JP2582352B2 - 高速分析プロセツサ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明はサンプルを処理する方法、システム及び装
置に関し、特に（１）複合体形成反応原理に基づいたサ
ンプルの分析方法と、（２）親和力によって結合された
物質の除去を実行するためのシステム、装置及び方法に
関する。この分析方法範囲内に属するのは、免疫学的分
析原理、核酸ハイブリッド形成原理、親和力複合体形成
原理に基づく試験である。複合体形成技術は、可溶性坑
原、細胞、細胞小片、微生物及びそれらの生産物の検出
を含む広範囲の分析に適用できる。又親和力分離の範囲
に含まれるのは生命分子の複雑な混合体からの分離であ
る。

［従来の技術］ 一般にこの分析方法の範囲に含まれる試験は手順が複
雑であり、しばしば多重試薬添加、広範囲の洗浄段階及
び長時間に渡る培養時間を要する。この様な手順の複雑
さは試験の便利さを帳消しにする。さらにこの様な試験
は高感度でなければならない。この高感度に到達するた
めにはサンプル内の分析物の微小量を捕獲するための長
い試薬平衡時間が必要である。

分析学的には、複合体に基づく試験は、治療薬に対し
て診断上重要であり又生命化学の研究にも調査上重要な
広い範囲の分析物に適用可能である。複合体試験は元来
敏感で特殊である。しかし前述のようにこの様な試験は
集中的な労力と幾時間もの分析時間を必要とする。

例えば典型的な試験には以下の一般化された工程が含
まれる。第１の工程では試験用の分析物を含むサンプル
流体が、当該分析物用の特別な複合体試薬とともに準備
された固相の“捕獲試薬”に接触される。次にサンプル
流体は担体に付着できるように充分な時間固相試薬と平
衡化される。捕獲試薬と平衡化された後サンプル流体は
除去され、過剰サンプル材料を除去するために固相試薬
は濯がれる。この工程中捕獲担体に付着した分析物は捕
獲担体の表面に固定している。

分析学的処理の一般的な法則として付着分析物を直接
検出することはできない。従って第２の“標識化する複
合体形成試薬”が添加され、分析物の存在を検出あるい
は視覚化するためにしばしば固相担体と平衡化されなけ
ればならない。又この平衡化は分析物が固相表面と効果
的に反応するように充分な時間行われなければならな
い。平衡化の後過剰な“自由な”標識化する試薬は“結
合された”標識化する試薬から分離されなければならな
い。これは固定していない活性要素を分離するために固
相担体を洗浄することによって行なわれる。この段階で
標識化する試薬の状態に依存しながら固相担体上の活性
要素を直接に読取ることができる。試験信号を標識化す
るために酵素あるいは他のトレーサを用いて試験するこ
とが望ましい時は、まず１つ以上の基本試薬が添加され
なければならない。さらに培養期間の後色彩が見られる
ようになる。

残念なことに試験を行う上で必要な多くの操作、特に
連続的な試薬添加、洗い落とし、培養の間には、タイミ
ング、試薬計量、見本同定の誤り及び試験サンプルの偶
発的な損失の危険性が伴う。これは大量のサンプルが一
度に一回分として一緒に処理される時は特にあてはま
る。従ってこの様な種類の試験が診断所によって行われ
る際に生じる問題は数多くある。臨床研究所では大量の
サンプルを処理し、結果の重要性を判定し、広い範囲の
確定を行ない、結果を迅速に戻し、各分析試験が正確に
行われたことを確認しなければならない。これは集中的
な労力を要し診療研究所で行われる他の試験と比較して
複雑な技術に遭遇する困難さにも拘らず、経済的に行わ
れなければならない［“イギリス医療手引き（British
Medical Bulletin）”第38頁ないし第43頁、1974年
出版、参照］。

この様な試験を実行できる例ば数々あるが、実際上及
び理論的な制限の検討は充分に文書化されており本発明
の範囲を越えている。これらの困難性を克服するために
数多くの装置及び自動化の手掛りが従来技術文献に記載
されている。

現在数多くの自動化装置が市販されている。これらの
種類の装置ではマイクロタイタープレートかあるいはそ
の応用例等のマルチウエル消耗品が利用されている。一
般的にこれらの装置は濃縮量に関する情報が必要な試験
に有効である。そして通常これらの装置は複雑で高価で
ある。

上記の試験機能の全てに適応するために、装置の設計
にはサンプル適用要素、洗浄要素、プレート読取り器あ
るいは検出器のような多重構成要素が要いられている。
これらのシステムはしばしば完全に自動化されておら
ず、マルチウエルプレートを１つの構成要素か次の構成
要素に移動させるのにオペレータの介入を必要とする。

この型のシステムにおける最も重大な欠点は試験時間
が長いこと及び分析処理の範囲が限定されていることに
起因する。試験を行うには数時間から数日を要する。マ
イクロタイタ−テストウエルの試験表面は比較的小さい
ので分析物と反応可能な複合体形成試薬の量が限定され
るため長い平衡時間を必要とする。さらにこれらのシス
テムは分析物をテストら次の構成要素に移動させるのに
オペレータの介入を必要とする。

この型のシステムにおける最も重大な欠点は試験時間
が長いこと及び分析処理の範囲が限定されていることに
起因する。試験を行うには数時間から数日を要する。マ
イクロタイタ−テストウエルの試験表面は比較的小さい
ので分析物と反応可能な複合体形成試薬の量が限定され
るため長い平衡時間を必要とする。さらにこれらのシス
テムは分析物をテストウエルの表面に接触させるのに単
に拡散あるいは機械的震動に頼っている。その結果平衡
化には通常幾時間も用する。従って医学的緊急時や患者
と医者間のインタビユーの間にテスト結果を充分に利用
することはできない。

このシステムをさらに限定するのは、これらが免疫分
析の応用に限られ、DNAとRNAのハイブリッド形成原理に
基づく新しい複合体形成試験には充分には適用可能では
ないということである。

これらの限定を克服するために近年、試験装置を交互
に利用する多数のプロセッサシステムが特許文献に報告
されている。例えばアメリカ合衆国特許第4071315号明
細書には、一連の作業モジュールを通して連続的に供給
される多孔フイルムのロールに付着された複合体形成捕
獲試薬を利用したプロセッサの概念が記載されている。

このシステムには前述したものと同じ多数の欠点があ
る。システムは多重独立モジユールの機能に依存して複
雑であり、混合及び分析物とフイルム試薬との平衡を達
成するのに単に拡散に頼っている。さらにこのシステム
では試験結果の転回が迅速でない。しかし一度動作が開
始されると大量のサンプルを高い生産効率で処理するこ
とができる。

アメリカ合衆国特許第4225558号明細書にはモータ駆
動回転子の周辺に配置された複数の流体試験セルを具備
する遠心力法が記載されている。試験される流体と各試
薬は別々にそれぞれの試験セルに導入され、次に分析用
の反応チアンバ内で混合される。流体の導入は真空を用
いて行われ流体は遠心力によって混合される。このシス
テムにはシステムのスループットを減少させシステムを
不必要に複雑化させる遠心力を必要とする欠点がある。

別のシステムがアメリカ合衆国特許第4424279号及び
第4458020号明細書に記載されている。これらの特許は
共にクイデル（Quidel）に譲渡され、プランジャーフイ
ルタ装置が取り付けられている開口端部を備えたシリン
ダ管を処理するための装置が記載されている。抗原のよ
うな複合体形成試薬で感乍されたビーズは装置と共に用
いることができる。操作は、サンプルと感乍されたビー
ズを混合させるように押し下げられるプランジャー付近
に集中する。その後試薬が添加され、チアンバから流体
を除去するためにプランジャーが上げられる。ビーズは
プランジャーを上下させることによりほぼ同じ方法で洗
浄される。システムは構成上簡単であるが、試薬及び洗
浄流体を手作業で添加し、分析を行うために４つのチア
ンバ型投与ユニットとフイルタ管装置を１つの位置から
次の位置へ手作業で移動させる必要があり、オペレータ
の関与は広範囲に渡る。さらに管とフイルタ装置は操作
中開口しているため装置は漏洩しやすく従ってユーザが
伝染性物質と接触する可能性を生じる。

“分析学的生化学（Analytical Biochemistry）18、
1981年”の第324頁から第329頁においてミヒャエル．カ
イズ（Michael Cais）とモシュー．シモニ（Moshue.Si
moni）により、“自由”及び“結合”分析物の分離が液
体抽出法によって迅速かつ安全に行われる免疫分析のた
めの管装置が記載されている。これは明白に記載されて
いるわけではないが、一度に40までの分析を同時に行う
簡単な自動装置が開発されたことが指摘されている。こ
の装置は高精度の部品を必要とする複雑な構成であり、
溶媒分離によって分離することのできる分析物に適用が
限定されるという欠点がある。

アメリカ合衆国特許第4483825号明細書には遠心分離
分析された血液サンプルから血漿を分離する装置が記載
されている。この装置には２つの開口端の内１つにフィ
ルタが取り付けられているピペットが具備されている。
フイルタ端部は血液サンプルを保持しフイルタを通して
ピペットに血漿を送るピストンのように作動される管に
挿入されている。この様な装置は複合体形成型の試験に
は用いられていない。さらに両端部が開口しているため
この装置によってオペレータが生物学的危険物質にさら
される。

