CZ299602B6 - Zpusob imunitního stanovení analytu v kapalném vzorku a systém pro kontinuální provádení identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny - Google Patents

Abstract

Vynález se týká zpusobu imunitního stanovení analytu v kapalném vzorku, jehož podstata spocívá v tom, že zahrnuje stupne zavedení reakcního kotouce do reakcní nádobky; pridání alespon jednoho kapalného reakcního cinidla, které se váže na povrch reakcního kotouce; pridání kapalného vzorku obsahujícího stanovovaný analyt, pricemž tento analyt se imunospecificky prímo nebo neprímo váže na reakcní cinidlo vázané na povrchu reakcního kotouce; a príménebo neprímé stanovení analytu vázaného na reakcním kotouci. Systém pro kontinuální provádení identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny obsahuje soubor reakcních nádobek (2) s aktivovanými reakcními kotouci (5), reakcními cinidly (10) a prostredky (11, 30) pro dávkování, prostredky (11a) pro míchání a prostredky pro stanovení, které jsou ovládány pocítacem(52).

Description

Způsob imunitního stanovení analytů v kapalném vzorku a systém pro kontinuální provádění identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu imunitního stanovení analytů v kapalném vzorku a systému pro kontinuální provádění identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny.

Dosavadní stav techniky

V mnoha imunostanoveních je zapotřebí zařadit separační stupeň. Známý způsob usnadňující tento proces spočívá v insolubilizaci činidla vazbou na ve vodě nerozpustný nosič tak, že jakýkoliv reakční produkt vzniklý reakcí mezi činidlem a vzorkem během imunostanovení se váže na nosič. Potom se může buď nosič, nebo zbylý reakční roztok nezávisle hodnotit, a to přímo nebo nepřímo na přítomnost a/nebo množství analytů kterého se stanovení týká. Příklady takovýchto systémů zahrnují papírové disky potažené alergenem ve známých setech RAST (obchodní značka) pro in vitro radioimunostanovení alergie.

V testu na alergii RAST (obchodní značka) se používají papírové disky s jedním navázaným alergenem. Proto je nutné při provedení série testů, zahrnující například 50 různých alergenů na jednom vzorku, zvolit 50 různých papírových disků, každý umístit do reakční nádobky a potom pokračovat v testu v každé z 50 různých nádobek. Uchovávání, vyhledávání, manipulace a umísťování až asi 600 různě navázaných disků (což odpovídá počtu alergenů pro které se stanovení vyžaduje) v jednotlivých nádobkách je komplikované. S disky není snadná manipulace a zajištění spolehlivého automatického provedení pro celkovou analýzu vzorku je obtížné.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky jsou podstatnou měrou eliminovány způsobem imunitního stanovení analytů v kapalném vzorku podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom. že zahrnuje stupně

5? a) zavedení reakčního kotouče do reakční nádobky;

b) přidání do reakční nádobky alespoň jednoho kapalného reakčního činidla, které se váže na povrch reakčního kotouče;

c) přidání do reakční nádobky kapalného vzorku obsahujícího stanovovaný analyt, přičemž tento analyt se imunospecificky přímo nebo nepřímo váže na reakční činidlo vázané na povrchu reakč40 ního kotouče; a

d) přímé nebo nepřímé stanovení analytů vázaného na reakčním kotouči.

Výhodně je reakčním kotoučem kotouč z papíru nebo plastu, jehož povrch je aktivován. Výhodně má reakční kotouč ve svém středu otvor. Výhodně se reakční nádobkou během stupňů b)a c) krouživě třepe. Výhodně se stanovení analytů ve stupni d) provádí přímo v reakční nádobce obsahující reakční kotouč a kapalný vzorek. Výhodně je imunostanovení určeno pro diagnózu alergie, přičemž reakčním činidlem je alergen a analytem je IgU imunospecificky pro tento alergen. Výhodně se ve stupni a) do reakční nádobky zavede reakční kotouč, který již byl aktivován pro reakci s reakčním činidlem. Výhodně se kapalný vzorek analyzuje na přítomnost několika analvtu obsažených v kapalném vzorku, přičemž se stupně a) až d) provádějí pro každý analyt v příslušné nádobce. Výhodně je provádění způsobu podle vynálezu automaticky řízeno počítačem. Výhodně se stanovení analytů ve stupni d) provádí optickou analýzou skrze otvor ve středu reakčního kotouče, Výhodně způsob podle vynálezu dále zahrnuje promytí reakčního kotouče v reakční nádobce potom, co se reakční činidlo navázalo na povrch reakčního kotouče.

Vynález se rovněž týká systému pro kontinuální provádění souboru identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny obsahující soubor analytu. při kterém se při každém stanovení analytu kapalný vzorek biologické tekutiny uvede do styku se zvoleným specifickým reakčním činidlem vázaným na nerozpustný reakční kotouč, vyznačený tím, že obsahuje soubor reakčních nádobek, z nichž každá obsahuje aktivovaný reakění kotouč; soubor reakčních činidel jednotlivě obsažených v každé reakční nádobce; prostředky pro dávkování jednotlivých zvolených reakčních činidel do příslušných reakčních nádobek; prostředky pro mícháni reakční nádobky; prostředky pro dávkování kapalného vzorku biologické tekutiny do každé ío reakění nádobky; a prostředky pro stanovení analytu v reakční nádobce; přičemž uvedené dávkovači prostředky a prostředky pro stanovení analytu jsou automaticky ovládány počítačem.

