DK170352B1 - Fremgangsmåde og apparat til immunanalyser - Google Patents

Description

i DK 170352 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse eller koncentration af en udvalgt ligand i en prøve på væskeform. Især angår den immunana-lysefremgangsmåder og først og fremmest de, der anvender 5 monoklone antistoffer. I en anden udførelsesform angår den et apparat til udførelse af sådanne analyser.

I næsten 20 år har immunanalysefremgangsmåder været sensitive diagnostiske midler til in vitro bestemmelse af et antal antigener associeret med sygdom 10 eller andet af klinisk betydning. Oprindelig anvendte man ved sådanne heterogene analyser en polyklonal antistofpræparation, der var bundet til fast fase. I sådanne analyser lader man en opløsning af mærket antigen konkurrere direkte med antigen i den prøve, der skal 15 analyseres for antistof i fast fase eller som tilsættes antistoffet i en trinvis proces. Den udstrækning det mærkede antigen er bundet til den faste fase eller kan påvises i den væskeformige fase, kan benyttes som mål for tilstedeværelse og mængde af antigen i den prøve, 20 der skal analyseres.

Senere blev immunometriske analyser, der ikke var baseret på konkurrence, mulige. I disse analyser benyttede man også en polyklonal antistofpræparation bundet til en fast fase. Man lod prøven, der eventuelt inde-25 holdt antigen, komme i kontakt med den faste fase, så antigenet kunne binde til antistofferne på den faste fase. Typisk lod man efter en inkubationsperiode prøven adskille fra den faste fase, som man derefter udvaskede og inkuberede med en opløsning af yderligere polyklonale 30 antistoffer, som var blevet mærket f.eks. med et radio-nuclid, et enzym eller en fluorescerende gruppe.

Efter denne anden inkubation skilte man det mærkede antistof, der ikke var bundet, fra den faste fase, og bestemte mængden af mærket antistof i enten den væ-35 skeformige eller bundet til den faste fase i en antistof: antigen: antistof kombination som et mål for tiiste- 2 DK 170352 B1 deværelse og/eller koncentration af antigen i den undersøgte prøve.

Senere er immunanalysefremgangsmåder blevet ændret, så de benytter monoklonale antistoffer. F.eks.

5 beskriver U.S. patent nr. 4.376.110 to-position immuno-metriske analyser, der benytter par af monoklonale antistoffer, det ene bundet til en fast fase, og det andet mærket, så det kan påvises. Anvendelsen af par af monoklonale antistoffer, som genkender forskellige epitop-10 positioner på et antigen, har gjort det muligt samtidig at udføre immunometriske analyser, hvor inkubationerne med antigen og mærket antistof ikke kræver de mellemliggende vasketrin, som tidligere fremgangsmåder krævede.

I de nævnte fremgangsmåder er antistoffet på fast 15 fase typisk bundet til en lille kugle eller små partikler eller er overtrukket en overflade. Alle disse fremgangsmåder kræver typisk en inkubationstid, både med den faste fase og de mærkede antistoffer og som følge heraf tager de tid, selvom de udføres samtidigt. Det er i vir-20 keligheden ikke ualmindeligt, at det kræver adskillige timer at udføre en analyse. Derudover har nødvendigheden af at benytte tidsafmålte inkubationstrin og adskillige udvaskninger med afmålte reagenser i det store og hele begrænset benyttelsen af disse fremgangsmåder til store 25 hospitaler og store kliniske laboratorier, der benytter højt uddannet personale og raffineret udstyr til analyserne. Derfor er der stadig et behov for en simpel og hurtig fremgangsmåde til at udføre immunanalyser, som benytter et relativt simpelt apparat, så sådanne analy-30 ser kan udføres hos den private læge og endog hjemme af utrænede personer, når de køber et sådant apparat.

US patent nr. 4.246.339 beskriver et apparat til analyse af væskeprøver, hvilket apparat omfatter teleskopiske top- og bunddele. Bunddelen indeholder prøve-35 brønde, hvis bund i hvert tilfælde er en mikroporøs membran, på hvis hele overflade en medreaktant er immobili- 3 DK 170352 B1 seret. Bunddelen indeholder et absorberende middel. Elastiske indretninger får delene til at stå i åben position, hvor de ikke er i kontakt med hinanden. Assayreak-tionen finder sted, når apparatet står i- åben position, 5 dvs. at de to dele ikke er i kontakt med hinanden. Når en for reaktionen tilstrækkelig tidsperiode er forløbet, presser man midlertidigt topdelen ned til kontakt med den anden del, hvorved væsken i hver brønd kan passere ind i absorptionsmidlet i den anden del.