これら従来技術におけるシステムでは、連続的な露
出、固相捕獲試薬の平衡化及び洗浄のために補助装置と
設備が導入されているのが特徴である。例えば反応流体
と捕獲試薬の制御された均一の露出を保持し又分析物と
担体の相互作用の速度を速めるのにバイブレータあるい
は撹拌器が役立つ。さらに懸濁固相の試薬を平衡化に続
いて集積させるのに遠心分離器が有用かつ有効である。
そして固相試薬の上澄み液から反応流体のとりだしを促
進させるのにアスピレータが用いられる。ぜん動性ポン
プあるいは自動スポイトが試薬の添加及び／又は溶液の
洗浄に有用である。これらの多くの分離技術は比較的簡
単な構成の自動装置として実行することは困難であり、
特に単一の装置にまとめることは困難である。

分析物捕獲の効果を上げ分析時間を短縮するためにク
ロマトグラフィー原理を利用した多数のシステムが報告
されてきた。西ドイツ国特許出願第DE3217−032−Ａ号
明細書には乾燥したクロマトグラフイーコラム材料を用
いた免疫分析分離工程が記載されている。この様な装置
の記載された出願においては自動システムは記載されて
いない。

ジエイ；テイー；ベイカー；アンド；ウオーター；イ
ンコーポレーテッド（J.T.Baker.and.Water.Inc.）によ
って提唱されたようなマニホルドシステムを用いたシス
テム等の他のシステムが開発されている。これらのシス
テムは真空を用いることによりコラム溶離液の流れと収
集を速めている。これらのシステムはそれ自体では、そ
の中で流体が一方向にのみ流れる開口コラムに依存して
いる。プロセッサは単に、免疫試薬担体を通して洗浄溶
液を吸引する真空源からなる。結果として試験工程を遂
行するには多重管とかなりのオペレータ介入を要する。

分析物捕獲用のクロマトグラフイー型コラムベッドを
用い処理するフロースルー型のシステムは免疫分析及び
生物分離に関する文献において数多く記載されている。
しかしフロースルーシステムでは、流体が注ぎ込むこと
と流体と担体との接触を減少させるトラップされたガス
が入り込むのを防ぐためにコラムを注意深く包装しなけ
ればならないという欠点がある。これによりコラム製造
は困難となりコストも高くなる。さらに処理の間分析物
の捕獲は高効率のコラムを必要する単一パス内で遂行さ
れなければならない。このためフローシステムに背圧が
加えられ、増大した背圧を補い流体のフローを確実にす
るためにしばしばポンプの積極的な交換が必要となる。
さらに多重サンプルの同時処理は不可能である。又連続
的サイクルにおいてこれらのシステムは粒子と残骸によ
って汚染され塞がれる。さらに続く再生処理においては
捕獲試薬の活性の減少が観察される。捕獲担体との平衡
に先立つサンプルと試薬の混合は、試験装置に試薬が到
達するのに先立って行われなければならない。これはし
ばしば、汚染されやすく液体が反応容器に到達するのに
かなりの長時間を要する長い接続管を用いることによっ
て行われる。

1983年12月26日に公告された日本国特許出願第582237
58号明細書には、フロースルーシステムの多くの欠点を
克服することを意図したフロースルーシステムと循環反
応装置が記載されている。反応管は両端が開口した開口
管である。フイルタはノズル内の抗体あるいは抗原を固
定するための担体を提供するのに用いられる。能動圧力
はセルを通して材料を送り固相捕獲試薬を洗浄するのに
用いられる。システムは、多数のスポイトポンプの操作
を要し、機械的に複雑である。システムは能動圧力にお
いて操作されるため有毒かつ伝染性の噴霧質の放射ある
いは放出にさらされる。さらにシステムは流体フローが
一方向の包装された捕獲床を利用しているため、塞閉に
よってフローの減少及び背圧の増大が起こる。

［発明の解決すべき問題点］ 従って本発明の目的は、複合体形成反応（例えば抗原
−抗体結合、核酸ハイブリッド形成及び表面固着等）に
基づく試験に要する多数の工程段階を実行する自動シス
テムを提供することにある。特に（１）サンプル除去、
固相試薬とのサンプル平衡、洗浄、試薬添加及び色彩現
像を含む試薬操作をオペレータの助力なしに実行し、
（２）分析物と複合体形成試薬間の相互作用を積極的に
進める手段を提供し（このようにして究極的な検出限界
や分析の感度を生ずることなく試験時間を実質的に削減
することができる。）、（３）オペレータがサンプル材
料に接触するとなく有毒材料が収集され浄化される負圧
閉鎖システムを用いることにより使用者の安全性を高
め、（４）多重試験を同時に行えるようにする安価な試
験システムを提供することにある。

［問題点解決のための手段及び作用］ 本発明は、１つの開口端を有する流体容器内に位置さ
れている流体サンプルを処理し、決定されるべき分析物
を含む可能性のある固体支持体上の捕獲試薬を有し、分
析物を捕獲試薬にさらすための手段を具備している流体
サンプル処理装置において、閉鎖されたチャンバを形成
し、このチャンバと連通する第１と第２の出入口を具備
しているマニホルドと、前記マニホルドの第１の出入口
と結合して流体を流通させるように流体容器の開口端を
設置する手段と、前記サンプルの容器内を大気圧よりも
低い負圧状態に維持しながら、ガス、真空、試薬および
洗浄流体を前記マニホルドの第２の出入口を通って前記
閉鎖されたチャンバ、及び前記流体容器中に選択的に導
入し、又そこから選択的に除去し、捕獲試薬と分析物と
の間の迅速な反応と、捕獲試薬の効率的な洗浄と、分析
物の収集とを交互に行わせる手段とを具備していること
を特徴とする。

この発明のシステムは真空と空気の調整されたパルス
をチアンバ、及びさらに容器に与えている。これにより
流体は容器に連続して添加され又引出される。システム
は又流体を容器内で捕獲試薬を通して前後に循環させ、
それによって捕獲試薬とサンプル流体間の相互作用を速
める手段を備えている。一旦分析物が捕獲試薬に付着す
れば、洗浄流体を同じ容器に導入し引きだすことができ
る。同様に、現像材料を容器に導入し再び引きだすこと
ができる。

一実施例ではマニホルドが、第２のポートから等距離
にある複数の容器ポートを具備している。望ましい実施
例においては容器は細長く、一端は閉成され他端は開口
し、この開口端は閉鎖チアンバと流体接続している。多
孔性の保有器が、コンパートメント内に配置された捕獲
試薬を保有するように開口端に置かれる。捕獲試薬は通
常固体担体上に置かれるが、この担体は微粒子（ビー
ズ）であってもよく、あるいは多孔性の保有器自体に付
着させるか容器の壁に付着させてもよい。好ましい一態
様では容器自身が押し潰せる様になっている。

本発明の方法においては、分析物を含有するサンプル
は分析物のための捕獲試薬とともにアクセスポートを持
つ閉鎖された容器内に置かれることにより処理される。
それから多孔性保有器が捕獲試薬が逃げるのを防ぐため
容器内に配置される。この方法はアクセスポートそして
さらに容器を真空に置く工程を含み、その後容器を選択
的に試薬、真空、空気及び／または洗浄流体にさらし、
それによって分析物を捕獲し、洗浄し、及び／又は現像
する。典型的には容器は、分析物及び試薬を捕獲試薬を
通過して前後に再循環させるために真空及び空気に交互
にさらされる。

本発明による方法、装置及びシステムは、いろいろな
試験あるいは複合体形成反応に基づく分離を実行し、一
方使用者の安全を促進し、オペレータの介入を最小限に
し、試験時間を実質的に減少させる。複合体形成反応に
は、抗原／抗体結合、核酸ハイブリッド形成及び表面固
着が含まれる。試験工程には、サンプル除去、固相試薬
とのサンプル平衡、洗浄試薬添加及び色彩現像段階が含
まれる。試験時間は、分析物と複合体試薬との間の相互
作用を活性化させる手段を提供することにより削減され
る。使用者の安全は、オペレータがサンプル材料に接触
することなく有害物質が収集でき浄化される閉鎖システ
ムを導入することにより促進される。試験スループット
も又多重試験が同時に実行されるようなシステムと装置
を提供することにより増加する。記載されたシステムは
種々の異なった試験と分析に充分適用可能なものであ
る。これには免疫分析、DNAハイブリッド形成及び親和
力着色試験が含まれる。本発明の方法とシステムは、最
小限のオペレータの介入で、複合体形成反応を含む多く
の試験と分離を自動的に実行するのに適用している。

この種の試験は、サンプル及び洗浄流体の段階的な導
入と平衡、固相“捕獲”試薬のための試薬の増幅と視覚
化を含み、工程が複雑である。撹拌、震動あるいは超音
波処理等いくつかの手段が、分析物と固相捕獲試薬との
相互作用の速度及び効率を促進させるために、平衡段階
の中にしばしば導入される。