Charakteristické pro předložený vynález je, že ploché papírové kotouče se umístí do jednotlivých reakčních nádobek, ve kterých sc do nich navazuje příslušný antigen před bezprostředním stano15 vením provedeným v dané nádobce. Tímto způsobem je možné se vyhnout přípravě a uchovávání okolo 600 papírových kotoučů s různým potahem. Místo toho je nezbytné uchovávání a umožnění selektivního dávkovaní okolo 600 různých roztoků alergenů do jednotlivých reakčních nádobek obsahujících slepé kotouče. Nicméně manipulace s kapalnými reakčními činidly a jejich dávkování do reakčních nádobek je dobře známé způsoby umožňujícími automatické provedení.

Vynález ledy umožňuje zjednodušení celkového postupu, který, je-li to žádoucí může být automatizován.

Ve stupni (a) podle vynálezu se do nádobky umístí reaktivní kotouč. Tento kotouč není upevněný, aleje do nádobky volně vložený. Kotouč je obvykle pružný. Výhodně je kotouč vyroben z papíru, výhodně z vysokoporézního papíru, může však být vyroben také z pružného nebo z tuhého plastického materiálu, jakým je plastický materiál připravený kondenzační nebo adiční reakcí, například z polyamidu nebo z polystyrenu. Výhodné je. když kotouč leží na dne nádobky, a protože většina v nádobek má kruhový půdorys, je uvedený kotouč výhodné v kotoučovité formě o průměru o něco menším než je vnitrní průměr nádobky tak, aby těsně přiléhal k nádobce. Jak30 koliv se zde uvádí kotouč, popřípadě prstenec v případě, že je tento kotouč opatřen středovým otvorem, mohou v rámci vynálezu být použity i jiné tvary. Výhodný je však tvar plochého kotouče.

Kotouč musí být reaktivní v tom smyslu, že bude ve stupni (b) reagovat s tekutým prvním reakč35 ním činidlem. Aktivace papírových a plastických substrátů se provede způsobem zachovávajícím autoreaktivita vůči biologickým reagujícím látkám jako jsou antigeny, protilátky a další vazebné proteiny dobře známé v oboru. V případě papírových nebo obdobných substrátů uvedený způsob zahrnuje aktivaci povrchu substrátu reakcí například s bromkyanem nebo epoxidem, nebo diazotacní reakcí, tak aby vznikla reaktivní místa pro následnou tvorbu kovalentní vazby s prvním to reakčním činidlem. Toto navázání, například alergenů, na papírové kotouče je v oboru dobře známé a aktivaci povrchu papíru použitého ve způsobu podle vynálezu je možné provést obdobně jako v dosud známých způsobech v oboru. Alergeny jsou většinou proteiny, glykoproteiny, lipoproteiny a některé hapteny navážené na lidský sérový albumin (USA). Na aktivovaný povrch terče se pak kovalentně navazuje aminoskupina, sulfo-karbonylová skupina a další skupiny.

Papírové kotouče mohou být například aktivované následujícím způsobem podle NIRSC (National Institute for Biologieal Standards and Controis, U.K). Kotouče se nejprve nechají nasáknout v nádobce vodou ve které se ponechají asi 30 minut. Potom se přidá 5% roztok bromkyanu a obsah nádobky se míchá asi 10 minut při teplotě místnost i s použitím mechanického míchadla. Přidá se hydroxid sodný (0,05 M) tak, aby hodnota pH se udržela v rozmezí 10,25 až 10,50. Směs se pak vlije do chladného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, kotouče se oddělí a promyjí sc roztokem uhličitanu sodného (5 x) a potom acetonem (4 x). Pak se kotouče suší přes noc v atmosféře dusíku načež jsou připravené pro použití vc způsobu stanovení podle vynálezu. Jsou také známé alternativní způsoby přípravy, například s použitím jiného pufru. například fosforečnanu drasel55 ného a jiného rozmezí pH. například 11,0 až 12.0.

QZ 299602 BÓ

Aktivované materiály z plastických hmot, jako je polystyren, polyamid nebo nylon, jsou obchodné dostupné například od firem Nunc GmbH, Wiesbaden. Německo. Pal! Bio Support Div.. Port Washington, New York. USA, nebo Gelman Sciences Lid.. Northampton. Velká Británie.

V provedení podle vynálezu je zvláště výhodné připravit aktivované kotouče v předstihu před jejich použitím při stanovení. Je možné je připravit hromadně a poměrně snadno uchovávat například v dokonale vzduchotěsných nádobkách při asi 4 °C po dobu až asi 2 let. Během této doby si kotouče uchovají svoji autoreaktivitu. Podle dalšího vysoce výhodného provedení vyňalo lezu mohou být aktivované kotouče umístěny jednotlivě do analytických nádobek, například do jamek mikrotítrační destičky, kde jamky se dokonale uzavřou, a aktivované terče jsou uchovány v připraveném stavu pro vlastní stanovení. Na rozdíl od výše uvedeného je třeba uvést, že kotouče s naneseným alergenem dosud používané v oboru, musí být uchovávány bud v lyofilizovaném stavu (kdy se musí před použitím provést rekonstituce), nebo se musí uchovávat po celou dobu před použitím v pufru.

V rámci vynálezu se výhodné používá uzavřená nádobka obsahující aktivovaný kotouč pro stanovení podle vynálezu. T outo nádobkou může být mikrotítrační jamková destička, a to například celá destička, proužek nebo jednotlivá jamka.

Přestože použití preaktivováných kotoučů je zvláště výhodné, je také možné provést aktivaci terče v reakční nádobce před stupněm (a) imunostanovení. foto provedení není výhodné ale je možné.

