CZ387199A3 - Způsob imunostanovení analytu - Google Patents

Description

Způsob imunostanovení analytu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu a zařízení pro provedení imunostanovení, zejména, ale nikoliv výlučně, pro in vitro hodnocení alergie.

Dosavadní stav techniky

V mnoha imunostanoveních je zapotřebí zařadit separační stupeň. Známý způsob usnadňující tento proces spočívá v insolubi1 izaci činidla vazbou na ve vodě nerozpustný nosič tak, že jakýkoliv reakční produkt vzniklý reakcí mezi činidlem a vzorkem během imunostanovení se váže na nosič.

Potom se může bud nosič nebo zbylý reakční roztok nezávisle hodnotit a to přímo nebo nepřímo na přítomnost a/nebo množství analytu kterého se stanovení týká. Příklady takovýchto systémů zahrnují papírové disky potažené alergenem ve známých setech PAST (obchodní značka) pro in vitro radioimunostanovení alergi e .

V testu na alergii KAST (obchodní značka) se používají papírové disky s jedním navázaným alergenem. Proto je nutné při provedení série testů, zahrnující například 50 různých alergenů na jednom vzorku, zvolit 50 různých papírových disků, každý umístit do reakční nádobky a potom pokračovat v testu v každé z 50 různých nádobek. Uchovávání, vyhledávání, manipulace a umísťování až asi 600 různě navázaných disků (což odpovídá počtu alergenů pro které se stanovení vyžaduje) v jednotlivých nádobkách je komplikované. S disky není snadná manipulace a zajištění spolehlivého automatického provedení pro celkovou analýzu vzorku je obtížné.

• · · ft ft ftft 9 9 9 9 • · · ftft · ft · ftftftft • ·· ftft· · · ·· ·· ftftftft ftft ft «ftftft ftft ftft ftft ftftft ft* ··

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu navrhli jednodušší způsob provedení tohoto typu stanovení, kterým je možné se vyhnout nebo překonat výše uvedené problémy spojené s papírovými disky s naneseným alergenem,

Charakteristické pro předložený vynález je, Ze ploché papírové disky se umístí do jednotlivých reakčních nádobek, ve kterých se do nich navazuje příslušný antigen před bezprostředním stanovením provedeným v dané nádobce. Tímto způsobem je možné se vyhnout přípravě a uchovávání okolo 600 papírových disků s různým potahem. Místo toho je nezbytné uchovávání a umožněni selektivního dávkovaní okolo 600 různých roztoků alergenů do jednotlivých reakčních nádobek obsahujících slepé disky. Nicméně manipulace s kapalnými reakčními činidly a jejich dávkování do reakčních nádobek je dobře známé způsoby umožňujícími automatické provedení.

Vynález tedy umožňuje zjednodušení celkového postupu, který, je-li to žádoucí může být automatizován.

I když vynález je zvláště vhodný pro testování alergie a je v této souvislosti popisován, je nutné ho chápat tak, že je vhodný i pro další sériově prováděné testy.

Podle jednoho aspektu vynálezu, vynález poskytuje způsob imunostanovení analytu v tekutém vzorku, který zahrnuje následující stupně:

a) umístění reakčního terče do nádobky;

b) přídavek prvního tekutého reakčního činidla do ·«· 4 4 4 4 *44*

4444 4 4 4 4 44 · * 44 444 4 4 44 44 4

4444 4* · 4 444

44 44 444 «4 44 nádobky, čímž dojde k reakci tohoto činidla s povrchem kotouče a navázání činidla na uvedený povrch;

c) přídavek tekutého vzorku obsahujícího analyt který je stanovován do nádobky, čímž dojde k imunospecificky přímému nebo nepřímému navázání analytu na první reakční činidlo na uvedeném terč i; a

d) přímé nebo nepřímé stanovení analytu navázaného na terči .

V dalším aspektu vynálezu vynález poskytuje zařízení pro provedení více stejných nebo podobných testů v biologickém tekutém vzorku, pro více analytu v tomto vzorku obsažených, kde každý testovaný vzorek se uvede do styku se specifickým činidlem v daném testu navázaném na nerozpustný nosič, a kde zařízení obsahuje více reakčních nádobek z nichž každá obsahuje stejný reakční kotouč; prostředky pro selektivní dávkování jednoho z více prvních reakčních činidel do každé nádobky; prostředky pro odsání tekutiny z každé nádobky; prostředky pro dávkování tekutého reakčního prostředku do každé nádobky; a prostředky pro stanovení stanovované složky v každé nádobce.

Ve stupni (a) podle vynálezu se do nádobky umístí reaktivní terč. Tento terč není upevněný, ale je do nádobky volně vložený. Terč je obvykle pružný. Výhodně je terč vyroben z papíru, výhodně z vysokoporézního papíru, může však být vyroben také z pružného nebo z tuhého plastického materiálu, jakým je plastický materiál připravený kondenzační nebo adiční reakcí, například z polyamidu nebo z polystyrenu. Výhodné je, když terč leží na dně nádobky, a protože většina nádobek má kruhový půdorys, je uvedený terč výhodné v « · ·fcfc « fcfc « fcfc fcfc fcfc

kotoučovité formě o průměru o něco menším než je vnitřní průměr nádobky tak, aby těsně přiléhal k nádobce. Přesný tvar tohoto terče není kritický, výhodný však je plochý kotoučovitý tvar.

