DE60220281T2

DE60220281T2 - Verfahren zur herstellung von reduziertem coenzym q10

Info

Publication number: DE60220281T2
Application number: DE60220281T
Authority: DE
Inventors: Takahiro Kobe-shi UEDA; Shiro Akashi-shi KITAMURA; Yasuyoshi Himeji-shi UEDA
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2001-07-13
Filing date: 2002-07-15
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2022-07-16
Also published as: EP1415972A1; AU2002318847A2; EP1415972B1; KR20040018455A; DE60220281D1; US7105709B2; US20040236154A1; AU2002318847B2; WO2003006412A1; ATE362907T1; JP4116541B2; CN1551864A; CN1266103C; JPWO2003006412A1; EP1415972A4; CA2453165A1; TWI237019B

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von reduziertem Coenzym Q₁₀. Reduziertes Coenzym Q₁₀ zeigt ein höheres Niveau der oralen Absorbierbarkeit verglichen mit oxidiertem Coenzym Q₁₀, und ist eine Verbindung, die als Inhaltsstoff in guten Nahrungsmitteln, funktionalen Ernährungsnahrungsmitteln, spezifischen Gesundheitsnahrungsmitteln, Nährstoffergänzungsmitteln, Nährstoffen, Tiermedikamenten, Getränken, Futter, Kosmetika, Medikamenten, Heilmitteln, vorbeugenden Medikamenten, etc. nützlich ist.
Technischer Hintergrund
Es ist bekannt, daß reduziertes Coenzym Q₁₀ durch Herstellen des Coenzyms Q₁₀ in konventioneller Weise hergestellt werden kann, beispielsweise durch Synthese, Fermentieren oder Extraktion aus natürlichen Produkten, und durch das Aufkonzentrieren einer reduzierten Coenzym Q₁₀-haltigen Eluatfraktion, die durch Chromatographie gewonnen wird ( JP-A-10-109933 ). Bei der Gelegenheit, wie in der oben zitierten Veröffentlichung beschrieben, kann die chromatographische Aufkonzentrierung nach der Reduzierung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ durchgeführt werden, welches in dem reduziertem Coenzym Q₁₀ enthalten ist, indem ein Reduktionsmittel wie Natriumborhydrid oder Natriumdithionit (Natriumhyposulfit) verwendet wird, oder reduziertes Coenzym Q₁₀ kann durch Umsetzen des Reduktionsmittels, das oben erwähnt wurde, mit einem vorhandenen Coenzym Q₁₀ von hohem Reinheitsgrad hergestellt werden.
JP-A-57-70834 offenbart ein Beispiel, bei dem reduziertes Coenzym Q_l0 durch Lösen von Coenzym Q₁₀ in Hexan synthetisiert wurde, und indem eine wäßrige Lösung aus Natriumhydrosulfit (Natriumhyposulfit) in einer zweifach dem Gewicht des Coenzym Q₁₀ entsprechenden Menge zur Lösung zugegeben wurde, gefolgt vom Rühren.
Die vorstelligen Erfinder haben jedoch das obige Reduktionsverfahren vorläufig untersucht und herausgefunden, daß es nicht so leicht ist, reduziertes Coenzym Q₁₀ in großer Ausbeute mit hoher Qualität zu gewinnen.
Das obige Problem führt nicht nur zu ökonomischen Nachteilen, sondern auch zu Problemen der Qualität wie beispielsweise der Zumischung oxidierten Coenzyms Q₁₀, welches schwer zu entfernen ist, in einem Produkt. Die Verwendung einer großen Menge an Reduktionsmittel verstärkt außerdem die Last der Entfernung und Entgiftung des Reduktionsmittels und der hiervon abstammenden Bestandteile.
Die obigen Nachteile der obigen Reduktionsreaktion geben daher Anlaß für die Notwendigkeit eines anderen Reinigungsverfahrens.
Zusammenfassung der Erfindung
Im Hinblick auf das oben Gesagte, hat die vorliegende Erfindung das Ziel, ein günstiges und effizientes Syntheseverfahren zum Erhalt von reduziertem Coenzym Q₁₀ mit hoher Qualität bereitzustellen.
Die vorstelligen Erfinder haben intensive Untersuchungen angestellt, und im Ergebnis herausgefunden, daß reduziertes Coenzym Q₁₀ von hoher Qualität in einer hohen Ausbeute auf leichte und wirksame Weise gewonnen werden kann, indem eine Reduktionsreaktion unter spezifischen Bedingungen in einem Verfahren zur Herstellung von reduziertem Coenzym Q₁₀ durchgeführt werden kann, welches das Reduzieren des oxidierten Coenzyms Q_l0 mit Dithionsäure oder einem Salz davon umfaßt. Auf Grundlage dieses Befundes haben die vorstelligen Erfinder die vorliegende Erfindung vollbracht.
Demgemäß ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese von reduziertem Coenzym Q₁₀, welches das Reduzieren eines oxidierten Coenzyms Q₁₀ in wäßrigem Medium unter Verwendung von Dithionsäure oder einem Salz davon umfaßt, wobei die Reduktion in Gegenwart eines Salzes und/oder in einer deoxygenierten Atmosphäre und bei einem pH-Wert von 7 oder darunter durchgeführt wird.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung wird Dithionsäure oder ein Salz davon als Reduktionsmittel verwendet. Die Dithionsäure oder ein Salz davon ist nicht besonders beschränkt, aber eine Salzform der Dithionsäure wird allgemein verwendet. Das Salz der Dithionsäure ist nicht besonders beschränkt, schließt aber als bevorzugte Spezies Alkalimetalle, Erdalkalimetallsalze, Ammoniumsalze und ähnliche ein. Alkalimetallsalze wie ein Lithiumsalz, ein Natriumsalz und Kaliumsalz sind mehr bevorzugt, und ein Natriumsalz ist am meisten bevorzugt.