10 US patent nr. 4.002.532 beskriver konjugater mel lem enzymer og makromolekyler tilvejebragt ved konjugation med polyfunktionelle reagenser i nærvær af organiske forbindelser, der tilpasser reaktionsbetingelserne. Konjugaterne er egnede til påvisning og mængdebestemmel-15 se af stoffer såsom IgE i biologiske væsker.

US patent nr. 3.843.324 beskriver fibre, der er udspændt på en ramme eller vævet på form af et i det væsentlige stift netværk, og til hvilke er bundet materialer indeholdende immunreaktive grupper. Produktet kan 20 benyttes til selektiv fjernelse af celler fra væsker.

US patent nr. 4.298.685 beskriver et assay, i hvilket en prøve indeholdende et antigen eller hapten blandes med antistoffer frembragt mod denne substans, der er blevet mærket med biotin og med en kendt mængde 25 af denne substans mærket med et enzym. Efter den konkur- . rerende kompleksdannelse af antistoffet med den mærkede substans og substansen til påvisning, tilsætter man avi-din immobiliseret på en inert bærer. Dette avidin binder til biotin og medfører, at komplekset udfældes. Adskil-30 lelse af faste faser og væskefaser og måling af aktiviteten af enzymet i en af faserne tillader bestemmelse af mængden af substansen til analyse i prøven.

Opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde, hvorved man simpelt og hurtigt udfører ligand-receptor-35 analyser, f.eks. immun- og immunometriske analyser og analyser, som udnytter hybridiseringen af nucleinsyre- 4 DK 170352 B1 oligomerer, som benytter et simpelt apparat og som ikke kræver lange inkubationstider. Apparatet ifølge opfindelsen er ejendommelig ved at omfatte (a): en porøs første del, som har en øvre og en 5 nedre overflade og er anbragt i apparatet, så prøven kan sættes på den øvre overflade, og hvori mindst en første receptor, der kan binde til den udvalgte ligand, eller mindst en antireceptor, der kan binde til den udvalgte ligand, er direkte 10 bundet inden for et areal, der er mindre end det areal af delen, som prøven kan sættes på.

F.eks. er i tilfælde af immun- og immunometriske analyser, hvor liganden er et antigen, et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof, bundet til den porøse 15 del som receptor.

Apparatet er yderligere ejendommeligt ved at omfatte (b): en anden del, som udgøres af absorberende materiale med en overflade, over hvilken den ned-20 re overflade af den første del er anbragt, den anden del er gennemtrængt af kapillarrør i en retning alment vinkelret på den overflade, over hvilken den første del er anbragt, hvilke kapillarrør står i forbindelse med porerne i den nedre 25 overflade af den første del, således at væske sat på den øvre overflade af første del og som har gennemtrængt denne vil blive trukket ind i kapillarrørene i anden del; idet den første og den anden del er anbragt således i apparatet, at for-30 bindelse heri mellem er tilvejebragt før, og op retholdt under tilsætning af væske til apparatet ved analyse.

Heri benyttes betegnelsen "kapillær" til at betegne et kapillarrør eller anden kanal eller gennem- - 35 gangsvej som tillader væsken at passere gennem den absorberende del.

5 DK 170352 B1

Den anden del kan også fungere som understøtning for første del.

Analysen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 14's kendetegnende del angivne og består af 5 følgende trin: Man sætter en væskeformig prøve til den porøse del, og mens væsken flyder gennem delen, vil receptoren, der er bundet til den porøse del, binde opløselig eller suspenderet ligand i prøven med en betydelig større hastighed end den, man observerer, når der 10 ikke løber væske gennem prøven. I denne udførelsesform af opfindelsen følges tilføjelsen af prøven af tilføjelse af en opløsning af en anden receptor for liganden; denne er mærket, så den kan påvises. F.eks. benytter man i en immunometrisk analyse for antigen en opløs-15 ning af antistof, fortrinsvis monoklonalt antistof, som binder antigenet ved en epitop, som ikke vekselvirker med binding af den første receptor. Den foretrukne mærkning er med et enzym, selvom man kan mærke på andre måder f.eks. ved hjælp af et radionuclid eller ved 20 fluorscerende mærkning. Antistoffet binder sig til antigenet, der tidligere er ekstraheret fra prøven, enten ved hjælp af det bundne antistof eller ved indfangning af cellulært materiale. Tilsætning af mærket antistof kan øjeblikkelig eller efter en kort inkubationstid, for 25 at forøge følsomheden ved at tillade større binding af antigen og mærket antistof, efterfølges af et vasketrin, hvorved man fjerner ikke bundet mærket antistof. Tilstedeværelsen af mærket antistof på den porøse del kan så bestemmes og benyttes som indikation for nærvæ-30 reisen af det udvalgte antigen i prøven. Hvis man benytter enzymmærkning, gøres dette ved tilsætning af en opløsning af et farvedannende substrat til den porøse del, så substratet kan reagere med enzymet.

