KR20040076266A

KR20040076266A - 보효소 ｑ１０의 제조방법

Info

Publication number: KR20040076266A
Application number: KR10-2004-7010068A
Authority: KR
Inventors: 가즈요시 야지마; 다까히사 가또; 아끼히사 간다; 시로 기따무라; 야스요시 우에다
Original assignee: 가네가후치 가가쿠 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2004-08-31
Also published as: JP5788831B2; JP2012157360A; RU2004122912A; US7910340B2; US20110136191A1; JP2014166191A; JP2008253271A; TWI305547B; US9315839B2; CN1608136A; KR100913464B1; TW200900507A; JPWO2003056024A1; AU2002357526A1; EP1466983A4; EP1466983B1; US9926580B2; DE60225478C5; US20080171373A1; JP5074287B2

Abstract

본 발명은 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 필요에 따라 상기 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 회수하는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법이다. 또한, 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄액을 산화시킨 후, 생성된 산화형 보효소 Q₁₀을 회수하거나, 또는 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄액으로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 회수한 후에 산화처리를 하는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법이다. 본 발명의 방법에 의해 환원형 보효소 Q₁₀, 및 산화형 보효소 Q₁₀을 공업적 규모로 간편하게 제조할 수 있다.

Description

보효소 Ｑ１０의 제조방법{PROCESSES FOR PRODUCING COENZYME Q10}

환원형 보효소 Q₁₀(I) 및 산화형 보효소 Q₁₀(II)은, 사람의 생체내의 세포 중에 있어서의 미토콘드리아의 전자전달계 구성인자이며, 산화적 인산화 반응에 있어서의 전자의 운반자로서 작용함으로써 ATP의 생성에 관여하고 있다.

종래부터 산화형 보효소 Q₁₀은 각종 질병에 대해서 뛰어난 약리 및 생리 효과를 나타내는 물질로서 의약품 이외에도 영양보조식품이나 화장품에 사용되는 등 폭넓은 용도로 이용되고 있다.

한편, 환원형 보효소 Q₁₀은 지금까지 그다지 주목받고 있지 않았지만, 최근 여러 가지 용도에 있어서 산화형 보효소 Q₁₀보다도 유효하다는 보고가 되어 왔다.

예를 들면 일본 특허 공개 평10-330251호 공보에는 환원형 보효소 Q₁₀을 유효 성분으로 하는, 뛰어난 콜레스테롤 저하작용을 가지는 항 고콜레스테롤 혈증제,항 고지혈증제 나아가서는 동맥 경화증 치료 및 예방제가 개시되어 있다. 또한, 일본 특허 공개 평10-109933호 공보에는 환원형 보효소 Q₁₀을 함유하는 보효소 Q₁₀을 유효성분으로 하는, 경구흡수성이 뛰어난 의약품 조성물이 개시되어 있다.

또한, 환원형 보효소 Q₁₀은 항 산화제, 라디컬 스캐빈저로서도 유효하고, 알·스토커(R. Stocker) 등은 환원형 보효소 Q₁₀이 인간 LDL의 과산화를 α-토코페롤, 리코펜이나 β-카로틴보다 효율적으로 방지한 것을 보고하고 있다(프로시딩스 오브 더 내셔널 아카데미 오브 사이언스 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America), 88권, 1646-1650페이지, 1991년).

생체내에서 산화형 보효소 Q₁₀과 환원형 보효소 Q₁₀은 어떤 종류의 평형관계에 있고 생체내에 흡수된 산화형 보효소 Q₁₀/환원형 보효소 Q₁₀은 서로 환원/산화되는 것이 알려져 있다.

환원형 보효소 Q₁₀의 제법으로서는 산화형 보효소 Q₁₀의 제법과 마찬가지로 화학 합성법을 생각할 수 있는데, 그 합성 프로세스는 번잡·위험하고, 고비용일 것으로 예상된다. 또한, 화학 합성법의 경우는 안전성이 염려되는 (Z)-이성체의 부생·혼입(바이오메디컬 앤드 클리니컬 애스펙트 오브 코엔자임 Q(Biomedical and clinical aspects of coenzyme Q), 3권, 19항-30항, 1981)를 최소화할 필요도 있을 것이다. 산화형 보효소 Q₁₀은 유럽 약방에 있어서는 (Z)-이성체의 함유량이 0.1%이하가 아니면 안된다고 규정되어 있다.

환원형 보효소 Q₁₀의 다른 제법으로서 미생물 세포를 이용하는 방법, 즉, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 분리·회수하는 방법도 생각할 수 있지만, 상기 미생물 세포에 의해 생산되는 환원형 보효소 Q₁₀은 많은 산화형 보효소 Q₁₀을 포함하고 있고, 기지의 방법을 이용하는 환원형 보효소 Q₁₀의 분리·회수는 비용이 비싸다.

미생물 세포 중에 환원형 보효소 Q₁₀이 존재하는 것을 기재한 것으로서는 예를 들면, 이하의 세균의 예가 알려져 있다.

1)광합성 세균의 배양 균체에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀이 전 보효소 Q₁₀중, 적은 경우에서 5 내지 10중량%, 많은 경우에서 30 내지 60중량% 존재한다고 기재한 예(일본 특허 공개 소57-70834호 공보).

2)슈도모나스속 균체를 수산화 나트륨 및 피로가롤의 존재하에, 유기용제로 가열 추출한 후, 5% 하이드로설파이트 소다수로 처리하고, 다시 탈수농축해서 아세톤 가용부를 채취함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 포함하는 유상물(油狀物)을 취득한 예(일본 특허 공개 소60-75294호 공보).

상기 1) 및 2)는 모두 얻어진 환원형 보효소 Q₁₀과 산화형 보효소 Q₁₀의 혼합물, 또는 환원형 보효소 Q₁₀을 다시 산화시켜서 산화형 보효소 Q₁₀으로 변환시키는것을 목적으로 한 것이며, 환원형 보효소 Q₁₀은 산화형 보효소 Q₁₀제조에 있어서의 중간물질로서 기재되어 있는 것에 지나지 않는다.

상기 1)은 광합성 세균을 이용하고 있어 배양이 번잡한 동시에, 상기 미생물 세포에 있어서는, 환원형 보효소 Q₁₀의 제조를 목적으로 했을 경우, 전 보효소 Q₁₀중의 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 충분하다고는 할 수 없다.

상기 2)는 헥산상 중에 포함되는 산화형 보효소 Q₁₀을 환원제인 하이드로설파이트 소다로 환원형 보효소 Q₁₀으로 변환시키는 조작(일본 특허 공개 소60-75294호 공보의 실시예 3을 참조)을 포함하고 있고, 미생물 세포중의 전 보효소 Q₁₀중의 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 명확하지 않다.

또한, 상기 1) 및 2)에 있어서는, 배양에 있어서의 보효소 Q의 생산량은 기재되어 있지 않다.

이상과 같이 환원형 보효소 Q₁₀을 높은 비율로 함유하는 미생물 세포는 지금까지 보고되어 있지 않고, 더구나 환원형 보효소 Q₁₀을 공업적 규모로 발효생산, 즉, 미생물을 배양해서 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 높은 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 환원형 보효소 Q₁₀을 회수함으로써 고순도의 환원형 보효소 Q₁₀을 얻은 예도 알려져 있지 않다.

이러한 상황에 있어서, 미생물을 배양하여 환원형 보효소 Q₁₀비율이 높은 보효소 Q₁₀을 다량으로 얻는 방법을 찾아낼 수 있으면, 환원형 보효소 Q₁₀의 지극히 유리한 제조법이 될 수 있다.

본 발명은 하기 식 (I)로 나타내어지는 환원형 보효소 Q₁₀, 및 하기 식 (II)로 나타내어지는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법에 관한 것이다.

더욱 자세하게는 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고,필요에 따라 상기 미생물 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 회수하는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법에 관한 것이다.

또한, 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물을 산화처리를 한 후에 산화형 보효소 Q₁₀을 회수하거나, 또는 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 회수한 후에 산화처리를 하는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법에도 관한 것이다.

도 1은 실시예 8에서 이용한 향류 3단 연속 추출장치의 개략도이다.

본 발명의 목적은 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양하여 환원형 보효소 Q₁₀을 높은 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 상기 미생물 세포로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 바람직하게 회수함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 안전하면서도 효율적으로 공업적 규모로 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.

또한, 본 발명의 목적은 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양하여 환원형 보효소 Q₁₀을 높은 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 상기 미생물 세포로부터 얻어진 환원형 보효소 Q₁₀을 산화형 보효소 Q₁₀제조에 있어서의 중간물질로 하고, 이것을 산화시킴으로써 간편한 조작으로 산화형 보효소 Q₁₀을 제조하는 방법을 제공하는 것에도 있다.

다시 말해, 본 발명은 하기 식 (I)로 나타내어지는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법으로서, 탄소원, 질소원, 인원 및 미량 영양소를 포함하는 배지 중에서 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 필요에 따라 상기 미생물 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하는 것을 특징으로 하는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법이다.

<화학식 I>

또한, 본 발명은 하기 식 (II)로 나타내어지는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법으로서, 탄소원, 질소원, 인원 및 미량 영양소를 포함하는 배지 중에서, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 필요에 따라 상기 미생물 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 산화시켜 산화형 보효소 Q₁₀으로 변환시킨 후에 이것을 유기용제로 추출하거나, 또는 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하고, 필요에 따라 정제 처리를 실시한 후에, 환원형 보효소 Q₁₀을 산화시켜 산화형 보효소 Q₁₀으로 변환시키는 것을 특징으로 하는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법이기도 하다.

<화학식 II>

본 발명의 방법에 의하면, 미생물의 배양, 환원형 보효소 Q₁₀의 회수라고 하는 매우 간편한 조작에 의해 환원형 보효소 Q₁₀을 공업적 규모로 염가에 제조할 수 있다. 또한, 산화형 보효소 Q₁₀에 대해서도 간편한 조작에 의해 제조할 수 있다. 또한, 미생물에 의해 생산되는 이들 보효소 Q₁₀은 기본적으로 (Z)-이성체를 포함하지 않고, 고기, 물고기 등에 포함되는 것과 같은 (all-E)-이성체를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 우선, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양하고, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻는다(발효).

전 보효소 Q₁₀중, 상기와 같은 높은 비율로 환원형 보효소 Q₁₀을 함유하는 미생물 세포는 기본적으로 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상의 비율로 생성할 수 있는 미생물을 배양함으로써 얻을 수 있다.

미생물이 전 보효소 Q₁₀중, 어떤 비율로 환원형 보효소 Q₁₀을 생성할 수 있을지는 예를 들면, 시험관(내경 21㎜, 전체 길이 200㎜)을 이용해서 미생물을 10mL의 배지[(글루코오스 20g, 펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g)/L, pH6.0] 중에서 25℃, 72시간 진탕 배양(진폭 2㎝, 310왕복/분)하는 방법에 의해 평가할 수 있다.

공업적 규모에서의 발효생산에 있어서의 바람직한 배양조건에 대해서는 후술하는데, 상기의 배양조건은 미생물이 그 능력으로서 가지는 환원형 보효소 Q₁₀비율을 크게 오류가 없는 범위에서 반영하도록 표준화하기 위한 하나의 방법이다.