容器の実施例としてはいくつかが可能である。これら
容器は押し潰し可能な形状であっても又なくても良い。
１つの形状としては、容器はその一端部が細長い管と連
続している球根状のコンパートメントを持つ装置のよう
なピペットを構成している。容器内にある種の固相捕獲
試薬を保有するために多孔性が管内に取り付けられる。
その代わりに捕獲試薬を多孔栓自体に、容器内の微粒子
に、容器の管状部分内にある包装されたベッドに、ある
いは管状部分の壁に取り付けてもよい。別の形状では、
容器を一端が閉じた中空管あるいは一端がシールされた
柔軟な管状容器として構成してもよい。

高速捕獲装置においては、多孔隔壁の形状と配置がサ
ンプル分析物を自動的に捕獲するためには重要であるこ
とが見出だされている。包装されたコラム形状は、分子
拡散距離が最小限になるため分析物捕獲率を最大にする
のに理想的である。しかし反対に背圧及び包装されたベ
ッドによって流れが限定され、流体の容器への出入りに
重大な障害となる。従ってベッドが包装されることによ
りサンプルが捕獲ビーズを通して再循環する時間が伸び
る。さらに流体を圧力貯蔵部にある空気無しに効果的に
除去することはできないため、包装された床が捕獲ビー
ズの高速かつ効果的な洗浄を妨げる。

圧力貯蔵部の近くに多孔隔壁を位置させる、すなわち
球根状部分の内部容量とアクセスポートへ導かれる細長
い通り道が各々試験流体の容量を越えるようにすること
によって、再循環工程の全体が容器の範囲内に収まるよ
うに実行される。さらに装置内の流体と空気の流れへの
障害物は大きく減少する。これは処理工程中装置内へ動
く循環流体が上昇し、包装された捕獲試薬のベッドを粉
砕するためである。従って捕獲微粒子は背圧にはほとん
ど寄与しておらず、又最も重要なことは装置内への空気
の流れを限定していないことである。さらに包装された
ベッド形状によって達成される捕獲効率は、流体が容器
から引き出されるときルーズに捕獲微粒子が迅速に円筒
状チアンバ内に流し込まれ再び包装されるので保有され
る。従って効率的な円筒状ベッドが構成される。このよ
うにして流れの限定は大幅に減少され、最良の分析物捕
獲が保持される。球根状部分その幾何学的形状からルー
ズな捕獲物が迅速に流れて円筒状チアンバへ戻るのを促
進し、それによってさらに包装された円筒状体が再循環
工程において捕獲ビーズにより迅速に再形成されるのを
促進する。

別の実施例においては、多重の異なる捕獲試薬担体を
試験容器に組込むことができる。これらは、同じサンプ
ル内の複数の異なる分析物を同時に検査するのに用いる
ことができる。又、複数の担体の間の試験反応の相対比
は単一の分析物の準定量に用いることができる。

ここに記載されたシステム、方法及び装置は低コスト
の、複雑でない、試験時間を自動化した手段と複合体形
成工程を利用した試験処理工程を提供する。本発明によ
り得られる低コスト、スピード及び便宜性によって医療
研究所とともに医師の事務所においても試験を促進する
ことができる。

［実施例］ この発明のシステムはマルチポートマニホルド10を具
備し、このマニホルドはマニホルドを通して延出する導
管12の形状で閉鎖チアンバを限定しているのが見られ
る。導管12の一端部はバルブ14とトラップ16を通して真
空源18に接続している。通常この真空源は真空吸引装置
すなわちポンプになっている。複数の容器ポート20はマ
ニホルド10の上部に形成され、各ポートは後述するよう
に適切な容器あるいは他の高速分析装置を受入れるよう
に構成されている。各ポートは容器の挿入及び除去を容
易に行なうことができるように真空密閉シールを備えて
いる。導管12は又バルブ17を通してガス源19に接続され
ており、これは通常大気圧における空気である。導管12
の別の端部は適切なバルブ22を通して各々補助試薬源2
4、洗浄流体26、及び基質28に接続している。各バルブ1
4、17、22は適切な工程制御ユニット30によって順に制
御されている。

ポート20のシールは、ポート内部が先細りになってお
り図に示されたように同様に先細りの容器のチップ42を
受容するように構成するか（第２図参照）、あるいは外
部シールが望ましい場合にはマニホルドに、第８図に示
されたような同様に先細りの容器チップ内に適合するよ
うに先細りのスタブを取り付けるようにポートを構成す
ることによって達成することができる。いかなる場合で
もポート20は異なる種々の試験装置及び構成物を受容す
るように構成される。

バルブはいろいろな流体、真空源及び空気源の導管12
へのアクセスを制御するために電気的に制御されている
ことが望ましい。バルブの選択にあたっては約0.1秒以
内で高速にオンオフ制御するものを選択することが重要
である。満足のいくものであると認められた適切なバル
ブの一例はカリフオルニア州のアクロ．エア．アソシエ
イツ．オブ．コンコルド（ACRO.AIR.Associates of Co
ncord）より購入されたピンチバルブである。導管を接
続するためのシリコンゴム管と組合わせて使用されるこ
れらのバルブは試験に用いられ好結果を示した。制御ユ
ニット30には任意の適切なコンピュータを用いてもよ
い。この種のコンピュータは良く知られておりこれ以上
の説明は必要でないため省略する。一例としてはHP−85
型コンピュータがこの目的に連続して使用された。真空
源18は25インチ以上の水銀真空の得られるものでなくて
はならない。トラップ16は生物有害物質を収集するのに
有効である。使用して好結果を示した真空ポンプの一例
はニュージャジー州、ブルームフイールドのエス．ジ
ー．エイ．サイエンテイフィック（SGA Scientific）
より購入されたものであった。

各ポート20はマニホルド10の頂面に形成され、導管12
と連通する先細りの孔32の形状をしている。マニホルド
10は化学的及び生物学的に不活性の任意の適当な材料か
らできている。この様な適切な物質はポリエチレン、ポ
リプロピレン、あるいはエイ．アイ．デユポン．デユ．
ニュモラス．アンド．コンパニ（E.I.du Pont de Ne
mours and Company）によって販売されているスルリ
ンのようなイオノマーレジンである。

第１図に示されたマニホルドとともに使用される典型
的な容器は第２図に示されるように一般的な形状はピペ
ットであり、頭部の球根状部分あるいはコンパートメン
ト38と管状部40を持つ。容器はマニホルドに使用される
任意のプラスチック材料からなる。コンパートメント38
は柔軟で管状部40に結合しており、管状部40の終端は細
長いマニホルドポート32に挿入可能な細長いチップ42に
なっている。

コンパートメント38は容器に出入りする流体の流れを
手作業で計測する手段となっている。指に圧力を加え手
作業で容器を使用する場合には、使用者は容器に出入り
するサンプルと液体試薬の量を調節することができる。
例えば試験流体は管の予め目盛りを付けた印の所まで引
上げることができる。この様にして別の計測装置を用い
る必要もなく計測された量のサンプルを容器内に取入れ
ることができる。コンパートメント38は捕獲試薬の貯蔵
用に用いることができる。又他の種類の試薬、例えば抗
体酵素接合あるいは他の種類のタグ試薬も又装置のこの
コンパートメントの部分に貯蔵することができる。多孔
性保有器を容器の管状部分40内に挿入して浸透性バリヤ
として作用させてもよい。保有器の孔は、流体の流れあ
るいはセル、微小有機物、細胞片あるいは分析に関係す
る微小片を制限しない程度に大きくなければならない。
一方孔は捕獲試薬の微粒子を効率的に収集するのに充分
な程度小さくなければならない。この様にして捕獲試薬
は充分に保有され洗浄される。従って、多孔性保有器44
が容器の管状部40に挿入される前に捕獲微粒子試薬41が
コンパートメント38に導入される。特別な応用では、多
孔性保有器と捕獲吸収管の機能を結合させることが望ま
しい。これは例えば捕獲試薬を多孔性保有器かあるいは
コラム管そのものの壁に固定させることによって達成さ
れる。全ての場合において捕獲試薬は容器から離れない
ように固体担体に付着することによって固定される。

管状部分40の長さと内径とによって形成する容量は、
コンパートメント38の容量と同等かあるいはそれより小
さくなければならない。同様に管状部分40の内容量は分
析物のサンプルと、処理される附随試薬流体、例えば試
験流体の容量より大でなければならない。従って容器の
内容量は試験流体の容量の２倍以上でなければならな
い。

別の実施例においては管状部分40はコラムとしてパッ
クされている。この方法ではサンプル分析物を捕獲する
ためのマイクロコラム内に吸収管試薬を形成する手段が
設けられている。コラム室は第２の試薬室としての機能
も行うことができる。捕獲あるいは試薬微粒子は製造中
にコラムチアンバ内に添加し貯蔵することができる。コ
ラムはどちらかの端部に多孔性栓（図示されていない）
を形成することにより簡単に形成される。

さらに別の実施例では、さらに別のコンパートメント
が取り付けられている。例えば押し潰すことができるよ
うなアンプルあるいは気泡状部分をコンパートメント38
内に一体に形成することができる。このようにして試薬
は試験工程の適当な段階まで区分けされる。アンプルあ
るいは気泡状の部分は圧力を掛けることにより破れて開
口し、試薬が放出される。