V německém patentu DE 4123324 C2 je popsán kotouč s navázanými antigeny nebo protilátkami, který je zvláště vhodný pro použití v testech na alergii. Jedinečný rys tohoto kotouče spočívá v tom, že obsahuje v podstatě centrální otvor nebo oko a má tedy prstencový tvar. Výhoda tohoto kotouče je v tom, že v případě použití kolorimetrického nebo fluorimetrického stanovení je možné konečné spektrální stanovení provést přímo v tekutině v reakční nádobce pomocí svčtel30 ného paprsku procházejícího otvorem nebo okem v kotouči. To odstraňuje potřebu vyjmout tekutinu nebo kotouč z nádobky před provedením spektrálního stanovení (což je nezbytné u kotoučů neobsahujících otvor).

Tyto kotouče jsou zvláště výhodné pro použití podle vynálezu a podrobnosti o nich jsou uvedeny v DE 4123324 C2. Ve způsobu podle vynálezu se na tyto kotouče (dále pro zjednodušení ale bez jakéhokoliv omezení sc označují jako ..prstenec¹¹) naváže příslušný alergen (nebo jiné činidlo) ve stupni (b) způsobu podle vynálezu. Aktivované kotouče podle stupně (a) jsou připravené pro navázání alergenu. Uvedené prstence mají kromě výhody popsané výše rovněž další a neočekávané výhody ve stupni (b) podle vynálezu, jak bude popsáno dále.

Pracovníkům v oboru je známý obvyklý způsob provedení pomocí sestavy nebo sady reakčních nádobek, například mikrotitračních destiček obsahujících například 96 jednotlivých reakčních nádobek. Způsob podle vynálezu je možné pochopitelně provést tímto způsobem, s použitím různých alergenů přidaných do jednotlivých nádobek pro každý vzorek určený ke stanovení ve stupni (b) a s přidáváním alikvotních podílů stejného vzorku ve stupni (c). Použití mikrotitračních destiček a podobných systémů pro souběžné provedení více stanovení je samozřejmě dobře známé a nebude dále popisováno.

Ve stupni (b) způsobu podle vynálezu se přidá do reakční nádobky (obsahující reaktivní kotouč) první tekuté reakční činidlo, které reaguje s povrchem kotouče a naváže se na jeho povrch. Pochopitelně, v případě testů na alergii, je toto první reakční činidlo alergen (tj. ten alergen jehož citlivost odezvy se zjišťuje). Tento alergen se naváže na povrch kotouče. V případě jiných testů než je hodnocení alergie se první reakční činidlo zvolí tak aby bylo vhodné pro daný test jak bude pracovníkům v oboru jasné.

-3CZ 299602 B6

Příprava alergeny potažených papírových kotoučů dosud známými způsoby v oboru pro použití například v RAS'!’ (obchodní značka) způsobu, sc provádí reakcí mezi alergenem a povrchem papírového kotouče, kde tento proces trvá obvykle několik hodin (například až 24 hodin) než je proces dokončen. Tato dlouhá doba přípravy však není zvláštní nevýhodou dosavadních známých způsobů, protože papírové kotouče se připravují v předstihu před stanovením a uchovávají se. Nicméně ve způsobu podle vynálezu by tato dlouhá doba přípravy byla nevýhodou, protože samotné potahování kotoučů tvoří součást samotného způsobu stanovení. Autoři vynálezu nalezli způsob jak překonat uvedený problém s použitím urychlovačů a/nebo katalyzorů vazebné reakce. Tímto způsobem dojde k dokončení vazby mnohem rychleji, například do asi 60 minut. Vhodné ío urychlovače a katalyzátory jsou pracovníkům v oboru známé, a zahrnují například peroxidy a různé další zdroje nebo katalyzátory volných radikálů.

Urychlovače a/nebo katalyzátory lze výhodně včlenit do prvních tekutých reakčních činidel, a tímto způsobem je společně dávkovat do reakčních nádobek a uvádět je tak do styku s aktivovali ným povrchem. Použití urychlovačů a/nebo katalyzátorů nijak celý způsob nekomplikuje, protože je možné je smísit s prvním tekutým reakčním činidlem.

Aktivované prstence lze například potáhnout alergenem následujícím způsobem. Prstence jsou umístěny (při uchovávání) v jednotlivých jamkách mikrotitrační destičky. Do každé jamky se pak vnese 50 μΙ tekutého roztoku alergenu obsahujícího urychlovač. Pak se jamky podrobí krouživému protřepavání trvajícímu 50 až 60 minul při teplotě místnosti. Pak se do každé jamky přidá asi 50 μ! přerušovacího roztoku, například roztoku epiehlorhydrinu nebo diethanolaininu. a obsahy jamek se důkladně promíchávají při teplotě místnosti dalších 20 až 30 minut. Nakonec sc potažené prstence promyjí (3 x) promývacím roztokem.

Tekuté alergeny (extrakty) se výhodně připravují a hodnotí podle práce „Metliod of the Taboratory of Allergenic Products DEP, OBRR, CDB a PDA 1986 a standardními způsoby pro kontrolu alergenových extraktů používaných N1BSC. Všechny extrakty, používané pro vazbu na pevnou fázi se výhodně testují vhodným způsobem aby se zajistila vhodnost jejich použití. U pylových extraktů jc minimálním požadavkem shoda záznamu isoelektrické fokusace s referenčním přípravkem OBRR. U extraktů z Dermatophagoides je minimálním požadavkem prokázání shody s OBRR referenčním přípravkem při RAS E (obchodní značka) inhibici. U extraktů z potravin je minimálním požadavkem prokázání shody s obchodně dostupnými extrakty (Príck testovací roztok) při RAST (obchodní značka) inhibici. Příklad způsobu přípravy extraktu alergenu je násle35 dující:

1. 4 gramy zdroje alergenu se extrahují s40ml vhodné extrakční tekutiny za mírného promíchávání po dobu 20 hodin při 4 °C.