상기의 배양조건하, 환원형 보효소 Q₁₀이 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상의 함량을 나타내는 미생물 세포를 본 발명에 이용할 수 있다. 또한, 더욱 바람직하게는 상기의 배양조건하, 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력으로서, 통상 1㎍/mL 이상, 바람직하게는 2㎍/mL 이상의 생산능력을 가지는 미생물을 이용할 수 있다.

여기에서, 상기의 환원형 보효소 Q₁₀함유량, 및 전 보효소 Q₁₀중의 환원형 보효소 Q₁₀비율은 미생물 세포를 물리적으로 파쇄한 후, 유기용매로 추출해서 HPLC 분석을 함으로써 행확인할 수 있다. 구체적으로는 이하의 수순에 따라 측정된다.

1)미생물 증식액을 필요에 따라 농축하고, 해당 증식액 10용량부를 나사구 시험관(내경 16.5㎜, 전체 길이 130㎜)에 옮기고, 유리 비즈(425 내지 600미크론;SIGMA사제) 10용량부를 가한다.

2)질소분위기하, 상기 증식액 10용량부에 대해서 이소프로판올 3용량부 및 n-헥산 18.5용량부를 가한다.

3)질소분위기하, 3분간 격렬하게 진탕함으로써 미생물 세포의 파쇄 및 추출을 행한다.

4)얻어진 소수성 유기용제상(n-헥산상)을 감압하에 에버포레이트(배스 온도:40℃)하고, HPLC에 의해 분석한다.

컬럼:YMC-pack 4.6×250㎜(YMC. CO., Ltd.제)

이동상:메탄올/n-헥산=85/15

유속:1mL/min

검출:UV 275nm

유지시간:환원형 보효소 Q₁₀13.5min

산화형 보효소 Q₁₀22.0min

상기 측정방법은 얻어진 결과가 환원형 보효소 Q₁₀함유량 및 전 보효소 Q₁₀중의 환원형 보효소 Q₁₀비율을 극력 바르게 반영하도록, 또한, 최저한 보증할 수 있는 환원형 보효소 Q₁₀함유량 및 비율을 표준화하기 위해 주어진다. 이 방법은 본 발명자들의 몇 가지 실험에 의해 실시하는 것이 용이하면서도 적절한 방법인 것이 발견된 것이다.

본 발명에서 이용하는 상기 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물로서는 세균,효모, 곰팡이 어느 것이라도 제한없이 사용할 수 있다. 상기 미생물로서는 구체적으로는 예를 들면, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 아세토백터(Acetobacter)속, 아미노백터(Aminobacter)속, 아그로모나스(Agromonas)속, 아시드필라스(Acidiphilium)속, 불레로미세스(Bulleromyces)속, 불레라(Bullera)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 크립토코카스(Cryptoco㏄us)속, 키오노스파에라(Chionosphaera)속, 칸디다(Candida)속, 세리노스테루스(Cerinosterus)속, 엑소피알라(Exisophiala)속, 엑소바시디움(Exobasidium)속, 필로미세스(Fellomyces)속, 필로바시디엘라(Filobasidiella)속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 게오트리컴(Geotrichum)속, 그라피올라(Graphiola)속, 글루코노백터(Gluconobacter)속, 코코바엘라(Kockovaella)속, 쿠르츠마노미세스(Kurtzmanomyces)속, 랄라리아(Lalaria)속, 로이코스포리디움(Leucosporidium)속, 레기오넬라(Legionella)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 미코플라나(Mycoplana)속, 오오스포리디움(Oosporidium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 슈도지마(Psedozyma)속, 파라코카스(Paraco㏄us)속, 페트로미세스(Petromyc)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 리조모나스(Rhizomonas)속, 로도비움(Rhodobium)속, 로도플라네스(Rhodoplanes)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 로도백터(Rhodobacter)속, 스포로볼로미세스(Sporobolomyces)속, 스포리디오볼러스(Sporidiobolus)속, 사이토엘라(Saitoella)속, 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속, 스핀고모나스(Sphingomonas)속, 스포트리쿰(Sporotrichum)속, 심포디오미코프시스(Sympodiomycopsis)속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium)속, 타파리나(Tapharina)속, 트레멜라(Tremella)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 틸레티아리아(Tilletiaria)속, 틸레티아(Tilletia)속, 톨리포스포리움(Tolyposporium)속, 틸레티오프시스(Tilletiopsis)속, 우스틸라고(Ustilago)속, 우데니오미세스(Udeniomyce)속, 크산토필로미세스(Xanthophllomyces)속, 크산토박테리움(Xanthobacter)속, 페킬로마이세스(Paecilomyces)속, 아크레모니움(Acremonium)속, 하이호모나스(Hyhomonus)속, 리조비움(Rhizobium)속 등의 미생물을 들 수 있다.

배양의 용이함이나 생산성의 관점에서는, 세균(바람직하게는 비광합성 세균) 및 효모가 바람직하고, 예를 들면, 세균에서는 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 글루코노백터(Gluconobacter)속 등이, 효모에서는 시조사카로미세스(Schizosa㏄haromyces)속, 사이토엘라(Saitoella)속 등을 들 수 있다.

바람직한 종으로서는 예를 들면, 아그로박테리움·투메파시엔스(Agrobacterium tumefacience IFO13263), 아그로코박테리움·라디오백터(Agrobacterium radiobacter ATCC4718), 아스페르길루스·클라바터스(Aspergillus clavatus JCM1718), 아세토백터·크실리눔(Acetobacterxylinum IFO15237), 아미노백터·아가노우엔시스(Aminobacter aganouensis JCM7854), 아그로모나스·올리고트로피카(Agromonas oligotrophica JCM1494), 아시드필라스·멀티보럼(Acidiphilium multivorum JCM8867), 불레로미세스·알버스(Bulleromyces albus IFO1192), 불레라·아르메니카(Bullera armeniaca IFO10112), 브레분디모나스·디미누타(Brevundimonas diminuta JCM2788), 크립토코카스·라우렌티(Cryptococcus laurentii IFO0609), 키오노스파에라·아포바시디알리스(Chionosphaera apobasidialis CBS7430), 칸디다·쿠르바타(Candida curvata ATCC10567), 세리노스테루스·루테오알바스(Cerinosterus luteoalbus JCM2923), 엑소피알라·알칼로필라(Exisophiala alcalophila TCM12519), 엑소바시디움·그라실(Exobasidium gracile IFO7788), 필로미세스·푸조엔시스(Fellomyces fuzhouensis IFO10374), 필로바시디엘라·네오포르마스(Filobasidiella neoformans CBS132), 필로바시디움·캡슐로이게눔(Filobasidium capsuloigenum CBS1906), 게오트리컴·카피타움(Geotrichum capitatum JCM6258), 그라피올라·실리드리컴(Graphiola cylindrica IFO6426), 글루코노백터·서복시던스(Gluconobacter suboxydans IFO3257), 코코바엘라·임페라타에(Kockovaella imperatae JCM7826), 쿠르츠마노미세스·넥타이레이(Kurtzmanomyces nectairei IFO10118), 랄라리아·세라시(Lalaria cerasi CBS275.28), 로이코스포리디움·스코티(Leucosporidium scottii IFO1212), 레기오넬라·아니사(Legionella anisa JCM7573), 메틸로박테리움·엑토르구엔스(Methylobacterium extorguens JCM2802),미코플라나·라모사(Mycoplana ramosa JCM7822), 오오스포리디움·마르가리티페룸(Oosporidium margaritiferum CBS2531), 슈도모나스·데니트리피칸스(Pseudomonas denitrificans IAM12023), 슈도모나스·실킬리엔시스(Pseudomonas shuylkilliensis IAM1092), 슈도지마·아피디스(Psedozyma aphidis CBS517.23), 파라코카스·데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans JCM6892), 페트로미세스·알리아세우스(Petromyces alliaceus IFO7538), 로도토룰라·글루티니스(Rhodotorula glutinis IFO1125), 로도토룰라·미누타(Rhodotorula minuta IFO0387), 로도스포리디움·디오보바튬(Rhodosporidium diobovatum ATCC1830), 리조모나스·스베리파시엔스(Rizomonas suberifaciens IFO15212), 로도비움·오리엔츠(Rodobium orients JCM9337), 로도플라네스·엘레강스(Rodoplanes elegans JCM9224), 로도슈도모나스·팔루트리스(Rhodopseudomonas palustris JCM2524), 로도백터·캡스레터스(Rhodobacter capsulatus SB1003), 스포로볼로미세스·홀사티카스(Sporobolomyces holsaticus IFO1034), 스포로볼로미세스·파라로세우스(Sporobolomyces pararoseus IFO0471), 스포리디오볼러스·존소니(Sporidiobolus johnsonii IFO1840), 사이토엘라·콤플리카타(Saitoella complicata IFO10748), 시조사카로미세스·폼베(Schizosa㏄haromyces pombe IFO0347), 스핀고모나스·파라파우시모빌리스(Sphingomonas parapaucimobilis IFO15100), 스포트리쿰·셀룰로필리움(Sporotrichum cellulophilium ATCC20493), 심포디오미코프시스·파피오페딜리(Sympodiomycopsis paphiopedili JCM8318), 스테리그마토스포리디움·폴리모르파(Sterigmatosporidium polymorphum IFO10121), 스핀고모나스·애드헤시바(Sphingomonas adhesiva JCM7370), 타파리나·카에룰레스센스(Tapharina caerulescens CBS351.35), 트레멜라·메센테리카(Tremella mesenterica ATCC24438), 트리코스포론·쿠타네움(Trichosporon cutaneum IFO1198), 틸레티아리아·아노말라(Tilletiaria anomala CBS436.72), 틸레티아·카리에스(Tilletia caries JCM1761), 톨리포스포리움·불라탐(Tolyposporium bullatum JCM2O06), 틸레티오프시스·워싱토네시스(Tilletiopsis washintonesis CBS544), 우스틸라고·에스쿨렌타(Ustilago esculenta IFO9887), 우데니오미세스·메갈로스포러스(Udeniomyces megalosporus JCM5269), 크산토필로미세스·덴드로로우스(Xanthophllomyces dendrorhous IFO10129), 크산토박테리움·플라버스(Xanthobacter flavus JCM1204), 페킬로마이세스·리아시누스(Paecilomyces lilacinus ATCC10114), 아크레모니움·크리소게넘(Acremonium chrysogenum ATCC11550), 하이호모나스·히시아나(Hyphomonas hirschiana ATCC33886), 리조비움·멜로티(Rhizobium meliloti ATCC9930) 등을 들 수 있다.

환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물로서는 상기 미생물의 야생주뿐만 아니라, 예를 들면, 상기의 미생물의 환원형 보효소 Q₁₀생합성에 관여하는 유전자의 전사 및 번역활성, 또는 발현 단백질의 효소활성을 개변 또는 개량한 미생물도 바람직하게 사용할 수 있다.

유전자의 전사 및 번역활성, 또는 발현 단백질의 효소활성을 개변 또는 개량하는 수단으로서는 유전자 조합(자기 유전자의 개량, 증폭, 파괴나, 외래 유전자의 도입 및 상기 유전자의 개량, 증폭을 포함한다)이나, 변이원에 의한 변이유발을 들 수 있는데, 변이원에 의한 변이유발이 바람직하다.