Terč musí být reaktivní v tom smyslu, že bude ve stupni (b) reagovat s tekutým prvním reakčním Činidlem. Aktivace papírových a plastických substrátů se provede způsobem zachovávajícím autoreaktivita vůči biologickým reagujícím látkám jako jsou antigeny, protilátky a další vazebné proteiny dobře známé v oboru. V případě papírových nebo obdobných substrátů uvedený způsob zahrnuje aktivaci povrchu substrátu reakcí například s bromkyanem nebo epoxidem, nebo diazotační reakcí, tak aby vznikla reaktivní místa pro následnou tvorbu kovalentní vazby s prvním reakčním činidlem. Toto navázání, například alergenů, na papírové kotouče je v oboru dobře známé a aktivaci povrchu papíru použitého ve způsobu podle vynálezu je možné provést obdobně jako v dosud známých způsobech v oboru. Alergeny jsou většinou proteiny, glykoproteiny, lipoproteiny a některé hapteny navážené na lidský sérový albumin (HSA). Na aktivovaný povrch terče se pak kovalentně navazuje aminoskupina, sulfo-karbony1ová skupina a další skupiny.

Papírové kotouče mohou být například aktivované následujícím způsobem podle NIBSC (National Institute for Biological Standards and Controls, U.K). Kotouče se nejprve nechají nasáknout v nádobce vodou ve které se ponechají asi 30 minut. Potom se přidá 5% roztok bromkyanu a obsah nádobky se míchá asi 10 minut při teplotě místnosti s použitím mechanického míchadla. Přidá se hydroxid sodný (0,05 M) tak, aby hodnota pH se udržela v rozmezí 10,25 až 10,50. Směs se pak vlije do chladného roztoku hydrogenuhličitanu sodného,

0 * «« 0

0 0 0 00 00 kotouče se oddělí a promyjí se roztokem uhličitanu sodného (5 x) a potom acetonem (4 x). Pak se kotouče suší přes noc v atmosféře dusíku načež jsou připravené pro použití ve způsobu stanovení podle vynálezu. Jsou také známé alternativní způsoby přípravy, například s použitím jiného pufru, například fosforečnanu draselného a jiného rozmezí pH, například 11,0 až 12,0.

Aktivované materiály z plastických hmot, jako je polystyren, polyamid nebo nylon, jsou obchodně dostupné například od firem Nunc GmbH, Wiesbaden, Německo, Pall Bio Support Div., Port Washington, New York, USA, nebo Gelman Sciences Ltd., Northampton, Velká Británie.

V provedení podle vynálezu je zvláště výhodné připravit aktivované terče v předstihu před jejich použitím při stanovení. Je možné je připravit hromadně a poměrně snadno uchovávat například v dokonale vzduchotěsných nádobkách při asi 4 °C po dobu až asi 2 let. Během této doby si kotouče uchovají svoji autoreaktivitu. Podle dalšího vysoce výhodného provedení vynálezu mohou být aktivované kotouče umístěny jednotlivě do analytických nádobek, například do jamek mikrotitrační destičky, kde jamky se dokonale uzavřou, a aktivované terče jsou uchovány v připraveném stavu pro vlastní stanovení. Na rozdíl od výše uvedeného je třeba uvést, že kotouče s naneseným alergenem dosud používané v oboru, musí být uchovávány bucf v 1 yofi 1 izovančm stavu (kdy se musí před použitím provést rekonstituce) nebo se musí uchovávat po celou dobu před použitím v pufru.

Podle dalšího aspektu tedy vynález zahrnuje uzavřenou nádobku obsahující aktivovaný terč pro stanovení podle vynálezu. Touto nádobkou může být mikrotitrační jamková • 000 * 0 • · 0*0 · · 00 00 0 0000 00 0 0000

00 00 ·· 00 00 destička, a to například celá destička, proužek nebo jednotlivá jamka.

Přestože použití preaktivovaných kotoučů je zvláště výhodné, je také možné provést aktivaci terče v reakční nádobce před stupněm (a) imunostanovení. Toto provedení není výhodné ale je možné.

V německém patentu č.4123324 je popsán kotouč s navázanými antigeny nebo protilátkami, který je zvláště vhodný pro použití v testech na alergii. Jedinečný rys tohoto kotouče spočívá v tom, že obsahuje v podstatě centrální otvor nebo oko a má tedy prstencový tvar. Výhoda tohoto kotouče je v tom, že v případě použití kolorimetrického nebo fluorimetrického stanovení je možné konečné spektrální stanovení provést přímo v tekutině v reakční nádobce pomocí světelného paprsku procházejícího otvorem nebo okem v kotouči. To odstraňuje potřebu vyjmout tekutinu nebo kotouč z nádobky před provedením spektrálního stanovení (což je nezbytné u kotoučů neobsahujících otvor).

Tyto kotouče jsou zvláště výhodné pro použití podle vynálezu a podrobnosti o nich jsou uvedeny v DE 4123324 C. Ve způsobu podle vynálezu se na tyto kotouče (dále pro zjednodušení ale bez jakéhokoliv omezení se označují jako prstence) naváže příslušný alergen (nebo jiné činidlo) ve stupni (b) způsobu podle vynálezu. Aktivované kotouče podle stupně (a) jsou připravené pro navázání alergenu. Uvedené prstence mají kromě výhody popsané výše rovněž další a neočekávané výhody ve stupni (b) podle vynálezu, jak bude popsáno dále.

Pracovníkům v oboru je známý obvyklý způsob provedení / 9 · 9*9 «9 9 9 9 9 * « 99 999 9 9 99 99 9

9999 9* 9 9999

9· 99 99 999 99 99 pomocí sestavy nebo sady reakčních nádobek, například mikrotitračnícb destiček obsahujících například 96 jednotlivých reakčních nádobek. Způsob podle vynálezu je možné pochopitelně provést tímto způsobem, s použitím různých alergenů přidaných do jednotlivých nádobek pro každý vzorek určený ke stanovení ve stupni (b) a s přidáváním alikvotních podílu stejného vzorku ve stupni (c). Použití mikrotitračních destiček a podobných systémů pro souběžné provedení více stanovení je samozřejmě dobře známé a nebude dále popisováno.

