DE60225478T2

DE60225478T2 - Verfahren zur herstellung des coenzyms q10

Info

Publication number: DE60225478T2
Application number: DE60225478T
Authority: DE
Inventors: Kazuyoshi Akashi-shi YAJIMA; Takahisa Akashi-shi KATO; Akihisa Osaka-shi KANDA; Shiro Akashi-shi KITAMURA; Yasuyoshi Himeji-shi UEDA
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2022-12-28
Also published as: TWI305547B; TW200301306A; US20110136191A1; EP1466983A4; JPWO2003056024A1; RU2298035C2; DE60225478D1; TWI349039B; US20050069996A1; JP5788831B2; JP2012157360A; US9926580B2; JP2008253271A; JP5074287B2; AU2002357526A1; CN100523205C; AU2002357526B2; WO2003056024A1; KR20040076266A; EP1466983A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen des reduzierten Coenzyms Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (I):
und ein Verfahren zum Herstellen des oxidierten Coenzyms Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (II):
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des reduzierten Coenzyms Q₁₀, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: die Kultivierung von Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, gegebenenfalls das Zerstören der mikrobiellen Zellen und das Gewinnen des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen des oxidierten Coenzyms Q₁₀, welches entweder das Gewinnen des oxidierten Coenzyms Q₁₀ nach dem Oxidieren der oben erwähnten mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon oder das Gewinnen des reduzierten Coenzyms Q₁₀ aus den oben erwähnten mikrobiellen Zellen oder dem zerstörten Produkt hiervon umfasst, um hiernach das so erhaltene reduzierte Coenzym Q₁₀ zu oxidieren.
Hintergrund der Erfindung
Das reduzierte Coenzym Q₁₀ (I) und das oxidierte Coenzym Q₁₀ (II) sind mitochondrische, ein Elektronentransportsystem darstellende Faktoren in Zellen eines lebenden Körpers eines Menschen und sind in die ATP-Produktion involviert, indem sie als Elektronenträger in oxidativen Phosphorisierungsreaktionen agieren.
Oxidiertes Coenzym Q₁₀ findet üblicherweise, außer als pharmazeutisch und physiologisch effektive Substanzen, für eine Vielzahl von Krankheiten in pharmazeutischen Produkten breite Anwendung in Nahrungsergänzungsmitteln und kosmetischen Produkten.
Im übrigen hat das reduzierte Coenzym Q₁₀ bisher noch kaum Aufmerksamkeit auf sich gezogen; in vergangenen Jahren wurde jedoch berichtet, dass reduziertes Coenzym Q₁₀ in verschiedenen Anwendungen effektiver ist als das oxidierte Coenzym Q₁₀.
Zum Beispiel beschreibt die japanische Veröffentlichung Kokai Hei-10-330251 ein antihypercholesterolemisches Mittel mit hervorragender Cholesterin-senkender Eigenschaft, ein antihyperlipämisches Mittel und ein Mittel zum Behandeln und zum Vorbeugen von Arteriosklerose, welche reduziertes Coenzym Q₁₀ als aktiven Bestandteil enthalten. Darüber hinaus offenbart die japanische Veröffentlichung Kokai Hei-10-109933 eine pharmazeutische Zusammensetzung mit hervorragender oraler Absorptionsfähigkeit, umfassend Coenzym Q₁₀, welches reduziertes Coenzym Q₁₀ als aktiven Bestandteil enthält.
Des Weiteren ist reduziertes Coenzym Q₁₀ als Antioxidationsmittel und Radikalfänger wirksam. R. Stocker, et al. haben berichtet, dass reduziertes Coenzym Q₁₀ die Peroxidation von humanem LDL effizienter unterdrückt als α-Tocopherol, Lycopen und β-Carotin (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, Band 88, Seiten 1646–1650, 1991).
Es ist bekannt, dass sich oxidiertes Coenzym Q₁₀ und reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem lebenden Körper in einem bestimmten Gleichgewicht befinden und dass im lebenden Körper absorbiertes oxidiertes Coenzym Q₁₀/reduziertes Coenzym Q₁₀ beiderseitig reduziert/oxidiert wird.
Es wird vermutet, dass reduziertes Coenzym Q₁₀ durch ein chemisches Syntheseverfahren hergestellt wird, welches dem Verfahren zum Herstellen von oxidiertem Coenzym Q₁₀ ähnelt. Jedoch geht man davon aus, dass das Syntheseverfahren kompliziert, riskant und kostenaufwendig ist. Darüber hinaus ist es notwendig, im Falle von chemischen Syntheseverfahren, die Entstehung von und die Kontaminierung mit einem (Z)-Isomer zu unterdrücken, von dem man annimmt, dass es unsicher ist (Biomedical and Clinical Aspects of Coenzym Q, Band 3, Seiten 19–30, 1981). Die Europäische Pharmacopoeia schreibt vor, dass der Gehalt an (Z)-Isomer in oxidiertem Coenzym Q₁₀ nicht höher als 0,1% sein darf.
Als weiteres Verfahren zum Herstellen von reduziertem Coenzym Q₁₀ kann ein Verfahren angenommen werden, das mikrobielle Zellen verwendet, d. h. ein Verfahren zum Trennen und Gewinnen von reduziertem Coenzym Q₁₀ von Mikroorganismen, die reduziertes Coenzym Q₁₀ herstellen. Allerdings enthält das durch mikrobielle Zellen der oben genannten Mikroorganismen hergestellte reduzierte Coenzym Q₁₀ eine große Menge von oxidiertem Coenzym Q₁₀, und die Trennung und Gewinnung des reduzierten Coenzym Q₁₀ durch ein konventionelles Verfahren ist mit hohen Kosten verbunden.
Die folgenden Dokumente beschreiben die Anwesenheit von reduziertem Coenzym Q₁₀ in mikrobiellen Zellen und die folgenden Beispiele von Bakterien sind bekannt.

(1) Ein Beispiel, welches beschreibt, dass wenigstens 5 bis 10 Gew.-% und höchstens 30 bis 60 Gew.-% von reduziertem Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ in Kulturzellen von Photosynthesebakterien vorhanden sind ( japanische Veröffentlichung Kokai Sho-57-70834 ).
(2) Ein Beispiel, welches beschreibt, dass die Gattung Pseudomonas einer thermischen Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart von Natriumhydroxid und Pyrogallol unterworfen wird, und worin das Erhaltene mit 5%iger Natriumhydrosulfitlösung behandelt und anschließend getrocknet und konzentriert wird, um einen acetonlöslichen Teil zu erhalten, und worin ein ölhaltiges reduziertes Coenzym Q₁₀ erhalten wird ( japanische Veröffentlichung Kokai Sho-60-75294 ).

Sowohl Beispiel (1) als auch Beispiel (2) zielen darauf ab, eine Mischung des erhaltenen reduzierten Coenzyms Q₁₀ und oxidierten Coenzyms Q₁₀ oder das erhaltene reduzierte Coenzym Q₁₀ durch weitere Oxidation in oxidiertes Coenzym Q₁₀ zu überführen. Insofern wird reduziertes Coenzym Q₁₀ lediglich als ein Zwischenprodukt in der Herstellung von oxidiertem Coenzym Q₁₀ beschrieben.
In dem obigen Beispiel (1) werden Photosynthesebakterien verwendet, deren Kultivierung kompliziert ist. Darüber hinaus kann nicht gesagt werden, dass das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ in den mikrobiellen Zellen der oben genannten Mikroorganismen ausreichend ist, wenn auf die Herstellung von reduziertem Coenzym Q₁₀ abgezielt wird.
Das obige Beispiel (2) umfasst ein Verfahren zum Überführen von in einer Hexanphase enthaltenem oxidierten Coenzym Q₁₀ in reduziertes Coenzym Q₁₀ mit Natriumhydrosulfit, einem Reduktionsmittel (siehe Beispiel 3 in der japanischen Veröffentlichung Kokai Sho-60-75294) . Insofern ist das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ in den mikrobiellen Zellen nicht klar.
Darüber hinaus sind weder im obigem Beispiel (1) noch im Beispiel (2) die Herstellungsmengen von Coenzymen Q in der Kultur beschrieben.
Wie oben beschrieben, wurde bisher nicht über mikrobielle Zellen berichtet, die reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem hohen Anteil aufweisen. Umso weniger war ein Fermentationsverfahren zum Herstellen von reduziertem Coenzym Q₁₀ in industriellem Maßstab, d. h. ein Verfahren, umfassend die Kultivierung von Mikroorganismen, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem hohen Anteil unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, und das Gewinnen des reduzierten Coenzyms Q₁₀, um hochreines reduziertes Coenzym Q₁₀ zu erhalten, bekannt.
Falls ein Verfahren zum Erhalten einer großen Menge von Coenzym Q₁₀, welches einen großen Anteil reduziertes Coenzym Q₁₀ enthält, durch Kultivierung von Mikroorganismen gefunden wird, kann es unter diesen Umständen ein sehr nützliches Verfahren zum Herstellen von reduziertem Coenzym Q₁₀ darstellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein sicheres und in industriellem Maßstab effizientes Verfahren zum Herstellen von Coenzym Q₁₀ durch Kultivierung von Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die einen hohen Anteil an reduziertem Coenzym Q₁₀ enthalten, und zum geeigneten Gewinnen von reduziertem Coenzym Q₁₀ aus den mikrobiellen Zellen bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Herstellen von oxidiertem Coenzym Q₁₀ in einfachen Verfahren durch Kultivierung von Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, um mikrobielle Zellen mit einem hohen Anteil an reduziertem Coenzym Q₁₀ zu erhalten, und Oxidieren des aus den mikrobiellen Zellen als Zwischensubstanz in der Herstellung von oxidiertem Coenzym Q₁₀ erhaltenen reduzierten Coenzym Q₁₀ bereitzustellen.
Insofern betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen des reduzierten Coenzym Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (I):
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: die Kultivierung von Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle und einen Mikronährstoff enthält, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten,
gegebenenfalls das Zerstören der mikrobiellen Zellen und das Extrahieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ mit einem organischen Lösungsmittel.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen des oxidierten Coenzyms Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (II):
wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
die Kultivierung von Mikroorganismen, die reduziertes Coenzym Q₁₀ herstellen in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle und einen Mikronährstoff enthält, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten,
gegebenenfalls das Zerstören der mikrobiellen Zellen; und entweder das Oxidieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ unter Verwendung eines Oxidationsmittels und anschließendes Extrahieren des Resultierenden mit einem organischen Lösungsmittel oder das Extrahieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ mit einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls Reinigen und Oxidieren des Resultierenden zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ unter Verwendung eines Oxidationsmittels.
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann reduziertes Coenzym Q₁₀ günstig in industriellem Maßstab mit verhältnismäßig einfachen Schritten, umfassend die Kultivierung von Mikroorganismen und das Gewinnen von reduziertem Coenzym Q₁₀ hergestellt werden. Des Weiteren kann oxidiertes Coenzym Q₁₀ ebenfalls in einfachen Verfahren hergestellt werden. Außerdem enthalten diese durch Mikroorganismen hergestellten Coenzyme Q₁₀ im Wesentlichen keine (Z)-Isomere hiervon und die (all-E)-Isomere hiervon können erhalten werden, welche dieselben sind wie diejenigen, die in Fleisch, Fisch etc. enthalten sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung werden zunächst Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, kultiviert, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol%, unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten (Fermentation).
Die mikrobiellen Zellen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in solch einem hohen Verhältnis unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, können im Wesentlichen durch Kultivierung von Mikroorganismen erhalten werden, die zum Herstellen von reduziertem Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol%, unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ geeignet sind.
In was für einem Verhältnis die Mikroorganismen das reduzierte Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ herstellen können, kann z. B. durch ein Verfahren ermittelt werden, welches die Kultivierung der Mikroorganismen unter Schütteln (Amplitude: 2 cm, 310 Pendelbewegungen/min) bei 25°C für 72 Stunden in 10 ml eines Kulturmediums [(Glucose: 20 g, Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g)/l, pH: 6,0] unter Verwendung eines Teströhrchens (innerer Durchmesser: 21 mm, Gesamtlänge: 200 mm) umfasst.
Obwohl die bevorzugten Kultivierungsbedingungen für die Fermentationsherstellung in industriellem Maßstab später beschrieben wird, ist die oben genannte Kultivierungsbedingung ein Verfahren zum Standardisieren des Verhältnisses von hergestelltem reduzierten Coenzym Q₁₀, welches Mikroorganismen als ihre Fähigkeit aufweisen, um das Verhältnis innerhalb eines Bereiches wiederzuspiegeln, ohne signifikante Ungenauigkeiten aufzuweisen.
Unter der oben genannten Kultivierungsbedingung ist es für die vorliegende Erfindung bevorzugt, mikrobielle Zellen zu verwenden, in denen der Gehalt an reduziertem Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol%, unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ ist. Es ist noch bevorzugter, Mikroorganismen zu verwenden, die eine Produktivität von im Wesentlichen nicht weniger als 1 μg/ml, bevorzugt nicht weniger als 2 μg/ml reduziertes Coenzym Q₁₀ pro Einheit Kulturmedium unter der oben genannten Kultivierungsbedingung aufweisen.
Der oben erwähnte Gehalt an reduziertem Coenzym Q₁₀ und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ kann physikalisch durch Zerstören der mikrobiellen Zellen, Extrahieren des Coenzyms Q₁₀ aus den so erhaltenen Zellen mit einem organischen Lösungsmittel und Durchführen einer HPLC-Analyse bestätigt werden. Insbesondere kann die Messung gemäß den folgenden Verfahren durchgeführt werden:

