WO2003056024A1 - Procedes de production de la co-enzyme q10 - Google Patents

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WO2003056024A1
WO2003056024A1 PCT/JP2002/013766 JP0213766W WO03056024A1 WO 2003056024 A1 WO2003056024 A1 WO 2003056024A1 JP 0213766 W JP0213766 W JP 0213766W WO 03056024 A1 WO03056024 A1 WO 03056024A1
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organic solvent
reduced coenzyme
coenzyme
production method
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Kazuyoshi Yajima
Takahisa Kato
Akihisa Kanda
Shiro Kitamura
Yasuyoshi Ueda
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Kaneka Corporation
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the present invention provides a compound represented by the following formula (I):
  • a reduced coenzyme Q 10 represented by the following formula (II) In the manufacturing method of the oxidized coenzyme Q 1 0 about it represented.
  • reduced coenzyme Q is prepared by culturing reduced coenzyme QaQ- producing microorganisms. 70 mol of the total capsidase Q i 0. A microbial cell containing at a ratio of / 0 or more is obtained, and the microbial cell is crushed if necessary. The recovered to a method for producing a reduced form capturing enzyme Q 1 0.
  • the present invention also relates to a method for producing an oxidized coenzyme Q, 0, wherein the oxidized coenzyme Q, 0 is subjected to an oxidizing treatment after the recovery.
  • Reduced coenzyme Q 10 (I) and oxidized coenzyme Q 10 (II) are components of the mitochondrial electron transport system in cells in human organisms, and are carriers of electrons in oxidative phosphorylation. Is involved in the production of ATP.
  • oxidized coenzyme Is used in a wide range of applications as a substance showing excellent pharmacological and physiological effects on various diseases, such as nutritional supplements and cosmetics in addition to pharmaceuticals.
  • JP-A-10-330251 discloses a reduced coenzyme.
  • An anti-hypercholesterolemia agent, an anti-hyperlipidemic agent, and a therapeutic and prophylactic agent for arteriosclerosis having an excellent cholesterol-lowering effect and having an effective component of cholesterol are disclosed.
  • JP-A-10-109333 discloses a reduced coenzyme.
  • a pharmaceutical composition having excellent oral absorbability and comprising as an active ingredient is disclosed.
  • Antioxidants are also effective as a radical scavenger, Earl 'stocker (R.Stocker) et al., Reduction capturing enzyme Q 0 Gahi preparative L DL of peroxide ct one tocopherol, lycopene and / 3-force (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of América), reported that the prevention was more efficient than Rotin (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America). Vol. 88, 1646—165 pages, 1991).
  • oxidized capture enzyme Q 1 In vivo, oxidized capture enzyme Q 1 . And reduced coenzyme Q. Is a kind of equilibrium, and the oxidized capture enzyme Q absorbed into the living body. / Reduced enzyme Qi. Are known to be mutually reduced and oxidized.
  • Another method of reduced coenzyme Q 10 a method of utilizing microbial cells, i.e., reduced coenzyme from reduced coenzyme Q 10 producing microorganism.
  • a method of separating and recovering is also considered, but reduced coenzyme Q i produced by the above microbial cells. Indicates many oxidized coenzymes Q. And reduced coenzyme Q! Using a known method. . Separation-recovery is costly.
  • reduced coenzyme Q 1 Q is all coenzyme. Of which, if less than 5-10 weight. / 0 , an example in which the content is 30 to 60% by weight in most cases (JP-A-57-70834).
  • Pseudomonas cells were extracted by heating with an organic solvent in the presence of sodium hydroxide and pyrogallol, treated with 5% aqueous hydrosanolephite soda, and further dehydrated and concentrated to remove the acetone-soluble part. By collecting the reduced coenzyme Q.
  • Example in which an oil containing oil was obtained JP-A-60-75294).
  • the above 1) is used photosynthetic bacteria, after cultivation is complicated, in the above-mentioned microbial cells, if intended for production of the reduced capturing enzyme Q 10, all coenzymes.
  • the above 2) is an oxidized capture enzyme contained in the hexane phase. Reduced enzyme with hydrosanolefeit soda as a reducing agent. (See Example 3 of JP-A-60-75294), and reduced coenzyme Q in total coenzyme Q0 in a diffuse cell. The ratio of is not clear. In 1) and 2) above, the production amount of coenzyme Q in the culture is not described.
  • the microorganism is cultured and reduced coenzyme ⁇ 3 d. High ratio of coenzyme. If you find a way to obtain large amounts of, you can use reduced enzyme. Can be a very advantageous production method.
  • SUMMARY OF THE INVENTION-An object of the present invention is a reduced coenzyme. Cultivate productive microorganisms and reduce reduced coenzyme Q t . , A microbial cell containing a high ratio of reduced coenzyme Qi. By suitably recovering, reduced coenzyme. It is an object of the present invention to provide a method for safely and efficiently producing on an industrial scale.
  • Another object of the present invention is to provide a reduced coenzyme.
  • reduced coenzyme Q obtained 10 microbial cells containing at higher ratios, the enzyme Q 10 capturing original type instead obtained from microorganism cells, oxidized coenzyme Q 10 produced By oxidizing this, the oxidized coenzyme Q! .
  • a reduced coenzyme represented by A carbon source, a nitrogen source, a phosphorus source and And reduced nutrients in a medium containing micronutrients By culturing the productive microorganism, reduced coenzyme Q, Is obtained at a ratio of 70 mol% or more of the total coenzyme Q i0, and the microbial cells are crushed as necessary to produce the reduced coenzyme Q! . And extracting the reduced coenzyme Q 0 with an organic solvent.
  • reduced coenzyme Q i Q is replaced by total coenzyme Q i.
  • microbial cells containing at least 70 mol% are obtained, and the microbial cells are crushed, if necessary, to produce reduced coenzyme Qi.
  • microorganism culturing reduced coenzyme.
  • the reduced coenzyme Q! Can be produced on an industrial scale at low cost.
  • the oxidized coenzyme Q 1 0 may also be prepared by a simple operation.
  • these coenzymes produced by microorganisms. Is basically free of the (Z) -isomer and can obtain the same (a111-E) -isomer as that contained in meat, fish and the like.
  • reducing coenzyme Q 1 o is the total coenzyme Q.
  • Microbial cells containing are essentially reduced coenzymes. The whole coenzyme. Of the microorganisms which can be produced at a ratio of 70 mol% or more, preferably 75 mol% or more.
  • Microorganisms are all coenzymes.
  • Uruka generated reduced coenzyme Q 10 in any ratio for example, using a test tube (inner diameter 21 mm, total length 2 O Omm), a microorganism 1 OiriL medium [(glucose 20 g, peptone 5 g Yeast extract 3 g, malt extract 3 g) / L, pH 6.0], and shake culture (amplitude 2 cm, 310 reciprocations / min) for 72 hours at 25 ° C can be evaluated.
  • Preferred culture conditions for fermentation production on an industrial scale will be described later, but the culture conditions described above are reduced coenzymes that the microorganism has as its ability. This is one way to standardize the ratio to reflect it within a large, error-free range.
  • reduced capture enzyme there are all coenzymes. Among them, microbial cells having a content of 70 mol% or more, preferably 75 mol% or more are preferably used in the present invention. In addition, more preferably, a reduced-type capture enzyme per medium under the above culture conditions. It is preferable to use a microorganism having a production capacity of usually l / ig / mL or more, preferably 2 ⁇ gZmL or more.
  • reduced coenzyme Q 10 content of the, and, all capturing the enzyme reduced coenzyme in.
  • the ratio can be confirmed by physically crushing the microbial cells, extracting them with an organic solvent, and performing HP LC analysis. Specifically, it is measured by the following procedure.
  • the obtained result is the reduced enzyme Qi.
  • Reduced coenzyme Q that reflects the ratio as accurately as possible and that can be guaranteed at a minimum! .
  • This method has been found by some experiments of the present inventors to be an easy and appropriate method to carry out.
  • any of bacteria, yeast, and mold can be used without limitation.
  • the microorganisms include, for example, genus Agrobacterium, genus Aspergillus, genus Acetobacter, genus Aminobacter, genus Agromonas, and Acidiphilium Genus, genus Breromyces, genus Bullera, genus Brevundimo nas, genus Cryptococcus, genus Chionospha era, genus Candida cerinus, Serinos Genus, Exisophiala, genus Exobasidimn, genus Filomyces, genus Filobasidiella, genus Filobasidium, genus Geophihum, Geotrichum, Geotrichum Genus (Gluconobacter), Genus Kockovaella, Genus Tanolec (Kurtzmanomyces), Genus Lalaria, Gen
  • Genus genus Saitoella, genus Schizosaccharomyces, genus Sphingomonas, genus Sporotrichum, genus Sympodiomycopsis, Sterigmato igs , Tough The genus Tapharina, the genus Tremella, the genus Trichosporon ⁇ The genus Tilletiaria, the genus Tilletia, the genus Triplysporium (Tolyposporium), the genus Tilletiopus tila, The genus Udeniomyce, the genus Xanthophllomyces, the genus Xanthobacter, the genus Paecilomyces, the genus Acremonium, the genus Hyomonus zobium R Bacteria (preferably non-photosynthetic bacteria) and yeasts are preferred from the viewpoint of easiness of culture and productivity.
  • bacteria include the genus Agrobacterium, The genus Gluconobacter, etc. is used in yeast, and Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) is used in yeast. genus charomyces) and genus Saitoella.
  • Preferred species include, for example, Agrobacterium tumefacience IF013263, Agrobacterium 'radipactor (A grobacterium radiobacter ATCC4718), Aspergillus clavatus (Aspergillus clavatus JCM1718 pat. (Acetobacter xylinum I F015237), Aminobacter aganouensis JC M7854, Agromonas oligotrophica JCM1494, Acidophilus Multibrum alba, Acidiphilium multivorum J.
  • Rhodotonerella ⁇ Rhodotorala glutin is IF0387 Jodopobatum (Rhodosporidium diobovatum ATCC1830), Rhizomonas suberifaciens IF015212, Rhodobium orients (Rhodobium orients JC 9337), Rhodoplanes' elegance (Mod oplanes elegans J ⁇ ⁇ 0 ⁇ ⁇ ⁇
  • Paphiopegyri (Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318), Sterigmatosporidium 'Polymonorefa (Sterigmatosporidium polymorphum IFO10 121), Sphingomonas ⁇ Adhesiba (Sphingomonas) adhesiva JCM7370), Tafarina 'force Errescens (Tapharina caerulescens CBS351.35), Tremella-mesenteric force (Tremella mesenterica ATCC24438), Trichosporon-cutaneum (Trichosporon cutaneum IF01198), Chiretialia-Anomala ti anomala ti anomala ti anomaloma , Tilletia caries JCM1761, Tolyposporium bullatum JCM2006, Tilletiopsis- ⁇ sintonesis (Tilletiopsis washintonesis CBS544), Ustirago 's
  • Rizobiumu 'Merotti (Rhizobium meliloti ATCC9930) can be mentioned.
  • the reduced coenzyme Q 1 0 producing microorganism not only the wild-type strain of the microorganism, for example, reduced coenzyme Q E of the above microorganisms.
  • Microorganisms in which the transcription and translation activities of genes involved in biosynthesis or the enzymatic activities of expressed proteins are modified or improved can also be used preferably.
  • Modification or improvement of gene transcription and translation activity, or enzyme activity of expressed protein Means for carrying out this method include genetic recombination (including improvement, amplification, and rupture of self-genes, introduction of a foreign gene and improvement and amplification of the gene), and mutagenesis using a mutagen. Mutagenesis is preferred.
  • More preferred microorganisms that can be used in the present invention are reduced coenzyme Qe when the above-mentioned modified or improved microorganism, preferably a microorganism that has been mutagenized with a mutagen, is evaluated by the above-described culturing method and measuring method.
  • It is a microorganism having a content of at least / 0 , particularly preferably at least 90 mol%.
  • reduced coenzyme per culture medium is additionally required.
  • Production capacity of 1 g ZmL or more preferably 2 ⁇ g ZmL or more, more preferably 3 / zg ZmL or more, still more preferably 5 ⁇ g ZmL or more, particularly preferably 10 ⁇ g / m2. It is preferable to use a microorganism having a production capacity of not less than L, particularly preferably not less than 15 ⁇ g Zml, most preferably not less than 20 g / ml.
  • Mutagenesis can be performed as a single mutagenesis, but it is preferred to perform more than one mutagenesis. This is because the ability to produce a reduced form capturing enzyme Q 1 0 by each mutagenesis step was found to be improved.
  • the reduced coenzyme Qi is as high as possible when evaluated by the above-described growth method and measurement method. Needless to say, those having production capacity are preferable.
  • the mutagenesis treatment can be performed using any appropriate mutagen.
  • the term “mutagen” in a broad sense includes not only drugs having a mutagenic effect, for example, but also treatments having a mutagenic effect such as UV irradiation.
  • suitable mutagens include ethyl methanesulfonate, UV irradiation, nucleotide base analogs such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, promouracil, and acridines.
  • the present invention is not limited to this.
  • mutagenesis is followed by a high reduced coenzyme.
  • high productivity of reduced coenzyme Q 1 0 in the fermentative production on an industrial scale in part, the reduced coenzyme.
  • the whole coenzyme. Obtained by the use of microbial cells containing 7 0 mol% or more ratio of, also, in part, of the order to increase the production capacity of the reduced coenzyme Q 1 0 per medium described below Obtained by using suitable culture (fermentation) conditions. It is particularly preferred to combine the use of the preferred microbial cells described above with the use of the following preferred culture (fermentation) conditions.
  • the cultivation is usually carried out in a medium containing macro and micronutrients suitable for the growth of the microorganism.
  • the nutrients include, for example, carbon sources (eg, glucose, sucrose, maltose, starch, corn syrup, molasses and other carbohydrates; alcohols such as methanol, ethanol, etc.), nitrogen sources (eg, corn steep liquor, ammonium sulfate).
  • phosphorus sources eg, ammonium phosphate, phosphoric acid, etc.
  • micronutrients eg, magnesium, potassium, zinc, copper, iron, manganese
  • Minerals such as molybdenum, sulfuric acid, and hydrochloric acid; vitamins such as biotin, desthiobiotin, and vitamin B1; amino acids such as alanine and histidine; and natural materials containing vitamins such as yeast extract and malt extract). But are not limited to these It can be used to be used for.
  • the components of the natural medium such as yeast extract also contain a phosphorus source such as phosphate. The above nutrients are used in appropriate combinations.
  • the temperature for the culture is usually 15 to 45 ° C, preferably 20 to 37 ° C. Below 15 ° C, the growth rate of microorganisms tends to be low to be acceptable for industrial production, and at temperatures above 45 ° C, the survival of microorganisms tends to be impaired.
  • The: H of the culture is usually: -9, preferably 5-8. At H3 or less and pH10 or more, the growth of microorganisms tends to be easily inhibited.
  • the concentration of the carbon source (including the alcohol formed), substantially reduced coenzyme Q 1 0 capacity It is preferable to control the concentration so as not to adversely affect the image quality. Therefore, the concentration of the carbon source in the culture solution is reduced coenzyme. It is preferable to control the culture so that the concentration does not substantially adversely affect the production capacity, that is, usually 20 g ZL or less, preferably 5 g / L or less, more preferably 2 g / L or less. .
  • the concentration of the carbon source it is preferable to employ a fed-batch culture method.
  • the supply of nutrients based on culture management indicators such as pH, dissolved oxygen concentration (DO) or residual sugar concentration
  • DO dissolved oxygen concentration
  • the carbon source concentration in the culture solution it can.
  • the supply of nutrients may be started from the beginning of the culture or may be started during the culture.
  • the supply of nutrients can be continuous or intermittent.
  • the above-mentioned carbon source is separated from other components and supplied to the medium (separately).
  • Culture is performed using the desired reduced coenzyme Qi. It can be terminated when the production volume reaches.
  • the culturing time is not particularly limited, but is usually 20 to 200 hours.
  • the above culture is usually performed aerobically.
  • the term “aerobic” means that oxygen is supplied so that oxygen limitation (oxygen deficiency) does not occur during culture.
  • oxygen limitation is performed during culture. It means that the supply of oxygen is sufficient so that it does not substantially occur.
  • the cultivation is usually performed under aeration, preferably under aeration and stirring.
  • a reduced coenzyme can be obtained by using the microorganisms and culture conditions as described above.
  • the total capture enzyme Qi Among them, microbial cells containing at least 70 mol%, preferably at least 75 mol% can be obtained. Also, reduced coenzyme. Also yields a high value of 1 g / mL or more, preferably 2 ⁇ g / mL or more, and more preferably 3 g / mL or more.
  • the reduced coenzyme Q i0 is recovered by extraction from the microbial cells obtained by the above culture using an organic solvent. Upon extraction, the cells can be crushed if desired. Cell disruption contributes to efficient extraction of the enzyme Q 1 0 capturing production ⁇ accumulated reduction in the cell. Needless to say, cell disruption and extraction may be performed simultaneously.
  • a reduced coenzyme is used. It is sufficient that the surface structure such as the cell wall is damaged to such an extent that the microorganism can be extracted, and it is not always necessary to break or fragment the microbial cells.
  • yeast yeast molds usually require cell disruption treatment, and if the cells are not disrupted, reduced enzyme produced and accumulated in the cells. Is difficult to collect efficiently.
  • the microbial cells are crushed by performing one or several of the following crushing methods in an arbitrary order.
  • Examples of the crushing method include, in addition to physical treatment, chemical treatment, and enzymatic treatment, heat treatment, autolysis, osmotic lysis, and plasmolysis.
  • Examples of the physical treatment include use of a high-pressure homogenizer, an ultrasonic homogenizer, a French press, a pole mill, and the like, or a combination thereof.
  • Examples of the chemical treatment include a treatment using an acid (preferably a strong acid) such as hydrochloric acid or sulfuric acid, a treatment using a base (preferably a strong base) such as sodium hydroxide or a hydroxylating lime, and the like. Combinations can be mentioned.
  • an acid preferably a strong acid
  • a base preferably a strong base
  • Examples of the enzymatic treatment include a method using lysozyme, zymolyase, dalcanase, nopozyme, protease, cellulase and the like, and these may be used in combination as appropriate.
  • Examples of the heat treatment include a treatment at 60 to 100 ° C. for about 30 minutes to 3 hours.
  • Examples of the self-digestion include treatment with a solvent such as ethyl acetate.
  • osmotic lysis and cytoplasmic lysis in which cells are broken by treating the cells with a solution different from the intracellular salt concentration, may not be sufficient in this method alone.
  • the cell disruption method as a pretreatment for the extraction and recovery of the cells includes physical treatment, chemical treatment (particularly acid treatment, and preferably strong acid (for example, pKa of 2.5 in an aqueous solution. acid treatment) or heat treatment under conditions that the reduced coenzyme Q 1 0, as described below has been protected from oxidation reaction lay preferred by the following acids), more preferably physical treatment in terms of crushing efficiency.
  • the morphology of the microbial cells used for the cell disruption described above includes a culture solution, a concentrated culture solution, a sample obtained by collecting microbial cells from a culture solution as wet cells, a wash of these cells, and a wet cell as a solvent (for example, Suspended in water, physiological saline, buffer, etc.), dried cells obtained by drying the wet cells described above, and dried cells in a solvent (eg, water, physiological saline, buffer solution, etc.). ), But is preferably an aqueous suspension of living cells, and more preferably from the viewpoint of operability and the like, more preferably a culture solution, a concentrated culture solution, It has been washed.
  • the form of the microbial cells or the crushed cells used for the extraction and recovery of the microorganisms is not particularly limited, as described above, and may be wet cells or dried cells of the microbial cells or the crushed cells. Is an aqueous suspension of microbial cells or a crushed cell thereof, more preferably a culture solution, a concentrated and / or washed culture solution, or a crushed solution of these (all aqueous suspensions) .
  • the concentration of the cells in the above-mentioned microorganism cells or the suspension of the crushed cells is not particularly limited, and may be usually 1 to 25% by weight on a dry weight basis, but is economically 10 to 20% by weight. Preferably, the amount is%.
  • the microbial cells and the cell crushed product obtained in this manner are treated with an organic solvent. By performing the extraction, reduced coenzyme Q i 0 can be recovered.