Ve stupni (b) způsobu podle vynálezu se přidá do reakční nádobky (obsahující reaktivní terč) první tekuté reakční činidlo, které reaguje s povrchem terče a naváže se na jeho povrch. Pochopitelně, v případě testů na alergii, je toto první reakční činidlo alergen (t.j. ten alergen jehož citlivost odezvy se zjišťuje). Tento alergen se naváže na povrch terče. V případě jiných testů než je hodnocení alergie se první reakční činidlo zvolí tak aby bylo vhodné pro daný test jak bude pracovníkům v oboru jasné.

Příprava alergeny potažených papírových kotoučů dosud známými způsoby v oboru pro použití například v RAST (obchodní značka) způsobu, se provádí reakcí mezi alergenem a povrchem papírového kotouče, kde tento proces trvá obvykle několik hodin (například až 24 hodin) než je proces dokončen. Tato dlouhá doba přípravy však není zvláštní nevýhodou dosavadních známých způsobů, protože papírové kotouče se připravují v předstihu před stanovením a uchovávají se.

Nicméně ve způsobu podle vynálezu by tato dlouhá doba přípravy byla nevýhodou, protože samotné potahování disků tvoří součást samotného způsobu stanovení. Autoři vynálezu nalezli způsob jak překonat uvedený problém s použitím * 9 *

9

9» 9

9 9 9

9 9 9

9

9

9 9

999 • 999 • 9 9 9 • · 9 9

9· ·» urychlovačů a/nebo katalyzorú vazebné reakce. Tímto způsobem dojde k dokončení vazby mnohem rychleji, například do asi 60 minut. Vhodné urychlovače a katalyzátory jsou pracovníkům v oboru známé, a zahrnují například peroxidy a různé další zdroje nebo katalyzátory volných radikálů.

Urychlovače a/nebo katalyzátory lze výhodně včlenit do prvních tekutých reakčních činidel, a tímto způsobem je společně dávkovat do reakčních nádobek a uvádět je tak do styku s aktivovaným povrchem. Použití urychlovačů a/nebo katalyzátorů nijak celý způsob nekomplikuje, protože je možné je smísit s prvním tekutým reakčním činidlem.

Aktivované prstence lze například potáhnout alergenem následujícím způsobem. Prstence jsou umístěny (při uchovávání) >4 v jednotlivých jamkách mikrotitrační destičky. Do každé jamky se pak vnese 50 μΐ tekutého roztoku alergenu obsahujícího urychlovač. Pak se jamky podrobí krouživému protřepávání trvajícímu 50 až 60 minut při teplotě místnosti. Pak se do každé jamky přidá asi 50 μΐ přerušovacího roztoku, například roztoku epichlorhydrinu nebo diethanolaminu, a obsahy jamek se důkladně promíchávají při teplotě místnosti dalších 20 až 30 minut. Nakonec se potažené prstence promyjí (3 x) promývacím roztokem.

Tekuté alergeny (extrakty) se výhodně připravují a hodnotí podle práce Method of the Laboratory of Allergenic Products DBF, OBRR, CDB a FDA 1986 a standardními způsoby pro kontrolu alergenových extraktů používaných NIBSC. Všechny extrakty, používané pro vazbu na pevnou fázi se výhodně testují vhodným způsobem aby se zajistila vhodnost jejich použití. U pylových extraktů je minimálním požadavkem shoda záznamu isoelektrické fokusace s referenčním • · « toto to totototo ·· «· ·· ·♦· toto toto přípravkem OBRR. U extraktů z Dermatophagoides je minimálním požadavkem prokázání shody s OBRR referenčním přípravkem při RAST (obchodní značka) inhibici. U extraktů z potravin je minimálním požadavkem prokázání shody s obchodně dostupnými extrakty (Prick testovací roztok) při RAST (obchodní značka) inhibici. Příklad způsobu přípravy extraktu alergenu je následující:

1. 4 gramy zdroje alergenu se extrahují s 40 ml vhodné extrakční tekutiny za mírného promíchávání po dobu 20 hodin při 4 °C.

2. Získaná směs se odstředuje 30 minut při 4 °C a při 10 000 x g.

3. Supernatant se zfiltruje přes membránový filtr 0,22.

4. Filtrát se dialyzuje proti pufru v dialyzační trubici MWCO 7 000.

5. Přidá se stabilizátor a urychlovače/katalyzátory.

Po reakci mezi prvním reakčním činidle a povrchem aktivovaného terče se tekutina v nádobce odstraní, obvykle odsátím, a nádobka a kotouč se promyjí. Aby se zajistilo, že na povrchu kotouče již nezbývají Žádná aktivní místa (která by mohla intereferovat v následujících stupních stanovení), výhodné se terč promyje s přerušovacím prostředkem (například s EPA 33 nebo s roztokem dietanolaminu). Ve všech případech se pak promývací tekutina odstraní.

Při přípravě alergenem potažených kotoučů, kde každý je v příslušné reakční nádobce, je důležité zajistit tak jak je to υ

• · ··· * · « · • · « · ·· ·· • · · • · ·

9 9 t*

9 9 * • · · « ♦ 9 9 9

99 možné, aby celý povrch (obě strany) terče mohl reagovat s alergenem. Proto je Žádoucí zajistit aby pro účel daného testu byl k dispozici dostatek alergenu. To je zvláště důležité v případě prstenců popsaných výše (a v DE 4123324 C2), protože dostupná plocha povrchu prstenců je menší než u odpovídajících kotoučů bez otvoru.