2. Získaná směs se odstřeďuje 30 minut při 4 °C a při 10 000 x g.

3. Supernatant se zfiltruje přes membránový filtr 0.22.

ío 4. Filtrát se d i a lyžuje proti pufru v dialyzaění trubici MWCO 7 000.

5. Přidá se stabilizátor a urychlovače/kalalyzátory.

Po reakci mezí prvním reakčním činidlem a povrchem aktivovaného kotouče sc tekutina v nádobce odstraní, obvykle odsátím, a nádobka a kotouč se promyjí. Abv se zajistilo, že na povr45 chu kotouče již nezbývají žádná aktivní místa (která by mohla intereferovat v následujících stupních stanovení), výhodně se kotouč promyje s přerušovacím prostředkem (například s FPA 33 nebo s roztokem dictanolaminu). Ve všech případech se pak promývací tekutina odstraní.

Při přípravě alergenem potažených kotoučů, kde každý je v příslušné reakční nádobce, jc důležité zajistit tak, jak je to možné, aby cely povrch (obě strany) terče mohl reagovat s alergenem. Proto je žádoucí zajistit aby pro účel daného testu byl k dispozici dostatek alergenu. To je zvláště důležité v případe prstenců popsaných výše (a v DE 4123324 C2), protože dostupná plocha povrchu prstenců je menší než u odpovídacích kotoučů bez otvorů.

-4CZ 299602 B6

Autoři vynálezu našli způsob jak zajistit, aby prstence byly příslušným způsobem potažené. Zejména bylo zjištěno, že jestliže se nádobka podrobí protřepávání. zejména krouživému protřepávání, prstence mají sklon se v prvním reakčním činidle pohybovat vzhůru a dolů, čímž se oba povrchy dostávají s tekutinou do styku a mohou s ní reagovat. Podle vy nálezu jc tedy výhodné v případě použití terčů ve formě prstenců podrobit nádobku během stupně (b) stanovení krouživému třepání. Ve skutečnosti je výhodné nádobku podrobit krouživému třepání kdykoliv během stanovení, kdy je zapotřebí dosáhnout dobrý kontakt mezi tekutinou v nádobce a povrchy prstence. Krouživé protřepávání sc také výhodně použije ve stupni (c) k zajištění dobrého kontaktu ío mezi povrchem kotouče s navázaným alergenem $ analy zovaným vzorkem.

Ve stupni (c) stanovení podle vynálezu se vnese do reakční nádobky obsahující kotouč s navázaným činidlem analyzovaný vzorek. V případě například standardního zjišťování alergie je činidlo navázané na kotouč příslušný alergen, a jakýkoliv IgE přítomný ve vzorku se bude vázat na aler15 gen na kotouči. Následně se pak protilátky navázané na alergen stanoví přímým nebo nepřímým způsobem (stupeň (d)). Tekutý vzorek je obvykle krevní sérum, ale pro stanovení příslušných analytu je možné použít i další biologické tekutiny.

I když jak bylo výše uvedeno, vynález je zvláště vhodný pro standardní stanovení IgE alergie,

2(i není vynález na toto stanovení omezen. Například pro určité účely je žádoucí aby postup umožnil stanovení lgG₄, například v případě bodnutí včelou nebo vosou. Způsob podle vynálezu tento postup umožňuje. Dále pro diagnostické nebo pro terapeutické aplikace mohou být prospěšné testy mukózní tekutiny na obsah IgA protilátek, kde způsob podle vynálezu lze využít při provedení testu na antigen-spccifieké sekreční IgA protilátky. Jak bude pracovníkům v oboru zřejmé, jsou možné i další aplikace vynálezu, například týkající se stanovení thyroidního hormonu atd., zejména v případech provedení série podobných testů na stejném vzorku.

Ve stupni (d) způsobu, se provede stanovení analytu (pokud je přítomen) navázaného na kotouč. Tento postup je v oboru dobře známý, a proto nebude dále podrobněji popisován. Ve výhodných stanoveních podle vynálezu, kde kotouč je tvořen prstencem, se použije kolorimetrické stanovení. Optické stanovení se provede pomocí svazku paprsků procházejícího otvorem v prstenci. Nicméně je možné použít i další způsoby, například enzymatické nebo radioaktivní stanovení, kde tyto způsoby se provedou obvyklým způsobem, jako je například odstranění tekutiny z nádobky a její analýzou na jiném místě, nebo vyjmutím prstence a stanovením jeho radioaktivity.

Jednoduchou formu příkladu znázorňujícího stanovení alergenu podle vynálezu lze uvést provedením podle následujícího způsobu.