Die oben erwähnte Reduktionsreaktion wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Menge an Wasser, die in der Reduktionsreaktion verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt, kann jedoch eine Menge Wasser sein, damit eine passende Menge des Reduktionsmittels, d.h. die Thionsäure oder eines Salzes davon, darin gelöst werden kann. Im allgemeinen ist es beispielsweise ratsam, daß die Menge der Dithionsäure oder des Salzes davon für gewöhnlich auf nicht mehr als 30 Gew.% eingestellt ist, und vorzugsweise auf nicht mehr als 20 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des Wassers. Vom Gesichtspunkt der Produktivität aus ist es u.a. ratsam, daß die Menge im allgemeinen auf nicht weniger als 1 Gew.% eingestellt wird, vorzugsweise nicht weniger als 5 Gew.% und mehr bevorzugt nicht weniger als 10 Gew.%.
Die oben erwähnte Reduktionsreaktion wird in Gegenwart eines Salzes und/oder in einer deoxygenierten Atmosphäre durchgeführt, und bei einem pH-Wert von 7 oder darunter. Anders gesagt kann die oben erwähnte Reduktionsreaktion in einer sauerstoffhaltigen Atmosphäre, wenn in Gegenwart eines Salzes und wenn ein pH-Wert von 7 oder darunter vorliegt, durchgeführt werden. Außerdem ist eine Bedingung ohne Vorhandensein von Salzen erlaubt, wenn die Reduktion in einer deoxygenierten Atmosphäre und einem pH-Wert von 7 oder darunter durchgeführt wird. Außerdem ist es ebenfalls möglich, die Reduktion in Gegenwart eines Salzes und in einer deoxygenierten Atmosphäre bei einem pH-Wert von 7 oder darunter durchzuführen.
Das oben erwähnte Salz ist nicht besonders beschränkt, sofern das reduzierte Coenzym Q₁₀ hierdurch nicht oxidiert wird. Beispielsweise kann ein Salz erwähnt werden, das aus einem Alkalimetall wie Lithium, Natrium und Kalium besteht, oder Erdalkalimetalle, wie Magnesium und Kalium, mit einem Halogenatom wie beispielsweise Fluor, Chlor und Brom, oder einem Rest, der durch Ausschließen eines Protons einer anorganischen Säure wie Schwefelsäure oder einer organischen wie Ameisensäure, Essigsäure und Propionsäure gewonnen wird. Von diesen sind die anorganischen Salze bevorzugt, und Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumsulfat und ähnliche sind mehr bevorzugt.
Hinsichtlich der Konzentration des oben erwähnten Salzes, ist eine hohe Konzentration vorzuziehen. Genau gesagt beträgt die Konzentration vorzugsweise 3 Gew.% oder darüber, mehr bevorzugt 5 Gew.% oder darüber und noch bevorzugter 10 Gew.% oder darüber, bezogen auf Wasser. Außerdem ist es besonders bevorzugt das obigen Salz in einem Reaktionssystem (wäßriges Medium) zu lösen, so daß die Sättigung nahe der Sättigung liegt.
Die oben erwähnte deoxygenierte Atmosphäre kann durch Substituierung mit einem inerten Gas, Druckreduzierung, Kochen oder eine Kombination daraus erreicht werden. Es ist bevorzugt, zumindest die Substitution in einem inerten Gas durchzuführen, d.h. eine inerte Gasatmosphäre zu verwenden. Als inertes Gas können beispielsweise Stickstoffgas, Kohlendioxidgas, Heliumgas, Argongas, Wasserstoffgas und ähnliche erwähnt werden. Stickstoffgas ist jedoch bevorzugt.
Es wurde gefunden, daß die Reduktionsreaktion in Gegenwart eines Salzes und/oder in einer deoxygenierten Atmosphäre, die oben erwähnt wurde, besonders effizient war, wenn Dithionsäure oder ein Salz als Reduktionsmittel verwendet wird, und daß eine solche Reaktion stark an der Verbesserung der Ausbeute der Reduzierungsreaktion oder der Abnahme des Reduktionsmittels teil hatte.
Außerdem wird die obige Reduktionsreaktion bei einem pH-Wert von 7 oder darunter durchgeführt, vorzugsweise in einem pH-Bereich von 3 bis 7 und mehr bevorzugt in einem pH-Bereich von 3 bis 6. Der oben erwähnte pH-Wert kann mit Säuren eingestellt werden (z.B. Mineralsäuren, wie Salzsäure und Schwefelsäure), oder mit Basen (z.B. Alkalimetallhydroxiden, wie Natriumhydroxid).
Wie oben beschrieben wurde, können zahlreiche Faktoren entsprechend kontrolliert werden, um den Verbleib oxidierten Coenzyms Q₁₀ oder eine Bildung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ als Nebenprodukt des reduzierten Coenzym Q₁₀ zu minimieren, und dadurch kann reduziertes Coenzym Q₁₀ mit hoher Qualität in einer großen Ausbeute synthetisiert werden.