Autoři vynálezu našli způsob jak zajistit, aby prstence byly příslušným způsobem potažené. Zejména bylo zjištěno, že jestliže se nádobka podrobí protřepávání, zejména krouživému protřepávání, prstence mají sklon se v prvním reakčním činidle pohybovat vzhůru a dolů, čímž se oba povrchy dostávají s tekutinou do styku a mohou s ní reagovat. Podle vynálezu je tedy výhodné v případě použití terčů ve formě prstenců podrobit nádobku během stupně (b) stanovení krouživému třepání. Ve skutečnosti je výhodné nádobku podrobit krouživému třepání kdykoliv během stanovení, kdy je zapotřebí dosáhnout dobrý kontakt mezi tekutinou v nádobce a povrchy prstence. Krouživé protřepávání se také výhodně použije ve stupni (c) k zajištění dobrého kontaktu mezi povrchem terče s navázaným alergenem s analyzovaným vzorkem.

Ve stupni (c) stanovení podle vynálezu se vnese do reakční nádobky obsahující terč s navázaným činidlem analyzovaný vzorek. V případě například standardního zjišťování alergie je činidlo navázané na terč příslušný alergen, a jakýkoliv IgE přítomný ve vzorku se bude vázat na alergen na kotouči. Následně se pak protilátky navázané na alergen stanoví přímým nebo nepřímým způsobem (stupeň (d)). Tekutý vzorek je obvykle krevní sérum, ale pro stanovení příslušných analytů je možné použít i další biologické tekutiny.

0 0 ··· * · * · · · * · * 0 0 0 * · 000000

0000 00 0 0000

00 00 »00 0« 00

I když jak bylo výše uvedeno, vynález je zvláště vhodný pro standardní stanovení IgE alergie, není vynález na toto stanovení omezen. Například pro určité účely je Žádoucí aby postup umožnil stanovení IgG^, například v případě bodnutí včelou nebo vosou. Způsob podle vynálezu tento postup umožňuje. Dále pro diagnostické nebo pro terapeutické aplikace mohou být prospěšné testy mukózní tekutiny na obsah IgA protilátek, kde způsob podle vynálezu lze využít při provedení testů na antigen-specifické sekreční IgA protilátky Jak bude pracovníkům v oboru zřejmé, jsou možné i další aplikace vynálezu, například týkající se stanovení thyroidního hormonu atd., zejména v případech provedení série podobných testů na stejném vzorku.

Ve stupni (d) způsobu, se provede stanovení analytu (pokud je přítomen) navázaného na terč. Tento postup je v oboru dobře známý, a proto nebude dále podrobněji popisován.

Ve výhodných stanoveních podle vynálezu, kde terč je tvořen prstencem, se použije kolorimetrické stanovení. Optické stanovení se provede pomocí svazku paprsků procházejího otvorem v prstenci. Nicméně je možné použít i další způsoby, například enzymatické nebo radioaktivní stanovení, kde tyto způsoby se provedou obvyklým způsobem, jako je například odstranění tekutiny z nádobky a její analýzou na jiném místě, nebo vyjmutím prstence a stanovením jeho radioaktivity.

Jednoduchou formu příkladu znázorňujícího stanovení alergenu podle vynálezu lze uvést provedením podle následujícího způsobu.

V jamkách mikrotitrační destičky jsou umístěny aktivované papírové prstence. Následující stupně lze provést © · ··· © « · · © · · • · · · · · ©· ·© ·© »©* • © · · © © © · · • · · © ·· ©t automatizovaným způsobem:

1) na prstence v každé jamce se vnese po 50 μΐ příslušeného alergenu;

2) za třepaní se nechá probíhat po dobu 1 hodiny inkubace;

3) jamky se promyjí (x 1) 300 μΐ podíly promývacího roztoku, kterým je 1% hovězí sérový albumin (BSA) a 0,005% tween 20 ve fosforečnanovém solném pufru (PBS);

4) do každé jamky se přidá po 100 μΐ přerušovacího roztoku;

5) nechá se probíhat inkubace po dobu 0,5 hodiny;

6) jamky se promyjí (x 3) vždy 300 μΐ promývacího roztoku;

7) do příslušných jamek se vnese po 50 μΐ standardu nebo vzorku;

8) po dobu 1 hodiny se nechá probíhat inkubace;

9) jamky se promyjí (x 3) 300 μΐ promývacího roztoku;

10) do každé jamky se vnese 50 μΐ konjugátu;

11) po dobu 1 hodiny se nechá probíhat inkubace;

12) jamky se promyjí (x 3) 300 μΐ promývacího roztoku;

v v • · ··· • · « • · « * « · · · ·« ··· • · ·«

13) do každé jamky se vnese po 100 μΐ roztoku enzymového substrátu;

14) po dobu 0,5 hodiny se nechá probíhat inkubace;

15) do každé jamky se vnese po 100 μΐ přerušovacího roztoku;

16) provede se odečet optického parametru při 405 nm ref 620/630;

17) výsledky se vytisknou v m.j./ml a vyhodnotí se.

Celková doba analýzy je 4 hodiny (údaje vztažené k odsávání jsou pro zjednodušení vynechány).

Pro snadnější pochopení vynálezu jsou jeho hlavní rysy formou příkladu dále popsány pomocí obrázků v připojených nákresech.

Popis obrázku na připojených nákresech

Na obrázku 1 je schematicky znázorněno jedno provedení způsobu podle vynálezu;

obrázek 2 znázorňuje vertikální pohled v řezu na reakční nádobku s pevným nosičem; a obrázek 3 znázorňuje standardní křivku pro stanovení dále popsané v příkladu 3.

Na obrázku 1 je schematicky znázorněn jeden systém pro provedení způsobu podle vynálezu. Tento systém obsahuje zdroj • · · 4 4 4 4 4 4 a 4 4 4 4

4 4 4 4 4 · · 4 4 ·

44 44 444 44 44 nebo zásobník 1 reakčních nádobek 2, a zásobník 2 terčů, například kotoučů nebo prstenců. Jak je ve schématu znázorněné, terčem je papírový disk 5 s centrálním otvorem 6. Zařízení obsahuje prostředky (nejsou znázorněné) pro vnesení jednoho kotouče 5 do každé z reakčních nádobek 2.

