep. Med. Chem., 31, pp. 289-98 (1996)]. MAPK는 성장 인자, 사이토킨, UV 조사 및 스트레스 유도제를 포함하는 다양한 시그널에 의해 자체 활성화된다.
특히 흥미로운 MAPK는 p38이다. 사이토킨 억제성 항-염증성 약물 결합 단백질(CSBP) 및 RK로도 공지된 p38은 지다당류(lipopolysaccharides, LPS) 수용체 CD14로 형질 감염되고, LPS로 유도된 쥐 과의 B 세포 전구체(pre-B cell)에서 분리되었다. 그 이후 p38은 분리되고 서열화되었고, 사람 및 마우스에서 p38을 암호화하는 cDNA도 분리 및 서열화되었다. p38의 활성화는, 스트레스[예: 지다당류(LPS) 처리, UV, 아니소마이신 또는 삼투성 쇼크] 및 사이토킨(예: IL-1 및 TNF)에 의해 자극을 받은 세포에서 관찰되었다.
p38 키나아제의 저해는 IL-1 및 TNF 양자의 생성을 차단하게 된다. IL-1 및 TNF는 다른 친염증성 사이토킨(예: IL-6 및 IL-8)의 생성을 자극하며, 급성 및 만성 염증성 질병 및 폐경기 이후의 골다공증에 관련된다[R. B. Kimble et al., Endocrinol., 136, pp. 3054-61 (1995)].
이 발견을 기초로 하여, 기타 MAPK와 함께 p38이, 백혈구 축적, 대식 세포(macrophage)/단핵 세포(monocyte) 활성화, 조직 재흡수, 발열, 급성 상 반응 및 호중구증가증과 같은 염증성 자극에 대한 세포의 반응을 매개하는 데 역할을 한다고 여겨진다. 또한, p38과 같은 MAPKs는 암, 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집, 면역 결핍 질환, 자가면역 질환, 세포 괴사, 알러지, 골다공증 및 신경 퇴행성 질병에 관련된다. 또한, p38의 저해제는 프로스타글란딘 엔도퍼옥시드 신타아제-2 유도의 저해를 통해 통증 조절 영역에도 관련된다. WO 96/21654에서는 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF 과잉 생성과 관련된 기타 질병이 개시되어 있다.
MAPKs를 특이적으로 저해하는 약물을 개발하려는 노력들이 이미 시작되었다. 예를 들어, PCT 공보 WO 95/31451은 MAPKs, 특히 p38을 저해하는 피라졸 화합물에 대해 기재하고 있다 . 그러나 생체내에서 이들 저해제의 효능은 아직 연구 중에 있 다.
따라서, p38 활성화와 관련된 각종 상태를 치료하는 데 유용한 다른 강력한 p38-특이적 저해제를 개발해야 할 필요성은 여전히 크다.
발명의 개요
본 발명은, p38을 강력하고 특이적으로 저해하는 화합물들을 제공함으로써 상기 문제점을 해결한다.
이들 화합물은 하기의 화학식을 가진다:
Figure 111999006289858-pct00001
또는
Figure 111999006289858-pct00002
상기에서, Q1 및 Q2 각각은 5 내지 6원의 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계, 또는 방향족 카르보사이클릭 고리, 방향족 헤테로사이클릭 고 리 또는 방향족 카르보사이클릭 고리와 방향족 헤테로사이클릭 고리의 조합을 포함하는 8 내지 10원의 바이사이클릭 고리계에서 독립적으로 선택된다.
Q1을 구성하는 고리는 1 내지 4개의 치환체로 치환되며, 각각의 치환체는 할로; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONHR´2로 임의 치환된 C1-C3 알킬; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONR´2로 임의 치환된 O-(C1-C3)-알킬; NR´2; OCF3; CF3; NO2; CO2R´; CONR´; SR´; S(O2)N(R´)2; SCF3; CN; N(R´)C(O)R4; N(R´)C(O)OR4; N(R´)C(O)C(O)R4; N(R´)S(O2)R4; N(R´)R4; N(R4)2; OR4; OC(O)R4; OP(O)3H2; 또는 N=CH-N(R´)2에서 독립적으로 선택된다.
Q2를 구성하는 고리는 4개 이하의 치환체로 임의 치환되며, 각각의 치환체는 할로; NR´2, OR´, CO2R´, S(O2)N(R´)2, N=CH-N(R´)2, R3, 또는 CONR´2로 임의 치환된 C1-C3 직쇄 또는 분지쇄 알킬; O-(C1-C3)-알킬; NR´2, OR´, CO2R´, S(O2)N(R´)2, N=CH-N(R´)2, R3, 또는 CONR´2로 임의 치환된 O-(C1-C3)-알킬; NR´2; OCF3; CF3; NO2; CO2R´; CONHR´; R3; OR3; NHR3; SR3; C(O)R3; C(O)N(R´)R3; C(O)OR3; SR´; S(O2)N(R´)2; SCF3; N=CH-N(R´)2; 또는 CN에서 독립적으로 선택된다.
R´는 수소, (C2-C3)-알킬; (C2-C3)-알케닐 또는 알키닐; 페닐, 또는 할로, 메톡시, 시아노, 니트로, 아미노, 히드록시, 메틸 또는 에틸에서 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐에서 선택된다.
R3 은 5 내지 6원의 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계에서 선택된다.
R4는 N(R´)2, OR´, CO2R´, CON(R´)2 또는 SO2N(R2)2로 임의 치환된 (C1-C4)-알킬이거나; 또는 N(R´)2, OR´, CO2R´, CON(R´)2 또는 SO2N(R2)2 로 임의 치환된 5 내지 6원의 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계이다.
X는 -S-, -O-, -S(O2)-, -S(O)-, -S(O2)-N(R2)-, -N(R2)-S(O2)-, -N(R2)-C(O)O-, -O-C(O)-N(R2), -C(O)-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -C(O)-N(R2)-, -N(R2)-C(O)-, -N(R2)-, -C(R2)2-, 또는 -C(OR2)2-에서 선택된다.
각 R은 수소, -R2, -N(R2)2, -OR2, SR2, -C(O)-N(R2)2, -S(O2)-N(R2)2, 또는 -C(O)-OR2에서 독립적으로 선택되며, 상기 2개의 인접한 R은 임의로 상호 결합되고, 그들이 개별적으로 결합된 각각의 Y와 함께 4 내지 8원의 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R2는 수소, (C1-C3)-알킬 또는 (C1-C3)-알케닐에서 선택되며; 각각은 -N(R´)2, OR´, SR´, -C(O)-N(R´)2 , -S(O2)-N(R´)2, -C(O)-OR´ 또는 R3로 임의 치환된다.
Y는 N 또는 C이고;
A(존재할 경우)는 N 또는 CR´이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 수소, (C1-C3)-알킬, OH, 또는 O-(C1-C3)-알킬이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 p38 저해제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 이들 조성물은, 다양한 질병, 예컨대, 암, 염증성 질병, 자가면역 질환, 파괴성 골질환, 증식성 질병, 감염성 질병, 바이러스성 질병 및 신경 퇴행성 질병의 치료 또는 예방을 위한 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 이들 조성물은 세포 괴사 및 과형성을 방지하기 위한 방법에서 유용하므로, 졸증(stroke)에서의 재관류(reperfusion)/허혈, 심장 발작, 장기 저산소증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이들 조성물은 트롬빈-유도된 혈소판 응집을 예방하는 방법에서도 유용하다. 전술한 이들 방법 각각은 또한 본 발명의 일부이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하기의 화학식을 가진 p38의 저해제를 제공한다.
화학식 Ia
Figure 111999006289858-pct00003
또는
화학식 Ib
Figure 111999006289858-pct00004
상기에서, Q1 및 Q2 각각은 5 내지 6원의 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계, 또는 방향족 카르보사이클릭 고리, 방향족 헤테로사이클릭 고리 또는 방향족 카르보사이클릭 고리와 방향족 헤테로사이클릭 고리의 조합을 포함하는 8 내지 10원의 바이사이클릭 고리계에서 독립적으로 선택된다.
Q1을 구성하는 고리는 1 내지 4개의 치환체로 치환되며, 각각의 치환체는 할로; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONHR´2로 임의 치환된 C1-C3 알킬; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONR´2로 임의 치환된 O-(C1-C3)-알킬; NR´2; OCF3; CF3; NO2; CO2R´; CONR´; SR´; S(O2)N(R´)2; SCF3; CN; N(R´)C(O)R4; N(R´)C(O)OR4; N(R´)C(O)C(O)R4; N(R´)S(O2)R4; N(R´)R4; N(R4)2; OR4; OC(O)R4; OP(O)3H2; 또는 N=CH-N(R´)2에서 독립적으로 선택된다.
Q2를 구성하는 고리는 4개 이하의 치환체로 임의 치환되며, 각각의 치환체는 할로; NR´2, OR´, CO2R´, S(O2)N(R´)2, N=CH-N(R´)2, R3, 또는 CONR´2로 임의 치환된 C1-C3 직쇄 또는 분지쇄 알킬; O-(C1-C3)-알킬; NR´2, OR´, CO2R´, S(O2)N(R´)2, N=CH-N(R´)2, R3, 또는 CONR´2 로 임의 치환된 O-(C1-C3)-알킬; NR´2; OCF3; CF3; NO2; CO2R´; CONHR´; R3; OR3; NHR3; SR3; C(O)R3; C(O)N(R´)R3; C(O)OR3; SR´; S(O2)N(R´)2; SCF3; N=CH-N(R´)2; 또는 CN에서 독립적으로 선택된다.
R´는 수소, (C1-C3)-알킬; (C2-C3)-알케닐 또는 알키닐; 페닐, 또는 할로, 메톡시, 시아노, 니트로, 아미노, 히드록시, 메틸 또는 에틸에서 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 치환체로 치환된 페닐에서 선택된다.
R3 은 5 내지 6원의 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계에서 선택된다.
R4는 N(R´)2, OR´, CO2R´, CON(R´)2, 또는 SO2N(R2)2로 임의 치환된 (C1-C4)-알킬이거나; 또는 N(R´)2, OR´, CO2R´, CON(R´)2, 또는 SO2N(R2)2 로 임의 치환된 5 내지 6원의 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계이다.
X는 -S-, -O-, -S(O2)-, -S(O)-, -S(O2)-N(R2)-, -N(R2)-S(O2)-, -N(R2)-C(O)O-, -O-C(O)-N(R2), -C(O)-, -C(O)O-, -O-C(O)-, -C(O)-N(R2)-, -N(R2)-C(O)-, -N(R2)-, -C(R2)2-, 또는 -C(OR2)2-에서 선택된다.
각 R은 수소, -R2, -N(R2)2, -OR2, SR2, -C(O)-N(R2)2, -S(O2)-N(R2)2, 또는 -C(O)-OR2에서 독립적으로 선택되며, 상기 2개의 인접한 R은 임의로 상호 결합되고, 그들이 개별적으로 결합된 각각의 Y와 함께, 4 내지 8원의 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
2개의 R 구성 요소가, 이들이 개별적으로 결합된 Y 구성 요소들과 함께 고리를 형성할 때, 각각의 비융합된 R 구성 요소로부터 말단 수소가 제거된다는 것은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 하나는 -NH-CH3-이고 다른 하나는 -CH2-CH3인 2개의 R 구성 요소를 함께 결합시켜 고리 구조를 형성한다면, 각각의 R 구성 요소(굵게 표시됨)상에 존재하는 하나의 말단 수소가 제거될 것이다. 따라서, 생성된 고리 구조 부분은 화학식 -NH-CH2-CH2-CH2-를 가질 것이다.
R2는 수소, (C1-C3)-알킬, 또는 (C2-C3)-알케닐에서 선택되며; 각각은 -N(R´)2, OR´, SR´, -C(O)-N(R´)2 , -S(O2)-N(R´)2, -C(O)-OR´, 또는 R3로 임의 치환된다.
Y는 N 또는 C이고;
A(존재할 경우)는 N 또는 CR´이고;
n은 0 또는 1이고;
R1은 수소, (C1-C3)-알킬, OH 또는 O-(C1-C3)-알킬에서 선택된다.
R1이 OH이면, 생성된 저해제가 호변이성체화되어(tautomerize) 하기 화학식의 화합물을 생성할 수 있다는 것은 당업자에게 명백하다.
Figure 111999006289858-pct00005
또는
Figure 111999006289858-pct00006
이들은 또한 본 발명의 p38 저해제이다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, Q1은 1 내지 3개의 치환체를 함유하는 피리딜 또는 페닐에서 선택되며, 상기 치환체 중 적어도 하나는 오르토 위치에 있고 상기 치환체는 클로로, 플루오로, 브로모, -CH3, -OCH3, -OH, -CF3, -OCF3, -O(CH2)2CH3, NH2, 3,4-메틸렌디옥시, -N(CH3)2, -NH-S(O)2-페닐, -NH-C(O)O-CH2-4-피리딘, -NH-C(O)CH2-모르폴린, -NH-C(O)CH2-N(CH3)2, -NH-C(O)CH2-피페라진, -NH-C(O)CH2-피롤리딘, -NH-C(O)C(O)-모르폴린, -NH-C(O)C(O)-피페라진, -NH-C(O)C(O)-피롤리딘, -O-C(O)CH2-N(CH3)2, 또는 -O-(CH2)2-N(CH3)2에서 독립적으로 선택된다.