In der oben erwähnten Reduktionsreaktion wird ein günstiges Umfeld bereitgestellt, welches ermöglicht, daß vorzugsweise die Reduktionsreaktion voranschreitet, und der Verbleib, die Nebenproduktbildung und die Zumischung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ minimiert wird. Dadurch kann in stabiler Weise eine große Ausbeute erreicht werden. Außerdem ist es ebenfalls möglich, die Menge der oben erwähnten Dithionsäure oder des Salzes, das als Reduktionsmittel verwendet werden soll, zu minimieren.
Die Menge der Dithionsäure oder des Salzes, das verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus gesehen sollte die Menge, die verwendet wird, jedoch nicht größer sein als das Beladungsgewicht des oxidierten Coenzyms Q₁₀. Das untere Niveau kann vorzugsweise nicht geringer als 1/5 des Gewichts sein, mehr bevorzugt nicht geringer als ungefähr 2/5 des Gewichts und noch bevorzugter nicht geringer als 3/5 des Gewichts, bezogen auf das Beladungsgewicht des oxidierten Coenzyms Q₁₀. Auf diese Weise kann die Reaktion besser mit einer Menge durchgeführt werden, die innerhalb eines Bereichs von ungefähr 2/5 des Gewichts des oben erwähnten Beladungsgewichts bis zu einem Gewicht, das grob dem des Beladungsgewichts entspricht, durchgeführt werden.
Die oben erwähnte Reduktionsreaktion wird vorzugsweise unter Druckfluß durchgeführt. Die Kraft, die für das Rühren benötigt wird, um einen solchen Fluß per Volumeneinheit zu verursachen, beträgt im allgemeinen nicht weniger als ungefähr 0,01 kW/m³, vorzugsweise nicht weniger als ungefähr 0,1 kW/m³ und mehr bevorzugt nicht weniger als ungefähr 0,3 kW/m³. Der oben erwähnte Druckfluß wird im allgemeinen durch die Umdrehung einer Rührschaufel/Rührschaufeln verursacht, aber die Verwendung von Rührschaufeln ist nicht immer notwendig, sofern der oben erwähnte Fluß anders erzielt werden kann. Beispielsweise kann ein Verfahren, das auf Flüssigzirkulation beruht, benutzt werden.
Die Temperatur für die oben erwähnte Reduktionsreaktion ist nicht besonders beschränkt, aber vorzugsweise beträgt sie 100°C oder darunter, mehr bevorzugt 80°C oder darunter und noch bevorzugter 60°C oder darunter. Das untere Niveau der Temperatur ist vorzugsweise das der Verfestigungstemperatur des Systems. Die Reaktion kann vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 0 bis 100°C, mehr bevorzugt von 0 bis 80°C und noch bevorzugter von 0 bis 60°C durchgeführt werden.
Die Substratkonzentration in der oben erwähnten Reduktionsreaktion ist nicht besonders beschränkt, aber das Gewicht des oxidierten Coenzyms Q₁₀ bezogen auf das Lösungsmittelgewicht beträgt vorzugsweise nicht weniger als 1 Gew.%, mehr bevorzugt nicht weniger als 3 Gew.%, noch bevorzugter nicht weniger als 10 Gew.% und besonders bevorzugt nicht weniger als 15 Gew.%. Das obere Niveau ist nicht besonders beschränkt, aber ist ebenfalls vorzugsweise nicht mehr als ungefähr 60 Gew.%, mehr bevorzugt nicht mehr als 50 Gew.%, noch bevorzugter nicht mehr als 40 Gew.% und besonders bevorzugt nicht mehr als 30 Gew.%. Das bedeutet, daß die Reaktion vorzugsweise bei einer Substratkonzentration von ungefähr 1 bis 60 Gew.%, bevorzugt ungefähr 3 bis 50 Gew.%, und am bevorzugtesten ungefähr 10 bis 40 Gew.% durchgeführt werden kann.
Die oben erwähnte Reduktionsreaktion wird in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Das wäßrige Medium kann einfaches Wasser sein oder es kann eine Kombination aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel sein.
Das oben erwähnte organische Lösungsmittel ist nicht besonders beschränkt, aber im Hinblick auf die Ausbeute und Qualität des reduzierten Coenzyms Q₁₀, vorzugsweise mindestens eine Art, die aus Kohlenwasserstoffen, Fettsäureestern, Ethern und Nitrilen ausgewählt ist, und hiervon sind Kohlenwasserstoffe am bevorzugtesten. Die oben erwähnten organischen Lösungsmittel sind wirksame Lösungsmittel mit großer Fähigkeit das Vorhandensein, die Bildung von Nebenprodukten und die Zumischung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ zu inhibieren.
Die Kohlenwasserstoffe sind nicht besonders beschränkt, aber es können beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, aromatische Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe etc. erwähnt werden. Bevorzugt sind aliphatische Kohlenwasserstoffe und aromatische Kohlenwasserstoffe und darunter sind aliphatische Kohlenwasserstoffe besonders bevorzugt.
Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe sind nicht besonders beschränkt, und sie können cyclisch oder acyclisch sein oder gesättigt oder ungesättigt. Jedoch enthalten sie im allgemeinen 3 bis 20 Kohlenstoffatome und bevorzugt 5 bis 12 Kohlenstoffatome.