V jamkách mikrotitrační destičky jsou umístěny aktivované papírové prstence. Následující stupně

4o lze provést automatizovaným způsobem:

1) na prstence v každé jamce se vnese po 50 μΙ příslušeného alergenu:

2) za třepání se nechá probíhat po dobu 1 hodiny inkubace;

3) jamky se promyjí (χ 1) 300 μΐ podíly promývacího roztoku, kterým jc 1% hovězí sérový albumin (BSA) a 0,005% tween 20 ve fosforečnan o vém solném pufru (PBS):

4) do každé jamky se přidá po 100 μΙ přerušovacího roztoku;

5) nechá se probíhat inkubace po dobu 0,5 hodiny;

6) jamky se promyjí (x 3) vždy 300 μΙ promývacího roztoku;

7) do příslušných jamek se vnese po 50 μΐ standardu nebo vzorku;

8) po dobu 1 hodiny se nechá probíhat inkubace;

9) jamky se promyjí (x 3) 300 μΐ promývacího roztoku;

10) do každé jamky se vnese 50 μΐ konjugát li;

- s CZ 299602 B6

11) po dobu 1 hodiny se nechá probíhat inkubace;

12) jamky se promyjí (x 3) 300 μΐ promývacího roztoku;

13) do každé jamky se vnese po 100 μΐ roztoku enzymového substrátu:

14) po dobu 0,5 hodiny se nechá probíhat inkubace;

15) do každé jamky se vnese po 100 μΐ přerušovacího roztoku;

16) provede se odečet optického parametru při 405 nm ref 620/630;

17) výsledky se vytisknou v m.j./ml a vyhodnotí se.

Celková doba analýzy jc 4 hodiny (údaje vztažené k odsávání jsou pro zjednodušení vynechány ).

1«

Pro snadnější pochopení vynálezu jsou jeho hlavní rysy formou příkladu dále popsány pomocí obrázků v připojených nákresech,

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je schematicky znázorněno jedno provedení způsobu podle vynálezu; obrázek 2 znázorňuje vertikální pohled v řezu na reakční nádobku s pevným nosičem; a obrázek 3 znázorňuje standardní křivku pro stanovení dále popsané v příkladu 3.

Příklady provedení vynálezu

Na obr. 1 je schematicky znázorněn jeden systém pro provedení způsobu podle vynálezu. Tento systém obsahuje zdroj nebo zásobník i reakčních nádobek 2. a zásobník 3 terčů, například kotoučů nebo prstenců. Jak je ve schématu znázorněné, je papírový kotouč 5 opatřen středovým otvorem 6. Zařízení obsahuje prostředky (nejsou znázorněné) pro vnesení jednoho kotouče 5 do každé z reakčních nádobek 2.

3(i Do reakční nádobky 2 sc potom vnese příslušné množství prvního reakčního činidla JO vybraného z prostředku JJ pro dávkování reakčních činidel, tvořeného zásobníkem, který obsahuje všechna první reakční činidla potřebná pro provedení určeného stanovení. K nasáti pivního reakčního činidla J_0 ze zásobníku a jeho vnesení do reakční nádobky 2 lze použít obvyklý dálkově ovládaný aspirálor a dávkovač vzorku (nejsou znázorněny).

Reakční nádobka 2 se podrobí krouživému třepání v prostředku J_l_a pro mícháni reakční nádobky, tvořeném třepačkou, které se nechá probíhat přiměřenou dobu (například 30 až 60 minut) tak. aby se první reakční činidlo JJ) navázalo na kotouč 5. Jestliže je zapotřebí, aby se na kotouč 5 vázala po prvním reakčním činidle ]0 další reakční činidla, lze tato činidla automaticky přidat do reakční nádobky 2 před a nebo po přidání prvního reakčního činidla JO podle toho, jak je to zapotřebí.

Jakmile došlo k navázání prvního reakčního činidla J_0 na obě strany kotouče 5, z reakční nádobky 2 se odsaje tekutina a kotouč 5 se promyje. Tento pracovní stupeň je na obr. 1 označen vztai5 hovou značkou J_5.

V dalším pracovním slupni se do reakční nádobky 2 přidá zc zásobníku 20 přerušovací roztok 2J za účelem zablokování zbývajících aktivních míst na kotouči 5. Potom se roztok z reakční nádobky 2 odsaje a obsah sc promyje ve stupni J_5.

-6CZ 299602 B6

Do reakční nádobky 2 se potom přidá ze zásobníku 31 alikvotní podíl vzorku 30 a následně se ponechá probíhat reakce mezi stanovovaným analytem (pokud je ve vzorku obsažen) a prvním reakčním činidlem £0. Reakění nádobka 2 může být v této fázi protřepávána a/nebo inkubována.

Po ukončení reakce se tekutina z reakční nádobky 2 odstraní odsátím a kotouč 5 se promyje v pracovním stupni 15. Potom se přítomnost a/nebo množství analytů navázaného na kotouč 5 stanoví obvyklým způsobem. Do reakční nádobky 2 jedno nebo více činidel 40 pro stanovení ze zásobníků 43. 44 a po ukončení reakce se provede kolorimetrické stanovení za použití světelného zdroje 41a senzoru 42. Dráha světlaje obvykle vzhledem k reakční nádobce 2 axiální a prochází ío otvorem 6 v kotouči 5. Výsledky lze vytisknout nebo zobrazit v jednotce 50. Celý systém 5£ je řízen počítačem 52 a stanovení může takto probíhat automaticky.

Na obr. 2 je zobrazena reakční nádobka 2 s obsaženým papírovým kotoučem 5. Tento kotouč 5 obsahuje středový otvor ó. Přestože kotouč 5 má průměr jen o málo menší, než jc vnitřní průměr nádobky 2. a je tak v nádobce 2 uložen těsně, zúčastní se obě strany kotouče 5, tj. horní strana 60 a spodní strana CL vazby s prvním reakčním činidlem JO. Když se totiž nádobka 2 podrobí krouživému protřepávání. má kotouč 5 sklon zvedat se ode dna nádobky 2 a rotovat, přičemž tekutina v nádobce 2 víří kolem otvoru 6. Výsledkem je. že obě strany kotouče 5 jsou plně ve styku s tekutinou v nádobce 2. přičemž tato tekutina s nimi reaguje, anebo s promývací tekutinou. Proto20 že kotouč 5 doléhá těsně k vnitřní stěně nádobky 2, nachází se otvor 6 ve středu nádobky 7, což zajišťuje, že dráha světelných paprsků 62 je k nádobce 2 v axiální konfiguraci.