둘 다 오르토 위치에 있는, 적어도 2개의 전술한 치환체를 함유하는 피리딜 또는 페닐이 더 바람직하다.
바람직한 Q1의 일부 구체적인 예는 다음과 같다:
Figure 111999006289858-pct00007
Figure 111999006289858-pct00008
Figure 111999006289858-pct00010
Figure 111999006289858-pct00011
Figure 111999006289858-pct00012
Figure 111999006289858-pct00013
Figure 111999006289858-pct00014
Figure 112005502258832-pct00429
Figure 112005502258832-pct00430
Figure 112005502258832-pct00431
Figure 112005502258832-pct00378
Figure 112005502258832-pct00379
Figure 112005502258832-pct00380
Figure 112005502258832-pct00381
또는
Figure 112005502258832-pct00382
Q1이 2-플루오로-6-트리플루오로메틸페닐, 2,6-디플루오로페닐, 2,6-디클로로페닐, 2-클로로-4-히드록시페닐, 2-클로로-4-아미노페닐, 2,6-디클로로-4-아미노페닐, 2,6-디클로로-3-아미노페닐, 2,6-디메틸-4-히드록시페닐, 2-메톡시-3,5-디클로로-4-피리딜, 2-클로로-4,5-메틸렌디옥시 페닐, 또는 2-클로로-4-(N-2-모르폴리 노-아세타미도)페닐에서 선택되는 것이 가장 바람직하다.
바람직한 구체예에 따르면, Q2는 0 내지 3개의 치환체를 함유하는 피리딜 또는 페닐이며, 상기 치환체 각각은 클로로, 플루오로, 브로모, 메틸, 에틸, 이소프로필, -OCH3, -OH, -NH2, -CF3, -OCF3, -SCH3, -C(O)0H, -C(O)0CH3, -CH2NH2,-N(CH3)2, -CH2-피롤리딘 및 -CH2OH에서 독립적으로 선택된다.
바람직한 Q2의 일부 구체적인 예는 다음과 같다:
Figure 111999006289858-pct00024
Figure 111999006289858-pct00025
Figure 111999006289858-pct00026
Figure 111999006289858-pct00027
Figure 111999006289858-pct00028
Figure 111999006289858-pct00029
Figure 111999006289858-pct00030
Figure 111999006289858-pct00031
Figure 111999006289858-pct00032
Figure 111999006289858-pct00033
Figure 111999006289858-pct00034
Figure 111999006289858-pct00035
Figure 111999006289858-pct00036
Figure 111999006289858-pct00037
Figure 111999006289858-pct00038
미치환된 2-피리딜 또는 미치환된 페닐.
Q2가 페닐, 2-이소프로필페닐, 3,4-디메틸페닐, 2-에틸페닐, 3-플루오로페닐, 2-메틸페닐, 3-클로로-4-플루오로페닐, 3-클로로페닐, 2-카르보메톡실페닐, 2-카르복시페닐, 2-메틸-4-클로로페닐, 2-브로모페닐, 2-피리딜, 2-메틸렌히드록시페닐, 4-플루오로페닐, 2-메틸-4-플루오로페닐, 2-클로로-4-플루오로페닐, 2,4-디플루오로페닐, 2-히드록시-4-플루오로페닐 또는 2-메틸렌히드록시-4-플루오로페닐에서 선택되는 화합물이 가장 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, X는 -S-, -O-, -S(O2)-, -S(O)-, -NR-, -C(R2)- 또는 -C(O)-이며, 가장 바람직하게는 X는 S이다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, n는 1이고 A는 N이다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, 각 Y는 C이다.
더 바람직한 구체예에 따르면, 각 Y는 C이고 이들 Y 구성 요소에 부착된 R은 수소 또는 메틸에서 선택된다.
본 발명의 일부 구체적인 저해제를 하기 표에서 나타낸다.
Figure 112005502258832-pct00432
Figure 112005502258832-pct00384
Figure 112005502258832-pct00439
Figure 112005502258832-pct00386
Figure 112005502258832-pct00387
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 상기한 화학식 (Ia)의 p38 저해제를 제조하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 하기 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 하기 화학식 (IIa)의 이탈기 시약 또는 하기 화학식 (IIb)의 이탈기 시약과 반응시키는 것을 포함한다.
Figure 111999006289858-pct00090
여기서, 상기 화학식의 가변적인 기 각각은 본 발명의 저해제에 대해 상기 정의한 것과 동일하다.
Figure 111999006289858-pct00091
상기에서, R´는 상기 정의한 것과 동일하다.
Figure 111999006289858-pct00092
상기에서, L1, L2, 및 L3 각각은 독립적으로 이탈기를 나타낸다.
상기 반응에서 사용된 이탈기 시약을, 단독으로 또는 톨루엔과 같은 공용매와 함께 과량으로 첨가한다. 상기 반응을 25℃ 내지 150℃의 온도에서 수행한다.
본 발명의 p38 저해제를 제조하는 데 유용한, 화학식 (Ⅱa)의 이탈기 시약은 디메틸포름아미드 디메틸아세탈, 디메틸아세타미드 디메틸아세탈, 트리메틸 오르토포르메이트, 디메틸포름아미드 디에틸아세탈 및 기타 관련 시약을 포함한다. 본 발명의 저해제를 제조하는 데 사용되는 화학식 (Ⅱa)의 이탈기 시약은 디메틸포름아미드 디메틸아세탈인 것이 바람직하다.
본 발명의 p38 저해제를 제조하는 데 유용한 화학식 (Ⅱb)의 이탈기 시약은 포스겐, 카르보닐디이미다졸, 디에틸 카르보네이트 및 트리포스겐을 포함한다.
본 발명의 화합물을 제조하는 더 바람직한 방법은, 가변적인 기 각각이 본 발명의 화합물에 대해 전술한 바와 같이 더 바람직한 선택 및 가장 바람직한 선택면에서 정의된 화학식 (Ⅱ)의 화합물을 사용하는 것이다.
R1의 원천(source)은 이탈기 시약(C-R´또는 C=O)이므로, 그것의 주체성은, 물론 그 시약의 구조에 따라 좌우된다. 그러므로, R1이 OH인 화합물의 경우, 화학식 (Ⅱb)의 시약이 사용되었을 것이다. 유사하게, R1이 H 또는 (C1-C3)-알킬인 경우, 화학식 (Ⅱa)의 시약이 사용되었을 것이다. R1이 O-(C1-C3)-알킬인 저해제를 생성하기 위해서는 R1이 OH인 화합물을 먼저 생성한 후, DMF 중의 나트륨 하이드라이드, 요오드화 메틸 및 요오드화 에틸로 처리하는 것과 같은, 표준 기법에 의해 그 히드록시를 알킬화한다.
화학식 (Ia)의 본 발명의 저해제에 대한 직접적인 전구체[즉, 화학식 (Ⅱ)의 화합물]는 하기의 합성 반응식들 중 하나에 의해 합성될 수 있다.
Figure 111999006289858-pct00093
반응식 1에서, (1) 단계와 (2) 단계의 순서는 역전될 수 있다. 또한, 출발 물질인 니트릴은 상응하는 산 또는 에스테르로 대체될 수 있다. 대안적으로, 기타 잘 공지된 잠재성 카르복실 또는 카르복스아미드 잔기(moiety)는 니트릴을 대신해서 사용될 수 있다(반응식 2 참고). 당해 기술 분야에서 잘 공지된, 차후의 탈보호 방법 및 작용성화 방법을 사용하여 카르복실산 , 카르복실산 에스테르, 옥사졸린 또는 옥사졸리디논과 같은 변형체를 상기 반응식에 포함할 수 있다.
반응식 1(및 반응식 2, 하기)의 제 1단계에서 사용된 염기는 나트륨 하이드라이드, 나트륨 아미드, LDA, 리튬 헥사메틸디실라지드, 나트륨 헥사메틸디실라지드, 또는 임의의 개수의 기타 비친핵성 염기(니트릴에 대한 알파 위치를 탈프로톤화함)에서 선택된다.
또한, 상기 도시한 단일의 단계에서 HX-Q2의 첨가는 2단계로 대체될 수 있다 - - 보호된 X 유도체 또는 비보호된 X 유도체를 첨가한 후, 그 다음 단계에서 Q2 유도체의 첨가.
Figure 111999006289858-pct00094
반응식 2에서 Z는 COOH, COOR´, CON(R´)2, 옥사졸린, 옥사졸리디논 또는 CN에서 선택된다. R´는 상기 정의된 것과 동일하다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 도시한 화학식 (Ib)의 p38 저해제를 제조하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 하기 화학식 (Ⅲ)의 화합물을 전술한 화학식 (IIa) 또는 (IIb)의 이탈기 시약과 반응시키는 것을 포함한다.
Figure 111999006289858-pct00095
여기서, 상기 화학식의 가변적인 기 각각은 본 발명의 저해제에 대해 상기 정의한 것과 동일하다.
화학식 IIa
Figure 111999006289858-pct00096
또는
화학식 IIb
Figure 111999006289858-pct00097
본 발명의 화학식 (Ib)의 p38 저해제에 대한 2개의 완전한 합성 반응식을 하기에서 나타낸다.
Figure 111999006289858-pct00098
반응식 3에서, Q1 치환된 유도체를, 나트륨 하이드라이드, 나트륨 아미드, LDA, 리튬 헥사메틸디실라지드, 나트륨 헥사메틸디실라지드 또는, 임의의 수의 기타 비친핵성 염기(차폐된 아미드 잔기를 나타내는 Z기에 대한 알파 위치를 탈프로톤화함)와 같은 염기로 처리할 수 있다. 대안적으로, Z는 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 옥사졸린 또는 옥사졸리디논이다. 이어서, 탈프로톤화로부터 생성된 음이온을, 팔라듐 촉매의 존재하에 2개의 이탈기 또는 잠재성 이탈기를 함유하는 질소-함유 헤테로사이클릭 화합물과 접촉시킨다. 이런 화합물의 한 예로 2,6-디클로로피리딘이 있을 수 있다.
제2단계에서, Q2 고리 잔기를 도입한다. 이것은 당해 기술 분야에 잘 공지된 다수의 반응을 사용하여 수행될 수 있으며, 그 결과 바이아릴(biaryl) 화합물이 생성된다. 한 예로서, 아릴 리튬 화합물을 제1단계에서 생성된 피리딘 중간체와 반응시킬 수 있다. 대안적으로, Pd°촉매의 존재하에 아릴 스타난(stannane)과 같은 아릴금속성 화합물 또는 아릴 보론산(boronic acid)을 피리딘 중간체의 아릴 할라이드 부분과 반응시킬 수 있다.
제 3단계에서, Z기가 탈보호되고/되거나 작용성화되어 아미드 화합물을 형성한다. Z가 카르복실산, 카르복실산 에스테르, 옥사졸린 또는 옥사졸리디논인 경우, 당해 기술 분야에서 잘 공지된 탈보호 방법 및 작용성화 방법의 변형법을 이용해 아미드를 제조한다. 마지막으로 제 4단계에서, DMF 아세탈 또는 유사한 시약과 같은 시약을 단독으로 또는 유기용매 중에서 사용하여 아미드 화합물을 최종 생성물로 고리화한다.
Figure 111999006289858-pct00099
반응식 4는, Q1 출발 물질과의 반응 전에 바이아릴 중간체가 먼저 생성되는 것을 제외하면 유사하다.
다른 구체예에 따르면, 본 발명은 상기 화학식 (Ia) 및 화학식 (Ib)의 p38 저해제와 유사한 p38 저해제를 제공하지만, 상기 Q1 치환체를 지니는 고리내 C=N이 환원된다. 이들 저해제는 하기의 화학식 (Ic) 또는 (Id)를 가진다.
Figure 111999006289858-pct00100
또는
Figure 111999006289858-pct00101
상기에서, A, Q1, Q2, R, R′, X, Y 및 n은 화학식 (Ia) 및 화학식 (Ib)의 화합물에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 정의된다. 이들 정의는 상기 가변적인 기 각각의 모든 구체예(즉, 기본적인, 바람직한, 더 바람직한 및 가장 바람직한 것)를 보유한다. R5는 수소, -CR′2OH, -C(O)R4, -C(O)OR4, -CR′2OPO3H2, -PO3H2 및 -PO3H2의 염에서 선택된다.
R5가 수소가 아닐 경우, 생성된 화합물은, 생체 내에서 분열되어 R5가 수소인 화합물을 생성해야 하는 프로드럭 형태인 것으로 기대된다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, 화학식 (Ic)의 화합물에서, A가 바람직하게는 질소, n은 바람직하게는 1, 및 X는 바람직하게는 황이다. 화학식 (Ic) 또는 화학식 (Id)의 화합물에서, Q1 및 Q2는, 화학식 (Ia) 및 화학식 (Ib)의 화합물의 가변적인 기에 대해 전술한 잔기와 동일한 것이 바람직하다.
R1위치에 수소, C1-C3 알킬 또는 C2-C3 알케닐 또는 알키닐을 함유하는 화학식 (Ia) 또는 화학식 (Ib)의 화합물(예: R1=R′)로부터 직접 화학식 (Ic) 및 화학식 (Id)의 화합물을 제조할 수 있다. 이들 화합물의 합성 반응식을 하기 반응식 5 및 반응식 6에서 도시한다.