出荷中の試薬の保護のために、あるいは試験中装置を
扱う際に使用者を保護するために望ましい場合には、保
護キャップ43が容器の端部に被される。例えば保護キヤ
ップ43は搬送中及び貯蔵時の容器内の乾燥試薬を保護す
るための効果的な水蒸気に対するバリヤを提供するもの
として使用することもできる。処理工程においては使用
者が容器内の伝染性あるいは有害なサンプル材料に接触
する危険を減らすためにキャップを利用することが望ま
しい。さらにキヤップは試験後に、容器内の色彩形成試
薬をシールし試薬が色彩形成工程に置いて漏れるのを防
ぐ。キヤップは容器同様柔軟で化学的に不活性のプラス
チックからできている。

先細りの孔32に対応する形状の栓46が試験操作中容器
にによって使用されていない任意のマニホルドポートを
閉成するように用いられる。栓46は容器と同じ適当なプ
ラスチック材料で形成される。

操作原理は、マルチポートマニホルドのポートに流体
容器を挿入することにより作られる閉システムの形成に
依存している。これはマニホルドの内部と容器あるいは
試験装置の内部とを結合させる閉システムを形成する。
真空及び空気バルブの調整された開口によって各容器内
の操作圧力は大気圧に減少あるいは増加される。試薬、
空気、真空、基質及び洗浄流体バルブを調整して開口及
び閉成することにより、各容器に流体がアクセスする。
望ましくは真空と空気はパルスで供給される。流体を容
器から除去する際も同じ操作力を用いることができる。

真空、空気、あるいはガスを容器内に保持、あるいは
添加すると、流体を容器から“ポンプでくみあげる”よ
うに吸い上げることによって流体の容器からの除去を促
進する泡が拡張的に供給される。この手段によって、単
一方向真空力を充てることにより１つの容器に入り又そ
こから出るという２方向の流体伝達が達成される。

従って流体の流れはスポイトあるいは流体ポンプなど
の複雑な装置を必要とせずに行われる。このようにシス
テムは負圧で操作される。従って流体は、単に真空を適
用するだけで容器内及び外への２方向に単一ポートを通
して迅速に移動させることができる。真空及び空気の調
整されたパルスによって容器内の固相捕獲試薬を動揺さ
せ又“活性”分析物捕獲の手段を提供する。マニホルド
内の真空を制御することによりサンプル及び試験試薬は
捕獲試薬を通して再循環させることができる。これによ
り分析物接合の率は増大し、固体相担体によって分析物
捕獲の効率は最大限となる。例えば再循環工程はサンプ
ル内の分析物が担体に効率良く結合するまで継続され
る。これは分析時間を減少させるだけではなく試験反応
を最大限保障する。

第６図には一般的なプロセッサプログラムのフローダ
イヤグラムが示されており、これにより制御ユニット30
（第１図参照）がいろいろなバルブ14、17、22（第１図
参照）を駆動させ、容器36を真空あるいはガス圧力にさ
らし、あるいは種々の洗浄あるいは試薬にさらす。プロ
グラムにはブロック50で示された用に初めにパージング
工程が含まれており、使用前にシステムをクリーンな状
態にしておく。このサイクルではシステムが閉鎖される
ように全てのポート32が容器のポート栓46で塞がれてい
る。パージング作業の間、初めに５秒間程度バルブ14を
開口することにより真空源18から真空が導管12に供給さ
れる。その後直ぐに洗浄溶液用のバルブ22が真空ととも
に短時間、通常0.2秒開口される。サイクルのこの過程
において洗浄流体は導管12に引き出され真空源18へ通じ
ているトラップ16へ送られ、それによって導管を浄化す
る。このサイクルは数回、典型的には３回繰返され、そ
の間に洗浄バルブの１つと共にバルブ14を開口すること
に続いてまず真空が供給される。その後システムから全
ての液体を除去するために短時間、通栄２秒間真空が保
持された後、オペレータには休止命令が与えられ、さら
に処理を進める前に装置に容器を取り付けるように指示
される。この休止の間、処理される各サンプル及びある
種の複合対形成反応を示すことができる捕獲試薬を含む
容器が異なるポート32に配置される。

次にブロック52で示されるようにサンプルリサイクル
シーケンスが開始される。このシーケンスの間容器のコ
ンパートメント38内の試験流体は捕獲試薬を通って連続
的に容器の管状部に送られ、その後容器内の球根状コン
パートメント38へ戻される。このシーケンスはサンプル
と捕獲試薬の相互作用を効果的に進めるために５乃至10
回繰返される。この工程は初めに真空バルブ14と空気バ
ルブ17を同時に開口して、システム全体を増加していく
ゆるやかな真空（0.5乃至10インチHg）状態にすること
によって遂行される。そしてバルブを閉じる。少し遅れ
て約0.5秒後に、空気バルブ19が通常５乃至10秒開かれ
る。このため試験流体は容器の頂部に戻される。そして
前述の真空／空気バルブのシーケンスが、分析物が効果
的に捕獲されるまで通常３乃至10回くりかえされる。工
程中流体が以下に説明されるように遅れて引出されるよ
うに、容器内にはガスあるいは空気をいくらか残すこと
が重要である。

次にブロック54で示されるように、サンプルは容器か
ら除去されトラップ16に送られる。これは容器間でサン
プルの搬送が行われないようにして行わなければならな
い。通常これは容器から流体を序々に除去しトラップに
流れて行くにつれてマニホルドチアンバ10内で試験流体
を稀薄にすることによって行われる。方法としては真空
及び洗浄バルブを0.1秒間隔で同時に繰返し開くことに
よって容器内の圧力を次第に減少させる。これは容器内
の圧力を段々に減少させる一方、洗浄流体をマニホルド
を通して押し稀薄にしトラップ16へ流す。次にサンプル
の除去サイクルは、真空バルブ14を0.5秒間隔で繰返し
開くことによって残留流体を全て除去するためにより強
い真空を与えることにより遂行される。

次に容器はブロック56（第６図参照）に示されたよう
に洗浄される。洗浄サイクルの間バルブ14を開くことに
よって容器は通常５乃至10秒管真空にさらされる。その
後バルブ19と22を開くことにより洗浄流体が注入され
る。これにより容器には洗浄流体が満たされる。次に流
体は、連続的に真空そして次に空気をマニホルドシステ
ムに供給することによって段階的に除去される。このよ
うに真空と空気を交互に供給することにより流体は分散
し又は容器内の捕獲試薬を浮遊させ、この動揺により内
表面の全てが流体と確実に接触させる。真空及び空気の
交互添加は数回繰返される。さいごに容器内の残りの流
体を全て除去するために真空が供給される。この過程の
間容器内のトラップされたガスが膨脹して流体容器から
押し出す。こうして空気の添加は洗浄効率を増大させ又
マニホルドシステムから流体を除去を促進する。

次にまずマニホルドシステム全体を真空にさらすこと
によって、色彩形成試薬を各容器36に添加する（第６図
のブロック58を参照）。次に基質試薬28（第１図参照）
の添加に続いて、捕獲微粒子を浮遊させ色彩形成試薬を
容器36中に送るために空気圧が印加される。この空気の
パルス化供給は数回繰返され、その後空気が約10秒供給
される。色彩を現像させ容器を“読み取らせる”ために
数分の遅延が与えられる。その後真空、及びそれに続く
洗浄溶液のパルス、そして又真空を印加することにより
システムはクリーンにされる。洗浄溶液と真空のこのシ
ーケンスは数回繰返される。

容器を選択的に試薬、空気、洗浄流体及び真空にさら
すことにより、装置への流体の流れの出入りは精密に制
御され、複合体形成工程に必要な全ての必須工程機能を
備えることができる。こうして試験方法の完全な自動化
が達成される。

試験反応の促進や高感度のような、この発明の作業シ
ステム及び方法の結果として得られる試験を行う上での
重要な利点は又、試験容器を手作業で扱うことによって
も得られる。本発明では容器が柔軟で球根状であるため
に、手作業で流体を装置から引きだし処理することがで
きる。従ってサンプル計量、活性分析物捕獲、試薬分離
及び色彩形成試薬添加の試験機能は、押し潰し可能な球
根状容器に使用者が指で力を加えることによって手作業
で遂行することができる。この手作業の工程においても
又サンプルを捕獲試薬を通して前後に再循環させること
により、積極的な分析物の捕獲が達成される。次にその
後に続く洗浄段階で過剰なサンプルと試薬は除去され
“結合”分析物から分離される。そして非同位体及び／
又は同位体タグ試薬を用いて結合分析物が検出される。
こうして球根状容器はピペット及び点滴器としての多く
の機能を果たすことができる。このシステムによって得
られる試験速度と感度の利点は手作業のにおいても保持
されるが、手作業の工程にはオペレータの積極的な参加
が必要であり、そのためにより労力集中的でありかつオ
ペレータの誤操作の危険がある。

実験例 本発明を構成する試験方法技術の能力及び利点を説明
するために、３つの試験例を示す。これらの例には連鎖
状球菌属Ａ類、単純性疱疹ビールス（HSV）、人間性線
分泌亢進物質（HCG）の試験が含まれる。これらは可溶
性分析物、微生物有機体及びビールス性物質の検出に分
析学的に適用可能であることが示される。