본 발명에 사용할 수 있는, 보다 바람직한 미생물은 상기 개변 또는 개량한 미생물, 바람직하게는 변이원에 의해 변이처리한 미생물을, 상기 증식방법 및 측정방법에 의해 평가했을 경우에, 환원형 보효소 Q₁₀이 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상, 보다 바람직하게는 80몰% 이상, 더욱 바람직하게는 85몰% 이상, 특히 바람직하게는 90몰% 이상의 함량을 나타내는 미생물이다. 공업규모에서의 발효생산에 있어서는, 또한, 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력으로서, 1㎍/mL 이상, 바람직하게는 2㎍/mL 이상, 보다 바람직하게는 3㎍/mL 이상, 더욱 바람직하게는 5㎍/mL 이상, 특히 바람직하게는 10㎍/mL 이상, 특히 더욱 바람직하게는 15㎍/mL, 가장 바람직하게는 20㎍/mL 이상의 생산능력을 가지는 미생물을 이용할 수 있다.

변이유발은 단일의 변이유발로서 행할 수 있는데, 2회 이상의 변이유발을 행하는 것이 바람직하다. 각 변이유발 단계에 따라 환원형 보효소 Q₁₀을 생산하는 능력이 개량될 수 있는 것이 발견되었기 때문이다. 변이유발처리에 가해지는 미생물 세포의 후보으로서는 통상은 상기 증식방법 및 측정방법에 의해 평가했을 경우에 될 수 있는 한 높은 환원형 보효소 Q₁₀생산능력을 가지는 것이 바람직한 것은 말할 필요도 없다.

변이유발처리는 임의의 적당한 변이원을 이용해서 행할 수 있다. 「변이원」이라는 말은 광의의 의미에서, 예를 들면 변이유발효과를 가지는 약제뿐만 아니라, UV조사와 같은 변이유발효과를 가지는 처리도 포함한다. 적당한 변이원의 예로서, 에틸메탄술포네이트, UV조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 브로모우라실과 같은 뉴클레오티드 염기 유사체 및 아크리딘류 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되는 것이 아니다.

상용의 변이유발기법에 따르면, 변이유발에 계속해서 높은 환원형 보효소 Q₁₀생산능력을 가지는 미생물 세포의 적절한 선택을 행한다. 이것을 위해서는 단일 콜로니로 만들어진 배양물의 평가를 예를 들면, 상기 증식방법 및 측정방법을 이용해서 행하는 것이다. 환원형 보효소 Q₁₀의 결정은 백색의 고층 또는 무색의 액상을 형성하기 때문에, 콜로니의 선별시에는 상기 측정법에 의해 환원형 보효소 Q₁₀생산능력의 평가를 바람직하게 행할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 공업적 규모에서의 발효생산에 있어서의 환원형 보효소 Q₁₀의 높은 생산성은, 부분적으로는 상기의 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포의 사용에 의해 얻을 수 있고, 또한, 부분적으로는 이하에 기재되는 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력을 향상시키기 위한 바람직한 배양(발효)조건의 사용에 의해 얻을 수 있다. 그리고 특히 상기의 바람직한 미생물 세포의 사용과 이하의 바람직한 배양(발효)조건의 사용을조합시키는 것이 바람직하다.

배양은 통상 미생물의 증식에 적합한 다량 영양소나 미량 영양소를 포함하는 배지 중에서 행하여진다. 상기 영양소는 예를 들면, 탄소원(예를 들면, 글루코오스, 슈크로오스, 말토오스, 전분, 콘 시럽, 당밀 등의 탄수화물;메탄올, 에탄올 등의 알코올 등), 질소원(예를 들면, 콘스티프리커, 황산 암모늄, 인산 암모늄, 수산화 암모늄, 요소, 펩톤 등), 인원(예를 들면, 인산 암모늄, 인산 등), 및 미량 영양소(예를 들면, 마그네슘, 칼륨, 아연, 구리, 철, 망간, 몰리브덴, 황산, 염산 등의 미네랄;비오틴, 데스티오비오틴, 비타민 B1 등의 비타민류;알라닌, 히스티딘 등의 아미노산;효모 엑기스나 말토 엑기스 등의 비타민류를 함유하는 천연원료 등)를 포함하는데, 이것들로 제한되는 것이 아니고, 일반적으로 사용되는 것을 이용할 수 있다. 또한, 효모 엑기스 등의 천연배지성분 중에는 인산염 등의 인원도 포함된다. 또한, 상기의 영양소는 적당히 조합시켜 이용할 수 있다.

배양의 온도는 통상 15 내지 45℃, 바람직하게는 20 내지 37℃에서 행하여진다. 15℃ 미만에서는 공업 생산을 위해 허용되기에는 미생물의 증식속도가 낮아지는 경향이 있고, 45℃를 초과하는 고온에서는 미생물의 생존이 상해되기 쉬운 경향이 있다.

배양의 pH는 통상 4 내지 9, 바람직하게는 5 내지 8이다. pH3 이하 및 pH10이상에서는 미생물의 증식이 저해되기 쉬운 경향이 있다.

공업규모에서의 발효생산에 있어서는, 미생물의 종류에도 따르지만, 배양중, 탄소원(생성된 알코올도 포함한다)의 농도를 환원형 보효소 Q₁₀생산능력에 실질적으로 악영향을 끼치지 않는 농도로 제어하는 것이 바람직하다. 따라서, 배양액 중의 탄소원의 농도가, 환원형 보효소 Q₁₀생산능력에 실질적으로 악영향을 끼치지 않는 농도, 즉, 통상 20g/L 이하, 바람직하게는 5g/L 이하, 보다 바람직하게는 2g/L 이하가 되도록 배양을 제어하는 것이 바람직하다.

탄소원의 농도제어를 위해서는 유가(流加)배양법을 채용하는 것이 바람직하다. pH, 용존산소농도(DO) 또는 잔당농도 등의 배양관리지표에 근거해서, 영양원(특히 탄소원)의 공급을 조절함으로써 배양액 중의 탄소원 농도를 제어할 수 있다. 영양원의 공급은 미생물의 종류에도 따르지만, 배양의 당초부터 개시할 수 있고, 배양도중부터 개시할 수 있다. 영양원의 공급은 연속적이거나, 단속적일 수 있다. 또한, 영양원의 공급에 있어서는, 상기 탄소원을 다른 성분으로부터 분리해서 (별도로) 배지에 공급하는 것이 바람직하다.

배양은 소망의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산량에 달한 시점에서 종료할 수 있다. 배양시간은 특별히 제한되지 않지만, 통상 20 내지 200시간이다.

상기의 배양은 통상 호기적으로 행하여진다. 여기에서, 「호기적」 이란 말은, 배양 중에 산소의 제한(산소의 결핍)이 생기지 않도록 산소의 공급이 행하여지는 것을 의미하고, 바람직하게는 배양 중에 산소의 제한이 실질적으로 생기지 않도록 산소의 공급이 충분히 행하여지는 것을 의미한다. 배양은, 통상은 통기하, 바람직하게는 통기 교반하에 행하여진다.

상기와 같은 미생물, 및 배양조건을 이용함으로써 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻을 수 있다. 또한, 환원형 보효소 Q₁₀의 생산량도, 1㎍/mL 이상, 바람직하게는 2㎍/mL 이상, 더욱 바람직하게는 3㎍/mL 이상이라고 하는 높은 값을 얻을 수 있다.

다음에 상기 배양에 의해 생산된 환원형 보효소 Q₁₀의 회수에 대해서 설명한다.

본 발명에 있어서, 공업적 규모에서의 환원형 보효소 Q₁₀의 효율적인 제조는 부분적으로는 상기의 바람직한 배양에 의해 가능해지고, 또한, 부분적으로는 이하의 환원형 보효소 Q₁₀의 바람직한 회수조작에 의해 가능해진다.

환원형 보효소 Q₁₀의 회수는 상기 배양으로 얻어진 미생물 세포로부터의 유기용제를 이용하는 추출에 의해 행하여진다.

추출에 있어서는 소망에 따라 상기 세포를 파쇄할 수 있다. 세포의 파쇄는 세포 중에 생산·축적된 환원형 보효소 Q₁₀의 효율적인 추출에 기여한다. 말할 필요도 없이 세포의 파쇄와 적출을 동시에 할 수 있다.

또한, 본 발명의 「파쇄」에 있어서는, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출이 가능해 질 정도로 세포벽 등의 표면구조가 상처를 받으면 되고, 반드시 미생물 세포가 찢어지거나 또는 단편화될 필요는 없다.

또한, 상기의 세포 파쇄처리는 세균에서는 반드시 필요하지 않은 경우도 있다. 그러나, 효모나 곰팡이에서는 통상 세포 파쇄처리는 필요하고, 세포가 파쇄되어 있지 않은 경우, 세포 중에 생산·축적된 환원형 보효소 Q₁₀은 효율적으로 회수되기 어려워진다.

상기 미생물 세포의 파쇄는 이하의 한 가지 또는 몇 가지의 파쇄방법을 임의의 순서로 행함으로써 행하여진다. 파쇄방법으로서는 예를 들면, 물리적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리 외에, 가열처리, 자기 소화, 침투압 용해, 원형질 용해 등을 들 수 있다.

상기 물리적 처리로서는 예를 들면, 고압 호모지나이저, 초음파 호모지나이저, 프렌치 프레스, 볼 밀 등의 사용, 또는 이것들의 조합을 들 수 있다.

상기 화학적 처리로서는 예를 들면, 염산, 황산 등의 산(바람직하게는 강산)을 이용하는 처리, 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨 등의 염기(바람직하게는 강염기)을 이용하는 처리 등이나, 이것들의 조합을 들 수 있다.

상기 효소적 처리로서는 예를 들면, 리조팀, 자이모리아제, 글루카나아제, 노보자임, 프로테아제, 셀룰라아제 등을 이용하는 방법을 들 수 있고, 적절히 이것들을 조합시켜 이용할 수 있다.

상기 가열처리로서는 예를 들면, 60 내지 100℃에서 30분 내지 3시간정도의 처리를 들 수 있다.

상기 자기소화로서는 예를 들면, 아세트산 에틸 등의 용매에 의한 처리를 들 수 있다.

또한, 세포내의 염농도와 다른 용액에 의해 세포를 처리함으로써 세포가 파괴되는 침투압 용해나 원형질 용해는, 본 방법 단독으로는 파쇄효과가 불충분한 경우가 많아, 상기 물리적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리, 가열처리, 자기소화 등과 아울러 이용되는 경우가 많다.

환원형 보효소 Q₁₀의 추출·회수의 전처리로서의 세포 파쇄방법으로서는 상기 파쇄방법 중에서도, 물리적 처리, 화학적 처리(특히 산처리, 바람직하게는 강산(예를 들면, 수용액 중에 있어서의 pKa가 2.5이하인 산)에 의해 후술하는 환원형 보효소 Q₁₀이 산화 반응으로부터 방호된 조건하에서의 산처리)이나 가열처리가 바람직하고, 파쇄효율의 점에서 물리적 처리가 보다 바람직하다.

종래의 세포 파쇄 및 보효소 Q₁₀의 추출방법, 구체적으로는 수산화 나트륨 및 피로가롤의 존재하에 유기용제로 추출하는 방법은 비용, 폐기물처리, 폐기 미생물(폐균체) 유효이용(단백질의 회수 등)시의 안전성 등의 면에서 문제가 있었다. 그러나, 본 발명에 있어서의 세포 파쇄방법, 특히 물리적 처리법은 중화에 의해 다량의 염을 부생시키지 않고, 폐기물처리뿐만 아니라 폐미생물(폐균체)의 유효이용의 면에서도 바람직한 방법이다.