Figure 111999006289858-pct00102
Figure 111999006289858-pct00103
이들 반응식에서, 화학식 (Ia) 또는 화학식 (Ib)의 화합물을 과량의 디이소부틸알루미늄 하이드라이드 또는 등가의 시약과 반응시켜 환원함으로써 고리 환원된 화학식 (Ic) 또는 화학식 (Id)의 화합물을 각각 수득했다.
상기 도시한 화학식 (Ic) 또는 화학식 (Id)의 화합물과 적절한 시약(들)을 반응시켜, 수소 이외의 R5 구성 요소를 고리 질소상에 첨가한다. 하기 실시예 부분에서 이러한 개질의 실시예를 제공한다.
화학식 (Ic)의 본 발명의 일부 특정 저해제를 하기 표에서 제시한다.
Figure 112005502258832-pct00433
Figure 112005502258832-pct00389
Figure 112005502258832-pct00390
Figure 112005502258832-pct00391

Figure 112005502258832-pct00392
또 다른 구체예에 따르면, 본 발명은 하기 화학식의 p38 저해제를 제공한다:
Figure 111999006289858-pct00149
Figure 111999006289858-pct00150
Figure 111999006289858-pct00151
또는
Figure 111999006289858-pct00152
상기에서, A, Q1, Q2, R, X, Y 및 n은 화학식 (Ia) 및 화학식 (Ib)의 화합물에 대해 기재된 것과 동일한 방식으로 정의된다. 이들 정의는 상기 가변적인 기 각각의 모든 구체예(즉, 기본적인, 바람직한, 더 바람직한 및 가장 바람직한 것)를 보유한다. 화학식 (Ie)의 화합물에서, Q2가 미치환된 페닐인 것이 더 바람직하다.
Q3은 5 내지 6 원의 방향족 카르보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리계, 또는 방향족 카르보사이클릭 고리, 방향족 헤테로사이클릭 고리 또는 방향족 카르보사이클릭 고리와 방향족 헤테로사이클릭 고리의 조합을 포함하는 8 내지 10 원의 바이사이클릭 고리계이다. Q3의 고리는 1 내지 4개의 치환체로 치환되며, 치환체 각각은 할로; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONHR´2로 임의 치환된 C1-C3 알킬; NR´2, OR´, CO2R´ 또는 CONHR´2로 임의 치환된 O-(C1-C3)-알킬; NR´2; OCF3; CF3; NO2; CO2R´; CONR´; SR´; S(O2)N(R´)2; SCF3; CN; N(R´)C(O)R4; N(R´)C(O)OR4; N(R´)C(O)C(O)R4; N(R´)S(O2)R4; N(R´)R4; N(R4)2; OR4; OC(O)R4; OP(O)3H2; 또는 N=CH-N(R´)2에서 독립적으로 선택된다.
하나의 바람직한 구체예에 따르면, Q3은 2 내지 4개의 치환체로 치환되며, 상기 치환체 중 적어도 하나는, Q3이 저해제의 나머지에 부착되는 지점에 대한 오르토 위치에 존재한다. Q3이 바이사이클릭 고리인 경우, 오르토 위치에 있는 2개의 치환체는, 저해제 분자의 나머지에 가장 근접한(즉, 적접 부착된) 고리 상에 존재한다. 다른 2개의 임의의 치환체는 어느 하나의 고리상에 존재할 수 있다. 상기 치환체 중 하나가 이러한 오르토 위치 둘다를 차지하는 것이 더 바람직하다.
다른 바람직한 구체예에 따르면, Q3은 모노사이클릭 카르보사이클릭 고리이며, 상기에서 각각의 오르토 치환체는 할로 또는 메틸에서 독립적으로 선택된다. 다른 바람직한 구체예에 따르면, Q3은 NR´2, OR´, CO2R´, CN, N(R´)C(O)R4; N(R´)C(O)OR4; N(R´)C(O)C(O)R4; N(R´)S(O2)R4; N(R´)R4; N(R4)2; OR4; OC(O)R4; OP(O)3H2; 또는 N=CH-N(R´)2에서 독립적으로 선택된는 1 또는 2개의 추가 치환체를 함유한다.
Q3이 아래 표 3에 제시된 Ie 화합물에 존재하는 임의의 Q3 잔기, 또는 아래 표 4에 제시된 Ig 화합물에 존재하는 임의의 Q3 잔기에서 선택되는 것이 바람직하다.
당업자는 화학식 (Ie)의 화합물을, 본 발명의 화학식 (Ia) 및 화학식 (Ic)의 p38 저해제의 일부(즉, Q1=Q3인 화합물)에 대한 직접적인 전구체로서 인식할 것이다. 당업자는 또한 화학식 (Ig)의 화합물이 본 발명의 화학식 (Ib) 및 화학식 (Id)의 p38 저해제의 일부(즉, Q1=Q3인 화합물)에 대한 전구체라는 것을 인식할 것이다. 따라서, 화학식 (Ie) 저해제의 합성은 상기 반응식 1 및 반응식 2에 도시되며, 여기서 Q1은 Q3으로 대체된다. 유사하게, 화학식 (Ig) 저해제의 합성은 상기 반응식 3 및 반응식 4에 도시되며, 여기서 Q1은 Q3으로 대체된다.
화학식 (If) 및 화학식 (Ih) 저해제의 합성을 하기 반응식 7 및 8에서 도시한다.
Figure 111999006289858-pct00153
Figure 111999006289858-pct00154
반응식 8은 Ih형 화합물의 합성을 도시한다, 예컨대, 나트륨 하이드라이드와 같은 염기의 존재하에 출발 물질인, 디브로모 유도체(예: 2,6-디브로모피리딘)를 아민으로 처리하여 2-아미노-6-브로모 유도체를 생성한다. 팔라듐 촉매의 존재하에 서 상기 중간체를 페닐보론산과 같은 페닐보론산 유사체(Q2-보론산)으로 처리하여, 2치환된 유도체를 수득하였는데, 이는 나중에 최종 생성물로 아실화될 수 있다. 본 합성의 최초 2단계의 순서는 역전될 수 있다.
이론에 구애될 필요는 없지만, 본 출원인들은 화학식 (Ie) 및 화학식 (Ig) 저해제의 Q3 고리에 있는 디오르토(diortho) 치환 및 화학식 (If) 및 화학식 (Ih) 저해제의 Q1고리에 직접 부착된 질소의 존재가 화합물의 “평평화”를 유발하여 p38을 효과적으로 저해할 수 있게 한다고 믿는다.
본 발명의 바람직한 화학식 (Ie)인 저해제는, A가 탄소이고, n이 1이고, X가 황이고, 각각의 Y가 탄소이고, 각각의 R이 수소이고, Q3이 2,6-디클로로페닐이며 Q2가 페닐인 화합물로서, 상기 화합물은 화합물 201로 언급된다. 본 발명의 바람직한 화학식 (Ig) 저해제는, Q3이 2,6-디클로로페닐이고, Q2가 페닐이며, 각각의 Y는 탄소이고, 각각의 R은 수소인 화합물이다. 본원에서는 상기 화합물을 화합물 202로 언급한다. 본 발명의 다른 바람직한 화학식 (Ig)의 화합물을 아래 표 4에 열거한다.
본 발명의 바람직한 Ih 화합물을 아래 표 5에 나타낸다. 다른 바람직한 Ih화합물은, Q1이 2위치 및 6위치가 클로로 또는 플루오로로 독립적으로 치환된 페닐이고; 각각의 Y는 탄소이며; 각각의 R은 수소이고; Q2는 2-메틸페닐, 4-플루오로페닐, 2,4-디플루오로페닐, 2-메틸렌히드록시-4-플루오로페닐, 또는 2-메틸-4-플루오로페 닐인 화합물이다.
화학식 (Ie), 화학식 (Ig) 및 화학식 (Ih)의 일부 특정 저해제를 하기 표에서 도시한다.
Figure 112005502258832-pct00434
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Figure 112005502258832-pct00395
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Figure 112005502258832-pct00400
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본 발명의 p38 저해제의 활성을 시험관내(in vitro), 생체내 또는 세포주 내에서 분석할 수 있다. 시험관 내의 분석은 활성화된 p38의 키나아제 활성 또는 활성화된 p38의 ATPase 활성의 저해를 측정하는 분석을 포함한다. 대안적인 시험관 내 분석은 저해제가 p38에 결합하는 능력을 정량화하며, 결합 전에 저해제를 방사선표지하고 저해제/p38 복합체를 분리하여, 방사선 표지가 결합된 것의 양을 측정하거나, 또는 새로운 저해제를, 공지된 방사선 리간드에 결합된 p38과 함께 항온처리하는 경쟁 실험을 수행함으로써 측정될 수 있다.
본 발명의 화합물의 저해 효과의 세포 배양 분석은 음성(negative) 대조군으로 처리한 세포와 비교하여 저해제로 처리한 세포내에서, 전혈 또는 그 세포 분획물 중의 생성된 TNF, IL-1, IL-6 또는 IL-8의 양(amount)을 측정할 수 있다. 시판하는 ELISAs를 사용하여 이들 사이토킨의 농도를 측정할 수 있다.
본 발명의 p38 저해제의 저해 활성을 측정하는 데 유용한 생체내 분석은, 마 이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)에 의해 유도된 보조 관절염이 있는 래트에서 뒷발 부종의 억제이다. 이것은 문헌[J. C. Boehm et al., J. Med. Chem., 39, pp. 3929-37 (1996)]에 기재되어 있으며, 이 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다. 또한, 참고 문헌[A. M. Badger et al., J. Pharmacol. Experimental Therapeutics, 279, pp. 1453-61 (1996)]에 기재된 것과 같이 관절염, 골 흡수, 내독소 쇼크 및 면역 기능의 동물 모델에서 본 발명의 p38 저해제를 분석할 수 있으며, 상기 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 포함된다.
p38 저해제 또는 그것의 약학적 염을 동물 또는 사람에게 투여하기 위한 약학적 조성물로 제제화할 수 있다. p38에 의해 매개되는 상태를 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양의 p38 저해제 및 약학적 허용 담체를 포함하는 이들 약학적 조성물은 본 발명의 다른 구체예이다.
본원에 사용된 “p38에 의해 매개되는 상태”라는 용어는 p38이 역할을 한다고 공지된, 임의의 질병 또는 기타 유해한 상태를 의미한다. 이는 IL-1, TNF, IL-6 또는 IL-8 과잉 생성이 야기하는 것으로 공지된 상태를 포함한다. 이러한 상태는 염증성 질병, 자가면역 질환, 파괴성 골질환, 증식성 질병, 감염성 질병, 신경 퇴행성 질병, 알러지, 졸증에서의 재관류(reperfusion)/허혈, 심장 발작, 맥관 형성성 질병, 장기 저산소증, 혈관 과형성, 심장 비대증, 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집 및 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 신타아제-2와 관련된 상태를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
치료 또는 예방될 수 있는 염증성 질병은 급성 췌장염, 만성 췌장염, 천식, 알러지, 및 성인 호흡 곤란 증후군을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는 자가면역 질환은 사구체 신염, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 경피증, 만성 갑상선염, 그레이브스 병, 자가면역 위염, 당뇨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 호중구감소증, 혈소판 감소증, 아토피성 피부염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론 병, 건선, 또는 이식편 대 숙주의 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는 파괴성 골질환은 골다공증, 골관절염 및 다발성 골수종과 관련된 골 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는 증식성 질병은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 전이성 흑색종, 카포시 육종, 및 다발성 골수종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는 맥관 형성성 질병은 고형 종양, 눈의 혈관 신생, 영아의 혈관종을 포함한다.
치료 또는 예방될 수 있는 감염성 질병은 패혈증, 패혈성 쇼크 및 세균성 이질(Shigellosis)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
치료 또는 예방될 수 있는 바이러스성 질병은 급성 간염 감염(A형 간염, B형 간염 및 C형 간염을 포함), HIV 감염 및 CMV 망막염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 화합물에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 신경 퇴행성 질병은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 뇌성 허혈, 또는 외상적 손상에 의한 신경 퇴행성 질병을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
“p38에 의해 매개되는 상태”는 졸증에서의 허혈/재관류, 심장 발작, 심근의 허혈, 장기 저산소증, 혈관 과형성, 심장 비대증, 및 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집을 또한 포함한다.
이외에, 본 발명의 p38 저해제는 사이클로옥시게나아제-2(COX-2)라고도 언급되는 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 신타아제-2(PGHS-2)와 같은 유도 가능한 친염증성 프로테인(pro-inflammatory protein)의 발현을 또한 저해할 수 있다. 따라서, 기타 “p38에 의해 매개되는 상태”는 부종, 무통각, 발열 및 통증(예: 신경근육통, 두통, 암의 통증, 치통, 관절염 통증)이다.
또한, 본 발명의 p38 저해제에 의해 치료 또는 예방될 수 있는 질병은, 상기 질병의 원인이라고 여겨지는 사이토킨(IL-1, TNF, IL-6, IL-8)에 의해 편의상 분류될 수 있다.
따라서, IL-1에 의해 매개되는 질병 또는 상태는, 류마티스성 관절염, 골관절염, 졸증, 내독소혈증 및/또는 독성 쇼크 증후군, 내독소에 의해 유발된 염증 반응, 염증성 장 질환, 결핵, 죽상 동맥 경화증, 근육 퇴행성, 악액질, 건선 관절염, 라이터(Reiter) 증후군, 통풍, 외상성 관절염, 풍진 관절염, 급성 활액막염, 당뇨병, 췌장의 β-세포 질병 및 알츠하이머 병을 포함한다.