Do nádobky 2 se pak vnese příslušné množství prvního reakčního činidla 10 vybraného se zásobníku 1 1, který obsahuje všechna první reakční činidla potřebná pro provedení určeného stanovení. K nasátí zvoleného prvního reakčního prostředku 10 ze zásobníku a jeho vnesení do nádobky 2 lze použít obvyklý dálkově ovládaný aspirátor a dávkovač vzorku (není znázorněn).

Nádobka 2 se pak podrobí krouživému třepání v třepačce 1t. které se nechá probíhat přiměřenou dobu (například 30 až 60 minut) tak aby se první reakční činidlo navázalo na kotouč

5. Jestliže je zapotřebí aby se na disk 5 vázala po prvním reakčním činidle 10 další reakční činidla, lze tato činidla automatickým přídavkem dodat do nádobky 2 před a nebo po přídavku prvního reakčního Činidlo podle toho jak je zapotřebí.

Jakmile došlo k navázání prvního reakčního činidla 10 na obě strany kotouče 5, z nádobky 2 se odsaje tekutina a kotouč se promyje. Tento operační stupeň je na obr.l znázorněn symbolem 15.

V dalším stupni se do nádobky 2 přidá ze zásobníku 20 přerušovací roztok, pro k zablokování zbývajících aktivních míst na kotouči 5. Pak se roztok z nádobky odsaje a obsah se promyje 15.

* · fcfc * * • fcfc fc « fc · fc ·· fcfc fc v··· fcfc · fcfcfcfc fcfc fcfc · ··· fcfc fcfc

Do nádobky 2 se pak přidá ze zásobníku 31 alikvotní podíl vzorku 30, a pak se nechá probíhat reakce mezi stanovovaným analytem (je-li ve vzorku obsažený) a prvním reakčním činidlem 10. Nádobka může být v této fázi protřepávána a/nebo inkubována, jak je to vhodné.

Po skončení reakce se tekutina v nádobce 2 odstraní odsátím a kotouč 5 se promyje 15. Potom se přítomnost a/nebo množství analytu navázaného na kotouč 5 stanoví obvyklým způsobem. Do nádobky 2 se přidá jedno nebo více tekutých činidel pro stanovení 40 (ze zásobníků 43, 44.) a po skončení reakce se provede kolorimetrické stanovení s použitím světelného zdroje 41 a senzoru 42. Dráha světla je obvykle vzhledem k nádobce axiální a prochází otvorem 6 v disku 5.. Výsledky lze vytisknout nebo zobrazit v jednotce 50.

Celý systém 51 je řízen počítačem 52 a celý postup tak může probíhat automaticky.

Na obrázku 2 je znázorněna reakční nádobka 2 s obsaženým papírovým kotoučem 5. Uvedený kotouč obsahuje centrální otvor

6. Přestože kotouč 5 má průměr jen o málo menší než nádobka 2, a je tak těsně v nádobce umístěn, obě strany disku, horní 60 a spodní 61 se zúčastní vazby s prvním reakčním činidlem. Když se nádobka 2 podrobí krouživému protřepávání, kotouč má sklon se zvedat od dna nádobky a rotovat, přičemž tekutina víří kolem otvoru 6. Výsledkem je, že oba povrchy disku jsou plně v kontaktu s tekutinou která s nimi reaguje a nebo s promývací tekutinou. Protože disk 5 těsně doléhá ke stěnám nádobky 2> otvor 6 je automaticky ve středu nádobky 2, což zajišťuje, že dráha světelných paprsků 62 je obecně k nádobce 2 v axiální poloze.

• · φφ • · • · φ φφφ φ φ φφ «φ φ φφφφ φφ · φφφφ φφ φφ φφ φφφ φ φ φφ

Pro lepší pochopení vynálezu jsou pouze pro znázornění uvedeny následující příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Aktivace papírových prstenců

Papírové prstence (o průměru 6,3 mm) mající centrální otvor (o průměru 2,0 mm ± 0,1 mm) se nechají během 10 minut v sintrované skleněné nálevce při teplotě místnosti nasáknout pufrem (pH 11,9) obsahujícím fosforečnanem draselný (K3PO4). Pak se prstence promyjí dalším podílem pufru obsahujícího fosforečnan draselný. Promyté prstence se pak umístí do skleněné kádinky obsahující 100 ml pufru s fosforečnanem draselným na 1000 prstenců. Tato směs míchá způsobem při kterém se prstence v pufru pohybují až do ustálení pH. Pak se během asi 1 minuty pomalu přidá roztok 0,435 g bromkyanu v 10,0 ml acetonitrilu na 1000 prstenců, a pokračuje se v promíchávání. Hodnota pH směsi se po dobu 10 minut po přídavku bromkyanu udržuje v rozmezí mezi 11,5 až 12,0 přídavkem hydroxidu sodného.

Aktivované prstence se pak převedou do sintrové skleněné nálevky na Er1enmayerově baňce a promyjí se vodou. Promyté prstence se pak vysají do sucha filtračním papírem a umístí se do sáčku z plastické hmoty s připojeným přívodem suchého dusíku. Sáčkem se nechá proudit plyn tak, aby došlo k vysušení aktivovaných prstenců. Jakmile se u prstenců docílí jejich v podstatě původní suché hmotnosti, uzavřou se v sáčku z plastické hmoty a uchovávají se v evakuovaném exsikátoru při asi -20 °C.