(1) Die Mikroorganismenbrühe wird gegebenenfalls konzentriert, 10 Vol.Teile der Brühe werden in ein Teströhrchen mit Schraubverschluss überführt (innerer Durchmesser: 16,5 mm, Gesamtlänge: 130 mm) und 10 Vol.Teile Glasperlen werden zugegeben (425 bis 600 μm, hergestellt von SIGMA Co.);
(2) 3 Vol.Teile Isopropanol und 18,5 Vol.Teile n-Hexan, bezogen auf 10 Vol.Teile der Brühe, werden unter Stickstoffatmosphäre zugegeben;
(3) Zerstörung der mikrobiellen Zellen und Extraktion werden durch starkes Schütteln der Mischung für 3 Minuten unter einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt; und
(4) die erhaltene hydrophobe organische Lösungsmittelphase (n-Hexan-Phase) wird unter vermindertem Druck verdampft (Badtemperatur: 40°C), um das Resultierende mittels HPLC zu analysieren.

Säule:	YMC-Pack 4,6 × 250 mm (hergestellt
	von YMC. Co., Ltd.)
Mobile Phase:	Methanol/n-Hexan = 85/15
Flussrate:	1 ml/min,
Detektion:	UV 275 nm,
Retentionszeit:	reduziertes Coenzym Q₁₀ 13,5 min
	oxidiertes Coenzym Q₁₀ 22,0 min.