TNF에 의해 매개되는 질병 또는 상태는 류마티스성 관절염, 류마티스성 척추염, 골관절염, 통풍성 관절염 및 기타 관절염성 상태, 패혈증, 패혈성 쇼크, 내독 소 쇼크, 그람 음성 패혈증, 독성 쇼크 증후군, 성인 호흡 장애 증후군, 뇌성 말라리아, 만성 폐의 염증성 질병, 규폐증, 폐의 유육종증(sarcoisosis), 골 흡수 질병, 재관류 손상, 이식편 대 숙주 반응, 동종 이식 거부, 감염에 의한 발열 및 근육통, 감염에 대한 2차적 악액질, AIDS, ARC 또는 악성 종양(암), 켈로이드(keloid) 형성, 반흔(scar) 조직 형성, 크론 병, 궤양성 대장염 또는 피레시스(pyresis)을 포함한다. 또한, TNF에 의해 매개되는 질병은, HIV, CMV, 인플루엔자 및 헤르페스와 같은 바이러스 감염; 및 말의 감염성 빈혈 바이러스, 염소의 관절염 바이러스, 비스나(visna) 바이러스 또는 미테(maedi) 바이러스를 포함하는(그러나, 이에 제한되지는 않는다) 렌티바이러스 감염; 또는 고양이의 면역 결핍 바이러스, 소의 면역 결핍 바이러스 또는 개의 면역 결핍 바이러스를 포함하는 레트로바이러스 감염과 같은 가축 바이러스성 감염을 포함한다.
IL-8에 의해 매개되는 질병 또는 상태는 건선, 염증성 장 질환, 천식, 심장 및 신장의 재관류 손상, 성인 호흡 장애 증후군, 혈전증 및 사구체 신염과 같은 거대 호중구 침윤을 특징으로 하는 질병을 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물을 국소적으로 사용하여, IL-1 또는 TNF에 의해 유발되었거나 또는 악화된 상태를 치료 또는 예방할 수 있다. 이런 상태는 염증이 생긴 관절, 습진, 건선, 염증성 피부 상태(예: 햇볕 화상), 안염증성 상태(예: 결막염), 피레시스, 통증 및 염증과 관련된 기타의 상태를 포함한다.
본 발명의 화합물 이외에, 본 발명의 화합물의 약학적 허용염을 또한 조성물 중에 사용하여 전술한 질병을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적 허용염은 약학적으로 허용 가능한 무기산, 무기염기, 유기산 및 유기염기에서 유도된 것을 포함한다. 적합한 산 염의 예로서, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄퍼레이트, 캄퍼설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 글리콜레이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 히드로요오다이드, 2-히드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 살리실레이트, 숙시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 옥살산과 같은 기타 산은, 그 자체가 약학적으로 허용 가능하지는 않지만, 본 발명의 화합물 및 그 약학적 허용 산 부가염을 수득하는 데 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 적절한 염기에서 유도된 염은, 알칼리 금속(예: 나트륨 및 칼륨), 알칼리 토금속(예: 마그네슘), 암모늄 및 N-(C1-4 알킬)4+ 염을 포함한다. 또한, 본 발명은 본원에 개시된 화합물의 임의의 염기성 질소-함유 기의 4차염화를 제안한다. 이러한 4차염화에 의해 물 또는 오일에 가용성 또는 분산성인 생성물을 수득할 수 있다.
이들 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약학적 허용 담체는 이온 교환기 , 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예: 사람 혈청 알부민), 완 충 물질(예: 인산염), 글리신, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 식물성 포화 지방산의 부분적 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들면, 황산 프로타민, 수소 인산 2나트륨, 수소 인산 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록(block) 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이로, 국소적으로, 직장내로, 비강으로, 협측으로(buccally), 질로 또는 이식 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 “비경구적”이라는 용어는 피하의, 정맥내의, 근육내의, 관절내의, 활액내의, 흉골내의, 난포막내의, 간내의, 병변내의, 및 두개내(intracranial)의 주사 기법 또는 주입 기법을 포함한다. 상기 조성물은 경구적으로, 복강내로 또는 정맥내로 투여되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 멸균 주사성 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이 현탁액은, 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당해 분야에서 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 또한, 이 멸균 주사성 제제는, 예컨대 1,3-부탄디올 중의 용액과 같이, 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사성 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 비이클(vehicle) 및 용매 중에는 물, 링거용액 및 염화 나트륨 등장용액이 있다. 또한, 용매 또는 현탁 매질로서 멸균된 불휘발유를 통상적으로 사용한다. 이런 목적으로, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하여, 임의의 자극성이 적은 불휘발유를 사용할 수 있다. 올레인산 및 그 글리세라이드 유도체와 같은 지방산은 주사 제제에서 유용하고, 올리브 오일 또는 피마자 오일과 같은 천연의 약학적 허용 오일, 특히 그것의 폴리옥시에틸화된 형이 유용하다. 또한, 이들 오일 용액 또는 현탁액은 장 쇄의 알콜 희석제 또는 분산제를 함유할 수 있는데, 에멀젼 및 현탁액을 포함하여 약학적 허용 제형의 제제화에 흔히 사용되는 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 트윈(Tween), 스판(Span) 및 기타 유화제와 같은 기타 흔히 사용되는 계면 활성제, 또는 약학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 제형의 제조에 흔히 사용되는 생체이용률 증강제도 제제의 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액을 포함하는(그러나, 이에 제한되지는 않는다) 임의의 경구적으로 허용 가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우에, 흔히 사용되는 담체는 락토오스 및 옥수수 전분(corn starch)을 포함한다. 또한, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 통상적으로 첨가된다. 캡슐 형태로 경구 투여하기 위해서, 유용한 희석제는 락토오스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 경구용으로 수성 현탁액이 필요한 경우, 활성 성분을 유화제 및 현탁화제와 결합시킨다. 바람직한 경우, 특정 감미료, 미제 또는 색소를 첨가할 수도 있다.
대안적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들은, 실온에서 고체이지만 직장내 온도에서 액체이고, 따라서 직 장 내에서 용융하여 약물을 방출시킬 수 있는 적합한 비자극성 부형제와 약제를 혼합하여 제조할 수 있다. 이런 물질은 코코아 버터, 밀랍(beeswax) 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은, 특히 치료의 표적 부위가 눈, 피부, 또는 하부 장관의 질병을 포함하여, 국소 적용에 의해 쉽게 접근 가능한 영역 또는 장기를 포함하는 경우, 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제제는 이들 영역 또는 장기 각각을 위해 용이하게 제조된다.
하부 장관에 대한 국소 적용은, 직장 좌제(상기 참조) 또는 적합한 관장제로 달성할 수 있다. 국소적-경피 패취를 사용할 수도 있다.
국소 적용을 위해서, 약학적 조성물은 하나 이상의 담체 내에 현탁되거나 또는 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제제화될 수 있다. 본 발명의 화합물의 국소 투여를 위한 담체는 광유, 액상 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 이 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적 허용 담체내에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제제화될 수 있다. 적합한 담체는 광유, 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알콜, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알콜 및 물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
눈에 사용하기 위해서, 이 약학적 조성물은 염화 벤질알코늄과 같은 보존제를 함유하거나 함유하지 않는, pH 조정된 멸균 등장 식염수 중의 미세화된 현탁액 으로서, 또는 바람직하게는 pH 조정된 멸균 등장 식염수 중의 용액으로서 제제화될 수 있다. 대안적으로, 눈에 사용하기 위해서, 약학적 조성물은 바셀린과 같은 연고로 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이런 조성물은 약학적 제제 분야에서 잘 공지된 기술에 따라 제조되며, 벤질 알콜 또는 기타 적합한 보존제, 생체 이용률을 증진시키는 흡수 촉진제, 플루오로탄소, 및/또는 기타 종래의 가용화제 또는 분산제를 사용하여, 식염수 중의 용액으로 제조될 수 있다.
단일 복용 형태를 제조하기 위한 담체 물질과 결합될 수 있는 p38 저해제의 양은 처리되는 숙주, 구체적 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 바람직하게는, 조성물은, 0.01 내지 100 mg/kg(체중)/1일 용량의 저해제가 상기 조성물을 투여받는 환자에게 투여될 수 있도록 제제화되어야 한다.
또한, 임의의 구체적 환자에 대한 특정 투여량과 치료법은 사용된 특정 화합물의 활성, 나이, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 속도, 약의 조합, 및 치료하는 의사의 판단 및 치료될 구체적 질병의 심각성을 포함하는 다양한 인자들에 따라 좌우된다는 것을 이해해야 한다. 또한, 저해제의 양은 이 조성물 중의 구체적인 화합물에 따라 좌우될 것이다.
다른 구체예에 따라, 본 발명은 전술한 약학적 조성물 중 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함하여, p38에 의해 매개되는 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본원에 사용된“ 환자”라는 용어는 동물, 바람직하게는 사람을 의미한다.
바람직하게는, 상기 방법은 염증성 질병, 자가면역 질환, 파괴성 골질환, 증식성 질병, 감염성 질병, 퇴행성 질병, 알러지, 졸증에서 재관류/허혈, 심장 발작, 맥관 형성성 질병, 장기 저산소증, 맥관 과형성, 심장 비대증, 및 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집에서 선택되는 상태를 치료 또는 예방하는데 사용된다.
다른 구체예에 따라, 본 발명의 저해제는 IL-1, IL-6, IL-8 또는 TNF에 의해 매개되는 질병 또는 상태를 치료 또는 예방하는 데 사용된다. 이런 상태는 전술한 것과 동일하다.
치료 또는 예방되는, p38에 의해 매개되는 구체적인 상태에 따라, 그 상태를 치료 또는 예방하기 위해 정상적으로 투여되는 추가적인 약물은 본 발명의 저해제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 증식성 질병을 치료하기 위해서 화학요법제 또는 기타 항증식제를 본 발명의 p38 저해제와 결합할 수 있다.
그러한 추가적인 약제는, p38 저해제-함유 조성물로부터, 다중 투여량 요법의 일부로서 개별적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 그러한 약제는 단일 조성물 중에 p38 저해제와 함께 혼합된, 단일 복용 형태의 일부일 수도 있다.
본원에 기재된 본 발명을 보다 완전히 이해시키기 위해서, 하기의 실시예가 제시된다. 이 실시예들은 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다고 이해된다.
실시예 1
p38 저해제 화합물 1의 합성
화학식 (Ia)의 몇가지 화합물의 합성예를 하기의 4가지 실시예에서 제시한다.
A.
Figure 111999006289858-pct00275
무수 테트라히드로푸란(20 ml) 중 90%의 나트륨 아미드(1.17 g, 30 mmol)의 슬러리에 무수 테트라히드로푸란(10 ml) 중 시안화 벤질(2.92 g, 25.0 mmol)의 용액을 실온에서 첨가했다. 이 혼합물을 30분간 실온에서 교반했다. 무수 테트라히드로푸란(10 ml) 중 3,6-디클로로피리다진(3.70 g, 25.0 mmol)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가했다. 30분간 교반한 후, 반응 혼합물을 중탄산 나트륨 포화 수용액으로 희석했다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출했다. 층을 분리하고 유기층을 물, 염수로 세척한 후, 황산 마그네슘 상에서 건조, 여과 및 진공에서 농축시켰다.
잔류물을 실리카겔(용출제: n-헥산 중의 30%의 에틸 아세테이트) 상에서 크로마토그래피로 정제하여 3.71 g(16.20 mmol ∼ 54%)의 생성물을 백색의 고형물로서 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00276
무수 테트라히드로푸란(10 ml) 중 95%의 나트륨 하이드라이드(0.14 g, 6.0 mmol)의 슬러리에 티오페놀(0.66 g, 6.0 ml)을 실온에서 첨가했다. 이어서, 반응 혼합물을 10분간 교반했다. 무수 에탄올(20 ml) 중 전 단계 A의 생성물(1.31 g, 5.72 mmol) 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가했다. 이어서, 반응 혼합물을 환류하면서 1시간동안 교반했다. 저온의 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 이 잔류물을 1N 수산화나트륨 용액(10 ml)으로 희석한 후, 염화 메틸렌으로 추출했다. 유기상을 물, 염수로 세척하고 황산 마그네슘 상에서 건조 및 진공에서 농축시켰다.
잔류물을 실리카 겔(용출제: n-헥산 중 20%의 에틸 아세테이트) 상에서 크로마토그래피로 정제하여 0.66 g(2.19 mmol ∼ 40%)의 생성물을 백색의 고형물로 수득했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00277
전구체-1
B 단계의 생성물(0.17 g, 0.69 mmol) 및 농축황산(5 ml)의 혼합물을 1시간동안 100℃로 가열했다. 이 용액을 냉각시키고, 중탄산 나트륨 포화용액을 사용하여 pH 8로 조정했다. 이 반응 혼합물을 염화 메틸렌으로 추출했다. 유기층을 물, 염수로 세척, 황산 마그네슘 상에서 건조 및 진공에서 농축하여 0.22 g(0.69 mmol ∼ 100%)의 화합물 전구체-1(pre-1)을 오렌지색의 오일로서 수득했다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d7.7 (d), 7.5 (d), 7.4 (m), 7.3 - 7.2 (m).
D.