Fig. 1 er et tværsnit af et apparat til udførelse 35 af en immunanalyse ifølge opløsningen.

Fig. 2 er et billede set fra oven af en porøs del anvendt i opfindelsen til at fjerne antigen fra en prøve, der skal analyseres.

6 DK 170352 B1

Som nævnt ovenfor indeholder apparatet ifølge opfindelsen som en første del en porøs membran eller et filter, til hvilken er bundet en receptor for en ligand eller en anti-receptor. Der kan bruges hvilke som helst 5 af en stor gruppe filtre inkluderende glasfiberfiltre og filtre af forskellige syntetiske og naturlige materialer .

Når den porøse del har en receptor bundet til sig, vælger man receptoren ud fra dens evne til at binde 10 selektivt direkte med den udvalgte ligand. F.eks. kan receptoren være et antistof, hvis liganden er et antigen og med fordel være et monoklonalt antistof. Hvis den udvalgte ligand er et antistof, kan receptoren være et antigen eller et anti-antistof. Hvis liganden er et enzym, 15 kan receptoren være en receptor for enzymet. Hvis liganden er en nucleinsyre, f.eks. RNA eller DNA, kan receptoren være en komplementær oligomer af DNA eller RNA. I en foretrukken udførelsesform består første del af en membran eller et filter, til hvilket en antistofpræpara-20 tion er bundet kovalent. Med fordel består antistofpræparationen af et monoklonalt antistof, selvom polyklona-le antistoffer fra antisera kan anvendes. Fremstilling af polyklonale og monoklonale antistofpræparationer er nu velkendte og behøver ingen referencer her.

25 Materialet til den porøse del vælges blandt mate rialer, som receptoren eller eventuelt anti-receptoren er i stand til at binde til. I tilfælde af protein-receptorer eller anti-receptorer f.eks. antistoffer eller antigener er et foretrukket materiale nylon, som besid-30 der aminogrupperester eller som af kemisk vej har fået sådanne grupper indført, som tillader et protein at blive tilkoblet ved den velkendte glutaraldehydmetode. Antistoffer kan kobles til glasfibre ved hjælp af amino-silaner. Andre naturlige eller syntetiske materialer, 35 som kan kobles direkte eller via mellemled til en receptor, kan også anvendes.

7 DK 170352 B1 I det foregående betones kemisk binding af recep- · toren eller anti-receptoren til den porøse del. Imidlertid kan i udvalgte tilfælde receptoren eller anti-re-ceptoren være et overtræk på den porøse del eller være i 5 form af småpartikler, som er fysisk indespærret i den porøse del. Derfor vil ordet "bundet" i denne sammenhæng omfatte enhver måde til at binde receptor eller anti-re-ceptor til den porøse del.

Anden del af apparatet er en absorberende del, 10 som har kapillære åbninger gennem sig, i almindelighed på tværs af den øvre og den nedre overflade. Den anden del samles med den første på en måde, så der er direkte forbindelse mellem porerne eller åbningerne i den første del og kapillarrørene i anden del. Når en væske således 15 påsættes den første del og gennemtrænger den, vil væsken blive trukket ind i den absorberende del. Som et resultat af dette kan man inducere væskegennemstrømning i første del, når man anbringer en væske på dens øvre overflade, selvom det hydrostatiske tryk af væsken er så 20 lavt, at den ikke uden hjælp ville flyde igennem første del, f.eks. ved et tryk der skulle presse den igennem eller ved et vakuum, der skulle trække den igennem.

Valget af materiale til den anden del er ikke kritisk, og man kan anvende en række fibrøse filterma-25 terialer. Et nyttigt materiale er celluloseacetatfibre orienteret som i et cigaretfilter. En fagmand vil kunne se, at andre absorberende materialer af polyester, polyolefin eller andet kan anvendes istedet for celluloseacetat.