  • organic solvent used for extraction examples include hydrocarbons, fatty acid esters, ethers, alcohols, fatty acids, ketones, nitrogen compounds (including nitriles and amides), and sulfur compounds. Can be.
  • reduced coenzyme Q In the extraction of water, it is preferable to use at least one of hydrocarbons, fatty acid esters, ethers and nitriles as an extraction solvent from the viewpoint of protection from oxidation by molecular oxygen. Hydrogens and fatty acid esters are preferred, and hydrocarbons are most preferred.
  • hydrocarbons examples include, but are not particularly limited to, aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, and halogenated hydrocarbons. Aliphatic hydrocarbons and aromatic hydrocarbons are preferred, and aliphatic hydrocarbons are more preferred.
  • the aliphatic hydrocarbon may be cyclic or non-cyclic, saturated or unsaturated, and is not particularly limited. In general, a saturated hydrocarbon is preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 5 to 12 carbon atoms, more preferably 5 to 8 carbon atoms are used.
  • Specific examples include, for example, propane, butane, isobutane, pentane, 2-methyl ⁇ / butane, hexane, 2-methinolepentane, 2,2-dimethylbutane, 2,3-dimethylbutane, heptane, heptane isomers (eg, , 2-Methylhexane, 3-Methyl / Lexane, 2,3-Dimethinolepentane, 2,4-Dimethinolepentane), Octane, 2,2,3-Trimethylpentane, Isooctane, Nonane, 2,2, 5-trimethylhexane, decane, dodecane, 2-pentene, 1-hexene, 1-heptene, 1-octene, 1-nonene, 1-decene, cyclopentane, methinolecyclopentane, cyclohexane, methinolecyclohexan
  • pentane, 2-methylptane, hexane, 2-methyl / lepentane, 2,2-dimethylinobutane, 2,3-dimethylbutane, heptane, and heptane isomers eg, 2-methylhexane, 3-methylethane) Hexane, 2,3-dimethinolepentane, 2,4-dimethylpentane), octane, 2,2,3-trimethylpentane, isooctane, cyclopentane, methinole cyclopentane, cyclohexane, methinolecyclohexane, ethinolecyclo Hexane and the like.
  • heptane and heptane are preferably used. More preferably, pentanes having 5 carbon atoms (such as pentane), hexanes having 6 carbon atoms (such as hexane and cyclohexane), and heptane having 7 carbon atoms (such as heptane and methylcyclohexane) Hexane, etc.). Particularly preferred are heptane (eg, heptane, methylcyclohexane, etc.), and most preferred is heptane, since the protective effect against oxidation is particularly high.
  • pentanes having 5 carbon atoms such as pentane
  • hexanes having 6 carbon atoms such as hexane and cyclohexane
  • heptane having 7 carbon atoms such as heptane and methylcyclohexane
  • the aromatic hydrocarbon is not particularly limited, but usually has 6 to 20 carbon atoms, preferably 6 to 12 carbon atoms, and more preferably 7 to 10 carbon atoms.
  • Specific examples include benzene, tonolene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, ethynolebenzene, cumene, mesitylene, tetralin, ptynolebenzene,: —cymene, cyclohexyl / madzene, getinole Benzene, pentylbenzene, dipentinolebenzene, dodecinolebenzene, styrene and the like can be mentioned.
  • More preferred are toluene, xylene, o-xylene, m-xylene, p-xylene, cumene, tetralin and the like. Most preferred is cumene.
  • the halogenated hydrocarbon may be cyclic or non-cyclic, saturated or unsaturated, and is not particularly limited. Generally, non-cyclic halogenated hydrocarbons are preferably used. More preferred are chlorinated hydrocarbons and fluorinated hydrocarbons, and even more preferred are chlorinated hydrocarbons. Further, those having 1 to 6 carbon atoms, preferably 1 to 4 carbon atoms, and more preferably 1 to 2 carbon atoms are suitably used.
  • Specific examples include, for example, dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,1,2-Tetrachloroethane, 1,1,2,2-Tetrachloroethane, Pen'tachloroethane, Hexachloroethane, 1,1-Dichloroethylene, 1,2-Dichloroethylene , trichlorethylene, tetrachlorethylene, 1, 2-dichloroethane port Purono ⁇ 0 emissions, 1, 2, 3-trichloro port Purono ⁇ 0 down, black hole benzene, 1, 1, 1, and 2-Tetorafuruo port ethane .
  • dichloromethane chloroform, tetrachloride, 1,1-dichloroethane, 1,2-dichloroethane, 1,1,1-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, 1,1,2-trichloroethane, Examples include 1-dichloroethylene, 1,2-dichloroethylene, trichloroethylene, chlorobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane. More preferred are dichloromethane, chlorophonolem, 1,2-dichloroethylene, trichloroethylene, cyclobenzene, 1,1,1,2-tetrafluoroethane and the like.
  • the fatty acid esters are not particularly limited, but include, for example, propionate, acetate, formate and the like. Preferred are acetate and formate, and more preferred are acetate.
  • the ester group is not particularly limited, but is usually an alkyl ester having 1 to 8 carbon atoms, an aralkyl ester having 7 to 12 carbon atoms, preferably an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably an alkyl ester having 1 to 6 carbon atoms. An alkyl ester having 1 to 4 carbon atoms is used.
  • propionate esters include, for example, methyl propionate, ethyl propionate, butyl propionate, isopentyl propionate and the like. Can be. Preferred is ethyl propionate.
  • acetate esters include, for example, methyl acetate, ethyl acetate, propyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, isoptyl acetate, sec-butyl acetate, pentyl acetate, isopentyl acetate, sec-hexyl acetate, cyclohexanol acetate. And benzyl acetate.
  • formate esters include, for example, methyl formate, ethyl formate, propyl formate, isopropyl formate, butyl formate, isoptyl formate, sec-butyl formate, pentyl formate, and the like.
  • Preferred are methyl formate, ethyl formate, propyl formate, butyl formate, isoptyl formate, pentyl formate and the like. Most preferred is ethyl formate.
  • the ethers are not particularly limited, regardless of whether they are cyclic or acyclic, or saturated or unsaturated, but generally, saturated ethers are preferably used. Usually, those having 3 to 20 carbon atoms, preferably 4 to 12 carbon atoms, more preferably 4 to 8 carbon atoms are used. Specific examples include getyl ether, methyl tert-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutinole ether, dihexyl ether, ethyl vinyl ether, butyl vinyl ether, aesone, and phenene.
  • Tonole Petinolepheninoleatenole, Methoxytoluene, Dioxane, Furan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydrodropyran, Ethylene glycolone Dimethylatenole, Ethylene glycol jeteinoatenole, Etylene glycol Examples include ethylene glycolone monomethyzooleate, ethylene glycolone monomethyzooleate, ethylene glycolone monoethylenate, and ethylene glycolone monoenotinoleatene.
  • getinoleether More preferably, they include getinoleether, methinole tert-butylenoate ethere, aniso monoleate, dioxane, tetrahydrofuran, ethylene glycolone monomethinoleate ethere, and ethylene glycol monoethyl ether. More preferred are getyl ether, methyl tert-butyl ether, anisol and the like, and most preferred is methinolle tert-butyl / leatenole.
  • the alcohols may be cyclic or non-cyclic, saturated or unsaturated, and are not particularly limited. In general, saturated alcohols are preferably used. Usually, it has 1 to 20 carbon atoms, preferably 1 to 12 carbon atoms, and more preferably 1 to 6 carbon atoms. Of these, monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms, dihydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms, and trihydric alcohols having 3 carbon atoms are preferable.
  • these alcohols include, for example, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-ptanol, 2-butanol, isoptinoleanol, tert-butynoleano Reconore, 1-pentano-1-nore, 2-pentano-nore, 3-pentanono-nore, 2-methyl-1-butanol, isopentino-leno-nocole, tert-pentino-leno-no-reno, 3-methinole 2-butanol , Neopen chinoreanorekonore, 1-hexanore, 2-methinole 1-pentanole, 4-methyl 2-pentanol, 2-ethyl-1-1-ptanole, 1-heptanoone, 21-heptanole , 3-Heptano-nore, 1-Octano-nore, 2-Octano-no-re,
  • Preferred examples of the monohydric alcohol include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutynoleanol, tert-butyl alcohol, 1-pentanol and 2-pentanol. Nore,
  • 3-Pentanol 2-Methylenol 1-Ptanolone, Isopentynole alcohol, tert-Pentinoleanole cone, 3-Methinole-1-butanol, Neopentine / Leanole coneole, 1-hexanol, 2-Methylenole 1-pentanole 1-hole, 4-methinole 2-pentanol, 2-ethyl-1 butanol, 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol, 1-oktananol, 2-octanol, 2-etch / ray 1 1-hexanol, 1-nonanol, 1-decanol, 1 pendanol,
  • methanol ethanol
  • 1-propanol 2-propanol
  • 2-propanol 1-butanol
  • 2-butanol isobutyl alcohol
  • 2-methyl-1-butanol isopentyl alcohol, etc.
  • 2-propanol 2-propanol.
  • dihydric alcohol 1,2-ethanediol, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol and the like are preferred, and 1,2-ethanediol is most preferred.
  • Glycerin is preferred as the trihydric alcohol.
  • fatty acids examples include formic acid, acetic acid, propionic acid and the like. Preferably, it is formic acid or acetic acid, most preferably acetic acid.
  • Ketones are not particularly limited, and those having 3 to 6 carbon atoms are preferably used. Specific examples include, for example, acetone, methyl ethyl ketone, methyl butyl ketone, methyl isobutyl ketone, and the like. Preferably, they are acetone and methyl ethyl ketone, and most preferably, acetone.
  • the etryl is not particularly limited, regardless of cyclic or non-cyclic, or saturated or unsaturated, but saturated is generally preferably used. Usually, those having 2 to 20 carbon atoms, preferably 2 to 12 carbon atoms, more preferably 2 to 8 carbon atoms are used.
  • acetonitrile for example, acetonitrile, propionitrile, malononitrile, ptyronitrile, isopyronitrile, succinonitrinole, valeroletrinole, gnorethalonitrile, hexanetrilinole, and heptylcyanide.
  • Octylcyanide decanecanitrile, dodecanenitrile, tridecanenitrile, pentadecane-tolyl, stearonitrinole, chloroacetonitrile, bromoacetonitrile, chloropropionitole, bromopropiolinee, methoxyacetonitrile Methyl anoacetate, ethyl cyanoacetate, tolunitrile, benzo-tolyl, benzobenzonitrile, bromobenzonitrile, cyanobenzoic acid, nitrobenzonitrile, anisonitrile, phthalonitrile , Bromotonolenitrile, methyl cyanobenzoate, methoxybenzonitrile, acetylbenzonitrile, naphthotrile, biphenylcarbonitrile, phenylpropionitrile, phenylbutyrate-tolyl, methylfurineacetonitrile, diphenacenitritoletrynitrile,
  • acetonitrile Preferably, it is acetonitrile, propionitrile, succinonitrile, petit mouth nitrile, isobutyrate-tolyl, valeronitrile, methyl cyanoacetate, ethyl cyanoacetate, benzonitrile, tonorenitrile, and clomouth propionitrile. More preferred are acetonitrile, propionitrile, ptyronitrile, isopyronitrile, and most preferred is acetonitrile.
  • nitrogen compounds other than nitriles include amides such as formamide, N-methylformamide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, and the like.
  • amides such as formamide, N-methylformamide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, and the like.
  • Tromethane, triethylamine, pyridin and the like can be mentioned.
  • sulfur compounds examples include dimethyl sulfoxide, sulfolane and the like.
  • boiling point e.g., appropriate heating to increase solubility, and easy removal of solvent from wet bodies and recovery of solvent from crystallization filtrate, etc.
  • Boiling point approximately 30 to 150 ° C at 1 atm, melting point that hardens to solidify when handled at room temperature and when cooled below room temperature (above about 0 ° C, preferably about 10 ° C, (Preferably about 20 ° C or more) and low viscosity (about 10 ° C or less at 20 ° C)).
  • the oxidation protective effect of the reduced coenzyme Tends to increase in highly concentrated solutions of Reduced coenzyme. Has a high solubility in the above-mentioned organic solvents (eg, hydrocarbons, fatty acid esters, etc.) having a high oxidation protection effect. This high solubility enables handling in highly concentrated solutions, Subsidies.
  • the preferred extraction time of concentration for the oxidation protective effects of reduced capturing enzyme Q 1 0 is not limited in particular, as the concentration of reduced coenzyme Q 1 0 for the organic solvent, usually 0.0 0 1 wt %, Preferably at least 0.1% by weight, more preferably at least 0.1% by weight.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually 10% by weight or less.
  • the extract ⁇ recovering the enzyme Q 1 0 catching reduced form have preferably to use a hydrophilic organic solvent. Specific examples include acetone, acetonitrile, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol and the like.
  • the extract ⁇ recovering the enzyme Q 1 0 catching reduced form rather preferably to use a hydrophobic organic solvent, which Aids in the removal of water-soluble substances derived from microorganisms.
  • Most of the hydrophobic organic solvents are organic solvents having a high oxidation protection effect as described above, which is extremely convenient.
  • hydrophobic organic solvent hydrocarbons, fatty acid esters, and ethers are preferable.
  • an organic solvent is used from an aqueous suspension of microbial cells or the crushed cell, particularly an aqueous suspension of the crushed cell, especially an aqueous suspension of the crushed cell by physical treatment.
  • an aqueous suspension of the crushed cell especially an aqueous suspension of the crushed cell by physical treatment.
  • hydrophilic organic solvent as an auxiliary solvent in addition to the hydrophobic organic solvent as the extraction solvent.
  • the hydrophobic organic solvent is not particularly limited, and the above-mentioned ones can be used, but hydrocarbons are preferable, and aliphatic hydrocarbons are more preferable.
  • the aliphatic hydrocarbons those having a coal number of 5 to 8 are preferably used.
  • aliphatic hydrocarbon having 5 to 8 carbon atoms include, for example, pentane, 21-methyl / lebutane, hexane, 2-methinolepentane, 2,2-dimethinolebutane, 2,3-dimethylbutane, heptane, heptane Isomers (eg, 2-methylhexane, 3-methylhexane, 2,3-dimethinolepentane, 2'4-dimethinolepentane), octane, 2,2,3-trimethinolepentane, isooctane, cyclo Pentane, methinolecyclopentane, cyclohexane, meth / lecyclohexane, ethynolecyclohexane and the like can be mentioned. Particularly preferred are hexane, heptane and methylcyclohexane, and most preferred are
  • the hydrophilic organic solvent used in combination with the above-mentioned hydrophobic organic solvent is not particularly limited, and the above-described ones can be used, but alcohols are preferable. Among alcohols, monohydric alcohols having 1 to 5 carbon atoms are preferably used.
  • Particularly preferred are methanol, ethanol, 1-propanol and 2-propanol, and most preferred is 2-propanol.
  • the amount of the hydrophilic organic solvent and the hydrophobic organic solvent is not particularly limited, but the concentration at the time of extraction is preferably 5 to 50% based on the volume of the whole solution. % By volume, and the hydrophobic organic solvent ranges from 25 to 65% by volume.
  • the temperature at the time of extraction is not particularly limited, but is usually 0 to 60 ° C, preferably 20 to 50 ° C.
  • Either batch extraction or continuous extraction can be used as the extraction method, but continuous extraction (preferably, multistage countercurrent extraction) can be used.
  • the stirring time in batch extraction is not particularly limited, but is usually 5 minutes or more.
  • the average residence time in continuous extraction is not particularly limited, but is usually 10 minutes or more.
  • Reduced coenzyme When recovering, reduced coenzyme. It is preferable to take care not to decompose (eg, not oxidized to oxidized coenzyme).
  • the above extraction is preferably performed under acidic to weakly basic conditions, preferably under acidic to neutral conditions.
  • pH When pH is used as an index, it depends on the contact time, but it is pH 10 or less, preferably pH 9 or less, more preferably pH 8 or less, and still more preferably pH 7 or less.
  • the oxidation reaction can be substantially protected.
  • the above-mentioned cell crushing and / or Z extraction or extraction is carried out under conditions where reduced coenzyme 0 is protected from the oxidation reaction. Is preferred. More preferably, at least the above extraction is performed under such conditions, and more preferably, the above crushing and extraction are performed.
  • condition protected from the oxidation reaction examples include, for example, under a deoxygenated atmosphere (under an inert gas atmosphere such as a nitrogen gas, a carbon dioxide gas, a helium gas, an argon gas, a hydrogen gas, a reduced pressure, a boiled Ji blue, Under conditions of high salt concentration, for example, preferably when the concentration of salts in the aqueous phase (eg, inorganic salts such as sodium chloride and sodium sulfate) is about 5% or more.
  • a strong acid eg, an acid having a pKa of 2.5 or less in an aqueous solution
  • a reduced coenzyme for example, a reduced coenzyme.
  • the present invention also provides an oxidized coenzyme after subjecting the microbial cell or the crushed cell to an oxidation treatment. Is extracted with an organic solvent, or reduced coenzyme Q i is obtained from the microbial cells or the crushed cells. Is extracted with an organic solvent and, if necessary, subjected to a purification treatment, and then subjected to an oxidation treatment to obtain an oxidized coenzyme. Can be manufactured.
  • the oxidation may be carried out, for example, by using reduced coenzyme Q 1 Q (preferably, a microbial cell containing reduced coenzyme Q i described above, an aqueous suspension of the cell lysate, or reduced coenzyme Q 1) . And an oxidizing agent (eg, manganese dioxide), and the mixture is treated at room temperature (eg, 30 ° C.) for 30 minutes or more.
  • an oxidized enzyme is used.
  • it can be performed in the same manner as the extraction operation of the enzyme Q 1 0 catching the reduced form of the above-mentioned, it'll Ri oxidized coenzyme. Can be efficiently collected.
  • oxidized coenzyme Q 1 does not need to conduct a "under the conditions protected from oxidation reaction", as recommended in the recovery of the reduced capturing enzyme Q 1 0, normal safe operation and the like Should be taken into consideration.
  • the oxidized capture enzyme Q thus obtained. May be purified by column chromatography or the like, if desired.
  • Type coenzyme Q i. It can be obtained as crystals.
  • FIG. 1 is a schematic view of a countercurrent three-stage continuous extraction device used in Example 8. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Mouth do Tonerella ⁇ Rhodotomla glutinis IF01125 is aerobically grown at 25 ° C in medium (5 g of peptone, 3 g of yeast extract, 3 g of manoleto extract, 20 g / L of gnorecose, pH 6.0). The cells were cultured for 8 hours. After culturing, the cells are collected by centrifugation, and N-methyl-N'-nitro-2-N-trotroguanidine is added to a concentration of 200 ⁇ g / mL. In pH 7 phosphate buffer. After 1 hour at 25, the cells were washed 5 times with 0.9% NaCl solution and resuspended in 0.9% NaCl solution.
  • the cell suspension was diluted appropriately to form colonies on the agar plate of the above medium.
  • the ratio of reduced coenzyme Q x Q were examined in the same manner as in Example 1.
  • a mutant strain having a productivity of 15 g / mL or more was obtained by repeating the mutation 10 times.
  • the reduced coenzyme at this time. was 80 mol% or more.
  • Cytoella, Saitoella complicata IFO 10748 is aerobically grown at 25 ° C in a medium (5 g of peptone, 3 g of yeast extract, 3 g of malt extract, 20 g / L of glucose, pH 6.0).
  • a medium 5 g of peptone, 3 g of yeast extract, 3 g of malt extract, 20 g / L of glucose, pH 6.0.
  • the obtained cells were crushed twice at a crushing pressure of 80 MPa using a Lanie pressure type homogenizer sealed with nitrogen gas to prepare a cell lysate. Extraction was repeated three times from the cell lysate at a ratio of 30 parts by volume of isopropanol and 40 parts by volume of hexane to obtain an extract.
  • the extraction rate was 99% and reduced coenzyme.
  • Mouth dotorula ⁇ Glutinis (Rhodotomla glutinis)
  • darcos When cultivating aerobically at 25 ° C with 0 L (10 g of peptone, 5 g of yeast extract, 3 g of malt extract, 20 g / L of glucose, pH 6.0), darcos should be obtained after 48 hours. By the 96th hour at a rate of 4 g Z hour, the mixture was fed (a fed glucose amount of 190 g).