Figure 111999006289858-pct00278
전구체-1
톨루엔(5 ml) 중 C 단계에서의 전구체-1(0.22 g, 0.69 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈(0.18 g, 1.5 mmol)의 용액을 100℃에서 1시간동안 가열했다. 냉각한 후, 생성된 고형물을 여과하고 따뜻한 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 디에틸 에테르를 적가하여 상기 생성물을 침전시켰다. 이어서, 이 생성물을 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 0.038 g의 화합물 1을 황색의 고형물로서 수득했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d8.63 (s), 7.63 - 7.21 (m), 6.44 (d).
실시예 2
p38 저해제 화합물 2의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00279
4-플루오로페닐아세토니트릴을 사용하여, 실시예 1A와 유사한 방법으로 상기 제 1 중간체를 제조하여 1.4 g(5.7 mmol, ∼15%)의 생성물을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00280
실시예 1B와 유사한 방법으로, 상기 중간체를 제조하였다. 이것은 0.49 g(1.5 mmol, 56%)의 생성물을 제조했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00281
실시예 1C와 유사한 방법으로, 상기 중간체를 제조하였다. 이것은 0.10 g(0.29 mmol, 45%)의 화합물 전구체-2를 생성했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d7.65 - 7.48 (m), 7.47 - 7.30 (m), 7.29 - 7.11 (m), 7.06 - 6.91 (m), 5.85 (s, br).
D.
Figure 111999006289858-pct00282
실시예 1D와 유사한 방법으로, 전구체-2로부터 화합물 2(표 1에 나타냄)를 제조하였다. 이것은 0.066 g의 생성물을 제조했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.60 (s), 7.62 - 7.03 (m), 6.44 (d)
실시예 3
p38 저해제 화합물 6의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00283
2,6-디클로로페닐아세토니트릴을 사용하여, 실시예 1A와 유사한 방법으로 화합물 6의 제조에서 제 1 중간체를 제조하여 2.49 g(8.38, 28%)의 생성물을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00284
실시예 1B에 기재된 것과 유사한 방법으로, 화합물 6의 합성에서 다음 단계를 수행했다. 이것은 2.82 g(7.6 mmol, 91%)의 생성물을 제조했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00285
실시예 1C에 기재된 것과 유사한 방법으로, 최종 중간체인 전구체-6을 제조하였다. 이것은 0.89 g(2.3 mmol, 85%)의 생성물을 제조했다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 7.5 - 7.4 (dd), 7.4 (m), 7.3 (d), 7.2 (m), 7.05 (d).
D.
Figure 111999006289858-pct00286
실시예 1D에 기재된 것과 같이, 화합물 6(표 1에 나타냄)의 합성에서 최종 단계를 수행했다. 이것은 0.06 g의 생성물을 제조했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.69 (s), 7.65 - 7.59 (d), 7.58 - 7.36 (m), 7.32 - 7.22 (m), 6.79 (d), 6.53 (d).
실시예 4
p38 저해제 화합물 5의 제조
A.
Figure 111999006289858-pct00287
2,4-디클로로페닐아세토니트릴을 사용하여, 실시예 1A에 기재된 것과 유사한 방법으로 화합물 5의 합성에서 제 1 중간체를 제조하여 3.67 g(12.36 mmol, 49%)의 생성물을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00288
실시예 1B에 기재된 것과 유사한 방법으로, 제 2 중간체를 제조하였다. 이것은 3.82 g(9.92 mmol, 92%)의 생성물을 제조했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00289
실시예 1C에 기재된 것과 유사한 방법으로, 최종 중간체인 전구체-5를 제조하였다. 이것은 0.10 g(0.24 mmol, 92%)의 생성물을 제조했다. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d 7.9 (d), 7.7 (d), 7.6 - 7.5 (dd), 7.4 - 7.3 (m), 2.4 (s).
D.
Figure 111999006289858-pct00290
실시예 1D에 기재된 것과 유사한 방법으로, 화합물 5(표 1에 나타냄)의 제조에서 최종 단계를 수행했다. 이것은 0.06 g의 생성물을 제조했다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) d 8.64 (s), 7.51 - 7.42 (m), 7.32 - 7.21 (m), 6.85 (d), 6.51 (d), 2.42 (s).
적절한 출발 물질을 사용하여, 유사한 방법으로 본 발명의 화학식 (Ia)의 다른 화합물을 합성할 수 있다.
실시예 5
화학식 (Ib)의 p38 저해제 화합물의 제조
화학식 (Ib)의 본 발명의 p38 저해제의 합성예를 하기에 제시한다.
A.
Figure 111999006289858-pct00291
무수 테트라히드로푸란 중 90%(1.1 eq)의 나트륨 아미드의 슬러리에, 무수 테트라히드로푸란 중 시안화 2,6-디클로로벤질(1.0 eq)의 용액을 실온에서 첨가했 다. 이 혼합물을 30분간 실온에서 교반했다. 무수 테트라히드로푸란 중 2,6-디클로로피리딘(1 eq)의 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가했다. 반응을 TLC로 모니터하고 반응이 완료되었을 때, 혼합물을 중탄산 나트륨의 포화 수용액으로 희석했다. 이어서, 이 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출했다. 층을 분리하고, 유기층을 물, 염수로 세척, 황산 마그네슘 상에서 건조, 여과 및 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 순수한 생성물을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00292
무수 테트라히드로푸란 중 4-플루오로-브로모벤젠(1 eq)의 용액(-78℃)에 t-부틸리튬(2 eq, 헥산 중의 용액)을 첨가했다. 이어서, 이 반응 혼합물을 30분간 교반했다. 무수 THF 중 A 단계의 생성물(1 eq) 용액을 상기 반응 혼합물에 첨가했다. 이어서, 반응 혼합물을 모니터하고, 서서히 실온으로 만들었다. 이 반응 혼합물을 물로 급냉한 후, 염화 메틸렌으로 추출했다. 유기상을 물, 염수로 세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조 및 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 수득했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00293
B 단계의 생성물 및 농축황산의 혼합물을 1 시간동안 100℃로 가열했다. 이 용액을 냉각시키고, 중탄산 나트륨 포화용액을 사용하여 pH 8로 조정했다. 이 반응 혼합물을 염화 메틸렌으로 추출했다. 유기층을 물, 염수로 세척, 황산 마그네슘 상에서 건조 및 진공에서 농축하여 생성물을 수득했다. 최종 생성물을 실리카 겔 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다.
D.
Figure 111999006289858-pct00294
톨루엔 중 C 단계의 생성물(1 eq) 및 N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈(2 eq)의 용액을 100℃에서 1시간동안 가열했다. 냉각한 후, 생성된 혼합물을 여과하고 따뜻한 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 디에틸 에테르를 적가하여 생성물을 침전시켰다. 이어서, 이 생성물을 여과하고 디에틸 에테르로 세척하여 화학식 (Ib) 의 p38 저해제를 수득했다. 최종 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 추가로 정제했다.
적절한 출발 물질을 사용하여, 유사한 방법으로 본 발명의 화학식 (Ib)의 다른 화합물을 합성할 수 있다.
실시예 6
p38 저해제 화합물 103의 합성
Figure 111999006289858-pct00295
본 실시예는 화학식 (Ic)의 화합물의 전형적인 합성을 나타낸다.
A. B 단계에서 4-플루오로티오페닐을 사용한 것을 제외하고는, 본질적으로 실시예 4에 제시된 것과 동일한 방법으로 p38 저해제 화합물 12를 제조했다.
B. 실온에서 무수 THF(5 ml) 중에 화합물 12를 용해시켰다. 이 용액에 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(톨루엔 중 1M 용액, 5ml, 5 mmol)를 첨가하고, 이 반응물을 실온에서 1시간동안 교반했다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 로셀(Rochelle)염을 첨가해서 급냉했다. 층을 분리하고 유기층을 격리시킨 후 물, 염수의 순으로 세척, 황산 마그네슘 상에서 건조 및 여과해서 미정제 화합물 103을 수득했다. 이 미정제 생성물을 실리카 겔 상에서 염화 메틸렌 중 2% 메탄올로 용출시켜 크로마토그래피했다. 이와 같이 하여 순수한 화합물 103을 수득했 다.(210 mg, 50%의 수율): 1H NMR (500MHz, CDCl3) 7.51 (m, 1H), 7.38 (d, 2H), 7.20 (t, 2H), 7.08 (t, 2H), 6.70 (넓은 s, 1H), 6.30 (dd, 2H), 5.20 (s, 2H).
실시예 7
p38 저해제 화합물 201의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00296
DMF 중(20 ml)에 상기 출발 물질인 니트릴(5.9 g, 31.8 mmol)을 실온에서 용해시켰다. 이어서, 나트륨 하이드라이드(763 mg, 31.8 mmol)을 첨가하여 연황색의 용액을 수득했다. 15분 후, DMF(10 ml) 중 2,5-디브로모피리딘(5.0 g, 21.1 mmol)의 용액을 첨가한 후, 팔라듐 테트라키스 (트리페닐포스핀)(3 mmol)을 첨가했다. 이어서, 상기 용액을 3시간동안 환류했다. 이 반응물을 실온으로 냉각하고, 에틸 아세테이트로 희석했다. 이어서, 유기층을 분리하여, 물, 염수의 순으로 세척, 황산 마그네슘상에서 건조, 여과 및 진공에서 증발시켜 미정제 오일을 수득했다. 헥산 중 10% 에틸 아세테이트로 용출시켜 플래쉬 컬럼 크로마토그래피함으로써, 생성물(5.8 g, 84%)을 회백색의 고형물로서 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00297
A 단계에서 생성된 브롬화물(194.8 mg, 0.57 mmol)을 자일렌(15 ml)에 용해시켰다. 이 용액에 티오페닐스타난(thiophenylstannane, 200㎕, 537 mmol) 및 팔라듐 테트라키스 (트리페닐포스핀)(25 mg)을 첨가했다. 상기 용액을 밤새 환류시켜 냉각, 여과 및 진공에서 증발시켰다. 이 미정제 생성물을 실리카 겔상에서 크로마토그래피(용출제: 염화 메틸렌)하여 순수한 생성물(152 mg, 72%)을 황색의 오일로서 수득했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00298
B 단계에서 생성된 니트릴(1.2 g, 3.37 mmol)을 빙초산(30 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액에 물(120 ㎕, 6.67 mmol)을 첨가한 후, 사염화 티타늄(760 ㎕, 6.91 mmol)을 첨가한 결과, 열이 발산되었다. 이어서, 상기 용액을 2시간동안 환류하고 냉각하여, 1N HCl에 부어 넣었다. 수성층을 염화 메틸렌으로 추출했다. 유기층을 1N NaOH로 역(逆)세척하고, 황산 마그네슘 상에서 건조하여 실리카 겔의 플러그(plug) 상에서 여과했다. 이 플러그를 먼저 염화 메틸렌으로 용출시켜 미반응의 출발 물질을 제거한 후, 에틸 아세테이트로 용출시켜 화합물 201을 수득했다. 이 에틸 아세테이트를 증발시켜 순수한 화합물 201(1.0 g, 77%)을 수득했다.
실시예 8
p38 저해제 화합물 110의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00299
출발물질인 니트릴(3.76 g, 11.1 mmol)을 먼저 빙초산(20 ml)에 용해시켰다. 이 용액에 사염화 티타늄(22.2 mmol) 및 물(22.2 mmol)을 첨가하고, 이 용액을 1시간동안 가열 환류시켰다. 이어서, 이 반응 혼합물을 냉각하고, 물/에틸 아세테이트로 희석했다. 이어서, 유기층을 분리하고, 염수로 세척한 후, 황산 마그네슘 상에서 건조했다. 유기층을 여과하고 진공에서 증발시켰다. 그 결과 얻어진 미정제 생성물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피(용출제: 염화 메틸렌 중 5% 메탄올)해서 순수한 생성물을 황색의 포말체(2.77 g, 70%)로 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00300
A 단계에서 생성된 아미드(1.54 g, 4.3 mmol)를 톨루엔(20 ml)중에 용해시켰 다. 이어서, N,N-디메틸포름아미드 디메틸아세탈(1.53 g, 12.9 mmol)을 첨가하고 생성된 용액을 10분간 가열한 후, 방치해서 실온으로 냉각시켰다. 상기 반응물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 상에서 염화 메틸렌 중 2∼5% 메탄올로 용출시켜 크로마토그래피했다. 이어서, 회수된 물질을 고온의 에틸 아세테이트 중에 용해시켰다. 이 용액을 방치하여 냉각한 결과, 순수한 생성물을 황색의 고형물(600 mg, 40%)로 결정화했다. 저장 용액으로부터 추가량의 물질(∼800 mg)을 입수할 수 있었다.
C.
Figure 111999006289858-pct00301
B 단계의 브롬화물(369 mg, 1 mmol)을 THF(10 ml)중에 용해시켰다. 디이소부틸알루미늄 하이드라이드(1.0 M 용액, 4 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 10분간 교반한 후 메탄올(1 ml)로 반응물을 급냉했다. 이어서, 로셀염의 포화 용액을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 이 혼합물을 추출했다. 유기층을 분리하고 황산 마그네슘상에서 건조 및 증발시킨 후, 그 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피(용출제: 염화 메틸렌 중 1∼3% 메탄올)하여 밝은 오렌지색의 고형물(85 mg, 23%의 수율)을 수득했다.
D.