Pro lepší pochopení vynálezu jsou pouze pro znázornění uvedeny následující příklady.

Příklad 1

Aktivace papírových prstenců

Papírové prstence (o průměru 6,3 mm) mající centrální otvor (o průměru 2,0 mm ± OJ mm) se nechají během 10 minut v sintrované skleněné nálevce při teplotě místnosti nasáknout pufrem (pil 11.9) obsahujícím fosforečnanem draselný (Κ<ΡΟ₄). Pak se prstence promyjí dalším podílem pufru obsahujícího fosforečnan draselný. Promyté prstence se pak umístí do skleněné kádinky obsahující 100 ml pufru s fosforečnanem draselným na 1000 prstenců. Tato směs míchá způso35 bem při kterém se prstence v pufru pohybují až do ustálení pH. Pak se během asi 1 minuty pomalu přidá roztok 0,435 g bromkyanu v 10.0 ml acetonitrilu na 1000 prstenců, a pokračuje se v promíchávání. Hodnota pil směsi sc po dobu 10 minut po přídavku bromkyanu udržuje v rozmezí mezi 11.5 až 12,0 přídavkem hydroxidu sodného.

Aktivované prstence se pak převedou do sintrové skleněné nálevky na Erlenmayerově baňce a promyjí se vodou. Promyté prstence se pak vysají do sucha filtračním papírem a umístí se do sáčku z plastické hmoty s připojeným přívodem suchého dusíku. Sáčkem se nechá proudil plyn tak. aby došlo k vysušení aktivovaných prstenců. Jakmile se u prstenců docílí jejich v podstatě původní suché hmotnosti, uzavřou sc v sáčku z plastické hmoty a uchovávají se v evakuovaném exsikátoru při asi -20 °C.

Příklad 2

Navázání prvního reakčního činidla na aktivované prstence

Jednotlivé aktivované prstence připravené podle příkladu 1 se umístí do mikrotitrační jamkové destičky (jeden kroužek do jamky) a do každé jamky se přidá 50 pl roztoku alergenu (obsahujícího peroxidový urychlovač). Pak se jamky podrobí krouživému protřepávání po dobu 1 hodiny, načež se tekutina z jamek odstraní odsátím. Pak se prstence v jednotlivých jamkách promyjí s 300 ml promývacího roztoku (1% ESA, 0,005% tween 20 v PES). Po odstranění promývacího

-7CZ 299602 B6 roztoku odsátím se do každé jamky přidá 100 pl přerušovacího roztoku reagujícího s případnými zbylými reaktivními místy na povrchu prstence. Po inkubaci trvající 30 minut sc roztok odstraní odsátím a prstence se třikrát promyjí 300 pl podíly promývacího roztoku. Potom jsou prstence připravené k použití při vlastním stanovení.

Výše uvedený způsob lze aplikovat na všechny obvyklé alergeny. Použijí se roztoky alergenů standardizované na každý alergen (pracovníkům v oboru je tento postup známý). Obvyklý urychlovač je kyselina peroxyoctová. Přerušovací roztok je diethanol amin (pH 9,8).

Příklad 3

Stanovení

Stanovení různých alergenů přítomných ve vzorku se provede následujícím způsobem.

Použijí se mikrotitrační destičky obsahující v každé jamce aktivované papírové prstence připravené způsobem popsaným v příkladu I. Pak se do každé jamky vnese 50 μΙ roztoku alergenu, který' se naváže na papírový prstenec jak jc popsáno v příkladu 2.

K provedení vlastního stanovení a odvození požadované standardní křivky se do jednotlivých jamek obsahujících příslušné papírové prstence s prvním reakčním činidlem přidají 50 μ] podíly IgE standardu (lidský v PES s 10% koňským sérem) a stanovovaného vzorku. (Při stanoveních celkového IgE se použije králÍčí-antí-{lidský IgE) (Dako). Jamky se inkubují 1 hodinu za krou25 živého protřepávání a potom se tekutina z jamek odsaje a papírový prstenec se třikrát promyje 300 μΙ podíly promývacího roztoku.

V tomto stupni došlo k navázání příslušného IgE na příslušný prstenec. V příštím stupni se provádí kvantitativní vyhodnocení množství IgE. Do každé jamky se přidá 50 μΙ kozího anlilidské50 ho-lgE konjugovaného s markerovým enzymem, v PED s 1% ESA. Mg, Zn a s některými ze stabilizátorů. Použitým enzy mem v tomto příkladu je alkalická fosfatáza. Po jedné hodině inkubace se prstence třikrát promyjí 300 μί podíly promývacího roztoku. Pak se do každé jamky přidá po 100 μΐ roztoku substrátu, kterým je pro alkalickou fosťatázu PNPP. Po 30 minutách inkubace se do každé jamky přidá 100 μΙ přerušovacího roztoku (v tomto případě 2 N hydroxidu sodného) k ukončení enzymatické reakce.

Pak se změří v každé jamce barva tekutiny (optická hustota) při 405 nm. Z hodnot z jamek ve kterých byl použit standard se vynese kalibrační nebo standardní křivka. Z této křivky a z hodnot optické hustoty (OD) získané z příslušných jamek pro hodnocení vzorku se vyhodnotí množství to IgE—protilátek na různé testované alergeny ve vzorku.