  • the production amount of reduced enzyme Q 1 Q per medium is 20 g / mL or more, and the amount of reduced enzyme is reduced.
  • Example 3 The extract obtained in Example 3 was replaced with a hexane solution, adsorbed to a column filled with silica gel, and developed and eluted with an n- hexane / getyl ether (9Z1) solution. And reduced coenzyme. Was obtained. This fraction was further cooled to 2 QC with stirring to obtain a white slurry. All the above operations were performed in a nitrogen atmosphere. The obtained slurry was filtered under reduced pressure, the wet crystals were washed with the above developing solution (the temperature of the solvent used for washing was 2 ° C), and the wet crystals were dried under reduced pressure (20 to 40 ° C, 1 to 30 mmHg). ) To obtain 81 mg of white dry crystals. The purity of the obtained crystals is 99.9%, reduced coenzyme. Was 90 mol%.
  • Example 3 The extract obtained in Example 3 was replaced with n-hexane, manganese dioxide (5 Omg) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C for 30 minutes. This reaction solution was fractionated and purified as in Example 5 to obtain high-purity oxidized coenzyme Q. 74 mg was obtained.
  • Cytoella 'Saitoella complicata IFO 10748 in medium (5 g of peptone, 3 g of yeast extract, 3 g of masoleto extract, g / recose 20 g / L, ⁇ H6.0) at 25 ° C for 72 hours
  • the culture was performed 50 OmL aerobically.
  • the obtained cells were crushed twice at a crushing pressure of 80 MPa using a pressure-type homogenizer manufactured by LaEye sealed with nitrogen gas to prepare a cell lysate.
  • Reduced coenzyme in crushed stone fluid Percentage of total coenzyme, including oxidized form. 97%.
  • Isopropanol and n-hexane were mixed with 20 mL of the cell lysate at a ratio shown in the column of the first extraction in Table 4 below so that the total amount of the solvent was 500 mL, and the temperature was 40 ° C. C.
  • the mixture was stirred for 30 minutes, and the first extraction operation was performed. After completion of the extraction, the mixture was allowed to stand for 10 minutes, and the separated upper layer was separated.
  • the volume ratio of the lower layer (residue) to the total liquid volume at this time was used as an index of separation, and is shown in Table 4 as the interface position.
  • the solvent concentration of the residue layer was measured, and isopropanol and hexane were added so that the total solvent ratio was the ratio shown in the second column of Table 4.
  • the mixture was stirred at a temperature of 40 ° C for 30 minutes. Then, let stand for 10 minutes, separate the upper layer in the same manner as above, measure the solvent concentration of the residue layer, and use isopropanol so that the total solvent ratio becomes the ratio shown in the third column of Table 4. And add hexane, temperature 25 The mixture was stirred at 30 ° C. for 30 minutes to perform the third extraction operation.
  • Table 4 shows the calculation results.
  • the static separation was good, and the total extraction rate after three extractions was 90% or higher, indicating a high recovery rate.
  • the isopropanol concentration was set to 30% or more, a high recovery rate of 99 ° / 0 or more was obtained.
  • Saitoella complicata IFO 10748 in medium (5 g of peptone, 3 g of yeast extract, 3 g of ma / reto extract, 20 g / L of glucose / recose, pH 6.0) at 25 ° C, 72 750 L of cells were cultured aerobically for hours.
  • the obtained cells were disrupted twice with a pressure homogenizer manufactured by Lanney and sealed with nitrogen gas at a disruption pressure of 140 MPa to prepare a cell disrupted liquid.
  • the cell lysate was continuously extracted by a countercurrent three-stage continuous extraction device shown in Fig. 1.
  • the capacity of the stirring tank was 630 L
  • the capacity of the stationary separation tank was 200 L.
  • the microbial cell lysate was supplied to the first-stage stirred tank, and isopropanol and n-hexane were supplied to each stage.
  • the supply volume of the lysate was 2 L / min, and the supply volume of isopropanol and n-hexane was 1.3 L / min of isopropanol and ⁇ -hexane 3. It was set to 7 LZ. However, at this time, the solvent concentration in each stage was appropriately adjusted so that the isopropanol concentration was 5 to 50 vZv% and the n-hexane concentration was 25 to 65 VnV%.
  • the extraction was performed at a temperature of 40 ° C and the treatment time was 6 hours.
  • microorganism culturing reduced coenzyme.
  • the oxidized coenzyme Q 10 can also be manufactured by a simple operation .

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Description

補酵素 。の製造方法 技術分野
本発明は、 下記式 （I )
Figure imgf000003_0001
で表される還元型補酵素 Q 1 0、 及び、 下記式 （II)
Figure imgf000003_0002
で表される酸化型補酵素 Q 1 0の製造方法に関する。
さらに詳しくは、 還元型補酵素 Q a Q生産性微生物を培養することによって、 還元型補酵素 Q 。を全捕酵素 Q i 0のうち 7 0モル。 /0以上の比率で含有する微生 物細胞を得、 必要に応じて該微生物細胞を破砕し、 生産された還元型捕酵素 。を回収する、 還元型捕酵素 Q 1 0の製造方法に関する。
また、 前記微生物細胞又は該細胞破砕物を酸化処理に付した後に酸化型補酵素 。を回収する力、、 或いは、 前記微生物細胞又は該細胞破砕物から還元型補酵 素 Q i。を回収した後に酸化処理に付す、 酸化型補酵素 Q , 0の製造方法にも関す る。 景技術
還元型補酵素 Q10 (I) 及び酸化型補酵素 Q10 (II) は、 人の生体内の細胞 中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成因子であり、 酸化的リン酸化反応に おける電子の運搬子として働くことにより AT Pの生成に関与している。
従来から、 酸化型補酵素 。は、 各種疾病に対して優れた薬理及び生理効果 を示す物質として医薬品以外にも栄養補助食品や化粧品に使用される等、 幅広い 用途で用いられている。
一方、 還元型補酵素 Q10は、 これまであまり注目されていなかったが、 近年、 種々の用途において酸化型補酵素 Q i。よりも有効であるとの報告がなされるよ うになつてきた。
例えば、 特開平 10— 33025 1号公報には、 還元型補酵素 。を有効成 分とする、 優れたコレステロール低下作用を有する抗高コレステロ一ル血症剤、 抗高脂血症剤ひいては動脈硬化症治療及び予防剤が開示されている。 また、 特開 平 1 0— 10 9 9 33号公報には、 還元型補酵素 。を含有する捕酵素 。を 有効成分とする、 経口吸収性に優れた医薬品組成物が開示されている。
さらに、 還元型補酵素 。は抗酸化剤、 ラジカルスカベンジャーとしても有 効であり、 アール 'ストッカー （R.Stocker) らは、 還元型捕酵素 Q 0がヒ ト L DLの過酸化を ct一トコフエロール、 リコペンや /3—力ロチンより効率的に防止 したことを報告している (プロシーディングス ォブ ザ ナショナル ァカデ ミー ォプ サイエンス ォブ ザ ユナイテッド ステーッ ォブ アメリカ (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of Am erica) 、 88卷、 1646— 1 6 50頁、 1 9 9 1年） 。
生体内で、 酸化型捕酵素 Q 1。と還元型補酵素 Q 。はある種の平衡関係にあり 生体内に吸収された酸化型捕酵素 Q 。/還元型捕酵素 Q i。は相互に還元 Ζ酸化 されることが知られている。
還元型捕酵素 。の製法としては、 酸化型補酵素 。の製法と同様、 化学合 成法が考えられるが、 その合成プロセスは煩雑.危険で、 コスト高と予想される。 また、 化学合成法の場合は、 安全性が懸念される （Z) —異性体の副生 '混入 （ バイオメディ力ノレ アンド クリニカル アスペク ト ォブ コェンザィム Q ( Biomedical and clinical aspects of coenzyme Q) 、 3卷、 1 9項一 30項、 1 981) を最小化する必要もあるであろう。 酸化型補酵素 。は、 ヨーロッパ 局方においては、 （Z) —異性体の含有量が 0. 1 %以下でなければならないと 規定されている。
還元型補酵素 Q10の別の製法として、 微生物細胞を利用する方法、 すなわち、 還元型補酵素 Q10生産性微生物から還元型補酵素 。を分離 ·回収する方法も 考えられるが、 上記微生物細胞により生産される還元型補酵素 Q i。は多くの酸 化型補酵素 Q 。を含んでおり、 既知の方法を用いる還元型補酵素 Q！。の分離 - 回収はコスト高である。
微生物細胞中に還元型補酵素 Q10が存在することを記載したものとしては、 例えば、 以下の細菌の例が知られている。
1) 光合成細菌の培養菌体において、 還元型捕酵素 Q1 Qが全補酵素 。のうち、 少ない場合で 5〜 10重量。 /0、 多い場合で 30〜 60重量％存在すると記载した 例 （特開昭 5 7— 708 34号公報） 。
2) シユードモナス属菌体を、 水酸化ナトリウム及ぴピロガロールの存在下に、 有機溶剤で加熱抽出した後、 5 %ハイドロサノレフアイトソーダ水で処理し、 さら に脱水濃縮してァセトン可溶部を採取することにより、 還元型補酵素 Q 。を含 む油状物を取得した例 （特開昭 60- 75294号公報） 。
上記 1) 及び 2) はいずれも、 得られた還元型補酵素 Q10と酸化型補酵素 。の混合物、 或いは、 還元型補酵素 Q10を、 さらに酸化して酸化型補酵素 。に 変換することを目的としたものであり、 還元型補酵素 Q！。は酸化型補酵素 Q 1。 製造における中間物質として記載されているにすぎない。
上記 1) は、 光合成細菌を用いており、 培養が煩雑であるうえ、 上記微生物細 胞においては、 還元型捕酵素 Q10の製造を目的とした場合、 全補酵素 。中の 還元型補酵素 Q i。の比率は+分とは言えない。
上記 2) は、 へキサン相中に含まれる酸化型捕酵素 。を還元剤であるハイ ドロサノレフアイトソーダで還元型捕酵素 。に変換する操作 （特開昭 60- 7 5294号公報の実施例 3を参照） を含んでおり、 ί散生物細胞中の、 全補酵素 Q 0中の還元型補酵素 Q 。の比率は明らかでない。 また、 上記 1) 及び 2) においては、 培養における補酵素 Qの生産量は記載さ れていない。
以上のように、 還元型補酵素 Q10を高い比率で含有する微生物細胞はこれま で報告されておらず、 ましてや還元型補酵素 Q1 Qを工業的規模で発酵生産、 即 ち、 微生物を培養して還元型補酵素 Q 。を全補酵素 Q i。中高い比率で含有する 微生物細胞を得、 還元型補酵素 Q10を回収することにより、 高純度の還元型補 酵素 Q ^ 0を得た例も知られていない。
このような状況において、 微生物を培養して、 還元型補酵素 <3ェ。比率の高い 補酵素 。を多量に得る方法を見いだせれば、 還元型捕酵素 。の極めて有利 な製造法となり うる。 発明の要約 - 本発明の目的は、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養し、 還元型補酵素 Qt 。を高い比率で含有する微生物細胞を得、 該微生物細胞から還元型補酵素 Q i。を 好適に回収することにより、 還元型補酵素 。を安全且つ効率的に工業的規模 で生産する方法を提供することにある。
また、 本発明の目的は、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養し、 還元型補 酵素 Q10を高い比率で含有する微生物細胞を得、 該微生物細胞から得られた還 元型捕酵素 Q10を、 酸化型補酵素 Q10製造における中間物質として、 これを酸 化することにより、 簡便な操作で酸化型補酵素 Q！。を製造する方法を提供する ことにもある。
即ち、 本発明は、 下記式 （I ) ；
Figure imgf000006_0001
で表される還元型補酵素 。の製造方法であって、 炭素源、 窒素源、 リン源及 び微量栄養素を含んでなる培地中で、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養す ることによって、 還元型補酵素 Q ,。を全補酵素 Q i 0のうち 7 0モル％以上の比 率で含有する微生物細胞を得、 必要に応じて該微生物細胞を破碎し、 生産された 還元型補酵素 Q！。を有機溶剤で抽出することを特徴とする還元型補酵素 Q 0の 製造方法である。
また、 本発明は、 下記式 （II) ；
Figure imgf000007_0001
で表される酸化型補酵素 Q 1 0の製造方法であって、 炭素源、 窒素源、 リン源及 び微量栄養素を含んでなる培地中で、 還元型補酵素 Q x 0生産性微生物を培養す ることによって、 還元型補酵素 Q i Qを全補酵素 Q i。のうち 7 0モル％以上の比 率で含有する微生物細胞を得、 必要に応じて該微生物細胞を破碎し、 生産された 還元型補酵素 Q i。を酸化して酸化型捕酵素 Q！。に変換した後にこれを有機溶剤 で抽出するか、 或いは、 生産された還元型補酵素 。を有機溶剤で抽出し、 必 要により精製処理を施した後に、 還元型補酵素 。を酸化して酸化型補酵素 。に変換することを特徴とする酸化型補酵素 Q！。の製造方法でもある。
本発明の方法によれば、 微生物の培養、 還元型補酵素 。の回収という非常 に簡便な操作によって、 還元型補酵素 Q！。を工業的規模で安価に製造すること ができる。 また、 酸化型補酵素 Q 1 0についても、 簡便な操作によって製造する ことができる。 さらに、 微生物によって生産されるこれらの補酵素 。は、 基 本的に （Z ) —異性体を含まず、 肉、 魚等に含まれるものと同じ （a 1 1 一 E ) 一異性体を得ることができる。 発明の詳細な開示
本発明では、 まず、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養し、 還元型補酵素 Q 1 oを全補酵素 Q 。のうち 70モル％以上、 好ましくは 75モル％以上の比率 で含有する微生物細胞を得る （発酵） 。
全補酵素 Q！。中、 上記のような高い比率で還元型補酵素 Q！。を含有する微生 物細胞は、 基本的に、 還元型補酵素 。を全補酵素 。のうち 70モル％以上、 好ましくは 75モル％以上の比率で生成しうる微生物を培養することにより得ら れる。
微生物が、 全補酵素 。のうち、 いかなる比率で還元型補酵素 Q10を生成し うるかは、 例えば、 試験管 （内径 21mm、 全長 2 O Omm) を用いて、 微生物 を 1 OiriLの培地 [ (グルコース 20 g、 ペプトン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マル トエキス 3 g) /L、 pH6. 0] 中で 25°C、 72時間振とう培養 （振幅 2 c m、 310往復/分） する方法により評価することができる。
工業的規模での発酵生産における好ましい培養条件については後述するが、 上 記の培養条件は、 微生物がその能力として有する還元型補酵素 。比率を大き く誤りのない範囲で反映するように標準化するための一つの方法である。
上記の培養条件下、 還元型捕酵素 。が全補酵素 。のうち 70モル％以上、 好ましくは 75モル％以上の含量を示す微生物細胞を本発明に用いるのが良い。 尚、 さらに好ましくは、 上記の培養条件下、 培地当たりの還元型捕酵素 。の 生産能力として、 通常 l /i g/mL以上、 好ましくは 2 μ gZmL以上の生産能 力を有する微生物を用いるのが良い。
ここで、 上記の還元型補酵素 Q10含有量、 及び、 全捕酵素 。中の還元型補 酵素 。比率は、 微生物細胞を物理的に破碎した後、 有機溶媒で抽出して HP LC分析を行うことにより確認できる。 具体的には、 以下の手順により測定され る。
1) 微生物増殖液を必要に応じて濃縮し、 当該増殖液 10容量部をネジロ試験管 (内径 16. 5 mm、 全長 130mm) に移し、 ガラスビーズ （425〜600 ミクロン； S I GMA社製） 10容量部を加える。
2) 窒素雰囲気下、 該増殖液 10容量部に対してイソプロパノール 3容量部及び n—へキサン 18. 5容量部を加える。
3 ) 窒素雰囲気下、 3分間激しく振とうすることにより、 微生物細胞の破砕及び 抽出を行う。
4) 得られた疎水性有機溶剤相 （n—へキサン相） を減圧下にエバポレート （バ ス温： 40°C) し、 HPLCにより分析する。
カラム： YMC— P a c k 4. 6 X 25 Omm (YMC. C o. ， L t d. 移動相： メタノール/ n—へキサン =8 5/1 5
流速： 1 mL/m i n
検出： UV 275 nm
保持時間：還元型補酵素 Q i。 13. 5 m i η
酸化型捕酵素 Q1Q 22. Om i n
上記測定方法は、 得られた結果が還元型捕酵素 Q i。含有量及び全補酵素 Q i。 中の還元型補酵素 。比率を極力正しく反映するように、 且つ、 最低限保証し うる還元型補酵素 Q！。含有量及び比率を標準化するために与えられる。 この方 法は、 本発明者らの幾つかの実験により、 実施するのが容易且つ適切な方法であ ることが見出されたものである。