상기의 세포 파쇄에 이용하는 미생물 세포의 형태는, 배양액, 배양액을 농축한 것, 배양액으로부터 미생물 세포를 습균체로서 채취한 것, 이것들을 세정한 것,습균체를 용제(예를 들면, 물, 생리식염수, 완충액 등도 포함한다)에 현탁한 것, 상기의 습균체를 건조시킨 건조균체, 건조균체를 용제(예를 들면, 물, 생리식염수, 완충액 등도 포함한다)에 현탁한 것 등일 수 있는데, 바람직하게는 미생물 세포의 수성 현탁액이며, 조작성 등의 면에서 보다 바람직하게는 배양액, 배양액을 농축한 것이나, 이것들을 세정한 것이다.

환원형 보효소 Q₁₀의 추출·회수에 이용하는 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 형태도 상기와 같이 특별히 제한되지 않고, 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 습균체나 건조균체일 수 있는데, 바람직하게는 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액이고, 보다 바람직하게는 배양액, 배양액을 농축 및(또는) 세정한 것이나, 이것들의 파쇄액(모두 수성 현탁액)이다.

상기의 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물 현탁액에 있어서의 균체농도는 특별히 제한되지 않고, 건조중량으로 통상 1 내지 25중량%로 행할 수 있는데, 경제적으로는 10 내지 20중량%인 것이 바람직하다.

이렇게 해서 얻어지는 상기 미생물 세포 및 상기 세포 파쇄물을, 유기용제를 이용하는 추출을 함으로써 환원형 보효소 Q₁₀을 회수할 수 있다.

추출에 이용하는 유기용제로서는 탄화수소류, 지방산 에스테르류, 에테르류, 알코올류, 지방산류, 케톤류, 질소 화합물류(니트릴류, 아미드류를 포함한다), 유황 화합물류 등을 들 수 있다.

특히, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출에 있어서는 분자산소에 의한 산화로부터 방호하는 관점에서, 탄화수소류, 지방산 에스테르류, 에테르류, 및, 니트릴류 중 1종 이상을 추출용매로서 이용하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 탄화수소류, 지방산 에스테르류가 바람직하고, 탄화수소류가 가장 바람직하다.

공업적 규모에서의 제조에 있어서는 산소의 완전한 제거는 극히 어렵고, 또한 개개의 조작에 요하는 시간은 랩 스케일에서의 제조와는 달리 상당히 장시간이 되기 때문에, 잔존하는 산소가 큰 악영향을 끼친다. 상기 산화는 환원형 보효소 Q₁₀으로부터의 산화형 보효소 Q₁₀의 부생으로 직결된다. 따라서, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출에 있어서의 상기 산화방호효과가 큰 유기용제(탄화수소류, 지방산 에스테르류, 에테르류, 니트릴류 등)의 사용은 효율적인 추출을 조성한다.

탄화수소류로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 할로겐화 탄화수소 등을 들 수 있다. 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소가 바람직하고, 지방족 탄화수소가 보다 바람직하다.

지방족 탄화수소로서는 환상, 비환상을 불문하고, 또한, 포화, 불포화를 불문하고, 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 포화인 것이 바람직하게 이용된다. 통상, 탄소수 3 내지 20, 바람직하게는 탄소수 5 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 5 내지 8의 것이 이용된다. 구체예로서는 예를 들면, 프로판, 부탄, 이소부탄, 펜탄, 2-메틸부탄, 헥산, 2-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵탄 이성체(예를 들면, 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄), 옥탄, 2,2,3-트리메틸펜탄, 이소옥탄, 노난, 2,2,5-트리메틸헥산, 데칸, 도데칸,2-펜텐, 1-헥센, 1-헵텐, 1-옥텐, 1-노넨, 1-데센, 시클로펜탄, 메틸시클로펜탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 에틸시클로헥산, p-멘탄, 시클로헥센 등을 들 수 있다. 바람직하게는 펜탄, 2-메틸부탄, 헥산, 2-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵탄 이성체(예를 들면, 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄), 옥탄, 2,2,3-트리메틸펜탄, 이소옥탄, 노난, 2,2,5-트리메틸헥산, 데칸, 도데칸, 시클로펜탄, 메틸시클로펜탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 에틸시클로헥산, p-멘탄 등이다. 보다 바람직하게는 펜탄, 2-메틸부탄, 헥산, 2-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵탄 이성체(예를 들면, 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄), 옥탄, 2,2,3-트리메틸펜탄, 이소옥탄, 시클로펜탄, 메틸시클로펜탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 에틸시클로헥산 등이다.

일반적으로 헵탄류, 헵탄은 물론, 탄소수 7을 가지는 메틸시클로헥산 등의 이종 헵탄이나 그것들의 복수 혼합물을 바람직하게 이용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 탄소수 5의 펜탄류(예를 들면, 펜탄 등), 탄소수 6의 헥산류(예를 들면, 헥산, 시클로헥산 등), 탄소수 7의 헵탄류(예를 들면, 헵탄, 메틸시클로헥산 등) 등이다. 특히 바람직하게는 상기 산화로부터의 방호효과가 특히 크다고 하는 점에서 헵탄류(예를 들면, 헵탄, 메틸시클로헥산 등) 등이며, 가장 바람직하게는 헵탄이다.

방향족 탄화수소로서는 특별히 제한되지 않지만, 통상 탄소수 6 내지 20, 바람직하게는 탄소수 6 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 7 내지 10의 것을 이용할수 있다. 구체예로서는 예를 들면, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, o-크실렌, m-크실렌, p-크실렌, 에틸벤젠, 쿠멘, 메시틸렌, 테트라린, 부틸벤젠, p-시멘, 시클로헥실벤젠, 디에틸벤젠, 펜틸벤젠, 디펜틸벤젠, 도데실벤젠, 스티렌 등을 들 수 있다. 바람직하게는 톨루엔, 크실렌, o-크실렌, m-크실렌, p-크실렌, 에틸벤젠, 쿠멘, 메시틸렌, 테트라린, 부틸벤젠, p-시멘, 시클로헥실벤젠, 디에틸벤젠, 펜틸벤젠 등이다. 보다 바람직하게는 톨루엔, 크실렌, o-크실렌, m-크실렌, p-크실렌, 쿠멘, 테트라린 등이다. 가장 바람직하게는 쿠멘이다.

할로겐화 탄화수소로서는 환상, 비환상을 불문하고, 또한, 포화, 불포화를 불문하고, 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 비환상의 것이 바람직하게 이용된다. 보다 바람직하게는 염소화 탄화수소, 불소화 탄화수소이며, 더욱 바람직하게는 염소화 탄화수소다. 또한, 탄소수 1 내지 6, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 2의 것이 바람직하게 이용된다. 구체예로서는 예를 들면, 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화 탄소, 1,1-디클로로에탄, 1,2-디클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1,1,2-테트라클로로에탄, 1,1,2,2-테트라클로로에탄, 펜타클로로에탄, 헥사클로로에탄, 1,1-디클로로에틸렌, 1,2-디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 테트라클로로에틸렌, 1,2-디클로로프로판, 1,2,3-트리클로로프로판, 클로로벤젠, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 등을 들 수 있다. 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름, 사염화 탄소, 1,1-디클로로에탄, 1,2-디클로로에탄, 1,1,1-트리클로로에탄, 1,1,2-트리클로로에탄, 1,1-디클로로에틸렌, 1,2-디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 클로로벤젠, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 등이다. 보다 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름, 1,2-디클로로에틸렌, 트리클로로에틸렌, 클로로벤젠, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄 등이다.

지방산 에스테르류로서는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 프로피온산 에스테르, 아세트산 에스테르, 포름산 에스테르 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아세트산 에스테르, 포름산 에스테르이며, 보다 바람직하게는 아세트산 에스테르이다. 에스테르 기로서는 특별히 제한되지 않지만, 통상 탄소수 1 내지 8의 알킬에스테르, 탄소수 7 내지 12의 아르알킬에스테르가, 바람직하게는 탄소수 1 내지 6의 알킬에스테르가, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 4의 알킬에스테르가 이용된다.

프로피온산 에스테르의 구체예로서는 예를 들면, 프로피온산 메틸, 프로피온산 에틸, 프로피온산 부틸, 프로피온산 이소펜틸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 프로피온산 에틸 등이다.

아세트산 에스테르의 구체예로서는 예를 들면, 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 펜틸, 아세트산 이소펜틸, 아세트산 sec-헥실, 아세트산 시클로헥실, 아세트산 벤질 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸, 아세트산 sec-부틸, 아세트산 펜틸, 아세트산 이소펜틸, 아세트산 sec-헥실, 아세트산 시클로헥실 등이다. 보다 바람직하게는 아세트산 메틸, 아세트산 에틸, 아세트산 프로필, 아세트산 이소프로필, 아세트산 부틸, 아세트산 이소부틸 등이며, 가장 바람직하게는 아세트산 에틸이다.

포름산 에스테르의 구체예로서는 예를 들면, 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 포름산 이소프로필, 포름산 부틸, 포름산 이소부틸, 포름산 sec-부틸, 포름산 펜틸 등을 들 수 있다. 바람직하게는 포름산 메틸, 포름산 에틸, 포름산 프로필, 포름산 부틸, 포름산 이소부틸, 포름산 펜틸 등이다. 가장 바람직하게는 포름산 에틸이다.

에테르류로서는 환상, 비환상을 불문하고, 또한, 포화, 불포화를 불문하고, 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 포화인 것이 바람직하게 이용된다. 통상, 탄소수 3 내지 20, 바람직하게는 탄소수 4 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 4 내지 8의 것이 이용된다. 구체예로서는 예를 들면, 디에틸에테르, 메틸tert-부틸에테르, 디프로필에테르, 디이소프로필에테르, 디부틸에테르, 디헥실에테르, 에틸비닐에테르, 부틸비닐에테르, 아니솔, 페네톨, 부틸페닐에테르, 메톡시톨루엔, 디옥산, 푸란, 2-메틸푸란, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르, 에틸렌글리콜디부틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노에틸에테르, 에틸렌글리콜모노부틸에테르 등을 들 수 있다. 바람직하게는 디에틸에테르, 메틸tert-부틸에테르, 디프로필에테르, 디이소프로필에테르, 디부틸에테르, 디헥실에테르, 아니솔, 페네톨, 부틸페닐에테르, 메톡시톨루엔, 디옥산, 2-메틸푸란, 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 에틸렌글리콜디메틸에테르, 에틸렌글리콜디에틸에테르, 에틸렌글리콜디부틸에테르, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노에틸에테르 등이다. 보다 바람직하게는 디에틸에테르, 메틸tert-부틸에테르, 아니솔, 디옥산, 테트라히드로푸란, 에틸렌글리콜모노메틸에테르, 에틸렌글리콜모노에틸에테르 등이다. 더욱 바람직하게는 디에틸에테르, 메틸tert-부틸에테르, 아니솔 등이며, 가장 바람직하게는 메틸tert-부틸에테르다.