一般に以下に記載されたように種々の試験のための試
薬が準備されている。

捕獲試薬 各試験に必要とされる特定の単クローン性及びポリク
ローン性抗体が以下に記載されたようにいろいろな粒子
に結合された。

単クローン性抗体を含む腹水流体は４℃で40分間1000
0rpmで遠心分離することにより細胞破片と脂質を取り除
いてきれいにした。腹水流体はプールされカルボニルジ
イミンダゾール（CDI）活性化されたアガロースビーズ
（シグマ）かあるいはCDI活性化され制御された細孔ガ
ラス粒子（CPG）に結合された。ベセル氏等によって記
載された手順［ジエイ．クロム（J.Chrom）219 353（1
981）及び219 361（1981）］によれば、ビーズはPBS緩
衝液を用いて洗浄され過剰な抗体が除去される。分析さ
れる前にビーズは0.1％アジ化ナトリウムで保護されたP
BS緩衝液内で４℃で懸濁液として貯蔵される。

いくつかの例では特定の試験分析物のための抗体も
又、クロロメチルスチレンジビニルベンゼン共重合体ビ
ーズ（30乃至150ミクロン）及び／又はポリスチレンジ
ビニルベンゼンビーズ［デユーク．サイエンテイフイッ
ク．コーポレイション（Duke Scientific Co.）より市
販］に結合された。

一般的にポリスチレン粒子への抗体の固定化は、1.0g
のコア粒子を燐（10mM）、緩衝された（ph7.4）塩水（1
20mm）溶液（PBS）内の5mLの抗体（約2mg IgG）に添加
することによって達成された。次にビーズ懸濁液は粒子
を浮遊させるために４℃で30秒間超音波で処理され、そ
して４℃で48時間ゆっくりと転動された。平衡時間の終
においては、ビーズはソルバル（Sorvall）RC3B型遠心
分離器により毎分2000RPMで３分間遠心分離された。表
面の上澄み溶液が取り除かれた。次にペレット状の粒子
が0.1％の牛のリンパアルブミン（BSA）を含むPBS緩衝
溶液（10ml）に懸濁された。粒子は４℃で３時間転動さ
れた。そして捕獲ビーズ試薬が遠心分離によって製造さ
れた後３回洗浄された。各洗浄はビーズペレットを10ml
のPBS緩衝液に浮遊させることによって行われた。次に
ビーズ浮遊物は４℃で10分間ころがらされた。遠心分離
に続いて洗浄流体は除去され、前述のようにビーズ小球
が洗浄された。次に抗体ビーズ試薬は使用されるまで0.
1％のアジドナトリウムを含むPBS緩衝溶液に４℃で貯蔵
された。

連鎖状球菌属に対する抗体の親和力精製 連鎖状球菌属類Ａの坑血清が“疾病制御センター（Ce
nter for Disease Control によって確立されたプロ
トコールに従ってうさぎの中に準備された。第３のブリ
ードからの抗血清がプールされ精製段階で用いられた。
このようにして得られた抗血清はランセフイールドカピ
ラリープレシピテインテストでは連鎖状球菌属類抗原
Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇに積極的に反応しＢとＤには反応し
なかった。用いられた連鎖状球菌属類抗原はデイフコバ
クトストレプトコール抗原（Difco Bacto Streptocca
l Antigen）、カタログNo.2368−32、コントロールNo.
683957であった。

30mLの抗血清がＮ−アセチルグルコースアミンアガロ
ース（シグマケミカルカンパニー（Sigma Chemical C
ompany）から入手）を含む0.7cm×17cmのコラム（コラ
ムベッドの容量は約10.8mL）中に配置された。結合して
いない血清成分を120mLのPBS（0.8gのNacl、0.2gのMKH₂
PO₄、2.9gのNa₂HPO₄・12H₂O及び0.2gのKCLから用意す
る）で洗浄することによって除去した後、結合した抗体
が90mLの3MNH₄SCN、ph7.4で抽出された。小片は収集さ
れ、プールされ、PBSに対して広範囲に隔膜分析され、1
0000ドルトンの公称分子量のYM10膜とともにアミコン20
2型ウルトラフイルトレイションセルを用いて8.0mLに濃
縮された。1mg/mL溶液の免疫グロブリンの光学的濃度が
1.40.D.280nmである場合にはIgGの最終収量は12.8mgで
あった。この親和力精製抗連鎖状球菌属抗体（APSA）は
ランセフイールドプレシピテ球菌属Ａ抗原とのみ積極的
に反応した。制御としてASPAは予め同量のＮ−アセチル
グルコースアミンと混合されるが、いかなるストレップ
類抗原とも反応を示さなかった。APSAが同量のPBSと混
合された場合はストレップＡと反応が見られた。

酵素抗体接合 試験実証には２種類の酵素抗体接合が用いられた。セ
イヨウワサビのペルオキシダーゼ（HRP）接合物がナカ
ネ氏（Nakane）のペリオデートカップリング法［“日本
歴史化学及びチト化学”、22、1084（1974年）参照］に
よって用意された。幾通りか準備する中でこの方法の変
形としてフルオロジニトロベンゼンブロッキング（“酵
素学における方法”、70、133参照）を除いた方法が用
いられた。

エンガバル氏（E.Engavall）等によって記載され
（８、871（1971年））、又スリバン氏（M.J.O′Sulliv
anによる“アン、チム、バイオケム（Ann.Chim,Bioche
m）”（16、221（1979年）に記載された方法の変形例を
用いた試験実証ではアルカリ性フオスフエターゼ抗体接
合物が準備された。通常の準備例では約３ユニットの子
牛のインテスチンアルカリフオスフエターゼ［ボーリン
ガー．マンハイム．バイオケミカルス（Boehringer Ma
nnheim Biochemicals）参照］が1.2mLのフオスフエー
ト緩衝溶液（50mM、ph7.2）に溶解され、グルタリック
ジアルデハイド（10μＬ）で25℃で50分間培養された。
次に0.2乃至0.4mLのフオスフエート緩衝溶液に約1.5mg
のIgGを含む抗体溶液が添加され反応はさらに25℃で75
分間続いた。この時点で混合物は氷バス内で冷却され、
セフアクリルS200コラム（2cm×40cm）に付着された。
コラムは0.1M塩化ナトリウム、1mM塩化マグネシウム及
び0.1％（w/v）ナトリウムアジドを含む50mMのトリス
（ヒドロキシメチル）アミノエタン緩衝溶液（ph8.0）
で抽出された。コラムの抽出物は1mLの粒子片に収集さ
れた。接合物を含む粒子片は蛋白質（A280nm）と２−ア
ミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝溶液（ph10.
2）内の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールフオ
スフエート（2.3mM）基質との酵素的活性を計測するこ
とによって同定される。接合粒子片は使用前に、10mg/m
MのBSAと0.1％のナトリウムアジドを添加することによ
って４℃で貯蔵用に安定化された。

親和力精製ストレップＡ抗体−HRP（APSA−HRP）接合
物は試験実証のために以下のように準備された。前述の
ように準備された8.0mgのAPSAが以下の工程でセイヨウ
ワサビ・ペロキシダーゼと接合された。1.0mLの水に溶
けた4mgのHRP（Sigma）が新しく準備された0.2mLの0.1M
過ヨウ素酸ナトリウムNaIO₄と混合された。混合物は室
温で20分間撹拌され、1mM、ph4.4のナトリウムアセテー
ト緩衝溶液に対して４℃で一晩隔膜分析された。レテン
には、20μＬの0.2M、ph9.5のカルボネート緩衝溶液と
1.0mLの0.01M、ph9.5のカルボネート緩衝溶液に溶けた8
mgのIgGが添加され、室温で２時間撹拌された。この２
時間後、0.1mLの新しく準備されたナトリウムボロハラ
イド溶液（1mLの水に対して4mg）が添加され、混合物は
４℃で２時間放置された。次に同量の飽和したアンモニ
ウム硫酸塩溶液が添加された後に混合物は遠心分離さ
れ、沈澱物は飽和した50％アンモニウム硫酸塩溶液で２
回洗浄され、そしてPBSに対して広範囲に隔膜分析され
た。次に牛の血清アルブミンが１％濃縮液に添加され接
合物が細孔フイルタ（0.22μｍ）を通して濾化された。
フイルトレートには同量のグリセロールが添加された。
接合物は−20℃で貯蔵された。

試験装置 当該分野の専門家にとっては容器の基本的な成分及び
性質をいろいろな異なった形状と大きさに構成すること
ができるのは明らかであるが、試験例には血清用のピペ
ット形状のものが使用された。

センタウア・サイエンテイフイック・カンパニー（Ce
ntaur Scientific Co.）から購入された使い捨て可能
な血清用ピペットが、多孔隔膜の集積を可能にし試験装
置のチップとプロセッサマニホルドの間に形成される効
果的な気密シールの働きをするチップを提供するように
変形された。しかし多孔隔膜を取り除く前に抗体捕獲ビ
ーズ試薬（0.5乃至30mg乾燥重量）が装置に添加され
た。いくつかの例では凍結乾燥された接合試薬も又別に
添加されるか、あるいは捕獲試薬と混合された。次にポ
レックス・テクノロジーズ・インコーポレイション（Po
rex Technologies Inc.）から購入した多孔ポリボー
ルを挿入することによって装置の部品は完成する。