Figure 111999006289858-pct00302
C 단계에서 생성된 브롬화물(35.2 mg, 0.1 mmol)을 자일렌(12 ml) 중에 용해시켰다. 이 용액에 티오페놀(0.19 mmol), 트리부틸 주석 메톡시드(0.19 mmol)의 순으로 첨가했다. 생성된 용액을 10분간 가열 환류시킨 후, 팔라듐 테트라키스(트리페닐포스핀)(0.020 mmol)을 첨가했다. 이 반응물을 가열하고, 출발 물질인 브롬화물의 소멸을 모니터했다. 이어서, 상기 반응물을 실온으로 냉각하고, 실리카 겔의 플러그를 통과시켰다. 처음에는 이 플러그를 염화 메틸렌으로 용출시켜 과량의 주석 시약을 제거한 후, 에틸 아세테이트 중 5%의 메탄올을 사용하여 p38 저해제를 용출시켰다. 여과액을 농축한 후, 실리카 겔 상에서 재크로마토그래피(용출제: 에틸 아세테이트 중 5% 메탄올)하여 순수한 화합물 110(20 mg, 52%)을 수득했다.
실시예 9
p38 저해제 화합물 202의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00303
DMF(10 ml) 중에 출발 물질인 니트릴(2.32 g, 12 mmol)을 실온에서 용해시켰다. 이어서, 나트륨 하이드라이드(12 mmol)을 첨가하여 연황색의 용액을 수득했다. 15분 후, DMF(5 ml) 중 2,6-디브로모피리딘(2.36 g, 10 mmol)의 용액, 팔라듐 테트라키스 (트리페닐포스핀)(1.0 mmol)의 순으로 첨가했다. 이어서, 이 용액을 3시간동안 환류했다. 이 반응물을 실온으로 냉각하고, 에틸 아세테이트로 희석했다. 유기층을 분리하고, 물 및 염수로 세척한 후, 황산 마그네슘상에서 건조, 여과 및 진공에서 증발시켜 미정제의 오일을 수득했다. 헥산 중 10% 에틸 아세테이트로 용출시켜 플래쉬 컬럼 크로마토그래피하여, 생성물(1.45 g, 42%)을 백색의 고형물로서 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00304
A 단계에서 생성된 브로모 화합물(1.77 g, 5.2 mmol)을 톨루엔(20 ml) 중에 용해시키고, 생성된 용액의 가스를 제거했다. 질소 분위기 하에서, 에탄올(4 ml) 중 페닐보론산(950 mg, 7.8 mmol)의 용액, 및 물(4 ml) 중의 탄산 나트륨(1.73 g, 14 mmol)의 용액을 첨가했다. 이 반응 혼합물을 1시간동안 가열 환류시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 상기 반응물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물 및 염수로 세척했다. 이어서, 유기층을 황산 마그네슘으로 건조하고, 여과 및 진공에서 농축했다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 30% 에틸 아세테이트로 용출시켜 정제하여, 생성물을 백색의 고형물로 수득했다(1.56 g, 88%).
C.
Figure 111999006289858-pct00305
B 단계의 니트릴(700 mg, 2.07 mmol)을 농축황산(10 ml)에 용해시키고, 80℃로 1시간동안 가열했다. 이어서, 이 반응물을 실온으로 냉각하고, 6N 수산화 나트륨을 사용하여 pH 8로 조정했다. 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출했다. 유기층을 분리하고, 황산 마그네슘으로 건조한 후, 진공에서 증발시켜 화합물 202를 황색의 포말체(618 mg, 84%)로 수득했다.
실시예 10
화합물 410의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00306
화염-건조한 100 ml의 둥근 바닥 플라스크내에서, 2.28 g(93.8 mmol)의 마그네슘 조각을 50 ml의 무수 테트라히드로푸란에 첨가했다. 하나의 요오드 결정을 첨가해서 연갈색을 형성했다. 상기 용액에 2-브로모-5-플루오로톨루엔 샘플 10.0 ml(79.1 mmol) 중 1.5 ml를 첨가했다. 이 용액을 가열 환류했다. 갈색이 희미해지고, 그리나드(Grignard) 형성을 나타내는 외부적 열원이 제거될 때까지 환류를 계속했다. 환류가 감퇴함에 따라, 추가의 브롬화물 1.0 내지 1.5 ml 부를 첨가해서 격렬하게 환류시켰다. 이 과정을, 모든 브롬화물을 첨가할 때까지 반복했다. 올리브 그린색의 용액을 1시간동안 외부적으로 가열 환류시켜 완전한 반응을 보증했다. 상기 용액을 얼음 배스내에서 냉각시키고, 주사기(syringe)를 통해 테트라히드로푸란 100 ml 중의 트리메틸 보레이트 9.3 ml(81.9 mmol)의 용액에 -78℃에서 첨가했다. 그리나드시약을 첨가한 후, 이 플라스크를 냉각 배스에서 제거하고 상기 용액을 실온에서 밤새 교반했다. 회백색의 슬러리를 300 ml의 H2O에 부어 넣고, 휘발성 물질을 진공에서 증발시켰다. HCl(2N 용액 400 ml)을 첨가하고, 유백색의 혼합물을 1시간동안 실온에서 교반했다. 백색의 고형물이 침전되었다. 이 혼합물을 디에틸 에테르로 추출하고 유기 추출물을 건조(MgSO4) 및 진공에서 증발시켜 11.44 g(94%)의 보론산을 백색 고형물로 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00307
100 ml의 둥근 바닥 플라스크내에서, 7.92 g(33.4 mmol)의 2,6-디브로모피리딘을 50 ml의 무수 톨루엔 중에 용해시켜 투명한 무색의 용액을 형성했다. A 단계에서 생성된 4-플루오로-2-메틸벤젠 보론산(5.09 g, 33.1 mmol)을 첨가하여 백색의 현탁액을 형성했다. 탄산 탈륨(17.45 g, 37.2 mmol), 촉매량(150 mg)의 Pd(PPh3)4의 순으로 첨가했다. 상기 혼합물을 밤새 가열 환류하고, 냉각 및 실리카 겔의 패드상에서 여과했다. 이 실리카를 CH2Cl2로 세척하고, 여과액을 증발시켜 백색의 고형물을 수득했다. 이 고형물을 최소량의 50% CH2Cl2/헥산 중에 용해시키고, 실리카 겔의 짧은 컬럼상에서 크로마토그래피(용출제: 30% CH2Cl2/헥산)하여 6.55 g(74%)의 2-브로모-6-(4-플루오로-2-메틸페닐)피리딘을 백색의 고형물로 수득했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00308
50 ml의 둥근 바닥 플라스크내에서, B 단계에서 생성된 2-브로모-6-(4-플루오로-2-메틸페닐)피리딘 550 mg(2.07 mmol)을 30 ml의 무수 테트라히드로푸란중에 용해시켜 투명한 무색의 용액을 형성했다. 2,6-디플루오로아닐린(2.14 ml, 2.14 mmol), 광유 중 60% NaH 현탁액 112 mg(2.79 mmol)의 순으로 첨가했다. 완화한 발열과 함께 기체 방출이 관찰되었다. 이 용액을 밤새 가열 환류한 후, 냉각시켰다. 이 반응 혼합물을 10% NH4Cl에 부어 넣고, CH2Cl2로 추출했다. 유기 추출물을 건조(MgSO4)하고 진공에서 증발시켜, 생성물과 출발 물질의 혼합물인 갈색의 오일을 수득했다. 이 물질을 짧은 컬럼의 실리카 겔상에서 크로마토그래피(용출제: 50% CH2Cl2/헥산)하여, 262 mg(40%)의 2-(2,6-디플루오로페닐)-6-(4-플루오로-2-메틸페닐)피리딘을 무색의 오일로 수득했다.
D.
Figure 111999006289858-pct00309
100 ml의 둥근 바닥 플라스크내에서, C 단계에서 생성된 262 mg(834 mmol)의 2-(2,6-디플루오로페닐)-6-(4-플루오로-2-메틸페닐)피리딘을 30 ml의 무수 CHCl3 중에 용해시켜 투명한 무색의 용액을 형성했다. 클로로설포닐 이소시아네트(1.0 ml, 11.5 mmol)를 첨가하고, 연황색 용액을 실온에서 밤새 교반했다. 물(∼30 ml)을 첨가하여 완화한 발열 및 격렬한 기체 방출을 일으켰다. 밤새 교반한 후, 유기층을 분리하고, 건조(MgSO4) 및 진공에서 증발시켜, 생성물과 출발 물질의 혼합물인 갈색의 오일을 수득했다. 이 물질을 짧은 컬럼의 실리카 겔 상에서 크로마토그래피(용출제: 10% EtOAc/CH2Cl2)했다. 회수된 출발 물질을 반응 조건에 다시 노출시키고 동일한 방법으로 정제하여 총 205 mg(69%)의 우레아를 백색의 고형물로 수득했다.
실시예 11
화합물 138의 합성
Figure 111999006289858-pct00310
화합물 103 (106 mg, 0.25 mmol)을 THF (0.5 ml) 중에 용해시키고, 이 용액에 트리에틸아민(35 ㎕, 0.25 mmol), 과량의 포름알데히드(37% 수용액, 45 mg)의 순으로 첨가했다. 이 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 이 반응 혼합물을 감압하에서 회전증발(rotovap)하고, 그 잔류물을 염화 메틸렌 중에 용해시켜 플래쉬 실리카 겔 컬럼에 적용했다. 이 컬럼을 염화 메틸렌 중의 2% 메탄올로 용출시켜 순수한 생성물(78 mg, 70%의 수율)을 수득했다
실시예 12
화합물 103의 프로드럭의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00311
화합물 138(1 당량)을 염화 메틸렌에 용해시키고, 이 용액에 트리에틸아민(1 당량), 염화 디벤질포스포닐(1 당량)의 순으로 첨가했다. 이 용액을 실온에서 교반하고 출발 물질의 소모를 TLC로 모니터했다. 이어서 이 염화 메틸렌 층을 에틸 아 세테이트로 희석하고, 1N HCl, 포화 중탄산 나트륨 및 포화 NaCl로 세척했다. 이어서, 이 유기층을 건조, 회전증발하고, 미정제 생성물을 실리카 겔 상에서 정제했다. 이어서, 순수한 생성물을 메탄올에 용해시키고, 디벤질 에스테르를 수소 분위기 하에서, 10%의 목탄상 팔라듐으로 탈보호했다. 반응이 종결된 것으로 모니터되면, 이 촉매를 셀라이트(celite) 상에서 여과하고 그 여과액을 회전증발하여 인산염 생성물을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00312
화합물 103 (210 mg, 1.05 mmol)을 THF(2 ml) 중에 용해시키고 질소 분위기 하에서 -50℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 리튬 핵사메틸디실라잔(1.1 mmol), 염화 클로로아세틸(1.13 mmol)의 순으로 첨가했다. 이 반응물을 냉각 배스에서 제거하고, 방치하여 실온으로 가온한 후, 에틸 아세테이트로 희석하고 물로 급냉시켰다. 유기층을 염수로 세척하고 건조 및 회전증발하여 건조시켰다. 미정제 생성물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(용출제: 헥산 중의 25%의 에틸 아세테이트)하여 172 mg(70%)의 순수한 소정의 생성물을 수득했는데, 이것은 다음 반응에서 사용되었다.
C.
Figure 112005502258832-pct00404
클로로아세틸 화합물을 염화 메틸렌 중에 용해시키고 과량의 디메틸아민으로 처리했다. 반응을 TLC로 모니터하고 반응이 완료되었을 때, 모든 휘발성 물질을 제거하여 소정의 생성물을 수득했다.
실시예 13
화합물 34 및 117의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00314
실시예 5의 A 단계에서의 니트릴(300 mg, 1.0 mmol)을 에탄올(10 ml)에 용해시키고, 상기 용액에 티오우레아(80.3 mg, 1.05 mmol)를 첨가했다. 이 반응물을 4시간동안 환류하였는데, 그 시점에서 TLC는 모든 출발 물질이 소모되었다는 것을 나타내었다. 이 반응물을 냉각시키고 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하여, 그 잔류물을 아세톤(10 ml) 중에 용해시켰다.
이어서, 상기 용액에 2,5-디플루오로니트로벤젠(110 ㎕, 1.01 mmol)을 첨가 한 후, 탄산 칼륨(200 mg, 1.45 mmol) 및 물(400 ㎕)을 첨가했다. 이 반응물을 실온에서 밤새 교반했다. 이어서, 이 반응물을 염화 메틸렌(25 ml)으로 희석하고, 면 플러그를 통해 여과했다. 모든 휘발성 물질을 감압하에 제거하고, 그 잔류물을 실리카 겔 상에서 헥산 중 10%∼25%의 에틸 아세테이트의 농도 농도 구배(gradient)로 용출시켜 플래쉬 크로마토그래피하여, 소정의 생성물(142 mg, 33%)을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00315
A 단계의 니트릴 생성물(142 mg, 0.33 mmol)을 농축황산(2 ml)과 혼합하여 1시간동안 가열 환류시킨 후, 방치하여 실온으로 냉각했다. 이어서, 이 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 포화 탄산 칼륨 (수)용액으로 조심스럽게 중화시켰다. 층을 분리하고 유기층을 물, 염수로 세척한 후, 황산 마그네슘상에서 건조시켰다. 이 혼합물을 여과하고 증발 건조했다. 그 잔류물은 더 이상의 정제 없이 다음 단계에서 사용되었다(127 mg, 85%의 수율).
C.