30 I fig. 1 vises i tværsnit en indretning, som kan benyttes med apparatet ifølge opfindelsen for at udføre analyserne. I fig. 1 vises en cylindrisk beholder 10, den kan dog have andre passende former, med en øvre åbning 12, defineret ved sidevæggene 14. Beholderen kan 35 fremstilles af glas, plast eller andet passende materiale. Som vist i fig. l, har beholder 10 også en nedre DK 170352 B1 θ åbning 16, i hvilken findes en prop 18, der kan fjernes, til brug for anbringelse af den porøse del 20, en cirkulær membran eller filterskive og en eventuel del 21, hvis funktion beskrives nedenfor, og som hviler på 5 den cylinderformige absorberende del 22, som også anbringes i apparatet gennem åbningen 16.

En del af beholderen 10 er indsnævret som vist i fig. 1 ved nr. 24, så der dannes en slags tragt, hvorigennem en prøve kan rettes mod del 20, og ved hjælp af 10 hvilken man kan sikre, at analysen og andre reagenser inklusive skyllemidler dirigeres direkte ned på delen 20.

Størrelsen af del 22 og følgelig rumfanget af den del af beholder 10, der ligger under indsnævrin-15 gen, vælges med fordel således, at hele den væskemængde, der skal tilføres apparatet under en analyse, kan rummes i den absorberende del 22. Der findes ventilationshuller (ikke vist i fig. 1), f.eks. små porer i beholder 10 nær bunden, så overskudsluft kan undslippe. Eventuelt 20 kan man undlade bunden af beholder 10 og tillade væske at passere gennem delene 20 og 22 og tømme beholderen gennem bunden, men da man ønsker, at apparatet med indhold skal være let at kassere på en nem og hygiejnisk måde, foretrækkes det at anvende en struktur som vist i 25 fig. 1. _

Som tidligere bemærket anvendes delen 20 som bæremateriale for bunden receptor for den ligand, der skal analyseres, idet man tilsætter den væskeformige analyse til delen 20 gennem åbningen 12. Efter at prøven har 30 gennemtrængt delen 20 og væsken er bleven trukket igen nem denne og ned i den absorberende del 22, kan man tilsætte en opløsning af mærket receptor gennem åbning 12 til delen 20.

Den mærkede receptor binder så til liganden bun- 35 det til receptoren til delen 20. Hvis der foreligger en immunometrisk analyse og hvis delen 20 har et monoklo- 9 DK 170352 B1 nalt antistof bundet til sig og det mærkede antistof også er et monoklonalt antistof, udvælger man de to antistoffer, så de bindes til ikke vekselvirkende antigenbindende positioner som beskrevet i U.S. patenter nr.

5 4.376.110 og 4.486.530.

Det foretrækkes, at den opløselige receptor er mærket med et enzym, selvom man kan anvende andre konventionelle analysemærkninger under passende omstændigheder. F.eks. kan man anvende en fluorescerende mærkning 10 såsom fluorescein eller phycoerythrin, eller man kan anvende et radionuclid. Nyttige mærkningsmidler involverer også mikrokugler fyldt med et farvestof eller med fluorescerende partikler. Andre anvendelige mærkninger kan være liposomer eller andre små beholdere fyldt med 15 et farvestof eller fluorescerende partikler.

Efter at opløsningen af den mærkede receptor har passeret gennem delen 20, tilsætter man en vaskevæske til delen 20, så ikke bundet mærket receptor kan blive skyllet bort fra delen 20 og ind i delen 22. Den 20 indadskrånende struktur af væggene 24 tilvejebringer en slags tragt, så det bliver lettere at skylle væggene med vaskevæsken, så eventuelle rester af opløsning af mærket receptor kan fjernes.

Inden tilsætning af mærket receptoropløsning og 25 vaskevæske til delen 20 kan man benytte korte inkubationsperioder for at opnå kraftigere binding af receptor eller ligand i opløsning, der befinder sig i mellemrummene på delen 20 og derved forøge analysens følsomhed. Vi har imidlertid fundet, at sådanne inkubations-30 trin enten er unødvendige eller kan nøjes med at være meget korte, dvs. i almindelighed af størrelsesordenen 60 sekunder eller mindre. Gennemstrømningen af væske, der indeholder ligand eller bunden receptor gennem delen 20, fører til en meget større bindingshastighed end man 35 observerer uden gennemstrømning.