試験試薬はいろいろな種類があり、点滴器の表面とポ
リボールをBSAで前処理することが必要であった。これ
は内表面をフオスフエート（1mM）サリン（120mM）緩衝
剤（ph7.2内の１％BSA溶液で洗浄することによって行わ
れた。このようにして表面はBSAで被覆することができ
る。多くの例ではこの処理は捕獲試薬が添加された前か
あるいは後に行うことができる。

例１（類Ａ連鎖状球菌属） サンプルは公共健康研究所（Public Health Laborato
ries）に所定通り出された研究培養用の喉の細胞組織か
ら得られた。サンプルを吸う化学者には特別な指示は何
も与えられなかった。サンプル収集に使用する綿棒の種
類にも何も要件は付けられなかった。しかし大部分の綿
棒はダクロン（Dacron型（サイエンテイフイック・プロ
ダクツ・カンパニー製造）であった。

研究所に到着すると直ぐに細胞組織の標本は標準研究
工程を用いて羊の血液用培養プレートに擦り付けられ
た。５％の二酸化炭素のもと、37℃で18時間インキュベ
ーションした後、プレートはベータ容血性コロニーの有
無を検査された。これらコロニーの発見物は以下のよう
な直接の抗原試験と比較するための培養参考結果として
関係づけられ保持された。

いったんプレートが接種されると、“使用済”の細胞
組織は乾燥紙に置かれ、試験用に適当な数の標本が収集
されるまで−20℃で貯蔵された。この間有機物の生育性
を保持するために何等予防策を講じなかった。

試験実証のために50の“使用済”病細胞組織が、精製
していないストレプトミセス抽出［マクスト氏（Maxte
d）著、“ランセット（Lancet）"225（1948年）参照］
を用いて準備された0.5mLの溶液抽出流体に導入され
た。簡便のために適当な抽出流体も又ヒンソン・ウエス
コット・アンド・ダニング（Hynson Westcott and Dun
ning）から購入された。細胞組織は５秒間濾動され、そ
して37℃で60秒間インキュベーションされた。インキュ
ベーションの後、流体は試験管の壁に対して回転させる
ことによって細胞組織から圧出された。復元した細胞組
織抽出物は、前記のように準備されたウサギの抗連鎖状
球菌属Ａ捕獲試薬粒子（30乃至130μ）とウサギの抗連
鎖状球菌属Ａアルカリ・フオスファーゼ・接合物を用い
た高速試験装置に引き出された。

試験容器は処理のために高速分析プロセッサ（第１図
参照）のポートに挿入された。次にサンプル流体が分析
物抗体酵素接合複合体の捕獲を促進するために捕獲ベッ
ドを通して３乃至10回、前後に再循環された。この工程
を完遂するには一般に１乃至３分要する。次にこの段階
で真空を用いてサンプルが自動的に除去される。洗浄緩
衝剤のいくつかのアリコートは、装置のポート間のサン
プルの過剰搬送を最小限にするためにプロセッサの内部
を通してパルス的に送られる。次に高速分析装置内の粒
子は２乃至3mLのPBS緩衝剤の一部分で２乃至４回繰返し
洗浄される。この工程の間緩衝剤は、第１にシステムの
内容物を取り除き、次に洗浄貯蔵バルブを比較すること
によって装置内に迅速に引き出された。そして満たされ
た管が部分的に排気され空気のパルスが粒子を揺動させ
るために導入された。洗浄工程の間粒子は懸濁され容器
の内部を通して流される。別に真空及び空気の連続的な
パルスが、流体に完全に装置から除去されるまで導入さ
れる。洗浄循環の流体除去段階では真空と空気添加の３
段階が利用される。全体の洗浄サイクルは約30秒で完了
する。

洗浄の後酵素基質が自動的に高速分析装置に導入され
た。まず装置が一掃され、酵素基質貯蔵バルブが制御さ
れた時間の間開かれた（１管あたり0.1秒）。これによ
り約0.2mLの酵素基質試薬が装置に導入される。次に空
気パルスが印加され、粒子と基質試薬に簡単な動揺を起
こす。ここに記載された試験では５−ブロモ−４クロロ
−３−インドリル硫酸塩（2.3mM）から成る酵素基質試
薬（0.2ml）が用いられた。

３乃至10分間の後管内に色彩発色見られた。連鎖状球
菌属Ａの陰性制御サンプルの色彩強度を越える色彩強度
がサンプルから得られたことは、これが陽性連鎖状球菌
属Ａの試験結果であることが示される。

上記実施された50の試験結果は培養発見物と高速分析
技術を盲目的に比較することによって分析され、その結
果は以下のようである。17のケースでは両試験とも陽性
であり、31のケースでは両方法によって陰性であった。
２つのサンプルは培養では陽性、抗原では陰性であっ
た。試験結果では培養と抗原検出が良く一致しているこ
とが示されており、従って高速試験技術を用いることに
より微生物抗原検出が速く特別有効に実行することがで
きる。

例２（ベーターHCG） この発明を可溶性分析物に適用するシステムを実証す
るために、人絨毛性性線刺激ホルモン（HCG）に試験が
施された。この試験のために、上記の一般的な工程を用
いて以下の試験試薬が準備された。

HCG捕獲試薬は２つの単クローンマウスIgG抗体の混合
物をプラスチックビーズ（30乃至170μ）に固定させる
ことによって準備された。各単クローン抗体はHCG分子
上の分離した抗原結合位置と反応した。

HRP酵素（Sigma）は多価ウサギ抗−β−HCG−抗体に
接合され、0.01％チメロサールで貯蔵された蛋白質マト
リックスに保持された。

尿及び血清性性線刺激ホルモン（HCG）キャリブレー
タはオルガノン・デアグノステイクス（Organon Diagn
ostics）から購入された。

試験は３段階の工程によって行われた。

1mLのサンプル（尿素あるいは血清）が各容器に引き
出された。

次に各容器は、酵素接合試薬を溶解させ捕獲粒子試薬
を浮遊させるために逆さにされた。この時点で各容器は
マニホルド10に挿入された。約１分経過すると、サンプ
ルは既に述べたリサイクル法を用いて捕獲粒子試薬を通
して前後に再循環された。再循環が完了するとサンプル
は次に真空を用いて除去され、プロセッサの内部は装置
間に持越された可能性のあるサンプルを取り除くために
洗浄流体のパルスで洗浄された。容器は第１の平衡後も
残っている残留接合物及びサンプルを除去するために数
回洗浄された。これは前記工程を用いて４（薬2ml）部
分PBS緩衝剤により行われた。粒子試薬の動揺により捕
獲試薬の洗浄がより効率的になり洗浄時間が短縮され
る。

1.6mMテトラメチルベンジジン（TMB）、3.3mM尿過酸
化物、0.05Mクエン酸に溶けた0.075％のアルギン酸ナト
リウム、0.1M燐酸ナトリウム緩衝剤（ph5.0）を含む酵
素基質溶液（0.2mL）が、捕獲試薬粒子を浸水するため
に容器内に引き出された。

色彩が発色するには室温で３乃至10分の時間が必要で
ある。サンプルから生じる色彩強度がHCG陰性サンプル
の色彩強度よりも強いことから、この試験は陽性HCG試
験の反応であることがわかる。

50mIUのHCGを含むサンプルで行われた試験は５分以内
に陰性の尿素サンプルと明確に区別することができた。
さらにサンプルの捕獲試薬との接触時間を５分まで増加
したことにより、5mIU程度に低いHCGを含むサンプルを1
5分以内に充分に検出することができた。従ってHCGのレ
ベルがかなり低くても数分以内でHCGが検出でき、個人
により異なるが数日から数週間以内に妊娠を確定するこ
とができる。

例３（HSV試験） 単純性疱疹ビールス（HSV）の検出試験は、本発明が
ビールスを検出するのに充分に有効であることを実証す
るために行われた。

単純性疱疹ビールス１型（HSV−１）及び２型（HSV−
２）に対するウサギの抗体はダコ・コーポレイション
（DAKO.Corp.）より入手された。この抗体は粒子の捕獲
試薬及びアルカリ性フオスフエターゼ接合物を前記の試
薬準備の所で述べた一般的な方法によって準備するため
に用いられた。

ビールス性抗原制御物質はエム・エイ・バイオプロダ
クツ（Ｍ・Ａ・Bioproducts）より購入されるか、ある
いはHSVに感染したセル培養の表面浮遊物質から準備さ
れた。培養物質内の伝染性ビールスの相対的な量は標準
的なプレーク分析法を用いて決定され、mLあたりのユニ
ットを形成するプレークとして参照される。

HSV型１と型２の試験は、試験を効果的にすると決定
された上記試薬の稀釈と濃縮を用いて本発明のシステム
内で行われるが、最適濃度を前提とすることを意図する
ものではない。