本発明で用いる上記還元型補酵素 Q1 Q生産性微生物としては、 細菌、 酵母、 カビのいずれも制限無く使用することができる。 上記微生物としては、 具体的に は、 例えば、 ァグロパクテリゥム （Agrobacterium) 属、 ァスペルギルス （Asperg illus) 属、 ァセトバタター (Acetobacter) 属、 ァミノパクター (Aminobacter) 属、 ァグロモナス （Agromonas) 属、 ァシドフィラス （Acidiphilium) 属、 ブレロミ セス （Bulleromyces) 属、 ブレラ （Bullera) 属、 ブレブンジモナス （Brevundimo nas) 属、 タリプトコッカス （Cryptococcus) 属、 キオノスファエラ （Chionospha era) 属、 カンジタ （Candida) 属、 セリノステルス （Cerinosterus) 属、 ェキソフ ィァラ （Exisophiala) 属、 ェキソバシジゥム （Exobasidimn) 属、 フイロミセス (Fellomyces) 属、 フイロバシジエラ （Filobasidiella) 属、 フィロバシジゥム (Fi lobasidium) 属、 ゲォトリカム （Geotrichum) 属、 グラフィオラ （Graphiola) 属、 グ /レコノバクタ一 (Gluconobacter) 属、 コッコノ エラ (Kockovaella) 属、 タノレツ マノミセス （Kurtzmanomyces) 属、 ララリア （Lalaria) 属、 ロイコスポリジゥム (Leucosporidium) 属、 レギオネラ （Legionella) 属、 メチロバクテリウム （Meth ylobacterium) 属、 ミコプラナ (Mycoplana) 属、 オースポリジゥム （Oosporidiu m) 属、 シユードモナス (Pseudomonas 属、 シュドンマ (Psedozyma) 属、 ノ ラ コッカス （Paracoccus) 属、 ペトロミセス （Petromyc) 属、 ロ ドトルラ （R odoto rula) 属、 ロドスポリジゥム (Rhodosporidium) 属、 リゾモナス （Rhizomonas) 属、 ロドビゥム （Rhodobimn) 属、 ロドプラネス （Rhodoplanes) 属、 ロドシユー ドモナス （Rhodopseudomonas) 属、 ロ ドパクター （Rhodobacter) 属、 スポロボ 口ミセス （Sporobolomyces) 属、 スポリジォポラス （Sporidiobolus) 属、 サイ ト エラ （Saitoella) 属、 シゾサッカロミセス （Schizosaccharomyces) 属、 スフイン ゴモナス （Sphingomonas) 属、 スポトリクム （Sporotrichum) 属、 シンポジォミ コプシス （Sympodiomycopsis) 属、 ステリグマトスポリジゥム （Sterigmatosporid ium) 属、 タファリナ （Tapharina) 属、 トレメラ （Tremella) 属、 トリコスポロ ン (Trichosporon) 属ヽ チレチアリア (Tilletiaria) 属、 チレチア (Tilletia) 属、 トリポスポリゥム （Tolyposporium) 属、 チレチォプシス （Tilletiopsis) 属、 ウス チラゴ （Ustilago) 属、 ゥデニォミセス （Udeniomyce) 属、 キサントフイロミセ ス （Xanthophllomyces) 属、 キサントバクテリゥム (Xanthobacter) 属、 ぺキロマ イセス （Paecilomyces) 属、 アクレモニゥム （Acremonium) 属、 ハイホモナス ( Hy omonus) 属、 リゾビゥム （Rhizobium) 属等の微生物を挙げることができる。 培養の容易さや生産性の観点からは、 細菌 （好ましくは非光合成細菌） 及び酵 母が好ましく、 例えば、 細菌ではァグロバクテリゥム （Agrobacterium) 属、 グ ルコノバクタ一 （Gluconobacter) 属等が、 酵母ではシゾサッカロミセス （Schizo saccharomyces) 属、 サイ トエラ （Saitoella) 属等が挙げられる。
好ましい種としては、 例えば、 ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス （Agr obacterium tumefacience IF013263) 、 ァグロパクテリゥム ' ラジオパクター (A grobacterium radiobacter ATCC4718) 、 ァスペルギルス ·クラバータス （Aspergi llus clavatus JCM1718) 、 ァセトパクター ·キシリヌム （Acetobacter xylinum I F015237) 、 アミノバクタ一 'ァガノウェンシス （Aminobacter aganouensis JC M7854) 、 ァグロモナス 'オリゴトロフイカ （Agromonas oligotrophica JCM149 4) 、 ァシドフィラス 'ムルチボルム （Acidiphilium multivorum JCM8867) 、 プ レロミセス · ァノレバス （Bulleromyces albus IF01192) 、 ブレラ · ァノレメニカ （ Bullera armeniaca IFO10112) 、 ブレブンジモナス ·ジミヌタ （Brevundimonas d iminuta JCM2788) 、 クリプトコッカス ' ラウレンティー (Cryptococcus laurenti i IFO0609) 、 キオノスファエラ 'アポバシジアリス （Chionosphaera apobasidiali s CBS7430) 、 カンジタ ■クルバータ （Candida curvata ATCC10567) 、 セリノ ステルス 'ルテオアルバス （Cerinosterus luteoalbus JCM2923) 、 ェキソフィァ ラ ，アルカロフイラ （Exisophiala alcalophila JCM12519) 、 ェキソバシジゥム■ グラシル (Exobasidium gracile IF07788) 、 フイロミセス -フゾェンシス （Fello myces fiizhouensis IFO10374) 、 フイロバシジエラ 'ネオフォスレマス （Filobasidi ella neoformans CBS132) 、 フイロバシジゥム 'カプスロイゲヌム （Filobasidiu m capsuloigenum CBS 1906) 、 ゲォトリカム '力ピタウム （Geotrichum capitatu m JCM6258) 、 グラフィオラ 'シリンドリカム （Graphiola cylindrica IF06426 ) 、 グノレコノバクタ一 ' スポキシダンス （Gluconobacter suboxydans IF03257) 、 コッコバエラ ■ィムペラタエ （Kockovaella imperatae JCM7826) 、 タノレツマノ ミセス 'ネクタイレイ （Kurtzmanomyces nectairei IFO10118) 、 ララリア 'セラ シ （Lalaria cerasi CBS275.28) 、 ロイコスポリジゥム■スコティー （Leucospori dium scottii IF01212) 、 レギオネラ 'ァニーサ （Legionella anisa JCM7573) 、 メチロバクテリゥム .ェキトルダエンス （Methylobacterium extorguens JCM2802 ) 、 ミコプラナ · ラモーサ （Mycoplana ramosa JCM7822J 、 ス ースポリジゥム 'マルガリチフェルム （Oosporidium margaritiferum CBS2531) 、 シユードモナ ス 'デニトリフイカンス （Pseudomonas denitrificans IAM 12023) 、 シユードモ ナス ·シノレキリェンシス (Pseudomonas shuylkilliensis IAM 1092) 、 シュドジ マ ■ァフィジス （Psedozyma aphidis CBS517.23) 、 パラコッカス ·デニトリフ イカンス （Paracoccus denitrificans JCM6892) 、 ペトロミセス ·アリアセウス （ Petromyces alliaceus IF07538) 、 ロドトノレラ ■グノレティニス （Rhodotorala glutin is IF01125) 、 口 ドトノレラ ' ミヌタ （Rhodotomla minuta IFO0387) 、 口 ドスポ リジゥム 'ジォポバツム （Rhodosporidium diobovatum ATCC1830) 、 リゾモナ ス · スベリファシエンス （R izomonas suberifaciens IF015212) 、 ロ ドビゥム ' オリエンッ （Rhodobium orients JC 9337) 、 ロドプラネス 'エレガンス （Mod oplanes elegans JCM9224) 、 π ド、シュ^ド、モナス ■ノヽ0ノレトリス (R odopseudomo W 03
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nas palustris JCM2524) 、 口ドパクター -カプスレータス （R odobacter ca sulat us SB 1003) 、 スポロポロミセス ' ホルサティカス （Sporobolomyces holsaticus I FO1034) 、 スポロポロミセス 'パラロセウス （Sporobolomyces pararoseus IFO0 471) 、 スポリジォポラス ·ジョンソニー (Sporidiobolus johnsonii IFO1840) 、 サイ トエラ · コンプリカタ （Saitoella complicata IFO10748) 、 シゾサッカロミ セス ·ポンぺ (Schizosaccharomyces pombe IFO0347) 、 スフインゴモナス ·ノ ラパゥシモビリス （Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100) 、 スポトリクム 'セノレロフイリゥム （Sporotrichum cellulophilium ATCC20493) 、 シンポジォミ コプシス .パフィオペジリ （Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318) 、 ステ リグマトスポリジゥム 'ポリモノレファ （Sterigmatosporidium polymorphum IFO10 121) 、 スフインゴモナス ■アドへシバ （Sphingomonas adhesiva JCM7370) 、 タファリナ '力エルレスセンス （Tapharina caerulescens CBS351.35) 、 トレメラ -メセンテリ力 （Tremella mesenterica ATCC24438) 、 トリコスポロン -クタネ ゥム （Trichosporon cutaneum IF01198) 、 チレチアリア -ァノマラ （Tilletiaria a nomala CBS436.72) 、 チレチア，カリェス （Tilletia caries JCM1761) 、 トリポ スポリゥム 'ブラタム （Tolyposporium bullatum JCM2006) 、 チレチォプシス - ヮシントネシス （Tilletiopsis washintonesis CBS544) 、 ウスチラゴ 'エスクレン タ （Ustilago esculenta IF09887) 、 ゥデュオミセス ■ メガロスポラス （Udeniom yces megalosporus JCM5269) 、 キサントフイロミセス 'デンドロロウス （Xanth ophllomyces dendrorhous IFO10129) 、 キサントバクテリゥム ·フラブス （Xanth .obacter flavus JCM1204) 、 ぺキロマイセス■ リアシヌス （Paecilomyces lilacinu s ATCC10114) 、 ァクレモニゥム ·クリソゲナム （Acremonium chrysogenum A TCC11550) 、 ハイホモナス · ヒシアナ （Hyphomonas hirschiana ATCC33886) 、 リゾビゥム ' メロッティ （Rhizobium meliloti ATCC9930) 等が挙げられる。 還元型補酵素 Q 1 0生産性微生物としては、 上記微生物の野生株のみならず、 例えば、 上記の微生物の還元型補酵素 Qェ。生合成に関与する遺伝子の転写及び 翻訳活性、 或いは発現蛋白質の酵素活性を、 改変或いは改良した微生物も好まし く使用することができる。
遺伝子の転写及ぴ翻訳活性、 或いは発現蛋白質の酵素活性を、 改変或いは改良 する手段としては、 遺伝子組換え （自己遺伝子の改良、 増幅、 破壌や、 外来遺伝 子の導入及び該遺伝子の改良、 増幅を含む） や、 変異原による変異誘発が挙げら れるが、 変異原による変異誘発が好ましい。
本発明に使用しうる、 より好ましい微生物は、 上記改変或いは改良した微生物、 好ましくは変異原により変異処理した微生物を、 前記 殖方法並びに測定方法に より評価した場合に、 還元型補酵素 Qェ。が全補酵素 Q i。のうち 7 0モル％以上、 好ましくは 7 5モル％以上、 より好ましくは 8 0モル0 /0以上、 さらに好ましくは 8 5モル。 /0以上、 特に好ましくは 9 0モル％以上の含量を示す微生物である。 ェ 業規模での発酵生産においては、 さらに、 培地当たりの還元型補酵素 。の生 産能力として、 1 g Zm L以上、 好ましくは 2 μ g Zm L以上、 より好ましく は 3 /z g Zm L以上、 さらに好ましくは 5 μ g Zm L以上、 特に好ましくは 1 0 β g /m L以上、 特により好ましくは 1 5 μ g Zm L、 最も好ましくは 2 0 g /m L以上の生産能力を有する微生物を用いるのが良い。
変異誘発は単一の変異誘発として行うことができるが、 2回以上の変異誘発を 行うのが好ましい。 各変異誘発段階により還元型捕酵素 Q 1 0を生産する能力が 改良されうることが見出されたからである。 変異誘発処理にかけられる微生物細 胞の候捕としては、 通常は、 前記増殖方法並びに測定方法により評価した場合に できるだけ高い還元型補酵素 Q i。生産能力を有するものが好ましいことは言う までもない。
変異誘発処理は、 任意の適当な変異原を用いて行うことができる。 「変異原」 なる語は、 広義の意味において、 例えば変異誘発効果を有する薬剤のみならず、 U V照射のような変異誘発効果を有する処理も含む。 適当な変異原の例として、 ェチルメタンスルホネート、 U V照射、 N—メチルー N' —ニトロ一 N—二トロ ソグァニジン、 プロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及ぴァクリジン 類等が挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
常用の変異誘発技法に従えば、 変異誘発に続き、 高い還元型補酵素 。生産 能力を有する微生物細胞の適切な選択を行う。 このためには、 単一コロニーから 作られた培養物の評価を、 例えば、 前記増殖方法並びに測定方法を用いて行うこ とである。 還元型補酵素 Q 1 0の結晶は白色の固層又は無色の液相を形成するた め、 コロニーの選別時には、 前記測定法により還元型補酵素 Q 1 Q生産能力の評 価を好適に行うことができる。
本発明の方法において、 工業的規模での発酵生産における還元型補酵素 Q 1 0 の高い生産性は、 部分的には、 前記の還元型補酵素 。を全補酵素 。のうち 7 0モル％以上の比率で含有する微生物細胞の使用により得られ、 また、 部分的 には、 以下に記載される培地当たりの還元型補酵素 Q 1 0の生産能力を高めるた めの好適な培養 （発酵） 条件の使用により得られる。 そして特に、 上記の好適な 微生物細胞の使用と以下の好適な培養 （発酵） 条件の使用とを組み合わせるのが 好ましい。
培養は、 通常、 微生物の増殖に適した多量栄養素や微量栄養素を含んでなる培 地中で行われる。 上記栄養素は、 例えば、 炭素源 （例えば、 グルコース、 シユー クロース、 マルトース、 デンプン、 コーンシロップ、 糖蜜等の炭水化物；メタノ ール、 エタノール等のアルコール等） 、 窒素源 (例えば、 コーンスチープリカー、 硫酸アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 水酸化アンモニゥム、 尿素、 ペプトン 等） 、 リン源 （例えば、 リン酸アンモ-ゥム、 リン酸等） 、 並びに、 微量栄養素 (例えば、 マグネシウム、 カリウム、 亜鉛、 銅、 鉄、 マンガン、 モリブデン、 硫 酸、 塩酸等のミネラル； ビォチン、 デスチオビォチン、 ビタミン B 1等のビタミ ン類；ァラニン、 ヒスチジン等のアミノ酸；酵母エキスやマルトエキス等のビタ ミン類を含有する天然原料等） からなるが、 これらに制限されるものではなく、 一般的に使用されるものを用いることができる。 なお、 酵母エキス等の天然培地 成分中には、 リン酸塩等のリン源も含まれる。 また、 上記の栄養素は、 適宜、 組 み合わせて用いられる。
培養の温度は、 通常、 1 5〜4 5 °C、 好ましくは 2 0〜3 7 °Cで行われる。 1 5 °C未満では、 工業生産のために許容されるには微生物の増殖速度が低くなる傾 向があり、 4 5 °Cを越える高温では、 微生物の生存が傷害され易い傾向にある。 培養の: Hは、 通常 ：〜 9、 好ましくは 5〜8である。 ； H 3以下及ぴ、 p H 1 0以上では微生物の増殖が阻害され易い傾向がある。
工業規模での発酵生産においては、 微生物の種類にもよる力 培養中、 炭素源 (生成したアルコールも含む） の濃度を、 還元型補酵素 Q 1 0生産能力に実質的 に悪影響を及ぼさない濃度に制御するのが好ましい。 よって、 培養液中の炭素源 の濃度が、 還元型補酵素 。生産能力に実質的に悪影響を及ぼさない濃度、 つ まり、 通常 2 0 g Z L以下、 好ましくは 5 g / L以下、 より好ましくは 2 g /L 以下となるように、 培養を制御するのが好ましい。
炭素源の濃度制御のためには、 流加培養法を採用するのが好ましい。 p H、 溶 存酸素濃度 （D O) 或いは残糖濃度等の培養管理指標に基づき、 栄養源 （特に炭 素源） の供給を調節することにより、 培養液中の炭素源濃度を制御することがで きる。 栄養源の供給は、 微生物の種類にもよるが、 培養の当初から開始しても良 いし、 培養途中から開始してもよい。 栄養源の供給は、 連続的であっても良いし、 断続的であってもよい。 なお、 栄養源の供給にあたっては、 上記炭素源を他の成 分から'分離して （別に） 培地に供給するのが好ましい。
培養は、 所望の還元型補酵素 Q i。の生産量に達した時点で終了することがで きる。 培養時間は特に制限されないが、 通常、 2 0〜2 0 0時間である。
上記の培養は、 通常、 好気的に行われる。 ここで、 「好気的」 なる語は、 培養 中に酸素の制限 （酸素の欠乏） が生じないように酸素の供給が行われることを意 味し、 好ましくは、 培養中に酸素の制限が実質的に生じないように酸素の供給が 充分に行われることを意味する。 培養は、 通常は通気下、 好ましくは通気攪拌下 に行われる。
上記のような微生物、 並びに培養条件を用いることにより、 還元型補酵素 。を全捕酵素 Q i。のうち 7 0モル％以上、 好ましくは 7 5モル％以上の比率で含 有する微生物細胞を得ることができる。 また、 還元型補酵素 。の生産量も、 1 g /m L以上、 好ましくは 2 μ g /m L以上、 さらに好ましくは 3 g /m L以上という高い値が得られる。
次に、 上記培養により生産された還元型補酵素 。の回収について説明する。 本発明において、 工業的規模での還元型補酵素 。の効率的な製造は、 部分 的には、 上記の好適な培養によって可能となり、 また、 部分的には、 以下の還元 型捕酵素 Q i 0の好適な回収操作によって可能となる。
還元型補酵素 Q i 0の回収は、 上記培養で得られた微生物細胞からの有機溶剤 を用いる抽出により行われる。 抽出に際しては、 所望により前記細胞を破砕することができる。 細胞の破砕は、 細胞中に生産■蓄積された還元型捕酵素 Q 1 0の効率的な抽出に寄与する。 言う までもなく、 細胞の破砕と抽出とを同時に行っても良い。
なお、 本発明の 「破砕」 においては、 還元型補酵素 。の抽出が可能となる 程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよく、 必ずしも微生物細胞が破れる 或いは断片化される必要はない。
また、 上記の細胞破碎処理は、 細菌では必ずしも必要ではない場合もある。 し かし、 酵母ゃカビでは、 通常、 細胞破砕処理は必要であり、 細胞が破砕されてい ない場合、 細胞中に生産■蓄積された還元型捕酵素 。は効率的に回収されに くくなる。
上記微生物細胞の破碎は、 以下の 1つ又は幾つかの破碎方法を任意の順序で行 うことにより行われる。 破砕方法としては、 例えば、 物理的処理、 化学的処理、 酵素的処理の他、 加熱処理、 自己消化、 浸透圧溶解、 原形質溶解等を挙げること ができる。
上記物理的処理としては、 例えば、 高圧ホモジナイザー、 超音波ホモジナイザ 一、 フレンチプレス、 ポールミル等の使用、 或いは、 これらの組み合わせを挙げ ることができる。
上記化学的処理としては、 例えば、 塩酸、 硫酸等の酸 （好ましくは強酸） を用 いる処理、 水酸化ナトリゥムゃ水酸化力リゥム等の塩基 （好ましくは強塩基） を 用いる処理等や、 これらの組み合わせを挙げることができる。
上記酵素的処理としては、 例えば、 リゾチーム、 ザィモリアーゼ、 ダルカナー ゼ、 ノポザィム、 プロテアーゼ、 セルラーゼ等を用いる方法を挙げることができ、 適宜これらを組み合わせて用いても良い。
上記加熱処理としては、 例えば、 6 0〜 1 0 0 °Cで 3 0分〜 3時間程度の処理 を挙げることができる。
上記自己消化としては、 例えば、 酢酸ェチル等の溶媒による処理を挙げること ができる。
また、 細胞内の塩濃度と異なる溶液により細胞を処理することにより細胞が破 壌される浸透圧溶解や原形質溶解は、 本方法単独では破碎効果が不十分な場合が W
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多く、 上記物理的処理、 化学的処理、 酵素的処理、 加熱処理、 自己消化等と合わ せて用いられることが多い。
還元型補酵素 。の抽出 ·回収の前処理としての細胞破砕方法としては、 上 記破 方法の中でも、 物理的処理、 化学的処理 （特に酸処理、 好ましくは強酸 （ 例えば、 水溶液中における p K aが 2 . 5以下の酸） により後述するような還元 型補酵素 Q 1 0が酸化反応から防護された条件下での酸処理） や加熱処理が好ま しく、 破砕効率の点から物理的処理がより好ましい。
従来の細胞破砕並びに補酵素 。の抽出方法、 具体的には、 水酸化ナトリウ ム及びピロガロールの存在下に有機溶剤で抽出する方法は、 コスト、 廃棄物処理、 廃微生物 （廃菌体） 有効利用 （タンパク質の回収等） 時の安全性等の面で問題が あった。 しカゝし、 本発明における細胞破碎方法、 とりわけ物理的処理法は、 中和 により多量の塩を副生することがなく、 廃棄物処理のみならず廃微生物 （廃菌体 ) の有効利用の面からも好適な方法である。
上記の細胞破砕に用いる微生物細胞の形態は、 培養液、 培養液を濃縮したもの、 培養液から微生物細胞を湿菌体として採取したもの、 これらを洗浄したもの、 湿 菌体を溶剤 （例えば、 水、 生理食塩水、 緩衝液等も含む） に懸濁したもの、 前記 の湿菌体を乾燥させた乾燥菌体、 乾燥菌体を溶剤 （例えば、 水、 生理食塩水、 緩 衝液等も含む） に懸濁したもの等であってよいが、 好ましくは敷生物細胞の水性 懸濁液であり、 操作性等の面から、 より好ましくは、 培養液、 培養液を濃縮した ものや、 これらを洗浄したものである。
還元型補酵素 。の抽出 ·回収に用いる前記微生物細胞又は該細胞破砕物の 形態も、 上記と同様、 特に制限されず、 微生物細胞又は該細胞破碎物の湿菌体ゃ 乾燥菌体であってもよいが、 好ましくは、 微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸 濁液であり、 より好ましくは、 培養液、 培養液を濃縮及びノ又は洗浄したものや、 これらの破砕液 （いずれも水性懸濁液） である。