Das oben erwähnte Messverfahren wird bereitgestellt, damit das erhaltene Ergebnis den Gehalt an reduziertem Coenzym Q₁₀ und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ so genau wie möglich wiederspiegelt, und um den Gehalt und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀, welche als Minimum garantiert werden können, zu standardisieren. Die gegenwärtigen Erfinder haben durch verschiedene Untersuchungen gezeigt, dass dieses Verfahren leicht und geeignet durchgeführt werden kann.
Als oben genannte erfindungsgemäß zu verwendende Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, können Bakterien, Hefe und Pilze ohne besondere Einschränkung verwendet werden. Als spezifische Beispiele der oben genannten Mikroorganismen können z. B. Mikroorganismen der Gattung Agrobacterium, der Gattung Aspergillus, der Gattung Acetobacter, der Gattung Aminobacter, der Gattung Agromonas, der Gattung Acidiphilium, der Gattung Bulleromyces, der Gattung Bullera, der Gattung Brevundimonas, der Gattung Cryptococcus, der Gattung Chionosphaera, der Gattung Candida, der Gattung Cerinosterus, der Gattung Exisophiala, der Gattung Exobasidium, der Gattung Fellomyces, der Gattung Filobasidiella, der Gattung Filobasidium, der Gattung Geotrichum, der Gattung Graphiola, der Gattung Gluconobacter, der Gattung Kockovaella, der Gattung Kurtzmanomyces, der Gattung Lalaria, der Gattung Leucosporidium, der Gattung Legionella, der Gattung Methylobacterium, der Gattung Mycoplana, der Gattung Oosporidium, der Gattung Pseudomonas, der Gattung Psedozyma, der Gattung Paracoccus, der Gattung Petromyces, der Gattung Rhodotorula, der Gattung Rhodosporidium, der Gattung Rhizomonas, der Gattung Rhodobium, der Gattung Rhodoplanes, der Gattung Rhodopseudomonas, der Gattung Rhodobacter, der Gattung Sporobolomyces, der Gattung Sporidiobolus, der Gattung Saitoella, der Gattung Schizosaccharomyces, der Gattung Sphingomonas, der Gattung Sporotrichum, der Gattung Sympodiomycopsis, der Gattung Sterigmatosporidium, der Gattung Tapharina, der Gattung Tremella, der Gattung Trichosporon, der Gattung Tilletiaria, der Gattung Tilletia, der Gattung Tolyposporium, der Gattung Tilletiopsis, der Gattung Ustilago, der Gattung Udeniomyces, der Gattung Xanthophyllomyces, der Gattung Xanthobacter, der Gattung Paecilomyces, der Gattung Acremonium, der Gattung Hyhomonus oder der Gattung Rhizobium genannt werden.
Hinsichtlich der Einfachheit und Produktivität der Kultivierung sind Bakterien (bevorzugt nichtphotosynthetische Bakterien) und Hefe bevorzugt. Als Bakterien können z. B. die Gattung Agrobacterium, die Gattung Gluconobacter und ähnliche genannt werden. Als Hefe können z. B. die Gattung Schizosaccharomyces, die Gattung Saitoella und ähnliche genannt werden.
Als bevorzugte Arten können z. B. Agrobacterium tumefacience IF013263, Agrobacterium radiobacter ATCC4718, Aspergillus clavatus JCM1718, Acetobacter xylinum IF015237, Aminobacter aganouensis JCM7854, Agromonas oligotrophica JCM1494, Acidiphilium multivorum JCM8867, Bulleromyces albus IFO1192, Bullera armeniaca IFO10112, Brevundimonas diminuta JCM2788, Cryptococcus laurentii IFO0609, Chionosphaera apobasidialis CBS7430, Candida curvata ATCC10567, Cerinosterus luteoalbus JCM2923, Exisophiala alcalophila JCM12519, Exobasidium gracile IFO7788, Fellomyces fuzhouensis IFO10374, Filobasidiella neoformans CBS132, Filobasidium capsuloigenum CBS1906, Geotrichum capitatum JCM6258, Graphiola cylindrica IFO6426, Gluconobacter suboxydans IFO3257, Kockovaella imperatae JCM7826, Kurtzmanomyces nectairei IFO10118, Lalaria cerasi CBS275.28, Leucosporidium scottii IFO1212, Legionella anisa JCM7573, Methylobacterium extorguens JCM2802, Mycoplana ramosa JCM7822, Oosporidium margaritiferum CBS2531, Pseudomonas denitrificans IAM12023, Pseudomonas shuylkilliensis IAM1092, Psedozyma aphidis CBS517.23, Paracoccus denitrificans JCM6892, Petromyces alliaceus IFO7538, Rhodotorula glutinis IFO1125, Rhodotorula minuta IFO0387, Rhodosporidium diobovatum ATCC1830, Rhizomonas suberifaciens IFO15212, Rhodobium Orients JCM9337, Rhodoplanes elegans JCM9224, Rhodopseudomonas palustris JCM2524, Rhodobacter capsulatus SB1003, Sporobolomyces holsaticus IFO1034, Sporobolomyces pararoseus IFO0471, Sporidiobolus johnsonii IFO1840, Saitoella complicata IFO10748, Schizosaccharomyces pombe IFO0347, Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100, Sporotrichum cellulophilium ATCC20493, Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318, Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121, Sphingomonas adhesiva JCM7370, Tapharina caerulescens CBS351.35, Tremella mesenterica ATCC24438, Trichosporon cutaneum IFO1198, Tilletiaria anomala CBS436.72, Tilletia caries JCM1761, Tolyposporium bullatum JCM2006, Tilletiopsis washintonesis CBS544, Ustilago esculenta IFO9887, Udeniomyces megalosporus JCM5269, Xanthophyllomyces dendrorhous IFO10129, Xanthobacter flavus JCM1204, Paecilomyces lilacinus ATCC10114, Acremonium chrysogenum ATCC11550, Hyphomonas hirschiana ATCC33886, Rhizobium meliloti ATCC9930 und ähnliche genannt werden.
Als Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, können nicht nur wilde Arten der oben genannten Mikroorganismen, sondern ebenfalls bevorzugt Mikroorganismen verwendet werden, in denen zum Beispiel die Transkriptions- und Translationsaktivitäten der für die Biosynthese von reduziertem Coenzym Q₁₀ in den oben genannten Mikroorganismen relevanten Gene oder die Enzymaktivität für das exprimierte Protein modifiziert oder verbessert sind.
Als Mittel zum Modifizieren oder Verbessern der Transkriptions- und Translationsaktivitäten der Gene oder der Enzymaktivität des exprimierten Proteins können Genrekombination (die eine Genverbesserung, Vervielfältigung und Zerstörung durch sich selbst, externe Geneinführung und Genverbesserung und Proliferation so eingeführter externer Gene umfasst) und Mutagenese durch Mutagene erwähnt werden. Insbesondere ist die Mutagenese durch Mutagene bevorzugt.
Die bevorzugteren Mikroorganismen, die für die gegenwärtige Erfindung verwendbar sind, sind Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol%, noch bevorzugter nicht weniger als 80 mol%, noch bevorzugter nicht weniger als 85 mol% und besonders bevorzugt nicht weniger als 90 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ in dem Fall enthalten, in dem die oben genannten modifizierten oder verbesserten Mikroorganismen, bevorzugt durch Mutagene mutierte Mikroorganismen, mittels der oben genannten Proliferations- und Messverfahren ausgewertet werden. In der Fermentationsherstellung in industriellem Maßstab ist es bevorzugt, Mikroorganismen zu verwenden, die eine Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ pro Einheit Kulturmedium von nicht weniger als 1 μg/ml, bevorzugt nicht weniger als 2 μg/ml, noch bevorzugter nicht weniger als 3 μg/ml, noch bevorzugter nicht weniger als 5 μg/ml, besonders bevorzugt nicht weniger als 10 μg/ml, noch viel bevorzugter nicht weniger als 15 μg/ml und am bevorzugtesten nicht weniger als 20 μg/ml aufweisen.
Die Mutagenese kann durch eine einzelne Mutagenese durchgeführt werden; jedoch wird die Mutagenese bevorzugt nicht weniger als 2-mal durchgeführt. Dies liegt daran, dass gefunden wurde, dass die Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ in den jeweiligen Mutageneseschritten verbessert werden kann. Natürlich sind die zu mutierenden Kandidaten der mikrobiellen Zellen im allgemeinen diejenigen, die in dem Fall, in dem die Ermittlung mit Hilfe der oben genannten Proliferations- und Messverfahren durchgeführt wird, eine möglichst hohe Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ aufweisen.
Die Mutagenese kann unter Verwendung optionaler und passender Mutagene durchgeführt werden. Der Ausdruck "Mutagen" beinhaltet in einer breiten Definition z. B. nicht nur chemische Mittel mit Mutageneseeffekten, sondern auch Behandlungen wie UV-Bestrahlung mit Mutageneseeffekten. Als passende Mutagene können Ethylmethansulfonat, UV-Strahlung, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, Nukleotidbasenanaloga, wie Bromouracil und Acridine genannt werden; jedoch sind sie nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Gemäß herkömmlicher Mutagenesetechnik wird im Anschluss an die Mutagenese eine angemessene Auswahl mikrobieller Zellen mit hoher Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ durchgeführt. Dafür sollte die von einer einzelnen Kolonie erhaltene Kultur untersucht werden, z. B. durch die oben genannten Proliferations- und Messverfahren. Da ein reduzierter Coenzym Q₁₀-Kristall eine weiße feste Schicht oder eine farblose flüssige Phase bildet, kann die Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ geeignet durch das oben genannte Messverfahren zum Zeitpunkt der Auswahl der Kolonie ermittelt werden.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kann eine hohe Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ in der Fermentationsproduktion im industriellen Maßstab insbesondere durch Verwenden der mikrobiellen Zellen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, erreicht werden und insbesondere durch Verwenden geeigneter Kultivierungs(Fermentations-)bedingungen zum Steigern der Produktivität des reduzierten Coenzyms Q₁₀ pro Einheit Kulturmedium, wie unten beschrieben. Es ist insbesondere bevorzugt, die oben beschriebenen geeigneten mikrobiellen Zellen in Kombination mit geeigneten Kultivierungs-(Fermentations-)bedingungen, wie unten beschrieben, zu verwenden.
Die Kultivierung wird allgemein in einem Kulturmedium durchgeführt, welches für eine Proliferation der Mikroorganismen geeignete Hauptnährstoffe und Mikronährstoffe enthält. Als die oben genannten Nährstoffe können z. B. Kohlenstoffquellen (Kohlenwasserstoffe, wie Glucose, Saccharose, Maltose, Stärke, Maissirup und Molassen; Alkohole, wie Methanol und Ethanol), Stickstoffquellen (z. B. Corn Steep Liquor, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumhydroxid, Harnstoff und Pepton), Phosphorquellen (z. B. Ammoniumphosphat und Phosphorsäure) und Mikronährstoffe (z. B. Mineralien, wie Magnesium, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen, Mangan, Molybdän, Schwefelsäure und Salzsäure; Vitamine, wie Biotin, Desthiobiotin und Vitamin B1; Aminosäuren, wie Alanin und Histidin; und natürliche vitaminhaltige Rohmaterialien, wie Hefeextrakt und Malzextrakt) genannt werden; jedoch sind diese nicht beschränkend und herkömmlich verwendete können verwendet werden. Im übrigen sind in natürlichen Komponenten eines Kulturmediums, wie Hefeextrakt, Phosphorquellen, wie Phosphate enthalten. Die oben genannten Nährstoffe können geeignet in Kombination verwendet werden.
Die Kultivierung wird allgemein in einem Temperaturbereich von 15 bis 45°C, bevorzugt von 20 bis 37°C, durchgeführt. Unterhalb von 15°C neigt die Proliferationsgeschwindigkeit der Mikroorganismen dazu, für eine industrielle Herstellung zu langsam zu sein, und bei hohen Temperaturen, oberhalb von 45°C, ist die Entwicklungsfähigkeit der Mikroorganismen leicht eingeschränkt.
Allgemein wird die Kultivierung in einem pH-Bereich von 4 bis 9, bevorzugt 5 bis 8, durchgeführt. Wenn der pH nicht mehr als 3 oder nicht weniger als 10 beträgt, wird die Proliferation der Mikroorganismen leicht inhibiert.
Die Konzentration der Kohlenstoffquellen (welche die produzierten Alkohole beinhaltet) wird in der Fermentationsherstellung in industriellem Maßstab bevorzugt während der Kultivierung derart kontrolliert, dass im Wesentlichen keine negativen Effekte bezüglich der Produktivität des reduzierten Coenzyms Q₁₀ verursacht werden, obwohl dies von den Mikroorganismenarten abhängt. Entsprechend ist es bevorzugt, die Kultivierung derart zu kontrollieren, dass die Konzentration der Kohlenstoffquellen derart ist, dass im Wesentlichen keine negativen Effekte bezüglich der Produktivität des reduzierten Coenzyms Q₁₀ verursacht werden, d. h., dass sie im Allgemeinen nicht mehr als 20 g/l, bevorzugt nicht mehr als 5 g/l und bevorzugter nicht mehr als 2 g/l in der Brühe beträgt.
Um die Konzentration der Kohlenstoffquelle zu kontrollieren, wird bevorzugt ein Fed-Batch-Kultivierverfahren verwendet. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Brühe kann durch Einstellen der Zufuhr der Nährstoffquellen (insbesondere der Kohlenstoffquellen) hinsichtlich der Kulturkontrollindizes, wie pH, gelöste Sauerstoffkonzentration (DO) oder verbleibende Saccharidkonzentration, kontrolliert werden. Die Zufuhr der Nährstoffquellen kann ab dem Anfangsstadium der Kultivierung oder während der Kultivierung begonnen werden, obwohl dies von der Art der Mikroorganismen abhängt. Die Zufuhr der Nährstoffquellen kann kontinuierlich oder periodisch sein. Im übrigen ist es bevorzugt, beim Zugeben der Nährstoffquellen die oben genannten Kohlenstoffquellen getrennt von anderen Komponenten zu dem Kulturmedium zu geben.
Die Kultivierung kann zu dem Zeitpunkt, an dem eine gewünschte Menge von reduziertem Coenzym Q₁₀ hergestellt wurde, vollendet sein. Die Kultivierungsdauer ist keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und beträgt allgemein 20 bis 200 Stunden.
Die oben genannte Kultivierung wird gewöhnlich aerob durchgeführt. Der Ausdruck "aerob" beschreibt eine Bedingung, unter der Sauerstoff zugeführt wird, so dass keine Sauerstofflimitierung (Sauerstoffmangel) während der Kultivierung verursacht wird, und bevorzugt eine Bedingung, unter der ausreichend Sauerstoff zugeführt wird, so dass keine wesentliche Sauerstofflimitierung während der Kultivierung auftritt. Die Kultivierung wird üblicherweise unter Belüftungsbedingungen (aeration condition) durchgeführt, bevorzugt unter Belüftungs- und Rührbedingungen.
Unter Verwendung der oben genannten Mikroorganismen und Kultivierungsbedingungen ist es möglich, mikrobielle Zellen zu erhalten, die reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten. Zusätzlich kann eine hohe Produktivität an reduziertem Coenzym Q₁₀ von nicht weniger als 1 μg/ml, bevorzugt nicht weniger als 2 μg/ml und noch bevorzugter nicht weniger als 3 μg/ml erhalten werden.
Im Folgenden wird die Gewinnung des in der oben beschriebenen Kultivierung hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung wird eine effiziente Herstellung von reduziertem Coenzym Q₁₀ in industriellem Maßstab ermöglicht, teilweise durch die oben erwähnte geeignete Kultivierung und teilweise durch den unten beschriebenen Gewinnungsprozess des reduzierten Coenzyms Q₁₀. Die Gewinnung von reduziertem Coenzym Q₁₀ wird durch Extraktion der in der oben erwähnten Kultivierung erhaltenen mikrobiellen Zellen unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels durchgeführt.
In der Extraktion können Zellen gegebenenfalls zerstört werden. Die Zellzerstörung trägt zur effizienten Extraktion des hergestellten und in den Zellen akkumulierten reduzierten Coenzyms Q₁₀ bei. Selbstverständlich können die Zellzerstörung und die Extraktion gleichzeitig durchgeführt werden.
Im übrigen kann die "Zerstörung" erfindungsgemäß derart durchgeführt werden, dass die Oberflächenstruktur, wie Zellwände, aufgebrochen wird, so dass die Extraktion des reduzierten Coenzyms Q₁₀ ermöglicht wird; insofern ist es nicht notwendig, dass mikrobielle Zellen zerrissen oder fragmentiert werden.
Die oben genannte Zellzerstörung ist im Falle von Bakterien nicht notwendigerweise erforderlich. Im Falle von Hefe oder Pilzen ist die Zellzerstörung jedoch grundsätzlich nötig und es wird schwierig, das hergestellte und in den Zellen akkumulierte reduzierte Coenzym Q₁₀ effizient zu gewinnen, wenn die Zellen nicht zerstört werden.
Die oben genannte Zerstörung mikrobieller Zellen kann gemäß einem oder mehrerer der folgenden Zerstörungsverfahren in optionaler Reihenfolge durchgeführt werden. Als Zerstörungsverfahren kann z. B. eine physikalische Behandlung, eine chemische Behandlung, eine enzymatische Behandlung sowie eine Wärmebehandlung, eine Autolyse, eine Osmolyse, eine Plasmoptyse und dergleichen genannt werden.
Die oben genannte physikalische Behandlung kann z. B. unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisierers, eines Ultraschallhomogenisierers, einer French press, einer Kugelmühle und dergleichen oder unter Verwendung von ihnen in Kombination durchgeführt werden.