Als spezifische Beispiele können beispielsweise erwähnt werden Propan, Butan, Isobutan, Pentan, 2-Methylbutan, Cyclopentan, 2-Penten, Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, Hexylen, Cyclohexylen, Heptan, 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan, Methylcyclohexan, 1-Hepten, Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Ethylcyclohexan, 1-Octen, Nonan, 2,2,5-Trimethylhexan, 1-Nonen, Decan, 1-Decen, p-Menthan, Undecan, Dodecan, etc.
Von diesen sind die gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffe mit 5 bis 8 Kohlenstoffatomen mehr bevorzugt, und besonders bevorzugt werden Pentan, 2-Methylbutan und Cyclopentan verwendet, die 5 Kohlenstoffatome haben (bezeichnet als "Pentane"); Hexan, 2-Methylpentan, 2,2-Dimethylbutan, 2,3-Dimethylbutan, Methylcyclopentan, Cyclohexan, welche 6 Kohlenstoffatome haben (nachfolgend bezeichnet als "Hexane"); Heptan, 2-Methylhexan, 3-Methylhexan, 2,3-Dimethylpentan, 2,4-Dimethylpentan, Methylcyclohexan, die 7 Kohlenstoffatome haben (bezeichnet als "Heptane"); Octan, 2,2,3-Trimethylpentan, Isooctan, Ethylcyclohexan, die 8 Kohlenstoffatome haben (bezeichnet als Octane); und eine Mischung daraus. Insbesondere sind die oben erwähnten Heptane besonders bevorzugt, da sie die Neigung dazu haben, eine sehr starke Wirkung zu haben, um reduziertes Coenzym Q₁₀ vor Oxidierung zu schützen, und Heptan ist am meisten bevorzugt.
Die aromatischen Kohlenwasserstoffe sind nicht besonders beschränkt, aber im allgemeinen enthalten sie 6 bis 20 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 6 bis 12 Kohlenstoffatome und mehr bevorzugt 7 bis 10 Kohlenstoffatome. Als spezifische Beispiele können erwähnt werden beispielsweise Benzol, Toluol, Xylol, o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Ethylbenzol, Cumol, Mesitylen, Tetralin, Butylbenzol, p-Cymol, Cyclohexylbenzol, Diethylbenzol, Pentylbenzol, Dipentylbenzol, Dodecylbenzol, Styrol, etc. Bevorzugt sind Toluol, Xylol, o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Ethylbenzol, Cumol, Mesitylen, Tetralin, Butylbenzol, p-Cymol, Cyclohexylbenzol, Diethylbenzol und Pentylbenzol. Mehr bevorzugt sind Toluol, Xylol, o-Xylol, m-Xylol, p-Xylol, Cumol und Tetralin und am bevorzugtesten ist Cumol.
Die halogenierten Kohlenwasserstoffe sind nicht besonders beschränkt, und sie können cyclisch oder acyclisch, gesättigt oder ungesättigt sein. Jedoch werden acyclische Kohlenwasserstoffe vorzugsweise verwendet. Mehr bevorzugt sind chlorierte Kohlenwasserstoffe und fluorierte Kohlenwasserstoffe, und chlorierte Kohlenwasserstoffe werden noch mehr bevorzugt. Zusätzlich sind solche, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome und mehr bevorzugt 1 bis 2 Kohlenstoffatome enthalten, zu verwenden.
Als spezifische Beispiele können beispielsweise erwähnt werden Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, 1,1-Dichlorethan, 1,2-Dichlorethan, 1,1,1-Trichlorethan, 1,1,2-Trichlorethan, 1,1,1,2-Tetrachlorethan, 1,1,2,2-Tetrachlorethan, Pentachlorethan, Hexachlorethan, 1,1-Dichlorethylen, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Tetrachlorethylen, 1,2-Dichlorpropan, 1,2,3-Trichlorpropan, Chlorbenzol, 1,1,1,2-Tetrafluorethan, etc.
Bevorzugt sind Dichlormethan, Chloroform, Kohlenstofftetrachlorid, 1,1-Dichlorethan, 1,2-Dichlorethan, 1,1,1-Trichlorethan, 1,1,2-Trichlorethan, 1,1-Dichlorethylen, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Chlorbenzol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan. Mehr bevorzugt sind Dichlormethan, Chloroform, 1,2-Dichlorethylen, Trichlorethylen, Chlorbenzol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan.
Die Fettsäureester sind nicht besonders beschränkt, aber es können beispielsweise Propionate, Acetate, Formiate etc. erwähnt werden. Bevorzugt sind Acetate und Formiate und mehr bevorzugt sind Acetate. Funktionale Ester-Gruppen davon sind nicht besonders beschränkt, aber Alkylester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, Aralkylester mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, bevorzugt sind Alkylester mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und mehr bevorzugt sind Alkylester mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, zu verwenden.
Als Propionate können beispielsweise Methylpropionat, Ethylpropionat, Butylpropionat, Isopentylpropionate, etc. erwähnt werden.
Als Acetate können beispielsweise Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, sek-Butylacetat, Pentylacetat, Isopentylacetat, sek-Hexylacetat, Cyclohexylacetat, Benzylacetat, etc. erwähnt werden. Bevorzugt sind Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat, Isobutylacetat, sek-Butylacetat, Pentylacetat, Isopentylacetat, sek-Hexylacetat und Cyclohexylacetat. Mehr bevorzugt sind Methylacetat, Ethylacetat, Propylacetat, Isopropylacetat, Butylacetat und Isobutylacetat. Am meisten bevorzugt ist Ethylacetat.