上記の微生物細胞又は該細胞破碎物の懸濁液における菌体濃度は、 特に制限さ れず、 乾燥重量で通常 1〜 2 5重量％にて行いうるが、 経済的には 1 0〜 2 0重 量％であるのが好ましい。
このようにして得られる前記微生物細胞及び該細胞破碎物を、 有機溶剤を用い る抽出に付すことによって、 還元型補酵素 Q i 0を回収することができる。
抽出に用いる有機溶剤としては、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 アルコール類、 脂肪酸類、 ケトン類、 窒素化合物類 （二トリル類、 アミド類を含 む） 、 硫黄化合物類等を挙げることができる。
特に、 還元型補酵素 Q 。の抽出に際しては、 分子酸素による酸化から防護す る観点から、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類、 及び、 二トリル類の うちの少なくとも一種を抽出溶媒として用いるのが好ましく、 なかでも、 炭化水 素類、 脂肪酸エステル類が好ましく、 炭化水素類が最も好ましい。
工業的規模での製造においては、 酸素の完全な除去は極めて難しく、 さらに個 々の操作に要する時間はラボスケールでの製造とは異なりかなり長時間になるた めに、 残存する酸素が大きな悪影響を及ぼす。 上記酸化は還元型補酵素 。か らの酸化型捕酵素 。の副生に直結する。 従って、 還元型補酵素 。の抽出に おける上記酸化防護効果の高い有機溶剤 （炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エー テル類、 二トリル類等） の使用は、 効率的な抽出を助成する。
炭化水素類としては、 特に制限されないが、 例えば、 脂肪族炭化水素、 芳香族 炭化水素、 ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。 脂肪族炭化水素、 芳香 族炭化水素が好ましく、 脂肪族炭化水素がより好ましい。
脂肪族炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 一般に、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 3〜 2 0、 好ましくは炭素数 5〜1 2、 より好ましくは炭素数 5〜 8のものが用 いられる。 具体例としては、 例えば、 プロパン、 ブタン、 イソブタン、 ペンタン、 2—メチ^/ブタン、 へキサン、 2—メチノレペンタン、 2， 2—ジメチルブタン、 2 , 3—ジメチルブタン、 ヘプタン、 ヘプタン異性体 （例えば、 2—メチルへキ サン、 3―メチ /レへキサン、 2， 3—ジメチノレペンタン、 2， 4ージメチノレペン タン） 、 オクタン、 2， 2， 3—トリメチルペンタン、 イソオクタン、 ノナン、 2 , 2， 5—トリメチルへキサン、 デカン、 ドデカン、 2—ペンテン、 1—へキ セン、 1一ヘプテン、 1ーォクテン、 1一ノネン、 1ーデセン、 シクロペンタン、 メチノレシクロペンタン、 シクロへキサン、 メチノレシクロへキサン、 ェチノレシクロ へキサン、 p—メンタン、 シクロへキセン等を挙げることができる。 好ましくは、 ペンタン、 2—メチノレブタン、 へキサン、 2—メチ/レペンタン、 2 , 2—ジメチ ノレブタン、 2， 3—ジメチルブタン、 ヘプタン、 ヘプタン異性体 (例えば、 2— メチノレへキサン、 3—メチノレへキサン、 2， 3—ジメチノレペンタン、 2， 4ージ メチルペンタン） 、 オクタン、 2， 2 , 3—トリメチルペンタン、 イソオクタン、 ノナン、 2 , 2 , 5—トリメチルへキサン、 デカン、 ドデカン、 シクロペンタン、 メチノレシクロペンタン、 シクロへキサン、 メチノレシク口へキサン、 ェチノレシクロ へキサン、 p—メンタン等である。 より好ましくは、 ペンタン、 2—メチルプタ ン、 へキサン、 2—メチ /レペンタン、 2， 2—ジメチノレブタン、 2， 3—ジメチ ルブタン、 ヘプタン、 ヘプタン異性体 （例えば、 2—メチルへキサン、 3—メチ ルへキサン、 2， 3—ジメチノレペンタン、 2， 4一ジメチルペンタン） 、 ォクタ ン、 2 , 2， 3—トリメチルペンタン、 イソオクタン、 シクロペンタン、 メチノレ シクロペンタン、 シクロへキサン、 メチノレシクロへキサン、 ェチノレシクロへキサ ン等である。
一般に、 ヘプタン類、 ヘプタンはもちろん、 炭素数 7を有するメチルシクロへ キサン等の異種ヘプタンやそれらの複数混合物が好ましく用いられる。 さらに好 ましくは、 炭素数 5のペンタン類 （例えば、 ペンタン等） 、 炭素数 6のへキサン 類 （例えば、 へキサン、 シクロへキサン等） 、 炭素数 7のヘプタン類 （例えば、 ヘプタン、 メチルシクロへキサン等） 等である。 特に好ましくは、 上記酸化から の防護効果が特に高いという点から、 ヘプタン類 （例えば、 ヘプタン、 メチルシ クロへキサン等） 等であり、 最も好ましくはヘプタンである。
芳香族炭化水素としては、 特に制限されないが、 通常、 炭素数 6〜2 0、 好ま しくは炭素数 6〜1 2、 より好ましくは炭素数 7〜1 0のものが用いられる。 具 体例としては、 例えば、 ベンゼン、 トノレェン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キ シレン、 p—キシレン、 ェチノレベンゼン、 クメン、 メシチレン、 テトラリン、 プ チノレベンゼン、 ： —シメン、 シクロへキシ /レベンゼン、 ジェチノレベンゼン、 ペン チルベンゼン、 ジペンチノレベンゼン、 ドデシノレベンゼン、 スチレン等を挙げるこ とができる。 好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシレン、 ρ—キシレン、 ェチノレベンゼン、 タメン、 メシチレン、 テトラリン、 ブチノレベン ゼン、 j)ーシメン、 シクロへキシノレべンゼン、 ジェチノレベンゼン、 ペンチノレベン ゼン等である。 より好ましくは、 トルエン、 キシレン、 o—キシレン、 m—キシ レン、 p—キシレン、 クメン、 テトラリン等である。 最も好ましくは、 クメンで ある。
ハロゲン化炭化水素としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問 わず、 特に制限されないが、 一般に、 非環状のものが好ましく用いられる。 より 好ましくは塩素化炭化水素、 フッ素化炭化水素であり、 さらに好ましくは塩素化 炭化水素である。 また、 炭素数 1 〜 6、 好ましくは炭素数 1 〜 4、 より好ましく は炭素数 1 〜 2のものが好適に用いられる。 具体例としては、 例えば、 ジクロロ メタン、 クロ口ホルム、 四塩化炭素、 1 ， 1ージクロロェタン、 1 ， 2—ジクロ ロェタン、 1 ， 1 , 1一トリクロロェタン、 1 ， 1 ， 2—トリクロロェタン、 1 , 1 , 1 ， 2—テトラクロロェタン、 1 ， 1 , 2 ， 2—テトラクロロェタン、 ペン' タクロロエタン、 へキサクロロェタン、 1 ， 1ージク口口エチレン、 1 , 2—ジ クロ口エチレン、 トリクロロエチレン、 テトラクロロエチレン、 1 , 2—ジクロ 口プロノヽ0ン、 1 ， 2 , 3—トリクロ口プロノヽ0ン、 クロ口ベンゼン， 1 , 1 , 1 ， 2—テトラフルォ口エタン等を挙げることができる。 好ましくは、 ジクロロメタ ン、 クロ口ホルム、 四塩ィ匕炭素、 1 , 1ージクロロェタン、 1 , 2—ジクロロェ タン、 1 , 1 , 1一トリクロロェタン、 1， 1， 2—トリクロロェタン、 1， 1 ージクロ口エチレン、 1 , 2—ジクロ口エチレン、 トリクロロエチレン、 クロ口 ベンゼン、 1 , 1， 1， 2—テトラフルォロェタン等である。 より好ましくは、 ジクロロメタン、 クロロホノレム、 1， 2—ジクロ口エチレン、 トリクロロェチレ ン、 クロ口ベンゼン、 1 , 1 , 1 ， 2ーテトラフルォロェタン等である。
脂肪酸エステル類としては、 特に制限されないが、 例えば、 プロピオン酸エス テル、 酢酸エステル、 ギ酸エステル等を挙げることができる。 好ましくは、 酢酸 エステル、 ギ酸エステルであり、 より好ましくは酢酸エステルである。 エステル 基としては、 特に制限されないが、 通常、 炭素数 1 〜 8のアルキルエステル、 炭 素数 7 〜 1 2のァラルキルエステルが、 好ましくは炭素数 1 〜 6のアルキルエス テルが、 より好ましくは炭素数 1 〜 4のアルキルエステルが用いられる。
プロピオン酸エステルの具体例としては、 例えば、 プロピオン酸メチル、 プロ ピオン酸ェチル、 プロピオン酸ブチル、 プロピオン酸イソペンチル等を挙げるこ とができる。 好ましくはプロピオン酸ェチル等である。
酢酸エステルの具体例としては、 例えば、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロ ピル、 酢酸イソプロピル、 酢酸ブチル、 酢酸イソプチル、 酢酸 s e c一プチル、 酢酸ペンチル、 酢酸イソペンチノレ、 酢酸 s e c 一へキシル、 酢酸シクロへキシノレ、 酢酸べンジル等を挙げることができる。 好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢酸ィソプロピル、 酢酸プチル、 酢酸ィソブチル、 酢酸 s e c— ブチル、 酢酸ペンチル、 酢酸イソペンチル、 酢酸 s e c一へキシル、 酢酸シクロ へキシル等である。 より好ましくは、 酢酸メチル、 酢酸ェチル、 酢酸プロピル、 酢酸イソプロピル、 酢酸プチル、 酢酸イソブチル等であり、 最も好ましくは、 酢 酸ェチルである。
ギ酸エステルの具体例としては、 例えば、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロ ピル、 ギ酸イソプロピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸イソプチル、 ギ酸 s e c—ブチル、 ギ酸ペンチル等を挙げることができる。 好ましくは、 ギ酸メチル、 ギ酸ェチル、 ギ酸プロピル、 ギ酸ブチル、 ギ酸イソプチル、 ギ酸ペンチル等である。 最も好ま しくは、 ギ酸ェチルである。
エーテル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特 に制限されないが、 一般に、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 3 〜2 0、 好ましくは炭素数 4〜1 2、 より好ましくは炭素数 4〜8のものが用い られる。 具体例としては、 例えば、 ジェチルエーテル、 メチル t e r t一ブチル エーテル、 ジプロピルエーテル、 ジイソプロピルエーテノレ、 ジブチノレエーテノレ、 ジへキシルエ一テ /レ、 ェチルビニルエーテル、 プチルビ二ノレエーテル、 ァエソー ノレ、 フエネ ト一ノレ、 プチノレフエニノレエーテノレ、 メ トキシ トルエン、 ジォキサン、 フラン、 2—メチルフラン、 テ トラヒ ドロフラン、 テトラヒ ドロピラン、 ェチレ ングリコーノレジメチルエーテノレ、 エチレングリコールジェチノレエーテノレ、 ェチレ ングリコーノレジブチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノメチゾレエーテ /レ、 ェチ レングリコーノレモノエチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノプチノレエーテノレ等 を挙げることができる。 好ましくは、 ジェチルエーテル、 メチル t e r tーブチ ノレエーテル、 ジプロピノレエーテノレ、 ジィソプロピルエーテノレ、 ジブチノレエーテノレ、 ジへキシルエーテノレ、 ァ-ソ一ノレ、 フエネトール、 ブチノレフェニルエーテノレ、 メ トキシトルエン、 ジォキサン、 2—メチルフラン、 テトラヒドロフラン、 テトラ ヒドロピラン、 エチレングリコーノレジメチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレジェ チノレエーテノレ、 エチレングリコールジブチルエーテノレ、 エチレングリコーノレモノ メチノレエーテノレ、 エチレングリコーノレモノェチ ^ ^エーテ^/等である。 より好まし くは、 ジェチノレエ一テル、 メチノレ t e r t—プチノレエーテノレ、 ァニソ一ノレ、 ジォ キサン、 テトラヒドロフラン、 エチレングリコーノレモノメチノレエーテノレ、 ェチレ ングリコールモノェチルエーテル等である。 さらに好ましくは、 ジェチルエーテ ル、 メチル t e r t—プチルエーテル、 ァニソール等であり、 最も好ましくは、 メチノレ t e r t一プチ/レエーテノレである。
' ァ コール類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特に制限されないが、 一般に、 飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 1〜 2 0、 好ましくは炭素数 1〜1 2、 より好ましくは炭素数 1〜 6である。 な かでも、 炭素数 1〜5の 1価アルコール、 炭素数 2〜 5の 2価アルコール、 炭素 数 3の 3価アルコールが好ましい。
これらアルコ一/レ類の具体例としては、 例えば、 メタノール、 エタノール、 1 -プロパノール、 2—プロパノ一ル、 1ープタノ一ノレ、 2—ブタノ一ノレ、 イソプ チノレアノレコ'一ノレ、 t e r t—ブチノレアノレコーノレ、 1—ペンタノ一-ノレ、 2—ペンタ ノーノレ、 3一ペンタノ一ノレ、 2—メチルー 1一プタノール、 イソペンチノレアノレコ 一ノレ、 t e r t一ペンチノレアノレコーノレ、 3—メチノレー 2—ブタノール、 ネオペン チノレアノレコーノレ、 1—へキサノーノレ、 2—メチノレー 1一ペンタノ一ノレ、 4ーメチ ルー 2—ペンタノール、 2—ェチル一 1ープタノ一ノレ、 1—ヘプタノ一ノレ、 2一 ヘプタノ一ノレ、 3—ヘプタノ一ノレ、 1ーォクタノーノレ、 2—ォクタノー/レ、 2一 ェチノレー 1一へキサノーノレ、 1ーノナノ一ノレ、 1ーデカノーノレ、 1一ゥンデカノ 一/レ、 1一ドデカノール、 ァリノレアノレコーノレ、 プロパルギルァノレコーノレ、 ベンジ ルァノレコーノレ、 シク口へキサノーノレ、 1—メチ /レシクロへキサノー/レ、 2—メチ /レシクロへキサノール、 3—メチノレシクロへキサノーノレ、 4ーメチノレシクロへキ サノール等の 1価アルコール； 1 , 2—エタンジオール、 1， 2—プロパンジォ 一ノレ、 1 , 3一プロパンジォーノレ、 1 , 2—ブタンジォ一ノレ、 1 , 3—ブタンジ ォーノレ、 1， 4一ブタンジォーノレ、 2 , 3—ブタンジォーノレ、 . 1， 5—ペンタン ジオール等の 2価アルコール；グリセリン等の 3価アルコールを挙げることがで きる。
1価アルコールとしては、 好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1ープロノく ノール、 2—プロパノール、 1ーブタノール、 2—プタノール、 イソブチノレアノレ コール、 t e r t—ブチルアルコール、 1一ペンタノール、 2 --ペンタノ一ノレ、
3—ペンタノール、 2—メチノレー 1ープタノ一ノレ、 イソペンチノレアルコール、 t e r t一ペンチノレアノレコーノレ、 3—メチノレ一 2—ブタノーノレ、 ネオペンチ/レアノレ コーノレ、 1一へキサノーノレ、 2—メチノレー 1一ペンタノ一ノレ、 4—メチノレー 2— ペンタノ一/レ、 2—ェチルー 1ーブタノール、 1一へプタノール、 2—ヘプタノ ール、 3—ヘプタノ一ノレ、 1ーォクタノーノレ、 2—ォクタノーノレ、 2—ェチ /レー 1一へキサノール、 1—ノナノール、 1ーデカノール、 1一ゥンデ力ノール、 ェ
―ドデカノ一ル、 ベンジ /レアノレコール、 シク口へキサノーノレ、 1—メチノレシクロ へキサノーノレ、 2—メチノレシクロへキサノ一ノレ、 3—メチノレシクロへキサノール、 4ーメチルシクロへキサノール等である。 より好ましくは、 メタノール、 ェタノ ール、 1一プロパノール、 2—プロノヽ0ノール、 1ーブタノール、 2—ブタノール、 イソプチノレァノレコーノレ、 t e r t一プチノレアルコール、 1一ペンタノ一/レ、 2― ペンタノ一ノレ、 3一-ペンタノ一ノレ、 2—メチノレー 1ープタノ一ノレ、 イソペンチノレ ァノレコースレ、 t e r t—ペンチノレアノレコーノレ、 3—メチノレー 2—ブタノ一ノレ、 ネ オペンチノレアノレコ一ノレ、 1一へキサノーノレ、 2—メチ /レー 1—ペンタノ一ノレ、 4 ーメチノレ一 2—ペンタノ一ノレ、 2—ェチノレー 1ーブタノ一ノレ、 シクロへキサノー ル等である。 さらに好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノール、 1ーブタノ一ノレ、 2ーブタノール、 ィソブチルァ /レコーノレ、 t e r t一ブチルアルコール、 1一ペンタノ一ノレ、 2—ペンタノール、 3—ペン タノ一ノレ、 2ーメチノレー 1ーブタノ一ノレ、 ィソペンチノレアルコール、 t e r t— ペンチルアルコール、 3—メチル一 2—ブタノール、 ネオペンチルアルコール等 である。 特に好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プ ロパノール、 1ーブタノール、 2—ブタノール、 イソブチルアルコール、 2—メ チルー 1ープタノール、 イソペンチルアルコール等であり、 最も好ましくは、 2 一プロパノールである。 2価アルコールとしては、 1， 2—エタンジオール、 1 , 2—プロパンジォー ル、 1 , 3—プロパンジオール等が好ましく、 1 , 2—エタンジオールが最も好 ましい。 3価アルコールとしては、 グリセリンが好ましい。
脂肪酸類としては、 例えば、 ギ酸、 酢酸、 プロピオン酸等を挙げることができ る。 好ましくは、 ギ酸、 酢酸であり、 最も好ましくは酢酸である。
ケトン類としては、 特に制限されず、 炭素数 3〜 6のものが好適に用いられる。 具体例としては、 例えば、 アセトン、 メチルェチルケトン、 メチルブチルケトン、 メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。 好ましくは、 アセトン、 メチ ルェチルケトンであり、 最も好ましくはァセトンである。
エトリル類としては、 環状、 非環状を問わず、 又、 飽和、 不飽和を問わず、 特 に制限されないが、 一般に飽和のものが好ましく用いられる。 通常、 炭素数 2〜 2 0、 好ましくは炭素数 2〜1 2、 より好ましくは炭素数 2〜8のものが用いら れる。
具体例としては、 例えば、 ァセトニト リル、 プロピオ二トリノレ、 マロノ二トリ ノレ、 プチロニトリノレ、 イソプチロニトリノレ、 スクシノニトリノレ、 バレロェトリノレ、 グノレタロニ ト リ /レ、 へキサン二 ト リノレ、 へプチルシア二 ド、 ォクチルシア二 ド、 ゥンデカン二トリル、 ドデカン二トリル、 トリデカン二トリル、 ペンタデカン- トリル、 ステアロニトリノレ、 クロロアセトニトリル、 ブロモアセトニ下リル、 ク ロロプロピオ二 ト リノレ、 ブロモプロピオュ ト リノレ、 メ トキシァセトニ ト リノレ、 シ ァノ酢酸メチル、 シァノ酢酸ェチル、 トル二トリル、 ベンゾ-トリル、 クロ口べ ンゾニトリル、 ブロモベンゾニトリル、 シァノ安息香酸、 ニトロべンゾニトリル、 ァニソ二トリル、 フタロニトリノレ、 ブロモトノレ二トリル、 メチルシアノベンゾェ ート、 メ トキシベンゾニトリル、 ァセチルベンゾニトリル、 ナフトェトリル、 ビ フエニルカルボ二トリル、 フエニルプロピオ二トリル、 フエ二ルブチ口-トリル、 メチルフユ二ルァセトニトリル、 ジフエ二ルァセトニトリル、 ナフチルァセトニ トリノレ、 ニトロフエニノレアセトニトリノレ、 クロ口ペンジノレシアニ ド、 シクロプロ パンカノレポ二トリノレ、 、ンク口へキサンカルボ二トリノレ、 シクロヘプタンカノレポ二 トリノレ、 フエニノレシクロへキサンカノレポ二トリル、 トリルシクロへキサンカルボ 二トリル等を挙げることができる。 好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリノレ、 スクシノニトリル、 プチ口 二トリル、 イソブチ口-トリル、 バレロ二トリル、 シァノ酢酸メチル、 シァノ酢 酸ェチル、 ベンゾニトリル、 トノレニトリル、 クロ口プロピオ二トリルであり、 よ り好ましくは、 ァセトニトリル、 プロピオ二トリル、 プチロニトリル、 イソプチ ロニトリルであり、 最も好ましくは、 ァセト-トリルである。
二トリル類を除く窒素化合物類としては、 例えば、 ホルムアミド、 N—メチル ホルムアミ ド、 N， N—ジメチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリ ドン等のアミ ド類や-トロメタン、 トリェチルァミン、 ピリジ ン等を挙げることができる。
硫黄化合物類としては、 例えば、 ジメチルスルホキシド、 スルホラン等を挙げ ることができる。
上記有機溶剤の中でも、 沸点、 粘性等の性質 （例えば、 溶解度を高めるための 適度な加温ができ、 且つ、 湿体からの溶剤の乾燥除去や晶析濾液等からの溶剤回 収の行いやすい沸点 （1気圧下、 約3 0〜1 5 0 °0 、 室温での取り扱い時及び 室温以下に冷却した時も固化しにくい融点 （約 0 °C以上、 好ましくは約 1 0で以 上、 より好ましくは約 2 0 °C以上） を持ち、 粘性が低い （ 2 0 °Cにおいて約 1 0 以下等） ） を考慮して選定するのが好ましい。
溶剤中での還元型補酵素 。の酸化防護効果は、 還元型補酵素 。の高濃度 溶液において高まる傾向がある。 還元型補酵素 。は、 酸化防護効果の高い上 記有機溶剤 （例えば、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類等） に対して高い溶解性を 示し、 この高い溶解性は、 高濃度溶液での取り扱いを可能とし、 酸化防護を助成 する。 還元型捕酵素 Q 1 0の酸化防護効果のための好ましい抽出時の濃度は、 特 に制限されないが、 上記有機溶剤に対する還元型補酵素 Q 1 0の濃度として、 通 常 0 . 0 0 1重量％以上、 好ましくは 0 . 0 1重量％以上、 より好ましくは 0 . 1重量％以上である。 上限は特に制限されないが、 通常 1 0重量％以下である。 上記有機溶剤のうち、 微生物細胞又は該細胞破砕物の湿菌体ゃ乾燥菌体から、 還元型捕酵素 Q 1 0を抽出■回収するには、 親水性有機溶剤を用いるのが好まし い。 具体的には、 アセトン、 ァセトニトリル、 メタノール、 エタノール、 1—プ ロパノール、 2—プロパノール等を挙げることができる。 また、 上記有機溶剤のうち、 微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液から、 還元型捕酵素 Q 1 0を抽出■回収するには、 疎水性有機溶剤を用いるのが好まし く、 これは微生物由来の水溶性物質の除去を助成する。 疎水性有機溶剤の多くは、 先述の酸化防護効果の高い有機溶剤であり、 極めて好都合である。
また、 疎水性有機溶剤としては、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類、 エーテル類 が好ましい。
ところで、 上記抽出操作において、 微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液、 特に該細胞破砕物の水性懸濁液、 とりわけ物理的処理による該細胞破砕物の水性 懸濁液から有機溶剤を用いて抽出する場合、 一部タンパク質等の細胞成分の存在 によりェマルジヨンが形成されやすく、 相分離が困難になり易い傾向があるので、 上記ェマルジヨンの形成を抑制して、 効率よく抽出することが重要となる。