· · ··» ··· » ♦ » ♦ ······· ·«··«· • · · » φφ · »««· ·· ·φ ·* ««φ φ· «φ

Příklad 2

Navázání prvního reakčního činidla na aktivované prstence

Jednotlivé aktivované prstence připravené podle příkladu 1 se umístí do mikrotitrační jamkové destičky (jeden kroužek do jamky) a do každé jamky se přidá 50 μΐ roztoku alergenu (obsahujícího peroxidový urychlovač). Pak se jamky podrobí krouživému protřepávání po dobu 1 hodiny, načež se tekutina z jamek odstraní odsátím. Pak se prstence v jednotlivých jamkách promyjí s 300 ml promývacího roztoku (1% BSA, 0,005% tween 20 v PBS). Po odstranění promývacího roztoku odsátím se do každé jamky přidá 100 μΐ přerušovacího roztoku reagujícího s případnými zbylými reaktivními místy na povrchu prstence. Po inkubaci trvající 30 minut se roztok odstraní odsátím a prstence se třikrát promyjí 300 μΐ podíly promývacího roztoku. Potom jsou prstence připravené k použití při vlastním stanoveni.

Výše uvedený způsob lze aplikovat na všechny obvyklé alergeny. Použijí se roztoky alergenů standardizované na každý alergen (pracovníkům v oboru je tento postup známý). Obvyklý urychlovač je kyselina peroxyoctová. Přerušovací roztok je diethanolamin (pH 9,8).

Příklad 3

Stanovení

Stanovení různých alergenů přítomných ve vzorku se provede následujícím způsobem.

Použijí se mikrotitrační destičky obsahující v každé jamce aktivované papírové prstence připravené způsobem popsaným v příkladu 1. Pak se do každé jamky vnese 50 μΐ

Φ a ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ · φ · • Φφ φφφ Φ φ ΦΦ · · Φ

ΦΦΦΦ ΦΦ Φ Φ · Φ Φ

ΦΦΦΦ ΦΦ ·ΦΦ φφ Φ· roztoku alergenu, který se naváže na papírový prstenec jak je popsáno v příkladu 2.

K provedení vlastního stanovení a odvození požadované standardní křivky se do jednotlivých jamek obsahujících příslušné papírové prstence s prvním reakčním činidlem přidají 50 μΐ podíly IgE standardu (lidský v PBS s 10% koňským sérem) a stanovovaného vzorku. (Při stanoveních celkového IgE se použije král ičí-anti-(1idský IgE) (Dako). Jamky se inkubují 1 hodinu za krouživého protřepávání a potom se tekutina z jamek odsaje a papírový prstenec se třikrát promyje 300 μΐ podíly promývacího roztoku.

V tomto stupni došlo k navázání příslušného IgE na příslušný prstenec. V příštím stupni se provádí kvantitativní vyhodnocení množství IgE. Do každé jamky se přidá 50 μΐ kozího anti-3idského-IgE konjugovaného s markerovým enzymem, v PBD s 1% BSA, Mg, Zn a s některým ze stabilizátorů. Použitým enzymem v tomto příkladu je alkalická fosfatasa. Po jedné hodině inkubace se prstence třikrát promyjí 300 μΐ podíly promývacího roztoku. Pak se do každé jamky přidá po 100 μΐ roztoku substrátu, kterým je pro alkalickou fosfatasu PNPP. Po 30 minutách inkubace se do každé jamky přidá 100 μΐ přerušovacího roztoku (v tomto případě 2 N hydroxidu sodného) k ukončení enzymatické reakce.

Pak se změří v každé jamce barva tekutiny (optická hustota) při 405 nm. Z hodnot z jamek ve kterých byl použit standard se vynese kalibrační nebo standardní křivka. Z této křivky a z hodnot optické hustoty (OD) získané z příslušných jamek pro hodnocení vzorku se vyhodnotí množství

IgE-proti látek na různé testované alergeny ve vzorku.

t · i i ©«· © · · · « © · * ·* ·* • © · ·* ·*·

Na obrázku 3 je znázorněna standardní křivka získaná z naměřených hodnot. Celé stanovení zahrnuje jednak výsledky potřebné pro konstrukci standardní křivky, a rovněž výsledky stanovení různých alergenů ve vzorku pacienta, které jsou uvedeny v následující tabulce. Vzorek byl hodnocen na alergen Dl, alergen ml, alergen el, a alergen t3. Obvyklým způsobem byla prováděna postupná ředění, jak je uvedeno.

dl = Dermatophagoides pteronyssinus ml = Alternaria tenuis el = kočičí chlupy + epithelium t3 = pyly z břízy m2 = Aspergillus amstelodami m50 = Aspergillus flavus ml5 = Cladosporium herbarum ml6 = Curvularia lunata * * »»« · · · ♦ * · * ft ftft ftftft ft ft ftft ftft » ftftftft ftft · ftftftft • ftftft ftft ftftft ftft ··

Mikrotitrační destička

j amka-ozn.	standardy	ID OD	konc.	M-OD	M-konc
AO1BLK		0,061		0,056
BO1BLK		0,052
CO1STD1	0,0	0,042	0,00	0,051	0,00
DO1STD1		0,060	0,00
EO1STD2	0,35	0,112	0,46	0,109	0,42
FO1STD2		0,105	0,38
GO1STD3	0,7	0,167	1,03	0,157	0,93
HO1STD3		0,148	0,83
AO2STD4	3,5	0,515	4,92	0,497	4,69
BO2STD4		0,479	4,47
CO2STD5	17,5	1,319	20,04	1,312	19,76
DO2STD5		1,304	19,49
EO2STD6	50,0	1,814	59,93	1,768	53,51
FO2STD6		1 ,722	47,10
GO2STD7	100,0	2,026	105,60	2,000	100,10
HO2STD7		1,975	94,61

j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
AO3	d-p-alergenDl	1	1,281	18,69	1,214	16,96
BO3	d-p	1	1,148	15,23
CO3	1.2	2	0,896	10,48	0,979	11,97
DO 3	1.2	2	1,061	13,45
E03	1.4	3	0,720	7,68	0,732	7,85
FO3	1.4	3	0,743	8,03
GO3	1.8	4	0,394	3,48	0,384	3,36
H03	1.8	4	0,373	3,24