Na obrázku 3 je znázorněna standardní křivka získaná z naměřených hodnot. Celé stanovení zahrnuje jednak výsledky potřebné pro konstrukci standardní křivky , a rovněž výsledky stanovení různých alergenů ve vzorku pacienta, které jsou uvedeny v následující tabulce. Vzorek byl hod45 noeen na alergen Dl, alergen ml. alergen el, a alergen t3. Obvyklým způsobem byla prováděna postupná ředění, jak je uvedeno.

dl Dermatophagoides pteronyssinus ml - Alternaria tenuis el = kočičí chlupy l epithelium t3 - pyly z brízy m2 = Aspergillus amslelodami m50 = Aspergillus flavus ml5 = Cladosporium herbarum m!6 Curvularia lunata

-8Q1 299602 B6

M i kro filtrační destička

jamka-ozn.	standardy	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc.
AO1BLK			0,061		0,056
BO1BLK			0,052
CO1STD1	0,0		0,042	0,00	0,051	0,00
D01STD1			0,060	0,00
EO1STD2	0,35		0,112	0,46	0,109	0,42
F01STD2			0,105	0,38
G01STD3	0,7		0, 167	1,03	0,157	0,93
H01STD3			0,148	0,83
AO2STD4	3,5		0,515	4,92	0,497	4,69
BO2STD4			0,479	4,47
CO2STD5	17,5		1 ,319	20,04	1,312	19,76
DO2STD5			1,304	19,49
EO2STD6	50,0		1,814	59,93	1,768	53,51
FO2STD6			1,722	47,10
GO2STD7	100,0		2,026	105,60	2.000 100,10
HO2STD7			1 ,975	94,61
j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
AO3	d-p-alergenDl	i	1 ,281	18,69	1,214	16,96
B03	d’P	1	1 ,148	15,23
CO 3	1 .2	2	0,896	10,48	0,979	11,97
DO 3	1.2	2	1,061	13,45
E03	1 .4	3	0,720	7,68	0,732	7,85
FO3	1 ,4	3	0,743	8,03
G03	1.8	4	0,394	3,48	0,384	3,36
HO3	í.8	4	0,373	3,24

j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
AO4	1 .16	5	0,238	1 ,78	0,222	1,61
B04	1 ,16	5	0,206	1,44
CO4	1 .32	6	0,183	1,19	0,184	1,21
DO4	1.32	6	0,185	1,22
EO4	t .64	7	0,124	0,58	0,120	0,54
FO4	1 .64	7	0,117	0,51

-9CZ 299602 B6

jamka-ozn. Vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
GO4	p312012 alergen ml	8	0,243	1 ,83	0,224	1 ,63
H04	p312012 alergen ml	8	0,205	1 ,43
A05	1 .2	m2	9	0,305	2,49	0,336	2,84
BOS	1.2	m2	9	0,368	3,18
COS	1 .4	roSO	10	0,359	3,09	0,369	3,20
DOS	1.4	mSO	10	0,379	3,31
EO5	1.8	ml 5	11	0,343	2,91	0,341	2,89
FO5	1.8	mlS	1 1	0,340	2,88
GO5	1.16	ml 6	12	0,294	2.37	0,283	2,26
HOS	1.16	ml6	12	0,273	2,15
AO6	1.32 1:2	mSO	13	0,276	2,18	0,266	2,08
BO6	1.32 1:2	mSO	13	0,257	1,98

j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
CO6 p342	alergen el	14	0,826	9,32	0,814	9,13
DOÓ p342		14	0,802	8,94
EO6	1.2	15	0,614	6,19	0,589	5,86
F06	1.2	15	0,564	5,53
GO6	1 .4	16	0,347	2,95	0,343	2,90
HO6	1 .4	16	0,338	2,86
AO7	1.8	17	0,220	1,59	0,220	1,60
BO7	1.8	17	0,221	1,60
CO7	1 .16	18	0,146	0,81	0,164	1,00

jamka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD M-konc
DO7	1.16	18	0,182	1,18
EO7	1.32	19	0,109	0.42	0,105 0,38
FO7	1.32	19	0,102	0,35

- 10CZ 299602 B6

jamka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc .	M-OD	M-konc
GO7 p!30	alergen	t3 20	0,871	10,06	0,870	10,04
HO7 pl30		20	0,869	10,02
AO8	1 .2	21	0,966	11,69	0,959	11,56
BO8	1 .2	21	0,951	1 1,43
CO8	1 .4	22	0,729	7,82	0,736	7,94
DO8	1 .4	22	0,744	8,05
E08	1 .8	23	0,451	4,14	0,461	4,25
F08	1 .8	23	0,470	4,36
GO8	t . 16	24	0,282	2,24	0,274	2,15
H08	1.16	24	0,266	2,07
AO9	1 .32	25	0,179	1 ,15	0, 175	1,11
B09	1.32	25	0,171	1 ,07
CO9	1.64	26	0,113	0,47	0,123	0,57
D09	1.64	26	0,133	0,67

jamka-ozn. vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
EO9	D-P	dl	27	1,194	16,29	1,160	15,52
FO9	D-P	dl	27	1,125	14,74
j amka-	ozn. vzorky		ID	OD	konc.	M-OD	M-konc.
G09	p3 12012	ml	28	0,245	1 ,85	0,241	1,80
H09	p3120 12	ml	28	0,236	1,75
jamka-	ozn. vzorky		ID	OD	konc.	M-OD	M-konc