そのためには、 抽出溶剤として、 上記疎水性有機溶剤に加えて、 補助的溶剤と して親水性有機溶剤を併用するのが好ましい。
この場合、 疎水性有機溶剤としては、 特に制限されず、 上述のものを使用でき るが、 好ましくは炭化水素類、 より好ましくは脂肪族炭化水素である。 脂肪族炭 化水素のなかでも、 炭秦数 5〜8のものが好適に用いられる。
上記炭素数 5〜 8の脂肪族炭化水素の具体例としては、 例えば、 ペンタン、 2 一メチ/レブタン、 へキサン、 2—メチノレペンタン、 2， 2—ジメチノレブタン、 2， 3—ジメチルブタン、 ヘプタン、 ヘプタン異性体 （例えば、 2—メチルへキサン、 3—メチルへキサン、 2， 3—ジメチノレペンタン、 2 ' 4一ジメチノレペンタン） 、 オクタン、 2 , 2， 3—トリメチノレペンタン、 イソオクタン、 シクロペンタン、 メチノレシクロペンタン、 シクロへキサン、 メチ /レシクロへキサン、 ェチノレシクロ へキサン等を挙げることができる。 特に好ましくは、 へキサン、 ヘプタン、 メチ ルシクロへキサンであり、 最も好ましくは、 へキサン、 ヘプタンである。
上記の疎水性有機溶剤と組み合わせて用いられる親水性有機溶剤としては、 特 に制限されず、 上述のものを使用しうるが、 好ましくは、 アルコール類である。 アルコール類のなかでも、 炭素数 1〜5の 1価アルコールが好適に用いられる。 これらの具体例としては、 例えば、 メタノール、 エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノーノレ、 1—ブタノーノレ、 2—プタノ一ノレ、 イソブチノレアノレコーノレ、 t e r t—ブチノレアルコール、 1一ペンタノ一ノレ、 2—ペンタノール、 3—ペン タノール、 2—メチルー 1ープタノール、 イソペンチルアルコール、 t e r t— ペンチノレアノレコーノレ、 3ーメチルー 2—ブタノ一ノレ、 ネオペンチルアルコーノレ等 を挙げることができる。 特に好ましくは、 メタノール、 エタノール、 1一プロパ ノール、 2 _プロパノールであり、 最も好ましくは、 2—プロパノールである。 上記の親水性有機溶剤と疎水性有機溶剤の使用量としては、 特に制限はされな いが、 抽出時の濃度として、 全溶液の容量に対して、 好ましくは親水性有機溶剤 が 5〜 5 0容量％、 疎水性有機溶剤が 2 5〜 6 5容量％の範囲である。
還元型補酵素 。の回収において、 抽出時の温度は、 特に制限されないが、 通常 0〜6 0 °C、 好ましくは 2 0〜5 0 °Cの範囲である。
抽出方法としては、 回分抽出、 連続抽出 （好ましくは、 向流多段抽出） のどち らの方法でも行うことができるが、 連続抽出 （好ましくは、 向流多段抽出） カ、 生産性の面で特に好ましい。 回分抽出における撹拌時間は、 特に制限されないが、 通常 5分以上であり、 連続抽出における平均滞留時間は、 特に制限されないが、 通常 1 0分以上である。
還元型補酵素 。の回収に際しては、 還元型補酵素 。が分解しないように (例えば、 酸化型補酵素 。に酸化されないように） 留意するのが好ましい。 そのためには、 上記の抽出 （細胞破砕も含む） は、 酸性〜弱塩基性条件下、 好ま- しくは酸性〜中性条件下に行うのが好適である。 p Hを指標とする場合は、 接触 時間にもよるが、 p H l 0以下、 好ましくは p H 9以下、 より好ましくは p H 8 以下、 さらに好ましくは p H 7以下である。
以上により、 実質的に酸化反応を防護しうるが、 所望によって、 より厳密には、 還元型補酵素 0が酸化反応から防護された条件下に、 上記の細胞の破砕及ぴ Z又は抽出を行うのが好ましい。 当該条件下に少なくとも上記抽出を行うのがよ り好ましく、 上記破砕及び抽出を行うのがさらに好ましい。
「酸化反応から防護された条件下」 としては、 例えば、 脱酸素雰囲気下 （窒素 ガス、 炭酸ガス、 ヘリウムガス、 アルゴンガス、 水素ガス等の不活性ガス雰囲気 下、 減圧下、 沸 Ji碧下等） ；高塩濃度下、 例えば、 好ましくは水相の塩類 （例えば、 塩化ナトリウム、 硫酸ナトリゥム等の無機塩） の濃度が約 5 %以上である条件下 ；強酸 （例えば、 水溶液中における p K aが 2 . 5以下の酸） 存在下、 例えば、 還元型補酵素 。の 1モルに対して強酸 0 . 1モル％以上が存在する条件下； 酸化防止剤存在下、 例えば、 ァスコルビン酸、 クェン酸、 それらの塩やエステル 類の共存下 （例えば、 還元型捕酵素 。に対して 0 . 1重量％以上） 等を挙げ ることができる。 また、 還元条件下 （酸化型捕酵素 。が還元型捕酵素 Q 1 Qに 変換されうる条件） 、 例えば、 次亜硫酸類等の還元剤との接触も挙げられる。 以上の培養 （発酵） 及び抽出によって、 還元型補酵素 。は、 好適に生産及 び回収される。 好ましくは、 還元型補酵素 。を全補酵素 。のうち 7 0モル %以上、 好ましくは 7 5モル。 /0以上の比率で含有する抽出液を得る。
このようにして得られた還元型補酵素 Q 1 0を含有する抽出液を、 所望により カラムクロマトグラフィー、 還元処理等により精製した後、 晶析操作を用いて、 高純度の還元型補酵素 。結晶を取得することができる。 なお、 この場合も、 一連の操作は、 上述した 「酸化反応から防護された条件下」 に行うのが好ましい。 本発明では、 また、 上記微生物細胞又は該細胞破砕物を酸化処理に付した後に 酸化型補酵素 。を有機溶剤で抽出するか、 或いは、 前記微生物細胞又は該細 胞破砕物から還元型補酵素 Q i。を有機溶剤で抽出し、 必要により精製処理を施 した後、 これを酸化処理に付すことにより、 酸化型補酵素 。を製造すること ができる。
上記酸化は、 例えば、 還元型補酵素 Q 1 Q (好ましくは、 上述した還元型補酵 素 Q i。を含有する微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液や還元型補酵素 Q 1 。の抽出液等） と酸化剤 （例えば、 二酸化マンガン等） を混合し、 例えば、 室温 (例えば、 3 0 °C) で 3 0分以上処理することにより行うことができる。 微生物 細胞又は該細胞破砕物を酸化処理に付した場合は、 酸化型捕酵素 。の抽出操 作を、 上述の還元型捕酵素 Q 1 0の抽出操作と同様に行うことができ、 それによ り酸化型補酵素 。を効率よく回収することができる。 尚、 酸化型補酵素 Q 1 () の回収は、 還元型捕酵素 Q 1 0の回収において推奨される 「酸化反応から防護さ れた条件下」 に行う必要性はなく、 通常の安全操作等を配慮して実施すればよい。 このようにして得られる酸化型捕酵素 Q 。は、 所望によりカラムクロマトグラ フィ一等による精製を施しても良く、 最終的に晶析操作を用いて、 高純度の酸化 型補酵素 Q i。結晶として取得することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 8で用いた向流 3段連続抽出装置の概略図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明は、 これら実 施例に限定されるものではない。
(実施例 1 )
下記表 1〜 3の各種補酵素 。生産性微生物を、 試験管 （内径 2 lmm、 全 長 200mm) を用いて、 10 m Lの培地 [ (グルコース 20 g、 ペプトン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マルトエキス 3 g) ZL、 pH6. 0] 中で 25。C、 72時間 振とう培養 （振幅 2 cm、 310往復ノ分） し、 得られた増殖液を必要に応じ濃 縮し、 窒素雰囲気下、 該増殖液 10容量部に対してイソプロパノール 3容量部及 び n—へキサン 18. 5容量部の共存下に、 ガラスビーズ （425〜 600ミク ロン） 10容量部を用いて、 3分間激しく振とうして細胞の破砕及び抽出を行つ た。 得られたへキサン相を減圧下にエバポレートし （40°C) 、 高速液体クロマ トグラフィー （HPLC) で分析して、 還元型補酵素 Q10比率、 並びに、 還元 型補酵素 Q！。生産量を調べた。
HP L C条件
カラム： YMC— P a c k 4. 6 X 25 Omm (YMC. Co. , L t d. 製
)
移動相： メタノール/ n—へキサン = 85/15
流速： 1 mLZ分
検出： UV 275 nm
結果を表 1〜 3に示す。 なお、 還元型補酵素 。比率とは、 還元型捕酵素 Q10 及び酸化型補酵素 Q1 Qのピークの面積及び両者のモル吸光係数の比 （1 : 7. 5) をもとに、 酸化型補酵素 。と還元型補酵素 。の総和に対する還元型補 酵素 Q i。の割合をモル百分率で表した値を意味する。
Figure imgf000030_0001
2 上段： ja兀型補酵素 Q 1 0比率（％) 菌株名 下段：還元型補酵素 0生産量 ( μ g/ml) クルツマノミセス，ネクタイレイ 1FO 10118 79
(Kurtzmanomyces nectaireu 2
ララリア 'セラシ CBS 275.28 75
(し alar cerasi) 2
ロイコスポリジゥム -スコ亍ィ一 FO 1212 88
(Leucospondium scottn) 6
レギオネラ ·7ニーサ JCM 7573 73
( Legionella snissノ 3
メチロバク亍リウ厶 -ェキトルグエンス JCM 2802 72
( ethvlobactenum extorguens) 2
ミコプラナ ·ラモーサ JGMフ 822 80
(Mvco口 lana ramosa) 2
オースポリジゥ厶 'マルガリチフェルム CBS2531 76
(Oospondium margaritiTerum) 2
シュ一ドモナス ·デニトリフイカンス IAM 12023 85
(Pseudomonas denitrmcans) 8
シユードモナス-シルキリェンシス IAM 1092 84
(Pseudomonas shuvlkilnensis) 6
シュドジマ'ァフィジス GBS 517.23 79
(Psedozvma aphidis) 5
パラコッカス'デニトリフイカンス JCM 6892 83
(Paracoccus denitnficansj 5
ぺ卜ロミセス ·アリアセウス FO 7538 72
(Petromvces alliaceus) 2
ロドトルラ'グル亍イニス IF0 1 125 79
(Rhodotorula elutinis) 7
ロドトルラ'ミヌタ IFO 0387 74
(Rhodotorula minuta) 8
ロドスポリジゥ厶 -ジオボバッ厶 ATGG 1830 86
( Rhodospondium aiobovatum) 4
リゾモナス'スベリファシエンス IFO 15212 82
( Rhizomonas subenfaciensノ 2
ロドビゥム ·オリエンッ JCM 9337 80
(Rnodobium orients) 2
ロドプラネス 'エレガンス JGM9224 74
(Rhodoolanes elegans) 2
ロドシユードモナス-パルトリス JGM2524 90
( odoDseudomonas palustrは 6
ロトハクタ一'カプスレータス SB 1003 95
(Rhodobacter caosulatus) 6
スポロボ口ミセス ·ホルサ亍ィカス 0 1034 72
(c porobolomvces holsaticus) 9
スポロボ口ミセス'パラロセウス IFO 0471 93
( i>poroDoIomvces pararoseus) 8
スポリジオボラス ·ジョンソニー FO 1840 73
(Spondiobolus〖ohnsoniu 7
サイトエラ'コンプリカタ【FO 10748 97
aitoella cornplicata) 9 表 3
Figure imgf000032_0001
(実施例 2 )
口 ド トノレラ ■ グルティエス （Rhodotomla glutinis) IF01125 を培地 （ペプトン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マノレトエキス 3 g、 グノレコース 2 0 g/L、 p H 6. 0 ) で好気的に 2 5 °Cで 4 8時間培養した。 培養後の菌体を遠心分離により集菌し、 N—メチルー N' —二トロー N—二トロソグァ二ジンを 2 0 0 μ g/mLの濃度 になるように添加した p H 7のリン酸緩衝液に懸濁した。 2 5でで 1時間後、 菌 体を 0. 9 %N a C 1溶液で 5回洗浄し、 さらに 0. 9 %N a C 1溶液に再懸濁 した。 この細胞懸濁液を適度に希釈し、 上記培地の寒天プレートにコロニーを形 成させた。 単離した変異株の還元型補酵素 Q i。の生産量及び還元型補酵素 Q x Q の比率を実施例 1と同様にして調べた。 野生株と比較して生産量、 還元型補酵素 Q10の比率が高い株についてはさらに変異操作を繰り返した。 その結果、 1 0 回の変異を繰り返すことにより、 1 5 g/mL以上の生産能を示す変異株を得 た。 なお、 この時の還元型補酵素 。の比率は 8 0モル％以上であった。 (実施例 3 )
サイトエラ ， コンプリカタ （Saitoella complicata) IFO 10748 を培地 （ぺプト ン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マルトエキス 3 g、 グルコース 20 g/L、 p H 6. 0) で好気的に 2 5 °Cで 72時間 1 0 L培養した。 得られた菌体を、 窒素ガスで 密閉したラニー社製圧力式ホモジナイザ一により破砕圧力 8 0 MP aで 2回破碎 し、 菌体破碎液を調製した。 この菌体破碎液からイソプロパノール 30容量部、 へキサン 40容量部の割合で抽出を 3回繰り返すことにより、 抽出液を得た。 抽 出率は 9 9 %であり、 還元型補酵素 。の比率は 9 7モル％であった。
(実施例 4)
口ドトルラ ■グルティニス （Rhodotomla glutinis) IFO 1125 の変異株を培地 1
0 L (ペプトン 1 0 g、 酵母エキス 5 g、 マルトエキス 3 g、 グルコース 20 g /L、 pH6. 0) で 25 °Cで好気的に培養する際に、 48時間後よりダルコ一 スを 4 g Z時間の割合で 9 6時間目までに流カ卩した （流加グルコース量 1 9 0 g ) 。 培地あたりの還元型捕酵素 Q1 Qの生産量は 2 0 g/mL以上であり、 還 元型捕酵素 。の比率は 8 0モル％以上であった。
(実施例 5 )
実施例 3で得られた抽出液をへキサン溶液に置換し、 'シリカゲルを充填した力 ラムに吸着させ、 n—へキサン/ジェチルエーテル （9Z1) 溶液で展開、 溶出 して、 還元型補酵素 。を含む画分を得た。 さらに、 本画分を攪拌しながら 2 QCまで冷却し、 白色のスラリーを得た。 以上すベての操作は窒素雰囲気下で行つ た。 得られたスラリーを減圧ろ過し、 湿結晶を上記展開液で洗浄し （洗净に用い た溶媒の温度は 2 °C) 、 湿結晶を減圧乾燥 （20〜40°C、 1〜30 mmH g ) することにより、 白色の乾燥結晶 81 m gを得た。 得られた結晶の純度は 99. 9%、 還元型補酵素 。の比率は 90モル％であった。
(実施例 6 )
実施例 3で得られた抽出液を n—へキサンに置換し、 二酸化マンガンを 5 Om g加え、 30 °Cで 30分間攪拌した。 この反応液を分取し、 実施例 5と同様にし て精製すると高純度の酸化型補酵素 Q 。が 74 m g得られた。
(実施例 7)
サイトエラ ' コンプリカタ （Saitoella complicata) IFO 10748 を培地 （ぺプト ン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マゾレトエキス 3 g、 グ /レコース 20 g/L、 ρ H 6. 0) で 25°C、 72時間好気的に 50 OmL培養した。 得られた菌体を、 窒素ガ スで密閉したラエー社製圧力式ホモジナイザ一により破碎圧力 80MP aで 2回 破碎し、 菌体破砕液を調製した。 石皮砕液中の還元型補酵素 。の割合は、 酸化 型も含めた全補酵素 。に対し、 97%であった。 この菌体破砕液 20 OmL に対し、 イソプロパノール及び n—へキサンを、 下記表 4中の 1回目抽出の欄で 示す比率で、 溶剤量の合計が 500 m Lとなるよう混合し、 温度 40 °Cで 30分 間攪拌し、 第 1回目の抽出操作を行った。 抽出終了後、 10分間静置し、 分離し た上層を分離した。 このときのトータル液量に対する下層 （残渣） の容量比を、 分離性の指標とし、 界面位置として表 4中に示した。
さらに、 第 2回目の抽出を行うため、 残渣層の溶剤濃度を測定して、 全体の溶 剤比が表 4中の 2回目の欄で示す比率になるよう、 イソプロパノールとへキサン を追加し、 温度 40°Cで 30分間攪拌した。 次いで、 10分間静置し、 上記と同 様に上層を分離し、 残渣層の溶剤濃度を測定して、 全体の溶剤比が表 4中の 3回 目の欄で示す比率になるよう、 イソプロパノールとへキサンを追加し、 温度 25 °Cで 3 0分間攪拌し、 第 3回目の抽出操作とした。
第 1回、 第 2回、 第 3回のそれぞれの段階で分離された上層中に含まれる還元 型捕酵素 Q i。の量の、 抽出操作を行う前の菌体破砕液又は抽出残渣中に含まれ る還元型補酵素 Qェ Qの量に対する比を、 それぞれの段階での還元型補酵素 Q x。 の抽出率とし、 その計算結果を表 4中に示した。 また、 第 2回、 第 3回通算での 補酵素 。の抽出率も示した。 いずれの段階においても、 静置分離性は良好で あり、 3回の抽出を行った場合の通算抽出率は 9 0 %以上と、 高い回収率を示し た。 特に、 イソプロパノール濃度を 3 0 %以上とした場合は、 9 9 °/0以上の高い 回収率となった。
表 4
Figure imgf000035_0001
(実施例 8 )
サイトエラ ·コンプリカタ （Saitoella complicata) IFO 10748 を培地 （ぺプト ン 5 g、 酵母エキス 3 g、 マ/レトエキス 3 g、 グ /レコース 20 g/L、 p H 6. 0) で 25°C、 72時間好気的に 750 L培養した。 得られた菌体を、 窒素ガス で密閉したラニー社製圧力式ホモジナイザーにより破碎圧力 140MP aで 2回 破 し、 菌体破碎液を調製した。 この菌体破砕液を、 図 1に示す向流 3段連続抽 出装置にて連続抽出を行った。 攪搾槽の容量は 630 L、 静置分離槽の容量は 2 00 Lとした。 微生物菌体破砕液を第 1段攪拌槽へ、 ィソプロパノールと n—へ キサンを各段へ供給した。 菌体破砕液の供給液量は 2 L/分、 イソプロパノール 及び n—へキサンの供給量は、 各段への供給量を合計した総量として、 イソプロ パノール 1. 3 L/分、 η—へキサン 3. 7LZ分とした。 ただし、 この際、 各 段の溶剤濃度は、 イソプロパノール濃度 5〜50 vZv%、 n—へキサン濃度 2 5〜 65 Vノ V %の範囲となるように適宜調整した。 抽出は温度 40 °Cで、 処理 時間は 6時間とした。 6時間目の時点での、 3段目の静置分離槽の抽出残渣中に 残る還元型補酵素 Q1Qの量より、 菌体破碎液から抽出された還元型補酵素 Q10 の回収率を計算したところ、 98. 9%となった。 また、 全運転期間を通じ、 静 置分離は良好に行われ、 安定した抽出の連続操作が可能であった。 産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、 微生物の培養、 還元型補酵素 。の回収という非常 に簡便な操作によって、 還元型補酵素 Q α Qを工業的規模で安価に製造すること ができ、 また、 酸化型補酵素 Q10についても、 簡便な操作により製造すること ができる。

Claims

請求の範囲
1. 下記式 （I)
Figure imgf000037_0001
で表される還元型捕酵素 。の製造方法であって、 炭素源、 窒素源、 リン源及 ぴ微量栄養素を含んでなる培地中で、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養す ることによって、 還元型補酵素 。を全補酵素 。のうち 70モル％以上の比 率で含有する微生物細胞を得、 必要に応じて該微生物細胞を破砕し、 生産された 還元型補酵素 Q 1。を有機溶剤で抽出することを特徴とする還元型補酵素 Q i。の 製造方法。
2. 還元型補酵素 Q x Qを全補酵素 Q i Qのうち 70モル。/。以上の比率で含有す る抽出液を得る請求の範囲第 1項記載の製造方法。
3. 培養終了時の還元型補酵素 。生産量が 1 μ g/tnL以上である請求の 範囲第 1項又は 2項記載の製造方法。
4. 培養は、 15〜45°C、 且つ、 pH4〜9で行われる請求の範囲第 1〜3 項のいずれかに記載の製造方法。
5. 培養中、 炭素源の濃度を、 還元型補酵素 。の生産能力に実質的に悪影 響を及ぼさない濃度に制御する請求の範囲第 1〜 4項のいずれかに記載の製造方 法。
6 . 培養は、 流加培養法により行われる請求の範囲第 5項記載の製造方法。
7 · 炭素源を他の成分とは別に培地に供給する請求の範囲第 6項記載の製造方 法。
8 . 培養は、 好気的に行われる請求の範囲第 1〜 7項のいずれかに記載の製造 方法。
9 . 抽出に際して、 微生物細胞を破砕する請求の範囲第 1〜 8項のいずれかに 記載の製造方法。
1 0 . 細胞の破砕は、 物理的処理、 化学的処理、 酵素的処理、 加熱処理、 自己 消化、 浸透圧溶解、 又は、 原形質溶解により行われる請求の範囲第 9項記載の製 造方法。
1 1 . 細胞の破砕は、 物理的処理、 強酸を用いる酸処理、 又は、 加熱処理によ り行われる請求の範囲第 9項記載の製造方法。
1 2 . 細胞の破碎は、 物理的処理により行われる請求の範囲第 9項記載の製造 方法。
1 3 . 物理的処理は、 高圧ホモジナイザー、 超音波ホモジナイザー、 フレンチ プレス又はボールミルにより行われる請求の範囲第 1 2項記載の製造方法。
1 4 . 細胞の破砕は、 酸性〜弱塩基性条件下に行われる請求の範囲第 9〜 1 3 項のいずれかに記載の製造方法。
1 5 . 還元型補酵素 。の抽出に用いる有機溶剤として、 炭化水素類、 脂肪 酸エステル類、 エーテル類及び二トリル類のうちの少なくとも一種を用いる請求 の範囲第 1〜 1 4項のいずれかに記載の製造方法。
1 6 . 還元型補酵素 Q , 0の抽出は、 微生物細胞又は該細胞破碎物の湿菌体又 は乾燥菌体から、 親水性有機溶剤を用いて行われる請求の範囲第 1〜1 4項のい ずれかに記載の製造方法。
1 7 - 親水性有機溶剤は、 アセトン、 ァセトニトリル、 メタノール、 エタノー ノレ、 1一プロパノール又は 2—プロパノールである請求の範囲第 1 6項記載の製 造方法。
1 8 . 還元型補酵素 。の抽出は、 微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁 液から、 疎水性有機溶剤を用いて行われる請求の範囲第 1〜 1 5項のいずれかに 記載の製造方法。
1 9 . 疎水性有機溶剤は、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類又はエーテル類であ る請求の範囲第 1 8項記載の製造方法。
2 0 . 疎水性有機溶剤に加えて、 補助的溶剤として親水性有機溶剤を併用する 請求の範囲第 1 8項又は 1 9項記載の製造方法。
2 1 . 疎水性有機溶剤は、 炭化水素類であり、 親水性有機溶剤は、 アルコール 類である請求の範囲第 2 0項記載の製造方法。
2 2 . 疎水性有機溶剤は、 脂肪族炭化水素であり、 親水性有機溶剤は、 炭素数 1 ~ 5の 1価アルコールである請求の範囲第 2 0項記載の製造方法。