알코올류로서는 환상, 비환상을 불문하고, 또한, 포화, 불포화를 불문하고, 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 포화인 것이 바람직하게 이용된다. 통상, 탄소수 1 내지 20, 바람직하게는 탄소수 1 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 1 내지 6이다. 그 중에서도 탄소수 1 내지 5의 1가 알코올, 탄소수 2 내지 5의 2가 알코올, 탄소수 3의 3가 알콜이 바람직하다.

이들 알코올류의 구체예로서는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, tert-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, 3-메틸-2-부탄올, 네오펜틸알코올, 1-헥산올, 2-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-에틸-1-부탄올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 3-헵탄올, 1-옥탄올, 2-옥탄올, 2-에틸-1-헥산올, 1-노난올, 1-데칸올, 1-운데칸올, 1-도데칸올, 알릴알코올, 프로파르길알코올, 벤질알코올, 시클로헥산올, 1-메틸시클로헥산올, 2-메틸시클로헥산올, 3-메틸시클로헥산올, 4-메틸시클로헥산올 등의 1가 알코올;1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,3-부탄디올, 1,4-부탄디올, 2,3-부탄디올, 1,5-펜탄디올 등의 2가 알코올;글리세린 등의 3가 알코올을 들 수 있다.

1가 알코올로서는 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, tert-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, 3-메틸-2-부탄올, 네오펜틸알코올, 1-헥산올, 2-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-에틸-1-부탄올, 1-헵탄올, 2-헵탄올, 3-헵탄올, 1-옥탄올, 2-옥탄올, 2-에틸-1-헥산올, 1-노난올, 1-데칸올, 1-운데칸올, 1-도데칸올, 벤질알코올, 시클로헥산올, 1-메틸시클로헥산올, 2-메틸시클로헥산올, 3-메틸시클로헥산올, 4-메틸시클로헥산올 등이다. 보다 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, tert-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, 3-메틸-2-부탄올, 네오펜틸알코올, 1-헥산올, 2-메틸-1-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-에틸-1-부탄올, 시클로헥산올 등이다. 더욱 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, tert-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, 3-메틸-2-부탄올, 네오펜틸알코올 등이다. 특히 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올 등이며, 가장 바람직하게는 2-프로판올이다.

2가 알코올로서는 1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올, 1,3-프로판디올 등이 바람직하고, 1,2-에탄디올이 가장 바람직하다. 3가 알코올로서는 글리세린이 바람직하다.

지방산류로서는 예를 들면, 포름산, 아세트산, 프로피온산 등을 들 수 있다. 바람직하게는 포름산, 아세트산이며, 가장 바람직하게는 아세트산이다.

케톤류로서는 특별히 제한되지 않고, 탄소수 3 내지 6의 것이 바람직하게 이용된다. 구체예로서는 예를 들면, 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸부틸케톤, 메틸이소부틸케톤 등을 들 수 있다. 바람직하게는 아세톤, 메틸에틸케톤이며, 가장 바람직하게는 아세톤이다.

니트릴류로서는 환상, 비환상을 불문하고, 또한 포화, 불포화를 불문하고, 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로 포화인 것이 바람직하게 이용된다. 통상 탄소수 2 내지 20, 바람직하게는 탄소수 2 내지 12, 보다 바람직하게는 탄소수 2 내지 8의 것이 이용된다.

구체예로서는 예를 들면, 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 마로노니트릴, 부틸로니트릴, 이소부틸로니트릴, 숙시노니트릴, 발레로니트릴, 글루타로니트릴, 헥산니트릴, 헵틸시아니드, 옥틸시아니드, 운데칸니트릴, 도데칸니트릴, 트리데칸니트릴, 펜타데칸니트릴, 스테아로니트릴, 클로로아세토니트릴, 브로모아세토니트릴, 클로로프로피오니트릴, 브로모프로피오니트릴, 메톡시아세토니트릴, 시아노아세트산 메틸, 시아노아세트산 에틸, 톨루니트릴,벤조니트릴, 클로로벤조니트릴, 브로모벤조니트릴, 시아노벤조산, 니트로벤조니트릴, 아니소니트릴, 프탈로니트릴, 브로모톨루니트릴, 메틸시아노벤조에이트, 메톡시벤조니트릴, 아세틸벤조니트릴. 나프토니트릴, 비페닐카르보니트릴, 페닐프로피오니트릴, 페닐부틸로니트릴, 메틸페닐아세토니트릴, 디페닐아세토니트릴, 나프틸아세토니트릴, 니트로페닐아세토니트릴, 클로로벤질시아니드, 시클로프로판카르보니트릴, 시클로헥산카르보니트릴, 시클로헵탄카르보니트릴, 페닐시클로헥산카르보니트릴, 톨릴시클로헥산카르보니트릴등을 들 수 있다.

바람직하게는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 숙시노니트릴, 부틸로니트릴, 이소부틸로니트릴, 발레로니트릴, 시아노아세트산 메틸, 시아노아세트산 에틸, 벤조니트릴, 톨루니트릴, 클로로프로피오니트릴이며, 보다 바람직하게는 아세토니트릴, 프로피오니트릴, 부틸로니트릴, 이소부틸로니트릴이며, 가장 바람직하게는 아세토니트릴이다.

니트릴류를 제외한 질소 화합물류로서는 예를 들면, 포름아미드, N-메틸포름아미드, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드류나 니트로메탄, 트리에틸아민, 피리딘 등을 들 수 있다.

유황 화합물류로서는 예를 들면, 디메틸술폭시드, 술포란 등을 들 수 있다.

상기 유기용제 중에서도 비점, 점성 등의 성질(예를 들면, 용해도를 높이기 위한 적당한 가온을 할 수 있고, 또한, 습체로부터의 용제의 건조제거나 정석여액 등으로부터의 용제회수를 행하기 쉬운 비점(1기압하, 약 30 내지 150℃), 실온에서의 취급시 및 실온이하로 냉각했을 때도 고착화하기 어려운 융점(약 0℃이상, 바람직하게는 약 10℃이상, 보다 바람직하게는 약 20℃이상)을 가지고, 점성이 낮은 (20℃에 있어서 약 10cp이하 등)) 것을 고려해서 선정하는 것이 바람직하다.

용제 중에서의 환원형 보효소 Q₁₀의 산화방호효과는 환원형 보효소 Q₁₀의 고농도 용액에 있어서 커지는 경향이 있다. 환원형 보효소 Q₁₀은 산화방호효과가 큰 상기 유기용제(예를 들면, 탄화수소류, 지방산 에스테르류 등)에 대해서 높은 용해성을 나타내고, 이 높은 용해성은 고농도 용액에서의 취급을 가능하게 하고, 산화방호를 조성한다. 환원형 보효소 Q₁₀의 산화방호효과를 위한 바람직한 추출시의 농도는 특별히 제한되지 않지만, 상기 유기용제에 대한 환원형 보효소 Q₁₀의 농도로서 통상 0.001중량% 이상, 바람직하게는 0.01중량% 이상, 보다 바람직하게는 0.1중량% 이상이다. 상한은 특별히 제한되지 않지만, 통상 10중량% 이하다.

상기 유기용제 중, 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 습균체나 건조균체로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 추출·회수하기 위해서는 친수성 유기용제를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 등을 들 수 있다.

또한, 상기 유기용제 중, 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액으로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 추출·회수하기 위해서는 소수성 유기용제를 이용하는 것이 바람직하고, 이것은 미생물 유래의 수용성물질의 제거를 조성한다. 소수성 유기용제의 대부분은 전술의 산화방호효과가 큰 유기용제이며 극히 적절하다.

또한, 소수성 유기용제로서는 탄화수소류, 지방산 에스테르류, 에테르류가 바람직하다.

그런데, 상기 추출조작에 있어서, 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액, 특히 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액, 특히 물리적 처리에 의한 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액으로부터 유기용제를 이용해서 추출할 경우, 일부 단백질 등의 세포 성분의 존재에 의해 에멀전이 형성되기 쉽고, 상분리가 곤란해지기쉬운 경향이 있으므로, 상기 에멀전의 형성을 억제하고, 효율적으로 추출하는 것이 중요해진다.

그러기 위해서는 추출용제로서 상기 소수성 유기용제에 부가해서 보조적 용제로서 친수성 유기용제를 병용하는 것이 바람직하다.

이 경우, 소수성 유기용제로서는 특별히 제한되지 않고, 상술의 것을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 탄화수소류, 보다 바람직하게는 지방족 탄화수소다. 지방족 탄화수소 중에서도 탄소수 5 내지 8의 것이 바람직하게 이용된다.

상기 탄소수 5 내지 8의 지방족 탄화수소의 구체예로서는 예를 들면, 펜탄, 2-메틸부탄, 헥산, 2-메틸펜탄, 2,2-디메틸부탄, 2,3-디메틸부탄, 헵탄, 헵탄 이성체(예를 들면, 2-메틸헥산, 3-메틸헥산, 2,3-디메틸펜탄, 2,4-디메틸펜탄), 옥탄, 2,2,3-트리메틸펜탄, 이소옥탄, 시클로펜탄, 메틸시클로펜탄, 시클로헥산, 메틸시클로헥산, 에틸시클로헥산 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 헥산, 헵탄, 메틸시클로헥산이며, 가장 바람직하게는 헥산, 헵탄이다.

상기의 소수성 유기용제와 조합시켜 이용되는 친수성 유기용제로서는 특별히 제한되지 않고, 상술의 것을 사용할 수 있는데, 바람직하게는 알코올류이다. 알코올류 중에서도 탄소수 1 내지 5의 1가 알코올이 바람직하게 이용된다. 이들의 구체예로서는 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 이소부틸알코올, tert-부틸알코올, 1-펜탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 2-메틸-1-부탄올, 이소펜틸알코올, tert-펜틸알코올, 3-메틸-2-부탄올, 네오펜틸알코올 등을 들 수 있다. 특히 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올이며,가장 바람직하게는 2-프로판올이다.

상기의 친수성 유기용제와 소수성 유기용제의 사용량으로서는 특별히 제한은 되지 않지만, 추출시의 농도로서 전 용액의 용량에 대해서 바람직하게는 친수성 유기용제가 5 내지 50용량%, 소수성 유기용제가 25 내지 65용량%의 범위다.

환원형 보효소 Q₁₀의 회수에 있어서, 추출시의 온도는 특별히 제한되지 않지만, 통상 0 내지 60℃, 바람직하게는 20 내지 50℃의 범위다.

추출방법으로서는 회분추출, 연속추출(바람직하게는 향류(向流) 다단추출) 중 어느 방법으로도 행할 수 있지만, 연속추출(바람직하게는 향류 다단추출)이 생산성의 면에서 특히 바람직하다. 회분추출에 있어서의 교반시간은 특별히 제한되지 않지만, 통상 5분 이상이며, 연속추출에 있어서의 평균체류시간은 특별히 제한되지 않지만, 통상 10분 이상이다.

환원형 보효소 Q₁₀의 회수에 있어서는 환원형 보효소 Q₁₀이 분해되지 않도록(예를 들면, 산화형 보효소 Q₁₀으로 산화되지 않도록) 유의하는 것이 바람직하다. 그러기 위해서는 상기의 추출(세포 파쇄도 포함한다)은 산성 내지 약염기성 조건하, 바람직하게는 산성 내지 중성 조건하에 행하는 것이 바람직하다. pH를 지표로 할 경우는, 접촉시간에도 따르지만, pH10이하, 바람직하게는 pH9이하, 보다 바람직하게는 pH8이하, 더욱 바람직하게는 pH7이하다.