Die oben genannte chemische Behandlung kann z. B. unter Verwendung einer Säure (bevorzugt einer starken Säure), wie Salzsäure und Schwefelsäure, einer Base (bevorzugt einer starken Base), wie Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid und dergleichen oder unter Verwendung hiervon in Kombination durchgeführt werden.
Die oben erwähnte enzymatische Behandlung kann z. B. unter Verwendung von Lysozym, Zymolyase, Glucanase, Novozym, Protease, Cellulase und dergleichen oder unter Verwendung von ihnen in geeigneter Kombination durchgeführt werden.
Die oben erwähnte Wärmebehandlung kann z. B. durchgeführt werden, indem auf einen Temperaturbereich von 60 bis 100°C für ungefähr 30 Minuten bis 3 Stunden erwärmt wird.
Die oben erwähnte Autolyse kann z. B. durch Behandlung mit einem Lösungsmittel, wie Ethylacetat, durchgeführt werden.
Die Osmolyse oder die Plasmoptyse zum Zerstören der Zellen durch Behandeln der Zellen mit einer Lösung, die eine Salzkonzentration aufweist, die von der in den Zellen verschieden ist, werden häufig in Kombination mit der oben erwähnten physikalischen Behandlung, chemischen Behandlung, enzymatischen Behandlung, Wärmebehandlung, Autolyse und/oder dergleichen verwendet, da die obige lytische Methode alleine hinsichtlich des Zerstörungseffektes nicht ausreichend ist.
Als Vorbehandlung der Extraktion und zur Gewinnung von reduziertem Coenzym Q₁₀ sind als Zellzerstörungsverfahren von den oben genannten Zerstörungsverfahren das physikalische Verfahren, das chemische Verfahren (insbesondere ein Säureverfahren und insbesondere dasjenige mit einer starken Säure (z. B. einer Säure mit einem pKa-Wert von nicht mehr als 2,5 in der Form einer wässrigen Lösung) unter der Bedingung, unter der reduziertes Coenzym Q₁₀ vor eine Oxidationsreaktion, wie unten beschrieben, geschützt wird) und das Wärmeverfahren bevorzugt. Aus dem Gesichtspunkt der Zerstörungseffizienz ist die physikalische Behandlung bevorzugter.
Ein herkömmliches Zellzerstörungsverfahren und Coenzym Q₁₀-Extraktionsverfahren, insbesondere ein Verfahren, umfassend das Extrahieren von Coenzym Q₁₀ durch ein organisches Lösungsmittel in der Gegenwart von Natriumhydroxid und Pyrogallol, ist hinsichtlich der Kosten, der Abfallbehandlung, der Sicherheit bezüglich der effektiven Anwendung von Abfall-Mikroorganismen (Abfallzellen), wie Proteingewinnung und dergleichen, problematisch. Jedoch verursacht das Zellzerstörungsverfahren, insbesondere das physikalische Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung keine zusätzliche Entstehung großer Mengen von Salzen durch Neutralisation und es ist ein geeignetes Verfahren aus Abfallbehandlungsgesichtspunkten und hinsichtlich der effektiven Anwendung von Abfall-Mikroorganismen (Abfallzellen).
Die Form der für die oben erwähnte Zellzerstörung zu verwendenden mikrobiellen Zellen können eine Brühe, eine konzentrierte Brühe, mikrobielle Zellen, die als feuchte Zellen aus der Brühe erhalten wurden, ein Produkt, das durch das Waschen von ihnen erhalten wurde, eine Suspension der feuchten Zellen in einem Lösungsmittel (welches z. B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Puffer und dergleichen beinhaltet), trockene Zellen, die durch Trocknen der oben genannten feuchten Zellen erhalten wurden, eine Suspension der trockenen Zellen in einem Lösungsmittel (welches z. B. Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Puffer und dergleichen beinhaltet) und dergleichen sein. Bevorzugt ist eine wässrige Suspension von mikrobiellen Zellen und bevorzugter sind aus Handhabbarkeitsgesichtspunkten und dergleichen die konzentrierte Brühe und das durch Waschen erhaltene Produkt hiervon.
Die Form der für die Extraktion und die Gewinnung von reduziertem Coenzym Q₁₀ zu verwendenden oben erwähnten mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon ist, ähnlich wie oben beschrieben, keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und kann feuchte Zellen/trockene Zellen der mikrobiellen Zellen/des zerstörten Produktes hiervon, sein. Bevorzugt ist sie eine wässrige Suspension der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon und bevorzugter die Brühe, die konzentrierte Brühe und/oder gewaschene Brühe oder Lösungen, die durch Zerstören hiervon erhalten wurden (wobei jede eine wässrige Suspension darstellt).
Die Zellkonzentration in der oben erwähnten Suspension der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon ist nicht besonders limitiert und beträgt üblicherweise 1 bis 25 Gew.-%, bezogen auf das Trockengewicht. Bevorzugt beträgt sie hinsichtlich der Kosten 10 bis 20 Gew.-%.
Reduziertes Coenzym Q₁₀ kann durch Extrahieren der mikrobiellen Zellen mit einem organischen Lösungsmittel und des auf solche Art erhaltenen zerstörten Produktes hiervon gewonnen werden.
Als für die Extraktion zu verwendendes organisches Lösungsmittel können Kohlenwasserstoffe, Fettsäureester, Ether, Alkohole, Fettsäuren, Ketone, Stickstoffverbindungen (umfassend Nitrile und Amide), Schwefelverbindungen und dergleichen genannt werden.
Beim Extrahieren des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wird hinsichtlich des Schutzes vor Oxidation durch molekularen Sauerstoff bevorzugt, insbesondere wenigstens eine Art von Kohlenwasserstoffen, Fettsäureestern, Ethern und Nitrilen verwendet. Unter diesen sind Kohlenwasserstoffe und Fettsäureester besonders bevorzugt, und Kohlenwasserstoffe sind am bevorzugtesten.
Im industriellen Maßstab kann ein vollständiger Sauerstoffausschluss nur sehr schwer erzielt werden, und es sind darüber hinaus ziemlich lange Zeiten für die individuellen Verfahrensschritte, anders als bei der Darstellung im Labormaßstab, notwendig, so dass der Restsauerstoff einen großen Nebeneffekt ausübt. Die fragliche Oxidation steht in direktem Zusammenhang mit der Entstehung von oxidiertem Coenzym Q₁₀ aus reduziertem Coenzym Q₁₀. Insofern unterstützt die Verwendung des oben genannten organischen Lösungsmittels (wie Kohlenwasserstoffe, Fettsäureester, Ether und Nitrile) mit hohem Oxidationsvorbeugeeffekt bei der Extraktion von reduziertem Coenzym Q₁₀ eine effiziente Extraktion.
Die Kohlenwasserstoffe sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen, aber als Beispiels können aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind aliphatische Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe und bevorzugter sind aliphatische Kohlenwasserstoffe.
Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und können cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Grundsätzlich sind jedoch gesättigte bevorzugter. Gewöhnlich werden solche mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 5 bis 12 Kohlenstoffatomen und bevorzugter 5 bis 8 Kohlenstoffatomen verwendet. Als spezifische Beispiele können z. B. Propan, Butan, Isobutan, Pentan, 2-Methylbutan, Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Heptan, Heptanisomere (z. B. 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan), Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Nonan, 2,2,5-Trimethylhexan, Decan, Dodecan, 2-Penten, 1-Hexen, 1-Hegten, 1-Octen, 1-Nonen, 1-Decen, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Ethylcyclohexan, p-Menthan, Cyclohexen und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Pentan, 2-Methylbutan, Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Heptan, Heptanisomere (z. B. 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan), Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Nonan, 2,2,5-Trimethylhexan, Decan, Dodecan, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Ethylcyclohexan, p-Menthan und dergleichen. Bevorzugter sind Pentan, 2-Methylbutan, Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Heptan, Heptanisomere (z. B. 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan), Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Ethylcyclohexan und dergleichen.
Im Allgemeinen werden Heptane, nicht nur Heptan, sondern auch Heptanisomere, wie Methylcyclohexan, mit 7 Kohlenstoffatomen und Mischungen hiervon bevorzugt verwendet. Bevorzugter sind Pentane (z. B. Pentan und dergleichen) mit 5 Kohlenstoffatomen, Hexane (z. B. Hexan, Cyclohexan und dergleichen) mit 6 Kohlenstoffatomen und Heptane (z. B. Heptan, Methylcyclohexan und dergleichen) mit 7 Kohlenstoffatomen. Besonders bevorzugt sind Heptane (z. B. Heptan, Methylcyclohexan und dergleichen) hinsichtlich der besonders hohen Schutzwirkung vor Sauerstoff, und am bevorzugtesten ist Heptan.
Die aromatischen Kohlenwasserstoffe sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen, aber allgemein werden diejenigen mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 6 bis 12 Kohlenstoffatomen und bevorzugter 7 bis 10 Kohlenstoffatomen verwendet. Als besondere Beispiele können z. B. Benzol, Toluol, Xylol, o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Ethylbenzol, Cumen, Mesitylen, Tetralin, Butylbenzol, p-Cymen, Cyclohexylbenzol, Diethylbenzol, Pentylbenzol, Dipentylbenzol, Dodecylbenzol, Styrol und dergleichen genannt werden. Bevorzugter sind Toluol, Xylol o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Ethylbenzol, Cumen, Mesitylen, Tetralin, Butylbenzol, p-Cymen, Cyclohexylbenzol, Diethylbenzol, Pentylbenzol und dergleichen. Bevorzugter sind Toluol, Xylol, o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Cumen, Tetralin und dergleichen, und am bevorzugtesten ist Cumen.
Die halogenierten Kohlenwasserstoffe sind nicht besonders limitiert und können cyclisch oder acyclisch oder gesättigt oder ungesättigt sein. Jedoch werden im Allgemeinen die acyclischen bevorzugt verwendet. Grundsätzlich sind chlorierte Kohlenwasserstoffe und fluorierte Kohlenwasserstoffe bevorzugter und chlorierte Kohlenwasserstoffe sind noch bevorzugter. Des Weiteren werden geeigneterweise diejenigen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und bevorzugter 1 bis 2 Kohlenstoffatomen verwendet. Als spezifische Beispiele können z. B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,1-Dichlorethan, 1,2-Dichlorethan, 1,1,1-Trichlorethan, 1,1,2-Trichlorethan, 1,1,1,2-Tetrachlorethan, 1,1,2,2-Tetrachlorethan, Pentachlorethan, Hexachlorethan, 1,1-Dichlorethylen, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Tetrachlorethylen, 1,2-Dichlorpropan, 1,2,3-Trichlorpropan, Chlorbenzol, 1,1,1,2-Tetrafluorethan und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, 1,1-Dichlorethan, 1,2-Dichlorethan, 1,1,1-Trichlorethan, 1,1,2-Trichlorethan, 1,1-Dichlorethylen, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Chlorbenzol, 1,1,1,2-Tetrafluorethan und dergleichen. Bevorzugter sind Dichlormethan, Chloroform, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Chlorbenzol, 1,1,1,2-Tetrafluorethan und dergleichen.
Fettsäureester sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und es können z. B. Propionate, Acetate, Formiate und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Acetate und Formiate und bevorzugter sind Acetate. Die esterfunktionellen Gruppen hiervon sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen, aber grundsätzlich sind Alkylester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und Aralkylester mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen bevorzugt, bevorzugter sind Alkylester mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter sind Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.
Als spezifische Beispiele der Propionate können z. B. Methylpropionat, Ethylpropionat, Butylpropionat, Isopentylpropionat und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Ethylpropionat und dergleichen.
Als spezifische Beispiele der Acetate können z. B. Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, sec-Butylacetat, Pentylacetat, Isopentylacetat, sec-Hexylacetat, Cyclohexylacetat, Benzylacetat und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, sec-Butylacetat, Pentylacetat, Isopentylacetat, sec-Hexylacetat, Cyclohexylacetat und dergleichen. Noch bevorzugter sind Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat und dergleichen. Am bevorzugtesten ist Ethylacetat.
Als spezifische Beispiele der Formiate können z. B. Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Isopropylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat, sec-Butylformiat, Pentylformiat und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat, Pentylformiat und dergleichen. Am bevorzugtesten ist Ethylformiat.
Die Ether sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und können cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Aber die gesättigten werden im Allgemeinen bevorzugt verwendet. Grundsätzlich werden diejenigen mit 3 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugt 4 bis 12 Kohlenstoffatomen und bevorzugter 4 bis 8 Kohlenstoffatomen verwendet. Als spezifische Beispiele können z. B. Diethylether, Methyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Dihexylether, Ethylvinylether, Butylvinylether, Anisol, Phenetol, Butylphenylether, Methoxytoluol, Dioxan, Furan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Ethylenglycoldimethylether, Ethylenglycoldiethylether, Ethylenglycoldibutylether, Ethylenglycolmonomethylether, Ethylenglycolmonoethylether, Ethylenglycolmonobutylether und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Dihexylether, Anisol, Phenetol, Butylphenylether, Methoxytoluol, Dioxan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Ethylenglycoldimethylether, Ethylenglycoldiethylether, Ethylenglycoldibutylether, Ethylenglycolmonomethylether, Ethylenglycolmonoethylether und dergleichen. Bevorzugter sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Anisol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Ethylenglycolmonomethylether, Ethylenglycolmonoethylether und dergleichen. Noch bevorzugter sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Anisol und dergleichen und am bevorzugtesten ist Methyl-tert-butylether.
Die Alkohole sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen aber können cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Die gesättigten sind jedoch grundsätzlich bevorzugt. Im Allgemeinen werden diejenigen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, bevorzugter 1 bis 12 Kohlenstoffatomen und noch bevorzugter 1 bis 6 Kohlenstoffatomen verwendet. Unter ihnen sind einwertige Alkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, zweiwertige Alkohole mit 2 bis 5 Kohlenstoffatomen und dreiwertige Alkohole mit 3 Kohlenstoffatomen bevorzugt.
Als spezifische Beispiele dieser Alkohole können z. B. einwertige Alkohole, wie Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, tert-Butylalkohol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol, tert-Pentylalkohol, 3-Methyl-2-butanol, Neopentylalkohol, 1-Hexanol, 2-Methyl-1-pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Ethyl-1-butanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 3-Heptanol, 1-Octanol, 2-Octanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 1-Nonanol, 1-Decanol, 1-Undecanol, 1-Dodecanol, Allylalkohol, Propargylalkohol, Benzylalkohol, Cyclohexanol, 1-Methylcyclohexanol, 2-Methylcyclohexanol, 3-Methylcyclohexanol, 4-Methylcyclohexanol und dergleichen genannt werden; zweiwertige Alkohole, wie 1,2-Ethandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol, 1,2-Butandiol, 1,3-Butandiol, 1,4-Butandiol, 2,3-Butandiol, 1,5-Pentandiol und dergleichen; und dreiwertige Alkohole, wie Glycerol und dergleichen.
Als einwertige Alkohole sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, tert-Butylalkohol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol, tert-Pentylalkohol, 3-Methyl-2-butanol, Neopentylalkohol, 1-Hexanol, 2-Methyl-1-pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Ethyl-1-butanol, 1-Heptanol, 2-Heptanol, 3-Heptanol, 1-Octanol, 2-Octanol, 2-Ethyl-1-hexanol, 1-Nonanol, 1-Decanol, 1-Undecanol, 1-Dodecanol, Benzylalkohol, Cyclohexanol, 1-Methylcyclohexanol, 2-Methylcyclohexanol, 3-Methylcyclohexanol, 4-Methylcyclohexanol und dergleichen bevorzugt. Bevorzugter sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, tert-Butylalkohol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol, tert-Pentylalkohol, 3-Methyl-2-butanol, Neopentylalkohol, 1-Hexanol, 2-Methyl-1-pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Ethyl-1-butanol, cyclohexanol und dergleichen. Noch bevorzugter sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, tert-Butylalkohol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol, tert-Pentylalkohol, 3-Methyl-2-butanol, Neopentylalkohol und dergleichen. Besonders bevorzugt sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol und dergleichen. Am bevorzugtesten ist 2-Propanol.