Bezüglich der Formiate können beispielsweise erwähnt werden Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Isopropylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat, sek-Butylformiat, Pentylformiat, etc. Bevorzugt sine Methylformiat, Ethylformiat, Propylformiat, Butylformiat, Isobutylformiat und Pentylformiat und am meisten bevorzugt ist Ethylformiat.
Die Ether sind nicht besonders beschränkt, aber es können cyclische oder acyclische oder gesättigte oder ungesättigte sein. Gesättigte sind aber vorzugsweise zu verwenden. Im allgemeinen sind solche, die 3 bis 20 Kohlenstoffatome und bevorzugt 4 bis 12 Kohlenstoffatome und mehr bevorzugt 4 bis 8 Kohlenstoffatome haben zu verwenden.
Als spezifische Beispiele können beispielsweise erwähnt werden Diethylether, Methyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Dihexylether, Ethylvinylether, Butylvinylether, Anisol, Phenethol, Butylphenylether, Methoxytoluol, Dioxan, Furan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Ethylenglykoldimethylether, Ethylenglykoldiethylether, Ethylenglykoldibutylether, Ethylenglykolmonomethylether, Ethylenglykolmonoethylether, Ethylenglykolmonobutylether, etc.
Bevorzugt sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Dihexylether, Anisol, Phenetol, Butylphenylether, Methoxytoluol, Dioxan, 2-Methylfuran, Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Ethylenglykoldimethylether, Ethylenglykoldiethylether, Ethylenglykoldibutylether, Ethylenglykolmonomethylether und Ethylenglykolmonoethylether. Mehr bevorzugt sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Anisol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Ethylenglykolmonomethylether und Ethylenglykolmonoethylether. Mehr bevorzugt sind Diethylether, Methyl-tert-butylether, Anisol, etc. und am meisten bevorzugt ist Methyl-tert-butylether.
Die Nitrile sind nicht besonders beschränkt, und es können cyclische oder acyclische oder gesättigte oder ungesättigte sein. Jedoch werden vorzugsweise gesättigte verwendet. Im allgemeinen sind solche, die 2 bis 20 Kohlenstoffatome enthalten, vorzugsweise 2 bis 12 Kohlenstoffatome und mehr bevorzugt 2 bis 8 Kohlenstoffatome zu verwenden.
Als spezifische Beispiele können beispielsweise erwähnt werden Acetonitril, Propiononitril, Malononitril, Butyronitril, Isobutyronitril, Succinonitril, Valeronitril, Glutaronitril, Hexannitril, Heptylcyanid, Octylcyanid, Undecannitril, Dodecannitril, Tridecannitril, Pentadecannitril, Stearonitril, Chloracetonitril, Bromacetonitril, Chlorpropionnitril, Brompropionnitril, Methoxyacetonitril, Methylcyanoacetat, Ethylcyanoacetat, Tolunitril, Benzonitril, Chlorbenzonitril, Brombenzonitril, Cyanoobenzoesäure, Nitrobenzonitril, Anisonitril, Phthalonitril, Bromtolunitril, Methylcyanobenzoat, Methoxybenzonitril, Acetylbenzonitril, Naphthonitril, Biphenylcarbonitril, Phenylpropiononitril, Phenylbutyronitril, Methylphenylacetonitril, Diphenylacetonitril, Naphthylacetonitril, Nitrophenylacetonitril, Chlorbenzylcyanid, Cyclopropancarbonitril, Cyclohexancarbonitril, Cycloheptancarbonitril, Phenylcyclohexancarbonitril, Tolylcyclohexancarbonitril, etc.
Bevorzugt sind Acetonitril, Propiononitril, Succinonitril, Butyronitril, Isobutyronitril, Valeronitril, Methylcyanoacetat, Ethylcyanoacetat, Benzonitril, Tolunitril und Chlorpropiononitril. Mehr bevorzugt sind Acetonitril, Propiononitril, Butyronitril und Isobutyronitril und am meisten bevorzugt ist Acetonitril.
Von diesen oben erwähnten organischen Lösungsmitteln wird bevorzugt ein Lösungsmittel mit niedriger Mischbarkeit in Wasser verwendet. Das macht es möglich, die oben erwähnte Reduktionsreaktion, und zusätzlich die Nachbehandlungsschritte nach der Reduktionsreaktion adäquat durchzuführen.
Beim Auswählen des Lösungsmittels aus den oben erwähnten Lösungsmitteln, sind Eigenschaften wie der Siedepunkt und die Viskosität vorzugsweise in Betracht zu ziehen, zum Beispiel sollte das Lösungsmittel einen Siedepunkt haben, der eine entsprechende Erwärmung zur Steigerung der Löslichkeit ermöglicht, und die Gewinnung des Lösungsmittels aus den Kristallisierungsfiltraten erleichtert, und die Lösungsmittelentfernung aus den feuchten Massen durch Trocknung (ungefähr 30 bis 150°C bei 1 atm), ein Schmelzpunkt, bei dem eine Verfestigung bei Behandlung bei Raumtemperatur wie auch bei der Abkühlung auf Raumtemperatur oder darunter nicht auftritt (nicht weniger als ungefähr 0°C, bevorzugt nicht weniger als ungefähr 10°C, noch bevorzugter nicht weniger als ungefähr 20°C), und eine niedrige Viskosität (nicht höher als ungefähr 10 cp bei 20°C). Unter dem Gesichtspunkt der industriellen Verarbeitbarkeit wird ein Lösungsmittel, welches bei gewöhnlicher Temperatur kaum flüchtig ist bevorzugt; im allgemeinen beispielsweise eines mit einem Siedepunkt der nicht niedriger als ungefähr 80°C ist, und eines mit einem Siedepunkt von nicht weniger als ungefähr 90°C ist besonders bevorzugt.