이상에 의해 실질적으로 산화 반응을 방호할 수 있지만, 소망에 따라 보다 엄밀하게는 환원형 보효소 Q₁₀이 산화 반응으로부터 방호된 조건하에, 상기의 세포의 파쇄 및(또는) 추출을 행하는 것이 바람직하다. 해당 조건하에 적어도 상기 추출을 행하는 것이 보다 바람직하고, 상기 파쇄 및 추출을 행하는 것이 더욱 바람직하다.

「산화 반응으로부터 방호된 조건하」로서는 예를 들면, 탈 산소분위기하(질소 가스, 탄산 가스, 헬륨 가스, 아르곤 가스, 수소 가스 등의 불활성 가스 분위기하, 감압하, 비등하 등);고온 농도하, 예를 들면, 바람직하게는 수상의 염류(예를 들면, 염화나트륨, 황산 나트륨 등의 무기염)의 농도가 약 5% 이상인 조건하;강산(예를 들면, 수용액 중에 있어서의 pKa가 2.5이하인 산) 존재하, 예를 들면, 환원형 보효소 Q₁₀1몰에 대해서 강산 0.1몰% 이상이 존재하는 조건하;산화방지제 존재하, 예를 들면, 아스코르브산, 시트르산, 그것들의 염이나 에스테르류의 공존하(예를 들면, 환원형 보효소 Q₁₀에 대해서 0.1중량% 이상) 등을 들 수 있다. 또한, 환원 조건하(산화형 보효소 Q₁₀이 환원형 보효소 Q₁₀으로 변환될 수 있는 조건), 예를 들면, 차아황산류 등의 환원제와의 접촉도 들 수 있다.

이상의 배양(발효) 및 추출에 의해 환원형 보효소 Q₁₀은 바람직하게 생산 및 회수된다. 바람직하게는 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상, 바람직하게는 75몰% 이상의 비율로 함유하는 추출액을 얻는다.

이렇게 해서 얻어진 환원형 보효소 Q₁₀을 함유하는 추출액을 소망에 따라 컬럼 크로마토그래피, 환원 처리 등에 의해 정제한 후, 정석조작을 이용하여 고순도의 환원형 보효소 Q₁₀결정을 취득할 수 있다. 또한, 이 경우도 일련의 조작은 상술한 「산화 반응으로부터 방호된 조건하」에 행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 또한, 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물을 산화처리를 한 후에 산화형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하거나, 또는 상기 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물로부터 환원형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하고, 필요에 따라 정제 처리를 실시한 후, 이것을 산화처리를 함으로써 산화형 보효소 Q₁₀을 제조할 수 있다.

상기 산화는 예를 들면, 환원형 보효소 Q₁₀(바람직하게는 상술한 환원형 보효소 Q₁₀을 함유하는 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액이나 환원형 보효소 Q₁₀의 추출액 등)과 산화제(예를 들면, 이산화 망간 등)을 혼합하고, 예를 들면, 실온(예를 들면, 30℃)에서 30분 이상 처리함으로써 행할 수 있다. 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물을 산화처리를 했을 경우는, 산화형 보효소 Q₁₀의 추출조작을 상술의 환원형 보효소 Q₁₀의 추출조작과 마찬가지로 행할 수 있고, 그것에 의해 산화형 보효소 Q₁₀을 효율적으로 회수할 수 있다. 또한, 산화형 보효소 Q₁₀의 회수는 환원형 보효소 Q₁₀의 회수에 있어서 추장(推奬)되는 「산화 반응으로부터 방호된 조건하」에 행할 필요성은 없고, 통상의 안전조작 등을 배려해서 실시할 수있다. 이렇게 해서 얻어지는 산화형 보효소 Q₁₀은 소망에 따라 컬럼 크로마토그래피 등에 의한 정제를 할 수 있고, 최종적으로 정석조작을 이용해서 고순도의 산화형 보효소 Q₁₀결정으로서 취득할 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것이 아니다.

(실시예 1)

하기 표 1 내지 3의 각종 보효소 Q₁₀생산성 미생물을, 시험관(내경 21㎜, 전체 길이 200㎜)을 이용하여 10mL의 배지[(글루코오스 20g, 펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g)/L, pH6.0] 중에서 25℃, 72시간 진탕 배양(진폭 2㎝, 310왕복/분)하고, 얻어진 증식액을 필요에 따라 농축하고, 질소 분위기하, 상기 증식액 10용량부에 대해서 이소프로판올 3용량부 및 n-헥산 18.5용량부의 공존하에, 유리 비즈(425 내지 600미크론) 10용량부를 이용하여 3분간 격렬하게 진탕해서 세포의 파쇄 및 추출을 행했다. 얻어진 헥산상을 감압하에 에버포레이터하고(40℃), 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석하여 환원형 보효소 Q₁₀비율, 및 환원형 보효소 Q₁₀생산량을 조사했다.

HPLC조건

컬럼:YMC-Pack 4.6×250㎜(YMC. Co., Ltd.제)

이동상:메탄올/n-헥산=85/15

유속:1mL/분

검출:UV 275㎚

결과를 표 1 내지 3에 나타낸다. 또한, 환원형 보효소 Q₁₀비율이란, 환원형 보효소 Q₁₀및 산화형 보효소 Q₁₀의 피크의 면적 및 양자의 몰 흡광계수의 비(1:7.5)를 기초로, 산화형 보효소 Q₁₀과 환원형 보효소 Q₁₀의 총합에 대한 환원형효소 Q₁₀의 비율을 몰 백분률로 나타낸 값을 의미한다.

균주명	상단:환원형 보효소 Q₁₀비율(%)하단:환원형 보효소 Q_1O생산량(㎍/㎖)
아그로박테리움·튜메파시엔스 IFO13263(Agrobacterium tumefacience)	827
아그로박테리움·라디오백터 ATCC4718(Agrobacterium radiobacter)	787
아스페르길루스·클라바터스 JCM1718(Aspergillus clavatus)	832
아세토백터·크실리눔 IFO15237(Acetobacter xylinum)	772
아미노백터·아가노우엔시스 JCM7854(Aminobacter aganouensis)	703
아그로모나스·올리고트로피카 JCM1494(Agromonas oligotrophica)	752
아시드필라스·멀티보럼 JCM8867(Acidiphilium multivorum)	733
불레로미세스·알바스IFO1192(Bulleromyces albus)	722
불레라·아르메니카 IFO10112(Bullera armeniaca)	857
브레분디모나스·디미누타 JCM2788(Brevundimonas diminuta)	825
크립토코카스·라우렌티 IFO0609(Cryptococcus laurentii)	796
키오노스파에라·아포바시디알리스 CBS7430(Chionosphaera apobasidialis)	712
칸디다·쿠르바타 ATCC10567(Candida curvata)	743
세리노스테루스·루테오알바스 JCM2923(Cerinosterus luteoalbus)	795
엑소피알라·알칼로필라 JCM12519(Exisohiala alcalophila)	773
엑소바시디움·그라실 IFO7788(Exobadidium gracile)	792
필로미세스·푸조엔시스 IFO10374(Fellomyces fuzhouensis)	702
필로바시디엘라·네오포르마스 CBS132(Filobasidiella neoformans)	882
필로바시디움·캡슐로이게눔 CBS1906(Filobasidium capsuloigenum)	823
게오트리컴·카피타움 JCM6258(Geoturichum capitatum)	773
그라피올라·실린드리컴 IFO6426(Graphiola cylindrica)	754
글루코노백터·서복시던스 IFO3257(Gluconobacter suboxydans)	866
코코바엘라·임페라타에 JCM7826(Kockovaella imperatae)	782

균주명	상단:환원형 보효소 Q₁₀비율(%)하단:환원형 보효소 Q_1O생산량(㎍/㎖)
크르쯔마노미세스·넥타이레이 IFO10118(Kurtzmanomyces nectairei)	792
랄라리아·세라시 CBS275.28(Lalaria cerasi)	752
로이코스포리디움·스코티 IFO1212(Leucosporidium scotti)	886
레기오넬라·아니사 JCM7573(Legionella anisa)	733
메틸로박테리움·엑토르구엔스 JCM2802(Methylobacterium extorguens)	722
미코플라나·라모사 JCM7822(Mycoplana ramosa)	802
오오스포리디움·마르가리티페룸 CBS2531(Oosporidium margaritiferum )	762
슈도모나스·데니트리피칸스 IAM12023(Pseudomonas denitrificans)	858
슈도모나스·실킬리엔시스 IAM1092(Pseudomonas shuylkilliensis)	846
슈도지마·아피디스 CBS517.23(Psedozyma aphidis)	795
파라코카스·데니트리피칸스 JCM6892(Paracoccus denitrificans)	835
페트로미세스·알리아세우스 IFO7538(Petromyces alliaceus)	722
로도토룰라·글루티니스 IFO1125(Rhodotorula glutinis)	797
로도토룰라·미누타 IFO0387(Rhodotorula minuta)	748
로도스포리디움·디오보바튬 ATCC1830(Rhodosporidium diobovatum)	864
리조모나스·스베리파시엔스 IFO15212(Rhizomonas suberifaciens)	822
로도비움·오리엔츠 JCM9337(Rhodobium orients)	802
로도플라네스·엘레강스 JCM9224(Rhodoplanes elegans)	742
로도슈도모나스·팔루트리스 JCM2524(Rhodopseudomonas palustris)	906
로도백터·캡슐레터스 SB 1003(Rhodobacter capsulatus)	956
스포로볼로미세스·홀사티카스 IFO1034(Sporobolomyces holsaticus)	729
스포로볼로미세스·파라로세우스 IFO0471(Sporobolomyces pararoseus)	938
스포리디오볼러스·존소니 IFO1840(Soridiobolus johnsonii)	737
사이토엘라·컴플리카타 IFO10748(Sitoella complicata)	979

균주명	상단:환원형 보효소 Q₁₀비율(%)하단:환원형 보효소 Q_1O생산량(㎍/㎖)
시조사카로미세스·폼베 IFO0347(Schizosaccharomyces pombe)	908
스핀고모나스·파라파우시모빌리스스 IFO15100(Sphingomonas parapaucimobilis)	787
스포트리쿰·셀룰로필리움 ATCC20493(Sporotrichum cellulophilium)	736
심포디오미코프시스·파피오페딜리 JCM8318(Sympodiomycopsis paphiopedili)	806
스테리그마토스포리디움·폴리모르파 IFO10121(Sterigmatosporidium polymorphum)	722
스핀고모나스·아드헤시바 JCM7370(Sphingmonas adhesiva)	803
타파리나·카에룰레스센스 CBS351.35(Tapharina caerulescens)	812
트레멜라·메센테리카 ATCC24438(Tremella mesenterica)	893
트리코스포론·쿠타네움 IFO1198(Trichosporon cutaneum)	958
틸레티아리아·아노말라 CBS436.72(Tilletiaria anomala)	754
틸레티아·카리에스 JCM1761(Tilletia caries)	803
톨리포스포리움·불라탐 JCM2006(Tolyposporium bullatum)	734
틸레티오프시스·워싱토네시스 CBS544(Tilletiopsis washigtonesis)	762
우스틸라고·에스쿨렌타 IFO9887(Ustilago esculenta)	782
우데니오미세스·메갈로스포라스 JCM5269(Udeniomyces megalosporus)	872
크산토필로미세스·덴드로로우스 IFO10129(Xanthophllomyces dendrorhous)	842
크산토박테리움·플라브스 JCM1204(Xanthobacter flavus)	802
페킬로마이세스·리아시스 ATCC10114(Paecilomyces lilacinus)	805
아크레모니움·크리소게넘 ATCC11550(Acremonium chrysogenum)	755
하이호모나스·히시아나 ATCC33886(Hyphomonas hirschiana)	723
리조비움·멜로티 ATCC9930(Rhizobium meliloti)	8510