4 4 4« *

• · 4

4 4

4 4

4 4

4 444

jamka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
Λ04	1.16	5	0,238	1,78	0,222	1,61
B04	1 .16	5	0,206	1,44
CO 4	1.32	6	0,183	1,19	0,184	1 ,21
D04	1.32	6	0,185	1,22
E04	1.64	7	0,124	0,58	0,120	0,54
F04	1.64	7	0,117	0,51

jamka-ozn. Vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
G04	p312012 alergen m1	8	0,243	1,83	0,224	1 ,63
H04	p312012 alergen ml	8	0,205	1,43
A05	1.2	m2	9	0,305	2,49	0,336	2,84
BOS	1.2	m2	9	0,368	3,18
CO 5	1.4	m50	10	0,359	3,09	0,369	3,20
D05	1.4	m50	10	0,379	3,31
E05	1.8	ml 5	11	0,343	2,91	0,341	2,89
F05	1.8	ml5	11	0,340	2,88
GO5	1.16	ml 6	12	0,294	2,37	0,283	2,26
H05	1 .16	ml 6	12	0,273	2,15
AOÓ	1.32 1:2	m50	13	0,276	2,18	0,266	2,08
B06	1.32 1:2	m50	13	0,257	1,98

: · i * · · «· * ·· • » »·« fc · · · • · · · «V fc*

ΔΔ fc

j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
C06 p342	alergen el	14	0,826	9,32	0,814	9,13
D06 p342		14	0,802	8,94
E06	1.2	15	0,614	6,19	0,589	5,86
F06	1.2	15	0,564	5,53
G06	1.4	16	0,347	2,95	0,343	2,90
H06	1.4	16	0,338	2,86
A07	1 .8	17	0,220	1,59	0,220	1,60
B07	1.8	17	0,221	1,60
C07	1.16	18	0,146	0,81	0,164	1,00

j amka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
DO7	1 .16	18	0, 182	1, 18
EO7	1 .32	19	0,109	0,42	0,105	0,38
FO7	1.32	19	0,102	0,35

* · * · • · k

·* »·* ·♦

jamka-ozn.	vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M~konc
G07 pl30	alergen	t3 20	0,871	10,06	0,870	10,04
H07 pl30		20	0,869	10,02
A08	1.2	21	0,966	11,69	0,959	11 ,56
B08	1.2	21	0,951	11,43
C08	1.4	22	0,729	7,82	0,736	7,94
D08	1.4	22	0,744	8,05
E08	1 .8	23	0,451	4,14	0,461	4,25
F08	1.8	23	0,470	4,36
G08	1.16	24	0,282	2,24	0,274	2,15
H08	1.16	24	0,266	2,07
A09	1.32	25	0,179	1, 15	0,175	1,11
B09	1.32	25	0,171	1 ,07
C09	1.64	26	0,113	0,47	0,123	0,57
DO 9	1.64	26	0,133	0,67

jamka-ozn. vzorky	ID	OD	konc.	M-OD	M-konc
EO9 D-P FO9 D-P	dl 27 dl 27	1,194 1,125	16,29 14,74	1,160	15,52

• 9 999 w · ·· »999 • * 9 »99* » 99 9 9 9 9 · 9» »9 9 »999 99 9 »999

99 99 >99 99 99 jamka-ozn. vzorky

ID OD konc. M-OD M-konc.

GO9 P312012

HO9 Ρ312012 ml 28 ml 28

0,245

0,236 ,85 1,75

0,241

1,80 jamka-ozn. vzorky ID OD konc. M-OD M-konc.

A10	p342	e 1	28	0,812	9,10	0,809	9,05
BIO	p342	e 1	28	0,806	9,00
CIO	Ρ130	t3	30	1,089	14,00	1,009	12,52
D10	pl 30	t3	30	0,929	11,04

Příklad 4

Stanovení IgE na D.pteronyssinus

Papírové prstence aktivované způsobem popsaným v příkladu 1 se umístí do mikrotitrační jamky (jeden prstenec do jedné jamky) a do každé jamky se přidá 50 μΐ extraktu

Dermatophagoides pteronyssinus, který obsahuje 0,05 % (hmotn./obj.) kyseliny peroxooctové. Po inkubaci probíhající 1 hodinu za krouživého protřepávání při teplotě místnosti se každý z prstenců jednou promyje 300 μΐ promývacího roztoku popsaného v příkladu 2. Potom se přidá do každé jamky 100 μΐ přerušovacího/neutralizačního roztoku (diethanolaminu) popsaného v příkladu 2. Po inkubaci probíhající 30 minut za krouživého protřepávání při teplotě místnosti se každý prstenec třikrát promyje vždy 300 μΐ promývacího roztoku.

Tyto prstence se pak použijí při stanovení následujícím

« ·	V ···	• *	•	» 9 9 *
• »	* »
• »	« ·	• *	•	» *	fc *
99	·«	··	·· ·	««	fc*

způsobem. Do každé příslušné jamky se vnese po 50 μΐ standardu nebo vzorku. Po 1 hodinové inkubaci za krouživého protřepávání se prstence třikrát promyjí vždy 300 μΐ promývacího roztoku. Do každé jamky se pak vnese 50 μΐ konjugátu jak je popsané v příkladu 3. Po 1 hodinové inkubaci za krouživého protřepávání se prstence promyjí třikrát 300 μΐ podíly promývacího roztoku. Pak se do každé jamky přidá 100 μΐ roztoku substrátu jak je popsáno v příkladu 3. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se přidá do každé jamky 100 μΐ přerušovacího roztoku. Potom se v každé jamce odečte optická hustota tekutiny při 405 nm ref 620/630. Vynese se křivka závislosti optické hustoty na koncentraci standardu a tato křivka se použije k odečtení koncentrace specifického IgE v každém vzorku.