Als zweiwertige Alkohole sind 1,2-Ethandiol, 1,2-Propandiol, 1,3-Propandiol und dergleichen bevorzugt. Am bevorzugtesten ist 1,2-Ethandiol. Als dreiwertiger Alkohol ist Glycerol bevorzugt.
Als Fettsäuren können z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Ameisensäure und Essigsäure und am bevorzugtesten ist Essigsäure.
Die Ketone sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und die mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen werden bevorzugt verwendet. Als spezifische Beispiele können z. B. Aceton, Methylethylketon, Methylbutylketon, Methylisobutylketon und dergleichen genannt werden. Bevorzugt sind Aceton und Methylethylketon und am bevorzugtesten ist Aceton.
Die Nitrile sind keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und können cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Jedoch werden die gesättigten im Allgemeinen bevorzugt verwendet. Allgemein werden diejenigen verwendet, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome, bevorzugt 2 bis 12 Kohlenstoffatome und bevorzugter 2 bis 8 Kohlenstoffatomen haben.
Als spezifische Beispiele können z. B. Acetonitril, Propiononitril, Malononitril, Butyronitril, Isobutyronitril, Succinonitril, Valeronitril, Glutaronitril, Hexannitril, Heptylcyanid, Octylcyanid, Undecannitril, Dodecannitril, Tridecannitril, Pentadecannitril, Stearonitril, Chloracetonitril, Bromacetonitril, Chlorpropionnitril, Brompropionnitril, Methoxyacetonitril, Methylcyanoacetat, Ethylcyanoacetat, Tolunitril, Benzonitril, Chlorbenzonitril, Brombenzonitril, Cyanobenzoesäure, Ntrobenzonitril, Anisonitril, Phthalonitril, Bromtolunitril, Methylcyanobenzoat, Methoxybenzonitril, Acetylbenzonitril, Naphthonitril, Biphenylcarbonitril, Phenylpropiononitril, Phenylbutyronitril, Methylphenylacetonitril, Diphenylacetonitril, Naphthylacetonitril, Nitrophenylacetonitril, Chlorbenzylcyanid, Cyclopropancarbonitril, Cyclohexancarbonitril, Cycloheptancarbonitril,Phenylcyclohexancarbonitril, Tolylcyclohexancarbonitril und dergleichen genannt werden.
Bevorzugt sind Acetonitril, Propionnitril, Succinonitril, Butyronitril, Isobutyronitril, Valeronitril, Methylcyanoacetat, Ethylcyanoacetat, Benzonitril, Tolunitril und Chlorpropiononitril. Bevorzugter sind Acetonitril, Propionnitril, Butyronitril und Isobutyronitril und am bevorzugtesten ist Acetonitril.
Als andere Stickstoffverbindungen als Nitrile können z. B. Amide, wie Formamid, N-Methylformamid, N,N-Dimethylformamid, N,N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon und Nitromethan, Triethylamin, Pyridin und dergleichen genannt werden.
Als Schwefelverbindungen können z. B. Dimethylsulfoxid, Sulfolan und dergleichen genannt werden.
Beim Auswählen der zu verwendenden organischen Lösungsmittel aus den oben genannten organischen Lösungsmitteln werden bevorzugt solche Eigenschaften wie Siedepunkt und Viskosität in Betracht gezogen (z. B. sollte das Lösungsmittel einen Siedepunkt haben, der geeignetes Erwärmen zum Steigern der Löslichkeit erlaubt, und der ein Entfernen des Lösungsmittels von feuchten Massen durch Trocknen und ein Wiedergewinnen des Lösungsmittels aus Kristallisationsfiltraten und dergleichen ermöglicht (ungefähr 30 bis 150°C bei 1 Atm.), einen Schmelzpunkt, so dass ein Festwerden beim Handhaben bei Raumtemperatur sowie beim Kühlen auf Raumtemperatur oder niedriger (nicht niedriger als ungefähr 0°C, bevorzugt nicht niedriger als ungefähr 10°C, bevorzugter nicht niedriger als ungefähr 20°C) kaum auftritt, und eine niedrige Viskosität (nicht höher als ungefähr 10 cp bei 20°C und dergleichen)).
Der der Oxitation von reduziertem Coenzym Q₁₀ vorbeugende Effekt in einem Lösungsmittel scheint in einer hochkonzentrierten Lösung von reduziertem Coenzym Q₁₀ anzusteigen. Das reduzierte Coenzym Q₁₀ weist eine hohe Löslichkeit in den oben genannten organischen Lösungsmitteln mit hohem Oxidationsvorbeugeeffekt auf (z. B. Kohlenwasserstoffe, Fettsäureester und dergleichen). Die hohe Löslichkeit ermöglicht es, die hochkonzentrierte Lösung zu handhaben und den Oxidationsschutz zu fördern. Eine bevorzugte Konzentration des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zum Oxidationsschutz während der Extraktion ist nicht besonders limitiert, ist im Allgemeinen aber nicht weniger als 0,001 Gew.-%, bevorzugt nicht weniger als 0,01 Gew.-% und bevorzugter nicht weniger als 0,1 Gew.-% als Konzentration an reduziertem Coenzym Q₁₀ in dem oben genannten organischen Lösungsmittel. Die Obergrenze ist nicht besonders limitiert, sie beträgt jedoch im Allgemeinen nicht mehr als 10 Gew.-%.
Unter den oben genannten organischen Lösungsmitteln zum Extrahieren und Gewinnen von reduziertem Coenzym Q₁₀ aus feuchten Zellen und trockenen Zellen der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon werden hydrophile organische Lösungsmittel bevorzugt verwendet. Insbesondere können Aceton, Acetonitril, Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol und dergleichen genannt werden.
Darüber hinaus werden von den oben genannten organischen Lösungsmitteln zum Extrahieren und Gewinnen des reduzierten Coenzyms Q₁₀ aus der wässrigen Suspension der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon hydrophobe, organische Lösungsmittel bevorzugt verwendet. Die Verwendung solcher Lösungsmittel unterstützt das Entfernen von wasserlöslichen Substanzen, die von Mikroorganismen abgeleitet sind. Viele hydrophobe organische Lösungsmittel bieten, wie oben beschrieben, einen hohen Oxidationsvorbeugeeffekt und sind somit sehr vorteilhaft.
Als hydrophobe organische Lösungsmittel sind Kohlenwasserstoffe, Fettsäureester und Ether bevorzugt.
Im Falle des oben erwähnten Extraktionsschrittes kommt es aufgrund der Gegenwart der Zellkomponenten, wie Proteine, teilweise zur Bildung von Emulsionen, wenn reduziertes Coenzym Q₁₀ aus der wässrigen Suspension der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon, insbesondere aus der wässrigen Suspension des zerstörten Produktes mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, weiterhin insbesondere für den Fall, dass das zerstörte Produkt physikalisch behandelt wird, und die Phasentrennung wird schwierig. Insofern wird es wichtig, die Entstehung der oben genannten Emulsionen zu unterdrücken und die Extraktion effizient durchzuführen.
Insofern ist es bevorzugt, als Extraktionslösungsmittel zusätzlich zu dem oben erwähnten hydrophoben organischen Lösungsmittel ein hydrophiles organisches Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel in Kombination zu verwenden.
In diesem Fall ist das hydrophobe organische Lösungsmittel keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und die oben erwähnten können verwendet werden. Bevorzugt sind Kohlenwasserstoffe und bevorzugter sind aliphatische Kohlenwasserstoffe. Unter den aliphatischen Kohlenwasserstoffen werden diejenigen mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen bevorzugt verwendet.
Als spezifische Beispiele der aliphatischen Kohlenwasserstoffe mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen können z. B. Pentan, 2-Methylbutan, Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Heptan, Heptanisomere (z. B. 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan), Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Cyclopentan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, Methylcyclohexan, Ethylcyclohexan und dergleichen genannt werden. Besonders bevorzugt sind Hexan, Heptan und Methylcyclohexan und am bevorzugtesten sind Hexan und Heptan.
Das in Kombination mit dem oben erwähnten hydrophoben organischen Lösungsmittel zu verwendende hydrophile organische Lösungsmittel ist keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und die oben genannten können verwendet werden. Bevorzugt sind Alkohole. Unter den Alkoholen werden Alkohole mit einer Hydroxylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bevorzugt verwendet. Als spezifische Beispiele hiervon können z. B. Methanol, Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, Isobutylalkohol, tert-Butylalkohol, 1-Pentanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 2-Methyl-1-butanol, Isopentylalkohol, tert-Pentylalkohol, 3-Methyl-2-butanol, Neopentylalkohol und dergleichen genannt werden.
Besonders bevorzugt sind Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 2-Propanol und am bevorzugtesten ist 2-Propanol.
Die Mengen des oben genannten zu verwendenden hydrophilen organischen Lösungsmittels und des hydrophoben organischen Lösungsmittels sind nicht besonders limitiert. Bezüglich der Konzentration während der Extraktion wird jedoch das hydrophile organische Lösungsmittel bevorzugt in einem Bereich von 5 bis 50 Vol.% verwendet und das hydrophobe organische Lösungsmittel wird in einem Bereich von 25 bis 65 Vol.%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Gesamtlösung verwendet.
Beim Gewinnen des reduzierten Coenzyms Q₁₀ ist die Temperatur während der Extraktion keinen besonderen Einschränkungen unterworfen und sie ist grundsätzlich in einem Bereich von 0 bis 60°C und bevorzugt 20 bis 50°C.
Als Extraktionsverfahren können sowohl eine Batch-Extraktion als auch eine kontinuierliche Extraktion (bevorzugt eine mehrstufige Gegenstromextraktion) verwendet werden. Bezüglich der Produktivität ist jedoch die kontinuierliche Extraktion (bevorzugt die mehrstufige Gegenstromextraktion) bevorzugt. Die Rührdauer während der Batch-Extraktion ist nicht besonders beschränkt, beträgt aber im Allgemeinen nicht weniger als 5 Minuten. Die durchschnittliche Retentionszeit in der kontinuierlichen Extraktion ist nicht besonders limitiert, beträgt aber im Allgemeinen nicht weniger als 10 Minuten.
Beim Gewinnen des reduzierten Coenzyms Q₁₀ ist es bevorzugt, vorsichtig zu sein, so dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ nicht zersetzt wird (z. B. so, dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ nicht zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ oxidiert wird). Dafür wird die oben erwähnte Extraktion (die die Zellzerstörung beinhaltet) bevorzugt unter einer sauren bis leicht basischen Bedingung und bevorzugter unter einer sauren bis neutralen Bedingung durchgeführt. Für den Fall, in dem der pH als Index verwendet wird, beträgt der pH, obwohl dies von der Kontaktzeit abhängt, nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 9, bevorzugter nicht mehr als 8 und noch bevorzugter nicht mehr als 7.
Unter den oben erwähnten Bedingungen kann eine Oxidationsreaktion im Wesentlichen vermieden werden und gegebenenfalls wird die oben erwähnte Zellzerstörung und/oder Extraktion bevorzugt strenger unter derartigen Bedingungen durchgeführt, dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird. Es ist bevorzugt, zumindest die Extraktion unter dieser Bedingung durchzuführen und es ist bevorzugter, die Zerstörung und die Extraktion unter dieser Bedingung durchzuführen.
"Derartige Bedingung, dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird" bedeutet z. B. eine deoxygenierte Atmosphäre (eine Inertgasatmosphäre, wie z. B. Stickstoffgas, Kohlendioxidgas, Heliumgas, Argongas oder Wasserstoffgas, reduzierter Druck, Siedebedingung); einen Zustand hoher Salzkonzentration, z. B. bevorzugt einen Zustand, in dem Salze (z. B. anorganische Salze wie Natriumchlorid und Natriumsulfat) in einer Menge von nicht weniger als ungefähr 5% in einer wässrigen Phase enthalten sind; einen Zustand, in dem eine starke Säure anwesend ist (z. B. eine Säure mit einem pKa-Wert von nicht mehr als 2,5 in einer wässrigen Lösung), z. B. in dem nicht weniger als 0,1 mol% der starken Säure, bezogen auf 1 mol reduziertes Coenzym Q₁₀ anwesend ist; und einen Zustand, in dem ein Antioxidationsmittel anwesend ist, z. B. unter gleichzeitiger Anwesenheit von Ascorbinsäure, Zitronensäure, Salzen und Estern hiervon (z. B. nicht weniger als 0,1 Gew.-% hiervon, bezogen auf das reduzierte Coenzym Q₁₀). Ebenfalls erwähnt werden kann eine Reduktionsbedingung (eine Bedingung, in der oxidiertes Coenzym Q₁₀ in reduziertes Coenzym Q₁₀ überführt werden kann), z. B. eine Bedingung, die den Kontakt mit einem Reduktionsmittel, wie dithionige Säure involviert.
Durch die oben erwähnte Kultivierung (Fermentation) und Extraktion kann reduziertes Coenzym Q₁₀ geeignet hergestellt und gewonnen werden. Bevorzugt wird ein Extrakt erhalten, der mit weniger als 70 mol%, bevorzugt nicht weniger als 75 mol% reduziertes Coenzym Q₁₀ unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthält.
Der so erhaltene Extrakt, der reduziertes Coenzym Q₁₀ enthält, wird gegebenenfalls mittels Säulenchromatographie, einer Reduktionsbehandlung oder dergleichen gereinigt und dann einer Kristallisation unterworfen, um hochreine Kristalle von reduziertem Coenzym Q₁₀ zu erhalten. Im übrigen wird auch in diesem Fall die Serie der Behandlungsschritte bevorzugt unter den oben erwähnten "derartigen Bedingung durchgeführt, dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird".
In der vorliegenden Erfindung kann oxidiertes Coenzym Q₁₀ durch Oxidieren der oben genannten mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon und anschließendem Extrahieren des oxidierten Coenzyms Q₁₀ mit einem organischen Lösungsmittel oder Extrahieren des reduzierten Coenzyms Q₁₀ aus den mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon durch ein organisches Lösungsmittel, gegebenenfalls Reinigen und Oxidieren des Resultierenden zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ hergestellt werden.
Die oben erwähnte Oxidation kann z. B. durch Mischen des reduzierten Coenzyms Q₁₀ (bevorzugt eine wässrige Suspension der mikrobiellen Zellen oder des zerstörten Produktes hiervon, welche reduziertes Coenzym Q₁₀ enthält, ein Extrakt, enthaltend reduziertes Coenzym Q₁₀ oder dergleichen) mit einem Oxidationsmittel (z. B. Mangandioxid oder dergleichen) und dann z. B. Oxidieren der Mischung bei Raumtemperatur (z. B. 30°C) für nicht weniger als 30 Minuten durchgeführt werden. In dem Fall, in dem die mikrobiellen Zellen oder das zerstörte Produkt hiervon oxidiert werden, kann der Extraktionsschritt des oxidierten Coenzyms Q₁₀ auf die gleiche Art durchgeführt werden, wie der oben erwähnte Extraktionsschritt des reduzierten Coenzyms Q₁₀. Dadurch kann oxidiertes Coenzym Q₁₀ effizient gewonnen werden. Im übrigen ist es nicht nötig, die Gewinnung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ unter einer "derartigen Bedingung, dass das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird" durchzuführen, was für die Gewinnung von reduziertem Coenzym Q₁₀ empfohlen wird, und die Gewinnung kann unter Berücksichtigung eines allgemeinen sicheren Betriebs und dergleichen durchgeführt werden. Das so erhaltene oxidierte Coenzym Q₁₀ kann gegebenenfalls mittels Säulenchromatographie oder dergleichen gereinigt werden und anschließend können hochreine Kristalle von oxidiertem Coenzyme Q₁₀ durch einen Kristallisationsschritt erhalten werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein schematisches Diagramm einer kontinuierlichen 3-Stufen-Gegenstrom-Extraktionsvorrichtung, die in Beispiel 8 verwendet wird.
Beste Art zum Ausführen der Erfindung
Die folgenden Beispiele illustrieren die vorliegende Erfindung detaillierter. Diese Beispiele sind jedoch keinesfalls limitierend bezüglich des Umfangs der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1
Verschiedene, in den folgenden Tabellen 1 bis 3 gezeigte Coenzym Q₁₀ herstellende Mikroorganismen wurden unter Schütteln (Amplitude: 2 cm, 310 Pendelbewegungen/min) bei 25°C für 72 Stunden in 10 ml eines Kulturmediums [(Glucose: 20 g, Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g)/l, pH: 6,0] unter Verwendung eines Teströhrchens (innerer Durchmesser: 21 mm, Gesamtlänge: 200 mm) kultiviert und die erhaltene Brühe wurde gegebenenfalls konzentriert. Die erhaltenen Lösungen wurden für 3 Minuten unter Verwendung von 10 Vol.Teilen Glasperlen (425 bis 600 μm) unter einer Stickstoffatmosphäre unter gleichzeitiger Anwesenheit von 3 Vol.Teilen Isopropanol und 18,5 Vol.Teilen n-Hexan, bezogen auf 10 Vol.Teile der Brühe stark geschüttelt, um die Zellzerstörung und Extraktion durchzuführen. Die erhaltenen Hexanphasen wurden unter vermindertem Druck verdampft (bei 40°C) und mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) analysiert, um das Verhältnis und die Herstellungsmenge von reduziertem Coenzym Q₁₀ zu bestimmen. HPLC-Bedingungen