(실시예 2)

로도토룰라·글루티니스(Rhodotorula glutinis) IFO1125를 배지(펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g, 글루코오스 20g/L, pH6.0)에서 호기적으로 25℃로48시간 배양했다. 배양 후의 균체를 원심분리에 의해 집균하고, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘을 200㎍/mL의 농도가 되도록 첨가한 pH7의 인산 완충액에 현탁했다. 25℃에서 1시간 후, 균체를 0.9% NaCl용액으로 5회 세정하고, 다시 0.9% NaCl용액에 재현탁했다. 이 세포현탁액을 적당하게 희석하고, 상기 배지의 한천 플레이트에 콜로니를 형성시켰다. 단리한 변이주의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산량 및 환원형 보효소 Q₁₀의 비율을 실시예 1과 같이 해서 조사했다. 야생주와 비교해서 생산량, 환원형 보효소 Q₁₀의 비율이 높은 주에 대해서는 다시 변이조작을 반복했다. 그 결과, 10회의 변이을 반복함으로써 15㎍/mL 이상의 생산능력을 나타내는 변이주를 얻었다. 또한, 이 때의 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 80몰% 이상이었다.

(실시예 3)

사이토엘라·콤플리카타(Saitoella complicata) IFO10748을 배지(펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g, 글루코오스 20g/L, pH6.0)에서 호기적으로 25℃로 72시간 10L 배양했다. 얻어진 균체를 질소 가스로 밀폐한 라니사제 압력식 호모지나이저에 의해 파쇄압력 80MPa로 2회 파쇄하여 균체 파쇄액을 조제했다. 이 균체 파쇄액으로부터 이소프로판올 30용량부, 헥산 40용량부의 비율로 추출을 3회 반복함으로써 추출액을 얻었다. 추출율은 99%이며, 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 97몰%였다.

(실시예 4)

로도토룰라·글루티니스(Rodotorula glutinis) IFO1125의 변이주를 배지 10L (펩톤 10g, 효모 엑기스 5g, 말토 엑기스 3g, 글루코오스 20g/L, pH6.0)에서 25℃로 호기적으로 배양할 때에, 48시간 후부터 글루코오스를 4g/시간의 비율로 96시간 째까지 유가했다(유가 글루코오스량 190g). 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산량은 20㎍/mL 이상이며, 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 80몰% 이상이었다.

(실시예 5)

실시예 3에서 얻어진 추출액을 헥산 용액으로 치환하고, 실리카 겔을 충전한 컬럼에 흡착시켜, n-헥산/디에틸에테르(9/1)용액으로 전개, 용출시켜 환원형 보효소 Q₁₀을 포함하는 분획을 얻었다. 또한, 본 분획을 교반하면서 2℃까지 냉각시켜 백색의 슬러리를 얻었다. 이상 모든 조작은 질소분위기하에서 행했다. 얻어진 슬러리를 감압여과하여 습결정을 상기 전개액으로 세정하고(세정에 이용한 용매의 온도는 2℃), 습결정을 감압건조(20 내지 40℃, 1 내지 30mmHg) 함으로써 백색의 건조결정 81㎎을 얻었다. 얻어진 결정의 순도는 99.9%, 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 90몰%였다.

(실시예 6)

실시예 3에서 얻어진 추출액을 n-헥산으로 치환하고, 이산화 망간을 50㎎ 가하여 30℃로 30분간 교반했다. 이 반응액을 분취하고, 실시예 5와 같이 해서 정제하면 고순도의 산화형 보효소 Q₁₀을 74㎎ 얻을 수 있었다.

(실시예 7)

사이토엘라·콤플리카타(Saitoella complicata) IFO10748을 배지(펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g, 글루코오스 20g/L, pH6.0)에서 25℃, 72시간 호기적으로 500mL 배양했다. 얻어진 균체를 질소 가스로 밀폐한 라니사제 압력식 호모지나이저에 의해 파쇄압력 80MPa로 2회 파쇄하여 균체 파쇄액을 조제했다. 파쇄액 중의 환원형 보효소 Q₁₀의 비율은 산화형도 포함한 전 보효소 Q₁₀에 대해서 97%였다. 이 균체 파쇄액 200mL에 대해서, 이소프로판올 및 n-헥산을, 하기 표 4 중의 1회째 추출의 난에서 나타내는 비율로, 용제량의 합계가 500mL가 되도록 혼합하고, 온도 40℃로 30분간 교반하여 제1회째의 추출조작을 행했다. 추출 종료 후, 10분간 정치하고, 분리된 상층을 분리했다. 이 때의 토털 액량에 대한 하층(잔사)의 용량비를 분리성의 지표로 하고, 계면위치로서 표 4 중에 나타냈다.

또한, 제2회째의 추출을 행하기 위해, 잔사층의 용제농도를 측정하고, 전체의 용제비가 표 4 중의 2회째의 난에서 나타내는 비율이 되도록, 이소프로판올과 헥산을 추가하고, 온도 40℃로 30분간 교반했다. 그 다음에, 10분간 정치하고, 상기와 같이 상층을 분리하여 잔사층의 용제농도를 측정하고, 전체의 용제비가 표 4 중의 3회째의 난에서 나타내는 비율이 되도록 이소프로판올과 헥산을 추가하고, 온도 25℃로 30분간 교반하여 제3회째의 추출조작으로 했다.

제1회, 제2회, 제3회의 각각의 단계에서 분리된 상층 중에 포함되는 환원형 보효소 Q₁₀의 양의, 추출조작을 행하기 전의 균체 파쇄액 또는 추출잔사 중에 포함되는 환원형 보효소 Q₁₀의 양에 대한 비를, 각각의 단계에서의 환원형 보효소 Q₁₀의 추출율로 하고, 그 계산결과를 표 4 중에 나타냈다. 또한, 제2회, 제3회 통산에서의 보효소 Q₁₀의 추출율도 나타냈다. 어느 단계에 있어서나 정치 분리성은 양호하고, 3회의 추출을 행했을 경우의 통산 추출율은 90% 이상으로, 높은 회수율을 나타냈다. 특히, 이소프로판올 농도를 30% 이상으로 했을 경우는 99% 이상의 높은 회수율이 되었다.

		용제 비율(vol%)	계면 위치	추출율(%)
		이소프로판올	헥산	각 회 추출율	통산 추출율
Case 1	1회째2회째3회째	18.819.029.7	52.752.441.7	0.4920.6240.645	73.647.655.5	73.686.293.8
Case 2	1회째2회째3회째	31.337.740.6	40.233.730.9	0.4990.5490.565	90.783.740.1	90.798.599.1
Case 3	1회째2회째3회째	31.334.136.8	40.237.334.6	0.5260.5530.555	89.085.846.6	89.098.399.1
Case 4	1회째2회째3회째	31.334.142.4	40.237.329.0	0.5260.5530.644	89.085.850.0	89.098.399.0
Case 5	1회째2회째3회째	31.340.140.7	40.231.430.7	0.5260.5950.593	89.088.145.3	89.098.699.1
Case 6	1회째2회째3회째	31.340.145.8	40.231.425.7	0.5260.5950.663	89.088.140.7	89.098.699.0

(실시예 8)

사이토엘라·콤플리카타(Saitoella complicata) IFO10748을 배지(펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g, 글루코오스 20g/L, pH6.0)에서 25℃, 72시간 호기적으로 750L 배양했다. 얻어진 균체를 질소 가스로 밀폐한 라니사제 압력식 호모지나이저에 의해 파쇄압력 140MPa로 2회 파쇄하여 균체 파쇄액을 조제했다. 이 균체 파쇄액을 도1에 나타내는 향류 3단 연속추출장치로 연속추출을 행했다. 교반조의 용량은 630L, 정치 분리조의 용량은 200L로 했다. 미생물 균체 파쇄액을 제1단 교반조로, 이소프로판올과 n-헥산을 각 단으로 공급했다. 균체 파쇄액의 공급액량은 2L/분, 이소프로판올 및 n-헥산의 공급량은 각 단으로의 공급량을 합계한 총량으로서 이소프로판올 1.3L/분, n-헥산 3.7L/분으로 했다. 단, 이 때, 각단계의 용제농도는, 이소프로판올 농도 5 내지 50v/v%, n-헥산 농도 25 내지 65v/v%의 범위가 되도록 적당히 조정했다. 추출은 온도 40℃로, 처리시간은 6시간으로 했다. 6시간째의 시점에서의, 3단째의 정치 분리조의 추출잔사 중에 남는 환원형 보효소 Q₁₀의 양으로부터, 균체 파쇄액으로부터 추출된 환원형 보효소 Q₁₀의 회수율을 계산한 바, 98.9%가 되었다. 또한, 전 운전기간을 통해, 정치 분리는 양호하게 행하여지고, 안정한 추출의 연속조작이 가능했다.

본 발명의 방법에 의하면, 미생물의 배양, 환원형 보효소 Q₁₀의 회수라고 하는 매우 간편한 조작에 의해 환원형 보효소 Q₁₀을 공업적 규모로 염가에 제조할 수 있고, 또한, 산화형 보효소 Q₁₀에 대해서도 간편한 조작에 의해 제조할 수 있다.

Claims

하기 식 (I)로 나타내어지는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법으로서, 탄소원, 질소원, 인원 및 미량 영양소를 포함하는 배지 중에서 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양함으로써, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 필요에 따라 상기 미생물 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하는 것을 특징으로 하는 환원형 보효소 Q₁₀의 제조방법.