2 3 . 疎水性有機溶剤は、 へキサン及ぴヘプタンの少なくとも一種であり、 親 水性有機溶剤は、 メタノール、 エタノ^ "ル、 1一プロパノール及ぴ 2—プロパノ ールの少なく とも一種である請求の範囲第 2 0項記載の製造方法。
24. 抽出は、 疎水性有機溶剤が 25〜 65容量％及び親水性有機溶剤 5〜 5 0容量％の条件で行われる請求の範囲第 20〜23項のいずれかに記載の製造方 法。
25. 抽出は、 連続抽出により行われる請求の範囲第 1 8〜 24項のいずれか に記載の製造方法。
26. 抽出は、 酸性〜弱塩基性条件下に行われる請求の範囲第 1〜 25項のい ずれかに記載の製造 法。
27. 細胞の破碎及び/又は抽出は、 還元型補酵素 Q ,。が酸化反応から防護 された条件下に行われる請求の範囲第 1〜26項のいずれかに記載の製造方法。
28. 酸化反応から防護された条件下は、 脱酸素雰囲気下、 高塩濃度下、 強酸 存在下、 酸化防止剤存在下、 又は、 還元条件下である請求の範囲第 27項記載の 製造方法。
29. 還元型補酵素 Q！。生産性微生物は、 試験管 （内径 2 1 mm, 全長 20 Omm) を用いて、 10mLの培地 [ (グルコース 20 g、 ペプトン 5 g、 酵母 エキス 3 g、 マルトエキス 3 g) /L、 p H6. 0] 中で 25。C、 72時間振と う培養 （振幅 2 cm、 3 10往復/分） し、 得られた増殖液を必要に応じ濃縮し、 窒素雰囲気下、 該増殖液 10容量部に対してイソプロパノール 3容量部及び n— へキサン 18. 5容量部の共存下に、 ガラスビーズ （425〜 600ミクロン） 10容量部を用いて、 3分間激しく振とうして破砕することにより調製した疎水 性有機溶剤相 （n—へキサン相） について HP LCにより測定した場合に、 還元 型補酵素 。を全補酵素 。のうち 70モル。 /。以上の比率で含有するものであ る請求の範囲第 1〜 28項のいずれかに記載の製造方法。
3 0 . 還元型捕酵素 。生産性微生物は、 請求の範囲第 2 9項に記載の条件 で H JP L Cにより測定した場合に、 培地当たりの還元型補酵素 Qェ。の生産能力 として 1 g Zm L以上を示すものである請求の範囲第 2 9項記載の製造方法。
3 1 . 微生物が、 ァグロパクテリゥム （Agrobacterimn) 属、 ァスペルギルス (Aspergillus) 属、 ァセトパクター (Acetobacter) 属、 アミノノ クタ一 (Aminob acter) 属、 ァグロモナス （Agromonas) 属、 ァシドフィラス （Acidiphilium) 属、 プレロミセス （Bulleromyces) 属、 ブレラ （Bullera) 属、 ブレブンジモナス （Bre vundimonas) 属、 クリプトコッカス （Cryptococcus) 属、 キオノスファエラ （Chi onosphaera) 属、 カンジタ （Candida) 属、 セリノステノレス （Cerinosterus) 属、 ェ キソフィアラ （Exisophiala) 属、 ェキソバシジゥム （Exobasidium) 属、 ブイ口 ミセス （Fellomyces) 属、 フイロバシジエラ （Filobasidiella) 厲、 フイロバシジ ゥム （Filobasidium) 属、 ゲォトリカム （Geotrichum) 属、 グラフィオラ （Graphi ola) 属、 グノレコノバクタ一 (Gluconobacter) 属、 コッコノ ェラ (Kockovaella) 属、 クノレツマノミセス （Kurtzmanomyces) 属、 ララリア （Lalaria) 属、 ロイコス ポリジゥム （Leucosporidium) 属、 レギオネラ （Legionella) 属、 メチロバクテリ ゥム （Methylobacterium) 属、 ミコプラナ （Mycoplana) 属、 オースポリジゥム （ OosDondium) 属、 ンユートモ： rス (Pseudomonas) 属、 シュトシマ (Psedozyma ) 属、 ノ ラコッカス （Paracoccus) 属、 ペトロミセス （Petromyc) 属、 ロ ドトル ラ （Rhodotorula) 属、 ロドスポリジゥム （R odosporidium) 属、 リゾモナス （Rh izomonas) 属、 ロドビゥム （R odobium) 属、 ロ ドプラネス （Rhodoplanes) 属、 ロドシユードモナス (Rhodopseudomonas) 属、 ロドバタター (Rhodobacter) 属、 スポロボ口ミセス （Sporobolomyces) 属、 スポリジオボラス （Sporidiobolus) 属、 サイ トエラ （Saitoella) 属、 シゾサッカロミセス （Schizosaccharomyces) 属、 ス フィンゴモナス （Sphingomonas) 属、 スポトリクム （Sporotrichum) 属、 シンポ ジォミコプシス （Sympodiomycopsis) 属、 ステリグマトスポリジゥム （Sterigmat osporidium) 属、 タファリナ （Tapharirm) 属、 トレメラ （Tremella) 属、 トリコ スポロン （Trichosporon) 属、 チレチアリア （Tilletiaria) 属、 チレチア （Tilletia ) 属、 トリポスポリゥム （Tolyposporium) 属、 チレチォプシス （Tilletiopsis) 属、 ウスチラゴ （Ustilago) 属、 ゥデニォミセス （Udeniomyce) 属、 キサントフイロ ミセス （Xanthop llomyces) 属、 キサントバクテリゥム （Xanthobacter) 属、 ぺキ ロマイセス (Paecikmiyces) 属、 アクレモニゥム (Acremonium) 属、 ハイホモナ ス （Hyhomonus) 属、 又は、 リゾビゥム （R izobium) 属の微生物である請求の
.〜 3 0項のいずれかに記載の製造方法。
3 2 . 得られた還元型補酵素 Q 1 0を、 所望により精製した後、 晶析を行って、 還元型補酵素 Qュ。結晶を得る請求の範囲第 1〜 3 1項のいずれかに記載の製造 方法。
3 3 . 下記式 （II) ；
Figure imgf000042_0001
で表される酸化型捕酵素 。の製造方法であって、 炭素源、 窒素源、 リン源及 び微量栄養素を含んでなる培地中で、 還元型補酵素 。生産性微生物を培養す ることによって、 還元型補酵素 Q 1。を全補酵素 Q i。のうち 7 0モル％以上の比 率で含有する微生物細胞を得、 必要に応じて該微生物細胞を破碎し、 生産された 還元型補酵素 Q i 0を酸化して酸化型補酵素 Q τ。に変換した後にこれを有機溶剤 で抽出するか、 或いは、 生産された還元型補酵素 。を有機溶剤で抽出し、 必 要により精製処理を施した後に、 還元型補酵素 Q 1 0を酸化して酸化型捕酵素 Q 1 。に変換することを特徴とする酸化型補酵素 Q！ 0の製造方法。
3 4 . 培養終了時の還元型捕酵素 。生産量が 1 a g Zm L以上である請求 の範囲第 3 3項記載の製造方法。
35. 培養は、 15〜45°C、 且つ、 pH4〜 9で行われる請求の範囲第 33 項又は 34項に記載の製造方法。
36. 培養中、 炭素源の濃度を還元型補酵素 Q1Qの生産能力に実質的に悪影 響を及ぼさない濃度に制御する請求の範囲第 33〜35項のいずれかに記載の製 造方法。
37. 培養は、 流加培養法により行われる請求の範囲第 36項記載の製造方法。
38. 炭素源を他の成分とは別に培地に供給する請求の範囲第 37項記載の製 造方法。
39. 培養は、 好気的に行われる請求の範囲第 33〜 38項のいずれかに記载 の製造方法。
40. 抽出に際して、 微生物細胞を破砕する請求の範囲第 33〜39項のいず れかに記載の製造方法。
41. 細胞の破砕は、 物理的処理、 化学的処理、 酵素的処理、 加熱処理、 自己 消化、 浸透圧溶解、 又は、 原形質溶解により行われる請求の範囲第 40項記載の 製造方法。
42. 細胞の破碎は、 物理的処理により行われる請求の範囲第 41項記載の製 造方法。
43. 物理的処理は、 高圧ホモジナイザー、 超音波ホモジナイザー、 フレンチ プレス又はボールミルにより行われる請求の範囲第 42項記載の製造方法。
44. 補酵素 Qェ。の抽出は、 微生物細胞又は該細胞破碎物の湿菌体又は乾燥 菌体から、 親水性有機溶剤を用いて行われる請求の範囲第 3 3〜4 3項のいずれ かに記載の製造方法。
4 5 . 親水や生有機溶剤は、 ァセトン、 ァセトニトリル、 メタノール、 エタノー ル、 1—プロパノール又は 2—プロパノールである請求の範囲第 4 4項記載の製 造方法。
4 6 . 補酵素 Q 。の抽出は、 微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液から、 疎水性有機溶剤を用いて行われる請求の範囲第 3 3〜 4 3項のいずれかに記載の 製造方法。
4 7 . 疎水性有機溶剤は、 炭化水素類、 脂肪酸エステル類又はエーテル類であ る請求の範囲第 4 6項記載の製造方法。
4 8 . 疎水性有機溶剤に加えて、 補助的溶剤として親水性有機溶剤を併用する 請求の範囲第 4 6項又は 4 7項記載の製造方法。
4 9 . 疎水性有機溶剤は、 炭化水素類であり、 親水性有機溶剤は、 アルコール 類である請求の範囲第 4 8項記載の製造方法。
5 0 . 疎水性有機溶剤は、 脂肪族炭化水素であり、 親水性有機溶剤は、 炭素数 1〜5の 1価アルコールである請求の範囲第 4 8項記載の製造方法。
5 1 . 疎水性有機溶剤は、 へキサン及びへプタンの少なくとも一種であり、 親 水性有機溶剤は、 メタノール、 ェタノール、 1—プロパノール、 2—プロパノー ルの少なくとも一種である請求の範囲第 4 8項記載の製造方法。
5 2 . 抽出は、 疎水性有機溶剤が 2 5〜 6 5容量％及び親水性有機溶剤 5〜 5 0容量％の条件で行われる請求の範囲第 4 8〜5 1項のいずれかに記載の製造方 法。
53. 抽出は、 連続抽出により行われる請求の範囲第 46〜52項のいずれか に記載の製造方法。
54. 還元型補酵素 Q！。生産性微生物は、 試験管 （内径 21 mm、 全長 20 Oram) を用いて、 10：111^の培地 [ (グルコース 20 g、 ペプトン 5 g、 酵母 エキス 3 g、 マルトエキス 3 g) ノし、 H6. 0] 中で 25。C、 72時間振と う培養 （振幅 2 cm、 310往復 Z分） し、 得られた增殖液を必要に応じ濃縮し、 窒素雰囲気下、 該増殖液 10容量部に対してイソプロパノール 3容量部及び n— へキサン 1 8. 5容量部の共存下に、 ガラスビーズ （425〜 600ミクロン） 10容量部を用いて、 3分間激しく振とうして破砕することにより調製した疎水 性有機溶剤相 （n—へキサン相） について HP LCにより測定した場合に、 還元 型捕酵素 。を全捕酵素 。のうち 70モル％以上の比率で含有するものであ る請求の範囲第 33〜 53項のいずれかに記載の製造方法。
55. 還元型捕酵素 。生産性微生物は、 請求の範囲第 54項に記載の条件 で HP LCにより測定した場合に、 培地当たりの還元型補酵素 。の生産能力 として 1 gZmL以上を示すものである請求の範囲第 54項記載の製造方法。
56. ¾生物が、 ァグロパクテリゥム （Agrobacterium) 属、 アスペ^^ギルス (Aspergillus) 属、 ァセトパクター (Acetobacter) 属、 アミノバクタ一 (Aminob acter) 厲、 ァグロモナス （Agromonas) 属、 ァシドフィラス （Acidiphilium) 属、 ブレロミセス （Bulleromyces) 属、 ブレラ （Bullera) 属、 ブレブンジモナス （Bre vundimonas) 属、 クリプトコッカス （Cryptococcus) 属、 キオノスファエラ （Chi onosohaera) 属、 カンジタ (Candida 属、 セリノステノレス (Cerinosterus) 属、 ェ キソフィアラ （Exisophiak) 属、 ェキソパシジゥム （Exobasidium) 属、 フイロ ミセス （Fellomyces) 属、 フイロバシジエラ （Filobasidiella) 属、 フィロバシジ ゥム （Filobasidium) 属、 ゲォトリカム （Geotrichum) 属、 グラフィオラ （Graphi ola) 属、 グノレコノノくクタ '一 (Gluconobacter) 属、 コッコノエラ （Kockovaella) 属、 クルツマノミセス （Kurtzmanomyces) 属、 ララリア （Lalaria) 属、 ロイコス ポリジゥム （Leucosporidium) 属、 レギオネラ （Legionella) 属、 メチロバクテリ ゥム （Methylobacterium) 属、 ミコプラナ （Mycoplana) 属、 オースポリジゥム （ Oosporidium) 、 シュートモフ'ス (Pseudomonas) 属、 シュ トシマ (Psedozyma ) 属、 パラコッカス （Paracoccus) 属、 ペトロミセス （Petromyc) 属、 ロ ドトノレ ラ （Rhodotorula) 属、 ロ ドスポリジゥム （R odosporidium) 属、 リゾモナス （R izomonas) 属、 ロドビゥム （Rhodobium) 属、 ロドプラネス （ hodoplanes) 属、 ロドシユードモナス （Rhodopseudomonas) 属、 ロドパクター (Rhodobacter) 属、 スポロポロミセス （Sporobolomyces) 属、 スポリジォポラス （Sporidiobolus) 属、 サイ トエラ （Saitoella) 属、 シゾサッカロミセス （Schizosaccharomyces) 属、 ス フィンゴモナス （Sphingomonas) 属、 スポトリクム （Sporotrichum) 属、 シンポ ジォミコプシス （Sympodioniycopsis) 属、 ステリグマトスポリジゥム （Sterigmat osporidium) 属、 タファリナ （Tapharina) 属、 トレメラ （Tremdla) 属、 トリコ スポロン （Trichosporon) 属、 チレチアリア （Tilletiaria) 属、 チレチア （Tilletia ) 属、 トリポスポリゥム （Tolyposporium) 属、 チレチォプシス （Tilletiopsis) 属、 ウスチラゴ （Ustilago) 属、 ゥデュオミセス （Udeniomyce) 属、 キサントフイロ ミセス （Xanthophllomyces) 属、 キサントバクテリゥム （Xanthobacter) 属、 ぺキ ロマイセス (Paecilomyces) 属、 アクレモユウム （Acremonium) 属、 ノヽィホモナ ス （Hyhomomis) 属、 又は、 リゾビゥム （R izobium) 属の微生物である請求の 範囲第 3 3〜5 5項のいずれかに記載の製造方法。
5 7 . 得られた酸化型捕酵素 Q 1 0.を、 所望により精製した後、 晶析を行って、 酸化型補酵素 。結晶を得る請求の範囲第 3 3〜5 6項のいずれかに記載の製 造方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004051259A1 (ja) * 2002-12-03 2004-06-17 Shiseido Company, Ltd. コエンザイムｑ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システム
WO2012011589A1 (ja) * 2010-07-22 2012-01-26 株式会社カネカ 脂溶性生理活性物質の製造方法
US8952217B2 (en) 2005-10-14 2015-02-10 Metanomics Gmbh Process for decreasing verbascose in a plant by expression of a chloroplast-targeted fimD protein
JP2016208909A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 株式会社カネカ 脂溶性生理活性物質の製造方法
WO2016208658A1 (ja) * 2015-06-23 2016-12-29 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ１０の製造方法
JPWO2019189290A1 (ja) * 2018-03-28 2021-03-18 株式会社カネカ 補酵素ｑ１０の製造方法

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI305547B (en) 2001-12-27 2009-01-21 Kaneka Corp Processes for producing coenzyme q10
TW200302055A (en) * 2002-01-18 2003-08-01 Kaneka Corp Ubiquinol-enriched fat-containing foods
TW200810776A (en) * 2006-04-28 2008-03-01 Kaneka Corp Purification method of reduced coenzyme Q10
KR101406044B1 (ko) * 2007-06-08 2014-06-12 한국생산기술연구원 감귤박을 탄소원으로 첨가한 배지에서 로도토룰라균의배양을 통한 코엔자임큐텐의 제조방법
JP5364580B2 (ja) * 2007-08-22 2013-12-11 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ１０の製造方法、ならびに、その安定化方法
CN101307338B (zh) * 2008-07-17 2012-04-25 任雷 还原型辅酶q10的制备方法
CN101519681B (zh) * 2009-04-01 2012-11-07 宜都东阳光生化制药有限公司 一种辅酶q10的生产发酵工艺
US20110020312A1 (en) 2009-05-11 2011-01-27 Niven Rajin Narain Methods for treatment of metabolic disorders using epimetabolic shifters, multidimensional intracellular molecules, or environmental influencers
US20110269196A1 (en) * 2010-04-13 2011-11-03 Syracuse University Coenzyme q10 production using sporidiobolus johnsonii
WO2012129072A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Particle Dynamics International, Llc Solid particulate compositions comprising coenzyme q10
CN103608323B (zh) 2011-04-04 2016-08-17 博格有限责任公司 治疗中枢神经系统肿瘤的方法
CN102557912B (zh) * 2011-12-31 2015-01-07 内蒙古金达威药业有限公司 一种辅酶q10提取液的皂化方法
WO2013131068A1 (en) * 2012-03-02 2013-09-06 Berg Pharma, Llc Methods and kits for detection of coenzyme q10
AU2014251045B2 (en) 2013-04-08 2019-06-13 Berg Llc Treatment of cancer using coenzyme Q10 combination therapies
SG11201601583TA (en) 2013-09-04 2016-04-28 Berg Llc Methods of treatment of cancer by continuous infusion of coenzyme q10
CN103819326B (zh) * 2013-12-11 2016-08-17 湖南科源生物制品有限公司 一种从微生物中分离纯化辅酶q10的方法
CN105886562A (zh) * 2016-05-31 2016-08-24 兰州天和生物催化技术有限公司 微生物发酵法制备辅酶q10的方法
WO2018003974A1 (ja) * 2016-07-01 2018-01-04 株式会社カネカ 補酵素ｑ１０の製造方法
CN108048496B (zh) * 2017-12-25 2020-11-10 浙江新和成股份有限公司 氧化型辅酶q10的发酵生产方法、及由其制备而得的高含量氧化型辅酶q10
US10774350B2 (en) 2017-12-25 2020-09-15 Zhejiang Nhu Company Ltd. Method for fermentative production of oxidized coenzyme Q10
US20210238637A1 (en) * 2018-04-27 2021-08-05 Kaneka Corporation Method for producing coenzyme q10
CN108997153B (zh) * 2018-07-25 2021-02-02 中国人民大学 从光合细菌中逐级提取多种高价值物质的方法
CN109055417B (zh) 2018-08-28 2020-07-07 浙江新和成股份有限公司 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
CN109762757B (zh) * 2018-12-25 2020-01-07 神舟生物科技有限责任公司 一种高产辅酶q10类球红细菌及其诱变选育和应用
US11471426B2 (en) 2019-10-16 2022-10-18 American River Nutrition, Llc Compositions comprising quinone and/or quinol and methods of preparations and use thereof
CN112755589B (zh) * 2021-02-23 2022-04-15 山东泰和水处理科技股份有限公司 精制辅酶q10的萃取方法及装置
CN115584357B (zh) * 2022-11-02 2023-10-20 广东润和生物科技有限公司 一种辅酶q10的发酵提取方法

Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS488836B1 (ja) * 1970-03-31 1973-03-17
US3769170A (en) * 1970-03-31 1973-10-30 Ajinomoto Kk Method of producing coenzyme q10 by microorganisms
JPS54110388A (en) * 1978-01-10 1979-08-29 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Microbial preparation of coenzyme q10
JPS54119090A (en) * 1978-03-07 1979-09-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of coenzyme q10 by fermentation
JPS5528A (en) * 1978-05-29 1980-01-05 Hiroshi Aida Preparation of coenzyme q9