Säule: YMC-Pack 4,6 × 250 mm (hergestellt

von YMC. Co., Ltd.)

Mobile Phase: Methanol/n-Hexan = 85/15

Flussrate: 1 ml/min,

Detektion: UV 275 nm,

Die Ergebnisse sind in Tabellen 1 bis 3 gezeigt. Das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ bedeutet einen Molprozentwert des Verhältnisses von reduziertem Coenzym Q₁₀, bezogen auf die Summe von oxidiertem Coenzym Q₁₀ und reduziertem Coenzym Q₁₀ auf Grundlage der Flächen der Peaks von reduziertem Coenzym Q₁₀ und oxidiertem Coenzym Q₁₀ und des Verhältnisses der molaren Absorptionskoeffizienten hiervon (1:7,5). Tabelle 1

Stammkultur	Oberer Wert: Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ (%) Unterer Wert: Produktionsmenge des reduzierten Coenzyms Q₁₀ (μg/ml)
Agrobacterium tumefacience IFO13263	82 7
Agrobacterium radiobacter ATCC4718	78 7
Aspergillus clavatus JCM1718	83 2
Acetobacter xylinum IFO15237	77 2
Aminobacter aganouensis JCM7854	70 3
Agromonas oligotrophica JCM1494	75 2
Acidiphilium multivorum JCM8867	73 3
Bulleromyces albus IFO1192	72 2
Bullera armeniaca IFO10112	85 7
Brevundimonas diminuta JCM2788	82 5
Cryptococcus laurentii IFO0609	79 6
Chionosphaera apobasidialis CBS7430	71 2
Candida curvata ATCC10567	74 3
Cerinosterus luteoalbus JCM2923	79 5
Exisophiala alcalophila JCM12519	77 3
Exobasidium gracile IFO7788	79 2
Fellomyces fuzhouensis IFO10374	70 2
Filobasidiella neoformans CBS132	88 2
Filobasidium capsuloigenum CBS1906	82 3
Geotrichum capitatum JCM6258	77 3
Graphiola cylindricä IFO6426	75 4
Gluconobacter suboxydans IFO3257	86 6
Kockovaella imperatae JCM7826	78 2

Tabelle 2

Stammkultur	Oberer Wert: Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ (%) Unterer Wert: Produktionsmenge des reduzierten Coenzyms Q₁₀ (μg/ml)
Kurtzmanomyces nectairei IFO10118	79 2
Lalaria cerasi CBS275.28	75 2
Leucosporidium scottii IFO1212	88 6
Legionella anisa JCM7573	73 3
Methylobacterium extorguens JCM2802	72 2
Mycoplana ramosa JCM7822	80 2
Oosporidium margaritiferum CBS2531	76 2
Pseudomonas denitrificans IAM12023	85 8
Pseudomonas shuylkilliensis IAM1092	84 6
Psedozyma aphidis CBS517.23	79 5
Paracoccus denitrificans JCM6892	83 5
Petromyces alliaceus IFO7538	72 2
Rhodotorula glutinis IFO1125	79 7
Rhodotorula minuta IFO0387	74 8
Rhodosporidium diobovatum ATCC1830	86 4
Rhizomonas suberifaciens IFO15212	82 2
Rhodobium orients JCM9337	80 2
Rhodoplanes elegans JCM9224	74 2
Rhodopseudomonas palustris JCM2524	90 6
Rhodobacter capsulatus SB1003	95 6
Sporobolomyces holsaticus IFO1034	72 9
Sporobolomyces pararoseus IFO0471	93 8
Sporidiobolus johnsonii IFO1840	73 7
Saitoella complicata IFO10748	97 9

Tabelle 3

Stammkultur	Oberer Wert: Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ (%) Unterer Wert: Produktionsmenge des reduzierten Coenzyms Q₁₀ (μg/ml)
Schizosaccharomyces pombe IFO0347	90 8
Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100	78 7
Sporotrichum cellulophilium ATCC20493	73 6
Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318	80 6
Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121	72 2
Sphingomonas adhesiva JCM7370	80 3
Tapharina caerulescens CBS351.35	81 2
Tremella mesenterica ATCC24438	89 3
Trichosporon cutaneum IFO1198	95 8
Tilletiaria anomala CBS436.72	75 4
Tilletia caries JCM1761	80 3
Tolyposporium bullatum JCM2006	73 4
Tilletiopsis washintonesis CBS544	76 2
Ustilago esculenta IFO9887	78 2
Udeniomyces megalosporus JCM5269	87 2
Xanthophyllomyces dendrorhous IFO10129	84 2
Xanthobacter flavus JCM1204	80 2
Paecilomyces lilacinus ATCC10114	80 5
Acremonium chrysogenum ATCC11550	75 5
Hyphomonas hirschiana ATCC33886	72 3
Rhizobium meliloti ATCC9930	85 10