Die oben erwähnte Reduktionsreaktion kann für gewöhnlich innerhalb von 5 Stunden bis zum Ende durchgeführt werden, vorzugsweise innerhalb von 3 Stunden, und mehr bevorzugt innerhalb einer Stunde.
Das erzeugte reduzierte Coenzym Q₁₀ wird in einem organischen Lösungsmittel aus der so erhaltenen wäßrigen Mischung nach der Reduktionsreaktion extrahiert, um eine organische Phase zu gewinnen, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ enthält. Dann wird, falls notwendig (vorzugsweise), die organische Phase wiederholt weiter mit Wasser gewaschen, um Unreinheiten vollständig zu entfernen. Das zu verwendende Wasser zum Waschen ist nicht besonders beschränkt, aber es ist vorzugsweise Wasser oder eine wäßrige Lösung, die ein Salz enthält, vorzugsweise ein anorganisches Salz wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Natriumsulfat etc. hinsichtlich der Leichtigkeit der Flüssigkeitstrennung (wobei die Konzentration des Salzes vorzugsweise hoch ist und für gewöhnlich bei 5 Gew.% oder darüber liegt, vorzugsweise bei ungefähr 10 Gew.% oder darüber und mehr bevorzugt bei der Konzentration der Sättigung oder nahe der Sättigung). Die Extraktion und die Waschschritte, die oben erwähnt wurden, können unter sauren Bedingungen durchgeführt werden, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6 oder darunter und mehr bevorzugt bei pH 5 oder darunter zur Maximierung der Bildung von oxidiertem Coenzym Q₁₀ als Nebenprodukt.
Das organische Lösungsmittel, das in der Extraktion, die oben erwähnt wurde, verwendet wird ist nicht besonders beschränkt. Aber aufgrund der oben erwähnten Anhaltspunkte ist es bevorzugt, ein Art zu verwenden, die aus Kohlenwasserstoff, Fettsäureestern, Ethern und Nitrilen, wie oben erwähnt wurde, ausgewählt wurde. Wenn das organische Lösungsmittel zusammen in der oben erwähnten Reduktionsreaktion verwendet wird, wird das gleiche organische Lösungsmittel vorzugsweise ebenfalls als Extraktionslösungsmittel verwendet.
Die so erhaltene organische Phase, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ enthält, kann dann Arbeitsschritten unterworfen werden, die entsprechend aus Kühlen, Aufkonzentrierung, Lösungsmittelsubstituierung oder ähnlichen kombiniert werden, wobei das reduzierte Coenzym Q_l0 kristallisiert wird. Das reduzierte Coenzym Q_l0 von hoher Qualität, das durch das oben erwähnte Verfahren gewonnen wird, kann unter normalem Druck oder reduziertem Druck getrocknet werden.
Die oben erwähnten Behandlungen nach der Reduktionsreaktion, d.h. eine Reihe aus Arbeitsschritten von der Extraktion bis zur Gewinnung des getrockneten Kristalls, werden in einer deoxygenierten Atmosphäre durchgeführt. Vorzugsweise kann die Behandlung beispielsweise in einer trägen Gasatmosphäre wie in Stickstoffgas-, Heliumgas-, Kohlendioxidgas-, Argongasund Wasserstoffgasatmosphären durchgeführt werden, und besonders bevorzugt in einer Stickstoffgasatmosphäre.
Erfindungsgemäß können zahlreiche Faktoren, die das Vorhandensein, die Bildung von Nebenprodukten und die Zumischung des oxidierten Coenzyms Q₁₀ inhibieren entsprechend kontrolliert werden, und dadurch kann reduziertes Coenzym Q₁₀ von hoher Qualität in einer günstigen und wirksamen Weise bei hoher Ausbeute gewonnen werden. Das reduzierte Coenzym Q₁₀, das erfindungsgemäß gewonnen wird, ist ein Produkt, mit überwiegend hoher Qualität und es kann erwartet werden, daß das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zum oxidierten Coenzym Q₁₀ nicht weniger als 96/4 ist, vorzugsweise nicht weniger als 98/2, mehr bevorzugt nicht weniger als 99/1.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die folgenden Beispiele stellen die vorliegende Erfindung in weiterem Detail dar. Diese Beispiele sind jedoch in keiner Weise für den Bereich der vorliegenden Erfindung als beschränkend anzusehen. In den Beispielen wurden die Reinheit des reduzierten Coenzyms Q₁₀ und des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidierten Coenzym Q₁₀ Gewichtsverhältnis durch HPLC-Analyse, die unten beschrieben ist, bestimmt. Die Reinheitswerte des reduzierten Coenzyms Q₁₀, welche bestimmt wurden, sind jedoch in keiner Weise indikativ für die begrenzenden Reinheitswerte, die erfindungsgemäß erreicht werden können. Gleichermaßen sind die Gewichtsverhältniswerte des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidierten Coenzym Q₁₀ niemals indikativ für das obere Niveau dieses Verhältnisses.
(HPLC Bedingungen)