Hvis receptoren er mærket med et enzym, vil man efter udvaskningen til at fjerne ikke bunden receptor 10 DK 170352 B1 fra delen 20 sætte en opløsning af enzymsubstratet til delen 20. Hvis den udvalgte ligand er bundet til en receptor bundet til delen 20, vil liganden til sig have bundet noget mærket receptor. Enzymet vil få substratet 5 til at reagere, og man vil ved korrekt valg få en synlig farveændring.

Vi har fundet, at celluloseacetat anvendt som materiale til den absorberende del 22 kan binde mærket receptor uspecifikt på sin øvre overflade. Der kan der-10 for optræde en vis farveændring ved denne overflade lige under delen 20. Por at undgå, at denne farveændring skal kunne ses gennem delen 20, kan man anbringe en adskillende del (betegnet 21 i fig. 1) af porøs poly-ethylen eller andet materiale, som ikke binder receptor 15 uspecifikt, mellem delene 20 og 22.

I fig. 2 vises delen 20 set ovenfra. Den stiplede linie 26 repræsenterer den ydre omkreds af det areal 28, i hvilket liganden bindes. Dette areals diameter er mindre end diameteren af den indsnævring, der 20 dannes af væggene 24 på det snævreste sted. Når man anvender et enzym som mærkning på receptoren, kan man få følgende resultater: (1) hvis der udvikles mere farve i arealet 28 end i periferien af delen 20, vil man . aflæse et positivt resultat; (2) hvis der ingen farve 25 udvikles i delen 20, vil man læse det som et negativt resultat; (3) hvis der efter vask stadig findes noget mærket receptor i delen 20, vil man se en beskeden farveændring, som er ensartet over hele den synlige overflade. Et sådan resultat må også fortolkes som negativt.

30 I det foregående er givet en almindelig beskri velse af apparatet og fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Der kan med dette udføres en immunanalyse på mindre end 5 minutter regnet fra indførelsen af prøven til aflæsning af et positivt resultat. I et specifikt eksempel 35 binder man et monoklonalt antistof imod human choriogonadotropin (HCG), et antigen, der udvikles i urin hos 11 DK 170352 B1 gravide kvinder, til en porøs nylonmembran ved hjælp af glutaraldehydfremgangsmåden og anbringer denne i en beholder såsom nr. 10 i fig. 1, hvor den understøttes af en absorberende del af celluloseacetat, som den er ad-5 skilt fra ved hjælp af en skive af porøs polyethylen.

Der tilsættes urinprøver (4 ml der indeholder 0 og 50 mlU/ml af HCG) til det beskrevne apparat og disse trækkes gennem delene 20 og 21 ind i det absorberende materiale 22. Derefter tilsættes tre (3) dråber 10 af en opløsning af andet monoklonalt antistof imod HCG, til hvilket der er bundet alkalisk phosphatase. Efter en kort inkubationstid, omkring l minut, hvorunder denne kombination trækkes gennem delen 20, tilsætter man 4 ml vand for at fjerne ikke bundet antistof fra delen 15 20. Efter denne tilsætning tilsætter man tre dråber af en opløsning, der indeholder indoxylphosphat, et substrat for alkalisk phosphatase. Efter to minutter var ingen farve udviklet i indretningen, der blev benyttet til at analysere prøven, der ingen HCG indeholdt (0 20 mlU/ml). Ved 50 mlU/ml HCG prøven udvikledes en tydelig blå farve i midten af skiven i løbet af 30 sekunder og i løbet af 2 minutter blev den mørkeblå. Der udvikledes ingen farve i periferien af skiven. Hele analysen varede ca. fem minutter. Man må bemærke, at analysens følsomhed 25 kan tilpasses ved hjælp af variation af rumfang eller inkubationstider.

Selvom opfindelsen er blevet beskrevet med en analyse for HCG som eksempel, bør man bemærke, at der kan konstrueres lignende analyser for andre antigener.

30 Hele listen af udvalgt antigener er for lang til at give her, men antigener såsom IgE, prostatisk sur phosphatase, prostatisk specifikt antigen, α-fetoprotein, carci-noembryonisk antigen, leuteniserende hormon, kreatinki-nase MB og andre antigener i serum, plasma, urin eller 35 andre væskeformige medier kan påvises. Derudover kan væskeformige prøver, der indeholder materiale med associe- 12 DK 170352 B1 rede antigener såsom antigener associeret med bakterier, parasitter, svampe eller vira omfattende f.eks. gruppe A og B streptococcus, Neisseria gonorrhea, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, 5 Chlamydia trachomatis, hepatitis B og cytomegalovirus påvises ved brug af et filter, til hvilket antistof, der er specifikt for antigenet, er bundet som del 20. Tilsætning af en opløsning af et monoklonalt antistof, der f.eks. er mærket med et enzym, vil føre til binding af 10 antistoffet til antigenet. Udvaskning og tilsætning af et substrat vil føre til, at farveændringen associeret med tilstedeværelse af det mærkede antistof på cellerne udvikles, og denne kan påvises visuelt eller ved hjælp at et instrument.