Beispiel 2
Rhodotorula glutinis IFO1125 wurde bei 25°C für 48 Stunden in einem Kulturmedium (Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g, Glucose: 20 g/l, pH: 6,0) aerobisch kultiviert. Die Zellen wurden nach der Kultivierung mittels Zentrifugation gewonnen und in einer Phosphorsäurepufferlösung, zu der N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin zugefügt wurde, so dass die Konzentration hiervon 200 μg/ml betrug, bei pH 7 suspendiert. Nachdem die Lösung 1 Stunde bei 25°C aufbewahrt wurde, wurden die Zellen 5-mal mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend in einer 0,9%igen Natriumchloridlösung suspendiert. Die erhaltene Zellsuspension wurde richtig verdünnt und eine Kolonie wurde auf einer Agarplatte des oben erwähnten Kulturmediums gebildet. Die Herstellungsmenge und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ in der isolierten Stammmutante wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Stämme mit höherer Produktionsmenge und höherem Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ als die Wildstämme wurden weiter wiederholt mutiert. Im Ergebnis wurden durch 10-faches Wiederholen der Mutagenese Mutantenstämme mit einer Produktivität von nicht weniger als 15 μg/ml erhalten. In diesem Fall betrug das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ nicht weniger als 80 mol%.
Beispiel 3
Saitoella complicata IFO10748 wurde bei 25°C für 72 Stunden in 10 l eines Kulturmediums (Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g, Glucose: 20 g/l, pH: 6,0) aerob kultiviert. Die erhaltenen Zellen wurden 2-mal bei 80 MPa Zerstörungsdruck mit einem mit Stickstoffgas versiegelten Druckhomogenisierer (hergestellt von Lanni Co.) zerstört, um eine Lösung der zerstörten Zellen zu erhalten. Die Lösung mit zerstörten Zellen wurde mit 30 Vol.Teilen Isopropanol und 40 Vol.Teilen Hexan 3-mal extrahiert, um einen Extrakt zu erhalten. Das Extraktionsverhältnis betrug 99 Das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ betrug 97 mol%.
Beispiel 4
Während Mutantenstämme von Rhodotorula glutinis IFO1125 aerobisch bei 25°C in 10 l eines Kulturmediums (Pepton: 10 g, Hefeextrakt: 5 g, Malzextrakt: 3 g, Glucose: 20 g/l, pH: 6,0) kultiviert wurden, wurde Glucose mit einer Geschwindigkeit von 4 g/h zugefüttert, nachdem 48 Stunden bis 96 Stunden verstrichen waren (Menge an zugeführter Glucose: 190 g). Die Produktionsmenge von reduziertem Coenzym Q₁₀ pro Kulturmedium betrug nicht weniger als 20 μg/ml und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ betrug nicht weniger als 80 mol%.
Beispiel 5
Der im Beispiel 3 erhaltene Extrakt wurde einer Lösungsmittelsubstitution mit einer Hexanlösung unterworfen, das Resultierende wurde in einer mit Silicagel gefüllten Säule adsorbiert und einer Entwicklung und Elution durch eine Lösung von n-Hexan/Diethylether (9/1) unterzogen, um eine Fraktion zu erhalten, die reduziertes Coenzym Q₁₀ enthält. Des Weiteren wurde die Fraktion auf 2°C unter Rühren gekühlt, um einen weißen Schlamm zu erhalten. Alle oben genannten Schritte wurden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Der erhaltene Schlamm wurde unter reduziertem Druck filtriert, die resultierenden feuchten Kristalle wurden mit der gleichen, wie der oben verwendeten Entwicklungslösung gewaschen (die Temperatur des zum Waschen verwendeten Lösungsmittels betrug 2°C) und die feuchten Kristalle wurden unter reduziertem Druck (20 bis 40°C, 1 bis 30 mmHg) getrocknet, um 81 mg weißer trockener Kristalle zu erhalten. Die Reinheit der erhaltenen Kristalle betrug 99,9% und das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ betrug 90 mol%.
Beispiel 6
Der in Beispiel 3 erhaltene Extrakt wurde einer Lösungsmittelsubstitution mit n-Hexan unterworfen, dem Resultierenden wurden 50 mg Mangandioxid zugegeben und die Mischung wurde bei 30°C für 30 Minuten gerührt. Die so erhaltene Reaktionslösung wurde fraktioniert und auf die gleiche Art wie in Beispiel 5 gereinigt, um 74 mg hochreines oxidiertes Coenzym Q₁₀ zu erhalten.
Beispiel 7
Saitoella complicata IFO10748 wurde aerobisch bei 25°C für 72 Stunden in 500 ml eines Kulturmediums (Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g, Glucose: 20 g/l, pH: 6,0) kultiviert. Die erhaltenen Zellen wurden 2-mal bei 80 MPa Zerstörungsdruck mit einem mit Stickstoffgas versiegelten Druckhomogenisierer (hergestellt von Lanni Co.) zerstört, um eine Lösung mit zerstörten Zellen zu erhalten. Das Verhältnis von reduziertem Coenzym Q₁₀ in der Lösung mit zerstörten Zellen betrug 97%, bezogen auf die gesamten Coenzyme Q₁₀, was oxidiertes Coenzym Q₁₀ beinhaltet. 200 ml der Lösung mit zerstörten Zellen wurden mit Isopropanol und n-Hexan in den im ersten Extraktionsabschnitt in der folgenden Tabelle 4 gezeigten Verhältnissen gemischt, um die gesamte Lösungsmittelmenge auf 500 ml einzustellen, und die Mischungen wurden bei 40°C für 30 Minuten gerührt, um die erste Extraktion durchzuführen. Nach Vervollständigung der Extraktion wurden die Resultierenden für 10 Minuten stehen gelassen und die getrennten oberen Schichten wurden gesammelt. Die Volumenverhältnisse der unteren Schichten (Rückstände), bezogen auf die Gesamtlösungsmengen, wurden als Indizes der Trennbarkeit definiert und sind als Grenzflächen(Interface)-Positionen in Tabelle 4 gezeigt.
Um die zweite Extraktion durchzuführen, wurden zusätzlich die Lösungsmittelkonzentrationen der verbliebenen Schichten gemessen und Isopropanol und Hexan wurden weiter zugegeben, um die Lösungsmittelverhältnisse in den gesamten Lösungen derart zu halten, dass sie die in dem zweiten Extraktionsabschnitt in Tabelle 4 gezeigten Verhältnisse sind. Die resultierenden Lösungen wurden bei 40°C für 30 Minuten gerührt. Anschließend wurden die Lösungen für 10 Minuten stehen gelassen und die oberen Schichten wurden auf die gleiche Art, wie oben beschrieben, gesammelt, um die Lösungsmittelkonzentrationen der verbliebenen Schichten zu bestimmen. Isopropanol und Hexan wurden zugegeben, um die Lösungsmittelverhältnisse in den gesamten Lösungen derart zu halten, dass sie die im dritten Extraktionsabschnitt in Tabelle 4 gezeigten Verhältnisse sind, und die Lösungen wurden bei 25°C für 30 Minuten gerührt, um die dritte Extraktion durchzuführen.

Die Verhältnisse der Mengen des in den gesammelten oberen Schichten jedes der ersten, zweiten und dritten Schritte enthaltenen reduzierten Coenzyms Q₁₀, bezogen auf die Menge des in der Lösung von zerstörten Zellen oder dem Extraktionsrückstand vor der Extraktion erhaltenen reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurden als Extraktionsverhältnisse von reduziertem Coenzym Q₁₀ in den jeweiligen Schritten defineirt. Die Berechnungsergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die integrierten Extraktionsverhältnisse von reduziertem Coenzym Q₁₀ in den zweiten und dritten Extraktionsschritten sind ebenfalls gezeigt. In jedem Schritt war die statische Trennbarkeit exzellent und das integrierte Extraktionsverhältnis betrug in dem Fall, in dem die Extraktion dreimal wiederholt wurde, nicht weniger als 90%, so dass ein hohes Gewinnungsverhältnis gezeigt wurde. Insbesondere in dem Fall, in dem die Isopropanolkonzentration auf nicht weniger als 30% eingestellt wurde, betrug das Gewinnungsverhältnis nicht weniger als 99%. Tabelle 4

		Lösungsmittelverhältnis (Vol.%)		Grenzflächenposition	Extraktionsverhältnis (%)
		Isopropanol	Hexan	Grenzflächenposition	Jeweiliges Extraktionsverhältnis	Integriertes Extraktionsverhältnis
Fall 1	Erste Zweite Dritte	18,8 19,0 29,7	52,7 52,4 41,7	0,492 0,624 0,645	73,6 47,6 55,5	73,6 86,2 93,8
Fall 2	Erste Zweite Dritte	31,3 37,7 40,6	40,2 33,7 30,9	0,499 0,549 0,565	90,7 83,7 40,1	90,7 98,5 99,1
Fall 3	Erste Zweite Dritte	31,3 34,1 36,8	40,2 37,3 34,6	0,526 0,553 0,555	89,0 85,8 46,6	89,0 98,3 99,1
Fall 4	Erste Zweite Dritte	31,3 34,1 42,4	40,2 37,3 29,0	0,526 0,553 0,644	89,0 85,8 50,0	89,0 98,3 99,0
Fall 5	Erste Zweite Dritte	31,3 40,1 40,7	40,2 31,4 30,7	0,526 0,595 0,593	89,0 88,1 45,3	89,0 98,6 99,1
Fall 6	Erste Zweite Dritte	31,3 40,1 45,8	40,2 31,4 25,7	0,526 0,595 0,663	89,0 88,1 40,7	89,0 98,6 99,0

Beispiel 8
Saitoella complicata IFO10748 wurde bei 25°C für 72 Stunden in 750 l eines Kulturmediums (Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g, Glucose: 20 g/l, pH: 6,0) aerob kultiviert. Die erhaltenen Zellen wurden 2-mal bei 140 MPa Zerstörungsdruck mit einem mit Stickstoffgas versiegelten Druckhomogenisierer (hergestellt von Lanni Co.) zerstört, um eine Lösung mit zerstörten Zellen zu erhalten. Die Lösung mit zerstörten Zellen wurde einer kontinuierlichen Extraktion mit einem in 1 gezeigten kontinuierlichen 3-Stufen-Gegenstrom-Extraktionsapparat unterzogen. Die Kapazität des Rührtanks betrug 630 l und die Kapazität des statischen Trenntanks betrug 200 l. Die Lösung mit zerstörten Zellen wurde in den ersten Rührtank überführt und Isopropanol und n-Hexan wurden den jeweiligen Schritten zugeführt. Die Zuführmenge der Lösung mit zerstörten Zellen betrug 2 l/min und die Zuführmengen von Isopropanol und n-Hexan wurden auf 1,3 l/min für Isopropanol und 3,7 l/min für n-Hexan als Gesamtmenge der Zuführmengen in den jeweiligen Schritten eingestellt. In diesem Fall wurde die Lösungsmittelkonzentration in den jeweiligen Schritten richtig eingestellt, so dass die Isopropanol-Konzentration von 5 bis 50 V/V% und die n-Hexan-Konzentration von 25 bis 65 V/V% gehalten wurde. Die Extraktionstemperatur betrug 40°C und die Behandlungsdauer betrug 6 Stunden. Nachdem 6 Stunden vergangen waren, wurde das Gewinnungsverhältnis von aus der Lösung mit zerstörten Zellen extrahiertem reduziertem Coenzym Q₁₀ auf der Grundlage des in dem Extraktionsrückstand in dem statischen Trenntank im dritten Schritt verbliebenen reduzierten Coemzym Q₁₀ berechnet, um ein Gewinnungsverhältnis von 98,9% zu ermitteln. Die statische Trennung wurde während der gesamten Betriebsdauer gut durchgeführt und eine stabile kontinuierliche Extraktion war möglich.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung kann reduziertes Coenzym Q₁₀ günstig in industriellem Maßstab mit verhältnismäßig einfachen Schritten, umfassend das Kultivieren von Mikroorganismen und das Gewinnen von reduziertem Coenzym Q₁₀, hergestellt werden. Darüber hinaus kann oxidiertes Coenzym Q₁₀ ebenfalls in einfachen Verfahren hergestellt werden.