Säule: SYMMETRY C18 (Produkt von Waters), 250 mm (Länge), 4,6 mm (Innendurchmesser; mobile Phase: C₂H₅OH:CH₃OH = 4:3 (V/V); Detektionswellenlänge: 210 nm; Fließrate: 1 ml/min; Rückhaltedauer des reduzierten Coenzym Q₁₀: 9,1 min; Rückhaltedauer des oxidierten Coenzyms Q₁₀: 13,3 min.

(Beispiel 1)
Unter Rühren (Rührstromverbrauch 0,3 kW/m³), werden 100 g des oxidierten Coenzyms Q₁₀ (Reinheit 99,4 %) bei 48°C in einer wäßrigen Lösung durch Lösen von 80 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1100 g 10 Gew.%iger Lauge nacheinander als Reduktionsmittel hinzugegeben, um eine Reduktionsreaktion bei 48°C und einem pH-Wert von 4 bis 6 durchzuführen. Nach Verstreichen von 2 Stunden wurden 1000 g Heptan hinzugegeben und eine wäßrige Phase wurde entfernt. Dann wurde die Heptanphase 6-mal mit 1000 g gesättigter Lauge gewaschen, die durch Salzsäure auf pH 3 eingestellt worden ist, um eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zu ergeben. Alle der oben erwähnten Arbeitsschritte wurden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zum oxidierten Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 99,5/0,5, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Beispiel 2)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 gewonnen, außer daß die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in Heptan-Lösung betrug 99,0/1,0 und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Beispiel 3)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 gewonnen, außer daß eine wäßrige Lösung (kein Natriumchlorid hinzugefügt), durch Lösen von 80 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1000 g Wasser hergestellt, als Reduktionsmittel verwendet wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q_l0 in der Heptan-Lösung betrug 99,4/0,6, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Vergleichsbeispiel 1)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 gewonnen, außer daß eine wäßrige Lösung (kein Natriumchlorid hinzugefügt) durch Lösen von 80 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1000 g Wasser hergestellt wurde, und als Reduktionsmittel verwendet wurde, und die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 87,4/12,6, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 87 mol%.
(Beispiel 4)
Oxidiertes Coenzym Q₁₀ (100 g; Reinheit 99,4 %) wurde in 1000 g Heptan bei 25°C gelöst. Unter Rühren (Rührkraftverbrauch 0,3 kW/m³) wurde eine wäßrige Lösung durch Lösen von 62 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1100 g 10 Gew.%iger Lauge hergestellt und graduierlich als Reduktionsmittel hinzugegeben, um eine Reduktionsreaktion bei 25°C und einem pH-Wert von 4 bis 6 durchzuführen. Nach Verstreichen von 2 Stunden wurde die wäßrige Phase aus der Reaktionslösung entfernt und eine Heptanphase wurde 6-mal mit 1000 g gesättigter Lauge gewaschen, welche mit Salzsäure auf pH 3 eingestellt worden war, um eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ zu ergeben. Alle oben erwähnten Arbeitsschritte wurden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 99,5/0,5, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Beispiel 5)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzym Q_l0 wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 gewonnen, außer daß die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 99,3/0,7, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Beispiel 6)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 gewonnen, außer daß eine wäßrige Lösung (kein Natriumchlorid zugegeben) durch Lösen von 62 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1000 g Wasser hergestellt wurde, welches als Reduktionsmittel verwendet wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q_l0 in der Heptan-Lösung betrug 99,4/0,6, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Beispiel 7)
Eine Hexan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q_l0 wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 5 gewonnen, außer daß Hexan als Lösungsmittel für das Lösen des oxidierten Coenzyms Q₁₀ verwendet wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in der Hexan-Lösung betrug 99,1/0,9 und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Vergleichsbeispiel 2)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 gewonnen, außer daß eine wäßrige Lösung (kein Natriumchlorid hinzugegeben) durch Lösen von 65 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1000 g Wasser hergestellt wurde und als Reduktionsmittel verwendet wurde, und die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 91,0/9,0, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 91 mol%.
(Beispiel 8)
Eine Hexan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 gewonnen, außer daß Hexan als Lösungsmittel zum Lösen des oxidierten Coenzyms Q₁₀ verwendet wurde, und eine Lösung (kein Natriumchlorid hinzugegeben) in der 60 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1000 g gelöst war, wurde als Reduktionsmittel verwendet. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q_l0 in der Hexan-Lösung betrug 99,3/0,7, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms betrug 99 mol%.
(Vergleichsbeispiel 3)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 8 gewonnen, außer daß die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertes Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 90,9/9,1 und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 91 mol%.
(Beispiel 9)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 1 gewonnen, außer daß eine wäßrige Lösung durch Lösen von 80 g Natriumdithionit (Reinheit 75 % oder mehr) in 1050 g 5 Gew.% Lauge als Reduktionsmittel verwendet wurde, und die Reduktionsreaktion in der Atmosphäre durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidierten Coenzyms Q₁₀ betrug 98,9/1,1, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 99 mol%.
(Vergleichsbeispiel 4)
Eine Heptan-Lösung des reduzierten Coenzyms Q₁₀ wurde durch das gleiche Verfahren wie in Beispiel 4 gewonnen, außer daß die Reduktionsreaktion in einem PH-Bereich von 8 bis 9 durchgeführt wurde. Das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ in der Heptan-Lösung betrug 54,0/46,0, und die Ausbeute des reduzierten Coenzyms Q₁₀ betrug 54 mol%.
(Referenzbeispiel 1)
1 g reduziertes Coenzym Q₁₀ (Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidierten Coenzyms Q₁₀ ist 99,6/0,4) wurde in 20 g verschiedener Lösungsmittel, die in Tabelle 1 gezeigt sind, bei 25°C gelöst. In der Atmosphäre wurde das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ in den Lösungen nach Rühren für 24 Stunden bei 35°C gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Lösungsmittel R