<화학식 I>
제1항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 추출액을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 배양종료시의 환원형 보효소 Q₁₀생산량이1㎍/mL 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배양은 15 내지 45℃, 또한, pH4 내지 9로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 중, 탄소원의 농도를 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력에 실질적으로 악영향을 끼치지 않는 농도로 제어하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 배양은 유가배양법에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제6항에 있어서, 탄소원을 다른 성분과는 별도로 배지에 공급하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 배양은 호기적으로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 추출에 있어서 미생물 세포를 파쇄하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 세포의 파쇄는 물리적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리, 가열처리, 자기소화, 침투압 용해, 또는 원형질 용해에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 세포의 파쇄는 물리적 처리, 강산을 이용하는 산처리, 또는 가열처리에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서, 세포의 파쇄는 물리적 처리에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제12항에 있어서, 물리적 처리는 고압 호모지나이저, 초음파 호모지나이저, 프렌치 프레스 또는 볼밀에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 파쇄는 산성 내지 약염기성 조건하에 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출에 이용하는 유기용제로서 탄화수소류, 지방산 에스테르류, 에테르류 및 니트릴류 중 1종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출은 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 습균체 또는 건조균체로부터, 친수성 유기용제를 이용해서 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제16항에 있어서, 친수성 유기용제는 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀의 추출은 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액으로부터 소수성 유기용제를 이용해서 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제18항에 있어서, 소수성 유기용제는 탄화수소류, 지방산 에스테르류 또는 에테르류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 소수성 유기용제에 부가해서 보조적 용제로서 친수성 유기용제를 병용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제20항에 있어서, 소수성 유기용제는 탄화수소류이며, 친수성 유기용제는 알코올류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제20항에 있어서, 소수성 유기용제는 지방족 탄화수소이며, 친수성 유기용제는 탄소수 1 내지 5의 1가 알코올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제20항에 있어서, 소수성 유기용제는 헥산 및 헵탄의 1종 이상이며, 친수성 유기용제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 및 2-프로판올의 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 추출은 소수성 유기용제가 25 내지 65용량% 및 친수성 유기용제 5 내지 50용량%의 조건으로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 추출은 연속추출에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 추출은 산성 내지 약염기성 조건하에 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 세포의 파쇄 및(또는) 추출은 환원형 보효소 Q₁₀이 산화 반응으로부터 방호된 조건하에 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제27항에 있어서, 산화 반응으로부터 방호된 조건하는, 탈 산소분위기하, 고염 농도하, 강산 존재하, 산화방지제 존재하, 또는 환원조건하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물은, 시험관(내경 21㎜, 전체 길이 200㎜)을 이용해서 10mL의 배지[(글루코오스 20g, 펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g)/L, pH6.0] 중에서 25℃, 72시간 진탕 배양(진폭 2㎝, 310왕복/분)하고, 얻어진 증식액을 필요에 따라 농축하고, 질소분위기하, 상기 증식액 10용량부에 대해서 이소프로판올 3용량부 및 n-헥산 18.5용량부의 공존하에, 유리 비즈(425 내지 600미크론) 10용량부를 이용하여 3분간 격렬하게 진탕해서 파쇄함으로써 조제한 소수성 유기용제상(n-헥산상)에 대해서 HPLC에 의해 측정했을 경우에, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제29항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물은 제29항 기재의 조건으로 HPLC에 의해 측정했을 경우에, 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력으로서 1㎍/mL 이상을 나타내는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 아세토백터(Acetobacter)속, 아미노백터(Aminobacter)속, 아그로모나스(Agromonas)속, 아시드필라스(Acidiphilum)속, 불레로미세스(Bulleromyces)속, 불레라(Bullera)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 크립토코카스(Cryptococcus)속, 키오노스파에라(Chionosphaera)속, 칸디다(Candida)속, 세리노스테루스(Cerinosterus)속, 엑소피알라(Exisophiala)속, 엑소바시디움(Exobasidium)속, 필로미세스(Fellomyces)속, 필로바시디엘라(Filobasidiella)속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 게오트리컴(Geotrichum)속, 그라피올라(Graphiola)속, 글루코노백터(Gluconobacter)속, 코코바엘라(Kockovaella)속, 쿠르츠마노미세스(Kurtzmanomyces)속, 랄라리아(Lalaria)속, 로이코스포리디움(Leucosporidium)속, 레기오넬라(Legionella)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속, 미코플라나(Mycoplana)속, 오오스포리디움(Oosporidium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 슈도지마(Psedozyma)속, 파라코카스(Paracoccus)속, 페트로미세스(Petromyc)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 리조모나스(Rhizomonas)속, 로도비움(Rhodobium)속, 로도플라네스(Rhodoplanes)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 로도백터(Rhodobacter)속, 스포로볼로미세스 (Sporobolomyces)속, 스포리디오볼러스(Sporidiobolus)속, 사이토엘라(saitoella)속, 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속, 스핀고모나스(Sphingomonas)속, 스포트리쿰(Sporotrichum)속, 심포디오미코프시스(Sympodiomycopsis)속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium)속, 타파리나(Tapharina)속, 트레멜라(Tremella)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 틸레티아리아(Tilletiaria)속, 틸레티아(Tilletia)속, 톨리포스포리움(Tolyposporium)속, 틸레티오프시스(Tilletiopsis)속, 우스틸라고(Ustilago)속, 우데니오미세스(Udeniomyce)속, 크산토피로미세스(Xanthophllomyces)속, 크산토박테리움(Xanthobacter)속, 페킬로마이세스(Paecilomyces)속, 아크레모니움(Acremonium)속, 하이호모나스(Hyhomonus)속, 또는 리조비움(Rhizobium)속의 미생물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 환원형 보효소 Q₁₀을 소망에 따라 정제한 후, 정석을 하여 환원형 보효소 Q₁₀결정을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.
하기 식(II)로 나타내어지는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법으로서, 탄소원, 질소원, 인원 및 미량 영양소를 포함하는 배지 중에서 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물을 배양함으로써 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 미생물 세포를 얻고, 필요에 따라 상기 미생물 세포를 파쇄하여 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 산화시켜 산화형 보효소 Q₁₀으로 변환한 후에 이것을 유기용제로 추출하거나, 또는 생산된 환원형 보효소 Q₁₀을 유기용제로 추출하고, 필요에 따라 정제 처리를 실시한 후에, 환원형 보효소 Q₁₀을 산화시켜 산화형 보효소 Q₁₀으로 변환시키는 것을 특징으로 하는 산화형 보효소 Q₁₀의 제조방법.

<화학식 II>
제33항에 있어서, 배양종료시의 환원형 보효소 Q₁₀생산량이 1㎍/mL 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 또는 제34항에 있어서, 배양은 15 내지 45℃, 또한, pH4 내지 9로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 중, 탄소원의 농도를 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력에 실질적으로 악영향을 끼치지 않는 농도로 제어하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제36항에 있어서, 배양은 유가배양법에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제37항에 있어서, 탄소원을 다른 성분과는 별도로 배지에 공급하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 배양은 호기적으로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 추출에 있어서 미생물 세포를 파쇄하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제40항에 있어서, 세포의 파쇄는 물리적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리, 가열처리, 자기소화, 침투압 용해, 또는 원형질 용해에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제41항에 있어서, 세포의 파쇄는 물리적 처리에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제42항에 있어서, 물리적 처리는 고압 호모지나이저, 초음파 호모지나이저, 프렌치 프레스 또는 볼 밀에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 보효소 Q₁₀의 추출은 미생물 세포 또는 상기 세포 파쇄물의 습균체 또는 건조균체로부터, 친수성 유기용제를 이용해서 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제44항에 있어서, 친수성 유기용제는 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올 또는 2-프로판올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 보효소 Q₁₀의 추출은 미생물세포 또는 상기 세포 파쇄물의 수성 현탁액으로부터, 소수성 유기용제를 이용해서 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제46항에 있어서, 소수성 유기용제는 탄화수소류, 지방산 에스테르류 또는 에테르류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제46항 또는 제47항에 있어서, 소수성 유기용제에 부가해서 보조적 용제로서 친수성 유기용제를 병용하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제48항에 있어서, 소수성 유기용제는 탄화수소류이고, 친수성 유기용제는 알코올류인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제48항에 있어서, 소수성 유기용제는 지방족 탄화수소이며, 친수성 유기용제는 탄소수 1 내지 5의 1가 알코올인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제48항에 있어서, 소수성 유기용제는 헥산 및 헵탄의 1종 이상이며, 친수성 유기용제는 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 추출은 소수성 유기용제가 25내지 65용량% 및 친수성 유기용제 5 내지 50용량%의 조건으로 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 추출은 연속추출에 의해 행하여지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물은 시험관(내경 21㎜, 전체 길이 200㎜)을 이용하여 10mL의 배지[(글루코오스 20g, 펩톤 5g, 효모 엑기스 3g, 말토 엑기스 3g)/L, pH6.0] 중에서 25℃, 72시간 진탕 배양(진폭 2㎝, 310왕복/분)하고, 얻어진 증식액을 필요에 따라 농축하고, 질소분위기하, 상기 증식액 10용량부에 대해서 이소프로판올 3용량부 및 n-헥산 18.5용량부의 공존하에, 유리 비즈(425 내지 600미크론) 10용량부를 이용하여 3분간 격렬하게 진탕해서 파쇄함으로써 조제한 소수성 유기용제상(n-헥산상)에 대해서 HPLC에 의해 측정했을 경우에, 환원형 보효소 Q₁₀을 전 보효소 Q₁₀중 70몰% 이상의 비율로 함유하는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제54항에 있어서, 환원형 보효소 Q₁₀생산성 미생물은 제54항 기재의 조건으로 HPLC에 의해 측정했을 경우에 배지당의 환원형 보효소 Q₁₀의 생산능력으로서 1㎍/mL 이상을 나타내는 것인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 아스페르길루스(Aspergillus)속, 아세토백터(Acetobacter)속, 아미노백터(Aminobacter)속, 아그로모나스(Agromonas)속, 아시드필라스(Acidiphilium)속, 불레로미세스(Bulleromyces)속, 불레라(Bullera)속, 브레분디모나스(Brevundimonas)속, 크립토코카스(Cryptoco㏄us)속, 키오노스파에라(Chionosphaera)속, 칸디다(Candida)속, 세리노스테루스(Cerinosterus)속, 엑소피알라(Exisophiala)속, 엑소바시디움(Exobasidium)속, 필로미세스(Fellomyces)속, 필로바시디엘라(Filobasidiella)속, 필로바시디움(Filobasidium)속, 게오트리컴(Geotrichum)속, 그라피올라(Graphiola)속, 글루코노백터(Gluconobacter)속, 코코바엘라(Kockovaella)속, 쿠르츠마노미세스(Kurtzmanomyces)속, 랄라리아(Lalaria)속, 로이코스포리디움(Leucosporidium)속, 레기오넬라(Legionella)속, 메틸로박테리움(methylobacterium)속, 미코플라나(Mycoplana)속, 오오스포리디움(Oosporidium)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 슈도지마(Psedozyma)속, 파라코카스(Paracoccus)속, 페트로미세스(Petromyc)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 리조모나스(Rhizomonas)속, 로도비움(Rhodobium)속, 로도플라네스(Rhodoplanes)속, 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas)속, 로도백터(Rhodobacter)속,스포로볼로미세스(Sporobolomyces)속, 스포리디오볼라스(Sporidiobolus)속, 사이토엘라(Saitoella)속, 시조사카로미세스(Schizosaccharomyces)속, 스핀고모나스(Sphingomonas)속, 스포트리쿰(Sporotrichum)속, 심포디오미코프시스(Sympodiomycopsis)속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium)속, 타파리나(Tapharina)속, 트레멜라(Tremella)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 틸레티아리아(Tilletiaria)속, 틸레티아(Tilletia)속, 톨리포스포리움(Tolyposporium)속, 틸레티오프시스(Tilletiopsis)속, 우스틸라고(Ustilago)속, 우데니오미세스(Udeniomyce)속, 크산토필로미세스(Xanthophllomyces)속, 크산토박테리움(Xanthobacter)속, 페킬로마이세스(Paecilomyces)속, 아크레모니움(Acremonium)속, 하이호모나스(Hyhomonus)속, 또는 리조비움(Rhizobium)속의 미생물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제33항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 산화형 보효소 Q₁₀을 소망에 따라 정제한 후, 정석을 하여 산화형 보효소 Q₁₀결정을 얻는 것을 특징으로 하는 제조방법.