A1 0	p342	e 1	28	0,812	9,10	0,809	9,05
BIO	p342	el	28	0,806	9,00
CIO	pl 30	t3	30	1 ,089	14,00	1,009	12,52
DI0	p!30	t3	30	0,929	1 1,04

- II CZ 299602 B6

Příklad 4

Stanovení IgE na D.pteronyssinus

Papírové prstence aktivované způsobem popsaným v příkladu 1 se umístí do mikrotitrační jamky (jeden prstenec do jedné jamky) a do každé jamky se přidá 50 μΙ extraktu Derinatophagoides pteronyssinus, který obsahuje 0.05 % (hmotn,/obj.) kyseliny peroxooctovc. Po inkubaci probíhající I hodinu za krouživého protřepávání při teplotě místností se každý z prstenců jednou promyje 300 μ| promývacího roztoku popsaného v příkladu 2. Potom se přidá do každé jamky 100 μΐ přelo rušovaeího/neutralizačního roztoku (dicthanolaminu) popsaného v příkladu 2. Po inkubaci probíhající 30 minut za krouživého protřepávání při teplotě místnosti se každý prstenec třikrát promyje vždy 300 μΐ promývacího roztoku.

Tyto prstence se pak použijí při stanoveni následujícím způsobem. Do každé příslušné jamky se vnese po 50 μΙ standardu nebo vzorku. Po 1 hodinové inkubaci za krouživého protřepávání se prstence třikrát promyjí vždy 300 μΐ promývacího roztoku. Do každé jamky se pak vnese 50 μΙ konjugátu jak je popsané v příkladu 3. Po 1 hodinové inkubaci za krouživého protřepávání se prstence promyjí třikrát 300 μ] podíly promý vacího roztoku. Pak se do každé jamky přidá 100 μΐ roztoku substrátu jak je popsáno v příkladu 3. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se

2(i přidá do každé jamky 100 μΙ přerušovacího roztoku. Potom se v každé jamce odečte optická hustota tekutiny při 405 nm ref 620/630. Vynese se křivka závislostí optické hustoty na koncentraci standardu a tato křivka se použije k odečtení koncentrace specifického IgE v každém vzorku.

Claims (12)

1. PATENTOVÉ NÁROKY su 1. Způsob imunitního stanovení analytu v kapalném vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje stupně

   a) zavedení reakčního kotouče do reakční nádobky;

   b) přidání do reakční nádobky alespoň jednoho kapalného reakčního činidla, které se váže na povrch reakčního kotouče;

   55 c) přidání do reakční nádobky kapalného vzorku obsahujícího stanovovaný analyt. přičemž tento analyt se imunospecifcky přímo nebo nepřímo váže na reakění činidlo vázané na povrchu reakčního kotouče; a

   d) přímé nebo nepřímé stanovení analytu vázaného na reakčním kotouči.

   40
2. 2. Způsob podle nároku Lvy značený t í ni, že reakčním kotoučem je kotouč z papíru nebo plastu, jehož povrch je aktivován.
3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačený tím. že reakění kotouč má ve svém středu otvor.

   45
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený t í m , že reakční nádobkou se během stupňů b) a

   c) krouživě třepe.
5. 5. Způsob podle některého z nároků I až 4. vyznačený t í m , že se stanovení analytu ve stupni d) provádí přímo v reakční nádobce obsahující reakční kotouč a kapalný vzorek.
6. 6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačený t í m , že imunostanovení je určeno pro diagnózu alergie, přičemž reakčním činidlem je alergen a analytem je IgE imunospecifický pro tento alergen.

   - 12CZ 299602 B6
7. 7. Způsob podle některého z nároků I až6, vyznačený tím, že ve stupni a) se do reakční nádobky zavede reakční kotouč, který' již byl aktivován pro reakci s reakčním činidlem.
8. 8. Způsob podle některého z nároků l až 7, vyznačený t í m . že se kapalný vzorek analy5 zuje na přítomnost několika analytu obsažených v kapalném vzorku, přičemž stupně a) až dj se provádějí pro každý analyt v příslušné nádobce.
9. 9. Způsob podle některého z nároků l až 8, v y z n a ě e n ý t í m . že je automaticky řízen počítačem.

   w
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9. v y z n a č e n v t í m , že se stanovení analytu ve stupni d) provádí optickou analýzou skrze otvor ve středu reakěního kotouče.
11. 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačený t í m . že dále zahrnuje promytí

    15 reakěního kotouče v reakční nádobce potom, eo se reakční činidlo navázalo na povrch reakěního kotouče.
12. 12. Systém pro kontinuální provádění souboru identických nebo obdobných imunostanovení v kapalných vzorcích biologické tekutiny obsahující soubor analytu, při kterém se při každém sta20 noven i analytu kapalný vzorek biologické tekutiny uvede do styku se zvoleným specifickým reakčním činidlem vázaným na nerozpustný reakční kotouč, vyznačený (í m , že obsahuje soubor reakčních nádobek (2), z nichž každá obsahuje aktivovaný reakční kotouč (5); soubor reakčních činidel (10), jednotlivě obsažených v každé reakční nádobce (2); prostředky (11) pro dávkování jednotlivých zvolených reakčních činidel (10) do příslušných reakčních nádobek (2):

    25 prostředky (11a) pro míchání reakční nádobky (2); prostředky pro dávkování kapalného vzorku (30) biologické tekutiny do každé reakční nádobky (2); a prostředky pro stanovení analytu v reakční nádobce (2); přičemž uvedené dávkovači prostředky a prostředky pro stanovení analytu jsou automaticky ovládány počítačem (52).