15 Hvis der benyttes en anden mærkning end enzym mærkning, kan man ændre fremgangsmåden. Man kan måle membranens fluorescens, hvis der anvendes en fluorescerende mærkning. Hvis der anvendes en radionuclidmærkning såsom 125I, kan man fjerne membranen og anbringe den i 20 en tæller.

I det foregående har vi belyst anvendelsen af opfindelsen til trinvise immunometriske analyser med mo-noklonale antistoffer, dvs. en immunanalyse, der benytter en første monoklonal antistofreceptor på den porøse 25 del og en anden monoklonal antistof receptor som er mærket. Man sætter først prøven til den porøse del og derefter det mærkede antistof. Andre varianter af analysen er mulige. F.eks. kan man ved en immunometrisk analyse blande det mærkede antistof og prøven, før de sættes til 30 den porøse del.

Apparatet ifølge opfindelsen kan også anvendes i analyser for et antistof, som benytter et antigen som første receptor på fastfase form og som benytter mærket antigen eller mærket anti-antistof som anden receptor.

35 Det sidstnævnte er især brugbart til allergispecifikke analyser, hvor den første receptor er et allergen, der 13 DK 170352 B1 er bundet til den porøse del, og den anden receptor er et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof til IgE. I andre tilfælde kan man samtidig måle igG responsen til allergener, dvs. ved at benytte et antistof 5 såsom et monoklonalt antistof imod IgG som anden receptor. Andre antistofprøver som kan udføres på denne måde inkluderer prøver for antistoffer til herpes, rubella, hepatitis, cytomegalovirus og HTL-III.

I en anden udførelsesform for opfindelsen, som er 10 ejendommelig ved det i krav 21's kendetegnende del angivne, benytter man apparatet til at udføre konkurrerende analyser, dvs. analyser hvor ligandreceptoren er bundet til den porøse del, og hvor liganden i prøven konkurrerer med en bestemt mængde mærket ligand tilsat prø-15 veopløsningen, eller efter at prøveopløsningen er tilsat. Konkurrerende immunanalyser udføres konventionelt ved benyttelse af et antistof, f.eks. en monoklonal eller polyklonal antistofprasparation, som receptor bundet til den faste fase. Man kan sætte mærket antigen til 20 prøven, før denne sættes til den porøse del. Som alternativ kan det tilsættes, efter at prøven er tilsat eller samtidigt dermed.

Apparatet ifølge opfindelsen kan også anvendes til at påvise et enzym ved binding af enzymets receptor 25 til den porøse del som analysereceptor. Et mærket antistof mod enzymet kan benyttes til at påvise dannelsen af et receptor-enzymkompleks på den porøse del.

Den porøse del kan også præpareres med en nu-cleinsyreoligomer som sonde-receptor for nucleinsyrema-30 teriale i en prøve. Sonden kan være en oligomer af DNA, f.eks. komplementær til en sekvens i den aktuelle nu-cleinsyre og kan benyttes til at binde enten RNA eller DNA som ligand, efter hvad sagen drejer sig om. Påvisning af ligand-receptorkomplekset kan udføres ved brug 35 af en anden nucleinsyreoligomer, der er komplementær til en ikke-vekselvirkende region i den aktuelle nucleinsy- 14 DK 170352 B1 re, idet den anden oligomer er mærket, så den kan påvi ses.

Ved en yderligere udførelsesform af opfindelsen kan den porøse del have antireceptor bundet til sig.

5 Betegnelsen "antireceptor" skal her referere til midler, som vil binde selektivt til receptoren i et ligand-re- * ceptorpar. F.eks. hvis liganden er et antigen, og receptoren er et antistof, f.eks. et muse igG antistof (fortrinsvis et monoklonalt antistof) kan antireceptoren 10 være et antistof, fortrinsvis et monoklonalt antistof imod muse IgG. I andre tilfælde kan receptoren være konjugeret med en enhed, som binder selektivt til antireceptoren. F.eks. kan enheden være en hapten, og antireceptoren et antistof mod haptenen. En foretrukken hap-15 ten er fluorescein. I andre tilfælde kan antireceptoren være avidin. I dette tilfælde vil receptoren have biotin bundet til sig. I andre tilfælde kan receptoren være en oligomer af en nucleinsyre eller have en sådan oligomer bundet til sig, og antireceptoren kan være et seg-20 ment af en nucleinsyre, der er komplementær til en del af receptoroligomeren, som ikke forhindrer receptorens binding til liganden. Fagmanden vil af denne beskrivelse kunne se, at man kan anvende en stor mængde antirecep-tor:receptorkombinationer.