v •	v 0·«	9 «	V 0	0	V 0	V 0	0 0
•	• 0	0	0	0	•	0	0
	• 0	• 0	00·	• 0

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob imunostanovení analytu v tekutém vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

   a) umístění reaktivního terče do nádobky;

   b) přídavek prvního tekutého reakčního činidla do nádobky, kde toto činidlo reaguje s povrchem terče a naváže se na něj;

   c) přídavek tekutého vzorku obsahující stanovovaný analyt do nádobky, přičemž uvedený analyt se imunospecificky přímo nebo nepřímo naváže na uvedené první réakční činidlo na uvedeném terči; a

   d) přímé nebo nepřímé stanovení analytu navázaného na terči.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že terč je kotouč z papíru nebo z plastického materiálu který má aktivovaný povrch.
3. 3. Způsob podle nároku 2vyznačující se tím,

   Že uvedený kotouč obsahuje centrální otvor.
4. 4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že uvedená nádobka se ve stupních (b) a (c) podrobuje krouživému třepání.
5. 5. Způsob podle nároku 1,2,3, nebo 4, vyznačuj ící t '7 * » ’ · ·» ...»

   Z / * · ··* * · * t » * · • · · · · » · · · * * · · » · * » · * » kk·.

   ·· ·· ·« kkk sk kk se t í m , že stupeň (d) se provádí v obsahu přítomném v nádobce.
6. 6. Způsob podle nároku 1,2,3,4 nebo 5, vyznačující se tím, že imunostanovení je určené pro diagnózu alergie a kde prvním reakčním činidlem je alergen, a analyt je IgE imunospecifický pro tento alergen.
7. 7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 6 vyznačující se t í m , žc ve stupni (a) se do uvedené nádobky umístí terč, který již byl aktivován pro autoreakci s uvedeným prvním reakčním činidlem.
8. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 vyznačující se t í ni , že jeden tekutý vzorek se analyzuje na přítomnost více jednotlivých analytů v něm obsažených a kde stupně (a) až (d) se provádějí s ohledem na každý analyt v příslušné nádobce.
9. 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že probíhá automaticky za řízení počítačem.
10. 10. Způsob imunostanovení specifického IgE v krevním séru k diagnóze specifické alergie vyznačující se t í m , že zahrnuje

    a) navázání prvního reakčního činidla na papírový kotouč umístěný v reakční nádobce, kde toto první reakční činidlo je neznačený alergen specifický k IgE určenému ke stanovení;

    b) uvedení papírového kotouče v nádobce do styku se vzorkem séra, čímž se případně přítomný specifický IgE «00 00 • 0000 · 0

    0 0 0 0 0 0 0

    0 0 0 0 0 0

    00 00 00

    00 0000

    0 0*00 * « 0 0 « 0 * 0*00

    00* 0* *0 naváže na první reakční činidlo na kotouči; a

    c) přímé nebo nepřímé stanovení IgE navázaného na kotouč umístěný v nádobce.
11. 11, Způsob imunostanovení analytu v tekutém vzorku vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

    a) navázání prvního reakčního Činidla na papírový kotouč s otvorem, který je umístěný v reakční nádobce;

    b) uvedení tohoto kotouče v uvedené reakční nádobce do styku se vzorkem, přičemž analyt se naváže na první reakční činidlo na kotouči; a

    c) přímé nebo nepřímé stanovení analytu navázaného na kotouč v nádobce optickou analýzou umožněnou otvorem v kotouč i.
12. 12. Způsob imunostanovení vybraného analytu v tekutém vzorku vyznačující se t í m , že tento způsob zahrnuje;

    a) umístění papírového kotouče majícího reaktivní povrch do reakční nádobky;

    b) vnesení tekutého činidla do reakční nádobky přičemž dojde k jeho kontaktu s kotoučem, a činidlo se naváže na povrch kotouče;

    c) promytí kotouče v nádobce;

    d) vnesení tekutého vzorku do nádobky, přičemž případný vybraný analyt se naváže na reakční činidlo na uvedeném

    9 « 9 * • 9 999 * • 9 9 9 9 9

    9 9 f 9 9 kotouči; a

    e) přímé nebo nepřímé stanovení analytu na kotouči v nádobce, bez vyjmutí kotouče z nádobky.
13. 13. Systém pro kontinuální provedení imunostanovení pro více stejných nebo podobných zkouškek v biologické tekutině a pro více analytů v ní obsažené, vyznačující se t í ni , že v každé zkoušce se vzorek uvede do styku s vybraným specifickým reakčním činidlem pro danou zkoušku navázaným na nerozpustný terč, kde uvedený systém obsahuje více reakčních nádobek z nichž každá obsahuje aktivovaný terč; více prvních tekutých reakčních činidel; prostředky pro dávkování zvoleného prvního reakčního Činidla do každé reakční nádobky; prostředky pro míchání nádobek; prostředky pro dávkování vzorku do každé nádobky; a prostředky pro stanovení dané složky směsi v dané nádobce; a kde uvedené prostředky pro dávkování a stanovení jsou automaticky řízené počítačem.
14. 14. Uzavřená nádobka pro imunostanovení vyznačuj í cí se t í m , že uvedená nádobka obsahuje aktivovaný papírový kotouč nebo prstenec.
15. 15. Nádobka podle nároku 14 vyznačující se tím, že je to jamka mikrotitrační destičky.
16. 16. Proužek s mikrotitračními jamkami, nebo mikrotitrační destička, vyznačující se tím, že alespoň některé jamky jsou uzavřené a obsahují aktivovaný papírový kotouč nebo prstenec.