HSV試験及び制御標本（0.5mL）は独立した容器内に引
き出された。次に各容器はマニホルド内に挿入され、サ
ンプルは捕獲試薬を通して約５乃至10回前後に再循環さ
れた。そしてサンプルは除去された。今度は管を除去
し、抗HSV I型とII型の混合物を含む酵素接合溶液（0.5
mL）を人手によって添加し、又酵素接合物を捕獲試薬で
連続的に平衡させるために循環工程に休止期間が導入さ
れた。次に容器はプロセッサ内に再び挿入され、リサイ
クル工程は２乃至５分間にわたって２乃至10回継続され
た。そして接合溶液は除去された。次に容器の内容物は
まず3mlのフオスフエート緩衝剤塩類で次に0.5％エマル
フオゲンを含む緩衝剤（ph7.2）で連続して洗浄され
た。

２−アミノ−ジメチルプロパノール緩衝剤（ph10.2）
内に２、３−mM4−クロロ−３−インドリルフオスフエ
ートを含む酵素基質溶液は容器内に引き出された。そし
て試験結果は10乃至20分間の平衡後に目で見て判定され
た。

この方法を用いてバイオプロダクツの1;100、000の稀
釈の陽性制御抗原調剤を含むサンプルは、HSVを含まな
い陰性制御サンプルから直ちに検出された。同様に1mL
あたり約10³のプレーク形成ユニット（PFU）表面浮遊物
質から準備されたHSVサンプルがビールス物質を含むこ
とが確認された。

第７図に示されたような本発明によるシステムの別の
望ましい実施例では、マニホルド10′には導管80に続く
単一の出口があり、この導管80は第１図に示されたよう
な真空、空気、洗浄、試薬及び基質源に接続している。
この例では複数のポート20′が、マニホルドの内部に軸
方向に沿って上方に延出するマニホルドキャビテイ82か
ら等距離に（この場合には円筒状マニホルドの軸から放
射状に）間隔を置いて配置されている。この装置の利点
はポート20′が全て等しい距離にあるので、皆同じ真
空、空気圧等に正確に同時にさらされるということであ
る。この様な相違はあるが操作方法は第１図に示された
装置と同様である。

第３図に示された別の実施例では各試薬容器が試験管
108のようなガラス瓶の形状に構成されている。試験管1
00には適切な連結キャップ102がある。前記のように細
長い管状部104によりマニホルドポート20に装着される
ようになっている。固体相試薬の入った容器108は管100
に置かれる。これはボールあるいは多数のリブを持つか
い状等の多くの異なる形態を取ることができる。または
108は試薬を含むカプセルでもよい。そして試薬は適当
な圧力を加えることによって放出される。容器の実施例
は全て第１及び第２図に記載された実施例と同じ操作及
び使用方法のため、これ以上の説明は必要ないので省略
する。

容器に関して又別の実施例も用いられる。一実施例は
第４図に示されており、ここでは容器が、その一端部が
歯磨き粉の管のようにひだ付してシールされた柔軟な管
88の形状となっている。管88の下方部分は、細長い管状
出口部92を形成するように90の位置で内に向かって先細
りになっており、この出口部92に多孔保有器94が挿入さ
れる。望ましい場合は保護キャップ96が管の端部を覆う
ように挿入される。この管は望ましくは第１図及び第２
図に示された管と同様に化学的に柔軟で生物学的に不活
性なプラスチックから成る。

第５図には又別の実施例として容器36′が示されてい
る。この容器は実質的には、上圧力部あるいは球根部3
8′と、多孔性保有器44′を持つ細長い部分36′のある
第２図に示された容器と同じである。しかしこの実施例
の容器では、さらに別の多孔性保有器110と112が第１の
多孔性プラグ44′よりやや下に配置されている。このた
め容器36′は本質的に３つの個々の部分に同時に分離さ
れ、及び／又は同じサンプルから多重分析物を分析する
ことが可能である。

第５図に示されたように容器は、各々特定の抗体で調
整された３つの異なる多孔性捕獲試薬を含有することが
できる。例えば多孔性容器110と112にはそれぞれHSV1と
HSV2の抗体が含まれる。試薬44の場合には非反応性抗体
が含まれる。各担体に見られる試験反応はヘルペスビー
ルスの存在とそれが特定の型のビールスであることを示
している。多孔性容器44に現われる試験反応はバックグ
ラウンド閾値反応を示し、これは多孔性容器110と112の
担体が示す真の陽性結果を越えていなければならない。

本発明の別のシステムの実施例が第８図に示されてい
る。この図ではサンプル混合物の特別の成分を分離する
ことができるシステムが示されている。このシステムは
第１図に示されたシステムとほぼ同じであり、真空現1
8″、排気管16″、真空源用のバルブ14″を具備してい
る。マニホルド10″にはポート20″と未使用のポートを
閉じるために栓46″がある。又システムには、バルブ2
2″、17″、14″を含む数個のバルブを操作する制御ユ
ニット30″が含まれている。バルブ17″と22″は試薬源
24″、洗浄源26″及び空気源19″からの入力を制御す
る。

サンプルを特定の成分に分離することは、第１図に示
された容器36とほぼ同じ分離容器122を備えることによ
って行われる。この容器122には捕獲試薬を容器に与え
たり除去したりするためのキャップ24が備えられてい
る。さらにキャップには摩擦フイットがあり、いったん
分離容器がマニホルドに配置されるとシステムが閉じる
ようになっている。マニホルドが多重ポートを含むよう
に構成されている場合は、各容器が、ブロック126で示
されるサンプル混合物の異なった成分用の異なる捕獲試
薬を含む。サンプル混合物源はバルブ128を通してマニ
ホルド10″に接続している。精製したサンプル用の収集
器130は、バルブ132を通してマニホルドへ、第２のバル
ブ134を通して真空源18″及び排気管16″へ接続されて
いる。

第８図に示されたシステムでは操作中分析学的試験用
のシステム構成のために記載されたものと同じ流体伝達
及び配位子相互作用原理を利用している。マニホルド1
0″は第１にバルブ14を開くことにより真空にさらされ
る。次にバルブ128を開くことによりサンプル混合物の
計量された量が容器内に入る。サイクルはサンプル混合
物が捕獲試薬を通して完全に分析物結合に至るまで前後
に循環される前述のものとほぼ同じである。次に廃物サ
ンプルが容器122から除去され真空バルブ14″を開くこ
とによってトラップ16″に収集される。次に捕獲試薬に
バルブ14″及び22″を連続して開くことにより不特定の
残留物質を除去するために洗浄される。次に脱離試薬が
担体に付着した特定の親和力複合体物質を放出するため
に容器内に導入される。次にバルブ132と134を同時に開
くことによって溶解させた精製配位子が保有器130に収
集される。このようにして精製サンプル物質は保有器13
0に収集され捕獲試薬が別の洗浄段階で精製される。

これら同じシーケンスを繰返すことにより混合物の添
加量を処理し、捕獲担体を充分に再使用することができ
る。

上記実施例を含む親和力分離システムは高速精製の利
点がある上に、親和力精製システムに基づいた従来のク
ロマトグラフイーコラムにによって起こる実際の多くの
欠点を除去している。

コラム上の親和力クロマトグラフイーは親和力精製を
行うために最も頻繁に用いられる方法である。しかしな
がらこのクロマトグラフイーに基づくシステムには多く
の制限がある。可溶性物質を含むサンプルはその粒子が
コラムを塞ぎ汚染する傾向があるため使用することがで
きない。コラムに親和力担体を付加させることは集約的
な方法であり溶媒を取りだし親和力吸着剤を不均一に付
加させるには１日以上の長い時間を要する。吸着剤の結
合能力が４乃至６のフアクターによるサンプルを越える
時に精製が最も望ましい状態に達するため、大量の吸着
剤が必要である。クロマトグラフイー担体物質は高価で
あり精製された配位子は親和力吸着剤の準備を必要とす
るため、吸着剤の使用が不充分となり高価かつ不足物質
を浪費しうることに成る。最も重要なことには過剰な吸
着剤によってコラムの大きさが大きくなりコラムの流速
を減少させることによってサンプルの処理時間が増大す
ることである。さらに脱着の間精製されたサンプルが稀
薄される傾向がある。コラム監視器や小片収集器のよう
な高価な装置も又精製されたサンプルを配置し収集する
ために用いなければならない。