25 Når der benyttes en antireceptor, kan man ana- - lysere prøven på mange måder. F.eks. kan man i en "sandwich-analyse" kombinere første receptor og anden mærkede receptor med prøven, så liganden bliver bundet før den sættes til den porøse del. Eller, første recep-30 tor og prøven kan kombineres, før de sættes til den porøse del eller man tilsætter i rækkefølge første receptor og prøve, hvorefter den mærkede receptor tilsættes.

I sådanne sandwich-analyser udvælger man antireceptoren, så den binder til første receptor og ikke til den mærke-35 de receptor.

Anvendelse af en antireceptor, der er bundet til den porøse del, gør. det muligt at simplificere fremstil- 15 DK 170352 B1 ling og præparation af den porøse del til ligand-recep-toranalyser. F.eks. kan det, hvis receptoren er bundet til den porøse del, være nødvendigt at ændre bindingsfremgangsmåden for at optimere bindingen af hver recep-5 tor i en række analyser. Imidlertid kan en enkelt anti-receptor bundet til den porøse del anvendes i en lang række analyser. Derfor vil udvikling og fremstillingsmetoder blive meget simplere, når en sådan "universel" porøs del er mulig at fremstille.

10

Claims (28)

1. Apparat til brug i en ligand-receptor analysefremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelse eller 5 koncentration af en udvalgt ligand i en prøve på væskeform, kendetegnet ved at omfatte: (a) en porøs første del (20), som har en øvre og en nedre overflade og er anbragt i apparatet, så prøven kan sættes på den øvre overflade, og hvori 10 mindst en første receptor, der kan binde til den udvalgte ligand, eller mindst en antireceptor, der kan binde til den udvalgte ligand, er direkte bundet inden for et areal, der er mindre end det areal af delen, som prøven kan sættes på; og 15 (b) en anden del (22), som udgøres af absorberende materiale med en overflade, over hvilken den nedre overflade af den første del er anbragt, den anden del er gennemtrængt af kapillarrør i en retning alment vinkelret på den overflade, over 20 hvilken den første del er anbragt, hvilke kapil larrør står i forbindelse med porerne i den nedre overflade af den første del, således at væske sat på den øvre overflade af første del og som har gennemtrængt denne vil blive trukket ind i kapil-25 larrørene i anden del; idet den første og den an-· den del er anbragt således i apparatet, at forbindelse heri mellem er tilvejebragt før, og opretholdt under tilsætning af væske til apparatet ved analyse.

2. Apparat ifølge krav l, kendetegnet ved, at første del er en membran eller et filter.

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at liganden udvælges blandt antigener, antistoffer, enzymer og oligomerer af nucleinsyrer.

4. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at receptoren udvælges blandt anti- 17 DK 170352 B1 stoffer, fortrinsvis en polyklonal antistofpræparation eller et monoklonalt antistof, antigener, enzymreceptorer, og oligomerer af nucleinsyrer, fortrinsvis en oligomer af DNA.

5. Apparat ifølge krav 4, kendetegnet ved, at receptoren er et antigen og den udvalgte ligand er et antistof imod receptoren.

6. Apparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at antigenet er et allergen og antistoffet er et 10 antistof imod allergenet, fortrinsvis et igE eller et IgG.

7. Apparat ifølge et hvilket som helst af de forrige krav, kendetegnet ved, at den porøse første del består af et materiale udvalgt blandt glas 15 eller nylon.

8. Apparat ifølge et hvilket som helst af de forrige krav, kendetegnet ved, at apparatet yderligere omfatter en beholder (10) for første og anden del, og som besidder en åbning, der tillader tilførsel 20 af analysereagenser til første dels øvre overflade.

9. Apparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at åbningen yderligere indeholder en sektion med sider, der skråner indadtil, så at der herved defineres en tragt, hvorigennem de tilsatte reagenser kan føres ud 25 på den øvre overflade af første del.

10. Apparat ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at beholderens bund er lukket og at beholderen kan afluftes, så luft fortrængt af tilsatte reagenser kan undslippe.