JPS5527A (en) * 1978-05-25 1980-01-05 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Microbiological preparation of coenzyme q10
JPS5521756A (en) * 1978-08-04 1980-02-16 Hiroshi Aida Preparation of coenzyme q
JPS5568295A (en) * 1978-11-17 1980-05-22 Godo Shiyusei Kk Production of ubiquinone
US4220719A (en) * 1978-03-20 1980-09-02 Ko Aida Process for the production of Coenzyme Q10
JPS55148084A (en) * 1979-05-08 1980-11-18 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Incubation of microoranism
JPS5655196A (en) * 1979-10-08 1981-05-15 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Method of culturing microorganism
JPS56154994A (en) * 1980-04-30 1981-11-30 Sekisui Chem Co Ltd Preparation of coenzyme q10
JPS56154996A (en) * 1980-05-02 1981-11-30 Sekisui Chem Co Ltd Preparation of coenzyme q10
JPS5733599A (en) * 1980-08-06 1982-02-23 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Production of coenzyme q10
DD236552A1 (de) * 1985-04-26 1986-06-11 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von ubichinon-10
JPH1057072A (ja) * 1996-08-22 1998-03-03 Alpha- Shokuhin Kk ユビキノン−１０の生成方法
EP1123979A1 (en) * 1999-08-24 2001-08-16 Kaneka Corporation Process for producing coenzyme q 10?
WO2002040682A1 (fr) * 2000-11-20 2002-05-23 Kaneka Corporation Procede servant a preparer un coenzyme q¿10?
WO2002052017A1 (fr) * 2000-12-27 2002-07-04 Kaneka Corporation Procede relatif a la production de coenzyme q¿10?
WO2002088365A1 (fr) * 2001-04-25 2002-11-07 Kaneka Corporation Procede de production de coenzyme q¿10?

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB930752A (en) * 1958-12-29 1963-07-10 Merck & Co Inc Preparation of coenzyme q-10
US3066080A (en) 1961-03-22 1962-11-27 Merck & Co Inc Fermentation production of coenzyme q-10
JPS488836Y1 (ja) 1969-11-28 1973-03-08
JPS4825517B1 (ja) * 1970-08-24 1973-07-30
JPS4825517A (ja) 1971-08-04 1973-04-03
JPS5452790A (en) * 1977-10-04 1979-04-25 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Preparation of coenzyme q
JPS593197B2 (ja) 1978-09-25 1984-01-23 十條製紙株式会社 補酵素ｑ↓１↓０の製造法
JPS5771396A (en) * 1980-10-07 1982-05-04 Univ Nagoya Preparation of coenzyme q10
JPS5770834A (en) * 1980-10-17 1982-05-01 Takara Shuzo Co Ltd Preparation of coenzyme q
AR228195A1 (es) * 1981-08-19 1983-01-31 Pfizer Procedimiento microbiologico para la preparacion de hidroquinona
JPS6075294A (ja) * 1984-03-16 1985-04-27 Nisshin Flour Milling Co Ltd 補酵素ｑの製造法
JPS61271994A (ja) * 1985-05-28 1986-12-02 Mitsubishi Gas Chem Co Inc 補酵素ｑ↓１↓０の製造法
JPS6336789A (ja) * 1986-07-29 1988-02-17 Mitsubishi Gas Chem Co Inc 補酵素ｑ↓１↓０の製造法
JPS63317092A (ja) * 1987-06-19 1988-12-26 Mitsubishi Gas Chem Co Inc 補酵素ｑ↓１↓０の製造法
JPS63102691A (ja) 1987-09-11 1988-05-07 Nisshin Flour Milling Co Ltd 補酵素ｑ↓１↓０の製造法
JPH088836B2 (ja) 1991-10-31 1996-01-31 社団法人長野県農村工業研究所 酵素により特性を改変した澱粉粒の利用方法
CA2207093A1 (en) * 1994-12-06 1996-06-13 Ryan Pharmaceuticals, Inc. Water soluble ubiquinone compositions, prodrugs, and methods relating thereto
JP3889481B2 (ja) * 1996-08-16 2007-03-07 株式会社カネカ 医薬組成物
JP3926888B2 (ja) * 1997-05-27 2007-06-06 株式会社カネカ コレステロール低下剤
JPH1156372A (ja) 1997-08-27 1999-03-02 Alpha- Shokuhin Kk ユビキノン−１０の生成方法
DE60038565T2 (de) 1999-10-14 2009-06-10 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Verfahren zur herstellung von ubiquinon-10
JP3742602B2 (ja) * 2001-05-09 2006-02-08 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑの安定な溶液
TW200604159A (en) * 2001-07-13 2006-02-01 Kaneka Corp Method of producing reduced coenzyme Q10 as oily product
TWI237019B (en) * 2001-07-13 2005-08-01 Kaneka Corp Method of producing reduced coenzyme Q10
DE60238056D1 (de) * 2001-07-13 2010-12-02 Kaneka Corp Verfahren zum kristallisieren von reduziertem coenzym q10 aus wässriger lösung
TWI237018B (en) * 2001-07-13 2005-08-01 Kaneka Corp Method of producing reduced coenzyme Q10 crystals
TWI310029B (ja) * 2001-07-13 2009-05-21 Kaneka Corp
TWI235146B (en) * 2001-07-16 2005-07-01 Kaneka Corp Method of stabilizing reduced coenzyme q10 and method of acidic crystallization
JP3822479B2 (ja) * 2001-10-10 2006-09-20 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ水溶液の安定化組成
TWI329510B (en) * 2001-10-10 2010-09-01 Kaneka Corp Method of stabilizing reduced coenzyme q10
TWI305547B (en) * 2001-12-27 2009-01-21 Kaneka Corp Processes for producing coenzyme q10
JP3781118B2 (ja) 2003-03-03 2006-05-31 セイコーエプソン株式会社 配線基板の製造方法

Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS488836B1 (ja) * 1970-03-31 1973-03-17
US3769170A (en) * 1970-03-31 1973-10-30 Ajinomoto Kk Method of producing coenzyme q10 by microorganisms
JPS54110388A (en) * 1978-01-10 1979-08-29 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Microbial preparation of coenzyme q10
JPS54119090A (en) * 1978-03-07 1979-09-14 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of coenzyme q10 by fermentation
US4220719A (en) * 1978-03-20 1980-09-02 Ko Aida Process for the production of Coenzyme Q10
JPS5527A (en) * 1978-05-25 1980-01-05 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd Microbiological preparation of coenzyme q10
JPS5528A (en) * 1978-05-29 1980-01-05 Hiroshi Aida Preparation of coenzyme q9
JPS5521756A (en) * 1978-08-04 1980-02-16 Hiroshi Aida Preparation of coenzyme q
JPS5568295A (en) * 1978-11-17 1980-05-22 Godo Shiyusei Kk Production of ubiquinone
JPS55148084A (en) * 1979-05-08 1980-11-18 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Incubation of microoranism
JPS5655196A (en) * 1979-10-08 1981-05-15 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Method of culturing microorganism
JPS56154994A (en) * 1980-04-30 1981-11-30 Sekisui Chem Co Ltd Preparation of coenzyme q10
JPS56154996A (en) * 1980-05-02 1981-11-30 Sekisui Chem Co Ltd Preparation of coenzyme q10
JPS5733599A (en) * 1980-08-06 1982-02-23 Mitsubishi Gas Chem Co Inc Production of coenzyme q10
DD236552A1 (de) * 1985-04-26 1986-06-11 Akad Wissenschaften Ddr Verfahren zur herstellung von ubichinon-10
JPH1057072A (ja) * 1996-08-22 1998-03-03 Alpha- Shokuhin Kk ユビキノン−１０の生成方法
EP1123979A1 (en) * 1999-08-24 2001-08-16 Kaneka Corporation Process for producing coenzyme q 10?
WO2002040682A1 (fr) * 2000-11-20 2002-05-23 Kaneka Corporation Procede servant a preparer un coenzyme q¿10?
WO2002052017A1 (fr) * 2000-12-27 2002-07-04 Kaneka Corporation Procede relatif a la production de coenzyme q¿10?
WO2002088365A1 (fr) * 2001-04-25 2002-11-07 Kaneka Corporation Procede de production de coenzyme q¿10?

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE MEDLINE [online] KOCHOVA-KRATOCHVILOVA A. ET AL.: "Die beziehungen innerhalb der gattung cryptococcus (sanfelice) vuillemin", XP002967050, Database accession no. 77107492 *
NATORI Y. ET AL.: "Studies in the metabolites produced by facultative methanol oxidizing bacteria. Part I. Production of coenzyme Q10 by pseudomonas N842", AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 42, no. 9, 1978, pages 1799 - 1800, XP002967049 *
NATORI Y. ET AL.: "Studies on metabolites produced by facultative methanol-oxidizing bacteria. Part V. Enhancement of coenzyme Q10 accumulation by mutation and effects of medium components on the formation of coenzyme Q homologs by pseudomonas N842 and mutants", AGRIC. BIOL. CHEM., vol. 45, no. 10, 1981, pages 2175 - 2182, XP002967048 *
OHTA H.: "Agromonas oligotrophica gen. nov., sp. nov., a nitrogen-fixing oligotrophic bacterium", ANTONIE VAN LEEUWENHOEK, vol. 49, no. 4-5, 1983, pages 429 - 446, XP002967042 *
SAKATO K. ET AL.: "Agitation-aeration studies on coenzyme Q-10 production using rhodopseudomonas spheroides", BIOTECHNOL. APPL. BIOCHEM., vol. 16, no. 1, 1992, pages 19 - 28, XP002967047 *
URAKAMI T. ET AL.: "Production of isoprenoid compounds in the faculative methylotroph protomonas extroquens", J. FERMENT. TECHNOL., vol. 66, no. 3, 1988, pages 323 - 332, XP002967045 *
URAKAMI T. ET AL.: "Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll alpha by rhodobacter sphaeroides and rhodobacter sulfidophilus", JOURNAL OF FERMENTATION AND BIOENGINEERING, vol. 76, no. 3, 1993, pages 191 - 194, XP002967044 *
URAKAMI T. ET AL.: "Transfer of pseudomonas-aminovorans den Dooren de Jong 1926 to aminobacter gen. nov. as aminobacter aminovorans comb. nov. and description of aminobacter aganoensis sp. nov. and aminobacter niigataensis sp. nov.", INT. J. SYST. BACTERIOL., vol. 42, no. 1, January 1992 (1992-01-01), pages 84 - 92, XP002967043 *
WAKAO N. ET AL.: "Acidiphilium multivorm sp. nov., an acidophilic chemoorganotrophic bacterium from pyritic acid mine drainage", JOURNAL OF GENERAL AND APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 40, no. 2, 1994, pages 143 - 159, XP002967041 *
YABUUCHI E. ET AL.: "Proposals of sphingomonas paucimobilis gen. nov. and comb. nov., sphingomonas parapaucimobilis sp. nov., sphingomonas yanoikuyae sp. nov., sphingomonas adhaesiva sp. nov., sphingomonas capsulata comb. nov. and two genospecies of the genus sphingomonas", MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 34, no. 2, 1990, pages 99 - 119, XP000901217 *
YAMADA Y. ET AL.: "The coenzyme Q system in strains of trichosporon species and related organisms", JOURNAL OF GENERAL AND APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 28, no. 4, 1982, pages 355 - 358, XP002967046 *
YOSHIDA H. ET AL.: "Production of ubiquinone-10 using bacteria", JOURNAL OF GENERAL AND APPLIED MICROBIOLOGY, vol. 44, no. 1, 1998, pages 19 - 26, XP009003546 *
ZENTRALBLATT FUER BAKTERIOLOGIE, PARASITENKUNDE, INFEKTIONSKRANKHEITEN UND HYGIENE. ZWEITE NATURWISSENSCHAFTLICHE ABT.: ALLGEMEINE, LANDWIRTSCHAFTLICHE UND TECHNISCHE MIKROBIOLOGIE, vol. 131, no. 7, 1976, pages 610 - 631 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004051259A1 (ja) * 2002-12-03 2004-06-17 Shiseido Company, Ltd. コエンザイムｑ−１０およびその２電子還元体の分析方法ならびに分析システム
US7374901B2 (en) 2002-12-03 2008-05-20 Shiseido Company Ltd. Method of analyzing coenzyme Q-10 and two-electron reduction product thereof and analysis system
US8952217B2 (en) 2005-10-14 2015-02-10 Metanomics Gmbh Process for decreasing verbascose in a plant by expression of a chloroplast-targeted fimD protein
WO2012011589A1 (ja) * 2010-07-22 2012-01-26 株式会社カネカ 脂溶性生理活性物質の製造方法
JP5016734B2 (ja) * 2010-07-22 2012-09-05 株式会社カネカ 脂溶性生理活性物質の製造方法
US9006493B2 (en) 2010-07-22 2015-04-14 Kaneka Corporation Method for manufacturing a fat-soluble bioactive substance
JP2016208909A (ja) * 2015-05-08 2016-12-15 株式会社カネカ 脂溶性生理活性物質の製造方法
WO2016208658A1 (ja) * 2015-06-23 2016-12-29 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ１０の製造方法
JPWO2016208658A1 (ja) * 2015-06-23 2018-04-12 株式会社カネカ 還元型補酵素ｑ１０の製造方法
US10239811B2 (en) 2015-06-23 2019-03-26 Kaneka Corporation Process for producing reduced coenzyme Q10
JPWO2019189290A1 (ja) * 2018-03-28 2021-03-18 株式会社カネカ 補酵素ｑ１０の製造方法
JP7421471B2 (ja) 2018-03-28 2024-01-24 株式会社カネカ 補酵素ｑ１０の製造方法

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