Claims

Verfahren zum Herstellen des reduzierten Coenzyms Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (I):
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: (a) die Kultivierung von Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle und einen Mikronährstoff enthält, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, (b) gegebenenfalls das Zerstören der mikrobiellen Zellen und (c) das Extrahieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ mit einem organischen Lösungsmittel unter der Bedingung, daß das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird, um so einen Extrakt zu erhalten, der nicht weniger als 70 mol% reduziertes Coenzym Q₁₀ unter dem gesamten Coenzym Q₁₀ enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Herstellungsmenge des reduzierten Coenzyms Q₁₀ nach Beendigung der Kultivierung nicht weniger als 1 μg/ml ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das Kultivieren bei 15 bis 45°C und einem pH von 4 bis 9 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Kultur derart kontrolliert wird, daß im wesentlichen keine negativen Effekte bezüglich der Produktivität des reduzierten Coenzyms Q₁₀ verursacht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 4, worin das Kultivieren durch ein Fed-batch-Kultivierverfahren durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Kohlenstoffquelle dem Kulturmedium getrennt von anderen Komponenten zugeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Kultivieren aerob durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die mikrobiellen Zellen in der Extraktion zerstört werden.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Zellzerstörung durch physikalische Behandlung, chemische Behandlung, enzymatische Behandlung, Wärmebehandlung, Autolyse, Osmolyse oder Plasmoptyse durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Zellzerstörung durch physikalische Behandlung, Säurebehandlung mit einer starken Säure oder Wärmebehandlung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin die Zellzerstörung durch physikalische Behandlung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, worin die physikalische Behandlung mittels Hochdruckhomogenisierer, Ultraschallhomogenisierer, French-Press oder Kugelmühle durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, worin die Zellzerstörung unter saurer bis schwach basischer Bedingung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, worin als das für die Extraktion des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zu verwendende organische Lösungsmittel wenigstens eine Spezies von Kohlenwasserstoffen, Fettsäureestern, Ethern und Nitrilen verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, worin die Extraktion der reduzierten Coenzyme Q₁₀ aus feuchten Zellen oder trockenen Zellen der mikrobiellen Zellen oder einem zerstörten Produkt hiervon unter Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15, worin das hydrophile organische Lösungsmittel Aceton, Acetonitril, Methanol, Ethanol, 1-Propanol oder 2-Propanol ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Extraktion der reduzierten Coenzyme Q₁₀ aus einer wäßrigen Suspension der mikrobiellen Zellen oder einem zerstörten Produkt hiervon unter Verwendung eines hydrophoben organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein Kohlenwasserstoff, ein Fettsäureester oder ein Ether ist.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, worin das hydrophile organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel in Kombination mit dem hydrophoben organischen Lösungsmittel verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein Kohlenwasserstoff und das hydrophile organische Lösungsmittel ein Alkohol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein aliphatischer Kohlenwasserstoff und das hydrophile organische Lösungsmittel ein einwertiger Alkohol ist, der 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel wenigstens eine Spezies von Hexan und Heptan ist und das hydrophile organische Lösungsmittel wenigstens eine Spezies von Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 2-Propanol ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, worin die Extraktion unter einer derartigen Bedingung durchgeführt wird, daß das hydrophobe organische Lösungsmittel zu 25 bis 65 Vol.% und das hydrophile organische Lösungsmittel zu 5 bis 50 Vol.% enthalten ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17 bis 23, worin die Extraktion als kontinuierliche Extraktion durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 24, worin die Extraktion unter saurer bis schwach basischer Bedingung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 25, worin die Bedingung, daß das reduzierte Coenzym Q₁₀ vor einer Oxidationsreaktion geschützt wird, eine deoxygenierte Atmosphäre, eine Bedingung hoher Salzkonzentration, die Bedingung einer Gegenwart einer starken Säure, die Bedingung einer Gegenwart eines Antioxidans oder eine Bedingung ist, in der oxidiertes Coenzym Q₁₀ in reduziertes Coenzym Q₁₀ überführt werden kann.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26, worin das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten ist, wobei in dem Fall, daß die Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, unter Schütteln (Amplitude: 2 cm, 310 Pendelbewegungen/min) bei 25°C für 72 Stunden in 10 ml eines Kulturmediums [(Glucose: 20 g, Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g)/l, pH: 6,0] unter Verwendung eines Teströhrchens (innerer Durchmesser: 21 mm, Gesamtlänge: 200 mm) kultiviert werden, die erhaltene Brühe gegebenenfalls konzentriert wird, die erhaltene Lösung für 3 Minuten unter Verwendung von 10 Vol.Teilen Glasperlen (425 bis 600 μm) stark geschüttelt wird, um die Mikroorganismen unter einer Stickstoffatmosphäre in gleichzeitiger Anwesenheit von 3 Vol.Teilen Isopropanol und 18,5 Vol.Teilen n-Hexan, bezogen auf 10 Vol.Teile der Brühe, zu zerstören, und die hergestellte hydrophobe organische Lösungsmittelphase (n-Hexan-Phase) mittels HPLC analysiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 27, worin die Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, eine Produktivität von nicht weniger als 1 μg/ml reduziertes Coenzym Q₁₀ pro Einheit Kulturmedium aufweisen, wenn mittels HPLC gemäß der Bedingung von Anspruch 27 gemessen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 28, worin die Mikroorganismen Mikroorganismen der Gattung Agrobacterium, der Gattung Aspergillus, der Gattung Acetobacter, der Gattung Aminobacter, der Gattung Agromonas, der Gattung Acidiphilium, der Gattung Bulleromyces, der Gattung Bullera, der Gattung Brevundimonas, der Gattung Cryptococcus, der Gattung Chionosphaera, der Gattung Candida, der Gattung Cerinosterus, der Gattung Exisophiala, der Gattung Exobasidium, der Gattung Fellomyces, der Gattung Filobasidiella, der Gattung Filobasidium, der Gattung Geotrichum, der Gattung Graphiola, der Gattung Gluconobacter, der Gattung Kockovaella, der Gattung Kurtzmanomyces, der Gattung Lalaria, der Gattung Leucosporidium, der Gattung Legionella, der Gattung Methylobacterium, der Gattung Mycoplana, der Gattung Oosporidium, der Gattung Pseudomonas, der Gattung Psedozyma, der Gattung Paracoccus, der Gattung Petromyces, der Gattung Rhodotorula, der Gattung Rhodosporidium, der Gattung Rhizomonas, der Gattung Rhodobium, der Gattung Rhodoplanes, der Gattung Rhodopseudomonas, der Gattung Rhodobacter, der Gattung Sporobolomyces, der Gattung Sporidiobolus, der Gattung Saitoella, der Gattung Schizosaccharomyces, der Gattung Sphingomonas, der Gattung Sporotrichum, der Gattung Sympodiomycopsis, der Gattung Sterigmatosporidium, der Gattung Tapharina, der Gattung Tremella, der Gattung Trichosporon, der Gattung Tilletiaria, der Gattung Tilletia, der Gattung Tolyposporium, der Gattung Tilletiopsis, der Gattung Ustilago, der Gattung Udeniomyces, der Gattung Xanthophyllomyces, der Gattung Xanthobacter, der Gattung Paecilomyces, der Gattung Acremonium, der Gattung Hyhomonus oder der Gattung Rhizobium sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, worin das erhaltene reduzierte Coenzym Q₁₀ gegebenenfalls gereinigt und kristallisiert wird, um einen reduzierten Coenzym Q₁₀-Kristall zu erhalten.
Verfahren zum Herstellen des oxidierten Coenzyms Q₁₀, dargestellt durch die folgende Formel (II):
wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: die Kultivierung von Mikroorganismen, die reduziertes Coenzym Q₁₀ herstellen, in einem Kulturmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle und einen Mikronährstoff enthält, um mikrobielle Zellen zu erhalten, die reduziertes Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten, gegebenenfalls das Zerstören der mikrobiellen Zellen und entweder das Oxidieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ unter Verwendung eines Oxidationsmittels und anschließendes Extrahieren des Resultierenden mit einem organischen Lösungsmittel oder das Extrahieren des so hergestellten reduzierten Coenzyms Q₁₀ mit einem organischen Lösungsmittel, gegebenenfalls Reinigen, und Oxidieren des Resultierenden zu oxidiertem Coenzym Q₁₀ unter Verwendung eines Oxidationsmittels.
Verfahren gemäß Anspruch 31, worin die Herstellungsmenge des reduzierten Coenzyms Q₁₀ nach Beendigung der Kultivierung nicht weniger als 1 μg/ml ist.
Verfahren gemäß Anspruch 31 oder 32, worin das Kultivieren bei 15 bis 45°C und einem pH von 4 bis 9 durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 33, worin die Konzentration der Kohlenstoffquelle in der Kultur derart kontrolliert wird, daß im wesentlichen keine negativen Effekte bezüglich der Produktivität des reduzierten Coenzyms Q₁₀ verursacht werden.
Verfahren gemäß Anspruch 34, worin das Kultivieren durch ein Fed-batch-Kultivierverfahren durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 35, worin die Kohlenstoffquelle dem Kulturmedium getrennt von anderen Komponenten zugeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 36, worin das Kultivieren aerob durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 37, worin die mikrobiellen Zellen in der Extraktion zerstört werden.
Verfahren gemäß Anspruch 38, worin die Zellzerstörung durch eine physikalische Behandlung, chemische Behandlung, enzymatische Behandlung, Wärmebehandlung, Autolyse, Osmolyse oder Plasmoptyse durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 39, worin die Zellzerstörung durch physikalische Behandlung durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 40, worin die physikalische Behandlung mittels Hochdruckhomogenisierer, einem Ultraschallhomogenisierer, French-Press oder einer Kugelmühle durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 41, worin die Extraktion der Coenzyme Q₁₀ aus feuchten Zellen oder trockenen Zellen der mikrobiellen Zellen oder einem zerstörten Produkt hiervon unter Verwendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 42, worin das hydrophile organische Lösungsmittel Aceton, Acetonitril, Methanol, Ethanol, 1-Propanol oder 2-Propanol ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 41, worin die Extraktion der Coenzyme Q₁₀ aus einer wäßrigen Suspension der mikrobiellen Zellen oder dem zerstörten Produkt hiervon unter Verwendung eines hydrophoben organischen Lösungsmittels durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 44, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein Kohlenwasserstoff, ein Fettsäureester oder ein Ether ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 45, worin das hydrophile organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel in Kombination mit dem hydrophoben organischen Lösungsmittel verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 46, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein Kohlenwasserstoff und das hydrophile organische Lösungsmittel ein Alkohol ist.
Verfahren gemäß Anspruch 46, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel ein aliphatischer Kohlenwasserstoff und das hydrophile organische Lösungsmittel ein einwertiger Alkohol ist, der 1 bis 5 Kohlenstoffatome enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 46, worin das hydrophobe organische Lösungsmittel wenigstens eine Spezies von Hexan und Heptan ist und das hydrophile organische Lösungsmittel wenigstens eine Spezies von Methanol, Ethanol, 1-Propanol und 2-Propanol ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 46 bis 49, worin die Extraktion unter der Bedingung durchgeführt wird, daß das hydrophobe organische Lösungsmittel zu 25 bis 65 Vol.% und das hydrophile organische Lösungsmittel zu 5 bis 50 Vol.% enthalten ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 44 bis 50, worin die Extraktion als kontinuierliche Extraktion durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 51, worin das reduzierte Coenzym Q₁₀ in einem Verhältnis von nicht weniger als 70 mol% unter den gesamten Coenzymen Q₁₀ enthalten ist, wobei in dem Fall, daß die Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, unter Schütteln (Amplitude: 2 cm, 310 Pendelbewegungen/min) bei 25°C für 72 Stunden in 10 ml eines Kulturmediums [(Glucose: 20 g, Pepton: 5 g, Hefeextrakt: 3 g, Malzextrakt: 3 g)/l, pH: 6,0] unter Verwendung eines Teströhrchens (innerer Durchmesser: 21 mm, Gesamtlänge: 200 mm) kultiviert werden, die erhaltene Brühe gegebenenfalls konzentriert wird, die erhaltene Lösung für 3 Minuten unter Verwendung von 10 Vol.Teilen Glasperlen (425 bis 600 μm) stark geschüttelt wird, um die Mikroorganismen unter einer Stickstoffatmosphäre in gleichzeitiger Anwesenheit von 3 Vol.Teilen Isopropanol und 18,5 Vol.Teilen n-Hexan, bezogen auf 10 Vol.Teile der Brühe, zu zerstören, und die hergestellte hydrophobe organische Lösungsmittelphase (n-Hexan-Phase) mittels HPLC analysiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 52, worin die Mikroorganismen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ herstellen, eine Produktivität von nicht weniger als 1 μg/ml reduziertes Coenzym Q₁₀ pro Einheit Kulturmedium aufweisen, wenn mittels HPLC gemäß der Bedingung von Anspruch 52 gemessen wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 53, worin die Mikroorganismen Mikroorganismen der Gattung Agrobacterium, der Gattung Aspergillus, der Gattung Acetobacter, der Gattung Aminobacter, der Gattung Agromonas, der Gattung Acidiphilium, der Gattung Bulleromyces, der Gattung Bullera, der Gattung Brevundimonas, der Gattung Cryptococcus, der Gattung Chionosphaera, der Gattung Candida, der Gattung Cerinosterus, der Gattung Exisophiala, der Gattung Exobasidium, der Gattung Fellomyces, der Gattung Filobasidiella, der Gattung Filobasidium, der Gattung Geotrichum, der Gattung Graphiola, der Gattung Gluconobacter, der Gattung Kockovaella, der Gattung Kurtzmanomyces, der Gattung Lalaria, der Gattung Leucosporidium, der Gattung Legionella, der Gattung Methylobacterium, der Gattung Mycoplana, der Gattung Oosporidium, der Gattung Pseudomonas, der Gattung Psedozyma, der Gattung Paracoccus, der Gattung Petromyces, der Gattung Rhodotorula, der Gattung Rhodosporidium, der Gattung Rhizomonas, der Gattung Rhodobium, der Gattung Rhodoplanes, der Gattung Rhodopseudomonas, der Gattung Rhodobacter, der Gattung Sporobolomyces, der Gattung Sporidiobolus, der Gattung Saitoella, der Gattung Schizosaccharomyces, der Gattung Sphingomonas, der Gattung Sporotrichum, der Gattung Sympodiomycopsis, der Gattung Sterigmatosporidium, der Gattung Tapharina, der Gattung Tremella, der Gattung Trichosporon, der Gattung Tilletiaria, der Gattung Tilletia, der Gattung Tolyposporium, der Gattung Tilletiopsis, der Gattung Ustilago, der Gattung Udeniomyces, der Gattung Xanthophyllomyces, der Gattung Xanthobacter, der Gattung Paecilomyces, der Gattung Acremonium, der Gattung Hyhomonus oder der Gattung Rhizobium sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 bis 54, worin das erhaltene oxidierte Coenzym Q₁₀ gegebenenfalls gereinigt und kristallisiert wird, um einen oxidierten Coenzym Q₁₀-Kristall zu erhalten.