Figure 111999006289858-pct00316
B 단계의 아미드(127 mg, 0.28 mmol)를 THF(3 ml) 중에 용해시키고, 이 용액에 디메틸포름아미드 디메틸아세탈(110 ㎕, 0.83mmol)을 첨가했다. 이어서, 이 반응물을 5분간 가열 환류한 후, 실온으로 냉각했다. 모든 휘발성 물질을 진공에서 제거하고, 그 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(용출제: 염화 메틸렌 중의 2.5% 메탄올)하여 순수한 소정의 화합물 34 (118 mg, 92%)를 수득했다.
D.
Figure 111999006289858-pct00317
벤젠/메탄올(0.84 ml/0.84 ml)의 혼합물 중 니켈 디클로라이드 헥사하이드레이트(103 mg, 0.44 mol)의 용액을 벤젠(3.4 ml) 중의 화합물 34 (100.8 mg, 0.22 mmol)의 용액에 첨가하고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 이어서, 상기 용액에 나트륨 보로하이드라이드(49 mg, 1.3 mmol)을 첨가했다. 실온으로 가온하면서 이 반응물을 교반하였다. 이 반응물을 진공에서 증발시키고, 잔류물을 플래쉬 크로마토그래피(용출제: 염화 메틸렌 중 2%의 메탄올)하여 순수한 소정의 생성물인 화합물 117 (21 mg, 25%의 수율)을 수득했다.
실시예 14
화합물 53 및 화합물 142의 합성
A.
Figure 111999006289858-pct00318
클로로피리다진(359 mg, 1.21 mmol) 및 2,4-디플루오로티오페놀(176 mg, 1.21 mmol)을 사용하여 실시예 1의 B 단계의 방법으로 상기 반응에 나타낸 생성물을 합성했다. 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피를 한 후, 생성물(451 mg, 92%)을 수득했다.
B.
Figure 111999006289858-pct00319
451 mg의 출발 물질 및 5 ml의 농축황산을 사용하여, 실시예 1의 C 단계에 기재된 것과 같이 상기 반응을 수행하여 표시된 생성물(425 mg, 90%)을 수득했다.
C.
Figure 111999006289858-pct00320
출발 물질인 아미드(410 mg, 0.96 mmol) 및 디메틸포름아미드 디메틸아세탈(3 mmol)을 사용하여, 실시예 1의 D 단계에 기재된 것과 같이 상기 반응을 수행하였다. 이 반응물을 30 분간 50℃로 가열하고, 전술한 것과 같이 조작했다. 화합물 53 (313 mg, 75%)을 수득했다.
D.
Figure 111999006289858-pct00321
화합물 34 (213 mg, 0.49 mmol)를 THF(10 ml) 중에 용해시키고 0℃로 냉각한 후, 이 용액에 THF(1 M, 0.6 mmol) 중의 보란을 첨가했다. 이 반응물을 30 분간 교반하고, 물로 급냉시킨 후, 에틸 아세테이트로 희석했다. 유기층을 물 및 염수로 세척, 건조 및 회전증발했다. 그 잔류물을 실리카 겔 상에서 염화 메틸렌 중 1∼5% 메탄올 농도 구배로 용출시켜 정제하여, 화합물 142 (125 mg, 57%)를 수득했다.
실시예 15
곤충 세포에서 p38 키나아제의 클로닝
사람 p38 키나아제의 2개의 접합(splice) 변이인 CSBP1 및 CSBP2를 확인했다. 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용해서, HeLa 세포 라이브러리(Stratagene)를 주형으로 사용하는 CSBP2 cDNA의 암호화 영역을 증폭했다. 폴리머라아제 체인 반응 생성물을 pET-15b 벡터(Novagen) 내로 클로닝하였다. pET15b-(His)6-p38의 XbaI-BamHI 단편을 플라스미드 pVL1392(Pharmingen)내 상보적 인 영역으로 서브클로닝하여 바쿨로바이러스 전이 벡터, pVL-(His)6-p38을 구성했다.
플라스미드 pVL-(His)6-p38는, DNA 서열화(sequencing) 및 발현된 단백질의 N-말단 서열화에 의해 확인된 것과 같이, 프레임에서 p38의 N-말단에 융합된 23-잔기의 펩티드(MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMLE, 여기서 LVPRGS는 트롬빈 분열 영역을 나타냄)로 구성된 재조합 단백질의 합성을 지시했다.
스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda, Sf9) 곤충 세포(ATCC)의 단층 배양물을, T-플라스크내에서 10%의 태아 소의 혈청을 보충한 TNM-FH 배지[깁코(Gibco) BRL] 중에 27℃로 유지했다. 로그 상내의 Sf9 세포를, 리포펙틴(Invitrogen)을 사용하여 오토그라파 칼리포니카(Autographa Califonica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스(Pharmingen)의 선형 바이러스 DNA 및 전이 벡터 pVL-(His)6-p38로 공형질감염시켰다. 개별적인 재조합 바쿨로바이러스 클론은 1% 저융점 아가로오스를 사용하는 플라크(plaque) 분석을 통해 정제되었다.
실시예 16
재조합 p38 키나아제의 발현 및 정제
트리코플루시아 니(Trichoplusia ni, Tn-368) 하이-파이브TM(High-FiveTM) 세포(Invitrogen)를 27℃의, 진탕기 플라스크내 엑셀(Excel)-405 단백질이 없는 배지(JRH 바이오사이언스) 중의 현탁액 중에서 자라게 했다. 밀도가 1.5 X 106 세포수/ml인 세포를 5의 감염 다중도의 전술한 재조합 바쿨로바이러스로 감염시켰다. 토끼의 항-p38 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지)를 사용하여 면역블롯팅함으로써, 재조합 p38의 발현 레벨을 모니터했다. p38의 발현 레벨이 최고점에 도달한 감염 72 시간 후에 세포 물질을 수확했다.
(His)6이 부착된 p38을 발현하는 세포로부터 냉동 세포 페이스트를 5배 부피의 완충액 A (50 mM NaH2PO4 pH 8.0, 200 mM NaCl, 2mM β-메르캅토에탄올, 10% 글리세롤 및 0.2 mM PMSF) 중에 녹였다. 미세유동화기 내에서 세포를 기계적으로 분쇄한 후, 그 용해물을 30,000 x g에서 30분간 원심분리시켰다. 그 상청액을 탈론TM (TalonTM, 클론테크) 금속 친화성 수지와 함께, 예정된 p38 2∼4 mg 당 수지 1 ml의 비율로 사용하여 4℃에서, 3 내지 5시간동안 뱃치로 항온처리했다. 500 x g에서 5분간 원심분리하여 수지를 고정하고, 완충액 A를 사용하여 뱃치로 부드럽게 세척했다. 이 수지를 슬러리화하여 컬럼(약 2.6 x 5.0 cm)에 부어 넣고, 완충액 A + 5 mM 이미다졸로 세척했다.
(His)6-p38을 완충액 A + 100 mM 이미다졸로 용출시킨 후, 2 리터의 완충액 B (50 mM HEPES, pH 7.5, 25 mM β-글리세로포스페이트, 5% 글리세롤, 2mM DTT)에 대해 4℃에서 밤새 투석했다. p38의 1 mg당 1.5 단위의 트롬빈(칼바이오켐)을 첨가하고, 20℃에서 2 내지 3시간동안 항온처리하여 His6 택(tag)을 제거했다. 0.2 mM의 PMSF를 첨가하여 상기 트롬빈을 급냉한 후, 전체 샘플을 2 ml의 벤자미딘 아가로오스(어메리칸 인터내셔널 케미칼) 컬럼 상에 부하(load)했다.
분획을 통한 유동물을, 완충액 B + 0.2 mM PMSF 중에서 미리 평형화된 2.6 x 5.0 cm Q-세파로오스(파마시아) 컬럼상에 직접 부하했다. 완충액 B 중 0.6 M NaCl에 대한 20 컬럼 부피 선형 농도 구배를 사용하여, p38을 용출시켰다. 용출된 단백질 피이크를 합산하고, 완충액 C (50 mM HEPES pH 7.5, 5% 글리세롤, 50 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.2 mM PMSF)에 대해 4℃에서 밤새 투석했다.
투석된 단백질을 센트리프렙(Centriprep, 아미콘)에서 3 내지 4 ml로 농축하고, 2.6 x 100 cm 세파크릴 S-100HR (파마시아) 컬럼에 적용했다. 이 단백질을 35 ml/시의 유속으로 용출시켰다. 주된 피이크를 합산하고, 20 mM DTT로 조정한 후, 10 내지 80 mg/ml로 농축하고 -70℃에서 분취량으로 냉동하거나 또는 즉각 사용했다.
실시예 17
p38의 활성화
완충액 B + 10 mM MgCl2, 2mM ATP, 0.2 mM Na2VO4 중에서 0.005 mg/ml의 DD-이중 돌연변이 MKK6와 0.5 mg/ml의 p38을 20℃에서 30분간 결합시켜 p38을 활성화했다. 이어서, 이 활성화 혼합물을 1.0 x 10 cm 모노Q 컬럼(파마시아) 상에 부하하고, 완충액 B 중 1.0 M NaCl에 대한 선형 20 컬럼 부피 농도 구배를 사용하여 용출시켰다. ADP 및 ATP의 용출 후, 활성화된 p38이 용출되었다. 활성화된 p38 피이크를 합산하고, 완충액 B + 0.2 mM Na2VO4에 대해 투석하여 NaCl을 제거했다. 4.0 M 저장 용액을 첨가하여 상기 투석된 단백질을 1.1 M 인산 칼륨으로 조정하고, 완충 액 D (10% 글리세롤, 20 mM β-글리세로포스페이트, 2.0 mM DTT) + 1.1 M K2HPO4 중에 미리 평형을 유지시킨 1.0 x 10 cm HIC(라이닌 하이드로포어) 컬럼 상에 부하했다. 완충액 D + 50 mM K2HPO4에 대한 20 칼럼 부피 선형 농도 구배를 사용하여 상기 단백질을 용출시켰다. 이중(double) 인산화된 p38이 주된 피이크로서 용출되고, 이것을 완충액 B + 0.2 mM Na2VO4에 대한 투석에 있어서 합산했다. 이 활성화된 p38을 -70℃에서 저장했다.
실시예 18
p38 저해 분석
A. EGF 수용체 펩티드의 인산화의 저해
이 분석은 10 mM의 MgCl2, 25 mM β-글리세로포스페이트, 10% 글리세롤 및 100 mM HEPES 완충액의 존재하, pH 7.6에서 수행했다. 전형적인 IC50 측정을 위해, 전술한 모든 성분 및 활성화된 p38(5 nM)을 함유하는 저장 용액(stock solution)을 제조했다. 이 저장 용액을 바이알에 분취했다. 일정한 부피의 DMSO 또는 DMSO 중의 저해제(반응에서 DMSO의 최종 농도가 5%임)를 각각의 바이알에 도입하고, 혼합하여, 실온에서 15분간 항온처리했다. EGF 수용체 펩티드, KRELVEPLTPSGEAPNQALLR, p38-촉매화된 키나아제 반응 (1)의 포스포릴 수용체를 각각의 바이알에 첨가하여 최종 농도가 200 μM이 되게 했다. 이 키나아제 반응은 ATP(100 μM)에 의해 시작되고, 이 바이알을 30℃에서 항온처리했다. 30분 후, 이 반응물을 동일한 부피의 10% 트리플루오로아세트산(TFA)으로 급냉했다.
HPLC 분석으로 인산화 펩티드를 정량했다. 역상 컬럼(델타파크, 5 ㎛, C18 100D, 부분 번호 011795) 상에서 각각 0.1%의 TFA를 함유하는 물 및 아세토니트릴의 2성분으로 된 농도 구배를 사용하여, 비인산화 펩티드로부터 인산화 펩티드를 분리했다. 저해제 농도에 대해 잔존하는 활성%를 플롯하여 IC50 (50% 저해를 나타내는 저해제의 농도)을 측정했다.
B. ATPase 활성의 저해
이 분석은 10 mM의 MgCl2, 25 mM β-글리세로포스페이트, 10% 글리세롤 및 100 mM HEPES 완충액의 존재하, pH 7.6에서 수행했다. 전형적인 Ki 측정을 위해, 저해제의 부재하 및 2가지 농도의 저해제의 존재하에서 활성화된 p38 반응의 ATPase의 활성 중에서의 ATP에 대한 Km을 측정했다. 전술한 모든 성분 및 활성화된 p38(60 nM)을 함유하는 저장 용액을 제조했다. 이 저장 용액을 바이알내 분취했다. 일정한 부피의 DMSO 또는 DMSO 중의 저해제(반응에서 DMSO의 최종 농도가 2.5%임)를 각각의 바이알에 도입하고, 혼합하여, 실온에서 15분간 항온처리했다. 이 반응은 다양한 농도의 ATP를 첨가함으로써 시작되고 이어서, 30℃에서 항온처리되었다. 30분 후, 이 반응물을, pH 8.0의 EDTA(0.1 M, 최종 농도) 50㎕를 사용하여 급냉했다. HPLC 분석으로 p38 ATPase 활성의 생성물인 ADP를 정량했다.
역상 컬럼(수펠코실, LC-18, 3 ㎛, 부분 번호 5-8985) 상에서 하기 조성[용매 A - 8 mM 황산 수소 테트라부틸암모늄을 함유하는 0.1 M 인산염 완충액(시그마 케미칼 회사, 카탈로그 번호 T-7158), 용매 B - 30% 메탄올을 함유하는 용매 A]의 2성분 용매로 된 농도 구배를 사용하여 ATP로부터 ADP를 분리했다.