11. Apparat ifølge et hvilket som helst af de forrige krav, kendetegnet ved, at den porøse første del har anti-receptor bundet til sig.

12. Apparat ifølge et hvilket som helst af de forrige krav, kendetegnet ved, at den første 35 receptor er et antistof og anti-receptoren er et antistof imod den første receptor, eller den første receptor 18 DK 170352 B1 er konjugeret med en hapten, fortrinsvis fluorescein, og anti-receptoren er et antistof imod haptenen, eller anti-receptoren er avidin, og den første receptor er konjugeret med biotin.

13. Apparat ifølge krav li eller 12, kendetegnet ved, at anti-receptoren er et monoklonalt * antistof.

14. Fremgangsmåde til analytisk bestemmelse af tilstedeværelse eller koncentration af en udvalgt ligand 10. en prøve på væskeform, kendetegnet ved, at man a) sætter en væskeformig prøve, der menes at indeholde den udvalgte ligand, på den øvre overflade af den porøse første del af et apparat ifølge krav 1, idet 15 denne første del har tilbundet en første receptor for liganden; b) på denne øvre overflade sætter en anden receptor, der kan binde den udvalgte ligand, og som er mærket, så den kan påvises; 20 c) fraskiller ikke bundet receptor, og d) bestemmer tilstedeværelse eller koncentration af den udvalgte ligand ved påvisning af den eventuelt tilstedeværende anden receptor, bundet til liganden, som er bundet til første receptor.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kende tegnet ved, at den første receptor bundet til den porøse del udvælges blandt antigener, antistoffer, enzymreceptorer og oligomerer af nucleinsyrer.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller 15, 30kendetegnet ved, at den første receptor og den anden receptor binder til liganden ved ikke-veksel-virkende positioner.

16 DK 170352 B1

17. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16, kendetegnet ved, at den ud- * 35 valgte ligand er en oligomer af en nucleinsyre, og den første og den anden receptor er komplementære oligomerer 19 DK 170352 B1 af nucleinsyrer, eller den udvalgte ligand er et antigen, og den første og den anden receptor er monoklonale antistoffer, eller den udvalgte ligand er et antistof, og den første og den anden receptor er antigener.

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kende tegnet ved, at receptorerne er oligomerer af DNA, og den udvalgte ligand er en DNA-oligomer eller en RNA-oligomer, eller den udvalgte ligand er et antistof, den første receptor er et antigen, og den anden receptor er 10 et antistof imod det udvalgte antistof.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 18, kendetegnet ved, at den udvalgte ligand er et IgE eller et igG, og den første receptor er et angigen, som er et allergen.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, kende tegnet ved, at den udvalgte ligand er et IgE, og den anden receptor er et monoklonalt anti-IgE, eller den udvalgte ligand er et IgG, og den anden receptor er et anti-IgG.

21. Fremgangsmåde til analytisk bestemmelse af tilstedeværelse eller koncentration af en udvalgt ligand i en væskeformig prøve under anvendelse af apparat ifølge krav ll, i hvilket den porøse del til sig har bundet anti-receptor til en første receptor for den udvalgte 25 ligand, kendetegnet ved, at man a) sætter den første receptor, der kan binde den udvalgte ligand, og væskeprøven, der menes at indeholde den udvalgte ligand, på den øvre overflade af den porøse første del; 30 b) sætter en anden, mærket receptor på denne øvre overflade; c) fraskiller ikke bundet anden receptor; og d) bestemmer tilstedeværelse eller koncentration af den udvalgte ligand ved bestemmelse af bundet, 35 mærket anden receptor.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at tilsætning af den første receptor følges af tilsætning af den væskeformige prøve. 20 DK 170352 B1

23. Fremgangsmåde ifølge krav 21, kendetegnet ved, at den første receptor blandes med den væskeformige prøve før tilsætning til den porøse del.

24. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af 5 kravene 21-23, kendetegnet ved, at den mærkede receptor sættes på den porøse del efter tilsætning af den væskeformige prøve.

25. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 21-23, kendetegnet ved, at den mærke- 10 de anden receptor sættes til den væskeformige prøve, førend denne sættes på den porøse første del.

26. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 21-25, kendetegnet ved, at anti-receptoren er et antistof.

27. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 14-20, kendetegnet ved, at man fraskiller ikke bundet mærket anden receptor ved vask.

28. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 14-16 og 21-25, kendetegnet ved, at 20 den udvalgte ligand er et antigen, antistof, enzym eller en oligomer af en nucleinsyre.