ここに記載された操作原理によれば、コストが低くク
ロマトグラフイーコラムに基づくシステムによって生じ
る限定もなく親和力精製を行う利点を保持する完全自動
高速精製システムが提供される。前述のようにこのシス
テムはパックされていない遊離した（ルーズな）吸着剤
を利用している。従ってサンプルを容器内へ引き出すこ
とによりサンプルの高スループット及びサンプルと担体
との高速相互作用が得られる。こうして捕獲担体は流動
床に浮遊され懸濁状になる。このため背圧は大きく減少
し、流体の流れはなおサンプルと充分に総合作用をしな
がら増加する。次に流体が引き出されるにつれて捕獲担
体がパックされた床状ベッドに沈澱し、さらに担体とサ
ンプル配位子間の高速相互作用運動を促進させる。“流
動ベッド”及び“パックされた″両構成内の相互作用の
効率は、サンプルを親和力担体を通して前後に再循環さ
せることによってさらに上げられる。このようにしてサ
ンプルの相互作用を最大限にし、一方背圧による流れを
最小限にすることができる。容器内に親和力担体を付加
させることは、単に担体を容器内に注ぐだけで迅速かつ
都合良く行うことができる。従って溶媒を取り除きコラ
ムを包装するという時間の掛かる工程は必要でない。さ
らに精製されたサンプルを担体から脱着させる工程の
間、精製された物質は凝縮溶液として保持され単一保有
器内に収集される。従ってポンプ、コラム監視器、微片
収集器のような高価な担体装置はそのまま必要ではな
い。容器を伴う高速流体伝導により吸着剤を迅速に再精
製することができる。そのため親和力吸着剤は何回も繰
返し再使用することが可能となる。最も重要なことはサ
ンプル導入、サンプル平衡、担体洗浄、精製されたサン
プルの抽出及び担体の再性の全ての工程が都合良く行わ
れシステムによって制御されるため、サンプルのスルー
プット量が高く、使用者にも都合の良い、低コストの自
動システムが提供されることである。

第９図には第１図に示されたシステムの実施例とは別
の実施例が示されている。第９図に示されたシステムは
マニホルドが変形されている他は第１図に示されたシス
テムと実質的に同じである。マニホルド10′はマイクロ
タイタープレート120と共働できるように変形されてい
る。マイクロタイタプレート120の中には複数のキャビ
テイ122が形成されている。それに呼応してマニホルド1
0′は各ポートがマイクロタイタープレート120の各キャ
ビテイ122と適合するスタブ20′の形態に形成された構
成である。スタブ20′はキャビテイ122内に僅かな摩擦
ではめ込まれ閉鎖されたセル容器あるいはキャビテイを
提供するように僅かに先細りになっている。従ってマイ
クロタイタプレート120の各キャビテイ122内は捕獲試薬
ビーズと、処理されるべきサンプル分析物と共に必要と
されるあらゆる試薬で満たされている。次にマイクロタ
イタープレート120はキャビテイ122上に接合され異なる
各スタブ20′において適合される。ここからは第１図に
示されたシステムと実質的に同じ処理が行われるため説
明を繰返す必要がなく、省略する。又スタブ20′には平
らな接合シールを取り付けても良い。

本発明に従えば家庭あるいは医師の事務所に通常備え
られていない保持装置あるいは機具を必要とせずに、複
雑でない工程及び装置を用い、分析物の視覚的な決定及
び精製を非常に低濃度で行うことができる簡単で感度の
良い方法が提供される。又予め計量しそれ自体で試薬を
保有する容器を提供することもできる。さらに高速分析
物捕獲を行ないサンプル再循環のような検出を行ない流
動化された懸濁粒子試薬床を用いることができる。

試験工程における添加試薬の貯蔵性及び捕獲試薬を効
果的に洗浄する能力によってシステムに試験融通性が加
わることは重要である。例えば事実上全ての免疫試験工
程をこの装置で効果的に行うことができる。競争平衡、
連続飽和、免疫的、サンドイッチ状のタンデム反応原理
に基づく試験プロトコールを導入することができる。さ
らに固定化された抗原及び非免疫化学的な捕獲担体に基
づく試験プロトコールも行うことができる。例えばDNA
とRNAプローブの使用に依存するハイブリッド形成が導
入可能である。

さらにシステムを適用することが可能な別の応用例と
しては尿素サンプル内のバクテリヤの検出がある。これ
は、バクテリヤを粒子担体上に収集し従来の免疫学的あ
るいは細菌学的色素で着色する単純な着色法に基づいて
いる。

ここに記載されたシステム、方法及び装置は、通常複
合体形成型試験に要する時間の掛かる試験工程を自動化
し、低コストの複雑でない手段を提供する。本発明によ
って提供された低コスト、スピード及び便宜性によって
医療研究機関同様医者の事務所における試験も促進する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一形態に従って構成されたマルチポー
トプロセッサを一部はブロック図、一部は概略図で示し
ている。第２図は第１図に示されたシステムに用いられ
る本発明の一実施例に従って構成された容器の、一部断
面状の図である。第３図は第１図に示されたシステムに
用いられる容器の別の形態を分解した状態を示す図であ
り、第４図は第１図に示されたシステムに用いられるさ
らに別の容器を分解した状態を示す図であり、第５図は
第１図に示されたシステムに用いられる又さらに別の容
器を一部切り欠き状態で示す図である。第６図は第１図
に示されたシステムを用いて複合体形成試験を実行する
コンピュータ制御された方法を表わす流れ図である。第
７図及び第7A図は本発明のシステムに用いられるマニホ
ルドの別の形態を表わす一部概略的な図である。第８図
は本発明の別の実施例に従って構成された複合体混合物
を成分に分離するためのマルチポートプロセッサの一部
概略的な図であり、第９図はマイクロタイタープレート
を用いるように変形された本発明のシステムの一部概略
的な図である。 10、10′、10″……マルチポートマニホルド、12……導
管、14、14′、14″、17、17′、17″、22、22′、22″
……バルブ、16、16′、16″……トラップ、18、18′、
18″……真空源、19……ガス源、20、20′、20″……容
器ポート、24、24′、24″……補助試薬、26、26′、2
6″……洗浄流体、28……基質、30、30′、30″……制
御ユニット、38……コンパートメント、40……管状部、
43……保護キャップ、46……栓、110、112……多孔性容
器。

フロントページの続き (72)発明者 ジエス・ギヤレツト・フオーサイス・ジ ユニア アメリカ合衆国 ペンシルバニア州 19063 メデイア，リドレイ・クリー ク・ドライブ 924 (72)発明者 フランク・トーマス・ジエローミニ アメリカ合衆国 ニユージヤージー州 08027 ギブスタウン，マレン・アベニ ユー 825 (56)参考文献 特開 昭56−147067（ＪＰ，Ａ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１つの開口端を有する流体容器内に位置さ
   れている流体サンプルを処理し、決定されるべき分析物
   を含む可能性のある固体支持体上の捕獲試薬を有し、分
   析物を捕獲試薬にさらすための手段を具備している流体
   サンプル処理装置において、 閉鎖されたチャンバを形成し、このチャンバと連通する
   第１と第２の出入口を具備しているマニホルドと、 前記マニホルドの第１の出入口と結合して流体を流通さ
   せるように流体容器の開口端を設置する手段と、 前記サンプルの容器内を大気圧よりも低い負圧状態に維
   持しながら、ガス、真空、試薬および洗浄流体を前記マ
   ニホルドの第２の出入口を通って前記閉鎖されたチャン
   バ、及び前記流体容器中に選択的に導入し、又そこから
   選択的に除去し、捕獲試薬と分析物との間の迅速な反応
   と、捕獲試薬の効率的な洗浄と、分析物の収集とを交互
   に行わせる手段とを具備していることを特徴とする流体
   サンプル処理装置。
2. 【請求項２】前記選択的に導入する手段が閉鎖された前
   記チャンバ及び流体容器に調整されたパルス状の真空及
   び空気を供給する特許請求の範囲第１項記載の装置。
3. 【請求項３】流体容器が細長く、一端が閉じ又他端が開
   口しており、開口端が前記チャンバと連結されている特
   許請求の範囲第１項記載の装置。
4. 【請求項４】流体容器が空室を形成する閉じた部分と、
   開口端内の多孔性保持器とを備え、捕獲試薬が空室内に
   位置されている特許請求の範囲第２項記載の装置。
5. 【請求項５】捕獲試薬が保持器を通過することができな
   い粒子に固定されている特許請求の範囲第４項記載の装
   置。
6. 【請求項６】捕獲試薬が多孔性保持器に固定されている
   特許請求の範囲第４項記載の装置。
7. 【請求項７】流体容器が押し潰すことができるように構
   成されている特許請求の範囲第３項記載の装置。
8. 【請求項８】流体容器が空室を形成する閉じた部分と、
   開口端内の多孔性保持器を備え、捕獲試薬が空室内に位
   置されている特許請求の範囲第７項記載の装置。
9. 【請求項９】閉じたチャンバが細長い通路として形成さ
   れており、この通路の一端部に第２の出入口があり、通
   路の他端部には第３の出入口がある特許請求の範囲第８
   項記載の装置。
10. 【請求項１０】出入口を有し、この出入口以外は密閉さ
    れている流体容器内に分析物用の捕獲試薬と共に配置さ
    れた分析物を含む流体サンプルを有し、容器内の多孔性
    保持器によって捕獲試薬の逃げるのを阻止している流体
    サンプルの処理方法において、 前記出入口及び容器を真空にさらし、その後容器を選択
    的に試薬、真空、空気、又は洗浄流体にさらし、しかも
    容器内を常に大気圧よりも低い負圧状態に維持すること
    により捕獲試薬の洗浄および分析物の収集を行うことを
    特徴とする流体サンプルの処理方法。
11. 【請求項１１】分析物と試薬を捕獲試薬を通過して前後
    に往復的に再循環させるために、容器に調整した真空及
    び空気が与えられる特許請求の範囲第10項記載の方法。