저해제와 ATP 농도의 함수로서 비율(rate) 데이터로부터 Ki를 측정했다. 본 발명의 일부 저해제에 대한 결과를 하기 표 6에서 나타낸다.
Figure 112005502258832-pct00405
본 발명의 기타 p38 저해제도 p38의 ATPase 활성을 저해할 것이다.
C. LPS에 의해 자극받은 PBMCs에서의 IL-1, TNF, IL-6 및 IL-8 생성의 저해
저해제들을, 20 mM 저장 용액으로부터 DMSO 중에 연속적으로 희석했다. 적어도 6개의 일련의 희석액을 제조했다. 이어서, 4 ㎕의 저해제 희석액을 1 ml의 RPMI1640 배지/10%의 태아 소의 혈청에 첨가하여 4x 저해제 저장 용액을 제조했다. 상기 4x 저해제 저장 용액은 80 μM, 32 μM, 12.8 μM, 5.12 μM, 2.048 μM, 0.819 μM, 0.328 μM, 0.131 μM, 0.052 μM, 0.021 μM 등의 농도로 저해제를 함유했다. 이들 4x 저해제 저장 용액은 사용할 때까지 37℃에서 예비가온했다.
1500 x g에서 15분간 원심분리하여, 벡톤 & 디킨슨(Becton & Dickinson)에서 제조한 바큐테이너(Vacutainer) CPT(튜브를 채우기 위해 Mg2+/Ca2+이 없는 충분한 DPBS 및 4 ml의 혈액을 함유)내의 다른 세포로부터 신선한 사람 혈액의 담황갈색 세포를 분리했다. 바큐테이너내 최상단의 농도 구배에 위치한 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 제거하고 RPMI1640 배지/10% 태아 소의 혈청으로 2회 세척했다. 500 x g에서 10분간 원심분리하여 PBMCs를 수집했다. 뉴바우어(Neubauer) 세포 챔버를 사용하여 전체 세포수를 측정하고, 세포 배양 배지(10%의 태아 소의 혈청을 보충한 RPMI1640) 내에 4.8 x 106 세포수/ml의 농도가 되도록 세포를 조정했다.
대안적으로, 항응고제를 함유하는 전혈을 이 분석에서 직접 사용했다.
본 출원인들은 96-웰 세포 배양 플레이트의 각 웰 내에 100㎕의 세포 현탁액 또는 전혈을 넣었다. 이어서, 세포에 50 ㎕의 4x 저해제 저장 용액을 첨가했다. 마지막으로, 50 ㎕의 지다당류(LPS) 작용 저장 용액(세포 배양 배지 중 16 ng/ml)을 첨가해서, 분석에서 최종 농도가 4 ng/ml인 LPS를 수득했다. 50 ㎕의 세포 배양 배지를 첨가하여, 비이클 대조군의 전체 분석 부피를 200 ㎕로 조정했다. 이어서, PBMC 세포 또는 전혈을 습한 분위기 중 37℃/5% CO2에서 밤새(12 내지 15시간동안) 항온처리했다.
다음 날, 500 x g에서 5분동안 원심분리하기 전에 3 내지 5분간 진탕기 상에서 세포를 혼합했다. 세포 배양 상청액을 수확하고, IL-1b (R & D 시스템즈, 퀀티킨 키트, #DBL50), TNF-α(바이오소스, #KHC3012), IL-6 (엔도겐, #EH2-IL6) 및 IL-8 (엔도겐, #EH2-IL8)의 레벨을, 제조사의 지시에 따라 ELISA에 의해 분석했다. ELISA 데이터를 사용하여 IC50 수치가 유래된 용량-반응 곡선을 생성했다.
키나아제 분석(“키나아제”; 서브섹션 A, 상기), LPS에 의해 자극받은 PBMCs(“세포”)에서의 IL-1 및 TNF, 및 본 발명의 다양한 p38 저해제에 대한 전혈(“WB”)에서의 IL-1, TNF 및 IL-6에 대한 결과를 하기 표 7에서 나타낸다.
Figure 112005502258832-pct00406
Figure 111999006289858-pct00323



Figure 111999006289858-pct00373
Figure 111999006289858-pct00324



Figure 111999006289858-pct00325


Figure 111999006289858-pct00326



Figure 111999006289858-pct00374
Figure 111999006289858-pct00327
키나아제 IC50 수치에 있어서,“ +++”는 < 0.1 μM을, “ ++”는 0.1 μM 내지 1.0 μM을, 및“ +”는 > 1.0 μM이라는 것을 나타낸다. 세포의 IL-1 값 및 TNF 값에 있어서,“ +++”는 < 0.1 μM을,“ ++”는 0.1 μM 내지 0.5 μM을, 및“ +”는 > 0.5 μM이라는 것을 나타낸다. 모든 전혈(“ WB”) 분석치에 있어서,“ +++”는 < 0.25 μM을,“ ++”는 0.25 μM 내지 0.5 μM을, 및“ +”는 > 0.5 μM이라는 것을 나타낸다. 상기 표에 나타낸 모든 분석에서,“ N.D.”는 수치가 측정되지 않았다는 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 p38 저해제도 또한 EGF 수용체 펩티드의 인산화, 및 LPS에 의해 자극받은 PBMCs 또는 전혈에서 IL-8 뿐 아니라 IL-1, TNF 및 IL-6의 생성을 저해할 것이다.
D. IL-1에 의해 자극받은 PBMCs에서 IL-6 및 IL-8의 생성의 저해
이 분석은, (LPS) 작용 저장 용액 대신에 50 ㎕의 IL-1b 작용 저장 용액(세포 배양 배지 중 2 ng/ml)을 분석에 첨가하는 것을 제외하고는, 전술한 것과 완전히 동일하게 PBMCs 상에서 수행되었다.
세포 배양 상청액을 전술한 것과 같이 수확하고, IL-6 (엔도겐, #EH2-IL6) 및 IL-8 (엔도겐, #EH2-IL8)의 레벨을, 제조사의 지시에 따라 ELISA에 의해 분석했 다. ELISA 데이터를 사용하여 IC50 수치가 유래된 용량-반응 곡선을 생성했다.
p38 저해제 화합물 6에 대한 결과를 하기 표 8에서 나타낸다.
Figure 112005502258832-pct00407
E. PBMCs에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘 엔도퍼옥사이드 신타아제-2(PGHS-2, 또는 COX-2) 유도의 저해
바큐테이너 CPT(벡톤 & 디킨슨) 내에서 원심분리하여 신선한 사람 혈액의 담황갈색 코우트(coat)로부터 사람 말초의 단핵 세포(PBMCs)를 분리했다. 본 출원인들은 10% 태아 소의 혈청, 50 U/ml의 페니실린, 50 ㎍/ml의 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 보충한 RPMI 1640을 함유하는 6-웰 조직 배양 접시내에 15 x 106 개의 세포를 심었다. 화합물 6(상기)을 DMSO 중 0.2 μM, 2.0 μM 및 20 μM의 최종 농도로 첨가했다. 이어서, 4 ng/ml의 최종 농도로 LPS를 첨가해서 효소 발현을 유도했다. 최종 배양 부피는 10 ml/웰이었다.
37℃, 5% CO2에서 밤새 항온처리한 후, 긁어서 원심분리하여 세포를 수확했다. 이어서, 상청액을 제거하고, 세포를 빙냉된 DPBS (둘베코의 인산염 완충 염수, 바이오휘타커) 내에서 2회 세척했다. 세포를 1 ㎕의 벤조나아제[머크(Merck)의 DNAse]를 함유하는 저온의 용해(lysis) 완충액[20 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 150 mM NaCl, 1% 트리톤-X-100, 1% 데옥시콜린산, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 2% 아프로티닌(aprotinin, 시그마), 10 ㎍/ml 펩스타틴, 10 ㎍/ml의 류펩틴, 2mM PMSF, 1 mM 벤자미딘, 1 mM DTT] 50 ㎕중에서, 얼음상에서 10분간 용해시켰다. BCA 분석(피어스) 및 소의 혈청 알부민을 표준으로 사용하여, 각 샘플의 단백질 농도를 측정했다. 이어서, 저온의 용해 완충액을 사용하여, 각 샘플의 단백질 농도를 1 mg/ml로 조정했다. 100 ㎕의 용해물에 동일한 부피의 2xSDS PAGE를 부하한 완충액을 첨가하고, 이 샘플을 5분간 비등했다. 단백질(30 ㎍/lane)은 4∼20% SDS PAGE 농도 구배 겔(노벡스) 상에 크기별로 분획된 후, 20% 메탄올을 함유하는 토우빈 전이 완충액(25 mM 트리스, 192 mM 글리신)내, 100 mA에서 2시간동안 전기영동 방법으로 니트로셀룰로오스 막 위로 전이되었다. 이 막을, 차단(blocking) 완충액(0.1% 트윈-20을 보충한 DPBS 중 5% 비지방 건조 우유)으로 실온에서 1시간동안 예비처리하고, DPBS/0.1% 트윈-20 내에서 3회 세척했다. 이 막을, 차단 완충액 중에 모노클로날 항-COX-2 항체(트랜스덕션 연구소)의 1:250 희석액으로 4℃에서 밤새 항온처리했다. 이 막을 DPBS/0.1% 트윈-20 중에서 3회 세척한 후, 차단 완충액 중, 마우스 Ig(아메르샴)에 대한, 호오스래디시(horseradish) 퍼옥시다아제가 접합된 양의 항혈청의 1:1000 희석액과 함께 실온에서 1시간동안 항온처리했다. 이어서, 이 막을 다시 DPBS/0.1% 트윈-20 중에서 3회 세척하고, ECL 검출 시스템(Super SignalTM CL-HRP 기질 계, 피어스)을 사용하여 COX-2의 발현 레벨을 측정했다.
전술한 분석의 결과는, 화합물 6이 PBMCs 중에서 LPS에 의해 유도된 PGHS-2의 발현을 저해한다는 것을 나타낸다.
본원에서 본 발명의 다수의 구체예들을 제시했으나, 기본적인 구조는 본 발명의 방법을 사용하는 기타 구체예들을 제공하기 위해 변경될 수 있다는 것이 명백 하다.

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  16. 다음 화합물(2),(3), (5) 내지 (53)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 712005502771311-pct00463
    Figure 712005502771311-pct00464
    Figure 712005502771311-pct00465
    Figure 712005502771311-pct00466
    Figure 712005502771311-pct00446
  17. 다음 화합물(101) 내지 화합물(145)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 712005502771311-pct00467
    Figure 712005502771311-pct00468
    Figure 712005502771311-pct00469
    Figure 712005502771311-pct00450
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  22. 다음 화합물(201), (203) 내지 (209)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 712005502771311-pct00452
  23. 다음 화합물(202/301) 내지 (399) 및 (1301)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 712005502771311-pct00453
    Figure 712005502771311-pct00454
    Figure 712005502771311-pct00470
    Figure 712005502771311-pct00456
    Figure 712005502771311-pct00457
    Figure 712005502771311-pct00471
    Figure 712005502771311-pct00472
    Figure 712005502771311-pct00473
  24. 다음 화합물(401) 내지 화합물(412)로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
    Figure 712005502771311-pct00461
    Figure 712005502771311-pct00462
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  26. 염증성 질병, 자가면역 질환, 바이러스성 질병, 파괴성 골질환, 증식성 질병, 감염성 질병, 신경 퇴행성 질병, 알러지, 졸증에서의 재관류(reperfusion)/허혈 또는 심근허혈, 신장허혈, 심장 발작, 맥관 형성성 질병, 장기 저산소증, 혈관 과형성, 심장 비대증, 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집, 부종, 발열, 진통 또는 통증을 치료 또는 예방하기 위한, 제16-17항 또는 제22-24항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 급성 췌장염, 만성 췌장염, 천식, 알러지, 또는 성인 호흡 곤란 증후군에서 선택되는 염증성 질병인 약학 조성물.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 사구체 신염, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 경피증, 만성 갑상선염, 그레이브스 병, 자가면역 위염, 당뇨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 호중구감소증, 혈소판 감소증, 아토피성 피부염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론 병, 건선, 또는 이식편 대 숙주의 질병에서 선택되는 자가면역 질환인 약학 조성물.
  29. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 골관절염, 골다공증 또는 다발성 골수종과 관련된 골의 질환에서 선택되는 파괴성 골질환인 약학 조성물.
  30. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 전이성 흑색종, 카포시 육종, 또는 다발성 골수종에서 선택되는 증식성 질병인 약학 조성물.
  31. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 패혈증, 패혈성 쇼크 또는 세균성 이질에서 선택되는 감염성 질병인 약학 조성물.
  32. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 급성 간염 감염, HIV 감염 또는 CMV 망막염에서 선택되는 바이러스성 질병인 약학 조성물.
  33. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 뇌성 허혈 또는 외상적 손상에 의한 신경 퇴행성 질병에서 선택되는 신경 퇴행성 질병인 약학 조성물.
  34. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 졸증 또는 심근 허혈에서의 허혈/재관류, 신장 허혈, 심장 발작, 장기 저산소증 또는 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집인 약학 조성물.
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  36. 제26항에 있어서,
    상기 통증이 신경근육통, 두통, 암의 통증, 치통 또는 관절염의 통증에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  37. 제26항에 있어서,
    상기 질병이 고형 종양, 눈의 혈관 신생, 또는 영아의 혈관종에서 선택되는 맥관 형성성 질병인 약학 조성물.
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US8/822,373 1997-03-20
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