Heptan 99,1/0,9

Hexan 98,7/1,3

Toluol 98,8/1,2

Chloroform 98,9/1,1

Ethylacetat 98,9/1,1

Methyl-tert-butylether 98,6/1,4

Tetrahydrofuran 98,5/1,5

R: Reduziertes Coenzym Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ Gewichtsverhältnis

(Referenzbeispiel 2)
1 g des reduzierten Coenzyms Q₁₀ (Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ ist 99,6/0,4) wurde in 100 g verschiedener Lösungsmittel, die in Tabelle 2 gezeigt sind, bei 35°C gelöst. In der Atmosphäre wurde das Gewichtsverhältnis des reduzierten Coenzyms Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ in den Lösungen nach Rühren für 24 Stunden bei 25°C gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2

Lösungsmittel R

Heptan 96,7/3,3

Ethylacetat 96,4/3,6

Acetonitril 96,0/4,0

R: Reduziertes Coenzym Q₁₀/oxidiertem Coenzym Q₁₀ Gewichtsverhältnis

Industrielle Anwendbarkeit
Da die vorliegende Erfindung die Zusammensetzung hatte, die oben erwähnt wurde, kann reduziertes Coenzym Q_l0 von hoher Qualität in einer günstigen und effizienten Weise gewonnen werden. Dadurch ist das Verfahren für die Produktion in industriellem Maßstab geeignet.

Claims

Verfahren zum Herstellen eines reduzierten Coenzyms Q₁₀, umfassend das Reduzieren eines oxidierten Coenzyms Q₁₀ in einem wäßrigen Medium unter Verwendung von Dithionsäure oder eines Salzes davon, wobei die Reduzierung in Koexistenz eines Salzes und/oder in einer deoxygenierten Atmosphäre und bei einem pH von 7 oder darunter durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Salz ein anorganisches Salz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Konzentration des Salzes in Wasser 3 G/G% oder mehr ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, worin die deoxygenierte Atmosphäre eine inerte Gasatmosphäre ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin der PH-Bereich zwischen 3 und 7 ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, worin das wäßrige Medium ein gemischtes Medium, umfassend Wasser und ein organisches Lösungsmittel, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das organische Lösungsmittel mindestens eine Sorte ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kohlenwasserstoffen, Fettsäureestern, Ethern und Nitrilen.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das organische Lösungsmittel ein Kohlenwasserstoff ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das organische Lösungsmittel eines aus Pentanen, Hexanen, Heptanen oder Octanen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, worin das organische Lösungsmittel eines aus Heptanen ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, worin die organische Phase, die das reduzierte Coenzym Q₁₀ enthält, durch Extrahieren des erzeugten reduzierten Coenzyms Q₁₀ in einem organischen Lösungsmittel nach der Reduzierungsreaktion gewonnen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Extraktion bei einem pH von 6 oder darunter durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei die organische Phase, die durch Extraktion wiedergewonnen wird, zusätzlich mit Wasser gewaschen wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, welches in einer deoxygenierten Atmosphäre durchgeführt wird.